JPH07504158A - ジペプチジル−アミノペプチダーゼｉｖ型のインヒビタ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ジペプチジル−アミノペプチダーゼＩＶｕのインヒビタ発明の背景 本発明は、ジベブチジルーアミノベブチダーゼＩＶ型（ＤＰ−ＩＶ）のアミノペ プチダーゼ活性のインヒビタに関する。 ＤＰ−ＸＶは、ポリペプチドのアミノ末端からＸａａ−Ｐｒｏ　（Ｘａａはいが なるアミノ酸をも指す）ジペプチドを除去する特異性を有する、プロリンの後を 切断する酵素である。ＤＰ−ＩＶは、微弱な活性ながらアミノ末端がらＸａａ− Ａｌａジペプチドも除去する。ＤＰ−ＩＶは、例えば、腎小管細胞、腸上皮、及 び血漿など多くの哺乳類細胞及び組織中に存在する。ＣＤ４＋及びあるｍ瘍のＣ Ｄ８＋　Ｔ細胞の表面にも存在する。ＤＰ−ＩＶは、免疫応答の調節に関与する ものと思われる。細胞表面へのＤＰ−ＩＶの出現は、細胞のインターロイキン− ２（ＩＬ−２）の生産能に関連している。ＤＰ−ＩＶは、ジペプチジル−ペプチ ドヒドロラーゼＤＡＰ−ＩＶまたはＤＰＰ−ＩＶとも呼ばれる；これにはＥＣ番 号３．４．１４．５が付与されている。 三種の異なるＤＰ−ＥＶインヒビタが知られている。これらの１つは自殺インヒ ビタ：Ｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−０−にトロベンジル−）ヒドロキシルアミンである （本出願においては標準的な３文字表記のアミノ酸コードを使用する；０は酸素 を示す。）。もう一つは拮抗インヒビタ：ｅ−（４−二トロ）ベンゾキシカルボ ニル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏである。３つ目は、ポリクローナルウサギ抗ブタ肝臓ＤＰ −ＩＶイムノグロブリンである。 発明の要旨 ＤＰ−ＩＶの酵素活性には、ポリペプチドの遊離アミノ末端からのジペプチドの 切断が含まれる。ＤＰ−ＩＶはプロリンの後を切断する傾向がある、すなわちプ ロリンがアミノ末端から二番目に位置している場合に切断する。遊離のアミノ末 端が必要である；このようにＤＰ−ＩＶは、ポリペプチドのアミノ末端からＸａ ａ−Ｐｒｏ　（Ｘａａはプロリンを含むいかなるアミノ酸でもよい）ジペプチド を除去する特異性を有する、プロリンの後を切断する酵素である。ＤＰ−ＩＶは 、ポリペプチドのアミノ末端からＸａａ”−Ａｌａジペプチドも除去する（Ｘａ ａ゛カ、チロシンのような巨大側鎖を有するアミノ酸である場合）。 本発明は、ＤＰ−ＩＶの酵素活性に対する有力なインヒビタの１１１１８に関す る。 一般的に、プロリンのα−アミノホウ素酸アナログ（ｂｏｒｏＰｒｏは、ゾロリ ンのカルボキル基がＢ　（ＯＨ）、、基に置換されているアナログの１つを指す 。ここて、（ＯＨ）２は２個の水酸基を指し、Ｂはホウ素を指す）がアミノ酸に 結合し、ｂｏｒｏＰｒｏをカルボキシル末端残基に存するジペプチドを形成する 。これらのジペプチドプロリルホウ酸は、有力で、ＤＰ−ＩＶに非常に特異的な （Ｋｉ値がナノモル範囲）インヒビタである。 ｂｏｒｏＰｒｏ部分を有するジペプチドは比較的不安定である；このため、我々 は最低２つの池のアミノ酸残基を有するインヒビタを設計した。一般的に、これ らのインヒビタの構造はＸ−Ｐｒｏ−Ｙ−ｂｏｒｏＰｒｏ　（ここでＸ及びＹは 、プロリンを含むすべてのアミノ酸から選択する）である。このテトラペプチド は、アミノ末端に１つまたはそれ以上のジペプチドを付加して延長することがで きる。 各ジペプチドは一般的な構造式Ｚ−ＰｒｏまたはＺ−ａｌａ（ここで各２は、別 個の、プロリンを含むいかなるアミノ酸でもよい）を有する。この一般的な構造 式は、以下にさらに詳細に記載する。これらインヒビタの各ジペプチド部分はＤ Ｐ−ＩＶの基質であり、これらのインヒビタとＤＰ−ＩＶが反応した場合の最終 産物はジペプチドインヒビタＹ−ｂｏｒｏＰｒｏであるため、このようなインヒ ビタはＤＰ−ＩＶのインヒビタとして機能する。これらインヒビタのアミノ末端 はブロックされていてはならない。なぜなら、ＤＰ−ＩＶはＮ−末端がブロック されたポリペプチドからジペプチドを切断することはできないからである。 このように、第一の態様において本発明は、グループＩ−グループＩＩの構造を 有する化合物に関する。グループＩの構造は以下の通りである。 ここで、Ｈは水素、Ｃは炭素、０は酸素、Ｎは窒素を示し、各Ｒはそれぞれプロ リンを含むＲ基のアミノ酸からなる基から選択され、各破線はそれぞれＨまたは Ｒ基への結合を示し、各Ｈ′はその結合または水素を示し、ｐは０〜４（Ｏと４ を含む）の整数である。代替の様式において、グループＩは以下の構造を有する 。 ここで、ｎは０〜３（０と３を含む）であり、各０２及びＧ３はそれぞれＨまた はＣ１〜３（１〜３個の炭素原子）アルキルである。 Ｇ１は、ＮＨ３（Ｈ３は３個の水素を示す）、（Ｈ２は２個の水素を示す）、 または、ＮＧ４である。 ここで、Ｇ４はＣ−ａＳ　である。 （Ｇ５及びＧ６はＮＨ，Ｈ，または０１〜３アルキルまたは１つまたはそれ以上 の炭素が窒素に置換されたアルケニルである）である。 Ｇ１は荷電しており、Ｇ１及びグループＩＩはｐＨ７，０において共有結合した 環状構造を形成しない。グループＩは以下のような構造を有することもある。 ■ ここで、ａＳｂＳｃ％ｄ、ｅ及びｆ基はＮであり、それ以外はＣである。各Ｓ１ 〜Ｓ６はそれぞれＨまたは０１〜Ｃ３アルキルである。グループ！は２個の窒素 原子を有する不飽和５員環、すなわちイミダゾール環を含むこともある。グルー プＩＩは以下の構造を有する。 ここで、Ｄｌ及びＤ２はそれぞれ水酸基または生理的ｐＨにおいて水溶液中で水 酸基になり得る基である。こような基；よ以下の構造を有する。 ここで、ＧはＨ１フッ素（Ｆ）、または１〜２０個の炭素原子及び任意のへテロ 原子（Ｎ、　Ｓ　（イオウ）またはＯ）を含むアルキル基のいずれかである。ま たは、以下の構造を有するホスホネートＭ　（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ｇｒｏ ｕｐ　）である。 Ｐ−Ｊ −Ｊ ここで各ＪはそれぞれＯ−アルキル、Ｎ−アルキル、またはアルキルである。各 ０−アルキル、Ｎ−アルキル、またはアルキルは１〜２０個の炭素原子を含み、 任意でＮ、ＳまたはＯのへテロ原子を含む。一般的にＴは、ＤＰ−ＩＶの触媒部 位を有する化合物を形成することができる。 Ｒ４Ｒ５Ｒ４Ｒ５Ｒ７ ＩＩ　ｌ１１ ＹはＲ３−Ｃ−Ｒ４、Ｒ３−Ｃ−Ｃ−Ｒｅ　、またはＲ３−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｒ８Ｉ Ｉ　Ｉ１１ であり、各ＲＩ　ＳＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒｅ　、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ 別個の、ＤＰ−ＩＶが阻害的化合物を部位特異的に認識するのを大きく妨害する ことはな（ＤＰ−ＩＶとの複合体を形成することのできる基である。 好適な実施例において、Ｔはホウ素酸基、ホスホネート基、またはトリフルオロ アルキルケトン基である。各Ｒ１〜Ｒ８はＨである。各Ｒ１及びＲ２はＨであり 、各ＹはＣＨ２−ＣＨ２である。各Ｒはそれぞれ別個にプロリン及びアラニンの Ｒ基から選択される。阻害的化合物のＤＰ−ＩＶへの結合または解離定数は最低 １０””Ｍ、１０−８Ｍまたは１０−７Ｍである。阻害的化合物は薬理学的に許 容可能な担体物質と混合されている。各Ｄ１及びＤ２はそれぞれＦであるか、ま たはＤｌ及びＤ２は共に１〜２０の炭素原子を含み、任意でＮ、、Ｓまたは０の へテロ原子を有する環である。 第二の態様において本発明は、哺乳類においてＤＰ−ＩＶの酵素活性を阻害する 方法に関する。本方法には、効果的な量の上述の阻害的化合物の哺乳類への投与 が含まれる。投与する化合物の量は治療する動物１キログラム当たり１日１〜５ ００ｍｇが最も好ましい。 第三の態様において本発明は、以下の構造を有する、ＤＰ−ＩＶのインヒビタに 関する。 ここで、ｍは０〜１０（０及び１０を含む）の整数である。Ａ及びＡ′はＬ−ア ミノ酸残基（グリシンに関してはこのような区別はない）（各カッコ内のＡは異 なるアミノ酸残基でもよい）である。Ｂに結合したＣはＬ−立体配置である。Ａ とＮ、Ａ−１Ｃの間、及びＡ′とＮの間の結合はペプチド結合である。各Ｘ１Ｘ ２はそれぞれ水酸基、または生理的ｐＨにおいて水酸基に加水分解され得る基で ある。′Ｂに結合したＣｌ；ＬＬ−立体配置である０とは、Ｃの絶対的立体配置 がＬ−アミノ酸のようであることを意味する。 素との関係と同一の関係を有する。種々の好適な実施例において、Ａ及びＡ′は それぞれプロリンまたはアラニン残基である。ｍはＯである。Ｘｌ及びＸｌは水 酸基である。インヒビタはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏである。また、イン ヒビタはＬ−Ｐｒｏ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏである。 第四の態様において本発明は、哺乳類中でＤＰ−！Ｖを阻害する方法に関する。 本方法には、効果的な量の、以下の構造を有する上述の阻害的化合物の哺乳類へ の投与が含まれる。 好適な実施例において、投与する化合物の量は哺乳類１キログラム当たり１日１ ｍｇから哺乳類１キログラム当たり１日５００ｍｇである。 本発明の他の特徴及び利点は以下に記載する好適な実施例及び特許請求の範囲か ら明白である。 衷曳撚 ４、

【図面の簡単な説明】

図面 図１はポロプロリン化合物の合成を図示したものである。 図２は本発明の数種の実施例を図示したものである。 構造 本発明の阻害的化合物は、上述の発明の要旨中に列挙したような一般的構造をを する。好適な構造の例は、上述の好適な実施例中に記載したようなものである。 好適な阻害的化合物の構造は、ＤＰ−ＩＶ基質の切断部位近傍のアミノ酸配列の 少なくとも一部分が２回繰り返されているか、またはほぼ繰り返されているよう なものである。この２回の繰り返しは、ＤＰ−ＩＶ阻害的化合物または阻害的化 合物のＤＰ−ＩＶ切断産物と実際のＤＰ−ＩＶ基質との間の拮抗阻害を含むと思 われる機構により、部分的には阻害的化合物のＤＰ−ＩＶ阻害能に関わっている 。 阻害的化合物の阻害活性及び特異性は、いかなるアミノ酸配列を選択するかによ って影響を受ける。標準的な技術を用いてペプチド断片を合成し、インヒビタと しての有効性を試験することができる。特異性は、特定の阻害的化合物が酵素活 性に与える阻害効果を試験することにより同様の方法で決定する。阻害的化合物 はＤＰ−ＩＶの酵素活性を阻害し９、正常な細胞機能に必要な酵素は阻害しない ことが好ましい。 阻害的化合物は、拮抗的な方法のみならず、阻害的化合物とＤＰ−ＩＶの間に強 い結合を形成するような化学的反応性によってもＤＰ−ＩＶと複合体を形成する ための基（Ｔ）を有する。このように、この基は阻害的化合物がＤＰ−ＩＶに結 合するよう作用し、阻害的化合物の阻害的結合定数（Ｋ、）を増大させる。この 様な基の例には、ホウ酸、フルオロアルキルケトン及びホスホラミデート（ｐｈ ｏｓｐｈｏｒａｗｉｄａｔｅｓ　；これらの構造式は上述の要旨中に記載されて いる）が含まれる。 これらの基は、上述の構造式のように、化合物のプロリル残基に共有結合してい る。 ＤＰ−ＩＶの活性部位により認識されるプロリンの構造を模倣するよう、上記に おいて、 ｊＩ Ｒ１−Ｃ−Ｙ 喝 で示したプロリンまたはプロリンアナログを選択する。この認識を顕著に阻害す ることがなく、そのため化合物のに、に顕著な影響を与えないＲ１及びＲ２基を 五 提供することにより変更を行なうことができる。このため、］、っまたはそれ以 上の水酸基を置換してヒドロキシ−プロリンを形成することができ、メチルまた は糖部分をこれらの基に結合することができる。本発明においてこれらの基が決 定的なものではなく、Ｒ１及びＲ２について多くの置換可能な選択肢があること は当業者によって認識されるところである。ある意味で、上述のプロリンアナロ グがＤＰ−ＩＶの活性部位により認識されるプロリンの構造を模倣する必要があ るということは、Ｎ及びＹに結合するＣが、Ｌ−プロリンのアルファ炭素と同一 の立体化学を有することを意味している。 ポロプロリンの合成 図１において、初発化合物Ｉは、ビナンジオールエステルをピナコールエステル に置換した以外は本質的にはＭａｔｔｅｓｏｎ　ｅｔ　ａ）ＡＯｒｔ、ｙｓｏｚ ｗｉ／／Ｊｃｒ３：１２８４．１９８４）の方法に従って調製した。ポロピペコ リン酸及び２−アゼトジンホウ素数などの類似の化合物は、化合物ｉのペンチル 及びプロピルアナログを得るよう適切な初発物質を選択することにより調製する ことができる。さらに、構造式中のＢｒをＣ１に置換することもでき、構造式中 のピナコールを、例えば２，３−ブタンジオール及びアルファービナンジオール などの他のジオール保護基に置換することもできる。 化合物器は、化合物【を［（ＣＨ３）０３Ｓ　ｉｌ　２Ｎ−Ｌｉ十と反応させる ことにより調製する。この反応では、ヘキサメチルジシラザンをテトラヒドロフ ラン中に溶解し、−７８℃中で１当量のｎ−ブチルリチウムを添加する。室温（ ２０℃）まで加温した後−７８℃に冷却ｊ７．１当量の化合物■をテトラヒドロ フラン中に添加する。この混合物を室温まで徐々に加温し、−晩攪拌する。溶液 をエバポｌ／−トＬ、無水条件下でヘキサンを添加することにより、アルファー ビス［トリメチルシラン］に保護されたアミンを単離する。１！素ブランケツト 下で濾過して不溶性残留物を除去し、化合物Ｉｔのへキサン溶液を得る。 化合物１１１．即ちＮ−トリチシリルに保護された形のポロプロリンは、化合物 １１を１００−１５０”Ｃ１：加熱し蒸留物を０．０６〜Ｏ，１０ｍｍの圧力下 で６６〜６２℃で加熱Ｊる蒸留工程中に、化合物器が加熱環化されることにより 得られる。 化合物Ｉｖ（ポロプロリン−ピナコール塩化水素）は、化合物器■をＨＣＩニジ オキサンで処理することにより得られる。過剰のＭＣＩ及び副産物はエーテルと 共に粉砕することにより除去する。酢酸エチルから再結晶化させることにより、 非常に純度の高い最終産物が得られる。 ポロプロリンエステルは、化合物ＩＩの調製中に得られる反応液を酸無水物で処 理し、１−アミノ−４−ブロモブチルホウ素酸ピナコールを塩として回収するこ とによっても得られる。塩基により塩を中和し、加熱反応を行なうと環化が起こ る。 ポロプロリン−ピナコールの調製 中間体（４−ブロモ−１−クロロブチルホウ素酸ピナコール）は、大スケール調 製用に条件を修正しかつビナンジオール保護基をピナコールに置換する以外は、 にａｔｔｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　Ａｔ）ｒｚｔｖｉｙｏｚｅｌｉ／Ｉ／ｃｓ　３ ：１２ｇ４．１９８４）の方法に従ってｒｉ８製した。 ３−ブロモプロピルホウ素数ピナコールは、臭化アリル（１７３ｍＬ　２．００ モル）をカテコールボラン（２４０ｍｌ、２．００モル）を用いてヒドロボウ素 化（ｈｙｄｒｏｇｅｎｂｏｒｏｎａｔｉｏｎ）することにより調製した。カテコ ールボランを臭化アリルに添加し、窒素存在下で１００℃４時間の加熱反応を行 なった。蒸留により４９％の収率で、産物、３−ブロモプロピルホウ酸カテコー ル（沸点９５〜１０２℃、０．２５ｍｍ）を得た。カテコールエステル（１２４ ｇＳ０．５２モル）はピナコール（６１，５ｇ、０．５２モル）と共に５０ｍ１ のＴＨＦ中で混合し、０℃で０．５時間、室温で０．５時間攪拌することにより エステル転移反応を行なった。溶媒をエバボレートして除去し、２５０ｍ１のヘ キサンを添加した。カテコールは固体結晶として除去した。定量的除去は、ヘキ サンを用いて連続的に〜５００ｍ１及び〜１０１００Ｏに希釈し、各希釈液がら 結晶を除去することにより行なった。ヘキサンはエバボレートされ、蒸留により １７７ｇの産物を回収した（沸点６０〜６４℃、０．３５ｍｍ）。 ４−ブロモ−１−クロロブチルホウ素酸ピナコールは、対応するプロピルホウ素 酸をホモログ化することにより調製した。塩化メチレン（５０，５４ｍ１Ｓ０゜ ７１３モル）を５００ｍ１のＴＨＦ中に溶解し、−１００℃において１．　５４ Ｎのｎ−ブチルリチウム（４８０ｍｌ、０．７８０モル）ヘキサン溶液をゆっく りと添加した。３−ブロモプロピルホウ素数ピナコール（１７８ｇＳ０．７１３ モル）を５００ｍ１のＴＨＧに溶解し、溶液の凝固点まで冷却し、反応液に添加 した。塩化亜鉛（５４，４ｇ、０．３９２モル）を２５０ｍ１のＴＨＧに溶解し 、０℃まで冷却し、数回に分けて反応液に添加した。反応液を室温まで徐々に加 温し、−晩攪拌した。溶媒をエバボレートし、残留物をヘキサン（１リツトル） に溶解させ、水（１リツトル）を用いて洗浄した。不溶性物質は廃棄した。無水 硫酸マグネシウムを用いて乾燥した後、溶媒をエバボレートした。蒸留により１ ４７ｇ（沸点１１０〜１１２℃、０．２００ｍｍ）の産物を回収した。 Ｎ−トリメチルシリル−ポロプロリンピナコールは、最初にヘキサメチルジシラ ザン（２０，０ｇ、８０．０ミリモル）を３０ｍ１のＴＨＦ中に溶解し、−７８ ℃まで冷却し、１．６２Ｎのｎ−ブチルリチウム（４９，４ｍｌ、８０．０ミリ モル）ヘキサン溶液を添加することにより調製した。反応液を室温まで徐々に加 温した。これを−７８℃に冷却し、４−ブロモ−１クロロブチルホウ素酸ピナコ ール（２３，９ｇ、８０．０ミリモル）を２０ｍ１のＴＨＦ中に添加した。反応 液を室温まで徐々に加温し、−晩攪拌した。溶媒をエバボレートして除去し、残 留物にドライヘキサン（４００ｍｌ）を添加し、窒素雰囲気下で濾過することに より沈殿物を除去した。ａ液をエバボレートし、残留物を蒸留して、１９．４ｇ （沸点６０〜６２℃、０．１〜０．０６ｍｍ）の目的産物を回収した。 Ｈ−ポロプロリン−ピナコール・ＭＣＩ（ポロプロリン−ピナコール・ＨＣｌ） は、Ｎ−）リメチルシリルーボロプロリンビナコール（１６，０ｇ、６１．７ミ リモル）を−７８℃まで冷却し、４ＮＨＣ１ニジオキサン（４６ｍｌ、１８５ミ リモル）を添加することによりｇ製した。混合物を一７８℃で３０分間、室温で １時間攪拌した。エバボレートし、残留物をエーテルと共に粉砕し、固体を回収 した。粗生産物をクロロホルム中に溶解し、濾過により不溶性物質を除去した。 溶液をエバボレートし、産物を酢酸エチルから結晶化させて、１１．１ｇ（沸点 １５６．５〜１５７℃）の目的産物を回収した。 ポロプロリンペプチドの合成 適切な側鎖保護基を有するＮ末端が保護されたペプチド及びアミノ酸をＨ−ポロ プロリン−ピナコールにカプリングさせるには、一般的な方法を使用することが できる。もし必要であれば、無水ＭＣＩ、ＨＢｒ、トリフルオロ酢酸または触媒 的水素添加により、側鎖保護基及びＮ−末端保護基を除去することができる。 これらの手法は、ペプチド合成に精通する者に既知のものである。 ペプチドカップリングには、＾ｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（ｊ、ｌｘ、　Ｄ ｅｎ、　ｓｏｔ、　８９：５０１２．１９８４）の無水物法が好ましい。再度図 １を参照すると、Ｎ末端が保護されたアミノ酸またはペプチドは、ペプチドをテ トラヒドロフランに溶解し、１当量のＮ−メチルモルホリンを添加することによ り調製する。溶液を一２０℃まで冷却し、１当量のイソブチルクロロギ酸を添加 する。５分後、この混合液及び１当量のトリエチルアミン（または他の立体構造 的に障害となる塩基）を、冷クロロホルムまたはテトラヒドロフランのいずれか に溶解したＨ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ピナコール溶液に添加する。 反応液を一２０℃で１時間、室温（２０℃）で１〜２時間攪拌する。溶媒をエバ ボレートして除去し、残留物を酢酸エチルに溶解する。この有機溶液を０．　２ ＯＮ塩酸、５％重炭酸ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄する。無水硫酸ナ トリウムを用いて有機相を乾燥し、濾過し、蒸発乾固（エバボレート）する。シ リカゲルクロマトグラフィーまたはＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＬＨ−２０を使用した ゲル浸透クロマトグラフィーのいすわかを用い、メタノールを溶媒として、生成 物を精製する。 以前の研究から、ピナコール保護基は、１ｊｓｌｌｔｔにおいて、生物学的実験 に先立ちリン酸緩衝液でプレインキュベージｄンすることにより除去できること が示されている０ｆｅｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ノ’、　ＩＩ／ｃ／、　ｌ’ ｌｔｗ、２５９：１５１０６．１９８４）、数種の他の方法を用いてもポロプロ リンを含むペプチドからピナコール基を除去し、最終産物を作製することができ る。最初に、ペプチドをジェタノールアミンで処理し、対応するジェタノールア ミンホウ素酸エステルを生成させる。これは、Ｋｅｔｔｎｅｒａｔ、ａｌ、（前 出）が記載した方法に従って酸水溶液またはスルホン酸置換したポリスチレン樹 脂で処理することにより容易に加水分解することができる。ピナコール及びビナ ンジオール保護基は、Ｋｉｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、　（、／、　ｉｅｄ、　ｔ ’ｋｉ、　２ｇ：１９１７　）が記載した方法に従って塩化メチレン中でＢＣｌ ３で処理することにより除去することができる。最後に、遊離のホウ酸を、Ｋｌ ｎｄｅｒｅｔ　ａｌ　、　（前出）が記載した方法に従７てＨＦ水溶液で処理す ることによりジフルオロホウ素誘導体（−Ｂ　Ｆ　２）に変換することができる 。 同様に、不活性溶媒中で遊離のホウ酸を種々のジヒドロキシ化合物（Ｎえば、Ｓ またはＮなどのへテロ原子を含む化合物）と反応させることにより、異なるエス テル基を導入することができる。 Ｈ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏの調製 Ｂｏａ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏは、上述の通りＮ−Ｂｏｃ保護されたアラニン と、上述の通りＦＡ製したＨ−ｂｏｒｏＰｒｏを混合し、無水カップリングさせ ること（こより調製し！＝。Ｈ−Ａｌ　ａ−ｂｏｒｏＰｒｏ　（Ａｌａ−ｂｏｒ ｏＰｒｏ）は、０℃において、３．５モルを超過する４Ｎ　ＭＣｌ−ジオキサン 中でＢｏｃ保護基を除去することにより調製した。カップリング反応及び脱保護 反応は標準的な化学反応により行なった。Ａｌ　ａ−ｂｏｒｏＰｒｏは、ＤＰ− ＩＶに対してナノモル範囲のＫ　を有する。Ｂｏｃ−保護されたＡｌａ−ｂｏｒ ｏＰｒｏは、ＤＰ−ＩＶに対して親和性がない。 Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ピナコールの２種のジアステレオマーであるＬ−Ａｌ ａ−Ｄ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ピナコール及びＬ−Ａｌａ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ピ ナコールは、２０％メタノールのシリカゲルクロマトグラフィを用い、酢酸エチ ルにより溶出することにより、部分的に分離することができる。ＮＭＲ分析によ り、最初の分画は一つの異性体を９５％含有していることが判明した。この分画 は、後の分画（同一の濃度）と比較して、ＤＰ−ＩＶをより強力に阻害するため 、この分画には、Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ　（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ピ ナコール）異性体が豊富に含有されているものと思われる。 １ｌ−Ａｌａ−ｂｏｒａＰｒｏのＤＰ−ＩＶインヒビタとしての大きな欠点は、 中性ｐＨ及び室温（２０〜・２５℃）において、水溶液中で約０．　５時間の半 減期で分解することである。、Ｖ離のＮ−末端アミノ基及びＣ−末端の官能基（ ジフルオロメチルケトン等）を有する多くのジペプチド誘導体は、分子内反応が 起こるため、同様に不安定である。アミノ基とＣ−末端官能基の間で６員環が形 成され、加水分解等の更なる反応に耐える。ＤＰ−ＥＶに結合したインヒビタは より安定性が高く、これは、分解は分子内反応により生じるという仮説と一致す る。 Ｈ−Ｐｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏはＨ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏよりも安定性が高い 。Ｈ−Ｐｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏのＤＰ−ＩＶに対するに、は約ｌＸｌ０−８であ す、室温（２０〜２５℃）において、水溶液中で約１．５時間の半減期で分解す る。確かにＨ−Ｐｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏの親和性はＨ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒ。 のものの１０分の１ではあるが、安定性が高いことは利点である。 上述のジペプチドの半減期が比較的短いため、本発明の阻害的化合物は、上記の 一般的な構造式で示したようなテトラペプチドまたはそれよりも長いペプチドと して形成されている。これらの阻害的化合物はＤＰ−Ｉｖの基質となり、ジペプ チドインヒビタＡ＝−ｂｏｒｏＰｒｏが生成する。これらのポリペプチドホウ素 酸は一般的に安定性が高く、ＤＰ−ＩＶの基質として作用してその後強力なりＰ −ＩＶインヒビタ源として作用するようないかなる標準的な手法によっても投与 することができる。これらの分子の利点は、インヒビタが活性ＤＰｉＶの近くで のみ放出されることである。これらのポリペプチドホウ素酸は、当業者によって 例えば、Ｍａｔｔｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１）ｒｚｉｉｏｍｌ、ｔｌ／１ｃｓ ３：１２Ｂ４．１９１１４）の方法などにより、混合酸無水物法により作製する ことができる。 ＤＰ−ＩＶに対する上述の阻害的化合物の阻害活性を試験することができるシス テムの例を、以下に記載する。これらのシステムそれぞれにおいて、Ｈ−Ａ　Ｉ ａ−ｂｏｒｏＰｒｏを例に用いて試験した。単にＨ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏを 阻害的化合物に置換することにより、これらの化合物を試験することができる。 ＤＰ−１ｖは、Ｂａｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　＜１ｃｌｉ　１１０／、　Ｊｅｔｌ 、　ｌ；ｔｙｙ、　３２：１５７．１９７４）及びＷ。 Ｉｆ　ｅｔ　ａｌ、Ｃ１ｃｌｉ　Ｉ／Ｉｏ／、　Ｊｅｔｌ、　にｅｒｒ、　３７ ：４Ｑ９．１９７ｇ）の方法によりブタ肝臓皮質から、また、Ｐｕ５ｃｈｅｌ　 ｅｔ　ａｌ、　ＣＦｗ、　、／、力”ｏｃｆｉｅｚ、　１２６：３５９．１９＋ １２）の方法によりヒト胎盤から精製する。Ｈ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏは両酵 素をナノモル範囲のＫ　で阻害する。 ヒト末梢血管単核細胞 ＰＨＡに誘導される、ヒト末梢血管単核細胞の増殖に対する、Ｈ−Ａｌａ−ｂｏ ｒｏＰｒｏの影響を試験した。ヒト末梢血管単核細胞は、健常人から提供され、 Ｆ　ｉｃｏ　ｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により回収した。細胞を ＲＰＭｌ　１６４０培地中で３回洗浄し、１×１０６の濃度でＲＰＭｌ中に再度 懸濁する。必要に応じて、１０％ヒト血清を使用した。 リンパ球の増殖応答は、３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。５×１０３ 個のＭＮＣ細胞（Ｆｏｒｄ　Ｉｎ　／／ｍｔｆｌｒｏｏｔ　（７／　！ｚｐｅｒ ｊｚｅｔｙ／ｚ／　／ｉｚｍｏ１０ｆｙ、　Ｗｅｉｒ、　■пB 、　ｌ１ｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｆｅｎｔｌＨｃ　Ｐｕｂｒｌｃａｔｌｏｎｓ、 　０ｘｆｏｒｄ、　１９７ｇ）を、丸底マイクロタイタープレートのウェル中に 分散させ、種々の濃度に希釈した抗原、マイトジェン、リンホカインまたは他の 試験すべき薬物の存在下または非存在下でインキユベートした。５％ＣＯを含有 する空気中で７２時間細胞を培養し、その後、３Ｈ−チミジン（０，５μＣＩ／ ウェル；２゜ＯＣｉ　／ｍＭ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　） を添加し、その６時間後に培養を終了した。細胞を、マルチプルオートマチック ハーベスタにより回収し、液体シンンチレーシ町ンカウントにより３Ｈ−チミジ ンの取り込みを計測した。３Ｈ−チミジンの取り込みは、インヒビタ非存在下で 得た対照値との比較により決定した。インヒビタは最終１度がＩ　Ｘ　１０−４ Ｍになるように添加したが、これより低濃度でも使用することができる。 ＨＩＶ遺伝子複製 ＨｌＶ−１複製に対するＨ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏの影響を、／／７　ｙｌｌ ｒｔで検討した。この実験の合理性は、Ｔ−細胞の活性化、ＩＬ−２生産、及び ＨＩＶ複製と、ＨＩＶ蛋白質の発現との間に関連性があることが報告されている ことに由来スル。ｆＦ１工ｌｆ、ＨＩＶ複製に関連する誘導シグナルには、マイ トジェン、抗原、リンホカイン、及びＮＦ−にＢなどの転写因子が含まれ、これ らはすべて、ＩＬ−２生産またはＴ−細胞の活性化、またはその両方の誘導に関 与していることが知られている。 本研究に使用される細胞系には、へ３．５細胞（ＣＤ４＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、及 びＣＤ３−の単球細胞系）及び末梢血管単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれる。Ａ３ ．５細胞細胞は、培養中、外因性の成長因子を添加しなくても連続的に増殖する 。ＰＢＭＣは／／７　ｙｌｌｒｔで増殖するためにはＩＬ−２を要求する。５Ｘ １０−’組織培養感染用ｆ１５０　（ＴＣＩＤ５０）／細胞の感染の多重度（ｍ ａｔ）で、Ａ３゜５細胞とＰＢＭＣ細胞の両方＋：ＨｒＶ−１ｉ　１　ＩＢを感 染サセタ。ＲＰＭＩ−１６４０中でインヒビタを希釈し、次いで、０．２２μｍ フィルターに通して濾過した。各実験の開始時、２４ウエルプレート中で１×１ ０６細胞／ウエルに、上述のｍｏｉでＨＩＶ−１−Ｉ　Ｉ　ＩＢを感染させた。 同時に、適切に希釈したインヒビタを添加した。培養はすべて、５％ＣＯ２，３ ７℃において、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ Ａｌ＆液、及び加熱により不活性化した２０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ −１６４０中で行なった。細胞数及び生存率は、トリバンブルー排除（トリバン ブルーエクスクルージジン）により決定した。培養上清を回収し、Ｅ　Ｌ　Ｉ　 Ｓ　Ａ　（ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＨＡ）によりＨＩＶ−１ ｐ２４抗原をアッセイした。新鮮な培地とインヒビタを毎日添加した。ＰＢＭＣ 培養については、ｔＶ−１血清陰性提供者から細胞を採取し、ＨＩＶ−１により 感染を行なう３日前にＰＨＡ−Ｐ　（Ｄｌｆｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｌｔ、　Ｍｌ； 　１０μｇ／ｍｌ）と１０％Ｉ　Ｌ　−２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｎｕｃｌｅｏｎｌ ｃｓ、　５１１ｙｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ、　ＭＤ　）により刺激した。全ての実験 に使用するＰＢＭＣ培養には、インヒビタを含まない非感染細胞及び感染細胞、 種々の濃度のインヒビタを含む非感染細胞、及び１μｍ　ｚｌｄｏｖｕｄｆｎｅ 　（アジドチミジン、ＡＺＴ）存在下での感染細胞が含まれる。 Ａ３．５については、Ｈ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏは、１μｍのＡＺＴに対する 抗ＨＩｖの効果と類似の様式でＨＩ’ｌ’を検出限界以下のレベルまで抑制する 。 ＰＢＭＣ細胞についても類似の結果が得られた。このことから、本発明のインヒ ビタは、抗ＨＩＶ効果を有する。細胞生存性実験により、これらのインヒビタは 、比較的高濃度（Ａ３．５細胞に対して１０’Ｍ）でありでも細胞毒性がないこ とが示された。 生物学的試料中でのＤＰ−ＩＶ活性の決定細胞及び組織に応じたＤＰ−ＫＶ活性 を決定できることが非常に望まれている。 例えば、ＤＰ−ＥＶの阻害レベルと、観察される生物学的効果（例えば細胞増殖 、やＩＬ−２生産）の間の相互関係を確立することができる。このような相互関 係は、生物学的効果がＤＰ−ＩＶの阻害によるものなのかどうかを決定する場合 に有用である。我々は、容品に入手可能な、ＤＰ−ＩＶの呈色性基質：Ｘ−Ｐｒ 。 −ｐ−ニトロアニリド及びＸ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−トリフルオロメチルコ ーマリン（Ａ　Ｆ　Ｃ）を用いて、再現性や信頼性のある結果を得られることを 確認している。ＡＦＣ基質は蛍光性なので、より高感度である。ＤＰ−ＩＶ活性 は、分光光度計を用いてｐ−ニトロアニリドの放出を４１０ｎＭで測定するか、 またはＸ−Ｐ　ｒ　ｏ−ＡＦ　Ｃｍ導体を用いて５０５ｎＭで蛍光を測定する。 インヒビタ存在下で活性が減少するため、阻害活性は簡単な試験により測定する ことができる。 ＤＰ−ＩＶ阻害におけるインヒビタの立体化学の影響以下に記載する実験は、Ａ ｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ及びＰｒｏ−ｂｏｒｏＰｒ。 が、ナノモル範囲のに、値を有する強力なりＰ−ＩＶインヒビタであることを示 工 している。さらに、Ｌ、　Ｌ型のＰｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏは、Ｌ、　Ｄ型のＰｒ ｏ−ｂｏｒｏＰｒｏよりもはるかに強力なりＰ−ＩＶインヒビタであることも示 された。 ｖｏｌｆ　ｅｔ　ａｌ、（）乙７１１！ｉｏ、　、＆、　ｊｅｅｒ、　３７：４ ０９．１９７２）の方法に従ってブタ肝臓から単離したＤＰ−ＩＶの活性を、Ａ ｌａ−ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを基質として測定した。簡単に記載すると、 反応液は合計１゜Ｏｍｌの、５０μｍｏｌＨｅｐｅｓナトリウム（ｐＨ７，８） 、１０μｍｏｌ　Ａｌａ−ｐｒｏ−ｐ−二トロアニリド、６ミリユニツトのＤＰ −ＩＶ、及び２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルホルムアミドからなる。酵素を添 加して反応を開始し、２５℃での反応速度をβノ定した。 ３〜５種の異なる濃度のＡｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏｓ　Ｐｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏｓ ｂｏｒｏＰｒｏ及びＡ’−Ｂｏｃ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏにおいて、ＤＰ−Ｉ Ｖが触媒するＡｌａ−ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドの加水分解速度を測定した。 ある場合においては、初期速度は直線的ではなかった。反応速度は１０分以降に 直線になった。基質を添加する１０分前に酵素をインヒビタと共に予めインキユ ベー　トしておくことにより、この直線部分を２連で測定することができる。表 １は、直線範囲内でのに、の測定結果を示している。 表１：ＤＰ−ＩＶの数種のインヒビタの阻害定数ｂｏｒｏＰｒｏ　１１０，００ ０ Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ　２ Ｐｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏ　３ ９阻害は認められなかった Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏは、２×１０−９Ｍのに１値を有する有力なりＰ−ＩＶ インヒビタであった（表１）。このインヒビタのＮ−末端をブロックする（例え ばＮ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏＨ表１）と、阻害効果が失われる。この ことから、遊離の正に荷電したアミノ基が、酵素の認識及び結合に必須であると 思われる。ｐｙ□−ｔ）ｏｒｏＰｒｏのＫ、が３Ｘ１０−９Ｍであることは、ア ラニンメチル基の代わりにプロリン側鎖に置換すると同時に、Ｎ−末端のアミノ 官能基の代わりにイミノ基に置換してもＤＰ−ＩＶにより認識されることを示し ている。このことから、Ｓ２特異性サブサイトはさほど限定的なものではないこ とが示される。ＤＰ−ＩＶはほとんどすべてのＮ−末端アミノ酸を許容するが、 このアミノ酸と酵素との間の相互作用は結合に決定的な影響を与える。これは、 ＡＩａ−ｂｏｒｏＰｒｏまたはＰｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏと比較して、ｂｏｒｏＰ ｒ。 では親和性が１０〜１０６減少していることから実証される（表１）。 表１に示した阻害実験は、ブタ肝臓から単離したＤＰ−ＩＶに対して行なった。 Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ及びＰｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏは、ヒト胎盤由来のＤＰ− ！■に対しても同様の高い阻害活性を示した。 上述の実験に使用したＡｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ及びＰｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏは、 Ａｌｇ及びＰｒｏは共にＬ−異性体だが、ｂｏｒｏＰｒｏ部分がＤ型及びＬ型の 両方を含むラセミ混合物であった。 高速液体り０７トグラフイ　（ＨＰＬＣ）を用いてＬ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｄ−ｂ　ｏ 　ｒ　ｏＰｒＯをＬ−Ｐｒｏ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏから分離することができるｏ 　４．６ｍｍｘ２５０ｒｎｍ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃｌ８（５μ粒子）カラム を用い、２緩衝液系（緩衝液Ａは０．１％　ＴＦＡを含有する１００％　Ｈ２Ｏ 、緩衝液Ｂは７０％　ＣＨＣＮ、３０％　Ｈ２Ｏ，０，８６％　ＴＦＡ）を使用 して分離を行なうことができる。０〜５分は５％Ｂ及び９５％Ａ、５〜２５分は ５％〜１００％　Ｂを使用する。まず初めにり、Ｌ異性体が約７分で出現し、次 いで約１０分にり、Ｄ異性体が出現する。ＮＭＲ及びマススペクトル分析により 両方の化合物がＰｒｏ−ｂｏｒｏＰｒｏであることを確認した。最初にＨＰＬＣ カラムを通過した精製異性体を再度クロマトグラフィにかけることにより、各異 性体が９９〜６％の純度にまで精製されていることが示された。Ｌ−Ａｌ　ａ− Ｄ−ｂｏｒｏＰｒｏをＬ−Ａ、１ａ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏから分離したり、他の インヒビタのＤ−ｂｏｒｏＰｒｏ型をＬ−ｂｏｒｏＰｒｏ型から分離する場合に も同様に高速液体クロマトグラフィ　（ＨＰＬＣ）を使用することができる。　 Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ及びＬ−Ｐｒｏ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏをＤＰ− ＩＶ阻害アッセイに一興性体はＤＰ−ＩＶに対してり、Ｄ−異性体よりもはるか に有効なインヒビタである。さらに、本発明のＤＰ−ＩＶインヒビタのすべての アミノ酸残基はＤ−異性体であるよりもＬ−異性体であるほうが好ましい。 使用 阻害的化合物は単独でも、薬理学的に許容可能な担体または希釈液と組み合わせ ても投与することができる。 上述の阻害的化合物は、広範囲の疾患の治療に使用することができる。例えば、 自己免疫疾患、Ｔ細胞活性に依存する疾患などである。ＤＰ−ＩＶはこのような 自己免疫疾患において役割を演じ、ＤＰ−ＩＶ活性を阻害することにより疾患の 進行を調節することができる。このような疾患には関節炎、移植器官の拒絶反応 及びＳＬＥやＡＩＤＳが含まれる。本発明の阻害的化合物を哺乳類に投与（例え ば、経口的、局所的、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、非経口的、鼻腔内注入 、または坐剤として）すると、疾患と戦うために、例えば、その哺乳類の免疫系 の能力を増大させる。 ＤＰ−ＩＶのインヒビタはＩＬ−２生産を抑制することができるため、！Ｌ−２ 生産が変化する疾患の治療にも、これらのインヒビタを使用することができる。 これらのインヒビタは成長ホルモン放出因子の異化を遅らせることもでき、また 、アメーバや微生物病原体のＤＰ−ＩＶ活性を阻害することにより免疫系をより 効果的に機能させることもできる。 阻害的化合物または組成物は単独でも、幾つかを組み合わせても、または他の治 療薬と組み合わせても投与することができる。投与量は、１ｋｇあたり１日１〜 ５００ｍｇの範囲内であると思われる。 他の実施例 他の実施例は次に記載する特許請求の範囲内に含まれる。例えば、Ａｌａ−ｂｏ ｒｏＰｒｏの構造を模倣した他のインヒビタを作製することができる。Ａｌａ− ｂｏｒｏＰｒｏを含む、このようなインヒビタの例を図２に示す。これらのイン ヒビタは一般的にｂｏｒｏＰｒｏ基または上述の発明の要旨に記載されたそれと 同等のもの、および正に荷電したアミノ基を有する。インヒビタは、アミノ基と ｂｏｒｏＰｒｏ基の相互作用が最小限になるように設計されているため、ｐＨ７ ，０において環状構造を形成しない。これらのインヒビタはＤＰ−ＥＶと相互作 用し／または結合し、これにより正常な基質に対するＤＰ−ＩＶ活性を減少させ る。これらのインヒビタは、当業者に熟知された方法で合成される。 ＦＩＧ、１ ４−ブロモ−１−クロロブチル　ボロナート　ピナコール４−ブロモ−１［（ビ ストリメチルシリル）アミノコブチル　ボロナート　ピナコール　１Ｒ＝Ｈ，Ｏ Ｉ３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／　Ａ６１Ｋ　３８１ ５５　ＡＢＡ （７２）発明者　ブラウト　アンドリュー　ジ−アメリカ合衆国　マサチューセ ッツ州　ボストン　ワシントン　ストリート　７５０Ｉ （７２）発明者　フレントケ　ジョージ　アールアメリカ合衆国　マサチューセ ッツ州　ボストン　ハリソン　アベニュー　１３６

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の構造を有する、ＤＰ−ＩＶインヒビタ、▲数式、化学式、表等があり ます▼ ここで、ｍは０〜１０（０及び１０を含む）の整数である；Ａ及びＡ′はＬ−ア ミノ酸残基であり、繰り返されているカッコ内のＡは異なるアミノ酸残基でよい ；Ｃに結合したＢはＬ−立体構造である；ＡとＮ、Ａ、Ｃの間、及びＡとＮの間 の結合はペプチド結合である；各Ｘ１及びＸ２はそれぞれ水酸基、または生理的 ＰＨにおいて水酸基に加水分解され得る基である。
2. ２．Ａ及びＡ′がそれぞれ別個にプロリンまたはアラニン残基であることを特徴 とする請求項１に記載のインヒビタ。
3. ３．ｍが０であることを特徴とする請求項１に記載のインヒビタ。
4. ４．Ｘ１及びＸ２が水酸基であることを特徴とする請求項１に記載のインヒビタ 。
5. ５．前記インヒビタがＬ−Ａｌａ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏであることを特徴とする 請求項１に記載のインヒビタ。
6. ６．前記インヒビタがＬ−Ｐｒｏ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏであることを特徴とする 請求項１に記載のインヒビタ。