DD270382A1 - Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung von dipeptidylpeptidase iv mittels dipeptidhydraziden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidase IV (DP IV), das dadurch gekennzeichnet ist, dass vorzugsweise das Substrat Glycyl-L-Prolin-hydrazid die Bestimmung von Aktivitaeten der DP IV sowohl mit einer manuellen Zweipunktmethode als auch mit einem automatisiertem Verfahren nach dem "flow stream"-Prinzip mit hoher Spezifitaet und analytischer sowie diagnostischer Sensitivitaet ermoeglicht. Das vorzugsweise eingesetzte Substrat Glycyl-L-Prolin-Hydrazid wird durch DP IV in einem p H-Bereich zwischen 7,0 und 10,0 spezifisch zu Glycyl-L-Prolin und Hydrazin gespalten. Letzteres wird mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholisch-salzsaurer Loesung zu einem Farbstoff umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt. Die Erfindung ist fuer die theoretische methodische und klinische Enzymologie und fuer die medizinische Diagnostik und Verlaufsbeobachtung spezieller Krankheiten, wie z. B. bestimmter Krebserkrankungen und Immunmangelsyndrome von Bedeutung.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidase IV (OP IV) (Ec 3.4.14.5) in menschlichem und tierischem Untersuchungsmaterial zur Lösung biochemisch-wissenschaftlicher und medizinischdiagnostischer Aufgaben.
Die Bestimmung von DP IV-Aktivitäten in Körperflüssigkeiten vornehmlich als Marker für TM-Lymphozyten gewinnt zunehmend an Bedeutung in der enzymologischen Differentialdiagnostik von Erkrankungen mit lymphozytärer Reaktion und von Immunmangelsyndromen verschiedener Ätiopathogenese.
Die Anwendung der DP IV in der biochemischen Grundlagenforschung betrifft die Abklärung enzymkinetischer Probleme und die Stellung des Enzyms innerhalb proteolytischer Prozesse unter Freisetzung oder Abbau pharmakologisch und physiologisch aktiver Peptide.
Die Erfindung ist damit für die biochemischen und medizinischen Wissenschaften, für Forschung und medizinische Betreuung, für Diagnostik und Therapiekontrolle von Interesse und Bedeutung.
Zur Bestimmung von Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV wurden bisher ausschließlich Methoden auf der Grundlage der Substrate Glycyl-L-Prolin-4-nitroanilid, L-Alanyl-L-Prolin-4-nitroanilid bzw. der entsprechenden ß-Naphthylamide und Coumarinamide eingesetzt (M.Harada et al. Biochim. Biophys. Acta 705,288 (1982), Biochim. Biophys. Acta 576,280 [1979], K. Imai et al. J. Biochem. [Tokyo] 93,431 [1983]). Die Verfahren mit Verwendung dieser Substrate haben Nachteile:
— Die Methode unter Verwendung von Gly-Pro-p-nitroanilid besitzt aufgrund des vergleichsweise niedrigen molaren Extinktionskoeffizienten der enzymatisch freigesetzten und zu bestimmenden chromogenen Komponente p-Nitroanilin eine geringe analytische und dadurch bedingte eingeschränkte diagnostische Sensitivität.
— Alle bisherigen Verfahren erfordern Photometer mit kinetischer Registrierung und sind daher aufgrund der damit verbundenen Investitionskosten nicht in allen medizinischen Laboratorien unter ökonomischen Aspekten praktikabel. Dieser Aspekt gewinnt besondere Relevanz bei Einsatz des Verfahrens in der Vorfelddiagnostik.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Entwicklung einer einfachen manuellen bzw. nach dem Fließsystem automatisierbaren und in allen medizinischen Laboratorien praktikablen kolorimetrischen Methode zur einzelnen und massenweisen Bestimmung von Aktivitäten der DP IV in Körperflüssigkeiten zur Früherkennung, Differentialdiagnostik und Verlaufskontrolle von bestimmten Erkrankungen mit Störungen im Immunsystem mit höherer diagnostischer Sensitivität.
Die Erfindung ist vorzucjveise gedacht als Massen-Screening-Verfahren zur enzymologischen Erfassung von Immunmangelsyndromen, insbesondere von Acquired immuno = deficiency syndrome (AIDS). Die Erfindung dfent damit der Erfindung von Qualität und Wirksamkeit in der medizinischen Betreuung in ihrer Einheit von Prophylaxe, Diagnostik und Therapie und besitzt damit hohe gesundheitspolitische Bedeutung.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für die kolorimetrische Bestimmung von DP IV Substrate zu entwickeln, welche mit hoher enzymatischer Spezifität und analytischer und diagnostischer Sensitivität die Ermittlung der Enzymaktivitäten mittels einfacher Methodik unter Verwendung einer photometrischen Grundausstattung in allan medizinischen Laboratorien bzw. mit einem automatisierten Verfahren nach dem »flow-stream"-Prinzip bei Massenunterr jchungen gestattet. Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung der DP IV-Aktivität oin Substrat der Forme'. I
R-Prc-NH-NH2 , (I)
wobei R für eine proteinogene Aminosäure steht, vorzugsweise aber Glycyl-L-Prolin-hydrazid oder L-Alanyl-L-Prolinhydrazid, eingesetzt.
Ihre Darstellung ist dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel Il
Y-R-Pro-X , (II)
worin R für eine proteinogene Aminosäure, vorzugsweise für Glycin- oder L-Alanin, X für eine Estergruppierung bevorzugt Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder Phenacylester und Y (ür Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl.a.a'-Dimothylbenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder vorzugsweise für tert. Butyloxycarbonyl stehen durch Verknüpfung von Y-K-OH mit H-Pro-X nach den in der Peptidchemie üblichen Techniken, vorzugsweise nach der Mischü.nhydrid-Methode mittels Chlorkohlensäureisobutylester auibaut, durch Umsetzung mit alkoholischer Hydrazinlösung in /erbindungen der Formel III
Y-R-PrO-NH-NH2 (III)
mit R und Y in der obigen Definition überführt, aus denen man durch aeidolytische oder hydrogenolytische Abspaltung des Restes Y nach den in der Peptidchemie für diese Aminoschutzgruppen üblichen Deblc :kierungsbedingungen das entsprechende Substrat gemäß Formel I erhält, das vorzugsweise als Salz insbesondere als Dihydrochlorid für die kolorimetrische DP IV-Bestimmung eingesetzt wird.
Das entsprechende erfindungsgemäß dargestellte Substrat entsprechend Formel I zeichnet sich dadurch aus, daß es durch DP IV zu R-Pro (R steht für eine proteinogene Aminosäure), vorzugsweise aber Gly-Pro oder Ala-Pro und Hydrazin in einem pH-Bereich von 7,0 bis 10,0, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 gespalten wird, wobei das enzymatisch f reige setzte Hydrazin bei Zugabe von p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholischersalzsaurer Lösung unter gleichzeitigem Abbruch der Enzymreaktion zu einem orangeroten Farbsalz umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt wird.
Die bei 455mm gemessene Extinktion des Farbstoffes ist der DP IV-Aktivität direkt proportional.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.
Abkürzungen für Aminosäure- und Peptidderivate entsprechend IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol.
Chem. 247,977 (1972).
1. Darstellung von Glycyl-L-prolin-hydrazid · 2Hydrochlorld
8,8g tert. Butyloxycarbonyl (Boc)-glycin in 50ml Tetrahydrofuran werden bei -150C unter Rühren nacheinander mit 6,4ml N-Methylmorpholin und 6,5ml Chlorkohlensäureisobutylester versetzt und nach 8 Minuten 6,4ml N-Methylmorpholin und sofort danach 8,3g L-Prolin-methylester hydrochlorid in 30ml Tetrahydrofuran und einigen Tropfen Wasser hinzugefügt. Der Ansatz wird 1 Stunde bei -150C und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach dampft man das Lösungsmittel i.Vak. ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit Wasser, gesättigter NaHCO3-Lcsung, Wasser, 5%iger KHSO4-Lösung und Wasser. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und der Essigester i.Vak. verdampft. IEs werden 11,2g Boc-G!y-Pro-methylester erhalten. Der geschützte Dipeptidmethylesterwird in 50ml Ethanol gelöst und mit 10 ml Hydrazinhydrat versetzt.
Nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur läßt man das Lösungsmittel i.Vak. verdampfen. Das erhaltene Produkt Boc-Gly-PrO-NH-NH2 wird mit Ether verrieben, abgesaugt, sorgfältig im Hochvakuum über Schwefelsäure getrocknet (Schmp. 183 bis 187°C),[a)o' = -63,6° = 0,5 in Methanol) und zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 120ml 1,1 η HCI in Essigsäure behandelt. Der Ansatz wird i. Vak. eingeengt, der Rückstand mit Ether verrieben, abgesaugt und i.Vak.
getrocknet.
Ausbeute: 10,7g (60%d.Th.)
Schmp. 198-2010C
[aß1 = -68,6°c = 0,5 in Methanol
Dünnschichtchromatographisch einheitlich auf Kieselgelfolie Silufoi UV2S4, CSSR, in 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30:20:6:24), 1-Butanol-Essigsäure-Wasser-Essigester (20:20:20:20) und 2-Butanol-AmeisenEäure-Wasser (75:13,5:11,5)
2. Kolorlmetrische Bestimmung der DP IV-Aktlvitftt
0,500 ml Substrat-Puffer-Gemisch, bestehend aus 16,32mmol/l Gly-Pro-Hydrazid · 2HCI in Diäthanolamin-HCI-Puffer (200 mmol/l) vom pH 9,1, werden auf 370C temperiert und mit 0,OkO ml Serum für eine Zeit von 15 min inkubiert. Nach der Inkubation werden 5,00ml Farbreagens, bestehend aus 1 Volumenteil einer Lösung von 4g Dimethylaminobenzaidehyd in 100ml 96%igem Ethanol oder Methanol und 17 Volumentollen 0,1 N Salzsäure, zugegeben und die Ansätze nach 30 min Farbentwicklung bei 455 nm gegen einen Leerwert gemessen.
Dieser Leerwert wird wie folgt behandelt. 0,500ml des Substrat-Puffer-Gemisches werden 15min bei 370C inkubiert, danach mit 5,00ml Farbreagens und anschließend mit 0,020ml Serum versetzt.
Aus den Extinktionsdifferenzon wird über einen Hydrazin-Vergieichsansatz oder den molaren Extinktionskoeffizienten die Enzymaktivität in nmol/(s · I) errechnet.
Claims (4)
1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidaso IV (DP IV) in menschlichem und tierischem Untersuchungsmaterial, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung ein Substrat der Formel R-PrO-NH-NH2, worin R für eine proteinogene Aminosäure steht, vorzugsweise aber Glycyl-L-Prolin-hydrazid oder L-Alanyl-L-Prolin-hydrazid eingesetzt wird, das durch DP IV in einem pH-Bereich von 7,0-10,0 spezifisch zu R-Pro (R in der obigen Definition), vorzugsweise aber zu Glycyl-L-Prolin bzw. L-Alanyl-L-Prolin und Hydrazin gespalten wird und das enzymatisch freigesetzte Hydrazin mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholischer salzsaurer Lösung unter gleichzeitigem Abbruch der Enzymreaktion zu einem Farbstoff umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das entsprechende Substrat der Formel R-PrO-NH-NH2, worin R für eine proteinogene Aminosäure, vorzugsweise für Glycin oder L-Alanin, steht, aus Y-R-Pro-X, worin R wie oben definiert ist, X für eine Estergruppierung, vorzugsweise Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder Phenacylester und Y für Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonvl, a,a'-Dimethylbenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder vorzugsweise tert. Butyloxycarbonyl stehen, aufgebaut, durch Verknüpfung von Y-R-OH mit Pro-X nach den in der Peptidchemie üblichen Techniken durch Hydrazinolyse und anschließender acidolytischer oder hydrogenolytischer Abspaltung des Restes Y nach den in der Peptidchemie für diese Aminoschutzgruppen üblichen Deblockierungsbedingungen erhalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das jeweils verwendete Substrat in Form eines Salzes, vorzugsweise als Dihydrochlorid eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß sowohl eine Vorfeld- und Differentialdiagnostik als auch eine Verlaufs- und Therapiekontrolle von Krankheiten, vorzugsweise bestimmter maligner Erkrankungen und Immunmangelsyndrome, wie z. B. AIDS, nach einem einfachen Verfahren möglich ist.
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| DD (1) | DD270382A1 (de) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6100234A (en) * | 1997-05-07 | 2000-08-08 | Tufts University | Treatment of HIV |
| EP1050540A2 (de) * | 1991-10-22 | 2000-11-08 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Inhibitoren der Dipeptidyl-Aminopeptidase vom Typ IV |
| US6692753B2 (en) | 1997-05-07 | 2004-02-17 | Trustees Of Tufts College | Potentiation of the immune response |
| US6703238B2 (en) | 1997-09-29 | 2004-03-09 | Point Therapeutics, Inc. | Methods for expanding antigen-specific T cells |
| US6770628B2 (en) | 1998-05-04 | 2004-08-03 | Point Therapeutics, Inc. | Hematopoietic stimulation |
-
1986
- 1986-10-31 DD DD29578986A patent/DD270382A1/de not_active IP Right Cessation
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| EP1050540A3 (de) * | 1991-10-22 | 2002-01-02 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Inhibitoren der Dipeptidyl-Aminopeptidase vom Typ IV |
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