DD270382A1 - A process for the colorimetric determination of dipeptidyl peptidase IV by dipeptidhydraziden - Google Patents

A process for the colorimetric determination of dipeptidyl peptidase IV by dipeptidhydraziden Download PDF

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Univ Halle Wittenberg
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidase IV (DP IV), das dadurch gekennzeichnet ist, dass vorzugsweise das Substrat Glycyl-L-Prolin-hydrazid die Bestimmung von Aktivitaeten der DP IV sowohl mit einer manuellen Zweipunktmethode als auch mit einem automatisiertem Verfahren nach dem "flow stream"-Prinzip mit hoher Spezifitaet und analytischer sowie diagnostischer Sensitivitaet ermoeglicht. The invention relates to a method for the colorimetric determination of dipeptidyl peptidase IV (DP IV), which is characterized in that, preferably, the substrate glycyl-L-proline-hydrazide the determination of activities of the DP IV with both a manual two-point method as well as an automated procedure ABLE after the "flow stream" principle with high specificity and analytical and diagnostic sensitivity. Das vorzugsweise eingesetzte Substrat Glycyl-L-Prolin-Hydrazid wird durch DP IV in einem p H-Bereich zwischen 7,0 und 10,0 spezifisch zu Glycyl-L-Prolin und Hydrazin gespalten. The substrate preferably used glycyl-L-proline-hydrazide is cleaved by DP IV in a p H range from 7.0 to 10.0 specific to glycyl-L-proline and hydrazine. Letzteres wird mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholisch-salzsaurer Loesung zu einem Farbstoff umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt. The latter is reacted with p-dimethylaminobenzaldehyde in alcoholic hydrochloric acid solution to form a dye and determined colorimetrically. Die Erfindung ist fuer die theoretische methodische und klinische Enzymologie und fuer die medizinische Diagnostik und Verlaufsbeobachtung spezieller Krankheiten, wie z. The invention is for the theoretical methodological and clinical enzymology and for medical diagnosis and course monitoring of specific diseases, such. B. bestimmter Krebserkrankungen und Immunmangelsyndrome von Bedeutung. As certain cancers and immune deficiency syndromes important.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung Field of the Invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidase IV (OP IV) (Ec 3.4.14.5) in menschlichem und tierischem Untersuchungsmaterial zur Lösung biochemisch-wissenschaftlicher und medizinischdiagnostischer Aufgaben. The invention relates to a method for the colorimetric determination of dipeptidyl peptidase IV (OP IV) (EC 3.4.14.5) in human and animal tissue to the solution biochemical research and medical diagnostic tasks.

Die Bestimmung von DP IV-Aktivitäten in Körperflüssigkeiten vornehmlich als Marker für TM-Lymphozyten gewinnt zunehmend an Bedeutung in der enzymologischen Differentialdiagnostik von Erkrankungen mit lymphozytärer Reaktion und von Immunmangelsyndromen verschiedener Ätiopathogenese. Determination of DP IV Activities in body fluids primarily as a marker for TM-lymphocytes is becoming increasingly important in the enzymological differential diagnosis of diseases with lymphocytic response and immune deficiency syndromes of different etiopathogenesis.

Die Anwendung der DP IV in der biochemischen Grundlagenforschung betrifft die Abklärung enzymkinetischer Probleme und die Stellung des Enzyms innerhalb proteolytischer Prozesse unter Freisetzung oder Abbau pharmakologisch und physiologisch aktiver Peptide. The use of DP IV in biochemical basic research concerns the clarification enzymkinetischer problems and the position of the enzyme in proteolytic processes to release or degradation pharmacologically and physiologically active peptides.

Die Erfindung ist damit für die biochemischen und medizinischen Wissenschaften, für Forschung und medizinische Betreuung, für Diagnostik und Therapiekontrolle von Interesse und Bedeutung. The invention is thus for the biochemical and medical sciences, research and medical care for diagnosis and therapy control of interest and importance.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Characteristic of the known technical solutions

Zur Bestimmung von Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV wurden bisher ausschließlich Methoden auf der Grundlage der Substrate Glycyl-L-Prolin-4-nitroanilid, L-Alanyl-L-Prolin-4-nitroanilid bzw. der entsprechenden ß-Naphthylamide und Coumarinamide eingesetzt (M.Harada et al. Biochim. Biophys. Acta 705,288 (1982), Biochim. Biophys. Acta 576,280 [1979], K. Imai et al. J. Biochem. [Tokyo] 93,431 [1983]). heretofore for the determination of activity of dipeptidyl peptidase IV exclusively methods based on the substrates glycyl-L-proline-4-nitroanilide, L-alanyl-L-proline-4-nitroanilide or the corresponding ß-Naphthylamide and Coumarinamide used (M. Harada et al. Biochim. Biophys. Acta 705.288 (1982), Biochim. Biophys. Acta 576.280 [1979] K. Imai et al. J. Biochem. [Tokyo] 93.431 [1983]). Die Verfahren mit Verwendung dieser Substrate haben Nachteile: The method of using these substrates have drawbacks:

— Die Methode unter Verwendung von Gly-Pro-p-nitroanilid besitzt aufgrund des vergleichsweise niedrigen molaren Extinktionskoeffizienten der enzymatisch freigesetzten und zu bestimmenden chromogenen Komponente p-Nitroanilin eine geringe analytische und dadurch bedingte eingeschränkte diagnostische Sensitivität. - due to the relatively low molar extinction coefficient of the enzymatically liberated and chromogenic component to be determined p-nitroaniline The method using Gly-Pro-p-nitroanilide has a low analytical and consequent limited diagnostic sensitivity.

— Alle bisherigen Verfahren erfordern Photometer mit kinetischer Registrierung und sind daher aufgrund der damit verbundenen Investitionskosten nicht in allen medizinischen Laboratorien unter ökonomischen Aspekten praktikabel. - All previous methods require photometer with kinetic registry and are not in all medical laboratories, therefore, because of the associated investment costs in economic terms practicable. Dieser Aspekt gewinnt besondere Relevanz bei Einsatz des Verfahrens in der Vorfelddiagnostik. This is becoming particularly relevant when using the process in the run-up diagnostics.

Ziel der Erfindung OBJECT OF THE INVENTION

Das Ziel der Erfindung besteht in der Entwicklung einer einfachen manuellen bzw. nach dem Fließsystem automatisierbaren und in allen medizinischen Laboratorien praktikablen kolorimetrischen Methode zur einzelnen und massenweisen Bestimmung von Aktivitäten der DP IV in Körperflüssigkeiten zur Früherkennung, Differentialdiagnostik und Verlaufskontrolle von bestimmten Erkrankungen mit Störungen im Immunsystem mit höherer diagnostischer Sensitivität. The object of the invention is to develop a simple manual or after the flow system can be automated and all medical laboratories workable colorimetric method for individual and mass fractional determination of activities of DP IV in body fluids for the early detection, differential diagnosis and monitoring of certain diseases with immune system disorders higher diagnostic sensitivity.

Die Erfindung ist vorzucjveise gedacht als Massen-Screening-Verfahren zur enzymologischen Erfassung von Immunmangelsyndromen, insbesondere von Acquired immuno = deficiency syndrome (AIDS). The invention is vorzucjveise intended as a mass screening method for the detection of enzymological immunodeficiency syndromes, in particular of the Acquired Immuno = deficiency syndrome (AIDS). Die Erfindung dfent damit der Erfindung von Qualität und Wirksamkeit in der medizinischen Betreuung in ihrer Einheit von Prophylaxe, Diagnostik und Therapie und besitzt damit hohe gesundheitspolitische Bedeutung. The invention thus dfent the invention of quality and effectiveness in providing care in their unity of prevention, diagnosis and treatment and thus has a high public health importance.

Darlegung des Wesens der Erfindung Principle of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für die kolorimetrische Bestimmung von DP IV Substrate zu entwickeln, welche mit hoher enzymatischer Spezifität und analytischer und diagnostischer Sensitivität die Ermittlung der Enzymaktivitäten mittels einfacher Methodik unter Verwendung einer photometrischen Grundausstattung in allan medizinischen Laboratorien bzw. mit einem automatisierten Verfahren nach dem »flow-stream"-Prinzip bei Massenunterr jchungen gestattet. Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung der DP IV-Aktivität oin Substrat der Forme'. I The invention has for its object to develop IV substrates for the colorimetric determination of DP, which with high enzymatic specificity and analytical and diagnostic sensitivity determination of the enzyme activities by means of simple method using a photometric basic equipment in Allan medical laboratories or with an automated procedure jchungen permitted after the "flow stream" principle at Massenunterr. according to the invention IV activity is to determine the DP oin substrate of the Forme '. I

R-Prc-NH-NH 2 , (I) R-Prc-NH-NH 2, (I)

wobei R für eine proteinogene Aminosäure steht, vorzugsweise aber Glycyl-L-Prolin-hydrazid oder L-Alanyl-L-Prolinhydrazid, eingesetzt. wherein R is a proteinogenic amino acid, but preferably glycyl-L-Prolinhydrazid or L-alanyl-L-Prolinhydrazid used.

Ihre Darstellung ist dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel Il Their preparation is characterized in that compounds of the formula II

YR-Pro-X , (II) YR-Pro-X, (II)

worin R für eine proteinogene Aminosäure, vorzugsweise für Glycin- oder L-Alanin, X für eine Estergruppierung bevorzugt Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder Phenacylester und Y (ür Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl.a.a'-Dimothylbenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder vorzugsweise für tert. Butyloxycarbonyl stehen durch Verknüpfung von YK-OH mit H-Pro-X nach den in der Peptidchemie üblichen Techniken, vorzugsweise nach der Mischü.nhydrid-Methode mittels Chlorkohlensäureisobutylester auibaut, durch Umsetzung mit alkoholischer Hydrazinlösung in /erbindungen der Formel III wherein R is a proteinogenic amino acid, preferably glycine or L-alanine, X is a Estergruppierung preferably methyl, ethyl, benzyl or phenacyl, and Y (EBU benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl.a.a'-Dimothylbenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfenyl, or preferably tert. butyloxycarbonyl stand by linking YK-OH with H-Pro-X by customary in peptide chemistry techniques, preferably auibaut after Mischü.nhydrid method using isobutyl chlorocarbonate, by reaction with alcoholic hydrazine in / onnectivity of formula III

YR-PrO-NH-NH 2 (III) YR-PrO-NH-NH 2 (III)

mit R und Y in der obigen Definition überführt, aus denen man durch aeidolytische oder hydrogenolytische Abspaltung des Restes Y nach den in der Peptidchemie für diese Aminoschutzgruppen üblichen Deblc :kierungsbedingungen das entsprechende Substrat gemäß Formel I erhält, das vorzugsweise als Salz insbesondere als Dihydrochlorid für die kolorimetrische DP IV-Bestimmung eingesetzt wird. converted with R and Y in the above definition, from which one by aeidolytische or hydrogenolytic removal of the radical Y in accordance with the usual in peptide chemistry for this amino Deblc: kierungsbedingungen the corresponding substrate of the formula I obtained, preferably as a salt, in particular as the dihydrochloride for the DP IV colorimetric determination is used.

Das entsprechende erfindungsgemäß dargestellte Substrat entsprechend Formel I zeichnet sich dadurch aus, daß es durch DP IV zu R-Pro (R steht für eine proteinogene Aminosäure), vorzugsweise aber Gly-Pro oder Ala-Pro und Hydrazin in einem pH-Bereich von 7,0 bis 10,0, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 gespalten wird, wobei das enzymatisch f reige setzte Hydrazin bei Zugabe von p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholischersalzsaurer Lösung unter gleichzeitigem Abbruch der Enzymreaktion zu einem orangeroten Farbsalz umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt wird. The corresponding substrate according to the invention illustrated in accordance with formula I is characterized in that by DP IV R-Pro (R is a proteinogenic amino acid), but preferably Gly-Pro or Ala-Pro and hydrazine in a pH range of 7, 0 to 10.0, preferably between 7.5 and 8.5 is cleaved, wherein the enzymatically f reige sat hydrazine with the addition of p-dimethylaminobenzaldehyde in alcoholic hydrochloric acid solution under the simultaneous termination of the enzyme reaction converted to a red-orange dye salt and determined colorimetrically.

Die bei 455mm gemessene Extinktion des Farbstoffes ist der DP IV-Aktivität direkt proportional. The measured absorbance at 455mm of the dye is the DP IV-activity directly proportional.

Ausführungsbeispiele embodiments

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. The invention is explained below with reference to embodiments.

Abkürzungen für Aminosäure- und Peptidderivate entsprechend IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol. Abbreviations for amino acid and peptide derivatives according to IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol.

Chem. 247,977 (1972). Chem. 247.977 (1972).

1. Darstellung von Glycyl-L-prolin-hydrazid · 2Hydrochlorld 1. Preparation of glycyl-L-proline hydrazide · 2Hydrochlorld

8,8g tert. 8.8 g tert. Butyloxycarbonyl (Boc)-glycin in 50ml Tetrahydrofuran werden bei -15 0 C unter Rühren nacheinander mit 6,4ml N-Methylmorpholin und 6,5ml Chlorkohlensäureisobutylester versetzt und nach 8 Minuten 6,4ml N-Methylmorpholin und sofort danach 8,3g L-Prolin-methylester hydrochlorid in 30ml Tetrahydrofuran und einigen Tropfen Wasser hinzugefügt. Butyloxycarbonyl (Boc) -glycine in 50 ml of tetrahydrofuran are successively added at -15 0 C under stirring with 6,4ml N-methylmorpholine and 6.5 ml of isobutyl chlorocarbonate and 6,4ml after 8 minutes N-methylmorpholine, and immediately thereafter 8.3 g L-proline methyl ester hydrochloride added in 30 ml of tetrahydrofuran and a few drops of water. Der Ansatz wird 1 Stunde bei -15 0 C und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. The mixture is stirred for 1 hour at -15 0 C and 3 hours at room temperature. Danach dampft man das Lösungsmittel i.Vak. Thereafter, the solvent is evaporated in vacuo. ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit Wasser, gesättigter NaHCO 3 -Lcsung, Wasser, 5%iger KHSO 4 -Lösung und Wasser. , the residue dissolved in Essigester, washed successively with water, saturated NaHCO 3 -Lcsung, water, 5% KHSO 4 solution and water. Die organische Phase wird über Na 2 SO 4 getrocknet und der Essigester i.Vak. The organic phase is dried over Na 2 SO 4 and the Essigester vacuo. verdampft. evaporated. IEs werden 11,2g Boc-G!y-Pro-methylester erhalten. IEs are obtained 11.2 g Boc-G! Y-Pro-methylester. Der geschützte Dipeptidmethylesterwird in 50ml Ethanol gelöst und mit 10 ml Hydrazinhydrat versetzt. The protected Dipeptidmethylesterwird dissolved in 50 ml of ethanol and treated with 10 ml of hydrazine hydrate.

Nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur läßt man das Lösungsmittel i.Vak. After standing for 24 hours at room temperature, the solvent in vacuo is allowed. verdampfen. evaporate. Das erhaltene Produkt Boc-Gly-PrO-NH-NH 2 wird mit Ether verrieben, abgesaugt, sorgfältig im Hochvakuum über Schwefelsäure getrocknet (Schmp. 183 bis 187°C),[a)o' = -63,6° = 0,5 in Methanol) und zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 120ml 1,1 η HCI in Essigsäure behandelt. The product obtained Boc-Gly-Pro-NH-NH 2 is triturated with ether, filtered off with suction, thoroughly under high vacuum over sulfuric acid dried (mp. 183-187 ° C), [a) o '= -63.6 ° = 0, treated 5 in methanol) and to remove the Boc-protecting group for 30 minutes at room temperature with 120ml 1.1 η HCI in acetic acid. Der Ansatz wird i. The mixture is i. Vak. Vak. eingeengt, der Rückstand mit Ether verrieben, abgesaugt und i.Vak. concentrated, the residue triturated with ether, suction filtered and dried in vacuo.

getrocknet. dried.

Ausbeute: 10,7g (60%d.Th.) Yield: 10.7 g (60% d.Th.)

Schmp. 198-201 0 C Mp. 198-201 0 C

[aß 1 = -68,6°c = 0,5 in Methanol [ate 1 = -68.6 ° c = 0.5 in methanol

Dünnschichtchromatographisch einheitlich auf Kieselgelfolie Silufoi UV 2 S 4 , CSSR, in 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30:20:6:24), 1-Butanol-Essigsäure-Wasser-Essigester (20:20:20:20) und 2-Butanol-AmeisenEäure-Wasser (75:13,5:11,5) Thin layer chromatography uniformly to Kieselgelfolie Silufoi UV 2 S 4, CSSR, in 1-butanol-pyridine-acetic acid-water (30: 20: 6: 24), 1-butanol-acetic acid-water Essigester (20: 20: 20: 20) and 2-butanol AmeisenEäure-water (75: 13.5: 11.5)

2. Kolorlmetrische Bestimmung der DP IV-Aktlvitftt 2. Kolorlmetrische Determination of DP IV-Aktlvitftt

0,500 ml Substrat-Puffer-Gemisch, bestehend aus 16,32mmol/l Gly-Pro-Hydrazid · 2HCI in Diäthanolamin-HCI-Puffer (200 mmol/l) vom pH 9,1, werden auf 37 0 C temperiert und mit 0,OkO ml Serum für eine Zeit von 15 min inkubiert. 0.500 ml of substrate-buffer mixture consisting of 16,32mmol / l Gly-Pro-hydrazide · 2HCl in diethanolamine-HCl buffer (200 mmol / l) of pH 9.1, are tempered at 37 0 C with 0, OkO ml serum incubated for a period of 15 min. Nach der Inkubation werden 5,00ml Farbreagens, bestehend aus 1 Volumenteil einer Lösung von 4g Dimethylaminobenzaidehyd in 100ml 96%igem Ethanol oder Methanol und 17 Volumentollen 0,1 N Salzsäure, zugegeben und die Ansätze nach 30 min Farbentwicklung bei 455 nm gegen einen Leerwert gemessen. After incubation, added 5,00ml color reagent, consisting of 1 part by volume of a solution of 4g Dimethylaminobenzaidehyd in 100ml of 96% ethanol or methanol and 17 volume lugs 0.1 N hydrochloric acid and the batches measured after 30 minutes color development at 455 nm against a blank value ,

Dieser Leerwert wird wie folgt behandelt. This blank is treated as follows. 0,500ml des Substrat-Puffer-Gemisches werden 15min bei 37 0 C inkubiert, danach mit 5,00ml Farbreagens und anschließend mit 0,020ml Serum versetzt. 0,500ml of the substrate-buffer mixture are incubated at 37 0 C 15 minutes, then with 5,00ml color reagent and then mixed with 0,020ml serum.

Aus den Extinktionsdifferenzon wird über einen Hydrazin-Vergieichsansatz oder den molaren Extinktionskoeffizienten die Enzymaktivität in nmol/(s · I) errechnet. From the Extinktionsdifferenzon the enzyme activity in nmol / (s · I) is calculated over a hydrazine Vergieichsansatz or molar extinction coefficient.

Claims (4)

1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidaso IV (DP IV) in menschlichem und tierischem Untersuchungsmaterial, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung ein Substrat der Formel R-PrO-NH-NH 2 , worin R für eine proteinogene Aminosäure steht, vorzugsweise aber Glycyl-L-Prolin-hydrazid oder L-Alanyl-L-Prolin-hydrazid eingesetzt wird, das durch DP IV in einem pH-Bereich von 7,0-10,0 spezifisch zu R-Pro (R in der obigen Definition), vorzugsweise aber zu Glycyl-L-Prolin bzw. L-Alanyl-L-Prolin und Hydrazin gespalten wird und das enzymatisch freigesetzte Hydrazin mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholischer salzsaurer Lösung unter gleichzeitigem Abbruch der Enzymreaktion zu einem Farbstoff umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt wird. 1. A method for the colorimetric determination of Dipeptidylpeptidaso IV (DP IV) in human and animal tissue, characterized in that for determining a substrate of the formula R-PrO-NH-NH 2, wherein R is a proteinogenic amino acid, but preferably glycyl L-proline-hydrazide or L-alanyl-L-proline-hydrazide used by the DP IV in a pH range of 7.0-10.0 specifically R-Pro (R in the above definition), but preferably is cleaved to glycyl-L-proline or L-alanyl-L-proline, and hydrazine and the enzymatically liberated hydrazine with p-dimethylaminobenzaldehyde reacted in alcoholic hydrochloric acid solution under the simultaneous termination of the enzyme reaction to form a dye and is determined colorimetrically.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das entsprechende Substrat der Formel R-PrO-NH-NH 2 , worin R für eine proteinogene Aminosäure, vorzugsweise für Glycin oder L-Alanin, steht, aus YR-Pro-X, worin R wie oben definiert ist, X für eine Estergruppierung, vorzugsweise Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder Phenacylester und Y für Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonvl, a,a'-Dimethylbenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder vorzugsweise tert. 2. The method according to claim 1, characterized in that the corresponding substrate of the formula R-PrO-NH-NH 2, wherein R is a proteinogenic amino acid, preferably glycine or L-alanine, is from YR-Pro-X, wherein R is as defined above, X is a Estergruppierung, preferably methyl, ethyl, benzyl or phenacyl, and Y is benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonvl, a, a'-dimethylbenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfenyl, or preferably tert. Butyloxycarbonyl stehen, aufgebaut, durch Verknüpfung von YR-OH mit Pro-X nach den in der Peptidchemie üblichen Techniken durch Hydrazinolyse und anschließender acidolytischer oder hydrogenolytischer Abspaltung des Restes Y nach den in der Peptidchemie für diese Aminoschutzgruppen üblichen Deblockierungsbedingungen erhalten wird. Butyloxycarbonyl are constructed, by linking YR-OH with Pro-X by customary in peptide chemistry techniques by hydrazinolysis followed by acidolytic or hydrogenolytic removal of the radical Y is obtained according to the usual in peptide chemistry for this amino deblocking.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das jeweils verwendete Substrat in Form eines Salzes, vorzugsweise als Dihydrochlorid eingesetzt wird. 3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the substrate used in each case in the form of a salt, is preferably used as the dihydrochloride.
4. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß sowohl eine Vorfeld- und Differentialdiagnostik als auch eine Verlaufs- und Therapiekontrolle von Krankheiten, vorzugsweise bestimmter maligner Erkrankungen und Immunmangelsyndrome, wie z. 4. The method according to claim 1,2 and 3, characterized in that both a ramp and differential diagnosis as well as a course and therapy control of diseases, preferably of certain malignancies and immune deficiency syndromes, such. B. AIDS, nach einem einfachen Verfahren möglich ist. B. AIDS, is possible by a simple process.
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