DD270382A1 - PROCESS FOR THE COLORIMETRIC DETERMINATION OF DIPEPTIDYLPEPTIDASE IV BY DIPEPTIDE HYDRAZIDES - Google Patents

PROCESS FOR THE COLORIMETRIC DETERMINATION OF DIPEPTIDYLPEPTIDASE IV BY DIPEPTIDE HYDRAZIDES Download PDF

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Ingrid Reichelt
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidase IV (DP IV), das dadurch gekennzeichnet ist, dass vorzugsweise das Substrat Glycyl-L-Prolin-hydrazid die Bestimmung von Aktivitaeten der DP IV sowohl mit einer manuellen Zweipunktmethode als auch mit einem automatisiertem Verfahren nach dem "flow stream"-Prinzip mit hoher Spezifitaet und analytischer sowie diagnostischer Sensitivitaet ermoeglicht. Das vorzugsweise eingesetzte Substrat Glycyl-L-Prolin-Hydrazid wird durch DP IV in einem p H-Bereich zwischen 7,0 und 10,0 spezifisch zu Glycyl-L-Prolin und Hydrazin gespalten. Letzteres wird mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholisch-salzsaurer Loesung zu einem Farbstoff umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt. Die Erfindung ist fuer die theoretische methodische und klinische Enzymologie und fuer die medizinische Diagnostik und Verlaufsbeobachtung spezieller Krankheiten, wie z. B. bestimmter Krebserkrankungen und Immunmangelsyndrome von Bedeutung.The invention relates to a method for the colorimetric determination of dipeptidyl peptidase IV (DP IV), which is characterized in that preferably the substrate glycyl-L-proline hydrazide, the determination of activities of DP IV both with a manual two-point method and with an automated method according to the "flow stream" principle with high specificity and analytical and diagnostic sensitivity. The preferably used substrate glycyl-L-proline-hydrazide is cleaved by DP IV in a p H range between 7.0 and 10.0 specifically to glycyl-L-proline and hydrazine. The latter is reacted with p-dimethylaminobenzaldehyde in alcoholic-hydrochloric acid solution to a dye and determined colorimetrically. The invention is for the theoretical methodological and clinical enzymology and for medical diagnostics and follow-up monitoring of specific diseases such. B. certain cancers and immunodeficiency syndromes of importance.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidase IV (OP IV) (Ec 3.4.14.5) in menschlichem und tierischem Untersuchungsmaterial zur Lösung biochemisch-wissenschaftlicher und medizinischdiagnostischer Aufgaben.The invention relates to a method for the colorimetric determination of dipeptidyl peptidase IV (OP IV) (Ec 3.4.14.5) in human and animal specimens for solving biochemical-scientific and medical diagnostic tasks.

Die Bestimmung von DP IV-Aktivitäten in Körperflüssigkeiten vornehmlich als Marker für TM-Lymphozyten gewinnt zunehmend an Bedeutung in der enzymologischen Differentialdiagnostik von Erkrankungen mit lymphozytärer Reaktion und von Immunmangelsyndromen verschiedener Ätiopathogenese.The determination of DP IV activities in body fluids primarily as markers for TM lymphocytes is becoming increasingly important in the differential enzymology of diseases with lymphocytic reaction and immune deficiency syndromes of different etiopathogenesis.

Die Anwendung der DP IV in der biochemischen Grundlagenforschung betrifft die Abklärung enzymkinetischer Probleme und die Stellung des Enzyms innerhalb proteolytischer Prozesse unter Freisetzung oder Abbau pharmakologisch und physiologisch aktiver Peptide.The application of DP IV in basic biochemical research concerns the clarification of enzyme kinetic problems and the position of the enzyme within proteolytic processes with release or degradation of pharmacologically and physiologically active peptides.

Die Erfindung ist damit für die biochemischen und medizinischen Wissenschaften, für Forschung und medizinische Betreuung, für Diagnostik und Therapiekontrolle von Interesse und Bedeutung.The invention is thus of interest and importance for the biochemical and medical sciences, for research and medical care, for diagnostics and therapy control.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Zur Bestimmung von Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV wurden bisher ausschließlich Methoden auf der Grundlage der Substrate Glycyl-L-Prolin-4-nitroanilid, L-Alanyl-L-Prolin-4-nitroanilid bzw. der entsprechenden ß-Naphthylamide und Coumarinamide eingesetzt (M.Harada et al. Biochim. Biophys. Acta 705,288 (1982), Biochim. Biophys. Acta 576,280 [1979], K. Imai et al. J. Biochem. [Tokyo] 93,431 [1983]). Die Verfahren mit Verwendung dieser Substrate haben Nachteile:For the determination of activity of dipeptidyl peptidase IV, only methods based on the substrates glycyl-L-proline-4-nitroanilide, L-alanyl-L-proline-4-nitroanilide or the corresponding β-naphthylamides and coumarinamides have heretofore been used (M. Biophys, Acta 705, 288 (1982), Biochim, Biophys, Acta 576, 280 [1979], K. Imai et al., J. Biochem., Tokyo, 93, 431, [1983]). The methods using these substrates have disadvantages:

— Die Methode unter Verwendung von Gly-Pro-p-nitroanilid besitzt aufgrund des vergleichsweise niedrigen molaren Extinktionskoeffizienten der enzymatisch freigesetzten und zu bestimmenden chromogenen Komponente p-Nitroanilin eine geringe analytische und dadurch bedingte eingeschränkte diagnostische Sensitivität.- The method using Gly-Pro-p-nitroanilide has due to the comparatively low molar extinction coefficient of the enzymatically released and to be determined chromogenic component p-nitroaniline a low analytical and consequent limited diagnostic sensitivity.

— Alle bisherigen Verfahren erfordern Photometer mit kinetischer Registrierung und sind daher aufgrund der damit verbundenen Investitionskosten nicht in allen medizinischen Laboratorien unter ökonomischen Aspekten praktikabel. Dieser Aspekt gewinnt besondere Relevanz bei Einsatz des Verfahrens in der Vorfelddiagnostik.- All previous methods require photometers with kinetic registration and therefore are not practicable in all medical laboratories due to the associated investment costs in economic terms. This aspect gains particular relevance when using the procedure in apron diagnostics.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht in der Entwicklung einer einfachen manuellen bzw. nach dem Fließsystem automatisierbaren und in allen medizinischen Laboratorien praktikablen kolorimetrischen Methode zur einzelnen und massenweisen Bestimmung von Aktivitäten der DP IV in Körperflüssigkeiten zur Früherkennung, Differentialdiagnostik und Verlaufskontrolle von bestimmten Erkrankungen mit Störungen im Immunsystem mit höherer diagnostischer Sensitivität.The aim of the invention is the development of a simple manual or by the flow system automatable and practical in all medical laboratories colorimetric method for single and mass determination of activities of DP IV in body fluids for early detection, differential diagnosis and follow-up of certain diseases with disorders in the immune system with higher diagnostic sensitivity.

Die Erfindung ist vorzucjveise gedacht als Massen-Screening-Verfahren zur enzymologischen Erfassung von Immunmangelsyndromen, insbesondere von Acquired immuno = deficiency syndrome (AIDS). Die Erfindung dfent damit der Erfindung von Qualität und Wirksamkeit in der medizinischen Betreuung in ihrer Einheit von Prophylaxe, Diagnostik und Therapie und besitzt damit hohe gesundheitspolitische Bedeutung.The invention is intended to be a mass screening method for the enzymological detection of immunodeficiency syndromes, in particular Acquired immuno = deficiency syndrome (AIDS). The invention thus dfent the invention of quality and effectiveness in medical care in their unity of prophylaxis, diagnosis and therapy and thus has high health policy importance.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für die kolorimetrische Bestimmung von DP IV Substrate zu entwickeln, welche mit hoher enzymatischer Spezifität und analytischer und diagnostischer Sensitivität die Ermittlung der Enzymaktivitäten mittels einfacher Methodik unter Verwendung einer photometrischen Grundausstattung in allan medizinischen Laboratorien bzw. mit einem automatisierten Verfahren nach dem »flow-stream"-Prinzip bei Massenunterr jchungen gestattet. Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung der DP IV-Aktivität oin Substrat der Forme'. IThe invention has for its object to develop for the colorimetric determination of DP IV substrates, which with high enzymatic specificity and analytical and diagnostic sensitivity, the determination of enzyme activities by a simple methodology using a photometric standard equipment in allan medical laboratories or with an automated method According to the invention, in order to determine the DPIV activity, a substrate of the formula I.sub.1 is used according to the flow-stream principle

R-Prc-NH-NH2 , (I)R-Prc-NH-NH 2 , (I)

wobei R für eine proteinogene Aminosäure steht, vorzugsweise aber Glycyl-L-Prolin-hydrazid oder L-Alanyl-L-Prolinhydrazid, eingesetzt.wherein R is a proteinogenic amino acid, but preferably glycyl-L-proline hydrazide or L-alanyl-L-proline hydrazide used.

Ihre Darstellung ist dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel IlTheir representation is characterized in that compounds of the formula II

Y-R-Pro-X , (II)Y-R-Pro-X, (II)

worin R für eine proteinogene Aminosäure, vorzugsweise für Glycin- oder L-Alanin, X für eine Estergruppierung bevorzugt Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder Phenacylester und Y (ür Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl.a.a'-Dimothylbenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder vorzugsweise für tert. Butyloxycarbonyl stehen durch Verknüpfung von Y-K-OH mit H-Pro-X nach den in der Peptidchemie üblichen Techniken, vorzugsweise nach der Mischü.nhydrid-Methode mittels Chlorkohlensäureisobutylester auibaut, durch Umsetzung mit alkoholischer Hydrazinlösung in /erbindungen der Formel IIIin which R is a proteinogenic amino acid, preferably glycine or L-alanine, X is an ester grouping preferably methyl, ethyl, benzyl or phenacyl ester and Y (for benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, biphenylisopropyloxycarbonyl.a.a'-dimethybenzyloxycarbonyl, O-Nitrophenylsulfenyl or preferably tert-butyloxycarbonyl are prepared by linking YK-OH with H-Pro-X according to the techniques customary in peptide chemistry, preferably by the mixed-acid-hydride method using chlorocarbonic acid isobutyl ester, by reaction with alcoholic hydrazine solution in / entindungen of formula III

Y-R-PrO-NH-NH2 (III)YR-PrO-NH-NH 2 (III)

mit R und Y in der obigen Definition überführt, aus denen man durch aeidolytische oder hydrogenolytische Abspaltung des Restes Y nach den in der Peptidchemie für diese Aminoschutzgruppen üblichen Deblc :kierungsbedingungen das entsprechende Substrat gemäß Formel I erhält, das vorzugsweise als Salz insbesondere als Dihydrochlorid für die kolorimetrische DP IV-Bestimmung eingesetzt wird.with R and Y in the above definition, from which the corresponding substrate according to formula I is obtained by aeidolytic or hydrogenolytic cleavage of the radical Y according to the debubstrate conditions customary in peptide chemistry for these amino protective groups, preferably as salt, in particular as dihydrochloride, for the colorimetric DP IV determination is used.

Das entsprechende erfindungsgemäß dargestellte Substrat entsprechend Formel I zeichnet sich dadurch aus, daß es durch DP IV zu R-Pro (R steht für eine proteinogene Aminosäure), vorzugsweise aber Gly-Pro oder Ala-Pro und Hydrazin in einem pH-Bereich von 7,0 bis 10,0, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 gespalten wird, wobei das enzymatisch f reige setzte Hydrazin bei Zugabe von p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholischersalzsaurer Lösung unter gleichzeitigem Abbruch der Enzymreaktion zu einem orangeroten Farbsalz umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt wird.The corresponding substrate represented according to formula I according to the invention is characterized in that by DP IV to R-Pro (R is a proteinogenic amino acid), but preferably Gly-Pro or Ala-Pro and hydrazine in a pH range of 7, 0 to 10.0, preferably between 7.5 and 8.5 is cleaved, wherein the enzymatically f-saturated hydrazine reacted with the addition of p-dimethylaminobenzaldehyde in alcoholic acid solution while simultaneously terminating the enzyme reaction to an orange-red dye salt and determined colorimetrically.

Die bei 455mm gemessene Extinktion des Farbstoffes ist der DP IV-Aktivität direkt proportional.The extinction of the dye measured at 455mm is directly proportional to DP IV activity.

Ausführungsbeispieleembodiments

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments.

Abkürzungen für Aminosäure- und Peptidderivate entsprechend IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol.Abbreviations for Amino Acid and Peptide Derivatives According to IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol.

Chem. 247,977 (1972).Chem. 247,977 (1972).

1. Darstellung von Glycyl-L-prolin-hydrazid · 2Hydrochlorld1. Preparation of Glycyl-L-Proline Hydrazide · 2Hydrochloride

8,8g tert. Butyloxycarbonyl (Boc)-glycin in 50ml Tetrahydrofuran werden bei -150C unter Rühren nacheinander mit 6,4ml N-Methylmorpholin und 6,5ml Chlorkohlensäureisobutylester versetzt und nach 8 Minuten 6,4ml N-Methylmorpholin und sofort danach 8,3g L-Prolin-methylester hydrochlorid in 30ml Tetrahydrofuran und einigen Tropfen Wasser hinzugefügt. Der Ansatz wird 1 Stunde bei -150C und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach dampft man das Lösungsmittel i.Vak. ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit Wasser, gesättigter NaHCO3-Lcsung, Wasser, 5%iger KHSO4-Lösung und Wasser. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und der Essigester i.Vak. verdampft. IEs werden 11,2g Boc-G!y-Pro-methylester erhalten. Der geschützte Dipeptidmethylesterwird in 50ml Ethanol gelöst und mit 10 ml Hydrazinhydrat versetzt.8.8 g tert. Butyloxycarbonyl (Boc) -glycine in 50 ml of tetrahydrofuran are added successively with stirring at -15 0 C with 6.4 ml of N-methylmorpholine and 6.5 ml Chlorobohlensäureisobutylester and after 8 minutes 6.4 ml of N-methylmorpholine and immediately afterwards 8.3 g of L-proline methyl ester hydrochloride in 30ml tetrahydrofuran and a few drops of water. The mixture is stirred for 1 hour at -15 0 C and 3 hours at room temperature. Thereafter, the solvent i.Vak is evaporated. and the residue is dissolved in ethyl acetate, washed successively with water, saturated NaHCO 3 solution, water, 5% KHSO 4 solution and water. The organic phase is dried over Na 2 SO 4 and the ethyl acetate i.Vak. evaporated. IEs are obtained 11.2 g Boc-G! Y-Pro-methyl ester. The protected dipeptide methyl ester is dissolved in 50 ml of ethanol and treated with 10 ml of hydrazine hydrate.

Nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur läßt man das Lösungsmittel i.Vak. verdampfen. Das erhaltene Produkt Boc-Gly-PrO-NH-NH2 wird mit Ether verrieben, abgesaugt, sorgfältig im Hochvakuum über Schwefelsäure getrocknet (Schmp. 183 bis 187°C),[a)o' = -63,6° = 0,5 in Methanol) und zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 120ml 1,1 η HCI in Essigsäure behandelt. Der Ansatz wird i. Vak. eingeengt, der Rückstand mit Ether verrieben, abgesaugt und i.Vak.After standing for 24 hours at room temperature, the solvent is left in vac. evaporate. The resulting product Boc-Gly-PrO-NH-NH 2 is triturated with ether, filtered off with suction, dried carefully under high vacuum over sulfuric acid (mp 183 to 187 ° C.), [a) o '= -63.6 ° = 0, 5 in methanol) and to remove the Boc protecting group for 30 minutes at room temperature with 120 ml of 1.1 N HCl in acetic acid. The approach is i. Vak. concentrated, the residue triturated with ether, filtered off with suction and i.Vak.

getrocknet.dried.

Ausbeute: 10,7g (60%d.Th.)Yield: 10.7 g (60% of theory)

Schmp. 198-2010CMp 198-201 0 C

[aß1 = -68,6°c = 0,5 in Methanol[aβ 1 = -68.6 ° c = 0.5 in methanol

Dünnschichtchromatographisch einheitlich auf Kieselgelfolie Silufoi UV2S4, CSSR, in 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30:20:6:24), 1-Butanol-Essigsäure-Wasser-Essigester (20:20:20:20) und 2-Butanol-AmeisenEäure-Wasser (75:13,5:11,5)Thin-layer chromatography uniformly on silica gel film Silufoi UV 2 S 4 , CSSR, in 1-butanol-pyridine-acetic acid-water (30: 20: 6: 24), 1-butanol-acetic acid-water-ethyl acetate (20: 20: 20: 20) and 2-butanol-formic acid-water (75: 13.5: 11.5)

2. Kolorlmetrische Bestimmung der DP IV-Aktlvitftt2. Colorimetric determination of the DP IV Aktlvitftt

0,500 ml Substrat-Puffer-Gemisch, bestehend aus 16,32mmol/l Gly-Pro-Hydrazid · 2HCI in Diäthanolamin-HCI-Puffer (200 mmol/l) vom pH 9,1, werden auf 370C temperiert und mit 0,OkO ml Serum für eine Zeit von 15 min inkubiert. Nach der Inkubation werden 5,00ml Farbreagens, bestehend aus 1 Volumenteil einer Lösung von 4g Dimethylaminobenzaidehyd in 100ml 96%igem Ethanol oder Methanol und 17 Volumentollen 0,1 N Salzsäure, zugegeben und die Ansätze nach 30 min Farbentwicklung bei 455 nm gegen einen Leerwert gemessen.0.500 ml substrate-buffer mixture, consisting of 16.32 mmol / l Gly-Pro-hydrazide · 2HCl in diethanolamine-HCl buffer (200 mmol / l) of pH 9.1, are heated to 37 0 C and 0, OkO ml serum incubated for a period of 15 min. After incubation, 5.00 ml of color reagent consisting of 1 part by volume of a solution of 4g dimethylaminobenzaidehyde in 100 ml of 96% ethanol or methanol and 17 volumes of 0.1 N hydrochloric acid are added and the mixtures are measured after 30 min of color development at 455 nm against a blank ,

Dieser Leerwert wird wie folgt behandelt. 0,500ml des Substrat-Puffer-Gemisches werden 15min bei 370C inkubiert, danach mit 5,00ml Farbreagens und anschließend mit 0,020ml Serum versetzt.This blank value is treated as follows. 0,500ml of the substrate-buffer mixture are incubated at 37 0 C 15 minutes, then with 5,00ml color reagent and then mixed with 0,020ml serum.

Aus den Extinktionsdifferenzon wird über einen Hydrazin-Vergieichsansatz oder den molaren Extinktionskoeffizienten die Enzymaktivität in nmol/(s · I) errechnet.From the extinction differential, the enzyme activity in nmol / (s.I) is calculated via a hydrazine equivalent or the molar extinction coefficient.

Claims (4)

1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Dipeptidylpeptidaso IV (DP IV) in menschlichem und tierischem Untersuchungsmaterial, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung ein Substrat der Formel R-PrO-NH-NH2, worin R für eine proteinogene Aminosäure steht, vorzugsweise aber Glycyl-L-Prolin-hydrazid oder L-Alanyl-L-Prolin-hydrazid eingesetzt wird, das durch DP IV in einem pH-Bereich von 7,0-10,0 spezifisch zu R-Pro (R in der obigen Definition), vorzugsweise aber zu Glycyl-L-Prolin bzw. L-Alanyl-L-Prolin und Hydrazin gespalten wird und das enzymatisch freigesetzte Hydrazin mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in alkoholischer salzsaurer Lösung unter gleichzeitigem Abbruch der Enzymreaktion zu einem Farbstoff umgesetzt und kolorimetrisch bestimmt wird.1. A method for the colorimetric determination of Dipeptidylpeptidaso IV (DP IV) in human and animal specimens, characterized in that for determining a substrate of the formula R-PrO-NH-NH 2 , wherein R is a proteinogenic amino acid, but preferably glycyl L-proline hydrazide or L-alanyl-L-proline hydrazide is used, which by DP IV in a pH range of 7.0-10.0 specific to R-Pro (R in the above definition), but preferably is cleaved to glycyl-L-proline or L-alanyl-L-proline and hydrazine and the enzymatically released hydrazine is reacted with p-dimethylaminobenzaldehyde in alcoholic hydrochloric acid solution with simultaneous termination of the enzyme reaction to a dye and determined colorimetrically. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das entsprechende Substrat der Formel R-PrO-NH-NH2, worin R für eine proteinogene Aminosäure, vorzugsweise für Glycin oder L-Alanin, steht, aus Y-R-Pro-X, worin R wie oben definiert ist, X für eine Estergruppierung, vorzugsweise Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder Phenacylester und Y für Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonvl, a,a'-Dimethylbenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder vorzugsweise tert. Butyloxycarbonyl stehen, aufgebaut, durch Verknüpfung von Y-R-OH mit Pro-X nach den in der Peptidchemie üblichen Techniken durch Hydrazinolyse und anschließender acidolytischer oder hydrogenolytischer Abspaltung des Restes Y nach den in der Peptidchemie für diese Aminoschutzgruppen üblichen Deblockierungsbedingungen erhalten wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the corresponding substrate of the formula R-PrO-NH-NH 2 , wherein R is a proteinogenic amino acid, preferably glycine or L-alanine, is from YR-Pro-X, wherein R is as defined above, X is an ester grouping, preferably methyl, ethyl, benzyl or phenacyl ester and Y is benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, biphenylisopropyloxycarbonyl, a, a'-dimethylbenzyloxycarbonyl, o -nitrophenylsulfenyl or preferably tert. Butyloxycarbonyl, constructed by linking YR-OH with Pro-X according to the usual techniques in peptide chemistry by hydrazinolysis and subsequent acidolytic or hydrogenolytic cleavage of the radical Y is obtained according to the usual in peptide chemistry for these amino protecting deblocking. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das jeweils verwendete Substrat in Form eines Salzes, vorzugsweise als Dihydrochlorid eingesetzt wird.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the substrate used in each case in the form of a salt, preferably used as dihydrochloride. 4. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß sowohl eine Vorfeld- und Differentialdiagnostik als auch eine Verlaufs- und Therapiekontrolle von Krankheiten, vorzugsweise bestimmter maligner Erkrankungen und Immunmangelsyndrome, wie z. B. AIDS, nach einem einfachen Verfahren möglich ist.4. The method according to claim 1,2 and 3, characterized in that both an apron and differential diagnosis as well as a course and therapy control of diseases, preferably certain malignant diseases and immune deficiency syndromes, such. B. AIDS, according to a simple method is possible.
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