DE2322116A1 - Substrat mit hoher empfindlichkeit fuer proteolytische enzyme vom typ der peptidpeptidohydrolasen - Google Patents

Substrat mit hoher empfindlichkeit fuer proteolytische enzyme vom typ der peptidpeptidohydrolasen

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Description

PATENTANWALTS
DR.-ING. RICHARD GLAWE · DIPL-ING KLAUS DFLFS DIPL-PHYS. DR. WALTER MOLL MÖNCHEN HAMBURG MÜNCHEN
8 MÖNCHEN 26 POSTFACH 37 LIEBHERRSTR. 20 TEL. (0811) 22 £5 48 TELEX 52 25 05 SfKZ
2 HAMBURG WAITZSTR. TEL. (0411)89 22 21 29 21 «pez
IHR ZBCHB* HRE NACHRICHT VOM UNSER ZEICHEN
A 91
BETRIFFT:
MÖNCHEN
Aktiebolaget Bofors S-690 2o Bofors / Schweden
Substrat mit hoher Empfindlichkeit für proteolytische Enzyme vom Typ der Peptid-Peptidohydrolasen.
Die Erfindung betrifft ein Substrat der allgemeinen Formel
R1-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-Rr-1 ι ι 1 5
R2 R-j (CH2)H-NH-R^
in der R^ ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit 1-12 C-Atomen, eine i/0-Aminoacylgruppe mit 1-12 C-Atomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine νΛ3 -Cyclohexylacylgruppe, eine ^-Amlnomethyl-cyclohexylcarbonylgruppe, eine gegebenenfalls mit einem Halogenatom, einer Methyl-, Amino- oder Phenylgruppe od.dgl. oder mehreren dieser Substituenten
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substituierte Benzoylgruppe, eine UP -Phenylacylgruppe mit 1-5 C-Atomen im Acylteil und deren Phenylgruppe gegebenenfalls substituiert ist, oder eine Benzolsulfonyl-, 4-Toluolsulfonyl- oder N -Benzoyl-phenylalanylgruppe ist, und R2 eine Phenyl-, Benzyl, 4-Hydroxybenzyl-, 4-Methoxybenzyl- oder 4-Methylbenzylgruppe,
IU eine geradkettige verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3-8 C-Atomen oder eine Phenyl- oder Benzylgruppe, η die Zahlen 2, 3 und 4,
R^ ein Wasserstoffatom oder eine Guanylgruppe sowie Rjeine. Phenyl-, Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Chinolyl-- oder Nitrochinolylgruppe bedeuten, sowie deren Salze.
' Die Erfindung betrifft weiterhin ein Substrat mit hoher Empfindlichkeit für proteolytische Enzyme vom Typ der Peptid-Peptidohydrolasen, wie Thrombin, Plasmin oder Trypsin, zur diagnostischen Verwendung, das durch die Verbindung der obigen allgemeinen Formel, in der R,, R2, R,', R^, Rc- und η wie oben definiert sind.
Das Substrat der Erfindung kann zur qualitativen Bestimmung von klassifizierten und bisher nicht klassifizierten Enzymen verwendet werden, und zwar insbesondere von solchen Enzymen, die Peptide oder Proteine in den Peptidketten
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ander Carboxylseite des Arginins oder Lysins abbauen, z.B. Thrombin, Trypsin, Plasmin, Reptilase (Pentapharm, Basel, Schweiz), Arvine (Perring AB, Malmö, Schweden),
sowie des bisher nicht klassifizierten Enzyms Brinase (AB Astra, Södertälje, Schweden). Das Substrat der Erfindung kann weiterhin zur Untersuchung von Reaktionen verwendet werden, in denen diese Enzyme gebildet, inhibiert oder verbraucht werden, sowie zur Bestimmung von Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an diesen teilnehmen, beispielsweise zur Bestimmung von Proenzymen, Aktivatoren, Antienzymen und Enzyminhibitoren.
Pur die Klassifizierung der Enzyme wurde die von der International Union of Biochemietry'Esevier, Amsterdam, I965, empfohlene Enzymnomenklatur verwendet.
Verbindungen (Substrate), die bisher zur quantitativen Bestimmung der oben genannten Enzyme verwendet worden sind, sind in "Methoden der enzymatischen Analyse, Babd I, Seite Io2^ (Hrsg. Bergmeyer, H.U., Verlag Chemie, 197o) beschrieben. In Abhängigkeit davon, welche •katalytische Reaktion der proteolytischen Enzyme stattfindet - esterolytisch oder amidolytisch - können diese synthetischen Substrate prinzipiell in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: Estersubstrate und Amidsubsträte.
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Die größte Gruppe der bisher verwendeten synthetischen Substrate ist die Gruppe der Estersubstrate. Dies liegt in dem Umstand begründet, daß diese wesentlich schneller als die bisher hergestellten Amidsubstrate durch die Peptid-Peptidohydrolasen umgewandelt werden. Die prinzipielle biologische Wirkungsweise der als Peptid-Peptidohydrolasen klassifizierten Enzyme ist jedoch, wie bereits aus ihrem Namen hervorgeht, die Hydrolyse von Peptid - oder Amidbindungen natürlicher Substrate, nicht jedoch von Esterbindungen. In der Literatur (Blood Clotting Enzymology, Seite j56 und 42 - 44, Hrsg.: Seegers W.H., Academic Press, 19β7) wird berichtet, daß das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten der esterolytischen und der ämidolytischen Katalyse des Thrombins bei verschiedenen Reaktionsbedingungen nicht konstant ist. Es besteht daher ein Bedürfnis für synthetische Amidsubstrate, die eine weit größere Empfindlichkeit bzw. Spezifizität für die betreffenden Enzyme aufweisen und die auch schneller als die bisher bekannten zu meß- bzw. bestimmbaren Produkten abgebaut werden.können.
Um den Reaktionsverlauf der enzymatischen Hydrolyse untersuchen und verfolgen zu können, sind die Amidsubstrate besonders geeignet, da sie die folgenden Produkte ergeben:
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a) Chromophore Produkte, die spektrophotometrisch leicht gemessen werden können und Lichtabsorptionsmaxima aufweisen, die nicht mit denjenigen der ursprünglichen Amidsubstrate zusammenfallen;
b) Fluoreszierende Produkte, die durch die Fluoreszenzspektrophotometrie bestimmt werden können; und.
c) Produkte, aus denen nach der Verkopplung mit einem geeigneten Reagenz Kopplungsprodukte entstehen, die mit großer Empfindlichkeit photometrisch gemessen werden können.
Es sind bereits einige synthetische Amidsubstrate mit hydrolysierbaren chromophoren Gruppen zur Verwendung gelangt. Diese Substrate sind hauptsächlich vom Typ der N^-unsubstituierten und N^ -substituierten Mono-aminosäure-p-nitroanilid- und Mono-aminosäure- r-naphthylamid- Derivate. Von diesen Substanzen ist N^-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid-Hydrochlorid (BAPNA) als Reagenz für Trypsin (E.C. 3.4.4.) und für Reaktionen, an denen Trypsin teilnimmt, zu nennen. Die enzymatische Hydrolyse dieses Substrats liefert das chromophore Produkt p-Nitroanilin, das in leichter Weise spektrophotometrisch gemessen werden kann.
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Diese bisher bekannten A.mid -Substrate weisen jedoch nicht die.gewünsch te Spezifizität und Empfindlichkeit auf. Dies ist ein erheblicher Nachteil, durch den ein komplizierteres Verfahren für die Probenentnahme erforderlich werden kann, da dann eine erhebliche Menge an biologischem Material erforderlich ist. Weiterhin ist die enzymatische Reaktionszeit lang und die Genauigkeit der Enzymbestimmung kann unbefriedigend sein.
Insbesondere für Thrombin existiert kein synthetisches Amldsubstrat, das in befriedigender Weise arbeitet. BAPNA, wird beispielsweise hauptsächlich für Trypsin verwendet und ist für die Bestimmung von Thrombin nicht besonders geeignet, da es für, dieses Enzym eine niedrige Empfindlichkeit aufweist und nicht der Michaelis - Menten-Kinetik folgt. Durch das Substrat der Erfindung vom Amidtyp können diese Nachteile behoben werden.
Das Substrat der Erfindung kann im wesentlichen gemäß zwei verschiedenen Verfahren erhalten werden.
1) Das erste Verfahren beruht auf der Kopplung der chromophoren Gruppe H,- mit der betreffenden Aminosäure. Daran schließt sich ein stufenweiser Aufbau der gewünschten Peptidestruktur an, indem die übrigen Aminosäuren stufenweise angekoppelt werden. Die chromophore Gruppe wird hier als Block!erungsgruppe für die C-terminale Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet.
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2) Die andere Methode beruht auf einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur und auf der anschließenden Entfernung der verwendeten Blockierungsgruppen, wonach schließlich die chromophore Gruppe Η- an die Peptidstruktur angekoppelt wird.
PUr die stufenweise Synthese der Peptidderivate werden in der Peptidchemie übliche und bekannte Verfahren angewendet. Für die Blockierung der Aminogruppen werden bekannte Blockierungsgruppen verwendet, z.B. Cbo (Carbobenzoxy), MeOCbo (p-Methoxycarbobenzoxy) NOgCbo (p-Nitrocarbobenzoxy), MCbo (p-Methoxyphenylazo-carbobenzoxy), BOC (terfc-Butyloxycarbonyl), TFA (Trifluoracetyl) oder Formyl. Die dv. -Carboxylgruppe kann aktiviert werden, indem man sie in verschiedene, in der Peptidchemie bekannte und häufig verwendete reaktionsfähige Derivate überführt. Diese können entweder isoliert oder in situ hergestellt werden. Beispiele für die reaktionsfähigen Derivate sind p-Niferophenylester, Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, Säureazid sowie symmetrische oder unsymmetrische Säureanhydride. Die cv -Carboxylgruppe kann auch mit einem Carbodiimid, z.B. N^-Dicyclohexylcarbidiimid aktiviert werden. Die C-terminale Carboxylgruppe des Aminopeptid- oder Aminosäurederivats kann geschützt werden, indem man sie beispielsweise zum Methyl-, Äthyl- oder Isopropylester
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verestert oder in das chromophore Anilinderivat überführt, welches dann als Blockierungsgruppe während des Aufbaues der Peptidkette wirkt. Diejenigen freien funktioneilen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, können während der Synthese des Peptids oder der Peptidderivate in der folgenden Weise geschützt werden:
Für die Blockade der Arginyl-& -guanidogruppe und der Lysyl-£ - Aminogruppe kann man in der Peptidchemie übliche Aminoblockierungsgruppen, wie NOp, Tos (p-Toluolsulfonyl) oder auch lediglich die Protonierung als Schutz für die Guanidogruppe, oder Cbo (Carbobenzoxy), BOC (tert.-Butyloxycarbonyl oder ebenfalls Tos für die <£ -Aminogruppe verwenden. Als Schutz für die Hydroxylgruppe im Tyrosin kann man ebenfalls in der Peptidchemie üblicherweise verwendete Blοckierungsgruppen, z.B. Benzyl- und tertiäre Butylschutzgruppen einsetzen.
Bei der stufenweisen Synthese der Peptidstruktur kann eine systematische Reinigung mittels Gelfiltration nach jeder Verkopplung einer neuen Aminosäure durchgeführt werden. Für diese Gelfiltration wird eine Säule verwendet, die mit einem für die Gelfiltration geeigneten Material gefüllt ist, z.B. ein vernetztes Dextrangel vom Typ Sephadex G oder LH (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Ein anderes geeignetes Gel besteht aus Copolymeren des Vinylacetats,
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3 2322118
z.B. vom Typ MerckogelR OR-PVA (AG E. Merck, Darmstadt, West-Deutschland). Das Gelmaterial wird im Gleichgewicht mit einem geeigneten Lösungsmittel verwendet.- Die EIuierung wird dann mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt, z.B. mit Methanol, Äthanol, Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die Beispiele zeigen die Herstellung von verschiedenen Substraten gemäß der Erfindung durch stufenweise Synthese.
Für die dünnschichtchromatographische Analyse des Eluats und der Produkte wurden mit Silicagel (P 25^ AG E. Merck, Darmstadt, West-Deutschland) als Absorptionsmedium beschichtete Glasplatten verwendet. Für die Entwicklung der Dünnschichtchromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme eingesetzt:
A: n-Butanol:Essigsäure:Wasser (3:1:1)
C: n-Propanol:Ä'thylacetat:Wasser (7:1:2)
D: n-Heptan:n-ButanolEssigsäure (3:2:1)
P1: Chloroform:Methanol (9:1)
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Nach Beendigung der Dünnschichtchromatographie wurden die Platten zunächst unter einer UV-Lampe (254nm) und anschließend mittels der Chlor/Toluidin-Reaktion (G. Pataki: Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1956, S. 125) entwickelt.
Sämtliche verwendeten Aminosäuren weisen L-Konfiguration auf, wenn nichts anderes angegeben ist. Die verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
Arg = Arginin Phe = Phenylalanin
lie = Isoleucin Tyr = Tyrosin
Leu = Leucin VaI = Valin
Lys = Lysin C-Ph.GIy = C-Phenylglycin.
In den Beispielen werden weiterhin die folgenden Abkürzungen verwendet:
Ac = Acetyl
Ac2O = Acetanhydrid
AcOH = Essigsäure
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Bz = Benzoyl
BzI = Benzyl
2 = Benzoesäureanhydrid
Cbo = Carbobenzoxy
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
- Io -
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2322115
DCHA = Dicyclohexylamin
DCU = Dicyclohexylarbamid
DMP = Dimethylformamid
Et,N = Triäthylamin'
HMPTA = N,N,N1,N1, N",N"-Hexamethylphosphorsäuretriamid
MCbo = p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy
MeOH = Methanol
NA = Naphthylamin
OtBu = tert.-Butyloxy
OEt = Äthyloxy
OMe = Methyloxy
OpNP = ρ-Nitrophenoxy
OisoPr = iso-Propyloxy
pNA = p-Nitroanilid
TPA = Trifluoroacetyl
Tos = p-Toluo!sulfonyl
TLC = Dünnschichtchromatografie.
Die Gele SephadexR G-I5 und G-25, die für die Gelfiltration verwendet wurden,, sind - jeweils vernetzte Dextrangele ' mit unterschiedlichem Vernetzungsgrad der Pharmacia
jD
Pine Chemical, Uppsala, Schweden. Das Gel Sephadex LH-2o ist ein hydroxypropyliertes vernetztes Dextrangel der Pharmacia Pine Chemical, Uppsala, Schweden.
Beispiel I: N^- Bz - Phe - VaI- Arg - pNA . HCl
(D
Beispiel Ia: Cbo - Arg(NO0) - pNA
(la)
1) '55s5 g (0,1 Mol) trockenes Cbo - Arg(N02)-0H werden in 2oo ml trockenem frisch destilliertem HMTA bei Raum-
- 11 -
309847/1123
temperatur gelöst. Danach werden Ip,1 g (0,1 Mol) Et^N und 24,6 g (0,15 Mol) p-Nitrophenylisoeyanat unter Rühren und unter Peuchtigkeitsausschluß zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung 2 1 2^-iger Natriumbicar^onat-Lösung unter Rühren eingegossen. Der gebildete Niederschlag wird filtriert und dreimal mit 0,5 1 2#-iger Natriumbicarhonatlösung, zweimal mit 0,2 1 destilliertem Wasser unddanach zweimal mit 0,5 1 0,5 N Salzsäure sowie schließlich fünfmal mit 0,2 1 destilliertem Wasser gewaschen. Das getrocknete Rohprodukt wird mit warmem Methanol extrahiert. Auf diese Weise werden das gewünschte Produkt und einige zusätzliche Nebenprodukte gelöst. Der unlösliche Rückstand, der aus Ν,Ν'-bisp-nitrophenylcarbamid besteht, wird abfiltriert. Das Pil'trat wird auf einer Säule gereinigt, die mit mit
Methanol in Gleichgewicht gesetztem Sephadex LH-2o gefüllt ist.
29,8 g (63,0#) Ia, Smp. l85-l88°C, werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in P und C homogen. p4=-l,3° (c = 1.1; AcOH).
2) 35,3 g (0,1 Mol) Cbo-Arg(N02)-0H(getrocknet), werdei£n 000 1 Tetrahydrofuran: DMF (1:1) gelöst. Dazu werden lo,l g
- 12 -
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232211a
(0,1 Mol) Et,N gegeben. Danach wird die Lösung auf -10°C unter Feuchtigkeitsausschluß gekühlt. I3,7 g (0,1 Mol) Chlorameisemsäureisobutylester, gelöst in 5o ml Tetrahydrofuran,werden tropfenweise innerhalb von Io Minuten zu der gekühlten Mischung gegeben. Nach einer weiteren Zeitspanne von Io Minuten werden 16,4 g (0,1 Mol) p-Nitroanilin zugesetzt. Man läßt die Reaktionslösung sich auf Raumtemperatur erwärmen und läßt 24 Stunden stehen. Das Lösungsmittel der Reaktionsmischung wird dann im Vakuum abdestilliert. Das Reaktionsgemisch wird dann 3-5 mal jeweils mit destilliertem Wasser, 5^-iger Natriumbicarbonatlösung und destilliertem Wasser digeriert. Danach wird der Rückstand im Vakuum getrocknet.
Reinigung: Zweimaliges Umkristallisieren aus Methanol. Die Mutterlauge wird an Sephadex LH-2o in Methanol gelfiltriert.
Man erhält 2.5,ο g (48,5$) Ia mit den gleichen physikalischen Daten wie beim vorhergehenden Beispiel.
2) 35,3 g (0,1 Mol) Cbo - Arg(N02 - OhJ werden in DMP gelöst. Die Lösung wird auf -100C gekühlt. Danach werden
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2ο,5 g (0,1 Mol) DCCI und 16,4 g (0,1 Mol) p-Nitroanilin zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung zur Trockne eingedampft und 3-5 mal jeweils mit destilliertem Wasser, 5^-iger Bicarbonatlösung, destilliertem Wasser, 0,5 N HCl und destilliertem Wasser digeriert.
JD
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 14,7 g (j54,O#) Ia mit einem Schmelzpunkt von 186 - l88°C. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 und C homogen.
4="1j8° (c = lj0-: Ac0H)·
Beispiel Ib:
Cbo- VaI - Arg(NOp) - pNA (Ib) Unter Feuchtigkeitsausschluß werden Ho ml AcOH und 110 ml 4M HBr in AcOH zu 2o,6 g (4;?,5m Mol) gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 6o Minuten gerührt. Danach wird sie langsam in 75o ml trockenem Äther eingegossen. Das Gemisch wird heftig gerührt. Es bildet sich ein Niederschlag von 1,5 HBr. Die Ätherphase wird dekantiert. Der Niederschlag wird weiterhin 4mal mit 25o ml trockenem Äther gewaschen, um das gebildete Benzylbromid und den Überschuß
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an HBr und AcOH zu entfernen. Nach dem Trocknen la Vakuum über PgO,- erhält man das Hydrobromld des Amino-
tr
säure-derivate in quantitativer Ausbeute (2o,o g).
20,o g (45,5 m Mol) 1,5 HBr.H-Arg(N02)-pNA werden In I5o ml DMF gelöst und auf 100C gekühlt. 6,60 g (65,2 m Mol) EtJi werden zugesetzt, um H-Arg(N02)pNA aus- dem Hydrobromid freizusetzen. Das gebildete Et^N.HBr wird abfiltriert/ Das Piltrat wird auf -10°C gekühlt und mit 2o,j5 g (54,3 m Mol) Cbo-Val-OpNP versetzt. Wenn die Reaktionslösung nach mehreren Stunden Raumtemperatur erreicht hat, wird sie erneut gekühlt und mit 2,2 g (21,7 m Mol) Et5N gepuffert. Die Pufferungsmaßnahn« wird nach etwa 3 Stunden ein weiteres Mal wiederholt. Nach einer Gesamtreaktionszeit von etwa 24 Stunden wird das Reaktionsgemisch im Vakuum bei 4o°C getrocknet. Der Rückstand wird dreimal mit loo ml destilliertem Wasser digeriert. Danach wird er im Vakuum getrocknet.
Reinigung: Die zweimalige Umkristallisation des Rohprodukts aus Methanol ergibt 12,4 g (5ο#) Reinsubstanz. Die Mutterlauge wird mit Gelfiltration an einer mit Methanol ins Gleichgewicht gesetzte*1 Sephadex LH-2o-Kolonne gereinigt. Aus dem Eluat wird eine Fraktion erhalten, die weitere 10,8 g Reinsubstanz ergibt.
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Beispiel Ic:
Cbo - Phe - VaI - Arg(NO2) - pNA (Ic) Ausgangsmaterial: 28,6 g (5om Mol) Ib und 31,5 δ (75 m Mol)Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Die dreimalige Umkristallisation des Rohmaterials aus Methanol ergibt 14,1 g Reinsubstanz gemäß TLC in P1.
R Die Mutterlauge wird durch Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol gelfiltriert. Dabei werden 19*6 g Reinsubstanz gemäß TLC in P1 erhalten.
Man erhält somit ^4,0 g (94,4$) Ic mit einem Schmelzpunkt von 219.5 - 2220C, das gemäß TLC in P1 homogen ist.
?p =-17,1° (c=l,o; DMP-AcOHj 99:1) .
Beispiel Id:
N^-Bz - Phe - VaI - Arg (NO3)-OMe (Id) Ausgangsmaterial: J5o,7 g (50 m Mol) Cho-Phe-Val-Arg(NO OMe und 16,0 g (75 m Mol)
Herstellungsverfahren: Decarbobenzoxylierung von Cbo-Phe-Val-Arg(N02)-0Me, durchgeführt in der im Beispiel Ib beschriebenen Weise.
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30,o g (5o m Mol) HBr.H-Phe VaI-Arg(NO2)OMe werden in 35o ml DMP gelöst und auf -100C gekühlt. Danach werden 7*6 g (75 ra Mol) Et-,Ν zugesetzt. Die Lösung wird unter Peuchtigkeitsausschluß eine Stunde lang gerührt. Danach wird das gebildete EtJi.HBr abfiltriert. Das Piltrat wird auf -100C gekühlt und mit 16.ο (75 m Mol) Bz3O versetzt. Nach einer Reaktionszeit von etwa 5 Stunden hat die Lösung Raumtemperatur erhalten. Wird dann erneut gekühlt und mit 2,5 g (25 m Mol) Et5N gepuffert. Die Puffermaßnahme wird nach etwa 2 Stunden ein weiteres Mal wiederholt. Nach einer Gesamtreaktionszeit von etwa 24 Stunden wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in der im Beispiel Ib beschriebenen Weise digeriert und getrocknet.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol. 26.0 g (88,9) Id mit einem Schmelzpunkt von 138 - 1Al0C werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 und D homogen.
4 = -39.8° (c=l; MeOH).
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Beispiel Ie:
N^-Bz - Phe - VaI - Arg(N02) - OH (Ie)
11,7 g (2o m Mol) Id werden in 2oo ml 5o#igem Äthanol gelöst und mit 2oo ml IN KOH/95# EtOH versetzt. Man rührt 75 Minuten bei Raumtemperatur. Dann leitet man COo durch die Lösung, bis diese einenpH-Wert von 7 erhalten hat. Die Lösung wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 25 ml eingeengt und dann mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 5oo ml verdünnt. Die Lösung wird viermal mit Äthylacetat extrahiert. Danach wird die wässrige Phase mit IN HCl auf einen pH-Wert von 2,8 angesäuert. Die freigesetzte Benzoyl-tripeptidsäure, die beim Ansäuern ausfällt, wird abfiltriert und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Substanz wird im Vakuum getrocknet.
Reinigung: Zweimaliges Umkristallisieren aus Methanol. Die Mutterlauge wird durch Gelfiltration an Sephadex1* LH-2o in Methanol gereinigt.
lo,l g (88,5$) Ie mit einem Äquivalentgewicht von 555.7 werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in A und C homogen.
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Beispiel If:
N^- Bz - Phe - VaI - Arg(N02) - pNA (If)
1) Ausgangsmaterial: 7,2 g (Io m MoI) Ic und 3,4 g (15 m MoI) Bz2O.
Herstellungsverfahren: Gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an SephadexR LH-2o in Methanol.
5,2 g (75,5#) If mit einem Schmelzpunkt 236-2370C werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 und D homogen.
£·* r\T y-*O /_ 1_
2) Ausgangsmaterial: 5,7 g (Io m Mol) Ie und 2,46 g (15 m Mol) p-Nitrophenylisocyanat.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ia-I. Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol,
5,3 g {15,5%) If mit einem Schmelzpunkt von werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in P. und D homogen.
D4=-22,5° (c=l; DMP).
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- Bz - Phe - VaI - Arg - pNA . HCl
Beispiel Ig: ™
mg (0,5 m Mol) If werden in das Reaktionsgefäß einer Apparatur nach Sakakibara gegeben. 5 ml trockener Fluorwasserstoff werden in das Reaktionsgefäß einkondensiert. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei einer Temperatur
die
von 00C unter Rühren ist die Guanidinfunktion schützende Nitrogruppe abgespalten worden. Der Fluorwasserstoff wird dann im Vakuum abdestilliert. Der trocknere Bestand wird in DMF gelöst. Zur Überführung des Fluorwasserstoff-Derivats des Peptids in sein Hydrochlorid werden 0,25 ml konzentrierter Salzsäure zu der DMF-Lösung gegeben. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Konversionsmaßnahme wird ein weiteres Mal wiederholt. Der Rückstand wird dann in33#-"*i6e ssigsäure gelöst.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-I5 in Essigsäure.
275 mg (8o.7y£) I werden nach der Gefriertrocknung in Form eines amorphen Pulvers erhalten. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 5,12$ auf und ist gemäßTLC in A homogen. [fKJjP=-4;3.50 (c » 0,69; 5o# AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe 1.2; Arg: 0,99.
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Beispiel II
N=^- 5 Phenylpropionyl - Phe - VaI - Arg - pNA . HCl (II)
N 0^ -3-Phenylpropionyl-Phe-Val-Arg(N02)-
Ausgangsmaterial: 3o,7 g (5o m Mol Cbo-Phe-Val-Arg(NOp) OMe und 16,3 g (6o m Mol) 3-Phenylpropionyl-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
R ' Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol, Man erhält 25,2 g (82,5$) Ha. Das Produkt ist homogen gemäß TLC in P und C.
Ntt- 3 Phenylpropionyl-Phe-Val-Arg(N02) - OH (Hb)
Ausgangsmaterial: 7,1 g (11,5 m Mol) Ha. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ie. Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol,
o,5 g (93,1%) Hb mit einem Äquivalentgewicht von 584,1 werden erhalten. Das Produkt ist homogen gemäß TLC in A und C.
[flj ψ=- 9,3° (c = 1.0j MeOH).
- 3-Phenylpropionyl-Phe-Val-Arg(N02) pNA (lic)
Ausgangsmaterial: 3g 5 m Mol) Hb und 1,23 g (7,5 m Mol) p-Ni trophenylisocyanat.
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Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ia Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 2,65 g (56,%) lic. Das.Produkt ist gemäß TLC in P, homogen.
N^ - 3-Phenylpropionyl-Phe-Val-Arg-pNA .- HCl (II) ■ Ausgangsmaterial: I79 mg (0,25 m Mol) lic.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 33#iger Essigsäure.
45 mg (26,5$) II werden in amorpher Form beim Gefriertrocknen erhalten. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 4,91$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
5 0 ln Ac0H)·
Aminosäureanalyse: alio; Phe: 1.1; Arg: 0,99.
H-Phe-Val-Arg-pNA . 2 HCl (Hl)
Ausgangsmaterial: I98 mg (0,28 m Mol) Ic.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-25 in 5o#iger Essigsäure.
I70 mg (6l,0^) des amorphen gefriergetrockneten Produktes III werden erhalten. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 11,^7$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
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^ =-26.3° (c=0,6l; 5o# AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1.0; Phe: 0,95; Arg: 1.0.
Beispiel IV:
H-Phe-Phe-Val-Arg-pNA'2 HCl (IV) Cbo-Phe-Val-Arg (NO2)-pNA (IVa)
Ausgangsmaterial: 335 mg (0,46 m Mol) Ic und 317 mg (0,75 m Mol) Cbo-Phe-OpNP. Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in DMF.
282 mg (70.OJi)IVa mit einem Schmelzpunkt von 2olr2o4°C werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
Kl β5 =-l,o2° (c=0,98; DMF).
H-Phe-Phe-Val-Arg-pNA ' HCl (IV) Ausgangsmaterial: 92,9 mg (0,Io7 m Mol) IVa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-25 in 5o#iger Essigsäure.
Man erhält 59*5 mg (73.1 %) des amorphen gefriergetrockneten Produktes IV. Es weist einen Chlorgehalt von 9,18# auf und ist gemäß TLC in A homogen.
(X] Jp= -19,7° (c=0,76; 5oji AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 2.2; Arg: 0,98.
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Beispiel V:
p-Me-Bz-Phe-Val-Arg-pNA ' HCl (V)
p-Me-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (Va)
Ausgangsmaterial: 155 mg (0,216 m Mol) Ic und 83,2 mg (0,324 m Mol) p-Me-Bz-OpNP (Smp I69 - 1720C).
Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ib. Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
69,5 mg (45$) des amorphen Produktes Va werden erhalten. Das Produkt ist gemäß TLC in P^ homogen. QCj Jp= -26,1° (c= 0,69; DMF).
p-Me-Bz-Phe-Val-Arg-pNA ' HCl (V) Ausgangsmaterial: 68,98 mg (0,0965 m Mol) Va. Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 33$iger Essigsäure.
Man erhält 44,5 mg (66%) des&morphen gefriergetrockneten Produktes V. Es weist einen Chlorgehalt von 5,ol# auf und ist gemäß TLC in A homogen.
Jp=-4o, 8° (c= 0,7o; 5o$ AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1.0; Phe: 1.0; Arg: 1.0.
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H<k _Ac - Phe - VaI - Arg - pNA * HCl (VI) ■ N^-Ac- Phe - Val-Arg (N02)-pNA (VIa)
Ausgangsmaterial: 233 mg (0,33 m Mol) Ic und 41 mg (0,4om Mol) Ac2Ot
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 118 mg {66%) des amorphen Produktes VIa. Das
Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
D5= -i> 6° (G= l'16'
N ^-Ac-Phe-Val-Arg-pNA* HCl (Vl)
Ausgangsmaterial: 116 mg (O,l85 m Mol) VIa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
■p
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 2o#iger Essigsäure.
Man erhält 9° mg (79$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes VI. Es weist einen Chlorgehalt von 5,59$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
d= -21.0° (c=0,62; 5o$ AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1.0; Phe: 1,2; Arg: 1.1.
Beispiel VII:
- n-Öctanoyl-Phe-Val-Arg-pNA ' HCl (VII) -n-Octanoyl-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (VIIa)
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2322118
Ausgangsmaterial: 2o7 mg (0,288 m Mol) Ic und Io9 mg. (0,41 m Mol) Caprylsäure-p-nitrophenylester.
Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 172 mg (84#)des amorphen Produktes VIIa. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
[5i.]jp = -6.6° (c=o,5; DMF).
N^-n-Octanoyl-Phe-Val-Arg-pNA' HCl (VII) Ausgangsmaterial: 129,4 mg (0,182 m Mol) VIIa.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol und
SephadexR G-15 in j53$iger Essigsäure.
Man erhält Io9 mg (85$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes VII. Es weist einen Chlorgehalt von 4,90% auf und ist gemäß TLC in A homogen.
p = -29,5° (c=0,7i 5o% AcOH).
Aminosäureänalyse: VaI: 1.0; Phe: 1.0; Arg: 0,95.
Beispiel VIII
N^ -Cyclohexylcarbonyl - Phe - VaI- Arg - pNA * HCl (VIII) N^-Cyclohexylcarbonyl-Phe-Val-Arg(N02-pNA " (Villa)
Ausgangsmaterial: 23^ mg (0,j>3 m Mol) Ic und loo mg (o,4o ra Mol) Cyclohexylcarbonsäure-pTnitrophenylester.
Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ib.
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Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 117 mg (ca. 5o#) des amorphen Produktes Villa. Bs ist gemäß TLC in P1 homogen.
N^-Cyclohexylcarbonyl-Phe-Val-Arg-pNA ' HCl (VIII)
Ausgangsmaterial: 48 ,o2 mg (0,069 m Mol) Villa.
Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-15 in 5o#iger
Essigsäure.
Man erhält 33*7 mg (71$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes VIII. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von
auf und ist gemäß TLC in A homogen.
= -32.8° (c=O,68; 5o# AcOH).
D
Aminosäureanalyse: VaI: 1.0; Phe: 1.3* Arg: 1.0.
Beispiel IX
N0^-ToS-Phe-VaI-Arg-pNA ' HCl (IX)
N^-Tos-Phe-Val-Arg(N02) -pNA (IXa)
Ausgangsmaterial: 360 mg (0,5 m Mol) Ie und I80 mg (0,95m Mol) p-Toluolsulfochlorid.
Herstellungsverfahren: 360 mg Ic werden 1 ml Essigsäure ■ und 1 ml 5,6 NHBr/AcOH in feuchtigkeitsfreier Atmosphäre
gelöst. Man rührt das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wird dann tropfenweise unter heftigem Rühren zu destilliertem Äther getropft.
Dabei fallen 35o mg I.5 HBr.H-Phe-Val-Arg (NO2J-PNA aus. Man dekantiert die Ätherphase und wäscht den Rückstand
weitere dreimal mit Äther. Nach dem Trocknen im Vakuum
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über Phosphorpentoxid erhält man das Hydrobromid des Aminosäurederivats in quantitativer Ausbeute. Das Hydrobromid-Derivat wird in 4 ml DMP gelöst. Die Lösung wird auf -lo°C gekühlt. Dann fügt man 75 mg (0,75 m Mol) Triethylamin hinzu, um das H-Phe-Val-Arg(N02)-pNA aus dem Hydrobromid freizusetzen. Die Reaktionszeit beträgt eine Stunde in feuchtigkeitsfreier Atmosphäre. Das gebildete · Triathylaminhydrobromid wird abfiltri-ert. Man kühlt das Piltrat auf -100C. I90 mg p-Toluolsulfochlorid werden zugegeben. Man läßt die Lösung sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Danach, d.h. nach etwa 3 Stunden, wird die Lösung auf 100C gekühlt und mit 25 mg (0,25 m Mol) Triäthylamin gepuffert. Die Puffermaßnahme wird etwa 2 bis 5 Stunden späterhin weiteres Mal wiederholt. Nach einer Reaktionszeit von etwa 24 Stunden wird die Lösung bei 4o°C im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird dreimal mit destilliertem Wasser behandelt und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wird dann in Methanol gelöst und gereinigt.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 135 mg (j56,5#) des amorphen Produktes Villa, das gemäß TLC in P, homogen ist.
ESljp= - 0° (c=1.0i DMP).
N ^ -Tos-Phe-Val-Arg-pNA * HCl (IX)
Ausgangsmaterial: 81,4^ mg-(0,11 m Mol) IXa.
Syntheseverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-I5 in 2o#iger Essigsäure.
63 mg (78.4$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes IX.
Das Produkt weist einen Cl-Gehalt von 4,79# auf und ist gemäß TLC in A homogen.
P ° (c073;
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Aminosäureanalyse: VaI: 1.0; Phe: 1,2; Arg: 1.0.
Beispiel X
~p - Amino - Bz - Phe - VaI - Arg - pNA * 2 HCl (X) Cbo-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg (N02)-pNA (Xa)
Ausgangsmaterial: 2^5 mg (O,j53 m Mol) Ic und 17o mg (0,44 m Mol) Cbo-p-amino-Bz-OpNP, Smp. 169-172°.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR LH-2o in Methanol.
Man erhält 55 mg (2o#) des amorphen Produktes Xa. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
.2° (c=0,53;
N^ -prAmino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA * 2 HCl (X)
Ausgangsmaterial: 46,8l mg (0,056 m Mol) Xa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 2o#iger Essigsäure.
Man erhält 15 mg (37$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes X mit einem Chlorgehalt von 9.42$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
ψ = -46,7° (c=0,74; 59# AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1.0; Phe: 1.0; Arg: 0,95.
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Beispiel XI
N^-ö-Aminohexanoyl-Phe-Val-Arg-pNA * HCl (Xl) Cbo-6-aminohexanoyl-Phe-Val-Arg(N02)-pNA. (XIa)
Ausgangsmaterial: 360 mg (0,5 m Mol) Ic und 290 mg (0,75 m Mol) Cbo-o-aminocapronsäure-p-nitrophenylester.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 598 mg (95,5$) des amorphen Produktes XIa. · Das Produkt ist gemäß TLC homogen.
N de -6-Aminohexanoyl-Phe-Arg-pNA ' 2 HCl (Xl)
Ausgangsmaterial: J5oo mg (0,^61 m Mol) XIa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-I5 in ^^iger Essigsäure. . '
Man erhält 12J mg (48$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XI. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 9,68$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
= -32.0 (g=0,72; 5o# AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0, Phe: 1,1; Arg: 1,0.
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Beispiel XII,:
H - Phe - Leu - Arg - pNA . 2 HCl
Cbo-Leu-Arg (NO2>-pNÄ (XIIa)
Ausgangsmaterial: 5 g (lo,6m Mol) Ia und 4,92 g (12,7 m Mol) Cbo-Leu-OpNP).
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
R Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 6,1 g (98$) des amorphen Produktes XIIa. Das Produkt ist gemäß. TLC in P1 homogen. 5 = -53,5° (c=l,0; MeOH).
Cbo - Phe - Leu - Arg (NO2) -pNA (XIIb1)
Ausgangsmaterial: 3,6 g (6,5 m Mol) XIIa und 3,27 g (7,8 m Mol) Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 2,95 (69,0$) des amorphen Produktes XIIb. Das Produkt ist gemäß TLC in P, homogen. .
JSC] β5 = -6,2° (c=l.05 DMP).
H-Phe-Leu-Arg-pNA . 2 HCl (XII) Ausgangsmaterial: 124.9 mg (0,17 m Mol) XIIb.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-25 in 50% AcOH.
Man erhält .Vo mg (Λ%) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XII. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von
3 0 9 8 I* 7 7 ii 2~3
11,15$ auf und ist gemäß TLC in A homogen. ψ = -24.4° (c=0,63; 5o$ AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 1.0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Beispiel XIII
Ν«*- -Bz-Phe-Leu-Arg-pNA . HCl (XIIl) N^-Bz-Phe-Leu-Arg (N02)-pNA (XIIIa)
Ausgangsmaterial: 7^4 mg (1 m Mol) XIIb und 272 mg (1,2m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 589 mg.(84$) des Produktes XIIIa , Smp. l9o-197°C, Es ist gemäß TLC in P, und D homogen. nf = -19*1° (c=l.ol; DMP).
N <h> - Bz-Phe-Leu-Arg-pNA . HCl (XIII)
Ausgangsmaterial: 198,5 mg (0,282 m Mol) XIIIa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration11 G-25 in 5o$iger Essigsäure.
Man erhält I88 mg (96$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XIII. Es weist einen Chlorgehalt von 4,96$ auf und ist gemäß TLC in A homogen. I = -38,3° (c_O,69; 5o$ AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 1.0; Phe: 1,0; Arg: 1,0.
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Beispiel XIV:
fl-Phe-Ile-Arg-pNA . 2 HCl (XIV) Cbo-Ile-Arg(NO2)-pNA (XIVa)
Ausgangsmaterial: 1 g (2,1 m Mol) Ia und 0,98 g (2,46 m Mol) Cbo-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
■p
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 1,12 g (91$) des Produktes XIVa, Smp. 195-2o2°C. Das Produkt ist gemäß TLC in P^ homogen.
gC] 25= +2i8° (c= 1,Oj DMP).
Cho-Phe-Ile-Arg(NO2)-pNA (XIVb)
Ausgangsmaterial: 0,8 g (1,36 m Mol) XIVa und 0,69 g U,63 m Mol) Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 445 mg (41$) XIVb mit Smp. 219 - 222°. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
I5 = -7,1° (c=l; DMP).
H-Phe-Ile-Arg-pNA * HCl (XIV)
Ausgangsmaterial: 166,43 mg (0,226 m Mol) XlVb. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-25 in 5o#iger Essigsäure.
Man erhält 95*3 mg (67$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XIV. Es weist einen Chlorgehalt von 11,17$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
309847/ΓΙ23
Aminosäureanalyse: lie: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0. .
Beispiel XV:
N Λ -Bz-Phe-Ile-Arg-pNA * HCl (XV)
NcL_ Bz-Phe-Ile-Arg (NO2) -pNA (XVa)
Ausgangsmaterial: 25o mg (0,^4 m Mol) XIVb und 92 mg (0,4 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 21o mg (88$) des. Pr-oduktes -XVa, -Smp. 244-245°C Es ist gemäß TLC in P, homogen.
^5 = -22.3 (c=l; DMP).
-Bz-Phe-Ile-Arg-pNA * HCl (XV)
Ausgangsmaterial: 182.7 mg (0,26 m Mol) XVa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-25 in 5o#iger Essigsäure.
Man erhält I76.9 mg (97^) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XV. Es weist einen Chlorgehalt von 4,98$ auf und ist gemäß TLC in A homogen,
pTj^ = -41.5° (c= 0,69; 50$ AcOH).
Aminosäureanalyse: He: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,1.
309847/1123
Beispiel XVI:
H-Phe-Phe-Arg-pNA ' 1 HCl
CbOrPhe-Arg (NO2)-pNA
(XVI) (XVIa)
Ausgangsmaterial: 1 g (2,1 m Mol) Ia und I,o6 g (2,46 m Mol) Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
R Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 1,25 g (96,0#) des Produktes XVIa, Smp. 198-2o4°C. Das Produkt ist gemäß TLC in P, homogen.
d5 = +^,2° (c= 1,0; DMP).
Cbo-Phe-Phe-Arg (NO2)-pNA
(XVIb)
Ausgangsmaterial: 0,9 g (1,45 m Mol) XVIa und 0,737 S (1,7^ m Mol) Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 635 mg (58^) des Produktes XVIb, Smp. 2ol-2o3pC. Das Produkt ist gemäß TLC in P, homogen.
IiKl D
5= -23.0° (c= 1.0; DMP).
H-Phe-Phe-Arg-pNA * 2 HCl
(XVI)
Ausgangsmaterial: I96.9 mg (0,257 m Mol) XVIb. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-25 in 5o#iger Essigsäure.
Man erhält 75*8 mg (46$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XVI. Es weist einen Chlorgehalt von lo,65# auf und-ist gemäß TLC in A homogen.
- 35 -
309847/1123
= -6,7° (c=o,65; 5o# AcOH).
Aminosäureanalyse: Phe 2.0; Arg: 1,1.
Beispiel XVII:
N^-Bz-Phe-Phe-Arg-pNA ' HCl (XVIl)
N<K_Bz-Phe-Phe-Arg(N02)-pNA (XVIIa)
Ausgangsmaterial: 25o mg (0,^25 m Mol) XVIb und 90 mg (0,512 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 22o mg (92$) des amorphen Produktes XVIIa. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
d3= -36>6° (c = 0,95; DMP).
N Jv -Bz-Phe-Phe-Arg-pNA * HCl (XVII)
Ausgangsmaterial: 114,6 mg (0,156 m Mol) XVIIa.
Herstellungsverfahren:
in 5o#iger Essigsäure.
Herstellungsverfahren: Gelfiltration an SephadexR G-25
Man erhält 7Ti1I- mg (68%) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XVII. Es weist einen Chlorgehalt von 4,81$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
f °
jf = -25-5° (c=0,72; 5o# AcOH). Aminosäureanalyse: Phe: 2,0; Arg: 0,97.
309847/1123
Beispiel XVIII:
H-D- Phe - VaI - Arg - pNA * 2 HCl (XVIIl) Cbo-D-Phe-Val-Arg(NO2)-pNA / (XVIIIa)
Ausgangsraaterial: 48o rag (0,83.mMol) Ib und 53o rag (1,25 Mol) Cbo-D-Phe-OphP mit Smp. 126,2 - 126.6°, 4 °
ß4 = +24,75° (c=1.0; DMP).
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
R · Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 587 mg (98$) des amorphen Produktes XVIIIa. Es ist gemäß TLC in P, homogen.
9o (θΞ l)0. DMF).
H-D-Phe-Val-Arg-pNA* 2 HCl (XVIIl)
Ausgangsmaterial: I53.8 mg (0,212m Mol) XVIIIa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel I. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-15 in 2o#iger Essigsäure.
Man erhält 36,3 mg (28$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XVIII. Es weist einen Chlorgehalt von 11,34# auf und ist gemäß TLC in A homogen.
D5" -7ο·3° (c=0f61; 5o# AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Beispiel XIX:
N ^.Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA * HCl (XIX)
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N^V- Bz-D-Phe-Val-Arg (NO2)-ρΝΑ (XIXa)
Ausgangsraaterial: 244 mg ,0,34 ra Mol) XVIIIa und 92 mg (0,4lm Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol
Man erhält l8l mg {11%) des Produktes XIX, Smp. 211-215°C Das Produkt ist gemäß TLC in P^ homogen.
= -l,>i° (c=o,8; DMP). -Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA * HCl (XIX)
Ausgangsmaterial: 128,3 mg (O,186 m Mol) XIXa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-25 in 5#iger Essigsäure.
Man erhält Io3,8 mg (81$) des amorphen gefrxergetrockneten Produktes XIX. Es weist einen Chlorgehalt von 5,15$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
D^= -36.9° (c=0,68; 5o# AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 0,9; Arg: 0,9.
Beispiel XX:
H-Tyr-Val-Arg-pNA · HCl (XX)
Cbo-Tyr-(OBz)-VaI-Arg (NO2)-pNA (XXa)
Ausgangsmaterial: 48o mg (0,8^m Mol) ve« /-or-
und 66o mg (1,25 m Mol) Cho-Tyr-(OBz)-OpNP, Smp. 147.5'- l49.o°C und [el"] Q5 = -8,5° (c=2,0; DMF).
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am
30 984 7/1123
2322118
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 46o mg (55$) des amorphen Produktes XXa. Es ist gemäß TLC in P-, homogen
JdJ] Jp = -9,66° (c=l,Oj DMP).
H-Tyr-Val-Arg-pNA * HCl (XX) Ausgangsmaterial: 144,7 mg (0,169 m Mol) XXa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 2o#iger Essigsäure.
Man erhält 65*4 mg (625ε) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XX. Es weist einen Chlorgehalt von 11·,2ο$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
= -29,8° (c=0,63; 5o$ AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Tyr: 1,2; Arg: 1,0.
Beispiel XXI:
N^- - Bz-Tyr-Val-Arg-pNA ' HCl (XXl)
-Bz-Tyr-Val-Arg(NO2)-pNA (XXIa)
Ausgangsmaterial: 246 mg (0,287 m Mol) XXa und 65 mg (0,29 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Die Bz-Gruppe, die die OH-Gruppe des Tyrosine schützt, wird während der Behandlung HBr in gewissem Ausmaß abgespalten. Die Ausbeute ist daher niedrig. Das erhaltene Produkt steht
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im wesentlichen sowohl aus XXIa und NdWBz-Tyr (OBz)-Val-Arg (N02)-pNA).
■p
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 193 mg (8l#)eines amorphen Produktes, das im TLC in P-, zwei Substanzen zeigt (siehe oben).
N <^-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA * HCl (XXl)
Ausgangsmaterial: I38.9 mg XXIa und N -Bz-Tyr (OBz)-Val-Arg (N02)-pNA.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 5o$iger Essigsäure.
Man erhält 75»^ mg des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXI. Es weist einen Chlorgehalt von 5t5% auf und ist gemäß TLC in A homogen.
p = -34.7° (c=0,7; 5o% AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Tyr: 1,2; Arg: 1,0.
Beispiel XXII:
Nck-^-Aminoäthylcyclohexylcarbonyl-Phe-Val-Arg-pNA -2 HCl (XXII) Cbo-4-aminoäthylcyclohexylcarbonyl-Phe-Val-Arg-pNA (XXIIa)
Ausgangsmaterial: 268 mg (0,65m Mol) Cbo—4— AminoäthylcycIohexylcarbonyl-OpNP und 360 mg (0,5 m Mol) Ic.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
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Man erhält 2o5 mg (62$) des amorphen Produktes XXIIa. Das Produkt ist gemäß TLC in P, homogen. (XjJp = _8j5o (c=oi5i; DMP).
NiK-^-Aminoäthylcyclohexylcarbonyl-Phe-Val-Arg-pNA * 2 HCl (XXIl]
Ausgangsmaterial: 137 mg (0,16 m Mol) XXIa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-15 in 33 $iger Essigsäure.
Man erhält 82,2 (68,5$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXII. Es weist einen Chlorgehalt von 9,37$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
°5= -35.2° (c= 0,73;· 5o$ AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Beispiel XXIII:
Mdv-a-Cyclohexylacetyl-Phe-Val-Arg (N0P)-pNA (XXIIIa) ΝίΚ-2-Cyclohexylacetyl-Phe-Val-Arg (UO2)-pNA (XXIIIa)
Ausgangsmaterial: I97 mg (0,75 m Mol) Cyclohexylacetyl- OpNP und 331 mg (0,46 m Mol) Ic.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 2o5 mg (63$) des amorphen Produktes XXIIIa. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
p = -5.0° (c=0,5; DMP).
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Ndv_2-Cyclohexylacetyl-Phe-Val-Arg-pNA * HCl -(XXIlI)
Ausgangsmaterial: 173 mg (0,244 m Mol XXIIIa) Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
R Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in ^)^) $&iger Essigsäure.
Man erhält 139 mg (8l#) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXIII. Es weist einen Chlorgehalt von ^,ο\% auf und ist gemäß TLC in A homogen.
J= 0,35; 5o# AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Beispiel XXIV:
4-Aminobutylryl-Phe-Val-Arg-pNA * 2 HCl (XXIV)
Cbo-4-aminobutylryl-Phe-V^l-Arg (NO2) -pNA (XXIVa)
Ausgangsmaterial: 234 mg (0,65 m Mol) Cbo-4-amino-butyryl-OpNP und 360 mg (0,5m Mol) Ic.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib. Reinigung: Gelfiltration an S§phadexR LH-2o in Methanol.
Man erhält 297 mg (74$) des amorphen Produktes XXIVa. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
4-Aminobutyryl-Phe-Val-Arg-pNA '_2_HC1 (XXIV) Ausgangsmaterial:' 29I mg (0,362 m Mol) XXIVa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an S phadexR G-15 in 33#iger Essigsäure.
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Man erhält 167 mg ^66%) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXIV. Es weist einen Chlorgehalt von Io,o5# auf und ist gemäß TLC in A homogen.
P ° (c=0,72; 5o# AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 1,1.
Beispiel XXV:
2-(4-Aminophenyl)-acetyl-Phe-Val-Arg-pNA * 2 HCl (XXV) 2-(4-Cbo-aminophenyl)-acetyl-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (XXVa)
Ausgangsmaterial: 2oo mg (0,278 m Mol) Ic und 152 mg (0,371m Mol) 2-(4-Aminophenyl)-acetyl-0pNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
R Reinigung: Gelfiltration an Sephadex ■ LH-2o in Methanol.
Man erhält 2ol mg (85$) des amorphen Produktes XXVa. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
24
£4 = -4,3° (c=o,5; DMP).
2-(4-Aminophenyl)-acetyl-Phe-Val-Arg,pNA * HCl (XXV)
Ausgangsmaterial: 97,5 mg (0,114 m Mol) XXVa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Stphadex G-I5 in 33#iger Essigsäure.
Man erhält 43,5 (51$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXV. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 9,47# auf und ist gemäß TLC in A homogen.
Kl jp = -33.0° (c=0,75; 5o# AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,1.
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Beispiel XXVI:
N^-Bz-C-Phe-Gly-Val-Arg-pNA * HCl (XXVl)
Cbo-C-Ph * Gly-Val-Arg(N02)-pNA (XXVIa)
Ausgangsmaterial: 23o mg (0,568 m Mol) Cbo-C-Ph . GIy-OpNP und 250 mg (O,4j57 m Mol) Ib.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ic.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 292 mg (95$) des amorphen Produktes XXVIa. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
[3CJ ß4 = +8,2°■■ (C=O-,5o; DMF).
. Gly-Val-Arg (NO2)-pNA (XXVIb)
Aus gangs material: 29ο mg (0,4l m Mol) XXVIa und Ij5o mg (0,575 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 211 mg (J6%) des amorphen Produktes XXVIb. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen. ,0
ß3 = +lo,4° (c=0,51; DMP)
N<^-Bz-C-Ph . Gly-Val-Arg-pNA . HCl (XXVI) Ausgangsmaterial: 2oo mg (0,296 m Mol) XXVIb. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-I5 in Essigsäure.
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Man erhält l86 mg (95$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXVI. Es weist einen Chlorgehalt von 5,25$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
g5 = -27,0° (c-0,67i 5o% AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; C-Ph . GIy: 1,2; Arg: 0,9.
Beispiel XXVII:
N^-Bz-Phe-Phe-Val-Arg-pNA . HCl (XXVII) '
-Bz-Phe-Phe-Val-Arg(NO2)-pNA (XXVIIa)
Ausgangsmaterial: I4l mg (0,165 m Mol) IVa und 9o mg (0,4 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 114 mg (84$) des amorphen Produktes XXVIIa. Es ist gemäß TLC in Pl homogen.
5 ξ4= -0,75° (c=l,2; DMP).
N^-Bz-Phe-Phe-Val-Arg-pNA . HCl (XXVII)
Ausgangsmaterial: 71 mg (ca. 0,087m Mol) XXVIIa. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-I5 in 33#iger Essigsäure.
Man erhält 47 mg (60$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXVII. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 4,23$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 2,3; Arg: 1,0.
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τ*
Beispiel XXVIII:
NdUBz-DL-C-Ph . Gly-Val-Arg-pNA · HCl (XXVIIl) Cbo-DL-C-Ph ' Gly-Val-Arg(NO2)-pNA (XXVIHa)
Ausgangsmaterial: 285 mg (0,5 m Mol) Ib und 285 mg (0,7m Mol) Cbo-DL-C-Ph . GIy-OpNP, Smp. lo7-lo8°C.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ic.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 353 mg (8l#) des amorphen Produktes XXVIIIa. Es ist gemäß TLC in P, homogen.
N^-Bz-DL-C-PH . Gly-Val-Arg (NO2) . pNA (XXVIIIb)
Ausgangsmaterial: 285 mg (0,4o3m Mol) XXVIIIa und I8I mg (0,8 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Ti
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 226 mg 83$) des amorphen Produktes XXVIIIb. Das Produkt ist gemäß TLC in Ρχ homogen.
N (K -Bz-DL-C-Ph . Gly-Val-Arg-pNA . HCl (XXVIIl) Ausgangsmaterial: lol mg (0,15 m Mol) XXVIIIb. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-15 in 33#iger Essigsäure.
Man erhält 6l mg (6l#) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXVIII. Es weist einen Chlorgehalt von 5,21# auf und ist gemäß TLC in D homogen.
Aminosäureanalyse: VaI: 1,Oj C-Ph . GIy: 1,2; Arg: 0,9.
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Beispiel XXIX:
Ν'Λ-Bz-Phe-Val-Arg-2-NA . HCl (XXIX)
Cbo-Arg;NO2)-2-NA ' (XXIXa)
Ausgangsmaterial: 5,6 g lora Mol) Cbo-Arg (NC>2)-0H und 1,72 g (12m Mol) 2-Maph£ylamin.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ia-2.
R Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol,
Man erhält 4,05 g (84$) des amorphen Produktes XXIXa. Das Produkt ist gemäß TLG in P1 homogen. ] 2J* = +7,4° (c=l.Oj DMP).
Cbo-Val-Arg(NO2)-2-NA (XXIXb)
Ausgangsmaterial: 1,5 g (J5,lm Mol) XXIXa und 1,^8 g (3,7 m Mol) Cbo-Val-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol,
Man erhält l.Jo g (95%) eines zum Teil kristallenen Produktes XXIXb. Es ist gemäß TLC in P1 homogen. · Q2 = -6.0° (c=l,ol; DMP).
Cbo-Phe-Val-Arg(NO2)-2-NA (XXIXc)
A us gangs material: 1,65 g (2,84m Mol) XXIXb und 1,4.5 g O,k m Mol) Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ic.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
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Man erhält 1,55 g {15%) eines amorphen Produktes XXIXc. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
p2 = -10,9° (e=l,01; DMF).
NCv._Bz_phe_Val-Arg(N02)-2-NA (XXIXd)
Ausgangsmaterial: .1,15 g (1,58m Mol) XXIXc und ΚΘ5 mg (2.05m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
R Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 0,89 g (8o,3$) eines zum Teil kristallenen Produktes XXIXd. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
*~ D = -31.1° (o=l,öl; DMF).
N^-Bz-Phe-Val-Arg-2-NA . HCl (XXIX)
Ausgangsmaterial: 620 mg (0,89 m Mol) XXIXd. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig. Reinigung: Gelfiltration an SephadexR G-I5 in 5o#iger Essigsäure.
Man erhält 385 mg (ό3>#) eines amorphen gefriergetrockneten Produktes XXIX. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 5,12$ auf und ist gemäß TLC in A homogen.
ο2 = -53..8° (c=0,71; 50$ AcOH). Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
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Beispiel XXX:
Nd._Bz-Phe-Val-Arg-l-nitro-2-NA · HCl (XXX) Cbo-Arg (NO2)-l-nitro-2-NA (XXXa)
Ausgangsmaterial: 3,6 g (Io m Mol) Cbo-Arg(NO2)-OH und 2,26 g (12 m Mol) l-Hitro-2-naphthylamin.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ia-2.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 3,85 g (J3,l% des amorphen Produktes XXXa. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
*9 = -11.8° (c=l.0; DMF).
Cbo-Val-Arg(NO2)-1-nitro-2-NA (XXXb)
Ausgangsmaterial: 95o mg (1,8 m Mol) XXXa und 825 mg (2,2 m Mol) Cbo-Val-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 0,9 g (8o#) eines zum Teil kristallenen Produktes XXXb. Es ist gemäß TLC in P1 homogen.
Cbo-Phe-Val-Arg(NO2)-l-nitro-2-NA (XXXc)
Ausgangsmaterial: 800 mg (1,27 m MoI)1XXXb und o4o mg (1,52 m Mol) Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ic.
TD
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol,
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Man erhält 785 mg (79,9$) des amorphen Produktes XKXc. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
d~ = ~7'°° (°=l'02'> DMp)·
N^-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-nitro-2-NA (XXXd)
Ausgangsmaterial: 680 mg (0,88 m Mol) XXXb und 2öO mg (115 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 48o mg (73$) des amorphen Produktes XXXd. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
jd] ^4 = -31,4° (c=0,9; DMP).
Nök-Bz-Phe-Val-Arg-l,nitro-2-NA · HCl (XXX)
Ausgangsmaterial: 48o mg (0,65 m Mol) XXXd. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Tj
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-I5 in jjyol Essigsäure.
Man erhält 258 mg (57$) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXX. Es weist einen Chlorgehalt von 4,80$ uaf und ist gemäß TLC in A homogen.
D2 = -^9,7° (c=0,7J>; 5o$ AcOH). '
Beispiel XXXI:
N^-Bz-Phe-Val-Arg-4-nitro-l-NA » HCl (XXXI)
Cbo-Arg(N02)-4-nitro-l-NA (XXXIa)
Ausgangsmaterial: p,6 g (Io m Mol) Cbo-Arg(N02)-0H und
- 50 -
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:->,'do g (12 in Mol) 4-Kitro-l-naphthylamin. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ia-2.
Ti
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält j>,6l g jO>S) eines zum Teil kristallenen Produktes XXXa. Es ist gemäß TLC in P1 homogen. ^2 = -11,4° (c= l,ol; DMF).
Cbo-Val-Arg(N02)-4-nitro-l-NA (XXXIb) .
Ausgangsmaterial: 650 mg (1.2,5 m Mol) XXXIa und 55O mg (1,45 m Mol) Cbo-Val-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 460 mg (60#) des amorphen Produktes XXXIb. Ss ist gemäß TLC in P-, homogen.
Cbo-Phe-Val-ArgiN02)-4-nitro-l-NA (XXXIc)
Ausgangsmaterial: 450 mg (0,72 m Mol) XXXIb und j5o5 mg (0,86 m Mol) -Cbo-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Jc.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol.
Man erhält 500 mg (90$) eines zum Teil kristallenen Produktes XXXIc. Es ist gemäß TLC in P1 homogen. ^4= -6.0° (c=l,Oj DMF).
-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-4-nitro-l-NA XXXId)
Ausgangsmaterial: 490 mg (0,635 m Mol) XXXIc und 180 mg (0,8o rn Mol) Bz2O.
- 51 -
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2322118
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Id.
JD
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol,
Man erhält 400 mg (84,7#) des amorphen Produktes XXXId. Es ist gemäß TLC in P, homogen.
N^-Bz-Phe-Val-Arg-4-nitro-l-NA * HCl (XXXl)
Ausgangsmaterial: 380 mg (0,51 m Mol) XXXId. Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-I5 in 5o#lger Essigsäure.
Man erhält 3oj5 mg (81%) des amorphen gefriergetrockneten Produktes XXXI. Das Produkt weist einen Chlorgehalt von 4 auf und ist gemäß TLC in A homogen. = -37,7° (c=O,74; 50# AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 0,9.
Beispiel XXXII:
N^-Bz-Phe-Val-Lys-pNA . Hcl (XXXII)
Nd--BOC-Lys(£-Cbo)-pNA . (XXXIIa)
6,3 g (11,2 m Mol) N^-B0C-Lys-(£-Cbo)-OH * DCHA werden in 4o ml trockenem frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst. Danach werden 5 g (3o,5 m Mol) p-Nitrophehylisocyanat portionsweise unter Rühren und in einer feuchtigkeitsfreien Atmosphäre zugegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung gemäß der in Beispiel Ia angegebenen Beschreibung behandelt. Nebenprodukte der Reaktion sind N, N'-Bis-p-nitro-phenylcarbamid und N-p-Nitrophenyl-N, N'-dlcyclohexylcarbamid, .die kaum löslich in Methanol sind.
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Das Produkt wurde durch Gelfiltration an einer Kolonne mit Sephadex LH
setzt, gereinigt.
mit Sephadex LH-2o, mit Methanol ins Gleichgewicht ge-
Man erhält 4,17 g (7^,5#) des zum Teil kristallinen Produktes XXXIIa. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen.
N^-BOC-VaI-Lys (fc-Cbo)-pNA (XXXIIb)
10 ml frisch destillierte Trifluoresslgsäure werden zu 2,2o g (4,4 m Mol) XXXIIa in einer feuchtigkeitsfreien Atmosphäre gegeben. Nach 60-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung in 15O ml trockenen Äther unter heftigem Rühren eingegossen. Dies führt zu der Ausfällung von CP5COOH · H-Lys (£-Cbo)-pNA in Form <änes Öls, das beim Kühlen hart wird. Die Ätherphase wird dekantiert und der Niederschlag weitere drei mal mit 75 ml trockenem Äther behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum über Natriumhydroxid und Phosphorpentoxid erhält man das Trifluoracetat des Lysinderivats in quantitativer Ausbeute (2,25 g).
2,25 g (4,4 m Mol) CF^COOH . H-Lys(fc-Cbo)-pNA werden in Io ml DMP gelöst und auf -100C gekühlt. 0,75 ml (5,5 m Mol) Trläthylamin werden zugegeben, um das Aminosäurederivat aus seinem Trifluoracetat freizusetzen. Danach versetzt man 2,0 g (5,5 m Mol) BOC-VaI-OpNP. Nachdem die Reaktionslösung nach mehreren Stunden Raumtemperatur erreicht hat, wird sie erneut gekühlt und mit 0,^1 ml (2,2 m Mol) Triäthylamin gepuffert. Die Puffermaßnahme wird nach etwa 2 Stunden ein weiteres Mal wiederholt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung im Vakuum bei ca. 40°C zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird dreimal mit 2o ml destilliertem Wasser behandelt und im Vakuum getrocknet.
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Das Rohprodukt wird in Methanol gelöst und durch Gel»- filtration auf einer Kolonne mit mit Methanol ins Gleichgewicht gesetztem Sephadex LH-2o gereinigt. Man erhält aus dem Eluat eine Fraktion mit einem Gewicht,von 2,12 g (80,yft) XXXIIb. Das Produkt ist gemäß TLC in P1 und C homogen.
22 = _lj9o (Cslf0; DMP).
BOC-Phe-Val-Lys fc -Cbo)-pNA (XXXIIc)
Ausgangsmaterial: 0,85 g (1,42m Mol) XXXIIb und 0,77 g (2,0 m Mol) BOC-Phe-OpNP.
Herstellungsverfahren: gemäß Beispiel XXXIIb. Reinigung: Gelfiltration an Sephadex LH-2o in Methanol
Man erhält 0,84 g (79,3$) des amorphen Produktes XXXIIc.
Das Produkt ist gemäß TLC in P1 homogen. = -9,3° (c=l,02; DMP).
N d-Bz-Phe-Val-Lys (£ -Cbo) -pNA (XXXIId)
Ausgangsmaterial: 6OO mg (O,8o4m Mol) XXXIIc und 280 mg (1,25 m Mol) Bz2O.
Herstellungsverfahren: Decarbobutyloxylierung von XXXIIc wird analog zu dem Verfahren des Beispiels XXXIIIb durchgeführt.
608 mg CP3COOH * H-Phe-Val-Lys(£-Cbo)-pNA werden in Io ml DMF gelöst und auf -10°C gekühlt. Danach fügt man H^ ml (0,8 m Mol) Triäthylamin hinzu, um das Peptidamin aus seinem Salz in Freiheit zu setzen. 28o mg (1,25 m Mol) Bz2O werden zu der Lösung bei einer Temperatur von -100C gegeben. Die Lösung wird danach gepuffert und gemäß Beispiel XXXIIb behandelt. Die Gelfiltration des Rohproduktes an einer
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■ρ
Kolonne mit Sephadex LH-2o in Methanol ergibt 46o mg Produkt, das gemäß TLC in P1 und C homogen ist. g4= -22.8° (c=O,99J
N d.-Bz-Phe-Val-Lys-pNA · HCl (XXXII)
Ausgangsmaterial: 28o mg (0,373 m Mol) XXXIId. Herstellungsverfahren: Gemäß Beispiel Ig.
Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 5o#iger Essigsäure.
Man erhält 172 g (71#) cles amorphen gefriergetrockneten Produktes XXXII mit einem Chlorgehalt von 5,39 #· Das Produkt ist gemäß TLC in A homogen.
AcOH). .
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Phe: 0,9; Lys 1,1.
Die gemäß den vorstehenden Beispielen hergestellten Substrate wurden in der folgenden Weise zur Bestimmung von verschiedenen Enzymen verwendet:
Das Prinzip der Bestimmung beruht auf der Tatsache, daß das durch die enzymatische Hydrolyse gebildete Produkt ein UV-Spektrum aufweist, welches von dem des Substrats vollständig getrennt ist. Das Substrat gemäß Beispiel I, N1^- Bz-Phe-Val-Arg-pNA · HCl, weist somit ein Absorptionsmaximum bei 3o3 nm mit einem molaren Extinctionskoeffizienten von 12900 auf. Die Absorption des Substrats ist bei 4o5 nm nicht signifikant. p-Nitroanilin (pNA), das aus dem Substrat während der enzymatischen Hydrolyse gebildet wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 13200 auf, welcher bei 4o5 nm lediglich auf 9620 vermindert ist.
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Die enzymatische Reaktion kann in der folgenden Weise scheniatisch wiedergegeben werden:
kl k3
E + .q ■ ES ^ES1 + Chromophor P1
Ic2 1^
E + P2
E = Enzyme S 3= Substrat ES = Enzym-Substrat-Komplex Pl und P2 = Produkte
ki, k2, kx und kij. = Geschwindigkeitskonstanten
k2 Dissoziationskonstant, für ES = -^— =.Km {Michaelis TKons t. )
Wenn (S) >^ (E) und k^ <$C k^ ist, gilt:
K CtP) - (ESl7x (S) (1) (BB)
Die Bildungsgeschwindigkeit des Chromophors ist: ν =k-j> χ (ES)
k, x (E) χ (S)
v=—2 r- (2)
Km+ (S)
Wenn alles E an S gebunden ist, gilt: (ES) = (E) und
v = Vtx = k3 x
Lineweaver-Burk-Gleichung: K.
max
- 56 -3098O/1
Wie sich aus Gleichung (2) ergibt, bestimmen die Konstanten K und k^ die Wirksamkeit des Enzymsubstrats für ein vorgegebenes Enzym. Zum Zweck der Bestimmung dieser Konstanten wird im wesentlichen das folgende Verfahren angewandt: Das Enzym und das Substrat werden in einer Pufferlösung gemischt und die Reaktion wird spektrophotometrisch 5 Minuten lang verfolgt. Die Konzentration des Substrats (S) wird variiert, während die Enzymkonzentration (E) für jedes Substrat konstant gehalten wird. Die Extinktion (OD) wird als Punktion der Zeit aufgetragen. Aus der in dieser Weise erhaltenen Kurve ergibt der Tangent (=Differenz der Extinktion pro Minute, /Nk OD/min., aus der die Menge in uMol des gebildeten p-NÄ/min (v) berechnet werden kann) zur Zeit Null die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit, v. Wenn __ gegen ,^\ aufgetragen wird, erhält man K und ν „ (aus äer Gleichung (4)) aus dem Diagramm, ro max
K1n und k-5 (= max ) für Thrombin und verschiedene
Enzymsubstrate sind in Tabelle 1 und für Trypsin in Tabelle wiedergegeben. Die Daten bezüglich Km und k, sind in solchen
Fällen nicht angegeben, in denen die Werte nicht bestimmt worden sind, oder diese konnten nicht bestimmt werden, weil keine lineare Abhängigkeit zwischen 1 und 1 erhalten wurde.
Eine orientierende Bewertung der Enzym-Substrat-Beziehung für verschiedene Substrate kann erhalten werden, indem man die Menge des pro Minute und pro ml gebildeten p-Nitroanilins bei gleicher Substratkonzentration vergleicht. Dies ist in Tabelle J> für Thrombin, in Tabelle 4 für Trypsin und in Tabelle 5 für das Enzym Reptilase , welches ein aus Bothrops Atrox isoliertes und in seiner Wirkungsweise dem Thrombin ähnliches Enzym 1st, sowie in Tabelle 6 für Plasmin gezeigt.
Optimale Bedingungen für die Arnidolyse des Substrats gemäß Beispiel I mit Thrombin werden bei einem pH-Wert von 8,2, einer
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Ionenstärke von 0,13 bis 0,15 und einer Temperatur von 37 - 40°C erhalten.
Die in den Tabellen verwendeten Buchstaben NIH beziehen sich auf Einheiten des National Institute of Health. Die Trypsineinheit ist gleich der Hydrolyse eines uMols N^-Tosyl-arginin-methylester-Hydrochlorid (TAME) pro Minute bei 25°C und einem pH-Wert von 8,1 in Gegenwart von 0,01 MjI Kalziumionen. Das Trypsin wurde von der Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., USA erhalten. Das Plasmin wurde von AB Kabi, Stockholm, Schweden, erhalten. 1 mg entsprach 3 Kaseineinheiten (CU).
Tabelle 1: Thrombinaktivität
K und k-, m 3
Substrat
Substrat-
Konz.
(uMol/1
Enzymkonz. ,NIH/ml)
Km χ 10* Mol/l
k5 χ ΙΟ2*- (uMol/min, NIH/ml)
ΒΑΡΝΑ 250-666 5o 5 6 6<i 11
I I9.3-89.6 0, 1, 8 134o
II 28.2-94.Ο 5 5 0, 55 5o
VIII I9.3-89.6 0, 0, 91 360
XII 3I.8-I06.O 5 3, Ho
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Tabelle 21 Trypsinaktivität, Km und k
Subs trat
Substrat-
konz.
(uMol/1)
Enzymkonz. (NIH/ml) Km χ 10*
(Mol/l)
uMol/min, NIH/ml
BAPNA
VIII
XII
255-666 75
19.0-88,2 3
28.2-94.Ο 3
19.0-88,2 3
31.8-I06.O 3
16
0,31
1,01
0,31
0,89
8,3 110
112" 98
60
Tabelle 3: Thrombinaktivität
Substrat
Substratkonz.
uMol/ml
Enzymekonz.
NIH-Einheiten/ml
Gebild.p-Nitroanilin Ί1Μ0 l/min und ml
BAPNA 333.0 5o,o
I 64,6 0,417
VI 57,4 0,:4l7
VIII 65,4 0,417
IX 66,4 0,417
X 58,2 0,417
XI 65,1 0,417
XVIII 06,9 0,417
XIX 66,2 0,417
XX 67,6 0,417
XXI 65,6 0,417
XXII 65,7 0,417
XXIV 65,6 0,417
XXV 56,4 0,417
XXVI 64,7 0,417
XXXII 59,0 0,417
I,o4
6,0
0,3
2,7
0,5
1,7
0,2
5,6
0,3 0,2
1,7 2,0 0,4 0,6 1,4 0,1
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€0
Tabelle 4: VI Trypsinaktiv!tat Enzymkonz. Gebild.p-Nitroanilin
VIII Substratkonz Einheiten/ml nMol/min und /ml
Substrat IX nMol/ml 2,o8 6,1
X 0,0833 16,3
ΒΑΡΝΑ XI 66,7 0,0833 12,9
I XVIII 66,2 0,0833 11,1
V XIX 67,4 0,0833 13,7
XX 65,4 0,0833 6,8
XXI 56,4 0,0833 13,1
XXII 58,2 0,0833 1,6
XXIII 65,1 0,0833 14,1
XXIV 66,9 0,0833 5,5
XXV 66,2 0,0833 6,2
XXVI. 67,6 0,0833 14,0
XXXII 65,6 0,0833 6,2
o5,7 0,0833 5,9
57,1 0,0833 6,2
66,6 0,0833 10,9
65,4 0,0833 23,7
64,7 0,0833 2,9
69,0
- 60 -
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Tabelle 5: ReptilaseR-Aktivität
Substrat
Substratkonz. nMol/ml
Enzymkonz. Einheiten/ml
Gebild.p-Ni troanllin nMol/min und /ml
XIII
XV
66,7 66,7 66,7 66,7
0,5 0,5 0,5 0,5
4,4 5,0 4,6 2,2
Tabelle 6: Piasminaktivität
Substrat
Substratkonz, nMol/ml
Enzymkonz, CU-Einheiten/ml
Gebild.p-Ni troanilin nMol/min und /ml
I 66,7 0,167 5,6
V 66,2 0,167 6,2
VI 67,4 0,167 4,l'
VIII 65,4 0,167 7,6
IX 66,4 0,167 3,4
X 58,2 0,167 2,7
XI 65,1 0,167 4,7
XVIII 66,9 0,167 5,3
XIX 66,2 0,167 2,1
XX 67,6 0,167 2,1
XXI 65,6 0,167 3,4
XXII 65,7 0,167 2.2
XXIII 67,1 0,167 5,4
XXIV 66,6 0,167 2,5
XXV 66,5 0,167 4,3
XXVI 64,7 0,167 6,2
XXXII 69,0 0,167 5,7
- 61 -
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Die Tabellen 1 bis 6 zeigen in eindeutiger Weise die Vorteile der Enzymsubstrate der Erfindung im Vergleich zu dem bekannten Amidsubstrat für Trypsin (BAPNA). Infolge Ihrer größeren Empfindlichkeit ermöglichen die Substrate der Erfindung die Bestimmung von kleinen Enzymmengen, ohne daß dabei die Genauigkeit der Bestimmung gefährdet wird. Vom klinischen Standpunkt gesehen ist dies sehr wichtig, da dadurch die Probenentnahme erleichtert wird.
Die Blutkoagulation ist ein sehr komplizierter Vorgang, bei dem die Umwandlung des Pibrinogens zu Fibrin durch Thrombin enzymatisch reguliert wird. Verschiedene der anderen Koagulationsfaktoren des Blutes sind durch Reaktionen in der gleichen Weise am Thrombin gekoppelt. Die Enzymsubstrate der Erfindung ermöglichen, diese Koagulationsfaktoren zu bestimmen.
Die folgende Bestimmung des Antithrombins gründet sich im Prinzip auf die Tatsache, daß eine bekannte Thrombinmenge im Uberschluß einer Plasmäprobe zugesetzt wird. Das freie Antithrombin im Blut wird an das zugesetzte Thrombin gebunden, und das überschüssige Thrombin wird dann mit Hilfe des Enzymsubstrats bestimmt. ^Danach kann die reagierende Menge des Antithrombins berechnet werden.
■Anti thrombinbes timmung
Venöses Blut wird defitoüinogeniert und zentrifugiert. 0,5 ml Plasma werden entnommen und mit 2 ml einer Trisimidazol-Pufferlösung gepuffert. 0,1 ml einer wässrigen Thrombinlösung (10 NIH *= National Institute of Health) werden .dann mit 0,25 ml dieser Plasmalösung für genau 5 Minuten bei
- 62 -
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einer Temperatur von 37 - 40°C inkubiert. 1 ml einer vorgewärmten Pufferlösung und 0,25 ml einer wässrigen Enzym- Substratlösung (1 mg/ml) werden nacheinander zugegeben. Die Mischung wird dann,genau 1 Minute lang bei einer Temperatur von J57 - 40°C inkubiert. Die Reaktion wird dann mit 0,25 ml konzentrierter Essigsäure gestoppt. Die Extinktion wird bei 4o5 nm an einem Spektrophotometer abgelesen.
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Claims (2)

  1. Patentansprüche
    /Ή. Substrat der allgemeinen Formel
    R1 -NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-Rc-R2 R^ (CH2Jn-NH-Rj+
    in der R-^ ein Wasserstoff atom, eine Acylgruppe mit 1 - 12 C-Atomen, eine U7-Aminoaeylgruppe mit 1-12 C-Atomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine tä-Cyelohexylaeylgruppe, eine 4-Aminomethyl-cyclohexylcarbonylgruppe, eine gegebenenfalls mit einem Halogenatom, einer Methyl-, Amino- oder Phenylgruppe od.dgl. oder mehreren dieser Substituenten substituierte Benzoylgruppe, eine Itf-Phenylacylgruppe mit 1 - 5 C-Atomen im Acylteil und deren Phenylgruppe gegebenenfalls substituiert ist, oder eine Benzolsulfonyl-, 4-Toluolsulfonyl- oder N0*—Benzoyl-phenylalanylgruppe ist, und
    R2 eine Phenyl-, Benzyl, 4-Hydroxybenzyl-, 4-Methoxybenzyl- oder 4-Methylbenzyogruppe,
    R-, eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3-8 C-Atomen oder eine Phenyl- oder Benzylgruppe, η die Zahlen 2, 3 und 4,
    Rh ein Wasserstoffatorn oder eine Guanylgruppe sowie
    Rc; eine Phenyl-, Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Chin.olyl- oder Nitrochln.olylgruppe bedeuten, sowie, deren Salze.
    - 64 -.
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  2. 2. Substrat mit hoher Empfindlichkeit für proteolytische Enzyme vom Typ der Peptid-Peptidohydrolasen wie Thrombin, Plasmin oder Trypsin, zur diagnostischen Verwendung, gekennzeichnet durch die Verbindung der obigen allgemeinen Formel, wobei R1, R2, R-*, R^, Rc und η wie oben definiert sind. '
    - 65 -
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