FI56828C - Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser - Google Patents

Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser Download PDF

Info

Publication number
FI56828C
FI56828C FI1299/73A FI129973A FI56828C FI 56828 C FI56828 C FI 56828C FI 1299/73 A FI1299/73 A FI 1299/73A FI 129973 A FI129973 A FI 129973A FI 56828 C FI56828 C FI 56828C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
product
mmol
phe
arg
val
Prior art date
Application number
FI1299/73A
Other languages
English (en)
Other versions
FI56828B (fi
Inventor
Gustaf Erik Birger Blombaeck
Margareta Blombaeck
Karl Goeran Claeson
Lars-Gundro Svendsen
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Application granted granted Critical
Publication of FI56828B publication Critical patent/FI56828B/fi
Publication of FI56828C publication Critical patent/FI56828C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/13—Luteinizing hormone-releasing hormone; related peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

GSFH M (11)KUULUTUSJULKAISU
fWA lJ 1 U UTLÄGGNINOSSKRIFT DDOZO
C (45) Patentti myönnetty 10 C4 1930 £n\g Patent neddelat ^ ^ (51) Kv.lk.'/lnt.ci.* C 07 C 103/52 SUOMI —FINLAND (21) P«*nttlh*k*mu* — Pauntanteknlnf 1299/73 (22) Hakamlapiivl — Aittöknlngsdtg 2 4. OH.7 3 ^ ^ (23) Alkupllvt—Glltlghutsdag 24. 04. 73 (41) Tullut luikitaksl — Bllvlt offuntllg 03.11.73
Patentti· ja rekisterihallitus (44) NthttvUuip™, j. kuuLiultataun pvm.-
Patent- och ragittarstyralaan ' Anattkan utlagd och utljkrtften publker»d 31.12. T9 (32)(33)(31) Pyydetty etuolkiui— Begird prlorltet 02.05-72 Ruotsi-Sverige(SE) 5757/72 (71) Aktiebolaget Kabi, Lindhagensgatan 133, Stockholm, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Gustaf Erik Birger Blombäck, Solna, Margareta Blombäck, Solna,
Karl Göran Claeson, Göteborg, Lars-Gundro Svendsen, Mölndal, Ruotsi-Sverige(SE) (74) Berggren Oy Ab (54) Uusia yhdisteitä käytettäviksi taudinmäärityksessä, jotka yhdisteet ovat erittäin spesifisiä yhdisteitä trombiinin ja muiden proteolyyttisten pep-tidyylipeptidihydrolaasityyppisten entsyymien suhteen - Nya diagnostiskt verksamma substrat med hög specificitet tili trombin och andra proteoly-tiska ensymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser Tämä keksintö koskee uusia yhdisteitä käytettäviksi taudinmäärityksessä, jotka yhdisteet ovat erittäin spesifisiä yhdisteitä trombiinin ja muiden proteolyyttisten peptidyylipeptidihydrolaasi-tyyppisten entsyymien suhteen. Keksinnön mukaiset aineet on tarkoitettu luokiteltujen ja tähän saakka luokittelemattomien, tyyppiä E.C. 3.4.4. olevien entsyymien kvantitatiiviseen määritykseen, erityisesti sellaisten, jotka hajottavat peptidiketjun peptidejä tai proteiineja enginiinin ja lysiinin karboksyylipuoliskosta. Näitä aineita voidaan käyttää edelleen niiden reaktioiden tutkimiseen, joihin tällaiset entsyymit ottavat osaa, esim. entsyymien esiasteiden, entsyymien vasta-aineiden ja entsyymien inhibiittoreiden määrittämiseen.
Entsyymien luokituksessa käytettiin The International Union of Biochemistry, Elsevier, Amsterdam 1965 suosittelemaa entsyyminimistöä. Tähän astiluokittelemättomista entsyymeistä mainittakoon erityisesti Reptilase ® ja Arvine^i
Yhdisteitä (substraatteja), joita on aiemmin käytetty yllä mainittujen entsyymien kvantitatiiviseen määritykseen, kuvataan teoksessa "Methoden der entzymatischen Analyse", Voi I, s. 1023 (julk. Bergmeyer, H.U., Verlag Chemie, 1970). Riippuen siitä, kumpi valkuaista hajottavien entsyymien katalyyttisistä reaktioista tapahtuu -esterolyyttinen vai amidolyyttinen - nämä synteettiset substraatit 2 56828 voidaan periaatteesta jakaa kahteen pääryhmään: esterisubstraattei-hin ja amidisubstraatteihin. Suurin aikaisemmin käytettyjen synteettisten substraattien ryhmä on esterisubstraattien ryhmä. Tämä johtuu siitä, että nämä muuttuvat paljon nopeammin peptidipeptidohydrolaa-sien vaikutuksesta kuin tähän saakka tuotetut amidisubstraatit. Kuitenkin peptidipeptidohydrolaaseiksi luokiteltujen entsyymien pääasiallinen biologinen tehtävä on kuten nimestäkin ilmenee hydrolysoida luonnon substraattien peptidi- tai amidisidoksia, mutta ei esteri-sidoksia. Kirjallisuudessa (Blood Clotting Enzymology, s. 36 ja 42-44, julk. Seegers W.H., Academie Press, 1967) ilmoitetaan, että näiden entsyymien esterolyyttisten ja amidolyyttisten katalyysien reaktionopeuksien välinen suhde ei ole vakio eri reaktio-olosuhteissa. Tästä syystä synteettiset amidisubstraatit, jotka ovat paljon herkempiä kyseessä oleville entsyymeille ja jotka myös voivat nopeammin hajota mitattaviksi tuotteiksi kuin tähän saakka tunnetut substraatit, ovat olleet haluttuja.
Entsymaattisen hydrolyysin reaktiokulun tutkimiseksi ja seuraamiseksi ovat amidisubstraatit erityisen sopivia, koska niillä voidaan saada: leromoforisia tuotteita, jotka on helppo mitata spektrofotomet-risesti ja joilla on absorptiomaksimit, jotka eivät satu yhteen alkuperäisten amidisubstraattien piikkien kanssa.
Joitakin synteettisiä amidisubstraatteja, joissa on hydrolysoituvia kromoforisia ryhmiä, on tullut käyttöön. Nämä ovat pääasiassa niitä tyyppejä kuin Na-substituoimattomat ja Na-substituoidut monoaminohappo-p-nitroanilidijohdannaiset ja monoaminohappo-B-naf-tyyliamidijohdannaiset. Näistä aineista Na-bentsoyyli-DL-arginiini-p-nitroanilidihydrokloridi (ΒΑΡΝΑ) voidaan mainita trypsiinin (E.C.
3-4.4.) reagenssina ja niiden reaktioiden reagenssina, joihin tryp-siini ottaa osaa. Tämän substraatin entsymaattinen hydrolyysi tuottaa kromoforisena tuotteena p-nitroaniliinia, joka voidaan helposti mitata spektrofotometrisesti.
Näillä aiemmin tunnetuilla amidisubstraateilla ei kuitenkaan ole haluttua spesifisyyttä ja herkkyyttä. Tämä on merkittävä haitta, joka saattaa johtaa monimutkaisempaan menettelyyn näytteenotossa, koska tällöin vaaditaan huomattava määrä biologista materiaalia.
Sitä paitsi entsymaattinen reaktioaika on pitkä ja entsyymin määrityksen tarkkuus saattaa olla epätyydyttävä.
Varsinkaan trombiinille ei ole olemassa synteettistä amidi-substraattia, joka toimisi tyydyttävästi. Esimerkiksi BAPNA:a käyte- 3 56828 tään pääasiassa trypsiinille eikä se ole kovin sopiva trombiinimää-ritykseen, sillä sen herkkyys tälle entsyymille on alhainen. Tämän keksinnön mukaiset uudet amidityyppiset substraatit, joiden herkkyys trombiinille ja muille peptidyylipeptidihydrolaaseille on hyvin suuri, esitetään seuraavalla yleisellä kaavalla: 0 0 0
Il II P
R, -NH-CH-C-HN-CH-C-NH-CH-C-NH-Rr- 1 I I I 5 R2 R3 (CH2)n
NH
Ri| tai sen suoloina, jossa kaavassa R^ voi olla vetyatomi, 1-8 C-atomia sisältävä asyyliryhmä, 1-6 C-atomia sisältävä ω-aminoasyyliryhmä, sykloheksyylikarbonyyliryhmä, ω-sykloheksyyliasetyyliryhmä, 4-amino-metyylisykloheksyylikarbonyyliryhmä, bentsoyyliryhmä, bensoyyliryhmä, joka on substituoitu metyyli- tai aminoryhmillä, ω-fenyyliasyyliryh-mä, jonka asyyliosassa on 1-3 C-atomia ja jonka fenyylirengas voi olla substituoitu aminoryhmällä, ^-tolueenisulfonyyli-, Na-bentsoyyli-fenyylialanyyli- ja fenyylialaniiniryhmä, R2 voidaan valita ryhmästä, johon kuuluvat fenyyli-, bensyyli-, 4-hydroksibensyyliryhmä, R^ voi olla haarautunut alkyyli, jossa on 3-4 C-atomia, n voi olla 3 tai 4, R^ voi olla vetyatomi tai guanyyliryhmä,
Rc voi olla nitrofenyyli-, naftyyli- tai nitronaftyyliryhmä.
o 56826 Nämä uudet substraatit voidaan valmistaa kahden periaatteessa eri menetelmän mukaisesti.
1. Ensimmäinen menetelmä perustuu kromoformisen ryhmän R5 parit-tamiseen kyseessä olevaan aminohappoon ja sen jälkeen asteittaiseen halutun peptidirakenteen kokoamiseen jäljellä olevien aminohappojen vähittäisellä parittamisella. Kromoforista ryhmää käytetään tässä ensimmäisen aminohapon C-päätekarboksyyliryhmän suojastusryhmänä.
2. Toinen menetelmä perustuu asteittaiseen halutun peptidirakenteen kokoamiseen ja sen jälkeiseen käytettyjen suojastusryhmien poistoon ja lopulta kromoförisen ryhmän R,- parittamiseen peptidirakentee-seen.
Peptidijohdannaisten vaiheittaisessa synteesissä on käytetty sellaisia paritusmenetelmiä, jotka ovat yleisesti käytettyjä pepti-dikeamiassa. Sellaisia hyvin tunnettuja suojausryhmiä, joita käytetään yleisesti peptidikemiassa, kuten esim. Cbo (karbobensoksi-), MeOCbo (p-metoksikarbobensoksi-), NC^CbO (p-nitrokarbobensoksi-), MCbo (p-metoksifenyyliatsokarbobensoksi-), BOC (tert.-butyylioksi-karbonyyli-), TFA (trifluoriasetyyli-) tai formyyliryhmiä, käytetään aminoryhmän suojastusryhminä. α-karboksyyliryhmä voidaan aktivoida muuttamalla se erilaisiksi, peptidikemiassa hyvin tunnetuiksi ja usein käytetyiksi johdannaisiksi, jotka voidaan joko eristää tai kehittää itse seoksessa, esim. p-nitrofenyyliesteriksi, trikloori-fenyyliesteriksi, pentakloorifenyyliesteriksi, N-hydroksisukkinimidi-esteriksi, happoatsidiksi, hanpoanhydridiksi, joka voi olla symmetrinen tai epäsymmetrinen. Se voidaan myös aktivoida karbodi-imidillä, kuten N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidillä. Aminopeptidijohdannai-sessa tai aminohappojohdannaisessa oleva C-päätekarboksyyliryhmä voidaan suojata esteröimällä se esim. metyyli-, etyyli- tai isopropyy-liesteriksi tai muuttamalla se kromoforiseksi aniliinijohdannaiseksi, joka täten toimii suoj astusryhmänä peptidiket jun kokoamisen ajan. Ne vapaat reaktiokykyiset ryhmät, jotka eivät osallistu reaktioon, voidaan peptidien tai peptidijohdannaisten synteesin ajaksi suojata seuraavalla tavalla:
Arginyyli δ-guanidiryhmän ja lysyyli ε-aminoryhmän suojestämiseen voidaan käyttää sellaisia peptidikemiassa yleisesti käytettyjä aminosuojastusryhmiä kuin esim. NC>2:a, Tos:ia (p-tolueenisulfonyyli-ryhmä) tai pelkkää protonin muodostusta guanidiryhmän suojaamiseen, ja Cbo:a (karbobensoksiryhmä),BOC:ia (tert.-butyylioksikarbonyyli-ryhmä) tai myös Tos:ia ε-aminoryhmälle. Tyrosiinissa olevan hydrok-syyliryhmän suojauksena voidaan käyttää sellaisia yleisesti neptidi- S G 8 2 8 5 kemiassa käytettyjä suojastusryhmiä, kuin esim. bensyyli- ja tert.-butyylisuoj astusryhmiä.
Peptidirakenteen vaiheittaisessa synteesissä voidaan suorittaa järjestelmällinen puhdistus geelisuodatuksella jokaisen uuden aminohapon parituksen jälkeen. Tähän geelisuodatukseen käytetään kolonnia, joka on täytetty geelisuodatukseen sopivalla aineella, esim. silloitetulla dekstraanigeelillä, joka on tyyppiä Sephadex®G tai LH, valmistaja Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala, Ruotsi. Toinen sopiva geeli koostuu vinyyliasetaatin kopolymeereistä, esim. tyypistä Mercogel^ OR-PVA, valmistaja AG E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta. Geelimateriaalia käytetään tasapainotettuna sopivalla liuottimena ja eluointi suoritetaan sitten samalla liuottimena.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä, jotka esittävät erilaisten keksinnön mukaisten substraattien valmistusta asteittaisella synteesillä. Nämä esimerkit eivät kuitenkaan rajoita keksinnön suojapiiriä.
Eluaatin ja tuotteiden ohutlevykromatografisessa analyysissä käytettiin lasilevyjä, joissa silikageeli (F 254, valm. AG E, Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) toimi absorptioväliaineena. Ohut-levykromatogrammien kehitykseen on käytetty seuraavia liuotinsystee-me j ä: A: n-butanoli:etikkahappo:vesi (3:1:1) C: n-propanoli:etyyliasetaatti:vesi (7:1:2) D: n-heptaani:n-butanoli:etikkahappo (3:2:1) P^: kloroformi:metanoli (9:1)
Ohutlevykromatografoinnin jälkeen tutkittiin ensin levyjä UV-valossa (254 nm) ja sen jälkeen käytettiin kloori/toluidiinireaktiota (Ref. : G. Pataki: DiinnschluOhtchromatografie in der Aminosäure und
Peptid-Chemie, Walter de Gryter & Co., Berliini, 1966, s. 125) kehitysmenetelmänä .
Alla olevilla lyhenteillä on seuraavat merkitykset.
Aminohapot:
Lyhenteet merkitsevät aminohappojäännöksiä. Vapaa aminohappo tai peptidi merkitään H-:11a aminoryhmässä ja -CH:lla karboksyyliryh-mässä. Aminoryhmä merkitään aina oikealle ja karboksyyliryhmä vasemmalle. Kaikilla aminohapoilla on L-konfiguraatio ellei toisin mainita.
Arg = arginiini Phe = Penyylialaniini
Ile = isoleusiini Tyr = tyrosiini
Leu = leusiini Vai = väliini
Lys = lysiini C-Ph.Gly = C-fenyyliglysiini* 6
06Ö2U
Muita esimerkeissä käytettyjä lyhenteitä:
Ac = asetyyli
Ac20 = etikkahappoanhydridi
AcOH = etikkahappo BOC = tert.-butyylioksikarbonyyli
Bz = bensoyyli
Bzl = bensyyli
Bx20 = bensoehappoanhydridi
CbO = karbobensoksi DCCI = disykloheksyylikarbodi-imidi DCHA = disykloheksyyliamiini DCV = disykloheksyylikarbamidi DMF = dimetyyliformamidi
EtjN = trietyyliamiini HMPTA = N,N,N' ,N' ,N",N,,-heksametyylifosforitriamidi MCbo = p-metoksifenyyliatsokarbobensoksi
MeOH = metanoli
Na = naftyyliamiini
OtBu = tert.-butyylioksi OEt = etyylioksi OMe = metyylioksi
OpNP = p-nitrofenoksi
OisoPr = iso-propyylioksi pNA = p-nitroanilidi TFA = trifluoriasetyyli
Tos = p-tolueenisulfonyyli TLC = ohutlevykromatografia
Esimerkeissä mainitut lämpötilat ovat °C, ellei toisin mainita.
Geelisuodatukseen käytetyt geelit Sephadex®G-15 ja G-25 ovat molemmat silloitettuja dekstraanigeelejä, joilla on eri silloitugas-teet, valm. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi. Sephadex 'S' LH-20-geeli on hydroksipropyloitu, silloitettu dekstraanigeeli, valm. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi.
Esimerkki I: Να-Bz-Phe-Val-Arg-pNA·HC1 (I)
Esimerkki I a: Cbo-Arg(N02)-pNA (Ia) 1) 35,3 g (0,1 moolia) kuivaa Cbo-Arg(N02)-0H:a liuotettiin 200 ml:an kuivaa juuri tislattua HMTA:a huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 10,1 g (0,1 moolia) Et^N:a ja 24,6 g (0,15 moolia) p-nitrofenyyli-isosyanaattia sekoittaen täysin kuivissa olosuhteissa.
24 tunnin reaktioajan jälkeen huoneenlämpötilassa reaktioseos kaadet-
G o 8 2 U
tiin 2 l:an 2 %:sta natriumbikarbonaattiliuosta sekoittaen. Muodostunut sakka, suodatettiin ja pestiin kolmasti 0,5 1:11a 2 $:sta natriumbikarbonaattiliuosta, kahdesti 0,2 1:11a tislattua vettä ja'tämän jälkeen kahdesti 0,5 1:11a tislattua vettä. Kuivattu epäpuhdas tuote uutettiin lämpimällä metanolilla ja tällä tavoin haluttu tuote ja hieman muita sivutuotteita liuotettiin. Liukenematon jäännös, joka koostui N,N'-bis-p-nitrofenyylikarbamidista, suodatettiin pois ja suodos puhdistettiin kolonnissa, joka sisälsi SephadexR LH-20-val-mistetta tasapainotettuna MeOH:lla.
Saatiin 29,3 g (63,0 %) tuotetta Ia, sp. I85-IB80C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja C:llä, ja jonka /"a7^ = -1,3° ( c = 1,1; AcOH).
2) 35,3 F, (0,1 moolia) Cbo-Arg(N02)-OH:a (kuivattua) liuotettiin 600 ml:aan tetrahydrofuraanin ja DMF:n seosta (1:1). 10,1 g (0,1 moolia) Et^N lisättiin minkä jälkeen liuos jäähdytettiin -10°C:en täysin kuivissa olosuhteissa. 13,7 g (0,1 moolia) isobutyyliklooriformaat-tia liuotettuna 50 ml:an tetrahydrofuraania lisättiin tipottain jäähdytettyyn seokseen 10 minuutin aikana ja vielä toisen 10 minuutin päästä lisättiin 16,4 g (0,1 moolia) p-nitroaniliinia. Kun reaktioseos oli saavuttanut huoneenlämpötilan, se jätettiin seisomaan 24 tunniksi. Reaktioseoksen liuotin tislattiin sitten pois tyhjössä, uutettiin 3-5 kertaa ensin tislatulla vedellä, sitten 5 %sella natriumbikarbonaatilla ja lopuksi tislatullaredellä, minkä jälkeen jäännös kuivattiin tyhjössä.
Puhdistus: uudelleenkiteytys kahdesti MeOH:sta. Emäliuos geelisuoda-tettiin Sephadex® LH-20-geeIillä tasapainoitettuna MeOH:lla.
Saatiin 23,0 g (48,5 %) tuotetta Ia, jolla oli samat fysikaaliset arvot kuin edellisessä esimerkissä.
3) 35,3 g (0,1 moolia) Cbo-Arg(NC>2)-OH:a liuotettiin DMF:in, liuos jäähdytettiin -10OC:en, minkä jälkeen lisättiin 206 g (0,1 moolia) DCCI:a ja 16,4 g (0,1 moolia) p-nitroaniliinia. 24 tunnin reak-tioajan jälkeen huoneenlämpötilassa reaktioliuos haihdutettiin kuiviin ja uutettiin 3-5 kertaa ensin tislatulla vedellä, sitten 5 %' sella natriumbikarbonaattiliuoksella, tislatulla vedellä, 0,5-n HC1: la ja tislatulla vedellä. Jäännös kuivattiin tyhjössä.
Puhdistus: geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä tasapainoitettuna metanolilla.
Saatiin 14,7 g (34,0 %) tuotetta Ia, sp. 186-188°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja C:llä, ja jonka /-0.7^ = _1j38° (C = 1,0; AcOH).
8
S682U
Esimerkki I b: Cbo-Val-Arg(NC).-, )-pNA (Ib) 20,6 g:an (43,5 mmoolia) tuotetta I a lisättiin 110 ml AcOH:a ja 110 ml 4-n HBr AcOH-liuoksena täysin kuivissa olosuhteissa. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 60 min., minkä jälkeen se kaadettiin hitaasti 750 ml:an kuivaa eetteriä samalla kun koko seosta sekoitettiin voimakkaasti, jolloin säestettäessä saatiin 1,5 HBr*H-Arg(N02)-pNA:a. Eetterifaasi dekantoitiin, sakka pestiin vielä neljästi 250 ml: 11a kuivaa eetteriä muodostuneen bensyylibromidin ja ylimäärin olevan HBr:n .ia AcOH:n poistamiseksi. Kun tuote oli kuivattu tyhjössä P^^lla, saatiin aminohappojohdannaisen hydrobromidi kvantitatiivisella saaliilla (20,0 g).
20,0 g (43,5 mmoolia) 1,5 HBr.H.Arg(N02)-pNA:a liuotettiin 150 ml:an DMF:a ja jäähdytettiin 10°C:en. 6,60 g (65,2 mmoolia) Et^N:a lisättiin H-Arg(N02)pNA:a vapauttamiseksi hydrobromidisuolasta. Muodostunut Et^N.HBr suodatettiin pois ja suodokseen, joka jäähdytettiin -10°C:en, lisättiin 20,3 g (54,3 mmoolia) Cbo-Val-OpNP:a. Kun reaktio-seos oli usieden tuntien kuluttua saavuttanut huoneenlämpötilan, se jäähdytettiin jälleen ja puskuroitiin 2,2 g:lla (21,7 mmoolia) Et^N:a. Puskurointimenettely toistettiin vielä kerran suunnilleen 3 tunnin kuluttua. Noin 24 tunnin kokonaisreaktioajan kuluttua reaktioseos kuivattiin tyhjössä 40°C:ssa. Jäännös uutettiin 3 kertaa 100 ml:lla tislattua vettä, minkä jäkeen ne kuivattiin tyhjössä.
Puhdistus: Kiteyttämällä epäpuhdas materiaali uudelleen kah desti MeOH:sta saatiin 12,4 g (50 %) puhdasta Cbo-Val-Arg(NC>2 )-pNA: ta. Emäliuos puhdistettiin geelisuodatuksella kolonnissa, jossa oli Spehadex ^ LH-20-geeliä tasapainoitettuna MeOH:lla. Eluaatista saatiin jae, joka antoi vielä 10,8 g puhdasta ainetta. Fys. omin: O 11 /~a_7p = +5,8° (c=l,0, DMF); sp. 200-202°; homogeeninen TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pirilä ja C:llä.
Esimerkki I c: Cbo-Phe-'Val-Arg(NQ2)-pNA (Ie) Lähtöaine: 28,6 g (50 mmoolia) tuotetta I b ja 31,5 g (75 mmoolia) Cbo-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Kiteyttämällä epäpuhdas tuote uudelleen 3 kertaa MeOH:sta saatiin 14,4 g puhdasta ainetta TLC-analyysin mukaan kehitettynä Ρη:llä. Emäneste puhdistettiin geelisuodattamalla käyttäen Sephadex"' LH-20-geeliä MeOH:ssa, ja tämä antoi 19,6 g puhdasta ainetta TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä.
Saatiin 34,0 g (94,4 %) tuotetta I c, jonka sp. oli 219-222°C, joka oli homogeenista TLC.analyysin mukaan P^-.llä kehitettynä ja jonka /"a_7p5= -17,1° (c=l,0; DMF-AcOH; 99:1).
9 O o82 d
Esimerkki I d: Na-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-0Me (Id) Lähtöaine: 30,7 g (50 mmoolia) Cbo-Phe-Val-Arg(N02)-OMe ja 16,0 g (75 mmoolia) Bz20.
Synteesimenetelmä: Cbo-Phe-Val-Arg(NC>2)-OMe :n dekabrobensoksy-lointi suoritettiin samalla tavoin kuin esimerkissä I b esitettiin.
30,0 g (50 mmoolia) 1,5 Hbr.H-Phe-Val-Arg(N02)-0Me: a liuotettiin 350 ml:an DMF:a ja jäähdytettiin -10°C:en, minkä jälkeen lisättiin 7,6 g (75 mmoolia) Et^N:a. Liuosta sekoitettiin täysin kuivissa olosuhteissa 1 tunti, minkä jälkeen muodostunut Et-^.IIBr suodatettiin pois. Suodos jäähdytettiin -10°C:en ja. 16,0 g (75 mmoolia) Bz2 = a lisättiin. Noin 3 tunnin reaktioajan jälkeen, kun liuos oli saavuttanut huoneenlämpötilan, se jäähdytettiin uudelleen ja puskuroitiin 2,5 g:lla (25 mmoolia) Et-jN:a. Puskurointimenettely toistettiin vielä kerran n. 3 tunnin kuluttua. Noin 2>\ tunnin kokonaisreaktioajan kuluttua liuos haihdutettiin tyhjössä. Jäännös uutettiin ja kuivattiin esimerkissä I b esitetyn menettelyn mukaisesti.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ LH-20-geelillä MeOJIrssa.
Saatiin 26,0 g (88,9 %) tuotetta Id, sp. 138-liH°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettäessä Pirilä ja D:llä ja jonka /_-a/^ = -39,8° (c = l; MeOH).
Esimerkki I e: Na-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-OH (Ie) 11,7 g (20 mmoolia) tuotetta I d liuotettiin 200 ml:an 50 %: sta EtOII:ta ja 200 ml 1-n KOH/95 % EtOH lisättiin. 75 minuutin sekoituksen jälkeen huoneenlämpötilassa C02:a johdettiin liuoksen läpi, kunnes sen pH saavutti arvon 7· Liuos haihdutettiin tyhjössä n'. 25 ml:n tilavuuteen ja laimennettiin sitten H20:lla 500 ml:n kokonaisti-tilavuuteen. Liuos uutettiin 4 kertaa EtOAC:lla, minkä jälkeen vesi-faasi tehtiin happamaksi 1-n HCl:lla pH-arvoon 2,8. Vapautunut benso-yyli-tripeptidihappo, joka saostui hapotuksessa, suodatettiin pois ja pestiin monta kertaa tislatulla vedellä. Aine kuivattiin tyhjössä.
Puhdistus: Uudelleenkiteytys kahdesti MeOH:sta. Emäliuos puhdis-tettiin geelisuodatuksella käyttäen Sephadejr^ LII-20-geeliä MeOH:ssa.
Saatiin 10,1 g (88,5 %) tuotetta I e amorfisessa muodossa, jonka ekvivalenttipairio oli 555,7 ja joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettäessä A:11a ja C:llä.
Esimerkki I f: Na-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (I f) 1) Lähtöaine: 7,2 g (10 mmoolia) tuotetta I c ja 3,1! g (15 mmoolia) Bz20:a.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
10 ® . δόβ20
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex-'' LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 5,2 g (75,5 %) tuotetta I f, sp. 236-237°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pi:llä ja D:llä, ja jonka /”a7^ = -23,0° (c = l; DMF).
2) Lähtöaine: 5,7 g (10 mmoolia) tuotetta I e ja 2,46 g (15 mmoo-lia) p-nitrofenyyli-isosyanaattia.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I a - I mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 5,3 g (75,5 %) tuotetta I f, sp. 235-237°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja D:llä ja jon-ka /“o7^= -22,5° (c = l; DMF).
Esimerkki I g: Na-Bz-Phe-Val-Arg-pNA*HCl (I) 345 mg (0,5 mmoolia) tuotetta I f asetettiin Sakakibara-laitteen reaktioastiaan. 5 ml kuivaa fluorivetyä tiivistettiin astiaan. Kun seosta oli sekoitettu 1 tunnin reaktioaika 0°C:ssa, nitroryhmä, joka suojasi guanidiiniosaa, oli lohjennut pois. Fluorivety tislattiin sitten pois tyhjössä jakuiva jäännös liuotettiin DMF:in. Peptidin fluoridijohdannaisen muuttamiseksi kloorivetysuolakseen lisättiin DMF-liuokseen 0,25 ml väkevää HCl:a. Liuos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Muutosmenettely toistettiin vielä kerran. Jäännös liuotettiin 33 1: seen AcOH:in.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex G-15-geelillä 33 $:sessa
AcOH:ssa.
Saatiin 275 mg (80,7 %) tuotetta I pakastekuivauksen jälkeen amorfisena jauheena, jonka Cl-pitoisuus oli 5,12, joka oli homogee-nista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /_α_7"ρ = -1*3,5° (c=0,69i 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,2; Arg: 0,99·
Esimerkki II: Nct-3~fenyylipropionyyli-Phe-Val-Arg-pNAtHCl (II)
Na-3~f,enyylipropionyyli-Phe-Val-Arg(N02) -OMe (II a) Lähtöaine: 30,7 g (50 mmoolia) Cbo-Phe-Val-Arg(N02)-OMe:a ja 16,3 g (60 mmoolia) 3“fenyylipropionyyli-0pNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20 MeOH:ssa. Saatiin 25,2 g (82,5 %) tuotetta II a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä ?^:llä ja C:llä.
Ma-3_fenyylipropionyyli-Phe-Val-Arg(N02)“OH (Hb) Lähtöaine: 7,1 g (11,5 mmoolia) tuotetta II a.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I e mukainen.
11 5όβ28
Puhdistus: Geeli suodatus Sephade5$^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 6,5 g (93,7 %) tuotetta II b, jonka ekvivalenttipaino oli 584,1, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan A: 11a ja C:llä ke-hitettynä ja jonka f_ a7p = -9,3° (c=l,0; MeOH).
Not-3-fenyylipropionyyli-Phe-Val-Arg(N02) -pNA (Ile) Lähtöaine: 3 g ( 5 mmoolia) tuotetta II c ja 1,23 g (7,5 mmoo-lia p-nitrofenyyliisosyanaattia.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I a - 1 mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geeIillä MeOH:ssa. Saatiin 2,55 g (66,3 %) tuotetta II c, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^: llä.
Na-3-fenyylipropj.onyyli-Phe-Val-Arg-pNA»HCl (II) Lähtöaine: 179 mg (0,25 mmoolia) tuotetta II c. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-15-geelillä 30 $:sessa AcOH:ssa.
Saatiin 45 mg (26,5 %) tuotetta II pakastekuivauksen jälkeen amorfisessa muodossa, jonka Cl-pitoisuus oli 4,91 %» joka oli homogeenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /_"q_7^= -36,7° (c=0,71j 50 % AcOH:ssa).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 0,99.
Esimerkki III: H-Phe-Val-Arg-pNA·2HC1 (III) Lähtöaine: 198 mg (0,28 mmoolia) tuotetta I c.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-25-geelillä 50 I?:sessa AcOH:ssa.
Saatiin: 170 mg (6l,0 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta III, jonka Cl-pitoisuus oli 11,37 %, joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /_a/D - -26,3° (c=0,6l; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 0,95; Arg: 1,0.
Esimerkki IV: H-Phe-Phe-Val-Arg-pNA·2HC1 (IV)
Cb o-Phe-Phe-Val-Arg(NO2)-pNA (IVa) Lähtöaine: 335 mg (0,46 mmoolia) tuotetta I c ja 317 mg (0,75 mmoolia) Cbo-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geeli DMF:ssä. Saatiin 282 mg (70,0 %) tuotetta IV a, jonka sp. oli 201-204°C, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka 56628 /α_7ρ5= -1,02° (c = 0,98; DMF).
H-Phe-Phe-Val-Arg-pNA·HC1 (IV) Lähtöaine: 92,9 mg (0,107 mmoolia) tuotetta IV a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-25~geeIillä 50 £:sessa AcOH:ssa. Saatiin 59,5 mg (75A 2) amorfista, pakastekuivattua tuotetta IV, jonka Cl-pitoisuus oli 9,18 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka /”ix7jp = -19,7° (c=0,76; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai 1,0; Phe: 2,2; Arg: 0,98.
Esimerkki V: p-Me-3z-Phe-Val-Arg-pHA«HCl (V) p-Me-Bz-Phe-Val-Arg(N02)“pNA (Va) Lähtöaine: 155 mg (0,216 mmoolia) tuotetta Ie ja 83,2 mg (0,324 mmoolia) p-Me-Bz-OpNP, sp. l69-172°C.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOfhssa. Saatiin 69,5 g (45 %) amorfista tuotetta V a, joka oli homogeenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä, jonka A"«7jp = “26,1° (c=0,69 J DMF).
p-Me-Bz-Phe-Val-Arg-pNA’HCl (V) Lähtöaine: 68,98 mg (0,0965 mmoolia) tuotetta V a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ 0-15-geelillä 33 5:sessa AcOH:ssa. Saatiin 44,5 mg (66 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta V, jonka Cl-pitoisuus oli 5,01 %, joka oli homogeenista TLC-ana- — —2 3 lyysin mukaan A: 11a. kehitettynä ja jonka /_ a/^ - -40,8° (c=0,70; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 1,0.
Esimerkki VI: Na-Ac-Phe-Val-Arg,-pNA “HCl (VI)
Na-Ac-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (Via) Lähtöaine: 233 mg (0,33 mmoolia) tuotetta I c ja 41 mg (0,40 mmoolia) Ac20:a.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LII-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 118 mg (66 %) amorfista tuotetta VI a, joka oli homo-geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka -3,6° (c = 1,16; DMF).
N^-Ac-Phe-Val-Arg-pNA-HCl (VT) Lähtöaine: 116 mg (0,1?5 mmoolia) tuotetta VI a.
13 56826
Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ G-15Tee Iillä 20 %:sessa AcOH:ssa.
Saatiin 90 mm (79 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta VT, jonka Cl-pitoisuus oli 5,59 %» joka oLi homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /. a7jp = -21,0° (c= 0,62; 50 % AcOH) .
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,2; Arm: 1,1.
Esimerkki VII: Na-n-oktanoyyli-Phe-Val-Arg-pNA *HC1 (VII)
Na-n-oktanoyyli-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (Vila) Lähtöaine: 207 mg (0,288 mmoolia) tuotetta I c ja 109 mm (0,4l mmoolia) kapryylihappo-p-nitrofenyyliesteriä.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ LH-20-meelillä MeOIhssa.
Saatiin 172 mg (84 %) amorfista tuotetta VII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka /fcx_7jp = -6,6° (c=0,5; DMP).
Not-n-oktanoyyli-Phe-Val-Arp:-pNA»HCl (VII) Lähtöaine: 129,4 mg (0,182 mmoolia) tuotetta VII a.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa ja Sephade^ G-15-geelillä 33 %:sessa AcOHrssa.
Saatiin 109 mg (85 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta VII, jonka Cl-pitoisuus oli 4,96 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka -29,5° (c=0,7; 50 %
AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 0,95.
Esimerkki VIII: NCt-sykloheksyylikarbonvyli-Phe-Val-Arp|—nNA*HCl (VIII)
Na-sykloheksyylikarbonyyli-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (Villa) Lähtöaine: 233 mg (0,33 mmoolia) tuotetta I c ja 100 mg (0,40 mmoolia) sykloheksyylikarboksyylihappo-p-nitrofenyyliesteriä.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOII:ssa.
Saatiin 117 mg (n. 50 %) amorfista tuotetta VIII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_ α_7D --10,9° (c=0,23; DWP).
Na-sykloheksyylikarbonyyli-Phe-Val-Arg-pNA'HCl (VIII) Lähtöaine: 48,02 mg (0,069 mmoolia) tuotetta VIII a.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ G-15-geelillä 50 #:sessa AcOH:ssa.
1¾ S6828
Saatiin: 33,7 mg (71 %>) amorfista» pakastekuivattua tuotetta VIII, jonka klooripitoisuus oli 5,11 1,, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan A:lla kehitettynä ja jonka /_~q_7p = -32,8° (c = 0,6B; 50 % AcOH).
Aminihappoanalyysi: Vai 1,0; Phe: 1,3; Arg: 1,0.
Esimerkki IX: Na-Tos-Phe-Val-Arg-pNA«HC1 (IX)
Na-Tos-Phe-Val-Arg(NOp) -pNA (IX a) Lähtöaine: 360 mg (0,5 mmoolia) tuotetta Ie ja luO mg (0,95 mmoolia) p-tolueenisulfokloridia.
Synteesimenetelmä: 360 mg tuotetta I c liuotettiin 1 ml:an AcOH:a ja 1 ml:an 5,6 NIIBr/AeOH: a täysin kuivassa atmosfäärissä ja liuosta sekoitettiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Reaktioseos lisättiin sitten tipottain tislattuun eetteriin sekoittaen samalla voimakkaasti, jolloin saostui 350 mg 1,5 HEr •H-Phe-Val-Arg()-pNA . Kette-rifaasi dekantoitiin ja sakka pestiin vielä kolme kertaa eetterillä.
Kun tuote oli kuivattu tyhjössä ?20^:lla, saatiin aminohappojohdan-naisen IIBr-suola kvantitatiivisella saannolla. HBr-johdannainen liuotettiin A ml:an DMF'.a. Liuos jäähdytettiin -10°C:en ja 75 mg (0,75 mmoolia) EtjN:a lisättiin H-Phe-Val-Arg(N02)-pNA:n vapauttamiseksi hydrobromidisuolastaan. Reaktioaika oli 1 tunti täysin kuivassa atmosfäärissä. Muodostunut Et-^N*HBr suodatettiin pois ja suodos jäähdytettiin -10°C:en. 190 mg p-tolueenisulfokloridia lisättiin ja liuoksen annettiin hitaasti saavuttaa huoneen lämpötilan, minkä jälkeen se n. 3 tuntia myöhemmin jäähdytettiin -10°C:en ja puskuroitiin 25 mg:11a (0,25 mmoolia) Et^N:a. Puskurointimenettely toistettiin vielä kerran 2-3 tuntia myöhemmin. Noin 24 tunnin reaktioajan jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin 40°C:ssa tyhjössä. Jäännöstä käsiteltiin 3 kertaa tislatulla vedellä ja se kuivattiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin FeOH:in ja ouhdistettiin.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:sss.
Saatiin 135 mg (36,5 %) amorfista tuotetta IX a, joka oli ho- — p 7 mogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^’.lla ja jonka !_a_7D = - QO (c=1,0; DMP).
Na-Tos-Phe-Val-Arg-pNA·Η01 (IX) Lähtöaine: 81,43 mg (0,11 mmoolia) tuotetta IX a.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephsdex® 0-15-geelillä 20 ft:sessa AcOH:ssa. Saatiin 63 mm (78,4 d) amorfista, nakastekuivattua tuotetta IX, jonka Cl-nitoisuus oli 4,79 *, joka oli homogeenista TLG-ana- 5ύ82ΰ
ρ I
lyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka /1^7^ = - 0° (0=0,73; 30 %
AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai; 1,0; phe: 1,2; Arg: 1,0.
Esimerkki X: i^-p-amino-Bz-Phe-Va1-Arg-pHA·2HC1 (X)
Cbo~p-amino-Bz-Phe-Val-Arr:(N02) -pNA (X a ) Lähtöaine: 233 mg (0,33 mmoolia) tuotetta I c ja 170 mg (0,44 mmoolia) Cbo-p-amino-Bz-OpNP, sp. l69~172°C.
Synteesimenetelmä: Esimerkin T b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus SephadejP^ LH-20-geeIillä MeOH:ssa. Saatiin 55 mg (20 %) amorfista tuotetta X a, joka oli homogee-nista TLC-analvysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /_α_/ρ = -30,2° (c=0,53i DMF).
Na-p-anino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA·2HC1 (X) Lähtöaine: 46,8l mg (0,056 mmoolia) tuotetta X a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
(?b
Puhdistus: Geelisuuodatus Senhadex^ G-15-geelillä 20 öisessä AcOH:ssa. Saatiin 15 mg (37 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta X, jonka Cl-pitoisuus oli 9>42 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a. ja jonka /. a_7jp= -46,7° (c=0,74; 59 % AcOH) .
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 0,95·
Esimerkki XI: N^S-aminoheksanoyyli-Phe-Val-Arg-pNA'2HC1 (XI)
Cbo-6-aminoheksanoyyli-Phe-Val-Arg(NOg)-pNA (XI a) Lähtöaine: 360 mg (0,5 mmoolia) tuotetta I c ja 290 mg (0,75 mmoolia) Cbo-6-aminokapronihappo-p-nitrofenyyliesteriä. Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geeIillä MeOH:ssa. Saatiin 398 mg (95,5 %) amorfista tuotetta XI a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan ja jonka /_ 7^ = -5,7° (c = l,l; DMF).
Nct-6-aminohekssnoyyli-Phe-Val-Arg-pNA· 2HC1 (XI) Lähtöaine: 300 mg (0,361 mmoolia) tuotetta XI a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ G-15“geeIillä 33 ?>:sessa AcOH:ssa. Saatiin 127 mg (48 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XI, jonka Cl-pitoisuus oli 9,68 %, joka oli homogeenista TLC-ana- lyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /.a/p = “32,0 (c = 0,72; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XII: H-Phe-Leu-Arg-pNA·2HC1 (XII)
Cbo-Leu-Arg(N02)~pMA (XII a) 16 56828 Lähtöaine: 5 g (10*6 mmoolia) tuotetta I a ja 4,92 g (12,7 mmoolia) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 6,1 g (98 %) amorfista tuotetta XII a, joka oli homo- — —25 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /_ α_/β --33,5° (c=1,0; MeOH).
Cbo-Phe-Leu-ArgCHOg)pHA (XII b) Lähtöaine: 3,6 g (6,5 mmoolia) tuotetta XII a ja 3,27 g (7,8 mmoolia) Cbo-Phe-OpHP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOII:ssa. Saatiin 2,95 (69,0 %) amorfista tuotetta XII b, joka oli homo-geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä F-^llä /_ o-6,2° (c=l,0; DMF) .
H-Phe-Leu-Arg-pNA» 2HC1 (XII) Lähtöaine: 124,9 mg (0,17 mmoolia) tuotetta XII b. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadei^ O-25-geelillä 50 3:sessa AcOH:ssa. Saatiin 65 mg (6l %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XII, jonka Cl-pitoisuus oli 11,15 %> joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /"a_7jp= “24,4° (c=0,63; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Leu: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XIII: l^-Bz-Phe-Leu-Arg-pNA»HC1 (XIII) .Ja-Bz-Phe-Leu-Arg(NO^)-pNA (XIII a) Lähtöaine: 734 mg (1 mmoolia) tuotetta XII b ja 272 mg (1,2 mmoolia) Bz2<9.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
©
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 589 mg (84 %) tuotetta XIII a, jonka sp. oli 196-197°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä pi:llä ja D:lla ja jonka /"q_7p5 = -19,1° (c= 1,01; DMF).
14a-Bz-Phe-Leu-Arg-pNA-HCl (XIII) Lähtöaine: 198,5 mg (0,282 mmoolia) tuotetta XIII a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® G-25-geelillä 50 3:sessa AcOH:ssa.
Saatiin 188 mg (96 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XIII, jonka Cl-pitoisuus oli 4,96 %y joka oli homogeenista TLC-ana- 17 &ö82e _ 21| lyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka £q_7^ = “38*3° (c=0,69; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Leu: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 1,0.
Esimerkki XIV: H-Phe-Ile-Arg-pNA· 2IIC1 (XIV)
Cbo-Ile-Arp-,(NQ2)-pNA (XIV a) Lähtöaine: 1 g (2, 1 mmoolia) tuotetta I a ja 0,98 g (2,46 mmoolia) Cbo-Ile-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-geelillä MeOIlissa. Saatiin 1,12 g (91 %) tuotetta XIV a sp. 195-202oC, joka oli p p- homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_ «7^ = +2,8°, (c=l,0; DMP).
Cbo-Phe-Ile-Arg(NO?)-pNA (XIV b) Lähtöaine: 0,8 g (1»36 mmoolia) tuotetta XIV a ja 0,69 g (1,63 mmoolia) Cbo-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadej^ LH-20-geelillä MeOIhssa. Saatiin 445 mg (41 %) tuotetta XIV b, sp. 219-222°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_"a_7^ = -7,1° (c=l; DMP).
H-Phe-Ile-Arg-pNA-HCl (XIV) Lähtöaine: 166,43 mg (0,226 mmoolia) tuotetta XIV b. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ O-25-geelillä 50 öisessä AcOH:ssa.
Saatiin 95,3 mg (67 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XIV, jonka Cl-pitoisuus oli 11,17 %> joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /1x7^= -32,0° (c=0,63; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Ile: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XV: Ha-Bz-Phe-Ile-Arg-pNA»HCl (XV)
Na-Bz-Phe-Ile-Arg(N02)-pNA (XV a) Lähtöaine: 250 mg (0,34 mmoolia) tuotetta XIV b ja 92 mg (0,4 mmoolia) BZ2O.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOII:ssa.
Saatiin 210 mg (88 %) tuotetta XV, sp. 244-245°C, joka oli . — —25 homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_a_/^--22,3 (c=l; DMP).
ib $6828
Na-Bz-Phe-Ile-Arg,-pNA‘HCl (XV) Lähtöaine: 182,7 mg (0,26 mmoolia) tuotetta XV s. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® G-25-geelillä 50 |:sessa AcOH:ssa. Saatiin 176,9 mg (97 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XV, jonka Cl-pitoisuus oli 4,98 %y joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A:llaja jonka = -41,5° (c=0,69; ‘50 %
AcOH).
Aminohappoanalyysi: Ile: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,1.
Esimerkki XVI: H-Phe-Phe-Arm-ηίΙΑ ·2Η01 (XVI)
Cbo-Phe-ArgCNO?)-pNA (XVI a) Lähtöaine: 1 g (2,1 mmoolia) tuotetta I a ja 1,06 g (2,46 mmoolia) Cbo-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 1,25 g (96,0 %) tuotetta XVI, sp. 198-204°C, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_~ct~ +4,2° (c=l,0; DMF).
Cbo-Phe-Phe-Arg(NO?)-pHA (XVI b) Lähtöaine: 0,9 (1,45 mmoolia) tuotetta XVI a ja 0,777 g (1,74 mmoolia) Cbo-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LII-20-geeIillä MeOHrssa.
.Saatiin 675 mg (58 %) tuotetta XVI b, sp. 201-207°C, joka oli homo- _ 25 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_ ot_/ D = -27,0° (c=l,0; DMF).
H-Phe-Phe-Arg-pNA.· 2HC1 (XVI) Lähtöaine: 196,9 mg (0,257 mmoolia) tuotetta XVI b. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® G-25~geelillä 50 öisessä AcOH:ssa. Saatiin 75,8 mg (46 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XVI, jonka Cl-pitoisuus oli 10,65 %y joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka £ q_7p = -6,7° (c=0,65; 50 5 AcOH).
Aminohappoanalyysi: Phe: 2,0; Arg: 1,1.
Esimerkki XVII: Na-Bz-Phe-Phe-Arg-pNA»HC1 (XVII)
Mot-Bz-Phe-Phe-Arg(N02)~pNA (XVII a) Lähtöaine: 250 mg (0,725 mmoolia) tuotetta XVI b ja 90 mg (0,712 mmoolia) BZgO.
S6828 19
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LII-20-geelillä MeOHrssa. Saatiin 220 mg (92 %) amorfista tuotetta XVII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka Aö_7^ = -36,60 (c = 0,95 ; DMF).
Na-Bz-Phe-Phe-Arg-pNA‘HCl (XVII) Lähtöaine: 114,6 mg (0,156 mmoolia) tuotetta XVII a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
(r)
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ G-25~geelillä 50 #:sessa AcOH:ssa. Saatiin 77,4 mg (68 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XVII, jonka Cl-pitDisuus oli 4,8l %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka (_ a_7^ - “25,5° (c=0,72; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Phe: 2,0; Arg:0,97.
Esimerkki XVIII: H-D-Phe-Val-Arg-pNA·2HC1 (XVIII)
Cbo-D-Phe-Val-Arg(NQ2)-pNA (XVIII a) Lähtöaine: 480 mg (0,83 mmoolia) tuotetta I b ja 530 mg (1,25 o li mmoolia) Cbo-D-Phe-0pNP, sp, 126,2-126,6°, / a_7^ = +24,750 (c=l,0; DMF) .
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ LH-20-geeIillä MeOH:ssa.
Saatiin 587 mg (98 %>) amorfista tuotetta XVIII a, joka oli _ 23 homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pirilä ja jonka /_a_7 = + 18,9° (c = 2,0 ; DMF).
H-D-Phe-Val-Arg-pNA» 2HC1 (XVIII) Lähtöaine: 153,8 mg (0,212 mmoolia) tuotetta XVIII a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukaan.
Puhdistus: Geelisuodatus SephadejP^ G-15~geelillä 20 !?:sessa Ac0H:ssa. Saatiin 36,3 mg (28 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XVIII, jonka Cl-pitoisuus oli 11,34 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka f_ oTq = -70,3° (c=0,6l; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XIX: Ha-Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA»HCl (XIX)
Na-Bz-D-Phe-Val-Arg(N0o)-pNA (XIX a) Lähtöaine: 244 mg (0,34 mmoolia) tuotetta XVIII a ja 92 mg (0,41 mmoolia) BZ2O.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukaan.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LIJ-20-geelillä MeOII:ssa.
20 5 6 8 2 8
Saatiin 181 mg (77 *) tuotetta XIX, sp. 2U-215°C, joka oli _ _2 t homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pirilä ja jonka !_ uj ^ = 1,36° (c=0,8; DMF).
Na-Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA·HC1 (XIX) Lähtöaine: 128,3 mg (0,186 mmoolia) tuotetta XTX a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukaan.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® G-25~geelillä 3 $:sessa AcOH:ssa. Saatiin 103,8 mg (8l %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XIX, jonka Cl-pitoisuus oli 5>15 %» joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä £: 11a ja jonka = ”36,9° (c = 0,68; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 0,9; Arg: 0,9.
Esimerkki XX: H-Tyr-Val-Arg-pNA»HCl (XX)
Cbo-Tyr- (OBz) -Va.l-Arg(N02) -pH A (XX a) Lähtöaine: 480 mg (0,83 mmoolia) I b ja 660 mg (1,25 mmoolia) Cbo-Tyr(OBz)-OpMP, so. 147,5-149,0° ja /.a_7^5= -8,5° (c=2,0; DMF). Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus SephadejP^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 460 mg (65 %) amorfista tuotetta XX a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka Act_7jp = -9,66° (c=l,0; DMF).
H-Tyr-Val-Arg-pNA«HCl (XX) Lähtöaine: 144,7 mg (0,169 mmoolia) tuotetta XX a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® G-15-geelillä 20 $:sessa AcOH:ssa. Saatiin 65,4 mg (62 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XX, jonka Cl-pitoisuus oli 11,20 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /_a_7^= -29,8° (c = 0,63; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Tyr: 1,2; Arg: 1,0.
Esimerkki XXI: Na-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA‘HCl (XXI)
Na-Bz-Tyr-Val-Arg(N02)-pNA (XXI a) Lähtöaine: 246 mg (0,287 mmoolia) tuotetta XX a ja 65 mg (0,29 mmoolia) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Bz-ryhmä, joka suojaa tyrosin-OH-ryhmää, lohkeaa jossain määrin IIBr-käsittelyn aikana. Saanto on tämän vuoksi huono, ja koostuu ilmeisesti sekä tuotteesta XXI a että yhdisteestä Na-Bz-Tyr (OBz) -Val-Arg(N02)-pNA.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä MeOH:ssa.
21 56628
Saatiin 193 mg (81 %) amorfista tuotetta, jossa esiintyi 2 ainetta TLC-analyysin mukaan kehitettynä P1:llä (kts. yllä).
Na-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA-HC1 (XXI) Lähtöaine: 138,9 mg tuotetta XXI a ja N -3z-Tyr(0Bz)-Val-Arg- (N02)"PNA.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-15-geeIillä 50 öisessä AcOH:ssa. Saatiin 75,4 mg amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXI, jonka Cl-pitoisuus oli 5,3 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /_ a7j^ = “3^,7° (c= 0,7; 50 % AcOH) . Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Tyr: 1,2; Arg: 1,0.
Esimerkki XXII: N -ä-aminoetyylisykloheksyylikarbonyyli-Phe-Val-Arg-
ΡΪΤ7ΓΓ2ΙΓ5Τ-(XXTIT
Cbo-^-aminoetyylisykloheksyylikarbonyyli-Phe-Val-
Arg-oNA (XXII a) Lähtöaine: 268 ml (0,65 mmoolia) ja Cbo-4-aminoetyylisyklo- heksyylikarbonyyli-OpNP ja 360 mg (0,5 mmoolia) tuotetta I c.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 265 mg (62 %) amorfista tuotetta XXII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pi:llä ja jonka /^a_7D = -8,5° (c=0,51; DMF).
Na-4-aminoetyylisykloheksyylikarbonyyli-Phe-Val-Arg-pNA♦ 2HC1 (XXII) Lähtöaine: 137 mg (0,16 mmoolia) tuotetta XXI a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-15-geelillä 33 3:sessa AcOH:ssa. Saatiin 82,2 g (68,5 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXII, jonka Cl-pitoisuus oli9,373, joka öli hanqgeemsta TLC-änalyysin mukaan kehitettynä A:llaja jonka £a_7^ = -35,2° (c = 0,73; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XXIII: Na-2-sykloheksyyliasetyyli-Phe-Val-Arg-pNA-HCl (XXIII) N0t-2-sykloheksyyliasetyyli-Phe-Val-A.rg(NO? )- pNA " (XXIIIa) Lähtöaine: 197 mg (0,75 mmoolia) sykloheksyyliasetyyli-OpMP:a ja 331 mg (0,^6 mmoolia) tuotetta I c.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade3^ LTI-20-geeli llä MeOII:ssa. Saatiin 205 mg (63 %) amorfista tuotetta XXIII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka 22 56828 ΓαΤd3= ·5»°° (c=0>5; dmp).
I-jq-2-sykloheksyy liasetyyli-Phe-Val-Arg-pNA-IICl (XXIII) Lähtöaine: 173 mg (0,2Μ mmoolia) tuotetta XXIII a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadei^ G-15-geelillä 33 #:sessa AcOH:ssa. Saatiin 139 mg (8l %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXIII, jonka Cl-pitoisuus oli 5,01 joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka /fö_723 = -32,0° (c=0,35;
50 % AcOH). D
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XXIV: 4-aminobutyryyli-Phe-Val-Arg-pNA♦2HC1 (XXIV)
Cbo-^-aminobutyryyli-Val-Arg(NO^)-pNA (XXIV a) Lähtöaine: 23^ mg (0,65 mmoolia) Cbo-4-amino-butyryyli-OpNP:a ja 360 mg (0,5 mmoolia) tuotetta I c.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 297 mg (71! %) amorfista tuotetta XXIV a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä ja jonka Ca/T^--5,0° (c=0,6; DMF).
iJ-aninobutyryyli-Phe-VaI-Arg-pNA‘2HCl (XXIV) Lähtöaine: 291 mg (0,362 mmoolia) tuotetta XXIV a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
P
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex ' G-15-geelillä 33 #:sessa
AcOH:ssa.
Saatiin 167 mg (66 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXIV, jonka Cl-pitoisuus oli 10,05 %, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka £*q_7jp = "35,3° (c = 0,72; 50 % AcOH).
Aminohappoanilyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 1,1.
Esimerkki XXV: 2-(^-aminofenyyli)-asetyyli-Phe-Val-Arg-pNA· 2HC1 (XXV) 2-(^-Cbo-aminofenyyli)-asetyyli-Phe-Val-Arg(NQ?)-pNA (XXV a) Lähtöaine: 200 mg (0,278 mmoolia) tuotetta I c ja 152 mg (0,371 mmoolia) 2-(i|-aminofenyy li)-asetyy li-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-geelillä MeOHtssa. Saatiin 201 mg (85 %) amorfista tuotetta XXV a, joka oli ho- . . . . . — -r? il mogeemsta TLC-analyysm mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka /_a_7p " -il, 3° ( c = 0,5 ; DMF) .
2 3 S6826 2-( ^-aminofenyyli)-asetyyli-Phe-Val-Arg-pNA »2HC1 (XXV) Lähtöaine: 97,5 mp (0,11*4 mmoolia) tuotetta XXV a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® 0-15-peelillä 33 ^:sessa AcOH:ssa. Saatiin *43,5 mp, (51 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXV, jonka Cl-pitoisuus oli 9,^7 %» joka oli homopeenista TLC-analyy-sin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka /_ot_/jp = -33>0° (c=0,75; 50 % AcOH) .
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; phe: 1,1; Arp: 1,1.
Esimerkki XXVI: Na-3z-C-Phe-flly-Val-Arg-pNA’HCl (XXVI)
Cbo-C-Ph·Gly-Val-Arp(NOo)-pNA (XXVI a) Lähtöaine: 230 mp (0,568 mmoolia) Cbo-C-Ph·Gly-OpNP ja 250 mp (0,^37 mmoolia) tuotetta I b.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I c mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LII-20-peeIillä MeOlhssa.
Saatiin 292 mp (95 %) amorfista tuotetta XXVIa, joka oli ho- — —2 *1 moreenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka /ja/D = +8,2° (c=0,50; DMF).
Na-Bz-pH«Gly-Vai-Arp(NO?)-pNA (XXVI b) Lähtöaine: 290 mg (0,*41 mmoolia) tuotetta XXVI a ja 130 mg (0,575 mmoolia) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä Me01I:ssa. Saatiin 211 mp (76 %) amorfista tuotetta XXVI b, joka oli ho-
. . O T
mopeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka f_ a_7^ = + 10, *4° (c = 0,51; DMF).
Na-Dz~C-Ph·Gly-Val-Arg-pNA «HCl (XXVI) Lähtöaine: 200 mg (0,296 mmoolia) tuotetta XXVI b. Synteesimenetelmä: Esimerkin I p mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ G-15-geelillä 33 Ji:sessa AcOH:ssa. Saatiin 186 mp (95 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXVI, jonka Cl-pitoisuus oli 5,25 %» joka oli homopeenista. TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /_a_/Q = -27,0° (c = 0,67; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; C-Ph*Gly: 1,2; Arg: 0,9.
Esimerkki XXVII: N^Bz-Phe-Phe-Val-Arp-pMA^HCl (XXVII)
Na-Bz-Phe-Phe-Val-Arg(NQ9)-pMA (XXVII a) Lähtöaine: l'tl mp (0,163 mmoolia) tuotetta IV a ja 90 mg (0,*4 mmoolia) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
(Β)
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 111! mg (84 %) amorfista tuotetta XXVII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /_«_7p = -0,75° (c=l,2; DMF) .
Na-Bz-Phe-Phe-Val-Arg-pNA «HC1 (XXVII) Lähtöaine: 71 mg (n. 0,087 mmoolia) tuotetta XXVII a. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ G-15-geelillä 33 £:sessa AcOH:ssa. Saatiin 47 mg (60 %) amorfista, nakastekuivattua tuotetta XXVII, jonka Cl-nitoisuus oli 4,23 %» joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a.
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 2,3; Arg: 1,0.
Esimerkki XXVIII: Na-Bz-DL-C-Ph·Gly-Val-Arg-pNA-HC1 (XXVIII)
Cbo-DL-C-Ph♦Gly-Val-Arg(N02)-pNA (XXVIII a) Lähtöaine: 285 mg (0,5 mmoolia) tuotetta I b ja 285 mg (0,7 mmoolia) Cbo-DL-C-Ph·Gly-OpNP, sp. 107-108°C.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I c mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LII-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 353 mg (81 %) amorfista tuotetta XXVIII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä.
Na-Bz-DL-CpPh·Gly-Vai-Arg(NO?)·ρΝΑ (XXVIII b) Lähtöaine: 285 mg (0,403 mmoolia) tuotetta XXVIII a ja 181 mg (0,8 mmoolia) BZ2O.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa. Saatiin 226 mg (83 %) amorfista tuotetta XXVIII b, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä.
Na-Bz-DL-C-Ph·Gly-Val-Arg-pNA »HC1 (XXVIII) Lähtöaine: 101 mg (0,15 mmoolia) tuotetta XXVIII b. Synteesimenetelmä: Esimerkin I grrukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade>P^ G-15-geelillä 33 ?5:sessa AcOH:ssa.
Saatiin 6l mg (61 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXVIII, jonka Cl-pitoisuus oli 5,21 %t joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a.
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; C-Ph*Gly: 1,2; Arg: 0,9.
Esimerkki XXIX: Mot-3z-Phe-Val-Arg-2-Na,3Cl (XXIX)
Cbo-Arg(N02)-2-NA (XXIX a) Lähtöaine: 3,6 g (10 mmoolia) Cbo-Arg.(NO?)-OH ja 1,72 g (12 mmoolia) 2-naftyyliamiinia.
56826 25
Synteesimenetelmä: Esimerkin I a-2 mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä MeOII:ssa.
Saatiin 4,0*5 p (34 %) amorfistatuotetta XXIX a, joka oli ho- - -r2 3_ mogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^:llä ja jonka Is1—']) ~ +7,4° (c=l,0; DMF).
Cbo-Val-Arg(N0?)-2-NA (XXIX b) Lähtöaine: 1,5 p (3,1 mmoolia) tuotetta XXIX a ja 1,33 g (3,7 mmoolia) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-peelillä MeO!I:ssa· Saatiin 1,66 p (95 %>) osittain kiteistä tuotetta XXIX b, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä ja jonka /_"ö_7^2= -6,0° (c= 1,01; DMF).
Cbo-Phe-Val-Arp(HO?)-2-NA (XXIX c)
Lähtöaine: 1,65 p (2,84 mmoolia) tuotetta XXIX b ja 1,43 P
(3,4 mmoolia) Cbo-Phe-OpHP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I c mukainen.
0¾
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-peelillä MeOH:ssa. Saatiin 1,55 g (75 %) amorfista tuotetta XXIX c, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka L°l7y) ~ -10,9° (c=1,01; DMF).
Na-Bz-Phe-Val-Arg(NCb)-2-NA (XXIX d) Lähtöaine: 1,15 p (1,58 mmoolia) tuotetta XXIX c ja 465 mg (2,05 mmoolia) BzjO.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ LH-20-geeIillä MeOH:ssa. Saatiin 0,89 g (80,3 %) osittain kiteistä tuotetta XXIX d, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jon-ka /“α720 = -31,1° (c = l,01; DMP) .
Na-Bz-Phe-Val-Arg-2-NA,HCl (XXIX) Lähtöaine: 620 mp (0,89 mmoolia) tuotetta XXIX d. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-15-geelillä 50 /£:sessa AcOH:ssa. Saatiin 385 mg (63 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXIX, jonka Cl-pitoisuus oli 5,12 %, joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka = ”53,8° (c = 0,71; 50 %
AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arp: 1,0.
Esimerkki XXX: Na-Bz-Phe-Val-Arg-l-nitro-2-NA-HC1 (XXX)
Cbo-Arg(NCb)-l-nitro-2-NA (XXX a) 26 £o828 Lähtöaine: 3,6 g (10 mmoolia) Cbo-ArgCNC^)-OH ja 2,26 g (12 mmoolia) l-nitro-2-naftyyliamiinia.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ia-2 mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 3,83 g (73,1 %) amorfista tuotetta XXX a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pi:llä ja jonka /_"α_7^ = -11,80 (c=l,0; DMP).
Cbo-Val-Arg(MQ?)-l-nitro-2-NA (XXX b) Lähtöaine: 950 mg (1,8 mmoolia) tuotetta XXX a ja 825 mg.
(2,2 mmoolia) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 0,9 g (80 %) osittain kiteistä tuotetta XXX b, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka /“q7p2= +1,05° (c = l,0; DMF).
Cbo-Phe-Val-ArprfNOn) -l-nitro-2-NA (XXX c) Lähtöaine: 800 mg (1,27 mmoolia) tuotetta XXX b ja 640 mg (1,52 mmoolia) Cbo-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I c mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä Me0H:ssa.
785 mg (79,9 %) amorfista tuotetta XXX c, joka oli homogee-nista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P1:llä ja jonka (_ a_7^ = -7,0° (c=l,02; DMF).
N a-Bz-Phe-Val-Arg(NOp)-l-nitro-2-NA (XXX d) Lähtöaine: 680 mg (0,88 mmoolia) tuotetta XXX b ja 260 mg (1,15 mmoolia) BZ2O.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 480 mg (73 %) amorfista tuotetta XXX d, joka oli ho- _ _24 mogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /_ qi_/ = -31,4° (c = 0,9 ; DMF).
Na-Bz-Phe-Val-Arg-l-nitro-2-NA»HCl (XXX) Lähtöaine: 430 mg (0,65 mmoolia) tuotetta XXX d.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Igmukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ G-15~geelillä 33 $:sessa AcOH:ssa.
Saatiin 268 mg (57 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXX, jonka Cl-pitoisuus oli 4,80 joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka /_*"a_7p = -39,7° (c=0,73; 50 % AcOII).
27 $6828
Esimerkki XXXI: Nra-Bz-Phe-Val-Arg-4-nitro-l-NA-HCl (XXXI)
Cbo-Arg(MO?)-4-nitro-l-NA (XXXI a) Lähtöaine: 3,6 g (10 mmoolia) Cbo-Arg(N02)"0H ja 2,26 g (12 mnoolia) 4-nitro-l-naftyyliamiinia.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I a-2 mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade^ LH-20-geelillä MeOII:ssa. Saatiin 3,61 g (60 %) osittain kiteistä tuotetta XXXI a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /“ä_722 = -11,4° (c = l,01; DMF).
Cbo-Val-Arg(MO?)-4-nitro-l-NA (XXXI b) Lähtöaine: 650 mg (1,23 mmoolia) tuotetta XXXI a ja 550 mg (1,45 mmoolia) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade'i^ LH-20-geeIillä MeOH:ssa. Saatiin 460 mg (60 %) amorfista tuotetta XXXI b, joka oli ho-mogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P]_:llä ja jonka /_ «_7D = +0,9°, (c=0,55; DMF).
Cbo-Phe-Val-ArgtNOo )-4-nitro-l-NA (XXXI c) Lähtöaine: 450 mm (0,72 mmoolia) tuotetta XXXI b ja 365 mg (0,86 mmoolia) Cbo-Phe-OoNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I.cmukainen*
Puhdistus:.Geelisuodatus Senhade^ LH-20-geelillä MeOII:ssa. Saatiin 500 mg (90 %) osittain kiteistä tuotetta XXXT c, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /li_72i4= -6,0° (c = l,0; DMF).
Na-Bz-Phe-Val-Arg(N09)-4-nitro-l-NA (XXXI d) Lähtöaine: 490 mg (0,633 mmoolia) tuotetta XXXI c ja 180 mg (0,80 mmoolia) BZ2O.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I d mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saatiin 400 mg (84,7 %) amorfista tuotetta XXXI d, joka oli
— —PO
homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka Z.°L'p = -31,0° (c = l,0j DMF).
Na-Bz-Phe-Val-Arg-4-nitro-l-NA MICl (XXXJ) Lähtöaine: 380 mg (0,51 mmoolia) tuotetta XXXI d. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ G-15-geelillä 50 %:sessa AcOII: ssa.
Saatiin 303 mg (8l %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXXI, jonka Cl-pitoisuus oli 4,79 %} joka oli homogeenista TLO-ana-lyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka 7 8L^p = “57,7° (o=0,74; 50 55 AcOII).
2f! 56828
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 1,1; Arp:: 0,9.
Esimerkki XXXII: N^Bz-Phe-Val-Lys-pNA «HC1 (XXXII)
Na-30C-Lys(ε-Cbo)-pNA (XXXII a) 6,3 g (11,2 mmoolia) Να-Β00-Ι^3(ε-α>ο)-0ΙΙ·ϋ0ΗΛ : a liuotettiin 40 nl:an kuivaa, juuri tislattua HMPTA:a huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 5 g (30,5 mmoolia) p-nitrofenyyli-isosyansattia annoksittain samalla sekoittaen ja täysin kuivassa atmosfäärissä.
24 tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa reaktioseosta käsiteltiin esimerkin Ia kuvauksen mukaisesti. Reaktion sivutuotteet olivat N,NT-bis-p-nitrofenyylikarbamidi ja N-p-nitrofenyyli-N,N'-disyklo-heksyylikarbamidi, jotka olivat niukkaliukoisia MeOII:in ja ne puhdistettiin geelisuodatuksella käyttäen Sephade^ LH-20-kolonnia tasapai-noitettuna MeOH:lla. Saatiin 4,17 g (74,5 %) osittain kiteistä tuotetta XXXII a, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pi ja jonka /fq_721= +1,7° (c = l,0; DMP).
Ma-30C-Val-Lys(ε-Cbo)-pNA (YXXII b) 10 ml juuri tislattua trifluorietikkahappoa lisättiin 2,20 g: an (4,4 mmoolia) tuotetta XXXII a täysin kuivassa atmosfäärissä.
Kun reaktioseosta oli sekoitettu 60 min. huoneenlämpötilassa, se kaadettiin 150 ml:an kuivaa eetteriä sekoittaen samalla voimakkaasti; tämä johti CF^COOH'H-Lys(ε-Cbo)-pNA:n saostumiseen öljynä, joka kovettui jäähtyessään. Eetterifaasi dekantoitiin ja sakkaa käsiteltiin vielä 3 kertaa 75 ml:11a kuivaa eetteriä. Kun tuote oli kuivattu tyhjössä Na0H:lla ja 320^:110, lysiinijohdsnnaisen trifluoriasetaat-tisuola saatiin kvantitatiivisella saaliilla (2,25 g).
2,25 g (4,4 mmoolia) CF-jCOOH*H-Lys(ε-Cbo)-pNA liuotettiin 10 ml:an DMF:a ja jäähdytettiin -10°C:en. 0,75 ml (5,5 mmoolia) Et^N:a lisättiin aminohappojohdannaisen vapauttamiseksi trifluoriasetaatti-suolastaan ja tämän jälkeen lisättiin 2,0 g (5*5 mmoolia) BOC-Val-OpNP, Kun reaktioliuos oli useiden tuntien kuluttua saavuttanut huoneenlämpötilan, se jäähdytettiin jälleen ja puskuroitiin 0,31 ml:11a 2,2 mmoolia) Et^N:a. Puskurointimenettely toistettiin vielä kerran n. 2 tunnin kuluttua. 24 tunnin reaktioajan päätyttyä liuos haihdutettiin kuiviin tyhjössä n. 40°C:ssa. Jäännöstä käsiteltiin 3 kertaa 20 ml:11a tislattua vettä ja kuivattiin tyhjössä.
Epäpuhdas tuote liuotettiin MeOH:in ja puhdistettiin geeli-suodatuksella käyttäen Sephadex® LH-20-kolonnia tasapainotettuna MeOH:lla. Eluaatista saatu jae tuotti 2,12 g (80,3 %) tuotetta XXXII b, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Px: llä ja C:llä ja jonka λα_722=-1,9° (c= 1,0; DMF) .
29 56826 BOC-Phe-Val-Lys(ε-Cbo)-pNA (XXXII c) Lähtöaine: 0,85 g (1^2 mmoolia) tuotetta XXXII b ja 0,77 Γ. (2,0 mmoolia) BOC-Phe-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin XXXII b mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus SephadeLH-20-geeIillä MeOH:ssa. Saatiin 0,8¾ g (79,3 %) amorfista tuotetta XXXII c, joka oli _ o 7 homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka !_ o_7"D = -9,3° (c=l,02; DMP).
Na-Bz-Phe-Val-Lys( -Cbo)-pNA (XXXII d) Lähtöaine: 600 mg (0,80¾ mmoolia) tuotetta XXXII c ja 2R0 mg (1,25 mmoolia) Βζ2<0·
Synteesimenetelmä: Tuotteen XXXII c dekarbobutyylioksylointi suoritettiin analogisesti esimerkin XXXII b menetelmän mukaisesti.
608 mg CF^COOH*H-Phe-Val-Lys(e-Cbo)-pNA liuotettiin 10 ml: an DFF:a ja jäähdytettiin -10°C:en, minkä jälkeen lisättiin 113 ml (0,8 mmoolia) Ety^a peptidiamiinin vapauttamiseksi suolastaan, 280 mg (1,25 mmoolia) 3z20:a lisättiin liuokseen -10°C:n lämpötilassa, minkä jälkeen se puskuroitiin ja sitä käsiteltiin esimerkin XXXIT b JS) mukaisesti. Epäpuhtaan tuotteen geelisuodatus käyttäen Sephadex^ LH-20-kolonnia MeOH:ssa tuotti ^460 mg tuotetta XXXII d, joka oli homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pn:llä ja jonka -22,8o (c = 0,99j JMF).
Na-Bz-Phe-Val-Lys-pNA»HCl (XXXII) Lähtöaine: 280 mg (0,373 mmoolia) tuotetta XXXII d. Synteesimenetelmä: Esimerkin I g mukainen.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephade)^ 0-15-geelillä 50 *:sessa
AcOH:ssa.
Saatiin 172 g (71 %) amorfista, pakastekuivattua tuotetta XXXII,jonka Cl-pitoisuus oli 5,39 %, joka oli homogeenista TLC-ana-lyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /.«Jp = -36,2° (c = 0,67; 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi: Vai: 1,0; Phe: 0,9; Lys: 1,1.
Esimerkkien mukaisesti valmistettuja substraatteja käytettiin erilaisten entsyymien määrittämiseen seuraavalla tavalla: Määritysperiaate perustuu siihen, että entsymaattisella hydro-lyysillä muodostunut tuote antaa UV-spektrin, joka on täysin poikkeava substraatin spektristä. Näin ollen esimerkin I mukaisella subs-traatilla, N -Bz-Phe-Val-Arg-pNAMICl on absorptiomaksimi kohdassa 303 nm molaarisella ekstinktiokertoimella 12900. Substraatin absorp- 30 56828 tio on merkityksetön kohdassa 405 nm. p-nitroaniliinilla (pNA), joka muodostuu substraatista entsymaattisen hydrolyysin sikana, on ab-sorptiomaksimi kohdassa 3$0 nm molaarisella ekstinktiokertoimella 13200, joka kohdassa 405 nm on laskenut vain arvoon 9620.
Tämän vuoksi mittaamalla spektrofotometrisesti aallonpituudella 405 nm voidaan helposti seurata entsymaattista hydrolysoitumis-astetta, joka on verrannollinen muodostuneen p-nitroaniliinin määrään. Läsnä oleva substraatin ylimäärä ei häiritse mittausta tällä aallonpituudella. Asianlaita on ]ähes sama muilla keksinnön substraateilla ja tästä syystä spektrofotometriset mittaukset suoritettiin kauttaaltaan aallonpituudella 405 nm.
Entsymaattinen reaktio voidaan kaavamaisesti kirjoittaa seura avaan tapaan: kl E + S r..... ES ---VES’ + kromofori Ρη E + ?2 E = entsyymi S = substraatti ES = entsyymi-substraattikompleksi ?1 ja ?2 = tuotteita ki. k2· k^ ja ka = nopeusvakioita kp
Dissosiaatiovakio ES:lie = — = Km (Michaelis'in vakio) kl
Jos (S) >>(E) ja k4<?C k-j, on seuraava totta: K = ZTE) ~ (ES)7x (S) ------------------(p) m (ES)
Nopeus, jolla kromofori muodostuu = v = k^ x (ES) k x (E) x (S) V = ϊζΓ~+ (ST (2) m
Kun kaikki E sitoutuu S:in, (ES) = (E) ja v = vmax = k3 x (E) --------------------------O)
Lineweawer - Burk'in yhtälö - = —- x i + -- ; --------------------(4) v vmax ^ vmax
Kuten yhtälöstä (2) ilmenee, vakiot Km ja k^ määräävät ent-syymisubstraatin tehokkuuden tiettyyn entsyymiin nähden. Näiden vakioiden määrittämisessä on menettely periaatteessa seuraava: Ents-syymi ja substraatti sekoitetaan puskuriliuokseen ja reaktiota seu- 31 56828 rataan spektrofotometrisesti 5 min. Substraatin väkevyyttä (S) vaihdellaan kun taas entsyymin väkevyys (E) pidetään kullekin substraatille vakiona. Ekstinktio (OD) piirretään ajan funktiona. Tällä tavoin saadun käyrän tangentti (= ekstinktion ero minuutissa, ΔΟΡ/min, josta muodostunut p-NA/min-määrä ^moolissa (v) voidaan laskea) ajan-hetkellä nolla antaa alkuperäisen reaktionopeuden v. Jos ^ piirre-tään funktiona^ :sta, saadaan Km ja vmgx (yhtälö (4)) diagrammista. Km ja ^3 (= —) trombiinille ja eri entsyymisubstraateille esi tetään taulukossa 1 ja trypsiinille taulukossa 2. Vakioita ja k3 koskevat tiedot puuttuvat tapauksissa, joissa näitä arvoja ei ole määritetty tai kun niitä ei voitu laskea, koska ei saatu lineaarista riippuvuutta muuttujien ^ Ja(jg) välille·
Karkea arvio entsyymin ja substraatin väliselle suhteelle eri substraateilla voidaan saada vertaamalla minuuteissa ja millilitraa kohti muodostuneen p-nitroaniliinin määrää samalla substraattien väkevyydellä. Tämä esitetään taulukossa 3 trombiinille, taulukossa 4 trypsiinille, taulukossa 5 Reptilase -entsyymille, joka on saatu Bothrop'in Atrox-tuotteesta ja on vaikutukseltaan verrattavissa trombiiniin, ja taulukossa 6 plasmiinille.
Optimiolosuhteet esimerkin I mukaisen substraatin amidolyy-sille trombiinin kanssa saadaan pH-arvolla 8,2 ionivahvuudella 0,13“ 0,15 ja lämpötilassa 37-40°C.
Taulukoissa käytetyt kirjaimet NIH viittaavat National Institute of Health-laitoksen yksiköihin. Trypsiiniyksikkö vastaa N -tosyyli-arginiini-metyyliesterin hydrokloridin (TAME) yhden pmoolin hydrolyysia minuutissa 25°C:ssa ja pH-arvolla 8,1, kun läsnä on 0,01-M kalsiumionia ja trypsiini saatiin Worthington Biochemical Corporation-yhtiöltä, Freehold, N.J., USA. Plasmiini saatiin AB Kabi-yhtiöltä, Tukholma, Ruotsi, ja 1 mg /astasi kolmea kaseiiniyk-sikköä (CU).
Taulukko 1. Trombiini-aktiivisuus, Km ja k-^
Substraatti Substraatin Entsyymin K x 10^ k^ x 10** väkevyys väkevyys n (/umoolia/min, (/umoolia/1) (NIH/ml) (moolia/1) NIH/ml) ΒΑΡΝΑ 250-666 50 6 11 I 19,3-89,6 0,5 1,62 1340 II 28,2-94,0 5 0,8 50 VIII 19,3-89,6 0,5 0,55 360 XII 31,8-106,0 5 3,91 110
Taulukko 2. Trypsiiniaktiivisuus, Km ja k^ 32 56828
Substraatti Substraatin Entsyymin K x 10^ k, x 10^ väkevyys väkevyys (”00lia/1) (^oolia/mn, (μmoolla/ml) (NIH/ml) NIH/ml) ΒΑΡΝΑ 255-666 75 16 P,3 I 19,0-88,2 3 0,31 110 II 28,2-9^,0 3 1,01 112 VIII 19,0-88,2 3 0,31 98 XII 31,8-106,0 3 0,89 60
Taulukko 3. Trombiiniaktiivisuus
Substraatti Substraatin Entsyymin Muodostunut p-nitro- väkevyys väkevyys NIH- aniliini nmoolia/min nmoolia/ml. yksikköS/ml. ja/fnl.
ΒΑΡΝΑ 333,0 50,0 1,04 I 64,6 0,417 6,0 VI 67,4 " 0,3 VIII 65,4 " 2,7 IX 66,4 " 0,5 X 58,2 " 1,7 XI 65,1 " 0,2 XVIII 66,9 " 5,6 XIX 66,2 " 0,3 XX 67,6 " 0,2 XXI 65,6 " 1,7 XXII 65,7 " 2,0 XXIV 66,6 " 0,4 XXV 66,4 " 0,6 XXVI 64,7 ” 1,4 XXXII 69,0 " 0,1
Taulukko 4. Trypsiiniaktiivisuus 33 56828
Substraatti Substraatin Entsyymin Muodostunut n-nitro- väkevyys, väkevyys aniliini nmoolia/min nmoolia/ml yks./ml ja /ml . ΒΑΡΝΑ 333,0 2,08 6,1 I 66,7 0,0833 16,3 V 66,2 " 12,9 VI 67,4 " 11,1 VIII 65,4 " 13,7 IX 66,4 " · 6,8 X 58,2 " 13,1 XI 65,1 " 1,6 XVIII 66,9 " 14,1 XIX 66,2 " 5,5 XX 67,6 '* 6,2 XXI 65,6 " 14,0 XXII 65,7 " 6,2 XXIII 67,1 . " 5,9 XXIV 66,6 " 6,2 XXV 66,¾ " 10,9 XXVI 64,7 " 23,7 XXXII 69,0 " 2,9
Taulukko 5. Peptilase®-sktiivisuus
Substraatti Substraatin Entsyymin Muodostunut p-nitrn- väkevyys väkevyys aniliini nmoolia/min nmoolia/ml yks./ml ja /nl I 66,7 0,5 4,4 II 66,7 " 3,0 XIII 66,7 " 4,6 XV 66,7 " 2,2 56828
Taulukko 6. Plasmiiniaktiivisuus 3»
Substraatti Substraatin Entsyymin Muodostunut p-nitro- väkevyys väkevyys aniliini nmoolia/nin nmoolia/ml CU-yks./ml ja /ml I 66,7 0,167 5,6 V 66,2 " 6,2 VI 67,4 " 4,1 VIII 65,4 " 7,6 IX 66,4 " 3,4 X 5B,2 " 2,7 XI 65,1 " 4,7 XVIII 66,9 " 5,3 XIX 66,2 " 2,1 XX 67,6 " 2,1 XXI 65,6 " 3,4 XXII 65,7 " 2,2 XXIII 67,1 " 5,4 XXIV 66,6 " 2,5 XXV 66,4 " 4,3 XXVI 64,7 " 6,2 XXXII 69,0 " 5,7
Taulukot 1-6 osoittavat selvästi tämän keksinnön entsyymi-substraattien edut verrattuna, aikaisemmin trypsiinille käytettyyn amidisubstraattiin (ΒΑΡΝΑ). Suuremman herkkyytensä ansiosta nämä uudet substraatit tekevät pienten entsyymimäärien määrityksen mahdolliseksi vaarantamatta määrityksen tarkkuutta. Tämä on erittäin tärkeää kliiniseltä kannalta, sillä se yksinkertaistaa näytteiden keräämistä.
Veren koaguloituminen on erittäin monimutkainen prosessi, jossa trombiini säätelee entsymaattisesti fibrinogeenin muuttumista fibriiniksi. Useat muutkin veren koaguloitumiseen vaikuttavat tekijät ovat samalla tavoin kytkeytyneet trombiiniin reaktioiden avulla. Tämän keksinnön entsyymisubstraatit tarjoavat mahdollisuuden määrittää nämä koaguloitumistekijät.
Seuraava antitrombiinin määritys perustuu periaatteessa siihen, että tunnettu määrä trombiinia lisätään ylimäärin veriheranäyt-teeseen. Veressä oleva vapaa antitrombiini sitoutuu lisättyyn trombiiniin ja ylimääräinen trombiini määritetään sitten entsyymisubst-raatin avulla, minkä jälkeen antitrombiinin reagoiva määrä voidaan laskea.
35 5 6 8 2 6
Antitrombiinin määritys
Suoniverestä poistetaan fibrinopeeni ja se sentrifupoidaan. Siitä otetaan 0,5 ml veriheraa ja se laimennetaan 2 ml:11a trisimi-datsolipuskuriliuosta. 0,1 ml trombiinin vesiliuosta (10 NIH = National Institute of Health) idätetään sitten 0,25 ml:n kanssa tätä ve-riheraliuosta tarkalleen 5 min. lämpötilassa 37_^0°C. Tämän jälkeen lisätään 1 ml esilämmitettyä puskuriliuosta ja 0,25 ml entsyymi-substraatin vesiliuosta (1 mp/ml) j3 seosta idätetään tarkalleen 1 min. lämpötilassa 57~^0°C. Reaktio päätetään sitten 0,25 ml:11a väkevää etikkahappoa ja ekstinktio luetaan spektrofotometrillä aallonpituudella ^05 nm.

Claims (3)

  1. 36 S6828 Patenttivaatimus Uusia yhdisteitä käytettäviksi taudinmäärityksessä, jotka yhdisteet ovat erittäin spesifisiä yhdisteitä trombiinin ja muiden proteolyyttisten peptidyylipeptidihydrolaasityyppisten entsyymien suhteen, tunnettu siitä, että sitä esittää yleinen kaava: 0 0 0 n n n R, -NH-CH-C-HH-OH-C-NH-CH-C-NH-R,.
  2. 1. I I 5 R2 R3 (CH2)n NH R4 tai sen suolat, jossa kaavassa R-^ voi olla vetyatomi, 1-8 C-atomia sisältävä asyyliryhmä, 1-6 C-atomia sisältävä ω-aminoasyyliryhmä, sykloheksyylikarbonyyliryhmä, ω-sykloheksyyliasetyyliryhmä, ^-amino-metyylisykloheksyylikarbonyyliryhmä, bentsoyyliryhmä, bensoyyliryhmä, joka on substituoitu metyyli- tai aminoryhmillä, ω-fenyyliasyyliryh-mä, jonka asyyliosassa on 1-3 C-atomia ja jonka fenyylirengas voi olla substituoitu aminoryhmällä, ^-tolueenisulfonyyli- ja Na-bentso-yylifenyylialanyyli- ja fenyylialaniiniryhmä, R2 voidaan valita ryhmästä, johon kuuluvat fenyyli-, bensyyli-, 4-hydroksibensyyliryhmä, R^ voi olla haarautunut alkyyli, jossa on 3-H C-atomia, n voi olla 3 tai 4, Rjj voi olla vetyatomi tai guanyyliryhmä, R^ voi olla nitrofenyyli-, -naftyyli- tai nitronaftyyliryhmä. Patentkrav Nya diagnostiskt verksamma substrat med hög specificitet tili trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl- peptidhydrolaser kännetecknadeav den allmänna formeln: 0 0 0 Il II II R-. -NH-CH-C-HN-CH-C-NH-CH-C-NH-Rr-
  3. 1. I I 5 R2 Rj (0H2)n NH Rn
FI1299/73A 1972-05-02 1973-04-24 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser FI56828C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7205757A SE380257B (sv) 1972-05-02 1972-05-02 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
SE575772 1972-05-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI56828B FI56828B (fi) 1979-12-31
FI56828C true FI56828C (fi) 1980-04-10

Family

ID=20267168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI1299/73A FI56828C (fi) 1972-05-02 1973-04-24 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser

Country Status (23)

Country Link
US (1) US3884896A (fi)
JP (1) JPS559199B2 (fi)
AT (1) AT324557B (fi)
AU (1) AU475377B2 (fi)
BE (1) BE798916A (fi)
CA (1) CA1010849A (fi)
CH (1) CH590476A5 (fi)
CS (1) CS187376B2 (fi)
DD (1) DD108281A5 (fi)
DE (1) DE2322116B2 (fi)
ES (1) ES414252A1 (fi)
FI (1) FI56828C (fi)
FR (1) FR2183188B1 (fi)
GB (1) GB1428039A (fi)
HU (1) HU170670B (fi)
IL (1) IL42123A (fi)
IT (1) IT1050662B (fi)
NL (1) NL7306085A (fi)
NO (1) NO135245C (fi)
PL (1) PL90746B1 (fi)
SE (1) SE380257B (fi)
SU (1) SU671721A3 (fi)
ZA (1) ZA732976B (fi)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS50139215U (fi) * 1974-04-30 1975-11-17
DE2527932C2 (de) * 1974-07-02 1983-04-21 Pentapharm AG, 4052 Basel Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein
US4016259A (en) * 1974-07-26 1977-04-05 Research Corporation Contraceptive polypeptides
US4162941A (en) * 1974-12-05 1979-07-31 Ab Kabi Method for determining a proteolytic enzyme
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
CH622286A5 (fi) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
US4169015A (en) * 1975-07-11 1979-09-25 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
SE407405B (sv) * 1975-07-11 1979-03-26 Kabi Ab Nya kromogena trombinsubstrat
US4061625A (en) * 1975-07-11 1977-12-06 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407115B (sv) * 1975-10-06 1979-03-12 Kabi Ab Forfarande och metelektroder for studium av enzymatiska och andra biokemiska reaktioner
SE419871B (sv) * 1975-12-01 1981-08-31 Pharmacia Ab Sett att bestemma aktiviteten hos faktor xa-inhibitor i blod
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
FR2416883A2 (fr) * 1977-02-18 1979-09-07 Delalande Sa Nouveaux oligopeptides trifluoromethyles, leur procede de preparation et leur application en therapeutique
JPS5415797A (en) * 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
CA1087075A (en) * 1977-08-05 1980-10-07 Robert J. Gargiulo Composition and method for determining transferase and protease activity
DE2757992A1 (de) * 1977-12-24 1979-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur prothrombin-bestimmung
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
DE2812943C3 (de) * 1978-03-23 1981-05-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma
US4302538A (en) * 1978-03-27 1981-11-24 Ortho Diagnostics Inc. Buffer system in an anti-thrombin III test
IL60888A (en) * 1978-06-16 1984-07-31 Yeda Res & Dev Substrates and process for the quantitative assay of enzymes
DE2964956D1 (en) * 1978-07-18 1983-04-07 Kabi Ab Bradykinin inhibiting tripeptide derivatives, process for their preparation and pharmaceutical preparations containing them
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4166825A (en) * 1978-08-17 1979-09-04 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
US4161488A (en) * 1978-08-17 1979-07-17 Abbott Laboratories Enzymatic substrates
JPS5559150A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
JPS5559149A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
JPS59499B2 (ja) * 1978-11-02 1984-01-07 味の素株式会社 ペプチド誘導体
US4289498A (en) * 1979-01-08 1981-09-15 Ortho Diagnostics, Inc. One-stage prothrombin assay and compositions useful therein
US4217269A (en) * 1979-03-23 1980-08-12 Abbott Laboratories Dipeptide chromogenic substrates
US4219497A (en) 1979-04-06 1980-08-26 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
US4409140A (en) * 1979-04-23 1983-10-11 Smith Robert E Substrates and method for determining enzymes
EP0018002B1 (de) * 1979-04-24 1983-02-09 Marcel Jozefonvicz Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen
CA1161431A (en) * 1979-05-11 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives
US4221706A (en) * 1979-06-14 1980-09-09 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
US4308202A (en) * 1979-10-25 1981-12-29 Torii & Co., Ltd. Prolylphenylalanylarginine derivatives, process for producing same and method for measuring activity of enzymes using same
JPS5661339A (en) * 1979-10-26 1981-05-26 Ajinomoto Co Inc Arginine derivative
US4318904A (en) * 1980-04-25 1982-03-09 Research Corporation Peptide affinity labels for thrombin and other trypsin-like proteases
DK155051C (da) * 1980-05-06 1989-07-03 Pentapharm Ag Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf
WO1982000641A1 (en) * 1980-08-25 1982-03-04 Ab Kabivitrum Peptide substrates for determination of protease activity
US4568636A (en) * 1981-03-25 1986-02-04 Pentapharm Ag Tripeptide derivatives
US4388233A (en) * 1981-05-15 1983-06-14 The Regents Of The University Of California Synthetic substrates for enzyme analysis
US4434096A (en) 1981-06-30 1984-02-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes
JPS5856695A (ja) * 1981-09-28 1983-04-04 Nitto Boseki Co Ltd 新規なトロンビン測定用基質
JPS5863399A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Nitto Boseki Co Ltd 新規なプラスミン測定用基質
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
DE3268329D1 (en) * 1981-11-02 1986-02-13 Pentapharm Ag Process for the quantitative determination of the blood clotting factor xii in human plasma
SE8203887D0 (sv) * 1982-06-23 1982-06-23 Kabivitrum Ab Nya trombininhiberande foreningar
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JPS6117956A (ja) * 1984-07-04 1986-01-25 Nitto Boseki Co Ltd 新規な尿中カリクレイン測定用基質
US4897444A (en) * 1985-05-31 1990-01-30 The Research Foundation Of The State University Of New York Immobilized fluorogenic substrates for enzymes; and processes for their preparation
JPH0413880Y2 (fi) * 1985-08-22 1992-03-30
US5187069A (en) * 1990-08-06 1993-02-16 Henry Ford Health System Active site labelling of plasminogen
EP0535485B1 (en) * 1991-10-03 1997-07-16 Bayer Corporation Device and method of separating and assaying whole blood
AU4287593A (en) * 1992-04-27 1993-11-29 Avocet Medical, Inc. Test article and method for performing blood coagulation assays
US5580744A (en) * 1992-04-27 1996-12-03 Avocet Medical, Inc. Test article and method for performing blood coagulation assays
US5399487A (en) * 1993-03-04 1995-03-21 Haematologic Technologies, Inc. 6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamides useful as fluorogenic proteolytic enzyme substrates
US6297024B1 (en) 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
US6235494B1 (en) 1999-02-08 2001-05-22 The Scripps Research Institute Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates

Also Published As

Publication number Publication date
JPS4949695A (fi) 1974-05-14
NL7306085A (fi) 1973-11-06
AT324557B (de) 1975-09-10
ES414252A1 (es) 1976-05-01
AU475377B2 (en) 1976-08-19
CH590476A5 (fi) 1977-08-15
JPS559199B2 (fi) 1980-03-08
FR2183188B1 (fi) 1977-02-11
HU170670B (fi) 1977-08-28
SU671721A3 (ru) 1979-06-30
AU5503873A (en) 1974-11-07
IL42123A (en) 1978-01-31
ZA732976B (en) 1974-11-27
BE798916A (fr) 1973-08-16
DE2322116B2 (de) 1980-01-10
PL90746B1 (fi) 1977-01-31
NO135245B (fi) 1976-11-29
GB1428039A (en) 1976-03-17
FI56828B (fi) 1979-12-31
DD108281A5 (fi) 1974-09-12
IL42123A0 (en) 1973-06-29
CS187376B2 (en) 1979-01-31
US3884896A (en) 1975-05-20
NO135245C (fi) 1977-03-09
FR2183188A1 (fi) 1973-12-14
SE380257B (sv) 1975-11-03
IT1050662B (it) 1981-03-20
CA1010849A (en) 1977-05-24
DE2322116A1 (de) 1973-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI56828C (fi) Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
US4070245A (en) Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes
FI56829C (fi) Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
US4457866A (en) Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates
US4314936A (en) Substrates for the quantitative assay of enzymes and such assay
EP0046742B1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
US4508644A (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
US4480030A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
US4190574A (en) Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators
NO142074B (no) Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser
CA2363827A1 (en) Oligopeptide derivatives for the electrochemical measurement of protease activity
US4520100A (en) Method for measuring thrombin
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
US4428874A (en) Tripeptide derivatives
JPS58209999A (ja) 組織プラスミノゲンアクチベ−タ−の活性を検定する方法及びその方法に使用するキツト
US4568636A (en) Tripeptide derivatives
US5917012A (en) Peptide derivatives
US4216142A (en) Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
GB2126720A (en) A method for determination of enzyme activity
FI56525C (fi) Nya kromogena trombinsubstrat
Fleminger et al. Fluorogenic substrates for bacterial aminopeptidase P and its analogs detected in human serum and calf lung
EP0077124A1 (en) Novel substrates for measuring plasmin
US4434096A (en) Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes
HU197757B (en) Process for producing chromogen compounds