DE69823712T2

DE69823712T2 - Rab3 GEP Protein

Info

Publication number: DE69823712T2
Application number: DE69823712T
Authority: DE
Inventors: Yoshimi Kobe-shi Takai; Hiroyuki Kobe-shi Nakanishi; Manabu Kobe-shi Wada
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2018-02-03
Also published as: DE69823712D1; JP4151999B2; EP0856583B1; EP0856583A2; EP0856583A3; JPH10210971A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein für die kleinen GTP-bindenden Proteine (G-Proteine) der Rab3-Unterfamilie spezifisches GDP/GTP-Austauschprotein (GEP). Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Protein Rab3-GEP, das für die Aufklärung des molekularen Mechanismus des für die Aufrechterhaltung der Homöostase eines lebenden Organismus erforderlichen intrazellulären Vesikelverkehrs, oder für die Diagnose oder die Entwicklung präventiver oder therapeutischer Wirkstoffe für neurale Krankheiten brauchbar ist.
Beschreibung des zugehörigen Fachgebiets
Im Allgemeinen liegen in Zellen, aus denen ein lebender Organismus aufgebaut ist, eine Anzahl von Organellen vor, die von Einheitsmembranen umgeben sind, beispielsweise das endoplasmatische Retikulum, der Golgi-Komplex, Lysosome und Endosome, und der Materialtransport zwischen diesen Organellen wird über einen genauen Vesikelverkehr (intrazellulärer Vesikelverkehr) bewerkstelligt. Beispielsweise werden Membranrezeptoren wie EGF- und PDGF-Rezeptoren an Ribosomen synthetisiert und zur Membran des endoplasmatischen Retikulums transportiert, von wo sie durch den Golgi-Komplex hindurch über Vesikel zur Plasmamembran transportiert werden. Lösliche Substanzen, beispielsweise solche, die von der Plasmamembran aus der Zelle sekretiert werden, werden ebenfalls über Vesikel transportiert. Beispielsweise werden Hormone und Verdauungsenzyme an Ribosomen synthetisiert und zum Lumen des endoplasmatischen Retikulums transportiert, von wo sie zur Plasmamembran transportiert werden. Exozytose, Endozytose und Transzytose werden über einen intrazellulären Vesikelverkehr durchgeführt. Es gibt zwei exozytotische Wege: einer davon ist ein regulierter Weg, und der andere ein konstitutiver Weg. In ersterem wird die Exozytose in den meisten Fällen über Ca²⁺ reguliert. Ein intrazellulärer Vesikelverkehr ist auch an verschiedenen anderen Zellfunktionen beteiligt, beispielsweise der Ausbildung der Zellpolarität, der Zytokinese und der Zellmotilität. Obwohl der intrazelluläre Vesikelverkehr einer der sehr wichtigen oben beschriebenen zellulären Vorgänge ist, wurde der molekulare Mechanismus noch nicht vollständig aufgeklärt. Der bisher aufgeklärte Mechanismus des intrazellulären Vesikelverkehrs sieht folgendermaßen aus.
Beim intrazellulären Vesikelverkehr existieren mindestens vier grundsätzliche Mechanismen: (i) Knospung des Vesikels von der Donormembran; (ii) zielgerichteter Transport des Vesikels zur Akzeptormembran; (iii) Andocken des Vesikels an der Akzeptormembran; (iv) Fusion des Vesikels mit der Akzeptormembran. Der Vesikelverkehr wird durch die kleinen G-Proteine der Rab-Familie reguliert. Die Rab-Familie hat ungefähr dreißig Mitglieder, und jedes Mitglied ist in jedem Membrankompartiment lokalisiert und übt seine spezifische Funktion aus. Die Wirkungsweise der Mitglieder der Rab-Familie bei den Vorgängen des zielgerichteten Transports und Andockens im Rahmen des intrazellulären Vesikelverkehrs sieht folgendermaßen aus: die an GDP gebundene inaktive Form jedes Mitglieds der Rab-Familie liegt im Komplex mit einem Rab-GTP-Dissoziationsinhibitor (GDI) vor und verbleibt im Zytoplasma. Bei Freisetzung von Rab-GDI wird GEP aktiv und das Mitglied der Rab-Familie wird in die GTPgebundene aktive Form umgewandelt. Diese GTP-gebundene Form bindet an deren spezifisches Zielprotein auf dem Vesikel, das folglich zur Akzeptormembran transportiert wird. Vor oder nach der Fusion des Vesikels mit der Membran wird die GTP-gebundene Form in die GDP-gebundene Form umgewandelt. Sobald die GTPgebundene Form auf der Membran erzeugt wurde, wird sie mit Rab-GDI komplexiert und von der Membran in das Zytoplasma transloziert.
Die vorliegenden Erfinder haben nun Rab3A als Mitglied der kleinen G-Proteine der Rab-Familie entdeckt (J. Biol. Chem., 263: 2879–2904, 1998) und gezeigt, dass Rab3A eine wichtige Rolle bei der Ca²⁺-abhängigen Exozytose spielt, insbesondere bei der Freisetzung von Neurotransmitter (Int. Rev. Cytol., 133: 187–230, 1992). Sie entdeckten weiterhin Rab-GDI, ein regulatorisches Protein von Rab3A (J. Biol. Chem., 265: 2333–2337, 1990), und Rabphilin3A, ein Zielprotein von Rab3A (Mol. Cell. Biol., 13: 2061–2068, 1993).
Beim intrazellulären Vesikelverkehr wie oben beschrieben wurde die Wirkungsweise der Mitglieder der Rab-Familie aufgeklärt, und die von den vorliegenden Erfindern unternommenen Forschungsanstrengungen erlaubten die Bestimmung von regulatorischen Proteinen und Zielproteinen der Mitglieder der Rab-Familie.
Um den Mechanismus des intrazellulären Vesikelverkehrs genauer zu verstehen, ist es jedoch unerlässlich, GEPs und GAPs zu finden, die spezifisch für jedes Mitglied der Rab-Familie oder Rab-Untertamilie sind. Zumindest wurde für die Mitglieder der Rab3-Unterfamilie (Rab3A, -B, -C und -D) spezifisches GEP oder GAP bisher noch nicht identifiziert. Zwei GEPs für Rab3A, Mss4 (Nature, 361: 464–467, 1993) und Rab3A-GRF (J. Biol. Chem., 267: 22715–22718, 1992) wurde bisher gefunden: ersteres ist nicht spezifisch für die Rab3-Unterfamilie, und letzteres wurde lediglich teilweise aufgereinigt und seine Primärstruktur wurde noch nicht veröffentlicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Zu einem Zeitpunkt, zu dem dessen Struktur (Aminosäuresequenz) und Eigenschaften noch nicht aufgeklärt sind, liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines neuen Proteins (Rab3 GEP), das spezifisch für die am intrazellulären Vesikelverkehr beteiligten kleinen G-Proteine der Rab3-Unterfamilie ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung von Material für die Genmanipulation dieses Rab3-GEP.
Die Erfindung stellt ein Protein Rab3-GEP bereit, das ein für die kleinen G-Proteine der Rab3-Unterfamilie spezifisches GDP/GTP-Austauschprotein ist und die Aminsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Die Erfindung stellt zusätzlich eine cDNA-Sequenz bereit, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 kodiert.
Die Erfindung stellt auch eine genomische DNA-Sequenz bereit, an welche die vorstehend angegebene cDNA oder ein Teil davon hybridisiert.
Erfindungsgemäß wird ein neues, für die am intrazellulären Vesikelverkehr beteiligten kleinen G-Proteine der Rab3-Unterfamilie spezifisches Protein (Rab3-GEP), und weiterhin genetisches Material für die industrielle Verwendung eines solchen Proteins, bereitgestellt. Dieses Protein ist nicht nur brauchbar für die Aufklärung des molekularen Mechanismus des intrazellulären Vesikelverkehrs, eines wichtigen zellulären Vorgangs, sondern auch für die Entwicklung diagnostischer, präventiver und therapeutischer Mittel für neurale Krankheiten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Säulenchromatographieläufe: (A) zeigt eine Chromatographie mit einer Superdex 200-Säule und (B) zeigt die zweite Chromatographie mit einer Hydroxyapatitsäule (• stellt das gebundene [3H]GDP dar, das ein Indikator für die Aktivität von Rab3-GEP ist, --- die Extinktion bei 280 nm, und die unteren Tafeln zeigen die Analyse mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und Silberfärbung);
2 zeigt die Substratsspezifität von Rab3-GEPII (A-1, B-1) und Mss4 (A-2, B-2): (A-1, A-2) Rab3A (•), Rab2 (Δ), Rab5A (o), Rab10 (
) und Rab11 (
); und (B-1, B-2) Rab3A (•), Rab3B (Δ), Rab3C (
), Rab3D (o); und
3A zeigt das Erfordernis von Rab3-GEPII (A-1) und Mss4 (A-2) für Lipidmodifizierungen von Rab3A, wobei deren Aktivität gegenüber lipidmodifiziertem Rab3A (•) und nicht-lipidmodifiziertem Rab3A (o) dargestellt sind; und 3B zeigt die Sensitivität von Rab3-GEPII und Mss4 gegenüber Rab-GDI (mit Rab3-GEPII •), mit Mss4 (
), ohne Rab3-GEPII oder Mss4 (o)).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein erfindungsgemäßes Rab3-GEP-Protein wird aus der löslichen Fraktion von Rattenhirnsynapsen durch aufeinanderfolgende Säulenchromatographieläufe unter Verwendung von lipidmodifiziertem Rab3A als Substrat aufgereinigt und hat bei Bestimmung durch SDS-PAGE ein Molekulargewicht von ungefähr 200 kD (bei Bestimmung durch Gelfiltration ungefähr 270 kD). Man erhielt mit Teilaminosäuresequenzen dieses aufgereinigten Proteins als Sonden einen cDNA-Klon aus einer cDNA-Bibliothek der Ratte, woraufhin die Aminosäuresequenz der cDNA analysiert wurde. Es wurde bestätigt, dass dieses Protein Rab3-GEP die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufwies.
Das erfindungsgemäße Rab3-GEP ist daher durch Insertion der vorstehend genannten DNA in einen geeigneten Expressionsvektor und Expression der cDNA in Escherichia coli und anderen Bakterien erhältlich. Ein von einem anderen Lebewesen als der Ratte stammendes Protein kann beispielsweise durch ein Verfahren erhalten werden, bei dem eine cDNA einer cDNA-Bibliothek des Lebewesens unter Verwendung der erfindungsgemäßen cDNA oder eines Teils davon als Sonde isoliert wird, und in einem geeigneten Wirt/Vektor-System zur Expression gebracht wird. Das auf diese Weise von einem anderen Lebewesen als der Ratte stammende Protein weist ebenfalls eine Aminosäuresequenz auf, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die von SEQ ID NO: 1.
Wie vorstehend beschrieben umfasst die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz cDNA der Ratte oder jedes anderen Lebewesens als der Ratte. Die erfindungsgemäße genomische cDNA-Sequenz umfasst die DNA-Sequenz jeder beliebigen Art von Lebewesen.
Beispiele
Ein erfindungsgemäßes Rab3-GEP-Protein wird durch Beispiele nun weiter detailliert beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die nachfolgenden Beispiele beschränkt.
Beispiel 1: Aufreinigung von Rab3-GEP
Aus 80 Rattenhirnen wurde eine lösliche Synapsenfraktion hergestellt. Eine Hälfte der Fraktion (500 ml, 455 mg Protein) wurde auf 0,2 M NaCl eingestellt und auf eine mit 0,2 M NaCl enthaltendem Puffer A (20 mM Tris/Cl bei pH 7,5 und 1 mM DTT) äquilibrierte Q-Sepharose FF-Säule (2,6 × 10 cm) aufgetragen. Die Elution wurde mit 350 ml Puffer A durchgeführt, der 0,5 M NaCl enthielt. Es wurden Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt. Beim Testen der Rab3-GEP-Aktivität durch Messung der Dissoziation von [³H]GDP von lipidmodifiziertem Rab3A wurde Aktivität in den Fraktionen 5–19 festgestellt.
Diese Fraktionen (150 ml, 159 mg Protein) wurden gesammelt und NaCl bis auf eine Endkonzentration von 2 M zugegeben. Die Probe wurde auf eine Phenyl-Sepharose-Säule (2,6 × 10 cm) aufgetragen, die mit 2 M NaCl enthaltendem Puffer A äquilibriert war. Die Elution erfolgte über 360 ml eines linearen NaCl-Gradienten (2–0 M) in Puffer A, worauf sich 180 ml Puffer A anschlossen. Es wurden Fraktionen von jeweils 6 ml gesammelt. Rab3-GEP-Aktivität wurde in den Fraktionen 52–63 festgestellt.
Diese Fraktionen (72 ml, 8,6 mg Protein) wurden gesammelt und auf eine Hydroxyapatitsäule (1,0 × 30 cm) aufgetragen, die mit Puffer B (20 mM Kaliumphosphat bei pH 7,8, 1 mM DTT, 0,6% CHAPS, und 10% Glycerin) äquilibriert war. Die Elution erfolgte über 75 ml eines linearen Gradienten von Kaliumphosphat (20–100 mM) in Puffer B und anschließend 75 ml eines linearen Gradienten (100–300 mM) in Puffer B und anschließend 50 ml eines linearen Gradienten (300–500 mM) in Puffer B. Es wurden Fraktionen von jeweils 2,5 ml gesammelt. Die Rab3-GEP-Aktivität wurde in den Fraktionen 46–54 festgestellt.
Diese Fraktionen (22,5 ml, 2,2 mg Protein) wurden gesammelt, mit einem gleichen Volumen Puffer C (20 mM bis-Tris/Cl bei pH 5,5, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,6% CHAPS und 10% Glycerin) gemischt und auf eine mit Puffer C äquilibrierte MonoQ HR 10/10 Säule aufgetragen. Die Elution erfolgte über 60 ml eines linearen NaCl-Gradienten (0,2–0,5 M) in Puffer C. Es wurden Fraktionen von jeweils 1 ml gesammelt. Die Rab3-GEP-Aktivität wurde in den Fraktionen 24–33 festgestellt.
Diese Fraktionen (10 ml, 0,44 mg Protein) wurden gesammelt, auf ungefähr 2 ml eingeengt und auf eine Superdex 200-Säule (1,6 × 60 cm) aufgetragen, die mit Puffer D (20 mM Tris-Cl bei pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,6% CHAPS, 0,45% Natriumcholat, 10% Glycerin und 0,15 M NaCl) äquilibriert war. Die Elution erfolgte mit dem gleichen Puffer. Es wurden Fraktionen von jeweils 2 ml gesammelt. Rab3-GEP-Aktivität erschien in den Fraktionen 26–30 (1A, Pfeilspitze).
Diese aktiven Fraktionen (10 ml, 45 mg Protein) wurden gesammelt. Die andere Hälfte der löslichen Synapsenfraktion wurde ebenfalls in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben aufeinanderfolgenden Säulenchromatographieläufen unterworfen. Die aktiven Fraktionen der beiden Chromatographieläufe mit Superdex 200 Säulen wurden vereinigt und auf eine Hydroxyapatit-Hochdrucksflüssigkeitschromatographiesäule aufgetragen, die mit Puffer B äquilibriert war. Die Elution erfolgte mit 12,5 ml eines linearen Kaliumphosphatgradienten (20–100 mM) in Puffer B, worauf sich 50 ml eines linearen Kaliumphosphatgradienten (100–500 mM) in Puffer B anschlossen. Es wurden Fraktionen von jeweils 1 ml gesammelt. Rab3 GEP-Aktivität tauchte in zwei Peaks (1B, Pfeilspitze) in den Fraktionen 29–33 und 34–38 (1B) auf. Der erste Peak (5 ml, 15,5 mg Protein) und der zweite Peak (5 ml, 7,5 mg Protein) wurden getrennt als Rab3 GEPI bzw. Rab3 GEPII gesammelt und –80°C gelagert.
Dieses Rab3-GEPII erwies sich als inaktiv gegenüber den anderen Rab-Familien (Rab2, Rab5A, Rab10 und Rab11) (2A). Rab3-GEPII war gegenüber Rab3A und Rab3C aktiv, teilweise aktiv gegenüber Rab3D, aber fast inaktiv gegenüber Rab3B (2B). Weiterhin war Rab3-GEPII inaktiv gegenüber nicht-lipidmodifiziertem Rab3A, während es gegenüber lipidmodifiziertem Rab3A aktiv war (3A). Diese Eigenschaften von Rab3-GEPII unterschieden sich von denen des Proteins Mss4, das gegenüber lipidmodifiziertem und nicht-lipidmodifiziertem Rab3A gleichermaßen aktiv war und gegenüber vielen anderen Mitgliedern der Rab-Familie (2 und 3) aktiv war, während sowohl Rab3-GEPII und Mss4 gegenüber mit Rab-GDI komplexiertem Rab3A inaktiv waren (3B). Rab3-GEPI wies beinahe die gleichen Eigenschaften auf wie Rab3-GEPII.
Beispiel 2: Peptidkartierung von Rab3-GEP und Klonierung von dessen cDNA
Rab3-GEPII (20 mg Protein) und Rab3-GEPI (10 mg Protein), die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben aufgereinigt worden waren, wurden unabhängig voneinander einer SDS-PAGE (6,5% Polyacrylamidgel) unterworfen. Jede Proteinbande, die einem Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 200 kD entsprach, wurde aus dem Gel isoliert, vollständig mit einer Lysyl-Endopeptidase verdaut und einer C18 Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterworfen. Die Sequenzen der neun Peptide wurden über einen Peptidsequenzierer bestimmt. Zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von Rab3-GEPII wurde aufgereinigtes GEPII (4 mg Protein) über SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Proteinbande wurde aus der Membran ausgeschnitten und direkt in den Peptidsequenzierer gegeben. Unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die auf der Grundlage der Teilaminosäuresequenzen entworfen worden waren, wurde eine cDNA-Bibliothek aus Rattenhirn gescreent und eine cDNA von Rab3-GEPII kloniert. Die Sequenz dieser cDNA wurde über ein bekanntes Verfahren unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers (ABI373) bestimmt, und die Aminsäuresequenz (SEQ ID NO: 1) von Rab3-GEPII wurde aus der resultierenden Nukleotidsequenz bestimmt.
Als Ergebnis einer Computerhomologiesuche wies diese Aminosäuresequenz 35% Identität mit einem von der cDNA yk26g7.5 von Caenorhabditis elegans kodiertem Protein auf. Während es fast identisch mit einem vom menschlichen DENN kodiertem Protein war, fehlten dem menschlichen DENN-Protein ungefähr 300 C-terminale Aminosäuren von Rab3-GEP.
Beispiel 3: Expression von rekombinantem Rab3-GEP
Die cDNA von Rab3-GEP wurde in den pCMV-Vektor inseriert und das Konstrukt über die DEAE-Dextran-Methode in COS7-Zellen transfektiert. Die COS7-Zellen wurden mit einem Puffer (20 mM Tris/Cl bei pH 7,5, 1 mM DTT und 0,6% CHAPS) homogenisiert und 1 h mit 100,000 × g zentrifugiert. Der Überstand (2 ml, 4,2 mg Protein) wurde auf eine Mono Q PC1.6/5-Chromatographiesäule aufgetragen. Die Rab3-GEP-Aktivität jeder Fraktion wurde gemessen und die aktiven Fraktionen als rekombinantes Rab3-GEP verwendet.
Dieses rekombinante Rab3-GEP wies dieselben Eigenschaften auf wie das zuvor aufgereinigte Rab3-GEPII (Erfordernis der Lipidmodifikationen von Rab3A, Substratspezifität und Sensivität gegenüber Rab-GDI). Northern Blot- und Western Blot-Analysen zeigten, dass Rab3-GEP in allen Rattengeweben (Herz, Hirn, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Hoden) exprimiert wurde, wobei die höchste Expression im Gehirn vorlag.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein GDP/GTP-Austauschprotein spezifisch für die G-Proteine der Rab3-Unterfamilie, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst.
Eine cDNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 kodiert.