DE19938671A1 - Neutrale Hirn-Sphingomyelinase - Google Patents
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Abstract
Nukleinsäure kodierend für eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase (nSMase2) mit den Sequenzmotiven X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -D-Y-X 5 und X 6 -X 7 -T-D-H-X 8 , wobei X 1 , X 6 = A oder G; X 2 , X 3 = R oder K; X 4 , X 5 , X 7 , X 8 = I oder L oder V oder M ist.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für humane oder murine eu
karyontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase codieren, und ihre Anwendung.
Sphingomyelin ist eine wesentliche Komponente von Plasmamembranen. Der Abbau
des Sphingomyelins gibt eine Vielzahl von Substanzen, die potentielle second mes
senger Eigenschaften haben, z. B. Ceramid, Sphingosin, Sphingosin-1-phosphat. Es
sind zwei sphingomyelinspaltende Enzymaktivitäten bekannt, zum einen die der lyso
somalen sauren Sphingomyelinase und zum anderen die der plasmamembran
gebundenen neutralen Sphingomyelinase.
Im Menschen und in Säugetieren liegt die Aktivität der neutralen Sphingomyelinase
bevorzugt im Gehirn vor. Die einzige bisher charakterisierte eukaryontische neutrale
Sphingomyelinase kommt in Säugern in allen Gewebetypen vor und ist nicht maß
geblich für die im Gehirn meßbare Sphingomyelinase-Aktivität verantwortlich.
Hayashi et al. beschreiben im J. of Biol. Chem. 272 (1997) 18082-18086 ein Protein
ccal.
Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals Nukleinsäuren, codierend für hu
mane oder murine eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase, verfügbar ge
macht. Sie wird auch als nSMase2 bezeichnet. Die eukaryontische neutrale Hirn-
Sphingomyelinase ist dadurch charakterisiert, daß sie im Gehirn angereichert ist,
Sphingomyelin in Ceramid und Phosphocholin spaltet und die Aktivität von der Zu
gabe von Magnesiumionen abhängig ist. Es handelt sich um ein membrangebundenes
Enzym. Die maximale Aktivität wird im neutralen pH-Bereich erzielt.
Das Molekulargewicht liegt im Bereich von 50 bis 80 kD, vorzugsweise im Bereich
von 70 bis 75 kD.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse von Northern- und Westernblots von Zellinien, die
nSMase2 überexprimieren.
Bevorzugt handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure um Nukleinsäuren
mit der Seq. ID. Nr. 3 und Seq. ID. Nr. 4.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eignen sich zur Expression der eukaryonti
schen neutralen Hirn-Sphingomyelinase in pro- oder eukaryontischen Systemen.
Darüber hinaus sind sie auch zur Expression der nSMase2 in vivo im Sinne einer
Gentherapie oder insbesondere in Form von Fragmenten auch in komplementärer
Struktur als Antisense-Nukleotide zur Verringerung der Expression der nSMase2
geeignet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können durch chemische Synthese oder durch
Vervielfältigung in gentechnisch veränderten Organismen nach dem Fachmann an
sich bekannten Verfahren hergestellt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die durch die Expression der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren erhältliche eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase.
Sie weist zwei Teilmotive X1-X2-X3-X4-D-Y-X5 und X6-X7-T-D-H-X8, wobei X1, X6
= A oder G; X2, X3 = R oder K; X4, X5, X7, X8 = I oder L oder V oder M ist auf.
Die erfindungsgemäße nSMase2 läßt sich durch Expression in gentechnisch verän
derten Organismen herstellen. Insbesondere sind eukaryontische Expressionssysteme
geeignet. Entsprechende eukaryontische Expressionssysteme sind dem Fachmann
bekannt wie beispielsweise pRc/CMV (Firma Stratagene). Die Aufreinigung aus
gentechnisch veränderten Organismen bietet, insbesondere im Falle der Überexpres
sion, einen leichten und direkten Zugang zur erfindungsgemäßen nSMase2 und er
laubt darüber hinaus die Isolierung in größeren Mengen.
Die Aminosäuresequenzen der humanen und murinen neutralen Hirn-
Sphingomyelinase sind als Seq. ID. Nr. 1 und 2 wiedergegeben.
Die Molekulargewichte der humanen bzw. murinen Sphingomyelinase 2 beträgt je
weils etwa 71 kDa. Im Gegensatz zu den bakteriellen nSMasen enthalten die erfin
dungsgemäßen nSMase2 Sequenzen keine Signalsequenz am N-Terminus. Aufgrund
der Hydrophobizitätsanalyse kann davon ausgegangen werden, daß zwei benachbarte
hydrophobe Membrandomänen am N-Terminus durch 35 Aminosäuren getrennt sind.
Es scheint sich daher um integrale Membranproteine zu handeln, deren katalytisch
aktive Domäne zum Cytosol zeigt, während nur ein geringer Anteil der Enzyme
Kontakt zur extrazellulären Umgebung hat. Dies ist im Gegensatz zu den bakteriellen
nSMasen, bei denen es sich um sekretierte, lösliche Proteine handelt, ist aber in Über
einstimmung mit bisherigen Untersuchungen zu den Eigenschaften der neutralen
Sphingomyelinasen von Säugetieren. Die ubiquitäre eukaryontische Sphingomyelina
se nSMase1 besitzt ebenfalls zwei hydrophobe Transmembrandomänen, die sich
jedoch am C-Terminus des Proteins befinden.
Die 6 kb mRNA der humanen nSMase2 wird gemäß Northern Blot Analyse bevorzugt
im Gehirn exprimiert. In Leber und Dünndarm zeigt der Northern Blot ein schwäche
res Signal, während in Thymus eine kreuzhybridisierende mRNA von unterschiedli
cher Größe (3.5 kB) exprimiert wird.
Das pH-Optimum der erfindungsgemäßen neutralen Hirn-Sphingomyelinase liegt im
Bereich von 6 bis 8. Die Aktivität ist magnesiumionenabhängig, die Zugabe von
EDTA führt zu einer Inhibierung der nSMase-Aktivität, kann jedoch durch Zugabe
von Mn2+- oder Mg2+-Ionen wiederhergestellt werden. Die Aktivität ist unbeeinflußt
durch Behandlung mit DTT oder 2-Mercaptoethanol.
Weiterhin beansprucht werden Varianten der eukaryontischen neutralen Hirn-
Sphingomyelinase. Unter den Begriff "Varianten" fallen sowohl natürlich vorkom
mende allelische Variationen der eukaryontischen neutralen Hirn-Sphingomyelinase
sowie durch rekombinante DNA-Technologie (insbesondere durch in vitro Mutagene
se mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden) und anschließende Ex
pression erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunolo
gischen Aktivität der eukaryontischen neutralen Sphingomyelinase entsprechen. Da
bei können sowohl Aminosäuren deletiert, eingefügt oder konservativ ausgetauscht
werden. Konservativer Austausch bedeutet, daß eine Aminosäure durch eine Ami
nosäure ersetzt wird, die ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist.
So sind beispielsweise folgende Aminosäuren austauschbar: Serin für/gegen Alanin,
Alanin für/gegen Glycin, Methionin für/gegen Serin, Lysin für/gegen Arginin, Lysin
für/gegen Serin.
Insbesondere umfaßt der Begriff Varianten auch N- und/oder C-terminale verkürzte
Proteine sowie acetylierte, glykosylierte, amidierte und/oder phosphorylierte Derivate.
Auch Verbindungen, bei denen nSMase2 oder ihre Varianten mit weiteren Molekülen
wie Farbstoffen, Radionukliden oder Affinitätskomponenten gekoppelt sind, stellen
erfindungsgemäße Varianten dar.
Beansprucht werden auch Nukleinsäuren, die für eukaryontische neutrale Hirn-
Sphingomyelinase codieren bzw. komplementär zu diesen Nukleinsäuren sind. Bei
den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um DNA, RNA, PNA oder um nuklea
seresistente Analoga handeln. Nukleaseresistente Analoga sind insbesondere solche
Verbindungen, in denen die Phosphodiesterbindung durch hydrolysestabile Verbin
dungen modifiziert sind, beispielsweise Phosphothioate, Methylphosphonate o. ä.
Für Antisensenukleotide sind insbesondere kurze Fragmente der Nukleinsäuren ge
eignet. Diese sollten aus Gründen der Spezifität bevorzugt mehr als 6, noch mehr
bevorzugt mehr als 8 und am meisten bevorzugt mehr als 12 Nukleotide aufweisen.
Aus Gründen der Diffusion und der Kosten haben sie üblicherweise eine Länge von
weniger als 30 Nukleotiden, bevorzugt 24 oder weniger und noch mehr bevorzugt 18
oder weniger Nukleotide.
Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate von Nukleinsäuren, die für diagnosti
sche oder therapeutische Zwecke mit anderen Molekülen gekoppelt sind, beispiels
weise mit Fluoreszenzfarbstoffen, radioaktiven Markern oder Affinitätskomponenten,
sowie Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und der zu diesen Nuklein
säuren komplementären Nukleinsäuren sowie Varianten der Nukleinsäuren.
Fragmente bezeichnet dabei Nukleinsäuren, die am 5' oder 3' oder an beiden Seiten
verkürzt sind. Unter dem Begriff "Varianten" wird verstanden, daß diese Nukleinsäu
ren unter stringenten Bedingungen mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw.
dazu komplementären Nukleinsäuren hybridisieren. Unter dem Begriff "stringente
Bedingungen" wird verstanden, daß die Hybridisierung bei Bedingungen durchgeführt
wird, bei der die Temperatur noch bis zu 10°C unter der Temperatur liegt (bei sonst
identischen Bedingungen), bei der exakt komplementäre Nukleinsäuren gerade noch
hybridisieren würden. Wenn beispielsweise eine exakt hybrisierende Nukleinsäure
unter gegebenen Bedingungen bis zu einer Temperatur von ca. 55°C hybridisiert,
dann sind stringente Bedingungen Temperaturen gleich oder höher 45°C. Bevorzugt
ist der Temperaturbereich für stringente Bedingungen von 5°C, noch mehr bevorzugt
von 3°C.
Desweiteren betrifft die Erfindung Antikörper, die gegen die erfindungsgemäße
nSMase2 oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gerichtet sind. Diese Substan
zen eignen sich insbesondere zum Einsatz in der Diagnostik, dem Fachmann an sich
bekannten Immunoassays, zur histologischen Untersuchung sowie als Arzneimittel
zur Behandlung von Zuständen, die mit einer Überexpression der nSMase verbunden
sind. Solche erfindungsgemäßen Antikörper können mit dem Fachmann an sich be
kannten Verfahren durch Immunisierung mit nSMase, erfindungsgemäßen Nuklein
säuren oder Peptid- und Nukleinsäurenfragmenten in Gegenwart von Hilfsreagenzien
erhalten werden.
Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung Zellinien, die die erfindungsgemäße nSMa
se2 überexprimieren. Solche Zellinien sind erhältlich durch Transfektion mit Vekto
ren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für nSMase kodieren, enthalten.
Im Falle von eukaryontischen Zellinien kann die Transfektion beispielsweise durch
Elektroporation erfolgen. Die Zellinien sind dabei vorzugsweise stabiltransfiziert.
Überexpression bedeutet in diesem Zusammenhang, daß diese Zellinie eine höhere
Aktivität der nSMase aufweisen als die Zellinien, die nicht mit den erfindungsgemä
ßen Nukleinsäuren transfiziert wurden. Geeignete eukaryontische Zellinien sind bei
spielsweise die Zellinien U937, HEK 293 oder Jurkat.
Die Zellinien zeigten in Experimenten eine spezifische nSMase-Aktivität zwischen
0,1 und 10 µmol/mg Protein/Stunde.
Fig. 1 zeigt die Northern Blot Analyse der nSMase2-Expression in humanen Gewe
ben. Teil A zeigt dabei das Ergebnis der Hybridisierung mit einer nSMase2 Sonde.
Teil B zeigt als Kontrolle die Hybridisierung des Northen Blots mit einer Sonde spezi
fisch für β-Actin.
Die Fig. 2 bis 5 zeigen die erfindungsgemäßen Sequenzen.
Die Zugabe von 0,5 mM Arachidonsäure führte zu einer dreifachen Erhöhung der
nSMase-Aktivität in einem Extrakt aus HEK 293 Zellen, die nSMase2 überexprimie
ren. Die Zugabe von Phosphatidylserin führte zu einer sechsfachen Erhöhung der
nSMase-Aktivität in einem Extrakt aus HEK 293 Zellen, die nSMase2 überexprimie
ren.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein transgenes Säugetier, das eine Überex
pression (gain of function) oder eine Gendefizienz bzw. einen Gendefekt (loss of
function) für die erfindungsgemäße nSMase2 aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei
dem Säugetier um ein Nagetier, insbesondere eine Maus. Diese transgenen Säugetiere
sind durch für den Fachmann an sich bekannte Verfahren erhältlich und eignen sich
insbesondere zur Funktionsaufklärung der neutralen Sphingomyelinase. Für transgene
Säugetiere werden definierte Genkonstrukte durch DNA-Mikroinjektion in den Vor
kern (Pronukleus) einer befruchteten Eizelle im Einzellstadium injiziert, um die Ex
pression des zusätzlichen Gens zu erreichen. Durch zielgerichtete Veränderung eines
Gens im Genoms von Es-Zellen, die nachfolgend in Blastozysten injiziert werden,
wird die Funktion eines Gens ausgeschaltet.
Bevorzugt handelt es sich bei den transgenen Tieren um Tiere, bei denen das Gen
zeitlich und gewebsspezifisch von außen induzierbar ein- bzw. ausgeschaltet werden
kann. Entsprechende transgene Säugetiere eignen sich insbesondere zur Aufklärung
der mit der erfindungsgemäßen nSMase im Zusammenhang stehenden Stoffwechsel-
und Signaltransduktionswegen, die wiederum diagnostische oder therapeutische An
wendungen eröffnen. Insbesondere eignen sich die transgenen Säugetiere zum Scree
ning von pharmazeutischen Wirkstoffen.
Die erfindungsgemäße eukaryontische neutrale Sphingomyelinase, die erfindungsge
mäßen Nukleinsäuren sowie die erfindungsgemäßen Antikörper können in Arznei
mitteln und Diagnostikmitteln gegebenenfalls zusammen mit weiteren Hilfsstoffen
enthalten sein. Diese Arznei- und Diagnostikmittel eigenen sich zur Diagnose und
Behandlung von Erkrankungen, die auf einer Über- oder Unterexpression und/oder
einer erhöhten oder verminderten Aktivität der eukaryontischen neutralen Sphin
gomyelinase und/oder auf Störungen der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und/-
oder Apoptose beruhen.
Insbesondere sind dies Erkrankungen, bei denen Entzündungsprozesse, Zellwachs
tumstörungen und Stoffwechselstörungen eine Rolle spielen. Dies können beispiels
weise Krebserkrankungen oder Störungen der Cholesterinhomöostase
(Arteriosklerose) sein.
Ein erfindungsgemäßes pharmazeutisches Screening-Verfahren beruht auf der Verän
derung der Expression oder Aktivität der erfindungsgemäßen nSMase2 in nSMase2-
überexprimierenden Zellinien bei Zugabe von mindestens einer potentiell phar
mazeutisch wirksamen Substanz. Die Zellinien eignen sich somit insbesondere zur
Entwicklung und Prüfung von pharmazeutischen Leitstrukturen.
Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele weiter erläutert werden.
Die erfindungsgemäßen für die neutrale Hirn-Sphingomyelinase kodierenden Nu
kleinsäuren wurden in die NotI Schnittstellen der Klonierungsstelle des eukaryonti
schen Expressionsvektors pRc/CMV (Stratagene) kloniert. Die erhaltenen Sequenzen
wurden durch Sequenzierung mit einem Perkin-Elmer DNA-Sequenzer 377A erhal
ten.
Die Gesamt-RNA wurde nach bekannten Methoden aus verschiedenen Organen von
acht drei Wochen alten CD1 Mäusen isoliert und Poly(A+)-RNA wurde durch Affini
tätsreinigung an Oligo(dT)cellulose (Boehringer Mannheim Deutschland) gemäß
Standardmethoden isoliert.
HEK 293 Zellen wuchsen in DMEM Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 1 µg/ml
Penicillin/Streptomycin und 1 mM Pyruvat bei 37°C und 5% CO2. 5 × 106-Zellen wur
den mit 1 µg linearisierter Plasmid-DNA, die für die erfindungsgemäße nSMase ko
dierte durch Elektroporation mit einem "gene pulser" (Firma Bio-Rad) transfiziert.
Die Selektion stabiler Klone erfolgte unter 1 mg/ml Geneticin (G418, Life Technolo
gies, Gaithersburg, MD).
Die aus den Zellinien aufgereinigte nSMase zeigte eine spezifische Aktivität zwischen
0,2 und 1 µmol/mg Protein/Stunde. Das pH-Optimum lag bei 6 und 8. Die Aktivität
war von der Anwesenheit von Magnesiumionen abhängig; die Zugabe von EDTA
inhibierte die Aktivität.
Die enzymatische Aktivität wurde in Zellen und Mäusegewebe untersucht. Die Zellen
wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und bei 1.000 g sedimentiert. Das
Pellet wurde in Lysepuffer resuspendiert und die Zellen wurden durch wiederholtes
Einfrieren und Auftauen zerstört. Nach Zentrifugation für 2 min bei 2.500 g gefolgt
von einer Extraktion mit Lysepuffer mit 0,2% Triton X-100. Anschließend erfolgt
eine Zentrifugation für 15 min bei 100.000 g.
Gewebe von drei Wochen alten Mäusen wurde in kaltem Lysepuffer homogenisiert.
Die zu untersuchende Menge an Protein oder homogenisiertem Gewebe wurde mit
10 nm (80.000 dpm) [N-14CH3]-Sphingomyelin für 30 min bei 37°C in einem Ge
samtvolumen von 200 µl inkubiert. Dann wurden 100 µl Wasser zugesetzt und unrea
giertes Substrat durch Extraktion mit Chloroform-Methanol (2 : 1, v/v) entfernt. Die
Radioaktivität der wäßrigen Phase, die das enzymatisch freigesetzte Phosphocholin
enthielt, wurde in einem Szintillationszähler gemessen.
Claims (24)
1. Nukleinsäure kodierend für eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase
(nSMase2) mit den Sequenzmotiven X1-X2-X3-X4-D-Y-X5 und X6-X7-T-D-H-
X8, wobei X1, X6 = A oder G; X2, X3 = R oder K; X4, X5, X7, X8 = I oder L
oder V oder M ist.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um neu
trale Hirnsphingomyelinase eines Säugetiers, insbesondere um murine oder
humane Hirnsphingomyelinase handelt.
3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
neutrale Sphingomyelinase Sphingomyelin in Ceramid und Phosphocholin
spaltet und ihre Aktivität von der Zugabe von Magnesiumionen abhängig ist.
4. Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Sequenz
gemäß Seq. ID. Nr. 3 oder Seq. ID. Nr. 4.
5. Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich um DNA, RNA, PNA oder nukleaseresistente Analoga
handelt.
6. Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich um mRNA, cDNA oder genomische DNA handelt.
7. Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, daß sie komplementär zur Nukleinsäure
gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.
8. Eukaryontische neutrale Hirnsphingomyelinase erhältlich durch Expression der
Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 bis 7, insbesondere mit der Sequenz gemäß
Seq. ID. Nr. 1 oder Seq. ID. Nr. 2.
9. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie gegen eukaryontische neutrale
Hirnsphingomyelinase gemäß Anspruch 8 oder eine Nukleinsäure gemäß min
destens einem der Ansprüche 1 bis 7 gerichtet sind.
10. Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie eukaryontische neutrale Hirnsphin
gomyelinase gemäß Anspruch 8 überexprimiert.
11. Zellinie gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine
eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase exprimierende Zellinie han
delt, die auf den Zellinien U937, HEK 293 oder Jurkat beruht.
12. Transgenes Säugetier mit Überexpression (gain of function) oder Gendefizienz
oder Gendefekt (loss of function) für eukaryontische neutrale Hirn-Sphin
gomyelinase.
13. Transgenes Säugetier gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
Nagetier ist.
14. Arzneimittel enthaltend eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase ge
mäß Anspruch 8, eine Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1
bis 7 und/oder einen Antikörper gemäß Anspruch 9 zusammen mit weiteren
Hilfsstoffen.
15. Diagnostikmittel enthaltend eukaryontische neutrale Hirn-Sphingomyelinase
gemäß Anspruch 8, eine Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche
1 bis 7 und/oder einen Antikörper gemäß Anspruch 9 zusammen mit weiteren
Hilfsstoffen.
16. Verwendung der Arzneimittel gemäß Anspruch 14 oder der Diagnostikmittel
gemäß Anspruch 15 zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, die auf
einer Über- oder Unterexpression und/oder einer erhöhten oder verminderten
Aktivität der eukaryontischen neutralen Hirn-Sphingomyelinase und/ oder auf
Störungen der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und/oder Apotose beru
hen.
17. Verwendung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den
Erkrankungen um Entzündungsprozesse, Zellwachstumstörungen, Krebs
und/oder Stoffwechselstörungen wie Störungen der Cholesterinhomöostase
(Arteriosklerose) handelt.
18. Verfahren zum Screening von Wirkstoffen dadurch gekennzeichnet, daß die
Veränderung der Expression oder Aktivität der eukaryontischen neutralen
Hirn-Sphingomyelinase in Zellinien gemäß Anspruch 10 bei Zugabe von min
destens einer möglichen pharmazeutisch wirksamen Substanz gemessen wird.
19. Verwendung der Zellinie gemäß Anspruch 10 zur Entwicklung und Prüfung
von pharmazeutischen Leitstrukturen.
20. Verfahren zur Herstellung der eukaryontischen neutralen Hirn-Sphin
gomyelinase gemäß Anspruch 8 durch chemische Peptidsynthese oder durch
Expression in gentechnisch veränderten Organismen, insbesondere in eu
karyontischen Expressionssystemen.
21. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der
Ansprüche 1 bis 7 durch chemische Synthese oder durch Vervielfältigung in
gentechnisch veränderten Organismen.
22. Nukleinsäuren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge
kennzeichnet, daß es sich um das Gen für eukaryontische neutrale Hirn-Sphin
gomyelinase handelt und neben codierenden Bereich (Exons) nicht codierende
Bereiche (Introns) aufweist.
23. Varianten der eukaryontischen neutralen Hirn-Sphingomyelinase gemäß An
spruch 8.
24. Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 22, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um Derivate, Fragmente oder Varianten der Nu
kleinsäuren handelt.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2017134116A1 (en) * | 2016-02-02 | 2017-08-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer |
-
1999
- 1999-08-14 DE DE19938671A patent/DE19938671A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017134116A1 (en) * | 2016-02-02 | 2017-08-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer |
| US11078277B2 (en) | 2016-02-02 | 2021-08-03 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and pharmaceutical compositions for enhancing CD8+ T cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer |
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