DE69333154T2

DE69333154T2 - Für den prostaglandinrezeptor kodierendes gen, damit transformierte zelle und dessen expressionsprodukt

Info

Publication number: DE69333154T2
Application number: DE69333154T
Authority: DE
Inventors: Staffan Lake; Johan Stjernschantz
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2013-10-02
Also published as: US6416972B1; JPH08502061A; EP0672067B1; WO1994007920A1; ATE247668T1; AU5123393A; CA2146150C; CA2146150A1; PT672067E; SE9202892D0; DK0672067T3; EP0672067A1; DE69333154D1; JP3634361B2; US5750369A; ES2204904T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das molekulare Klonen und die Expression eines Rezeptor-Proteins und insbesondere einen Prostaglandin-F2α-Rezeptor und Fragmente davon, die mit der Aktivierung von sekundären Botenstoffen verbunden sind, wie z. B. durch cAMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium gemessen. Die Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die einen Prostaglandin-F2α-Rezeptor codiert, ein Rekombinations-DNA-Molekül, das eine solche DNA-Sequenz umfaßt, und damit transformierte Zellen. Die Erfindung betrifft auch Antikörper gegen den F2α-Rezeptor und ein Verfahren zum Nachweis eines F2α-Rezeptors mit dem Antikörper. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines F2α-Rezeptors, der ein DNA-Fragment in der Probe codiert, die Verwendung von transformierten Zellen zum Absuchen (Screenen) von Arzneimitteln, sowie Arzneimittel, die unter Anwendung eines solchen Screeningverfahrens hergestellt worden sind.
Hintergrund-Informationen
Prostaglandin-F2α-Rezeptoren gehören zu einer großen Gruppe von Hormonrezeptoren, die über Guanidin-Nucleotid-bindende Regulations-(G)-Proteine mit ihren Signal-Transduktionspfaden verbunden sind. Derartige Rezeptoren gehören zu den am intensivsten untersuchten Rezeptor-Systemen. Prostaglandin-Rezeptoren sind klassisch so definiert, daß sie mit der Stimulation von sekundären Botenstoffen verbunden sind und gemessen werden durch cyclisches AMP (cAMP), Inositol-3-phosphat (IP₃) oder intrazelluläres Calcium und mit einem G-Regulations-Protein gekuppelt sind (Muallem, Biochem. J. 263: 769–774 (1989)). Im Gegensatz dazu kann die Aktivierung von Prostaglandin-Rezeptoren zur Hemmung verschiedener Antworten führen, einschließlich der Hemmung der Adenylyl-cyclase-Aktivität, Hemmung des Phosphatidylinositol-Umsatzes und Hemmung der Ca²⁺-Mobilisierung (Muallem, Biochem. J. 263: 769–774 (1989) und Duncan, Endocrinology 128: 1519–1526 (1991)). Es wurden auch Hinweise gesammelt, die Heterogenität in der Kategorie von Rezeptoren nahelegen (Balapure, Biol. Reprod. 41: 385–392 (1989)).
Zwei Prostaglandin-Rezeptoren sind schon geklont worden, nämlich der Human- und Mäuse-Thromboxan-A2-Rezeptor und der Mäuse-Prostaglandin-E₃-Rezeptor (Hirata, Nature 349: 617–620 (1991); Namba, BBRC 184: 1197–1203 (1992) bzw. Sugimoto, J. Biol. Chem. 267: 6463–6466 (1992)).
Prostaglandin-F2α-Rezeptoren sind vom klinisch therapeutischen Standpunkt aus extrem wichtig. Arzneimittel, die diese Rezeptoren aktivieren (Agonisten) können angewandt werden, um Glaukom zu behandeln (Alm, Arch. Ophthalmol. 109: 1564– 1568 (1991)), während Arzneimittel, die Prostaglandin-F2α-Rezeptoren blockieren (Antagonisten) therapeutisch angewandt werden können, um pathologische Zustände, z. B. in der Lunge und im Uterus, zu behandeln. Es kann von pharmazeutischem Wert sein, wenn es möglich ist, endogenes Prostaglandin-F2α mit einem löslich gemachten Rezeptor zu titrieren, sowie einen immobilisierten Rezeptor bei der Reinigung eines Liganden und seiner Analogen zu verwenden. Trotz ihrer klinischen Nützlichkeit liegt ein Problem der Prostaglandin-F2α-Agonisten- und wahrscheinlich -Antagonisten-Arzneimittel, die derzeit zur Verfügung stehen, darin, daß sie viele Nebenwirkungen haben, wie viele andere Arzneimittel, die durch Wechselwirkungen mit Rezeptoren wirken. Diese Nebenwirkungen beruhen hauptsächlich auf einem Mangel an Rezeptoren-Spezifität. D. h. das verwendete Arzneimittel tritt nicht nur mit den Prostaglandin-F2α-Rezeptoren in Wechselvrirkung, sondern auch mit anderen Rezeptoren, s. z. B. Muallem Biochem. J. 263: 769–774 (1989)-
Ein Hauptziel der klinischen Pharmakologie und der pharmazeutischen Industrie ist die Entwicklung von selektiveren Arzneimitteln mit größerer Effizienz als diejenigen, die derzeit angewandt werden. Ein Hindernis für diesen Prozeß ist die geringe Menge an Prostaglandin-F2α-Rezeptor-Protein, die für Untersuchungen. im Augengewebe zur Verfügung steht, sowie der Mangel an geeigneten homogenen Modellsystemen für die Rezeptoren mit denen Arzneimittel dagegen abgesucht werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung möchte eine Lösung für dieses Problem liefern durch eine neue Annäherung, umfassend das Klonen von cDNAs, die Prostaglandin-F2α-Rezeptoren codieren, Aufbauen von eukaryontischen Expressionsvektoren, die diese cDNAs enthalten, und Erzeugen einer Reihe von stabil transfizierten Säugetier-Zellinien oder prokaryontischen Zellen, die funktionelle Prostaglandin-F2α-Rezeptoren in großer Menge exprimieren. Diese Zellinien, die eine homogene Population von Prostaglandin-F2α-Rezeptoren exprimieren würden, können in der pharmazeutischen Industrie oder anderen angewandt werden, um Arzneimittel abzusuchen und die Prostaglandin-F2α-Rezeptoren unter Anwendung einer Vielfalt von biochemischen, physiologischen und pharmakologischen Techniken zu untersuchen.
Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine cDNA, die einen Ratten-Prostaglandin-F2α-Rezeptoren-Subtyp codiert, der mit der Aktivierung von sekundären Botenstoffen verbunden ist, gemessen z. B. durch AMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium, isoliert. Diese cDNA, die einen F2α-Rezeptor codiert, wird in unterschiedliche eukaryontische und prokaryontische Expressionsvektoren eingefügt und beim Aufbau von verschiedenen Säugetier-Zellinien verwendet, die dieses funktionelle Protein exprimieren. Die erhaltenen F2α-Rezeptoren exprimierenden Zellinien können angewandt werden, um die Affinitäten und Wirksamkeiten von Agonisten- und Antagonisten-Arzneimitteln mit einem F2α-Rezeptor unter Anwendung verschiedener Techniken, wie Radioliganden-Bindung und Untersuchung von sekundären Botenstoffen, zu untersuchen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher einen F2α-Rezeptor, der mit der Stimulierung von sekundären Botenstoffen, wie cAMP, IP₃ oder intrazellulärem Calcium, verbunden ist und der, soweit vorhanden, mit Guanidin-Nucleotid-bindenden Regulations (G) Proteinen kuppelt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Fragment„ das den oben beschriebenen Prostaglandin-F2α-Rezeptor codiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Rekombinations-DNA-Konstrukt oder Molekül, umfassend einen Vektor und das oben beschriebene DNA-Fragment.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Rekombinations-DNA-Konstrukt transformiert ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Prostaglandin-F2α-Rezeptors. Das Verfahren umfaßt das Kultivieren der oben erwähnten Wirtszelle unter solchen Bedingungen, daß das den F2α-Rezeptor codierende DNA-Fragment exprimiert und ein Prostaglandin-F2α-Rezeptor gebildet wird.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Antikörper gegen den F2α-Rezeptor.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines F2α-Rezeptors in einer Probe durch Zusammenbringen der Probe mit einem solchen Antikörper.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines DNA-Fragments, das einen F2α-Rezeptor codiert, in einer Probe durch Zusammenbringen der Probe mit einer DNA-Sonde, umfassend ein DNA-Fragment, das ein F2α-Rezeptor-Protein oder Polypeptid codiert, um das DNA-Fragment damit zu hybridisieren.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Absuchen von Arzneimitteln auf eine F2α-Rezeptoren aktivierende oder blockierende Aktivität durch Zusammenbringen der oben erwähnten transformierten Wirtszelle mit dem Arzneimittel.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, wobei das Verfahren das Absuchen von möglichen Arzneimitteln auf ihre F2α-Rezeptoren aktivierende oder blockierende Aktivität umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Arzneimittel dessen Herstellung das Absuchen von möglichen Arzneimitteln auf ihre F2α-Rezeptoren aktivierende oder blockierende Aktivität umfaßte.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B zeigen die Sequenz eines Ratten-Prostaglandin-F2α-Rezeptors und einen Vergleich mit den Sequenzen von anderen an G-Protein gekuppelten Rezeptoren.
1A zeigt die Nucleotid-Sequenz eines F2α-Rezeptors zusammen mit der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz des längsten offenen Leserasters. Die Nucleotid-Sequenz ist von dem vermutlichen Initiator Methionin aus numeriert und an der linken Seite jeder Zeile angegeben, während die Nummern der Aminosäuren auf der rechten Seite jeder Leile angegeben sind. Die postulierten N-gebundenen Glycosylierungsstellen sind durch ein Sternchen gekennzeichnet. Die potentiellen Stellen für eine Phosphorylierung durch die cAMP-abhängige Kinase sind unterstrichen.
1B zeigt einen Vergleich einer Aminosäure-Sequenz. eines Prostaglandin-F2α-Rezeptor mit derjenigen von anderen bekannten Prostaglandin-Rezeptoren. Aminosäure-Sequenzen des Human-Thromboxan-A₂-Rezeptors (2) und des Mäuse-Prostaglandin-E₃-Rezeptors wurden in Übereinstimmung gebracht (aligned), um die Homologie mit einer Ratten-Prostaglandin-F2α-Rezeptor-Sequenz (3) zu optimieren. Aminosäure-Identitäten zwischen dem F2α und den beiden anderen Prostaglandin-Rezeptoren sind in Fettdruck angegeben. Die vermuteten transmembranen (TM) Bereiche sind durch die punktierten Linien angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Prostaglandin-F2α-Rezeptor, der mit der Aktivierung von sekundären Botenstoffen verbunden ist, wie z. B. durch cAMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium gemessen und der, soweit vorhanden, mit dem Guanidin-Nucleotid-bindenden Regulations (G) Protein gekuppelt ist. Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen (Fragmente), die das gesamte oder Teile eines F2α-Rezeptor-Proteins codieren. Die Erfindung betrifft auch ein Rekombinations-Konstrukt, das solche DNA-Sequenzen umfaßt, damit transformierte Zellen und Verfahren zum Exprimieren des Rezeptur-Gens. Die Erfindung betrifft auch einen Antikörper gegen den F2α-Rezeptor und die Verwendung des Antikörpers zum Nachweis des Vorhandenseins eines F2α-Rezeptors in der Probe. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines DNA-Fragments, das einen F2α-Rezeptor codiert, in der Probe. Die Erfindung betrifft auch ein Screeningverfahren für Arzneimittel mit Hilfe der transformierten Zellen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln, wobei das Verfahren ein solches Screeningverfahren umfaßt, sowie Arzneimittel, die nach diesem Verfahren hergestellt worden sind.
Das F2α-Rezeptor-Protein oder -Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung ist eines aus einer großen Gruppe von Rezeptoren, die über Guanidin-Nucleotid-bindende Regulations-Proteine mit ihrer Signal-Transduktion verbunden sind. Speziell ist ein F2α-Rezeptor nach der Erfindung mit der Aktivierung von sekundären Botenstoffen, wie z. B. durch cAMP, IP₃ oder intrazellulärem Calcium gemessen, verkrbunden und kuppelt, soweit vorhanden, mit dem G Regulations-Protein (z. B. besitzen prokaryontische Systeme keine G Regulations-Proteine).
Der Ausdruck „F2α-Rezeptor", wie er hier im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in einem weiten Sinn zu verstehen. So kann ein F2α-Rezeptor die vollständige in 1A angegebene Sequenz haben oder er kann die Aminosäure-Sequenz eines Moleküls mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften eines sekundäres Botenstoffes, gemessen z. B. durch cAMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium, pharmakologischen Eigenschaften und Kupplungseigenschaften an G-Regulations-Protein aufweist, wie das Molekül, das der 1A entspricht, haben (z. B. die allelen Variationen des F2α-Rezeptor-Proteins). Alternativ kann ein F2α-Rezeptor-Protein (oder -Polypeptid) nach der Erfindung eine Aminosäure-Sequenz haben, die irgendeinem aktiven Teil oder Teilen eines in 1A gezeigten Proteins (oder allelen Variationen davon) entspricht. Als ein Beispiel kann ein F2α-Rezeptor-Protein (oder – Polypeptid) eine Aminosäure-Sequenz haben, die einem Epitcp der Sequenz der Fig. olypeptid) eine Aminosäure-Sequenz haben, die einem Epitop der Sequenz der 1A (oder einer allelen Variation davon) entspricht.
Das F2α-Rezeptor-Protein oder -Polypeptid kann in einer im wesentlichen reinen Form vorliegen d. h. in einer Form, die im wesentlichen frei ist von Proteinen und Nucleinsäuren, mit denen es normalerweise assoziiert ist. Ein F2α-Rezeptor-Protein kann gereinigt werden unter Anwendung von bekannten Verfahrensweisen. Ein F2α-Rezeptor-Protein kann auch nach bekannten Verfahrensweisen als Antigen angewandt werden, um Antikörper dazu zu bilden, und zwar sowohl monoklonale als auch polyklonale.
Wie oben angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung auch DNA-Sequenzen (einschließlich cDNA-Seqüenzen), die die gesamte in 1A angegebene Aminosäure-Sequenz codieren (die in 1A angegebene spezielle cDNA-Sequenz ist nur ein Beispiel), oder irgendeinen Teil davon. Die DNA-Sequenzen, auf die sich die Erfindung bezieht, umfassen auch solche, die Proteine (oder Polypeptide) codieren mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften eines sekundären Botenstoffes, gemessen z. B. durch cAMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium, pharmakologischen Eigenschaften und Kupplungseigenschaften an G-Regulations-Protein eines F2α-Rezeptors (z. B. allele Formen der Sequenz der 1A).
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Rekombinations-DNA-Konstrukt, das einen Vektor und eine DNA-Sequenz, wie oben angegeben (vorteilhafter Weise eine DNA-Sequenz, die den in 1A gezeigten Rezeptor oder einen Rezeptor mit den glei chen sekundären Boten-Eigenschaften, wie z. B. durch cAMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium gemessen, pharmakologischen Eigenschaften und G Protein-Kupplungs-Eigenschaften des Proteins codiert) enthält..
Der Vektor kann die Form eines Virus oder eines Plasmid-Vektors (z. B. Lambda ZAP II) annehmen. Die DNA-Sequenz kann in dem Vektor operabel mit Regulationselementen, umfassend z. B. einen Promotor, verbunden vorliegen. Das Rekombinations-Konstrukt kann geeignet sein zum Transformieren von prokaryantischen oder eukaryontischen Zellen oder, vorteilhafter Weise, Säugetier-Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit dem oben angegebenen Rekombinations-Konstrukt transformiert ist. Der Wirt kann prokaryontisch (z. B. Bakterien), nieder eukaryontisch (z. B. Pilze, einschließlich Hefe) oder höher eukaryontisch (z. B. alle Säugetiere, einschließlich aber nicht begrenzt auf Ratten und Menschen) sein. Z. B. werden stabile Transformationen erreicht in Eierstockzellen von chinesischen Hamstern (CHO-Zellen). Die Transformation kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die transformierten Wirtszellen können als Quelle für die oben beschriebene DNA-Sequenz (die Sequenz stellt einen Teil des Rekombinations-Konstrukts dar) verwendet werden. Wenn der Rekombinations-Rezeptor die Form eines Expressions-Systems annimmt, können die transformierten Zellen als Quelle für den oben beschriebenen Rezeptor verwendet werden.
Das Vorhandensein eines F2α-Rezeptor-Proteins kann in einer Probe (z. B. Gewebe von einem Menschen oder einem anderen Säugetier oder einer Zellkultur) nachgewiesen werden durch Zusammenbringen der Probe mit einem Antikörper gegen den Rezeptor. Der Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Komplexes zwischen dem Rezeptor dem Antikörper kann nach bekannten Verfahren erreicht werden. Das Vcrhandensein-eines DNA-Segments, das ein F2α-Rezeptor-Protein codiert, kann in einer Probe (z. B. Gewebe von einem Menschen oder einem anderen Säugetier oder einer Zellkultur) nachgewiesen werden durch Zusammenbringen der Probe mit einer DNA-Sonde, die aus dem DNA-Segment oder Fragmenten davon besteht. Unter Anwendung von bekannten Methoden und unter Bedingungen, daß eine Hybridisierung eintritt, kann ein Komplex zwischen der Sonde und dem DNA-Segment aus der Probe gebildet werden. Der Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Komplexes kann nach bekannten Vertahren erreicht werden.
Ein Prostaglandin-F2α-Rezeptor-Protein und Nucleinsäure-Sequenzen nach der vorliegenden Erfindung können sowohl in Forschungs-Anordnungen (z. B. um das Verständnis von Rezeptor-Protein-Mechanismen zu erleichtern) als auch in klinischen An ordnungen (z. B. als Modellsystem für den Rezeptor, mit dem Agonisten- und Antagonisten-Arzneimittel dagegen abgesucht werden können) angewandt werden. Z. B. haben therapeutische Arzneimittel; die dazu vorgesehen sind, mit Prostaglandin-F2α-Rezeptoren in Wechselwirkung zu treten, häufig Nebenwirkungen, aufgrund eines Mangels an Rezeptor-Spezifität. Eine Zellinie, die einen F2α-Rezeptor exprimiert, kann angewandt werden zur Untersuchung von Affinitäten und Wirksamkeiten von Agonisten- und Antagonisten-Arzneimitteln mit einem F2α-Rezeptor unter Anwendung verschiedener Techniken, wie Radioliganden-Bindung und Untersuchung von sekundären Botenstoffen. Die Aktivität der mit Arzneimittel behandelten Zelle kann mit derjenigen einer Kontrollzelle verglichen werden, um die Aktivierung oder Blockierung eines F2α-Rezeptors zu bewerten.
Für diagnostische Zwecke kann die Expression einer F2α-Rezeptor-cDNA in Zellen unter Anwendung bekannter Methoden gemessen werden. Um dies zu tun, können Antikörper gegen einen F2α-Rezeptor (hergestellt durch Erzeugung eines vollständigen F2α-Rezeptor-Proteins oder Teilen davon und Injizieren in verschiedene Tierarten, z. B. Kaninchen, Schafe, Ziegen oder Mäuse) angewandt werden.
Die Erfindung wird unten und in den nicht-einschränkenden Beispielen mehr im Detail beschrieben in Bezug auf die Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen für einen F2α-Rezeptor.
Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen für einen Prostaglandin-F2α-Rezeptor
(i) Klonen und Sequenzanalysen von Prostaglandin-F2α-Rezeptor cDNA
Um einen Prostaglandin-F2α-Rezeptor, im folgenden der Kürze halber oft als FP-Rezeptor bezeichnet, der mit einer Aktivierung eines sekundären Botenstoffes, gemessen durch cAMP, IP₃ oder intrazelluläres Calcium verbunden ist zu klonenwurde die PCR-Methode angewandt, um selektiv cDNA-Sequenzen von mRNA, gereinigt von Ratten-Gelkörpern zu amplifizieren. Es konnte früher gezeigt werden, daß Schaf- und Rinder-Gelbkörper diesen Rezeptor-Untertyp exprimieren (Balapure, Biol. Reprod. 41: 385–392 (1989) und Orlicky, Prostaglandins Leucotrines and Essential Fatty Acids, 41: 51–61 (1990)). Eine kommerzielle cDNA-Bibliothek wurde angewandt, um cDNA von Ratten-Gelbkörper zu erhalten. Eine PCR-Amplifikation wurde mit einem Paar hoch degenerierter Primer durchgeführt, die von den zweiten und siebenten und dritten und sechsten transmembranen Bereichen von vorher geklonten sieben Mitgliedern der transmembranen Überfamilie stammten. Dieses Verfahren führte zur Amplifikation von verschiedenen cDNA-Fragmenten.
Diese Fragmente wurden vorher durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Es zeigte sich, daß eines dieser Fragmente beträchtliche Sequenz-Homologie mit verwandten vorher geklonten an G-Protein gekuppelten Rezeptoren aufwies und es wurde anschließend angewandt, um die cDNA-Bibliothek von Ratten-Telbkörper abzusuchen„ um einen Klon voller Länge zu isolieren. Es wurden 24 cDNA-Klone mit Insert-Größen im Bereich von etwa 1,7 bis 3,3 kb isoliert, die bei der Southern-Analyse alle stark mit der mit ³²P markierten Sonde hybridisiert waren. Bei einem dieser Klone mit einem Insert von etwa 3 kb wurde die Sequenz untersucht und er zeigte eine Homologie der Aminosäure-Sequenz mit verwandten Rezeptoren in den codierenden Bereichen der Sequenz von mehr als 55%. Die Homologie ist bei allen Kombinationen etwa die glei che, trotz der unterschiedlichen Rezeptoren und auch die in einem Falle unterschiedlichen Arten, Menschen und Ratten. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen für Klon FP sind in 1A angegeben. Das längste offene Leseraster in dieser cDNA codiert ein Protein mit 366 Resten mit einem theoretischen Molekularge- wicht von 40.65 kDa.
Obwohl in diesem Leseraster Nachbarsequenzen mit ATG vorliegen, die denjenigen von Kozaks Consensus-Anfangs-Sequenz sehr ähnlich sind, (Kozak, Nucleic Acids res. 12: 857–872 (1984)), stellt der Met Codon in 1 Stellung tatsächlich die wahrscheinlichste Stelle dar. (1A).
Die Hydrophobie-Analyse des translatierten Proteins zeigt sieben Gruppen von etwa 20 bis 25 hydrophoben Resten, von denen vorhergesagt wird, daß die Transmembranen überspannende Domänen darstellen, die über drei extrazelluläre und drei intrazelluläre Schleifen miteinander verbunden sind. Dieses Muster ist demjenigen ähnlich, das bei anderen geklonten an G Protein gekuppelten Rezeptoren beobachtet wird, bei denen angenommen wird, daß der NH₂-Terminus extrazellulär ist und der COOH-Terminus in das Zytoplasma hineinragt (Dohlman, Biochemistry, 26: 2657–2664 (1987)). Der NH₂-Terminus enthält zwei Consens-Stellen für eine N-gebundene Glycosylierung, während die vorhergesagte dritte Cytoplasma-Schleife eine aufweist. Consens-Erkennungsstellen für eine Phosphorylierung durch die cDNA-abhängige Protein-Kinase finden sich in den Cytoplasma-Schleifen des Carboxyl-Schwanzes. Außerdem enthält der lange COOH-Terminus verschiedene Serin-Reste, die möglicherweise zusätzliche Stellen für eine regulierende Phosphorylierung darstellen. Diese Phosphorylierungen sollen für die Regulierung der transmembranen Signalerzeugung und Desensibilisierung des Rezeptors verantwortlich sein (Sibley, Cell. 48: 913–922 (1987)).
(ii) Charakterisierung der Aminosäure-Sequenzen eines Prostaglandin-F2α-Rezeptor-Klons.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz für die cDNA-Klone mit den Sequenzen von verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren ist in 1B angegeben. Wie zu erkennen ist, scheinen die Bereiche mit der höchsten Identität innerhalb der vorhergesagten transmembranen überspannenden Domänen aufzutreten. Innerhalb dieser Bereiche zeigt das FP-Rezeptor-Protein die stärksten Sequenz-Homologien mit dem Ratten-Prostaglandin-E3- und Thramboxan-A2-Rezeptor von Mäusen und Menschen. Die NH₂- und COOH-Termini und die extrazellulären und Intrazellulären Schleifen sind bei diesen Rezeptoren deutlich stärker divergent. Es ist interessant festzustellen, daß innerhalb der dritten vermuteten transmembranen Domäne von FP kein konservierter Asparagin-Rest vorhanden ist, der allen Biogenen Amin-Rezeptoren gemeinsam ist, deren Sequenz bisher untersucht worden ist (Strader, FASEB J., 3: 1825–1832 (1989)). Darüber hinaus enthält auch die fünfte transmembrane überspannende Domäne zwei Serin-Reste, die in Catecholamin-Rezeptoren konserviert sind und die für die Erkennung von Agonisten-Liganden, die eine Catechoi-Gruppe enthalten, kritisch sind (Strader, FASER J., 3: 1825–1832 (1989)).
Ferner wurden mit Primern, die von der den F2α-Rezeptor codierenden Sequenz stammen, und unter Verwendung von PCR in cDNA-Bibliotheken aus menschlichem Gewebe, von denen erwartet wird, daß sie den F2α-Rezeptor exprimieren, Fragmente der korrekten Größe gefunden, die untereinander identische Restriktionsfragmente zweigen. Diese Gewebe waren z. B. aus dem Auge, den Eierstöcken, dem Uterus und der Niere.
BEISPIEL
Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen für einen neuen an G-Protein gekuppelten Rezeptor
Um einen FP-Rezeptor zu klonen, wurde das Polymerase-Kettenreaktions (PCR) Verfahren angewandt, um cDNA-Sequenzen von der Ratten-Gelbkörper cDNA-Bibliothek in dem Lambda ZAP^C11-Vektor zu amplifizieren (Stratagene, Katalog Nr. 936504). 1 × 10⁶ pfu der Bibliothek wurden amplfiziert und Lambda-DNA wurde wie in Current protocolls in Molecular Biology (1990) 1.13.1–1.13.3 beschrieben hergestellt. 50 ng der Lambda DNA wurden 45 Zyklen PCR-Amplifizierung einem gesamten Reaktionsvolumen von 25 μl mit 1 μm jedes der folgenden zwei Primer:
und 200 μM dNTPs und 2 u Taq DNA-Polymerase unterworfen (Perkin Elmer-Cetus, USA). Das angewandte Zeitschema betrug 45 s (in dem ersten Zyklus 3 min) bei 95°C; 3 min bei 50°C und 3 min bei 72°C. Die Stufe bei 72°C wurde um 6 s je Zyklus verlängert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese in 1% LMP-Agarose (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA, Katalog Nr. 162–0020) gereinigt. Einzelne Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und 20 Zyklen einer PCR-Amplifizierung in einem gesamten Reaktionsvolumen von 20 μl mit jeweils 100 μm jedes der beiden gleichen Primer wie oben, d. h.:

und 200 μM dNTPs und 2,5 u Taq DNA-Polymerase unterworfen. Das angewandte Zeitschema war identisch mit dem oben angegebenen.
Die Reaktionsprodukte wurden in den Vektor PCR1000 eingebaut nach den Anweisungen des TA Clonig-Kits (Invitrogen Corporation, USA, Katalog Nr. K2000-1 ). Das erhaltene Plasmid wurde als pKGE858 bezeichnet. Die Miniherstellung von Plasmid DNA wurde mit einem Qiagene-tip 100 Kit (Diagene GmbH, Deutschland) durchgeführt. Die Sequenzbestimmung des Inserts wurde nach bekannten Verfahren durchgeführt. So wurde die Sequenz der cDNA Inserts mit Primern durchgeführt, die zu den Berei- chen auf der M13 Mehrfach-Klon-Stelle homolog waren. Um die gesamten cDNA-Sequenzen zu zeigen, wurde eine Gen-Durchlauf-Strategie angewandt. Alle Sequenzanalysen wurden mit einem DNA Sequenzbestimmungssystem, Modell 373A von Applied Biosystem (Applied Biosystems Inc. USA) nach der Anleitung von Biosystems für ihr Taq Dye Dioxy Terminator cycle sequenzing Kit durchgeführt. Die erhaltenen primären Daten wurden auf einem VAX-Computer verarbeitet unter Anwendung des Sequenz-Analyse-Programms von Genetics Computer Group Inc., Madison, USA (Devereux, Nucleic Acids Research 12(1): 387–395 (1984)). Es zeigte sich, daß eines der Inserts eine Sequenz-Hamologie mit verwandten Rezeptoren aufwies (dem menschlichen Thromboxan-A2-Rezeptor und später auch anderen geklonten Prostaglandin-Rezeptoren; Hirata Nature 349: 617–620 (1991), Sugimoto, J. Biol. Chem. 267: 6463–6466 (1992) und Namba BBRC 184: 1197–120 (1992). Dieses Insert wurde anschließend angewandt als Sonde um die cDNA-Bibliothek von Ratten-Gelbkörper abzusuchen, um einen Klon voller Länge zu isolieren. 1 × 10⁶ Rekombinanten der cDNA-Bibliothek von Ratten-Gelbkörper , aufgebaut in dem Lambda ZAP II Vektor, wurden mit der oben angegebenen Sonde abgesucht. Die oben erhaltene Sonde, bestehend aus dem Notl/Hindlll 600 by Fragment des Plasmids pKGE858 wurde mit Amershams Megaprime DNA Markierungssystem (Amersham, England RPN1607) markiert. Doppelte Nitrocellulose-Filter (Hybond-N, (Amersham, England)) wurden in 10% (Gew./Vol) Dextransulfat, 1% Natrium-dodecylsulfat, 1 M Natriumchlorid und 100 μg/ml beschallter Lachssperma-DNA (Boehringer Mannheim, Deutschland) mit der oben beschriebenen Sonde 16 h bei 65°C hybridisiert. Die Filter wurden sehr gründlich mit 2 × SSC und 1% Natrium-dodecylsulfat 30 min bei 65°C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen-Klone wurden weiter gereinigt durch erneutes Absuchen unter Anwendung der gleichen Sonde wie bei dem ersten Absuchen. 25 positiv hybridisierende gereinigte Phagen-Klone wurden in E. coli XL1-Blau (Stratagene, USA) expandiert und die erhaltenen Phagen-Vorräte wurden angewandt, um cDNA enthaltende pBluescript Plasmide durch Phagemid-Exzision unter Anwendung von Helfer-Phagen R408 nach der Stratagene Anleitung herzustellen. Plasmid DNA wurde mit Qiagene-tip 100 (Diagene GmbH, Deutschland) hergestellt und weiter durch Restriktionsanalyse untersucht. Die vier Plasmide mit den längsten Inserts wurden nach bekannten DNA-Sequenzbestimmungs-Methoden analysiert. Die DNA-Sequenz eines dieser Inserts ist in 1A angegeben.
Um den F2α-Rezeptor in Geweben, von denen angenommen wird, daß sie ihn exprimiert, nachzuweisen, wurden von der Sequenz, die den F2α-Rezeptor in transmembranen (TM) Bereichen VI und VI codiert, stammende Primer angewandt. Die Primer-Sequenz in TM VI war:
und die Primer-Sequenz in TM VII war:
Das amplifizierte Produkt hatte eine Größe von 173 bp. Die PCR-Reaktionen wurden wie oben durchgeführt. Durch Ausschneiden des Fragments mit dem Restriktionsenzym Haelll, das in dem. menschlichen Fragment einmalig ist, wurden zwei Banden mit Größen von 100 bzw. 73 by erhalten. Fragmente aus der cDNA-Bibliothek zeigten alle diese Charakteristika.
Der gesamte Inhalt aller oben genannter Literaturstellen ist als Verweis angegeben.
Während die Erfindung mehr im Detail zur Klarheit und zum Verständnis beschrieben worden ist, wird für den Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung deutlich, daß verschipdene Veränderungen in der Form und im Detail vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims

Reine Form eines Prostaglandin-F2α-Rezeptors, wobei der Rezeptor eine Aminosäuresequenz, entsprechend der in 1A gezeigten, aufweist.
Antikörper gegen den Rezeptor nach Anspruch 1.
DNA-Fragment, das einen Prostaglandin-F2α-Rezeptor codiert, wobei das DNA-Fragment die in 1A angegebene Aminosäuresequenz codiert.
Rekombinations-DNA, umfassend (i) einen Vektor und (ii) ein DNA-Fragment nach Anspruch 3.
Rekombinations-DNA nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein eukaryontischer Expressionsvektor ist.
Rekombinations-DNA nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein prokaryontischer Expressionsvektor ist.
Rekombinations-DNA nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei das DNA-Fragment eine in 1A angegebene Aminosäuresequenz codiert.
Wirtszelle, die durch eine Rekombinations-DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle eine eukaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle eine prokaryontische Zelle ist.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Prostaglandin-F2α-Rezeptors in einer Probe, umfassend die Stufen des Zusammenbringens der Probe mit mindestens einem Antikörper nach Anspruch 2 und Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Komplexes aus dem Rezeptor und dem Antikörper.
Verfahren zum Aufsuchen von Arzneimitteln, die mit einem Prostaglandin F2α Rezeptor in Wechselwirkung treten, umfassend das Zusammenbringen eines aktiven Prostaglandin F2α Rezeptors, der durch eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10 gebildet worden ist, mit einem Arzneimittel unter Bedingungen, die die Rezeptor-Funktionen aktivieren oder blockieren, und Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Prostaglandin F2α Rezeptor-Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 12, umfassend das Zusammenbringen des Arzneimittels mit der Wirtszelle.