DE69432794T2

DE69432794T2 - Menschliche kalziumkanale und verwendungen davon

Info

Publication number: DE69432794T2
Application number: DE69432794T
Authority: DE
Inventors: M. Michael HARPOLD; B. Steven ELLIS; E. Mark WILLIAMS; F. Ann McCUE; Alison Gillespie
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1993-08-11
Filing date: 1994-08-11
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-08-12
Also published as: JPH09509041A; GB2284814B; AU707793B2; WO1995004822A1; ATE242324T1; GB2284814A; DE69432794D1; US5874236A; EP0716695A1; JP2004180691A; JP3628693B2; CA2166982A1; GB9503692D0; AU7632294A; ES2199964T3; EP0716695B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie und Pharmakologie. Spezieller betrifft die Erfindung Calciumkanal-Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben.
Hintergrund der Erfindung
Calciumkanäle sind membran-überspannende Proteine mit mehreren Untereinheiten, die den kontrollierten Eintritt von Ca²⁺-Ionen aus der extrazellulären Flüssigkeit in Zellen erlauben. Zellen im gesamten Tierreich und mindestens einige Bakterien-, Pilz- und Pflanzenzellen besitzen einen oder mehrere Typ(en) von Calciumkanal.
Der häufigste Typ von Calciumkanal ist spannungsabhängig. Die "Öffnung" eines spannungsabhängigen Kanals, um einen Einstrom von Ca²⁺-Ionen in die Zellen zu erlauben, erfordert eine Depolarisation bis zu einem bestimmen Niveau der Potentialdifferenz zwischen der Innenseite der Zelle, welche den Kanal trägt, und dem extrazellulären Medium, in dem die Zelle badet. Die Einstromrate von Ca²⁺ in die Zelle hängt von dieser Potentialdifferenz ab. Alle "anregbaren" Zellen in Lebewesen, wie z. B. Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS), periphere Nervenzellen und Muskelzellen, einschließlich diejenigen der Skelettmuskeln, Herzmuskeln und glatten Muskeln der Venen und Arterien, besitzen spannungsabhängige Calciumkanäle.
Es wurden mehrere Typen von Calciumkanälen in Säugerzellen aus verschiedenen Geweben, einschließlich Skelettmuskel, Herzmuskel, Lunge, glatter Muskel und Gehirn, identifiziert [siehe z. B. Bean, B. P. (1989), Ann. Rev. Physiol. 51: 367–384, und Ness, P. (1990), Ann. Rev. Neurosci. 56: 337]. Die verschiedenen Arten von Calciumkanälen wurden grob in vier Klassen eingeteilt, L-, T-, N- und P-Typ, die sich durch die Stromkinetik, Haltepotential-Sensitivität und Sensitivität gegenüber Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten unterscheiden.
Calciumkanäle sind Proteine mit mehreren Untereinheiten, welche zwei große Untereinheiten mit der Bezeichnung α₁ und α₂, die Molekulargewichte zwischen etwa 130 und etwa 200 Kilodalton ("kD") besitzen, und ein bis drei verschiedene kleinere Untereinheiten von weniger als etwa 60 kD Molekulargewicht enthalten. Mindestens eine der größeren Untereinheiten und möglicherweise einige der kleineren Untereinheiten sind glycosyliert. Einige der Untereinheiten sind in der Lage, phosphoryliert zu werden. Die α₁-Untereinheit hat ein Molekulargewicht von etwa 150 bis etwa 170 kD bei Analyse mittels Natriumdodecylsulfat- (SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) nach Isolierung aus Säugermuskelgewebe und besitzt spezifische Bindungsstellen für verschiedene 1,4-Dihydropyridine (DHPs) und Phenylalkylamine. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen (in Gegenwart von N-Ethylmaleimid) wandert die α₂-Untereinheit bei SDS-PAGE als eine Bande, die einem Molekulargewicht von etwa 160–190 kD entspricht. Nach Reduktion werden ein großes Fragment und kleinere Fragmente freigesetzt. Die β-Untereinheit des Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanals ist ein phosphoryliertes Protein, das ein Molekulargewicht von 52–65 kD, wie mittels SDS-PAGE-Analyse bestimmt, aufweist. Diese Untereinheit ist unempfindlich gegenüber reduzierenden Bedingungen. Die γ-Untereinheit des Calciumkanals, welche nicht in allen gereinigten Präparationen beobachtet wird, scheint ein Glycoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 30–33 kD, wie mittels SDS-PAGE-Analyse bestimmt, zu sein.
Zur Untersuchung der Struktur und Funktion eines Calciumkanals sind große Mengen an reinem Kanalprotein erforderlich. Aufgrund der komplexen Natur dieser Proteine mit mehreren Untereinheiten, den unterschiedlichen Konzentrationen an Calciumkanälen in Gewebequellen des Proteins, der Anwesenheit gemischter Populationen von Calciumkanälen in Geweben, der Schwierigkeiten beim Erhalt von interessierenden Geweben und den Modifizierungen des nativen Proteins, welche während des Isolierungsverfahrens auftreten können, ist es extrem schwierig, große Mengen an hoch gereinigtem, vollständig intaktem Calciumkanal-Protein zu erhalten.
Die Charakterisierung eines speziellen Typs von Calciumkanal durch Analyse ganzer Zellen ist stark beschränkt durch die Anwesenheit gemischter Populationen verschiedener Typen von Calciumkanälen bei der Mehrzahl von Zellen. Einzelkanal-Aufzeichnungsverfahren, welche zur Untersuchung individueller Calciumkanäle eingesetzt werden, offenbaren keinerlei Information bezüglich der molekularen Struktur oder biochemischen Zusammensetzung des Kanals. Ferner wird bei der Durchführung dieses Analysetyps der Kanal aus anderen Zellbestandteilen isoliert, welche für natürliche Funktionen und pharmakologische Wechselwirkungen von Bedeutung sein könnten.
Die Charakterisierung des Gens oder der Gene, welches) für Calciumkanäle kodierten, bietet ein weiteres Mittel der Charakterisierung verschiedener Typen von Calciumkanälen. Die Aminosäuresequenz, die von einer vollständigen Nukleotidsequenz des kodierenden Bereichs eines Gens, das für ein Calciumkanal-Protein kodiert, bestimmt wurde, repräsentiert die Primärstruktur des Proteins. Ferner kann die Sekundärstruktur des Calciumkanal-Proteins und die Beziehung des Proteins zur Membran auf Grundlage der Analyse der Primärstruktur vorausgesagt werden. Beispielsweise zeigen Hydropathie-Diagramme des α₁-Untereinheits-Proteins des Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanals an, daß es vier interne Repeats enthält, die jeweils sechs mutmaßliche Transmembranregionen enthalten [Tanabe, T., et al. (1987), Nature 328: 313].
Nachdem Calciumkanäle in verschiedenen Geweben vorliegen und eine zentrale Rolle bei der Regulierung intrazellulärer Calciumionenkonzentrationen spielen, sind sie an einer Reihe von lebenswichtigen Prozessen in Lebewesen, einschließlich Neurotransmitter-Freisetzung, Muskelkontraktion, Schrittmacheraktivität und Sekretion von Hormonen und ande- ren Substanzen, beteiligt. Diese Prozesse scheinen an zahlreichen humanen Erkrankungen, wie z. B. ZNS-Erkrankungen und kardiovaskulären Erkrankungen, beteiligt zu sein. Calciumkanäle werden so mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Man nimmt an, daß eine Reihe von Verbindungen, die sich zur Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen bei Lebewesen, einschließlich Menschen, eignen, ihre günstigen Wirkungen durch Modulation der Funktionen von spannungsabhängigen Calciumkanälen, die im Herzmuskel und/oder glatten Gefäßmuskel vorliegen, ausüben. Viele dieser Verbindungen binden an Calciumkanäle und blockieren den Einstrom von Ca²⁺ in die Zellen als Reaktion auf eine Depolarisation der Zellmembran oder verringern dessen Geschwindigkeit.
Die Ergebnisse von Untersuchungen der rekombinanten Expression von cDNA-Klonen, die für eine Kaninchen-Calciumkanal-α₁-Untereinheit kodieren, und von Transkripten der cDNA-Klone weisen darauf hin, daß die α₁-Untereinheit die Pore bildet, durch die Calcium in die Zellen eintritt. Die Relevanz der in diesen rekombinanten Zellen gebildeten Bariumströme für den tatsächlichen Strom, welcher durch Calciumkanäle hervorgerufen wird, die als eine Komponente die jeweiligen α₁-Untereinheiten enthalten, in vivo ist unklar. Zur vollständigen und genauen Charakterisierung und Beurteilung verschiedener Calciumkanal-Typen ist es jedoch essentiell, die funktionellen Eigenschaften von rekombinanten Kanälen zu untersuchen, die alle Untereinheiten enthalten, wie sie in vivo gefunden werden.
Zur Durchführung dieser Untersuchung und für das vollständige Verständnis der Struktur und Funktion von Calciumkanälen ist es kritisch, so viele Calciumkanal-Untereinheiten wie möglich zu identifizieren und zu charakterisieren. Auch ist es zur Herstellung rekombinanten Zellen zur Verwendung für die Identifizierung von Verbindungen, welche mit Calciumkanälen wechselwirken, erforderlich, Zellen herstellen zu können, welche gleichbleibende Populationen von Calciumkanälen mit definierten Untereinheiten exprimieren.
Ein Verständnis der Pharmakologie von Verbindungen, welche mit Calciumkanälen in anderen Organsystemen, wie z. B. dem ZNS, wechselwirken, kann zum rationalen Design von Verbindungen beitragen, welche spezifisch mit Subtypen von humanen Calciumkanälen wechselwirken, um erwünschte therapeutische Wirkungen aufzuweisen, wie z. B. bei der Behandlung von neurodegenerativen und kardiovaskulären Erkrankungen. Ein solches Verständnis und das Vermögen zum rationalen Design therapeutisch wirksamer Verbindungen waren jedoch behindert durch das Unvermögen, unabhängig die Typen von humanen Calciumkanälen und die molekulare Natur individueller Subtypen festzustellen, insbesondere im ZNS, und durch die mangelnde Verfügbarkeit reiner Präparationen von speziellen Kanal-Subtypen zur Verwendung für die Beurteilung der Spezifität von calciumkanal-beeinflussenden Verbindungen. Somit würde die Identifizierung von DNA, die für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, und die Verwendung solcher DNA zur Expression von Calciumkanal-Untereinheiten und funktioneller Calciumkanäle beim Screenen und Design therapeutisch wirksamer Verbindungen helfen.
Deshalb besteht eine Aufgabe hier darin, DNA bereitzustellen, die für spezielle Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, und eukaryotische Zellen bereitzustellen, die rekombinante gewebespezifische oder subtypenspezifische Calciumkanäle tragen. Es ist auch eine Aufgabe, Assays zur Identifizierung potentieller therapeutischer Verbindungen bereitzustellen, die als Calciumkanal-Antagonisten und -Agonisten wirken.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden isolierte und gereinigte Nukleinsäurefragmente bereitgestellt, welche für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodieren. DNA, die für α₁-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, und RNA, die für solche Untereinheiten kodiert, nach Transkription solcher DNA hergestellt, werden bereitgestellt. Insbesondere werden DNA-Fragmente bereitgestellt, die für α₁-Untereinheiten von spannungsabhängigen humanen Calciumkanälen (VDCCs) vom Typ A, Typ B (auch als VDCC IV bezeichnet), Typ C (auch als VDCC II bezeichnet), Typ D (auch als VDCC III bezeichnet) und Typ E kodieren.
Es wird DNA bereitgestellt, die für α_1A-, α_1B-, α_1C-, α_1D- und α_1E-Untereinheiten kodiert. DNA, die für eine α_1D-Untereinheit kodiert, welche die Aminosäuren im wesentlichen wie als Reste 10-2161 von SEQ-ID-Nr. 1 angegeben umfaßt, wird bereitgestellt. DNA, die für eine α_1D-Untereinheit kodiert, welche im wesentlichen die als Aminosäuren 1–34 in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Aminosäuren anstelle der Aminosäuren 373–406 von SEQ-ID-Nr. 1 umfaßt, wird ebenfalls bereitgestellt. DNA, die für eine α_1C-Untereinheit kodiert, welche die Aminosäuren im wesentlichen wie in SEQ-ID-Nr. 3 oder SEQ-ID-Nr. 6 angegeben umfaßt, und DNA, die für eine α_1B-Untereinheit kodiert, welche eine Aminosäuresequenz im wesentlichen wie in SEQ-ID-Nr. 7 oder in SEQ-ID-Nr. 8 angegeben umfaßt, wird ebenfalls bereitgestellt.
DNA, die für α_1A-Untereinheiten kodiert, wird ebenfalls bereitgestellt. Eine solche DNA schließt DNA ein, die für eine α_1A-Untereinheit kodiert, welche im wesentlichen dieselbe Sequenz von Aminosäuren aufweist wie sie von der in SEQ-ID-Nr. 22 oder Nr. 23 angegebenen DNA kodiert wird, oder für andere Splice-Varianten von α_1A, welche die gesamte Sequenz, die in SEQ-ID-Nr. 22 oder 23 angegeben ist, oder einen Teil davon umfassen. Die in SEQ-ID-Nr. 22 angegebene Sequenz ist eine Splice-Variante mit der Bezeichnung α_1A–1 und die in SEQ-ID-Nr. 23 angegebene Sequenz ist eine Splice-Variante mit der Bezeichnung α_1A–2. DNA, die für α_1A-Untereinheiten kodiert, schließt auch untereinheits-kodierende DNA ein, welche unter Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils der DNA mit der SEQ- ID-Nr. 21, 22 oder 23 oder DNA, die aus dem Phagen-Lysat eines E. coli-Wirts, enthaltend für eine α_1A-Untereinheit kodierende DNA, welcher bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Hinterlegungs-Nr. 75293 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt wurde, erhalten wurde, isoliert werden kann. Die DNA in einem solchen Phagen schließt ein DNA-Fragment ein, welches die in SEQ-ID-Nr. 21 angegebene Sequenz aufweist. Dieses Fragment hybridisiert unter Bedingungen hoher Stringenz selektiv mit DNA, die für α_1A kodiert, jedoch nicht mit DNA, die für α_1B kodiert, und kann somit zur Isolierung von DNA, die für α_1A-Untereinheiten kodiert, eingesetzt werden.
DNA, die für α_1E-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, wird ebenfalls bereitgestellt. Diese DNA schließt DNA ein, welche für eine α_1E-Splice-Variante mit der Bezeichnung α_1E–1 kodiert, kodiert von der in SEQ-ID-Nr. 24 angegebenen DNA, und eine Variante mit der Bezeichnung α_1E–3, kodiert von SEQ-ID-Nr. 25. Diese DNA schließt auch andere Splice-Varianten davon ein, kodierend für Sequenzen von Aminosäuren, die von der Gesamtheit oder einem Teil der in den SEQ-ID-Nrn. 24 und 25 angegebenen Nukleotidsequenzen kodiert werden, und DNA, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit der DNA von SEQ-ID-Nr. 24 oder 25 hybridisiert und für eine α_1E-Splice-Variante kodiert.
Es wird DNA, die für α₂-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, und RNA, die für solche Untereinheiten kodiert, hergestellt nach Transkription einer solchen DNA, bereitgestellt. Es wird auch DNA bereitgestellt, die für Splice-Varianten der α₂-Untereinheit, einschließlich gewebespezifischer Splice-Varianten, kodiert. Insbesondere wird DNA bereitgestellt, welche für die α_2a-α_2e-Untereinheits-Subtypen kodiert. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die für die α₂-Untereinheit kodierende DNA bereitgestellt, welche durch alternative Prozessierung eines primären Transkripts gebildet wird, das DNA, kodierend für die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebenen Aminosäuren, und die DNA von SEQ-ID-Nr. 13, inseriert zwischen den Nukleotiden 1624 und 1625 von SEQ-ID-Nr. 11, umfaßt. Die DNA- und Aminosäuresequenzen von α_2a-α_2e sind in den SEQ-ID-Nrn. 11 (α_2b), 29 (α_2a) bzw. 30 bis 32 (α_2c-α_2e) angegeben.
Es werden isolierte und gereinigte DNA-Fragmente bereitgestellt, die für humane Calciumkanal-β-Untereinheiten, einschließlich DNA, die für β₁-, β₂-, β₃- und β₄-Untereinheiten kodiert, und Splice-Varianten der β-Untereinheiten kodieren. RNA, die für β-Untereinheiten kodiert, hergestellt nach Transkription der DNA, wird ebenfalls bereitgestellt.
DNA, kodierend für eine β₁-Untereinheit, welche durch alternative Prozessierung eines primären Transkripts hergestellt wird, das DNA umfaßt, die für die in SEQ-ID-Nr. 9 angegebenen Aminosäuren kodiert, jedoch die in SEQ-ID-Nr. 12 angegebene DNA anstelle der Nukleotide 615–781 von SEQ-ID-Nr. 9 inseriert umfaßt, wird ebenfalls bereitgestellt. Es wird auch DNA bereitgestellt, die für β₁-Untereinheiten kodiert, welche von Transkripten kodiert werden, welche die in SEQ-ID-Nr. 9 angegebene Sequenz, einschließlich der in SEQ-ID-Nr. 12 angegebenen DNA anstelle der Nukleotide 615–781 von SEQ-ID-Nr. 9 inseriert, aufweisen, denen jedoch eine oder mehrere der folgenden Nukleotidsequenzen fehlen: Nukleotide 14–34 von SEQ-ID-Nr. 12, Nukleotide 13–34 von SEQ-ID-Nr. 12, Nukleotide 35–55 von SEQ-ID-Nr. 12, Nukleotide 56–190 von SEQ-ID-Nr. 12 und Nukleotide 191–271 von SEQ-ID-Nr. 12. Insbesondere werden die im folgenden beschriebenen β₁-Untereinheits-Splice-Varianten β_1–1-β_1–5 (siehe SEQ-ID-Nrn. 9, 10 und 33–35) bereitgestellt.
Die β₂-Untereinheits-Splice-Varianten β_2c-β_2e, welche die Gesamtheit oder einen Teil der SEQ-ID-Nrn. 26, 37 und 38 umfassen, werden bereitgestellt; β₃-Untereinheits-Splice-Varianten, einschließlich β₃-Untereinheits-Splice-Varianten, welche die in den SEQ-ID-Nrn. 19 und 20 angegebenen Sequenzen aufweisen, und DNA, kodierend für die β₄-Untereinheit, welche DNA mit der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz und die in SEQ-ID-Nr. 28 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, werden bereitgestellt.
Es wurden auch Escherichia coli (E. coli)-Wirtszellen, welche Plasmide beherbergen, die für β₃ kodierende DNA enthalten, gemäß dem Budapester Vertrag unter der Hinterlegungs-Nr. 69048 bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Der hinterlegte Klon umfaßt die Nukleotide 122–457 in SEQ-ID-Nr. 19 und 107–443 in SEQ-ID-Nr. 20.
DNA, kodierend für β-Untereinheiten, welche gebildet werden durch alternative Prozessierung eines primären Transkripts, das für eine β-Untereinheit kodiert, einschließlich eines Transkripts, das für die in SEQ-ID-Nr. 9 angegebenen Aminosäuren kodierende DNA umfaßt, oder einschließlich eines primären Transkripts, das für β₃ kodiert, wie hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69048, das jedoch alternative Exons umfaßt und dem solche fehlen, wird bereitgestellt oder kann anhand der hier bereitgestellten DNA konstruiert werden.
Vollängen-DNA-Klone und entsprechende RNA-Transkripte, die für die Untereinheiten α₁, einschließlich Splice-Varianten von α_1A, α_1D, α_1B, α_1C und α_1E, α₂ und β, einschließlich β_1–1-β_1-5, β_2C, β_2D, β_2E, β_3–1 und β₄, von humanen Calciumkanälen kodieren, werden bereitgestellt. Ebenfalls bereitgestellt werden DNA-Klone, die für substantielle Abschnitte der bestimmten α_1C-Untereinheits-Subtypen und γ-Untereinheiten von spannungsabhängigen humanen Calciumkanälen kodieren, zur Herstellung von Vollängen-DNA-Klonen, welche für die ent sprechenden Vollängen-Untereinheiten kodieren. Vollängen-Klone können unschwer unter Verwendung der offenbarten DNA als Sonde wie hier beschrieben erhalten werden.
Die α_1A-Untereinheit, α_1C-Untereinheit, α_1E-Untereinheit und Splice-Varianten davon, die β_2D-, β_2C- und β_2E-Untereinheiten und β₄-Untereinheiten und Nukleinsäuren, welche für diese Untereinheiten kodieren, sind hier von besonderem Interesse.
Es werden eukaryotische Zellen bereitgestellt, enthaltend heterologe DNA, die für eine oder mehrere Calciumkanal-Untereinheiten) kodiert, insbesondere humane Calciumkanal-Untereinheiten, oder enthaltend RNA-Transkripte von DNA-Klonen, die für eine oder mehrere der Untereinheiten kodieren. Eine einzelne α₁-Untereinheit kann einen Kanal bilden. Die erforderliche Kombination von Untereinheiten zur Bildung aktiver Kanäle in ausgewählten Zellen kann jedoch unter Anwendung der hier vorliegenden Verfahren empirisch bestimmt werden. Beispielsweise kann, falls ein ausgewählter α₁-Subtyp oder eine Variante keinen aktiven Kanal in einer ausgewählten Zellinie bildet, eine zusätzliche Untereinheit oder zusätzliche Untereinheiten hinzugefügt werden, bis ein aktiver Kanal gebildet wird.
In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Zellen DNA oder RNA, die für eine humane α_1E-3-Untereinheit kodiert. In bevorzugteren Ausführungsformen enthalten die Zellen DNA oder RNA, die für zusätzliche heterologe Untereinheiten kodiert, einschließlich mindestens einer β- oder α₂-Untereinheit. Bei solchen Ausführungsformen werden eukaryotische Zellen bereitgestellt, die stabil oder vorübergehend mit irgendeiner Kombination von einem, zwei, drei oder vier der untereinheits-kodierenden DNA-Klone, z. B. DNA, die für irgendeines von α₁, α₁ + β, α₁ + β + α₂ kodiert, transfiziert sind.
Die hier bereitgestellten eukaryotischen Zellen enthalten heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit kodiert, oder heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit kodiert, und heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit kodiert. Mindestens eine ausgewählte Untereinheit ist eine α_1E–3-, β_2C-, β_2D-, β_2E- oder eine β₄-Untereinheit. In bevorzugten Ausführungsformen exprimieren die Zellen solche heterologen Calciumkanal-Untereinheiten und schliessen eine oder mehrere der Untereinheiten in membran-überspannenden heterologen Calciumkanälen ein. In bevorzugteren Ausführungsformen exprimieren die eukaryotischen Zellen funktionelle, heterologe Calciumkanäle, welche in der Lage sind, die Passage von calciumkanal-selek tiven Ionen zu steuern und/oder Verbindungen zu binden, welche in physiologischen Konzentrationen die Aktivität des heterologen Calciumkanals modulieren. In bestimmten Ausführungsformen schließen die heterologen Calciumkanäle mindestens eine heterologe Calciumkanal-Untereinheit ein. In am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind die Calciumkanäle, welche auf der Oberfläche der eukaryotischen Zellen exprimiert werden, im wesentlichen oder vollständig aus Untereinheiten zusammengesetzt, die von der heterologen DNA oder RNA kodiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die heterologen Calciumkanäle solcher Zellen von etwaigen endogenen Calciumkanälen der Wirtszelle unterscheidbar. Solche Zellen bieten ein Mittel, um homogene Populationen von Calciumkanälen zu erhalten. Typischerweise enthalten die Zellen den ausgewählten Calciumkanal als den einzigen heterologen Ionenkanal, der von der Zelle exprimiert wird.
In bestimmten Ausführungsformen werden die rekombinanten eukaryotischen Zellen, welche die heterologe DNA enthalten, die für die Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, durch Transfektion mit DNA erzeugt, die für eine oder mehrere der Untereinheiten kodiert, oder erhalten Injektionen mit RNA-Transkripten von DNA, die für eine oder mehrere der Calciumkanal-Untereinheiten kodiert. Die DNA kann als lineares DNA-Fragment eingeführt werden oder kann in einen Expressionsvektor für die stabile oder vorübergehende Expression der für die Untereinheit kodierenden DNA eingeschlossen werden. Es werden auch Vektoren bereitgestellt, welche DNA enthalten, die für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodiert.
Die eukaryotischen Zellen, welche heterologe Calciumkanäle exprimieren, können in Assays für die Calciumkanal-Funktion eingesetzt werden oder, im Falle von Zellen, die mit weniger untereinheits-kodierenden Nukleinsäuren transformiert sind als nötig, um einen funktionellen rekombinanten humanen Calciumkanal auszumachen, können solche Zellen zur Ermittlung der Wirkungen zusätzlicher Untereinheiten auf die Calciumkanal-Aktivität eingesetzt werden. Die zusätzlichen Untereinheiten können durch anschließende Transfektion einer solchen Zelle mit einem oder mehreren DNA-Klon(en) oder RNA-Transkripten, die für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodieren, bereitgestellt werden.
Die rekombinanten eukaryotischen Zellen, welche membran-überspannende heterologe Calciumkanäle exprimieren, können in Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche Calciumkanal-Aktivität modulieren, eingesetzt werden. Insbesondere werden die Zellen in Assays eingesetzt, welche Agonisten und Antagonisten von Calciumkanal-Aktivität bei Menschen identifizieren, und/oder bei der Ermittlung des Beitrags der verschiedenen Calciumkanal-Untereinheiten zum Transport und zu der Regulation des Transports von Calciumionen. Nachdem die Zellen homogene Populationen von Calciumkanälen darstellen, bieten sie ein Mittel zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten von Calciumkanal-Aktivität, die für eine jede solche Population spezifisch sind.
Es werden auch die Assays bereitgestellt, welche die eukaryotischen Zellen zur Identifizierung von Verbindungen, welche Calciumkanal-Aktivität modulieren, verwenden. Bei der Durchführung dieser Assays befindet sich die eukaryotische Zelle, welche einen heterologen Calciumkanal exprimiert, der mindestens eine Untereinheit enthält, die von der hier bereitgestellten DNA kodiert wird, in einer Lösung, die eine Testverbindung und ein calciumkanalselektives Ion enthält, die Zellmembran wird depolarisiert und der in die Zelle fließende Strom wird nachgewiesen. Falls die Testverbindung eine ist, welche Calciumkanal-Aktivität moduliert, ist der nachgewiesene Strom verschieden von demjenigen, welcher durch Depolarisierung derselben oder einer im wesentlichen identischen Zelle in Gegenwart desselben Calciumkanal-selektiven Ions, jedoch in Abwesenheit der Verbindung, erzeugt wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird vor dem Depolarisierungsschritt die Zelle bei einem Haltepotential gehalten, welches im wesentlichen Calciumkanäle inaktiviert, die für die Zelle endogen sind. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Zellen auch Säugerzellen, am meisten bevorzugt HEK-Zellen oder Amphibien-Oozyten.
Nukleinsäure-Sonden, typischerweise zum Nachweis markiert, die mindestens etwa 14, vorzugsweise 16 oder gewünschtenfalls 20 oder 30 oder mehr, zusammenhängende Nukleotide von α_1D-, α_1C-, α_1B-, α_1A- und α_1E-, α₂-, β-, einschließlich β₁-, β₂-, β₃- und β₄-Splice-Varianten, und γ-Untereinheits-kodierender DNA enthalten, werden bereitgestellt. Verfahren, welche die Sonden zur Isolierung und Klonierung von für eine Calciumkanal-Untereinheit kodierender DNA, einschließlich Splice-Varianten in Geweben und Zwischengewebe-Varianten, einsetzen, werden ebenfalls bereitgestellt.
Es werden gereinigte humane Calciumkanal-Untereinheiten und gereinigte humane Calciumkanäle bereitgestellt. Die Untereinheiten und Kanäle können aus einer eukaryotischen Zelle isoliert werden, welche mit DNA transfiziert ist, die für die Untereinheit kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform werden Immunglobuline oder Antikörper, erhalten aus dem Serum eines Lebewesens, das mit einer im wesentlichen reinen Präparation eines humanen Calciumkanals, einer humanen Calciumkanal-Untereinheit oder eines epitop-enthaltenden Fragments einer humanen Calciumkanal-Untereinheit immunisiert wurde, bereitgestellt. Es werden auch monoklonale Antikörper bereitgestellt, welche unter Verwendung eines humanen Calciumkanals, einer humanen Calciumkanal-Untereinheit oder eines epitopenthaltenden Fragments davon als Immogen hergestellt wurden. E. coli-Fusionsproteine, die ein Fragment einer humanen Calciumkanal-Untereinheit einschließen, können ebenfalls als Immunogen verwendet werden. Solche Fusionsproteine können ein bakterielles Protein oder einen Teil davon, wie z. B. das E. coli-TrpE-Protein, fusioniert mit einem Calciumkanal-Untereinheitspeptid enthalten. Die Immunglobuline, welche unter Verwendung der Calciumkanal-Untereinheiten oder gereinigten Calciumkanäle als Immunogene hergestellt werden, haben neben anderen Eigenschaften das Vermögen, spezifisch und vorzugsweise an einen humanen Calciumkanal oder eine Untereinheit davon, welcher) in einer biologischen Probe oder einer Lösung, die von einer solchen biologischen Probe stammt, vorliegen kann, zu binden und/oder dessen/deren Immunpräzipitation zu verursachen. Solche Antikörper können auch zur selektiven Isolierung von Zellen eingesetzt werden, die Calciumkanäle exprimieren, welche die Untereinheit enthalten, für die die Antikörper spezifisch sind.
Es werden auch Verfahren zur Modulierung der Aktivität von Ionenkanälen durch Kontaktierung der Calciumkanäle mit einer effektiven Menge der oben beschriebenen Antikörper bereitgestellt.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein diagnostisches Verfahren zur Feststellung des Vorliegens des Lambert-Eaton-Raoke-Syndroms (LES) bei einem Menschen, das auf der immunologischen Reaktivität von LES-Immunglobulin G (IgG) mit einer humanen Calciumkanal-Untereinheit oder einer eukaryotischen Zelle, welche einen rekombinanten humanen Calciumkanal oder eine Untereinheit davon exprimiert, basiert. Insbesondere wird ein Immunoassay-Verfahren zur Diagnose des Lambert-Eaton-Rooke-Syndroms bei einer Person durch Kombination von Serum oder einer IgG-Fraktion der Person (Testserum) mit Calciumkanal-Proteinen, einschließlich der α- und β-Untereinheiten, und Feststellung, ob Antikörper in dem Testserum mit einer oder mehreren der Untereinheiten oder einer rekombinanten Zelle, welche eine oder mehrere der Untereinheiten exprimiert, in größerem Ausmaß reagieren als Antikörper in Kontrollserum, erhalten von einer Person oder einer Gruppe von Personen, welche bekanntermaßen frei von dem Syndrom ist/sind, bereitgestellt. Es kann ein beliebiges Immunoassay-Verfahren, das im Stand der Technik zum Nachweis von Antikörpern gegen ein gegebenes Antigen in Serum bekannt ist, bei dem Verfahren eingesetzt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen:
Soweit nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung wie sie gewöhnlich von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Alle Patente und Publikationen, auf die hier Bezug genommen wird, sind durch die Bezugnahme mit eingeschlossen.
Die Bezugnahme auf jede der Calciumkanal-Untereinheiten schließt die Untereinheiten ein, welche hier speziell offenbart werden, und humane Calciumkanal-Untereinheiten, kodiert von DNA, welche unter Verwendung der offenbarten DNA als Sonden und Screening einer geeigneten humanen cDNA- oder genomischen Bank mit mindestens niedriger Stringenz isoliert werden kann. Solche DNA schließt auch DNA ein, welche für Proteine kodiert, die 40 Homologie zu irgendeinem der hier beschriebenen Untereinheitsproteine aufweisen, oder DNA, welche unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz mit der hier bereitgestellten DNA hybridisiert, und das Protein, welches von einer solchen DNA kodiert wird, weist zusätzliche identifizierende charakteristische Eigenschaften auf, wie z. B. Funktion oder Molekulargewicht.
Es versteht sich, daß Untereinheiten, die von Transkripten kodiert werden, welche Splice-Varianten der offenbarten Untereinheiten darstellen, weniger als 40% Gesamthomologie zu irgendeiner einzelnen Untereinheit aufweisen können, jedoch Bereiche einer solchen Homologie zu einer oder mehreren solcher Untereinheiten umfassen werden. Es versteht sich auch, daß sich 40% Homologie auf Proteine bezieht, die 40% ihrer Aminosäuren gemeinsam haben, wobei die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert ist.
Wie hier verwendet, werden die α₁-Untereinheitstypen, die von verschiedenen Genen kodiert werden, als Typ α_1A, α_1B, α_1C, α_1D und α_1E bezeichnet. Diese Typen wurden auch als VDCC IV für α_1B, VDCC II für α_1C und VDCC III für α_1D bezeichnet. Untereinheitssubtypen, welche Splice-Varianten sind, werden beispielsweise als α_1B–1, α_1B–2, α_1C–1 etc. bezeichnet.
Somit bezieht sich, wie hier verwendet, DNA, die für die α₁-Untereinheit kodiert, auf DNA, welche mit der hier bereitgestellten DNA unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz hybridisiert oder für eine Untereinheit kodiert, die mindestens etwa 40% Homologie zu einem Protein aufweist, das von hier offenbarter DNA kodiert wird, welche für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert. Eine α₁-Untereinheit kann durch ihr Vermögen zur Bildung eines Calciumkanals identifiziert werden. Typischerweise weisen α₁-Untereinheiten Molekülmassen von mehr als mindestens etwa 120 kD auf. Auch zeigen Hydropathie-Diagramme von abgeleiteten α₁-Untereinheits-Aminosäuresequenzen an, daß die α₁-Untereinheiten vier interne Repeats enthalten, die jeweils sechs mutmaßliche Transmembrandomänen enthalten.
Die Aktivität eines Calciumkanals kann in vitro durch Verfahren ermittelt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich der hier beschriebenen elektrophysiologischen und anderen Verfahren. Typischerweise schließen α₁-Untereinheiten Regionen ein, mit denen ein oder mehrere Modulator(en) von Calciumkanal-Aktivität, wie z. B. 1,4-DHP oder ω-CgTx, direkt oder indirekt wechselwirken. Typen von α₁-Untereinheiten können nach irgendeinem Verfahren unterschieden werden, welches Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, einschließlich einem auf Grundlage der Bindungsspezifität. Beispielsweise wurde hier festgestellt, daß α_1B-Untereinheiten an der Bildung von Kanälen beteiligt sind, die bisher als Kanäle vom N-Typ bezeichnet wurden, α_1D-Untereinheiten an der Bildung von Kanälen beteiligt sind, die bisher als Kanäle vom L-Typ bezeichnet wurden, und α_1A-Untereinheiten an der Bildung von Kanälen, welche Charakteristiken aufweisen, die typisch für Kanäle sind, die bisher als Kanäle vom P-Typ bezeichnet wurden, beteiligt zu sein scheinen. So ist beispielsweise die Aktivität von Kanälen, welche die α_1B-Untereinheit enthalten, nicht sensitiv für 1,4-DHPs, wohingegen die Aktivität von Kanälen, welche die α_1D-Untereinheit enthalten, durch ein 1,4-DHP moduliert oder verändert wird. Es ist gegenwärtig bevorzugt, sich auf Calciumkanäle auf Grundlage der pharmakologischen Eigenschaften und Stromkinetiken zu beziehen und historische Bezeichnungen zu vermeiden. Typen und Subtypen von α₁-Untereinheiten können auf Grundlage der Wirkungen solcher Modulatoren auf die Untereinheit oder einen Kanal, der die Untereinheit enthält, charakterisiert werden sowie auf Grundlage von Unterschieden in den Strömen und Stromkinetiken, die durch Calciumkanäle erzeugt werden, welche die Untereinheit enthalten.
Wie hier verwendet, wird eine α₂-Untereinheit von DNA kodiert, welche mit der hier bereitgestellten DNA unter Bedingungen niedriger Stringenz hybridisiert oder für ein Protein kodiert, das mindestens etwa 40% Homologie zu dem hier offenbarten aufweist. Eine solche DNA kodiert für ein Protein, das typischerweise eine größere Molekülmasse als etwa 120 kD aufweist, jedoch keinen Calciumkanal in Abwesenheit einer α₁-Untereinheit bildet, und die Aktivität eines Calciumkanals verändern kann, der eine α₁-Untereinheit enthält. Subtypen der α₂-Untereinheit, die als Splice-Varianten auftreten, werden durch Kleinbuchstaben bezeichnet, wie z. B. α₂ _a, ... α_2e. Darüber hinaus scheinen die α₂-Untereinheit und das große Fragment, welches gebildet wird, wenn das Protein reduzierenden Bedingungen unterworfen wird, mit mindestens N-verknüpften Zuckern glycosyliert zu sein und nicht spezifisch an die 1,4-DHPs und Phenylalkylamine zu binden, welche spezifisch an die α₁-Untereinheit binden. Das kleinere Fragment, das C-terminate Fragment, wird als die δ-Untereinheit bezeichnet und schließt Aminosäuren von etwa 946 (SEQ-ID-Nr. 11) bis etwa zum C-Terminus ein. Dieses Fragment kann von dem verbleibenden Teil von α₂ dissoziieren, wenn die α₂-Untereinheit reduzierenden Bedingungen unterworfen wird.
Wie hier verwendet, wird eine β-Untereinheit von DNA kodiert, welche mit der hier bereitgestellten DNA unter Bedingungen niedriger Stringenz hybridisiert oder für ein Protein kodiert, das mindestens etwa 40% Homologie zu dem hier offenbarten aufweist und ein Protein ist, das typischerweise eine geringere Molekülmasse als die α-Untereinheiten und in der Größenordnung von etwa 50–80 kD aufweist, keinen nachweisbaren Calciumkanal in Abwesenheit einer α₁-Untereinheit bildet, jedoch die Aktivität eines Calciumkanals verändern kann, der eine α₁-Untereinheit enthält oder der eine α₁- und α₂-Untereinheit enthält.
Typen der β-Untereinheit, die von verschiedenen Genen kodiert werden, werden mit tiefgestellten Indices wie β₁, β₂, β₃ und β₄ bezeichnet. Subtypen von β-Untereinheiten, die als Splice-Varianten eines speziellen Typs auftreten, werden mit einem numerischen tiefgestellten Index bezeichnet, der sich auf den Typ und die Variante bezieht. Solche Subtypen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, die β₁-Splice-Varianten, einschließlich β_1-1--β_1-5, und β₂-Varianten, einschließlich β_2C-β_2E.
Somit kann ein Fachmann in Anbetracht der vorliegenden Offenbarung DNA identifizieren, die für α₁-, α₂- und β-Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, einschließlich Typen, die von verschiedenen Genen kodiert werden, und Subtypen, die Splice-Varianten repräsen tieren. Beispielsweise können DNA-Sonden, die auf der hier offenbarten DNA basieren, zum Screenen einer geeigneten Bank, einschließlich einer genomischen Bank oder cDNA-Bank, hinsichtlich Hybridisierung mit der Sonde und zum Erhalt von DNA in einem oder mehreren Klon(en), welche ein Fragment mit einem offenen Leserahmen umfaßt, das für ein vollständiges Protein kodiert, eingesetzt werden. Nach dem Screenen einer geeigneten Bank mit der hier offenbarten DNA kann die isolierte DNA hinsichtlich der Anwesenheit eines offenen Leserahmens, aus dem die Sequenz des kodierten Proteins abgeleitet werden kann, überprüft werden. Die Bestimmung des Molekulargewichts und der Vergleich mit den hier vorliegenden Sequenzen sollte die Identität der Untereinheit als eine α₁-, α₂- etc. -Untereinheit zeigen. Funktionelle Assays können erforderlichenfalls eingesetzt werden, um festzustellen, ob die Untereinheit eine α₁-, α₂-Untereinheit oder β-Untereinheit ist.
Beispielsweise kann DNA, die für eine α_1A-Untereinheit kodiert, durch Screenen einer geeigneten Bank mit DNA, die für die Gesamtheit oder einen Teil der humanen α_1A-Untereinheit kodiert, isoliert werden. Solche DNA schließt die DNA in dem unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 75293 hinterlegten Phagen ein, die für einen Teil einer α₁-Untereinheit kodiert. DNA, die für eine α_1A-Untereinheit kodiert, kann durch Screenen mit einem Oligonukleotid, welches die Gesamtheit oder einen Teil der in SEQ-ID-Nr. 21, 22 und/oder 23 angegebenen Sequenz aufweist, oder mit der DNA in dem hinterlegten Phagen aus einer geeigneten Bank erhalten werden. Alternativ kann eine solche DNA eine Sequenz aufweisen, welche für eine α_1A-Untereinheit kodiert, die von SEQ-ID-Nr. 22 oder 23 kodiert wird.
Gleichermaßen kann für β₃ kodierende DNA durch Screenen einer Human-cDNA-Bank mit Sonden, die von dem Plasmid β1.42, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69048, hergestellt wurden, isoliert werden oder kann durch Verwendung von Sonden mit Sequenzen, die nach den in den SEQ-ID-Nrn. 19 und/oder 20 angegebenen Sequenzen hergestellt wurden, aus einer geeigneten Bank erhalten werden. Auch kann für β₄ kodierende DNA isoliert werden durch Screenen einer Human-cDNA-Bank mit DNA-Sonden, die nach der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen DNA, welche die DNA-Sequenz eines für eine β₄-Untereinheit kodierenden Klons angibt, hergestellt wurden. Die Aminosäuresequenz ist in SEQ-ID-Nr. 28 angegeben. Es kann ein beliebiges Verfahren, das Fachleuten auf dem Gebiet zur Isolierung und Identifizierung von DNA und zur Herstellung von genomischen oder cDNA-Klonen voller Länge bekannt ist, einschließlich hier beispielhaft erläuterter Verfahren, eingesetzt werden. DNA, kodierend für die Untereinheit, die von isolierter DNA kodiert wird, kann durch Vergleich mit den DNA- und Aminosäuresequenzen der hier bereitgestellten Untereinheiten identifiziert werden. Splice-Varianten haben umfangreiche Homologiebereiche gemeinsam, schließen jedoch nicht-homologe Bereiche ein, Untereinheiten, die von verschiedenen Genen kodiert werden, haben eine gleichmäßige Verteilung nicht-homologer Sequenzen gemeinsam.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Splice-Variante auf eine Variante, welche durch unterschiedliche Prozessierung eines primären Transkripts von genomischer DNA, die zu mehr als einem Typ von mRNA führt, erzeugt wurde. Splice-Varianten können innerhalb eines einzigen Gewebetyps oder zwischen Geweben (gewebespezifische Varianten) auftreten. Somit werden cDNA-Klone, die für Calciumkanal-Untereinheitssubtypen kodieren, welche Bereiche identischer Aminosäuren und Bereiche unterschiedlicher Aminosäuresequenzen aufweisen, hier als "Splice-Varianten" bezeichnet.
Wie hier verwendet, ist ein "calciumkanal-selektives Ion" ein Ion, das einen Calciumkanal, der eine zelluläre Membran überspannt, unter Bedingungen, welche im wesentlichen in gleicher Weise die Passage von Ca²⁺ gestatten oder blockieren würden, passieren kann oder dessen Passage blockiert wird. Ba²⁺ ist ein Beispiel eines Ions, das ein calciumkanalselektives Ion ist.
Wie hier verwendet, ist eine Verbindung, die Calciumkanal-Aktivität moduliert, eine Verbindung, welche das Vermögen des Calciumkanals zur Passage von calciumkanalselektiven Ionen beeinflußt oder andere nachweisbare Calciumkanal-Merkmale, wie z. B. Stromkinetiken, beeinflußt. Solche Verbindungen schließen Calciumkanal-Antagonisten und -Agonisten ein und Verbindungen, welche ihre Wirkung auf die Aktivität des Calciumkanals direkt oder indirekt ausüben.
Wie hier verwendet, ist eine) "im wesentlichen reine(s)" Untereinheit oder Protein eine Untereinheit oder ein Protein, die oder das ausreichend frei von anderen Polypeptid-Verunreinigungen ist, um bei SDS-PAGE homogen zu erscheinen oder eindeutig sequenziert zu werden.
Wie hier verwendet, bedeutet selektives Hybridisieren, daß ein DNA-Fragment mit einem zweiten Fragment mit ausreichender Spezifität hybridisiert, um die Identifizierung oder Isolierung des zweiten Fragments aus einer Vielzahl von Fragmenten zu erlauben. Im allgemeinen findet eine selektive Hybridisierung unter Bedingungen hoher Stringenz statt.
Wie hier verwendet, werden heterologe oder fremde DNA und RNA austauschbar verwendet und beziehen sich auf DNA oder RNA, welche nicht natürlicherweise als Teil des Genoms vorkommt, in dem sie vorliegt, oder welche an einer Stelle oder an Stellen in dem Genom gefunden wird, die sich von denen unterscheidet, an denen sie in der Natur vorkommt. Es ist DNA oder RNA, die nicht endogen für die Zelle ist und künstlich in die Zelle eingeführt wurde. Beispiele heterologer DNA schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, DNA, die für eine Calciumkanal-Untereinheit kodiert, und DNA, die für RNA oder Proteine kodiert, welche die Expression endogener DNA durch Beeinflussung der Transkription, Translation oder anderer regulierbarer biochemischer Prozesse vermittelt oder verändert. Die Zelle, welche die heterologe DNA exprimiert, wie z. B. eine Calciumkanal-Untereinheit, kann DNA enthalten, welche für die gleichen oder verschiedene Calciumkanal-Untereinheiten kodiert. Die heterologe DNA braucht nicht exprimiert zu werden und kann auf solche Weise eingeführt werden, daß sie in das Wirtszellgenom integriert wird oder episomal aufrechterhalten wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich die funktionsfähige Verknüpfung von heterologer DNA mit regulatorischen Sequenzen und Effektorsequenzen von Nukleotiden, wie z. B. Promotoren, Enhancer, transkriptionalen und translationalen Stoppstellen und anderen Signalsequenzen, auf die funktionelle Beziehung zwischen solcher DNA und solchen Nukleotidsequenzen. Beispielsweise bezieht sich die funktionsfähige Verknüpfung von heterologer DNA mit einem Promotor auf die physikalische und funktionelle Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, so daß die Transkription solcher DNA von dem Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, welche spezifisch die DNA im Leserahmen erkennt, bindet und transkribiert.
Wie hier verwendet, bezieht sich isolierte, im wesentlichen reine DNA auf DNA-Fragmente, die nach von Fachleuten angewandten Standardverfahren gereinigt wurden [siehe z. B. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].
Wie hier verwendet, bezieht sich Expression auf den Prozess, mit dem Nukleinsäure in mRNA transkribiert und in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert wird. Falls die Nukleinsäure von genomischer DNA stammt, kann die Expression das Splicing der mRNA einschließen, falls eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder geeigneter eukaryotischer Organismus ausgewählt wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich Vektor oder Plasmid auf diskrete Elemente, welche zur Einführung heterologer DNA in Zellen für entweder die Expression der heterologen DNA oder die Replikation der klonierten heterologen DNA verwendet werden. Die Selektion und Verwendung solcher Vektoren und Plasmide liegt ohne weiteres im Rahmen der Fachkenntnis.
Wie hier verwendet, schließt ein Expressionsvektor Vektoren ein, die zur Expression von DNA-Fragmenten in der Lage sind, welche sich in funktionsfähiger Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen, z. B. Promotorbereichen, befinden, welche zur Veranlassung der Expression solcher DNA-Fragmente in der Lage sind. Somit bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, z. B. ein Plasmid, ein Phage, rekombinantes Virus oder anderer Vektor, welches nach Einführung in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der klonierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind Fach leuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen diejenigen ein, welche in eukaryotischen Zellen und/oder prokaryotischen Zellen replizierbar sind, und diejenigen, welche episomal bleiben oder in das Wirtszellgenom integrieren können.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein Promotorbereich auf den Teil der DNA eines Gens, welcher die Transkription der DNA steuert, mit der er funktionsfähig verknüpft ist. Der Promotorbereich umfasst spezifische DNA-Sequenzen, welche zur RNA-Polymerase-Erkennung, -Bindung und Transkriptionsinitiation ausreichend sind. Dieser Teil des Promotorbereichs wird als der Promotor bezeichnet. Darüber hinaus schließt der Promotorbereich Sequenzen ein, welche diese Erkennungs-, Bindungs- und Transkriptionsinitiations-Aktivität der RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können cis wirken oder können auf trans-wirkende Faktoren ansprechbar sein. Promotoren können je nach Art der Regulation konstitutiv oder reguliert sein.
Wie hier verwendet, ist eine rekombinante eukaryotische Zelle eine eukaryotische Zelle, die heterologe DNA oder RNA enthält.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein rekombinanten oder heterologer Calciumkanal auf einen Calciumkanal, der eine oder mehrere Untereinheiten) enthält, die von heterologer DNA kodiert wird/werden, welche in eine eukarytische Zelle, die den rekombinanten Calciumkanal exprimiert, eingeführt und exprimiert wurde. Ein rekombinanten Calciumkanal kann auch Untereinheiten einschließen, welche von DNA gebildet werden, die für die Zelle endogen ist. In bestimmten Ausführungsformen kann der rekombinante oder heterologe Calciumkanal nur Untereinheiten enthalten, die von heterologer DNA kodiert werden.
Wie hier verwendet, bedeutet "funktionell" bezüglich eines rekombinanten oder heterologen Calciumkanals, daß der Kanal in der Lage ist, als Reaktion auf einen Stimulus für den Eintritt von calciumkanal-selektiven Ionen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ca²⁺ oder Ba²⁺, zu sorgen und diesen zu regulieren und/oder Liganden mit Affinität für den Kanal zu binden. Vorzugsweise ist eine solche Calciumkanal-Aktivität durch beispielsweise elektrophysiologische, pharmakologische und andere Mittel, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, von etwaiger endogener Calciumkanal-Aktivität unterscheidbar, die in der Wirtszelle vorliegt.
Wie hier verwendet, umfaßt ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen wie in einer speziellen SEQ-ID-Nr. angegeben ist, Peptide, welche dieselbe Funktion aufweisen, jedoch kleinere Variationen in der Sequenz einschließen können, wie z. B. konservative Aminosäureaustausche oder kleinere Deletionen oder Insertionen, welche die Aktivität des Peptids nicht ändern. Die Aktivität eines Calciumkanal-Rezeptor-Untereinheitspeptids bezieht sich auf dessen Vermögen, funktionelle Calciumkanäle mit anderen solchen Untereinheiten zu bilden.
Wie hier verwendet, ist eine physiologische Konzentration einer Verbindung diejenige, welche erforderlich und ausreichend ist, damit ein biologischer Prozess stattfindet. Beispielsweise ist eine physiologische Konzentration eines calciumkanal-selektiven Ions eine Konzentration des calciumkanal-selektiven Ions, welche erforderlich und ausreichend ist, um einen einwärts gerichteten Strom zu ergeben, wenn der Kanal offen ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Aktivität eines Calciumkanals auf die Bewegung eines calciumkanal-selektiven Ions durch einen Calciumkanal. Eine solche Aktivität kann mit irgendeinem Verfahren gemessen werden, das Fachleuten bekannt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die Messung der Strommenge, welche als Antwort auf einen Stimulus durch den rekombinanten Kanal fließt.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein "funktioneller Assay" auf einen Assay, welcher funktionelle Calciumkanäle identifiziert. Ein funktioneller Assay ist somit ein Assay zur Feststellung der Funktion.
Wie es sich für Fachleute auf dem Gebiet versteht, erfordern Assay-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, wie z. B. Antagonisten und Agonisten, welche Calciumkanal-Aktivität modulieren, im allgemeinen einen Vergleich mit einer Kontrolle. Ein Typ einer "Kontroll"-Zelle oder "Kontroll"-Kultur ist eine Zelle oder Kultur, welche im wesentlichen auf die gleiche Weise wie die Zelle oder Kultur behandelt wird, welche der Testverbindung ausgesetzt ist, mit Ausnahme dessen, daß die Kontrollkultur nicht der Testverbindung ausgesetzt ist. Ein weiterer Typ einer "Kontroll"-Zelle oder "Kontroll"-Kultur kann eine Zeile oder eine Kultur von Zellen sein, welche mit den transfizierten Zellen identisch sind, mit der Ausnahme, daß die für die Kontrollkultur eingesetzten Zellen keine funktionellen Calciumkanäle exprimieren. In diesem Fall wird die Reaktion der Testzelle auf die Testverbindung mit der Reaktion (oder mangelnden Reaktion) der calciumkanal-negativen Zelle auf die Testverbindung verglichen, wenn die Zellen oder Kulturen eines jeden Zelltyps im wesentlichen denselben Reaktionsbedingungen in Gegenwart der zu untersuchenden Verbindung unterworfen werden. Beispielsweise kann bei Verfahren, welche elektrophysiologische "Patch-Clamp"-Verfahren einsetzen, dieselbe Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der Testverbindung getestet werden, indem die äußere Badlösung der Zelle ausgetauscht wird, wie im Stand der Technik bekannt.

Es versteht sich auch, daß jede der hier offenbarten Untereinheiten modifiziert werden kann, indem konservative Aminosäuresubstitutionen vorgenommen werden, und die resultierenden modifizierten Untereinheiten werden hier in Betracht gezogen. Geeignete konservative Substitutionen von Aminosäuren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und können im allgemeinen ohne Veränderung der biologischen Aktivität des resultierenden Moleküls vorgenommen werden. Fachleute auf diesem Gebiet verstehen, daß im allge meinen einzelne Aminosäuresubstitutionen in nicht-essentiellen Bereichen eines Polypeptids die biologische Aktivität nicht wesentlich ändern (siehe z. B. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. Co., S. 224). Solche Substitutionen werden vorzugsweise, wenn auch nicht ausschließlich, entsprechend den in der folgenden TABELLE 1 angegebenen vorgenommen. TABELLE 1

ursprünglicher Rest	konservative Substitution
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys
Asn (N)	Gln; His
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (N)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; Gln; Glu
Met (M)	Leu; Tyr; Ile
Phe (F)	Met; Leu; Tyr
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

Andere Substitutionen sind ebenfalls zulässig und können empirisch oder entsprechend bekannten konservativen Substitutionen festgestellt werden. Eine beliebige solche Modifizierung des Polypeptids kann auf irgendeine Weise, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, durchgeführt werden. Eine Mutation kann mit irgendeinem Verfahren bewirkt werden, das Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, einschließlich stellenspezifischer oder stellengerichteter Mutagenese von DNA, welche für das Protein kodiert, und des Einsatzes von DNA-Amplifizierungsmethoden unter Verwendung von Primern, um Veränderungen in die DNA-Matrize einzuführen und zu amplifizieren.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodiert
Es werden Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für α₁-, α₂- und β-Untereinheiten von humanen Calciumkanälen kodiert, bereitgestellt.
Die Identifizierung und Isolierung solcher DNA kann erreicht werden durch Hybridisierung unter geeigneten Bedingungen bei mindestens niedriger Stringenz, wodurch DNA, welche für die gewünschte Untereinheit kodiert, isoliert wird, von restriktionsenzym-verdauter humaner DNA mit einer markierten Sonde, die mindestens 14, vorzugsweise 16 oder mehr, Nukleotide aufweist und die von irgendeinem zusammenhängenden Abschnitt von DNA stammt, die eine hier durch eine Sequenzidentifizierungsnummer angegebene Sequenz von Nukleotiden aufweist. Nachdem ein hybridisierendes Fragment bei der Hybridisierungsreaktion identifiziert worden ist, kann es unter Einsatz von Standardklonierungstechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, kloniert werden. Vollängen-Klone können durch das Vorhandensein eines vollständigen offenen Leserahmens identifiziert werden und die Identität des kodierten Proteins kann durch Sequenzvergleich mit den hier bereitgestellten Untereinheiten und durch funktionelle Assays, um das Vermögen zur Bildung eines Calciumkanals oder eine andere Funktion festzustellen, verifiziert werden. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, genomische DNA zu identifizieren, welche für die Untereinheit kodiert, oder cDNA, welche für Splice-Varianten von humanen Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, die durch alternatives Splicing des primären Transkripts von genomischer Untereinheits-DNA gebildet wurden. Beispielsweise kann DNA, cDNA oder genomische DNA, kodierend für eine Calciumkanal-Untereinheit, durch Hybridisierung mit einer DNA-Sonde identifiziert werden und mit Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie z. B. Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung, charakterisiert und mit der hier bereitgestellten DNA verglichen zu werden, um Heterogenität oder Divergenz in den Sequenzen der DNA festzustellen. Solche Sequenzunterschiede können anzeigen, daß die Transkripte, von denen die cDNA gebildet wurde, das Ergebnis des alternativen Splicings eines primären Transkripts sind, falls die nicht-homologen und homologen Bereiche Cluster bilden, oder von einem verschiedenen Gen stammen, falls die nicht-homologen Bereiche über die klonierte DNA verteilt sind.
Es kann jedes geeignete Verfahren zur Isolierung von Genen mit Hilfe der hier bereitgestellten DNA verwendet werden. Beispielsweise wurden Oligonukleotide, die Bereichen von Sequenzunterschieden entsprechen, zur Isolierung, durch Hybridisierung, von DNA, die für die Vollängen-Splice-Variante kodiert, eingesetzt und können zur Isolierung genomischer Klone verwendet werden. Eine Sonde, die auf einer hier offenbarten Nukleotidsequenz basiert, welche für mindestens einen Abschnitt einer Untereinheit eines humanen Calcium kanals kodiert, wie z. B. ein gewebespezifisches Exon, kann als Sonde zur Klonierung verwandter DNA verwendet werden, um einen cDNA-Klon oder einen genomischen Klon voller Länge, kodierend für die humane Calciumkanal-Untereinheit, zu klonen.
Markierte, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, radioaktiv oder enzymatisch markierte, RNA oder einzelsträngige DNA von mindestens 14 im wesentlichen zusammenhängenden Basen, vorzugsweise 16 oder mehr, im allgemeinen mindestens 30 zusammenhängenden Basen einer Nukleinsäure, welche für mindestens einen Teil einer humanen Calciumkanal-Untereinheit kodiert, wobei die Sequenz der Nukleinsäure einem Abschnitt einer hier durch Bezugnahme auf eine SEQ-ID-Nr. offenbarten Nukleinsäuresequenz entspricht, wird bereitgestellt. Solche Nukleinsäureabschnitte können als Sonden in den hier bereitgestellten Verfahren zur Klonierung von DNA, die für Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, eingesetzt werden. Siehe allgemein Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Darüber hinaus können Nukleinsäureamplifizierungstechniken, welche im Stand der Technik wohlbekannt sind, eingesetzt werden, um Splice-Varianten von Calciumkanal-Untereinheiten zu lokalisieren, indem Oligonukleotide, die auf DNA-Sequenzen basieren, welche die divergierenden Sequenzprimer umgeben, zur Amplifizierung von humaner RNA oder genomischen DNA eingesetzt werden. Größen- und Sequenzbestimmungen der Amplifizierungsprodukte können Splice-Varianten offenbaren. Ferner kann die Isolierung von humanen genomischen DNA-Sequenzen durch Hybridisierung DNA ergeben, die mehrere durch Introns getrennte Exons enthält, welche unterschiedlichen Splice-Varianten von Transkripten entsprechen, die für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodieren.
DNA, welche für Typen und Subtypen einer jeden der α₁-, α₂- und β-Untereinheiten von spannungsabhängigen humanen Calciumkanälen kodiert, wurde hier kloniert durch Nukleinsäureamplifizierung von cDNA aus ausgewählten Geweben oder durch Screenen von humanen cDNA-Banken, die aus isolierter Poly A+-mRNA aus Zellinien oder Gewebe menschlichen Ursprungs mit solchen Calciumkanälen erstellt worden waren. Unter den Quellen für solche Zellen oder solches Gewebe zum Erhalt von mRNA sind humanes Gehirngewebe oder eine humane Zelline neuronalen Ursprungs, wie z. B. eine Neuroblastom-Zellinie, humaner Skelettmuskel oder humane glatte Muskelzellen und dgl. Verfahren zur Erstellung von cDNA-Banken sind im Stand der Technik wohlbekannt [siehe allgemein Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York; und Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York].
Bevorzugte Bereiche, aus denen Sonden zu konstruieren sind, umfassen 5'- und/oder 3'-kodierende Sequenzen, Sequenzen, von denen vorausgesagt wird, daß sie für Transmembrandomänen kodieren, Sequenzen, von denen vorausgesagt wird, daß sie für zyto plasmatische Schleifen kodieren, Signalsequenzen, ligandenbindende Stellen und andere funktionell bedeutsame Sequenzen (siehe Tabelle unten). Entweder die vollständige, für eine Untereinheit kodierende DNA oder Fragmente davon können als Sonden eingesetzt werden, vorzugsweise mit einem geeigneten Markierungsmittel für den schnellen Nachweis markiert. Werden Fragmente als Sonden eingesetzt, so werden die DNA-Sequenzen bevorzugt typischerweise von dem für das Carboxylende kodierenden Abschnitt der DNA stammen und werden am meisten bevorzugt Abschnitte einschließen, die auf Grundlage einer Hydropathie-Analyse der abgeleiteten Aminsoäuresequenz für vorausgesagte Transmembrandomänen kodieren [siehe z. B. Kyte und Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 167: 105].
Es wurden Ribosonden hergestellt, welche spezifisch für humane Calciumkanal-Untereinheitstypen oder -subtypen sind. Diese Sonden eignen sich zur Identifizierung der Expression spezieller Untereinheiten in ausgewählten Geweben und Zellen. Die Bereiche, aus denen die Sonden hergestellt wurden, wurden durch Vergleich der DNA- und Aminosäuresequenzen aller bekannten α- oder β-Untereinheitssubtypen identifiziert. Regionen von minimaler Homologie, vorzugsweise Sequenzen humanen Ursprungs, und im allgemeinen von etwa 250 bis etwa 600 Nukleotiden, wurden ausgewählt. Es wurden zahlreiche Ribosonden für α- und β-Untereinheiten hergestellt, einige davon sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
TABELLLE 2 Zusammenfassung von RNA-Sonden
Die oben angegebenen Nukleotidbereiche sind auch von Nutzen bei der Auswahl von Bereichen des Proteins zur Herstellung von untereinheits-spezifischen Antikörpern, nachfolgend erläutert.
Die hier bereitgestellten DNA-Klone und Fragmente davon können somit zur Isolierung genomischer Klone eingesetzt werden, welche für jede Untereinheit kodieren, und zur Isolierung etwaiger Splice-Varianten durch Hybridisierungs-Screening von Banken, die aus verschiedenen humanen Geweben erstellt wurden. Nukleinsäureamplifizierungstechniken, welche im Stand der Technik wohlbekannt sind, können ebenfalls zur Lokalisierung von DNA eingesetzt werden, welche für Splice-Varianten von humanen Calciumkanal-Untereinheiten kodiert. Dies wird erreicht durch Einsatz von Oligonukleotiden, welche auf DNA-Sequenzen basieren, die (eine) divergente Sequenzen) umgeben, als Primer zur Amplifizierung von humaner RNA oder genomischer DNA. Größen- und Sequenzbestimmungen der Amplifizierungsprodukte können die Existenz von Splice-Varianten zeigen. Ferner kann die Isolierung von genomischen Human-DNA-Sequenzen durch Hybridisierung DNA ergeben, die mehrere durch Introns getrennte Exons enthält, welche verschiedenen Splice-Varianten von Trans-kripten entsprechen, die für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodieren.
Nachdem eine für eine Calciumkanal-Unterheit kodierende DNA isoliert worden ist, können Ribonuklease (RNase)-Schutz-Assays eingesetzt werden, um festzustellen, welche Gewebe mRNA exprimieren, die für eine spezielle Calciumkanal-Untereinheit oder -Variante kodiert. Dieses Assays bieten ein empfindliches Mittel zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung einer RNA-Spezies in einer komplexen Mischung von zellulärer Gesamt-RNA.
Die Untereinheits-DNA wird markiert und mit zellulärer RNA hybridisiert. Falls komplementäre mRNA in der zellulären RNA vorhanden ist, resultiert ein DNA-RNA-Hybrid. Die RNA-Probe wird dann mit RNase behandelt, welche einzelsträngige RNA abbaut. Etwaige RNA-DNA-Hybride werden vor RNase-Abbau geschützt und können mittels Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht werden. In situ-Hybridisierungstechniken können ebenfalls eingesetzt werden, um festzustellen, welche Gewebe mRNA exprimieren, die für eine spezielle Calciumkanal-Untereinheit kodiert. Die markierten Untereinheit-DNAs werden mit verschiedenen Gewebescheiben hybridisiert, um die Untereinheits-mRNA-Expression sichtbar zu machen.
Bezüglich jeder der jeweiligen Untereinheiten (α₁, α₂, β oder γ) von humanen Calciumkanälen wurde, nachdem die für die Kanal-Untereinheit kodierende DNA mit einem Nukleinsäure-Screening-Verfahren identifiziert wurde, der isolierte Klon für das weitere Screening zur Identifizierung überlappender Klone eingesetzt. Einige der klonierten DNA-Fragmente können in einen geeigneten Vektor, z. B. pIBI24/25 (IBI, New Haven, CT), M13mp18/19, pGEM4, pGEM3, pGEM7Z, pSP72 und andere solche Vektoren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung und Restriktionsenzym-Kartierung charakterisiert werden und wurden es. Eine sequentielle Reihe von überlappenden Klonen kann so für jede der Untereinheiten erzeugt werden, bis ein Vollängen-Klon mit Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren, welche die Identifizierung von Translationsinitiations (Start)- und Translationsterminations (Stopp)-Codons einschließen, hergestellt werden kann. Zur Expression der klonierten DNA kann der 5'-nicht-kodierende Bereich und andere transkriptionale und translationale Kontrollbereiche eines solchen Klons durch eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und andere regulatorische Bereiche, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, ersetzt werden. Andere Fachleuten bekannte Modifizierungen des 5'-Endes, welche erforderlich sein können, um die Translations- und/oder Transkriptionseffizienz zu optimieren, können ebenfalls vorgenommen werden, falls dies als erforderlich erachtet wird.
Die Beispiele II–VIII unten beschreiben detailliert die Klonierung einer jeden der verschiedenen Untereinheiten eines humanen Calciumkanals sowie Subtypen und Splice-Varianten, einschließlich gewebespezifischer Varianten davon. In den wenigen Fällen, in denen partielle Sequenzen einer Untereinheit offenbart werden, liegt es in Anbetracht der hier gebotenen Lehre ohne weiteres im Rahmen der Fachkenntnis, die entsprechenden Vollängen-Klone und die Sequenz davon, welche für die Untereinheit, den Subtyp oder die Splice-Variante davon kodiert, mit Hilfe der oben beschriebenen und im folgenden beispielhaft erläuterten Verfahren zu erhalten.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für α₁-Untereinheiten kodiert
Eine Reihe von α₁-Untereinheits-Genen spannungsabhängiger Calciumkanäle, welche im humanen ZNS und in anderen Geweben exprimiert werden, wurden identifiziert und als α_1A, α_1B (oder VDCC IV), α_1C (oder VDCC II), α_1D (oder VDCC III) und α_1E bezeichnet. Es wurde aus einer humanen neuronalen cDNA-Bank isolierte DNA isoliert, welche für jede der Untereinheitssubtypen kodiert. DNA, kodierend für Subtypen eines jeden der Typen, die sich als Splice-Varianten ergeben, wird ebenfalls bereitgestellt. Die Subtypen werden hier beispielsweise als α_1B–1, α_1B–2 bezeichnet.
Die α₁-Untereinheitstypen A, B, C, D und E von spannungsabhängigen Calciumkanälen und Untereinheiten und Subtypen davon unterscheiden sich bezüglich der Sensitivität gegenüber bekannten Klassen von Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten, wie z. B. DHPs, Phenylalkylaminen, Omega-Conotoxin (ω-CgTx), dem Trichternetzspinnentoxin ω-Aga-IV und Pyrazonoylguanidinen. Diese Untereinheitstypen scheinen sich auch im Haltepotential und in der Kinetik der nach Depolarisation von Zellmembranen, die Calciumkanäle enthalten, welche unterschiedliche Typen von α₁-Untereinheiten umfassen, produzierten Ströme zu unterscheiden.
Es wird DNA bereitgestellt, welche für eine α₁-Untereinheit kodiert, die an mindestens eine Verbindung bindet, die aus Dihydropyridinen, Phenylalkylaminen, ω-CgTx, Komponenten von Trichternetzspinnentoxin und Pyrazonoylguanidinen ausgewählt ist. Beispielsweise scheint die hier bereitgestellte α_1B-Untereinheit spezifisch mit ω-CgTx in Kanälen vom N-Typ zu Wechselwirken und die hier bereitgestellte α_1D-Untereinheit wechselwirkt spezifisch mit DHPs in Kanälen vom L-Typ.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α_1D-Calciumkanal-Untereinheit kodiert
Die α_1D-Untereinheits-cDNA wurde isoliert unter Verwendung von Fragmenten der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₁-Untereinheits-cDNA als Sonde zum Screenen einer cDNA-Bank einer humanen Neuroblastom-Zellinie, IMR32, um den Klon α1.36 zu erhalten. Dieser Klon wurde als Sonde zum Screenen zusätzlicher IMR32-Zell-cDNA-Banken eingesetzt, um überlappende Klone zu erhalten, welche dann zum Screenen eingesetzt wurden, bis eine ausreichende Reihe von Klonen erhalten wurde, um die Länge der Nukleotidsequenz, welche für die humane α_1D-Untereinheit kodiert, zu überspannen. Vollängen-Klone, die für α_1D kodierten, wurden durch Ligierung von Abschnitten partieller α_1D-Klone wie in Beispiel II beschrieben konstruiert. SEQ-ID-Nr. 1 zeigt die Sequenz von 7635 Nukleotiden der cDNA, welche für die α_1D-Untereinheit kodiert. Es gibt einen Leserahmen mit einer Sequenz von 6483 Nukleotiden, welcher für eine Sequenz von 2161 Aminosäuren kodiert (wie in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben).
SEQ-ID-Nr. 2 stellt die Sequenz eines alternativen Exons bereit, welches für die IS6-Transmembrandomäne [siehe Tanabe, T., et al. (1987), Nature 328: 313–318, hinsichtlich einer Beschreibung der Transmembrandomänen-Terminologie] der α_1D-Untereinheit kodiert.
SEQ-ID-Nr. 1 zeigt auch die Sequenz von 2161 Aminosäuren, die von der humanen neuronalen Calciumkanal-α_1D-Untereinheits-DNA abgeleitet ist. Basierend auf der Aminosäuresequenz, hat das α_1D-Protein ein berechnetes Molekulargewicht Mr von 245.163. Die α_1D-Untereinheit des Calciumkanals enthält vier mutmaßliche, interne, wiederholte Sequenzbereiche. Vier intern wiederholte Bereiche repräsentieren 24 mutmaßliche Transmembransegmente und die Amino- und Carboxyltermini reichen in die Zelle hinein.
Von der α_1D-Untereinheit wurde gezeigt, daß sie DHP-sensitive, durch hohe Spannung aktivierte, anhaltende Calciumkanal-Aktivität vermittelt. Diese Calciumkanal-Aktivität wurde nachgewiesen, wenn Oozyten RNA-Transkripte, die für α_1D- und β_1-2- oder α_1D-, α_2b und β_1-2-Untereinheiten kodierten, coinjiziert wurden. Diese Aktivität wurde von Ba²⁺-Strömen unterschieden, die nachgewiesen wurden, wenn Oozyten RNA-Transkripte injiziert wurden, die für die β_1-2± α_2b-Untereinheiten kodierten. Diese Ströme entsprachen pharmakologisch und biophysikalisch den Ca²⁺-Strömen, die für Oozyten ohne Injektion berichtet wurden.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α_1A-Calciumkanal-Untereinheit kodiert
Biologisches Material, enthaltend DNA, die für einen Teil der α_1A-Untereinheit kodiert, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der Internationalen Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens und der gemäß diesem Vertrag bekanntgemachten Regeln hinterlegt. Proben des hinterlegten Materials sind für Patentämter und andere Personen, die gemäß den Bedingungen des Vertrags und der Regeln gesetzlich zu deren Empfang ermächtigt sind, jetzt und in Zukunft verfügbar und ansonsten in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen und Regelwerken der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderen Nationen oder internationalen Organisationen, bei denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird oder bei denen irgendein Patent, das auf irgendeiner solchen Anmeldung beruht, erteilt wird.
Ein Teil einer α_1A-Untereinheit wird von einem etwa 3-kb-Insert in dem λgt10-Phagen mit der Bezeichnung α1.254 in dem E. coli-Wirtsstamm NM514 kodiert. Ein Phagenlysat dieses Materials wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC- Hinterlegungs-Nr. 75293 wie oben beschrieben hinterlegt. DNA, welche für α_1A kodiert, kann auch durch Screenen mit einer Sonde identifiziert werden, welche anhand von DNA hergestellt wurde, welche die SEQ-ID-Nr. 21 hat:
Es wurden α_1A-Splice-Varianten erhalten. Die Sequenzen der beiden α_1A-Splice-Varianten α_1a–1 und α_1a–2 sind in den SEQ-ID-Nrn. 22 und 23 angegeben. Andere Splice-Varianten können durch Screenen einer Human-Bank wie oben beschrieben oder durch Verwendung der Gesamtheit oder eines Abschnitts der in den SEQ-ID-Nrn. 22 und 23 angegebenen Sequenzen erhalten werden.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α_1B-Calciumkanal-Untereinheit kodiert
DNA, welche für die α_1B-Untereinheit kodiert, wurde durch Screenen einer Human-Basalganglien-cDNA-Bank mit Fragmenten der für die Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₁-Untereinheit kodierenden cDNA isoliert. Ein Abschnitt eines der positiven Klone wurde zum Screenen einer IMR32-Zell-cDNA-Bank eingesetzt. Klone, welche mit der Basalganglien-DNA-Sonde hybridisierten, wurden für das weitere Screening einer IMR32-Zell-cDNA-Bank eingesetzt, um überlappende Klone zu identifizieren, welche wiederum zum Screenen einer Human-Hippocampus-cDNA-Bank eingesetzt wurden. Auf diese Weise wurde eine ausreichende Reihe von Klonen erhalten, um nahezu die gesamte Länge der Nukleotidsequenz, welche für die humane α_1B-Untereinheit kodiert, zu überspannen. Eine Nukleinsäureamplifizierung von spezifischen Regionen der IMR32-Zell-α_1B-mRNA ergab zusätzliche Segmente der für α_1B kodierenden Sequenz.
Ein Vollängen-α_1B-DNA-Klon wurde durch Ligierung von Abschnitten der partiellen cDNA-Klone wie in Beispiel II.C beschrieben konstruiert. SEQ-ID-Nrn. 7 und 8 zeigen die Nukleotidsequenzen von DNA-Klonen, welche für die α_1B-Untereinheit kodieren, sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Die von SEQ-ID-Nr. 7 kodierte α_1B-Untereinheit wird als die α_1B–1-Untereinheit bezeichnet, um sie von einer anderen α_1B-Untereinheit, α_1B–2, zu unterscheiden, die von der als SEQ-ID-Nr. 8 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert wird, welche von einem alternativen Splicing des α_1B-Untereinheits-Transkripts stammt.
Eine Nukleinsäureamplifizierung von IMR32-Zell-mRNA unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, welche anhand von Nukleotidsequenzen innerhalb der für α_1B–1 kodierenden DNA konstruiert wurden, identifizierte Varianten des α_1B-Transkripts, welche Splice-Varianten zu sein scheinen, da sie divergente kodierende Sequenzen enthalten.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α_1C-Calciumkanal-Untereinheit kodiert
Es wurden zahlreiche α_1C-spezifische DNA-Klone isoliert. Eine Charakterisierung der Sequenz offenbarte die für α_1C kodierende Sequenz, die α_1C-Translationsinitiationssequenz und eine alternativ gesplicte Region von α_1C. Es wurden alternativ gesplicte Varianten der α_1C-Untereinheit identifiziert. SEQ-ID-Nr. 3 gibt DNA an, die für einen wesentlichen Anteil einer α_1C-Untereinheit kodiert. Die in SEQ-ID-Nr. 4 und Nr. 5 angegebenen DNA-Sequenzen kodieren für zwei mögliche aminoterminale Enden des α_1C-Proteins. SEQ-ID-Nr. 6 kodiert für ein alternatives Exon für die IV S3-Transmembrandomäne. Die Sequenzen von substantiellen Anteilen von zwei α_1C-Splice-Varianten, als α_1C–1 und α_1C–2 bezeichnet, sind in den SEQ-ID-Nrn. 3 bzw. 36 angegeben.
Die Isolierung und Identifizierung von DNA-Klonen, welche für Teile der α_1C-Untereinheit kodieren, wird detailliert in Beispiel II beschrieben.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α_1E-Calciumkanal-Untereinheit kodiert
DNA, welche für humane α_1E-Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, wurde aus einer oligo-dT-geprimten Human-Hippocampus-Bank isoliert. Die resultierenden Klone, welche Splice-Varianten sind, wurden als α_1E–1 und α_1E–3 bezeichnet. Die Untereinheit mit der Bezeichnung α_1E–1 besitzt die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz und eine Untereinheit mit der Bezeichnung α_1E–3 besitzt die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz. Diese Splice-Varianten unterscheiden sich durch ein 57-Basenpaar-Insert zwischen den Nukleotiden 2405 und 2406 von SEQ-ID-Nr. 24.
Die hier bereitgestellten α_1E-Untereinheiten scheinen an der Bildung von Calciumkanälen beteiligt zu sein, welche Eigenschaften von durch hohe Spannung aktivierten Calciumkanälen und durch niedrige Spannung aktivierten Kanälen aufweisen. Diese Kanäle werden im Vergleich zu anderen durch hohe Spannung aktivierten Calciumkanälen schnell inaktiviert. Darüber hinaus zeigen diese Kanäle pharmakologische Profile, welche spannungsaktivierten Kanälen ähnlich sind, jedoch auch sensitiv gegenüber DHPs und ω-Aga-IVA sind, welche bestimmte, durch hohe Spannung aktivierte Kanäle blockieren. Zusätzliche Details bezüglich der Elektrophysiologie und Pharmakologie von Kanälen, welche α_1E-Untereinheiten enthalten, werden in Beispiel VII. F. geliefert.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für zusätzliche humane α₁-Calciumkanal-Untereinheitstypen und -subtypen kodiert
DNA, welche für zusätzliche α₁-Untereinheiten kodiert, kann unter Verwendung der hier bereitgestellten DNA wie für die α_1A-, α_1B-, α_1C-, α_1D- und α_1E-Untereinheiten beschrieben oder unter Verwendung anderer Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, isoliert und identifiziert werden. Insbesondere kann die hier bereitgestellte DNA zum Screenen geeigneter Banken für die Isolierung verwandter DNA eingesetzt werden. Vollängen-Klone können mit Hilfe von Verfahren wie den hier beschriebenen konstruiert werden und die resultierenden Untereinheiten durch Vergleich ihrer Sequenzen und elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften mit den hier beispielhaft erläuterten Untereinheiten charakterisiert werden.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für humane β-Calciumkanal-Untereinheiten kodiert
DNA, welche für β₁ kodiert
Zur Isolierung von DNA, welche für die β₁-Untereinheit kodiert, wurde eine Human-Hippocampus-cDNA-Bank mittels Hybridisierung gegen ein DNA-Fragment, das für eine Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-β-Untereinheit kodierte, gescreent. Ein hybridisierender Klon wurde ausgewählt und wiederum verwendet, um überlappende Klone zu isolieren, bis die überlappenden Klone, die DNA umfaßten, welche für die gesamte humane Calciumkanal-β-Untereinheit kodierte, isoliert und sequenziert wurden.
Fünf alternativ gesplicte Formen der humanen Calciumkanal-β₁-Untereinheit wurden identifiziert und für eine Reihe von Formen kodierende DNA wurde isoliert. Diese Formen werden als β_1-1, exprimiert im Skelettmuskel, β_1-2, exprimiert im ZNS, β_1-3, ebenfalls im ZNS exprimiert, β_1-4, exprimiert in Aortagewebe und HEK 293-Zellen, und β_1-5, exprimiert in HEK 293-Zellen, bezeichnet. Vollängen-DNA-Klone, kodierend für die β_1-2- und β_1-3-Untereinheiten wurden konstruiert. Die Untereinheiten β_1-1, β_1-2, β_1-4 und β_1-5 wurden durch Nukleinsäure-Amplifizierungsanalyse als alternativ gesplicte Formen der β-Untereinheit identifiziert. Sequenzen der β₁-Splice-Varianten werden in den SEQ-ID-Nrn. 9, 10 und 33–35 angegeben.
DNA, welche für β₂ kodiert
DNA, welche für die β₂-Splice-Varianten kodiert, wurde erhalten. Diese Splice-Varianten schließen β_2C-β_2E ein. Die Splice-Varianten β_2C-β_2E umfassen die gesamte Sequenz, die in SEQ-ID-Nr. 26 angegeben ist, mit Ausnahme des Abschnittes am 5'-Ende (bis Nukleotid 182), der sich bei den Splice-Varianten unterscheidet. Die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Sequenz kodiert für β_2D. Weitere Splice-Varianten können unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Oligonukleotide, welche die Gesamtheit oder Abschnitte der in SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Sequenz umfassen, isoliert werden oder können wie in den Beispielen beschrieben hergestellt oder erhalten werden. Die Sequenzen der β₂-Splice-Varianten β_2C und β_2E sind in den SEQ-ID-Nrn. 37 bzw. 38 angegeben.
DNA, welche für β₃ kodiert
DNA, welche für die β₃-Untereinheit kodiert, und irgendwelche Splice-Varianten davon können durch Screenen einer Bank, wie oben für die β₁-Untereinheit beschrieben, unter Verwendung von DNA-Sonden, die anhand der SEQ-ID-Nrn. 19, 20 hergestellt wurden, oder unter Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils des hinterlegten β₃-Klon-Plasmids β1.42 (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69048) Isoliert werden.
Der E. coli-Wirt, der das Plasmid β1.42 enthält, welches DNA umfaßt, die für eine β₃-Untereinheit kodiert, wurde als ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69048 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der Internationalen Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens und der gemäß diesem Vertrag bekanntgemachten Regeln hinterlegt. Proben des hinterlegten Materials sind für Patentämter und andere Personen, die gemäß den Bedingungen des Vertrags und der Regeln gesetzlich zu deren Empfang ermächtigt sind, jetzt und in Zukunft verfügbar und ansonsten in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen und Regelwerken der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderen Nationen oder internationalen Organisationen, bei denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird oder bei denen irgendein Patent, das auf irgendeiner solchen Anmeldung beruht, erteilt wird.
Das für β₃ kodierende Plasmid wird als β1.42 bezeichnet. Das Plasmid enthält ein für β₃ kodierendes 2,5-kb-EcoRI-Fragment, inseriert in den Vektor pGem7zF(+), und wurde in dem E. coli-Wirtsstamm DH5α hinterlegt. Die Sequenzen von β₃-Splice-Varianten, als β_3–1 und β_3–2 bezeichnet, sind in den SEQ-ID-Nrn. 19 bzw. 20 angegeben.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α₂-Calciumkanal-Untereinheit kodiert
DNA, welche für eine humane neuronale Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodiert, wurde auf eine Weise isoliert, die derjenigen zur Isolierung von DNA, welche für eine α₁-Untereinheit kodierte, im wesentlichen ähnlich war, mit der Ausnahme, daß eine genomische Human-DNA-Bank unter Bedingungen niedriger und hoher Stringenz mit einem Fragment von DNA sondiert wurde, welches für die Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodierte. Das Fragment umfaßte Nukleotide mit einer Sequenz, die der Nukleotidsequenz zwischen den Nukleotiden 43 und 272, einschließlich, der Kaninchenrücken-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₂-Untereinheits-cDNA, wie offenbart in der internationalen PCT-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 89/09834, entsprach.
Beispiel IV beschreibt die Isolierung von DNA-Klonen, welche für α₂-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodieren, aus einer Human-DNA-Bank unter Verwendung von genomischer DNA und cDNA-Klonen, identifiziert durch Hybridisierung mit der genomischen DNA, als Sonden.
Die SEQ-ID-Nrn. 11 und 29–32 zeigen die Sequenz von DNA, welche für α₂-Untereinheiten kodiert. Wie in Beispiel V beschrieben, identifizierte eine Nukleinsäureamplifizierungsanalyse von RNA aus humanem(r) Skelettmuskel, Gehirngewebe und Aorta unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, welche spezifisch für eine Region der humanen neuronalen α₂-Untereinheits-cDNA waren, die sich von der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₂-Untereinheits-cDNA unterscheidet, Splice-Varianten des humanen Calciumkanal-α₂-Untereinheits-Transkripts.
Antikörper
Antikörper, monoklonal oder polyklonal, welche für Calciumkanal-Untereinheitssubtypen oder für Calciumkanal-Typen spezifisch sind, können unter Anwendung von Standardtechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, unter Verwendung der Untereinheitsproteine oder von Teilen davon als Antigene hergestellt werden. Anti-Peptid- und Anti-Fusionsprotein-Antikörper können eingesetzt werden (siehe beispielsweise Bahouth et al. (1991), Trends Pharmacol. Sci. 12: 338–343; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg.), John Wiley and Sons, New York (1984)]. Faktoren zur Berücksichtigung bei der Auswahl von Abschnitten der Calciumkanal-Untereinheiten zur Verwendung als Immunogene (entweder als synthetisches Peptid oder als rekombinant hergestelltes bakterielles Fusionsprotein) beinhalten Antigenizität, Zugänglichkeit (d. h. extrazelluläre und zytoplasmatische Domänen), Einzigartigkeit für die spezielle Untereinheit und andere Faktoren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind.
Die Verfügbarkeit von untereinheits-spezifischen Antikörpern ermöglicht die Anwendung der Technik der Immunhistochemie, um die Verteilung und Expressionsdichte verschiedener Untereinheiten (z. B. in normalem gegenüber erkranktem Gehirngewebe) zu überprüfen. Solche Antikörper könnten auch bei diagnostischen Anwendungen, z. B. LES-Diagnose, und therapeutischen Anwendungen, wie z. B. Verwendung von Antikörpern, welche Aktivitäten von Calciumkanälen modulieren, eingesetzt werden.
Die Antikörper können einem Individuum unter Anwendung von Standardverfahren, z. B. mittels intraperitonealer, intramuskulärer, intravenöser oder subkutaner Injektion, Implantate oder transdermaler Verabreichungsweisen und dgl., verabreicht werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann empirisch Dosierungsformen, Behandlungspläne etc. in Abhängigkeit von der Art der eingesetzten Verabreichung festlegen.
Es wurden untereinheits-spezifische monoklonale Antikörper und polyklonale Antiseren hergestellt. Die Bereiche, von denen die Antigene stammten, wurden durch Vergleich der DNA- und Aminosäuresequenzen aller bekannten α- oder β-Untereinheitssubtypen identifiziert. Es wurden Bereiche der geringsten Homologie, vorzugsweise Sequenzen humanen Ursprungs, ausgewählt. Die ausgewählten Bereiche oder Fusionsproteine, welche die ausgewählten Bereiche enthalten, werden als Immunogene verwendet. Hydrophobizitäts-Analysen von Resten in ausgewählten Proteinbereichen und Fusionsproteinen werden ebenfalls durchgeführt; Bereiche hoher Hydrophobizität werden vermieden. Von größerer Bedeutung ist auch, daß bei der Herstellung von Fusionsproteinen in bakteriellen Wirten seltene Codons vermieden werden. Insbesondere wird der Einschluß von 3 oder mehr aufeinanderfolgenden seltenen Codons in einem gewählten Wirt vermieden. Zahlreiche Antikörper, polyklonal und monoklonal, die für α- oder β-Untereinheitstypen oder -subtypen spezifisch sind, wurden hergestellt; einige davon sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Beispielhafte Antikörper und Peptid-Antigene, welche zur Herstellung der Antikörper verwendet wurden, sind in der folgenden Tabelle angegeben:
TABELLE 3
Die GST-Fusionsproteine sind jeweils spezifisch für die zytoplasmatische Schleifenregion IIS6-IIS1, welche eine Region niedriger Subtypenhomologie für alle Subtypen darstellt, einschließlich α_1C und α_1D, für welche ähnliche Fusionen und Antiseren hergestellt werden können.
Herstellung von rekombinanten eukaryotischen Zellen, welche für heterologe Calciumkanal-Untereinheiten kodierende DNA enthalten
DNA, welche für eine oder mehrere der Calciumkanal-Untereinheiten oder einen Teil einer Calciumkanal-Untereinheit kodiert, kann zur Expression oder Replikation der DNA in eine Wirtszelle eingeführt werden. Eine solche DNA kann unter Anwendung von Verfahren, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden, oder unter Anwendung anderer Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, eingeführt werden. Die Inkorporation von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion eukaryotischer Zellen mit einem Plasmidvektor oder einer Kombination von Plasmidvektoren, die jeweils für ein unterschiedliches Gen oder mehrere unterschiedliche Gene kodieren, oder mit linearer DNA und die Selektion transfizierter Zellen sind ebenfalls im Stand der Technik wohlbekannt (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Klonierte Vollängen-DNA, die für irgendeine der Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, kann in einen Plasmidvektor zur Expression in einer eukaryotischen Zelle eingeführt werden. Eine solche DNA kann genomische DNA oder cDNA sein. Wirtszellen können mit einem oder einer Kombination der Plasmide transfiziert werden, wovon jedes für mindestens eine Calciumkanal-Untereinheit kodiert. Alternativ können Wirtszellen unter Anwendung von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, mit linearer DNA transfiziert werden.
Während die hier bereitgestellte DNA in irgendeiner eukaryotischen Zelle, einschließlich Hefezellen, wie z. B. P. pastoris [siehe z. B. Cregg et al. (1987), Bio/Technology 5: 479], exprimiert werden kann, sind Säuger-Expressionssysteme für die Expression der DNA, welche für die hier bereitgestellten humanen Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, bevorzugt.
Die heterologe DNA kann nach irgendeinem Verfahren, das Fachleuten bekannt ist, wie z. B. Transfektion mit einem für die heterologe DNA kodierenden Vektor, eingeführt werden. Besonders bevorzugte Vektoren zur Transfektion von Säugerzellen sind die pSVdhfr-Expressionsvektoren, die den frühen SV40-Promotor, das Maus-dhfr-Gen, SV40-Polyadenylierungs- und Splicestellen und Sequenzen, welche für die Aufrechterhaltung des Vektors in Bakterien erforderlich sind, enthalten, Vektoren auf Basis des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors, wie z. B. pCDNA1 oder pcDNA-amp, und Vektoren auf Basis des MMTV-Promotors. DNA, welche für die humanen Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, wurde in den Vektor pcDNA1 an einer Position unmittelbar nach dem CMV-Promotor inseriert. Der Vektor pCDNA1 ist derzeit bevorzugt.
Stabil oder vorübergehend transfizierte Säugerzellen können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden durch Transfektion von Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein selektierbares Markergen aufweist, wie z. B. das Gen für Thymidinkinase, Dihydrofolatreduktase, Neomycinresistenz und dgl., und, zur vorübergehenden Transfektion, Züchtung der transfizierten Zellen unter Bedingungen, welche für Zellen selektiv sind, die das Markergen exprimieren. Funktionelle spannungsabhängige Calciumkanäle wurden in HEK 293-Zellen gebildet, die mit einem Derivat des Vektors pCDNA1, welches für eine humane Calciumkanal-Untereinheit kodierende DNA enthält, transfiziert worden waren.
Die heterologe DNA kann in der Zelle als episomales Element aufrechterhalten werden oder in chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Die resultierenden rekombinanten Zellen können dann aus einer solchen Kultur oder Subkultur davon kultiviert oder subkultiviert werden (oder, im Falle von Säugerzellen, Passagen unterworfen werden). Verfahren zur Transfektion, Injektion und Kultivierung rekombinanter Zellen sind dem geschulten Fachmann bekannt. Eukaryotische Zellen, in die DNA oder RNA eingeführt werden kann, schließen beliebige Zellen ein, die mit einer solchen DNA oder RNA transfiziert werden können oder in die solche DNA injiziert werden kann. Praktisch jede eukaryotische Zelle kann als Vehikel für heterologe DNA dienen. Bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche auch die DNA und RNA exprimieren können, und die am meisten bevorzugten Zellen sind diejenigen, die rekombinante oder heterologe Calciumkanäle bilden können, welche eine oder mehrere Untereinheiten) einschließen, die von der heterologen DNA kodiert wird/werden. Solche Zellen können empirisch identifiziert werden oder aus denjenigen ausgewählt werden, von denen bekannt ist, daß sie unschwer einer Transfektion oder Injektion zu unterwerfen sind. Bevorzugte Zellen zur Einführung von DNA schließen diejenigen ein, welche vorübergehend oder stabil transfiziert werden können, und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zellen, die von Säugern stammen, wie z. B. COS-Zellen, Maus-L-Zellen, CHO-Zellen, Humanembryo-Nierenzellen, Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze und andere solche Zellen, die Fachleuten bekannt sind, Amphibienzellen, z. B.
Xenopus laevis-Oozyten, oder diejenigen von Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Bevorzugte Zellen zur Expression von injizierten RNA-Transkripten oder cDNA schließen Xenopus laevis-Oozyten ein. Zur Transfektion von DNA bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche unschwer und effizient transfiziert werden können. Solche Zellen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt oder können empirisch identifiziert werden. Bevorzugte Zellen schließen DG44-Zellen und HEK 293-Zellen ein, insbesondere HEK 293-Zellen, welche in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann aufgetaut und erneut gezüchtet werden können. Solche HEK 293-Zellen werden beispielsweise im US-Patent Nr. 5,024,939 von Gorman beschrieben ([siehe auch Stillman et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 2051–2060].
Die Zellen können als Vehikel zur Replikation von darin eingeführter heterologen DNA oder zur Expression der darin eingeführten heterologen DNA verwendet werden. Bei bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen als Vehikel zur Expression der heterologen DNA als Mittel zur Herstellung im wesentlichen reiner humaner Calciumkanal-Untereinheiten oder heterologen Calciumkanäle eingesetzt. Wirtszellen, welche die heterologe DNA enthalten, können unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen die Calciumkanäle exprimiert werden. Die Calciumkanal-Untereinheiten können mit Hilfe von Proteinreinigungsverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper, wie z. B. die hier bereitgestellten, welche spezifisch an eine oder mehrere der Untereinheiten binden, für die Affinitätsreinigung der Untereinheit oder der Calciumkanäle, welche die Untereinheiten enthalten, eingesetzt werden.
Im wesentlichen reine Untereinheiten von humanen Calciumkanal-α₁-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals, α₂-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals und β-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals werden bereitgestellt. Im wesentlichen reine isolierte Calciumkanäle, welche mindestens eine der humanen Calciumkanal-Untereinheiten enthalten, werden ebenfalls bereitgestellt. Im wesentlichen reine Calciumkanäle, welche eine Mischung von einer oder mehreren Untereinheit(en), die von der Wirtszelle kodiert wird/werden, und einer oder mehreren Untereinheit(en), die von heterologen DNA oder RNA, welche in die Zelle eingeführt wurde, kodiert wird/werden, enthalten, werden ebenfalls bereitgestellt. Es werden auch im wesentlichen reine subtyp- oder gewebespezifische Calciumkanäle bereitgestellt.
In anderen Ausführungsformen werden eukaryotische Zellen bereitgestellt, die heterologe DNA enthalten, welche für mindestens eine von einer α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, einer α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals und einer β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die heterologe DNA in der eukaryotischen Zelle exprimiert und kodiert vorzugsweise für eine humane Calciumkanal-α₁-Untereinheit.
Expression heterologer Calciumkanäle: Elektrophysiologie und Pharmakologie
Elektrophysiologische Verfahren zur Messung von Calciumkanal-Aktivität sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und hier beispielhaft erläutert. Beliebige solche Verfahren können eingesetzt werden, um die Bildung funktioneller Calciumkanäle nachzuweisen und die Kinetiken und anderen charakteristischen Eigenschaften der resultierenden Ströme zu charakterisieren. Pharmakologische Studien können mit den elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden, um die Calciumkanäle weiter zu charakterisieren.
Bezüglich der Messung der Aktivität funktioneller heterologer Calciumkanäle kann vorzugsweise die endogene Ionenkanal-Aktivität und gewünschtenfalls die heterologe Kanal-Aktivität von Kanälen, welche nicht die gewünschten Untereinheiten enthalten, einer Wirtszelle bis zu einem beträchtlichen Maß durch chemische, pharmakologische und elektrophysiologische Mittel, einschließlich des Einsatzes eines unterschiedlichen Haltepotentials, um das S/N-Verhältnis der gemessenen Aktivität heterologer Calciumkanäle zu erhöhen, inhibiert werden.
Somit werden verschiedene Kombinationen von Untereinheiten, welche von der hier bereitgestellten DNA kodiert werden, in eukaryotische Zellen eingeführt. Die resultierenden Zellen können überprüft werden, um festzustellen, ob funktionelle Kanäle exprimiert werden, und um die Eigenschaften der Kanäle festzustellen. In besonders bevorzugten Aspekten exprimiert die eukaryotische Zelle, welche die heterologe DNA enthält, diese und entfaltet eine rekombinante funktionelle Calciumkanal-Aktivität. In bevorzugteren Aspekten ist die rekombinante Calciumkanal-Aktivität unschwer nachweisbar, da sie ein Typ ist, welcher bei der untransfizierten Wirtszelle fehlt, oder von einer Größe ist und/oder pharmakologische Eigenschaften besitzt oder biophysikalische Eigenschaften aufweist, welche die untransfizierte Zelle nicht zeigt.
Die eukaryotischen Zellen können mit verschiedenen Kombinationen der hier bereitgestellten Untereinheitssubtypen transfiziert werden. Die resultierenden Zellen werden eine gleichbleibende Population von Calciumkanälen zur Untersuchung der Calciumkanal-Aktivität und zur Verwendung bei den hier bereitgestellten Arzneiwirkstoff-Screening-Assays liefern. Durchgeführte Experimente haben die Unzulänglichkeit früherer Klassifizierungsschemata demonstriert.
Bevorzugt unter den transfizierten Zellen ist eine rekombinante eukaryotische Zelle mit einem funktionellen heterologen Calciumkanal. Die rekombinante Zeile kann erzeugt werden durch Einführung und Expression von heterologer DNA oder RNA-Transkripten, die für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodierten, bevorzugter auch exprimierten, einer heterologen DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und/oder heterologer DNA, die für eine α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert. Besonders bevorzugt ist die Expression einer jeden der α₁-, β- und α₂-Untereinheiten, die von einer solchen heterologen DNA oder solchen RNA-Transkripten kodiert werden, in einer solchen rekombinanten Zelle. Die funktionellen Calciumkanäle können vorzugsweise mindestens eine α₁-Untereinheit und eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals einschließen. Eukaryotische Zellen, welche diese beiden Untereinheiten exprimieren, und auch Zellen, welche zusätzliche Untereinheiten exprimieren, wurden durch Transfektion von DNA und durch Injektion von RNA-Transkripten hergestellt. Solche Zellen zeigten spannungsabhängige Calciumkanal-Aktivität, welche Calciumkanälen zuzuschreiben war, die eine oder mehrere der heterologen humanen Calciumkanal-Untereinheiten enthalten. Beispielsweise wurde gezeigt, daß eukaryotische Zellen, die heterologe Calciumkanäle exprimieren, welche neben der α₁-Untereinheit und einer β-Untereinheit eine α₂-Untereinheit enthalten, einen erhöhten calcium-selektiven Ionenfluß durch die Zellmembran als Reaktion auf Depolarisation zeigen, was darauf hinweist, daß die α₂-Untereinheit die Calciumkanal-Funktion verstärken könnte. Zellen, die mit zunehmenden Verhältnissen von α₂ zu α₁ cotransfiziert wurden, und die Aktivität der resultierenden Calciumkanäle wurde gemessen. Die Ergebnisse zeigen an, daß die Erhöhung der Menge an α₂-kodierender DNA im Verhältnis zu den anderen transfizierten Untereinheiten die Calciumkanal-Aktivität erhöht.
Eukaryotische Zellen, welche heterologe Calciumkanäle exprimieren, die mindestens eine humane α₁-Untereinheit, eine humane β-Untereinheit und eine humane α₂-Untereinheit enthalten, sind bevorzugt. Eukaryotische Zellen, die mit einer Zusammensetzung transformiert wurden, welche cDNA oder ein RNA-Transkript enthält, die/das für eine α₁-Untereinheit allein oder in Kombination mit einer β- und/oder einer α₂-Untereinheit kodiert, können zur Herstellung von Zellen, die funktionelle Calciumkanäle exprimieren, eingesetzt werden. Nachdem rekombinante Zellen, welche humane Calciumkanäle exprimieren, die alle die von der heterologen cDNA oder RNA kodierten humanen Untereinheiten enthalten, besonders bevorzugt sind, ist es wünschenswert, solche Wirtszellen mit einer ausreichenden Konzentration der untereinheits-kodierenden Nukleinsäuren zu transformieren oder den Wirtszellen diese zu injizieren, um Calciumkanäle zu bilden, welche die von heterologer DNA oder RNA kodierten humanen Untereinheiten enthalten. Die genauen Mengen und Verhältnisse von DNA oder RNA, welche für die Untereinheiten kodiert, können empirisch bestimmt und für eine spezielle Kombination von Untereinheiten, Zellen und Assay-Bedingungen optimiert werden.
Insbesondere wurden Säugerzellen vorübergehend und stabil mit DNA transfiziert, die für eine oder mehrere humane Calciumkanal-Untereinheiten) kodiert. Solche Zellen exprimieren heterologe Calciumkanäle, welche pharmakologische und elektrophysiologische Eigenschaften zeigen, die humanen Calciumkanälen zugeschrieben werden können. Solche Zellen repräsentieren jedoch homogene Populationen und die pharmakologischen und elektrophysiologischen Daten lieferten Einsichten in die Aktivität humaner Calciumkanäle, die bisher nicht erhältlich waren. Beispielsweise wurden HEK-Zellen vorübergehend mit DNA transfiziert, welche für die α_1E–1-, α_2b- und β_1–3-Untereinheiten kodiert. Die resultierenden Zellen exprimieren vorübergehend diese Untereinheiten, die Calciumkanäle bilden, welche Eigenschaften aufweisen, die eine pharmakologisch unterschiedliche Klasse von spannungsaktivierten Calciumkanälen, verschieden von den Kanälen vom L-, N-, T- und P-Typ, darzustellen scheinen. Die beobachteten α_1E-Ströme waren gegenüber Arzneiwirkstoffen und Toxinen unempfindlich, die bisher zur Definierung anderer Klassen von spannungsaktivierten Calciumkanälen eingesetzt wurden.
In bestimmten Ausführungsformen wird die eukaryotische Zelle mit einem heterologen Calciumkanal durch Einführung einer ersten Zusammensetzung, welche mindestens ein RNA-Transkript enthält, das in der Zelle in eine Untereinheit eines humanen Calciumkanals translatiert wird, in die Zelle erzeugt. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die translatierten Untereinheiten eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals. Bevorzugter enthält die eingeführte Zusammensetzung ein RNA-Transkript, welches für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und enthält auch (1) ein RNA-Transkript, welches für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und/oder (2) ein RNA-Transkript, welches für eine α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert. Besonders bevorzugt ist die Einführung von RNA, die für eine humane α₁-, β- und α₂-Calciumkanal-Untereinheit kodiert. Verfahren für die in vitro-Transkription einer klonierten DNA und Injektion der resultierenden RNA in eukaryotische Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Transkripte irgendeiner Vollängen-DNA, welche für irgendwelche der Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, können allein oder in Kombination mit anderen Transkripten in eukaryotische Zellen zur Expression in den Zellen injiziert werden. Amphibien-Oozyten sind zur Expression von in vitro-Transkripten der hier bereitgestellten cDNA-Klone humaner Calciumkanal-Untereinheiten besonders bevorzugt. Amphibien-Oozyten, welche funktionelle heterologe Calciumkanäle exprimieren, wurden nach diesem Verfahren erzeugt.
Assays und klinische Anwendungen der Zellen und Calciumkanal-Assays
Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Calciumkanal-Aktivität modulieren
Unter den Anwendungen für eukaryotische Zellen, welche eine oder mehrere Untereinheiten) rekombinant exprimieren, sind Assays zur Feststellung, ob eine Testverbindung Calciumkanal-Agonisten- oder -Antagonisten-Aktivität aufweist. Diese eukaryotischen Zellen können auch eingesetzt werden, um unter bekannten Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten diejenigen auszuwählen, welche eine spezielle Calciumkanal-Subtypspezifität aufweisen, und um dadurch Verbindungen auszuwählen, welche ein Potential als krankheits- oder gewebespezifische therapeutische Mittel besitzen.
Es werden in vitro-Verfahren bereitgestellt zur Identifizierung von Verbindungen, wie z. B. Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten, welche die Aktivität von Calciumkanälen modulieren, unter Verwendung von eukaryotischen Zellen, welche heterologe humane Calciumkanäle exprimieren.
Insbesondere verwenden die Assays eukaruotische Zellen, welche heterologe humane Calciumkanal-Untereinheiten exprimieren, die von hier bereitgestellter heterologer DNA kodiert werden, zum Screenen potentieller Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten, welche spezifisch für humane Calciumkanäle sind, und insbesondere zum Screenen hinsichtlich Verbindungen, welche für spezielle humane Calciumkanal-Subtypen spezifisch sind. Solche Assays können in Verbindung mit Verfahren eines rationalen Arzneiwirkstoffdesigns eingesetzt werden, um unter Agonisten und Antagonisten, welche sich in der Struktur leicht unterscheiden, diejenigen auszuwählen, welche zur Modulierung der Aktivität von humanen-Calciumkanälen besonders geeignet sind, und um Verbindungen, welche subtyp- oder gewebespezifische Calciumkanal-Antagonisten- und Agonisten-Aktivitäten zeigen, zu gestalten oder auszuwählen. Diese Assays sollten die relative therapeutische Wirksamkeit einer Verbindung zur Behandlung bestimmter Erkrankungen bei Menschen genau voraussagen. Darüber hinaus können, nachdem subtyp- und gewebespezifische Calciumkanal-Untereinheiten bereitgestellt werden, Zellen mit gewebespezifischen oder subtypspezifischen rekombinanten Calciumkanälen hergestellt werden und in Assays zur Identifizierung von gewebe- oder subtypspezifischen Human-Calciumkanal-Arzneiwirkstoffen eingesetzt werden.
Wünschenswerterweise bildet die Wirtszelle für die Expression von Calciumkanal-Untereinheiten keine endogenen Calciumkanal-Untereinheiten des Typs oder in einer Menge, welcher) den Nachweis heterologer Calciumkanal-Untereinheiten in Ligandenbindungsassays oder den Nachweis heterologer Calciumkanal-Funktion, wie z. B. die Erzeugung eines Calciumstroms, in funktionellen Assays substantiell stört. Auch sollten die Wirtszellen vorzugsweise keine endogenen Calciumkanäle bilden, welche nachweisbar mit Verbindungen Wechselwirken, die in physiologischen Konzentrationen (im allgemeinen nanomolare oder pikomolare Konzentrationen) Affinität für Calciumkanäle aufweisen, welche eine oder alle der hier bereitgestellten humanen Calciumkanal-Untereinheiten enthalten.
Bezüglich Ligandenbindungsassays zur Identifizierung einer Verbindung, welche Affinität für Calciumkanäle besitzt, werden Zellen eingesetzt, welche vorzugsweise mindestens eine heterologe α₁-Untereinheit exprimieren. Transfizierte eukaryotische Zellen, welche mindestens eine α₁-Untereinheit exprimieren, können zur Feststellung des Vermögens einer Testverbindung zur speziellen Bindung an heterologe Calciumkanäle eingesetzt werden, indem beispielsweise das Vermögen der Testverbindung zur Inhibierung der Wechselwirkung einer markierten Verbindung, von der bekannt ist, daß sie spezifisch mit Calciumkanälen wechselwirkt, beurteilt wird. Solche Ligandenbindungsassays können mit intakten transfizierten Zellen oder daraus hergestellten Membranen durchgeführt werden.
Die Kapazität einer Testverbindung zur Bindung an oder anderweitigen Wechselwirkung mit Membranen, die heterologe Calciumkanäle oder Untereinheiten davon enthalten, kann durch Anwendung irgendeines geeigneten Verfahrens, wie z. B. Analyse kompetitiver Bindung, z. B. Scatchard-Plots, worin die Bindungskapazität solcher Membranen in Gegenwart und Abwesenheit einer oder mehrerer Konzentrationen einer Verbindung mit bekannter Affinität für den Calciumkanal bestimmt wird, bestimmt werden. Erforderlichenfalls können die Ergebnisse mit einem Kontrollexperiment verglichen werden, welches gemäß Verfahren entwickelt wurde, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise können als negative Kontrolle die Ergebnisse mit denjenigen von Assays einer identisch behandelten Membranpräparation aus Wirtszellen verglichen werden, welche nicht mit einer oder mehreren untereinheits-kodierenden Nukleinsäure(n) transfiziert wurden.
Die Assays beinhalten das Kontaktieren der Zellmembran einer rekombinanten eukaryotischen Zelle, welche mindestens eine α_1E-Untereinheit eines humanen Calciumkanals exprimiert, mit einer Testverbindung und Messen des Vermögens der Testverbindung zur spezifischen Bindung an die Membran oder zur Veränderung oder Modulierung der Aktivität eines heterologen Calciumkanals auf der Membran.
Im bevorzugten Verfahren wird bei dem Assay eine rekombinante Zelle verwendet, welche einen Calciumkanal aufweist, der eine α_1E-Untereinheit eines humanen Calciumkanals in Kombination mit einer β-Untereinheit des humanen Calciumkanals und/oder einer α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals enthält.
In bestimmten Ausführungsformen werden die Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Calciumkanal-Aktivität modulieren, durchgeführt durch Messen der Calciumkanal-Aktivität einer eukaryotischen Zelle mit einem heterologen funktionellen Calciumkanal, wenn eine solche Zelle einer Lösung ausgesetzt wird, welche die Testverbindung und ein Calciumkanal-selektives Ion enthält, und Vergleichen der gemessenen Calciumkanal-Aktivität mit der Calciumkanal-Aktivität derselben Zelle oder einer im wesentlichen identischen Kontrollzelle in einer Lösung, welche die Testverbindung nicht enthält. Die Zelle wird in einer Lösung gehalten, die eine ausreichende Konzentration an Calciumkanal-selektiven Ionen aufweist, um einen einwärts gerichteten Strom zu ergeben, wenn der Kanal offen ist. Rekombinante Zellen, welche Calciumkanäle exprimieren, die jede der humanen α_1E-, β- und α₂-Untereinheiten einschließen, sind zur Verwendung in solchen Assays besonders bevorzugt. Verfahren zur Durchführung solcher Assays sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Hinsichtlich ähnlicher Verfahren, die mit Xenopus laevis-Oozyten und Acetylcholin-Rezeptoren durchgeführt wurden, siehe z. B. Mishina et al. [(1985), Nature 313: 364], und, mit solchen Oozyten und Natriumkanälen, siehe Noda et al. [(1986), Nature 322: 826–828]. Für ähnliche Studien, welche mit dem Acetylcholin-Rezeptor durchgeführt wurden, siehe z. B. Claudio et al. [(1987), Science 238: 1688–1694].
Funktionelle rekombinante oder heterologe Calciumkanäle können mit irgendeinem Verfahren identifiziert werden, das Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist. Beispielsweise können wohlbekannte elektrophysiologische Verfahren zur Messung des Stroms über eine ionenselektive Membran einer Zelle eingesetzt werden. Das Ausmaß und die Dauer des Flusses von calciumselektiven Ionen durch heterologe Calciumkanäle einer rekombinanten Zelle, enthaltend DNA, die für eine oder mehrere der hier bereitgestellten Untereinheiten kodiert, wurde mit Hilfe elektrophysiologischer Aufzeichnungen unter Verwendung von Zweielektroden- und den Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken gemessen. Zur Verbesserung der Sensitivität der Assays können bekannte Verfahren eingesetzt werden, um Nicht-Calciumströme und Calciumströme, die von endogenen Calciumkälen herrühren, zu eliminieren oder zu verringern, wenn die Calciumströme durch rekombinante Kanäle gemessen werden. Beispielsweise verstärkt das DHP Bay K 8644 speziell die Calciumkanal-Funktion vom L-Typ durch Erhöhung der Dauer des offenen Zustands der Kanäle [siehe z. B. Ness, J. B., et al. (1984), Nature 311: 538–544]. Eine längere Öffnung der Kanäle führt zu Calciumströmen erhöhter Größe und Dauer. Restströme („tail currents") können nach Repolarisation der Zellmembran nach Aktivierung von Ionenkanälen durch ein depolarisierendes Spannungssignal beobachtet werden. Die geöffneten Kanäle benötigen eine endliche Zeit für die Schließung (oder „Deaktivierung") nach Repolarisation und der Strom, welcher während dieses Zeitraums durch die Kanäle fließt, wird als Reststrom bezeichnet. Nachdem Bay K 8644 die Öffnungsereignissse in Calciumkanälen verlängert, neigt es dazu, diese Restströme zu verlängern und sie ausgeprägter zu machen.
Bei der Durchführung dieser Assays können stabil oder vorübergehend transfizierte Zellen oder injizierte Zellen, welche spannungsabhängige humane Calciumkanäle exprimieren, die eine oder mehrere der Untereinheiten eines humanen Calciumkanals enthalten, wünschenswerterweise in Assays zur Identifizierung von Agentien, wie z. B. Calciumkanal-Agonisten und -Antagonisten, welche Calciumkanal-Aktivität modulieren, eingesetzt werden.
Funktionelle Tests der Aktivität von Testverbindungen, einschließlich von Verbindungen mit unbekannter Aktivität, hinsichtlich Calciumkanal-Agonisten- oder Antagonistenaktivität zur Feststellung, ob die Testverbindung den Fluß von Calciumionen oder anderen Ionen durch einen humanen Calciumkanal verstärkt, inhibiert oder auf andere Weise verändert, können erfolgen durch (a) Halten einer eukaryotischen Zelle, welche transfiziert ist oder eine Injektion erhielt, um einen heterologen funktionellen Calciumkanal zu exprimieren, welcher zur Regulation des Flusses von calciumkanal-selektiven Ionen in die Zelle in einem Medium, das calciumkanal-selektive Ionen enthält, in der Lage ist, (i) in Gegenwart und (ii) in Abwesenheit einer Testverbindung; (b) Halten der Zelle unter solchen Bedingungen, daß die heterologen Calciumkanäle im wesentlichen geschlossen sind und die endogenen Calciumkanäle der Zelle im wesentlichen inhibiert sind, (c) Depolarisieren der Membran der in Schritt (b) gehaltenen Zelle bis zu einem Ausmaß und für eine ausreichende Zeitspanne, um (vorzugsweise im wesentlichen nur) die heterologen Calciumkanäle zu veranlassen, für die calciumkanal-selektiven Ionen durchlässig zu werden; und (d) Vergleichen der Menge und Dauer des Stromflusses in die Zelle in Gegenwart der Testverbindung mit derjenigen des Stromflusses in die Zelle oder eine im wesentlichen ähnliche Zelle in Abwesenheit der Testverbindung.
Die Assays verwenden somit Zellen, hier bereitgestellt, welche heterologe funktionelle Calciumkanäle exprimieren, und messen funktionell, z. B. elektrophysiologisch, das Vermögen einer Testverbindung zur Potenzierung, Antagonisierung oder anderweitigen Modulation der Größe und Dauer des Flusses von calciumkanal-selektiven Ionen, wie z. B. Ca⁺⁺ oder B⁺⁺, durch den heterologen funktionellen Kanal. Die Strommenge, welche durch die rekombinanten Calciumkanäle einer Zelle fließt, kann direkt bestimmt werden, z. B. elektrophysiologisch, oder durch Überwachung einer unabhängigen Reaktion, welche intrazellulär stattfindet und welche direkt in einer von Calciumionen (oder anderen Ionen) abhängigen Weise beeinflußt wird. Ein beliebiges Verfahren zur Beurteilung der Aktivität eines Calciumkanals kann in Verbindung mit den hier bereitgestellten Zellen und Assays eingesetzt werden. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform des Verfahrens zum Testen einer Verbindung hinsichtlich ihres Vermögens zur Modulation von Calciumkanal-Aktivität die Strommenge gemessen durch deren Modulation einer Reaktion, welche für Calciumkanal-selektive Ionen sensitiv ist, und eine eukaryotische Zelle verwendet, welche einen heterologen Calciumkanal exprimiert und auch eine transkriptionales Kontrollelement enthält, das zur Expression mit einem Strukturgen, welches für ein Indikatorprotein kodiert, funktionsfähig verknüpft ist. Das transkriptionale Kontrollelement, welches zur Transkription des Indikatorgens verwendet wird, ist in der Lage, in der Zelle auf ein calciumkanal selektives Ion, wie z. B. Ca²⁺ und Ba²⁺, anzusprechen. Die Details solcher transkriptionsbasierten Assays werden in WO-A-9202639 beschrieben; siehe auch WO-A-9313423.
Assays zur Diagnose von LES
LES ist eine Autoimmunerkrankung, welche durch eine unzureichende Acetylcholin-Freisetzung von motorischen Nervenendungen, die normalerweise auf Nervenimpulse ansprechen, charakterisiert ist. Immunglobuline (IgG) von LES-Patienten blockieren individuelle spannungsabhängige Calciumkanäle und inhibieren so Calciumkanal-Aktivität [Kim und Neher, Science 239: 405–408 (1988)]. Ein diagnostischer Assay für das Lambert Eaton-Rooke-Syndrom (LES) wird hier bereitgestellt. Der diagnostische Assay für LES beruht auf der immunologischen Reaktivität von LES-IgG mit den humanen Calciumkanälen oder speziellen Untereinheiten allein oder in Kombination oder auf der Oberfläche von rekombinanten Zellen exprimiert. Beispielsweise kann ein solcher Assay auf der Immunpräzipitation von LES-IgG durch die hier bereitgestellten humanen Calciumkanal-Untereinheiten und Zellen, welche solche Untereinheiten exprimieren, basieren.
Klinische Anwendungen
Bezüglich der therapeutischen Behandlung verschiedener Krankheitszustände erlaubt die Verfügbarkeit von DNA, die für humane Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, die Identifizierung irgendwelcher Veränderungen in solchen Genen (z. B. Mutationen), welche mit dem Auftreten bestimmter Krankheitszustände korrelieren können. Darüber hinaus wird die Schaffung von Tiermodellen solcher Krankheitszustände möglich, indem spezifisch solche Mutationen in synthetische DNA-Fragmente eingeführt werden, welche dann in Labortiere oder in vitro-Assay-Systeme zur Feststellung ihrer Wirkungen eingeführt werden können.
Es kann auch ein genetisches Screening unter Verwendung der Nukleotidsequenzen als Sonden durchgeführt werden. So können Nukleinsäure-Proben von Individuen mit pathologischen Zuständen, von denen man annimmt, daß sie die Veränderung/Modifizierung irgendeiner oder mehrerer der Calciumkanal-Untereinheiten beinhalten, mit geeigneten Sonden gescreent werden, um festzustellen, ob irgendwelche Anomalien bezüglich irgendwelcher der endogenen Calciumkanäle vorliegen. Gleichermaßen können Individuen mit einer Familiengeschichte von Krankheitszuständen, die mit einer Calciumkanalstörung in Zusammenhang stehen, gescreent werden, um festzustellen, ob sie ebenfalls eine Veranlagung für solche Krankheitszustände besitzen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind nur zu Illustrationszwecken eingeschlossen und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
BEISPIEL I: Erstellung von Banken, die zur Isolierung von DNA, welche für humane neuronale spannungsabhängige Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, eingesetzt wurden
A. RNA-Isolierung
1. IMR32-Zellen
IMR32-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC Hinterlegungs-Nr. CCL127, Rockville, MD) erhalten und in DMEM, 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin/-Streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY) plus 1,0 mM Dibutyryl-cAMP (dbcAMP) 10 Tage lang gezüchtet. Gesamt-RNA wurde aus den Zellen nach dem von H. C. Birnboim [(1988), Nucleic Acids Research 16: 1487–1497] beschriebenen Verfahren isoliert. Poly(A⁺)-RNA wurde nach Standardverfahren selektioniert [siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; S. 7.26–7.29].
2. Human-Thalamusgewebe
Human-Thalamusgewebe (2,34 g), erhalten von der National Neurological Research Bank, Los Angeles, CA, welches bei –70°C eingefroren gelagert worden war, wurde mit Hilfe eines Mörsers und Pistills in Gegenwart von flüssigem Stickstoff pulverisiert und die Zellen wurden in 12 ml Lysispuffer (5 M Guanidiniumisothiocyanat, 50 mM TRIS, pH 7,4, 10 mM EDTA, 5% β-Mercaptoethanol) lysiert. Lysispuffer wurde dem Lysat zugegeben, um ein Endvolumen von 17 ml zu ergeben. N-Laurylsarcosin und CsCl wurden der Mischung zugegeben, um Endkonzentrationen von 4% bzw. 0,01 g/ml in einem Endvolumen von 18 ml zu ergeben.
Die Probe wurde mit 9000 UpM in einem Sorvall SS34-Rotor 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das unlösliche Material als Pellet zu entfernen. Der Überstand wurde in zwei gleiche Portionen aufgeteilt und jeweils über ein 2-ml-Kissen einer Lösung von 5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA, in separaten Zentrifugenröhrchen enthalten, geschichtet, um etwa 9 ml pro Röhrchen zu ergeben. Die Proben wurden in einem SW41-Rotor mit 37.000 UpM 24 Stunden lang bei 20°C zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurde jedes RNA-Pellet in 3 ml ETS (10 mM TRIS, pH 7,4, 10 mM EDTA, 0,2% SDS) resuspendiert und in einem einzigen Röhrchen vereinigt. Die RNA wurde mit 0,25 M NaCl und zwei Volumina 95%igem Ethanol präzipitiert.
Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gewonnen und in 4 ml PK-Puffer (0,05 M TRIS, pH 8,4, 0,14 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% SDS) resuspendiert. Proteinase K wurde der Probe bis zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml zugegeben. Die Probe wurde bei 22°C eine Stunde lang inkubiert, gefolgt von zweimaliger Extraktion mit einem gleichen Volumen an Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 48 : 2), gefolgt von einer Extraktion mit einem gleichen Volumen an Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1). Die RNA wurde mit Ethanol und NaCl gefällt. Das Präzipitat wurde in 400 μl ETS-Puffer resuspendiert. Die Ausbeute an Gesamt-RNA betrug etwa 1,0 mg. PolyA⁺-RNA (30 μg) wurde aus der Gesamt-RNA nach Standardverfahren isoliert wie in Beispiel I.A.1 angegeben.
B. Bank-Erstellung
Doppelsträngige cDNA wurde nach Standardverfahren synthetisiert (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 8]. Jede Bank wurde auf im wesentlichen dieselbe Weise erstellt, mit Ausnahme von Unterschieden bezüglich: 1) des für das Primen der cDNA-Synthese des ersten Strangs eingesetzten Oligonukleotids, 2) der Adapter, welche mit der doppelsträngigen cDNA verknüpft wurden, 3) des zur Entfernung der freien oder nicht verwendeten Adapter verwendeten Verfahrens und 4) der Größe der fraktionierten cDNA, welche in den λ-Phagenvektor ligiert wurde.
1. IMR32-cDNA-Bank #1
Einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung der IMR32-Poly(A⁺)-RNA (Beispiel I.A.1.) als Matrize synthetisiert und unter Verwendung von Oligo(dT)_12-18 (Collaborative Research Inc., Bedford, MA) geprimt. Die einzelsträngige cDNA wurde in doppelsträngige cDNA überführt und die Ausbeute betrug etwa 2 μg. Ecol-Adapter:
welche auch SnaBI- und XhoI-Restriktionsstellen enthalten, wurden dann der doppelsträngigen cDNA nach dem folgenden Verfahren hinzugefügt.
a. Phosphorylierung des 18-mers
Das 18-mer wurde nach Standardverfahren [siehe z. B. Sambrook et al. (1989) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 8] phosphoryliert durch Kombination des 18-mers (225 pMol) mit [³²P]-γ-ATP (7000 Ci/mMol; 1,0 μl) und Kinase (2 E) in einem Gesamtvolumen von 10 μl und Inkubation für 15 Minuten bei 37°C. Nach der Inkubation wurden 1 μl 10 mM ATP und zusätzliche 2 E Kinase zugegeben und 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Kinase wurde dann durch Kochen für 10 Minuten inaktiviert.
b. Hybridisierung des 22-mers
Das 22-mer wurde mit dem phosphorylierten 18-mer durch Zugabe von 225 pMol des 22-mers (plus Wasser, um das Volumen auf 15 μl zu bringen) und Inkubation bei 65°C für 5 Minuten hybridisiert. Die Reaktion wurde dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Die Adapter waren so in einer Konzentration von 15 pMol/μl vorhanden und bereit für die cDNA-Adapter-Ligierung.
e. Ligierung von Adaptern mit cDNA
Nachdem die EcoRI-, SnaBI-, XhoI-Adapter mit der doppelsträngigen cDNA unter Anwendung eines Standardverfahrens [siehe z. B. Sambrook et al. (1989) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 8] ligiert worden waren, wurde die Ligase durch Erwärmung der Mischung für 15 Minuten auf 72°C inaktiviert. Die folgenden Reagenzien wurden der cDNA-Ligierungsreaktion zugegeben und 30 Minuten lang auf 37°C erwärmt: cDNA-Ligierungsreaktion (20 μl), Wasser (24 μl), 10 × Kinasepuffer (3 μl), 10 mM ATP (1 μl) und Kinase (2 μl von 2 E/μl). Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2 μl 0,5 M EDTA, gefolgt von einer Phenol/Chloroform-Extraktion und einer Chloroform-Extraktion, gestoppt.
d. Größenselektion und Verpackung von cDNA
Die doppelsträngige cDNA mit den ligierten EcoRI-, SnaBI-, XhoI-Adaptern wurde von den freien oder unligierten Adaptern mit Hilfe einer 5-ml-Sepharose-CL-4B-Säule (Sigma, St. Louis, MO) gereinigt. 100-μl-Fraktionen wurden gesammelt und diejenigen, welche die cDNA enthielten, mittels Überwachung der Radioaktivität festgestellt, wurden vereinigt, mit Ethanol gefällt, in TE-Puffer resuspendiert und auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt und die Fraktion von 1 bis 3 kb aus dem Gel ausgeschnitten. Die cDNA, welche in der Agarose eingebettet war, wurde unter Verwendung des „Geneluter Electroelution System" (Invitrogen, San Diego, CA) eluiert. Die eluierte cDNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und in TE-Puffer mit 0,10 pMol/μl resuspendiert. Die cDNA wurde mit 1 μg EcoRI-verdautem, dephosphoryliertem λgt11 in einem 5-μl-Reaktionsvolumen in einem 2-4fachen molaren Überschußverhältnis von cDNA gegenüber dem λgt11-Vektor ligiert. Der ligierte λgt11, der das cDNA-Insert enthielt, wurde in vitro mit Hilfe des Gigapack-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) in λ-Phagenvirionen verpackt. Die verpackten Phagen wurden auf einem E. coli Y1088-Bakterienrasen als Vorbereitung für das Screening ausplattiert.
2. IMR32-cDNA-Bank #2
Diese Bank wurde wie beschrieben (Beispiel I.B.1.) erstellt, mit der Ausnahme, daß cDNA-Fragmente von 3 bis 9 kb statt der Fragmente von 1 bis 3 kb in den λgt11-Phagen-vektor ligiert wurden.
3. IMR32-cDNA-Bank #3
IMR32-Zell-Poly(A⁺)-RNA (Beispiel I.A.1.) wurde als Matrize zur Synthese von einzelsträngiger cDNA verwendet. Die Primer für die cDNA-Synthese des ersten Strangs waren statistische Primen (Hexadesoxynukleotide [pd(N)₆], Kat. #5020-1, Clontech, Palo Alto, CA). Die doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert, EcoRI-, SnaBI-, XhoI-Adapter wurden der cDNA hinzugefügt, die unligierten Adapter wurden entfernt und die doppelsträngige cDNA mit den ligierten Adaptern wurden auf einem Agarosegel fraktioniert, wie in Beispiel I.B.1. beschrieben. Die cDNA-Fraktion von mehr als 1,8 kb wurde aus der Agarose eluiert, in λgt11 ligiert, verpackt und in einen Bakterienrasen von Y1088 (wie in Beispiel I.B.1. beschrieben) ausplattiert.
4. IMR32-cDNA-Bank #4
IMR32-Zell-Poly(A⁺)-RNA (Beispiel I.A.1.) wurde als Matrize zur Synthese von einzelsträngiger cDNA verwendet. Die Primer für die cDNA-Synthese des ersten Strangs waren die Oligonukleotide: 89–365a, spezifisch für die kodierende Sequenz der α₁-Untereinheit vom α_1D-Typ (VDCC III) (siehe Beispiel II.A) (die komplementäre Sequenz von Nt. 2927–2956, SEQ-ID-Nr. 1), 89–495, spezifisch für die kodierende Sequenz der α₁-Untereinheit vom α_1C-Typ (VDCC II) (siehe Beispiel II.B) (die komplementäre Sequenz von Nt. 852 bis 873, SEQ-ID-Nr. 3), und 90–12, spezifisch für die kodierende Sequenz der α_1C-Untereinheit (die komplementäre Sequenz von Nt. 2496 bis 2520, SEQ-ID-Nr. 3). Die cDNA-Bank wurde dann wie beschrieben (Beispiel I.B.3.) erstellt, mit der Ausnahme, daß die cDNA-Größenfraktion von mehr als 1,5 kb statt der Fraktion von mehr als 1,8 kb aus der Agarose eluiert wurde.
5. IMR32-cDNA-Bank #5
Die cDNA-Bank wurde wie beschrieben (Beispiel I.B.3.) erstellt, mit der Ausnahme, daß die Größenfraktion von mehr als 1,2 kb statt der Fraktion von mehr als 1,8 kb aus der Agarose eluiert wurde.
6. Human-Thalamus-cDNA-Bank #6
Human-Thalamus-Poly(A⁺)-RNA (Beispiel I.A.2.) wurde als Matrize zur Synthese von einzelsträngiger cDNA verwendet. Oligo(dT) wurde zum Primen der Synthese des ersten Strangs eingesetzt (Beispiel I.B.1.). Die doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert (Beispiel I.B.1.) und EcoRI-, KpnI-, NcoI-Adapter der folgenden Sequenz:
wurden mit der doppelsträngigen cDNA wie beschrieben (Beispiel I.B.1.) ligiert, wobei das 20-mer das 18-mer ersetzte und das 24-mer das 22-mer ersetzte. Die unligierten Adapter wurden entfernt, indem die cDNA-Adapter-Mischung durch eine BioGel-A-50-Säule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) von 1 ml geschickt wurde. Fraktionen (30 μl) wurden gesammelt und 1 μl einer jeden Fraktion im ersten Peak der Radioaktivität wurden auf einem 1%igem Agarosegel elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf einem Vakuumgeltrockner getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die Fraktionen, welche größere cDNA-Fragmente als 600 bp enthielten, wurden vereinigt, mit Ethanol gefällt und in λgt11 ligiert (Beispiel I.B.1.). Die Erstellung der cDNA-Bank wurde wie beschrieben (Beispiel I.B.1.) abgeschlossen.
C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen
Die Hybridisierung von radioaktiv markierten Nukleinsäuren mit immobilisierter DNA für das Screening von cDNA-Banken, DNA-Southern-Transfers oder Northern-Transfers wurde routinemäßig unter Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt [Hybridisierung: 50%iges entionisiertes Formamid, 200 μg/ml beschallte Heringssperma-DNA (Kat. # 223646, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 5 × SSPE, 5 × Denhardts Lösung, 42°C; Waschen: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C]. Die Rezepte für SSPE und Denhardts Lösung und die Herstellung von entionisiertem Formamid sind beispielsweise in Sambrook et al. (1989) ( Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8) beschrieben. Bei einigen Hybridisierungen wurden insofern Bedingungen niedrigerer Stringenz angewandt, als 10%iges entionisiertes Formamid das für die Standardhybridisierungsbedingungen angegebene 50%ige entionisierte Formamid ersetzte. Die Waschbedingungen zur Entfernung der unspezifischen Sonde von den Filtern waren entweder hohe, mittlere oder niedrige Stringenz wie im folgenden beschrieben:

1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C
2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
3) niedrige Stringenz: 1,0 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C

Es versteht sich, daß äquivalente Stringenzbedingungen unter Verwendung alternativer Puffer, Salze und Temperaturen erzielt werden können.
Beispiel II: Isolierung von DNA, welche für die humane neuronale Calciumkanal-α₁-Untereinheit kodiert
A. Isolierung von DNA, welche für die α_1D-Untereinheit kodiert
1. Referenzliste partieller α_1D-cDNA-Klone
Es wurden zahlreiche α_1D-spezifische cDNA-Klone isoliert, um die für α_1D kodierende vollständige Sequenz plus Teile der 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen zu charakterisieren. SEQ-ID-Nr. 1 zeigt die für α_1D kodierende vollständige DNA-Sequenz plus 510 Nukleotide von 5'-untranslatierter α_1D-Sequenz, welche mit dem Guanidin-Nukleotid neben dem Adenin-Nukleotid der angenommenen Translationsinitiation endet, sowie 642 Nukleotide von 3'-untranslatierter Sequenz. Ebenfalls in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt ist die abgeleitete Aminosäuresequenz. Eine Liste partieller cDNA-Klone, welche zur Charakterisierung der α_1D-Sequenz eingesetzt wurden, und die Nukleotidposition eines jeden Klons, bezogen auf die Vollängen-α_1D-cDNA-Sequenz, welche in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben ist, ist im folgenden gezeigt. Die Isolierung und Charakterisierung dieser Klone wird im folgenden beschrieben (Beispiel II.A.2.).
2. Isolierung und Charakterisierung individueller Klone, die in Beispiel II.A.1. aufgelistet sind
a. IMR32 1.36
Zwei Millionen Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #1 (Beispiel I.B.1.) wurden in doppelter Ausführung in einer Dichte von etwa 200.000 Plaques pro 150-mm-Platte unter Verwendung einer Mischung von radioaktiv markierten Fragmenten des kodierenden Bereichs der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₁-cDNA gescreent [hinsichtlich der Sequenz der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₁-Untereinheits-cDNA, siehe Tanabe et al. (1987), Nature 328: 313–318]:

Fragment Nukleotide

KpnI-EcoRI –78 bis 1006

EcoRI-XhoI 1006 bis 2653

ApaI-ApaI 3093 bis 4182

BglII-Sacl 4487 bis 5310
Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Nur eine α_1D-spezifische Rekombinante (IMR32 1.36) der 2 × 10⁶ gescreenten wurde identifiziert. IMR32 1.36 wurde nach Standardverfahren (J. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 8) plaquegereinigt, in pGEM3 (Promega, Madison, WI) subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert.
b. IMR32 1.80
Etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #2 (Beispiel I.B.2.) wurden in doppelter Ausführung in einer Dichte von etwa 100.000 Plaques pro 150-mm-Platte unter Verwendung des IMR32 1.36-cDNA-Fragments (Beispiel II.A.1.) als Sonde gescreent. Es wurden Standardhybridisierungsbedingungen angewandt und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Drei positive Plaques wurden identifiziert, wovon einer IMR32 1.80 war. IMR32 1.80 wurde nach Standardverfahren plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert.
c. IMR32 1.144
Etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #3 (Beispiel I.B.3.) wurden mit dem EcoRI-PvulI-Fragment (Nt. 2083 bis 2518, SEQ-ID-Nr. 1) von IMR32 1.80 gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.) durchgeführt und die Filter bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden drei positive Plaques identifiziert, von einer einer IMR32 1.144 war. IMR32 1.144 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert und das cDNA-Insert wurde in pGEM7Z (Promega, Madison, WI) subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Diese Charakterisierung offenbarte, daß IMR32 1.144 eine Reihe von ATG-Codons aufweist, die für 7 mögliche Initiationsmethionine kodieren (Nt. 511 bis 531, SEQ-ID-Nr. 1). Nukleinsäureamplifizierungsanalyse und DNA-Sequenzierung von klonierten Produkten der Nukleinsäureamplifizierungsanalyse, welche für diese 7 ATG-Codons kodierten, bestätigte, daß diese Sequenz in dem α_1D-Transkript vorliegt, welches in dbcAMP-induzierten IMR32-Zellen exprimiert wird.
d. IMR32 1.136
Etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #4 (Beispiel I.B.4.) wurden mit dem EcoRI-PvuII-Fragment (Nt. 2083 bis 2518, SEQ-ID-Nr. 1) von IMR32 1.80 gescreent (Beispiel II.A.1.). Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Sechs positive Plaques wurden identifiziert, von denen einer IMR32 1.136 war. IMR32 1.136 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert und das cDNA-Insert wurde in einen Standardplasmidvektor, pSP72 (Promega, Madison, WI), subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Diese Charakterisierung offenbarte, daß IMR32 1.136 für ein unvollständig gesplictes α_1D-Transkript kodiert. Der Klon enthält die Nt. 1627 bis 2988 von SEQ-ID-Nr. 1, dem ein Intron von etwa 640 bp vorausgeht. Diesem Intron geht dann ein 104-Nt.-Exon (SEQ-ID-Nr. 2) voraus, welches ein alternatives Exon ist, das für die IS6-Transmembrandomäne [siehe z. B. Tanabe et al. (1987), Nature 328: 313–318, hinsichtlich einer Beschreibung der IS1- bis IVS6-Transmembran-Terminologie] der α_1D-Untereinheit kodiert und die Nukleotide 1627 bis 1730 von SEQ-ID-Nr. 1 ersetzen kann, um ein vollständig gesplictes α_1D-Transkript zu ergeben.
e. IMR32 1.163
Etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #3 (Beispiel (I.B.3.) wurden mit dem NcoI-XhoI-Fragment von IMR32 1.80 (Beispiel II.A.1.), welches die Nukleotide 5811 bis 6468 enthält (SEQ-ID-Nr. 1), gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden drei positive Plaques identifiziert, von denen einer IMR32 1.163 war. IMR32 1.163 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert und das cDNA-Insert in einen Standardplasmidvektor, pSP72 (Promega, Madison, WI), subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Diese Charakterisierung offenbarte, daß IMR32 1.163 das α_1D-Terminationscodon, Nt. 6994 bis 6996 (SEQ-ID-Nr. 1), enthält.
3. Konstruktion einer Vollängen-α_1D-cDNA [pVDCCIII(A)]
Die α_1D-cDNA-Klone IMR32 1.144, IMR32 1.136, IMR32 1.80 und IMR32 1.163 (Beispiel II.A.2.) überlappen und umfassen die gesamte für α_1D kodierende Sequenz, Nt. 511 bis 6993 (SEQ-ID-Nr. 1), mit der Ausnahme einer 148-bp-Deletion, Nt. 2984 bis 3131 (SEQ-ID-Nr. 1). Teile dieser partiellen cDNA-Klone wurden ligiert, um eine Vollängen-α_1D-cDNA in einem eukaryotischen Expressionsvektor herzustellen. Der resultierende Vektor wurde als pVDCCIII(A) bezeichnet. Die Konstruktion von pVDCCIII(A) erfolgte in vier Schritten, die detailliert im folgenden beschrieben sind: (1) die Konstruktion von pVDCCIII/5' unter Verwendung von Teilen von IMR32 1.144, IMR32 1.136 und IMR32 1.80, (2) die Konstruktion von pVDCCIII/5'.3, welche die 148-Nt.-Deletion in dem IMR32 1.80-Anteil von pVDCCIII/5' korrigiert, (3) die Konstruktion von pVDCCIII/3'.1 unter Verwendung von Teilen von IMR32 1.80 und IMR32 1.163, und (4) die Ligierung eines Teils des pVDCCIII/5'.3-Inserts, des Inserts von pVDCCIII/3'.1 und von pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), um pVDCCIII(A) zu bilden. Der Vektor pcDNA1 ist ein eukaryotischer Expressionsvektor, der einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor enthält, welcher ein konstitutiver Promotor ist, der von Säuger-Wirtszell-RNA-Polymerase II erkannt wird.
Jedes der DNA-Fragmente, die zur Herstellung des Vollängen-Konstrukts verwendet wurden, wurde mittels Elektrophorese durch ein Agarosegel auf DE81-Filterpapier (Whatman, Clifton, NJ) und Elution von dem Filterpapier unter Verwendung von 1,0 M NaCl, 10 mM TRIS, pH 8,0, 1 mM EDTA, gereinigt. Die Ligierungen wurden typischerweise in einem Reaktionsvolumen von 10 μl mit einem gleichen Molverhältnis von Insert-Fragment und einem zweifachen molaren Überschuss des gesamten Inserts relativ zum Vektor durchgeführt. Die Menge an eingesetzter DNA betrug normalerweise etwa 50 ng bis 100 ng.
a. pVDCCIII/5'
Zur Konstruktion von pVDCCIII/5' wurde IMR32 1.144 (Beispiel II.A.2.c.) mit XhoI und EcoRI verdaut und das Fragment, welches den Vektor (pGEM7Z), α_1D-Nt. 1 bis 510 (SEQ-ID-Nr. 1) und α_1D-Nt. 511 bis 1732 (SEQ-ID-Nr. 1 ) enthielt, wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Das EcoRI-ApaI-Fragment von IMR32 1.136 (Beispiel II.A.2.d.), Nukleotide 1733 bis 2671 (SEQ-ID-Nr. 1), wurde isoliert und das ApaI-HindIII-Fragment von IMR32 1.80 (Beispiel ILA.2.b.), Nukleotide 2672 bis 4492 (SEQ-ID-Nr. 1), wurde isoliert. Die drei DNA-Klone wurden ligiert, um pVDCCIII/5' zu bilden, das die Nukleotide 1 bis 510 (5'-untranslatierte Sequenz; SEQ-ID-Nr. 1) und Nt. 511 bis 4492 (SEQ-ID-Nr. 1) enthielt.
b. pVDCCIII/5'.3
Ein Vergleich der DNA-Sequenzen von IMR32 1.36 und IMR32 1.80 offenbarte, daß sich diese beiden cDNA-Klone in der für α_1D kodierenden Sequenz, Nt. 2984 bis 3212, unterscheiden. Eine Nukleinsäureamplifizierungsanalyse von IMR32 1.80 und dbcAMP-induzierter (1,0 mM, 10 Tage) zytoplasmatischer IMR32-RNA (isoliert nach Ausubel, F. M., et al. (Hrsg.) (1988), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York) offenbarte, daß IMR32 1.80 eine Deletion von 148 Nukleotiden, Nt. 2984 bis 3131 (SEQ-ID-Nr.1), aufwies und daß IMR32 1.36 eine Deletion von 132 Nukleotiden, Nt. 3081 bis 3212, aufwies. Zur Durchführung der Nukleinsäureamplifizierungsanalyse wurde die Amplifizierungsreaktion mit den α_1D-spezifischen Oligonukleotiden 112 (Nt. 2548 bis 2572, SEQ-ID-Nr. 1) und 311 (der komplementären Sequenz von Nt. 3928 bis 3957, SEQ-ID-Nr. 1) geprimt. Diese Produkte wurden dann unter Verwendung der α_1D-spezifischen Oligonukleotide 310 (Nt. 2583 bis 2608, SEQ-ID-Nr. 1) und 312 (der komplementären Sequenz von Nt. 3883 bis 3909) erneut amplifiziert. Dieses erneut amplifizierte Produkt, welches AccI- und BglII-Restriktionsstellen enthält, wurde mit AccI und BglII verdaut und das AccI-BglII-Fragment, Nt. 2765 bis 3890 (SEQ-ID-Nr. 1), wurde in AccI-BglII-verdautes pVDCCIII/5' kloniert, um das AccI-BglII-pVDCCIII/5'-Fragment zu ersetzen, welches die Deletion aufwies. Dieses neue Konstrukt wurde als pVDCCIII/5'.3 bezeichnet. Eine DNA-Sequenzbestimmung von pVDCCIII/5'.3 über die amplifizierte Region bestätigte die Deletion von 148 Nukleotiden in IMR32 1.80.
c. pVDCCIII/3'.1
Zur Konstruktion von pVDCCIII/3'.1 wurde das cDNA-Insert von IMR32 1.163 (Beispiel II.A.2.e.) in pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) als XhoI-Fragment subkloniert. Die XhoI-Stellen auf dem cDNA-Fragment wurden durch die Adapter bereitgestellt, welche zur Erstellung der cDNA-Bank verwendet worden waren (Beispiel I.B.3.). Das Insert war so orientiert, daß die translationale Orientierung des Inserts von IMR32 1.163 gegenläufig zu derjenigen des lacZ-Gens war, das in dem Plasmid vorlag, wie durch Analyse von Restriktionsenzymverdauungen des resultierenden Plasmids bestätigt. Dies erfolgte, um die Möglichkeit einer Expression von α_1D-Sequenzen aufgrund einer Fusion mit dem lacZ-Gen in DH5α-Zellen auszuschließen, welche mit diesem Plasmid transformiert waren. Dieses Plasmid wurde dann mit HindIII und BglII verdaut und das HindIII-BglII-Fragment (die HindIII-Stelle kommt von dem Vektor und die BglII-Stelle befindet sich bei Nt. 6220, SEQ-ID-Nr. 1) wurde eliminiert, wodurch die Nukleotide 5200 bis 6220 (SEQ-ID-Nr. 1) des IMR32 1.163-Klons eliminiert wurden und diese Sequenz aus dem Rest des Plasmids entfernt wurde, welcher das 3'-BglII-XhoI-Fragment, Nt. 6221 bis 7635 (SEQ-ID-Nr. 1), enthielt. Dann wurde pVDCCIII/3'.1 hergestellt durch Zusammenspleißen des HindIII-PvuII-Fragments von IMR32 1.80 (Nt. 4493–5296, SEQ-ID-Nr. 1), des PvuII-BglII-Fragments von IMR32 1.163 (Nt. 5294 bis 6220, SEQ-ID-Nr. 1) und des HindIII-BglII-verdauten pBluescript-Plasmids, enthaltend das 3'-BglII/XhoI-IMR32 1.163-Fragment (Nt. 6221 bis 7635, SEQ-ID-Nr. 1).
d. pVDCCIII(A): das Vollängen-α_1D-Konstrukt
Zur Konstruktion von pVDCCIII(A) wurde das DraI-HindIII-Fragment (5'-untranslatierte Sequenz, Nt. 330 bis 510, SEQ-ID-Nr. 1, und kodierende Sequenz der Nt. 511 bis 4492, SEQ-ID-Nr. 1) von pVDCCIII/5'.3 (Beispiel II.A.3.b.) isoliert, das HindIII-XhoI-Fragment von pVDCCIII/3'.1 (enthaltend die Nt. 4493 bis 7635, SEQ-ID-Nr. 1, plus die XhoI-Stelle des Adapters) (Beispiel II.A.3.c.) wurde isoliert und der Plasmidvektor, pcDNA1, wurde mit EcoRV und XhoI verdaut und auf einem Agarosegel isoliert. Die drei DNA-Fragmente wurden ligiert und MC1061-P3 (Invitrogen, San Diego, CA) wurde transformiert. Isolierte Klone wurden durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung analysiert und pVDCCIII(A) wurde identifiziert, welches die Fragmente korrekt miteinander ligiert aufwies: DraI-HindIII, HindIII-XhoI, XhoI-EcoRV mit der glattendigen DraI- und EcoRV-Stelle zusammenligiert, um das zirkuläre Plasmid zu bilden.
Der Aminoterminus der α_1D-Untereinheit wird von den sieben aufeinanderfolgenden 5'-Methionin-Codons (Nt. 511 bis 531, SEQ-ID-Nr. 1) kodiert. Dieser 5'-Anteil plus die Nt. 532 bis 537, kodierend für zwei Lysinreste, wurden aus pVDCCIII(A) deletiert und durch eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle (5'-ACCACC-3') ersetzt, um pVDCCIII.RBS(A) zu bilden. Expressionsexperimente, bei denen Transkripte dieses Konstrukts in Xenopus laevis-Oozyten injiziert wurden, führten zu keiner Erhöhung des Expresssionsniveaus rekombinanter spannungsabhängiger Calciumkanäle im Verhältnis zum Expressionsniveau in Oozyten, denen Transkripte von pVDCCIII(A) injiziert worden waren.
B. Isolierung von DNA, welche für die α_1C-Untereinheit kodiert
1. Referenzliste partieller α_1C-cDNA-Klone
Es wurden zahlreiche α_1C-spezifische cDNA-Klone isoliert, um die für α_1C kodierende Sequenz, die α_1C-Translationsinitiation und eine alternativ gesplicte Region von α_1C zu charakterisieren. SEQ-ID-Nr. 3 gibt eine für α_1C kodierende Sequenz (α_1C–1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz an; SEQ-ID-Nr. 36 gibt eine weitere Splice-Variante mit der Bezeich nung α_1C–2 an. SEQ-ID-Nr. 4 und Nr. 5 kodieren für zwei mögliche aminoterminale Enden einer α_1C-Splice-Variante. SEQ-ID-Nr. 6 kodiert für ein alternatives Exon für die IV S3-Transmembrandomäne. Andere α_1C-Varianten können konstruiert werden, indem die alternativen aminoterminalen Enden anstelle der Enden in SEQ-ID-Nr. 3 oder 36 ausgewählt werden und/oder indem das alternative Exon (SEQ-ID-Nr. 6) an der geeigneten Stelle inseriert wird, wie z. B. in SEQ-ID-Nr. 3 anstelle der Nt. 3904–3987. Darüber hinaus kann die Sequenz von 75 Nukleotiden (Nt. 1391 bis 1465 in SEQ-ID-Nr. 3) deletiert oder inseriert werden, um eine alternative α_1C-Splice-Variante zu erzeugen.
Im folgenden ist eine Liste von Klonen gezeigt, welche zur Charakterisierung der α_1C-Sequenz verwendet wurden, und die Nukleotidposition eines jeden Klons in Bezug auf die charakterisierte α_1C-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 3). Die Isolierung und Charakterisierung dieser cDNA-Klone sind unten beschrieben (Beispiel II.B.2.).
2. Isolierung und Charakterisierung von Klonen, welche in Beispiel II.B.1. beschrieben werden
a. CNS 1.30
Es wurden etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten der Human-Thalamus-cDNA-Bank Nr. 6 (Beispiel I.B.6.) mit Fragmenten der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₁-cDNA, beschrieben in Beispiel II.A.2.a., gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden sechs positive Plaques identifiziert, von denen einer CNS 1.30 war. CNS 1.30 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. CNS 1.30 kodiert für die α_1C-spezifische Sequenz der Nt. 2199 bis 3903 (SEQ-ID-Nr. 3), gefolgt von Nt. 1 bis 84 einer der beiden identifizierten alternativen α_1C-Exons (SEQ-ID-Nr. 6). CNS 1.30 enthält 3' von SEQ-ID-Nr. 6 ein Intron und somit kodiert CNS 1.30 für ein partiell gesplictes α_1C-Transkript.
b. 1.16G
Es wurden etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten einer humanen genomischen DNA-Bank auf λEMBL3-Basis (Kat.-Nr. HL1006d Clontech Corp., Palo Alto, CA) unter Verwendung eines Kaninchen-Skelettmuskel-cDNA-Fragments (Nt. –78 bis 1006, Beispiel II.A.2.a.) gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden 14 positive Plaques identifiziert, wovon einer 1.16G war. Der Klon 1.16G wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und Abschnitte wurden durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Die DNA-Sequenzierung offenbarte, daß 1.16G für eine α_1C-spezifische Sequenz kodiert wie in Beispiel II.B.1. beschrieben.
e. IMR32 1.66 und IMR32 1.67
Es wurden etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank # 5 (Beispiel I.B.5.) mit einem 151-bp-KpnI-SacI-Fragment von 1.16G (Beispiel II.B.2.b.), kodierend für eine α_1C-Sequenz (Nt. 758 bis 867, SEQ-ID-Nr. 3), gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.). Die Filter wurden dann in 0,5 × SSPE bei 65°C gewaschen. Von den positiven Plaques wurden IMR32 1.66 und IMR32 1.67 identifiziert. Die hybridisierenden Plaques wurden gereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Zwei dieser cDNA-Klone, IMR32 1.66 und 1.67, kodieren für α_1C-Untereinheiten wie beschrieben (Beispiel II.B.1.). Darüber hinaus kodiert IMR32 1.66 für ein partiell gesplictes α_1C-Transkript, das durch ein GT-Splice-Donor-Dinukleotid, beginnend an dem Nukleotid 3' von Nt. 916 (SEQ-ID-Nr. 3), gekennzeichnet ist. Die Intronsequenz innerhalb von 1.66 ist 101 Nukleotide lang. IMR32 1.66 kodiert für die α_1C-Translationsinitiation, Nt. 1 bis 3 (SEQ-ID-Nr. 3), und 132 Nt. von 5' untranslatierter Sequenz (SEQ-ID-Nr. 4) gehen dem Startcodon in IMR32 1.66 voraus.
d. IMR32 1.37 und IMR32 1.38
Es wurden etwa 2 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #1 (Beispiel I.B.1.) mit dem CNS 1.30-cDNA-Fragment (Beispiel II.B.2.a.) gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden vier positive Plaques identifiziert, plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Zwei der Klone, IMR32 1.37 und IMR32 1.38, kodieren für α_1C-spezifische Sequenzen wie in Beispiel II.B.1. beschrieben.
Ein DNA-Sequenzvergleich von IMR32 1.37 und IMR32 1.38 offenbarte, daß das α_1C-Transkript zwei Exons einschließt, welche für die IVS3-Transmembrandomäne kodieren. IMR32 1.37 besitzt ein einziges Exon, Nt. 3904 bis 3987 (SEQ-ID-Nr. 3), und IMR32 1.38 scheint anomal gesplict worden zu sein, um beide Exons, Nt. 3904 bis 3987 (SEQ-ID-Nr. 3), gefolgt von Nt. 1 bis 84 (SEQ-ID-Nr. 6), nebeneinander zu enthalten. Das alternative Splicing des α_1C-Transkripts, um eines der beiden Exons, welche für die IVS3-Region kodieren, zu enthalten, wurde bestätigt durch Vergleich der CNS 1.30-Sequenz mit der IMR32 1.37-Sequenz. CNS 1.30 enthält die Nukleotide 1 bis 84 (SEQ-ID-Nr. 6), denen die identische Sequenz vorangeht, welche in IMR32 1.37 für die Nukleotide 2199 bis 3903 (SEQ-ID-Nr. 3) enthalten ist. Wie in Beispiel II.B.2.a. beschrieben, folgt ein Intron den Nukleotiden 1 bis 84 (SEQ-ID-Nr. 6). Zwei alternative Exons wurden neben Nt. 3903 gesplict (SEQ-ID-Nr. 3), repräsentiert durch CNS 1.30 und IMR32 1.37.
e. IMR32 1.86
IMR32-cDNA-Bank #1 (Beispiel I.B.1.) wurde in doppelter Ausführung unter Verwendung der Oligonukleotid-Sonden 90–9 (Nt. 1462 bis 1491, SEQ-ID-Nr. 3) und 90–12 (Nt. 2496 bis 2520, SEQ-ID-Nr. 3) gescreent. Diese Oligonukleotid-Sonden wurden gewählt, um einen Klon zu isolieren, welcher für die α_1C-Untereinheit zwischen dem 3'-Ende von IMR32 1.67 (Nt. 1717, SEQ-ID-Nr. 3) und dem 5'-Ende von CNS 1.30 (Nt. 2199, SEQ-ID-Nr. 3) kodiert. Die Hybridisierungsbedingungen waren Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.), mit der Ausnahme, daß das 50%ige entionisierte Formamid auf 20% verringert wurde. Die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden drei positive Plaques identifiziert, von denen einer IMR32 1.86 war. IMR32 1.86 wurde plaquegereinigt, subkloniert und durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert. IMR32 1.86 kodiert für α_1C-Sequenzen wie in Beispiel II.B.1. beschrieben. Charakterisierung durch DNA-Sequenzierung offenbarte, daß IMR32 1.86 im Vergleich zu der DNA, welche für die Kaninchen-Herzmuskel-Calciumkanal-α₁-Untereinheit kodiert [Mikami et al. (1989}, Nature 340 : 230] eine Deletion von 73 Nukleotiden enthält, Nt. 2191 bis 2263. Diese fehlenden Nukleotide entsprechen den Nukleotiden 2176–2248 von SEQ-ID-Nr. 3. Nachdem das 5'-Ende von CNS 1.30 das 3'-Ende von IMR32 1.86 überlappt, werden einige dieser fehlenden Nukleotide, d. h., Nt. 2205 bis 2248 von SEQ-ID-Nr. 3, von CNS 1.30 gestellt. Die verbleiben den fehlenden Nukleotide der 73-Nukleotide-Deletion in IMR32 1.86 (d. h., Nt. 2176 bis 2204, SEQ-ID-Nr. 3) wurden mittels Nukleinsäureamplifizierungsanalyse von dbcAMP-induzierter IMR32-Zell-RNA bestimmt. Die 73-Nt.-Deletion ist eine Leserahmenverschiebungsmutation und muss somit korrigiert werden. Die exakte Human-Sequenz über diese Region (welche durch die DNA-Sequenz von CNS 1.30 und Nukleinsäureamplifizierungsanalyse von IMR32-Zell-RNA bestimmt wurde) kann in IMR32 1.86 nach Standardverfahren, z. B. Ersatz eines Restriktionsfragments oder stellengerichtete Mutagenese, eingeführt werden.
f. IMR32 1.157
Es wurden eine Million Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #4 (Beispiel I.B.4.) mit einem XhoI-EcoRI-Fragment von IMR32 1.67, kodierend für die α_1C-Nukleotide 50 bis 774 (SEQ-ID-Nr. 3); gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.). Die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Einer der identifizierten positiven Plaques war IMR32 1.157. Dieser Plaque wurde gereinigt, das Insert wurde restriktionskartiert und in einen Standardplasmidvektor pGEM7Z (Promega, Madison, WI) subkloniert. Die DNA wurde durch Sequenzierung charakterisiert. IMR32 1.157 scheint für einen alternativen 5'-Abschnitt der α_1C-Sequenz, beginnend mit Nt. 1 bis 89 (SEQ-ID-Nr. 5) und gefolgt von Nt. 1 bis 873 (SEQ-ID-Nr. 3), zu kodieren. Die Analyse der 5'-Sequenz von 1.66 und 1.157 ist unten beschrieben (Beispiel II.B.3.).
3. Charakterisierung der α_1C-Translationsinitiationsstelle
Abschnitte der Sequenzen von IMR32 1.157 (Nt. 57 bis 89, SEQ-ID-Nr. 5; Nt. 1 bis 67, SEQ-ID-Nr. 3), IMR32 1.66 (Nt. 100 bis 132, SEQ-ID-Nr. 4; Nt. 1 bis 67, SEQ-ID-Nr. 3) wurden mit der Kaninchen-Lungen-CaCB-Rezeptor-cDNA-Sequenz, Nt. –33 bis 67 [Biel et al. (1990), FEBS Lett. 269: 409], verglichen. Die Human-Sequenzen sind mögliche alternative 5'-Enden des α_1C-Transkripts, welches für die Initiationsregion der Translation kodiert. IMR32 1.66 stimmt weitgehend mit der CaCB-Rezeptor-cDNA-Sequenz überein und weicht von der CaCB-Rezeptor-cDNA-Sequenz in der 5'-Richtung, beginnend bei Nukleotid 122 (SEQ-ID-Nr. 4), ab. Das in der CaCB-Rezeptor-cDNA-Sequenz identifizierte Startcodon ist dasselbe Startcodon, welches zur Beschreibung der Nukleotide 1 bis 3 (SEQ-ID-Nr. 3) der für α_1C kodierenden Sequenz verwendet wurde.
Die Sequenzen von α_1C-Splice-Varianten, bezeichnet als α_1C–1 und α_1C–2, sind in den SEQ-ID-Nrn. 3 und 36 angegeben.
C. Isolierung partieller cDNA-Klone, welche für die α_1B-Untereinheit kodieren, und Konstruktion eines Vollängen-Klons
Eine Human-Basalganglien-cDNA-Bank wurde mit den Kaninchen-Skelettmuskel-α₁-Untereinheits-cDNA-Fragmenten (siehe Beispiel II.A.2.a. hinsichtlich einer Beschreibung der Fragmente) unter Bedingungen niedriger Stringenz gescreent. Einer der hybridisierenden Klone wurde zum Screenen einer IMR32-Zell-cDNA-Bank verwendet, um zusätzliche parfielle α_1B-cDNA-Klone zu erhalten, welche wiederum verwendet wurden, um weiter eine IMR32-Zell-cDNA-Bank hinsichtlich zusätzlicher partieller cDNA-Klone zu screenen. Einer der partiellen IMR32-α_1B-Klone wurde dazu verwendet, eine Human-Hippocampus-Bank zu screenen, um einen partiellen α_1B-Klon zu erhalten, welcher für das 3'-Ende der für α_1B kodierenden Sequenz kodiert. Die Sequenz einiger Regionen der partiellen cDNA-Klone wurden mit der Sequenz von Produkten einer Nukleinsäureamplifizierungsanalyse von IMR32-Zell-RNA verglichen, um die Genauigkeit der cDNA-Sequenzen festzustellen.
Eine Nukleinsäureamplifizierungsanalyse von IMR32-Zell-RNA und genomischer DNA unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die Sequenzen entsprachen, welche sich 5' und 3' des Stop-Codons der für die α_1B-Untereinheit kodierenden DNA befinden, offenbarte eine alternativ gesplicte, für α_1B kodierende mRNA in IMR32-Zellen. Dieses zweite mRNA-Produkt ist das Ergebnis unterschiedlichen Splicings des α_1B-Untereinheits-Transkripts, um ein weiteres Exon einzuschließen, welches in der mRNA fehlt, die der anderen 3'-α_1B-cDNA-Sequenz entspricht, welche zuerst isoliert wurde. Zur Unterscheidung dieser Splice-Varianten der α_1B-Untereinheit wird die Untereinheit, welche von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die derjenigen Form entspricht, welche das zusätzliche Exon enthält, als α_1B–1 bezeichnet (SEQ-ID-Nr. 7), wohingegen die Untereinheit, welche von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die der Form ohne das zusätzliche Exon entspricht, als α_1B–2 bezeichnet wird (SEQ-ID-Nr. 8). Die Sequenz von α_1B–1 weicht von derjenigen von α_1B–2 beginnend bei Nt. 6633 (SEQ-ID-Nr. 7) ab. Nach der Sequenz des zusätzlichen Exons in α_1B–1 (Nt. 6633 bis 6819; SEQ-ID-Nr. 7) sind die α_1B–1- und α_1B–2-Sequenzen identisch (d. h., Nt. 6820 bis 7362 in SEQ-ID-Nr. 7 und Nt. 6633 bis 7175 in SEQ-ID-Nr. 8). SEQ-ID-Nr. 7 und Nr. 8 geben 143 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz (Nt. 1 bis 143) sowie 202 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz (Nt. 7161–-7362, SEQ-ID-Nr. 7) der für α_1B–1 kodierenden DNA und 321 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz (Nt. 6855–7175, SEQ-ID-Nr. 8) der für α_1B–2 kodierenden DNA an.
Eine Nukleinsäureamplifizierungsanalyse der IS6-Region des α_1B-Transkripts offenbarte anscheinend zusätzliche Splice-Varianten, basierend auf mehreren Fragmentgrößen, die auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegel, welches die Produkte der Amplifizierungsreaktion enthielt, beobachtet wurden.
Ein Vollängen-α_1B–1-cDNA-Klon mit der Bezeichnung pcDNA-α_1B–1 wurde in einem achtstufigen Verfahren wie folgt hergestellt:

Schritt 1: Die SacI-Restriktionsstelle von pGEM3 (Promega, Madison, WI) wurde durch Verdauung an der SacI-Stelle zerstört, es wurden glatte Enden durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase gebildet und erneut ligiert. Der neue Vektor wurde als pGEMΔSac bezeichnet.
Schritt 2: Fragment 1 (HindIII/KpnI; Nt. 2337 bis 4303 von SEQ-ID-Nr. 7) wurde in mit HindIII/KpnI verdautes pGEM3ΔSac ligiert, um pα1.177HK zu ergeben.
Schritt 3: Fragment 1 besitzt eine Deletion von zwei Nukleotiden (Nt. 3852 und 3853 von SEQ-ID-Nr. 7). Die Deletion wurde repariert durch Insertion eines amplifizierten Fragments (Fragment 2) von IMR32-RNA in pα1.177HK, So wurde Fragment 2 (NarI/KpnI; Nt. 3828 bis 4303 von SEQ-ID-Nr. 7) in mit NarI/KpnI verdautes pα1.177HK inseriert, was den NarI/KpnI-Abschnitt von Fragment 1 ersetzte und pα1.177HK/PCR ergab.
Schritt 4: Fragment 3 (KpnI/KpnI; Nt. 4303 bis 5663 von SEQ-ID-Nr. 7) wurde in mit KpnI verdautes pα1.177HK/PCR ligiert, um pα1B5'K zu ergeben.
Schritt 5: Fragment 4 (EcoRI/HindIII; EcoRI-Adapter plus Nt. 1 bis 2337 von SEQ-ID-Nr. 7) und Fragment 5 (HindIII/XhoI-Fragment von pα1B5'K; Nt. 2337 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7) wurden zusammen in mit EcoRI/XhoI verdautes pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert, um pα1B5' zu ergeben.
Schritt 6: Fragment 6 (EcoRI/EcoRI; EcoRI-Adapter auf beiden Enden plus Nt. 5749 bis 7362 von SEQ-ID-Nr. 7) wurde in mit EcoRI verdautes pBluescript II KS (Stratagene, La Jolla, CA) mit dem 5'-Ende des Fragments proximal zur KpnI-Stelle in dem Polylinker ligiert, um pα1.230 zu ergeben.
Schritt 7: Fragment 7 (KpnI/XhoI; Nt. 4303 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7) und Fragment 8 (XhoI/CspI; Nt. 5446 bis 6259 von SEQ-ID-Nr. 7) wurden in mit KpnI/CspI verdautes pα1.230 (entfernt die Nt. 5749 bis 6259 von SEQ-ID-Nr. 7, welche in pα1.230 kodiert war, und beläßt die Nt. 6259 bis 7362 von SEQ-ID-Nr. 7) ligiert, um pα1B3' zu ergeben.
Schritt 8: Fragment 9 (SphI/XhoI; Nt. 4993 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7) und Fragment 10 (XhoI/XbaI von pα1 B3'; Nt. 5446 bis 7319 von SEQ-ID-Nr. 7) wurden in mit SphI/XbaI verdautes pα1B5' (entfernt die Nt. 4993 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7, welche in pα1 B5' kodiert waren, und beläßt die Nt. 1 bis 4850 von SEQ-ID-Nr. 7) ligiert, um pcDNAα_1B–1 zu ergeben.

Das resultierende Konstrukt, pcDNAα_1B–1, enthält in pcDNA1 einen kodierenden Bereich voller Länge, kodierend für α_1B–1 (Nt. 144–7362, SEQ-ID-Nr. 7), plus 5'-untranslatierte Sequenz (Nt. 1–143, SEQ-ID-Nr. 7) und 3'-untranslatierte Sequenz (Nt. 7161–7319, SEQ-ID-Nr. 7) unter der transkriptionalen Kontrolle des CMV-Promotors.
D. Isolierung von DNA, welche für humane Calciumkanal-α _1A-Untereinheiten kodiert
1. Isolierung partieller Klone
DNA-Klone, welche für Teile von humanen Calciumkanal-α_1A-Untereinheiten kodierten, wurden erhalten durch Hybridisierungsscreening von Human-Cerebellum-cDNA-Banken und Nukleinsäureamplifizierung von Human-Cerebellum-RNA. Klone, die dem 3'-Ende der für α_1A kodierenden Sequenz entsprachen, wurden isoliert durch Screening von 1 × 10⁶ Rekombinanten einer statistisch geprimten Cerebellum-cDNA-Bank (größenselektioniert hinsichtlich Inserts von mehr als 2,8 kb Länge) unter Bedingungen niedriger Stringenz (6 × SSPE, 5 × Denharts Lösung, 0,2% SDS, 200 μg/ml beschallte Heringssperma-DNA, 42°C) mit Oligonukleotid 704, welches die Nt. 6190–6217 der für Ratten-α_1A kodierenden Sequenz enthielt [Starr et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 5621–5625]. Waschschritte wurden unter Bedingungen niedriger Stringenz durchgeführt. Es wurden mehrere Klone gereinigt, welche mit der Sonde hybridisierten, (Klone α1.251–α1.259 und α1.244) und durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Mindestens zwei der Klone, α1.244 und α1.254, enthielten ein Translationsterminationscodon. Obwohl die Klone α1.244 und α1.254 unterschiedliche Längen aufweisen, enthalten sie beide eine Sequenz von Nukleotiden, welche dem äußersten 3'- Ende des α_1A-Transkripts entspricht, d.h., die beiden Klone überlappen. Diese beiden Klone sind im Überlappungsbereich identisch, mit Ausnahme dessen, daß der Klon α1.244 eine Sequenz von 5 und eine Sequenz von 12 Nukleotiden enthält, welche in α1.254 nicht vorhanden sind.
Um zusätzliche für α_1A kodierende Klone zu erhalten, wurden 1 × 10⁶ Rekombinanten einer statistisch geprimten Cerebellum-cDNA-Bank (größenselektioniert hinsichtlich Inserts im Bereich von 1,0 bis 2,8 kb Länge) hinsichtlich Hybridisierung mit drei Oligonukleotiden gescreent: Oligonukleotid 701 (enthaltend die Nukleotide 2288 bis 2315 der für Ratten-α_1A kodierenden Sequenz), Oligonukleotid 702 (enthaltend die Nukleotide 3559–3585 der für Ratten-α_1A kodierenden Sequenz) und Oligonukleotid 703 (enthaltend die Nukleotide 4798–-4827 der für Ratten-α_1A kodierenden Sequenz). Hybridisierung und Waschschritte erfolgten unter Anwendung derselben Bedingungen wie für das erste Screening mit Oligonukleotid 704 angewandt, mit der Ausnahme, daß die Waschschritte bei 45°C durchgeführt wurden. 20 Klone (Klone α1.269–α1.288) hybridisierten mit der Sonde. Mehrere Klone wurden plaquegereinigt und durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Ein Klon, α1.279, enthielt eine Sequenz von etwa 170 Nukleotiden, welche in anderen Klonen nicht vorliegt, die derselben Region der kodierenden Sequenz entsprechen. Diese Region kann in anderen Splice-Varianten vorhanden sein. Keiner der Klone enthielt ein Translationsinitiationscodon.
Für den Erhalt von Klonen, die dem 5'-Ende der für Human-α_1A kodierenden Sequenz entsprachen, wurde eine weitere Cerebellum-cDNA-Bank erstellt unter Verwendung des Oligonukleotids 720 (enthaltend die Nukleotide 2485–2510 von SEQ-ID-Nr. 22), um spezifisch die cDNA-Synthese des ersten Strangs zu primen. Die Bank (8 × 10⁵ Rekombinanten) wurde hinsichtlich Hybridisierung mit drei Oligonukleotiden: Oligonukleotid 701, Oligonukleotid 726 (enthaltend die Nukleotide 2333–2360 der für Ratten-α_1A kodierenden Sequenz) und Oligonukleotid 700 (enthaltend die Nukleotide 767–796 der für Ratten-α_1A kodierenden Sequenz) unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen niedriger Stringenz gescreent. Etwa 50 Plaques hybridisierten mit der Sonde. Die hybridisierenden Klone α1.381–α1.390 wurden plaquegereinigt und durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Mindestens einer der Klone, α1.381, enthielt ein Translationsinitiationscodon.
Eine Zuordnung der Sequenzen der gereinigten Klone offenbarte, daß die Sequenzen überlappten, um die für α_1A kodierende vollständige Sequenz zu umfassen. Jedoch enthielten nicht alle überlappenden Sequenzen von partiellen Klonen günstige Enzymrestriktionsstellen zur Verwendung bei der Ligierung partieller Klone, um eine für α_1A kodierende Sequenz voller Länge zu konstruieren. Zum Erhalt von DNA-Fragmenten, welche günstige Restriktionsenzymstellen enthielten, die zur Konstruktion einer Vollängen-α_1A-DNA verwendet werden konnten, wurde cDNA von RNA synthetisiert, die aus Human-Cerebellum-Gewebe isoliert und einer Nukleinsäureamplifizierung unterworfen worden war. Die als Primer verwendeten Oligonukleotide entsprachen für Human-α_1A kodierender Sequenz, die sich 5' und 3' von ausgewählten Restriktionsenzymstellen befand. So wurden bei der ersten Amplifizierungsreaktion die Oligonukleotide 753 (enthaltend die Nukleotide 2368–2391 von SEQ-ID-Nr. 22) und 728 (enthaltend die Nukleotide 3179–3202 von SEQ-ID-Nr. 22) als Primerpaar eingesetzt. Zur Bereitstellung einer ausreichenden Menge des gewünschten DNA-Fragments wurde das Produkt dieser Amplifizierung unter Verwendung der Oligonukleotide 753 und 754 (enthaltend die Nukleotide 3112–3135 von SEQ-ID-Nr. 22) als Primerpaar erneut amplifiziert. Das resultierende Produkt besaß eine Länge von 768 Basenpaaren. Bei der zweiten Amplifizierungsreaktion wurden die Oligonukleotide 719 (enthaltend die Nukleotide 4950–4975 von SEQ-ID-Nr. 22) und 752 (enthaltend die Nukleotide 5647–-5670 von SEQ-ID-Nr. 22) als Primerpaar verwendet. Zur Bereitstellung einer ausreichenden Menge des gewünschten zweiten DNA-Fragments wurde das Produkt dieser Amplifizierung erneut unter Verwendung der Oligonukleotide 756 (enthaltend die Nukleotide 5112–5135 von SEQ-ID-Nr. 22) und 752 als Primerpaar amplifiziert. Das resultierende Produkt besaß eine Länge von 559 Basenpaaren.
2. Konstruktion von für α_1A kodierenden Sequenzen voller Länge
Abschnitte des Klons α1.381, des 768-bp-Nukleinsäureamplifizierungsprodukts, des Klons α1.278, des 559-bp-Nukleinsäureamplifizierungsprodukts, und des Klons α1.244 wurden an günstigen Restriktionsstellen ligiert, um eine für α_1A kodierende Sequenz voller Länge zu erzeugen, die als α_1A–1 bezeichnet wird.
Ein Vergleich der Sequenzanalyse-Ergebnisse der Klone α1.244 und α1.254 zeigte an, daß das primäre Transkript des α_1A-Untereinheits-Gens alternativ gesplict wird, um mindestens zwei Varianten-mRNAs zu ergeben, die für verschiedene Formen der α_1A-Untereinheit kodieren. Eine Form, α_1A–1, wird von der in SEQ-ID-Nr. 22 dargestellten Sequenz kodiert. Die Sequenz, welche für eine zweite Form, α_1A–2, kodiert, unterscheidet sich von der für α_1A–1 kodierenden Sequenz am 3'-Ende darin, daß ihr eine Sequenz von 5 Nukleotiden fehlt, die im Klon α1.244 gefunden wird (Nt. 7035–7039 von SEQ-ID-Nr. 22). Diese Deletion verschiebt den Leserahmen und führt ein Translationsterminationscodon ein, was zu einer für α_1A–2 kodierenden Sequenz führt, welche für eine kürzere α_1A-Untereinheit kodiert als diejenige, welche von der α_1A–1-Splice-Variante kodiert wird. Folglich ist ein Teil des 3'-Endes der für α_1A–1 kodierenden Sequenz tatsächlich 3'-untranslatierte Sequenz in der α_1A–2-DNA. Die vollständige Sequenz von α_1A–2, welche durch Ligierung von Abschnitten des Klons α1.381, des 768-bp-Nukleinsäureamplifizierungsprodukts, des Klons α1.278, des 559-bp-Nukleinsäureamplifizierungsprodukts, und des Klons α1.254 konstruiert werden kann, ist in SEQ-ID-Nr. 23 angegeben.
E. Isolierung von DNA, welche für die α_1E-Untereinheit kodiert
DNA, welche für α_1E-Untereinheiten des humanen Calciumkanals kodiert, wurde aus Human-Hippocampus-Banken isoliert. Die ausgewählten Klone wurden sequenziert. Eine DNA-Sequenzanalyse von DNA-Klonen, welche für die α_1E-Unterheit kodierten, zeigte an, daß mindestens zwei alternativ gesplicte Formen desselben primären α_1E-Untereinheits-Transkripts exprimiert werden. Eine Form hat die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Sequenz und erhielt die Bezeichnung α_1E–1 und die andere, welche die Sequenz aufweist, die durch Insertion eines 57-Rasenpaar-Fragments zwischen den Nukleotiden 2405 und 2406 von SEQ-ID-Nr. 24 erhalten wird, erhielt die Bezeichnung α_1E–3. Die resultierende Sequenz ist in SEQ-ID-Nr. 25 angegeben.
Die Untereinheit mit der Bezeichnung α_1E–1 besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von 254.836 und die Untereinheit mit der Bezeichnung α_1E–3 hat ein berechnetes Molekulargewicht von 257.348. α_1E–3 hat im Vergleich zu α_1E–1 in dem Bereich, welcher die zytoplasmatische Schleife zwischen den Transmembrandomänen IIS6 und IIIS1 zu sein scheint, eine Insertion von 19 Aminosäuren (kodiert von SEQ-ID-Nr. 25).
Beispiel III: Isolierung von cDNA-Klonen, welche für die humane neuronale Calciumkanal-β₁-Untereinheit kodieren
A. Isolierung partieller cDNA-Klone, welche für die β-Untereinheit kodieren, und Konstruktion eines Vollängen-Klons, welcher für die β₁-Untereinheit kodiert
Eine Human-Hippocampus-cDNA-Bank wurde mit einem Fragment der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-β₁-Untereinheits-cDNA (Nt. 441 bis 1379) [hinsichtlich der Isolierung und Sequenz der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-β₁-Untereinheits-cDNA siehe US-Patent Nr. 5386025 oder Ruth et al. (1989), Science 245: 1115] unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.) gescreent. Ein Teil eines der hybridisierenden Klone wurde zum erneuten Screening der Hippocampus-Bank verwendet, um zusätzliche cDNA-Klone zu erhalten. Die cDNA-Inserts hybrisierender Klone wurden durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert und mit der cDNA-Sequenz der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-β₁-Untereinheit verglichen.
Abschnitte der partiellen β₁-Untereinheits-cDNA-Klone wurden ligiert, um einen Volllängen-Klon zu bilden, der für die gesamte β₁-Untereinheit kodiert. SEQ-ID-Nr. 9 zeigt die für die β₁-Untereinheit kodierende Sequenz (Nt. 1–1434) sowie einen Teil der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1435–1546). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist ebenfalls in SEQ-ID-Nr. 9 bereitgestellt. Zur Durchführung von Expressionsexperimenten wurden Vollängen-β₁-Untereinheits-cDNA-Klone wie folgt konstruiert.

Schritt 1: Das DNA-Fragment 1 (~800 bp 5'-untranslatierter Sequenz plus Nt. 1–277 von SEQ-ID-Nr. 9) wurde mit dem DNA-Fragment 2 (Nt. 277–1546 von SEQ-ID-Nr. 9 plus 448 bp Intronsequenz) ligiert und in pGEM7Z kloniert. Das resultierende Plasmid, pβ1-1.18, enthielt einen Vollängen-β₁-Untereinheits-Klon, der ein 448-bp-Intron umfaßte.
Schritt 2: Für den Ersatz der 5'-untranslatierten Sequenz von pβ1-1.18 mit einer Ribosomen-Bindungsstelle wurde ein doppelsträngiger Adapter synthetisiert, der eine EcoRI-Stelle, eine Sequenz, die für eine Ribosomen-Bindungsstelle kodiert (5'-ACCACC-3'), und die Nukleotide 1–25 von SEQ-ID-Nr. 9 enthält. Der Adapter wurde mit SmaI-verdautem pβ1-1.18 ligiert und die Produkte der Ligierungsreaktion wurden mit EcoRI verdaut.
Schritt 3: Das EcoRI-Fragment aus Schritt 2, enthaltend den EcoRI-Adapter, eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und die Nukleotide 1–1546 von SEQ-ID-Nr. 9 plus Intronsequenz, wurde in einen Plasmidvektor kloniert und als pβ1-1.18RBS bezeichnet. Das EcoRI-Fragment von pβ1-1.18RBS wurde in EcoRI-verdautes pcDNA1 mit dem Initiationscodon proximal zum CMV-Promotor subkloniert, um pHBCaCHβ_1aRBS(A) zu bilden.
Schritt 4: Zur Bildung eines Vollängen-Klons, der für die β₁-Untereinheit ohne die Intron-Sequenz kodierte, wurde das DNA-Fragment 3 (Nt. 69–1146 von SEQ-ID-Nr. 9 plus 448 bp Intronsequenz, gefolgt von den Nukleotiden 1147–1546 von SEQ-ID-Nr. 9) einer stellengerichteten Mutagenese unterworfen, um die Intron-Sequenz zu deletieren, was pβ1(–) ergab. Das EcoRI-XhoI-Fragment von pβ1-1.18RBS (enthaltend die Ribosomen-Bindungsstelle und Nt. 1–277 von SEQ-ID-Nr. 9) wurde mit dem XhoI-EcoRI-Fragment von pβ1(–) (enthaltend die Nukleotide 277–1546 von SEQ-ID-Nr. 9) ligiert und in pcDNA1 mit der Translationsinitiation proximal zum CMV-Promotor kloniert. Das resultierende Expressionsplasmid erhielt die Bezeichnung pHBCaCHβ_1bRBS(A).

B. Splice-Variante β_1-3
Eine DNA-Sequenzanalyse der DNA-Klone, welche für die β₁-Untereinheit kodierten, zeigte an, daß im ZNS mindestens zwei alternativ gesplicte Formen desselben primären Human-β₁-Untereinheits-Transkripts exprimiert werden. Eine Form wird durch die in SEQ-ID-Nr. 9 gezeigte Sequenz dargestellt und wird als β_1-2 bezeichnet. Die Sequenzen von β_1-2 und der alternativen Form, β_1-3, divergieren bei Nt. 1334 (SEQ-ID-Nr. 9). Die vollständige β_1-3-Sequenz (Nt. 1–1851), einschließlich 3'-untranslatierter Sequenz (Nt. 1795–1851), ist in SEQ-ID-Nr. 10 angegeben.
Beispiel IV: Isolierung von cDNA-Klonen, welche für die humane neuronale Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodieren
A. Isolierung von cDNA-Klonen
Die für neuronale Human-α₂ kodierende vollständige Sequenz (Nt. 35–3310) plus ein Teil der 5'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1 bis 34) sowie ein Teil der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 3311–3600) ist in SEQ-ID-Nr. 11 angegeben.
Zur Isolierung von DNA, welche für die neuronale Human-α₂-Untereinheit kodiert, wurden zuerst genomische Human-α₂-Klone durch Sondierung von humanen genomischen Southernblots unter Verwendung eines Fragments der Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₂-Untereinheits-cDNA [Nt. 43 bis 272, Ellis et al. (1988), Science 240: 1661] isoliert.
Genomische Human-DNA wurde mit EcoRI verdaut, elektrophoresiert, geblottet und mit der Kaninchen-Skelettmuskel-Sonde unter Anwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.) und Waschbedingungen niedriger Stringenz (Beispiel I.C.) sondiert. Es wurden zwei Restriktionsfragmente identifiziert, 3,5 kb und 3,0 kb. Diese EcoRI-Restriktionsfragmente wurden kloniert durch Erstellung einer λgt11-Bank, welche genomische Human-EcoRI-Fragmente im Bereich von 2,2 kb bis 4,3 kb enthielt. Die Bank wurde wie oben beschrieben unter Verwendung der Kaninchen-α₂-Sonde gescreent, hybridisierende Klone wurden isoliert und mittels DNA-Sequenzierung charakterisiert. HGCaCHα2.20 enthielt das 3,5-kb-Fragment und HGCaCHα2.9 enthielt das 3,0-kb-Fragment.
Eine Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung offenbarte, daß HGCaCHα2.20 ein 82-bp-Exon (Nt. 130 bis 211 der für Human-α₂ kodierenden Sequenz, SEQ-ID-Nr. 11) auf einem PstI-XbaI-Restriktionsfragment von 650 bp enthält und daß HGCaCHα2.9 105 bp eines Exons (Nt. 212 bis 316 der kodierenden Sequenz, SEQ-ID-Nr. 11) auf einem XbaI-BglII-Restriktionsfragment von 750 bp enthält. Diese Restriktionsfragmente wurden zum Screenen der Human-Basalganglien-cDNA-Bank eingesetzt (Beispiel II.C.2.a.).
HBCaCHα2.1 wurde isoliert (Nt. 29 bis 1163, SEQ-ID-Nr. 11) und zum Screenen einer Human-Hirnstamm-cDNA-Bank (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 37432), erhalten von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, verwendet. Es wurden zwei Klone isoliert, HBCaCHα2.5 (Nt. 1 bis 1162, SEQ-ID-Nr. 11) und HBCaCHα2.8 (Nt. 714 bis 1562, SEQ-ID-Nr. 11, gefolgt von 1600 Nukleotiden intervenierender Sequenz). Ein 2400-bp-Fragment von HBCaCHα2.8 (bei Nt. 759 von SEQ-ID-Nr. 11 beginnend und bei einer Smai-Stelle in dem Intron endend) wurde zum erneuten Screenen der Hirnstamm-Bank und zur Isolierung von HBCaCHα2.11 (Nt. 879 bis 3600, SEQ-ID-Nr. 11) eingesetzt. Die Klone HBCaCHα2.5 und HBCaCHα2.11 überlappen, um für ein vollständiges Humangehirn-α₂-Protein zu kodieren.
B. Konstruktion von pHBCaCHα₂A
Zur Konstruktion von pHBCaCHα₂A, enthaltend DNA, die für eine humane Vollängen-Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodiert, wurden ein (EcoRI)-PvuII-Fragment von HBCaCHα2.5 (Nt. 1 bis 1061, SEQ-ID-Nr. 11, EcoRI-Adapter, partieller PvuII-Verdau) und ein PvuII-PstI-Fragment von HBCaCHα2.11 (Nt. 1061 bis 2424, SEQ-ID-Nr. 11; partieller PvuII-Verdau) in EcoRI-PstI-verdautes pIBI24 (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert. Anschließend wurde ein (EcoRI)-PstI-Fragment (Nt. 1 bis 2424, SEQ-ID-Nr. 11) isoliert und mit einem PstI-(EcoRI)-Fragment (Nt. 2424 bis 3600, SEQ-ID-Nr. 11) von HBCaCHα2.11 in EcoRI-verdautes pIBI24 ligiert, um DNA, HBCaCHα2, herzustellen, die für eine Vollängen-Humangehirn-α₂-Untereinheit kodiert. Das 3600-bp-EcoRI-Insert von HBCaCHα2 (Nt. 1 bis 3600, SEQ-ID-Nr. 11) wurde mit dem Methionin-Initiationscodon proximal zum CMV-Promotor in pcDNA1 subkloniert (pHBCaCHα2A). Das 3600-bp-EcoRI-Insert von HBCaCHα2 wurde auch subkloniert in pSV2dHFR [Subramani et al. (1981), Mol. Cell. Biol. 1: 854–864], welches den frühen SV40-Promotor, das Maus-Dihydrofolatreduktase (dhfr)-Gen, SV40-Polyadenylierungs- und Splice-Stellen und Sequenzen, welche zur Aufrechterhaltung des Vektors in Bakterien erforderlich sind, enthält.
Beispiel V: Unterschiedliche Prozessierung des Human-β₁-Transkripts und des Human-α₂-Transkripts
A. Unterschiedliche Prozessierung des β₂-Transkripts
Eine Nukleinsäureamplifizierungsanalyse des Human-β₁-Transkripts, das im Skelettmuskel, in der Aorta, im Hippocampus und in Basalganglien und HEK 293-Zellen vorliegt, offenbarte eine unterschiedliche Prozessierung der Region, die den Nukleotiden 615–781 von SEQ-ID-Nr. 9 entspricht, in jedem der Gewebe. Vier verschiedene Sequenzen, welche fünf unterschiedlich prozessierte β₁-Transkripte über diese Region ergeben, wurden identifiziert. Die β₁-Transkripte von den verschiedenen Geweben enthielten unterschiedliche Kombinationen der vier Sequenzen, mit Ausnahme eines der in HEK 293-Zellen exprimierten β₁-Transkripte (β_1-5), dem alle vier Sequenzen fehlten.
Keines der β₁-Transkripte enthielt jede der vier Sequenzen; zur leichteren Bezugnahme sind jedoch alle vier Sequenzen mit ihren Enden aneinandergefügt als einzige lange Sequenz in SEQ-ID-Nr. 12 angegeben. Die vier Sequenzen, welche unterschiedlich prozessiert werden, sind Sequenz 1 (Nt. 14–34 in SEQ-ID-Nr. 12), Sequenz 2 (Nt. 35–55 in SEQ-ID-Nr. 12), Sequenz 3 (Nt. 56–190 in SEQ-ID-Nr. 12) und Sequenz 4 (Nt. 191–271 in SEQ-ID-Nr. 12). Die Formen des β₁-Transkripts, welche identifiziert wurden, schließen ein: (1) eine Form, der die Sequenz 1 fehlt, bezeichnet als β_1-1(exprimiert im Skelettmuskel), (2) eine Form, der die Sequenzen 2 und 3 fehlen, bezeichnet als β_1-2(exprimiert im ZNS), (3) eine Form, der die Sequenzen 1, 2 und 3 fehlen, bezeichnet als β_1-4 (exprimiert in der Aorta und in HEK-Zellen), und (4) eine Form, der die Sequenzen 1m4 fehlen, bezeichnet als β_1-5 (exprimiert in HEK-Zellen). Ferner enthalten die β_1-4- und β_1-5-Formen ein Guanin-Nukleotid (Nt. 13 in SEQ-ID-Nr. 12), welches in den β_1-1- und β_1-2-Formen fehlt. Die Sequenzen von β₁-Splice-Varianten sind in den SEQ-ID-Nrn. 9, 10 und 33–35 angegeben.
B. Unterschiedliche Prozessierung von Transkripten, welche für die α₂-Untereinheit kodieren
Die für neuronale Human-α₂ kodierende vollständige Sequenz (Nt. 35m3307) plus ein Teil der 5'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1 bis 34) sowie ein Teil der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 3308m3600) ist als SEQ-ID-Nr. 11 angegeben.
Eine Nukleinsäureamplifizierungsanalyse des Human-α₂-Transkripts, das im Skelettmuskel, in der Aorta und im ZNS vorliegt, offenbarte eine unterschiedliche Prozessierung der Region, welche den Nukleotiden 1595–1942 von SEQ-ID-Nr. 11 entspricht, in jedem der Gewebe.
Die Analyse zeigte, daß das primäre Transkript der genomischen DNA, welches die Nt. 1595–1942 entsprechenden Nukleotide einschließt, auch eine zusätzliche Sequenz einschließt (SEQ-ID-Nr. 13: 5'CCTATTGGTGTAGGTATACCAACAATTAATTTAAGAAAAAGGAGACCCAATATCCAG 3'), die zwischen den Nukleotiden 1624 und 1625 von SEQ-ID-Nr. 11 inseriert ist. Es wurden fünf alternativ gesplicte Varianten-Transkripte identifiziert, welche sich hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von einem bis drei verschiedenen Abschnitten der Region des primären Transkripts, welche die Region von Nt. 1595–1942 von SEQ-ID-Nr. 11 plus SEQ-ID-Nr. 13, zwischen den Nukleotiden 1624 und 1625 inseriert, einschließt, unterscheiden. Die fünf für α₂ kodierenden Transkripte aus den verschiedenen Geweben schließen unterschiedliche Kombinationen der drei Sequenzen ein, mit Ausnahme eines der in der Aorta exprimierten α₂-Transkripte, dem alle drei Sequenzen fehlen. Keines der α₂-Transkripte enthielt jede der drei Sequenzen. Die Sequenzen der drei Regionen, welche unterschiedlich prozessiert werden, sind die Sequenz 1 (SEQ-ID-Nr. 13), Sequenz 2 (5' AACCCCAAATCTCAG 3', welches die Nt. 1625–1639 von SEQ-ID-Nr. 11 sind) und Sequenz 3 (5' CAAAAAAGGGCAAAATGAAGG 3', welches die Nt. 1908–1928 von SEQ-ID-Nr. 11 sind). Die fünf identifizierten α₂-Formen sind (1) eine Form, der die Sequenz 3 fehlt, bezeichnet als α_2a(exprimiert im Skelettmuskel), (2) eine Form, der die Sequenz 1 fehlt, bezeichnet als α_2b (exprimiert im ZNS), (3) eine Form, der die Sequenzen 1 und 2 fehlen, bezeichnet als α_2c (exprimiert in der Aorta), (4) eine Form, der die Sequenzen 1, 2 und 3 fehlen, bezeichnet als α_2d (exprimiert in der Aorta), und (5) eine Form, der die Sequenzen 1 und 3 fehlen, bezeichnet als α_2e (exprimiert in der Aorta).
Die Sequenzen von α_2a-α_2e sind in den SEQ-ID-Nrn. 11 (α_2b), 29 (α_2a) bzw. 30 bis 32 (α_2c-α_2e) angegeben.
Beispiel VII: Isolierung von cDNA-Klonen, welche für die humane neuronale Calciumcanal-β₂-Untereinheit kodieren
Isolierung von DNA, welche für humane Calciumkanal-β₂-Untereinheiten kodiert
Die Sequenzierung von Klonen, welche wie in Beispiel III beschrieben isoliert worden waren, offenbarte einen Klon, der für eine humane neuronale Calciumkanal-β₂-Untereinheit kodiert (bezeichnet als β_2D, siehe SEQ-ID-Nr. 26). Ein Oligonukleotid, das auf dem 5'-Ende dieses Klons basierte, wurde zum Primen einer Human-Hippocampus-cDNA-Bank verwendet. Die Bank wurde mit diesem β₂-Klon unter Bedingungen von niedriger bis mittlerer Stringenz gescreent (letzter Waschschritt 0,5 × SSPE, 50°C). Es wurden mehrere hybridisierende Klone isoliert und sequenziert. Unter diesen Klonen waren diejenigen, welche für β_2C, β_2D und β_2E kodieren. Beispielsweise ist die Sequenz von β_2C in SEQ-ID-Nr. 37 angegeben und die Sequenz von β_2E ist in SEQ-ID-Nr. 38 angegeben.
Eine statistisch geprimte Hippocampus-Bank wurde dann unter Verwendung einer Kombination des für β_2D kodierenden Klons und eines Abschnitts des β₃-Klons, der unter ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69048 hinterlegt wurde, gescreent. Es wurden mehrere hybridisierende Klone isoliert. Unter diesen waren Klone mit der Bezeichnung β101, β102 und β104. β101 scheint für das 5'-Ende einer Splice-Variante von β₂ mit der Bezeichnung β_2E zu kodieren. β102 und β104 kodieren für Abschnitte des 3'-Endes von β₂.
Es scheint, daß die β₂-Splice-Varianten die Nukleotide 182–2294 von SEQ-ID-Nr. 26 einschließen und sich nur im Startcodon und den Nukleotiden, welche 212 von SEQ-ID-Nr. 26 entsprechen, unterscheiden.
Beispiel VIII: Isolierung von cDNA-Klonen, welche für humane Calciumkanal-β₄- und -β₃-Untereinheiten kodieren
A. Isolierung von cDNA-Klonen, welche für eine humane β₄-Untereinheit kodieren
Ein Klon, enthaltend ein Translationsinitiationscodon und etwa 60% der für β₄ kodierenden Sequenz, wurde aus einer Human-Cerebellum-cDNA-Bank erhalten (siehe Nt. 1–894 von SEQ-ID-Nr. 27). Zum Erhalt von DNA, welche für den verbleibenden 3'-Abschnitt der für β₄ kodierenden Sequenz kodierte, wurde eine Human-Cerebellum-cDNA-Bank hinsichtlich Hybridisierung mit einem Nukleinsäureamplifizierungsprodukt unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen hoher Stringenz gescreent. Hybridisierende Klone werden gereinigt und durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert, um diejenigen zu identifizieren, welche eine Sequenz, die dem 3'-Ende der für eine β₄-Untereinheit kodier enden Sequenz entspricht, und ein Terminationscodon enthalten. Ausgewählte Klone werden mit dem Klon, der die 5'-Hälfte der für β₄ kodierenden Sequenz enthält, an günstigen Restriktionsstellen ligiert, um eine Vollängen-cDNA zu erzeugen, die für eine β₄-Untereinheit kodiert. Die Sequenz eines Vollängen-β₄-Klons ist in SEQ-ID-Nr. 27 angegeben; die Aminosäuresequenz ist in SEQ-ID-Nr. 28 angegeben.
B. Isolierung von cDNA-Klonen, welche für eine humane β₃-Untereinheit kodieren
Die Sequenzierung von Klonen, die wie in Beispiel III beschrieben isoliert worden waren, offenbarte auch einen Klon, der für eine humane neuronale Calciumkanal-β₃-Untereinheit kodierte. Dieser Klon wurde als Plasmid β1.42 hinterlegt (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69048).
Zur Isolierung eines Vollängen-cDNA-Klons, der für eine vollständige β₃-Untereinheit kodiert, wurde eine Human-Hippocampus-cDNA-Bank (Stratagene, La Jolla, CA) hinsichtlich Hybridisierung mit einem 5'-EcoRI-PstI-Fragment der für β_1-2 kodierenden cDNA unter Hybridisierungsbedingungen (20%iges entionisiertes Formamid, 200 μg/ml beschallte Heringssperma-DNA, 5 × SSPE, 5 × Denhardts Lösung, 42°C) und Waschbedingungen niedrigerer Stringenz gescreent. Einer der hybridisierenden Klone enthielt sowohl Translationsinitiations- als auch -terminationscodons und kodiert für eine vollständige β₃-Untereinheit mit der Bezeichnung β_3-1 (SEQ-ID-Nr. 19). In vitro-Transkripte der cDNA wurden hergestellt und zusammen mit Transkripten der α_1B–1- und α_2b-cDNAs unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in Beispiel IX.D. beschrieben in Xenopus-Oozyten injiziert. Zweielektroden-Spannungsklammer-Aufzeichnungen der Oozyten offenbarten signifikante spannungsabhängige, einwärts gerichtete Ba²⁺-Ströme.
Ein zusätzlicher, für eine β₃-Untereinheit kodierender Klon, als β_3-2 bezeichnet, wurde durch Screenen einer Human-Cerebellum-cDNA-Bank hinsichtlich Hybridisierung mit dem in Beispiel VIII.A. angegebenen Nukleinsäureamplifizierungsprodukt unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen niedrigerer Stringenz (20%iges entionisiertes Formamid, 200 μg/ml beschallte Heringssperma-DNA, 5 × SSPE, 5 × Denhardts Lösung, 42°C) erhalten. Die 5'-Enden dieses Klons (SEQ-ID-Nr. 20, β_3-2) und der ersten β₃-Untereinheit, als β_3-1 bezeichnet (SEQ-ID-Nr. 19), unterscheiden sich an ihren 5'-Enden und sind Splice-Varianten des β₃-Gens.
Beispiel IX: Rekombinante Expression von cDNA und RNA-Transkripten, kodierend für humane neuronale Calciumkanal-Untereinheiten, in Säugerzellen
A. Rekombinante Expression der cDNA der humanen neuronalen Calciumkanal-α₂-Untereinheit in DG44-Zellen
1. Stabile Transfektion von DG44-Zellen
DG44-Zellen [dhfr^–-Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters; siehe z. B. Urlaub, G., et al. (1986), Som. Cell Molec. Genet. 12: 555–566], erhalten von Lawrence Chasin an der Columbia University, wurden mittels CaPO₄-Präzipitationsverfahren [Wigler et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373–1376] mit dem Vektor pSV2dhfr, enthaltend die humane neuronale Calciumkanal-α₂-Untereinheits-cDNA (siehe Beispiel IV), zur polycistronischen Expression/Selektion in transfizierten Zellen stabil transfiziert. Die Transfektanten wurden auf Medium mit 10% DMEM ohne Hypoxanthin oder Thymidin gezüchtet, um Zellen zu selektionieren, welche den Expressionsvektor inkorporiert hatten. Es wurden 12 Transfektanten-Zellinien etabliert, wie durch ihr Vermögen angezeigt, auf diesem Medium zu überleben.
2. Analyse der α₂-Untereinheits-cDNA-Expression in transfizierten DG44-Zellen
Gesamt-RNA wurde nach dem Verfahren von Birnboim [(1988), Nuc. Acids Res. 16: 1487–-1497] aus vier der DG44-Zellinien extrahiert, welche stabil mit pSV2dhfr, enthaltend die cDNA der humanen neuronalen Calciumkanal-α₂-Untereinheit, transfiziert worden waren. RNA (~15 μg pro Spur) wurde auf einem 1%igen Agarose-Formaldehyd-Gel aufgetrennt, auf Nitrocellulose überführt und mit der statistisch geprimten, humanen neuronalen Calciumkanal-α₂-cDNA (Hybridisierung: 50%iges Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardts Lösung, 42°C; Waschschritt: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C) hybridisiert. Eine Northernblot-Analyse von Gesamt-RNA aus vier der DG44-Zelllinien, welche stabil mit pSV2dhfr, enthaltend die cDNA der humanen neuronalen Calciumkanal-α₂-Untereinheit, transfiziert worden waren, offenbarte, daß eine der vier Zellinien hybridisierende mRNA der Größe enthielt, die für das Transkript der α₂-Untereinheits-cDNA erwartet wurde (5000 Nt. auf Basis der cDNA-Größe), wenn sie in Gegenwart von 10 mM Natriumbutyrat zwei Tage lang gezüchtet wurde. Butyrat induziert unspezifisch die Transkription und wird oft zur Induktion des frühen SV40-Promotors eingesetzt [Gorman, C., und Howard, B. (1983), Nucleic Acids Res. 11: 1631]. Diese Zellinie, 44α₂-9, ergab auch kleinere mRNA-Spezies (mehrere Spezies) und größere (6800 Nt.) als die für das Transkript der α₂-cDNA (5000 Nt.) erwartete Größe, welche mit der Sonde auf α₂-cDNA-Basis hybridisierten. Die 5000- und 6.800-Nt.-Transkripte, welche von dieser Transfektante produziert wurden, sollten die gesamte für die α₂-Untereinheit kodierende Sequenz enthalten und deshalb ein Vollängen-α₂-Untereinheitsprotein ergeben. Ein schwach hybridisierendes 8000-Nt.-Transkript war in untransfizierten und transfizierten DG44-Zellen vorhanden. Anscheinend transkribieren DG44-Zellen eine Calciumkanal-α₂-Untereinheit oder ein ähnliches Gen auf niedrigen Niveaus. Das Expressionsniveau dieses endogenen α₂-Untereinheits-Transkripts schien durch die Exposition der Zellen gegenüber Butyrat vor der Isolierung von RNA für die Northern-Analyse nicht beeinflußt zu werden.
Gesamt-Protein wurde aus drei der DG44-Zellinien extrahiert, welche stabil mit pSV2dhfr, enthaltend die cDNA der humanen neuronalen Calciumkanal-α₂-Untereinheit, transfiziert worden waren. Es wurden etwa 10⁷ Zellen in 300 μl einer Lösung mit 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, beschallt. Ein gleiches Volumen an 2 × Auftragsfarbstoff [Laemmli, V. K. (1970), Nature 227: 680] wurde den Proben zugegeben und das Protein einer Elektrophorese auf einem 8%igen Polyacrylamidgel unterworfen und dann auf Nitrocellulose elektrotransferiert. Die Nitrocellulose wurde mit polyklonalen Meerschweinchen-Antiseren inkubiert (Verdünnung 1 : 200), welche gegen die Kaninchen-Skelettmuskel-Calciumkanal-α₂-Untereinheit gerichtet waren (erhalten von K. Campbell, University of Iowa), gefolgt von einer Inkubation mit [¹²⁵I]-Protein A. Der Blot wurde einem Röntgenfilm bei –70° C ausgesetzt. Reduzierte Proteinproben von den transfizierten Zellen sowie von untransfizierten DG44-Zellen enthielten immunreaktives Protein der erwarteten Größe für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals (130–150 kD). Das Niveau dieses immunreaktiven Proteins war höher in 44α₂-9-Zellen, welche in Gegenwart von 10 mM Natriumbutyrat gezüchtet worden waren, als in 44α₂-9-Zellen, welche in Abwesenheit von Natriumbutyrat gezüchtet worden waren. Diese Daten korrelieren gut mit denjenigen, welche bei Northern-Analysen von Gesamt-RNA aus 44α₂-9-Zellen und untransfizierten DG44-Zellen erhalten worden waren. Die Zellinie 44α₂-9 produzierte auch ein immunreaktives 110-kD-Protein, welches entweder ein Produkt des proteolytischen Abbaus der Vollängen-α₂-Untereinheit oder ein Translationsprodukt einer der in dieser Zellinie gebildeten kürzeren (<5000 Nt.) mRNAs, welche mit der α₂-Untereinheits-cDNA-Sonde hybridisierten, sein könnte.
B. Expression von DNA, welche für humane neuronale Calciumkanal-α₁-, -α₂- und -β₁-Untereinheiten kodiert, in HEK-Zellen
Human-Embryo-Nierenzellen (HEK 293-Zellen) wurden vorübergehend und stabil mit humaner neuronalen DNA transfiziert, welche für Calciumkanal-Untereinheiten kodiert. Individuelle Transfektanten wurden elektrophysiologisch hinsichtlich der Anwesenheit von spannungsaktivierten Bariumströmen und funktionellen rekombinanten spannungsabhängigen Calciumkanälen analysiert.
1. Transfektion von HEK 293-Zellen
sSeparate Expressionsvektoren, enthaltend DNA, die für humane neuronale Calciumkanal-α_1D-, -α₂- und -β₁-Untereinheiten kodierte, die Plasmide pVDCCIII(A), pHBCaCHα₂A bzw. pHBCaCHβ_1aRBS(A), wurden wie in den Beispielen II.A.3., IV.B. bzw. III.B.3. beschrieben konstruiert. Diese drei Vektoren wurden zur vorübergehenden Cotransfektion von HEK 293-Zellen eingesetzt. Für die stabile Transfektion von HEK 293-Zellen wurde der Vektor pHBCaCHβ_1bRBS(A) (Beispiel III.B.3.) anstelle von pHBCaCHβ_1aRBS(A) eingesetzt, um die für die β₁-Untereinheit kodierende DNA zusammen mit pVDCCIII(A) und pHBCaCHα₂A in die Zellen einzuführen.
a. Vorübergehende Transfektion
Die Expressionsvektoren pVDCCIII(A), pHBCaCHα₂A und pHBCaCHβ_1aRBS(A) wurden in zwei Sätzen vorübergehender Transfektionen von HEK 293-Zellen (ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL1573) eingesetzt. Bei einer Transfektionsprozedur wurden HEK 293-Zellen vorübergehend mit dem α₁-Untereinheits-cDNA-Expressionsplasmid, dem α₂-Untereinheits-cDNA-Expressionsplasmid, dem β₁-Untereinheits-cDNA-Expressionsplasmid und dem Plasmid pCMVβgal (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) cotransfiziert. Das Plasmid pCMVβgal enthält das IacZ-Gen (kodierend für E. coli-β-Galactosidase) in Fusion mit dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor und war in dieser Transfektion als Markergen zur Überprüfung der Transfektionseffizienz eingeschlossen. Bei der anderen Transfektionsprozedur wurden HEK 293-Zellen vorübergehend mit dem α₁-Untereinheits-cDNA-Expressionsplasmid pVDCCIII(A) und pCMVβgal cotransfiziert. Bei beiden Transfektionen wurden 2–4 × 10⁶ HEK 293-Zellen in einer 10-cm-Gewebekulturplatte mit 5 μg an jedem der in dem Experiment eingeschlossenen Plasmide nach Standard-CaPO₄-Präzipitationstransfektionsverfahren (Wigler et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373: 1376) vorübergehend cotransfiziert. Die Transfektanten wurden durch direkte Anfärbung des Produkts einer Reaktion unter Beteiligung von β-Galactosidase und dem X-gal-Substrat [Jones, J. R. (1986), EMBO 5: 3133–3142] und durch Messung der β-Galactosidase-Aktivität [Miller, J. H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, S. 352–355, Cold Spring Harbor Press] hinsichtlich β-Galactosidase-Expression analysiert. Zur Beurteilung der Untereinheits-cDNA-Expression in diesen Transfektanten wurden die Zellen hinsichtlich Bildung von Untereinheitstranskript (Nothern-Analyse), Bildung von Untereinheitsprotein (Immunoblot-Analyse von Zellysaten) und Expression eines funktionellen Calciumkanals (elektrophysiologische Analyse) analysiert.
b. Stabile Transfektion
HEK 293-Zellen wurden unter Anwendung des Calciumphosphat-Transfektionsverfahrens (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Wiley Inter-Science, Supplement 14, Einheit 9.1.1–9.1.9 (1990)] transfiziert. 10-cm-Platten, jeweils ein bis zwei Millionen HEK 293-Zellen enthaltend, wurden mit 1 ml DNA/Calciumphosphat-Präzipitat transfiziert, das 5 μg pVDCCIII(A), 5 μg pHBCaCHα₂A, 5 μg pHBCaCHβ_1bRBS(A), 5 μg pCMVβgal und 1 μg pSV2neo (als selektierbarer Macker) enthielt. Nach 10–20 Tagen Wachstum in Medium mit 500 μg G418 hatten sich Kolonien gebildet und wurden mit Hilfe von Klonierungszylindern isoliert.
2. Analyse von HEK 293-Zellen, die vorübergehend mit DNA transfiziert wurden, welche für humane neuronale Calciumkanal-Untereinheiten kodiert
a. Analyse der β-Galactosidase-Expression
Vorübergehende Transfektanten wurden durch β-Galactosidase-Aktivitätsassays (Miller, J. H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, S. 352–355, Cold Spring Harbor Press) von Zellysaten (hergestellt wie in Beispiel VII.A.2. beschrieben) und Anfärbung fixierter Zellen (Jones, J. R. (1986), EMBO 5: 3133–3142) hinsichtlich β-Galactosidase-Expression untersucht. Die Ergebnisse dieser Assays zeigten an, daß etwa 30% der HEK 293-Zellen transfiziert worden waren.
b. Northern-Analyse
PolyA+-RNA wurde mit Hilfe des Invitrogen Fast Trak Kits (In Vitrogen, San Diego, CA) aus HEK 293-Zellen isoliert, die vorübergehend mit DNA transfiziert worden waren, welche für jede der α₁-, α₂- und β₁-Untereinheiten und das IacZ-Gen oder die α₁-Untereinheit und das IacZ-Gen kodierte. Die RNA wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und auf Nitrocellulose überführt. Die Nitrocellulose wurde dann mit einer oder mehreren der folgenden radioaktiv markierten Sonden hybridisiert: das IacZ-Gen, für eine humane neuronale Calciumkanal-α_1D-Untereinheit kodierende cDNA, für eine humane neuronale Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodierende cDNA oder für eine humane neuronale Calciumkanal-β₁-Untereinheit kodierende cDNA. Zwei Transkripte, welche mit der für eine α₁-Untereinheit kodierenden cDNA hybridisierten, wurden in HEK 293-Zellen nachgewiesen, die mit der DNA transfiziert worden waren, welche für die α₁-, α₂- und β₁-Untereinheiten und das IacZ-Gen kodierte, sowie in HEK 293-Zellen, die mit der α₁-Untereinheits-cDNA und dem IacZ-Gen transfiziert worden waren. Eine mRNA-Spezies hatte die erwartete Größe für das Transkript der α₁-Untereinheits-cDNA (8000 Nukleotide). Die zweite RNA-Spezies war kleiner (4000 Nukleotide) als die für dieses Transkript erwartete Größe. RNA der erwarteten Größe für das Transkript des IacZ-Gens wurde in Zellen, die mit der für eine α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierenden cDNA und dem lacZ-Gen transfiziert worden waren, und in Zellen, die mit der α₁-Untereinheits-cDNA und dem IacZ-Gen transfiziert worden waren, durch Hybridisierung mit der lacZ-Gensequenz nachgewiesen.
RNA aus Zellen, die mit der für eine α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierenden cDNA und dem IacZ-Gen transfiziert worden waren, wurde auch mit den α₂- und β₁-Untereinheits-cDNA-Sonden hybridisiert. Zwei mRNA-Spezies hybridisierten mit der α₂-Untereinheits-cDNA-Sonde. Eine Spezies besaß die erwartete Größe für das Transkript der α₂-Untereinheits-cDNA (4000 Nukleotide). Die andere Spezies war größer (6000 Nukleotide) als die erwartete Größe dieses Transkripts. Mehrere RNA-Spezies in den Zellen, die mit der für eine α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierenden cDNA und dem IacZ-Gen transfiziert worden waren, hybridisierten mit der β₁-Untereinheits-cDNA-Sonde. Mehrere β-Untereinheits-Transkripte verschiedener Größe wurden gebildet, da der β-Untereinheits-cDNA-Expressionsvektor zwei potentielle PolyA⁺-Additionsstellen enthält.
e. Elektrophysiologische Analyse
Einzelne vorübergehend transfizierte HEK 293-Zellen wurden hinsichtlich der Anwesenheit von spannungsabhängigen Bariumströmen unter Anwendung der Ganzzell-Variante der Patch-Clamp-Technik [Hamill et al. (1981), Pflugers Arch. 391: 85–100] untersucht. HEK 293-Zellen, die vorübergehend mit lediglich pCMVβgal transfiziert worden waren, wurden als negative Kontrolle in diesen Experimenten hinsichtlich Bariumströmen untersucht. Die Zellen wurden in eine Badlösung gebracht, welche Bariumionen enthielt, um als Stromträger zu dienen. Cholin-Chlorid wurde anstelle von NaCl oder KCl als Hauptsalzkomponente der Badlösung verwendet, um Ströme durch Natrium- und Kaliumkanäle auszuschalten. Die Badlösung enthielt 1 mM MgCl₂ und wurde bei pH 7,3 mit 10 mM HEPES gepuffert (pH-Wert mit Natrium- oder Tetraethylammoniumhydroxid eingestellt). Patch-Pipetten wurden mit einer Lösung gefüllt, die 135 mM CsCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM Glucose, 10 mM EGTA, 4 mM ATP und 10 mM HEPES enthielt (pH-Wert auf 7,3 mit Tetraethylammoniumhydroxid eingestellt). Cäsium- und Tetraethylammoniumionen blockieren die meisten Typen von Kaliumkanälen. Die Pipetten wurden mit Sylgard (Dow-Corning, Midland, MI) beschichtet und besaßen Widerstände von 1–4 Megaohm. Die Ströme wurden durch einen 500-Megaohm-Kopfstufen-Widerstand mit dem Axopatch IC-Verstärker (Axon Instruments, Foster City, CA) gemessen, der mit einer Labmaster (Scientific Solutions, Solon, OH) Datenerfassungs-Steckkarte in einem IBM-kompatiblen PC verbunden war. pClamp (Axon Instruments) wurde zur Erzeugung von Spannungssignalen und zur Datenerfassung verwendet. Die Daten wurden mit pClamp- oder Quattro Professional-Programmen (Borland International, Scotts Valley, CA) analysiert.
Zur Verabreichung von Wirkstoffen wurden "Puffer"-Pipetten, die mehrere Mikrometer innerhalb der zu untersuchenden Zelle positioniert waren, eingesetzt, um Lösungen durch Druckausübung zu verabreichen. Die für die pharmakologische Charakterisierung verwendeten Arzneiwirkstoffe wurden in einer Lösung gelöst, die mit der Badlösung identisch war. Proben einer 10 mM Stammlösung von Bay K 8644 (RBI, Natick, MA), welche in DMSO hergestellt war, wurden vor der Verabreichung auf eine Endkonzentration von 1 μM in 15 mM Ba²⁺-enthaltender Badlösung verdünnt.
21 HEK 293-Zellen als Negativkontrolle (vorübergehend mit dem IacZ-Gen-Expressionsvektor pCMVβgal transfiziert) wurden mit der Ganzzell-Variante des Patch-Clamp-Verfahrens zur Aufzeichnung von Strömen analysiert. Nur eine Zelle zeigte einen wahrnehmbaren einwärts gerichteten Bariumstrom; dieser Strom wurde durch die Anwesenheit von 1 μM Bay K 8644 nicht beeinflußt. Darüber hinaus führte die Verabreichung von Bay K 8644 an vier Zellen, die keine Ba²⁺-Ströme zeigten, nicht zum Auftreten irgendwelcher Ströme.
Zwei Tage nach der vorübergehenden Transfektion von HEK 293-Zellen mit für eine α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierender cDNA und dem IacZ-Gen wurden einzelne Transfektanten hinsichtlich spannungsabhängiger Bariumströme untersucht. Die Ströme in neun Transfektanten wurden aufgezeichnet. Nachdem die Transfektionseffizienz einer Zelle sich von der Transfektionseffizienz einer anderen Zelle unterscheiden kann, variiert der Expressionsgrad heterologer Proteine in individuellen Transfektanten und einige Zellen inkorporieren oder exprimieren die fremde DNA nicht. Einwärts gerichtete Bariumströme wurden in zwei dieser neun Transfektanten nachgewiesen. Bei diesen Assays war das Haltepotential der Membran –90 mV. Die Membran wurde in einer Reihe von Spannungsschritten bis zu verschiedenen Testpotentialen depolarisiert und der Strom in Gegenwart und Abwesenheit von 1 μM Bay K 8644 wurde aufgezeichnet. Die Größe des einwärts gerichteten Bariumstroms wurde durch die Zugabe von Bay K 8644 signifikant erhöht. Der größte einwärts gerichtete Bariumstrom (~160 pA) wurde aufgezeichnet, wenn die Membran in Gegenwart von 1 μM Bay K 8644 auf 0 mV depolarisiert wurde. Ein Vergleich der I-V-Kurven, erstellt durch Auftragen des größten aufgezeichneten Stroms nach jeder Depolarisation gegen die Depolarisationsspannung entsprechend den Aufzeichnungen, die in Abwesenheit und Anwesenheit von Bay K 8644 vorgenommen wurden, illustrierte die Erhöhung des spannungsaktivierten Stroms in Gegenwart von Bay K 8644.
Es wurden ausgeprägte Restströme in den Aufzeichnungsspuren von Strömen nachgewiesen, welche in Gegenwart von Bay K 8644 in HEK 293-Zellen erzeugt wurden, die mit der für eine α₁-, α₂- und β-Untereinheit kodierenden cDNA und dem IacZ-Gen transfiziert worden waren, was anzeigt, daß die rekombinanten Calciumkanäle, welche für die spannungsaktivierten Bariumströme verantwortlich sind, die bei diesen Transfektanten aufgezeichnet wurden, DHP-sensitiv zu sein scheinen.
Die zweite der beiden transfizierten Zellen, welche einwärts gerichtete Bariumströme zeigten, exprimierte einen Strom von ~50 pA, wenn die Membran von –90 mV depolarisiert wurde. Dieser Strom wurde fast vollständig von 200 μM Cadmium, einem etablierten Calciumkanal-Blocker, blockiert.
10 Zellen, die vorübergehend mit der DNA transfiziert worden waren, welche für die α₁-Untereinheit und das IacZ-Gen kodierte, wurden mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Verfahren zwei Tage nach der Transfektion analysiert. Eine dieser Zellen zeigte einen einwärts gerichteten Bariumstrom von 30 pA. Dieser Strom erhöhte sich um das Zweifache in Gegenwart von 1 μM Bay K 8644. Ferner wurden kleine Restströme in Gegenwart von Bay K 8644 nachgewiesen. Diese Daten zeigen an, daß die Expression der für die humane neuronale Calciumkanal-α_1D-Untereinheit kodierenden cDNA in HEK 293 einen funktionellen DHP-sensitiven Calciumkanal ergibt.
3. Analyse von HEK 293-Zellen, die stabil mit DNA, welche für humane neuronale Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, transfiziert worden waren
Einzelne stabil transfizierte HEK 293-Zellen wurden elektrophysiologisch hinsichtlich der Anwesenheit von spannungsabhängigen Bariumströmen untersucht wie für die elektrophysiologische Analyse von vorübergehend transfizierten HEK 293-Zellen beschrieben (siehe Beispiel VII.B.2.c). In einem Versuch zur Maximierung der Calciumkanal-Aktivität durch CAMP-abhängige, kinase-vermittelte Phosphorylierung [Pelzer et al. (1990), Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 114: 107–207] wurde cAMP (Na-Salz, 250 μM) der Pipetten-Lösung zugegeben und Forskolin (10 μM) wurde der Badlösung bei einigen der Aufzeichnungen zugegeben. Es wurden qualitativ ähnliche Ergebnisse erhalten, ob diese Verbindungen vorhanden waren oder nicht.
Bariumströme wurden von stabil transfizierten Zellen in Abwesenheit und Gegenwart von Bay K 8644 (1 μM) aufgezeichnet. Wenn die Zelle von einem Haltepotential von –90 mV auf –10 mV in Abwesenheit von Bay K 8644 depolarisiert wurde, wurde ein Strom von etwa 35 pA mit einem schnell deaktivierenden Reststrom aufgezeichnet. Während der Verabreichung von Bay K 8644 rief ein identisches Depolarisierungsprotokoll einen Strom von etwa 75 pA hervor, begleitet von einem erhöhten und verlängerten Reststrom. Die maximale Größe von Strömen, die von dieser selben Zelle aufgezeichnet wurden, wurde als Funktion einer Reihe depolarisierender Spannungen ermittelt. Die Reaktionen in Gegenwart von Bay K 8644 nahmen nicht nur zu, sondern das gesamte Strom-Spannungs-Verhältnis verschob sich um etwa –10 mV. Somit wurden drei typische Charakteristika der Bay K 8644-Wirkung, nämlich erhöhte Stromstärke, verlängerte Restströme und negativ verschobene Aktivierungsspannung, beobachtet, was eindeutig die Expression eines DHP-sensitiven Calciumkanals in diesen stabil transfizierten Zellen anzeigt. Keine solchen Wirkungen von Bay K 8644 wurden bei untransfizierten HEK 293-Zellen weder mit noch ohne cAMP oder Forskolin beobachtet.
C. Verwendung von Vektoren auf pCMV-Basis und Vektoren auf pcDNA1-Basis zur Expression von DNA, welche für humane neuronale Calciumkanal-Untereinheiten kodiert
1. Herstellung von Konstrukten
Zusätzliche Expressionsvektoren wurden unter Verwendung von pCMV konstruiert. Die Vollängen-α_1D-cDNA aus pVDCCIII(A) (siehe Beispiel II.A.3.d), die Vollängen-α₂-cDNA, die auf einem 3600-bp-EcoRI-Fragment von HBCaCHα₂ enthalten ist (siehe Beispiel IV.B), und eine Vollängen-β₁-Untereinheits-cDNA aus pHBCaCHβ_1bRBS(A) (siehe Beispiel III.B.3.) wurden separat in das Plasmid pCMVβgal subkloniert. Das Plasmid pCMVβgal wurde mit NotI verdaut, um das IacZ-Gen zu entfernen. Der verbleibende Vektoranteil des Plasmids, als pCMV bezeichnet, wurde an den NotI-Stellen glattendig gemacht. Die für α₂ kodierende DNA und für β₁ kodierende DNA voller Länge, enthaltend auf separaten EcoRI-Fragmenten, wurden isoliert, glattendig gemacht und separat mit dem glattendig gemachten Vektorfragment von pCMV ligiert, was die cDNAs zwischen den CMV-Promotor und die SV40-Polyadenylierungsstellen in pCMV plazierte. Zur Ligierung der für α_1D kodierenden cDNA mit pCMV wurden die Restriktionsstellen in den Polylinkern unmittelbar 5' des CMV-Promotors und unmittelbar 3' der SV40-Polyadenylierungsstelle aus pCMV entfernt. Ein Polylinker wurde der NotI-Stelle hinzugefügt. Der Polylinker besaß die folgende Sequenz von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen:
Die für α_1D kodierende DNA, isoliert als BamHI/XhoI-Fragment aus pVDCCIII(A), wurde dann mit XbaII/SalI-verdautem pCMV ligiert, um sie zwischen den CMV-Promotor und die SV40-Polyadenylierungsstelle zu plazieren.
Das Plasmid pCMV enthält den CMV-Promotor ebenso wie pcDNA1, unterscheidet sich jedoch von pcDNA1 in der Lage der Splice-Donor/Splice-Akzeptor-Stellen in Bezug auf die inserierte untereinheits-kodierende DNA. Nach Insertion der untereinheits-kodierenden DNA in pCMV befinden sich die Splice-Donor/Splice-Akzeptorstellen 3' des CMV-Promotors und 5' des Startcodons der untereinheits-kodierenden DNA. Nach Insertion der untereinheits-kodierenden DNA in pcDNA1 befinden sich die Splice-Donor/Splice-Akzeptorstellen 3' des Stopcodons der Untereinheits-cDNA.
2. Transfektion von HEK 293-Zellen
HEK 293-Zellen wurden mit der für eine α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierenden DNA in pCMV oder mit der für eine α_1D-, α₂- und β-Untereinheit kodierenden DNA in pcDNA1 (Vektoren pVDCCIII(A), pHBCaCHα₂A bzw. pHBCaCHβ_1bRBS(A)) wie in Beispiel VII.B.1.a. beschrieben vorübergehend cotransfiziert. Das Plasmid pCMVβgal war bei jeder Transfektion als Maß der Transfektionseffizienz eingeschlossen. Die Ergebnisse von β-Galactosidase-Assays der Transfektanten (siehe Beispiel VII.B.2.) zeigten an, daß die HEK 293-Zellen gleichermaßen effizient mit Plasmiden auf pCMV- und pcDNA1-Basis transfiziert wurden. Die Plasmide auf pcDNA1-Basis sind jedoch derzeit zur Expression von Calciumkanal-Rezeptoren bevorzugt.
D. Expression von RNA, welche für humane neuronale Calciumkanal-Untereinheiten kodiert, in Xenopus laevis-Oozyten
Es wurden verschiedene Kombinationen der in vitro hergestellten DNA-Transkripte, welche für die humanen neuronalen α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodieren, in Xenopus laevis-Oozyten injiziert. Diejenigen, denen Kombinationen injiziert worden waren, welche α_1D einschlossen, zeigen spannungsaktivierte Bariumströme.
1. Herstellung von Transkripten
Transkripte, welche für die humanen neuronalen Calciumkanal-α_1D-, -α₂- und -β₁-Untereinheiten kodierten, wurden gemäß den Instruktionen des mCAP-mRNA CAPPING KIT (Stratagene, La Jolla, CA, Katalog #200350) synthetisiert. Das Plasmid pVDCC III.RBS(A), enthaltend pcDNA1 und die α_1D-cDNA, die mit einer Ribosomen-Bindungsstelle und dem achten ATG-Codon der kodierenden Sequenz beginnt (siehe Beispiel III.A.3.d), das Plasmid pHBCaCHα₁A, enthaltend pcDNA1 und eine α₂-Untereinheits-cDNA (siehe Beispiel IV), und das Plasmid pHBCaCHβ_1bRBS(A), enthaltend pcDNA1 und die β₁-DNA ohne die Intronsequenz und eine Ribosomen-Bindungsstelle enthaltend (siehe Beispiel III), wurden durch Restriktionsverdauung linearisiert. Die für die α_1D-cDNA und α₂-Untereinheit kodierenden Plasmide wurden mit XhoI verdaut und das für die β₁-Untereinheit kodierende Plasmid wurde mit EcoRV verdaut. Das DNA-Insert wurde mit T7-RNA-Polymerase transkribiert.
2. Injektion von Oozyten
Xenopus laevis-Oozyten wurden isoliert und durch Collagenase-Behandlung von Follikeln befreit und in 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,6, 20 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Streptomycin bei 19–25°C für 2 bis 5 Tage nach der Injektion und vor der Aufzeichnung gehalten. Für jedes Transkript, das in den Oozyten injiziert wurde, wurden 6 ng der spezifischen mRNA pro Zelle in einem Gesamtvolumen von 50 nl injiziert.
3. Aufzeichnungen intrazellulärer Spannung
Oozyten, die eine Injektion erhalten hatten, wurden hinsichtlich spannungsabhängiger Bariumströme unter Anwendung von Zweielektroden-Spannungsklammer-Verfahren [Dascal, N. (1987), CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 317] untersucht. Das pClamp-Software-Paket (Axon Instruments) wurde in Verbindung mit einem Labmaster 125 kHz-Datenerfassungs-Interface eingesetzt, um Spannungssignale zu erzeugen und um Daten zu erfassen und zu analysieren. Quattro Professional wurde ebenfalls bei dieser Analyse eingesetzt. Die Stromsignale wurden bei 1–5 kHz digitalisiert und in geeigneter Weise gefiltert. Die Badlösung enthielt das folgende: 40 mM BaCl₂, 36 mM Tetraethylammoniumchlorid (TEA-Cl), 2 mM KCl, 5 mM 4-Aminopyridin, 0,15 mM Nifluminsäure, 5 mM HEPES, pH 7,6.
a. Elektrophysiologische Analyse von Oozyten, denen für die humanen neuronalen Calciumkanal-α₁-, -α₂- und -β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren
Oozyten ohne Injektion wurden durch Zweielektroden-Spannungsklammer-Verfahren untersucht und ein sehr kleiner (25 nA) endogener, einwärts gerichteter Ba²⁺-Strom wurde in nur einer der sieben analysierten Zellen nachgewiesen.
Oozyten, die eine Coinjektion mit α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheits-Transkripten erhalten hatten, exprimierten verlängerte einwärts gerichtete Bariumströme nach Depolarisation der Membran von einem Haltepotential von –90 mV oder –50 mV (154 + 129 nA, n = 21). Diese Ströme zeigten typischerweise wenig Inaktivierung, wenn Testimpulse im Bereich von 140 bis 700 ms verabreicht wurden. Eine Depolarisation zu einer Reihe von Spannungen offen barte Ströme, die zuerst bei etwa –30 mV auftraten und einen Gipfel bei etwa 0 mV erreichten.
Die Verabreichung des DHP Bay K 8644 erhöhte die Größe der Ströme, verlängerte die Restströme, die nach Repolarisation der Zelle vorhanden waren, und induzierte eine hyperpolarisierende Verschiebung bei der Stromaktivierung. Bay K 8644 wurde frisch aus einer Stammlösung in DMSO hergestellt und als 10faches Konzentrat direkt in das 60-μl-Bad eingeführt, während die Perfusionspumpe abgeschaltet war. Die DMSO-Konzentration der verdünnten schließlichen Wirkstofflösungen in Kontakt mit der Zelle überschritt niemals 0,1 %. Kontrollexperimente zeigten, daß 0,1% DMSO keine Auswirkung auf Membranströme hatte.
Die Verabreichung des DHP-Antagonisten Nifedipin (Stammlösung in DMSO hergestellt und der Zelle verabreicht wie für die Verabreichung von Bay K 8644 beschrieben) blockierte einen wesentlichen Bruchteil (91 ± 6%, n = 7) des einwärts gerichteten Bariumstroms in Oozyten, die eine Coinjektion mit Transkripten der α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten erhalten hatten. Eine inaktivierende Restkomponente des einwärts gerichteten Bariumstroms verblieb typischerweise nach Nifedipin-Verabreichung. Der einwärts gerichtete Bariumstrom wurde durch 50 μM Cd²⁺ vollständig blockiert, jedoch nur etwa zu 15% durch 100 μM Ni²⁺.
Die Wirkung von ωCgTX auf die einwärts gerichteten Bariumströme in Oozyten, die eine Coinjektion mit Transkripten der α_1D-, α_2D- und β₁-Untereinheiten erhalten hatten, wurde untersucht. ωCgTX (Bachem, Inc., Torrance, CA) wurde in der 15 mM BaCl₂-Badlösung plus 0,1% Cytochrom C (Sigma), um als Trägerprotein zu dienen, präpariert. Kontrollexperimente zeigten, daß Cytochrom C keine Auswirkung auf die Ströme hatte. Eine Reihe von Spannungsimpulsen von einem Haltepotential von –90 mV bis 0 mV aus wurde in Intervallen von 20 ms aufgezeichnet. Zur Verringerung der Inhibierung der ωCgTX-Bindung durch zweiwertige Kationen erfolgten die Aufzeichnungen in 15 mM BaCl₂, 73,5 mM Tetraethylammoniumchlorid, und die verbleibenden Bestandteile waren identisch mit der Aufzeichnungslösung von 40 mM Ba²⁺. Bay K 8644 wurde der Zelle vor der Zugabe zu ωCgTX verabreicht, um die Wirkung von ωCgTX auf die DHP-sensitive Stromkomponente zu bestimmen, welche durch die verlängerten Restströme erkennbar war. Der einwärts gerichtete Bariumstrom wurde schwach (54 ± 29%, n = 7) und reversibel durch relativ hohe Konzentrationen (10–15 μM) von ωCgTX blockiert. Die Testströme und die begleitenden Restströme wurden fortschreitend innerhalb von 2 bis 3 Minuten nach Verabreichung von ωCgTX blockiert, beide erholten sich jedoch teilweise, als das ωCgTX aus dem Bad gespült wurde.
b. Analyse von Oozyten, denen nur Transkripte, welche für die humane neuronale Calciumkanal-Untereinheit α_1D kodierten, oder Transkripte, welche für eine α_1D- und andere Untereinheiten) kodierten, injiziert worden waren
Der Beitrag der α₂- und β₁-Untereinheiten zu dem einwärts gerichteten Bariumstrom in Oozyten, denen Transkripte injiziert worden waren, welche für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierten, wurde ermittelt durch Expression der α_1D-Untereinheit allein oder in Kombination mit entweder der β₁-Untereinheit oder der α₂-Untereinheit. In Oozyten, denen nur das Transkript einer α_1D-cDNA injiziert worden war, wurden keine Ba²⁺-Ströme nachgewiesen (n = 3). In Oozyten, denen Transkripte von α_1D- und β₁-cDNAs injiziert worden waren, wurden nach Depolarisation der Membran von einem Haltepotential von –90 mV kleine (108 ± 39 nA) Ba²⁺-Ströme nachgewiesen, welche den Strömen entsprachen, die in Zellen beobachtet wurden, denen Transkripte von α_1D-, α₂- und β₁-cDNAs injiziert worden waren, obwohl die Höhe des Stroms geringer war. Bei zwei der vier Oozyten, denen Transkripte der α_1D-kodierenden und β₁-kodierenden DNA injiziert worden waren, zeigten die Ba²⁺-Ströme eine Sensitivität für Bay K 8644 ähnlich der Bay K 8644-Sensitivität von Ba²⁺-Strömen nach Expression in Oozyten, denen Transkripte injiziert worden waren, welche für die α_1D-, α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierten.
Drei von fünf Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α_1D- und α₂-Untereinheiten, injiziert worden waren, zeigten sehr kleine Ba²⁺-Ströme (15 bis 30 nA) nach Depolarisation der Membran von einem Haltepotential von –90 mV. Diese Bariumströme zeigten wenig oder keine Reaktion auf Bay K 8644.
c. Analyse von Oozyten, denen für die humane neuronale Calciumkanal-α₂- und/oder -β₁-Untereinheit kodierende Transkripte injiziert worden waren
Zur Beurteilung des Beitrags der α_1D-Untereinheit α_1D zu den einwärts gerichteten Bariumströmen, die in Oozyten nachgewiesen wurden, denen Transkripte, kodierend für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren, wurden Oozyten, denen Transkripte injiziert worden waren, welche für die humanen neuronalen Calciumkanal-α₂- und/oder -β₁-Untereinheiten kodierten, auf Bariumströme hin untersucht. Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂-Untereinheit injiziert worden waren, zeigten keine nachweisbaren einwärts gerichteten Bariumströme (n = 5). Oozyten, denen Transkripte, kodierend für eine β₁-Untereinheit, injiziert worden waren, zeigten meßbare (54 ± 23 nA, n = 5) einwärts gerichtete Bariumströme nach Depolarisation und Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten injiziert worden waren, zeigten einwärts gerichtete Barium ströme, die etwa 50% größer waren (80 ± 61 nA, n = 18) als die in Oozyten nachgewiesenen, denen nur Transkripte der für β₁ kodierenden DNA injiziert worden waren.
Die einwärts gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen Transkripte injiziert worden waren, welche für die β₁-Untereinheit oder α₂- und β₁-Untereinheiten kodierten, wurden typischerweise zuerst beobachtet, wenn die Membran von einem Haltepotential von –90 mV auf –30 mV depolarisiert wurde, und erreichten ein Maximum, wenn die Membran auf 10 bis 20 mV depolarisiert wurde. Makroskopisch waren die Ströme in Oozyten, denen Transkripte, welche für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierten, oder Transkripte, welche für die β₁-Untereinheit kodierten, injiziert worden waren, nicht unterscheidbar. Im Gegensatz zu den Strömen in Oozyten, denen Transkripte von α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheits-cDNAs coinjiziert worden waren, zeigten diese Ströme eine signifikante Inaktivierung während des Testimpulses und eine starke Sensitivität für das Haltepotential. Die einwärts gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren, wurden gewöhnlich auf 10–60% der maximalen Größe während eines Impulses von 140 ms inaktiviert und waren signifikant sensitiver für das Haltepotential als diejenigen in Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren. Die Veränderung des Haltepotentials der Membranen von Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren, von –90 auf –50 mV resultierte in einer etwa 81%igen Verringerung (n = 11) der Größe des einwärts gerichteten Bariumstroms dieser Zellen. Im Gegensatz dazu wurden die einwärts gerichteten Bariumströme, welche in Oozyten gemessen wurden, denen Transkripte, kodierend für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren, um etwa 24% verringert (n = 11), wenn das Haltepotential von –90 auf –50 mV verändert wurde.
Die einwärts gerichteten Bariumströme, welche in Oozyten nachgewiesen wurden, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, injiziert worden waren, unterschieden sich pharmakologisch von den in Oozyten beobachteten, denen Transkripte, kodierend für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren. Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, injiziert worden waren, zeigten einwärts gerichtete Bariumströme, die für Bay K 8644 nicht sensitiv waren (n = 11). Die Nifedipin-Sensitivität war aufgrund der Haltepotential-Sensitivität von Nifedipin und des beobachteten Stroms in Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, injiziert worden waren, schwierig zu messen. Nichtsdestoweniger zeigten zwei Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, coinjiziert worden waren, meßbare (25 bis 45 nA) einwärts gerichtete Bariumströme bei Depolarisation von einem Haltepotential von –50 mV. Diese Ströme waren insensitiv für Nifedipin (5 bis 10 μM). Die einwärts gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α₂- und β₁-Untereinheiten, injiziert worden waren, zeigten dieselbe Sensitivität für Schwermetalle wie die nachgewiesenen Ströme in Oozyten, denen Transkripte, kodierend für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten, injiziert worden waren.
Der einwärts gerichtete Bariumstrom, der in Oozyten nachgewiesen wurde, denen Transkripte, kodierend für die humanen neuronalen α₂- und β₁-Untereinheiten, injiziert worden waren, hat pharmakologische und biophysikalische Eigenschaften, welche Calciumströmen in Xenopus-Oozyten ohne Injektion entsprechen. Nachdem den Aminosäuren dieser humanen neuronalen Calciumkanal-β₁-Untereinheit hydrophobe Segmente fehlen, welche zur Bildung von Transmembrandomänen in der Lage sind, ist es unwahrscheinlich, daß rekombinante β₁-Untereinheiten allein einen Ionenkanal bilden können. Es ist wahrscheinlicher, daß eine homologe endogene α₁-Untereinheit in Oozyten vorliegt und daß die durch eine solche α₁-Untereinheit vermittelte Aktivität durch die Expression einer humanen neuronalen β₁-Untereinheit erhöht wird.
E. Expression von DNA, welche für humane neuronale Calciumkanal-α_1B-, -α_2b- und -β_1-2-Untereinheiten kodiert, in HEK-Zellen
1. Transfektion von HEK-Zellen
Die vorübergehende Expression der humanen neuronalen α_1B–1-, α_2b- und β_1-2-Untereinheiten wurde in HEK 293-Zellen untersucht. Die HEK 293-Zellen wurden als Monoschichtkultur in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), enthaltend 5% definiert ergänztes Rinderkalbsserum (Hyclone) plus Penicillin G (100 E/ml) und Streptomycinsulfat (100 μg/ml), gezüchtet. Die HEK 293-Zell-Transfektionen wurden durch Calciumphosphat wie oben beschrieben vermittelt. Die transfizierten Zellen wurden hinsichtlich einwärts gerichteter Ba²⁺-Ströme (I_Ba), welche durch spannungsabhängige Ca²⁺-Kanäle vermittelt wurden, untersucht.
Zellen wurden transfiziert (2 × 10⁶ pro polylysin-beschichtete Platte). Standardtransfektionen (10-cm-Schale) enthielten 8 μg pcDNAα_1B–1, 5 μg pHBCaCHα₂A, 2 μg pHBCaCHβ_1bRBS(A) (siehe Beispiele II.A.3., IV.B. und III) und 2 μg CMVβ (Clontech) als β-Glactosidase-Expressionsplasmid und pUC18, um eine konstante Masse von 20 μg/ml aufrechtzuerhalten. Die Zellen wurden 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion analysiert. Die Transfektionseffizienzen (± 10%), welche durch in situ-histochemische Anfärbung auf β-Galactosidase-Aktivität bestimmt wurden (Sanes et al. (1986), EMBO J., 5: 3133), waren im allgemeinen größer als 50%.
2. Elektrophysiologische Analyse von Transfektanten-Strömen
a. Materialien und Methoden
Die Eigenschaften von rekombinant exprimierten Ca²⁺-Kanälen wurden durch Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken untersucht. Die Aufzeichnungen erfolgten mit transfizierten HEK 293-Zellen 2 bis 3 Tage nach der Transfektion. Die Zellen wurden mit 100.000 bis 300.000 Zellen pro polylysin-beschichtete, 35-mm-Gewebekulturschale (Falcon, Oxnard, CA) 24 Stunden vor den Aufzeichnungen ausplattiert. Die Zellen wurden mit 15 mM BaCl₂, 125 mM Cholin-Chlorid, 1 mM MgCl₂ und 10 mM Hepes (pH = 7,3), eingestellt mit Tetraethylammoniumhydroxid, (Badlösung) perfundiert. Die Pipetten wurden mit 135 mM CsCl, 10 mM EGTA, 10 mM Hepes, 4 mM Mg-Adenosintriphosphat (pH = 7,5), eingestellt mit Tetraethylammoniumhydroxid, gefüllt. Mit Sylgard (Dow-Corning, Midland, MI) beschichtete, glattgeschmolzene und gefüllte Pipetten besaßen Widerstände von 1 bis 2 Megaohm, bevor Gigaohm-Versiegelungen bei den Zellen etabliert wurden.
Bay K 8644 und Nifedipin (Research Biochemicals, Natick, MA) wurden aus Stammlösungen (in Dimethylsulfoxid) präpariert und in die Badlösung verdünnt. Die Dimethylsulfoxid-Konzentration in den endgültigen Arzneiwirkstofflösungen in Kontakt mit den Zellen überschritt niemals 0,1%. Kontrollexperimente zeigten, daß 0,1% Dimethylsulfoxid keine Auswirkung auf die Membranströme hatte. ωCgTX (Bachem, Inc., Torrance, CA) wurde in der 15 mM BaCl₂-Badlösung plus 0,1% Cytochrom C (Sigma, St. Louis MO), um als Trägerprotein zu dienen, präpariert. Kontrollexperimente zeigten, daß Cytochrom C keine Auswirkung auf die Ströme hatte. Diese Arzneiwirkstoffe wurden in Badlösung gelöst und kontinuierlich mit Hilfe von Pufferpipetten wie für ein gegebenes Experiment erforderlich verabreicht. Die Aufzeichnungen wurden bei Raumtemperatur (22° bis 25°C) vorgenommen. Reihenwiderstands-kompensation (70 bis 85%) wurde eingesetzt, um Spannungsfehler zu minimieren, welche aus dem Pipettenzugangswiderstand resultierten, typischerweise 2 bis 3,5 Megaohm. Die Stromsignale wurden gefiltert (–3 dB, 4-Pol-Bessel) bei einer Frequenz von ¼ bis 1/5 der Probenrate, welche im Bereich von 0,5 bis 3 kHz lag. Es wurden Spannungssignale erzeugt und die Daten mit CLAMPEX (pClamp, Axon Instruments, Foster City, CA) erfaßt. Alle angegebenen Daten wurden hinsichtlich linearer Kriechstrom- und kapazitiver Komponenten korrigiert. Eine exponentielle Anpassung der Ströme wurde mit CLAMPFIT (Axon Instruments, Foster City, CA) durchgeführt.
b. Ergebnisse
Transfektanten wurden hinsichtlich einwärts gerichteter Ba²⁺-Ströme (I_Ba) untersucht. Zellen, die mit DNA, kodierend für die α_1B–1-, α_2b- und β_1-2-Untereinheiten, cotransfiziert worden waren, exprimierten durch hohe Spannung aktivierte Ca₂₊-Kanäle. Ein I_Ba trat zuerst auf, wenn die Membran von einem Haltepotential von –90 mV auf –20 mV depolarisiert wurde und erreichte maximale Größe bei 10 mV. 39 von 95 Zellen (12 unabhängige Transfektionen) besaßen einen I_Ba, der im Bereich von 30 bis 2700 pA lag, mit einem Mittelwert von 433 pA. Die mittlere Stromdichte betrug 26 pA/pF und die höchste Dichte betrug 150 pA/pF. Der I_Ba nahm während der ersten 5 Minuten der Aufzeichnung typischerweise um das 2- bis 20fache zu. Wiederholte Depolarisationen während langer Aufzeichnungen offenbarten oft einen Entladungsabfall des I_Ba, gewöhnlich 20% nicht überschreitend, innerhalb von 10 Minuten. Der I_Ba wurde typischerweise innerhalb von 10 ms aktiviert und sowohl mit einer schnellen Zeitkonstante im Bereich von 46 bis 105 ms als auch einer langsamen Zeitkonstante im Bereich von 291 bis 453 ms (n = 3) inaktiviert. Die Inaktivierung zeigte eine komplexe Spannungsabhängigkeit, so daß der bei ≥ 20 mV hervorgerufene I_Ba langsamer inaktiviert wurde als der bei niedrigeren Testspannungen hervorgerufene I_Ba, möglicherweise eine Folge einer Erhöhung der Größe langsamer Inaktivierungskomponenten im Vergleich zu schnellen Inaktivierungskomponenten bei höheren Testspannungen.
Rekombinante α_1B–1α_2bβ_1–2-Kanäle waren sensitiv gegenüber dem Haltepotential. Eine Gleichgewichtsinaktivierung von I_Ba, gemessen nach einer Konditionierung von 30 bis 60 Sekunden bei verschiedenen Haltepotentialen, betrug etwa 50% bei einem Haltepotential zwischen –60 und –70 mV und etwa 90% bei –40 mV. Die Erholung des I_Ba von der Inaktivierung war gewöhnlich unvollständig und es wurden 55 bis 75% der ursprünglichen Höhe innerhalb einer Minute, nachdem das Haltepotential auf negativere Potentiale zurückgebracht worden war, gemessen, was möglicherweise etwas Entladung oder eine langsame Erholungsrate anzeigt.
Rekombinante α_1B–1α_2bβ_1–2-Kanäle wurden auch irreversibel durch ω-CgTx-Konzentrationen blockiert, welche während der Zeitskala der Experimente im Bereich von 0,5 bis 10 μM lagen. Eine Verabreichung von 5 μM Toxin (n = 7) blockierte die Aktivität vollständig innerhalb von 2 Minuten und nach dem Auswaschen von ω-CgTx aus dem Bad wurde für bis zu 15 Minuten keine Erholung des I_Ba beobachtet. Die d²⁺-Blockierung (50 μM) war schnell, vollständig und reversibel; Die DHPs Bay K 8644 (1 μM; n = 4) oder Nifedipin (5 μM; n = 3) hatten keine wahrnehmbare Auswirkung.
Zellen, die mit DNA, kodierend für die α_1B–1-, α_2b- und β_1–2-Untereinheiten, cotransfiziert worden waren, zeigten überwiegend eine einzige Klasse von sättigungsfähigen, hochaffinen ω-CgTx-Bindungsstellen. Der bestimmte Wert der Dissoziationskonstante (Kd) betrug 54,6 ± 14,5 pM (n = 4). Zellen, welche mit dem Vektor transfiziert worden waren, der nur für β-Galactosidase kodierende DNA oder α_2bβ-kodierende DNA enthielt, zeigten keine spezifische Bindung. Die Bindungskapazität (B_max) der α_1B–1α_2bβ-transfizierten Zellen betrug 28.710 ± 11.950 Stellen pro Zelle (n = 4).
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß α_1B–1α_2bβ_1-2-transfizierte Zellen durch hohe Spannung aktivierte, inaktivierende Ca²⁺-Kanal-Aktivität exprimieren, welche irreversibel von ω-CgTx blockiert wird, insensitiv gegenüber DHPs und sensitiv gegenüber dem Haltepotential ist. Die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken und die Spannungssensitivität des in diesen Zellen gebildeten Kanals stehen im allgemeinen im Einklang mit früheren Charakterisierungen von neuronalen Ca²⁺-Kanälen des N-Typs.
F. Expression von DNA, welche für humane neuronale Calciumkanal-α_1B–1-,-α_1B–2-, -α_2b-, -β_1-2- und -β_1-3-Untereinheiten kodiert, in HEK-Zellen
Signifikante Ba²⁺-Ströme wurden in untransfizierten HEK293-Zellen nicht nachgewiesen. Ferner exprimieren untransfizierte HEK 293-Zellen keine nachweisbaren ω-CgTx-GVIA-Bindungsstellen.
Zur Abschätzung der Expression einer homogenen Population von trimeren α_1B-, α_2b- und β₁-Proteinkomplexen in transfizierten HEK 293-Zellen wurden die α_1B-, α_2b- und β₁-Expressionsniveaus verändert. Die Effizienz der Expression und des Zusammenbaus von Kanalkomplexen an der Zelloberfläche wurden durch Einstellung des Molverhältnisses der in den Transfektionen verwendeten α_1B-, α_2b- und β₁-Expressionsplasmide optimiert. Die Transfektanten wurden hinsichtlich mRNA-Niveaus, ω-CgTx-GVIA-Bindung und Ca²⁺-Kanal-Stromdichte analysiert, um eine nahezu optimale Kanalexpression in Abwesenheit immunologischer Reagenzien zur Beurteilung der Proteinexpression zu bestimmen. Höhere Molverhältnisse von α_2b schienen die Calciumkanal-Aktivität zu erhöhen.
1. Transfektionen
HEK 293-Zellen wurden in DMEM (Gibco #320-1965AJ), 5,5%iges definiert ergänztes Rinderkalbsserum (Hyclone #A-2151-L), 100 E/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin, aufrechterhalten. Auf Ca²⁺-Phosphat basierende vorübergehende Transfektionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt und analysiert. Die Zellen wurden cotransfiziert mit entweder 8 μg pcDNA1α_1B–1 (beschrieben in Beispiel II.C.), 5 μg pHBCaCHα₂A (siehe Beispiel IV.B.), 2 μg pHBCaCHβ_1bRBS(A) (β_1-2-Expressionsplasmid; siehe Beispiele III.A. und IX.E.) und 2 μg pCMVβ-gal [Clontech, Palo Alto, CA] (2 : 1, 8 : 1-Molverhältnis von Ca²⁺-Kanal-Untereinheits-Expressionsplasmiden) oder mit 3 μg pcDNA1α_1B–1 oder pcDNA1α_1B–2, 11,25 μg pHBCaCHα₂A, 0,75 oder 1,0 μg pHBCaCHβ_1bRBS(A) oder pcDNA1β_1–3 und 2 μg pCMVβ-gal (2 : 10, 9 : 1-Molverhältnis von Ca²⁺-Kanal-Untereinheits-Expressionsplasmiden). Das Plasmid pCMVß-gal, ein β-Galactosidase-Expressionsplasmid, war in den Transfektionen als Marken eingeschlossen, um Abschätzungen der Transfektionseffizienz durch histochemische Anfärbung zu ermöglichen. Wenn weniger als drei Untereinheiten exprimiert wurden, wurde pCMVPL2, ein pCMV-Promoter-enthaltender Vektor, dem ein cDNA-Insert fehlt, substituiert, um gleiche Mole an pCMV-basierter DNA in der Transfektion beizubehalten. pUC18-DNA wurde dazu verwendet, um die Gesamtmasse an DNA in der Transfektion bei 20 μg/Platte zu halten.
RNA aus den transfizierten Zellen wurde mit Hilfe von statistisch geprimten, ³²P-markierten, untereinheits-spezifischen Sonden durch Northernblot-Analyse hinsichtlich Calciumkanal-Untereinheits-mRNA-Expression analysiert. HEK 293-Zellen, welche mit α_1B–1-, α_2b- und β_1-2-Expressionsplasmiden (8, 5 bzw. 2 μg; Molverhältnis = 2 : 1, 8 : 1) cotransfiziert worden waren, exprimierten keine äquivalenten Niveaus einer jeden Ca²⁺-Kanal-Untereinheits- mRNA. Es wurden relativ hohe Niveaus an α_1B–1- und β_1-2-mRNAs exprimiert, jedoch wurden signifikant niedrigere Niveaus an α_2b-mRNA exprimiert. Basierend auf autoradiographischen Expositionen, welche erforderlich waren, um äquivalente Signale für alle drei mRNAs zu ergeben, wurden die α_2b-Transkriptniveaus als 5- bis 10fach weniger als die α_1B–1- und β_1-2- Transkriptniveaus abgeschätzt. Untransfizierte HEK 293-Zellen exprimierten keine nachweisbaren Niveaus an α_1B–1-, α_2b- oder β_1-2-mRNAs.
Um äquivalente Expressionsniveaus an Ca²⁺-Kanal-Untereinheits-mRNA zu erhalten, wurde eine Reihe von Transfektionen mit verschiedenen Mengen an α_1B–1-, α_2b- und β_1-2- Expressionsplasmiden durchgeführt. Nachdem die α_1B–1- und β_1-2-mRNAs auf sehr hohen Niveaus im Vergleich zu α_2b-mRNA exprimiert wurden, wurde bei den Transfektionsexperimenten die Masse der α_1Bm1- und β_1-2-Plasmide verringert und die Masse des α_2b-Plasmids erhöht. Die Cotransfektion mit 3, 11,25 und 0,75 μg α_1B–1-, α_2b- bzw. β_1-2-Expressionsplasmiden (Molverhältnis = 2 : 10, 9 : 1) erbrachte fast äquivalente Expressionsniveaus an jeder Ca²⁺-Kanal-Untereinheits-mRNA. Die relative Molmenge des α_2b-Expressionsplasmids gegenüber den α_1B–1- und β_1-2-Expressionsplasmiden war 6fach erhöht. Die Masse der α_1B–1und β_1-2-Plasmide bei der Transfektion war 2,67fach verringert und die Masse des α_2b-Plasmids war 2,25fach erhöht. Die 6fache molare Erhöhung von α_2b relativ zu α_1B–1 und β_1-2, welche erforderlich war, um nahezu gleich häufige mRNA-Niveaus zu erreichen, steht in Einklang mit der vorherigen 5- bis 10fach niedrigeren Schätzung der relativen α_2b-mRNA-Häufigkeit. Die ω-CgTx-GVIA-Bindung an Zellen, die mit verschiedenen Mengen von Expressionsplasmiden transfiziert worden waren, zeigte an, daß die 3, 11,25 und 0,75 μg der α_1B–1-, α_2b- bzw. β_1-2-Plasmide das Niveau der Zelloberflächenexpression von Kanalkomplexen erhöhte. Weitere Erhöhungen der Masse von α_2b- und β_1-2-Expressionsplasmiden, während α_1B–1 konstant gehalten wurde, und Veränderungen der Masse des α_1B–1- Expressionsplasmids, während α_2b und β_1-2 konstant gehalten wurden, zeigten an, daß die Zelloberflächenexpression von ω-CgTx-GVIA-Bindungsstellen pro Zelle nahezu optimal war. Alle nachfolgenden Transfektionen wurden mit 3, 11,25 und 0,75 μg oder 1,0 μg von α_1B–1-oder α_1B–2, α_2b- und β_1-2- oder β_1-3-Expressionsplasmiden durchgeführt.
2. ¹²⁵I-ω-CgTx-GVIA-Bindung an transfizierte Zellen
Eine statistische Analyse der Kd- und B_max-Werte wurde mit einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von dem Tukey-Kramer-Test für mehrfache paarweise Vergleiche, vorgenommen (p ≤ 0,05).
Kombinationen von Untereinheiten eines humanen spannungsabhängigen Ca²⁺-Kanals, α_1B–1, α_1B–2, α_2b, β_1-2 und β_1-3, wurden hinsichtlich Sättigungsbindung von^{125 I}-ω-CgTx-GVIA analysiert. Etwa 200.000 Zellen wurden pro Assay eingesetzt, mit Ausnahme der α_1B–1-, α_1B–2-, α_1B–1α_2b- und α_1B–2α_2b-Kombinationen, welche einem Assay mit 1 × 10⁶ Zellen pro Röhrchen unterworfen wurden. Die transfizierten Zellen zeigten eine einzige Klasse von sättigungsfähigen hochaffinen Bindungsstellen. Die Werte für die Dissoziationskonstanten (Kd) und Bindungskapazitäten (B_max) wurden für die verschiedenen Kombinationen bestimmt. Die Ergebnisse sind wie folgt zusammengefaßt:
Zellen, die mit Untereinheitskombinationen transfiziert worden waren, denen entweder die α_1B–1- oder die α_1B–2-Untereinheit fehlte, wiesen keinerlei nachweisbare ¹²⁵I-ω-CgTx-GVIA-Bindung auf (≤600 Stellen/Zelle). Die¹²⁵I-ω-CgTx-GVIA-Bindung an HEK 293-Zellen, die mit α_1B–2 allein oder mit α_1B–2α_2b transfiziert worden waren, war zu gering für eine zuverlässige Scatchard-Analyse der Daten. Ein Vergleich der Kd- und B_max Werte offenbarte mehrere Beziehungen zwischen spezifischen Kombinationen von Untereinheiten und den Bindungsaffinitäten und- kapazitäten der transfizierten Zellen. In Zellen, die mit allen drei Untereinheiten (α_1B–1α_2bβ_1-2-, α_1B–1α_2bβ_1-3 -, α_1B–2α_2bβ_1-2- oder α_1B–2α_2bβ_1-3-Transfektanten) transfiziert worden waren, waren die K_d-Werte ununterscheidbar (p > 0,05), im Bereich von 44,3 ± 8,1 pM bis 54,9 ± 11,1 pM. In Zellen, die mit Kombinationen von zwei Untereinheiten ohne die α_2b-Untereinheit transfiziert worden waren (α_1B–1β_1-2, α_1B–1β_1-3, α_1B–2β_1-2 oder α_1B-2β_1-3), waren die Kd-Werte signifikant niedriger als bei den Kombinationen mit drei Untereinheiten (p < 0,01), im Bereich von 16,4 ± 1,2 bis 22,2 ± 5,8 pM. Zellen, die mit lediglich der α_1B–1-Untereinheit transfiziert worden waren, besaßen einen K_d-Wert von 31,7 ± 4,2 pM, einen Wert, der sich nicht von den Kombinationen mit zwei Untereinheiten ohne α_2b unterschied (p < 0,05). Wie bei dem Vergleich zwischen den vier α_1Bα_2bβ₁- gegen α_1Bβ₁-Kombinationen, nahm der Kd-Wert signifikant (p < 0,05) von 31,7 ± 4,2 auf 84,6 ± 5,3 pM zu, wenn α_1B–1 mit α_2b coexprimiert wurde. Diese Daten demonstrieren, daß die Coexpression der α_2b-Untereinheit mit α_1B–1-, α_1B–1β_1-2-, α_1B–1β_1-3-, α_1B–2β_1-2- oder α_1B–2β_1-3-Untereinheitskombinationen zu einer niedrigeren Bindungsaffinität der Zelloberflächenrezeptoren für¹²⁵I-ω-CgTx-GVIA führt. Die B_max Werte von Zellen, die mit verschiedenen Untereinheitskombinationen transfiziert worden waren, differierten ebenfalls beträchtlich. Zellen, die nur mit der α_1B–1-Untereinheit transfiziert worden waren, exprimierten eine niedrige, aber nachweisbare Anzahl von Bindungsstellen (etwa 750 Bindungsstellen/Zelle). Wurde die α_1B–1-Untereinheit mit der α_2b-Untereinheit coexprimiert, nahm die Bindungskapazität etwa um das dreifache zu, während die Coexpression einer β_1-2- oder β_1-3-Untereinheit mit α_1B–1- zu einer 8- bis 10fach höheren Expression der Oberflächenbindung führte. Zellen, die mit allen drei Untereinheiten transfiziert worden waren, exprimierten die höchste Anzahl an Zelloberflächenrezeptoren. Die Bindungskapazitäten von Zellen, die mit den Kombinationen α_1B–1α_2bβ_1-3- oder α_1B–2α_2bβ_1-3 transfiziert worden waren, waren etwa 2fach höher als die entsprechenden Kombinationen, welche die β_1-2-Untereinheit enthielten. Gleichermaßen exprimierten Zellen, die mit den Kombinationen α_1B–1α_2bβ_1-2 oder α_1B _–1α_2bβ_1-3 transfiziert worden waren, etwa 2,5fach mehr Bindungsstellen pro Zelle als die entsprechenden Kombinationen, die α_1B–2 enthielten. In allen Fällen erhöhte die Coexpression der α_2b-Untereinheit mit α_1B und β₁ die Oberflächenrezeptordichte im Vergleich zu Zellen, die nur mit den entsprechenden α_1B- und β₁-Kombinationen transfiziert worden waren; etwa 8fach für α_1B _–1α_2bβ_1-2, 10fach für α_1B _–1α_2bβ_1-3, 9fach für α_1B _–2α_2bβ_1-2 und 13fach für α_1B _–2α_2bβ_1-3 Somit legt der Vergleich der B_max Werte nahe, daß die toxin-bindende Untereinheit, α_1B–1 oder α_1B–2, effizienter exprimiert und auf der Zelloberfläche angeordnet wird, wenn sie entweder mit der α_2b- oder der β_1-2- oder β_1-3-Untereinheit coexprimiert wird, und am effizientesten exprimiert wird, wenn die Untereinheiten α_2b und β₁ anwesend sind.
3. Elektrophysiologie
Die funktionelle Expression der Untereinheitskombinationen α_1B _–1α_2bβ_1-2 und α_1B _–1β_1-2 wurde mit Hilfe der Ganzzell-Aufzeichnungstechnik bewertet. Transfizierte Zellen, welche keine Kontakte mit umgebenden Zellen und eine einfache Morphologie aufwiesen, wurden etwa 48 Stunden nach der Transfektion für die Aufzeichnung eingesetzt. Die Pipettenlösung war (in mM) 135 CsCl, 10 EGTA, 1 MgCl₂, 10 HEPES und 4 mM Mg-ATP (pH 7,3, mit TEA-OH eingestellt). Die externe Lösung war (in mM) 15 BaCl₂, 125 Cholin-Cl, 1 MgCl₂ und 10 HEPES (pH 7,3, mit TEA-OH eingestellt). ω-CgTx-GVIA (Bachem) wurde in der externen Lösung mit 0,1% Cytochrom C (Sigma), um als Träger zu dienen, präpariert. Kontrollexperimente zeigten, daß Cytochrom C keine Auswirkung auf den Ba²⁺-Strom hatte.
Es wurden die makroskopischen elektrophysiologischen Eigenschaften von Ba²⁺-Strömen in Zellen untersucht, die mit verschiedenen Mengen des α_2b-Expressionsplasmids transfiziert worden waren, während die relativen Mengen der α_1B–1- und β_1-2-Plasmide konstant gehalten worden waren. Die Amplituden und Dichten der Ba²⁺-Ströme (15 mM BaCl₂), die von ganzen Zellen dieser Transfektanten aufgezeichnet worden waren, unterschieden sich dramatisch. Die mittleren Ströme von 7 bis 11 Zellen von drei Transfektionstypen (kein α_2b; Molverhältnis 2 : 1, 8 : 1 [α_1B–1 : α_2b : β_1-2 ] und Molverhältnis 2 : 10, 9 : 1 [α_1B–1 : α_2b : β_1-2]) wurden bestimmt. Die kleinsten Ströme (Bereich: 10 bis 205 pA) wurden aufgezeichnet, wenn α_2b in der Transfektion nicht eingeschlossen war, und die größten Ströme (Bereich: 50 bis 8300 pA) wurden mit dem 2 : 10, 9 : 1-Verhältnis von α_1B–1α_2bβ_1-2-Plasmiden aufgezeichnet, dem Verhältnis, welches zu nahezu äquivalenten mRNA-Niveaus für jedes Untereinheitstranskript führte. Wenn die Menge an α_2b-Plasmid eingestellt wurde, um etwa eine gleiche Häufigkeit von Untereinheits-mRNAs zu ergeben, stieg der mittlere Ba²⁺-Gipfelstrom von 433 pA auf 1824 pA (4,2fach) mit einer entsprechenden Erhöhung der mittleren Ladungsdichte von 26 pA/pF auf 127 pA/pF (4,9fach). Diese Erhöhung findet in Gegenwart einer 2,7-fachen Abnahme der Masse von α_1B–1- und β_1-2-Expressionsplasmiden bei den Transfektionen statt. Bei allen Transfektionen folgten die Größen der Ba²⁺-Ströme keiner normalen Verteilung.
Zum Vergleich der Untereinheitskombinationen und Feststellung der Wirkungen von α_2b wurden die Strom-Spannungs-Eigenschaften von Zellen untersucht, die mit α_1B–1β_1-2 oder mit α_1B–1α_2bβ_1-2 entweder in dem Molverhältnis von 2 : 1, 8 : 1 (α_1B–1 : α_2b : β_1-2) oder dem Molverhältnis 2 : 10, 9 : 1 (α_1B–1 : α_2b : β_1-2) transfiziert worden waren. Die extremen Beispiele von keinem α_2b und 11,25 μg α_2b (2 : 10, 9 : 1 als Molverhältnis) zeigten keine signifikanten Unterschiede bei dem Strom-Spannungs-Diagramm bei Testpotentialen zwischen 0 mV und +40 mV (p < 0,05). Die leichten Unterschiede, die auf jeder Seite der Gipfelregion des Strom-Spannungs-Diagramms beobachtet wurden, waren wahrscheinlich auf die Normalisierung zurückzuführen. Die sehr geringen Ströme, die bei den α_1B-β_1-2-transfizierten Zellen beobachtet wurden, haben im Vergleich zu dem Bariumstrom, welcher durch den Testimpuls aktiviert wird, eine substantiell höhere Komponente an restlichem Kriechstrom. Wenn die Strom-Spannungs-Diagramme normalisiert werden, ist dieser Kriechstrom eine viel größere Komponente als bei den α_1B–1α_2bβ_1-2-transfizierten Zellen und als Folge erscheint das Strom/Spannungs-Diagramm breiter. Dies ist die wahrscheinlichste Erklärung der scheinbaren Unterschiede in den Strom/Spannungs-Diagrammen, insbesondere in Anbetracht der Tatsache, daß das Strom-Spannungs-Diagramm für die α_1B–1β_1-2-transfizierten Zellen auf beiden Seiten des Gipfels abweicht. Typischerweise wird, wenn die spannungsabhängige Aktivierung verschoben ist, das gesamte Strom-Spannungs-Diagramm verschoben, was nicht beobachtet wurde. Für den qualitativen Vergleich der jeweiligen Kinetik wurden die mittleren Reaktionen auf Testimpulse von –90 mV bis 10 mV normalisiert und graphisch aufgetragen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetiken von Ganzzell-Ba²⁺-Strömen bei irgendeiner Kombination beobachtet.
G. Expression von DNA, welche für humane neuronale Human-Calciumkanal-α_1E–3α_2bβ_1-3 und -α_1E–1α_2bβ_1-3-Untereinheiten kodiert, in HEK-Zellen
Die funktionelle Expression von α_1E–1α_2bβ_1-3 und α_1E–1α_2bβ_1-3 sowie von α_1E–3 wurde mit Hilfe der Ganzzell-Aufzeichnungstechnik beurteilt.
1. Methoden
Die Aufzeichnungen wurden mit vorübergehend transfizierten HEK 293-Zellen zwei Tage nach der Transfektion von Zellen, die keine Kontakte mit umgebenden Zellen hatten und eine einfache Morphologie aufwiesen, durchgeführt.
Die interne Lösung, welche zum Füllen von Pipetten für die Aufzeichnung des Bariumstroms von den transfizierten rekombinanten Calciumkanälen verwendet wurde, war (in mM) 135 CsCl, 10 EGTA, 1 MgCl₂, 10 HEPES und 4 mM Mg-ATP (pH 7,4–7,5, mit TEA-OH eingestellt). Die externe Lösung für die Aufzeichnung des Bariumstroms war (in mM) 15 BaCl₂, 150 Cholin-Cl, 1 MgCl₂ und 10 HEPES und 5 TEA-OH (pH 7,3, mit TEA-OH eingestellt). Bei Experimenten, in denen Ba²⁺ durch Ca²⁺ ersetzt wurde, wurde eine Laminarströmungskammer eingesetzt, um die extrazelluläre Lösung vollständig auszutauschen und jede Mischung von Ba²⁺ und Ca²⁺ zu verhindern. ω-CgTx-GVIA wurde in der externen Lösung mit 0,1% Cytochrom C, um als Träger zu dienen, präpariert, wobei das Toxin durch eine unter Druck stehende Pufferpipette verabreicht wurde. Der Reihenwiderstand wurde zu 70 bis 85 kompensiert und die Ströme wurden nur analysiert, falls der Spannungsfehler aufgrund des Reihenwiderstands weniger als 5 mV betrug. Ableitungswiderstand und Kapazitanz wurde korrigiert durch Subtraktion des beobachteten skalierten Stroms mit dem P/-4-Protokoll wie durch pClamp implementiert (Axon Instruments).
2. Elektrophysiologische Ergebnisse
Zellen, die mit α_1E–1α_2bβ_1-3 oder α_1E–3α_2bβ_1-3 transfiziert worden waren, zeigten bei Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen starke Bariumströme. Zellen, die α_1E–3α_2bβ_1-3 exprimierten, hatten größere Gipfelströme als diejenigen, welche α_1B–1α_2bβ_1-3 exprimierten. Darüber hinaus sind die Kinetiken der Aktivierung und Inaktivierung in den Zellen, die α_1E-Calciumkanäle exprimieren, eindeutig wesentlich schneller. HEK 293-Zellen, die α_1E–3 alleine exprimieren, haben ein signifikantes Maß an funktionellen Calciumkanälen mit Eigenschaften, die den α_1Eα_2bβ_1-3 exprimierenden ähnlich sind, jedoch mit wesentlich geringeren Gipfel-Bariumströmen. So sind mit α_1E die α₂- und β₁-Untereinheiten für die funktionelle Expression von α_1E-vermittelten Calciumkanälen nicht erforderlich, sie erhöhen jedoch substantiell die Anzahl funktioneller Calciumkanäle.
Die Untersuchung der Strom-Spannungs-Eigenschaften von α_1Eα_2bβ_1-3 exprimierenden Zellen zeigt an, daß α_1E–3α_2bβ_1-3 ein durch hohe Spannung aktivierter Calciumkanal ist, und der Gipfelstrom wird bei einem Potential erreicht, das nur etwas weniger positiv ist als bei anderen neuronalen Calciumkanälen, welche ebenfalls α_2b und β₁ und α_1B und α_1D exprimieren. Die Strom-Spannungs-Eigenschaften von α_1E–3α_2bβ_1-3 und α_1E–3α_2bβ_1-3 unterscheiden sich statistisch von denjenigen von α_1E–3α_2bβ_1-3. Strom-Spannungs-Kurven für α_1E–3α_2bβ_1-3 und α_1E–3α_2bβ_1-3 haben einen Gipfel bei etwa +5 mV, wie die Strom-Spannungs-Kurve für α_1E–3 alleine.
Die Kinetik und Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung bei Anwendung von sowohl Präimpuls- (200 ms) als auch Gleichgewichts-Inaktivierung wurde untersucht. α_1E-vermittelte Calciumkanäle werden im Vergleich zu bisher klonierten Calciumkanälen und anderen durch hohe Spannung aktivierten Calciumkanälen schnell inaktiviert. Die α_1E–3α_2bβ_1-3-vermittelten Calciumkanäle werden schnell inaktiviert und sind somit sensitiv gegenüber relativ kurzen (200 ms) Präimpulsen sowie langen Präimpulsen (> 20 s Gleichgewichts-Inaktivierung) erholen sich jedoch schnell von der Gleichgewichts-Inaktivierung. Die Kinetik der schnellen Inaktivierung hat zwei Komponenten, eine mit einer Zeitkonstante von etwa 25 ms und die andere mit einer Zeitkonstante von etwa 400 ms.
Zur Feststellung, ob α_1E-vermittelte Calciumkanäle Eigenschaften von durch niedrige Spannung aktivierten Calciumkanälen aufweisen, wurden die Details der Restströme, welche durch einen Testimpuls im Bereich von –60 bis +90 mV aktiviert wurden, bei –60 mV gemessen. Die Restströme, die bei –60 mV aufgezeichnet wurden, konnten gut mit einer einzigen Exponentialgröße von 150 bis 300 μs angepaßt werden; mindestens eine Größenordnung schneller als diejenigen, welche typischerweise mit durch niedrige Spannung aktivierten Calciumkanälen beobachtet werden.
In HEK 293-Zellen, welche α_1E–3α_2bβ_1-3 exprimieren, fließt mehr Strom mit Ba²⁺ als Ladungsträger und die Ströme, welche von Ba²⁺ und Ca²⁺ getragen werden, besitzen unterschiedliche Strom-Spannungs-Eigenschaften. Ferner ist mit Ca²⁺ als Ladungsträger der Zeitverlauf der Inaktivierung langsamer und das Ausmaß der Präimpuls-Inaktivierung geringer.
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Isoliertes DNA-Fragment, welches für eine α_1E–1-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, umfassend die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Sequenz von Aminosäuren, kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 1, umfassend die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Nukleotidsequenz, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Sequenz von Aminosäuren kodiert.
Isoliertes DNA-Fragment, welches für eine α_1E–3-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, umfassend die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Sequenz von Aminosäuren, kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 3, umfassend die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Nukleotidsequenz, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Sequenz von Aminosäuren kodiert.
Isoliertes DNA-Fragment, kodierend für eine α_1E-Splice-Variante, welches unter Bedingungen hoher Stringenz mit der in SEQ-ID-Nr. 24 oder SEQ-ID-Nr. 25 angegebenen Sequenz von Nukleotiden hybridisiert.
Isoliertes Protein, kodiert von einem DNA-Fragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5.
Isoliertes Protein, welches die in SEQ-ID-Nr. 24 oder SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Sequenz von Aminosäuren aufweist.
Isoliertes DNA-Fragment, welches für eine β₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, die die in SEQ-ID-Nr. 26 oder SEQ-ID-Nr. 37 oder SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt, kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 8, wobei die Untereinheit eine β₂-Untereinheit ist, welche die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
DNA-Fragment nach Anspruch 8, wobei die Sequenz von Nukleotiden die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Nukleotidsequenz, welche für die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Sequenz von Aminosäuren kodiert, umfaßt.
DNA-Fragment nach Anspruch 8, wobei die Untereinheit eine β_2D-Untereinheit ist, welche die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
DNA-Fragment nach Anspruch 11, wobei die Sequenz von Nukleotiden die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Nukleotidsequenz, welche für die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Sequenz von Aminosäuren kodiert, umfaßt.
DNA-Fragment nach Anspruch 8, wobei die Untereinheit eine β_2E-Untereinheit ist, welche die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
DNA-Fragment nach Anspruch 13, wobei die Sequenz von Nukleotiden die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Nukleotidsequenz, welche für die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Sequenz von Aminosäuren kodiert, umfaßt.
Isoliertes DNA-Fragment, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche für ein Protein kodiert, das mindestens 40% Homologie über die vollständige Sequenz mit einem Protein aufweist, das von der in SEQ-ID-Nr. 26, SEQ-ID-Nr. 37 oder SEQ-ID-Nr. 38 angegebenen Sequenz von Nukleotiden kodiert wird.
Isoliertes Protein, kodiert von einem DNA-Fragment nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 15.
Isoliertes Protein, welches die in SEQ-ID-Nr. 26, SEQ-ID-Nr. 37 oder SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Sequenz von Aminosäuren aufweist.
Isoliertes DNA-Fragment, welches für eine β₄-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, die die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Sequenz von Aminosäuren einschließt, kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 18, umfassend die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Nukleotidsequenz, welche für die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Sequenz von Aminosäuren kodiert.
Isoliertes DNA-Fragment, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche für ein Protein kodiert, das mindestens 40% Homologie über die vollständige Sequenz mit einem Protein aufweist, das von der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz von Nukleotiden kodiert wird.
Isoliertes Protein, kodiert von einem DNA-Fragment nach irgendeinem der Ansprüche 18 bis 20.
Isoliertes Protein, kodiert von der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz von Aminosäuren.
Eukaryotische Zelle, umfassend als heterologe DNA ein DNA-Fragment nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, 8 bis 15 oder 18 bis 20.
Eukaryotische Zelle, umfassend heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, wobei die α₁-Untereinheit eine in SEQ-ID-Nr. 24 oder SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt und die β-Untereinheit eine in SEQ-ID-Nr. 19 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt.
Zelle nach Anspruch 24, wobei die heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit kodiert, die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Zelle nach Anspruch 24, wobei die heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit kodiert, die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Eukaryotische Zelle, umfassend heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, wobei die α₁-Untereinheit eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 23 oder SEQ-ID-Nr. 36 angegeben ist, und die β-Untereinheit eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in SEQ-ID-Nr. 26, SEQ-ID-Nr. 27, SEQ-ID-Nr. 37 oder SEQ-ID-Nr. 38 angegeben ist.
Zelle nach Anspruch 27, wobei die heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit kodiert, die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Zelle nach Anspruch 27, wobei die heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit kodiert, die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Zelle nach Anspruch 27, wobei die heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit kodiert, die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Zelle nach Anspruch 27, wobei die heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit kodiert, die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Eukaryotische Zelle, umfassend heterologe DNA, die für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, wobei mindestens eine der Untereinheiten aus der Gruppe, bestehend aus einer α₁-Untereinheit, die eine in SEQ-ID-Nr. 24 oder SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, und einer β-Untereinheit, die eine in SEQ-ID-Nr. 26, SEQ-ID-Nr. 27, SEQ-ID-Nr. 37 oder SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle, umfassend heterologe DNA, die für eine β₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und heterologe DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, wobei die heterologe DNA, die für mindestens eine der Untereinheiten kodiert, eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, welche aus der Gruppe,bestehend aus der in SEQ-ID-Nr. 24 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 25 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 37 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 38 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, und der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle mit einem funktionellen heterologen Calciumkanal, hergestellt durch ein Verfahren, welches umfaßt: Einführung von heterologen Nukleinsäure, die für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, in die Zelle, wobei: die α₁-Untereinheit eine in SEQ-ID-Nr. 24 oder SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, der heterologe Calciumkanal mindestens eine Untereinheit enthält, die von der heterologen Nukleinsäure kodiert wird, und die einzigen heterologen Ionenkanäle Calciumkanäle sind.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 34, wobei die heterologe Nukleinsäure eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, welche aus der Gruppe bestehend aus der in SEQ-ID-Nr. 24 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, und der in SEQ-ID-Nr. 25 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 34, wobei die heterologe Nukleinsäure RNA ist, kodiert von einem DNA-Fragment, das die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, oder die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Eukaryotische Zelle mit einem funktionellen heterologen Calciumkanal, hergestellt durch ein Verfahren, welches umfaßt: Einführung von heterologer Nukleinsäure, welche für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, in die Zelle und Einführung von heterologer Nukleinsäure, welche für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, in die Zelle, wobei: mindestens eine der Untereinheiten aus der Gruppe, bestehend aus einer α_1E-, β₂- und einer β₄-Untereinheitausgewählt ist, die mindestens eine Untereinheit die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 24, 25, 26, 27, 37 oder 38 angegebene Sequenz von Aminosäuren einschließt, der heterologe Calciumkanal mindestens eine von der heterologen Nukleinsäure kodierte Untereinheit enthält, und die einzigen heterologen Ionenkanäle Calciumkanäle sind.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 37, wobei die heterologe Nukleinsäure, die für mindestens eine der Untereinheiten kodiert, eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die aus der Gruppe, bestehend aus der in SEQ-ID-Nr. 24 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 25 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 37 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 38 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, und der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 38, wobei die heterologe Nukleinsäure RNA ist, kodiert von einem DNA-Fragment, das eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die aus der Gruppe, bestehend aus der in SEQ-ID-Nr. 24 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 25 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 37 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 38 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, und der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle nach irgendeinem der Ansprüche 24 bis 39, welche darin eingeführt eine heterologe Nukleinsäure aufweist, die für eine α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 40, wobei die α₂-Untereinheit die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 41, wobei die α₂-Untereinheit von einer Nukleinsäure kodiert wird, die die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebene Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, umfaßt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität eines Calciumkanals moduliert, umfassend: Suspendieren einer eukaryotischen Zelle, die einen funktionellen heterologen Calciumkanal aufweist, in einer Lösung, welche die Verbindung und ein Calciumkanal-selektives Ion enthält, Depolarisieren der Zellmembran der Zelle, und Nachweisen des in die Zelle fließenden Stroms, wobei: der heterologe Calciumkanal mindestens eine humane Calciumkanal-Untereinheit einschließt, die von DNA oder RNA kodiert wird, welche für die Zelle heterolog ist, mindestens eine Untereinheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer α_1E–1-, α_1E–3-, β₂- und einer β₄-Untereinheit besteht, und die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 24, 25, 26, 27, 37 oder 38 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt, der nachgewiesene Strom sich von demjenigen unterscheidet, welcher durch Depolarisieren derselben oder einer identischen Zelle in Gegenwart desselben Calciumkanal-selektiven Ions, aber in Abwesenheit der Verbindung, erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei die heterologe DNA oder RNA, die für mindestens eine der Untereinheiten kodiert, eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die aus der Gruppe, bestehend aus der in SEQ-ID-Nr. 24 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 24 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 25 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 37 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 37 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, der in SEQ-ID-Nr. 38 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 38 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, und der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Sequenz von Nukleotiden, welche für die in SEQ-ID-Nr. 27 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt ist.
Antikörper, der für einen α₁-Untereinheitssubtyp eines humanen Calciumkanals spezifisch ist, wobei der Subtyp aus der Gruppe bestehend aus einem humanen Calciumkanal, wobei der Subtyp aus α_1E–1 und α_1E–3 ausgewählt ist, ausgewählt ist und die Untereinheit eine in SEQ-ID-Nr. 24 oder SEQ-ID-Nr. 25 angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
RNA- Sonde oder einzelsträngige DNA-Sonde von mindestens 30 Basen Länge, umfassend mindestens 30 zusammenhängende Basen einer Nukleotidsequenz, die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 24, 25, 26, 27, 37 oder 38 angegeben ist.
RNA- Sonde oder einzelsträngige DNA-Sonde von mindestens 16 Basen Länge, umfassend mindestens 16 zusammenhängende Basen einer Nukleotidsequenz, die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 24, 25, 26, 27, 37 oder 38 angegeben ist.
Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für eine humane Calciumkanal-Untereinheit kodieren, umfassend das Hybridisieren einer Sonde nach Anspruch 46 oder Anspruch 47 mit einer Bank von Nukleinsäurefragmenten unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz und die Selektion hybridisierender Fragmente.
Verfahren zur Identifizierung von Zellen oder Geweben, die eine für eine Calciumkanal-Untereinheit kodierende Nukleinsäure exprimieren, umfassend das Hybridisieren einer Sonde nach Anspruch 46 oder Anspruch 47 mit mRNA, die in den Zellen oder Geweben exprimiert wurde, oder cDNA, die von der mRNA hergestellt wurde, unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz und dadurch Identifizierung von Zellen oder Gewebe, welche mRNA exprimieren, die für die Untereinheit kodiert.
Humane Calciumkanal-Untereinheit, ausgewählt aus α_1E–1, α_1E–3, β₂ und β₄, wobei die Untereinheit die Sequenz von Aminosäuren einschließt, die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 24, 25, 26, 27, 37 oder 38 angegeben ist.