JPH09509041A - ヒトカルシウムチャンネル組成物及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 一次転写物のスプライス変異体として生じるサブユニットを含むヒトカルシウムチャンネルα₁−、α₂−、β−及びγ−サブユニットの各々をコードする単離ＤＮＡが提供される。特に、ヒトカルシウムチャンネルのα_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2、α_1E-3、β_3-1、β_2C、β_2D、β_2E及びβ₄サブユニットの各々をコードするＤＮＡクローンが提供される。ＤＮＡを含む細胞及びベクター、サブユニット特異的抗体及び核酸プローブ並びにヒトカルシウムチャンネルの活性を変調する化合物の同定方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトカルシウムチャンネル組成物及びその使用方法 技術的分野 本発明は分子生物学及び薬理学に関する。特に、本発明は、カルシウムチャン ネル組成物並びにその製造方法及び使用方法に関する。発明の背景 カルシウムチャンネルは、Ｃａ²⁺イオンを細胞外の流体から細胞内へ調節的に 流入させ得る膜貫通型タンパク質であり、多数のサブユニットを有している。動 物界のあらゆる細胞及び少なくともある種の細菌、菌類及び植物の細胞は１タイ プ以上のカルシウムチャンネルを有している。 最も普遍的なタイプのカルシウムチャンネルは電圧依存性である。細胞内へＣ ａ²⁺イオンを流入させるように電圧依存性チャンネルが「開く」ためには、チャ ンネル保有細胞の内部と細胞を浸漬させている細胞外媒体との間の電位差がある レベルになるまで脱分極する必要がある。細胞内へのＣａ²⁺イオンの流入量はこ の電位差に依存する。中枢神経系(ＣＮＳ)のニューロン、末梢神経細胞、並びに 、骨格筋、心筋、静脈及び動脈の平滑筋などの筋細胞のような動物体内のすべて の「興奮性」細胞は、電圧依存性カルシ ウムチャンネルを有している。 骨格筋、心筋、肺、平滑筋及び脳などの種々の組織に由来の哺乳類細胞中で多 くのタイプのカルシウムチャンネルが同定されている〔例えば、Ｂｅａｎ,Ｂ.Ｐ .(１９８９)Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｐｈｙｓｉｏｌ.５１：３６７−３８４及びＨｅｓｓ ,Ｐ.(１９９０)Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.５６：３３７参照〕。種々の タイプのカルシウムチャンネルは、電流カイネティクス(kinetics)、静止電位(h olding potential)感受性及びカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニ ストに対する感受性に基づいて識別可能なＬ−、Ｔ−、Ｎ−及びＰ−型の４種類 に大別される。 カルシウムチャンネルは、約１３０〜約２００キロダルトン(ｋＤ)の分子量を もちα₁及びα₂と呼ばれる２つの大サブユニットと、約６０ｋＤ未満の分子量を もつ１〜３個の異なる小サブユニットとから成るマルチサブユニットタンパク質 である。大サブユニットの少なくとも１つ及び任意に小サブユニットのいくつか がグリコシル化されている。いくつかのサブユニットはリン酸化されることも可 能である。α₁サブユニットは、哺乳類筋組織から単離後にドデシル硫酸ナトリ ウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動(ＰＡＧＥ)で分析すると分子量約１５０〜約１７０ｋＤを有し、種々の１ ,４−ジヒドロピリジン(ＤＨＰ)及びフェニルアルキルアミンに特異的に結合す る部位を有している。α₂サブユニットは、非還元性条件下(Ｎ−エチルマレイミ ドの存在下)のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量約１６０〜１９０ｋＤに対応す るバンドとして泳動する。還元によって、大断片とより小さい断片とが遊離する 。ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルのβサブユニットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析による測定分子量５２〜６５ｋＤのリン酸化タンパク質である。このサブユニ ットは還元性条件に感受性でない。カルシウムチャンネルのγサブユニットは、 精製されたすべての調製物中で観察されるとは限らないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析による測定見掛け分子量３０〜３３ｋＤの糖タンパク質であると考えられる。 カルシウムチャンネルの構造及び機能を研究するためには、大量の純粋なチャ ンネルタンパク質が必要である。これらのマルチサブユニットタンパク質が複合 体の性質を有すること、タンパク質が由来した組織中のカルシウムチャンネルの 濃度が多様であること、組織中にカルシウムチャンネルの混合集団が存在するこ と、目的の組織を得ること が難しく、また単離手順中に天然型タンパク質の修飾が生じることから、高度に 精製された完全にインタクトなカルシウムチャンネルタンパク質を大量に得るこ とは極めて難しい。 大多数の細胞中に種々のタイプのカルシウムチャンネルの混合集団が存在する ことが、全細胞の分析による特定タイプのカルシウムチャンネルのキャラクタリ ゼーションを極めて難しいものにしている。個々のカルシウムチャンネルを試験 するために使用される単一チャンネル記録方法は、チャンネルの分子構造または 生化学組成に関する情報を全く与えない。更に、この種の分析を行う場合には、 天然機能及び薬理学的相互作用に重要であると考えられる他の細胞構成成分から チャンネルが単離される。 種々のタイプのカルシウムチャンネルの別のキャラクタリゼーション手段とし て、カルシウムチャンネルをコードする１つまたは複数の遺伝子のキャラクタリ ゼーションがある。カルシウムチャンネルタンパク質をコードする遺伝子のコー ディング領域の完全ヌクレオチド配列から決定されたアミノ酸配列は、タンパク 質の一次構造を示す。更に、一次構造の分析に基づいて、カルシウムチャンネル タンパ ク質の二次構造及び膜に対するタンパク質の関係を予測し得る。例えば、ウサギ 骨格筋カルシウムチャンネルのα₁サブユニットタンパク質のハイドロパシープ ロットは、α₁サブユニットが、６個の推定トランスメンブラン領域を各々が含 む４個の内部リピートを含むことを示す〔Ｔａｎａｂｅ,Ｔ.ら(１９８７)Ｎａｔ ｕｒｅ３２８：３１３〕。 カルシウムチャンネルは種々の組織に存在し細胞内カルシウムイオン濃度の調 節に中心的役割を果たすので、神経伝達物質放出、筋収縮、ペースメーカー活性 、ホルモン及び他の物質の分泌などの動物体内の多数の生命プロセスに関与する 。これらのプロセスは、ＣＮＳ及び心血管疾患のような多数のヒト疾患に関与す ると考えられる。従ってカルシウムチャンネルもまた多数の疾患に関与する。ヒ トを含めた動物の種々の心血管疾患の治療に有用な多数の化合物は、心臓及び／ または血管の平滑筋に存在する電圧依存性カルシウムチャンネルの機能を変調す ることによってその有益な効果を作用させると考えられている。これらの化合物 の多くはカルシウムチャンネルに結合し、細胞膜の脱分極に反応して細胞内への Ｃａ²⁺の流入を阻害したりまたは流入速度を減少させたりする。 ウサギのカルシウムチャンネルα₁サブユニットをコードするｃＤＮＡクロー ン及びｃＤＮＡクローンの転写物の組換え発現の研究結果は、α₁サブユニット がカルシウムを細胞に流入させるポアを形成することを示す。これらの組換え細 胞中で発生したバリウム電流と、夫々のα₁サブユニットを１成分として含有す るカルシウムチャンネルによってｉｎ ｖｉｖｏに発生した実効電流との関連は 不明である。種々のカルシウムチャンネルのタイプを完全且つ正確に特性決定及 び評価するためには、ｉｎ ｖｉｖｏに見出されるサブユニットを全て含有する 組換えチャンネルの機能特性試験が必須である。 この試験を実施しカルシウムチャンネルの構造及び機能を完全に理解するため に、できるだけ多数のカルシウムチャンネルサブユニットを同定し特性決定する ことが極めて重要である。また、カルシウムチャンネルと相互作用する化合物の 同定に使用される組換え細胞を調製するために、所定のサブユニットを含有する カルシウムチャンネルの均一な集団を発現する細胞を産生することが必要である 。 ＣＮＳのような他の器官系においてカルシウムチャンネルと相互作用する化合 物の薬理学を理解することができれ ば、例えば神経変性疾患及び心血管疾患の治療において所望の治療効果を与える ようにヒトカルシウムチャンネルのサブタイプと特異的に相互作用する化合物の 合理的な設計が促進されるであろう。しかしながら、特にＣＮＳ中ではヒトカル シウムチャンネルのタイプ及び個々のサブタイプの分子的性質を独立に決定でき ないこと、また、カルシウムチャンネル作動化合物(calcium channel-effecting compounds)の特異性を評価するために必要な特定チャンネルサブタイプの純粋 な調製物を入手できないことが、このような理解及び治療有効化合物の合理的設 計の妨げとなっていた。従って、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコー ドするＤＮＡを同定し、カルシウムチャンネルサブユニット及び機能性カルシウ ムチャンネルを発現するためにこのようなＤＮＡを使用できれば、治療有効化合 物のスクリーニング及び設計が促進されるであろう。 従って、本発明の１つの目的は、特定カルシウムチャンネルサブユニットをコ ードするＤＮＡを提供し、組換え組織特異的または組換えサブタイプ特異的カル シウムチャンネルを保有する真核細胞を提供することである。本発明の目的は更 に、カルシウムチャンネルのアンタゴニスト及び アゴニストとして作用する有望な治療用化合物の同定アッセイを提供することで ある。発明の概要 ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする単離及び精製された核酸 フラグメントが提供される。ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコ ードするＤＮＡ、及び、かかるＤＮＡの転写によって作製された上記サブユニッ トをコードするＲＮＡが提供される。特に、電圧依存性ヒトカルシウムチャンネ ル(ＶＤＣＣ)のα₁サブユニットのタイプＡ、タイプＢ(ＶＤＣＣIVとも呼ぶ)、 タイプＣ(ＶＤＣＣIIとも呼ぶ)、タイプＤ(ＶＤＣＣIIIとも呼ぶ)及びタイプＥ をコードするＤＮＡフラグメントが提供される。 α_1A、α_1B、α_1C、α_1D及びα_1EサブユニットをコードするＤＮＡが提供され る。配列番号１の残基１０−２１６１として示すアミノ酸を実質的に含むα_1Dサ ブユニットをコードするＤＮＡが提供される。配列番号１のアミノ酸３７３−４ ０６に置換して配列番号２のアミノ酸１−３４として示すアミノ酸を実質的に含 むα_1DサブユニットをコードするＤＮＡが提供される。また、配列番号３または 配列 番号６として示すアミノ酸を実質的に含むα_1CサブユニットをコードするＤＮＡ 及び配列番号７または配列番号８として示すアミノ酸配列を実質的に含むα_1Bサ ブユニットをコードするＤＮＡも提供される。 α_1AサブユニットをコードするＤＮＡも提供される。このようなＤＮＡは、配 列番号２２もしくは２３で示すＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列と実質 的に同じアミノ酸配列を有しているα_1AサブユニットをコードするＤＮＡ、また は、配列番号２２もしくは２３で示す配列の全部もしくは一部を含むα_1Aの他の スプライス変異体をコードするＤＮＡを含む。配列番号２２で示す配列はα_1A-1 と呼ばれるスプライス変異体であり、配列番号２３で示す配列はα_1A-2と呼ばれ るスプライス変異体である。α_1AサブユニットをコードするＤＮＡはまた、配列 番号２１、２２もしくは２３を有するＤＮＡまたはブダペスト条約に従ってＡｍ ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ,１２３０１ Ｐ ａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ,Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ Ｕ.Ｓ.Ａ.に受託番号７５２９３で寄託されたα_1AサブユニットをコードするＤ ＮＡを含む大腸菌宿主のファージ溶菌液か ら得られたＤＮＡの全部または一部を用いて単離され得るサブユニットをコード するＤＮＡを含む。このようなファージ中のＤＮＡは配列番号２１で示す配列を 有するＤＮＡフラグメントを含む。このフラグメントは、高緊縮性条件下でα_1A をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズするが、α_1BをコードするＤＮＡ にハイブリダイズしないので、α_1AサブユニットをコードするＤＮＡを単離する ために使用され得る。 ヒトカルシウムチャンネルのα_1EサブユニットをコードするＤＮＡも提供され る。このＤＮＡは、配列番号２４で示すＤＮＡによってコードされたα_1E-1と呼 ばれるα_1Eスプライス変異体をコードするＤＮＡ、及び、配列番号２５で示すＤ ＮＡによってコードされたα_1E-3と呼ばれる変異体をコードするＤＮＡを含む。 このＤＮＡはまた、配列番号２４及び２５に示すヌクレオチドの配列の全部また は一部によってコードされたアミノ酸の配列をコードする他のスプライス変異体 を含み、また、高緊縮性条件下で配列番号２４または２５のＤＮＡにハイブリダ イズしα_1Eスプライス変異体をコードするＤＮＡを含む。 ヒトカルシウムチャンネルのα₂サブユニットをコード するＤＮＡ及び該サブユニットをコードするＲＮＡも提供される。該ＲＮＡは該 ＤＮＡの転写によって作製されたものである。組織特異的スプライス変異体のよ うなα₂サブユニットのスプライス変異体をコードするＤＮＡも提供される。特 に、サブユニットのα_2a−α_2eサブタイプをコードするＤＮＡが提供される。特 に好ましい実施態様では、配列番号１１に示すアミノ酸をコードするＤＮＡと、 配列番号１１のヌクレオチド１６２４と１６２５との間に挿入された配列番号１ ３のＤＮＡとを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるα₂サ ブユニットをコードするＤＮＡが提供される。α_2a−α_2eのＤＮＡ及びアミノ酸 を夫々配列番号１１及び２９〜３２に示す。 β₁、β₂、β₃及びβ₄サブユニット並びにβサブユニットのスプライス変異体 をコードするＤＮＡのような、ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコー ドする単離及び精製ＤＮＡフラグメントが提供される。ＤＮＡの転写によって作 製されたβサブユニットをコードするＲＮＡも提供される。 また、配列番号９に示すアミノ酸をコードしているが配列番号９のヌクレオチ ド６１５−７８１に置換して配列番 号１２の挿入ＤＮＡを含んでいるＤＮＡを含む一次転写物の選択的プロセシング によって産生されるβ₁サブユニットをコードするＤＮＡも提供される。配列番 号９に示す配列を有しており、配列番号９のヌクレオチド６１５−７８１に置換 して配列番号１２の挿入ＤＮＡを含み、以下のヌクレオチド配列：配列番号１２ のヌクレオチド１４−３４、配列番号１２のヌクレオチド１３−３４、配列番号 １２のヌクレオチド３５−５５、配列番号１２のヌクレオチド５６−１９０、配 列番号１２のヌクレオチド１９１−２７１、の１つ以上が欠失している転写物に よってコードされるβ₁サブユニットをコードするＤＮＡも提供される。特に、 後述するようなβ₁サブユニットスプライス変異体β_1-1−β_1-5(配列番号９、１ ０及び３３−３５参照)が提供される。 配列番号２６、２９及び３０の全部または一部分を含むβ₂サブユニットスプ ライス変異体β_2c−β_2eが提供される。配列番号１９及び２０に示す配列を有す るβ₃サブユニットスプライス変異体のようなβ₃サブユニットスプライス変異体 、配列番号２７に示す配列を有するＤＮＡを含むβ₄サブユニットをコードする ＤＮＡ、配列番号２８に 示すアミノ酸配列が提供される。 また、β₃をコードするＤＮＡを保有するプラスミドを内包する大腸菌(E.coli )宿主細胞は、ブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号６９０４８で寄託された。寄託された クローンは、配列番号１９のヌクレオチド１２２−４５７及び配列番号２０の１ ０７−４４３を包含する。 配列番号９に示すアミノ酸をコードするＤＮＡを含む転写物またはＡＴＣＣ受 託番号６９０４８で寄託されたβ₃をコードする一次転写物のような、βサブユ ニットをコードし且つ任意に選択的エキソンを含む一次転写物の選択的プロセシ ングによって産生されるβサブユニットをコードするＤＮＡは、本発明で提供さ れるかまたは本発明で提供されるＤＮＡから構築され得る。 ヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードするＤＮＡも提供される 。ＤＮＡの転写によって作製されたγサブユニットをコードするＲＮＡも提供さ れる。特に、配列番号１４で示すヌクレオチドの配列を含むＤＮＡが提供される 。 ヒトカルシウムチャンネルのα_1A、α_1D、α_1B、α_1C及 びα_1Eなどのスプライス変異体を含むα₁サブユニット、α₂サブユニット並びに β_1-1−β_1-5、β_2C、β_2D、β_2E、β_3-1及びβ₄などのβサブユニットをコード する全長ＤＮＡクローン及び対応するＲＮＡ転写物が提供される。また、対応す る全長サブユニットをコードする全長ＤＮＡクローンを調製するための、電圧依 存性ヒトカルシウムチャンネルのいくつかのα_1Cサブタイプのサブユニット及び γサブユニットの実質的部分をコードするＤＮＡクローンも提供される。本文中 に記載のように、開示されたＤＮＡをプローブとして用いると全長クローンが容 易に得られる。 本発明では、α_1Aサブユニット、α_1Cサブユニット、α_1Eサブユニット及びそ のスプライス変異体、β_2D、β_2C及びβ_2Eサブユニット並びにβ₄サブユニット 、これらのサブユニットをコードする核酸が特に重要である。 １つ以上のカルシウムチャンネルサブユニット、特にヒトカルシウムチャンネ ルサブユニットをコードする異種ＤＮＡを含むか、または、１つ以上のサブユニ ットをコードするＤＮＡクローンのＲＮＡ転写物を含む真核細胞が提供される。 単一のα₁サブユニットは１つのチャンネルを形成し得る。しかしながら、選択 された細胞中で活性の有る チャンネルを形成するために必要なサブユニットの組み合わせは、本文中に記載 の方法を用いて実験的に決定され得る。例えば、選択されたα₁サブタイプまた は変異体が選択された細胞系中で活性の有るチャンネルを形成しないならば、活 性の有るチャンネルが形成されるまで、１つまたは複数の追加のサブユニットを 付加し得る。 好適実施態様において、細胞は、ヒトα₁サブユニット、好ましくは少なくと も１つのα_1D、α_1B、α_1Aまたはα_1EサブユニットをコードするＤＮＡまたはＲ ＮＡを含む。より好ましい実施態様では、細胞が、少なくとも１つのβ、α₂ま たはγサブユニットのような追加の異種サブユニットをコードするＤＮＡまたは ＲＮＡを含む。このような実施態様においては、α₁、α₁＋β、α₁＋β＋α₂の いずれかをコードするＤＮＡのような１、２、３または４つのサブユニットをコ ードするＤＮＡクローンのいずれかの組み合わせによって安定にまたは一過的に トランスフェクトされた真核細胞が提供される。 本発明で提供される真核細胞は、α₁サブユニットをコードする異種ＤＮＡを 含むかまたはα₁サブユニットをコードする異種ＤＮＡとβサブユニットをコー ドする異種Ｄ ＮＡとを含む。少なくとも１つのサブユニットは、α_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、α_1E-1 、α_1E-3、β_2C、β_2D、β_2F、β_3-1、β_3-2サブユニットまたはβ₄サブユ ニットから選択される。好適実施態様では、細胞がこのような異種カルシウムチ ャンネルサブユニットを発現し、膜貫通型異種カルシウムチャンネル中に１つま たはそれ以上のサブユニットを含む。より好ましい実施態様では、真核細胞が、 生理的濃度で異種カルシウムチャンネルの活性を変調するカルシウムチャンネル 選択イオン及び／または結合化合物の通過を制御する機能性異種カルシウムチャ ンネルを発現させる。いくつかの実施態様では、異種カルシウムチャンネルが少 なくとも１つの異種カルシウムチャンネルサブユニットを含む。極めて好ましい 実施態様では、真核細胞の表面で発現されるカルシウムチャンネルが実質的にま たは完全に、異種ＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされたサブユニットから構 成される。好ましい実施態様において、このような細胞の異種カルシウムチャン ネルは宿主細胞のいかなる内因性カルシウムチャンネルからも識別される。この ような細胞は、カルシウムチャンネルの均質集団を得るための手段を提供する。 典型的には、細胞は、選択されたカルシ ウムチャンネルを、細胞によって発現される唯一の異種イオンチャンネルとして 含む。 いくつかの実施態様において、カルシウムチャンネルサブユニットをコードす る異種ＤＮＡを含む組換え真核細胞は、１つ以上のサブユニットをコードするＤ ＮＡのトランスフェクションによって産生されるか、または１つ以上のカルシウ ムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡのＲＮＡ転写物の注入によって産 生される。ＤＮＡは直鎖状ＤＮＡフラグメントとして導入されてもよく、または 、サブユニットをコードするＤＮＡを安定にまたは一過的に発現させるための発 現ベクター中に含まれてもよい。また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニット をコードするＤＮＡを保有するベクターも提供される。 異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞はカルシウムチャンネル機能ア ッセイで使用され得る。または、細胞が、機能性組換えヒトカルシウムチャンネ ルを構成するために必要な数よりも少数のサブユニットをコードする核酸で形質 転換された場合には、このような細胞は、カルシウムチャンネル活性に対する追 加サブユニットの効果を評価するために使用され得る。引き続いてこのような細 胞を ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする１つ以上のＤＮＡクローン またはＲＮＡ転写物でトランスフェクトすることによって追加サブユニットを提 供し得る。 膜貫通型異種カルシウムチャンネルを発現する組換え真核細胞は、カルシウム チャンネル活性を変調する化合物を同定する方法に使用され得る。特に、細胞は 、ヒトのカルシウムチャンネル活性のアゴニスト及びアンタゴニストを同定する アッセイ及び／またはカルシウムイオンの輸送及び輸送の調節に対する種々のカ ルシウムチャンネルサブユニットの寄与を評価するアッセイに使用される。細胞 は、カルシウムチャンネルの均質集団を構成するので、このような集団の各々に 特異的なカルシウムチャンネル活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定す る手段が提供される。 また、真核細胞を使用してカルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定 するアッセイが提供される。これらのアッセイを実施するときには、本発明で提 供されるＤＮＡによってコードされるサブユニットを少なくとも１つ含む異種カ ルシウムチャンネルを発現する真核細胞を、被検化合物とカルシウムチャンネル 選択イオンとを含有する溶 液中に導入し、細胞膜を脱分極させ、細胞に流入する電流を検出する。被検化合 物がカルシウムチャンネル活性を変調する化合物である場合、検出される電流は 、同じカルシウムチャンネル選択イオンが存在するが化合物の非存在下で同じま たは実質的に同じ細胞の脱分極によって生じる電流とは違っている。好適な実施 態様においては、脱分極ステップ前の細胞を、細胞に内在するカルシウムチャン ネルを実質的に不活化する静止電位に維持する。好適な実施態様においてはまた 、細胞は哺乳類細胞、極めて好ましくはＨＥＫ細胞または両生類卵母細胞である 。 α_1D、α_1C、α_1B、α_1A及びα_1E、α₂、β₁、β₂、β₃及びβ₄などのβスプ ライス変異体並びにγサブユニットをコードするＤＮＡの連続ヌクレオチドを、 少なくとも約１４、好ましくは１６、または所望の場合には２０もしくは３０以 上含み、検出のために典型的に標識された核酸プローブが提供される。これらの プローブを使用したカルシウムチャンネルサブユニットコーディングＤＮＡの単 離及びクローニング方法も提供される。これらのＤＮＡは組織内部のスプライス 変異体及び組織間の変異体を包含する。 精製されたヒトカルシウムチャンネルサブユニット及び 精製されたヒトカルシウムチャンネルが提供される。サブユニット及びチャンネ ルは、サブユニットをコードするＤＮＡをトランスフェクトした真核細胞から単 離され得る。 別の実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネル、ヒトカルシウムチャン ネルサブユニットまたはヒトカルシウムサブユニットのエピトープ含有フラグメ ントの実質的に純粋な調製物で免疫した動物の血清から得られる免疫グロブリン または抗体が提供される。ヒトカルシウムチャンネル、ヒトカルシウムチャンネ ルサブユニットまたはそのエピトープ含有フラグメントを免疫原として用いて産 生されたモノクローナル抗体も提供される。ヒトカルシウムチャンネルサブユニ ットのフラグメントを含む大腸菌融合タンパク質も免疫原として使用され得る。 このような融合タンパク質は、カルシウムチャンネルサブユニットペプチドに融 合した大腸菌ＴｒｐＥタンパク質のような細菌性タンパク質またはその一部分を 含み得る。カルシウムチャンネルサブユニットまたは精製カルシウムチャンネル を免疫原として用いて産生された免疫グロブリンは、他の特性のうちでも特に、 生物サンプル中またはかかる生物サンプルに由来の溶液中に存在し得るヒトカル シウムチャンネルまたは そのサブユニットに特異的及び優先的に結合するか及び／またはその免疫沈降を 惹起する能力を有している。このような抗体はまた、抗体の特異性の対象である サブユニットを含有するカルシウムチャンネルを発現する細胞を選択的に単離す るために使用され得る。 また、カルシウムチャンネルを有効量の上記抗体と接触させることによってイ オンチャンネルの活性を変調させる方法が提供される。 また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットに対するまたは組換えヒトカル シウムチャンネルもしくはそのサブユニットを発現する真核細胞に対するＬＥＳ 免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)の免疫反応性に基づいてヒトのランベール・イートン 症候群(Lambert Eaton Syndrome,ＬＥＳ)の存在を判定する診断方法が提供され る。特に、個人の血清またはそのＩｇＧ画分(被検血清)とα及びβサブユニット のようなカルシウムチャンネルタンパク質とを結合させ、被検血清中の抗体が、 罹患していないことが既知の個人または個人群から得られた対照血清中の抗体に 比べて、１種以上のサブユニットまたは１種以上のサブユニットを発現する組換 え細胞とより高度に反応することを確認することによっ て個人のランベール・イートン症候群を診断するイムノアッセイ方法が提供され る。この方法には、血清中の所与の抗原に対する抗体を検出するために当業界で 公知の任意のイムノアッセイ手順を使用し得る。発明の詳細な説明 定義 ： 他に定義されない限り、本文中で使用したすべての技術用語及び科学用語は、 本発明が所属する分野の当業者によって理解される慣用の意味と同義である。本 文中で引用したすべての特許及び刊行物は参照によって本発明に含まれるものと する。 言及されたカルシウムチャンネルサブユニットの各々は、本文中で詳細に開示 されるサブユニット、及び、開示されたＤＮＡをプローブとして用い少なくとも 低緊縮性下に適当なヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングす ることによって単離され得るＤＮＡによってコードされたヒトカルシウムチャン ネルサブユニットを包含する。かかるＤＮＡはまた、本文中に記載されたサブユ ニットタンパク質のいずれかに約４０％の相同性を有するタンパク質をコードす るＤＮＡ、または、少なくとも低緊縮性条件 下に本発明で提供されるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを包含し、かかるＤ ＮＡによってコードされているタンパク質は機能または分子量のような追加の識 別特性値を示す。 開示されたサブユニットまたは他のこのようなサブユニットのスプライス変異 体を示す転写物によってコードされるサブユニットは、任意の１つのサブユニッ トに対しては合計４０％未満の相同性を示すであろうが、１つ以上のサブユニッ トとの間でこのような相同領域を含むであろうことは理解されよう。また、４０ ％の相同性とは、約４０％またはそれよりもやや少ない程度のアミノ酸を共有し 且つ保存的なアミノ酸置換を含み、タンパク質の活性が実質的に変化していない タンパク質を意味する。 本文中では、種々の遺伝子によってコードされるα₁サブユニットのタイプは 、タイプα_1A、α_1B、α_1C、α_1D及びα_1Eとして示されている。これらのタイプ について、α_1BはＶＤＣＣIV、α_1CはＶＤＣＣII、α_1DはＶＤＣＣIIIとも呼ば れている。スプライス変異体であるサブユニットのサプタイプは例えば、α_1B-1 、α_1B-2、α_1C-1などと呼ばれる。 従って、本文中で使用された「α₁サブユニットをコードするＤＮＡ」とは、 少なくとも低緊縮性の条件下で本発明によって提供されるＤＮＡにハイブリダイ ズするＤＮＡを意味するか、または、ヒトカルシウムのα₁サブユニットをコー ドする本文中に開示されたＤＮＡによってコードされるタンパク質に少なくとも 約４０％の相同性を有するサブユニットをコードするＤＮＡを意味する。α₁サ ブユニットはカルシウムチャンネルを形成する能力によって同定され得る。典型 的には、α₁サブユニットは、少なくとも約１２０ｋＤよりも大きい分子量を有 している。また、推定されたα₁サブユニットアミノ酸配列のハイドロパシープ ロットは、α₁サブユニットが、６個の推定されたトランスメンブランドメイン を各々が含む４個の内部リピートを含むことを示す。 カルシウムチャンネルの活性は、電気生理学的方法及び本文中に記載の他の方 法のような当業者に公知の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価され得る。典型 的には、α₁サブユニットは、１,４−ＤＨＰまたはω−ＣｇＴｘのような１つ以 上のカルシウムチャンネル活性モジュレーターと直接または間接に相互作用する 領域を含む。α₁サブユニッ トの種々のタイプは、結合特異性に基づく方法のような当業者に公知の任意の方 法によって識別され得る。例えば、本文中では、α_1Bサブユニットは従来Ｎ−型 チャンネルと呼ばれていたチャンネルの形成に関与し、α_1Dサブユニットは従来 Ｌ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの形成に関与することが知見され、 α_1Aサブユニットは従来Ｐ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの典型的な 特徴を示すチャンネルの形成に関与すると考えられる。従って例えば、α_1Bサブ ユニットを含むチャンネルの活性は１,４−ＤＨＰに感受性でないが、α_1Dサブ ユニットを含むチャンネルの活性は１,４−ＤＨＰによって変調されるかまたは 変化する。現在では、薬理学的特徴及び電流カイネティクスに基づいてカルシウ ムチャンネルを命名し、過去の呼称を避けるのが好ましい。α₁サブユニットの タイプ及びサブタイプは、サブユニットまたはサブユニットを含むチャンネルに 対するこのようなモジュレーターの効果並びにサブユニットを含むカルシウムチ ャンネルによって生じる電流及び電流カイネティクスの差異に基づいて特性決定 し得る。 本文中で使用された「α₂サブユニット」は、低緊縮性 条件下で本発明で提供されるＤＮＡにハイブリダイズするかまたは本発明で開示 されたタンパク質に少なくとも約４０％の相同性を有するタンパク質をコードす るＤＮＡによってコードされている。このようなＤＮＡは、典型的には約１２０ ｋＤよりも大きい分子量を有するがα₁サブユニットの非存在下にカルシウムチ ャンネルを形成しないタンパク質をコードしており、α₁サブユニットを含むカ ルシウムチャンネルの活性を変化させ得る。スプライス変異体として生じるα₂ サブユニットのサブタイプは、α_2a、...α_2eのような下付き文字で示される。 更に、α₂サブユニット及びタンパク質を還元条件下で処理したときに産生され る大フラグメントは、少なくともＮ−結合した糖によってグリコシル化されると 考えられ、α₁サブユニットに特異的に結合する１,４−ＤＨＰ及びフェニルアル キルアミンに特異的に結合しない。より小さいフラグメント、Ｃ−末端フラグメ ントは、δサブユニットと呼ばれており、約９４６(配列番号１１)からほぼＣ− 末端までのアミノ酸を含む。このフラグメントは、α₂サブユニットを還元性条 件に暴露したときにα₂の残りの部分から解離し得る。 本文中で使用された「βサブユニット」は、低緊縮性条 件下で本発明で提供されるＤＮＡにハイブリダイズするかまたは本発明で開示さ れたタンパク質に少なくとも約４０％の相同性を有するタンパク質をコードする ＤＮＡによってコードされており、これは、典型的にはαサブユニットよりも小 さい約５０〜８０ｋＤのオーダーの分子量を有しており、α₁サブユニットの非 存在下に検出可能なカルシウムチャンネルを形成しないが、α₁サブユニットま たはα₁及びα₂サブユニットを含むカルシウムチャンネルの活性を変化させ得る タンパク質である。 種々の遺伝子によってコードされているβサブユニットの種々のタイプはβ₁ 、β₂、β₃及びβ₄のような下付き文字で示される。特定タイプのスプライス変 異体として生じるβサブユニットのサブタイプは、タイプ及び変異体に関する下 付き数字で示される。β₁スプライス変異体に関するこのようなサブタイプの例 としてはこれに限定されないが、β_1-1−β_1-5があり、β₂変異体に関するこの ようなサブタイプの例としてはこれに限定されないが、β_2c−β_2Eがある。 本文中で使用された「γサブユニット」は、γサブユニットをコードするＤＮ Ａとして本文中で開示されたＤＮＡに よってコードされるサブユニットであり、本文中でプローブとして開示されたＤ ＮＡを使用し、ハイブリダイゼーションまたは当業者に公知の他の同様の方法に よって単離及び同定され得る。従って、γサブユニットをコードしている全長ク ローンを単離または構築し得る。γサブユニットは低緊縮性条件下で本発明で提 供されたＤＮＡにハイブリダイズするかまたは本文中に記載されたγサブユニッ トに少なくとも約４０％の相同性を有するタンパク質をコードすべく十分な配列 相同性を示すＤＮＡによってコードされるであろう。 従って、当業者は、本発明の開示に基づいて、スプライス変異体を示す種々の 遺伝子及びサブタイプによってコードされているタイプを含むカルシウムチャン ネルのα₁、α₂、β、δ及びγサブユニットをコードするＤＮＡを同定し得る。 例えば、本発明で開示されたＤＮＡに基づくＤＮＡプローブは、プローブに対す るハイブリダイゼーションに基づいてゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーのよ うな適当なライブラリーをスクリーニングし、全タンパク質をコードする読み取 りフラグメントを含む１つ以上のクローン中のＤＮＡを取得するために使用され 得る。本発明に 開示されたＤＮＡで適当なライブラリーをスクリーニングした後で、単離ＤＮＡ について、コードされたタンパク質の配列を与えたと推定される読み取り枠の存 在を試験する。分子量の決定及び本発明の配列との比較によってサブユニットを α₁、α₂などのサブユニットとして同定し得る。必要な場合には、機能性アッセ イを使用してサブユニットがα₁、α₂サブユニットであるかβサブユニットであ るかを判断してもよい。 例えば、α_1AサブユニットをコードするＤＮＡは、ヒトα_1Aサブユニットの全 部または一部をコードするＤＮＡによって適当なライブラリーをスクリーニング することによって単離され得る。このようなＤＮＡとしては、ＡＴＣＣ受託番号 ７５２９３で寄託されたファージ中のα₁サブユニットの一部分をコードしてい るＤＮＡがある。α_1AサブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号２１、２２ 及び／または２３に示す配列の全部もしくは一部分を有するオリゴヌクレオチド または寄託ファージ中のＤＮＡによって適当なライブラリーをスクリーニングす ることによって得られる。または、このようなＤＮＡが、配列番号２２または２ ３によってコードされているα_1Aサブユニットをコードする配 列を有していてもよい。 同様に、β₃をコードするＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号６９０４８で寄託され たプラスミドβ１.４２から調製されたＤＮＡプローブによってヒトｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングすることによって単離されることができ、または、 配列番号１９及び／または２０に示された配列に従って調製された配列を有する プローブを用いて適当なライブラリーから得ることができる。更に、β₄をコー ドするＤＮＡは、β₄サブユニットをコードするクローンのＤＮＡ配列を示す配 列番号２７に示すＤＮＡに従って調製されたＤＮＡプローブによってヒトｃＤＮ Ａライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。そのアミノ酸 配列を配列番号２８に示す。ＤＮＡの単離及び同定並びに全長ゲノムまたはｃＤ ＮＡクローンの調製のためには本文中に例示した方法を含む当業者に公知の任意 の方法を使用し得る。ＤＮＡコーディング 単離したＤＮＡによってコードされるサブユニットは、本発明で提供されるサ ブユニットのＤＮＡ及びアミノ酸の配列比較によって同定され得る。スプライス 変異体は広い 相同領域を共有しているが、非相同領域も含み、種々の遺伝子によってコードさ れたサブユニットが非相同配列の均一分布を共有している。 本文中で使用された「スプライス変異体」とは、２タイプ以上のｍＲＮＡを与 えるゲノムＤＮＡの一次転写物の異なるプロセシングによって産生される変異体 を意味する。スプライス変異体は、１つの組織内部または複数の組織で発生し得 る(組織特異的変異体)。従って、等しいアミノ酸の領域及び異なるアミノ酸配列 の領域を有するカルシウムチャンネルサブユニットのサブタイプをコードするｃ ＤＮＡクローンを本文中で「スプライス変異体」と呼ぶ。 本文中で使用された「カルシウムチャンネル選択イオン」とは、細胞膜を貫通 するカルシウムチャンネルに対して、Ｃａ²⁺の流れが許容または阻害されるとき と実質的に同様の条件下でその流れが許容または阻害されるイオンを意味する。 Ｂａ²⁺はカルシウムチャンネル選択イオンの一例である。 本文中で使用された「カルシウムチャンネル活性を変調する化合物」とは、カ ルシウムチャンネル選択イオンを通過させるカルシウムチャンネルの能力に影響 を与えるか、 または、電流カイネティクスような他の検出可能なカルシウムチャンネルの特徴 に影響を与える化合物を意味する。このような化合物としては、カルシウムチャ ンネルアンタゴニスト及びアゴニスト並びにカルシウムチャンネルの活性に直接 及び間接に影響を与える化合物がある。 本文中で使用された「実質的に純粋な」サブユニットまたはタンパク質とは、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質に出現するようにまたは明確に配列決定されるように他 の夾雑ポリペプチドが十分に除かれたサブユニットまたはタンパク質を意味する 。 本文中で使用された「選択的にハイブリダイズする」とは、ＤＮＡフラグメン トが、複数のフラグメントから第２のフラグメントを同定または単離し得るよう に、第２のフラグメントに対して十分な特異性でハイブリダイズすることを意味 する。一般に、選択的ハイブリダイゼーションは高緊縮性条件下で生じる。 本文中では、異種または外来ＤＮＡ及びＲＮＡなる用語は互換的に使用されて おり、それらを存在させるゲノムの一部として天然に存在するものでないＤＮＡ もしくはＲＮＡまたは天然に存在する場所とは異なるゲノム内の１つま たは複数の場所に見出されるＤＮＡもしくはＲＮＡを意味する。これは、細胞に 内因性でなく、細胞内に人為的に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡである。異種Ｄ ＮＡの例としては以下に限定されないが、カルシウムチャンネルサブユニットを コードするＤＮＡ、転写、翻訳または他の調節可能な生化学プロセスに影響を与 えることによって内因性ＤＮＡの発現を媒介または変化させるＲＮＡまたはタン パク質をコードするＤＮＡがある。カルシウムチャンネルサブユニットをコード するＤＮＡのような異種ＤＮＡを発現する細胞は、同じまたは異なるカルシウム チャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含み得る。異種ＤＮＡは発現され る必要はなく、宿主細胞ゲノムに取り込まれるかまたはエピソーム的に維持され るように導入されてもよい。 本文中で使用された「プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳の終止部位 並びに他のシグナル配列のような調節ヌクレオチド配列及びエフェクターヌクレ オチド配列に対する異種ＤＮＡの機能し得る結合」とは、このようなＤＮＡとこ のようなヌクレオチド配列との間の機能的関係を意味する。例えば、プロモータ ーに対する異種ＤＮＡの機能し得る結合とは、ＤＮＡを特異的に認識し結合し読 み取 り枠に転写するＲＮＡポリメラーゼによってこのようなＤＮＡの転写がプロモー ターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターとの物理的及び機能的関係を意 味する。 本文中で使用された「実質的に純粋な単離ＤＮＡ」とは、当業者によって使用 される標準技術に従って精製されたＤＮＡフラグメントを意味する〔例えばＭａ ｎｉａｔｉｓら(１９８２)Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,ＮＹ参照〕。 本文中で使用された「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポ リペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。核酸がゲノムＤ ＮＡに由来する場合、適正な真核宿主細胞または生物が選択されるならば発現は ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。 本文中で使用された「ベクターまたはプラスミド」とは、異種ＤＮＡを発現さ せるかまたはクローン化異種ＤＮＡを複製させるために細胞内に異種ＤＮＡを導 入するために使用される個別要素(discrete elements)を意味する。このような ベクター及びプラスミドの選択及び使用は当業者の 標準的な知識の範囲内である。 本文中で使用された「発現ベクター」とは、このようなＤＮＡフラグメントの 発現を惹起し得るプロモーター領域のような調節配列と機能し得るように結合し ているＤＮＡフラグメントを発現し得るベクターを包含する。従って、発現ベク ターは、適当な宿主細胞に導入された時クローンＤＮＡを発現するプラスミド、 ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような、組換えＤＮＡまたはＲ ＮＡ構築物を意味する。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及 び／または原核細胞中で複製可能なベクター、並びにエピソームとして維持され るかもしくは宿主細胞ゲノムに取り込まれ得るベクターがある。 本文中で使用された「プロモーター領域」とは、機能し得るように結合したＤ ＮＡの転写を調節する遺伝子のＤＮＡ部分を意味する。プロモーター領域は、Ｒ ＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始に十分なＤＮＡの特異的配列を含む 。プロモーター領域のこの部分をプロモーターと呼ぶ。更に、プロモーター領域 は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列を含む。 これらの配列は、シス作用因子でもよくまたはトランス作用因 子に反応性でもよい。調節の性質次第でプロモーターは構成的または調節的であ る。 本文中で使用された「組換え真核細胞」とは異種ＤＮＡまたはＲＮＡを含む真 核細胞を意味する。 本文中で使用された「組換えまたは異種カルシウムチャンネル」とは、組換え カルシウムチャンネルを発現する真核細胞に導入され該真核細胞中で発現する異 種ＤＮＡによってコードされた１つ以上のサブユニットを含むカルシウムチャン ネルを意味する。組換えカルシウムチャンネルはまた、細胞に内在するＤＮＡに よって産生されるサブユニットも包含する。いくつかの実施態様において、組換 えまたは異種カルシウムチャンネルは、異種ＤＮＡによってコードされたサブユ ニットだけを含んでいてもよい。 組換えまたは異種カルシウムチャンネルに関して本文中で使用された「機能性 」なる用語は、チャンネルが、Ｃａ²⁺またはＢａ²⁺に限らないがＣａ²⁺またはＢ ａ²⁺などのカルシウムチャンネル選択イオンを刺激に反応して流入させるかまた は流入を調節するか及び／またはチャンネル親和性リガンドを結合させる能力を 有することを意味する。好ましいことにはこのようなカルシウムチャンネル活性 は、 電気生理学的、薬理学的及び当業者に公知の他の手段によって宿主細胞中の内因 性カルシウムチャンネル活性から識別可能である。 本文中で使用された「実質的に特定の配列番号で示されたアミノ酸配列を有す るペプチド」とは、同じ機能を有するが僅かな配列変異、例えばペプチドの活性 を変化させない保存性アミノ酸変異または小さい欠失もしくは挿入を含み得るペ プチドを意味する。カルシウムチャンネルレセプターサブユニットペプチドの活 性とは、他のこのようなサブユニットと共に機能性カルシウムチャンネルを形成 する能力を意味する。 本文中で使用された「化合物の生理的濃度」とは、生物プロセスを惹起するた めに必要且つ十分な濃度を意味する。例えば、カルシウムチャンネル選択イオン の生理的濃度は、チャンネルが開いたときに内向きの電流を与えるために必要且 つ十分なカルシウムチャンネル選択イオンの濃度である。 本文中で使用された「カルシウムチャンネルの活性」とは、カルシウムチャン ネルを通るカルシウムチャンネル選択イオンの移動を意味する。このような活性 は当業者に公 知の任意の方法によって測定されることができ、例としては、刺激に反応して組 換えチャンネルを流れる電流の量を測定する方法があるがこれに限定されない。 本文中で使用された「機能性アッセイ」なる用語は、機能性カルシウムチャン ネルを同定するアッセイを意味する。従って、機能性アッセイは機能を評価する アッセイである。 当業者に理解されるであろうが、カルシウムチャンネル活性を変調するアンタ ゴニスト及びアゴニストのような化合物を同定するアッセイ方法では一般に、対 照との比較が必要である。「対照」細胞または「対照」培養物の１つのタイプは 、対照培養物を被検化合物に接触させない以外は被検化合物に接触した細胞また は培養物と実質的に同様に処理した細胞または培養物である。別のタイプの「対 照」細胞または「対照」培養物は、対照培養物に使用した細胞が機能性カルシウ ムチャンネルを発現しない以外はトランスフェクト細胞に等しい細胞または細胞 培養物から成る。この場合には、アッセイの目的となる化合物の存在下で各タイ プの細胞または細胞培養物を実質的に同じ反応条件に維持し、このときの被検化 合物に対する被検細胞の反応と、被検化合物に対するカルシウムチャンネル陰性 細胞の反応 (または反応の欠如)とを比較する。例えば、パッチ固定(patch clamp)電気生理 学的手順を用いる方法では、細胞を浸漬させる外部溶液を当業界で公知のように 交換することによって被検化合物の存在下及び非存在下で同じ細胞を試験し得る 。 また、本文中に開示されたサブユニットの各々は保存性アミノ酸置換を行うこ とによって修飾され、得られた修飾サブユニットも本発明の目的であることが理 解されよう。適当な保存性アミノ酸置換は当業界で公知であり、通常は得られる 分子の生物学的活性を変化させることなく行われるであろう。ポリペプチドの非 必須領域の単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことは当 業者の一般認識である(例えば、Ｗａｔｓｏｎら,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ,４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ,１９８７,Ｔｈｅ Ｂｅｊ ａｃｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ.ｃｏ.,ｐ.２２４参照)。このような置換 は好ましくは以下の表１に示す置換に従って行われるが、これらに限定はされな い。 他の置換も可能であり、実験的にまたは既知の保存性置換に従って決定され得 る。ポリペプチドのこのような修飾はいずれも、当業者に公知の任意の手段によ って得られる。突然変異は、当業者に公知の任意の方法、例えばタンパク質をコ ードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発即ち特定部位の突然変異誘発及びＤＮ Ａ鋳型に変異を導入し増幅するためのプライマーを用いるＤＮＡ増幅方法の使用 などを包含する。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 ヒトカルシウムチャンネルのα₁、α₂、β及びγサブユニットをコードするＤ ＮＡの同定及び単離方法が提供される。 かかるＤＮＡの同定及び単離は、所望のサブユニットをコードするＤＮＡが単 離される少なくとも低緊縮性の適当な条件下で、制限酵素消化したヒトＤＮＡと 、本文中に配列識別番号で示したヌクレオチド配列を有するＤＮＡの任意の連続 部分に由来する少なくとも１４、好ましくは１６またはそれ以上のヌクレオチド を有する標識プローブとをハイブリダイズさせることによって行う。ハイブリダ イゼーション反応でハイブリダイズするフラグメントを同定し、当業者に公知の 標準クローニング技術を用いてクローニングし得る。完全読み取り枠の存在によ って全長クローンを同定し、コードされたタンパク質の同一性を、本発明で提供 されたサブユニットとの配列比較及びカルシウムチャンネル形成能力または他の 機能を評価する機能性アッセイによって確認する。この方法は、サブユニットを コードするゲノムＤＮＡを同定するため、またはゲノムサブユニット ＤＮＡの一次転写物の選択的スプライシングによって生じたヒトカルシウムチャ ンネルサブユニットのスプライス変異体をコードするｃＤＮＡを同定するために 使用され得る。例えば、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡ 、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション によって同定され、制限マッピング、ＤＮＡ配列決定のような当業者に公知の方 法によって特性決定され、ＤＮＡの配列中の異質性(heterogeneity)または異形 性(divergence)を識別するために本発明で提供されたＤＮＡと比較される。この ような配列の差異は、ｃＤＮＡの産生の出発材料となる転写物が、非相同領域及 び相同領域がクラスターである場合には一次転写物の選択的スプライシングに由 来し、非相同領域がクローン化したＤＮＡ全体に分布している場合には別の遺伝 子に由来することを示す。 本発明で提供されたＤＮＡを用いて遺伝子を単離するために、適当な任意の方 法を使用し得る。例えば、配列差異の領域に対応するオリゴヌクレオチドは、全 長スプライス変異体をコードするＤＮＡをハイブリダイゼーションによって単離 するために使用されているが、ゲノムクローンを単 離するために使用することができる。組織特異的エキソンのようなヒトカルシウ ムチャンネルの１つのサブユニットの少なくとも一部分をコードする、本発明で 開示されたヌクレオチド配列に基づくプローブは、近縁ＤＮＡをクローニングす るため、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする全長ｃＤＮＡまた はゲノムクローンをクローニングするために、プローブとして使用され得る。 ヒトカルシウムチャンネルサブユニットの少なくとも一部分をコードする核酸 の少なくとも１４の実質的に連続の塩基、好ましくは１６以上、通常は少なくと も３０の連続塩基から成る標識されたＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡが提供される。 標識の例としては放射性標識または酵素標識などがあるがそれに限定されない。 該核酸の配列は本明細書で配列番号を付けて示した核酸配列のセグメントに対応 する。このような核酸セグメントは、カルシウムチャンネルサブユニットをコー ドするＤＮＡをクローニングするために本発明で提供される方法においてプロー ブとして使用され得る。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(１９８９)Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照。 更に、当業界で公知の核酸増幅技術を用い、異なる配列プライマーを包囲する ＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用してヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮ Ａを増幅することによって、カルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変 異体の所在を検出し得る。増幅産物の大きさ及び配列の決定によってスプライス 変異体を確認し得る。更に、ハイブリダイゼーションによるヒトゲノムＤＮＡ配 列の単離は、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする転写物の種々 のスプライス変異体に対応する多数のエキソンを介在イントロンと共に含むＤＮ Ａを与える。 電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルのα₁、α₂、β及びγサブユニットの各 々のタイプ及びサブタイプをコードするＤＮＡは、本発明では、選択された組織 に由来のｃＤＮＡの核酸増幅によって、または、かかるカルシウムチャンネルを 有するヒト由来の細胞系または組織の単離ポリＡ⁺ｍＲＮＡから調製されたヒト ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、クローニングされ得る。ｍＲ ＮＡを得るためのかかる細胞または組織のソースとしては、ヒ ト脳組織、または、神経芽腫細胞系のようなヒト神経起原の細胞系、ヒト骨格筋 もしくは平滑筋細胞などがある。ｃＤＮＡライブラリーの調製方法は当業界で公 知である〔全般的にはＡｕｓｕｂｅｌら(１９８７)Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓ ｃｉｅｎｃｅ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓら(１９８６)Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ.,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照〕。 プローブ構築の出発点となる好ましい領域としては、５’及び／または３’コ ーディング配列、トランスメンブランドメインをコードすると予測される配列、 細胞質ループをコードすると予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位 、及び、他の機能的に有意な配列(後出の表参照)などがある。全長サブユニット をコードするＤＮＡまたはそのフラグメントを、好ましくは検出を容易にする適 当なラベル手段によって標識してプローブとして使用し得る。フラグメントをプ ローブとして使用するとき、ＤＮＡ配列が典型的にはカルボキシル末端をコード するＤＮＡ部分に由 来するのが好ましく、推定アミノ酸配列のハイドロパシー分析に基づいて予測さ れたトランスメンブランドメインをコードする部分を含むのが極めて好ましい〔 例えば、Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ(１９８２)Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏ１.１６ ７ ：１０５参照〕。 ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのタイプまたはサブタイプに特異的な リボプローブを調製した。これらのプローブは選択された組織及び細胞中の特定 サブユニットの発現を同定するために有用である。プローブ調製の出発点となっ た領域を、すべての既知のαまたはβサブユニットのサブタイプのＤＮＡ及びア ミノ酸の配列と比較することによって同定した。相同の最も少ない領域、好まし くはヒト由来の配列、一般的にほぼ約２５０〜約６００ヌクレオチドを選択した 。α及びβサブユニットの多数のリボプローブを調製した。これらのいくつかを 以下の表にまとめる。 上記ヌクレオチド領域はまた、後述するように、サブユニット特異的抗体調製 用タンパク質の領域を選択するためにも有用である。 従って、本発明で提供されるＤＮＡクローン及びそのフラグメントは、各サブ ユニットをコードするゲノムクローンを単離するため、及び、種々のヒト組織か ら調製されたライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによってス プライス変異体を単離するために使用され得る。当業界で公知の核酸増幅技術は また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体をコードする ＤＮＡを検出するために使用され得る。これは、（１つまたは複数の）異なる配 列を包囲するＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドをヒトＲＮＡまたはゲノム ＤＮＡを増幅するためのプライマーとして使用することによって達成される。増 幅産物の大きさ及び配列の決定によって、スプライス変異体の存在が確認され得 る。更に、ハイブリダイゼーションによってヒトゲノムＤＮＡを単離すると、ヒ トカルシウムチャンネルサブユニットをコードする転写物の種々のスプライス変 異体に対応する多数のエキソンを介在イントロンと共に含むＤＮＡが得られる。 カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを単離した後、特定の カルシウムチャンネルサブユニットまたは変異体をコードするｍＲＮＡをどの組 織が発現したかを決定するためにリボヌクレアーゼ(ＲＮアーゼ)保護アッセイを 使用し得る。これらのアッセイは、全細胞性ＲＮＡの複合混合物中でＲＮＡ種を 検出及び定量するための高感度の手段を提供する。サブユニットＤＮＡを標識し 、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズさせる。細胞性ＲＮＡ中に相補性ｍＲＮＡが存 在するときは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが生じる。次に、ＲＮＡサンプルを ＲＮアーゼで処理すると、一本鎖ＲＮＡが分解される。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリ ッドはＲＮアーゼ分解から保護されており、ゲル電気泳動及びオートラジオグラ フィーによって可視化され得る。また、特定のカルシウムチャンネルサブユニッ トをコードするｍＲＮＡをどの組織が発現したかを決定するために、ｉｎ ｓｉ ｔｕハイブリダイゼーション技術も使用され得る。サブユニットｍＲＮＡ発現を 可視化するために標識サブユニットＤＮＡを種々の組織切片にハイブリダイズさ せる。 ヒトカルシウムチャンネルのサブユニット(α₁、α₂、 βまたはγ)の各々に関して、チャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを核 酸スクリーニング方法によって同定し、単離されたクローンを使用して、オーバ ーラップするクローンを同定するために更にスクリーニングした。クローニング されたＤＮＡフラグメントのいくつかは、ｐＩＢ１２４／２５(ＩＢＩ,Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ,ＣＴ)、Ｍ１３ｍｐ１８／１９、ｐＧＥＭ４、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ ７Ｚ、ｐＳＰ７２及び当業界で公知の他のこのようなベクターにサブクローニン グでき、ＤＮＡ配列決定及び制限酵素マッピングによって特性決定した。従って 逐次シリーズのオーバーラップクローンを、各サブユニットに関する全長クロー ンが調製されるまで、翻訳開始(start)コドン及び翻訳終止(stop)コドンの同定 を含む当業界で公知の方法で作製し得る。クローン化したＤＮＡを発現させるた めに、このようなクローンの５’非コーディング領域並びに他の転写及び翻訳調 節領域を、有効なリポソーム結合部位及び当業界で公知の他の調製領域によって 置換し得る。翻訳及び／または転写効率を最適にするために必要な当業界で公知 の他の５'端修飾を必要に応じて行ってもよい。 後出の実施例II〜VIIIは、ヒトカルシウムチャンネルの種 々のサブユニット、サブタイプ及び組織特異的変異体のようなスプライス変異体 の各々のクローニングを詳細に記載している。サブユニットの部分配列が開示さ れた少数の例においては、本文中の教示に基づいて、対応する全長クローン及び そのサブユニット、サブタイプまたはそのスプライス変異体をコードする配列を 得ることは、上記に記載し後記に例示する方法を用いて当業者が容易に成し得る ことである。α₁サブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 ヒトＣＮＳ及び他の組織中で発現される多数の電圧依存性カルシウムチャンネ ルα₁サブユニット遺伝子を同定し、α_1A、α_1B(またはＶＤＣＣIV)、α_1C(また はＶＤＣＣII)、α_1D(またはＶＤＣＣIII)及びα_1Eと命名した。サブユニットの 各タイプをコードするヒト神経ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡを単 離した。スプライス変異体として生じるタイプの各々のサブタイプをコードする ＤＮＡも提供される。本文中ではサブタイプを例えばα_1B-1、α_1B-2などとして 示す。 電圧依存性カルシウムチャンネルのα₁サブユニットのタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 及びＥ、並びに、そのサブタイプは、 ＤＨＰ、フェニルアルキルアミン、オメガコノトキシン(ω−ＣｇＴｘ)、クモ毒 (funnel web spider toxin)ω−Ａｇａ−IV及びピラゾノイルグアニジンのよう な既知のカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストのクラスに対して 異なる感受性を示す。これらのサブユニットタイプはまた、静止電位が違ってお り、且つ、α₁サブユニットの種々のタイプを包含するカルシウムチャンネルを 含む細胞膜の脱分極のときに発生する電流のカイネティクスも違っていると考え られる。 ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ω−ＣｇＴｘ、クモ毒成分、ピ ラゾノイルグアニジンなどから選択された少なくとも１つの化合物に結合するα₁ サブユニットをコードするＤＮＡが提供される。例えば、本発明で提供される α_1Bサブユニットは、Ｎ−型チャンネル内でω−ＣｇＴｘと特異的に相互作用す ると考えられ、本発明で提供されるα_1DサブユニットはＬ−型チャンネル内でＤ ＨＰと特異的に相互作用する。ヒトカルシウムチャンネルα_1DサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₁サブユニットｃ ＤＮＡのフラグメントをヒト神経芽腫細胞系ＩＭＲ３２のｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングするためのプローブとして用い、α_1DサブユニットｃＤＮＡを 単離し、クローンα１.３６を作製した。このクローンをプローブとして用いて 追加のＩＭＲ３２細胞ｃＮＤＡライブラリーをスクリーニングして、オーバーラ ップするクローンを作製し、このクローンを用いてスクリーニングして次のクロ ーンを作製するという手順を、ヒトα_1Dサブユニットをコードするヌクレオチド 配列の全長に及ぶ十分なシリーズのクローンが得られるまで継続した。実施例II に記載のように部分的α_1Dクローンの断片を結合することによってα_1Dをコード する全長クローンを構築した。配列番号１はα_1DサブユニットをコードするｃＤ ＮＡの７,６３５ヌクレオチドの配列を示す。２,１６１アミノ酸の配列をコード する６,４８３ヌクレオチドの配列の読み取り枠が存在する(配列番号１に示す) 。 配列番号２はα_1DサブユニットのＩＳ６トランスメンブランドメインをコード する選択的エキソンの配列を与える〔トランスメンブランドメインなる用語の記 載に関してはＴａｎａｂｅ,Ｔ.ら(１９８７)Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３ １３−３１８参照〕。 配列番号１はまた、ヒト神経細胞カルシウムチャンネルα_1Dサブユニットから 推定された２,１６１アミノ酸の配列を示す。アミノ酸配列に基づいて、α_1Dタ ンパク質は計算分子量２４５,１６３を有している。カルシウムチャンネルのα_{1 D} サブユニットは推定された４つの内部反復配列領域を含む。４つの内部反復領 域は、２４の推定トランスメンブランセグメントを示し、アミノ−及びカルボキ シル−末端が細胞内に伸びている。 α_1Dサブユニットが、ＤＨＰ−感受性の、高電圧活性化される、長期持続カル シウムチャンネル活性を媒介することが判明した。このカルシウムチャンネル活 性は、α_1D及びβ_1-2サブユニットをコードするＲＮＡ転写物、またはα_1D、α_{2 b} 及びβ_1-2サブユニットをコードするＲＮＡ転写物を同時注入した卵母細胞で検 出された。この活性は、β_1-2±α_2bサブユニットをコードするＲＮＡ転写物を 卵母細胞に注入したときに検出されるＢａ²⁺電流とは違っていた。これらの電流 は、非注入卵母細胞で報告されたＣａ²⁺電流に薬理学的及び生物物理学的に類似 していた。ヒトカルシウムチャンネルα_1Aサブユニットをコードする ＤＮＡの同定及び単離 α_1Aサブユニットの一部分をコードするＤＮＡを含有する生物材料は、特許手 続き目的の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びこの条約に基づい て発布された条例の規約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ,１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ,Ｒｏｃｋｖ ｉｌｅ,Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２ Ｕ.Ｓ.Ａ.に寄託されている。寄託材料の サンプルは現在及び今後、上記の条約及び条例に基づいて、並びに、アメリカ合 衆国の特許法及び条例あるいは本願もしくは本願を優先権主張する出願が出願さ れたかまたはかかる出願に対して許諾されるいかなる特許も許諾される他のすべ ての国家または国際機関の特許法及び条例に基づいて、特許事務所及び他の法的 有資格者に入手可能であろう。 α_1Aサブユニットの一部分は、宿主大腸菌ＮＭ５１４株中のα１.２５４と命 名されたλｇｔ１０ファージ中の約３ｋｂのインサートによってコードされてい る。この材料のファージ溶菌液は、上記のようにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ ｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｃｅｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号７５２９３で寄託され ている。α_1Aをコードする ＤＮＡはまた、配列番号２１： を有するＤＮＡから調製されたプローブでスクリーニングすることによって同定 され得る。 α_1Aスプライス変異体も作製した。２つのα_1Aスプライス変異体、α_1a-1及び α_1a-aの配列を配列番号２２及び２３に示す。上記のごときヒトライブラリーの スクリーニングまたは配列番号２２及び２３に示した配列の全部または一部分を 用いることによって他のスクリーニング変異体を得ることができる。ヒトカルシウムチャンネルα_1BサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₁サブユニットをコードするｃＤＮＡの フラグメントでヒト脳幹神経節ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること によってα_1BサブユニットをコードするＤＮＡを単離した。１つの陽性クローン の一部分を使用してＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした 。脳幹神経節ＤＮＡプローブにハイブリダイズしたクローンを使用してＩＭＲ３ ２細胞ｃＤＮＡライブラリーを更にスクリーニングして、オー バーラップするクローンを同定し、このクローンを使用してヒト海馬ｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングした。このようにして、ヒトα_1Bサブユニットをコ ードするヌクレオチド配列のほぼ全長に及ぶ十分なシリーズのクローンを作製し た。ＩＭＲ３２細胞のα_1B ｍＲＮＡの特定領域の核酸増幅によって、α_1Bをコ ードする配列の追加のセグメントが得られた。 実施例II.Ｃに記載の部分的ｃＤＮＡクローンの断片を結合することによって 全長α_1B ＤＮＡクローンを構築した。配列番号７及び８は、α_1Bサブユニット をコードするＤＮＡクローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。 配列番号７によってコードされたα_1Bサブユニットをα_1B-1サブユニットと呼ぶ が、これは、α_1Bサブユニット転写物の選択的スプライシングによって得られた 配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされた別のα_1Bサブユニット即ち α_1B-2と区別するためである。 α_1B-1をコードするＤＮＡ内部のヌクレオチド配列に従って設計されたオリゴ ヌクレオチドプライマーを用いたＩＭＲ３２細胞ｍＲＮＡの核酸増幅によって、 異なるコーディング配列を含むのでスプライス変異体であると考えられる α_1B転写物の変異体を同定した。ヒトカルシウムチャンネルのα_1CサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単 離 多数のα_1C特異的ＤＮＡクローンを単離した。配列のキャラクタリゼーション によって、α_1Cコーディング配列、α_1C翻訳開始配列及びα_1Cの選択的スプライ ス領域が判明した。α_1Cサブユニットの選択的スプライス変異体が同定された。 配列番号３はα_1Cサブユニットの実質的な部分をコードするＤＮＡを示す。配列 番号４及び配列番号５に示すＤＮＡ配列は、α_1Cタンパク質の可能な２つのアミ ノ末端をコードする。配列番号６はIVＳ３トランスメンブランドメインの選択的 エキソンをコードする。α_1C-1及びα_1C-2と命名された２つのα_1Cスプライス変 異体の実質的な部分の配列を夫々、配列番号３及び３６に示す。 α_1Cサブユニットの部分をコードするＤＮＡクローンの単離及び同定を実施例 IIに詳細に記載する。ヒトカルシウムチャンネルのα_1EサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単 離 オリゴｄＴ−プライムしたヒト海馬ライブラリーからヒトカルシウムチャンネ ルα_1EサブユニットをコードするＤ ＮＡを単離した。得られたクローンはスプライス変異体であり、これをα_1E-1及 びα_1E-3と命名した。α_1E-1と命名されたサブユニットは、配列番号２４に示す アミノ酸配列を有し、α_1E-3と命名されたサブユニットは、配列番号２５に示す アミノ酸配列を有している。双方のスプライス変異体の違いは、配列番号２４の ヌクレオチド２４０５と２４０６との間の５７塩基対のインサートに基づく。 本文中で示したα_1Eサブユニットは、高電圧活性化カルシウムチャンネル及び 低電圧活性化チャンネルの特性を有するカルシウムチャンネルの形成に関与する と考えられる。これらのチャンネルは他の高電圧活性化カルシウムチャンネルに 比較して迅速に不活性化される。更にこれらのチャンネルは、電圧活性化チャン ネルに類似しているが、ある種の高電圧活性化チャンネルを遮断するＤＨＰ及び ω−Ａｇａ−ＩＶＡに感受性である薬理学的プロフィルを示す。α_1Eサブユニッ トを含むチャンネルの電気生理学及び薬理学に関しては実施例VIIのＦに更に詳 細に記載する。追加のヒトカルシウムチャンネルα₁サブユニットのタイプ及びサブタイプをコ ードするＤＮＡの同定及び単離 追加のα₁サブユニットをコードするＤＮＡをα_1A、α_{1 B} 、α_1C、α_1D及びα_1Eサブユニットに関して本発明で提供されたＤＮＡを用い るかまたは当業者に公知の他の方法を用いて単離及び同定し得る。特に、近縁Ｄ ＮＡを単離するための適当なライブラリーをスクリーニングするために本発明で 提供されるＤＮＡを使用し得る。本文中に記載されたような方法を用いて全長ク ローンを構築でき、得られたサブユニットの配列並びに電気生理学的及び薬理学 的特性を、本文中で例示したサブユニットのものと比較することによって特性決 定した。ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 β₁をコードするＤＮＡ β₁サブユニットをコードするＤＮＡを単離するために、ウサギ骨格筋カルシ ウムチャンネルβサブユニットをコードするＤＮＡフラグメントに対するハイブ リダイゼーションによってヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした 。ハイブリダイズするクローンを選択し、これを使用して、完全ヒトカルシウム チャンネルβサブユニットをコードするＤＮＡを包含するオーバーラップクロー ンが単離され配列決定されるまでオーバーラップクローンを単離 した。 ヒトカルシウムチャンネルβ₁サブユニットの５つの選択的スプライス形態を 同定し、多数の形態をコードするＤＮＡを単離した。これらの形態について、骨 格筋で発現された形態をβ_1-1と命名し、ＣＮＳで発現された形態をβ_1-2と命名 し、同じくＣＮＳで発現された形態をβ_1-3と命名し、大動脈及びＨＥＫ２９３ 細胞で発現された形態をβ_1-4と命名し、ＨＥＫ２９３細胞に発現された形態を β_1-5と命名した。β_1-2及びβ_1-3サブユニットをコードする全長ＤＮＡクロー ンを構築した。サブユニットβ_1-1、β_1-2、β_1-4及びβ_1-5をβサブユニットの 選択的スプライス形態として核酸増幅分析によって同定した。β₁スプライス変 異体の配列を配列番号９、１０及び３３〜３５に示す。β₂をコードするＤＮＡ β₂スプライス変異体をコードするＤＮＡが得られた。これらのスプライス変 異体はβ_2C−β_2Eを包含する。スプライス変異体β_2C−β_2Eは、スプライス変異 体間で違っている５'末端(ヌクレオチド１８２まで)の部分を除いて配列番号２ ６に示された配列全部を含む。配列番号２６に示す配列はβ_2Dをコードしている 。追加のスプライス変異体 は、本文に記載の方法と配列番号２６に示すＤＮＡの全部もしくは一部分を含む オリゴヌクレオチドとを用いて単離でき、または、実施例に記載のごとく調製も しくは取得できる。β₂スプライス変異体β_2C及びβ_2Eを夫々配列番号３７及び ３８に示す。β₃をコードするＤＮＡ β₃サブユニット及びその任意のスプライス変異体をコードするＤＮＡは、配 列番号１９、２０に従って調製されたＤＮＡプローブを用いるかまたは寄託され たβ₃クローンプラスミドβ１.４２(ＡＴＣＣ受託番号６９０４８)の全部もしく は一部分を用いてβ₁ブユニットに関する上記の記載と同様にライブラリーをス クリーニングすることによって単離され得る。 β₃サブユニットをコードするＤＮＡを含むプラスミドβ１.４２を保有する大 腸菌宿主は、特許手続き目的の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約及 びこの条約に基づいて発布された条例の規約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ,１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄ ｒｉｖｅ,Ｒｏｃｋｖｉｌｅ,Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ Ｕ.Ｓ.Ａ.にＡＴＣ Ｃ受 託番号６９０４８で寄託した。寄託材料のサンプルは現在及び今後、上記の条約 及び条例に基づいて、並びに、アメリカ合衆国の特許法及び条例あるいは本願も しくは本願を優先権主張する出願が出願されたかまたはかかる出願に対して許諾 されるいかなる特許も許諾される他のすべての国家または国際機関の特許法及び 条例に基づいて、特許事務所及び他の法的有資格者に入手可能であろう。 β₃をコードするプラスミドをβ１.４２と命名する。プラスミドはベクターｐ Ｇｅｍ７ｚＦ(＋)に挿入されたβ₃をコードする２.５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメ ントを含有し、宿主大腸菌ＤＨ５α株中で寄託した。β_3-1及びβ_3-2と命名され たβ₃スプライス変異体の配列を夫々配列番号１９及び２０に示す。ヒトカルシウムチャンネルα₂サブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₂サブ ユニットをコードするＤＮＡのフラグメントで低及び高緊縮性条件下にプローブ する以外は、α₁サブユニットをコードするＤＮＡを単離するために使用した方 法と実質的に同様の方法で、ヒト神経細胞カルシ ウムチャンネルα₂サブユニットをコードするＤＮＡを単離した。フラグメント は、ウサギ背骨格筋カルシウムチャンネルα₂サブユニットｃＤＮＡを含むヌク レオチド４３から２７２までのヌクレオチド配列に対応する配列を有するヌクレ オチドを含んでいた。これはＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ.ＷＯ８９／０９８３ ４に開示されており、これは米国出願０７／６２０,５２０(現在は許諾米国出願 ０７／９１４,２３１)に対応し、この米国出願は１９８８年４月４日出願の米国 出願１７６,８９９の一部継続出願である。 実施例IVは、ヒトカルシウムチャンネルのα₂サブユニットをコードするＤＮ Ａクローンを単離するために、ゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに よって同定されたゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡクローンをプローブとして用いた方 法を記載している。 配列番号１１及び２９〜３２は、α₂サブユニットをコードするＤＮＡの配列 を示す。実施例Ｖに記載したように、ヒト骨格筋、脳組織及び大動脈からのＲＮ Ａを、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₂サブユニットから分岐するヒト神 経細胞α₂サブユニットｃＤＮＡの領域に特異的な オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅分析し、ヒトカルシウムチャン ネルα₂サブユニット転写体のスプライス変異体を同定した。ヒトカルシウムチャンネルγサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離 ヒト神経細胞カルシウムチャンネルγサブユニットの一部分をコードするＤＮ Ａを実施例VIに詳細に記載の手順で単離した。配列番号１４は、４３アミノ酸残 基の配列をコードする読み取り枠を含むこのＤＮＡの３'端のヌクレオチド配列 を示す。得られた部分は、許諾された同一出願人の米国出願０７／４８２,３８ ４に記載のウサギクローンに相同であるから、クローンの残りの部分は常用の方 法によって得られる。抗体 カルシウムチャンネルサブユニットのサブタイプまたはカルシウムチャンネル のタイプに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、サブユニット タンパク質またはその部分を抗原として用いる当業者に公知の標準技術を用いて 調製され得る。抗ペプチド抗体及び抗融合タンパク質抗体を使用し得る〔例えば 、Ｂａｈｏｕｔｈら(１９９ １)Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.Ｓｃｉ.１２：３３８−３４３；Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ(Ａｕｓ ｕｂｅｌら,ｅｄｓ.)Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ( １９８４)〕。免疫原として(合成ペプチドまたは組換え的に産生された細菌性融 合タンパク質として)使用するためのカルシウムチャンネルサブユニットの部分 を選択するときに考慮すべき要因としては、抗原性発揮の可能性（即ち、細胞外 ドメイン及び細胞質ドメイン)、特定サブユニットに対する特異性(uniqueness) 、及び当業者に公知の他の要因がある。 サブユニット特異的抗体を入手できることにより、多様なサブユニットの分布 及び発現密度をモニターするために免疫組織化学の技術を適用することが可能で ある(例えば、正常脳組織対疾患脳組織)。このような抗体はまた、ＬＥＳ診断の ような診断目的、または、カルシウムチャンネルの活性を変調する抗体を用いる 治療目的で使用され得る。 抗体は、例えば、腹腔内、筋肉内、静脈内もしくは皮下注射、移植または経皮 投与方式、などの標準方法を用いて患者に投与され得る。当業者は、使用される 投与方式に従っ て投与形態、治療計画などを実験的に決定し得る。 サブユニット特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を調製し た。公知のすべてのα及びβサブユニットのサブタイプのＤＮＡ及びアミノ酸配 列の比較によって抗原が由来した領域を同定した。最も相同性の小さい、好まし くはヒト由来の配列を選択した。選択領域または選択領域を保有する融合タンパ ク質を免疫原として使用する。また、選択したタンパク質領域及び融合タンパク 質中の残基の疎水性分析を実施する。高疎水性の領域が回避される。また、より 重要には、細菌宿主中で融合タンパク質を調製するときに微量コドンが回避され る。特に、選択された宿主中の連続する３個以上の微量コドンの含有が回避され る。αまたはβサブユニットのタイプまたはサブタイプに特異的な多数のモノク ローナル及びポリクローナル抗体を調製した。これらのいくつかを以下の表に示 す。代表的な抗体及び抗体の調製に使用したペプチド抗原を以下の表に示す。 ＧＳＴ融合タンパク質の各々は、同様の融合物及び坑血清の調製が可能なα_1C 及びα_1Dを含むすべてのサブタイプにおいてサブタイプ相同性の小さい領域であ る細胞質ループ領域IIＳ６−IIＳ１に特異的である。異種カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含有する組換え真 核細胞の調製 １つ以上のカルシウムチャンネルサブユニットまたは１つのカルシウムチャン ネルサブユニットの一部分をコードするＤＮＡを、ＤＮＡを発現または複製する 宿主細胞に導入し得る。これらのＤＮＡは、以下の実施例に記載の方法を用いる かまたは当業者に周知の他の手順で導入され得る。クローン化したＤＮＡを適当 な発現ベクターに組込み、プラスミドベクターまたは各々が１つ以上の異なる遺 伝子をコードするプラスミドベクターの組合わせまたは直鎖状ＤＮＡを用いて真 核細胞をトランスフェクションし、トランスフェクト細胞を選択する手順も当業 界で周知である〔例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(１９８９)Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ ｔｉｏｎ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ ｓｓ〕。ヒト カルシウムチャンネルのサブユニットのいずれかをコードするクローン化した全 長ＤＮＡをプラスミドベクターに組み込んで真核細胞中で発現させ得る。このよ うなＤＮＡはゲノムＤＮＡでもよくまたはｃＤＮＡでもよい。各々が少なくとも １つのカルシウムチャンネルサブユニットをコードする１つのプラスミドまたは 組み合わせプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし得る。あるいは、当業界 で周知の方法を用い、直鎖状ＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトし得る。 本発明で提供されるＤＮＡは、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞を含む 任意の真核細胞中で発現し得るが〔例えば、Ｃｒｅｇｇら,(１９８７)Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：４７９参照〕、本発明で提供されるヒトカルシウムチ ャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの発現には哺乳類発現系が好ましい。 異種ＤＮＡをコードするベクターによるトランスフェクションのような当業界 で周知の任意の方法によって異種ＤＮＡを導入し得る。哺乳類細胞のトランスフ ェクションに特に好ましいベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスｄｈ ｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化及びスプラ イス部位、ベクターを細菌中に維持するために必要な配列を含有するｐＳＶ２ｄ ｈｆｒ発現ベクター、または、ｐＣＤＮＡ１もしくはｐｃＤＮＡ−ａｍｐのよう なサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターベースのベクター、並びに、ＭＭ ＴＶプロモーターベースのベクターである。ヒトカルシウムチャンネルサブユニ ットをコードするＤＮＡをＣＭＶプロモーターの直後の位置でベクターｐＣＤＮ Ａ１に挿入された。現在ではベクターｐＣＤＮＡ１が好ましい。 安定にまたは一過的にトランスフェクトされた哺乳類細胞は、チミジンキナー ゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシンに耐性の遺伝子のような選択可能 なマーカー遺伝子を有する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによ って当業界に周知の方法で調製でき、一過的トランスフェクションの場合には、 マーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下でトランスフェクト細胞を増殖 させる。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含有する ベクターｐＣＤＮＡ１の誘導体でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中で機 能性電圧依存性カルシウムチャンネルが産生された。 異種ＤＮＡはエピソーム要素として細胞中に維持されて もよく、または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。次に、得られた組換 え細胞を培養するか、または、このような培養物もしくはその継代培養物から継 代培養する(哺乳類細胞の場合には継代させる)。組換え細胞のトランスフェクシ ョン、注入及び培養の方法は当業者に周知である。ＤＮＡまたはＲＮＡを導入す る真核細胞は、このようなＤＮＡまたはＲＮＡによってトランスフェクト可能で あるかまたはこのようなＤＡＮの注入が可能であるいかなる細胞でもよい。実質 的にいかなる真核細胞も異種ＤＮＡのビヒクルとして有用であり得る。好ましい 細胞は、更にＤＮＡ及びＲＮＡを発現し得る細胞であり、極めて好ましい細胞は 異種ＤＮＡによってコードされた１つ以上のサブユニットを含む組換えまたは異 種カルシウムチャンネルを形成し得る細胞である。このような細胞は実験的に同 定されてもよくまたは容易にトランスフェクトまたは注入される既知の細胞から 選択されてもよい。ＤＮＡ導入用の好ましい細胞は、一過的にまたは安定にトラ ンスフェクトされ得る細胞であり、その例としては、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞 、ＣＨＯ細胞、ヒト胚性腎細胞、アフリカミドリザル細胞及び他の当業者に周知 のこのような細胞などの哺乳類起原の 細胞、アフリカツメガエル卵母細胞のような両生類細胞、またはＳａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの ような酵母細胞があるがそれに限定されない。注入されたＲＮＡ転写物またはｃ ＤＮＡの発現に好ましい細胞はアフリカツメガエル卵母細胞である。ＤＮＡのト ランスフェクションに好ましい細胞は容易にかつ効率的にトランスフェクトされ る細胞である。このような細胞は当業者に周知であるかまたは実験的に同定され 得る。好ましい細胞としては、ＤＧ４４細胞及びＨＥＫ２９３細胞があり、特に 、液体窒素中で凍結でき次いで解凍させて増殖を再開させ得るＨＥＫ２９３細胞 が好ましい。このようなＨＥＫ２９３細胞は例えばＧｏｒｍａｎの米国特許第５ ,０２４,９３９号に記載されている〔Ｓｔｉｌｌｍａｎら,(１９８５)Ｍｏｌ.Ｃ ｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.５：２０５１−２０６０も参照〕。 細胞は、その内部に導入された異種ＤＮＡを複製するかまたはその内部に導入 された異種ＤＮＡを発現させるためのビヒクルとして使用され得る。いくつかの 実施態様においては、細胞は、実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルサブユ ニットまたは異種カルシウムチャンネルを産生す る手段として異種ＤＮＡを発現させるビヒクルとして使用される。異種ＤＮＡを 含有する宿主細胞をカルシウムチャンネルが発現し得る条件下に培養するとよい 。カルシウムチャンネルサブユニットを当業者に周知のタンパク質精製方法を用 いて精製し得る。例えば、サブユニットまたはサブユニット含有カルシウムチャ ンネルをアフィニティ精製するために、本発明で提供される抗体のような１つ以 上のサブユニットに特異的に結合し得る抗体を使用してもよい。 ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルの α₂サブユニツト、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及びヒトカルシ ウムチャンネルのγサブユニットの実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルの サブユニットが提供される。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットの少なくと も１つを含む実質的に純粋な単離されたカルシウムチャンネルも提供される。ま た、宿主細胞によってコードされた１つ以上のサブユニットと細胞に導入された 異種ＤＮＡもしくはＲＮＡによってコードされた１つ以上のサブユニットとの混 合物を含有する実質的に純粋なカルシウムチャンネルも提供される。また、実質 的に純粋なサブタイプ−または組織−型特異的カルシ ウムチャンネルも提供される。 別の実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニット、ヒ トカルシウムチャンネルのα₂サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのβサ ブユニット及びヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットの少なくとも１つを コードする異種ＤＮＡを含有する真核細胞が提供される。１つの好適実施態様に おいては、異種ＤＮＡが真核細胞中で発現され、好ましくはそれはヒトカルシウ ムチャンネルα₁サブユニットをコードしている。異種カルシウムチャンネルの発現：電気生理学及び薬理学 カルシウムチャンネル活性を測定する電気生理学的方法は当業者に周知であり 本文中に例示されている。機能性カルシウムチャンネルの形成を検出し、得られ る電流のカイネティクス及び他の特徴を特性決定するために任意のこのような方 法を使用し得る。カルシウムチャンネルを更に特性決定するために、薬理学的試 験を電気生理学的測定と併用してもよい。 機能性異種カルシウムチャンネルの活性の測定に関しては、測定される異種カ ルシウムチャンネル活性のＳ／Ｎ比を増加させるために、内因性イオンチャンネ ル活性及び所 望の場合には所望のサブユニットを含有しないチャンネルの異種チャンネル活性 をディファレンシャル静止電位差の使用のような化学的、薬理学的及び電気生理 学的手段によって有意な程度に阻害し得る。 従って、本発明で提供されるＤＮＡによってコードされるサブユニットの種々 の組み合わせを真核細胞に導入する。得られた細胞を試験して、機能性チャンネ ルが発現されたか否かを確認しチャンネルの特性を決定し得る。特に好ましい様 相では、異種ＤＮＡを含有する真核細胞が該ＤＮＡを発現し、組換え機能性カル シウムチャンネル活性を形成する。より好ましい様相では、組換えカルシウムチ ャンネル活性が、非トランスフェクト宿主細胞には欠如しているタイプの活性で あるかまたは非トランスフェクト細胞中で示されない量及び／または薬理学的特 性を有するかまたは生物物理学的特性を示すので、容易に検出され得る。 真核細胞は本発明で提供されるサブユニットのサブタイプの種々の組み合わせ によってトランスフェクトされ得る。得られる細胞は、カルシウムチャンネル活 性を研究し本発明で提供される薬剤スクリーニングアッセイでの使用に適したカ ルシウムチャンネルの均一集団を提供するであろう。 行った実験は、従来の分類図式が適当でないことを示した。 トランスフェクト細胞のうちでも機能性異種カルシウムチャンネルを有する組 換え真核細胞が好ましい。組換え細胞は、ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブ ユニットをコードする異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物の導入及び発現、より好ま しくは、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする異種ＤＮＡ及 び／またはヒトカルシウムチャンネルのα₂サブユニットをコードする異種ＤＮ Ａも発現する異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物の導入及び発現によって産生され得 る。特に好ましくは、このような異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物によってコード されるα₁、β及びα₂サブユニットの各々、及び、任意にヒトカルシウムチャン ネルのγサブユニットをコードする異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物をこのような 組換え細胞中で発現させる。機能性カルシウムチャンネルは好ましくはヒトカル シウムチャンネルのα₁サブユニット及びβサブユニットを少なくとも含み得る 。これらの２つのサブユニットを発現する真核細胞及び追加のサブユニットを発 現する細胞を、ＤＮＡのトランスフェクション及びＲＮＡ転写物の注入によって 調製した。このような細胞は、１つ以上の異種ヒトカルシウム チャンネルサブユニットを含有するカルシウムチャンネルに帰因する電圧依存性 カルシウムチャンネル活性を示した。例えば、α₁サブユニットとβサブユニッ トとに加えてα₂サブユニットを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する 真核細胞は、脱分極に応じて細胞膜を透過するカルシウム選択イオン流量を増加 させ、これは、α₂サブユニットがカルシウムチャンネル機能を強めることを示 す。漸増比のα₂対α₁によって細胞をコトランスフェクトし、得られたカルシウ ムチャンネルの活性を測定した。結果は、他のトランスフェクトされたサブユニ ットに対してα₂をコードするＤＮＡの量を増加させるとカルシウムチャンネル 活性が増加することを示す。 ヒトα₁サブユニット、ヒトβサブユニット及びヒトα₂サブユニットを少なく とも含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞が好ましい。α₁サ ブユニットだけをコードしているかまたはβ及び／またはα₂サブユニットと組 み合わせてコードしているｃＤＮＡまたはＲＮＡ転写物を含有する組成物で形質 転換した真核細胞を、機能性カルシウムチャンネルを発現する細胞を産生するた めに使用し得る。異種ｃＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされ たヒトサブユニットの全部を含有するヒトカルシウムチャンネルを発現する組換 え細胞が特に好ましいので、異種ＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされたヒト サブユニットを含有するカルシウムチャンネルを形成するために十分な濃度のサ ブユニットコーディング核酸をこのような宿主細胞に注入またはトランスフェク トするのが好ましい。サブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの正確な量 及び比は実験的に決定でき、サブユニット、細胞及びアッセイ条件の個々の組み 合わせ毎に最適化し得る。 特に、哺乳類細胞は１つ以上のヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコー ドするＤＮＡで一過的及び安定にトランスフェクトされた。このような細胞は、 ヒトカルシウムチャンネルに帰因し得る薬理学的及び電気生理学的特性を示す異 種カルシウムチャンネルを発現する。しかしながら、このような細胞は均質集団 を示し、薬理学的及び電気生理学的データは、ヒトカルシウムチャンネル活性の 解明についてこれまでは得られなかった手掛かりを与える。例えば、ＨＥＫ細胞 を、α_1E-1、α_2b及びβ_1-3サブユニットをコードするＤＮＡで一過的にトラン スフェクトした。得られた細胞はこれらのサブユニットを一過的に発現し、 これらは、Ｌ−、Ｎ−、Ｔ−及びＰ−型のチャンネルとは異なる電圧活性化カル シウムチャンネルの薬理学的クラスであると考えられる特性を有するカルシウム チャンネルを形成する。観察されるα_1E電流は、他のクラスの電圧活性化カルシ ウムチャンネルを定義するためにこれまで使用されてきた薬剤及び毒素に感受性 でない。 α_1B-1、α_2b及びβ_1-2をコードするＤＮＡで一過的にトランスフェクトされ たＨＥＫ細胞は、ω−コノトキシンに対する感受性及びＮ−型チャンネルの典型 的な電流を示す異種カルシウムチャンネルを発現する。均等なｍＲＮＡレベルを 達成するために細胞に導入するα_1B-1、α_2b及びβ_1-2のモル比を変更すると、 細胞あたりのレセプターの数、電流密度が有意に増加し、ω−コノトキシンのＫ_d に影響を与えた。 α_1B-1、α_2b及びβ_1-2から産生されたこれらのチャンネルの電気生理学的特 性を、α_1B-1、α_2b及びβ_1-3をコードするＤＮＡでＨＥＫ細胞を一過的にトラ ンスフェクトすることによって産生されるチャンネルの特性と比較した。チャン ネルは、同様の電圧依存性活性化、実質的に等しい電圧依存性、同様の活性化の カイネティクス、単一指数に よって調整され得るテール電流を示した。不活性化のカイネティクスの電圧依存 性はすべての被検電圧において有意に違っていた。 いくつかの実施態様においては、少なくとも１つのＲＮＡ転写物を含有する第 １組成物を細胞に導入し、この転写物を細胞中でヒトカルシウムチャンネルのサ ブユニットとして翻訳することによって、異種カルシウムチャンネルを有する真 核細胞を産生する。好ましい実施態様においては、翻訳されるサブユニットが、 ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットを含む。より好ましくは、導入さ れる組成物が、ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードするＲＮ Ａ転写物を含有し、且つ、(１)ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコ ードするＲＮＡ転写物及び／または(２)ヒトカルシウムチャンネルのα₂サブユ ニットをコードするＲＮＡ転写物を含有する。特に好ましくは、ヒトカルシウム チャンネルのα₁、β及びα₂サブユニット及び任意にヒトカルシウムチャンネル のγサブユニットをコードするＲＮＡを導入する。クローン化したＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の方法、及び、得られたＲＮＡの真核細胞内注入方法は当業界 で周知である。ヒトカル シウムチャンネルのサブユニットのいずれかをコードする全長ＤＮＡのいずれか の転写物を、細胞中で発現させるために真核細胞中に単独で注入してもよくまた は他の転写物と組み合わせて注入してもよい。本発明で提供されるヒトカルシウ ムチャンネルサブユニットｃＤＮＡクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物の発現に は両生類卵母細胞が特に好ましい。機能性異種カルシウムチャンネルを発現する 両生類卵母細胞をこの方法によって産生した。細胞のアッセイ及び臨床使用並びにカルシウムチャンネルアッセイ カルシウムチャンネル活性を変調する化合物の同定アッセイ １つ以上のサブユニットを組換え的に発現する真核細胞の用途としては、被検 化合物がカルシウムチャンネルアゴニスト活性を有するかアンタゴニスト活性を 有するかを判定するアッセイがある。これらの真核細胞はまた、既知のカルシウ ムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストから特定のカルシウムチャンネルサ ブタイプ特異性を示すものを選択し、従って疾患特異的または組織特異的な治療 薬として有効な化合物を選択するために使用され得る。 異種ヒトカルシウムチャンネルを発現する真核細胞を使用して、カルシウムチ ャンネルアゴニスト及びアンタゴニストのようなカルシウムチャンネルの活性変 調(modulate)化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。 アッセイでは特に、ヒトカルシウムチャンネルに特異的な有力なカルシウムチ ャンネルアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするため、特に特定の ヒトカルシウ ムチャンネルサブタイプに特異的な化合物をスクリーニングするために、本発明 で提供される異種ＤＮＡによってコードされた異種ヒトカルシウムチャンネルサ ブユニットを発現する真核細胞を使用する。このようなアッセイは、構造がいく らか異なるアゴニスト及びアンタゴニストからヒトカルシウムチャンネルの活性 変調に特に有用なものを選択し、サブタイプ特異的または組織特異的カルシウム チャンネルアンタゴニスト及びアゴニスト活性を示す化合物を設計または選択す るための合理的な薬剤設計の方法と組み合わせて使用され得る。これらのアッセ イは、ある種のヒト疾患の治療に対する化合物の相対治療効果を正確に予想させ る。更に、サブタイプ特異的及び組織特異的カルシウムチャンネルサブユニット が提供されるので、組織特異的またはサブタイプ特異的組換えカルシウムチャン ネルを有する細胞を調製し、ヒトカルシウムチャンネル組織特異的またはサブタ イプ特異的薬剤の同定アッセイに使用され得る。 カルシウムチャンネルサブユニット発現用の宿主細胞は、リガンド結合アッセ イにおける異種カルシウムチャンネルサブユニットの検出を実質的に妨害したり または機能性アッ セイにおけるカルシウム電流の発生のような異種カルシウムチャンネル機能の検 出を実質的に妨害したりするタイプまたは量の内因性カルシウムチャンネルサブ ユニットを産生しないのが望ましい。また、宿主細胞は、生理学的濃度で(一般 にはナノモルまたはピコモルの濃度で)、本発明で提供されるヒトカルシウムチ ャンネルサブユニットの１つまたは全部を含有するカルシウムチャンネルに対す る親和性を有する化合物の検出を妨害する内因性カルシウムチャンネルを産生し ないのが好ましい。 カルシウムチャンネルに対する親和性を有する化合物を同定するリガンド結合 アッセイに関しては、少なくとも１つの異種α₁サブユニットを発現する細胞を 使用するのが好ましい。少なくとも１つのα₁サブユニットを発現するトランス フェクト真核細胞は、例えばカルシウムチャンネルと特異的に相互作用すること が分かっている標識化合物の相互作用を阻害する被検化合物の能力を評価するこ とによって、異種カルシウムチャンネルに特異的に結合する被検化合物の能力を 判断するために使用し得る。このようなリガンド結合アッセイはインタクトなト ランスフェクト細胞または該細胞から調製された膜に対して実施し得る。 異種カルシウムチャンネルまたはそのサブユニットを含有する膜に結合または 他の方法で相互作用する被検化合物の能力は、任意の適当な方法、例えば、カル シウムチャンネルに対して既知の親和性を有する１種以上の濃度の化合物の存在 下または非存在下でこのような膜の結合能力を測定するスキャッチャードプロッ トのような競合結合分析を用いて測定し得る。必要な場合、結果を、当業者に周 知の方法に従って設計された対照実験に比較し得る。例えば、１つ以上のサブユ ニットをコードする核酸でトランスフェクトしない宿主細胞からの膜調製物を同 様に処理したアッセイ結果を陰性対照とし、双方の結果を比較し得る。 アッセイは、ヒトカルシウムチャンネルの少なくとも１つのサブユニット、好 ましくはヒトカルシウムチャンネルの少なくとも１つのα₁サブユニットを発現 する組換え真核細胞の細胞膜を被検化合物と接触させ、膜に特異的に結合するか または膜の異種カルシウムチャンネルの活性を変化させるかもしくは変調する被 検化合物の能力を測定する処理を含む。 好ましい実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニット をヒトカルシウムチャンネルのβサ ブユニット及び／またはヒトカルシウムチャンネルのα₂サブユニットと組み合 わせて含有するカルシウムチャンネルを有する組換え細胞をアッセイに使用する 。このようなアッセイでは、ヒトα₁、β及びα₂サブユニットの各々を含有する 、及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットを含有する異種カルシ ウムチャンネルを発現する組換え細胞の使用が特に好ましい。 いくつかの実施態様において、カルシウムチャンネル活性を変調する化合物を 同定するアッセイは、被検化合物及びカルシウムチャンネル選択イオンを含有す る溶液に細胞を接触させたときに異種機能性カルシウムチャンネルを有する真核 細胞が示すカルシウムチャンネル活性を測定し、測定されたカルシウムチャンネ ル活性を被検化合物非含有の溶液中の同じ細胞または実質的に等しい対照細胞の カルシウムチャンネル活性に比較することによって行う。チャンネルが開いたと きに内向きの電流を与えるために十分なカルシウムチャンネル選択イオンの濃度 を有する溶液中に細胞を維持する。このようなアッセイでは、ヒトカルシウムチ ャンネルのα₁、β及びα₂サブユニットの各々及び任意にヒトカルシウムチャン ネルのγサブユニットを含むカ ルシウムチャンネルを発現する組換え細胞の使用が特に好ましい。このようなア ッセイの実施方法は当業者に公知である。例えば、アフリカツメガエル卵母細胞 とアセチルコリン受容体とを用いる同様の方法〔Ｍｉｓｈｉｎａら（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：３６４〕及びこのような卵母細胞とナトリウムチャンネ ルとを用いる同様の方法〔Ｎｏｄａら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：８２ ６−８２８〕がある。アセチルコリン受容体を用いて行った同様の試験に関して は、例えばＣｌａｕｄｉｏら〔(１９８７)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６８８− １６９４〕を参照するとよい。 機能性の組換えまたは異種カルシウムチャンネルは当業者に周知の任意の方法 で同定され得る。例えば、細胞のイオン選択膜を透過する電流を測定する方法と して公知の電気生理学的手順を使用し得る。本発明において提供される１つ以上 のサブユニットをコードするＤＮＡを含有する組換え細胞の異種カルシウムチャ ンネルを透過するカルシウム選択イオン流の量及び時間を、２電極及び全細胞パ ッチ固定法を用いる電気生理学的記録法を用いて測定した。アッセイ感度を向上 させるために、組換えチャンネルを通るカ ルシウム電流を測定するときに、非カルシウム電流及び内因性カルシウムチャン ネルから生じるカルシウム電流を除去または減少させる公知の方法を使用し得る 。 例えば、ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４４は、チャンネルの開状態の持続時間を延 長することによってＬ−型カルシウムチャンネル機能を特異的に増進させる〔例 えば、Ｈｅｓｓ,Ｊ.Ｂ.ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１１：５３８−５４４参 照〕。チャンネルの開時間が延長されると、その結果としてカルシウム電流の量 が増加し持続時間が延長する。脱分極電圧コマンドによってイオンチャンネルを 活性化した後で細胞膜を再分極するとテール電流を観察し得る。開いたチャンネ ルは、再分極されて閉鎖即ち「不活性化」するまでに有限時間を要し、この期間 にチャンネルを流れる電流をテール電流と呼ぶ。Ｂａｙ Ｋ ８６４４はカルシウ ムチャンネルの開口事象を延長させるので、テール電流を延長し、より大きくす る。 実際には好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルの１つ以上のサブユニットを 含有する電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルを発現する安定にまたは一過的に トランスフェクトされた細胞または注入された細胞は、カルシウムチャ ンネル活性を変調するカルシウムチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストの ような物質を同定するアッセイで使用され得る。未知の活性を有する化合物から 成る被検化合物がヒトカルシウムチャンネルを介してカルシウムイオンまたは他 のイオンの流れを強化、阻害または他の方法で変更するか否かを判断するための カルシウムチャンネルのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関する被検 化合物の機能性試験は、(ａ)カルシウムチャンネル選択イオンを含有する媒体中 で細胞に流入するカルシウムチャンネル選択イオンの流量を調節し得る異種機能 性カルシウムチャンネルを発現するようにトランスフェクトまたは注入された真 核細胞を、被検化合物の(ｉ)存在下及び(ii)非存在下に維持し、(ｂ)異種カルシ ウムチャンネルが実質的に閉鎖され細胞の内因性カルシウムチャンネルが実質的 に阻害される条件下に細胞を維持し、(ｃ)段階(ｂ)に維持された細胞の膜を、異 種カルシウムチャンネル(好ましくは実質的に該チャンネルだけ)がカルシウムチ ャンネル選択イオンに透過性になるために十分な程度及び時間を要して脱分極し 、(ｄ)被検化合物の存在下の電流の細胞流入量及び持続時間を、被検化合物の非 存在下の電流の同一細胞または実 質的に同じ細胞への流入量及び持続時間に比較することによって行う。 従ってアッセイは、本発明で提供される異種機能性カルシウムチャンネルを発 現する細胞を使用し、異種機能性チャンネルを介してＣａ⁺⁺またはＢａ⁺⁺のよう なカルシウムチャンネル選択イオン流の量及び持続時間を強化、拮抗または他の 方法で変調する被検化合物の能力を機能的、例えば電気生理学的に測定する。細 胞の組換えカルシウムチャンネルを流れる電流の量は、例えば電気生理学的に直 接測定されてもよく、または、カルシウム(または他の)イオンに依存的な影響を 直接受けながら細胞内で生じる独立反応をモニターすることによって測定されて もよい。任意のカルシウムチャンネル活性評価方法を、本発明で提供される細胞 及びアッセイと併用し得る。例えば、化合物のカルシウムチャンネル活性変調能 力を試験する方法の１つの実施態様では、異種カルシウムチャンネルを発現する 真核細胞を使用してカルシウムチャンネル選択イオン感受性反応の変調による電 流量を測定する。該真核細胞は更に、指示(indicator)タンパク質をコードする 構造遺伝子に機能し得るように結合された発現用の転写調節要素を含む。指示遺 伝子 の転写に使用される転写調節要素は、Ｃａ⁺⁺及びＢａ⁺⁺のようなカルシウムチャ ンネル選択イオンに細胞内で反応性である。このような転写に基づくアッセイの 詳細は、１９９０年８月７日出願の同一出願人所有の許諾された米国出願０７／ ５６３,７５１を優先権主張した１９９１年８月７日出願の同一出願人所有のＰ ＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／５６２５に記載されている。また、係属中 の米国出願０８／２２９,１５０及び０８／２４４,９８５に対応する同一出願人 所有の公開ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１０９０も参照されたい。 ＬＥＳの診断アッセイ ＬＥＳは、神経インパルスに正常に反応する運動神経末端からのアセチルコリ ン放出が不十分であることを特徴とする自己免疫疾患である。ＬＥＳ患者の免疫 グロブリン(ＩｇＧ)は個々の電圧依存性カルシウムチャンネルをブロックし、従 ってカルシウムチャンネル活性を阻害する〔Ｋｉｍ ＆ Ｎｅｈｅｒ,Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２３９：４０５−４０８(１９８８)〕。ランベルト−イートン症候群(ＬＥ Ｓ)の診断アッセイが本発明で提供される。ＬＥＳの診断アッセイは、組換え細 胞の表面で発現されたヒトカルシウムチャ ンネルまたは１つもしくは複数の特定サブユニットとＬＥＳ ＩｇＧとの免疫学 的反応性に依存する。例えば、このようなアッセイは、本発明によって提供され るヒトカルシウムチャンネルサブユニット及びこのようなサブユニットを発現す る細胞によるＬＥＳ ＩｇＧの免疫沈降に基づいてもよい。 臨床応用 様々な疾病状態の治療に関しては、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットを コードするＤＮＡが入手可能になると、ある種の疾病状態の発生に相関関係を有 し得る遺伝子の何らかの変異(例えば突然変異)を同定することが可能になる。更 に、このような疾病状態の動物モデルを作製し、上記のごとき突然変異を合成Ｄ ＮＡフラグメントに特異的に導入し、次に実験動物に導入するかまたはｉｎ ｖ ｉｔｒｏアッセイ系に導入することによっその効果を判定することが可能になる 。 また、ヌクレオチド配列をプローブとして使用して遺伝子スクリーニングを行 うことが可能になる。従って、いずれか１つまたはそれ以上のカルシウムチャン ネルサブユニットの変異／修飾が関与する疑いのある病理状態を有する患 者の核酸サンプルを適当なプローブによってスクリーニングし、内因性カルシウ ムチャンネルのいずれかに関して何らかの異常が存在するか否かを判断し得る。 同様に、カルシウムチャンネル機能不全に関連した疾病状態の家族歴を有する被 検者をスクリーニングして、彼らもまたこのような疾病状態に対する素質がある か否かを判断し得る。実施例 以下の実施例は例示の目的で与えられており、本発明の範囲を限定する意図は ない。実施例Ｉ ：ヒト神経電圧依存性カルシウムチャンネルサブユニットをコードする ＤＮＡの単離に使用するライブラリーの調製 Ａ.ＲＮＡ単離 １.ＩＭＲ３２細胞 ＩＭＲ３２細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ(ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ.ＣＣＬ１２７,Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,ＭＤ)か ら入手し、ＤＭＥＤ、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシ ン(ＧＩＢＣＯ,Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ,ＮＹ)と１.０ｍＭのジブチリルｃＡＭ Ｐ(ｄｂｃＡＭＰ)中で１ ０日間増殖させた。Ｈ.Ｃ.Ｂｉｒｎｂｏｉｍ〔(１９８８)Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１４８７−１４９７〕に記載された手順で全Ｒ ＮＡを細胞から単離した。ポリ(Ａ⁺)ＲＮＡを標準手順に従って選択した〔例え ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(１９８９)Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ｐｇ.７.２６−７.２９〕。 ２.ヒト視床組織 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ,Ｌ ｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ,ＣＡから入手し、−７０℃で冷凍保存しておいたヒト視床 組織(２.３４ｇ)を液体窒素の存在下に乳鉢と乳棒とを用いて微粉砕し、細胞を １２ｍｌの溶解バッファ(５Ｍのイソチオシアン酸グアニジニウム、５０ｍＭの Ｔｒｉｓ,ｐＨ７.４、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５％のβ−メルカプトエタノール) 中で溶解した。その溶解液に溶解バッファを添加し、最終容量１７ｍｌとした。 Ｎ−ラウリルサルコシン及びＣｓＣｌを、最終容量１８ｍｌ中の最終濃度が夫々 ４％及び０.０１ｇ／ｍｌになるまで混合物に添加した。 Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター内でサンプルを９,０００ｒｐｍで室温で１ ０分間遠心し、不溶物をペレットとして除去した。上清を等しい部分量に分け、 各アリコートを、別の遠心管に収容した５.７ＭのＣｓＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡ の溶液からなる２ｍｌのクッションに重層し、管あたり約９ｍｌとした。サンプ ルをＳＷ４１ローター内で３７,０００ｒｐｍで２０℃で２４時間遠心した。 遠心後、各ＲＮＡペレットを３ｍｌのＥＴＳ(１０ｍＭのＴＲＩＳ,ｐＨ７.４ 、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０.２％のＳＤＳ)中に再懸濁させ、１つの管に一緒に導 入した。ＲＮＡを０.２５ＭのＮａＣｌ及び２倍容の９５％エタノールで沈殿さ せた。 沈殿物を遠心によって収集し、４ｍｌのＰＫバッファ(０.０５ＭのＴＲＩＳ, ｐＨ８.４、０.１４ＭのＮａＣｌ、０.０１ＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ)中に再 懸濁させた。サンプルにプロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｍｌまで添加 した。サンプルを２２℃で１時間インキュベートし、次いで、等容量のフェノー ル：クロロホルム：イソアミルアルコール(５０：４８：２)で２回抽出し、次い で等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール(２４：１)で １回抽出した。ＲＮＡをエタノール及びＮａＣｌで沈殿させた。沈殿物を４００ μｌのＥＴＳバッファに再懸濁させた。全ＲＮＡの収量は約１.０ｍｇであった 。実施例Ｉ.Ａ.１に記載の標準方法に従ってポリＡ⁺ＲＮＡ(３０μｇ)を全ＲＮ Ａから単離した。 Ｂ.ライブラリー構築 標準方法に従って二重鎖ｃＤＮＡを合成した〔例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１ ９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ ｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ ｓ,Ｃｈａｐｔｅｒ ８参照〕。(１)第１ストランドのｃＤＮＡをプライムするた めに使用したオリゴヌクレオチド、(２)二重鎖ＤＮＡに結合したアダプター、( ３)遊離または非使用アダプターの除去に使用した方法、及び、(４)λファージ ベクターに結合した分画ｃＤＮＡの大きさ、が違う以外は、各ライブラリーを実 質的に同様に調製した。 １.ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１ ＩＭＲ３２ポリ(Ａ⁺)ＲＮＡ(実施例Ｉ.Ａ.１)を鋳型として用いて一本鎖ｃＤ ＮＡを合成し、オリゴ(ｄＴ)_12-18(Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｉｎｃ., Ｂｅｄｆｏｒｄ,ＭＡ)を用いてプライムした。一本鎖ｃＤＮＡを二重鎖ｃＤＮＡ に変換すると、収量約２μｇが得られた。次に、ＳｎａＢＩ及びＸｈｏＩ制限部 位も含むＥｃｏＩアダプター： を以下の手順で二重鎖ｃＤＮＡに付加した。 ａ.１８−ｍｅｒのリン酸化 １０μｌの総量で１８−ｍｅｒ(２２５ピコモル)と〔³²Ｐ〕γ−ＡＴＰ(７０ ００Ｃｉ／ミリモル；１.０μｌ)及びキナーゼ(２Ｕ)とを一緒にし、３７℃で１ ５分間インキュベートする標準方法〔例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｈａ ｐｔｅｒ ８参照〕によって１８−ｍｅｒをリン酸化した。インキュベーション 後、１μｌの１０ｍＭのＡＴＰと追加の２Ｕのキナーゼとを添加し、３７℃で１ ５分間インキュベートした。次に１０分間煮沸してキナーゼを失活させた。 ｂ.２２−ｍｅｒのハイブリダイゼーション ２２５ピコモルの２２−ｍｅｒ(及び容量１５μｌを与える水)の添加及び６５ ℃で５分間のインキュベーションによって２２−ｍｅｒをリン酸化１８−ｍｅｒ にハイブリダイズさせた。次に反応物を室温まで徐冷した。 この場合アダプターは１５ピコモル／μｌの濃度で存在し、ｃＤＮＡ−アダプ ター結合の準備が整った。 ｃ.ｃＤＮＡに対するアダプターの結合 標準プロトコル〔例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｈａｐｔｅｒ ８参照〕 を用いてＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩアダプターを二重鎖ｃＤＮＡに結合 した後で、混合物を７２℃で１５分間加熱してリガーゼを失活させた。ｃＤＮＡ 結合反応物（２０μｌ）に、試薬すなわち水(２４μｌ)、１０×キナーゼバッフ ァ(３μｌ)、１０ｍＭのＡＴＰ(１μｌ)及びキナーゼ(２Ｕ／μｌを２μｌ)を添 加し、３７℃で３０分間加熱した。２μｌの０.５ＭのＥＤＴＡを添加して反応 を停止させ、次いでフェノール／クロロホルムで１回抽出し、クロロホルムで１ 回抽出した。 ｄ.ｃＤＮＡの大きさ選択及びパッケージング ５ｍｌのセファロースＣＬ−４Ｂカラム(Ｓｉｇｍａ,Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ) を用いて遊離または非結合アダプターを除去することによって、ＥｃｏＲＩ、Ｓ ｎａＢＩ、ＸｈｏＩアダプターと結合した二重鎖ｃＤＮＡを精製した。１００μ ｌの画分を収集し、放射能のモニターによってｃＤＮＡ含有と判定された画分を プールし、エタノール沈殿させ、ＴＥバッファに再懸濁させ、１％アガロースゲ ルにロードした。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、１〜３ｋｂの画 分をゲルから切り出した。アガロースに封入されたｃＤＮＡを“Ｇｅｎｅｌｕｔ ｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ,ＣＡ)を用いて溶出させた。溶出したｃＤＮＡをエタノール沈 殿によって収集し、０.１０ピコモル／μｌでＴＥバッファに再懸濁させた。ｃ ＤＮＡを５μｌの反応容量中で、１μｇのＥｃｏＲＩ消化し脱リン酸化したλｇ ｔ１１に、ｃＤＮＡがλｇｔ１１ベクターよりも２倍〜４倍のモル過剰比になる 量で結合させた。ｃＤＮＡインサートを含む結合λｇｔ１１を、Ｇｉｇａｐａｃ ｋ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,ＣＡ)キットを 用いてλファージビリオンにｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージした。パッケージした ファージを大腸菌Ｙ１０８８の菌叢上で平板培養してスクリーニング用に調製し た。 ２.ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃２ このライブラリーは、１〜３ｋｂのフラグメントでなく３〜９ｋｂのｃＤＮＡ フラグメントをλｇｔ１１に結合させる以外は上記(実施例Ｉ.Ｂ.１)と同様に調 製した。 ３.ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃３ ＩＭＲ３２細胞ポリ(Ａ⁺)ＲＮＡ(実施例Ｉ.Ａ.１)を鋳型として使用して一本 鎖ｃＤＮＡを合成した。第１ストランドｃＤＮＡ合成のプライマーは、ランダム プライマー(ヘキサデオキシ−ヌクレオチド〔ｐｄ(Ｎ)₆〕Ｃａｔ ＃５０２０− １、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ)であった。二重鎖ｃＤＮＡを合 成し、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩアダプターをｃＤＮＡに付加し、未結 合のアダプターを除去し、アダプターと結合した二重鎖ｃＤＮＡを実施例Ｉ.Ｂ. １の記載と同様にアガロースゲルで分画した。１.８ｋｂよりも大きいｃＤＮＡ 画分をアガロースから溶出させ、λｇｔ１１に結合し、パッケージし、(実施例 Ｉ.Ｂ.１に記載のように)Ｙ１０８８の菌叢に平板培養 した。 ４.ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃４ ＩＭＲ３２細胞ポリ(Ａ⁺)ＲＮＡ(実施例Ｉ.Ａ.１)を鋳型として使用して一本 鎖ｃＤＮＡを合成した。第１ストランドｃＤＮＡ合成のプライマーは、α_1D(Ｖ ＤＣＣIII)タイプのα₁サブユニット(実施例II.Ａ参照)をコードする配列(配列 番号１のヌクレオチド２９２７−２９５６の相補的配列)に特異的なオリゴヌク レオチド８９−３６５ａ、α_1C(ＶＤＣＣII)タイプのα₁サブユニット(実施例II .Ｂ参照)をコードする配列(配列番号３のヌクレオチド８５２−８７３の相補的 配列)に特異的なオリゴヌクレオチド８９−４９５、α_1Cサブユニットをコード する配列に特異的なオリゴヌクレオチド９０−１２(配列番号３のヌクレオチド ２４９６−２５２０の相補的配列)であった。次に、１.８ｋｂでなく１.５ｋｂ を上回る大きさのｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出させる以外は上記(実施例 Ｉ.Ｂ.３)と同じ手順でｃＤＮＡライブラリーを構築した。 ５.ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃５ １.８ｋｂでなく１.２ｋｂを上回る大きさのｃＤＮＡ画分をアガロースから溶 出させる以外は上記(実施例Ｉ.Ｂ. ３)と同じ手順でｃＤＮＡライブラリーを構築した。 ６.ヒト視床ｃＤＮＡライブラリー＃６ ヒト視床ポリ(Ａ⁺)ＲＮＡ(実施例Ｉ.Ａ.２)を鋳型として使用して一本鎖ｃＤ ＮＡを合成した。第１ストランドの合成をプライムするためにオリゴ(ｄＴ)を使 用した(実施例Ｉ.Ｂ.１)。二重鎖ｃＤＮＡを合成し(実施例Ｉ.Ｂ.１)、配列： のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩアダプターを用い、上記(実施例Ｉ.Ｂ.１)の １８−ｍｅｒの代わりに２０−ｍｅｒ、２２−ｍｅｒの代わりに２４−ｍｅｒを 二重鎖ｃＤＮＡに結合した。ｃＤＮＡ−アダプター混合物を１ｍｌのＢｉｏ Ｇ ｅｌ Ａ−５０(Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, ＣＡ)カラムに通すことによって未結合のアダプターを除去した。画分(３０μｌ )を収集し、放射能の第１ピークに存在する１μｌの各画分を１％アガロースゲ ル電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを真空ゲルドライヤーで乾燥し、ｘ線フ ィルムに露光した。６００ｂｐよりも大きいｃＤＮＡフラグメントを含有する画 分をプールし、エタノール沈殿させ、λｇｔ１１に結合させた(実施例Ｉ.Ｂ.１) 。ｃＤＮＡライブラリーの構築を上記(実施例Ｉ.Ｂ.１)の手順で完了した。 Ｃ.ハイブリダイゼーション及び洗浄条件 ｃＤＮＡライブラリー、ＤＮＡサザン転移物またはノーザン転移物をスクリー ニングするために、定型化した方法で固定化ＤＮＡに対する放射性標識核酸のハ イブリダイゼーションを標準ハイブリダイゼーション条件下で実施した〔ハイブ リダイゼーション：５０％脱イオン化ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの音波処 理ニシン精子ＤＮＡ(Ｃａｔ ＃２２３６４５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ,Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ,ＩＮ)、５×Ｓ ＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、４２℃；洗浄：０.２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤ Ｓ、６５℃〕。ＳＳＰＥ及びＤｅｎｈａｒｄｔの配合比並びに脱イオン化ホルム アミドの調製は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｈａｐｔｅｒ ８に記載 されている。いくつかのハイブリダイゼー ションにおいては、標準ハイブリダイゼーション条件の５０％脱イオン化ホルム アミドを１０％の脱イオン化ホルムアミドに代えることによってより低い緊縮性 条件を使用した。 フィルターから非特異的プローブを除去する洗浄条件は以下に記載のような高 、中または低緊縮性条件を使用した。 (１)高緊縮性:０.１×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、６５℃ (２)中緊縮性:０.２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、５０℃ (３)低緊縮性:１.０×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、５０℃ 選択的バッファ、塩及び温度を用いて同様の緊縮性が得られることは理解され よう。実施例II ：ヒト神経カルシウムチャンネルα₁サブユニットをコードするＤＮＡ の単離 Ａ.α_1DサブユニットをコードするＤＮＡの単離 １.部分的α_1D ｃＤＮＡクローンの参照表 ５'及び３'の非翻訳配列の部分を加えた完全α_1Dコーディング配列を特性決定 するために、多数のα_1D特異的ｃＤＮＡクローンを単離した。配列番号１は、完 全α_1D ＤＮＡコーディング配列と、翻訳開始と推定されるアデニンヌクレオチ ドに隣接のグアニジンヌクレオチドで終結するα_1D ５'非翻訳配列の５１０ヌクレオチドと、３'非翻訳配列の６４２ヌクレオチドと を示す。配列番号１はまた、推定アミノ酸配列を示す。α_1D配列と配列番号１に 示された全長α_1D ｃＤＮＡ配列に対する各クローンのヌクレオチド位置とを特 性決定するために使用した部分的ｃＤＮＡクローンの表を以下に示す。これらの クローンの単離及びキャラクタリゼーションについては後述する(実施例II.Ａ. ２)。 ２.実施例II.Ａ.１に表示した個々のクローンの単離及びキャラクタリゼーショ ン ａ.ＩＭＲ３２ １.３６ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１(実施例Ｉ.Ｂ.１)の２×１０⁶の組換え 体を、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₁ ｃＤＮΛをコードする領域の放射 性標識フラグメントの混合物を用いて１５０ｍｍのプレートあたり約２００,０ ００プラークの密度でスクリーニングする重複試験を行った〔ウサギ骨格筋カル シウムチャンネルα₁サブユニットｃＤＮＡの配列に関してはＴａｎａｂｅら（ １９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３１３−３１８参照〕。 フラグメント ヌクレオチド ＫｐｎＩ-ＥｃｏＲＩ −７８-１００６ ＥｃｏＲＩ-ＸｈｏＩ １００６-２６５３ ＡｐａＩ-ＡｐａＩ ３０９３-４１８２ ＢｇｌII-ＳａｃＩ ４４８７-５３１０ 低緊縮性ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼ ーションを実施し、フィルターを低緊縮性条件下(実施例Ｉ.Ｃ)で洗浄した。ス クリーニングした２×１０⁶の組換え体のうちでα_1D特異的組換え体(ＩＭＲ３２ １.３６)が１つだけ同定された。ＩＭＲ３２ １.３６を標準方法でプラーク精 製し(Ｊ.Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｈａｐｔｅｒ ８)、ｐＧＥＭ３(Ｐｒｏｍ ｅｇａ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ)にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって 特性決定した。 ｂ.ＩＭＲ３２ １.８０ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃２(実施例Ｉ.Ｂ.２)の約１×１０⁶の組換 え体を、ＩＭＲ３２ １.３６ ｃＤＮＡフラグメント(実施例II.Ａ.１)をプロー ブとして用いて１５０ｍｍのプレートあたり約１００，０００プラークの密度で スクリーニングする重複試験を実施した。標準ハイブリダイゼーション条件を使 用し、フィルターを高緊縮性 条件下(実施例Ｉ.Ｃ)で洗浄した。３つの陽性プラークが同定され、その１つが ＩＭＲ３２ １.８０であった。ＩＭＲ３２ １.８０を標準方法によってプラーク 精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性 決定した。 ｃ.ＩＭＲ３２ １.１４４ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃３(実施例Ｉ.Ｂ.３)の約１×１０⁶の組換 え体をＩＭＲ３２ １.８０のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメント(配列番号１の ヌクレオチド２０８３−２５１８)でスクリーニングした。標準ハイブリダイゼ ーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮 性条件下で(実施例Ｉ.Ｃ)フィルターを洗浄した。３つの陽性プラークを同定し たが、その１つがＩＭＲ３２ １.１４４であった。ＩＭＲ３２ １.１４４をプラ ーク精製し、制限地図を作製し、ｃＤＮＡインサートをｐＧＥＭ７Ｚ(Ｐｒｏｍ ｅｇａ,Ｍａｄｉｏｓｎ,ＷＩ)にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって 特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、ＩＭＲ３２ １.１４４が ７つの開始可能メチオニン(配列番号１のヌクレオチド５１１−５３１)をコード する一連 のＡＴＧコドンを有することが判明した。核酸増幅分析及びこれらの７つのＡＴ Ｇコドンをコードするクローン化した核酸増幅分析産物のＤＮＡ配列決定によっ て、この配列がｄｂｃＡＭＰ誘発ＩＭＰ３２細胞中で発現されたα_1D転写物中に 存在することが確認された。 ｄ.ＩＭＲ３２ １.１３６ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃４(実施例Ｉ.Ｂ.４)の約１×１０⁶の組換 え体をＩＭＲ３２ １.８０(実施例II.Ａ.１)のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメン ト(配列番号１のヌクレオチド２０８３−２５１８)でスクリーニングした。標準 ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを 実施し、高緊縮性条件下(実施例Ｉ.Ｃ)でフィルターを洗浄した。６つの陽性プ ラークを同定したが、その１つがＩＭＲ３２ １.１３６であった。ＩＭＲ３２ １.１３６をプラーク精製し、制限地図を作製し、ｃＤＮＡインサートを標準プ ラスミドベクターｐＳＰ７２(Ｐｒｏｍｅｇａ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ)にサブクロ ーニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーショ ンによって、ＩＭＲ３２ １.１３６が不完全にスプライスされたα_1D転写物をコ ードしてい ることが判明した。クローンは約６４０ｂｐのイントロンに続く配列番号１のヌ クレオチド１６２７−２９８８を含む。このイントロンの前に、α_1Dサブユニッ トのＩＳ６トランスメンブランドメインをコードしている代替エキソンである１ ０４ヌクレオチドのエキソン(配列番号２)が存在し、このエキソンは完全にスプ ライスされたα_1D転写物を産生すべく配列番号１のヌクレオチド１６２７−１７ ３０に置換し得る〔ＩＳ１−IVＳ６トランスメンブラン用語の記述に関しては、 例えばＴａｎａｂｅら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３１３−３１８を参 照されたい〕。 ｅ.ＩＭＲ３２ １.１６３ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃３(実施例Ｉ.Ｂ.３)の約１×１０⁶の組換 え体を、ヌクレオチド５８１１−６４６８(配列番号１)を含むＩＭＲ３２ １.８ ０(実施例II.Ａ.１)のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩフラグメントでスクリーニングした。 標準ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼーショ ンを実施し、高緊縮性条件下(実施例Ｉ.Ｃ)でフィルターを洗浄した。３つの陽 性プラークを同定したが、その１つがＩＭＲ３２ １.１６３であった。ＩＭＲ３ ２ １.１６３をプラーク精製し、制限地 図を作製し、ｃＤＮＡインサートを標準プラスミドベクターｐＳＰ７２(Ｐｒｏ ｍｅｇａ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ)にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によっ て特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、ＩＭＲ３２ １.１６３ がα_1D末端コドン、ヌクレオチド６９９４−６９９６(配列番号１)を含むことが 判明した。 ３.全長α_1D ｃＤＮＡ〔ｐＶＤＣＣIII(Ａ)〕の構築 α_1D ｃＤＮＡクローンＩＭＲ３２ １.１４４、ＩＭＲ３２ １.１３６、ＩＭ Ｒ３２ １.８０及びＩＭＲ３２ １.１６３(実施例II.Ａ.２)はオーバーラップし ており、ヌクレオチド２９８４−３１３１(配列番号１)の１４８ｂｐの欠失以外 は全α_1Dをコードする配列であるヌクレオチド５１１−６９９３(配列番号１)を 含む。真核細胞発現ベクター中で全長α_1D ｃＤＮＡを作製するためにこれらの 部分的ｃＤＮＡクローン断片を結合した。得られたベクターをｐＶＤＣＣIII(Ａ )と呼ぶ。ｐＶＤＣＣIII(Ａ)の構築は以下に詳細に記載する４段階で行った。( １)ＩＭＲ３２ １.１４４、ＩＭＲ３２ １.１３６及びＩＭＲ３２ １.８０の断 片を用いるｐＶＤＣＣIII／５'の構築、(２)ｐＶＤＣＣIII／５'のＩＭＲ３２ １.８０部分の１４８ヌクレオチドの 欠失を修正するｐＶＤＣＣIII／５'.３の構築、(３)ＩＭＲ３２ １.８０部分及 びＩＭＲ３２ １.１６３部分を用いるｐＶＤＣＣIII／３'.１の構築、及び、(４ )ｐＶＤＣＣIII／５'.３インサートの一部分とｐＶＤＣＣIII／３'.１のインサ ートとｐｃＤＮＡ１(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ,ＣＡ)との結合 によるｐＶＤＣＣIII(Ａ)の形成。ベクターｐｃＤＮＡ１は、哺乳類宿主細胞Ｒ ＮＡポリメラーゼIIによって認識される構成的プロモーターであるサイトメガロ ウイルス(ＣＭＶ)プロモーターを含有する真核細胞発現ベクターである。 全長構築物の調製に使用したＤＮＡフラグメントの各々を、ＤＥ８１フィルタ ーペーパー(Ｗｈａｔｍａｎ,Ｃｌｉｆｔｏｎ,ＮＪ)に対するアガロースゲル電気 泳動及び１.０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴＲＩＳ,ｐＨ８.０、１ｍＭのＥＤＴ Ａを用いるフィルターペーパーからの溶出によって精製した。典型的には、１０ μｌの反応容量中に等モル比のインサートフラグメントをベクターに対して２倍 のモル過剰量のインサート総量で用いて結合させた。ＤＮＡの使用量は通常は約 ５０ｎｇ〜１００ｎｇであった。 ａ.ｐＶＤＣＣIII／５' ｐＶＤＣＣIII／５'を構築するために、ＩＭＲ３２ １.１４４(実施例II.Ａ. ２.ｃ)をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ベクター(ｐＧＥＭ７Ｚ)、α_1Dのヌ クレオチド１−５１０(配列番号１)及びα_1Dのヌクレオチド５１１−１７３２( 配列番号１)を含有するフラグメントをゲル電気泳動によって単離した。ＩＭＲ ３２ １.１３６(実施例II.Ａ.２.ｄ)のヌクレオチド１７３３−２６７１(配列番 号１)のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントを単離し、ＩＭＲ３２ １.８０(実施 例II.Ａ.２.ｂ)のヌクレオチド２６７２−４４９２(配列番号１)のＡｐａＩ−Ｈ ｉｎｄIIIフラグメントを単離した。３つのＤＮＡクローンを結合させて、ヌク レオチド１−５１０(配列番号１の５'非翻訳配列)とヌクレオチド５１１−４４ ９２(配列番号１)とを含有するｐＶＤＣＣIII／５'を形成した。 ｂ.ｐＶＤＣＣIII／５'.３ ＩＭＲ３２ １.３６及びＩＭＲ３２ １.８０のＤＮＡ配列の比較から、これら の２つのｃＤＮＡクローンはヌクレオチド２９８４−３２１２のα_1Dコーディン グ配列が違うことが判明した。ＩＭＲ３２ １.８０及びｄｂｃＡＭＰ誘発(１.０ ｍＭ、１０日間)ＩＭＲ３２細胞質ＲＮＡ(Ａｕｓ ｕｂｅｌ,Ｆ.Ｍ.ら(Ｅｄｓ)（１９８８）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ ｎｓ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従って単離)の核酸増幅分析によれば、ＩＭＲ３２ １. ８０がヌクレオチド２９８４−３１３１(配列番号１)の１４８ヌクレオチドの欠 失を有し、ＩＭＲ３２ １.３６がヌクレオチド３０８１−３２１２の１３２ヌク レオチドの欠失を有することが判明した。核酸増幅分析を行うために、増幅反応 をα_1D特異的オリゴヌクレオチド１１２(配列番号１のヌクレオチド２５４８− ２５７２)及び３１１(配列番号１のヌクレオチド３９２８−３９５７の相補的配 列)によってプライムした。次に、これらの産物をα_1D特異的オリゴヌクレオチ ド３１０(配列番号１のヌクレオチド２５８３−２６０８)及び３１２(ヌクレオ チド３８８３−３９０９の相補的配列)を用いて再増幅した。ＡｃｃＩ及びＢｇ ｌII制限部位を含むこの再増幅産物をＡｃｃＩ及びＢｇｌIIによって消化し、ヌ クレオチド２７６５−３８９０(配列番号１)のＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメント を、ＡｃｃＩ−ＢｇｌII消化したｐＶＤＣＣIII／５'にクローニングして、欠失 を有するＡｃｃＩ−ＢｇｌII ｐＶＤＣ ＣIII／５'フラグメントに置換した。この新しい構築物をｐＶＤＣＣIII／５'. ３と命名した。ｐＶＤＣＣIII／５'.３の増幅領域の配列決定によれば、ＩＭＲ ３２ １.８０中の１４８ヌクレオチドの欠失が確認された。 ｃ.ｐＶＤＣＣIII／３'.１ ｐＶＤＣＣIII／３'.１を構築するために、ＩＭＲ３２ １.１６３(実施例II. Ａ.２.ｅ)のｃＤＮＡインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII(Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,ＣＡ)にＸｈｏＩフラグメントとしてサブクローニングし た。ｃＤＮＡフラグメントのＸｈｏＩ部位に、ｃＤＮＡライブラリーの構築に使 用したアダプター(実施例Ｉ.Ｂ.３)を付加した。得られたプラスミドの制限酵素 消化物の分析によって確認すると、インサートは、ＩＭＲ３２ １.１６３のイン サートの翻訳方向がプラスミド中に存在するｌａｃＺ遺伝子の方向の逆になるよ うに配向されていた。その理由は、このプラスミドによって形質転換されたＤＨ ５α細胞中でｌａｃＺ遺伝子との融合によってα_1D配列の発現の可能性が生じる ことを防止するためである。次に、このプラスミドをＨｉｎｄIII及びＢｇｌII によって消化し、ＨｉｎｄIII−ＢｇｌIIフラグメント(ＨｉｎｄIII 部位はベクターに由来し、ＢｇｌII部位は配列番号１のヌクレオチド６２２０に ある)を除去し、このようにしてＩＭＲ３２ １.１６３クローンのヌクレオチド ５２００−６２２０(配列番号１)を欠失させ、ヌクレオチド６２２１−７６３５ (配列番号１)にあたる３'のＢｇｌII−ＸｈｏＩフラグメントを含むプラスミド の残部からこの配列を除去する。次に、ＩＭＲ３２ １.８０からのＨｉｎｄIII −ＰｖｕIIフラグメント(配列番号１のヌクレオチド４４９３−５２９６)と、Ｉ ＭＲ３２ １.１６３からのＰｖｕII−ＢｇｌIIフラグメント(配列番号１のヌク レオチド５２９４−６２２０)と、ＩＭＲ３２ １.１６３の３'のＢｇｌII／Ｘｈ ｏＩフラグメント(配列番号１のヌクレオチド６２２１−７６３５)を含むＨｉｎ ｄIII−ＢｇｌII消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドとを一緒にスプラ イシングすることによってｐＶＤＣＣIII／３'.１を作製した。 ｄ.ｐＶＤＣＣIII(Ａ)：全長α_1D構築物 ｐＶＤＣＣIII(Ａ)を構築するためにｐＶＤＣＣIII／５'.３(実施例II.Ａ.３. ｂ)のＤｒａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント(配列番号１のヌクレオチド３３０− ５１０の５'非翻訳配列及び配列番号１のヌクレオチド５１１−４４９２の コーディング配列)を単離した。ｐＶＤＣＣIII／３'.１のＨｉｎｄIII−Ｘｈｏ Ｉフラグメント(配列番号１のヌクレオチド４４９３−７６３５とアダプターの ＸｈｏＩ部位とを含む)(実施例II.Ａ.３.ｃ)を単離した。プラスミドベクターｐ ｃＤＮＡ１をＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩによって消化し、アガロースゲルで単離し た。３つのＤＮＡフラグメントを結合し、ＭＣ１０６１−Ｐ３(Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎ,Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ,ＣＡ)を形質転換した。単離クローンを制限マッピン グ及びＤＮＡ配列決定によって分析し、互いに正確に結合したＤｒａＩ−Ｈｉｎ ｄIII、ＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを含み、平 滑末端ＤｒａＩ及びＥｃｏＲＶ部位が一緒に結合して環状プラスミドを形成した ｐＶＤＣＣIII(Ａ)を同定した。 α_1Dサブユニットのアミノ末端は連続する７つの５'メチオニンコドン(配列番 号１のヌクレオチド５１１−５３１)によってコードされている。この５'部分と ２つのリシン残基をコードするヌクレオチド５３２−５３７とがｐＶＤＣＣIII( Ａ)から欠失し、有効なリボソーム結合部位(５'−ＡＣＣＡＣＣ−３')によって 置換されてｐＶＤＣＣIII.ＲＢＳ(Ａ)を形成していた。この構築物の転写物をア フリ カツメガエル卵母細胞に注入した発現実験では、組換え電圧依存性カルシウムチ ャンネル発現レベルがｐＶＤＣＣIII(Ａ)の転写物を注入した卵母細胞の発現レ ベルに比べて向上していなかった。 Ｂ.α_1CサブユニットをコードするＤＮＡの単離 １.部分的α_1C ｃＤＮＡクローンの参照表 α_1Cコーディング配列、α_1C翻訳開始及びα_1Cの代替スプライス領域を特性決 定するために多数のα_1C特異的ｃＤＮＡクローンを単離した。配列番号３は１つ のα_1Cコーディング配列(α_1C-1)と推定アミノ酸配列とを示す。配列番号３６は α_1C-2と命名した別のスプライス変異体を示す。配列番号４及び５は、α_1Cスプ ライス変異体の可能な２つのアミノ末端をコードしている。配列番号６はIV Ｓ ３トランスメンブランドメインの代替エキソンをコードしている。他のα_1C変異 体は配列番号３または３６の末端に代えて代替アミノ末端を選択し、及び／また は、ヌクレオチド３９０４−３９８７に代えて例えば配列番号３の適当な位置に 代替エキソン(配列番号６)を挿入することによって構築され得る。更に、別のα_1C スプライス変異体を産生するために、７５ヌクレオチドの配列(配列番号３の ヌクレオチド１３９１−１４６５)を欠失または挿入し得る。 α_1C配列を特性決定するために使用したクローンと、特性決定したα_1C配列( 配列番号３)に対する各クローンのヌクレオチド位置とを以下の表に示す。これ らのｃＤＮＡク ローンの単離及びキャラクタリゼーションに関しては後述する(実施例II.Ｂ.２) 。 ２.実施例II.Ｂ.１に記載のクローンの単離及びキャラクタリゼーション ａ.ＣＮＳ１.３０ ヒト視床ｃＤＮＡライブラリーＮｏ.６(実施例Ｉ.Ｂ.６)の約１×１０⁶の組換 え体を、実施例II.Ａ.２.ａに記載のウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₁ ｃ ＤＮＡのフラグメントによってスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーショ ン条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下( 実施例Ｉ.Ｃ)でフィルターを洗浄した。６つの陽性プラークを同定し、その１つ がＣＮＳ１.３０であつた。ＣＮＳ１.３０をプラーク精製し、制限地図を作製し 、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＣＮＳ１.３０ は、ヌクレオチド２１９９−３９０３(配列番号３)のα_1C特異的配列と、その直 後に続く２つの同定された代替α_1Cエキソン(配列番号６)の一方のヌクレオチド １−８４とをコードしている。配列番号６の３'のＣＮＳ１.３０はイントロンを 含み、従って、ＣＮＳ１.３０は部分的にスプライスされたα_1C転写物をコード している。 ｂ.１.１６Ｇ ウサギ骨格筋ｃＤＮＡフラグメント(ヌクレオチド−７８〜１００６、実施例I I.Ａ.２.ａ)を用いてλＥＭＢＬ３に基づくヒトゲノムＤＮＡライブラリー(Ｃａ ｔ＃ＨＬ１００６ｄ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ.,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ)の 約１×１０⁶の組換え体をスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条 件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下(実施 例Ｉ.Ｃ)でフィルターを洗浄した。１４の陽性プラークを同定し、その１つが１ .１６Ｇであつた。クローン１.１６Ｇをプラーク精製し、制限地図を作製し、サ ブクローニングし、部分をＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＤＮＡ配列決 定から、１.１６Ｇが実施例II.Ｂ.１に記載のようなα_1C特異的配列をコードし ていることが判明した。 ｃ.ＩＭＲ３２ １.６６及びＩＭＲ３２ １.６７ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃５(実施例Ｉ.Ｂ.５)の約１×１０⁶の組換 え体を、α_1C配列(配列番号３のヌクレオチド７５８−８６７)をコードしている １.１６Ｇ(実施例II.Ｂ.２.ｂ)の１５１ｂｐのＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメント でスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用い てハイブリダイゼーションを 行った。次に、フィルターを６５℃の０.５×ＳＳＰＥで洗浄した。陽性プラー クのうちで、ＩＭＲ３２ １.６６及びＩＭＲ３２ １.６７を同定した。ハイブリ ダイズするプラークを精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、ＤＮＡ 配列決定によって特性決定した。これらのｃＤＮＡクローンの２つ、ＩＭＲ３２ １.６６及び１.６７は、記載したような(実施例II.Ｂ.１)α_1Cサブユニットを コードしている。更に、ＩＭＲ３２ １.６６は９１６ヌクレオチド(配列番号３) の３'のヌクレオチドで始まるＧＴスプライスドナージヌクレオチドによってマ ークされる部分的にスプライスされたα_1C転写物をコードしている。１.６６の 内部のイントロン配列は１０１ヌクレオチドの長さである。ＩＭＲ３２ １.６６ はヌクレオチド１−３(配列番号３)のα_1C翻訳開始をコードしており、５'非翻 訳配列の１３２ヌクレオチド(配列番号４)がＩＭＲ３２ １.６６の開始コドンに 先行して存在する。 ｄ.ＩＭＲ３２ １.３７及びＩＭＲ３２ １.３８ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１(実施例Ｉ.Ｂ.１)の約２×１０⁶の組換 え体をＣＮＳ １.３０ ｃＤＮＡフラグメント(実施例II.Ｂ.２.ａ)によってスク リーニングし た。低緊縮性ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイ ゼーションを行い、低緊縮性条件下(実施例Ｉ.Ｃ)でフィルターを洗浄した。４ つの陽性プラークを同定し、プラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニ ングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。２つのクローンＩＭＲ３２ １. ３７及びＩＭＲ３２ １.３８は実施例II.Ｂ.１に記載のようなα_1C特異的配列を コードしている。 ＩＭＲ３２ １.３７とＩＭＲ３２ １.３８とのＤＮＡ配列比較から、α_1C転写 物がＩＶＳ３トランスメンブランドメインをコードする２つのエキソンを含むこ とが判明した。ＩＭＲ３２ １.３７はヌクレオチド３９０４−３９８７(配列番 号３)の単一エキソンを有しており、ＩＭＲ３２ １.３８はヌクレオチド３９０ ４−３９８７(配列番号３)とそれに続くヌクレオチド１−８４(配列番号６)とか ら成る２つの並列エキソンを含むように変則的にスプライスされていると考えら れる。ＩＶＳ３領域をコードする２つのエキソンのいずれかを含むようなα_1C転 写物の代替スプライスは、ＣＮＳ１.３０配列とＩＭＲ３２ １.３７配列との比 較によって確認された。ＣＮＳ１.３０は、ＩＭＲ３ ２ １.３７のヌクレオチド２１９９−３９０３(配列番号３)と同じ配列に先行さ れたヌクレオチド１−８４(配列番号６)を含んでいる。実施例II.Ｂ.２.ａに記 載されているように、ヌクレオチド１−８４(配列番号６)の後にイントロンが続 いている。２つの代替エキソンは、ＣＮＳ１.３０及びＩＭＲ３２ １.３７によ って示されるヌクレオチド３９０３(配列番号３)に隣接してスプライスされてい る。 ｅ.ＩＭＲ３２ １.８６ オリゴヌクレオチドプローブ９０−９(配列番号３のヌクレオチド１４６２− １４９１)及び９０−１２(配列番号３のヌクレオチド２４９６−２５２０)を用 いた重複試験によってＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１(実施例Ｉ.Ｂ.１) をスクリーニングした。ＩＭＲ３２ １.６７の３'端(配列番号３のヌクレオチド １７１７)とＣＮＳ１.３０の５'端(配列番号３のヌクレオチド２１９９)との間 のα_1Cサブユニットをコードするクローンを単離するためにこれらのオリゴヌク レオチドプローブを選択した。ハイブリダイゼーション条件は、５０％脱イオン 化ホルムアルデヒドを２０％に減らした以外は標準ハイブリダイゼーション条件 (実施例Ｉ.Ｃ)であった。フィルターを低緊縮性条件 下(実施例Ｉ.Ｃ)で洗浄した。３つの陽性プラークを同定し、その１つがＩＭＲ ３２ １.８６であった。ＩＭＲ３２ １.８６をプラーク精製し、サブクローニン グし、制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＩＭＲ３２ １.８６は実施例II.Ｂ.１に記載したようなα_1C配列をコードしている。ＤＮＡ 配列決定によるキャラクタリゼーションから、ＩＭＲ３２ １.８６がウサギ心筋 カルシウムチャンネルα₁サブユニットをコードするＤＮＡに比較してヌクレオ チド２１９１−２２６３の７３ヌクレオチドの欠失を含むことが判明した〔Ｍｉ ｋａｍｉら,(１９８９)Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２３０〕。これらの欠失ヌクレオ チドは配列番号３のヌクレオチド２１７６−２２４８に対応する。ＣＮＳ１.３ ０の５'端はＩＭＲ３２ １.８６の３'端にオーバーラップするので、これらの欠 失ヌクレオチドのいくつか、即ち配列番号２２０５−２２４８はＣＮＳ１.３０ によって占められている。ＩＭＲ３２ １.８６中の７３ヌクレオチドの欠失のう ちの残りの欠失ヌクレオチド(即ち配列番号３のヌクレオチド２１７６−２２０ ４)は、ｄｂｃＡＭＰ誘発ＩＭＲ３２細胞ＲＮＡの核酸増幅分析によって決定さ れた。７３ヌクレオチドの欠失は、フレーム シフト突然変異であり、従って、修正される必要はない。この領域の正確なヒト 配列(ＣＮＳ１.３０のＤＮＡ配列及びＩＭＲ３２細胞ＲＮＡの核酸増幅分析によ って決定)を標準方法、例えば制限フラグメント置換または部位特異的突然変異 誘発によってＩＭＲ３２ １.８６に挿入し得る。 ｆ.ＩＭＲ３２ １.１５７ ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃４(実施例Ｉ.Ｂ.４)の１×１０⁶の組換え 体を、α_1Cのヌクレオチド５０−７７４(配列番号３)をコードするＩＭＲ３２ １.６７のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントによってスクリーニングした。標 準ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてハイブリダイゼーション を実施した。低緊縮性条件下(実施例Ｉ.Ｃ)でフィルターを洗浄した。陽性プラ ークの１つがＩＭＲ３２ １.１５７であると同定された。このプラークを精製し 、インサートの制限地図を作製し、標準プラスミドベクターｐＧＥＭ７Ｚ(Ｐｒ ｏｍｅｇａ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ)にサブクローニングした。配列決定によって ＤＮＡを特性決定した。ＩＭＲ３２ １.１５７は、ヌクレオチド１−８９(配列 番号５)で始まりヌクレオチド１−８７３(配列番号３)が後続したα_1C配列の代 替５'部分をコ ードすると考えられる。１.６６及び１.１５７の５'配列の分析を以下に示す(実 施例II.Ｂ.３)。 ３.α_1C翻訳開始部位のキャラクタリゼーション ＩＭＲ３２ １.１５７(配列番号５のヌクレオチド５７−８９、配列番号３の ヌクレオチド１−６７)及びＩＭＲ３２ １.６６(配列番号４のヌクレオチド１０ ０−１３２、配列番号３のヌクレオチド１−６７)の配列の部分をウサギ肺Ｃａ ＣＢレセプターｃＤＮＡ配列、ヌクレオチド−３３−６７〔Ｂｉｅｌら,(１９９ ０)ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.２６９：４０９〕と比較した。ヒト配列は翻訳開始領域 をコードするα_1C転写物の可能な代替５'端である。ＩＭＲ３２ １.６６は、Ｃ ａＣＢレセプターｃＤＮＡ配列に緊密に整合し、ＣａＣＢレセプターｃＤＮＡ配 列からヌクレオチド１１２(配列番号４)で始まる５'方向に分岐する。ＣａＣＢ レセプターｃＤＮＡ配列中で同定された開始コドンはα_1Cコーディング配列を記 述するために使用したヌクレオチド１−３(配列番号３)の開始コドンと同じであ る。 α_1C-1及びα_1C-2と命名したα_1Cスプライス変異体の配列を配列番号３及び３ ６に示す。 Ｃ.α_1Bサブユニットをコードする部分的ｃＤＮＡクロー ンの単離及び全長クローンの構築 ヒト脳幹神経節ｃＤＮＡライブラリーを、ウサギ骨格筋α₁サブユニットｃＤ ＮＡフラグメント(フラグメントの記述に関しては実施例II.Ａ.２参照)によって 低緊縮性条件下にスクリーニングした。ＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーを スクリーニングするためにハイブリダイズするクローンの１つを使用し、追加の 部分的α_1B ｃＤＮＡクローンを作製し、次にこれを使用してＩＭＲ３２細胞ｃ ＤＮＡライブラリーを更にスクリーニングして追加の部分的ｃＤＮＡクローンを 作製した。部分的ＩＭＲ３２ α_1Bクローンの１つをヒト海馬ライブラリーのス クリーニングに使用してα_1Bコーディング配列の３'端をコードする部分的α_1B クローンを作製した。ｃＤＮＡ配列の正確度を決定するために部分的ｃＤＮＡク ローンの領域のいくつかの配列をＩＭＲ３２細胞ＲＮＡの核酸増幅分析産物の配 列に比較した。 α_1BサブユニットをコードするＤＮＡの終結コドンの５'及び３'に位置する配 列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＩＭＲ３２細胞ＲＮＡとゲ ノムＤＮＡとの核酸増幅分析から、ＩＭＲ２細胞中の代替的にスプライ スされたα_1BをコードするｍＲＮＡが判明した。この第２のｍＲＮＡ産物は、最 初に単離した他の３' α_1B ｃＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ中に存在しない別 のエキソンを含むようにα_1Bサブユニット転写物をディファレンシャルスプライ シングした結果として得られる。α_1Bサブユニットのこれらのスプライス変異体 を識別するために、追加のエキソンを含む形態に対応するＤＮＡ配列によってコ ードされたサブユニットをα_1B-1(配列番号７)と呼ぶ。他方、追加のエキソンが 欠失した形態に対応するＤＮＡ配列によってコードされたサブユニットをα_1B-2 (配列番号８)と呼ぶ。α_1B-1の配列は、ヌクレオチド６６３３(配列番号７)で始 まるα_1B-2の配列から分岐する。α_1B-1中の追加エキソンの配列(配列番号７の ヌクレオチド６６３３−６８１９)の後のα_1B-1及びα_1B-2の配列は等しい(即ち 、配列番号７のヌクレオチド６８２０−７３６２及び配列番号８のヌクレオチド ６６３３−７１７５)。配列番号７及び８は、α_1B-1をコードするＤＮＡの５'非 翻訳配列の１４３ヌクレオチド(ヌクレオチド１−１４３)と３'非翻訳配列の２ ０２ヌクレオチド(配列番号７のヌクレオチド７１６１−７３６２)及びα_1B-2を コードするＤＮＡの３'非翻訳配列の３ ２１ヌクレオチド(配列番号８のヌクレオチド６８５５−７１７５)を示す。 α_1B転写物のＩＳ６領域の核酸増幅分析から、増幅反応の産物を含む臭化エチ ジウム染色アガロースゲルで観察された多様なフラグメントの大きさに基づく追 加のスプライス変異体が存在するらしいことが判明した。 ｐｃＤＮＡ−α_1B-1と命名した全長α_1B-1 ｃＤＮＡクローンを以下の８段階 プロセスで調製した。 段階１：ｐＧＥＭ３(Ｐｒｏｍｅｇａ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＷＩ)のＳａｃＩ制限部位 をＳａｃＩ部位で消化することによって破壊し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処 理することによって平滑端を作製し、再結合させた。新しいベクターをｐＧＥＭ ΔＳａｃと命名した。 段階２：フラグメント１(ＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩ；配列番号７のヌクレオチド２ ３３７−４３０３)をＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩ消化したｐＧＥＭ３ΔＳａｃに結合 してｐα１.１７７ＨＫを産生した。 段階３：フラグメント１は２つのヌクレオチド欠失(配列番号７のヌクレオチド ３８５２及び３８５３)を有している。ＩＭＲ３２ ＲＮＡの増幅フラグメント( フラグメント ２)をｐα１.１７７ＨＫに挿入することによって欠失を修復した。従って、フラ グメント２(ＮａｒＩ／ＫｐｎＩ；配列番号７のヌクレオチド３８２８−４３０ ３)をＮａｒＩ／ＫｐｎＩ消化したｐα１.１７７ＨＫに挿入してフラグメント１ のＮａｒＩ／ＫｐｎＩ部分に置換させ、ｐα１.１７７ＨＫ／ＰＣＲを作製した 。 段階４：フラグメント３(ＫｐｎＩ／ＫｐｎＩ；配列番号７のヌクレオチド４３ ０３−５６６３)をＫｐｎＩ消化したｐα１.１７７ＨＫ／ＰＣＲに結合してｐα １Ｂ５'Ｋを作製した。 段階５：フラグメント４(ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII；ＥｃｏＲＩアダプターと配 列番号７のヌクレオチド１−２３３７との連続)及びフラグメント５(ｐα１Ｂ５ 'ＫのＨｉｎｄIII／ＸｈｏＩフラグメント；配列番号７のヌクレオチド２３３７ −５４４６)をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化したｐｃＤＮＡＩ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ ｎ,Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ,ＣＡ)に結合してｐα１Ｂ５'を作製した。 段階６：フラグメント６(ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ；両端にＥｃｏＲＩアダプタ ーと配列番号７のヌクレオチド５７４９−７３６２とが付加されている)を、Ｅ ｃｏＲＩ消化 したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,Ｃ Ａ)に、フラグメントの５'端をポリリンカー中のＫｐｎＩ部位に近接させて結合 して、ｐα１.２３０を作製した。 段階７：フラグメント７(ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ；配列番号７のヌクレオチド４３ ０３−５４４６)及びフラグメント８(ＸｈｏＩ／ＣｓｐＩ；配列番号７のヌクレ オチド５４４６−６２５９)を、ＫｐｎＩ／ＣｓｐＩ消化したｐα１.２３０に結 合して(ｐα１.２３０にコードされた配列番号７のヌクレオチド５７４９−６２ ５９を除去し、配列番号７のヌクレオチド６２５９−７３６２を維持する)、ｐ α１Ｂ３'を作製する。 段階８：フラグメント９(ＳｐｈＩ／ＸｈｏＩ；配列番号７のヌクレオチド４９ ９３−５４４６)及びフラグメント１０(ｐα１Ｂ３'のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ；配 列番号７のヌクレオチド５４４６−７３１９)を、ＳｐｈＩ／ＸｂａＩ消化した ｐαＢ５'に結合して(ｐα１Ｂ５'にコードされた配列番号７のヌクレオチド４ ９９３−５４４６を除去し、配列番号７のヌクレオチド１−４８５０を維持する )、ｐｃＤＮＡα_1B-1を作製する。 得られた構築物ｐｃＤＮＡα_1B-1はｐＣＤＮＡ１中に、５'非翻訳配列(配列番 号７のヌクレオチド１−１４３)及び３'非翻訳配列(配列番号７のヌクレオチド ７１６１−７３１９)を付加したα_1B-1をコードする全長コーディング領域(配列 番号７のヌクレオチド１４４−７３６２)を、ＣＭＶプロモーターの転写調節下 で含んでいる。 Ｄ.ヒトカルシウムチャンネルα_1AサブユニットをコードするＤＮＡの単離 １.部分的クローンの単離 ヒトカルシウムチャンネルα_1Aサブユニットの部分をコードするＤＮＡクロー ンは、ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング 及びヒト小脳ＲＮＡの核酸増幅によって得られた。ランダムにプライムした小脳 ｃＤＮＡライブラリー(長さ２.８ｋｂよりも大きいインサートに関しては大きさ 選択)の１×１０⁶の組換え体を、低緊縮性条件下(６×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈ ａｒｔ溶液、０.２％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの音波処理したニシン精子Ｄ ＮＡ、４２℃)で、ラットα_1Aコーディング配列のヌクレオチド６１９０−６２ １７を含むオリゴヌクレオチド７０４でスクリーニングすることによって、 α_1Aコーディング配列の３'端に対応するクローンを単離した〔Ｓｔａｒｒら,( １９９２)Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.Ｕ.Ｓ.Ａ．８８：５６２１−５ ６２５〕。低緊縮性条件下で洗浄した。プローブにハイブリダイズした複数のク ローン(クローンα１.２５１−α１.２５９及びα１.２４４)を精製し、制限酵 素マッピング及びＤＮＡ配列分析によって特性決定した。少なくとも２つのクロ ーンα１.２４４及びα１.２５４は翻訳終結コドンを含んでいた。クローンα１ .２４４とα１.２５４とは異なる長さを有しているが、双方がα_1A転写物の末端 の極限の３'端に対応するヌクレオチドの配列を含む。即ち、２つのクローンは オーバーラップしている。これらの２つのクローンは、クローンα１.２４４が α１.２５４に存在しない５ヌクレオチドの配列と１２ヌクレオチドの配列とを 含む以外はオーバーラップ領域で等しい。 追加のα_1Aをコードするクローンを得るために、ランダムにプライムした小脳 ｃＤＮＡライブラリーの１×１０⁶組換え体(長さ１.０−２.８ｋｂの範囲のイン サートに関して大きさで選択)を、３つのオリゴヌクレオチド、即ちオリゴヌク レオチド７０１(ラットα_1Aコーディング配列 のヌクレオチド２２８８−２３１５を含む)、オリゴヌクレオチド７０２(ラット α_1Aコーディング配列のヌクレオチド３５５９−３５８５を含む)、及び、オリ ゴヌクレオチド７０３(ラットα_1Aコーディング配列のヌクレオチド４７９８− ４８２７を含む)に対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングし た。洗浄を４５℃で行う以外は最初のオリゴヌクレオチド７０４のスクリーニン グに使用した条件と同じ条件を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行った 。２０のクローン(クローンα１.２６９−α１.２８８)がプローブにハイブリダ イズした。数個のクローンをプラーク精製し、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配 列分析によって特性決定した。１つのクローンα１.２７９はコーディング配列 の同じ領域に対応する他のクローンに存在しない約１７０のヌクレオチドの配列 を含んでいた。この領域は他のスプライス変異体中に存在するかもしれない。ど のクローンも翻訳開始コドンを含んでいなかった。 ヒトα_1Aコーディング配列の５'端に対応するクローンを得るために、第１鎖 のｃＤＮＡ合成を特異的にプライムするオリゴヌクレオチド７２０(配列番号２ ２のヌクレオ チド２４８５−２５１０を含む)を用いて別の小脳ｃＤＮＡライブラリーを調製 した。ライブラリー(８×１０⁵組換え体)を、３つのオリゴヌクレオチド、即ち オリゴヌクレオチド７０１、オリゴヌクレオチド７２６(ラットα_1Aコーディン グ配列のヌクレオチド２３３３−２３６０を含む)、及び、オリゴヌクレオチド ７００(ラットα_1Aコーディング配列のヌクレオチド７６７−７９６を含む)に対 する低緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件に基づいてスクリーニング した。約５０のプラークがプローブにハイブリダイズした。ハイブリダイズする クローンα１.３８１−α１.３９０をプラーク精製し、制限酵素マッピング及び ＤＮＡ配列分析によって特性決定した。少なくとも１つのクローンα１.３８１ は翻訳開始コドンを含んでいた。 精製クローンの配列を位置合わせすると、配列が完全α_1Aコーディング配列を 含むようにオーバーラップすることが判明した。しかしながら、部分クローンの オーバーラップ配列は、全長α_1Aコーディング配列を構築するための部分クロー ンの結合に使用される適当な酵素制限部位を必ずしも含んではいなかった。全長 α_1AＤＮＡを構築すると きに使用される適当な制限酵素部位を含むＤＮＡフラグメントを得るために、ヒ ト小脳組織から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、核酸増幅処理した。プラ イマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、選択された制限酵素部位の５'及 び３'に位置するヒトα_1Aコーディング配列に対応した。従って、最初の増幅反 応では、オリゴヌクレオチド７５３(配列番号２２のヌクレオチド２３６８−２ ３９１を含む)及び７２８(配列番号２２のヌクレオチド３１７９−３２０２を含 む)をプライマー対として使用した。所望のＤＮＡフラグメントを十分な量で提 供するために、この増幅の産物を、オリゴヌクレオチド７５３及び７５４(配列 番号２２のヌクレオチド３１１２−３１３５を含む)をプライマー対として用い て再増幅した。得られた産物は長さ７６８ｂｐであった。第２の増幅反応では、 オリゴヌクレオチド７１９(配列番号２２のヌクレオチド４９５０−４９７５を 含む)及び７５２(配列番号２２のヌクレオチド５６４７−５６７０を含む)をプ ライマー対として使用した。所望の第２のＤＮＡフラグメントを十分な量で提供 するために、この増幅の産物を、オリゴヌクレオチド７５６(配列番号２２のヌ クレオチド５１１２−５１３５を含む) 及び７５２をプライマー対として用いて再増幅した。得られた産物は長さ５５９ ｂｐであった。 ２.全長α_1Aコーディング配列の構築 クローンα１.３８１と、７６８ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１.２７８ と、５５９ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１.２４４とを、適当な制限部位 で結合して、全長α_1Aコーディング配列を作製し、α_1A-1と命名した。 クローンα１.２４４とα１.２５４との配列分析の結果を比較すると、α_1Aサ ブユニット遺伝子の一次転写物が代替的にスプライスされて、α_1Aサブユニット の異なる形態をコードする少なくとも２つの変異体ｍＲＮＡを生じることが判明 した。１つの形態α_1A-1は配列番号２２に示す配列によってコードされている。 第２の形態α_1A-2をコードする配列は、３'端がクローンα１.２４４に見出され る５ヌクレオチド(配列番号２２のヌクレオチド７０３５−７０３９)が欠失して いる点でα_1A-1をコードする配列と違っている。この欠失は読み取り枠をシフト させ、翻訳終結コドンを導入し、その結果として、α_1A-1スプライス変異体によ ってコードされるサブユニットよりも短いα_1Aサブユニットをコードするα_1A-2 コーディング配列となる。従っ て、α_1A-1コーディング配列の３'端の一部分は実際はα_1A-2ＤＮＡ中の３'非翻 訳配列である。クローンα１.３８１と、７６８ｂｐの核酸増幅産物と、クロー ンα１.２７８と、５５９ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１.２５４とを結合 することによって構築され得るα_1A-2の完全配列を配列番号２３に示す。 Ｅ.α_1EサブユニットをコードするＤＮＡの単離 ヒトカルシウムチャンネルのα_1EサブユニットをコードするＤＮＡをヒト海馬 ライブラリーから単離した。選択されたクローンを配列決定した。α_1Eサブユニ ットをコードするＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、同じα_1Eサブユニット一 次転写物の少なくとも２つの代替スプライス形態が発現されることを示した。１ つの形態は配列番号２４に示す配列を有しており、α_1E-1と命名し、他の形態は 配列番号２４のヌクレオチド２４０５と２４０６との間に５７塩基対のフラグメ ントを挿入することによって得られる配列を有しており、α_1E-3と命名した。得 られた配列を配列番号２５に示す。 α_1E-1と命名されたサブユニットは計算分子量２５４,８３６を有しており、 α_1E-3と命名されたサブユニットは 計算分子量２５７,３４８を有している。α_1E-3はα_1E-1に比べて、トランスメ ンブランドメインIIＳ６とIIIＳ１との間の細胞質ループであると考えられる領 域に１９アミノ酸の挿入(配列番号２５によってコードされている)を有している 。実施例III ：ヒト神経カルシウムチャンネルβ₁サブユニットをコードするｃＤＮ Ａクローンの単離 Ａ.βサブユニットをコードする部分的ｃＤＮＡクローンの単離及びβ₁サブユニ ットをコードする全長クローンの構築 ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ₁サ ブユニットｃＤＮＡフラグメント〔ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ₁サブ ユニットｃＤＮＡの単離及び配列に関しては米国特許出願第４８２,３８４号ま たはＲｕｔｈら(１９８９)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１１１５を参照〕によって 標準ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ.)を用いてスクリーニングした。 追加のｃＤＮＡクローンを得るために、ハイブリダイズする１つのクローンの一 部分を使用して海馬ライブラリーを再スクリニーングした。ハイブリダイズする クローンのｃＤＮＡ インサートを制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって特性決定し、ウサギ骨 格筋カルシウムチャンネルβ₁サブユニットｃＤＮＡ配列に比較した。 部分的β₁サブユニットｃＤＮＡクローンの部分を結合して全β₁サブユニット をコードする全長クローンを作製した。配列番号９はβ₁サブユニットコーディ ング配列(ヌクレオチド１−１４３４)と３'非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド１ ４３５−１５４６)とを示す。推定アミノ酸配列も配列番号９に示す。発現実験 を実施するために、全長β₁サブユニットｃＤＮＡクローンを以下のごとく構築 した。 段階１：ＤＮＡフラグメント１(〜８００ｂｐの５'非翻訳配列に配列番号９のヌ クレオチド１−２７７を付加)を、ＤＮＡフラグメント２(配列番号９のヌクレオ チド２７７−１５４６に４４８ｂｐのイントロン配列を付加)に結合し、ｐＧＥ Ｍ７Ｚにクローニングした。得られたプラスミドｐβ１−１.１８は、４４８ｂ ｐのイントロンを含む全長β₁サブユニットｃＤＮＡクローンを含んでいた。 段階２：ｐβ１−１.１８の５'非翻訳配列をリボソーム結合部位で置換するため に、ＥｃｏＲＩ部位、リボソーム結 合部位をコードする配列(５'−ＡＣＣＡＣＣ−３')及び配列番号９のヌクレオチ ド１−２５を含む二重鎖アダプターを合成した。ＳｍａＩ消化したｐβ１−１. １８にアダプターを結合し、結合反応の産物をＥｃｏＲＩによって消化した。 段階３：ＥｃｏＲＩアダプターと有効なリボソーム結合部位と配列番号９のヌク レオチド１−１５４６とイントロン配列とを含む段階２で得られたＥｃｏＲＩフ ラグメントを、プラスミドベクターにクローニングしてｐβ１−１.１８ＲＢＳ と命名した。ｐβ１−１.１８ＲＢＳのＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩ消 化ｐｃＤＮＡ１に、開始コドンをＣＭＶプロモーターに近接させてサブクローニ ングし、ｐＨＢＣａＣＨβ_1aＲＢＳ(Ａ)を作製した。 段階４：イントロン配列の欠失したβ₁サブユニットをコードする全長クローン を作製するために、ＤＮＡフラグメント３(配列番号９のヌクレオチド６６−１ １４６に４４８ｂｐのイントロン配列とその配列に続く配列番号９のヌクレオチ ド１１４７−１５４６を付加したもの)の部位特異的突然変異を誘発してイント ロン配列を欠失させ、これによってｐβ１(−)を作製した。ｐβ１−１.１８Ｒ ＢＳ のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント(リボソーム結合部位と配列番号９のヌク レオチド１−２７７を含む)を、ｐβ１(−)のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメン ト(配列番号９のヌクレオチド２７７−１５４６を含む)に結合し、翻訳開始をＣ ＭＶプロモーターに近接させてｐｃＤＮＡ１にクローニングした。得られた発現 プラスミドをｐＨＢＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ)と命名した。 Ｂ.スプライス変異体β_1-3 β₁サブユニットをコードするＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、ＣＮＳ中 に同じヒトβ₁サブユニット一次転写物の少なくとも２つの代替スプライス形態 が発現されることを示した。１つの形態は配列番号９に示す配列を有し、β_1-2 と呼ぶ。β_1-2の配列と代替形態β_1-3の配列とはヌクレオチド１３３４(配列番 号９)で分岐(diverge)する。３'非翻訳配列(ヌクレオチド１７９５−１８５１) を含む完全β_1-3配列(ヌクレオチド１−１８５１)を配列番号１０に示す。実施例IV ：ヒト神経カルシウムチャンネルα₂サブユニットをコードするｃＤＮ Ａクローンの単離 Ａ.ｃＤＮＡクローンの単離 完全ヒト神経α₂コーディング配列(ヌクレオチド３５−３３１０)と５'非翻訳 配列(ヌクレオチド１−３４)と３'非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド３３１１− ３６００)とを配列番号１１に示す。 ヒト神経α₂サブユニットをコードするＤＮＡを単離するために、ウサギ骨格 筋カルシウムチャンネルα₂サブユニットｃＤＮＡフラグメント〔ヌクレオチド ４３−２７２、Ｅｌｌｉｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１６６１〕 を用いたヒトゲノムサザンブロットをプローブすることによって、ヒトα₂ゲノ ムクローンを先ず単離した。ヒトゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動 にかけ、ブロットし、標準ハイブリダイゼーション条件(実施例Ｉ.Ｃ)及び低緊 縮性洗浄条件(実施例Ｉ.Ｃ)を用いてウサギ骨格筋プローブによってプローブし た。３.５ｋｂ及び３.０ｋｂの２つの制限フラグメントを同定した。これらのＥ ｃｏＲＩ制限フラグメントを、２.２ｋｂ〜４.３ｋｂの範囲のヒトゲノムＥｃｏ ＲＩフラグメントを含むλｇｔ１１ライブラリーを調製することによってクロー ニングした。ライブラリーをウサギα₂プローブを用いて上記のようにスクリー ニングし、ハイブリダイズするクローンを単離し、 ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＨＧＣａＣＨα２.２０は３.５ｋｂのフ ラグメントを含み、ＨＧＣａＣＨα２.９は３.０ｋｂのフラグメントを含んでい た。 制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によれば、ＨＧＣａＣＨα２.２０は６５ ０ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ制限フラグメント上に８２ｂｐのエキソン(配列番 号１１のヒトα₂コーディング配列のヌクレオチド１３０−２１１)を含み、ＨＧ ＣａＣＨα２.９は７５０ｂｐのＸｂａＩ−ＢｇｌII制限フラグメント上に１０ ５ｂｐのエキソン(配列番号１１のコーディング配列のヌクレオチド２１２−３ １６)を含むことが判明した。これらの制限フラグメントを使用してヒト脳幹神 経節ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした(実施例II.Ｃ.２.ａ)。ＨＢＣ ａＣＨα２.１を単離し(配列番号１１のヌクレオチド２９−１１６３)、Ａｍｅ ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ,１２３０１ Ｐａ ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ,Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,ＭＤ,２０８５２から得られたヒ ト脳幹ｃＤＮＡライブラリー(ＡＴＣＣ受託番号３７４３２)をスクリーニングす るために使用した。２つのクローン、ＨＢＣａＣＨα２.５(配列番号１１のヌク レオチド１−１１６２)及 びＨＢＣａＣＨα２.８(配列番号１１のヌクレオチド７１４−１５６２とこれに 続く１６００ヌクレオチドの介在配列)を単離した。ＨＢＣａＣＨα２.８の２４ ００ｂｐのフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド７５９で始まりイントロ ンのＳｍａＩ部位で終わる)を使用して、脳幹ライブラリーを再スクリーニング しＨＢＣａＣＨα２.１１(配列番号１１のヌクレオチド８７９−３６００)を単 離した。クローンＨＢＣａＣＨα２.５とＨＢＣａＣＨα２.１１とはオーバーラ ップして完全ヒト脳α₂タンパク質をコードする。 Ｂ.ｐＨＢＣａＣＨα₂Ａの構築 全長ヒトカルシウムチャンネルα₁サブユニットをコードするＤＮＡを含むｐ ＨＢＣａＣＨα₂Ａを構築するために、ＨＢＣａＣＨα２.５の(ＥｃｏＲＩ)−Ｐ ｖｕIIフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド１−１０６１、ＥｃｏＲＩア ダプター、ＰｖｕII部分消化物)と、ＨＢＣａＣＨα２.１１のＰｖｕII−ＰＳｔ Ｉフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド１０６１−２４２４；ＰｖｕII部 分消化物)とを、ＥｃｏＲＩ−ＰＳｔＩ消化したｐＩＢＩ２４(Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,ＣＡ)に結合 した。次いで、(ＥｃｏＲＩ)−ＰｓｔＩフラグメント(配列番号１１のヌクレオ チド１−２４２４)を単離し、ＥｃｏＲＩ消化したｐＩＢＩ２４中のＨＢＣａＣ Ｈα２.１１のＰｓｔＩ−(ＥｃｏＲＩ)フラグメント(配列番号１１のヌクレオチ ド２４２４−３６００)に結合し、全長ヒト脳α₂サブユニットをコードするＤＮ Ａ、ＨＢＣａＣＨα２を作製した。ＨＢＣａＣＨα２の３６００ｂｐのＥｃｏＲ Ｉインサート(配列番号１１のヌクレオチド１−３６００)をｐｃＤＮＡ１(ｐＨ ＢＣａＣＨα２Ａ)に、メチオニン開始コドンをＣＭＶプロモーターに近接させ てサブクローニングした。ＨＢＣａＣＨα２の３６００ｂｐのＥｃｏＲＩインサ ートを、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(ｄｈｆ ｒ)遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化部位及びスプライス部位、ベクターを細菌 中に維持するために必要な配列を含むｐＳＶ２ｄＨＦＲ〔Ｓｕｂｒａｍａｎｉら （１９８１）Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.１：８５４−８６４〕にサブクローニ ングした。実施例Ｖ Ａ.ヒトβ₁転写物及びヒトα₂転写物のディファレンシャルプロセシング 骨格筋、大動脈、海馬と脳幹神経節、及び、ＨＥＫ２９３細胞中に存在するヒ トβ₂転写物の核酸増幅分析によれば、各組織中で配列番号９のヌクレオチド６ １５−７８１に対応する領域のディファレンシャルプロセシングが判明した。こ の領域に異なるプロセシングを生じた５つのβ₁転写物を与えた４つの異なる配 列を同定した。異なる組織に由来のβ₁転写物は、ＨＥＫ２９３細胞中で発現さ れた１つのβ₁転写物(β_1-5)で４つの配列全部が欠失している以外は、４つの配 列の異なる組み合わせを含んでいた。 どのβ₁転写物も４つの配列の各々を含んでいなかった。しかしながら、参照 を容易にするために、４つの配列全部を末端同志をつないだ長い単一配列として 配列番号１２に示す。ディファレンシャルプロセシングされた４つの配列は、配 列１(配列番号１２のヌクレオチド１４−３４)、配列２(配列番号１２のヌクレ オチド３５−５５)、配列３(配列番号１２のヌクレオチド５６−１９０)及び配 列４(配列番号１２のヌクレオチド１９１−２７１)である。同定されたβ₁転写 物の形態は、(１)β_1-1と呼ばれる配列１の欠失した形態(骨格筋で発現される) 、(２)β_1-2と呼ばれる配列２及び３の欠失した形態(ＣＮＳで発現される)、 (３)β_1-4と呼ばれる配列１、２及び３の欠失した形態(大動脈及びＨＥＫ細胞で 発現される)、及び、(４)β_1-5と呼ばれる配列１−４の欠失した形態(ＨＥＫ細 胞で発現される)を含む。更に、β_1-4及びβ_1-5は、β_1-1及びβ_1-2の形態中に 欠失しているグアニンヌクレオチド(配列番号１２のヌクレオチド１３)を含む。 β₁スプライス変異体の配列を配列番号９、１０及び３３−３５に示す。 Ｂ.α₂サブユニットをコードする転写物のディファレンシャルプロセシング 完全ヒト神経α₂コーディング配列(ヌクレオチド３５−３３０７)と５'非翻訳 配列の一部分(ヌクレオチド１−３４)と３'非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド３ ３０８−３６００)とを配列番号１１に示す。 骨格筋、大動脈及びＣＮＳ中に存在するヒトα₂転写物の核酸増幅分析によれ ば、各組織中で配列番号１１のヌクレオチド１５９５−１９４２に対応する領域 のディファレンシャルプロセシングが判明した。 分析は、ヌクレオチド１５９５−１９４２に対応するヌクレオチドを含むゲノ ムＤＮＡの一次転写物が、配列番号１１のヌクレオチド１６２４と１６２５との 間に挿入され た追加の配列(配列番号１３：5'CCTATTGGTGTAGGTATACCAACAATTAATTTAAGAAAAAGGA GACCCAATATCCAG3')を含むことを示した。配列番号１１のヌクレオチド１５９５ −１９４２と、ヌクレオチド１６２４と１６２５との間に挿入された配列番号１ ３とを含む一次転写物の領域の１〜３個の異なる部分の有無に起因する差異を生 じた５つの選択的スプライス変異体転写物が同定された。種々の組織に由来のα₂ をコードする５つの転写物は、大動脈中に発現する１つのα₂転写物中で３つの 配列全部が欠失している以外は、３つの配列の異なる組み合わせを含む。どのα₂ 転写物も３つの配列の各々を含んでいなかった。ディファレンシャルプロセシ ングされた３つの領域の配列は配列１(配列番号１３)、配列２(配列番号１１の ヌクレオチド１６２５−１６３９である5'AACCCCAAATCTCAG3')及び配列３(配列 番号１１のヌクレオチド１９０８−１９２８である5'CAAAAAAGGGCAAAATGAAGG3') で示される。同定された５つのα₂形態は、(１)α_2aと呼ばれる配列３の欠失し た形態(骨格筋で発現される)、(２)α_2bと呼ばれる配列１の欠失した形態(ＣＮ Ｓで発現される)、(３)α_2cと呼ばれる配列１及び２の欠失した形態(大動脈で発 現される)、(４)α_2dと呼ばれる配列１、 ２及び３の欠失した形態(大動脈で発現される)、及び、(５)α_2eと呼ばれる配列 １及び３の欠失した形態(大動脈で発現される)である。 α_2a−α_2eの配列を夫々配列番号２９−３２に示す。実施例VI ：ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからのカルシウムチャンネルγサブユニ ットをコードするＤＮＡの単離 Ａ.γサブユニットをコードするＤＮＡの単離 ベクターγＪ１０〔Ｊａｙ,Ｓ.ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４９ ０−４９２〕に含まれているウサギ骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニット ｃＤＮＡの４８４ｂｐの配列(コーディング配列のヌクレオチド６２１−６２６ に３'−非翻訳配列の４３８ヌクレオチドを付加したもの)に対するハイブリダイ ゼーションによって、λｇｔ１１に基づくヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー(Ｃｌ ｏｎｔｅｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃ＨＬ１０８８ｂ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ)に由 来の約１×１０⁶の組換え体をスクリーニングした。中度の緊縮性条件(２０％の 脱イオンホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、６×ＳＳＰＥ、０.２％のＳＤ Ｓ、２０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、４２℃)を用いてハイブリダイゼーシ ョンを実施し、低緊縮性条件 下(実施例Ｉ.Ｃ参照)で洗浄した。このプローブにハイブリダイズしたプラーク を精製し、インサートＤＮＡをｐＧＥＭ７Ｚにサブクローニングした。このｃＤ ＮＡインサートをγ１.４と命名した。 Ｂ.γ１.４のキャラクタリゼーション γ１.４をＤＮＡハイブリダイゼーションによって確認し、ＤＮＡ配列決定に よって特性決定した。γ１.４の１５００ｂｐのＳｓｔＩフラグメントはサザン ブロットでウサギ骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニットｃＤＮＡ γＪ１ ０にハイブリダイズした。このフラグメントの配列分析によれば、このフラグメ ントが約５００ヌクレオチドのヒトＤＮＡ配列及び〜１０００ヌクレオチドのλ ｇｔ１１配列を含むことが判明した(後者の配列が含まれる理由は、λｇｔ１１ 中のＥｃｏＲＩクローニング部位の１つの見掛けの破壊が生じるからである。) 。ヒトＤＮＡ配列は、その直後に翻訳終結コドン及び３'非翻訳配列(配列番号１ ４)を有する１２９ヌクレオチドのコーディング配列を含む。 ヒトλサブユニットｃＤＮＡの残りの５'配列を単離するためには、先ず、ヒ トＣＮＳ ｃＤＮＡライブラリー及 び／またはヒトＣＮＳ組織からのｍＲＮＡ調製物を、γ１.４のγ ｃＤＮＡ特異 的配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅分析方法によっ て検定し得る。追加のヒト神経γサブユニットをコードするＤＮＡは、核酸増幅 分析アッセイの結果に基づいて、γ特異的増幅可能ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライ ブラリーから単離され得る。または、核酸増幅分析アッセイの結果に基づいて、 γ特異的増幅可能転写物を含むｍＲＮＡ調製物からｃＤＮＡライブラリーを構築 し得る。このようなライブラリーは、ポリＡ⁺ＲＮＡからの第１鎖のｃＤＮＡ合 成をプライムするためにオリゴｄＴを用いる標準方法によって構築される(実施 例Ｉ.Ｂ参照)。または、γ１.４中のヒトＤＮＡ配列に基づくγ ｃＤＮＡ特異的 オリゴヌクレオチドによって第１鎖のｃＤＮＡをプライムすることによって第１ 鎖のｃＤＮＡを特定し得る。次にこの第１鎖の合成に基づいてｃＤＮＡライブラ リーを構築し、γ１.４のγ特異的部分でスクリーニングし得る。実施例VII ：ヒト神経カルシウムチャンネルβ₂サブユニットをコードするｃＤＮ Ａクローンの単離 ヒトカルシウムチャンネルβ₂サブユニットをコードする ＤＮＡの単離 実施例IIIに記載のごとく単離されたクローンの配列決定によって、ヒト神経 カルシウムチャンネルβ₂サブユニットをコードするクローンが判明した(β₂₀と 命名、配列番号２６参照)。このクローンの５’端に基づくオリゴヌクレオチド を使用してヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをプライムした。低度から中度の緊縮 性の条件下(５０℃、０.５×ＳＳＰＥで最終洗浄)でこのβ₂クローンでライブラ リーをスクリーニングした。複数のハイブリダイズするクローンを単離し配列決 定した。これらのクローンとして、β_2C、β_2D及びβ_2Eをコードしているクロー ンが存在した。例えば、β_2Cの配列を配列番号３７に示し、β_2Eの配列を配列番 号３８に示す。 次に、ランダムプライムした海馬ライブラリーを、β_2Dをコードするクローン とＡＴＣＣ受託番号６９０４８で寄託されたβ₃クローンの一部分との組み合わ せを用いてスクリーニングした。多数のハイブリダイズするクローンが単離され た。これらのクローンをβ１０１、β１０２及びβ１０４と命名した。β１０１ はβ₂のスプライス変異体の５'端をコードすると考えられ、β_2Eと命名した。β １ ０２及びβ１０４はβ₂の３'端の部分をコードしている。 β₂スプライス変異体が配列番号２６のヌクレオチド１８２−２２９４を含み 、開始コドンと配列番号２６の２１２に対応するヌクレオチドとの間だけが違っ ている。実施例VIII ：ヒトカルシウムチャンネルβ₄及びβ₃サブユニットをコードするｃ ＤＮＡクローンの単離 Ａ.ヒトβ₄サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離 翻訳開始コドンとβ₄コーディング配列の約６０％とを含むクローンがヒト小 脳ｃＤＮＡライブラリーから得られた(配列番号２７のヌクレオチド１−８９４ 参照)。β₄コーディング配列の残りの３'部分をコードするＤＮＡを得るために 、高緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で核酸増幅産物のハイブリダ イゼーションに基づいてヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。 β₄サブユニットコーディング配列の３'端に対応する配列と終結コドンとを含む クローンを同定するために、ハイブリダイズするクローンを精製し、制限酵素マ ッピング及びＤＮＡ配列分析によって特性決定する。選択されたクローンをβ₄ コーディング配列の５'半鎖を含むクローンに適当な 制限部位で結合し、β₄サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡを作製する。全 長β₄クローンの配列を配列番号２７に示す。アミノ酸配列を配列番号２８に示 す。 Ｂ.ヒトβ₃サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離 実施例IIIに記載のごとく単離されたクローンの配列決定によって、ヒト神経 カルシウムチャンネルβ₃サブユニットをコードするクローンが判明した。この クローンはプラスミドβ１.４２(ＡＴＣＣ受託番号６９０４８)として寄託され た。 完全β₃サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡクローンを単離するために、 ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,ＣＡ) を、より低い緊縮性のハイブリダイゼーション条件(２０％の脱イオンホルムア ミド、２００μｇ／ｍｌの音波処理ニシン精子ＤＮＡ、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅ ｎｈａｒｄｔ溶液、４２℃)及び洗浄条件を用いて、β_1-2をコードするｃＤＮＡ の５’ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントに対するハイブリダイゼーションに基 づいてスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンの１つは、翻訳開始コ ドン及び翻訳終結コドンの双方を含み、β_3-1と命名された完全β₃サブユニット をコードしている(配列番号１９)。ｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を調製し 、実施例IX.Ｄと同様の方法を用 いてα_1B-1 ｃＤＮＡ及びα_2b ｃＤＮＡの転写物と共にアフリカツメガエル卵母 細胞に注入した。卵母細胞を２電極電圧固定法で記録すると、卵母細胞が有意な 電圧依存性の内向きのＢａ²⁺電流を示した。 β_3-2と命名された別のβ₃サブユニットをコードするクローンは、ヒト小脳ｃ ＤＮＡライブラリーを、より低い緊縮性の(２０％の脱イオンホルムアミド、２ ００μｇ／ｍｌの音波処理ニシン精子ＤＮＡ、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒ ｄｔ溶液、４２℃)のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、実施例VIII.Ａ に記載の核酸増幅産物に対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニン グすることによって得られた。このクローン(配列番号２０、β_3-2)とβ_3-1(配 列番号１９)と命名された第１β₃サブユニットとは５'端に差異を有しており、 β₃遺伝子のスプライス変異体である。実施例IX ：ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするｃＤＮＡ及 びＲＮＡ転写物の哺乳類細胞中での組換え発現 Ａ.ヒト神経カルシウムチャンネルα₂サブユニットｃＤＮＡのＤＧ４４細胞中で の組換え発現 １.ＤＧ４４細胞の安定なトランスフェクション コロンビア大学のＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎから入手したＤＧ４４細胞 〔ｄｈｆｒ^-チャイニーズハムスター卵巣細胞：例えばＵｒｌａｕｂ,Ｇ.ら（１ ９８６）Ｓｏｍ.Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ.Ｇｅｎｅｔ.１２：５５５−５６６参照〕 を、ＣａＰＯ₄沈殿法〔Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａ ｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７６：１３７１−１３７６〕によって、トランスフェクト細 胞中でポリシストロン性発現／選択を行わせるヒト神経カルシウムチャンネルα₂ サブユニットｃＤＮＡ(実施例IV参照)を含むｐＳＶ２ｄｈｆｒベクターで安定 にトランスフェクトした。発現ベクターに取り込まれた細胞を選択するために、 ヒポキサンチンまたはチミジン非含有の１０％ＤＭＥＭ培地でトランスフェクタ ントを増殖させた。この培地で生残能力を示した１２のトランスフェクタント細 胞系を樹立細胞系とした。 ２.トランスフェクトＤＧ４４細胞中のα₂サブユニットｃＤＮＡ発現の分析 ヒト神経カルシウムチャンネルα₂サブユニットｃＤＮＡを含むｐＳＶ２ｄｈ ｆｒで安定にトランスフェクトした ４つのＤＧ４４細胞系から、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ〔(１９８８)Ｎｕｃ.Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１６：１４８７−１４９７〕の方法で全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ(レー ンあたり〜１５μｇ)を１％アガロースホルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロ セルロースに移し、ランダムプライムしたヒト神経カルシウムチャンネルα₂ ｃ ＤＮＡにハイブリダイズした(ハイブリダイゼーション：５０％ホルムアミド、 ５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、４２℃)；洗浄：０.２×ＳＳＰＥ、０. １％ＳＤＳ、６５℃)。ヒト神経カルシウムチャンネルα₂サブユニットｃＤＮＡ を含むｐＳＶ２ｄｈｆｒで安定にトランスフェクトした４つのＤＧ４４細胞系か ら得られた全ＲＮＡをノーザンブロット分析すると、４つの細胞系の１つが１０ ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で２日間増殖させるとα₂サブユニットｃＤＮＡ の転写物に関して予測された大きさ(ｃＤＮＡの大きさに基づいて５０００ヌク レオチド)のハイブリダイズするｍＲＮＡを含むことが判明した。酪酸塩は転写 を非特異的に誘発し、しばしばＳＶ４０初期プロモーターを誘発するために使用 される〔Ｇｏｒｍａｎ,Ｃ ＆ Ｈｏｗａｒｄ,Ｂ.(１９８３)Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ.１１：１６３１〕。この 細胞系４４α₂−９はまた、α₂ ｃＤＮＡに基づくプローブにハイブリダイズし たα₂ ｃＤＮＡの転写物に関して予測された大きさ(５０００ヌクレオチド)より も小さいｍＲＮＡ種(複数の種)及び大きい(６８００ヌクレオチド)ｍＲＮＡ種を 産生した。このトランスフェクタントによって産生された５０００ヌクレオチド 及び６８００ヌクレオチドの転写物は、完全α₂サブユニットコーディング配列 を含み、従って全長α₂サブユニットタンパク質を産生する筈である。弱くハイ ブリダイズする８０００ヌクレオチドの転写物が非トランスフェクト及びトラン スフェクトの双方のＤＧ４４細胞中に存在していた。明らかに、ＤＧ４４細胞は 、カルシウムチャンネルα₂サブユニットまたは同様の遺伝子を低レベルで転写 する。この内因性α₂サブユニット転写物の発現レベルは、ノーザン分析のため にＲＮＡを単離する前に細胞を酪酸塩に接触させた場合にも変わらないことが観 察された。 ヒト神経カルシウムチャンネルα₂サブユニットｃＤＮＡを含むｐＳＶ２ｄｈ ｆｒで安定にトランスフェクトされた３つのＤＧ４４細胞系から全タンパク質を 抽出した。約１０⁷個の細胞を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴ Ａ、１ｍＭのＰＭＳＦを含む３００μｌの溶液中で音波処理した。等容量の２× のローディング色素〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ.Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２ ７：６８０〕をサンプルに添加し、タンパク質を８％ポリアクリルアミドゲル上 で電気泳動にかけ、次いで、ニトロセルロースにエレクトロトランスファーした 。ニトロセルロースをウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα₂サブユニット(Ｋ. Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａから入手)に対するモ ルモットのポリクローナル抗血清(希釈度１：２００)と共にインキュベートし、 次いで〔¹²⁵Ｉ〕−プロテインＡと共にインキュベートした。ブロットを−７０ ℃でＸ線フィルムに露光した。トランスフェクト及び非トランスフェクトの双方 のＤＧ４４細胞から得られたタンパク質の少数のサンプルが、ヒト神経カルシウ ムチャンネルのα₂サブユニットに関して予測された大きさ(１３０−１５０ｋＤ ａ)の免疫反応性タンパク質を含んでいた。この免疫反応性タンパク質のレベル は、酪酸ナトリウムの非存在下で増殖させた４４α₂−９細胞中よりも１０ｍＭ の酪酸ナトリウムの存在下で増殖させた４４α₂−９細胞中で高かった。これら のデータは、４４α₂−９及び非トランス フェクトＤＧ４４細胞の全ＲＮＡのノーザン分析で得られた結果と十分な相関関 係を有している。４４α₂−９細胞系はまた、１１０ｋＤの免疫反応性タンパク 質を産生し、これは全長α₂サブユニットのタンパク質分解産物であるか、また は、α₂サブユニットｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした細胞系中で産生さ れた１つの短い(＜５０００ヌクレオチド)ｍＲＮＡの翻訳産物である。 Ｂ.ヒト神経カルシウムチャンネルα₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードするＤ ＮＡのＨＥＫ細胞中の発現 ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡでヒト胚性腎 細胞(ＨＥＫ２９３細胞)を一過的及び安定にトランスフェクトした。個々のトラ ンスフェクタントについて、電圧活性化バリウム電流及び機能性組換え電圧依存 性カルシウムチャンネルの存在を電気生理学的に分析した。 １.ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション ヒト神経カルシウムチャンネルα_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコードするＤ ＮＡを含む個別の発現ベクター、即ちプラスミドｐＶＤＣＣIII(Ａ)、ｐＨＢＣ ａＣＨα₂Ａ及びｐＨＢＣａＣＨβ_1aＲＢＳ(Ａ)を夫々、実施例II.Ａ.３、 IV.Ｂ及びIII.Ｂ.３に記載のように構築した。これらの３つのベクターを使用し てＨＥＫ２９３細胞を一過的にコトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞の安 定なトランスフェクションのためには、β₁サブユニットをコードするＤＮＡを 細胞に導入するためにｐＨＢＣａＣＨβ_1aＲＢＳ(Ａ)に代えてｐＨＢＣａＣＨβ_1b ＲＢＳ(Ａ)(実施例III.Ｂ.３)を、ｐＶＤＣＣIII(Ａ)及びｐＨＢＣａＣＨα₂ Ａと共に使用した。 ａ.一過的トランスフェクション 発現ベクターｐＶＤＣＣIII(Ａ)、ｐＨＢＣａＣＨα₂Ａ及びｐＨＢＣａＣＨβ_1a ＲＢＳ(Ａ)を、ＨＥＫ２９３細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３)の２組の 一過的トランスフェクションに使用した。一方のトランスフェクション手順では 、ＨＥＫ２９３細胞を、α₁サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミド、α₂サブユニ ットｃＤＮＡ発現プラスミド、β₁サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミド及びプ ラスミドｐＣＭＶβｇａｌ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｐａ ｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ)によって一過的にコトランスフェクトした。プラスミドｐ ＣＭＶβｇａｌはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターに融合したｌ ａｃＺ遺伝子(大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする)を含んでおり、この遺 伝子は、トランスフェクション効率をモニターするマーカー遺伝子としてトラン スフェクションに参加した。他方のトランスフェクション手順では、ＨＥＫ２９ ３細胞を、α₁サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミドｐＶＤＣＣIII(Ａ)及びｐＣ ＭＶβｇａｌによって一過的にコトランスフェクトした。双方のトランスフェク ションで、１０ｃｍの組織培養皿中で２〜４×１０⁶のＨＥＫ２９３細胞を、実 験に使用した５μｇの各プラスミドによって、標準ＣａＰＯ₄沈殿トランスフェ クション手順に従って一過的にコトランスフェクトした(Ｗｉｇｌｅｒら(１９７ ９)Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７６：１３７３−１３７６)。 β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌ基質とを用いる反応の産物の直接染色〔Ｊｏ ｎｅｓ,Ｊ.Ｒ．（１９８６）ＥＭＢＯ ５：３１３３−３１４２〕及びβ−ガラ クトシダーゼ活性の測定〔Ｍｉｌｌｅｒ,Ｊ.Ｈ．（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ,ｐｐ.３５２−３５５,Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ〕によってトランスフェクタント のβ−ガラクトシダーゼ発現を分析し た。これらのトランスフェクタント中のサブユニットｃＤＮＡの発現を評価する ために、サブユニット転写物産生(ノーザン分析)、サブユニットタンパク質産生 (細胞溶解液のイムノブロット分析)及び機能性カルシウムチャンネル発現(電気 生理学的分析)について細胞を分析した。 ｂ.安定なトランスフェクション リン酸カルシウムトランスフェクション手順〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｖｏｌ.１,Ｗｉｌｅｙ Ｉｎ ｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ,Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １４,Ｕｎｉｔ ９.１.１−９. １.９(１９９０)〕を用いてＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。各々が １〜２×１０⁶のＨＥＫ２９３細胞を収容した１０ｃｍの培養皿に、５μｇのｐ ＶＤＣＣIII(Ａ)、５μｇのｐＨＢＣａＣＨα₂Ａ、５μｇのｐＨＢＣａＣＨβ_1b ＲＢＳ(Ａ)、５μｇのｐＣＭＶＢｇａｌ及び１μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ(選択マー カーとして)を含む１ｍｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物をトランスフェク トした。５００μｇのＧ４１８を含む培地中で１０〜２０日間増殖させた後、コ ロニーが形成されたので、クローニングシリンダーを用いて単離した。 ２.ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを一過的に トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の分析 ａ.β−ガラクトシダーゼ発現の分析 細胞溶解物(実施例VII.Ａ.２に記載の手順で調製)のβ−ガラクトシダーゼ活 性アッセイ(Ｍｉｌｌｅｒ,Ｊ.Ｈ.,(１９７２)Ｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ,ｐｐ.３５２−３５５,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ)及び固定細胞の染色(Ｊｏｎｅｓ,Ｊ.Ｒ.(１９８６ )ＥＭＢＯ ５：３１３３−３１４２)によって、一過的トランスフェクタントの β−ガラクトシダーゼの発現を検定した。これらのアッセイの結果は、ＨＥＫ２ ９３細胞の約３０％がトランスフェクトされたことを示した。 ｂ.ノーザン分析 α₁、α₂及びβ₁サブユニットの各々をコードするＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子を 用いるかまたはα₁サブユニットとｌａｃＺ遺伝子とを用いて一過的にトランス フェクトしたＨＥＫ２９３細胞からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｔｒａｋ Ｋｉｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ)を用いてポリＡ＋ ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをアガロースゲルで電気泳動 にかけ、ニトロセルロースに移した。次にニトロセルロースを以下の放射性標識 プローブの１つ以上とハイブリダイズさせた：ｌａｃＺ遺伝子、ヒト神経カルシ ウムチャンネルα_1DサブユニットをコードするｃＤＮＡ、ヒト神経カルシウムチ ャンネルα₂サブユニットをコードするｃＤＮＡまたはヒト神経カルシウムチャ ンネルβ₁サブユニットをコードするｃＤＮＡ。α₁サブユニットをコードするｃ ＤＮＡとハイブリダイズした２つの転写物が、α₁、α₂及びβ₁サブユニットの 各々をコードするＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってトランスフェクトされたＨ ＥＫ２９３細胞中及びα₁サブユニットｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってト ランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中で検出された。１つのｍＲＮＡ種はα₁ サブユニットｃＤＮＡの転写物に関して予測された大きさ(８０００ヌクレオチ ド)を有していた。第２のＲＮＡ種はこの転写物に関して予測された大きさより も小さかった(４０００ヌクレオチド)。ｌａｃＺ遺伝子の転写物であると予測さ れる大きさのＲＮＡは、α₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードするｃＤＮＡと ｌａｃＺ遺伝子とによってトランス フェクトされた細胞中及びα₁サブユニットｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによっ てトランスフェクトされた細胞中で、ｌａｃＺ遺伝子配列に対するハイブリダイ ゼーションによって検出された。 また、α₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子 とによってトランスフェクトされた細胞のＲＮＡはα₂及びβ₁サブユニットのｃ ＤＮＡプローブとハイブリダイズした。２つのｍＲＮＡ種がα₂サブユニットｃ ＤＮＡプローブにハイブリダイズした。１つの種はα₂サブユニットｃＤＮＡの 転写物であると予測された大きさ(４０００ヌクレオチド)を有していた。他方の 種はこの転写物に関して予測された大きさよりも大きかった(６０００ヌクレオ チド)。α₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子と によってコトランスフェクトされた細胞中の多数のＲＮＡ種はβ₁サブユニット ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした。βサブユニットｃＤＮＡ発現ベクター が２つのポリＡ⁺付加可能部位を含むので、種々の大きさのβサブユニット転写 物が多数産生された。 ｃ.電気生理学的分析 パッチ固定法〔Ｈａｍｉｌｌら（１９８１）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ.３９ １：８５−１００〕の全細胞変法を用い、一過的にトランスフェクトされたＨＥ Ｋ２９３細胞の各々について、電圧依存性バリウム電流を検定した。これらの実 験の陰性対照として、ｐＣＭＶβｇａｌだけで一過的にトランスフェクトされた ＨＥＫ２９３細胞のバリウム電流を検定した。細胞を電流キャリアーとして作用 するバリウムイオン含有の浴液に配置した。ナトリウムまたはカリウムチャンネ ルを流れる電流を除去するために浴液の主要塩成分としてＮａＣｌまたはＫＣｌ の代わりに塩化コリンを使用した。浴液は１ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有し、１０ｍ ＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７.３に緩衝した(ｐＨを水酸化ナトリウムまたは水酸化テ トラエチルアンモニウムで調整した)。１３５ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＭｇＣ ｌ₂、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＧＴＡ、４ｍＭのＡＴＰ及び１０ｍ ＭのＨＥＰＥＳを含む溶液(水酸化テトラエチルアンモニウムでｐＨを７.３に調 整)をパッチピペットに充填した。セシウムイオン及びテトラエチルアンモニウ ムイオンは殆どの型のカリウムチャンネルを遮断する。ピペットはＳｙｌｇａｒ ｄ(Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ,Ｍｉｄｌａ ｎｄ,ＭＩ)でコートされ、１−４メガオームの抵抗を有していた。ＩＢＭ互換性 ＰＣのＬａｂｍａｓｔｅｒ(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ,Ｓｏｌ ｏｎ,ＯＨ)データ取得ボードとインタフェースしたＡｘｏｐａｔｃｈ ＩＣ(Ａｘ ｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ,Ｆｏｓｔｅｒ Ｄｉｔｙ,ＣＡ)増幅器によって５ ００メガオームのヘッドステージ抵抗器を通る電流を測定した。ｐＣｌａｍｐ( Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)を使用して電圧コマンドを発生させ、データ を取得した。データをｐＣｌａｍｐまたはＱｕａｔｔｒｏ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏ ｎａｌ(Ｂｏｒｌａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ,Ｓｃｏｔｔｓ Ｖａｌｌｅ ｙ,ＣＡ)プログラムで分析した。 薬剤を付加するために、試験中の細胞から数マイクロメーター以内に配置され た「吹管(puffer)」ピペットを使用し圧力を加えて溶液を付加した。薬理学的キ ャラクタリゼーションに使用される薬剤を浴液と同じ溶液に溶解した。ＤＭＳＯ 中で調製したＢａｙ Ｋ ８６４４(ＲＢＩ,Ｎａｔｉｃｋ,ＭＡ)の１０ｍＭのスト ック溶液のサンプルを付加する前に、１５ｍＭのＢａ⁺²を含有する浴液で最終濃 度１μＭに希釈した。 ２１の陰性対照ＨＥＫ２９３細胞(ｌａｃＺ遺伝子発現ベクターｐＣＭＶβｇ ａｌ単独で一過的にトランスフェクトした)を、電流を記録するパッチクランプ 法の全細胞変法によって分析した。１つの細胞だけが識別可能な内向きのバリウ ム電流を示した。この電流は１μＭのＢａｙ Ｋ８６４４の存在によって影響さ れなかった。更に、Ｂａ²⁺電流を示さなかった４つの細胞にＢａｙ Ｋ ８６４４ を付加してもいかなる電流も出現しなかった。 α₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによ るＨＥＫ２９３細胞の一過的トランスフェクションの２日後に、個々のトランス フェクタントの電圧依存性バリウム電流を検定した。９つのトランスフェクタン トで電流が記録された。１つの細胞のトランスフェクション効率は別の細胞のト ランスフェクション効率とは異なっているので、個々のトランスフェクタント中 の異種タンパク質の発現の程度は一様でなく、異種ＤＮＡを取り込まない細胞ま たは発現しない細胞もある。これらの９個のトランスフェクタントのうちの２つ で内向きのバリウム電流が検出された。これらのアッセイにおいて、膜の静止電 位は−９０ｍＶであった。膜を一連の電圧段階で種々の 試験電位に脱分極し、１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下及び非存在下の電流 を記録した。内向きのバリウム電流の量はＢａｙ Ｋ ８６４４の付加によって有 意に増加した。内向きのバリウム電流の最大値(〜１６０ｐＡ)は、１μＭのＢａ ｙ Ｋ ８６４４の存在下で膜を０ｍＶに脱分極したときに記録された。Ｂａｙ Ｋ ８６４４の非存在下及び存在下の夫々の場合の各脱分極後に記録された最大 電流対脱分極電圧をプロットすることによってＩ−Ｖ曲線を作成し、双方の曲線 を比較すると、Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下で電圧活性化電流が増加することが 判明した。 α₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードするｃＤＮＡ及びｌａｃＺ遺伝子によ ってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中のＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下 に発生した電流の軌跡中に顕著なテール電流が検出されたが、これはこのトラン スフェクタントで記録された電圧活性化バリウム電流の原因である組換えカルシ ウムチャンネルがＤＨＰ感受性であると考えられることを示す。 内向きのバリウム電流を示した２つのトランスフェクト細胞のうちの第２の細 胞は、膜を−９０ｍＶから脱分極したときに〜５０ｐＡの電流を示した。この電 流は、確認さ れたカルシウムチャンネルブロッカーである２００μＭのカドミウムによってほ ぼ完全に遮断された。 α₁サブユニットをコードするＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによって一過的にト ランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの２日後に全細胞パッチ固 定法によって分析した。これらの細胞の１つは３０ｐＡの内向きのバリウム電流 を示した。この電流は１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下で２倍に増幅された 。更に、Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下で小さいテール電流が検出された。これら のデータは、ＨＥＫ２９３細胞中のヒト神経カルシウムチャンネルα_1Dサブユニ ットをコードするｃＤＮＡの発現が機能性ＤＨＰ感受性カルシウムチャンネルを 生じることを示す。 ３.ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡで安定にト ランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の分析 一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の電気生理学的分析に関す る記載(実施例VII.Ｂ.２.ｃ)と同様にして、安定にトランスフェクトされた個々 のＨＥＫ２９３細胞の電圧依存性バリウム電流の存在を電気生理学的に分析した 。サイクリックＡＭＰ依存性キナーゼ媒介リン酸 化〔Ｐｅｒｚｅｒら（１９９０）Ｒｅｖ.Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｐｈ ａｒｍａｃｏｌ．１１４：１０７−２０７〕を介してカルシウムチャンネル活性 を最大にするために、ｃＡＭＰ(Ｎａ塩、２５０μＭ)をピペット溶液に添加し、 いくつかの記録採取では浴液にフォルスコリン(１０μＭ)を添加した。これらの 化合物の有無にかかわりなく定性的に同様の結果が得られた。 Ｂａｙ Ｋ ８６４４(１μＭ)の非存在下及び存在下で安定にトランスフェクト された細胞からバリウム電流が記録された。細胞をＢａｙ Ｋ ８６４４の非存在 下で−９０ｍＶの静止電位から−１０ｍＶまで脱分極させると、急速に失活する テール電流を伴う約３５ｐＡの電流が記録された。Ｂａｙ Ｋ ８６４４を添加し たときは、同様の脱分極プロトコルで、テール電流の上昇及び延長を伴う約７５ ｐＡの電流が誘発された。この同じ細胞から記録された電流のピーク量を一連の 脱分極電圧の関数として評価した。Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下の応答が増加し ただけでなく、電流−電圧関係全体が約−１０ｍＶシフトした。従って、Ｂａｙ Ｋ ８６４４の典型的な３つの特徴、即ち電流量の増加、テール電流の延長及び 活性化電流の負シフトが観察され、 これらは明らかに、安定にトランスフェクトされた細胞中のＤＨＰ感受性カルシ ウムチャンネルの発現をと示す。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中ではｃ ＡＭＰまたはフォルスコリンの有無にかかわりなく、Ｂａｙ Ｋ ８６４４のこの ような効果は全く観察されなかった。 Ｃ.ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを発現する ためのｐＣＭＶに基づくベクター及びｐｃＤＮＡ１−に基づくベクターの使用 １.構築物の調製 ｐＣＭＶを用いて追加の発現ベクターを構築した。ｐＶＤＣＣIII(Ａ)からの 全長α_1D ｃＤＮＡ(実施例II.Ａ.３.ｄ)、ＨＢＣａＣＨα₂からの３６００ｂｐ のＥｃｏＲＩフラグメントに含まれた全長α₂ｃＤＮＡ(実施例IV.Ｂ)及びｐＨＢ ＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ)からの全長β₁サブユニットｃＤＮＡ(実施例III.Ｂ.３) を、プラスミドｐＣＭＶβｇａｌに個別にサブクローニングした。ｌａｃＺ遺伝 子を除去するためにプラスミドｐＣＭＶβｇａｌをＮｏｔＩで消化した。ｐＣＭ Ｖと呼ばれるプラスミドの残りのベクター部分のＮｏｔＩ部位に平滑末端を与え た。個別のＥｃｏＲＩフラグメントに含まれた全長α₂をコードするＤＮＡ及 びβ₁をコードするＤＮＡを単離し、平滑末端を与え、ｐＣＭＶの平滑末端を有 するベクターフラグメントに個別に結合させ、ｐＣＭＶ中のＣＭＶプロモーター とＳＶ４０ポリアデニル化部位との間にｃＤＮＡを配置した。α_1Dをコードする ｃＤＮＡをｐＣＭＶと結合するために、ＣＭＶプロモーターの５'に直結するポ リリンカー及びＳＶ４０ポリアデニル化部位の３'に直結するポリリンカー中の 制限部位をｐＣＭＶから除去した。ＮｏｔＩ部位に１つのポリリンカーを付加し た。このポリリンカーは制限酵素認識部位に以下の配列を有していた： ｐＶＤＣＣIII(Ａ)からＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩとして単離されたα_1Dをコード するＤＮＡを次に、ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位との間に 配置するためにＸｂａII−ＳａｌＩ消化したｐＣＭＶに結合した。 プラスミドｐＣＭＶはｐｃＤＮＡ１と同様にＣＭＶプロモーターを含んでいる が、挿入されたサブユニットをコードするＤＮＡに対するスプライスドナー／ス プライスアク セプターの位置がｐｃＤＮＡ１とは違っている。スプライスドナー／スプライス レセプターの部位はＣＭＶプロモーターの３'及びサブユニットをコードするＤ ＮＡの開始コドンの５'に位置している。サブユニットをコードするＤＮＡをｐ ｃＤＮＡ１に挿入した後、スプライスドナー／スプライスアクセプターの部位は サブユニットｃＤＮＡ終結コドンの３'に位置している。 ２.ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション 実施例VII.Ｂ.１.ａに記載したように、ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＣＭＶ中のα_1D 、α₂及びβ₁サブユニットをコードするＤＮＡまたはｐｃＤＮＡ１中のα_1D、 α₂及びβ₁サブユニットをコードするＤＮＡ(夫々ベクターｐＶＤＣＣIII(Ａ)、 ｐＨＢＣａＣＨα₂Ａ及びｐＨＢＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ))によって一過的にコト ランスフェクトした。トランスフェクション効率の測定手段として各トランスフ ェクションにプラスミドｐＣＭＶβｇａｌを導入した。トランスフェクタントの β−ガラクトシダーゼアッセイの結果は(実施例VII.Ｂ.２参照)、ＨＥＫ２９３ 細胞がｐＣＭＶ−及びｐｃＤＮＡ１−に基づくプラスミドによって等しい効率で トランスフェクトされたことを示した。しかしながら、 現在では、カルシウムチャンネルレセプター発現のためにはｐｃＤＮＡ１に基づ くプラスミドが好ましいとされている。 Ｄ.ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＲＮＡのアフリカ ツメガエル卵母細胞中での発現 ｉｎ ｖｉｔｒｏ調製されたヒト神経α_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコード するＤＮＡの転写物の種々の組み合わせをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し た。α_1Dを含む組み合わせを注入した卵母細胞は電圧活性化バリウム電流を示し た。 １.転写物の調製 ｍＣＡＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰＰＩＮＧ ＫＩＴ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ,Ｌａ Ｊｏ ｌｌａ,ＣＡ ｃａｔａｌｏｇ ＃２００３５０)の指示に従って、ヒト神経カルシ ウムチャンネルα_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を合成した。 ｐｃＤＮＡ１とリボソーム結合部位で始まるα_1D ｃＤＮＡとコーディング配列 の８番目のＡＴＧコドンとを含むプラスミドｐＶＤＣＣIII.ＲＢＳ(Ａ)(実施例I II.Ａ.３.ｄ参照)、ｐｃＤＮＡ１とα₂サブユニットｃＤＮＡをと含むプラスミ ドｐＨＢＣａＣＨα₁Ａ(実施例IV参照)、 及び、ｐｃＤＮＡ１とイントロン配列が欠失しリボソーム結合部位を含むβ₁Ｄ ＮＡとを含むプラスミドｐＨＢＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ)(実施例III参照)を、制 限消化によって直鎖化した。α_1D ｃＤＮＡ及びα₂サブユニットをコードするプ ラスミドをＸｈｏＩで消化し、β₁サブユニットをコードするプラスミドをＥｃ ｏＲＶで消化した。ＤＮＡインサートをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写 した。 ２.卵母細胞の注入 アフリカツメガエル卵母細胞を単離し、コラゲナーゼ処理によって濾胞を除去 し、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１.８ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭの ＭｇＣｌ₂、５ＭのＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.６、２０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び ２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中に１９〜２５℃で注入後２〜５日間維持 した後、記録採取した。卵母細胞に注入された各転写物に、細胞あたり６ｎｇの 特異的ｍＲＮＡを注入し、総量５０ｎｌとした。 ３.細胞内電圧記録 注入卵母細胞の電圧依存性バリウム電流を、２電極電圧固定法〔Ｄａｓｃａｌ ,Ｎ.（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７〕を 用いて試験した。 電圧コマンドを発生しデータを取得して分析するために、ｐＣｌａｍｐ(Ａｘｏ ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)ソフトウエアパッケージを、Ｌａｂｍａｓｔｅｒ １２５ｋＨｚのデータ取得インタフェースと共に使用した。この分析にはＱｕａ ｔｔｒｏ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌも使用した。電流信号を１−５ｋＨｚでデ ィジタル化し、適宜濾過した。浴液は、４０ｍＭのＢａＣｌ₂、３６ｍＭのテト ラエチルアンモニウムクロリド(ＴＥＡ−Ｃｌ)、２ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの４− アミノピリジン、０.１５ｍＭのニフルミン酸(niflumic acid)、５ｍＭのＨＥＰ ＥＳ,ｐＨ７.６を含んでいた。 ａ.ヒト神経カルシウムチャンネルα₁、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転 写物を注入した卵母細胞の電気生理学的分析 非注入の卵母細胞を２電極電圧固定法によって試験すると、７つの分析細胞中 の１つの細胞だけで極めて小さい(２５ｎＡ)内因性の内向きＢａ²⁺電流が検出さ れた。 α_1D、α₂及びβ₁サブユニット転写物を同時注入した卵母細胞は、−９０ｍＶ または−５０ｍＶの静止電位から膜を脱分極させると、内向きのバリウム電流( １５４±１２ ９ｎＡ,ｎ＝２１)が持続した。これらの電流は典型的には、１４０〜７００ｍｓ ｅｃ.の試験パルスを投与したときに失活をほとんど示さなかった。一連の電圧 に脱分極すると、電流は約−３０ｍＶで初めて出現し約０ｍＶでピークになるこ とが判明した。 ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４４を添加すると、電流量が増加し、細胞の脱分極の ときに存在するテール電流の持続が延長し、電流活性化に超分極シフトが誘発さ れた。Ｂａｙ Ｋ ８６４４をＤＭＳＯ中のストック溶液から新しく調製し、還流 ポンプを停止させながら６０μｌの浴に１０×濃縮物として直接導入した。細胞 と接触する最終希釈薬剤溶液のＤＭＳＯ濃度は０.１％を決して超過しなかった 。対照実験は、０.１％のＤＭＳＯが膜電流に全く影響しないことを示した。 ＤＨＰアンタゴニストであるニフェジピンの添加(ＤＭＳＯ中で調製しＢａｙ Ｋ ８６４４の添加に関して記載したように細胞に付加)は、α_1D、α₂及びβ₁サ ブユニットの転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流のかなり の部分(９１±６％,ｎ＝７)を遮断した。内向きのバリウム電流の残留失活成分 は典型的にはニフェジピ ン添加後に残存していた。内向きのバリウム電流は、５０μＭのＣｄ²⁺によって 完全に遮断されたが、１００μＭのＮｉ²⁺によれば約１５％遮断されただけであ った。 α_1D、α₂及びβ₁サブユニットの転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きの バリウム電流に対するωＣｇＴＸの効果を試験した。キャリアータンパク質とし て作用させるために、ωＣｇＴＸ(Ｂａｃｈｅｍ,Ｉｎｃ.,Ｔｏｒｒａｎｃｅ Ｃ Ａ)を０.１％のシトクロムＣ(Ｓｉｇｍａ)を加えた１５ｍＭのＢａＣｌ₂浴液中 で調製した。対照実験は、シトクロムＣが電流に全く影響しないことを示した。 −９０ｍＶの静止電位から０ｍＶまでの一連の電圧パルスを２０ｍｓｅｃ.間隔 で記録した。二価カチオンによるωＣｇＴＸ結合の阻害を減少させるために、１ ５ｍＭのＢａＣｌ₂、７３.５ｍＭのテトラエチルアンモニウムクロリドと４０ｍ ＭのＢａ²⁺記録溶液に等しい残りの成分中で記録を採取した。テール電流の延長 によって識別されるＤＨＰ感受性電流成分に対するωＣｇＴＸの効果を判定する ために、ωＣｇＴＸの添加に先立ってＢａｙ Ｋ ８６４４を細胞に添加した。比 較的高い濃度(１０−１５μＭ)のωＣｇＴＸによって内向きのバリウム電流は弱 く(５４±２９％,ｎ＝ ７)且つ可逆的に遮断された。試験電流及び随伴するテール電流はωＣｇＴＸの 添加後２〜３分以内に徐々に遮断されたが、ωＣｇＴＸを浴から洗浄除去すると 双方が部分的に回復した。 ｂ.ヒト神経カルシウムチャンネルα_1Dをコードする転写物単独またはα_1Dと他 のサブユニットとをコードする転写物を注入した卵母細胞の分析 α_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内 向きのバリウム電流に対するα₂及びβ₁サブユニットの貢献度を、α_1Dサブユニ ット単独による発現及びβ₁サブユニットまたはα₂サブユニットとの併用による 発現によって評価した。α_1D ｃＤＮＡの転写物単独を注入した卵母細胞では、 Ｂａ²⁺電流が全く検出されなかった(ｎ＝３)。α_1D及びβ₁のｃＤＮＡの転写物 を注入した卵母細胞では、−９０ｍＶの静止電位から膜を脱分極したときにα_1D 、α₂及びβ₁のｃＤＮＡの転写物を注入した細胞で観察される電流に類似の小さ い(１０８±３９ｎＡ)Ｂａ²⁺電流が検出されたが、電流量は少なかった。α_1Dを コードするＤＮＡ及びβ₁をコードするＤＮＡの転写物を注入した４つの卵母細 胞のうちの２つでは、Ｂａ²⁺ 電流はＢａｙ Ｋ ８６４４に対して、α_1D、α₁−、α₂−及びβ₁サブユニット をコードする転写物を注入した卵母細胞で発現されたＢａ²⁺電流のＢａｙ Ｋ ８ ６４４感度と同様の感度を示した。 α_1D及びα₂サブユニットをコードする転写物を注入した５つの卵母細胞のう ちの３つでは、−９０ｍＶの静止電位から膜を脱分極したときに極めて小さいＢ ａ²⁺電流(１５−３０ｎＡ)を示した。これらのバリウム電流はＢａｙ Ｋ ８６４ ４に殆どまたは全く反応しなかった。 ｃ．ヒト神経カルシウムチャンネルα₂及び／またはβ₁サブユニットをコードす る転写物を注入した卵母細胞の分析 α_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中 で検出された内向きのバリウム電流に対するα_1D α₁−サブユニットの貢献度を 評価するために、ヒト神経カルシウムチャンネルα₂及び／またはβ₁サブユニッ トをコードする転写物を注入した卵母細胞のバリウム電流を検定した。α₂サブ ユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は検出可能な内向きのバリウム 電流を全く示さなかった(ｎ＝５)。β₁サブユニットをコードする転写物を注入 した卵母細胞は脱分極されると測定可能 な(５４±２３ｎＡ,ｎ＝５)内向きのバリウム電流を示したが、α₂及びβ₁サブ ユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は、β₁をコードするＤＮＡ単 独の転写物を注入した卵母細胞で検出されたよりも約５０％大きい(８０±６１ ｎＡ,ｎ＝１８)内向きのバリウム電流を示した。 β₁サブユニットをコードする転写物またはα₂とβ₁との双方のサブユニット をコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流は典型的には 、膜が−９０ｍＶの静止電位から−３０ｍＶまで脱分極したときに最初に観察さ れ、膜が１０〜２０ｍＶに脱分極したときにピークを示した。巨視的には、α₂ とβ₁との双方のサブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の電流 とβ₁サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の電流とを識別す ることはできなかった。α_1D、α₂及びβ₁サブユニット ｃＤＮＡの転写物を同 時注入した卵母細胞中の電流と対比して、これらの電流は、試験パルス中に有意 な失活を示し静止電位に対して強力な感度を示した。α₂及びβ₁サブユニットを コードする転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流は通常は、 １４０ｍｓｅｃのパルス中にピーク量の１０〜６０％まで失活し、α_1D 、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中の電 流よりも静止電位に対する感度が有意に増加していた。α₂及びβ₁サブユニット をコードする転写物を同時注入した卵母細胞の膜の静止電位を−９０ｍＶから− ５０ｍＶに変化させると、これらの細胞の内向きのバリウム電流の量が約８１％ (ｎ＝１１)減少した。これに対比して、α_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコード する転写物を同時注入した卵母細胞中で測定された内向きのバリウム電流は静止 電位を−９０ｍＶから−５０ｍＶに変化させたときに約２４％(ｎ＝１１)減少し た。 α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きの バリウム電流はα_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を同時注入し た卵母細胞中で観察された内向きのバリウム電流とは薬理学的に違っていた。α₂ 及びβ₁サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞はＢａｙ Ｋ ８６ ４４に不感受性の内向きのバリウム電流を示した(ｎ＝１１)。α₂及びβ₁サブユ ニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中でニフェジピンの静止電位感度 及び電流が観察されたので、ニフェジピン感度の測定は難しい。しかしながら、 α₂及びβ₁サブユ ニットをコードする転写物を同時注入した２つの卵母細胞は−５０ｍＶの静止電 位から脱分極したときに測定可能な(２５〜４５ｎＡ)の内向きのバリウム電流を 示した。これらの電流はニフェジピン(５〜１０μＭ)に感受性でなかった。α₂ 及びβ₁サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の内向きのバリウ ム電流は重金属に対して、α_1D、α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を 注入した卵母細胞中で検出された電流と同じ感度を示した。 ヒト神経α₂及びβ₁サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中で 検出された内向きのバリウム電流は、非注入のアフリカツメガエル卵母細胞中の カルシウム電流に類似する薬理学的及び生物物理学的特性を有していた。このヒ ト神経カルシウムチャンネルβ₁サブユニットのアミノ酸はトランスメンブラン ドメインを形成し得る疎水性セグメントが欠失しているので、組換えβ₁サブユ ニット単独でイオンチャンネルを形成し得るとは考え難い。むしろ、卵母細胞中 に相同内因性α₁サブユニットが存在し、このようなα₁サブユニットによって媒 介される活性がヒト神経β₁サブユニットの発現によって強化される可能性が高 い。 Ｅ.ヒト神経カルシウムチャンネルα_1B、α_2B及びβ_1-2サブユニットをコードす るＤＮＡのＨＥＫ細胞中での発現 １.ＨＥＫ細胞のトランスフェクション ヒト神経α_1B-1、α_2b及びβ_1-2サブユニットの一過的発現をＨＥＫ２９３細 胞中で試験した。５％の限定補充したウシ胎仔血清(Ｈｙｃｌｏｎｅ)とペニシリ ンＧ(１００Ｕ／ｍｌ)及び硫酸ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)とを含む ダルベッコの改質イーグル培地(Ｇｉｂｃｏ)中でＨＥＫ２９３細胞を単層培養物 として増殖させた。ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを前述のようにリ ン酸カルシウムによって媒介した。トランスフェクトした細胞の電圧依存性Ｃａ²⁺ チャンネルによって媒介される内向きのバリウム電流(Ｉ_Ba)を試験した。 ポリリシンをコートしたプレートあたり２×１０⁶の細胞をトランスフェクト した。標準トランスフェクション(１０ｃｍの皿)は、８μｇのｐｃＤＮＡα_1B-1 、５μｇのｐＨＢＣａＣＨα₂Ａ、２μｇのｐＨＢＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ)(実施 例II.Ａ.３、IV.Ｂ及びIII参照)及び２μｇのＣＭＶβ−ガラクトシダーゼ発現 プラスミド及び２０μｇ／ｍｌの一定質量を維持するためのｐＵＣ１８とを含ん で いた。トランスフェクションの４８〜７２時間後に細胞を分析した。β−ガラク トシダーゼ活性に対するｉｎ ｓｉｔｕ組織化学染色(Ｓａｎｅｓら（１９８６） ＥＭＢＯＪ.,５：３１３３)によって測定したトランスフェクション効率(±１０ ％)は概して５０％を上回っていた。 ２.トランスフェクタント電流の電気生理学的分析 ａ.材料及び方法 組換え発現されたＣａ²⁺チャンネルの特性を全細胞パッチ固定法によって試験 した。トランスフェクションの２〜３日後にトランスフェクトＨＫＥ２９３細胞 において記録を採取した。記録採取の２４時間前に、ポリリシンをコートした３ ５ｍｍの組織培養皿(Ｆａｌｃｏｎ,Ｏｘｎａｒｄ,ＣＡ)あたり１００,０００〜 ３００,０００の細胞を平板培養した。水酸化テトラエチルアンモニウム(浴液) で調整した１０ｍＭのＢａＣｌ₂、１２５ｍＭの塩化コリン、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ(ｐＨ＝７.３)で細胞を潅流した。水酸化テトラエチ ルアンモニウムで調整した１３５ｍＭのＣｓＣｌ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍ ＭのＨｅｐｅｓ、４ｍＭのＭｇ−アデノシン三リン酸(ｐＨ＝７.５)をピペット に充填した。Ｓｙｌｇａｒｄ(Ｄ ｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ,Ｍｉｄｌａｎｄ,ＭＩ)コートし、火炎研磨し、充填した ピペットは、ｇｉｇｏｈｍのシールを細胞に設ける前には１〜２メガオームの抵 抗を有していた。 Ｂａｙ Ｋ ８６４４及びニフェジピン(Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ,Ｎａｔｉｃｋ,ＭＡ)をストック溶液(ジメチルスルホキシド中)から調製 し、浴液に希釈した。細胞と接触する最終薬剤溶液中のジメチルスルホキシドの 濃度が０.１％を超過することはなかった。対照実験は、０.１％のジメチルスル ホキシドが膜電流に全く影響しないことを示した。ωＣｇＴＸ(Ｂａｃｈｅｍ,Ｉ ｎｃ.,Ｔｏｒｒａｎｃｅ,ＣＡ)を、キャリアータンパク質として作用する０.１ ％のシトクロムＣ(Ｓｉｇｍａ,Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ)を加えた１５ｍＭのＢａ Ｃｌ₂浴液中で調製した。対照実験はシトクロムＣが電流に全く影響しないこと を示した。これらの薬剤を浴液に溶解し、所与の実験の必要に応じた吹管ピペッ トによって連続的に添加した。室温で(２２℃〜２５℃)、記録採取を行った。典 型的には２〜３.５メガオームのピペットアクセス抵抗に起因する電圧誤差を最 小にするための直列抵抗補償(７０〜８５％) を使用した。０.５〜３ｋＨｚの範囲のサンプリング速度の１／４〜１／５の周 波数で電流信号を濾過した(−３ｄＢ,４極Ｂｅｓｓｅｌ)。電圧コマンドを発生 させ、データをＣＬＡＭＰＥＸ(ｐＣｌａｍｐ,Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ,Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ,ＣＡ)で取得した。報告された全データを直線状リー ク及び容量成分に対して補正した。ＣＬＡＭＰＦＩＴ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ,Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ,ＣＡ)によって電流を指数調整(exponential f it)を行った。 ｂ.結果 トランスフェクタントの流入Ｂａ²⁺電流(Ｉ_Ba)を試験した。α_1B-1、α_2b及び β_1-2サブユニットをコードするＤＮＡでコトランスフェクトした細胞は高い電 圧活性化Ｃａ²⁺チャンネルを発現した。Ｉ_Baは膜が−９０ｍＶの静止電位から− ２０ｍＶに脱分極したときに最初に出現し、１０ｍＶでピーク量に到達した。９ ５細胞中の３９の細胞が(１２の独立トランスフェクション)３０〜２７００ｐＡ の範囲の平均４３３ｐＡのＩ_Baを有していた。平均電流密度は２６ｐＡ／ｐＦで あり、最大密度は１５０ｐＡ／ｐＦであった。典型的にはＩ_Baは記録採取の最初 の５分間で２〜 ２０倍に増加した。長期間の記録採取中には反復する脱分極によってＩ_Baの減少 が生じたが、この減少は通常は１０分以内で２０％を超過することはなかった。 Ｉ_Baは典型的には１０分以内に活性化され、４６〜１０５ｍｓの範囲の高速時定 数及び２９１〜４５３ｍｓ(ｎ＝３)の範囲の低速時定数の双方で失活した。失活 は、複合的な電圧依存性を示し、≧２０ｍＶで誘発されたＩ_Baは、より低い試験 電圧で誘発されたＩ_Baよりも遅く失活した。その理由は恐らく、高い試験電圧で は高速失活成分に比べて低速失活成分の量が増加しているためであろう。 組換えα_1B-1α_2bβ_1-2チャンネルは静止電位に感受性であった。多様な静止 電位における３０〜６０秒のコンディショニング後に測定したＩ_Baの定常状態の 失活は−６０ｍＶと−７０ｍＶの間の静止電位では約５０％であり、−４０ｍＶ の静止電位では約９０％であった。失活したＩ_Baの回復は通常は不完全であり、 静止電位をより大きい負の電位に戻した後１分以内では初期量の５５〜７５％で あった。これはある程度の減少が存在すること、即ち低速の回復が存在すること を示す。 組換えα_1B-1α_2bβ_1-2チャンネルはまた、実験の時間 規模中に０.５〜１０μＭの範囲の濃度のω−ＣｇＴｘによって不可逆的に遮断 された。５μＭの毒素(ｎ＝７)を添加すると２分以内に活性が完全に遮断され、 浴からω−ＣｇＴｘを洗浄した後も１５分間はＩ_Baの回復が観察されなかった。 ｄ²⁺の遮断(５０μＭ)は速く完全で可逆的であった。ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４ ４(１μＭ；ｎ＝４)またはニフェジピン(５μＭ；ｎ＝３)は識別可能な影響を与 えることはなかった。 組換えα_1B-1、α_2b及びβ_1-2サブユニットをコードするＤＮＡでコトランス フェクトした細胞は、主として単一クラスの飽和可能な高親和性ω−ＣｇＴｘ結 合部位を示した。測定された解離定数(Ｋ_d)の値は５４.６±１４.５ｐＭ(ｎ＝４ )であった。β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡまたはα_2bβをコードす るＤＮＡだけを含むベクターでトランスフェクトした細胞は特異的結合を全く示 さなかった。α_1B-1α_2bβトランスフェクト細胞の結合容量(Ｂ_max)は細胞あた り２８,７１０±１１,９５０部位(ｎ＝４)であった。 これらの結果は、α_1B-1α_2bβ_1-2トランスフェクト細胞が高電圧で活性化さ れるＣａ²⁺チャンネル活性を発現し、 この活性は失活する成分を含み、ω−ＣｇＴｘによって不可逆的に遮断され、Ｄ ＨＰに不感受性で静止電位に感受性であることを示す。これらの細胞中に形成さ れたチャンネルの活性化及び不活性化のカイネティクス並びに電圧感受性は、神 経細胞のＮ型Ｃａ²⁺チャンネルの従来のキャラクタリゼーションとほぼ合致する 。 Ｆ.ヒト神経カルシウムチャンネルα_1B-1、α_1B-2、α₂B、β_1-2及びβ_1-3サブ ユニットをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞中での発現 非トランスフエクトＨＥＫ２９３細胞中で有意なＢａ²⁺電流は検出されなかっ た。更に、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞は検出可能なω−ＣｇＴｘ Ｇ ＶＩＡ結合部位を発現しない。 トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中の三量体α_1B、α_2b、β₁タンパク質複 合体の均質集団の発現の近似状態を得るために、α_1B、α_2b、β₁の発現レベル を変化させた。トランスフェクションに使用したα_1B、α_2b、β₁発現プラスミ ドのモル比を調節することによって細胞表面におけるチャンネル複合体の発現効 率及び組立効率を最適にした。タンパク質発現を評価する免疫試薬の非存在下で ほぼ最適のチャンネル発現を決定するために、トランスフェクタントのｍＲＮＡ レベル、ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合及びＣａ²⁺チャンネル電流密度を分析した 。α_2bのモル比が高いほどカルシウムチャンネル活性が増加するらしいと考えら れた。 １.トランスフェクション ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ(Ｇｉｂｃｏ ＃３２０−１９６５ＡＪ)、５５ ％限定／補充ウシ胎仔血清(Ｈｙｃｌｏｎｅ ＃Ａ−２１５１−Ｌ)、１００Ｕ／ ｍｌのペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中に維持した。 Ｃａ²⁺リン酸塩ベースの一過的トランスフェクションを行って前述のように分析 した。細胞を、８μｇのｐｃＤＮＡ１α_1B-1(実施例II.Ｃに記載)、５μｇのｐ ＨＢＣａＣＨα₂Ａ(実施例IV.Ｂ参照)、２μｇのｐＨＢＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ) (β_1-2発現プラスミド；実施例III.Ａ及びIX.Ｅ参照)及び２μｇのｐＣＭＶβ− ｇａｌ〔Ｃｌｏｎｔｅｃｈ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ〕(Ｃａ²⁺チャンネルサブユ ニット発現プラスミドのモル比２：１.８：１)、または、３μｇのｐｃＤＮＡ１ α_1B-1もしくはｐｃＤＮＡ１α_1B-2、１１.２５μｇのｐＨＢＣａＣＨα₂Ａ、０ .７５もしくは１.０μｇのＰＨＢＣａＣＨβ_1bＲＢＳ(Ａ)もしくはｐｃＤＮＡ１ β_1-3及び２μｇのｐＣＭＶβ−ｇａｌ(Ｃａ²⁺チャンネルサブユニット発現プラ スミドのモル比２：１０.９：１)とコトランスフェクトした。β−ガラクトシダ ーゼ発現プラスミドであるプラスミドｐＣＭＶβ−ｇａｌを組織化学的染色によ ってトランスフェクション効率を推定さ せ得るマーカーとしてトランスフェクションに導入した。３個未満のサブユニッ トが発現したときは、ｃＤＮＡインサートが欠失したｐＣＭＶプロモーター含有 ベクターであるｐＣＭＶＰＬ２で置換してトランスフェクション中に等モルのｐ ＣＭＶベースのＤＮＡを維持するようにした。トランスフェクション中のＤＮＡ の総量を２０μｇ／プレートに維持するためにｐＵＣ１８を使用した。 トランスフェクト細胞のＲＮＡのカルシウムチャンネルサブユニットｍＲＮＡ 発現を、ランダムプライムした³²Ｐ標識サブユニット特異的プローブを用いたノ ーザンブロットによって分析した。α_1B-1、α_2b及びβ_1-2発現プラスミド(夫々 ８、５及び２μｇ；モル比＝２：１.８：１)でコトランスフェクトしたＨＥＫ２ ９３細胞は、各Ｃａ²⁺チャンネルサブユニットｍＲＮＡを等しいレベルで発現し なかった。α_1B-1及びβ_1-2のｍＲＮＡは比較的高いレベルで発現されたが、α_{2 b} のｍＲＮＡは有意に低いレベルで発現された。３つのｍＲＮＡの全部で等価の 信号を生じるために必要なオートラジオグラフ露光に基づいて、α_2b転写物のレ ベルは、α_1B-1及びβ_1-2転写物のレベルよりも５〜１０分の１であると推定さ れた。非トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞は検出可能なレベルのα_1B-1、α_2bまたはβ_1-2ｍＲＮＡを発現しな かった。 等価のＣａ²⁺チャンネルサブユニットｍＲＮＡ発現レベルを達成するために、 種々の量のα_1B-1、α_2b及びβ_1-2発現プラスミドを用いた一連のトランスフェ クションを行った。α_1B-1及びβ_1-2のｍＲＮＡがα_2bのｍＲＮＡに比べて極め て高いレベルで発現したので、トランスフェクション実験でα_1B-1及びβ_1-2プ ラスミドの量を減らし、α_2bプラスミドの量を増やした。夫々３、１１.２５及 び０.７５μｇのα_1B-1、α_2b及びβ_1-2発現プラスミド(モル比＝２：１０.９： １)を用いたコトランスフェクションで、各Ｃａ²⁺チャンネルサブユニットｍＲ ＮＡが均等な発現レベルに近づいた。α_1B-1及びβ_1-2発現プラスミドに対する α_2b発現プラスミドの相対的モル量を６倍に増やした。トランスフェクション中 のα_1B-1及びβ_1-2プラスミドの量が２.６７倍減少し、α_2bプラスミドの量が２ .２５倍増加した。ほぼ等しい量のｍＲＮＡレベルを得るために必要なα_2bのモ ル量がα_1B-1及びβ_1-2の６倍であったということは、α_2bのｍＲＮＡの相対量 が５〜１０分の１であるというこれまでの推定と合致する。種々の量の発現プラ スミ ドでトランスフェクトした細胞に対するω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合は、夫々３ 、１１.２５及び０.７５μｇのα_1B-1、α_2b及びβ_1-2プラスミドがチャンネル 複合体の細胞表面発現レベルを改良したことを示した。α_1B-1を一定に維持して α_2b及びβ_1-2発現プラスミドの量を更に増加させても、α_2b及びβ_1-2を一定に 維持してα_1B-1発現プラスミドの量を変化させても、細胞あたりのω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合部位の細胞表面発現レベルがほぼ最適になることが判明した。その 後のすべてのトランスフェクションは、夫々３、１１.２５及び０.７５μｇまた は１.０μｇのα_1B-1もしくはα_1B-2、α_2b及びβ_1-2もしくはβ_1-3発現プラス ミドを用いて実施した。 ２.トランスフェクト細胞に対する¹²⁵Ｉ−ω−ＣｇＴｘＧＶＩＡ結合 分散量の１方向分析(ＡＮＯＶＡ)及び多数を対合比較するＴｕｋｅｙ−Ｋｒａ ｍｅｒテスト(ｐ≦０.０５)を順次に用いてＫ_d及びＢ_maxの統計的分析を行った 。ヒト電圧依存性Ｃａ²⁺チャンネルサブユニット、α_1B-1、α_1B-2、α_2b、β_{1- 2} 、β_1-3、の種々の組み合わせについて¹²⁵Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡの飽和結 合を試験した。アッセイ あたり約２００,０００の細胞を使用したが、α_1B-1、α_1B-2、α_1B-1α_2b、α_{1 B-2} α_2bの組み合わせの場合は、管あたり１×１０⁶細胞を用いて検定した。トラ ンスフェクト細胞は、単一クラスの飽和可能な高親和性結合部位を示した。種々 の組み合わせについて解離定数(Ｋ_d)及び結合容量(Ｂ_max)の値を測定した。結果 を以下にまとめる。 Ｎ.Ｄ.＝検出不能 α_1B-1またはα_1B-2サブユニットが欠失したサブユニットの組み合わせでトラ ンスフェクトした細胞は検出可能な¹²⁵Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合を全く示 さなかった (≦６００部位／細胞)。α_1B-2単独またはα_1B-2α_2bをトランスフェクトしたＨ ＥＫ２９３細胞に対する¹²⁵Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合は信頼できるＳｃ ａｔｃｈａｒｄデータ分析を得るためにはあまりにも低かった。Ｋ_d値及びＢ_max 値の比較から、サブユニットの特定の組み合わせとトランスフェクト細胞の結合 親和性及び容量との間のいくつかの関係が判明した。３つのサブユニット全部で トランスフェクトした細胞(α_1B-1α_2bβ_1-2、α_1B-1α_2bβ_1-3、α_1B-2α_2bβ_{1 -2} またはα_1B-2α_2bβ_1-3トランスフェクタント)中では、４４.３±８.１ｐＭ〜 ５４.９±１１.１ｐＭの範囲のＫ_d値が識別不可能であった(ｐ＞０.０５)。α_2b サブユニットの欠失した２つのサブユニットの組み合わせでトランスフェクトし た細胞(α_1B-1β_1-2、α_1B-1β_1-3、α_1B-2β_1-2またはα_1B-2β_1-3)中では、１ ６.４±１.２〜２２.２±５.８ｐＭの範囲のＫ_d値は３つのサブユニットの組み 合わせよりも有意に低かった(ｐ＜０.０１)。α_1B-1サブユニット単独でトラン スフェクトした細胞は３１.７±４.２ｐＭのＫ_d値を有しており、この値は、α_{2 b} の欠失した２つのサブユニットの組み合わせと違っていなかった(ｐ＜０．０５ )。α_1Bα_2bβ₁対α_1Bβ₁の４つの組 み合わせの比較と同様に、α_1B-1がα_2bと同時発現したとき、Ｋ_dは３１.７±４ .２から８４.６±５.３ｐＭまで有意に増加した(ｐ＜０.０５)。これらのデータ は、α_1B-1、α_1B-1β_1-2、α_1B-1β_1-3、α_1B-2β_1-2またはα_1B-2β_1-3などの サブユニットの組み合わせとα_2bサブユニットとの同時発現が¹²⁵Ｉ−ω−Ｃｇ Ｔｘ ＧＶＩＡに対する細胞表面レセプターの結合親和性を低下させることを示 す。種々のサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞のＢ_max値も かなり違っていた。α_1B-1サブユニット単独でトランスフェクトした細胞は低い が検出可能な数の結合部位(約７５０結合部位／細胞)を発現した。α_1B-1サブユ ニットをα_2bサブユニットと同時発現させると、結合容量は約３倍に増加するが 、β_1-2またはβ_1-3をα_1B-1と同時発現させると表面結合の発現が８または１０ 倍に増加した。３つのサブユニット全部でトランスフェクトした細胞は最大数の 細胞表面レセプターを発現した。α_1B-1α_2bβ_1-3またはα_1B-2α_2bβ_1-3の組み 合わせでトランスフェクトした細胞の結合容量は、β_1-2サブユニットを含む対 応する組み合わせの約２倍であった。同様に、α_1B-1α_2bβ_1-2またはα_1B-1α_{2 b} β_1-3の組み合わせでトランスフェク トした細胞はα_1B-2を含む対応する組み合わせの約２.５倍の結合部位を細胞あ たりに含んでいた。すべての場合に、α_2bサブユニットをα_1B及びβ₁と同時発 現させたときの表面レセプター密度は、対応するα_1B及びβ₁の組み合わせだけ でトランスフェクトした細胞に比べて増加していた。α_1B-1α_2bβ_1-2では約８ 倍、α_1B-1α_2bβ_1-3では１０倍、α_1B-2α_2bβ_1-2では９倍及びα_1B-2α_2bβ_{1- 3} では１３倍であった。従って、Ｂ_max値の比較は、毒素結合サブユニットα_1B-1 またはα_1B-2は、α_2bまたはβ_1-2もしくはβ_1-3サブユニットと同時発現された ときに細胞表面でより効率的に発現および組立られ、α_2bまたはβ₂サブユニッ トが存在するときに極めて効率的に発現される。 ３.電気生理学 全細胞記録法を用いてα_1B-1α_2bβ_1-2及びα_1B-1β_1-2サブユニットの機能性 発現を評価した。周囲細胞と非接触で簡単な形態を有しているトランスフェクト 細胞をトランスフェクションの約４８時間後に記録採取に使用した。ピペット溶 液は、(ｍＭで)１３５ＣｓＣｌ、１０ＥＧＴＡ、１ＭｇＣｌ₂、１０ＨＥＰＥＳ 及び４ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ(ｐＨ７．３、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。外部溶 液は (ｍＭで)１５ＢａＣｌ₂、１２５コリンＣｌ、１ＭｇＣｌ₂及び１０ＨＥＰＥＳ( ｐＨ７.３、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。キャリアーとして作用する０.１％ のシトクロムＣ(Ｓｉｇｍａ)を含むω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ(Ｂａｃｈｅｍ)の外 部溶液を調製した。対照実験は、シトクロムＣがＢａ²⁺電流に全く影響しないこ とを示した。 α_1B-1プラスミドとβ_1-2プラスミドとの相対量を一定に維持して、種々の量 のα_2b発現プラスミドでトランスフェクトした細胞中のＢａ²⁺電流の巨視的電気 生理学特性を試験した。これらのトランスフェクタントの全細胞から記録された Ｂａ²⁺電流(１５ｍＭのＢａＣｌ₂)の振幅及び密度は劇的な違いを示した。３種 類のトランスフェクション(α_2b非含有；〔α_1B-1：α_2b：β_1-2〕のモル比２： １.８：１；〔α_1B-1：α_2b：β_1-2〕のモル比２：１０.９：１)の７〜１１の細 胞からの平均電流を測定した。トランスフェクションにα_2bが含まれていないと きに最小電流(範囲：１０〜２０５ｐＡ)が記録され、α_1B-1α_2bβ_1-2プラスミ ドが比２：１０.９：１であるときの最大電流(範囲：５０〜８３００ｐＡ)が記 録された。この比は、各サブユニット転写物のｍＲＮＡレベルがほぼ等価になっ た値である。 α_2bプラスミドの量を、ほぼ等しい量のサブユニットｍＲＮＡが生じるように調 整すると、平均のピークＢａ²⁺電流は４３３ｐＡから１,８２４ｐＡ(４.２倍)に 増加し、対応する平均電流密度の増加は２６ｐＡ／ｐＦから１２７ｐＡ／ＰＦ( ４.９倍)であった。この増加は、トランスフェクション中に１／２.７倍に減量 したα_1B-1及びβ_1-2発現プラスミドの存在下で生じる。全部のトランスフェク ション中で、Ｂａ²⁺電流の量は正規分布に従っていなかった。 サブユニットの組み合わせを比較しα_2bの効果を判定するために、α_1B-1β_{1- 2} または２：１.８：１(α_1B-1：α_2b：β_1-2)のモル比または２：１０.９：１( α_1B-1：α_2b：β_1-2)のモル比のα_1B-1α_2bβ_1-2でトランスフェクトした細胞 の電流−電圧特性を試験した。α_2b非含有及び１１.２５μｇのα_2b含有(モル比 ２：１０.９：１)の極限実施例は、０ｍＶ〜＋４０ｍＶの試験電位で電流電圧プ ロットの有意な違いを示さなかった(ｐ＜０.０５)。電流電圧プロットのピーク 領域の両側で観察された僅かな差異は正規化に起因すると考えられる。α_1B-1β_1-2 でトランスフェクトした細胞で観察された極めて小さい電流は、試験パルス によって活性化されたバリウム電流に比べてかなり高い 残留リーク成分を有していた。電流電圧プロットを正規化すると、このリークは α_1B-1α_2bβ_1-2でトランスフェクトした細胞中よりもはるかに大きい成分であ り、その結果として、電流電圧プロットの幅が広くなったと考えられる。特に、 α_1B-1β_1-2でトランスフェクトした細胞の電流−電圧プロットがピークの両側 で開いていくという事実から考えると、これが電流電圧プロットの見掛けの差異 の最も正しい説明であろうと考えられる。典型的には、電圧依存性活性化がシフ トすると、電流−電圧プロット全体がシフトするが、これは観察されなかった。 各々のカイネティクスを定性的に比較するために、−９０ｍＶ〜１０ｍＶの試験 パルスの平均応答を正規化しプロットした。どの組み合わせに関しても、全細胞 Ｂａ²⁺電流の活性化または不活性化のカイネティクスの有意な差異は観察されな かった。 Ｇ.ヒト神経カルシウムチャンネルα_1E-3α_2Bβ_1-3及びα_1E-1α２_Bβ_1-3サブユ ニットをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞中での発現 α_1E-1α_2Bβ_1-3及びα_1E-3α_2Bβ_1-3並びにα_1E-3の機能性発現を全細胞記録 法を用いて評価した。 １.方法 周囲細胞と非接触で簡単な形態を有する一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞の記録をトランスフェクションの２日後に採取した。 トランスフェクトした組換えカルシウムチャンネルからのバリウム電流を記録 するためにピペット充填に使用した内部溶液は、(ｍＭで)１３５ＣｓＣｌ、１０ ＥＧＴＡ、１ＭｇＣｌ₂、１０ＨＥＰＥＳ及び４ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ(ｐＨ７.４ −７.５、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。バリウム電流を記録するための外部溶 液は、(ｍＭで)１５ＢａＣｌ₂、１５０コリンＣｌ、１ＭｇＣｌ₂及び１０ＨＥＰ ＥＳ及び５ＴＥＡ−ＯＨ(ｐＨ７.３、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。Ｃａ²⁺を Ｂａ²⁺に置換した実験では、細胞外溶液を完全に交換しＢａ²⁺とＣａ²⁺との混合 を完全に防止するために層流室を使用した。キャリァーとして作用する０.１％ のシトクロムＣを含むω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡの外部溶液を調製した。加圧した 吹管ピペットによって毒素を添加した。直列抵抗を７０−８５％補償し、直列抵 抗からの電圧誤差が５ｍＶ未満のときにだけ電流を分析した。リーク抵抗及びキ ャパシタンスは、ｐＣｌａｍｐ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)によって作 成されたＰ／−４プロ トコルによって観察された標準化電流を減算することによって修正した。 ２.電気生理学的結果 α_1E-1α_2bβ_1-3またはα_1E-3α_2bβ_1-3は全細胞パッチ固定記録法によって強 いバリウム電流を示した。α_1E-3α_2Bβ_1-3を発現する細胞は、α_1E-1α_2bβ_1-3 を発現する細胞よりも大きいピーク電流を有していた。更に、活性化及び不活性 化のカイネティクスは、α_1Eカルシウムチャンネルを発現する細胞中よりも明ら かに実質的に速い。α_1E-3単独を発現するＨＥＫ２９３細胞は有意な程度の機能 性カルシウムチャンネルを含み、α_1Eα_2bβ_1-3を発現する細胞と同様の特性を 有するが実質的により小さいピークバリウム電流を有する。従って、α_1Eの場合 、α₂及びβ₁サブユニットはα_1E媒介カルシウムチャンネルの機能性発現のため には不要であるが、機能性カルシウムチャンネルの数を実質的に増加させる。 α_1Eα_2bβ_1-3を発現する細胞の電流電圧特性の試験は、α_1E-3α_2bβ_1-3が高 電圧活性化カルシウムチャンネルであり、同じくα_2bとβ₁、及びα_1Bとα_1Dを 発現する他の神経カルシウムチャンネルをやや下回る正の電位でピーク 電流に達することを示す。α_1E-1α_2bβ_1-3及びα_1E-3α_2bβ_1-3の電流電圧特性 はα_1B-1α_2bβ_1-3の電流電圧特性とは統計的に違っている。α_1E-1α_2bβ_1-3及 びα_1E-3α_2bβ_1-3の電流電圧曲線は、α_1E-3単独の電流電圧曲線と同様に約＋ ５ｍＶでピークに達する。 双方のプレパルス(２００ｍｓ)を用いる失活及び定常状態の失活のカイネティ クス及び電圧依存性を試験した。α_1E媒介カルシウムチャンネルは従来のクロー ン化されたカルシウムチャンネル及び他の電圧活性化カルシウムチャンネルに比 べて速やかに失活する。α_1E-1α_2bβ_1-3媒介カルシウムチャンネルは速やかに 失活し、従って、比較的短い(２００ｍｓ)プレパルス及び長いプレパルス(＞２ ０ｓ定常状態失活)の双方に感受性であるが、定常状態失活から速やかに回復す る。速やかな失活のカイネティクスは２つの成分を有しており、一方は約２５ｍ ｓの時定数をもち、他方は約４００ｍｓの時定数をもつ。 α_1E媒介カルシウムチャンネルが低電圧活性化カルシウムチャンネルの特性を 有するか否かを判断するために、−６０〜＋９０ｍＶの範囲の試験パルスによっ て活性化されたテール電流を−６０ｍＶで詳細に測定した。−６０ｍＶ で記録されたテール電流は、１５０〜３００μｓの単一指数によって十分に調整 できた。この値は、低電圧活性化カルシウムチャンネルで典型的に観察された値 よりも少なくとも１桁速い。 α_1E-3α_2bβ_1-3を発現するＨＥＫ２９３細胞は、荷電キャリヤーとＢａ²⁺及 びＣａ²⁺によって搬送される電流とが異なる電流−電圧特性を有するときにＢａ²⁺ によってより多くの電流を流す。更に、不活性化の時間的進行はより緩徐であ り、プレパルスの不活性化の量はＣａ²⁺が荷電キャリヤーであるときにより少な い。 本発明をある程度詳細に説明して来たが、通常の知識をもつ当業者に明らかな 修正が本発明の範囲を逸脱することなく可能であろう。このような修正は当業者 に明らかであるから、本発明は請求の範囲によってのみ限定されることを理解さ れたい。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年９月２１日 【補正内容】 ３４条補正 請求の範囲 １．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2及びα_1E-3から成る群から選択されたヒト カルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む 単離されたＤＮＡフラグメント。 ２．α₁サブユニットがα_1A-1またはα_1A-2であり、 α_1A-1サブユニットが配列番号２２に示されるアミノ酸配列または機能的に等 価のその変異体を含み、 α_1A-2サブユニットが配列番号２３に示されるアミノ酸配列または機能的に等 価のその変異体を含む 請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。 ３．サブユニットが配列番号２２または２３で示されるアミノ酸配列を含む請求 項２に記載のＤＮＡフラグメント。 ４．α₁サブユニットがα_1E-1であり、 α_1E-1サブユニットが配列番号２４に示されるアミノ酸配列または機能的に等 価のその変異体を含む 請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。 ５．α₁サブユニットがα_1E-3であり、 α_1E-3サブユニットが配列番号２５に示されるアミノ酸 配列または機能的に等価のその変異体を含む 請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。 ６．サブユニットが配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む請求項４に記載 のＤＮＡフラグメント。 ７．サブユニットが配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載 のＤＮＡフラグメント。 ８．α₁サブユニットがα_1C-2であり、 α_1C-2サブユニットが配列番号３６に示されるアミノ酸配列または機能的に等 価のその変異体を含む 請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。 ９．α_1C-2サブユニットが配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む請求項８ に記載のＤＮＡフラグメント。 １０．ヒトカルシウムチャンネルのβ₂またはβ₄サブユニットをコードするヌク レオチド配列を含む単離されたＤＮＡフラグメント。 １１．サブユニットがβ_2C、β_2Dまたはβ_2Eサブユニットである請求項１０に記 載のＤＮＡフラグメント。 １２．β_2C、β_2Dまたはβ_2Eサブユニットが配列番号２６、２９または３０に示 されるアミノ酸配列または機能的に等価のその変異体を含む請求項１１に記載の ＤＮＡフラグメ ント。 １３．β_2C、β_2Dまたはβ_2Eサブユニットが配列番号２６、２９または３０に示 されるアミノ酸配列を含む請求項１２に記載のＤＮＡフラグメント。 １４．ヒトカルシウムチャンネルのβ₃サブュニットをコードするＤＮＡフラグ メント。 １５．サブユニットがβ_3-1サブユニットである請求項１４に記載のＤＮＡフラ グメント。 １６．β_3-1サブユニットが配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む請求項 １５に記載のＤＮＡフラグメント。 １７．サブユニットがβ₄サブユニットであり、 β4サブユニットが配列番号２７に示されるアミノ酸配列または機能的に等価 のその変異体を含む 請求項１０に記載のＤＮＡフラグメント。 １８．サブユニットが配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む請求項１７に 記載のＤＮＡフラグメント。 １９．α_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、α_1E-1及びα_1E-3から成るサブユニットの群か ら選択されたヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする異種Ｄ ＮＡを含む真核細胞。 ２０．α₁サブユニットが配列番号２２、２３、２４、２５または３６のいずれ かに示すアミノ酸配列を含む請求項１９に記載の真核細胞。 ２１．α₁サブユニットが、α_1A-1、α_1A-2またはα_1C-2サブユニットである請 求項２０に記載の真核細胞。 ２２．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする異種ＤＮＡと ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする異種ＤＮＡとを含み、 少なくとも１つのサブユニットが、α_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、β₂、β_3-1及びβ₄ サブユニットから成るサブユニットの群から選択される真核細胞。 ２３．βサブユニットがβ_2C、β_2Dまたはβ_2Eから成るサブユニットの群から選 択される請求項２２に記載の真核細胞。 ２４．β₂サブユニットが、配列番号２６、２９または３０に示されるアミノ酸 配列または機能的に等価のその変異体を含むβ_2C、β_2Dまたはβ_2Eサブユニット である請求項２２または２３に記載の真核細胞。 ２５．β₂サブユニットが、配列番号２６、２９または３０に示されるアミノ酸 配列を含むβ_2C、β_2Dまたはβ_2Eサ ブユニットである請求項２３または２４に記載の真核細胞。 ２６．βサブユニットがβ₄サブユニットである請求項２２に記載の真核細胞。 ２７．β₄サブユニットが、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列によって コードされるアミノ酸配列または機能的に等価のその変異体を含む請求項２６に 記載の真核細胞。 ２８．β₄サブユニットが、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列によって コードされるアミノ酸配列を含む請求項２６に記載の真核細胞。 ２９．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞及びマウスＬ細胞から成る群から選択される請求項１９に記載の真核細胞 。 ３０．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞及びマウスＬ細胞から成る群から選択される請求項２２に記載の真核細胞 。 ３１．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする異種核酸を細 胞に導入することを含む方法によって産生される機能性異種カルシウムチャンネ ルを有する真核細胞であって、 α₁サブユニットがα_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、α_1E-1及びα_1E-3から成る群か ら選択され、 異種カルシウムチャンネルが異種核酸によってコードされた少なくとも１つの サブユニットを含み、 異種イオンチャンネルがカルシウムチャンネルだけであることを特徴とする真 核細胞。 ３２．α₁サブユニットが配列番号２２、２３、２４、２５もしくは３６のいず れかによってコードされたアミノ酸配列または機能的に等価のその変異体を有す る請求項３１に記載の真核細胞。 ３３．α₁サブユニットが配列番号２２、２３または３６のいずれかによってコ ードされたアミノ酸配列を有する請求項３１に記載の真核細胞。 ３４．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする核酸を細胞に 導入し、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする核酸を細胞に 導入する段階を含む方法によって産生される機能性異種カルシウムチャンネルを 有する真核細胞であって、 サブユニットの少なくとも１つがα_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1E-3、β_2C、β_2D 、β_2E、β₃及びβ₄サブユニット から成る群から選択され、 少なくとも１つのサブユニットが配列番号１９、２２、２３、２４、２５、２ ６、２７、２８、２９、３０もしくは３６のいずれかに示されるアミノ酸配列ま たは前記配列番号のいずれかに示されるＤＮＡによってコードされたアミノ酸配 列または機能的に等価のその変異体を含み、 異種カルシウムチャンネルが異種核酸によってコードされる少なくとも１つの サブユニットを含み、 異種イオンチャンネルがカルシウムチャンネルだけであることを特徴とする真 核細胞。 ３５．少なくとも１つのサブユニットが配列番号１９、２２、２３、２６、２７ 、２８、２９、３０もしくは３６のいずれかに示されるアミノ酸配列または前記 配列番号のいずれかに示されるＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を含む 請求項３４に記載の真核細胞。 ３６．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞、マウスＬ細胞及び両生類卵母細胞から成る群から選択される請求項３１ に記載の真核細胞。 ３７．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細 胞、アフリカミドリザル細胞、マウスＬ細胞及び両生類卵母細胞から成る群から 選択される請求項３４に記載の真核細胞。 ３８．βサブユニットがヒトカルシウムチャンネルのβ_2C、β_2D、β_2E、β₃ま たはβ₄サブユニットである請求項３４に記載の真核細胞。 ３９．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする核酸、ヒトカ ルシウムチャンネルのα₂サブユニットをコードする核酸を細胞に導入し、ヒト カルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする核酸を該細胞に導入する段 階を含む方法によって産生される機能性異種カルシウムチャンネルを有する真核 細胞であって、 α₂サブユニットがヒトカルシウムチャンネルのα_2bサブユニットであり、α₁ サブユニットがヒトカルシウムチャンネルのα_1A、α_1C、α_1B、α_Dまたはα_1E サブユニットであり、βサブユニットがヒトカルシウムチャンネルのβ₃または β₄サブユニットであり、 α₁サブユニットが配列番号１、２、３、６、７、８、２２、２３、２４、２ ５または３６のいずれかに示されたアミノ酸配列を含み、α_2bサブユニットが配 列番号１１に 示されるアミノ酸配列を含み、βサブユニットが配列番号１９に示されたアミノ 酸配列を含み、または、前記配列番号のいずれかによってコードされる機能的に 等価のサブユニットの変異体であることを特徴とする真核細胞。 ４０．カルシウムチャンネルがα_1A-2、α_2b、β_3-1サブユニットまたはα_1B-1 、α_2b、β_3-1サブユニットを含む請求項３９に記載の真核細胞。 ４１．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする核酸、ヒトカ ルシウムチャンネルのα₂サブユニットをコードする核酸を細胞に導入し、ヒト カルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする核酸を該細胞に導入する段 階を含む方法によって産生される機能性異種カルシウムチャンネルを有する真核 細胞であって、、 カルシウムチャンネルがヒトカルシウムチャンネルのα_2bサブユニット、ヒト カルシウムチャンネルのα_1Bまたはα_1Dサブユニット及びヒトカルシウムチャン ネルのβ_1-1β_1-2またはβ_1-3サブユニットを含み、 α₁サブユニットが配列番号１、２、７または８によってコードされたアミノ 酸配列を含み、α_2bサブユニットは配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含み 、βサブユニッ トが配列番号９、１０及び３３〜３５に示されたアミノ酸配列を含み、または、 これらのサブユニットが前記配列番号のいずれかによっコードされたサブユニッ トの機能的に等価の変異体を含むことを特徴とする真核細胞。 ４２．カルシウムチャンネルがα_1B-1、α_2b、β_1-2サブユニットまたはα_1B-1 、α_2b、β_1-3サブユニット、またはα_1B-2、α_2b、β_1-3サブユニットを含む請 求項４１に記載の真核細胞。 ４３．カルシウムチャンネルの活性を変調する化合物を同定する方法であって、 機能性異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞を前記化合物とカルシウム チャンネル選択イオンとを含有する溶液に懸濁させ、 細胞の細胞膜を脱分極し、 細胞に流入する電流を検出する段階を含み、ここで、 異種カルシウムチャンネルが、細胞に異種のＤＮＡまたはＲＮＡによってコー ドされる少なくとも１つのヒトカルシウムチャンネルサブユニットを含み、 少なくとも１つのサブユニットがα_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1E-3、α_1C-2、 β_2C、β_2D、β_2E、β₃サブユニッ ト及びβ₄サブユニットから成る群から選択され、配列番号１９、２２、２３、 ２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０もしくは３６のいずれかに示された アミノ酸配列もしくは前記配列番号のいずれかに示されたヌクレオチド配列によ ってコードされたアミノ酸配列、または機能的に等価のその変異体を含み、 検出される電流が、同じカルシウムチャンネル選択イオンが存在するが前記化 合物の非存在下で同じまたは実質的に等しい細胞を脱分極することによって生じ る電流とは異なることを特徴とする方法。 ４４．異種ＤＮＡまたはＲＮＡがβ₃サブユニットをコードすることを特徴とす る請求項４３に記載の方法。 ４５．異種ＤＮＡまたはＲＮＡがβ₄サブユニットをコードすることを特徴とす る請求項４３に記載の方法。 ４６．ヒトカルシウムチャンネルのαサブユニットのタイプまたはαサブユニッ トのサブタイプに結合する抗体から成る群から選択されるサブユニット特異的抗 体であって、サブユニットがα_1A、α_1C、α_1E、α_1Dまたはα_1Bのタイプのα₁ サブユニットであり、サブユニットが配列番号１、２、３、６、７、８、２２、 ２３、２４、２５または３６ のいずれかに示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とするサブユニット特異的 抗体。 ４７．抗体がサブタイプ特異的であり、α₁サブユニットがα_1A、α_1E及びα_1B である請求項４６に記載の抗体。 ４８．サブユニットのサブタイプがα_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、α_1E-1またはα_{1E -3} である請求項２９に記載の抗体。 ４９．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1E-3、β_2C、β_2D、β_2E及びβ₄から成るサ ブユニットの群から選択されるヒトカルシウムチャンネルのサブユニットをコー ドする核酸に由来の少なくとも３０の実質的に連続の塩基を含む少なくとも３０ 塩基の長さのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡプローブ。 ５０．α_1E-1、α_1E-3、β_2C、β_2D、β_2E及びβ₄サブユニットから成るサブユ ニットの群から選択されるヒトカルシウムチャンネルのサブユニットをコードす る核酸に由来の少なくとも１６の実質的に連続の塩基を含む少なくとも１６塩基 の長さのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡプローブ。 ５１．少なくとも低緊縮性の条件下に請求項４９または５０のプローブを核酸フ ラグメントのライブラリーにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズするフラグメ ントを選択する段階を含むヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコ ードする核酸の同定方法。 ５２．少なくとも低緊縮性の条件下に請求項４９または５０のプローブを細胞も しくは組織中で発現されたｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡにハ イブリダイズさせ、これによりサブユニットをコードするｍＲＮＡを発現する細 胞または組織を同定する段階を含むカルシウムチャンネルサブユニットをコード する核酸を発現する細胞または組織の同定方法。 ５３．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2、α_1E-3、β_3-1、β_2C、β_2D、β_2E及 びβ₄から成る群から選択される実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルサブ ユニット。 ５４．配列番号１９、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０もしく は３６のいずれかに示されたアミノ酸配列または機能的に等価のその変異体を含 むサブユニットから選択される実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルサブユ ニット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 ウイリアムス，マーク・イー アメリカ合衆国、カリフオルニア・92009、 カールスバツド、ペア・ツリー・ドライ ブ・6919 (72)発明者 マツキユー，アン・エフ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91942、 ラ・メサ、コロラド・アベニユー・6939 (72)発明者 ギルスパイ，アリソン アメリカ合衆国、カリフオルニア・92129、 サン・デイエゴ、テキサナ・ストリート・ 12922

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2及びα_1E-3から成る群から選択されるα₁ サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡフラグメン ト。 ２．α₁サブユニットがα_1A-1またはα_1A-2である請求項１に記載のＤＮＡフラ グメント。 ３．α₁サブユニットがα_1E-1またはα_1E-3である請求項１に記載のＤＮＡフラ グメント。 ４．α₁サブユニットがα_1C-2である請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。 ５．β₂、β₃及びβ₄から成る群から選択されるβサブユニットをコードするヌ クレオチド配列を含む単離されたＤＮＡフラグメント。 ６．サブユニットがβ_2C、β_2Dまたはβ_2Eサブユニットである請求項５に記載の ＤＮＡフラグメント。 ７．サブユニットがβ₃サブユニットである請求項５に記載のＤＮＡフラグメン ト。 ８．サブユニットがβ_3-1サブユニットである請求項７に記載のＤＮＡフラグメ ント。 ９．サブユニットがβ₄サブユニットである請求項５に記 載のＤＮＡフラグメント。 １０．サブユニットが配列番号２８に示すアミノ酸配列を有する請求項９に記載 のＤＮＡフラグメント。 １１．α_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、α_1E-1及びα_1E-3から成る群から選択されるα₁ サブユニットをコードする異種ＤＮＡを含む真核細胞。 １２．α₁サブユニットをコードする異種ＤＮＡとβサブユニットをコードする 異種ＤＮＡとを含み、少なくとも１つのサブユニットが、α_1A-1、α_1A-2、α_{1C -2} 、α_1E-1、α_1E-3、β_2C、β_2D、β_2E、β_3-1及びβ₄サブユニットから成るサ ブユニットの群から選択される真核細胞。 １３．βサブユニットがβ₂サブユニットである請求項１２に記載の真核細胞。 １４．βサブユニットがβ₄サブユニットである請求項１２に記載の真核細胞。 １５．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞及びマウスＬ細胞から成る群から選択される請求項１１に記載の真核細胞 。 １６．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞及びマウスＬ細胞から成る群 から選択される請求項１２に記載の真核細胞。 １７．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする異種核酸を細 胞に導入することを含む方法によって産生される機能性異種カルシウムチャンネ ルを有する真核細胞であって、 α₁サブユニットがα_1A-1、α_1A-2、α_1C-2、α_1E-1及びα_1E-3から成る群か ら選択され、 異種カルシウムチャンネルが異種核酸によってコードされる少なくとも１つの サブユニットを含み、 異種イオンチャンネルがカルシウムチャンネルだけであることを特徴とする真 核細胞。 １８．ヒトカルシウムチャンネルのα₁サブユニットをコードする核酸を細胞に 導入し、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする核酸を細胞に 導入することを含む方法によって産生される機能性異種カルシウムチャンネルを 有する真核細胞であって、 サブユニットの少なくとも１つがα_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1E-3、β_2C、β_2D 、β_2E、β₃及びβ₄サブユニットから成る群から選択され、 異種カルシウムチャンネルが異種核酸によってコードさ れる少なくとも１つのサブユニットを含み、 異種イオンチャンネルがカルシウムチャンネルだけであることを特徴とする真 核細胞。 １９．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞、マウスＬ細胞及び両生類卵母細胞から成る群から選択される請求項１７ に記載の真核細胞。 ２０．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザ ル細胞、マウスＬ細胞及び両生類卵母細胞から成る群から選択される請求項１８ に記載の真核細胞。 ２１．βサブユニットがヒトカルシウムチャンネルのβ₂、β₃及びβ₄サブユニ ットである請求項１８に記載の真核細胞。 ２２．カルシウムチャンネルがヒトカルシウムチャンネルのα_2bサブユニット、 ヒトカルシウムチャンネルのα_1B-1サブユニット及びヒトカルシウムチャンネル のβ₃サブユニットを含む請求項１８に記載の真核細胞。 ２３．カルシウムチャンネルが、α_1B-1、α_2b及びβ_1-2サブユニットを含むか 、α_1B-1、α_2b及びβ_1-3サブユニッ トを含むか、α_1B-2、α_2b及びβ_1-3サブユニットを含むか、α_1A-2、α_2b及び β_3-1サブユニットを含むか、または、α_1B-1、α_2b及びβ_3-1サブユニットを含 む請求項１８に記載の真核細胞。 ２４．カルシウムチャンネルが、ヒトカルシウムチャンネルのα_2bサブユニット と、ヒトカルシウムチャンネルのα_1Bまたはα_1Dサブユニットと、ヒトカルシウ ムチャンネルのβ_1-1、β_1-2またはβ_1-3サブユニットとを含む請求項１８に記 載の真核細胞。 ２５．カルシウムチャンネルの活性を変調する化合物を同定する方法であって、 機能性異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞を化合物とカルシウムチャ ンネル選択イオンとを含有する溶液に懸濁させ、 該細胞の細胞膜を脱分極し、 該細胞に流れる電流を検出する段階を含み、ここで、 異種カルシウムチャンネルが細胞に異種のＤＮＡまたはＲＮＡによってコード される少なくとも１つのヒトカルシウムチャンネルサブユニットを含み、 少なくとも１つのサブユニットがα_1A-1、α_1A-2、α_1E -1、α_1E-3、α_1C-2、β_2C、β_2D、β_2E、β₃サブユニット及びβ₄サブユニット から成る群から選択され、 検出される電流が、同じカルシウムチャンネル選択イオンが存在するが前記化 合物の非存在下で同じまたは実質的に等しい細胞を脱分極することによって生じ る電流とは異なることを特徴とする方法。 ２６．異種ＤＮＡまたはＲＮＡがβ₃サブユニットをコードすることを特徴とす る請求項２５に記載の方法。 ２７．異種ＤＮＡまたはＲＮＡがβ₄サブユニットをコードすることを特徴とす る請求項２６に記載の方法。 ２８．ヒトカルシウムチャンネルのαサブユニットのタイプまたはαサブユニッ トのサブタイプに結合する抗体から成る群から選択され、サブユニットがα₁サ ブユニットであることを特徴とするサブユニット特異的抗体。 ２９．抗体がサブタイプ特異的であり、α₁サブユニットがα_1A、α_1E、及びα_{1 B} である請求項２８に記載の抗体。 ３０．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2、α_1E-3、β_3-1、β_2C、β_2D、β_2E及 びβ₄から成るサブユニットの群から選択されるヒトカルシウムチャンネルのサ ブユニットをコードする核酸からの少なくとも１６の実質的に連続する塩 基を含む少なくとも１６塩基の長さのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡプローブ。 ３１．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2、α_1E-3、β_3-1、β_2C、β_2D、β_2E及 びβ₄サブユニットから成るサブユニットの群から選択されるヒトカルシウムチ ャンネルのサブユニットをコードする核酸からの少なくとも３０の塩基を含む請 求項３０に記載のプローブ。 ３２．少なくとも低緊縮性の条件下に請求項３０に記載のプローブを核酸フラグ メントのライブラリーにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズするフラグメント を選択する段階を含むヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする核酸 の同定方法。 ３３．少なくとも低緊縮性の条件下に請求項３０に記載のプローブを細胞もしく は組織中で発現されたｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡにハイブ リダイズさせ、これによりサブユニットをコードするｍＲＮＡを発現する細胞ま たは組織を同定する段階を含むカルシウムチャンネルサブユニットをコードする 核酸を発現する細胞または組織の同定方法。 ３４．α_1A-1、α_1A-2、α_1E-1、α_1C-2、α_1E-3、β_3-1、 β_2C、β_2D、β_2E及びβ₄から成る群から選択される実質的に純粋なヒトカルシ ウムチャンネルサブユニット。