DE60125227T2

DE60125227T2 - Verfahren zum screening von diabetes-heilverfahren

Info

Publication number: DE60125227T2
Application number: DE60125227T
Authority: DE
Inventors: c/o Astellas Pharma Inc. Takahide OHISHI; c/o Astellas Pharma Inc. Jun TAKASAKI; c/o Astellas Pharma Inc. Mitsuyuki MATSUMOTO; c/o Astellas Pharma Inc. Tetsu SAITO; c/o Astellas Pharma Inc. Masazumi KAMOHARA; c/o Astellas Pharma Inc. Takatoshi SOGA; c/o Astellas Pharma Inc. Shigeru YOSHIDA; c/o Astellas Pharma Inc. Yoshitaka UEDA
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2021-12-01
Also published as: EP1770159A1; EP1338651A4; JPWO2002044362A1; EP1338651B1; DE60125227D1; EP1338651A1; EP1338651B9; ATE348152T1; ES2280435T3; US7662775B2; US20050136484A1; US20100144677A1; AU2002218509A1; US20030180813A1; JP3438186B2; WO2002044362A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren für Mittel zur Behandlung von Diabetes.
STAND DER TECHNIK
Diabetes ist eine Erkrankung mit einer persistenten Hyperglykämie und es wird angenommen, dass viele Umweltfaktoren, wie auch genetische Faktoren, einen Diabetes auslösen. Ein Hauptfaktor, der Blutglukose reguliert, ist Insulin und es ist bekannt, dass eine Defizienz an Insulin oder eine redundante Gegenwart verschiedener Faktoren, die die Aktivitäten von Insulin inhibieren (wie z.B. genetische Faktoren, fehlende körperliche Bewegung, Übergewicht, Stress oder ähnliches) zu einer Hyperglykämie führen.
Es gibt zwei Hauptarten des Diabetes, die in einen Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (IDDM) klassifiziert werden, ausgelöst durch eine verminderte Insulinsekretion aus dem Pankreas, aufgrund einer Autoimmunerkrankung oder ähnlichem und einen nicht-Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (NIDDM), der durch eine verminderte Insulinsekretion aus dem Pankreas, aufgrund eines erschöpften Pankreas ausgelöst wird, mit kontinuierlicher Hypersekretion von Insulin. Es wird angenommen, dass 95% oder mehr der japanischen Patienten mit Diabetes NIDDM sind und es gibt ein Problem im Hinblick auf die Zahl von Patienten, die entsprechend den Veränderungen des Lebensstils ansteigt.
Als Behandlung für Diabetes werden eine Diättherapie, eine Kinesitherapie, eine Heilung des Übergewichts oder ähnliches im wesentlichen in milden Fällen durchgeführt, ein orales Medikament für den Diabetes (z.B. ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, wie Sulfonylharnstoffe) wird verabreicht, wenn die Symptome schwerer werden und eine Insulinpräparation wird in besonders schwerwiegenden Fällen verabreicht [Ryuzo Abe und Masato Kasuga, "An Approach to EBM on the Treatment of Diabetes Mellitus", Nakado, 1997; Richard A. Harrigan et al., Annals of Emergency Medicine, 38(1), 68-78, 2001; und Japan Diabetes Society, "Tounyoubyou chiryou gaido 2000 (Treatment of diabetes mellitus, Guide 2000)", Bunkodo, 2000].
Die Sulfonylharnstoffe stimulieren die Pankreas-β-Zellen und unterstützen die Insulinsekretion. Die Zeitabstimmung der Insulinsekretion und die Menge des sezernierten Insulins werden jedoch durch das Timing der Medikamentenverabreichung und seine Dosis entschieden, unabhängig vom Blutglukoseniveau. Daher tritt manchmal eine Hypoglykämie als Nebenwirkung auf, ausgelöst durch einen Erhalt der Medikamentenaktivität. Weiterhin treten Symptome im Verdauungssystem, wie ein Appetitverlust, auf. Weiterhin sind Sulfonylharnstoffe für Patienten mit einer Leber- oder Nierenfehlfunktion oder solche mit einer schweren Ketose contraindiziert [Richard A. Harrigan et al., Annals of Emergency Medicine, 38(1), 68-78, 2001].
Die Insulinpräparationen vermindern sicherlich die Blutglukose. Sie müssen jedoch durch Injektion verabreicht werden und führen manchmal zu einer Hypoglykämie [McCrimmon RJ et al., Diabete. Metab., 20(6), 503-512, 1994].
Wie oben beschrieben, haben die konventionell verwendeten Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion und Insulinpräparationen diese Probleme. Daher besteht ein Wunsch nach Mitteln, die zu einer fortgeschrittene Kontrolle der Blutglukose in der Lage sind, d.h. Mittel, die nicht einfach die Blutglukose vermindern, sondern die Glutglukose in einem normalen Bereich steuern können.
Es ist bekannt, dass GLP-1 (Glucagon-ähnliches Peptid-1), PACAP (Hypophysenhormon-Adenylatcyclase-aktivierendes Polypeptid) und GIP (gastrisch inhibitorisches Polypeptid) ein Signal in eine Zelle über ihre eigenen spezifischen G-protein-gekoppelten Rezeptoren transduzieren und die Insulinsekretion unterstützen. Diese G-protein-gekoppelten Rezeptoren sind Rezeptoren, die an ein Gs-Protein gekoppelt sind, die Adenylatcyclase aktivieren und eine intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen. Weiterhin ist bekannt, dass ein GLP-1-Rezeptor, ein PACAP-Rezeptor und ein GIP-Rezeptor die Insulinsekretion durch Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration unterstützen. Es ist jedoch bekannt, dass die Expression dieser G-Proteingekoppelten Rezeptoren im Pankreas verteilt, jedoch nicht Pankreas spezifisch ist [Dunphy JL et al., Mol. Cell. Endocrinol., 141(1-2), 179-186, 1998; Timothy James Kieffer et al., Endocrine Reviews, 20(6), 876-913, 1999; David Vaudry et al., Pharmacological Reviews, 52(2), 269-324, 2000; Jean Claude Reubi et al., Cancer Research, 60, 3105-3112, 2000; und Ted B. Usdin et al., Endocrinology, 133(6), 2861-2870, 1993] und dass die Aktivierung des GIP-Rezeptors bei NIDDM nicht effektiv ist (Michael A. Nauck et al., J. Clin. Invest., 91, 301-307, 1993).
In diesem Zusammenhang wird über Nukleotidsequenzen berichtet, die dieselbe Aminosäure, wie diejenige eines "Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz mit SEQ ID Nr. 2" kodiert, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und die durch die Nukleotidsequenzen kodierten deduzierten Aminosäuresequenzen (WO00/22131, WO00/31258 und WO00/50562 Veröffentlichungen). Die Funktionen des "Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2" im Körper werden in diesen Berichten jedoch nicht deutlich beschrieben. Beispielsweise wird das Polypeptid als ein menschlicher Orphan-G-Protein-gekoppelter Rezeptor in den Veröffentlichungen WO00/22131 und WO00/31258 beschrieben. Die WO00/50562-Veröffentlichung listet als Verwendung von sowohl Agonisten als auch Antagonisten des "Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2" viele derselben Erkrankungen im Hinblick auf sowohl die Agonisten als auch Antagonisten auf, offenbart jedoch keine Stütze dafür, dass die Agonisten oder Antagonisten für die Behandlung dieser Erkrankungen nützlich sind.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines geeigneten Screening-Systems, um eine Substanz zu erhalten, die als Mittel zur Behandlung von Diabetes nützlich ist (insbesondere eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion, insbesondere bei hoher Glukosekonzentration), das die Glutglukose innerhalb eines normalen Bereichs kontrollieren kann.
Mit dem Ziel die oben erwähnten Probleme zu lösen, haben die gegenwärtigen Erfinder intensive Studien durchgeführt und im Ergebnis festgestellt, dass eine sezernierte Insulinmenge durch Aktivierung unter hoher Glukosekonzentration durch Überexpression eines Pankreas-spezifisch exprimierenden "Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2" in pankreatischen β-Zellen erhöht wird und dass demgegenüber eine sezernierte Insulinmenge durch Aktivierung unter niedriger Glukosekonzentration nicht verändert wird und haben so festgestellt, dass das Polypeptid und die Zelle, die das Polypeptid exprimiert, als Screening-Mittel für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden kann, mit einer Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch unter hoher Glukosekonzentration und befähigt, die Blutglukose in einem normalen Bereich zu kontrollieren. Weiterhin waren die Erfinder erfolgreich bei der Bereitstellung eines neuen Screening-Verfahrens für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes durch Verwendung des Screening-Werkzeugs. Die Erfinder haben bestätigt, dass aktivierende Substanzen, die durch ein Screening bekannter Verbindungen erhalten werden, von denen nicht bekannt war, dass sie eine Aktivität zur Behandlung von Diabetes haben, und zwar durch das Screening-Verfahren, eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von Insulin und eine Aktivität zur Verminderung von Blutglukose in Rattenplasma zeigen, wenn Glukose verabreicht wird und einen Anstieg eines Blutglukoseniveaus bei einer Diabetes-Modell-Ratte unterdrücken, wenn Glukose verabreicht wird und haben so die Nützlichkeit des Screening-Verfahrens der vorliegenden Erfindung deutlich gemacht.
Die vorliegende Erfindung betrifft nämlich:

[1] Verwendung eines Polypeptids, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus (1) einem Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16, (2) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16, das außerdem (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion aus Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität einer Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt, (3) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt sind und das (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt, und (4) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 90% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 und das (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt, als Screeningmittel für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes.
[2] Verwendung gemäß Punkt 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 umfasst.
[3] Verwendung gemäß Punkt 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit 90% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 umfasst.
[4] Verwendung gemäß einem der Punkte 1 bis 3, worin das Polypeptid (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt.
[5] Verwendung gemäß Punkt 1, wobei das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 besteht.
[6] Verwendung einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend ein Polynukleotid, kodierend ein Polypeptid wie beschrieben gemäß einem der Punkte 1 bis 5, und die das Polypeptid als Screening-Mittel für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes exprimiert.
[7] Screening-Verfahren für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes, umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren einer Zelle wie beschrieben gemäß Punkt 6 oder einer Zellmembran davon mit einer Verbindung, die getestet werden soll, und Analyse, ob ein Polypeptid wie beschrieben gemäß einem der Punkte 1 bis 5 aktiviert wird oder nicht.
[8] Screeningverfahren gemäß Punkt 7, wobei das Mittel zur Behandlung von Diabetes ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion ist. Die Bezeichnungen "Mittel zur Behandlung von Diabetes" und "pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes" wie hier verwendet, beinhaltet nicht nur ein Medikament zur Heilung eines Diabetes-Patienten, sondern auch ein Medikament zur Prävention eines Fortschreibens von Diabetes oder ähnlichen.

Die Bezeichnungen "Screening-Werkzeug" wie hier verwendet, bedeutet eine Werkzeug, das für ein Screening verwendet wird, insbesondere ein Polypeptid oder eine Zelle, die ein Polypeptid exprimiert, verwendet für das Screening. Die Bezeichnungen "Screening-Werkzeug" zur Behandlung von Diabetes, wie hier verwendet, bedeutet eine Zelle oder ein Polypeptid als ein Subjekt, das mit einer Testverbindung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung für ein Screening für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes kontaktiert wird, um nach einem Mittel zur Behandlung von Diabetes ein Screening durchzuführen. Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung des Polypeptids der Punkte [1] bis [5] oder der Zelle des Punkts [6] beim Screening nach einem Mittel zur Behandlung von Diabetes.
Im Hinblick auf das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 offenbart die EP1092727-Veröffentlichung, die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, eine DNA- Sequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids (PFI-007) kodiert, bestehend aus derselben Aminosäuresequenz wie derjenigen von SEQ ID Nr. 2 und eine deduzierte Aminosäure, kodiert durch die DNA-Sequenz, offenbart jedoch nicht, dass das Polypeptid PFI-007 erhalten wurde. Weiterhin offenbart die EP1092727-Veröffentlichung Behandlungen verschiedener Erkrankungen als Verwendung von Substanzen, die das Polypeptid PFI-007 modulieren und beinhaltet einen Anspruch, der auf ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes gerichtet ist, bestehend aus der Verabreichung einer Substanz, die das Polypeptid PFI-007 moduliert (ein Antagonist oder ein Agonist). Die Veröffentlich offenbart jedoch keinerlei Stütze, um zu zeigen, dass ein Agonist des Polypeptids PFI-007 bei der Behandlung von Diabetes effektiv ist, offenbart jedoch, dass ein Antagonist auch effektiv ist und so sind es offensichtlich, dass die vorliegenden Erfinder die zuerst festgestellt haben, dass der Agonist bei der Behandlung von Diabetes effektiv ist. Weiterhin offenbart die EP1092727-Veröffentlichung nicht, dass eine Aktivierung des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäure von SEQ ID Nr. 2, die Insulinsekretion unterstützt, noch dass das Polypeptid einer Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion aus Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung in den Pankreas-β-Zellen unter hoher Glukosekonzentration aufweist (hiernach manchmal bezeichnet als "hohe Glukose-abhängige Insulinsekretionsunterstützende Aktivität").
Wie oben erwähnt, sind die Verwendung des obigen Polypeptids und der obigen Zelle als Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes (insbesondere eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion) und des Screening-Verfahrens nach einem Mittel zur Behandlung von Diabetes (insbesondere eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion), wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, Erfindungen, die von den gegenwärtigen Erfindern als erste gemacht wurden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Grafik, die einen Zeitverlauf der Plasmainsulinkonzentration nach oraler Verabreichung von Glukose bei SD-Ratten zeigt, denen 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat (LT-1 Z 0059519) intraperitoneal verabreicht wurde.
2 ist eine Grafik, die einen Zeitverlauf des Blutglukoseniveaus nach der oralen Verabreichung von Glukose bei SD-Ratten darstellt, denen 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat (LT-1 Z 0059519) intraperitoneal verabreicht wurde.
3 ist eine Grafik, die einen Zeitverlauf des Blutglukoseniveaus nach oraler Verabreichung von Glukose bei GK-Ratten darstellt, denen 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat (LT-1 Z 0059519) intraperitoneal verabreicht wurde.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Detail hiernach beschrieben.
(1) Das Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes.
Das Screening-Werkzeug der gegenwärtigen Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes beinhaltet das Polypeptid-artige Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes und das Transformantentyp-artige Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes.
1) Das Polypeptidtyp-Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes
Als Polypeptid, das als Polypeptidtyp-Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden kann, gibt es:

(1) einem Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR. 2 oder 16,
(2) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR. 2 oder 16 deletiert, substituiert und/oder addiert sind, das außerdem (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion aus Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität einer Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt (hiernach bezeichnet als funktionell äquivalente Variante) und
(3) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die 90% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR. 2 oder 16 aufweist und (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt (hiernach bezeichnet als homologes Polypeptide).

Hiernach werden die Polypeptide, die als Polypeptidtyp-Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden können, kollektiv als "Polypeptide für ein Screening-Werkzeug" bezeichnet.
Eins der Polypeptide für ein Screening-Werkzeug, das Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 besteht, ist ein menschlicher G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der aus 335 Aminosäureresten besteht. Weiterhin ist eines der Polypeptide für ein Screening-Werkzeug, nämlich das Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 besteht, ein Ratten-G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der aus 335 Aminosäureresten besteht. Die Homologie zwischen dem menschlichen Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 und dem Ratten-Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16, beträgt 80,6% bei einem Aminosäuresequenzvergleich.
Die Bezeichnung "Homologie", wie hier verwendet, bedeutet einen Wert, der durch eine BLAST- [Basic local alignment search tool; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)] Suche erhalten wird. Die Homologie in der Aminosäuresequenz kann durch einen BLAST-Search-Algorithmus berechnet werden. Genauer gesagt kann er unter Verwendung eines b12seq-Programms berechnet werden (Tatiana A. Tatusova und Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) und zwar in einem BLAST-Package (sgi32bit-Ausgabe, Version 2.0.12; erhalten von NCBI), in Übereinstimmung mit einem Default-Parameter. Als paarweise Ausrichtungsparameter wird ein Programm "blastp" verwendet. Weiterhin werden "0" als Gap-Insertion-Cost-Wert, "0" als Gap-Verlängerungs-Cost-Wert, "SEG" als Filter für eine Query-Sequenz bzw. "BLOSUM62" als Matrix verwendet.
Die Polypeptide, die aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 bestehen, zeigen (a) eine hohe Glukose-abhängige Insulinsekretionsunterstützende Aktivität und (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge an intrazellulären cAMP-Zellen durch Aktivierung in den Zellen (hiernach manchmal bezeichnet als "Aktivität zur Erhöhung des intrazellulären cAMPs"). In diesem Zusammenhang unterstützen die Polypeptide, die aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 bestehen, nicht die Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen bei niedriger Glukosekonzentration, wenn sie durch Überexpression der Polypeptide in den pankreatischen β-Zellen aktiviert werden.
Die Bezeichnung "bei hoher Glukosekonzentration", wie hier verwendet, bedeutet einen Zustand, worin eine Glukosekonzentration beispielsweise in Blut oder einer Umgebung um Zellen höher ist als ein normaler Glukosekonzentrationsbereich, insbesondere 16,8 mmol/l.
Die Bezeichnung "bei niedriger Glukosekonzentration", wie hier verwendet, bedeutet einen Zustand, worin die Glukosekonzentration niedriger ist als ein normaler Glukosekonzentrationsbereich, insbesondere 3,3 mmol/l oder weniger.
Ein Verfahren zur Bestätigung, ob oder nicht ein Polypeptid, das getestet werden soll, die "Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen durch Aktivierung in den pankreatischen β-Zellen" wie hier verwendet zeigt, ist nicht besonders begrenzt, kann jedoch beispielsweise durch das unten beschriebene Verfahren bestätigt werden (vorzugsweise ein in Beispiel 5 beschriebenes Verfahren). Die pankreatischen β-Zellen werden nämlich jeweils mit einem Expressionsvektor transformiert, umfassend ein Polynukleotid, das das Testpolypeptid kodiert oder einen Kontrollexpressionsvektor ohne das Polynukleotid. Nach einer bestimmten Anzahl von Tagen (wie z.B. 2 oder 3 Tagen) nach der Transformation, wird das Medium durch einen Puffer ersetzt, der eine bestimmte Glukosekonzentration enthält. Nach einer bestimmten Zahl von Stunden (wie z.B. etlichen Stunden) der Inkubation, wird eine Insulinmenge, die in den Puffer sezerniert wurde (d.h., den Kulturüberstand) gemessen. Wenn die sezernierte Insulinmenge im Kulturüberstand der Zellen (Testzellen) ansteigt, die mit dem Expressionsvektor transformiert sind, umfassend das Polynukleotid, das das Polypeptid kodiert, und zwar im Vergleich zu derjenigen der Zellen (Kontrollzellen), die mit dem Kontrollexpressionsvektor transformiert wurden, kann entschieden werden, dass das Testpolypeptid die "Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen durch Aktivierung in pankreatischen β-Zellen" zeigt. Es wird durch den Student's-t-Test entschieden, ob oder nicht die sezernierte Insulinmenge in den Testzellen im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant erhöht ist. Wenn die sezernierte Insulinmenge in den Testzellen ansteigt und der signifikante Differenzwert zu den Kontrollzellen p < 0,05 (vorzugsweise p < 0,01) beträgt, wird entschieden, dass die sezernierte Insulinmenge signifikant angestiegen ist.
Ein Verfahren zur Bestätigung, ob oder nicht ein Polypeptid, das getestet werden soll, die "Aktivität zur Erhöhung einer Menge an intrazellulärem cAMP durch Aktivierung in den Zellen", wie hier verwendet, zeigt, ist nicht besonders begrenzt, kann aber beispielsweise durch das folgende Verfahren bestätigt werden (vorzugsweise das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren). Genauer gesagt werden die Zellen mit einem Expressionsvektor, umfassend ein Polynukleotid, das das Polypeptid kodiert, oder einen Kontrollexpressionsvektor ohne das Polynukleotid transformiert. Nach einer bestimmten Zahl von Stunden (wie z.B. 20 Stunden) nach der Trans formation, wird das Medium durch ein Medium ersetzt, das einen Phosphodiesteraseinhibitor [wie z.B. IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)] enthält. Nach einer bestimmten Anzahl von Minuten (wie z.B. 40 Minuten) einer Inkubation, wird eine Menge an cAMP in den Zellen gemessen. Wenn die cAMP-Menge in den Zellen angestiegen ist, die mit dem Expressionsvektor transformiert sind, umfassend das Polynukleotid, das das Polypeptid kodiert, und zwar im Vergleich zu derjenigen der Zellen, die mit dem Kontrollexpressionsvektor transformiert sind, kann entschieden werden, dass das Testpolypeptid die "Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP durch Aktivierung in den Zellen" zeigt.
Der Zustand, in dem das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, wie hier verwendet, "aktiviert" wird, bedeutet einen Zustand, worin ein Signal stromabwärts vom G-Proteingekoppelten Rezeptor unabhängig von einer Ligandenbindung transduziert wird. Das Polypeptid ist aktiviert, wenn die Gesamtmenge einer aktiven Form des G-Protein-gekoppelten Rezeptors eine bestimmte Menge überschreitet.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren befinden sich in einem Gleichgewichtszustand zwischen einer aktiven und einer inaktiven Form. Das Gleichgewicht verlagert sich zu der aktiven Form, wenn ein Ligand an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet. Es ist bekannt, dass der G-Protein-gekoppelte Rezeptor ebenfalls aktiviert wird und ein Signal stromabwärts davon in Abwesenheit des Liganden transduziert, wenn der G-Protein-gekoppelte Rezeptor überexprimiert wird, das die Gesamtmenge des aktivierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors ansteigt (Milano, C.A. et al., Science, 264, 582-586, 1994). Es ist daher, selbst wenn der Ligand nicht identifiziert wird, möglich, ein Signal von dem G-Protein-gekoppelten Rezeptor durch Überexpression des G-Protein-gekoppelten Rezeptors in Zellen nachzuweisen. In jedem der in den Beispielen 4 oder 5 beschriebenen Experimente wird das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug in Abwesenheit des Liganden dagegen durch Überexpression des Polypeptids aktiviert. Der Zustand ist derselbe wie der durch eine agonistische Bindung aktivierte.
Die funktionell äquivalente Variation, die als Polypeptid-artiges Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden kann, ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um ein Polypeptid handelt, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10, noch bevorzugter 1 bis 7, besonders bevorzugt 1 bis 5, wie z.B. 1 oder etliche Aminosäuren an ein oder mehr Positionen der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt wur den und das (a) die hohe Glukose-abhängige Insulinsekretions-unterstützende Aktivität und/oder (b) die Aktivität zur Erhöhung von intrazellulärem cAMP [vorzugsweise sowohl (a) die hohe Glukose-abhängige Insulinsekretionsunterstützende Aktivität als auch die Aktivität zur Erhöhung von intrazellulärem cAMP, noch bevorzugter zusätzlich zu diesen Aktivitäten (c) eine Nicht-Unterstützung einer Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen bei niedriger Glukosekonzentration, bei Aktivierung durch Überexpression des Polypeptids in den pankreatischen β-Zellen zeigt] aufweist. Weiterhin ist der Ursprung der funktionell äquivalenten Variation nicht auf den Menschen oder eine Ratte begrenzt.
Die funktionell äquivalente Variation beinhaltet nicht nur menschliche Variationen des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, Ratten-Variationen des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16, sondern auch funktionell äquivalente Variationen, die von anderen Organismen als vom Menschen oder einer Ratte abstammt (wie z.B. einer Maus, einem Hamster oder einem Hund) und weitere Polypeptide, erhalten durch künstliche Modifikationen dieser nativen Polypeptide (d.h. menschliche oder Ratten-Variationen oder funktionell äquivalente Variationen, die von anderen Organismen als einem Menschen oder einer Ratte abstammen) oder das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 durch genetische Manipulationstechniken. Die Bezeichnung "Variation", wie hier verwendet, bedeutet einen individuellen Unterschied zwischen denselben Polypeptiden in derselben Art oder einen Unterschied zwischen homologen Polypeptiden in etlichen Arten.
Menschliche Variationen des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, Ratten-Variationen des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16, oder funktionell äquivalente Variationen, abstammend von anderen Organismen als einem Menschen oder einer Ratte, können von dem Fachmann auf dem Gebiet, basierend auf der Information einer Nukleotidsequenz (beispielsweise der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1) eines Polynukleotids, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, oder derjenigen einer Nukleotidsequenz (beispielsweise der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 15) eines Polynukleotids, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16, erhalten werden. In diesem Zusammenhang können die genetischen Manipulationstechniken im allgemeinen gemäß bekannten Verfahren durchgeführt werden (z.B. Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982).
Beispielsweise werden eine geeignete Sonde oder geeignete Primer gemäß der Information einer Nukleotidsequenz eines Polynukleotids, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16, entworfen. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) oder ein Hybridisierungsverfahren wird unter Verwendung einer Probe durchgeführt (beispielsweise Gesamt-RNA oder einer mRNA-Fraktion, einer cDNA-Bibliothek, oder einer Phagenbibliothek), abstammend von einem Organismus (beispielsweise einem Säuger, wie z.B. einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Hamster oder einem Hund) von Interesse und den Primern oder der Sonde um ein Polynukleotid zu erhalten, das Polypeptid kodiert. Ein gewünschtes Polypeptid kann durch Expression des resultierenden Polynukleotids in einem geeigneten Expressionssystem erhalten werden und durch Bestätigung, dass das exprimierte Polypeptid beispielsweise die hoch Glukose-abhängige Insulinsekretions-unterstützende Aktivität durch das Verfahren gemäß Beispiel 5 oder die Aktivität zur Erhöhung von intrazellulärem cAMP durch das Verfahren von Beispiel 4 aufweist.
Weiterhin kann das Polypeptid, das künstlich durch genetische Manipulationstechniken modifiziert wurde, beispielsweise durch das folgende Verfahren erhalten werden. Ein Gen, das das Polypeptid kodiert, wird durch ein konventionelles Verfahren, wie z.B. eine ortspezifischen Mutagenese, erhalten (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984). Ein gewünschtes Polypeptid kann durch Expression des resultierenden Polynukleotids in einem geeigneten Expressionssystem und Bestätigung, dass das exprimierte Polypeptid beispielsweise die hohe Glukose-abhängige Insulinsekretions-unterstützende Aktivität durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren oder die Aktivität zur Erhöhung von intrazellulärem cAMP durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren zeigt, erhalten werden.
Weiterhin beinhaltet die funktionell äquivalente Variation ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16, und das (a) eine Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glukosekonzentration und/oder (b) die Aktivität zur Erhöhung einer Menge an intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung zeigt. Sie beinhaltet beispielsweise ein Polypeptid (d.h. Fusionspolypeptid), worin eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus des Polypeptids zugefügt wird, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16, solang das Fusionspolypeptid (a) die hohe Glukose-abhängige Insulinsekretions unterstützende Aktivität und/oder (b) die Aktivität zur Erhöhung von intrazellulärem cAMP zeigt.
Als Markersequenz kann eine Sequenz zur einfachen Durchführung einer Bestätigung einer Polypeptidexpression, einer Bestätigung ihrer intrazellulären Lokalisierung, einer Reinigung oder ähnliches verwendet werden. Als Sequenz können beispielsweise ein FLAG-Epitop, ein Hexa-Histidin-tag, ein Hämagglutinin-tag oder ein myc-Epitop, usw. verwendet werden.
Das homologe Polypeptid, das als Polypeptidtyp-Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden kann, ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit einer 90- oder höher prozentigen Homologie mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 handelt, und (a) die hohe Glukose-abhängige Insulinsekretions-unterstützende Aktivität und/oder (b) die Aktivität zur Erhöhung von intrazellulärem cAMP zeigt. Das homologe Polypeptid kann eine Aminosäuresequenz mit vorzugsweise einer 95%igen oder höheren Homologie, noch bevorzugter einer 98%igen oder höheren Homologie, besonders bevorzugt einer 99%igen oder höheren Homologie im Hinblick auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 sein.
Das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, das als Polypeptidtyp-Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden kann, kann durch verschiedene bekannte Verfahren erhalten werden, die z.B. bekannte genetische Manipulationstechniken unter Verwendung eines Polynukleotids, das ein Protein von Interesse kodiert. Genauer gesagt kann das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug durch Kultivierung einer Transformanten für ein Screening-Werkzeug, wie unten beschrieben, hergestellt werden (d.h., einer Transformanten, die mit einem Expressionsvektor transformiert wird, umfassend eine DNA, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert und Expression des Polypeptids) unter Bedingungen, worunter eine Expression des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug durchgeführt werden kann und Abtrennen und Reinigung des Proteins von Interesse aus der resultierenden Kultur durch üblicherweise verwendete Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Rezeptorproteinen.
Als Polynukleotid, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, könne beispielsweise Polynukleotide erwähnt werden, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, Polynukleotide, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16, Polynukleotide, kodierend die funktionell äquivalenten Variationen oder Polynukleotide, kodierend die homologen Polypeptide. Die Bezeichnung "Polynukleotid", wie hier verwendet, beinhaltet sowohl DNA als auch RNA.
Ein Verfahren zur Herstellung des Polynukleotids, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, ist nicht besonders begrenzt, es kann jedoch beispielsweise (1) ein Verfahren unter Verwendung von PCR, (2) ein Verfahren unter Verwendung von konventionellen genetischen Manipulationstechniken (d.h., ein Verfahren zur Selektion einer Transformante, umfassend eine gewünschte cDNA von Stämmen, die mit einer cDNA-Bibliothek transformiert sind) oder (3) ein chemisches Syntheseverfahren erwähnt werden. Diese Verfahren werden in dieser Reihenfolge hiernach erklärt.
Bei dem Verfahren unter Verwendung von PCR kann das Polynukleotid, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, beispielsweise durch das folgende Verfahren erzeugt werden.
mRNA wird aus menschlichen Zellen oder Geweben extrahiert, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug erzeugen können. Ein Paar von Primersätzen, zwischen denen Gesamtlängen-mRNA, korrespondierend zu dem Polypeptid für ein Screening-Werkzeug oder eine Teilregion der mRNA lokalisiert ist, wird auf der Basis der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug synthetisiert. Gesamtlängen-cDNA, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert oder ein Teil der cDNA, kann durch Durchführung einer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) erhalten werden.
Genauer gesagt wird Gesamt-RNA, enthaltend mRNA, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, durch ein bekanntes Verfahren aus Zellen oder Geweben (wie z.B. dem Pankreas) extrahiert, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug produzieren können. Als Extraktionsverfahren kann beispielsweise ein Guanidinthiocyanat-Heißphenolverfahren, ein Guanidinthiocyanat-Guianidinhydrochloridverfahren oder ein Guanidinthiocyanat-Cäsiumchloridverfahren erwähnt werden. Das Guanidinthiocyanat-Cäsiumchloridverfahren wird vorzugsweise verwendet. Die Zellen oder das Gewebe, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug erzeugen können, können beispielsweise durch ein Northern-Blot-Verfahren unter Verwendung eines Polynukleotids oder eines Teils davon, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug oder ein Western-Blot-Verfahren unter Verwendung eines für das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug spezifischen Antikörpers identifiziert werden.
Als nächstes wir die extrahierte mRNA gereinigt. Die Reinigung der mRNA kann gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise kann die mRNA durch Adsorption und Elution unter Verwendung einer Oligo(dT)-Cellulosesäule gereinigt werden. Die mRNA kann weiter beispielsweise durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, falls nötig, fraktioniert werden. Alternativ kann kommerziell erhältliche extrahierte und gereinigte mRNA verwendet werden, ohne die Extraktion der mRNA durchzuführen.
Als nächstes wird die cDNA des ersten Strangs durch Durchführung einer reversen Transkriptasereaktion der gereinigten mRNA in Gegenwart eines Zufallsprimers, eines Oligo-dT-Primers und/oder eines marktüblichen Primers synthetisiert. Diese Synthese kann gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden. Die resultierende cDNA des ersten Strangs wird einer PCR unter Verwendung von zwei Primern unterworfen, zwischen denen eine Gesamtlänge oder eine Teilregion des Polynukleotids von Interesse lokalisiert ist, wodurch die cDNA von Interesse amplifiziert wird. Die resultierende DNA wird beispielsweise durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Ein DNA-Fragment von Interesse kann erhalten werden, indem ein Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen und eine darauffolgende Ligation durchgeführt wird, falls nötig. Alternativ kann ein DNA-Fragment von Interesse aus einer genomischen DNA erhalten werden.
Bei dem Verfahren unter Verwendung konventioneller genetischer Manipulationstechniken kann das Polynukleotid, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, beispielsweise durch das folgende Verfahren erzeugt werden.
Zunächst wird eine einzelsträngige cDNA unter Verwendung der reversen Transkriptase und als Matrize, mRNA, hergestellt durch das oben erwähnte PCR-Verfahren, synthetisiert, woraufhin doppelsträngige cDNA aus der einzelsträngigen cDNA synthetisiert wird. Als dieses Verfahren kann beispielsweise ein Sl-Nukleaseverfahren erwähnt werden (Efstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), ein Land-Verfahren (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981) ein 0. Joon Yoo-Verfahren (Yoo, O. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983) und ein Okayama-Verg-Verfahren (Okayama, H. und Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982).
Als nächstes wird ein rekombinantes Plasmid, umfassend die doppelsträngige cDNA, hergestellt und in einen Escherichia coli-Stamm eingeführt, wie z.B. DH 5α, wodurch der Stamm transformiert wird. Eine Transformante wird unter Verwendung einer Arzneimittelresistenz gegen beispielsweise Tetracyclin oder Ampicillin als Marker selektiert. Wenn die Wirtszelle E. coli ist, kann die Transformation der Wirtszelle beispielsweise durch das Verfahren von Hanahan (Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166, 557-580, 1983) durchgeführt werden; nämlich ein Verfahren, worin die rekombinante DNA zu kompetenten Zellen zugefügt wird, die in Gegenwart von CaCl₂, MgCl₂ oder RbCl hergestellt wurden. Weiterhin kann als anderer Vektor als ein Plasmid ein Phagenvektor, wie z.B. ein lambda-System, verwendet werden.
Als Verfahren zur Selektion einer Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse aus den resultierenden Transformanten, können verschiedene Verfahren wie z.B. (1) ein Screening-Verfahren unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde, (2) ein Screening-Verfahren unter Verwendung einer durch PCR erzeugten Sonde, (3) ein Verfahren, bei dem das Screening durch Erzeugung des Polypeptids von Interesse in anderen tierischen Zellen durchgeführt wird, (4) ein Screening-Verfahren unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug oder (5) ein Verfahren unter Verwendung eines selektiven Hybridisierungs-Translationssystems verwendet werden.
Bei dem Screening-Verfahren unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde kann die Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Ein Oligonukleotid, das zu der Gesamtheit oder einem Teil des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug korrespondiert, wird synthetisiert (in diesem Fall kann es entweder eine Nukleotidsequenz sein, die die Kodonverwendung in die Betrachtung mit einbezieht oder eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen als Kombination möglicher Nukleotidsequenzen und im letzteren Fall kann ihre Zahl durch den Einschluss von Inosin reduziert werden) und wobei dieses Oligonukleotid als Sonde verwendet wird (markiert mit ³²P oder ³³P) wird mit einem Nitrocellulosefilter hybridisiert, worauf DNAs der Transformanten denaturiert und fixiert sind, um die resultierenden positiven Stämme einem Screening zu unterwerfen und zu selektieren.
Bei dem Screening-Verfahren unter Verwendung einer Sonde, die durch PCR erzeugt wurde, kann die Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Oligonukleotide eines Sense-Primers und eines Antisense-Primers, die zu einem Teil des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug korrespondieren, werden synthetisiert und ein DNA-Fragment, das die Gesamtheit oder einen Teil des Polypeptids von Interesse kodiert, wird durch Durchführung von PCR unter Verwendung dieser Primer in Kombination amplifiziert. Als in diesem Verfahren verwendete Matrizen-DNA wird eine cDNA, synthetisiert durch eine reverse Transkriptionsreaktion von mRNA von Zellen, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug erzeugen können oder genomische DNA verwendet. Das resultierende DNA-Fragment wird mit ³²P oder ³³P markiert und eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird durch Durchführung einer Kolonie-Hybridisierung oder einer Plaque-Hybridisierung bei Verwendung dieses Fragments als Sonde selektiert.
Bei dem Verfahren, bei dem das Screening durch Erzeugung des Polypeptids von Interesse in anderen tierischen Zellen durchgeführt wird, kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Die Polynukleotide werden durch Kultivierung der Transformanten amplifiziert und tierische Zellen werden mit den Polynukleotiden transfiziert (in diesem Fall können entweder ein Plasmid, das sich selbst replizieren kann und eine Transkriptions-Promotor-Region enthält oder ein Plasmid, das in das Chromosom von tierischen Zellen integriert werden kann, verwendet werden), wodurch die Polypeptide erzeugt werden, die von den Polynukleotiden auf der Zelloberfläche kodiert werden. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird von den ursprünglichen Transformanten durch Nachweis des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug selektiert, wobei ein Antikörper gegen das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug verwendet wird.
Bei dem Verfahren, bei dem die Selektion unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug durchgeführt wird, kann die Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Zunächst wird cDNA in einen Expressionsvektor integriert und Polypeptide werden auf der Zelloberfläche der Transformanten erzeugt. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird durch Nachweis eines Stamms selektiert, der das gewünschte Polypeptid erzeugt, wobei ein Antikörper gegen das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug verwendet wird und ein zweiter Antikörper gegen den ersten Antikörper.
Bei dem Verfahren unter Verwendung eines selektiven Hybridisierungs-Translationssystems kann die Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Zunächst wird eine cDNA, die von jeder Transformante erhalten wurde, beispielsweise auf einen Nitrocellulosefilter geblottet und mit mRNA hybridisiert, die aus Zellen hergestellt wurde, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug erzeugen können und dann wird die an die cDNA gebundene mRNA dissoziiert und gewonnen. Die gewonnene mRNA wird in ein Polypeptid in einem geeigneten Polypeptidtranslationssystem translatiert, beispielsweise durch Injektion in Xenopusoocyten oder ein zellfreies System, wie z.B. ein Kaninchen-Reticulocytenlysat oder Weizenkeimlinge. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird durch Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug selektiert.
Ein Verfahren zum Sammeln des Polynukleotids, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, aus den resultierenden Transformanten von Interesse, kann gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt werden (beispielsweise Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Gold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982). Beispielsweise kann es durch Separieren einer Fraktion, die zu der Plasmid-DNA- korrespondiert, aus Zellen und Ausschneiden der cDNA-Region aus der Plasmid-DNA durchgeführt werden.
Bei dem chemischen Syntheseverfahren kann das Polynukleotid, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, beispielsweise durch Bindung von DNA-Fragmenten, erzeugt durch ein chemisches Syntheseverfahren, erzeugt werden. Jede DNA kann unter Verwendung eines DNA-Synthesizers [beispielsweise Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman) oder 394 DNA/RNA-Synthesizer (Applied Biosystems)] synthetisiert werden.
Weiterhin kann das Polynukleotid, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug durch eine chemische Nukleinsäure Synthese erzeugt werden, gemäß einem konventionellen Verfahren, wie z.B. dem Phosphit-Triester-Verfahren (Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 1984), basierend auf der Information auf dem Polypeptid für ein Screening-Werkzeug. In diesem Zusammenhang sind Kodons für jede Aminosäure bekannt und können optional durch ein konventionelles Verfahren gewählt und bestimmt werden, beispielweise indem eine Kodonverwendung von jedem zu verwendenden Wirt mit in die Betrachtung einbezogen wird (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Weiterhin kann eine Teilmodifikation der Kodons dieser Nukleotidsequenzen gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden, wie z.B. ortspezifischer Mutagenese, die einen Primer verwendet, umfassend ein synthetisches Oligonukleotid, das eine gewünschte Modifikation kodiert (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).
Die Bestimmung der DNA-Sequenzen, die durch die oben erwähnten Verfahren erhalten wurden, kann beispielsweise durch ein Maxam-Gilbert chemisches Modifikationsverfahren durchgeführt werden (Maxam, A. M. und Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) oder durch ein Dideoxynukeotid-Kettenterminationsverfahren (Messing, J. und Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).
Eine Wirtszelle (vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, noch bevorzugter eine 293-EBNA-Zelle) kann durch Reintegration eines isolierten Polynukleotids, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, in eine geeignete Vektor-DNA und unter Verwendung des resultierenden Expressionsvektors transformiert werden.
Das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, das auf der Zelloberfläche der Transformanten durch Kultivierung der Transformanten erzeugt wurde, kann daraus durch verschiedene bekannte Abtrennverfahren getrennt und gereinigt werden, wobei man sich der physikalischen und chemischen Eigenschaften und ähnlichem des Polypeptids bedient. Genauer gesagt kann eine Zellmembranfraktion, enthaltend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, beispielsweise erhalten werden, indem die Zellen kultiviert werden, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug auf ihrer Oberfläche exprimieren, durch Suspension der kultivierten Zellen in einem Puffer, homogenisieren der Suspension und Zentrifugation des Homogenats. Nachdem die resultierende Zellmembranfraktion löslich gemacht wurde, kann das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug durch Behandlung der Mischung mit einer üblicher Weise verwendeten Behandlung gereinigt werden, z.B. einer Behandlung mit einem Proteinausfällmittel, Ultrafiltration, verschiedenen Flüssigkeitschromatographietechniken, wie z.B. Molekularsiebchromatographie (Gelfiltration), Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder durch Dialyse oder einer Kombination daraus. In diesem Zusammenhang können, wenn die Zellmembranfraktion unter Verwendung eines so mild wie möglich löslichmachenden Mittels löslich gemacht wird (wie z.B. CHAPS, Triton X-100, Digitonin oder dergl.) die Eigenschaften des Rezeptors nach dem Löslichmachen erhalten bleiben.
Wenn das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug als Fusionsprotein mit einer Markersequenz in frame exprimiert wird, kann eine Bestätigung der Expression des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug, eine Bestätigung der intrazellulären Lokalisierung, eine Reinigung oder ähnliches, einfach durchgeführt werden. Als Markersequenz können beispielsweise ein FLAG-Epitop, ein Hexa-Histidin-Tag, ein Hämagglutinin-Tag oder ein myc-Epitop erwähnt werden. Weiterhin kann durch Insertion einer spezifischen Amino säuresequenz, erkannt durch eine Protease, wie z.B. eine Enterokinase, Faktor Xa oder Thrombin zwischen der Markersequenz und dem Polypeptid für ein Screening-Werkzeug die Markersequenz durch die Protease entfernt werden. Beispielsweise gibt einen Bericht, worin ein Muscarin-Acetylcholin-Rezeptor und ein Hexa-Histidin-Tag durch eine Thrombin-Erkennungssequenz verbunden wurden (Hayashi, M. K. und Haga, T., J. Biochem., 120, 1232-1238, 1996).
2) Das Transformantentyp-Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes
Als Transformanten, die als Transformantentyp-Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und zwar für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes (hiernach bezeichnet als "Transformante für ein Screening-Werkzeug") können beispielsweise die folgenden erwähnt werden:

(i) eine Transformante, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, umfassend ein Polynukleotid, das das Polypeptid kodiert, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 und das Polypeptid exprimiert;
(ii) eine Transformante, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend ein Polynukleotid, das eine funktionell äquivalente Variation kodiert und das Polypeptid exprimiert oder
(iii) eine Transformante, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend ein Polynukleotid, kodierend ein homologes Protein und das Polypeptid exprimiert.

Der Transformante für ein Screening-Werkzeug kann beispielsweise durch Reintegration eines Polynukleotids (durch die oben erwähnten Verfahren isoliert), kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, in eine geeignete Vektor-DNA und Transformation einer Wirtszelle (vorzugsweise einer eukaryontischen Zelle, noch bevorzugter einer 293-EBNA-Zelle) mit dem resultierenden Expressionsvektor erhalten werden. Es ist weiterhin möglich, das Polypeptid in einer gewünschten Wirtszelle zu exprimieren, indem ein geeigneter Promotor und eine Sequenz, die mit der Genexpression in Bezug steht, in den Vektor eingeführt werden.
Die Erfinder haben es ermöglicht, dass das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug auf der Zellmembran überexprimiert wird, durch Verwendung eines Expressionsvektors, der eine Signalsequenz am N-Terminus des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug zufügen kann. Der Expressionsvektor ist nicht besonders begrenzt, solange er ein Polynukleotid umfasst, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug. Als Expressionsvektor kann beispielsweise ein Expressionsvektor erwähnt werden, erhalten durch Ein führung des Polynukleotids, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug in einen bekannten Expressionsvektor, der in geeigneter Weise gemäß einer zu verwendenden Wirtszelle gewählt wird.
Weiterhin haben die Erfinder ein Polypeptid für ein Screening-Werkzeug möglich gemacht, dass auf einer Zellmembran durch Verwendung einer 293-EBNA-Zelle überexprimiert wird. Die Transformante für ein Screening-Werkzeug, die als Transformantentyp-Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden kann, ist nicht besonders begrenzt, so lange sie mit dem Expressionsvektor transformiert ist, das Polynukleotid umfasst, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug und das Polypeptid exprimiert, wenn sie als Transformantentyp-Screening-Werkzeug für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet wird. Die Transformante für ein Screening-Werkzeug kann beispielsweise eine Zelle sein, worin das Polynukleotid, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug in ein Chromosom einer Wirtszelle integriert ist oder eine Zelle, enthaltend das Polynukleotid als Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid. Die Transformante für ein Screening-Werkzeug kann beispielsweise durch Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, erhalten werden.
In den eukaryontischen Wirtszellen sind beispielsweise Zellen von Vertebraten, Insekten und Hefe beinhaltet. Als Vertebratenzelle können beispielsweise eine COS-Zelle als Affenzelle (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), ein Dihydrofolatreduktase-defekter Stamm einer chinesischen Hamster-Ovar-Zelle (CHO) (Urlaub, G. und Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), eine menschliche embryonale Nieren-abstammende HEK293-Zelle oder eine 293-EBNA-Zelle (Invitrogen) erwähnt werden, erhalten durch Einführen eines EBNA-1-Gens vom Epstein-Barr-Virus.
Als Expressionsvektor für eine Vertebratenzelle kann allgemein ein Vektor, enthaltend einen Promotor, der stromaufwärts vom zu exprimierenden Polynukleotid positioniert ist, eine RNA-Spleiß-Stelle, eine Polyadenylieungsstelle, eine Transkriptions-Terminationssequenz und ähnliches verwendet werden. Der Vektor kann weiterhin einen Replikationsursprung, falls nötig, enthalten. Als Expressionsvektor kann beispielsweise pSV2dhfr erwähnt werden, enthaltend einen frühen SV40-Promotor (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS, enthaltend einen menschlichen Elongationsfaktorpromotor (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) oder pCEP4, enthaltend einen Cytomegalieviruspromotor (Invitrogen). Weiterhin kann ein Expressionsvektor, der eine Signalsequenz, wie z.B. eine Influenza-Hämagglutinin-Signalsequenz, in frame zum stromaufwärts gelegenen Bereich des zu exprimierenden Polypeptids fusionieren kann, verwendet werden (J. Biol. Chem., 267, 21995-21998, 1992). Als solch ein Vektor kann beispielsweise ein Plasmid (eine pEF-BOS-Signalsequenz-FLAG-Plasmid), erhalten durch Einführung einer Sequenz, kodierend eine Signalsequenz und ein FLAG-Epitop, in pEF-BOS verwendet werden.
Wenn die 293-EBNA-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann beipielsweise pCEP4 (Invitrogen), enthaltend einen Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus und dazu in der Lage eine autonome Replikation in der 293-EBNA-Zelle durchzuführen, als Expressionsvektor verwendet werden.
Wenn die COS-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann ein Vektor, der einen SV40-Replikationsursprung aufweist, eine autonome Replikation in der COS-Zelle durchführen kann und mit einem Transkriptionspromotor, einem Transkriptions-Terminationssignal und einer RNA-Spleiß-Stelle als Expressionsvektor verwendet werden. Als Vektor können beispielsweise pME18S (Maruyama, K. und Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) oder pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987) erwähnt werden.
Der Expressionsvektor kann in COS-Zellen beispielsweise durch ein DEAE-Dextran-Verfahren (Luthman, H. und Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), ein Calciumphosphat-DNA-Copräzipitationsverfahren (Graham, F. L. und van der Ed. A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), ein Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzes (beispielsweise FuGENE^TM6 Tranfection Reagent; Roche Diagnostics) oder ein Elektroporationsverfahrens (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982) eingebaut werden.
Wenn eine CHO-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann eine Transformante, die dazu in der Lage ist, das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug stabil zu produzieren, erhalten werden, indem eine Cotransfektion eines Expressionsvektors durchgeführt wird, umfassend das Polynukleotid, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, zusammen mit einem Vektor, der ein neo-Gen exprimieren kann, das als G418 Resistenz-Marker wirkt, wie z.B. pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) oder pSV2-neo (Southern, P. J. und Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982) und durch Selektion einer G418-resistenten Kolonie.
Die Transformante für ein Screening-Werkzeug kann gemäß dem konventionellen Verfahren kultiviert werden und das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug wird auf der Zelloberfläche erzeugt. Als bei der Kultivierung zu verwendendes Medium kann eine Medium auf geeignete Weise gewählt werden, das üblicher Weise für eine gewünschte Wirtszelle verwendet wird. Im Fall der COS-Zelle kann beispielsweise ein Medium, wie z.B. ein RPMI-1640-Medium oder ein Dulbecco-modifiziertes Eagle-Minimalessentialmedium (DMEM) verwendet werden, indem es mit einer Serumkomponente suplementiert wird, wie z.B. fötalem Rinderserum (FBS) falls nötig. Im Fall der 293-EBNA-Zelle kann ein Medium, wie z.B. Dulbecco's-modifiziertes Eagle's-Minimal-Essential-Medium (DMEM) mit einer Serumkomponente, wie z.B. fötales Rinderserum (FBS) und G418 verwendet werden.
(2) Das Verfahren zum Screening nach einem Mittel zur Behandlung von Diabetes
Es ist möglich eine Substanz einem Screening zu unterwerfen, die die Aktivitäten des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug kontrollieren kann (insbesondere eine Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, d.h., ein Agonist), wobei das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug über die Transformante für ein Screening-Werkzeug verwendet wird. Wie oben beschrieben hat das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug eine Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen durch Aktivierung in den pankreatischen β-Zellen bei hoher Glukosekonzentration. Daher ist eine Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, als aktiver Wirkstoff eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion nützlich, und ist dazu in der Lage, die Insulinsekretion aus pankreatischen β-Zellen bei hoher Glukosekonzentration zu unterstützen oder als das eines Mittels zur Behandlung von Diabetes. Weiterhin kann das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug per se oder die Transformante für ein Screening-Werkzeug per se als Werkzeug zum Screening nach einem Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden (insbesondere eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer gesagt eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion spezifisch bei hohen Glukosekonzentrationen).
Die Bezeichnung "Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch bei hoher Glukosekonzentration", wie hier verwendet, bedeutet einen Zustand, in dem eine Menge an sezerniertem Insulin signifikant im Vergleich mit einer Kontrollgruppe ansteigt, und zwar bei hoher Glukosekonzentration und worin eine Menge der erhöhten Insulinkonzentration bei hoher Glukosekonzentration bei einer mit einer Testverbindung behandelten Gruppe im Vergleich zu einer Kontrollgruppe 1,5-mal oder mehr (vorzugsweise 3-mal oder mehr) höher ist als die Insulinsekretion, die bei niedriger Glukosekonzentration erhöht ist, noch bevorzugter ein Zustand, unter dem eine sezernierte Insulinmenge sich in der mit einer Testverbindung behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe bei niedriger Glukosekonzentration nicht signifikant erhöht. Es kann entschieden werden, ob oder nicht eine Menge an Insulinsekretion signifikant bei der mit einer Testverbindung behandelten Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe erhöht ist, indem beispielsweise ein Experiment unter den in den Beispielen 8 oder 12 beschriebenen Bedingungen und unter Verwendung des Student's-t-Test durchgeführt wird. Wenn die sezernierte Insulinmenge bei der mit einer Testverbindung behandelten Gruppe erhöht ist und der signifikante Unterschied davon im Hinblick auf die Kontrollgruppe p < 0,05 (vorzugsweise p < 0,01) ist, wird entschieden, dass die sezernierte Insulinmenge signifikant angestiegen ist.
Zu testende Verbindungen, die unter Verwendung des Screening-Werkzeugs der vorliegenden Erfindung einem Screening für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes unterworfen werden können, sind nicht besonders begrenzt, es können jedoch beispielsweise verschiedene bekannte Verbindungen (einschließlich Peptide), die in chemischen Datenbanken eingetragen sind, Verbindungen, die durch kombinatorische chemische Techniken erhalten werden (Terrett, N. K. et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) oder statistische Peptide, hergestellt durch Verwendung eines Phagendisplayverfahrens (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) oder ähnliche, erwähnt werden. Zusätzlich können Kulturüberstände von Mikroorganismen, natürliche Komponenten, die von Pflanzen oder marinen Organismen, oder von tierischen Gewebeextrakten abstammen als Testverbindungen für das Screening verwendet werden. Weiterhin können Verbindungen (einschließlich Peptiden), die durch chemische oder biologische Modifikation von Verbindungen (einschließlich Peptide) erhalten wurden, gewählt durch das Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden.
Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung nach einem Mittel zur Behandlung von Diabetes (vorzugsweise einem Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch bevorzugter einem Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion spezifisch bei hohen Glukosekonzentrationen) ist nicht besonders begrenzt, so lange es den Schritt der Kontaktierung der Transformante für ein Screening-Werkzeug, worin das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug exprimiert wird und als Rezeptor wirkt oder einer Zellmembran davon mit einer zu testenden Verbindung und die Analyse, ob oder nicht das Polypeptid aktiviert wird, umfasst. Es können auf der Basis von Unterschieden zwischen den für die Analyse im Hinblick auf die Aktivierung des Polypeptids verwendeten Verfahren, beispielsweise die folgenden erwähnt werden

1) ein Screening-Verfahren, worin Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration als Indikator verwendet werden (hiernach bezeichnet als "cAMP-Typ-Screening-Verfahren"),
2) ein Screening-Verfahren unter Verwendung eines GTPγS-Bindungsverfahrens (hiernach bezeichnet als "GTPγS-Bindungstyp-Screening-Verfahren) oder
3) ein Screening-Verfahren unter Verwendung eines Ligandenbindungs-Assayverfahrens (hiernach bezeichnet als "Ligandenbindungstyps-Screening-Verfahren).

1) cAMP-Typ-Screening-Verfahren
Im Fall eines Screenings nach einer Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert (d.h., einem Agonist), nützlich als Wirkstoff eines Mittels zur Behandlung von Diabetes (insbesondere eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer gesagt eines Mittels zur Unterstützung der Insulinsekretion spezifisch bei hoher Glukosekonzentration) durch Verwendung von Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration als Indikator wird es analysiert, ob oder nicht das Polypeptid aktiviert wird, indem die Transformante für ein Screening-Werkzeug mit einer Testverbindung kontaktiert wird und Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in den Zellen direkt oder indirekt analysiert (d.h., gemessen oder nachgewiesen) werden. Das cAMP-Typ-Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung, worin Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration als Indikator verwendet werden, umfasst nämlich die Schritte des Kontaktierens der Transformante für ein Screening-Werkzeug mit einer Testverbindung und die Analyse der Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in den Zellen. Genauer gesagt wird das Screening vorzugsweise durch jedes der Verfahren, wie beschrieben in den Beispielen 6, 7, 10 oder 11, durchgeführt. Beispielsweise wird ein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration als Indikator gemessen, indem eine Testverbindung für eine bestimmte Zeit exponiert wird und dann eine Testverbindung, deren EC₅₀ 10 μm oder weniger beträgt (vorzugsweise 1 μm oder weniger) als Substanz mit einer agonistischen Aktivität gewählt.
Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration können beispielsweise direkt durch Verwendung eines kommerziell erhältlichen cAMP-Messkits (Amersham oder ähnliche), wie in Beispiel 6 oder 11 dargestellt, analysiert werden oder indirekt durch Analyse einer transkriptionellen Aktivität eines Gens, bei dem eine Regulation der Transkription von der cAMP-Konzentration abhängt [wie z.B. ein Gen, erhalten durch Einführung eines cAMP-reaktiven Elements (CRE) stromaufwärts von einem Luciferasegen], wie in Beispiel 7 oder 10 dargestellt.
Wenn die Transformante für ein Screening-Werkzeug in Kontakt mit einer Testverbindung gebracht wird und die intrazelluläre cAMP-Konzentration darin dann ansteigt, kann entschieden werden, dass die Testverbindung ein Agonist für das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug ist. In diesem Zusammenhang wird ein ähnliches Verfahren unter Verwendung einer Wirtszelle, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug nicht exprimiert oder einer Zelle, die mit einem leeren Vektor transformiert ist, anstelle der Transformante für ein Screening-Werkzeug als Kontrolle durchgeführt und es wird bevorzugt zu bestätigen, dass die cAMP-Konzentration in den Kontrollzellen durch die Testverbindung nicht angehoben wird.
Das Screening nach einer Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, durch direkte Analyse von Veränderungen der cAMP-Konzentration unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen cAMP-Messkits (Amersham oder ähnliche) kann beispielsweise durch das folgende Verfahren, wie in Beispiel 6 dargestellt, durchgeführt werden. Genauer gesagt werden Zellen, die ein Gen, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, enthalten, 20 Stunden nach dem Gentransfer kultiviert und das Medium wird entfernt. Nachdem 400 μl von 1 mmol/l IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin)/DMEM zugefügt wurde, wird das ganze bei 37°C 10 Minuten in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Weiterhin wird eine Testverbindung (wie z.B. eine Verbindung, ein Peptid oder ein Antikörper), verdünnt mit 100 μl 1 mmol/l IBMX/DMEM zugefügt und für weitere 30 Minuten inkubiert. Das Medium wird entfernt und dann wird eine Menge an cAMP in den resultierenden Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen cAMP-Messkits (wie z.B, dem cAMP-Enzymimmunoassaysystem; Amersham Pharmacia Biotech) gemessen. Eine Testverbindung, bei der ein spezifischer Anstieg von cAMP in Gegenwart der Testverbindung beobachtet wird, kann als Substanz gescreent werden, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, d.h., ein Mittel zur Behandlung von Diabetes.
Das Screening nach einer Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, indem indirekt Veränderungen der cAMP-Konzentration durch Analyse einer transkriptionellen Aktivität eines Gens, bei dem eine Regulation der Transkription von der cAMP-Konzentration abhängt, analysiert werden, kann beispielsweise durch das folgende Verfahren, wie in Beispiel 7 dargestellt, durchgeführt werden. Genauer gesagt werden Zellen, die ein Gen enthalten, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug und ein Gen, worin eine Regulation der Transkription von der cAMP-Konzentration abhängt [beispielsweise ein Gen, erhalten durch Einführung eines cAMP-reaktiven Elements (CRE) stromaufwärts von einem Luciferasegen; wie z.B. ein pCRE-Luc-Vektor (CLONTECH)] für 18 bis 20 Stunden nach dem Gentransfer kultiviert. Eine mit einem Medium verdünnte Testverbindung wird zugefügt und das Ganze wird bei 37°C 5 bis 6 Stunden in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Das Medium wird entfernt und die Zellen werden mit einer Zelllyselösung lysiert. Eine Luciferaseaktivität des Lysats wird gemessen. Eine Substanz oder ähnliches, worin ein spezifischer Anstieg einer Reporteraktivität in Gegenwart der Testverbindung beobachtet wird, kann als Substanz gescreent werden, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, d.h., ein Mittel zur Behandlung von Diabetes.
2) GTPγS-Bindungstyp-Screening-Verfahren
Das Screening nach einer Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert (d.h., Agonist), nützlich als Wirkstoff für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes (insbesondere ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer gesagt ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch bei hoher Glukosekonzentration) unter Verwendung eines GTPγS-Bindungsverfahrens (Lazzareno, S. und Birdsall, N. J. M., Br. J. Pharmacol., 109, 1120-1127, 1993) kann beispielsweise durch das folgende Verfahren durchgeführt werden. Genauer gesagt wird eine Zellmembran, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug exprimiert, mit ³⁵S-markiertem GTPγS (400 pmol/l) in einer Mischlösung (20 mmol/L HEPES (pH 7,4), 100 mmol/l NaCl, 10 mmol/l MgCl₂ und 50 mmol/l GDP] vermischt. Nach Inkubation in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung werden Reaktionslösungen mit einem Glasfilter oder ähnlichem gefiltert und daraufhin wird die verbleibende GPTγS-Radioaktivität auf jedem Filter durch eine Flüssigszintillations-Zählvorrichtung oder ähnliches gemessen. Ein Agonist gegen das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, d.h., ein Mittel zur Behandlung von Diabetes, kann durch einen spezifischen Anstieg der GTPγS-Bindung in Gegenwart einer Testverbindung als Indikator gescreent werden.
Das GTPγS-Bindungstyp-Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des GTPγS-Bindungsverfahrens umfasst die Schritte des Kontaktierens einer Zellmembran der Transformante für ein Screening-Werkzeug mit einer Testverbindung in Gegenwart von ³⁵S-markiertem GTPγS, Abtrennen der GTPγS-Bindung an die Zellmembran von ungebundenem GTPγS und Analyse einer Radioaktivität von einem der abgetrennten GTPγS.
3) Ligandenbindungstyp-Screening-Verfahren
Das Screening nach einer Substanz, die an das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug bindet, nützlich als Wirkstoff für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes (insbesondere ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer gesagt ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch bei hoher Glukosekonzentration) unter Verwendung eines Ligandenbindungs-Assayverfahrens kann beispielsweise durch das folgende Verfahren durchgeführt werden. Genauer gesagt wird die Transformante für ein Screening-Werkzeug, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug exprimiert oder eine Zellmembran davon oder das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug (vorzugsweise eine gereinigte Präparation davon) hergestellt. Assaybedingungen, wie z.B. Puffer, Ionen und/oder pH, werden optimiert Die Transformante, die das Polypeptid exprimiert oder die Zellmembran davon oder das Polypeptid und eine markierte Substanz, erhalten beispielsweise durch das cAMP-Typ-Screening und/oder das GTPγS-Bindungstyp-Screening-Verfahren [d.h. ein Agonist, wie z.B. 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat oder L-α-Lysophosphatidylcholinoleoyl] werden in dem optimierten Puffer inkubiert und zwar zusammen mit einer Testverbindung für eine bestimmte Zeit. Nach der Reaktion wird das Ganze durch einen Glasfilter oder ähnliches gefiltert und der Filter wird mit einem geeigneten Volumen des Puffers gewaschen. Die auf dem Filter verbleibende Radioaktivität wird durch eine Flüssigszintillations-Zählvorrichtung oder ähnliches gemessen. Ein Ligand des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug kann durch die Bindungsinhibition der Markierung als Indikator gewählt werden. In diesem Zusammenhang kann bestätigt werden, dass der Ligand ein Agonist oder ein Antagonist ist, beispielweise durch das cAMP-Typ-Screening-Verfahren und/oder das GTPγS-Bindungstyp-Screening-Verfahren.
(3) Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes (nur zur Referenz)
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann beschrieben werden, umfassend als Wirkstoff eine Substanz (beispielsweise DNAs, Proteine [einschließlich Antikörper und Fragmente davon), Peptide oder andere Verbindungen], die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, beispielsweise gewählt durch das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention von Diabetes (ein Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Diabetes; noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterstützung der Insulinsekretion, besonders bevorzugt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterstützung der Insulinsekretion spezifisch bei hoher Glukosekonzentration), umfassend eine Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, als Wirkstoff.
Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes beschrieben, bestehend aus den folgenden Schritten:
Durchführung einer Analyse, wie unten beschrieben, in einem Qualitätskontrolltest einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes und
Herstellung einer Formulierung, enthaltend die analysierte Substanz.
Die Analyse kann durchgeführt werden durch

(1) Kontaktieren einer Zelle für ein Screening-Werkzeug oder einer Zellmembran davon mit einer Testverbindung und Analyse, ob oder nicht ein Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert wird oder
(2) Kontaktieren einer Zelle für ein Screening-Werkzeug oder einer Zellmembran davon mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Agonisten des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug und eine Analyse einer Veränderung einer Menge des markierten Agonisten, der die Zelle oder die Zellmembran davon bindet.

Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes beschrieben, bestehend aus dem Schritt der Herstellung einer Formulierung, enthaltend eine Substanz, die durch das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, umfassend die Analyse durch die oben erwähnten Verfahren.
Als Wirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung kann eine Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, verwen det werden. Die aktivierende Substanz kann beispielsweise durch ein Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung gewählt werden. Als Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert, können beispielsweise 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat (siehe Beispiel 7) oder L-α-Lysophosphatidylcholinoleoyl (siehe Beispiel 10) erwähnt werden und 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat wird bevorzugt. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist nicht auf eine pharmazeutische Zusammensetzung begrenzt, die als Wirkstoff eine Substanz umfasst, die durch das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, sondern beinhaltet eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Substanz umfasst, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert. Als pharmazeutische Zusammensetzung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterstützung der Insulinsekretion bevorzugt und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterstützung der Insulinsekretion, insbesondere bei hoher Glukosekonzentration, wird noch mehr bevorzugt.
In diesem Zusammenhang ist es möglich zu bestätigen, dass eine Substanz bei der Behandlung von Diabetes effektiv ist, durch Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind oder modifizierte Verfahren. Beispielsweise kann eine Aktivität der Insulinsekretion durch das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren bestätigt werden. Eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von Insulin im Plasma oder eine Aktivität zur Verminderung der Blutglukose kann beispielsweise durch das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren bestätigt werden.
Die Präparation, die als Wirkstoff eine Substanz [beispielsweise DNAs, Proteine (einschließlich Antikörper und Fragmente davon), Peptide oder andere Verbindungen] umfasst, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktivieren, kann beispielsweise als pharmazeutische Zusammensetzung unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Füll-stoffen und/oder anderen Additiven hergestellt werden, die üblicherweise bei der Herstellung einer Formulierung gemäß dem Wirkstoff verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention von Diabetes, umfassend als Wirkstoff eine Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert und die Insulinsekretion unterstützt, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention von Diabetes, umfassend als Wirkstoff eine Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert und die Insulinsekretion spezifisch bei hoher Glukosekonzentration unterstützt. Ebenfalls wird ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Diabetes offenbart, umfassend die Verabreichung einer Substanz, die das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug aktiviert.
Verabreichungsbeispiele beinhalten eine orale Verabreichung durch Tabletten, Pillen, Kapseln, Körner, feine Körner, Pulver, orale Lösungen und ähnliches und eine parenterale Verabreichung durch Injektionen (z.B. intravenös, intramuskulär oder ähnliche), Suppositorien, transdermale Präparationen, transmukosale Absorptionspräparationen und ähnliche. Insbesondere wird im Fall von Peptiden, die im Magen verdaut werden, eine parenterale Verabreichung, wie z.B. eine intravenöse Injektion oder ähnliche bevorzugt.
Bei der festen Zusammensetzung zur Verwendung bei der oralen Verabreichung können ein oder mehr aktive Substanzen mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel, wie Laktose, Mannitol, Glukose, mikrokristalline Cellulose, Hydroxypropylcellulose, Stärke, Polyvinylpyrrolidon oder Aluminiummagnesiumsilikat vermischt werden. Auf dem üblichen Weg kann die Zusammensetzung Additive außer dem inerten Verdünnungsmittel enthalten, wie z.B. ein Gleitmittel, ein Desintegrationsmittel, einen Stabilisator oder ein die Löslichmachung unterstützendes oder lösendes Mittel. Falls nötig können die Tabletten oder Pillen mit einer Zuckerbeschichtung oder einem Film einer gastrischen oder enterischen Substanz beschichtet werden.
Die flüssige Zusammensetzung für die orale Verabreichung kann beispielsweise Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere beinhalten und kann ein üblicher Weise verwendetes inertes Verdünnungsmittel, wie z.B. gereinigtes Wasser oder Ethylalkohol enthalten. Die Zusammensetzung kann andere Additive außer dem inerten Verdünnungsmittel enthalten, wie z.B. Befeuchtungsmittel, Suspendiermittel, Süßmittel, Geschmacksstoffe oder Antiseptika.
Die Injektionen für die parenterale Verabreichung können aseptische wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen beinhalten. Beispiele für das Verdünnungsmittel zur Verwendung bei den wässrigen Lösungen, und Suspensionen beinhalten destilliertes Wasser für die Injektionsverwendung und physiologische Salzlösung. Beispiele für das Verdünnungsmittel zur Verwendung in den nicht-wässrigen Lösungen und Suspensionen beinhalten Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl (z.B. Olivenöl), Alkohole (z.B. Ethanol), Polysobat 80 und ähnliche. Solch eine Zusammensetzung kann weiterhin ein Anfeuchtungsmittel, einen Emulgator, ein Dispersionsmittel, einen Stabilisator, ein lösendes oder die Lösung unter stützendes Mittel, ein Antiseptikum oder ähnliches enthalten. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterienrückhaltenden Filter, Vermischen mit einem Germicid oder Bestrahlung sterilisiert werden. Alternativ können sie verwendet werden, indem sie zunächst zu sterilen festen Zusammensetzungen formuliert werden und dann in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen Lösungsmittel zur Injektionsverwendung vor ihrer Verwendung gelöst werden.
Die Dosis wird optional entschieden, indem die Stärke von jedem Wirkstoff oder Symptome, Alter, Geschlecht oder ähnliches von jedem Patienten, an den verabreicht werden soll, mit in die Betrachtung einbezogen werden.
Beispielsweise liegt die übliche Dosis für einen Erwachsenen (60 kg Gewicht) im Fall einer oralen Verabreichung bei ungefähr 0,1 bis 100 mg, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg pro Tag. Im Fall der parenteralen Verabreichung liegt die übliche Dosis bei ungefähr 0,01 bis 50 mg, vorzugsweise 0,01 bis 10 mg pro Tag in Form einer Injektion.
Das Polynukleotid, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, kann zur Herstellung des Screening-Werkzeugs der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, verwendet werden und ist zusätzlich für eine Gentherapie nützlich.
Beispielsweise wird bei einer Gentherapie unter Verwendung des Polynukleotids, das das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug kodiert, das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug spezifisch im Pankreas überexprimiert, indem spezifisch das Polynukleotid in den Pankreas eingeführt wird. Das Polypeptid wird spontan in Abwesenheit des Liganden aktiviert und unterstützt die Insulinsekretion bei hoher Glukosekonzentration. Daher ist das Verfahren zur Behandlung von Diabetes nützlich. Die Gentherapie kann gemäß den Verfahren durchgeführt werden, die beispielsweise in Japan Society of Gene Therapy, "Idenshi chiroyou kaihatsu kenkyuu handobukku (Handbook of gene therapy research)", NTS, 1999 oder Tadashi Ariga und Yukio Sakiyama, Tanpakushitsu Kakusan Koso, 40(17), 2772-2780, 1995 beschrieben sind.
Weiterhin kann eine Substanz, die eine Expression des Polypeptids (insbesondere ein natürliches Polypeptid, wie z.B. ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16) für ein Screening-Werkzeug unterstützt (wie z.B. eine Substanz, die eine transkriptionelle Aktivität eines Polynukleotids, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug, unterstützt) die Insulinsekretion bei hoher Glukosekonzentration durch Überexpression des Polypeptids für ein Screening-Werkzeug unterstützen und ist so als Wirkstoff für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes nützlich (insbesondere ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer gesagt ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch bei hoher Glukosekonzentration). Die Expressions-unterstützende Substanz kann beispielsweise gewählt werden, indem ein Expressionsvektor hergestellt wird, erhalten durch Fusion einer Promotorregion eines Polynukleotids, kodierend das Polypeptid für ein Screening-Werkzeug stromaufwärts von einem geeigneten Reportergen (wie ein Luciferasegen), Kontaktieren der mit dem Expressionsvektor transformierten Zellen mit einer Testverbindung und Analyse der Veränderungen der Expression des Reportergens.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele illustriert, ist jedoch auf keine Weise durch diese begrenzt. Die Verfahren wurden gemäß den bekannten Verfahren durchgeführt (Maniatis, T., et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982), falls nicht anders angegeben.
BEISPIEL 1: ISOLATION DES POLYNUKLEOTIDS, DAS DAS POLYPEPTID KODIERT, BESTEHEND AUS DER AMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2
Eine Gesamtlängen-cDNA, die das Polypeptid kodierte, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, wurde durch die reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung einer menschlichen genomischen DNA (TOYOBO) als Matrize gemäß den folgenden Verfahren hergestellt.
Ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 3 wurde als Forward-Primer und ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 4, wurde als reverser Primer verwendet. An jedem der 5'-Enden der Primer wurde jeweils eine XbaI-Erkennungssequenz hinzugefügt und existierte dort. Die RT-PCR wurde unter Verwendung einer Polymerase (Pyrobest-DNA-Polymerase; Takara-shuzo) in Gegenwart von 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) durch Wiederholung eines Zyklus durchgeführt, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden, bei 58°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 2 Minuten, 34-mal. Im Ergebnis wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,0 kbp amplifiziert.
Das resultierende Fragment wurde mit einem Restriktionsenzym, XbaI, verdaut und das resultierende Produkt wurde in ein pEF-BOS-Plasmid kloniert und ein pEF-BOS-Signal-Sequenz-Flag-Plasmid (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990). Eine Nukleotidsequenz eines resultie renden Klons wurde bestimmt, wobei ein DNA-Sequenzer (ABI377 DNA-Sequenzer; Applied Biosystems) durch ein Dideoxytherminatorverfahren verwendet wurde, um eine Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 zu finden.
Um 5'-Terminus und 3'-Terminus der cDNA zu bestimmen, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 wurde ein RACE (rapid amplification of cDNA ends) -Verfahren durchgeführt, wobei eine menschliche Pankreas-cDNA (Human Pancreas Marathon-Ready cDNA; Clontech) als Matrize verwendet wurde. Die Prozeduren wurden konkret gemäß einem Manual durchgeführt, das der obigen cDNA beigefügt war.
In einer ersten PCR des 5'-RACE wurde ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 5 und ein AP1-Primer, angehaftet an die obige cDNA, verwendet; und in einer zweiten PCR wurden ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 und ein AP2-Primer, angehaftet an die obige cDNA, verwendet. In einer ersten PCR von 3'-RACE wurden ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 7 und ein AP1-Primer verwendet; und in einer zweiten PCR ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 8 und der AP2-Primer.
Die erste PCR von jeweils 5'- und 3'-RACE wurde unter Verwendung einer Taq-Polymerase (LA Taq; Clontech) unter Wiederholung eines Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 64°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 3 Minuten 27-mal durchgeführt. Die zweite PCR wurde unter Verwendung einer Taq-Polymerase (LA Taq; Clontech) durch Wiederholung eines Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 64°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 3 Minuten 34-mal durchgeführt. Nukleotidsequenzen der resultierenden PCR-Produkte wurden durch einen DNA-Sequencer (ABI377 DNA-Sequencer; Applied Biosystems) gemäß einem Dideoxyterminatorverfahren bestimmt.
Von der 5'-RACE wurde eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 9 als Sequenz des 5'-Terminus erhalten und von der 3'-RACE eine Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 10 als Sequenz des 3'-Terminus. In der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 9 existierte ein Terminationskodon (tag; 161te-163te) direkt stromaufwärts eines deduzierten Initiationskodons (atg; 200te-202te) und zwischen dem obigen Terminations- und dem obigen Initiationskodon existierte kein Initiationskodon in frame. In der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 10 existierte ein Terminationskodon (taa; 217te-219te) an einer erwarteten Position. Daher wurde bestätigt, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 eine Nukleotidsequenz war, die eine Gesamtlängen-Aminosäuresequenz kodier te, enthaltend Initiations- und Terminationskodon. Weiterhin korrespondierte die von der obigen Sequenz deduzierte Aminosäuresequenz (335 Aminosäuren) zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2. Die deduzierte Aminosäuresequenz enthielt hydrophobe Regionen, die sieben Transmembrandomänen sein sollten, d.h., ein charakteristisches Merkmal eines G-Proteingekoppelten Rezeptors. Daher wurde bestätigt, dass die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor kodiert.
BEISPIEL 2: BESTÄTIGUNG DER EXPRESSIONSVERTEILUNG VON mRNA DES POLY-PEPTIDS, BESTEHEND AUS DER AMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2
Eine Expressionsverteilung des Polynukleotids, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, wurde durch ein RT-PCR-Verfahren gemäß den folgenden Verfahren analysiert.
In einem ersten Schritt wurde eine poly A+-RNA (5 μg; Clontech), hergestellt aus menschlichen Organen, genauer gesagt Gehirn, d.h., Mantel, Nucleus caudatus, Hippocampus, Corpus callosum, Substantia nigra und Cerebellum, Rückenmark, Hypophyse, Herz, Plazenta, Lunge, Trachea, Leber, Niere, Pankreas, Dünndarm, Magen, Milz, Knochenmark, Thymus, Thyroid-Drüse, Speicheldrüse, Nebennierendrüse, Brustdrüse, Prostata, Hoden und Ovar mit einer DNase (DNase; Nippon Gene) bei 37°C für 15 Minuten umgesetzt. Ein Teil (4 μg) der resultierenden poly A+-RNA, behandelt mit der DNase wurde für eine Reaktion mit einer reversen Transkriptase (MMLV Reverse Transcriptase; Clontech) bei 42°C für 60 Minuten und 94°C für 5 Minuten umgesetzt, um eine cDNA zu erhalten. Die resultierende cDNA wurde in 800 μl sterilisiertem Wasser gelöst.
Die Expressionsverteilung der mRNA des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, wurde durch eine PCR analysiert, worin die resultierenden cDNAs der obigen menschlichen Organe als Matrize verwendet wurden und eines Oligonukleotids, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 11 und eines Oligonukleotids, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 12 als Primerset. Die PCR wurde unter Verwendung einer Taq-Polymerase (Ex Taq; Takara-shuzo) durchgeführt. In der PCR wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 30 Sekunden, bei 50°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 1 Minute 30-mal in Gegenwart von 5% DMSO wiederholt. Als interner Standard wurde ein Gen der menschlichen Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH) durch eine PCR unter denselben Bedingungen amplifiziert, wobei die cDNAs von den obigen menschlichen Organen als Matrize und ein menschliches G3PDH-Kontroll-Amplimerset (Human G3PDH Control Amplimer Set; Clontech) verwendet wurden. Die resultierenden PCR- Produkte wurden durch eine Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Ein amplifiziertes Produkt mit ungefähr 500 bp, erhalten von der mRNA des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 wurde nur im Pankreas angetroffen.
BEISPIEL 3: ISOLATION UND BESTÄTIGUNG DER EXPRESSIONSVERTEILUNG EINES RATTENPOLYNUKLEOTIDS, KORRESPONDIEREND ZU DEM, KODIEREND DAS POLYPEPTID, BESTEHEND AUS DER AMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2
Ein Rattenpolynukleotid, korrespondierend zu dem menschlichen Polynukleotid, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 und isoliert in Beispiel 1, wurde aus den folgenden Verfahren erhalten.
Eine PCR wurde zunächst durchgeführt, wobei eine Ratten-genomische DNA (rat genomic DNA; Clontech) als Matrize und das Oligonukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 11 und das Oligonukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 12, jeweils verwendet in Beispiel 2, als Primerset verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine DNA-Polymerase (Pyrobest DNA-Polymerase; Takara-shuzo) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden, bei 57°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 1 Minute wurde in Gegenwart von 5% DMSO 34-mal wiederholt. Dann wurde eine weitere PCR durchgeführt, wobei die resultierenden PCR-Produkte als Matrize verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine DNA-Polymerase (Pyrobest DNA-Polymerase; Takara-shuzo) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden, bei 55°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 1 Minute wurde 34-mal in Gegenwart von 5% DMSO wiederholt. Teilsequenzen der resultierenden PCR-Fragmente wurden analysiert und vier Oligonukleotide, bestehend aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID Nr. 21 bis 24 wurden als Primer für ein RACE-Verfahren entworfen.
In dem folgenden RACE-Verfahren wurde eine Gehirn-cDNA (Marathon-Ready cDNA; Clontech) als Matrize verwendet. Für das 5'-RACE wurden ein Oligonukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 21 und ein AP1-Primer (angehaftet an die obige cDNA) in einer ersten PCR verwendet; und das Oligonukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 22 und ein AP2-Primer (angehaftet an die obige cDNA) wurden in der zweiten PCR verwendet. Für das 3'-RACE wurden ein Oligonukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 23 und der obige AP1-Primer in einer ersten PCR; und das Oligonukleotid, bestehend aus der Nukleotid sequenz von SEQ ID Nr. 24 und der obige AP2-Primer in einer zweiten PCR verwendet.
Im Fall der ersten und zweiten PCRs für 5'-RACE wurde eine Taq-Polymerase (LA Taq; Clontech) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 65°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 3 Minuten wurde jeweils 34-mal wiederholt. Im Fall der ersten und zweiten PCRs für 3'-RACE wurde eine Taq-Polymersate (LA Taq; Clontech) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 65°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 5 Minuten wurde jeweils 34-mal wiederholt. Die Nukleotidsequenzen der resultierenden PCR-Produkte von 5'-RACE und 3'-RACE wurden analysiert.
Ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 25 und ein solches bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 26 wurden auf der Basis der bestimmten Nukleotidsequenzen entworfen. Eine PCR wurde durchgeführt, wobei das entworfene Primerset und die Rattengehirn-cDNA als Matrize verwendet wurden. In der PCR wurde eine DNA-Polymerase (pfu-Turbo-DNA-Polymerase; STRATAGENE) verwendet; und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 64°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 2 Minuten wurde 12-mal wiederholt, ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 61°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 2 Minuten wurde 12-mal wiederholt und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 58°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 2 Minuten wurden 16-mal wiederholt. Dann wurde eine weitere PCR durchgeführt, wobei die resultierenden PCR-Produkte als Matrize verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine DNA-Polymerase (pfu-Turbo-DNA-Polymerase; STRATEGENE) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 64°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 150 Sekunden wurde 12-mal wiederholt, ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 61°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 150 Sekunden wurde 12-mal wiederhol und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 58°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 150 Sekunden wurde 16-mal wiederholt. Die resultierenden PCR-Produkte (hiernach bezeichnet als PCR-Produkte A) wurden subkloniert und die Nukleotidsequenzen davon wurden bestätigt.
Darauffolgend wurde ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 13 (ein Forward-Primer) und ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 14 (eine Reverse-Primer) auf der Basis der bestimmten Nukleotidsequenzen entworfen.
Es existierte eine XbaI-Erkennungsstelle, zugefügt zum 5'-Terminus von jeweils jedem Primer. Eine PCR wurde durchgeführt, wobei das Primerset und die subklonierten PCR-Produkte A als Matrize verwendet wurden. In der PCR wurde eine DNA-Polymerase (pfu-Turbo-DNA-Polymerase; STRATAGENE) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 20 Sekunden, bei 59°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 90 Sekunden wurde 25-mal wiederholt. Im Ergebnis wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,0 kbp amplifiziert. Das resultierende Fragment wurde mit einem Restriktionsenzym, XbaI, verdaut und dann in ein pEF-BOS-Plasmid kloniert. Eine Nukleotidsequenz eines resultierenden Klons wurde bestimmt, wobei ein DNA-Sequencer (ABI377 DNA-Sequencer; Applied Biosystems) mit einem Dideoxyterminatorverfahren verwendet wurde, um eine Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 15 zu finden. Eine von der resultierenden Nukleotidsequenz deduzierte Aminosäuresequenz war eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16.
Daraufhin wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Oligonukleotid verwendet wurde, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 17 und ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 18, jeweils entworfen auf der Basis der resultierenden Nukleotidsequenzen als Primerset und cDNA, hergestellt aus einer Ratten-pankreatischen β-Zelllinie RIN-5F (ATCC: CRL-2058) als Matrize. Die verwendete cDNA wurde durch Herstellung einer Gesamt-RNA unter Verwendung eines Gesamt-RNA-Reinigungsreagenzes (ISOGEN; NIPPONGENE) synthetisiert und dann durch Umsetzung mit reverser Transkriptase. In der PCR wurde eine Taq-Polymerase (rTaq; Takarashuzo) verwendet und ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 30 Sekunden, bei 57°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 1 Minute wurde 34-mal wiederholt und zwar in Gegenwart von 5% DMSO. Die resultierenden PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Es wurde bestätigt, dass mRNA des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 16 in der pankreatischen Ratten-β-Zelllinie exprimiert wurde.
Weiterhin wurde eine PCR für die von einer Maus-pankreatischen β-Zelllinie NIT-1 (ATCC: CRL-2055) hergestellte cDNA durchgeführt. Die verwendete cDNA wurde wie im Fall der obigen Ratten-pankreatischen β-Zell-linie RIN-5F durch Herstellung einer Gesamt-RNA unter Verwendung eines Gesamt-RNA-Reinigungsreagenzes (ISOGEN; NIPPONGENE) und dann Umsetzung mit reverser Transkriptase synthetisiert. Die PCR wurde durch Wiederholung der im Fall der obigen Ratten-pankreatischen β-Zelllinie RIN-5F beschriebenen Verfahren durchgeführt, außer dass ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 19 und ein Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 20, jeweils entworfen auf der Basis der Nukleotidsequenz des obigen Ratten-Polypeptids, d.h., der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 15, als Primerset verwendet wurden, um ein DNA-Fragment mit ungefähr 400 bp zu finden. Es wurde angenommen, dass das resultierende DNA-Fragment ein Teil eines Maus-Polynukleotids war, korrespondierend zu dem menschlichen Polynukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder dem Ratten-Polynukleotid, bestehend aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 15. Weiter wurde bestätigt, dass mRNA des Maus-Polynukleotids, korrespondierend zu dem Polynukleotid, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder Nr. 16 ebenfalls in der Maus-pankreatischen β-Zelllinie exprimiert wurde.
Die Ergebnisse von Beispiel 2 und dem gegenwärtigen Beispiel zeigten, dass die mRNA des Polynukleotids, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder das korrespondierende Ratten- oder Maus-Polynukleotid spezifisch im Pankreas exprimiert wurden, einem Organ, das intensiv an einem Diabetes beteiligt ist und in den pankreatischen β-Zelllinien. Daher wäre es möglich, eine pankreatische β-Zelllinie oder eine Pankreaszelle für eine Selektion von Substanzen zu verwenden, die das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder ähnliches aktivieren würden, anstelle der Expression des Polynukleotids, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder dem korrespondierenden Ratten- oder Maus-Polynukleotid durch Einführung davon in verschiedene Zellstämme.
BEISPIEL 4: EXPRESSION EINES POLYPEPTIDS, BESTEHEND AUS EINER AMINO-SÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2 IN 293-EBNA-ZELLEN UND VERÄNDERUNG DER INTRAZELLULÄREN cAMP-KONZENTRATION DURCH ÜBEREXPRESSION
Um das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 zu exprimieren, wurde der Klon, hergestellt in Beispiel 1, d.h., das pEF-BOS-Signalsequenz-Flag-Plasmid, enthaltend die Gesamtlängen-cDNA, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 (hiernach bezeichnet als Plasmid pEF-BOS SSF-NA) verwendet. Dies lag daran, da der Expressionsvektor, der dazu in der Lage war eine Signalsequenz zum N-Terminus des gewünschten Polypeptids zuzufügen, verwendet wurde, um das gewünschte Polypeptid mit hoher Frequenz auf einer Zellmembran zu exprimieren.
293-EBNA-Zellen (7 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden auf einer Platte mit 24 Vertiefungen, beschichtet mit Kollagen, ausgesät und 24 Stunden kultiviert. Dann wurde ein Transfektionsreagenz (FuGENE6; Boehringer Mannheim) verwendet, um ein Plasmid pEF-BOS SSF-NA oder ein Plasmid pEF-BOS (negativer Kontrollvektor) in die Zellen zu transfizieren. Die transfizierten Zellen wurden weitere 20 Stunden kultiviert und dann wurde ein Medium aspiriert. Nach Zugabe von 500 μl 1 mmol/l IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin)/DMEM wurde das Ganze bei 37°C 40 Minuten in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Das verwendete IBMX war ein Phosphodiesteraseinhibitor. Dann wurde das Medium aspiriert und eine cAMP-Menge der resultierenden Zellen wurde gemessen. Ein kommerziell erhältliches cAMP-Enzymimmunoassaysystem (Amersham Pharmacia Biotech) wurde für die Messung der cAMP-Menge verwendet.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Menge an intrazellulärem cAMP abhängig von der Menge der Plasmide in den Zellen anstieg, die mit dem Plasmid pEF-BOS SSF-NA transfiziert worden waren, während keine Veränderung der Menge an intrazellulärem cAMP bei den Zellen beobachtet wurde, die mit dem Plasmid pEF-BOS transfiziert worden waren. Der Anstieg der cAMP-Menge durch Überexpression des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 zeigte, dass cAMP einer der second Messengers des Polypeptids war, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.
BEISPIEL 5: EXPRESSION DES POLYPEPTIDS, BESTEHEND AUS DER AMINOSÄURE-SEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2 IN DER PANKREATISCHEN β-MAUSZELLLINIE NIT-1 UND VERÄNDERUNG DER SEZERNIERTEN INSULINMENGE DURCH ÜBEREXPRESSION
Das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16 wurde spezifisch im Pankreas exprimiert und seine Expression in pankreatischen β-Zelllinien wurde bestätigt (siehe Beispiele 2 und 3). Es wäre möglich die Funktion des Polypeptids durch Überexpression des Polypeptids in den pankreatischen β-Zelllinien vorherzusagen. Um das Polypeptid zu exprimieren, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, wurde das Plasmid pEF-BOS SSF-NA, wie verwendet in Beispiel 4, auch im gegenwärtigen Beispiel verwendet.
NIT-1-Zellen (4 × 10⁵ Zellen) wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden kultiviert. Dann wurde ein Transfektionsreagenz (FuGENE6; Boehringer Mannheim) verwendet, um das Plasmid pEF-BOS SSF-NA oder das Plasmid pEF-BOS (negativer Kontrollvektor) in die Zellen zu transfizieren. Die transfizierten Zellen wurden weiter 2 oder 3 Tage kultiviert und dann wurde ein Medium aspiriert. Nach einem Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurde 1 ml 3,3 mmol/l Glukose-haltiger KRBB (Krebs-Ringer Biocarbonatpuffer) zugefügt und das Ganze 1 oder 2 Stunden bei 37°C inkubiert, und zwar in Gegenwart von 5% CO₂. Daraufhin wurde der Puffer aspiriert und 1 ml 3,3 mmol/l Glukose-haltige KRBB oder 1 ml 16,8 mmol/l Glukose-haltiger KRBB wurde zugefügt. Das Ganze wurde bei 37°C 2 Stunden in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Eine Insulinmenge in den Überständen wurde gemessen. Ein kommerziell erhältlicher Insulin-Radioimmunoassykit (Phadeseph-Insulin; Pharmacia Upjohn) wurde für die Messung der Menge des sezernierten Insulins verwendet.
Es ergab sich, dass die Überexpression des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 keine Veränderung der sezernierten Insulinmenge in Gegenwart von 3,3 mmol/l Glukose auslöste, jedoch zu einem Anstieg der sezernierten Insulinmenge in Gegenwart von 16,8 mmol/l Glukose führte.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor war, der spezifisch in einem Pankreas, wie dargestellt in Beispiel 2, exprimiert wurde und eine Funktion zur Beschleunigung einer Sekretion von Insulin, abhängig von der Glukosekonzentration, zeigte. Daher wäre es möglich, eine pankreatische Erkrankung, insbesondere Diabetes, zu verhindern und/oder zu behandeln durch Aktivierung des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.
BEISPIEL 6: SCREENING VON SUBSTANZEN, DIE EINE AKTIVITÄT DES POLY-PEPTIDS, BESTEHEND AUS EINER RMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2 MODIFI-ZIEREN KÖNNEN, BASIEREND AUF EINER VERÄNDERUNG DER INTRAZELLULÄREN cAMP-KONZENTRATION – TEIL 1
Um das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 zu exprimieren, wurde der Klon, hergestellt in Beispiel 1, d.h., das pEF-BOS-Plasmid, in das die Gesamtlängen-cDNA, kodierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 eingeführt worden war (hiernach bezeichnet als Plasmid pEF-BOS-NA) verwendet.
293-EBNA-Zellen (7 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, beschichtet mit Kollagen, ausgesät und 24 Stunden kultiviert. Dann wurde ein Transfektionsreagenz (FuGENE6; Boehringer Mannheim) verwendet, um 50 ng des Plasmids pEF-BOS-NA oder eines Plasmids pEF-BOS (negativer Kontrollvektor) in die Zellen zu transfizieren. Die transfizierten Zellen wurden für 20 Stunden weiter kultiviert und dann wurde ein Medium aspiriert. Nach Zugabe von 400 μl 1 mmol/l IBMS (3-Isobutyl-1-methylxanthin)/DMEM wurde das Ganze 10 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Weiterhin wurde eine Testverbindung, wie z.B. eine Verbindung, ein Peptid oder ein Antikörper, verdünnt mit 100 μl 1 mmol/l IBMX zugefügt und das Ganze wurde 30 Minuten inkubiert. Dann wurde das Medium aspiriert und die resultierenden Zellen wurden für eine Messung einer cAMP-Menge verwendet. Ein kommerziell erhältliches cAMP-Enzymimmunoassaysystem (Amersham Pharmacia Biotech) kann für die Messung der Menge von cAMP verwendet werden und die Testverbindung, die einen Anstieg der cAMP-Menge spezifisch in den Zellen hervorruft, in denen das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 exprimiert wurde, kann als Substanz gewählt werden, die das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aktivieren kann.
BEISPIEL 7: SCREENING VON SUBSTANZEN, DIE DIE AKTIVITÄT DES POLY-PEPTIDS, BESTEHEND AUS AMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2 MODIFIZIEREN KÖNNEN, BASIEREND AUF EINER VERÄNDERUNG DER INTRAZELLULÄREN cAMP-KONZENTRATION – TEIL 2
Das in Beispiel 6 verwendete pEF-BOS-NA-Plasmid wurde ebenfalls im gegenwärtigen Beispiel verwendet.
293-EBNA-Zellen (1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit Kollagen, ausgesät und über Nacht in einem Dulbecco-modifizierten Eagles-Medium (DMEM), enthaltend 10%iges fötales Kälberserum (FCS) kultiviert. Dann wurde ein Transfektionsreagenz (LIPOFECTAMINE 2000; GIBCO BRL) verwendet, um 0,01 ng eines Plasmids pEF-BOS-NA oder eines Plasmids pEF-BOS (negativer Kontrollvektor) und 5 ng eines pCRE-Luc-Vektors (CLONTECH) in die Zellen zu transfizieren. Die transfizierten Zellen wurden weiter für 18 bis 20 Stunden kultiviert und dann wurde eine Testverbindung (eine bekannte Verbindung, jedoch unbekannt im Hinblick auf ihre Effizienz zur Behandlung von Diabetes), verdünnt mit dem Medium, zugefügt und das Ganze wurde für 5 bis 6 Stunden in Gegenwart von 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Nachdem das Medium aspiriert wurde, wurden die Zellen mit einer Zelllyselösung (Zelllysepuffer LCβ; Toyo Ink Mfg.) lysiert. Eine Luciferaseaktivität des Lysats wurde durch einen kommerziell erhältlichen Messkit (PicaGENE Luminescent kit; Toyo Ink Mfg.) und einem Messapparat (ML3000 Mikrotiterplatten-Luminometer; Dynatech Laboratories) gemessen.
Die Testverbindungen, die zu einem Anstieg der Reporteraktivität spezifisch in den Zellen führten, in denen das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 exprimiert wurde, wurden als Substanz gewählt, die eine Aktivität des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 erhöhen kann und vier unterschiedliche Verbindungen, einschließlich 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat (LT-1 Z 0059519; LaboTest)) konnten erhalten werden. Ein EC₅₀-Wert von 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat lag bei 3,2 μM.
BEISPIEL 8: EXPERIMENT DER SEKRETION VON INSULIN AUS DER PANKREA-TISCHEN β-MAUSZELLLINIE MIN6 – TEIL 1
MIN6-Zellen (2 × 10⁵ Zellen) wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät und 2 Tage in DMEM, enthaltend 10% FCS, kultiviert. Das Medium wurde aspiriert und die Zellen mit KRB-HEPES (140 mmol/l NaCl, 2,6 mmol/l KCl, 0,5 mmol/l NaH₂PO₄, 0,5 mmol/l MgSO₄, 1,5 mmol/l CaCl₂, 10 mmol/l Hepes, 2 mmol/l NaHCO₃, 0,1% BSA, pH 7,4) gewaschen. Nachdem 2,8 mmol/l Glukose-haltige KRB-HEPES (1 ml) zugefügt worden war, wurde das Ganze 30 bis 60 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert.
Nachdem der Puffer aspiriert worden war, wurde eine der vier Verbindungen, erhalten durch das Screening in Beispiel 7, d.h., 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat, in Form einer Lösung (0,5 ml), hergestellt durch Verdünnung der Verbindung mit 2,8 mmol/l oder 16,8 mmol/l Glukose-haltigem KRB-HEPES zugefügt und das Ganze wurde 20 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Ein Überstand wurde zur Messung einer sezernierten Insulinmenge verwendet.
Ein kommerziell erhältlicher Insulin-Radioimmunoassaykit (Phadeseph-Insulin; Pharmacia Upjohn) wurde für die Messung der sezernierten Insulinmenge verwendet.
Es ergab sich, dass die Stimulierung durch 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat nicht zu einem Anstieg der sezernierten Insulinmenge in Gegenwart von 2,8 mmol/l Glukose, jedoch zu einem solchen in Gegenwart von 16,8 mmol/l Glukose führte. Daher wurde gezeigt, dass 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat eine Funktion zur Beschleunigung einer Insulinsekretion nur bei Stimulation durch eine hohe Glukosekonzentration zeigen kann.
Für eine der drei in Beispiel 7 gefundenen Verbindungen, außer 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat wurden die Verfahren, die für das Experiment von 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat beschrieben wurden, wiederholt. Es ergab sich, dass die Stimulation durch die Verbindung nicht zu einem Anstieg der sezernierten Insulinmenge in Gegenwart von 2,8 mmol/l Glukose, jedoch zu einem solchen in Gegenwart von 16,8 mmol/l Glukose führte. Daher wurde gezeigt, dass die Verbindung eine Funktion zur Beschleunigung der Insulinsekretion nur dann zeigen kann, wenn sie durch eine hohe Glukosekonzentration stimuliert wird.
BEISPIEL 9: GLUKOSETOLERANZTESTS FÜR SD-RATTEN UND GK-RATTEN DURCH EINE ORALE DOSIS
SD-Ratten (4 Wochen alt; CREA JAPAN) ließ man über Nacht fasten und 2 g/kg Glukose wurden oral verabreicht. 100 mg/kg 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat (LT-1 Z 0059519) wurden intraperitoneal 5 Minuten vor der Glukoseverabreichung verabreicht. Eine geeignete Blutmenge wurde bei 0 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten nach der Glukoseverabreichung entnommen und für die Messung des Blut-Glukose-Niveaus und einer Konzentration des Plasmainsulins verwendet.
Zur Messung des Blut-Glukose-Niveaus wurde ein Überstand, erhalten durch Vermischen von Blut und 0,33 mol/l Perchlorsäure (Blut: 0,33 mol/l Perchlorsäure = 1:10) und Zentrifugation der Mischung (3.000 × g, 10 Minuten, 4°C) verwendet. Zur Messung der Konzentration des Plasmainsulins wurde ein Überstand, erhalten durch Zentrifugation von Blut (3.000 × g, 10 Minuten, 4°C) verwendet. Weiterhin wurde der Glukose-C-Test-Wako (Wako) bei der Messung des Blut-Glukose-Niveaus verwendet und ein Ratten-Insulin-Assaysystem (Amersham) bei der Messung der Konzentration des Plasmainsulins.
Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 dargestellt. 1 illustriert einen Zeitverlauf der Konzentration von Plasmainsulin (Einheit = ng/ml) nach oraler Verabreichung von Glukose und 2 illustriert einen Zeitverlauf des Blut-Glukose-Niveaus (Einheit = mg/dl) nach der oralen Verabreichung von Glukose. Das Zeichen "*" in 1 und 2 zeigt, dass ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe, d.h. der Gruppe, der kein 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat verabreicht wurde p < 0,05 (Student's-t-Test) betrug.
Wie in 1 dargestellt, wurde ein signifikanter Anstieg der Plasmainsulinkonzentration 30 Minuten nach der Glukoseverabreichung bei der Gruppe beobachtet, der 100 mg/kg 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat verabreicht wurde. Weiterhin wurde ein Anstieg des Blut-Glukose-Niveaus durch die Glukoseverabreichung signifikant 30 Minuten nach der Glukoseverabreichung unterdrückt, und zwar bei der Gruppe, der 100 mg/kg 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat verabreicht wurde.
Daher wurde bestätigt, dass bei den SD-Ratten, denen Glukose verabreicht worden war, 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat eine Funktion zur Erhöhung der Insulinmenge im Plasma und eine Funktion zur Reduktion des Blut-Glukose-Niveaus ausübte.
Dann wurde ein Glukose-Toleranztest für GK (Goto-Kakizaka) -Ratten (Typ II Diabetesmodelle mit inkompletter Insulinsekretion; 7 Wochen alt; Charles River Japan) durch eine orale Dosis durchgeführt. Die GK-Rattenlinie wurde durch selektive Paarung von Wistar-Ratten gemäß einem Index einer schlechten Toleranz in einem oralen Glukose-Toleranztest durch Yoshio Goto, et al., School of Medicine, Tohoku University, 1975 etabliert.
Die Verfahren des Glukose-Toleranzetst für SD-Ratten wurden wiederholt, außer dass 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat oral verabreicht wurde.
3 illustriert einen Zeitverlauf des Blut-Glukose-Niveaus (Einheit = mg/dl) nach der oralen Verabreichung von Glukose. Das Zeichen "*" in 3 zeigt, dass ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe, d.h. der Gruppe, der kein 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat verabreicht wurde p < 0,05 (Student's-t-Test), betrug und das Zeichen "**" bedeutet, dass der signifikante Unterschied, wie oben definiert, p < 0,01 war.
Wie in 3 dargestellt, wurde ein Anstieg des Blut-Glukose-Niveaus durch die Glukoseverabreichung 30 und 60 Minuten nach Glukoseverabreichung bei der Gruppe signifikant unterdrückt, der 100 mg/kg 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat verabreicht worden war und daher wurde die Nützlichkeit von 2-(Pyridin-4-yl)ethylthiobenzoat in dem Diabetesmodell-Rattensystem bestätigt.
BEISPIEL 10: SCREENING VON SUBSTANZEN, DIE DIE AKTIVITÄT DES POLY-PEPTIDS MODIFIZIEREN KÖNNEN, BESTEHEND AUS DER AMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2, BASIEREND AUF EINER VERÄNDERUNG DER INTRAZELLULÄREN cAMP-KONZEN-TRATION – TEIL 3
Das in Beispiel 6 verwendete pEF-BOS-NA-Plasmid wurde ebenfalls im gegenwärtigen Beispiel verwendet.
293-EBNA-Zellen (7 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, beschichtet mit Kollagen, ausgesät und über Nacht in einem Dulbecco-modifizierten Eagles-Medium (DMEM), enthaltend 1% fötales Kälberserum (FCS), kultiviert. Dann wurde ein Transfektionsreagenz (LIPOFECTAMINE 2000; GIBCO BRL) verwendet, um 0,1 ng eines Plasmids pEF-BOS-NA oder eines Plasmids pEF-BOS (negativer Kontrollvektor) und 20 ng eines pCRE-Luc-Vektors (CLONTECH) in die Zellen zu transfizieren. Die transfizierten Zellen wurden weiter 18 bis 20 Stunden kultiviert, woraufhin eine Testverbindung, verdünnt mit einem Medium, enthaltend 0,1% BSA, zugefügt wurde und das Ganze wurde bei 37°C für 6 Stunden in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Nach Aspiration des Mediums wurden die Zellen mit einer Zelllyselösung (Zelllysepuffer LCβ; Toyo Ink Mfg.) lysiert. Eine Luciferaseaktivität des Lysats wurde durch einen kommerziell erhältlichen Messkit (PicaGene Luminescence kit; Toyo Ink Mfg.) und einen Messapparat (ML3000 Mikrotiterplatten-Luminometer; Dynatech Laboratories) gemessen.
Diejenigen Testverbindungen, die zu einem Anstieg einer Reporteraktivität spezifisch in den Zellen führen, worin das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 exprimiert wurde, wurden als Substanz gewählt, die eine Aktivität des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 erhöhen kann. L-α-Lysophosphatidylcholinoleoyl (L1881; SIGMA), eine Biokomponente, konnte erhalten werden.
BEISPIEL 11: SCREENING VON SUBSTANZEN, DIE DIE AKTIVITÄT DES POLY-PEPTIDS MODIFIZIEREN KÖNNEN, BESTEHEND AUS DER AMINOSÄURESEQUENZ VON SEQ ID Nr. 2, BASIEREND AUF EINER VERÄNDERUNG DER INTRAZELLULÄREN cAMP-KONZEN-TRATION – TEIL 4
Das in Beispiel 6 verwendete pEF-BOS-NA-Plasmid wurde ebenfalls im gegenwärtigen Beispiel verwendet.
293-EBNA-Zellen (1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, beschichtet mit Kollagen, ausgesät und 24 h kultiviert. Dann wurde ein Transfektionsreagenz (LIPOFECTAMINE 2000; GIBCO BRL) verwendet, um 3 ng eines Plasmids pEF-BOS-NA oder eines Plasmids pEF-BOS (negativer Kontrollvektor) in die Zellen zu transfizieren. Die transfizierten Zellen wurden weiter 20 Stunden kultiviert und das Medium wurde aspiriert. Nachdem 80 μl 1 mmol/L IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin)/0,1% BSA/DMEM zugefügt worden waren, wurde das Ganze bei 37°C 10 Minuten in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Dann wurde eine mit 20 μl 1 mmol/l IBMX/0,1% BSA/DMEM verdünnte Testverbindung zugefügt und das Ganze wurde 30 Minuten inkubiert. Nach Aspiration des Mediums wurden die resultierenden Zellen für die Messung einer cAMP-Menge verwendet. Ein kommerziell erhältliches cAMP-Enzymimmunoassaysystem (zyklischer AMP-Kit; Nihon Schering) wurde verwendet, um die cAMP-Menge zu messen. Die in Beispiel 10 gewählte Verbindung, d.h., L-α-Lysophosphatidylcholinoleoyl zeigte einen Anstieg der cAMP-Menge spezifisch in den Zellen, in denen das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 exprimiert wurde, und wurde daher als Substanz gewählt, die das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, aktivieren kann.
BEISPIEL 12: EXPERIMENT EINER SEKRETION VON INSULIN AUS DER PANKREA-TISCHEN β-MAUSZELLLINIE MIN6 – TEIL 2
MIN6-Zellen ((2,5 × 10⁵ Zellen) wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät, die mit Kollagen beschichtet war, und wurden 2 Tage in DMEM, enthaltend 10% FCS (Kat. Nr., 11995-065; GIBCO BRL) kultiviert. Das Medium wurde aspiriert und 0,4 ml Glukose-freies DMEM, enthaltend 10% FCS (Kat. Nr. 11966-025; GIBCO BRL) wurde zugefügt. Das Ganze wurde 2 Stunden bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert.
Nach Aspiration des Mediums wurden 0,5 ml einer Lösung von L-α-Lysophosphatidylcholinoleoyl, nämlich der Verbindung, die durch das Screening-Verfahren von Beispiel 10 gewählt wurde, verdünnt mit 2,8 mmol/l oder 16,8 mmol/l Glukose-haltigem DMEM (Kat. Nr. 11966-025; GIBCO BRL) zugefügt und das Ganze wurde 30 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. Ein Überstand wurde zur Messung einer sezernierten Insulinmenge verwendet.
Ein kommerziell erhältlicher Insulin-Radioimmunoassaykit (Phadeseph-Insulin; Pharmacia Upjohn) wurde für die Messung der sezernierten Insulinmenge verwendet.
Es ergab sich, dass die Stimulation durch L-α-Lysophosphatidylcholinoleoyl zu einem Anstieg der sezernierten Insulinmenge in Gegenwart von 16,8 mmol/l Glukose führte.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 16, die funktionell äquivalente Variation und das homologe Polypeptid sind Pankreas-spezifische Polypeptide und zeigen eine Aktivität zur Unterstützung der Insulinsekretion bei hoher Glukosekonzentration. Daher kann durch Verwendung dieser Polypeptide ein geeignetes Screening-System zum Erhalt einer Substanz, die als Mittel zur Behandlung von Diabetes geeignet ist (insbesondere ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer gesagt ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch bei hoher Glukosekonzentration), und die eine Blutglukose in einem normalen Bereich kontrollieren kann, konstruiert werden.
Weiterhin kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes (insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterstützung der Insulinsekretion, noch genauer eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterstützung der Insulinsekretion, spezifisch bei hoher Glukosekonzentration), umfassend eine aktivierende Substanz, erhältlich durch das Screening-Werkzeug oder Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff, die die Blutglukose in einem normalen Bereich kontrollieren kann, hergestellt werden.
Weiterhin kann das Screening-Werkzeug der vorliegenden Erfindung, die Zelle für das Screening-Werkzeug oder die Zellmembran davon, nicht nur für ein Screening einer nützlichen Substanz als Mittel zur Behandlung von Diabetes verwendet werden, sondern auch bei einem Qualitätskontrolltest einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes.
FREIER TEXT IN DEM SEQUENZPROTOKOLL
Die Merkmale der "künstlichen Sequenz" werden unter dem Zahlenidentifikator <223> im Sequenzprotokoll beschrieben. Genauer gesagt ist jede der Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 3, 4, 13 und 14 eine künstlich synthetisierte Primersequenz.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus (1) einem Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16, (2) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16, das außerdem (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion aus Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität einer Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt, (3) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10. Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt sind und das (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt, und (4) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 90% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 und das (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und/oder (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt, als Screeningmittel für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit 90% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Polypeptid (a) eine Aktivität der Unterstützung der Insulinsekretion von Pankreas-β-Zellen durch Aktivierung bei hoher Glucosekonzentration und (b) eine Aktivität zur Erhöhung einer Menge von intrazellulärem cAMP in den Zellen durch Aktivierung ausübt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NR. 2 oder 16 besteht.
Verwendung einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend ein Polynukleotid, kodierend ein Polypeptid wie beschrieben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, und die das Polypeptid als Screeningmittel für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes exprimiert.
Screeningverfahren für ein Mittel zur Behandlung von Diabetes, umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren einer Zelle wie beschrieben gemäß Anspruch 6 oder einer Zellmembran davon mit einer Verbindung, die getestet werden soll, und Analyse, ob ein Polypeptid wie beschrieben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 aktiviert wird oder nicht.
Screeningverfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Mittel zur Behandlung von Diabetes ein Mittel zur Unterstützung der Insulinsekretion ist.