ES2280435T3 - Metodo de exploracion de remedios para la diabetes. - Google Patents

Abstract

El uso de un polipéptido seleccionado del grupo constituido por (1) un polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16, (2) un polipéptido que contiene una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16, y presenta (a) actividad de estimulación de la secreción de insulina a partir de las células del páncreas mediante la activación a elevada concentración de glucosa y/o (b) actividad de incremento de la cantidad de AMPc en las células mediante activación, (3) un polipéptido que contiene una secuencia aminoacídica en la que 1 a 10 aminoácidos han sido eliminados, sustituidos o añadidos en una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No 2 ó 16, y que presenta (a) actividad de estimulación de la secreción de insulina a partir de las células a del páncreas mediante activación, a elevada concentración de glucosa y/o (b) actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación, y (4) un polipéptido que contiene una secuencia aminoacídica que posee un 90% o más de homología con una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16 y presenta (a) actividad de estimulación de la secreción de insulina por las células del páncreas mediante activación a elevada concentración de glucosa y/o (b) actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación como método de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

Description

Método de exploración de remedios para la diabetes.

Área técnica

La presente invención se relaciona con un método para explorar agentes para el tratamiento de la diabetes.

Técnica anterior

La diabetes es una enfermedad con una hiperglicemia persistente, y se considera que muchos factores ambientales y genéticos causan diabetes. Un factor clave para la regulación de la glucosa sanguínea es la insulina, y se conoce que una deficiencia de insulina o la presencia redundante de diversos factores que inhiben las acciones de la insulina (tales como factores genéticos, falta de ejercicio, sobrepeso, estrés, o similares) provocan hiperglicemia.

Existen dos tipos fundamentales de diabetes que se clasifican en una diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) provocada por una disminución de la secreción de insulina por el páncreas debida a una enfermedad autoinmune o similar, y una diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) provocada por una disminución de la secreción de insulina por el páncreas debida a un páncreas agotado por una hipersecreción continua de insulina. Se considera que 95% o más de los pacientes japoneses con diabetes son NIDDM, y existe el problema de que el número de pacientes se incrementa en concordancia con los cambios en el estilo de vida.

Como tratamientos de la insulina, se llevan a cabo principalmente terapias dietéticas, quinesiterapias, remedios para la gordura, o similares en los casos leves, se administra un medicamento oral para la diabetes (por ejemplo, un agente que estimula la secreción de insulina, tal como las sulfonilureas) cuando los síntomas se hacen severos, y se administra una preparación de insulina en los casos graves [Ryuzo Abe and Masato Kasuga, "An Approach to EBM on the Treatment of Diabetes Mellitus", Nankodo, 1997; Richard A. Harrigan et al., Annals of Emergency Medicine, 38 (1), 68-78, 2001; and Japan Diabetes Society, "Tounyoubyou chiryou gaido 2000 (Treatment of diabetes mellitus, Guide 2000)", Bunkodo, 2000].

Las sulfonilureas estimulan las células \beta del páncreas y estimulan la secreción de insulina. Sin embargo, el momento de la secreción de insulina y la cantidad de insulina secretada se deciden mediante el momento de administración y la dosis del medicamento, independientemente del nivel de glucosa sanguínea. Por tanto, algunas veces ocurre una hipoglicemia provocada por un mantenimiento de la actividad del medicamento, como efecto colateral. Además tienen lugar síntomas en el sistema digestivo, tales como pérdida del apetito. Además, las sulfonilureas están contraindicadas para pacientes con disfunción hepática o renal o cetosis severa [Richard A. Harrigan et al., Annals of Emergency Medicine, 38 (1), 68-78, 2001].

Los preparados de insulina, ciertamente disminuyen la glucosa sanguínea. Sin embargo, deben administrarse mediante inyección, y a veces los mismos provocan hipoglicemia [McCrimmon RJ et al., Diabete. Metab., 20 (6), 503-512, 1994].

Como se describió anteriormente, los agentes utilizados de manera convencional para estimular la secreción de insulina y los preparados de insulina tienen estos problemas. Por tanto, es deseable la obtención de agentes capaces de un control avanzado de la glucosa sanguínea, o sea, agentes que no solo disminuyan la glucosa sanguínea, sino también capaces de controlar la glucosa sanguínea dentro de un rango normal.

Se conoce que el GLP-1 (péptido-1 de tipo glucagón), el PACAP (Polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria) y el GIP (Polipéptido gástrico inhibitorio) translucen una señal a la célula a través de sus propios receptores específicos asociados a proteína G, y estimulan la secreción de insulina. Estos receptores acoplados a proteína G son receptores que se encuentran asociados a una proteína Gs, activan la adenilato ciclasa e incrementan la concentración intracelular de AMPc. Además, se conoce que un receptor de GLP-1, un receptor de PACAP y un receptor de GIP estimulan la secreción de insulina mediante el incremento de la concentración intracelular de AMPc. Sin embargo, se conoce que la expresión de estos receptores acoplados a proteína G se encuentra distribuida en el páncreas, pero no específica del páncreas [Dunphy JL et al., Mol. Cell. Endocrinol., 141 (1-2), 179-186, 1998; Timothy James Kieffer et al., Endocrine Reviews, 20 (6), 876-913, 1999; David Vaudry et al., Pharmacological Reviews, 52 (2), 269-324, 2000; Jean Claude Reubi et al., Cancer Research, 60, 3105-3112, 2000; y Ted B. Usdin et al., Endocrinology, 133 (6), 2861-2870, 1993], y que la activación del receptor a GIP no es efectiva en NIDDM (Michael A. Nauck et al., J. Clin. Invest., 91, 301-307, 1993).

En conexión con esto, se reportan secuencias nucleotídicas que codifican los mismos aminoácidos de un "polipéptido que posee una secuencia aminoacídica de la ID SEQ No. 2" que puede emplearse en la presente invención, y las secuencias aminoacídicas codificadas por las secuencias nucleotídicas (folletos WO00/22131, WO00/31258, y WO00/50562). Sin embargo, las funciones del "polipéptido que posee una secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2" en un cuerpo no se describieron con claridad en estos informes. Por ejemplo, el polipéptido se describe como un receptor huérfano humano asociado a proteína G en los folletos WO00/22131 y WO00/31258. El folleto WO00/56562 lista, como un empleo tanto de agonistas como de antagonistas del "polipéptido que posee una secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2", muchas de las mismas enfermedades con respecto tanto a los agonistas como a los antagonistas, pero no revela ningún apoyo al hecho de que los agonistas o los antagonistas sean útiles para el tratamiento de estas enfermedades.

Presentación de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de exploración conveniente para obtener una sustancia útil como agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente que estimule la secreción de insulina, con mayor particularidad un agente para estimular la secreción de insulina, específicamente bajo elevadas concentraciones de glucosa) capaz de controlar la glucosa sanguínea dentro de un rango normal.

Con el objetivo de solucionar los problemas anteriores, estos inventores llevaron a cabo estudios intensivos y, como resultado, encontraron que una cantidad de insulina secretada se incrementa por activación bajo elevada concentración de glucosa mediante la sobreexpresión de un "polipéptido que posee una secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2", expresado de manera específica en el páncreas, en las células \beta del páncreas y que, por el contrario, una cantidad de insulina secretada no cambia por activación bajo baja concentración de glucosa y, por tanto, encontraron que el polipéptido y la célula que expresa el polipéptido pueden utilizarse como una herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes, que tengan una actividad que estimule la secreción de insulina de manera específica bajo una elevada concentración de glucosa y capaz de controlar la glucosa sanguínea dentro de un rango normal. Además, los inventores lograron proporcionar un novedoso método de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes mediante el uso de la herramienta de exploración. Los inventores han confirmado que las sustancias activadoras obtenidas al explorar compuestos conocidos que no se conocía que tuviesen actividad para el tratamiento de la diabetes, mediante el empleo del método de exploración, mostraron una actividad de aumento de la cantidad de insulina y una actividad de disminución de la glucosa sanguínea en el plasma de rata cuando se administra glucosa, y suprimen un incremento del nivel de glucosa sanguínea en un modelo de diabetes de rata cuando se administra glucosa y, por tanto, aclararon la utilidad del método de exploración de la presente invención.

En otras palabras, la presente invención se relaciona con:

[1]. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo formado por (1) un polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16,

(2)

un polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16 y posee (a) una actividad de estimulación de la secreción de insulina a partir de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo altas concentraciones de glucosa y/o (b) una actividad de aumento de una cantidad de AMPc intracelular en las células mediante activación.

(3)

un polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica en la que se han eliminado, sustituido y/o añadido 10 aminoácidos a la ID. SEQ. No. 2 ó 16, y que posee (a) una actividad de estimulación de la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo una elevada concentración de glucosa y/o (b) una actividad de aumento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación, y

(4)

un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica que posee 90% o más de homología con la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2 ó 16 y muestra (a) una actividad de estimulación de la secreción de insulina de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo una concentración elevada de glucosa y/o (b) una actividad de aumento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante la activación como herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

[2]. El uso, en concordancia con el inciso [1], en el que el polipéptido contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16.

[3]. El uso, en concordancia con el inciso [1], en el que el polipéptido contiene una secuencia aminoacídica que posee 90% o más de homología con la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16.

[4]. El uso, en concordancia con cualquiera de los incisos [1] a [3], donde el polipéptido muestra (a) una actividad de estimulación de la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo elevada concentración de glucosa y (b) una actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación.

[5]. El uso, en concordancia con el inciso [1], donde el polipéptido consiste en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16.

[6]. Uso de una célula que se ha transformado con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para un polipéptido como se describe en concordancia con cualquiera de los incisos 1 a 5 y que expresa el polipéptido como una herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

\newpage

[7]. Un método para la exploración en busca de un agente para el tratamiento de la diabetes que comprende los pasos de:

poner a una célula como se describió en el inciso 6 o a la membrana celular de la misma en contacto con un compuesto a ser testado; y

analizar si se activa o no un polipéptido como se describe de acuerdo a cualquiera de los incisos 1 a 5.

[8]. El método de exploración en concordancia con el inciso [7], en el que el agente para el tratamiento de la diabetes es un agente promotor de la secreción de insulina.

Los términos "agente para el tratamiento de la diabetes" y "composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes" como se utilizan en el presente documento incluyen no solo un medicamento para sanar un paciente diabético, sino también un medicamento para evitar el progreso de la diabetes o similares.

El término "herramienta para la exploración", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una herramienta utilizada para la exploración, con mayor particularidad un polipéptido o una célula que expresa un polipéptido utilizado para la exploración. El término "herramienta para la exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes", como se utiliza en el presente documento, significa una célula o polipéptido como sujeto a ponerse en contacto con un compuesto de prueba en el método de la presente invención para la exploración de un agente para el tratamiento de la diabetes. La presente invención incluye la utilización del polipéptido de los incisos [1] al [5] o de la célula del inciso [6] en la exploración en busca de un agente para el tratamiento de la diabetes.

Con respecto al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la publicación EP1092727, publicado después de la fecha de prioridad de la aplicación presente, presenta una secuencia de ADN que codifica para una secuencia aminoacídica de un polipéptido (PFI-007) que consiste en la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 2, y una deducida a partir de los aminoácidos codificados por la secuencia de ADN, pero no revela que el polipéptido PFI-007 fue obtenido. Más aún, la publicación EP1092727 presenta los tratamientos de varias enfermedades con el uso de estancias que modulan el polipéptido PFI-007 (un agonista o un antagonista). Sin embargo la publicación no presenta ningún argumento mostrando que in agonista del polipéptido PFI-007 es efectivo en el tratamiento de la diabetes pero sí muestra que un antagonista es también efectivo en este caso y, de ese modo, aparentemente los presentes inventores encontraron primero que el agonista es efectivo en el tratamiento de la diabetes. Más aún, la publicación EP1092727 no presentaque una activación del polipéptido PFI-007 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 promueve la secreción de insulina, ni que el polipéptido tiene una actividad promotora de la secreción de insulina por las células \beta del páncreas por activación de las células \beta del pancreáticas bajo una alta concentración de glucosa (más adelante a veces referida como "actividad promotora de la secreción de insulina dependiente de alta glucosa").

Como se menciona anteriormente, el uso del antes mencionado polipéptido y las células mencionadas antes como herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes (particularmente un agente para promover la secreción de insulina) y un método de búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes (particularmente un agente para promover la secreción de insulina) descritas en la presente aplicación son invenciones hechas por primera vez por los presentes inventores.

Breve descripción de las imágenes

La Fig. 1 es un gráfico que muestra el curso temporal de la concentración de insulina plasmática después de la administración oral de glucosa en ratas SD a las que se les administró intraperitonealmente 2-(piridina-4-il) etil tiobenzoato (LT-1 Z 0059519).

La Fig. 2 es un gráfico que muestra el curso temporal de los niveles de glucosa sanguínea después de la administración oral de glucosa en ratas SD a las que se les administró intraperitonealmente 2-(piridina-4-il) etil tiobenzoato (LT-1 Z 0059519).

La Fig. 3 es un gráfico que muestra el curso temporal del nivel de glucosa sanguínea luego de la administración oral de glucosa a ratas GK a las cuales se administró intraperitonealmente 2-(piridina-4-il) etil tiobenzoato (LT-1 Z 0059519).

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se explicará en detalles a partir de este punto.

(1) La herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes

La herramienta de exploración de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes incluye la herramienta de exploración de tipo polipéptido para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes y la herramienta de exploración de tipo transformante para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

1) La herramienta de exploración de tipo polipéptido para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes

Como polipéptidos que puedes utilizarse como herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención para la búsqueda de agente para el tratamiento de la diabetes se encuentran:

(1) un polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ No.2 o 16;

(2) un polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica en la que se han eliminado, sustituido y/o añadido 10 aminoácidos a la ID. SEQ. No. 2 ó 16, y que posee (a) una actividad de estimulación de la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo una elevada concentración de glucosa y/o (b) una actividad de aumento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación, y

(3) un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica que posee 90% o más de homología con la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2 ó 16 y muestra (a) una actividad de estimulación de la secreción de insulina de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo una concentración elevada de glucosa y/o (b) una actividad de aumento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante la activación como herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

A partir de este punto en el presente documento se da a estos polipéptidos que pueden emplearse como la herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes se les denomina colectivamente "polipéptidos para una herramienta de exploración".

Uno de los polipéptidos para una herramienta de exploración, el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, es un receptor humano asociado a proteína G que contiene 335 residuos de aminoácidos. Además, uno de los polipéptidos para una herramienta de exploración, el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16 es un receptor de rata asociado a proteína G que contiene 335 residuos de aminoácidos. La homología entre el polipéptido humano que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 y el polipéptido de rata que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16 es 80,6% en la comparación de secuencia aminoacídica.

El término "homología" como se utiliza en este documento significa un valor obtenido mediante una búsqueda de BLAST [Basic local alignment search tool; Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)]. La homología de la secuencia aminoacídica puede calcularse mediante el algoritmo de búsqueda del BLAST. Más particularmente, puede calcularse empleando un programa bl2seq (Tatiana A. Tatusova and Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) en el paquete del BLAST (edición sgi 32 bit, versión 2.0.12; obtenida a partir del NCBI) de acuerdo con los parámetros por defecto. Como parámetro del alineamiento de pares se emplea el programa "blastp". Además, se utilizan "0" para el costo de inserción de Gaps, "0" para el costo de extensión de Gaps, "SEG" como filtro para la secuencia de búsqueda, y la matriz "BLOSUM62", respectivamente.

Los polipéptidos que contienen las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16 presentan (a) la actividad de estimulación de la secreción de insulina dependiente de elevada concentración de glucosa y (b) una actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante la activación en las células (a la que se hace referencia a veces en este trabajo a partir de aquí como "actividad de incremento del AMPc intracelular"). En esta conexión, los polipéptidos que contienen las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16 no estimulan la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas a bajas concentraciones de glucosa, cuando se activan mediante la sobreexpresión de los polipéptidos en las células \beta del páncreas.

El término "a elevada concentración de glucosa" como se utiliza en el presente documento significa una condición en la que la concentración de glucosa en, por ejemplo, la sangre o un medio ambiente alrededor de las células es mayor que un rango normal de concentración de glucosa, en particular 16,8 mmol/L.

El término "a baja concentración de glucosa" como se utiliza en el presente documento significa una condición en la que la concentración de glucosa es inferior al rango de concentración normal de la glucosa, en particular 3,3 mmol/L o menos.

Un método para confirmar si un polipéptido a ser testado presenta o no la "actividad de estimulación de la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación en las células \beta del páncreas" como se utiliza en el presente documento no está particularmente limitado, pero puede confirmarse, por ejemplo, mediante el método descrito más adelante (de preferencia, un método descrito en el Ejemplo 5). En esencia, las células \beta del páncreas se transforman con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el polipéptido de prueba o un vector de expresión control sin el polipéptido. Luego de un número predeterminado de días (tal como 2 ó 3 días) a partir de la transformación, el medio se remplaza con un tampón que contiene una concentración predeterminada de glucosa. Luego de un número predeterminado de horas (tal como varias horas) de incubación, se mide la cantidad de insulina secretada al tampón (o sea, al sobrenadante del cultivo). Cuando la cantidad de insulina secretada en el sobrenadante del cultivo de las células (células de prueba) transformadas con el vector de expresión que contiene el polinucleótido que codifica para el polipéptido se incrementa con respecto a la de las células (células control) transformadas con el vector de expresión control, puede decidirse que el polipéptido de prueba muestra la "actividad de estimular la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación en las células \beta del páncreas". Se decide mediante la prueba t de Student si la cantidad de insulina secretada se incrementa o no de manera significativa en las células de prueba con respecto a las células control. Cuando la cantidad de insulina secretada por las células de prueba se incrementa y la diferencia de valor significativa con respecto a las células control es p<0,05 (de preferencia p<0,01), se decide que la cantidad de insulina secretada se ha incrementado de manera significativa.

Un método para confirmar si un polipéptido a ser testado posee o no la "actividad de incrementar la cantidad intracelular de AMPc mediante la activación en células" como se utiliza aquí no se encuentra particularmente limitado a, pero puede confirmarse mediante, por ejemplo, el método siguiente (de preferencia, un método descrito en el Ejemplo 4). Más particularmente, las células se transforman, respectivamente, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el polipéptido o un vector de expresión control sin el polinucleótido. Luego de un número predeterminado de horas (tal como 20 horas) después de la transformación, el medio se remplaza por un medio que contiene un inhibidor de la fosfodiesterasa [tal como IBMX (3-isobutil-1-metilxantina)]. Luego de un número predeterminado de minutos (tal como 40 minutos) de incubación, se mide la cantidad de AMPc en las células. Cuando la cantidad de AMPc en las células transformadas con el vector de expresión que contiene en polinucleótido que codifica para le polipéptido se ha incrementado en comparación con la de las células trasformadas con el vector de expresión control, puede decidirse que el polipéptido de control presenta la "actividad de incrementar la cantidad intracelular de AMPc mediante la activación en las células".

El estado en el cual el polipéptido para herramienta de exploración, un receptor asociado a proteína G se "activa" como se utiliza en el presente documento significa un estado en el que se transduce una señal a partir del receptor acoplado a proteína G sin importar si se encuentra unido o no un ligando. El polipéptido se activa cuando la cantidad total de la forma activa del receptor acoplado a proteína G excede una cierta cantidad.

Los receptores acoplados a proteína G se encuentran en un estado de equilibrio entre una forma activa y una forma inactiva. El equilibrio se desplaza hacia la forma activa cuando un ligando se une al receptor acoplado a la proteína G. Se conoce que el receptor acoplado a proteína G también se activa y transluce la señal a partir de sí mismo en ausencia de un ligando, cuando el receptor acoplado a proteína G se encuentra sobreexpresado, porque la cantidad total del receptor acoplado a proteína G activado se incrementa (Milano, C. A. et al., Science, 264, 582-586, 1994). Por tanto, incluso si el ligando no se ha identificado, resulta posible detectar la señal procedente del receptor acoplado a proteína G mediante la sobreexpresión en las células del receptor acoplado a proteína G. En cada experimento descrito en los Ejemplos 4 y 5, el polipéptido para la herramienta de exploración se activa en ausencia del ligando que se une al mismo, como consecuencia de la sobreexpresión del polipéptido. El estado que se obtiene en el mismo que mediante la unión de un agonista.

La variación funcionalmente equivalente que puede utilizarse como la herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes no se encuentra particularmente limitada, dado que se trata de un polipéptido que contiene una secuencia aminoacídica en la que de 1 a 10, con mayor preferencia, de 1 a 7, con la mayor preferencia de 1 a 5, tal como 1 o varios aminoácidos se encuentran eliminados, sustituidos y/o añadidos en una o varias posiciones de la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ No. 2 ó 16, y presenta (a) la actividad de estimulación de la secreción de insulina dependiente de concentración elevada de glucosa y/o (b) la actividad de incrementar el AMPc intracelular [de preferencia, que presente tanto (a) la actividad de estimulación de la secreción de insulina dependiente de concentración elevada de glucosa y (b) la actividad de incrementar el AMPc intracelular, con mayor preferencia, además de estas actividades, (c) no estimula la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas a bajas concentraciones de glucosa, cuando se activa por sobreexpresión del polipéptido en las células \beta del páncreas]. Además, el origen de la variación funcionalmente equivalente no se limita a humanos o ratas.

La variación funcionalmente equivalente incluye, no solo variantes humanas del polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, variaciones murinas del polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16, sino también variantes funcionalmente equivalentes derivadas a partir de organismos diferentes a los humanos o las ratas (tales como ratones, hámsteres, perros) y además, polipéptidos obtenidos mediante modificaciones artificiales de estos polipéptidos nativos (o sea, variantes humanas o murinas o variantes funcionalmente equivalentes obtenidas a partir de organismos que no son humanos o ratas) o el polipéptido que posee la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16 mediante técnicas de ingeniería genética. El término "variante" como se usa en este documento significa una diferencia individual entre el mismo polipéptido en la misma especie o una diferencia entre polipéptidos homólogos en varias especies.

Las variantes humanas del polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, las variantes murinas del polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16, o variantes funcionalmente equivalentes obtenidas a partir de organismos que no sean humanos o ratas pueden obtenerlas personas versadas en la técnica, en base a la información de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de ID. SEQ. No. 1) de un polinucleótido que codifica para el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, o la de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo la secuencia de nucleótidos de ID. SEQ. No. 15) de un polinucleótido que codifica para el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16. En esta conexión, las técnicas de ingeniería genética pueden llevarse a cabo de manera general de acuerdo con métodos conocidos (por ejemplo, Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982).

Por ejemplo, se diseña una sonda apropiada o cebadores apropiados de acuerdo con la información de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16. Se lleva a cabo un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) o un método de hibridización utilizando una muestra (por ejemplo, ARN total o una fracción de ARNm, una librería de ADNc, o una librería de fagos) obtenida a partir de un organismo (por ejemplo, un mamífero, como un humano, ratón, rata, hámster, o perro) de interés y los cebadores o la sonda para obtener un polinucleótido que codifique para el polipéptido. Se puede obtener el polipéptido deseado mediante la expresión del polinucleótido resultante en un sistema de expresión adecuado y la confirmación de que el polipéptido expresado presenta, por ejemplo, la actividad de estimulación de la secreción de insulina mediante el método descrito en el Ejemplo 5 o la actividad de incremento del AMPc intracelular mediante el método descrito en el Ejemplo 4.

Además, el polipéptido modificado de manera artificial mediante técnicas de ingeniería genética puede obtenerse mediante, por ejemplo, el procedimiento siguiente. Se obtiene un gen que codifica para el polipéptido se obtiene mediante un método convencional tal como mutagénesis sitios específica (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984). El polipéptido deseado puede obtenerse mediante la expresión del polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado y la confirmación de que el polipéptido expresado presenta, por ejemplo, la actividad de estimulación de la secreción de insulina dependiente de elevada concentración de glucosa mediante el método descrito en el Ejemplo 5 o al actividad de incremento del AMPc intracelular mediante el método descrito en el Ejemplo 4.

Además, la variación funcionalmente equivalente incluye un polipéptido que contiene una secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16 y que presenta (a) la actividad de estimular la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación bajo una elevada concentración de glucosa y/o (b) la actividad de incrementar la cantidad de AMPc intracelular en las células mediante activación. Incluye, por ejemplo, un polipéptido (llamado polipéptido de fusión) en el cual se añade una secuencia marcadora adecuada o un similar al N-terminal y/o al C-terminal del polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16, siempre que el polipéptido de fusión muestre (a) la actividad de estimulación de la secreción de insulina dependiente de elevada concentración de glucosa y/o (b) la actividad de incremento del AMPc intracelular.

Como secuencia marcadora puede emplearse una secuencia que permita de manera sencilla la confirmación de la expresión del polipéptido, una confirmación de la localización intracelular del mismo, la purificación del mismo, o similares. Como secuencia puede mencionarse, por ejemplo, un epítope FLAG, una marca de hexa-histidina, una marca de hemaglutinina, o un epítope myc, etc.

El polipéptido homólogo, que puede emplearse como la herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes no se limita de manera particular, siempre que se trate de una polipéptido que posea una secuencia aminoacídica que tenga 90% o más de homología con la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16, y que presente (a) la actividad de estimulación de la secreción de insulina dependiente de elevada concentración de glucosa y/o (b) la actividad de incremento del AMPc intracelular. El polipéptido homólogo puede poseer una secuencia aminoacídica que tenga de preferencia un 95% o más de homología, con mayor preferencia un 98% o más de homología, con la mayor preferencia, un 99% o más de homología, con respecto a la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16.

El polipéptido para la herramienta de exploración que puede emplearse como herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes puede obtenerse mediante varios métodos conocidos, tales como técnicas conocidas de ingeniería genética empleando un polinucleótido que codifique para una proteína de interés. Con mayor particularidad, el polipéptido para herramienta de exploración puede prepararse cultivando un transformante para la herramienta de exploración descrita más adelante (o sea, un transformante que está transformado con un vector de expresión que contenga ADN que codifique para el polipéptido para la herramienta de exploración y que exprese el polipéptido) bajo una condición en la que puede llevarse a cabo una expresión del polipéptido para la herramienta de exploración, así como la separación y la purificación de la proteína de interés a partir del cultivo resultante mediante métodos comúnmente empleados para la separación y la purificación de las proteínas receptoras.

Como polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración pueden mencionarse, por ejemplo, polinucleótidos que codifican para el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, polinucleótidos que codifican para el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16, polinucleótidos que codifican para variantes funcionalmente equivalentes o polinucleótidos que codifican para polipéptidos homólogos. El término "polinucleótido" como se usa en este documento incluye tanto al ADN como al ARN.

No se encuentra particularmente limitado el método para la producción del polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración, pero pueden mencionarse, por ejemplo, (1) un método que emplea PCR, (2) un método que emplea técnicas convencionales de ingeniería genética (o sea, un método para la selección de un transformante que contiene un ADNc deseado a partir de cepas transformadas con una librería de ADNc), o (3) un método de síntesis química. Estos métodos se explicarán en este orden a continuación.

\newpage

En el método que emplea PCR, el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración puede producirse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se extrae el UNAM a partir de células o tejidos humanos capaces de producir el polipéptido para herramienta de exploración. Se sintetiza un juego de cebadores entre los cuales se localiza la longitud total del ARNm que corresponde al polipéptido para herramienta de exploración o una región parcial del ARNm, sobre la base de la secuencia nucleotídica de una polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración. Puede obtenerse el ADNc de tamaño completo que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración o una parte de dicho ADNc mediante una reacción en cadena de la polimerasa-reverso transcriptasa (RT-PCR).

Con mayor particularidad, el ARN total que contiene el ARNm que codifica para le polipéptido para la herramienta de exploración se extrae mediante un método conocido a partir de células o tejidos (como el páncreas) capaces de producir el polipéptido para la herramienta de exploración. Como método de extracción pueden mencionarse, por ejemplo, un método de guanidinio tiocianato-fenol caliente, un método de guanidinio tiocianato-clorhidrato de guanidinio, o un método de guanidinio tiocianato-cloruro de cesio. Se prefiere usar el método de guanidinio tiocianato-cloruro de cesio. Las células o tejido capaces de producir el polipéptido para la herramienta de exploración pueden identificarse, por ejemplo, mediante un método de northern blotting que emplee un polinucleótido o parte del mismo que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración o un método de western blotting empleando un anticuerpo específico para el polipéptido para la herramienta de exploración.

A continuación se purifica en ARNm extraído. La purificación del ARNm puede llevarse a cabo de acuerdo con un método convencional, por ejemplo, el ARNm puede purificarse mediante adsorción y elusión empleando una columna de oligo(dT)-celulosa. El ARNm puede fraccionarse aún más mediante, por ejemplo, una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, si resulta necesario. De modo alternativo, puede emplearse ARNm purificado y extraído que se encuentra disponible comercialmente, sin tener que llevar a cabo la extracción del ARNm.

A continuación se sintetiza la primera hebra del ADNc mediante una reacción de reversotranscripción del ARNm purificado en presencia de un cebador aleatorio, un cebador oligo dT, y/o un cebador diseñado. Esta síntesis puede llevarse a cabo mediante un método convencional. La primera hebra de ADNc resultante se somete a PCR utilizando dos cebadores entre los cuales queda comprendida la longitud total o una región parcial del polinucleótido de interés, amplificando de ese modo el ADNc de interés. El ADN resultante se fracciona mediante, por ejemplo, una electroforesis en gel de azarosa. Puede obtenerse un fragmento de ADN de interés mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción y subsiguiente ligación, de ser necesario. De manera alternativa, puede obtenerse un fragmento de ADN de interés a partir de ADN genómico.

En el método que emplea técnicas convencionales de ingeniería genética, puede producirse el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración, por ejemplo, mediante el procedimiento
siguiente.

Primero, se sintetiza el ADNc mediante una reversotranscriptasa y, como molde se emplea el ARNm preparado mediante el método de PCR mencionado anteriormente y luego se sintetiza el ADNc de doble cadena a partir del ADNc de simple cadena. Como ejemplo de este método puede mencionarse, por ejemplo el método de la nucleasa S1 (Efstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), el método de Land (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981), el método de O. Joon Yoo (Yoo, O. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983), y el método de Okayama-Berg (Okayama, H. y Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982).

A continuación se prepara un plásmido que contiene el ADNc de doble cadena y se introduce a una cepa de Escherichia coli, tal como DH 5\alpha, transformando así la cepa. Se selecciona un transformante mediante la resistencia a una droga, como por ejemplo la tetraciclina o la ampicillina, como marcador. Cuando la célula hospedera es E. coli, se puede llevar a cabo al transformación de la célula hospedera, por ejemplo, mediante el método de Hanahan (Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166, 557-580, 1983), es decir, un método en el que se añade el ADN recombinante a células competentes preparadas en presencia de CaCl_{2}, MgCl_{2} o RbCl. Además, puede emplearse un vector que no sea plasmídico, como un fago, tal como un sistema lambda.

Como método para seleccionar un transformante que contenga el ADN de interés a partir de los transformantes resultantes se pueden emplear varios métodos, como (1) un método de exploración que emplee una sonda oligonucleotídica sintética, (2) un método de exploración que emplee una sonda producida mediante PCR, (3) un método en el que la exploración se lleva a cabo mediante la producción del polipéptido de interés en otras células animales, (4) un método de exploración empleando un antibiótico contra el polipéptido para la herramienta de exploración, o (5) un método que emplee un sistema de traducción de hibridización selectiva.

En el método de exploración que emplea una sonda oligonucleotídica sintética, se puede seleccionar el transformante que contiene el ADNc de interés, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente.

Se sintetiza un oligonucleótido que corresponde a la totalidad o parte del polipéptido para la herramienta de exploración (en este caso puede tratarse tanto de una secuencia nucleotídica que tome en cuenta el empleo de codones o una pluralidad de secuencias nucleotídicas como una combinación de posibles secuencias nucleotídicas, y en el segundo caso, sus números pueden reducirse mediante la inclusión de inosina) y, empleando este oligonucleótido como sonda (marcada con ^{32}P o ^{33}P), se hibridiza con un filtro de nitrocelulosa en el cual los ADNs de los transformantes se encuentran desnaturalizados y fijados, para explorar y seleccionar cepas positivas resultantes.

En el método de exploración que emplea una sonda producida mediante PCR, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente.

Se sintetizan los oligonucleótidos de cebadores sentido y antisentido que correspondan a una parte del polipéptido para la herramienta de exploración, y se amplifica un fragmento de ADN que codifica la totalidad o una parte del polipéptido de interés mediante un PCR utilizando estos cebadores en combinación. Se puede utilizar como ADN molde de esta reacción, el ADNc sintetizado mediante la reacción de reversotranscripción a partir del ARNm o el ADN genómico de células capaces de producir el polipéptido para la herramienta de exploración. El fragmento de ADN resultante se marca con ^{32}P o ^{33}P y se selecciona el transformante que contiene el ADNc de interés mediante una hibridización de colonia o una hibridización de placa empleando este fragmento como sonda.

En el método en el que se lleva a cabo la exploración mediante la producción del polipéptido de interés en otras células animales, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente.

Los polinucleótidos se amplifican mediante el cultivo de los transformantes, y se transfectan las células animales con los polinucleótidos (en este caso se puede emplear tanto un plásmido que puede autorreplicarse y contiene una región promotora de la transcripción, o un plásmido que puede integrarse a cromosomas de células animales), produciendo de ese modo los polipéptidos codificados por los polinucleótidos en la superficie celular. Los transformantes que contengan el ADNc de interés se seleccionan a partir de los transformantes originales mediante la detección del polipéptido para la herramienta de exploración empleando un anticuerpo contra el polipéptido para la herramienta de exploración.

En el método en el que la selección se lleva a cabo empleando un anticuerpo contra el polipéptido para la herramienta de exploración, el transformante que contiene el ADN de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente.

En primer lugar, el ADNc se integra en un vector de expresión y se producen polipéptidos en la superficie celular de los transformantes. Los transformantes que contienen el ADNc de interés se seleccionan mediante la detección de una cepa que produzca el polipéptido deseado mediante un anticuerpo contra el polipéptido para la herramienta de exploración y un segundo anticuerpo dirigido contra el primero.

En el método que emplea un sistema de traducción de hibridización colectiva, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente.

Primero, el ADNc obtenido a partir de cada transformante se puntea, por ejemplo sobre un filtro de nitrocelulosa y se hibridiza con el ARNm preparado a partir de células capaces de producir el polipéptido para la herramienta de exploración, y luego el ARNm unido al ADNv se disocia y se recupera. El ARNm recuperado se traduce en un polipéptido en un sistema adecuado de traducción de polipéptidos, por ejemplo, inyección en oocitos de Xenopus o un sistema libre de células, como un lisado de reticulocitos de conejo o germen de trigo. Los transformantes que contienen el ADNc de interés se seleccionan mediante su detección con el empleo de un anticuerpo contra el polipéptido para la herramienta de exploración.

Un método para la recogida del polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración a partir de los transformantes de interés puede llevarse a cabo de acuerdo con un método conocido (por ejemplo, Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982). Por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante la separación de una fracción correspondiente al ADN plasmídico de células y, el corte de la región de ADNc del ADN del plásmido.

En el método de síntesis química, el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración puede producirse, por ejemplo, mediante la unión de fragmentos de ADN producidos por un método de síntesis química. Cada ADN puede sintetizarse empleando un sintetizador de ADN [por ejemplo, Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman) o 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems)].

Además, el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración puede producirse mediante síntesis química de ácido nucleico de acuerdo con un método convencional tal como el método de triéster fosfito (Hunkapiller, M. et. al., Nature, 10, 105-111, 1984), que se basa en la información acerca del polipéptido para la herramienta de exploración. En esta conexión, se conocen codones para cada aminoácido y puede seleccionarse de manera opcional y determinarse mediante métodos convencionales, por ejemplo, seleccionando un empleo de codones de cada hospedero a utilizarse (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Además, puede llevarse a cabo una modificación parcial de los codones de estas secuencias nucleotídicas de acuerdo con un método convencional, tal como mutagénesis sitio específica que emplea un cebador que contiene un oligonucleótido sintético que codifica para la modificación deseada (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).

\newpage

La determinación de las secuencias de ADN obtenidas a partir de los métodos antes mencionados puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un método de modificación química de Maxam-Gilbert (Maxam, A. M. and Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) o un método de terminación de la cadena por dideoxinucleótidos (Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).

Una célula hospedera (de preferencia una célula eucariota, con mayor preferencia una célula 293-EBNA) puede transformarse mediante la reintegración de un polinucleótido aislado que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración dentro del ADN de un vector apropiado y empleando el vector de expresión resultante.

El polipéptido para la herramienta de exploración producido en la superficie celular de los transformantes mediante el cultivo de los transformantes puede separarse y purificarse a partir del mismo mediante varias técnicas de separación conocidas que utilizan las propiedades físicas, químicas o similares del polipéptido. Más particularmente, puede obtenerse una fracción de la membrana celular que contenga el polipéptido para la herramienta de exploración, por ejemplo, cultivando las células que expresan el polipéptido para la herramienta de exploración en la superficie de las mismas, suspendiendo las células cultivadas en un tampón, homogeneizando la suspensión, y centrifugando el homogenado. Luego de que se solubilice la fracción de membrana celular resultante, se puede purificar el polipéptido para la herramienta de exploración mediante el tratamiento de la mezcla con un tratamiento corrientemente empleado, por ejemplo, un tratamiento con un precipitante de proteína, ultrafiltración, varias técnicas de cromatografía líquida, tales como la cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), o diálisis, o una combinación de los mismos. En este respecto, cuando la fracción de membrana celular se solubiliza empleando un agente solubilizante tan suave como sea posible (tal como CHAPS, Triton X-100, digitonina o similares), se pueden mantener las características del receptor después de la solubilización.

Cuando el polipéptido para la herramienta de exploración se expresa como proteína de fusión con una secuencia marcadora en marco, se puede llevar a cabo con facilidad una confirmación de la localización intracelular del mismo, una purificación del mismo, o similares. Como secuencias marcadoras pueden citarse, por ejemplo, un epítope FLAG, una marca de hexahistidina, una marca de hemaglutinina o un epítope myc. Además, mediante la inserción de una secuencia aminoacídica específica, que sea reconocida por una proteasa como la enteroquinasa, el factor Xa, o la trombina, entre la secuencia marcadora y el polipéptido para la herramienta de exploración, se puede eliminar la secuencia marcadora mediante la proteasa. Por ejemplo, existe un informe en el que un receptor de acetilcolina muscarínico y una marca de hexa histidina estaban conectados a través de una secuencia de reconocimiento de trombina (Hayashi, M. K. and Haga, T., J. Biochem., 120, 1232-1238, 1996).

2) La herramienta de exploración de tipo transformante para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes

Como transformante que puede emplearse como la herramienta de exploración de tipo transformante de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes (que a partir de aquí se nombra "transformante para la herramienta de exploración"), pueden mencionarse, por ejemplo;

(i) un transformante que se encuentra transformado con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16 y expresa el polipéptido;

(ii) un transformante que se encuentra transformado con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para una variante funcionalmente equivalente y expresa el polipéptido; o

(iii) un transformante que se encuentra transformado con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína homóloga y expresa el polipéptido.

El transformante para la herramienta de exploración puede obtenerse, por ejemplo, mediante la reintegración de un polinucleótido (aislado mediante los métodos mencionados con anterioridad) que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración en el ADN de un vector apropiado y la transformación de una célula hospedera (de preferencia una célula eucariota, con mayor preferencia una célula 293-EBNA) con el vector de expresión resultante. Además es posible expresar el polinucleótido en una célula hospedera deseada, mediante la introducción de un promotor apropiado y una secuencia relacionada con la expresión del gen en el vector.

Los inventores posibilitaron que el polipéptido para la herramienta de exploración se sobreexpresará en la membrana celular, mediante el uso de un vector de expresión capaz de añadir una secuencia señal en el N-terminal del polipéptido para la herramienta de exploración. El vector de expresión no se encuentra particularmente limitado, mientras contenga un polinucleótido que codifique para el polipéptido para la herramienta de exploración. Como vector de expresión pueden mencionarse, por ejemplo, un vector de expresión obtenido mediante la introducción del polipéptido para la herramienta de exploración en un vector de expresión conocido seleccionado de manera adecuada de acuerdo con la célula hospedera a emplearse.

Además, los inventores posibilitaron que el polipéptido para la herramienta de exploración se sobreexprese en la membrana celular por medio de una célula 293-EBNA. El transformante para la herramienta de exploración que puede emplearse como herramienta de exploración de tipo transformante de la presente invención para la búsqueda de agentes para el tratamiento de la diabetes no se encuentra particularmente limitado, mientras se encuentre transformado con el vector de expresión que contiene el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración y exprese el polipéptido cuando se emplea como herramienta de exploración de tipo transformante para la búsqueda de agentes para el tratamiento de la diabetes. El transformante para la herramienta de exploración puede ser, por ejemplo, una célula en la que el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración se encuentra integrada a un cromosoma de la célula hospedera, o una célula que contenga el polinucleótido como un vector de expresión que contiene el polinucleótido. El transformante para la herramienta de exploración puede obtenerse, por ejemplo, transformando la célula hospedera deseada con un vector de expresión que contiene el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración.

En las células eucariotas hospederas se incluyen, por ejemplo, células de vertebrados, insectos y levaduras. Como células de vertebrados puede mencionarse, por ejemplo, una célula COS como células de simios (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), una cepa que carece de dihidrofilato reductasa de células de ovario de hámster chino (CHO) (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), células HEK293 obtenidas a partir de riñón de embriones humanos, o células 293-EBNA (Invitrogen) obtenidas mediante la introducción de un gen EBNA-1 de virus Epstein-Barr.

Como vector de expresión para las células de vertebrados puede emplearse, por lo general, un vector que contenga un promotor localizado upstream del polinucleótido a ser expresado, un sitio de splicing de ARN, un sitio de poliadenilación, una secuencia terminadora de la transcripción, y similares. El vector puede contener además un origen de replicación, de ser necesario. Como vector de expresión debe mencionarse, por ejemplo, pSV2dhfr, conteniendo un promotor temprano SV40 (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS, conteniendo un promotor para un factor de elongación humano (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18,5322, 1990), o pCEP4, conteniendo un promotor de citomegalovirus (Invitrogen). Además, puede utilizarse un vector de expresión capaz de fusionar una secuencia señal tal como una secuencia señal de hemaglutinina de influenza en marco correcto, upstream del polipéptido que se expresará (J. Biol. Chem., 267, 21995-21998, 1992). Como vector de ese tipo puede utilizarse, por ejemplo, un plásmido (un plásmido con una secuencia señal pEF-BOS), obtenido mediante la introducción de una secuencia que codifica para una secuencia señal y un epítope FLAG en el pEF-BOS.

Cuando se emplea la célula 293-EBNA como célula hospedera, puede emplearse como vector de expresión, por ejemplo, pCEP4 (Invitrogen), conteniendo un origen de replicación de virus Epstein-Barr, y capaz de llevar a cabo una replicación autónoma en la célula 293-EBNA.

Cuando se emplea la célula COS como célula hospedera puede utilizarse como vector de expresión un vector que posea un origen de replicación SV40, que puede llevar a cabo una replicación autónoma en la célula COS, y posee un promotor de la transcripción, una señal terminadora de la transcripción, y un sitio de splicing de ARNm. Como vector pueden mencionarse, por ejemplo, pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), o pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987).

El vector de expresión puede incorporarse a células COS mediante, por ejemplo, un método de DEAE-dextrana (Luthman, H. y Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), un método de co-precipitación de fosfato de calcio-ADN (Graham, F. L. y van der Ed, A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), un método que utiliza un reactivo de transfección comercialmente disponible (por ejemplo, FuGENE™6 Transfection Reagent; Roche Diagnostics), o un método de electroporación (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982).

Cuando se emplea la célula CHO como célula hospedera, puede obtenerse un transformante capaz de producir de manera estable el polipéptido para la herramienta de exploración, llevando a cabo la co-transfección de un vector de expresión que contiene el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración, junto con un vector capaz de expresar un gen neoplásico que funciona como marcador de resistencia a G418, tal como pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) o pSV2-neo (Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341,1982), y seleccionando una colonia resistente a G418.

El transformante para la herramienta de exploración puede cultivarse de acuerdo con el método convencional, y el polipéptido para la herramienta de exploración se produce en la superficie celular. Como medio para utilizar en el cultivo, puede seleccionarse de manera apropiada un medio usado comúnmente en la célula hospedera deseada. En el caso de las células COS, por ejemplo, puede emplearse un medio tal como un medio RPMI-1640 o un medio esencial mínimo de Eagle, modificado por Dulbecco (DMEM), suplementándolo con un componente del suero, como suero bovino fetal (FBS), de ser necesario. En el caso de la célula 293-EBNA, puede emplearse un medio tal como el medio esencial mínimo de Eagle, modificado por Dulbecco (DMEM), con un componente de suero, como suero fetal bovino (FBS) y G418.

(2) El método para la exploración de un agente para el tratamiento de la diabetes

Es posible explorar una sustancia capaz de controlar las actividades del polipéptido para la herramienta de exploración (en particular una sustancia que active al polipéptido para la herramienta de exploración, o sea, un agonista), empleando el polipéptido para la herramienta de exploración o el transformante para la herramienta de exploración. Como se describió anteriormente, el polipéptido para la herramienta de exploración posee una actividad de estimular la secreción de insulina por parte de las células \beta del páncreas mediante la activación de las células \beta del páncreas a elevadas concentraciones de glucosa. Por tanto, una sustancia que active al polipéptido para la herramienta de exploración resulta útil como ingrediente activo de un agente que estimule la secreción de insulina, capaz de estimular la secreción de insulina a partir de las células \beta del páncreas a elevadas concentraciones de glucosa, o como un agente para el tratamiento de la diabetes. Además, el polipéptido para la herramienta de exploración per se o el transformante para la herramienta de exploración per se pueden emplearse como herramientas para explorar un agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente que estimule la secreción de insulina, con más particularidad, un agente que estimule la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa).

El término "estimular la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa" como se emplea en este documento significa una condición en la que la cantidad de insulina secretada se incrementa de manera significativa con respecto a un grupo control bajo elevadas concentraciones de glucosa, y en la que la cantidad de la secreción de insulina aumentada a la concentración de glucosa elevada en un grupo tratado con un compuesto de prueba con respecto al grupo control es 1,5 veces o más (de preferencia 3 veces o más) la del incremento de la secreción de insulina a bajas concentraciones de glucosa, con mayor preferencia, una condición en la que un incremento en la secreción de insulina no se incrementa de manera significativa en el grupo tratado con el compuesto de prueba, con respecto al grupo control a bajas concentraciones de glucosa. Puede decidirse si un aumento de la secreción de insulina es significativo en el grupo tratado con el compuesto de prueba con respecto al grupo control, por ejemplo, llevando a cabo un experimento bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 8 ó 12 y utilizando la prueba de la t de Student. Cuando la cantidad de insulina secretada se ha incrementado en el grupo tratado con el compuesto de prueba y la diferencia significativa del mismo con respecto al grupo control es p<0,05 (de preferencia p<0,01), se decide que la cantidad de insulina secretada se ha incrementado de manera significativa.

Los compuestos a probar que pueden ser explorados empleando la herramienta de exploración de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes no se encuentran particularmente limitados, pero pueden mencionarse, por ejemplo, varios compuestos conocidos (incluyendo péptidos) registrados en archivos químicos, compuestos obtenidos mediante técnicas de química combinatoria (Terrett, N. K. et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995), o péptidos aleatorios preparados mediante el empleo de fagos (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991), o similares. Además, pueden utilizarse los sobrenadantes de cultivos de microorganismos, componentes naturales obtenidos a partir de plantas u organismos marinos, o extractos de tejido animal como compuestos de prueba para la exploración. Además, pueden emplearse compuestos (incluyendo péptido) obtenidos mediante la modificación química o biológica de compuestos (incluyendo péptidos) seleccionados mediante la herramienta de exploración de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

El método de exploración de la presente invención para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes (de preferencia, un agente que estimule la secreción de insulina, con mayor preferencia, un agente que promueva la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa) no se encuentra limitado de manera particular, mientras contenga los pasos de poner en contacto el transformante para la herramienta de exploración en el que el polipéptido para la herramienta de exploración se expresa y funciona como receptor, o la membrana celular del mismo con un compuesto a ser probado y analizado para determinar si el polipéptido resulta o no activado. Puede mencionarse sobre las bases de las diferencias entre los métodos empleados para el análisis de la activación del polipéptido, por ejemplo,

1)

un método de exploración en el que los cambios de la concentración intracelular de AMPc se emplean como indicador (nombrado a partir de este momento, "método de exploración de tipo AMPc"),

2)

un método de exploración que emplea un método de unión a GTP\gammaS (nombrado a partir de este momento "método de exploración de tipo unión a GTP\gammaS"), o

3)

un método de exploración que emplea un ensayo de unión a ligando (nombrado a partir de este momento "método de exploración de tipo de unión a ligando").

1) Método de exploración de tipo AMPc

En el caso de la exploración de una sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración (o sea, agonista) que resulta útil como ingrediente activo de un agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente que estimula la secreción de insulina, con mayor particularidad un agente que estimula la secreción de insulina específicamente a elevada concentración de glucosa), mediante el uso de cambios en la concentración intracelular de AMPc como indicador, se analiza si el polipéptido es activado o no al poner en contacto al transformante para la herramienta de exploración con el compuesto de prueba y analizar (o sea, medir o detectar) cambios en la concentración intracelular de AMPc en las células, de manera directa o indirecta. En otras palabras, el método de exploración de tipo AMPc de la presente invención en el cual se emplean como indicadores los cambios en la concentración intracelular de AMPc, incluye los pasos de poner en contacto el transformante para la herramienta de exploración con un compuesto de prueba y analizar los cambios de la concentración intracelular de AMPc en las células. Con mayor particularidad, la exploración se lleva a cabo preferiblemente mediante cada método descrito en el Ejemplo 6, 7, 10 u 11. Por ejemplo, el incremento de la concentración intracelular de AMPc, como indicador, se mide mediante la exposición de un compuesto de prueba, durante un tiempo predeterminado, y luego puede seleccionarse un compuesto de prueba cuya EC_{50} sea 10 \muM o menor (de preferencia 1 \muM o menor) como sustancia que posee actividad agonista.

Los cambios en la concentración intracelular de AMPc pueden, por ejemplo, analizarse directamente mediante el empleo de un paquete de medición de AMPc disponible comercialmente (Amersham o similares) como se muestra en el Ejemplo 6 u 11, o analizados indirectamente mediante el análisis de la actividad transcripcional de un gen cuya regulación de la transcripción dependa de la concentración de AMPc [tal como un gen obtenido mediante la introducción de un elemento de respuesta a AMPc (CRE) que se encuentra upstream de un gen de luciferasa], como se muestra en el ejemplo 7 o 10.

Cuando el transformante para la herramienta de exploración se pone en contacto con un compuesto de prueba, y a continuación la concentración intracelular de AMPc se incrementa, puede decidirse que el compuesto de prueba es un agonista del polipéptido para la herramienta de exploración. En este sentido, puede llevarse a cabo un procedimiento similar empleando como control una célula hospedera que no exprese el polipéptido para la herramienta de exploración o una célula transformada con un vector vacío en lugar del transformante para la herramienta de exploración, y resulta preferible confirmar que la concentración de AMPc en las células control no ha sido incrementada por el compuesto de prueba.

La exploración de la sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración mediante el análisis directo de cambios de la concentración de AMPc empleando un paquete comercialmente disponible de medición de AMPc (Amersham o similar) puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, el siguiente procedimiento como se muestra en el Ejemplo 6. Con mayor particularidad, las células que contienen un gen que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración se cultivan durante 20 horas después de la transferencia del gen y luego se elimina el medio. A continuación, se añaden 400 \muL de IBMX (3-isobutil-1-metilxantina)/DMEM 1 mmol, incubando la mezcla a 37ºC durante 10 minutos en presencia de CO_{2} 5%. Luego se añade el compuesto de prueba (tal como un compuesto, un péptido, o un anticuerpo) diluido en 100 \muL de IBMX/DMEM 1 mmol/L y se incuba durante 30 minutos. Se elimina el medio, y a continuación se mide la cantidad de AMPc en las células resultantes empleando un paquete de medida de AMPc comercialmente accesible (tal como un sistema inmunoenzimático de AMPc; Amersham pharmacia biotech). Un compuesto de prueba en el que se observe un incremento específico de AMPc en presencia del compuesto de prueba puede explorarse como sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración, o sea, un agente para el tratamiento de la diabetes.

La exploración de una sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración mediante el análisis indirecto de los cambios en la concentración de AMPc mediante el análisis de la actividad transcripcional de un gen en el cual la regulación de la transcripción dependa de la concentración de AMPc puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente, como se muestra en el Ejemplo 7. Con mayor particularidad, las células que contienen un gen que codifica para le polipéptido para la herramienta de exploración y un gen en el cual la regulación de la transcripción depende de la concentración de AMPc [por ejemplo, un gen obtenido mediante la introducción de un elemento de respuesta a AMPc (CRE) que se encuentra upstream del gen de la luciferasa; tal como el vector pCRE-Luc (CLONTECH)] se cultivan durante 18-20 horas después de la transferencia del gen. El compuesto de prueba se añade diluido en un medio y la mezcla se incuba a 37ºC durante 5 ó 6 horas en presencia de 5% de CO_{2}. Se elimina el medio, y las células se lisan con una solución de lisis celular. Se mide la actividad luciferasa del lisado. Una sustancia o similar en la que se observe un incremento específico de la actividad reportera en presencia del compuesto de prueba puede explorarse como sustancia activadora del polipéptido para la herramienta de exploración, o sea, como agente para el tratamiento de la diabetes.

2) Método de exploración de tipo de unión de GTP\gammaS

La exploración de una sustancia que active el polipéptido para herramienta de exploración (o sea, agonista) que sea útil como ingrediente activo de un agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente que estimule la secreción de insulina, con mayor particularidad, un agente que estimule la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa) empleando un método de unión de GTP\gammaS (Lazareno, S. and Birdsall, N. J. M., Br. J. Pharmacol., 109, 1120-1127, 1993) puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, el procedimiento siguiente. Con mayor particularidad, la membrana celular que expresa el polipéptido para la herramienta de exploración se mezcla con GTP\gammaS marcado con ^{35}S (400 pmol/L) en una solución de mezclado [HEPES 20 mmol/L (pH 7,4), NaCl 100 mmol/L, MgCl_{2} 10 mmol/L y GDP 50 mmol/L]. Luego de la incubación en presencia o ausencia del compuesto de prueba, las soluciones de reacción se filtran con un filtro de vidrio o similar. Puede explorarse un agonista contra el polipéptido para la herramienta de exploración, o sea, un agente para el tratamiento de la diabetes mediante el incremento específico de la unión de GTP\gammaS en presencia del compuesto de prueba, como indicador.

El método de exploración de tipo de unión de GTP\gammaS de la presente invención que emplea el método de unión a GTP\gammaS incluye los pasos de poner en contacto la membrana celular del transformante para la herramienta de exploración con el compuesto de prueba en presencia de GTP\gammaS marcado con ^{35}S, separando el GTP\gammaS unido a la membrana del no unido y analizando la radiactividad del GTP\gammaS separado.

3) Método de exploración de tipo de unión a ligando

La exploración de una sustancia que se una al polipéptido para la herramienta de exploración que puede ser útil como ingrediente activo de un agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente que estimule la secreción de insulina, con mayor particularidad un agente que estimule la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa) empleando un método de ensayo de unión a ligando puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente. Con mayor particularidad, se prepara el transformante para la herramienta de exploración que expresa el polipéptido para la herramienta de exploración, o al membrana celular del mismo, o el polipéptido para la herramienta de exploración (de preferencia una preparación purificada del mismo). Se optimizan las condiciones del ensayo, tales como tampón, iones, y/o pH. El transformante que expresa el polipéptido, o la membrana celular del mismo, o el polipéptido y una sustancia marcada obtenida, por ejemplo, mediante el método de exploración de tipo AMPc y/o el método de exploración de tipo de unión a GTP\gammaS [o sea, un agonista como la 2-piridina-4-il]etil tiobenzoato u oleoil L-\alpha-lisofosfatidilcolina se incuban en el tampón optimizado, junto al compuesto de prueba, durante un tiempo predeterminado. Luego de la reacción, la mezcla se filtra con un filtro de vidrio o similar, y el filtro se lava con un volumen adecuado del tampón. Se mide la radiactividad remanente en el filtro mediante un contador de centelleo líquido o similar. De esta manera se puede confirmar que el ligando es un agonista o un antagonista mediante, por ejemplo, el método de exploración de tipo AMPc y/o el método de exploración de tipo de unión a GTP\gammaS.

(3) Una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes (únicamente a modo de referencia)

Se puede describir una composición farmacéutica que posee una sustancia como ingrediente activo [por ejemplo, ADNs, proteínas (incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos), péptidos, u otros compuestos] que activan el polipéptido para la herramienta de exploración, por ejemplo, seleccionada mediante el método de exploración de la presente invención. La composición farmacéutica, de preferencia, es una composición para el tratamiento y/o la prevención de la diabetes (un agente para el tratamiento y la prevención de la diabetes; con mayor preferencia, una composición farmacéutica que estimula la secreción de insulina, con la mayor preferencia, una composición farmacéutica que estimula la secreción de insulina específicamente a elevada concentración de glucosa) que incluye como ingrediente activo una sustancia que activa al polipéptido como herramienta de exploración.

Además, se describe un proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes que consta de las etapas de:

Llevar a cabo un análisis como se describe más adelante en una prueba de control de calidad de la composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes; y

Preparar una formulación que contenga la sustancia analizada. El análisis puede llevarse a cabo mediante:

(1)

poniendo la célula para la herramienta de exploración o la membrana celular de la misma en contacto con el compuesto de prueba, y analizando si el polipéptido para la herramienta de exploración se activa o no; o

(2)

poniendo la célula para la herramienta de exploración o la membrana celular de la misma en contacto con un compuesto de prueba en presencia de un agonista marcado del polipéptido para la herramienta de exploración, y analizando el cambio en la cantidad de agonista marcado que se une a la célula o a la membrana celular de la misma.

Además, se describe un proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes que consta del paso de preparación de la formulación que contiene una sustancia obtenida a partir del método de exploración de la presente invención, que incluye el análisis mediante los procedimientos antes mencionados.

Como ingrediente activo de la composición farmacéutica puede emplearse una sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración. La sustancia activadora puede seleccionarse mediante, por ejemplo, el método de exploración de la presente invención. Como sustancias que activan el polipéptido para la herramienta de exploración pueden mencionarse, por ejemplo, 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato (ver Ejemplo 7) o un oleoil de L-\alpha-lisofosfatidilcolina (ver Ejemplo 10), y 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato es preferible. La composición farmacéutica no se limita a una composición farmacéutica como ingrediente activo de una sustancia obtenida mediante el método de exploración de la presente invención, sino que incluye una composición farmacéutica que contiene como ingrediente activo una sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración. Como composición farmacéutica se prefiere una composición farmacéutica que estimule la secreción de insulina, y es más preferible una composición farmacéutica para la estimulación de la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa.

En este sentido, es posible confirmar que una sustancia es efectiva en el tratamiento de la diabetes por métodos conocidos a los versados en la técnica o métodos modificados. Por ejemplo, la actividad sobre la secreción de insulina puede confirmarse mediante un método descrito en el Ejemplo 8. La actividad de incremento de la cantidad de insulina en el plasma o la actividad de disminución de la glucosa sanguínea puede confirmarse mediante, por ejemplo, un método descrito en el Ejemplo 9.

La preparación que contiene como ingrediente activo una sustancia (por ejemplo, ADNs, proteínas (incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos), péptidos, u otros compuestos) que activan el polipéptido para la herramienta de exploración puede prepararse, como composición farmacéutica, empleando portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes y/o otros aditivos empleados de manera general en la preparación de formulaciones, en concordancia con el ingrediente activo. La composición farmacéutica es, preferiblemente, una composición farmacéutica para le tratamiento y/o la prevención de la diabetes, que contiene como ingrediente activo una sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración y que estimula la secreción de insulina específicamente en condiciones de elevada concentración de glucosa. También se presenta un método para el tratamiento y/o la prevención de la diabetes, que incluye la administración de una sustancia que activa el polipéptido para la herramienta de exploración.

Ejemplos de administración incluyen la administración oral mediante tabletas, píldoras, cápsulas, gránulos, gránulos finos, polvos, soluciones orales y similares y la administración parenteral mediante inyecciones (p. e., intravenosa, intramuscular, o similares), supositorios, preparaciones transdérmicas, preparaciones de absorción transmucosal, y similares. En particular, en el caso de péptidos que se digieren en el estómago, resulta preferible la administración parental, tal como mediante una inyección intravenosa o similares.

En la composición sólida para el empleo en la administración oral, pueden mezclarse uno o más ingredientes activos con al menos un diluyente inerte, tal como lactosa, manitol, glucosa, microcelulosa cristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinil pirrolidona, o silicato de aluminio y magnesio. En la forma usual, la composición puede contener aditivos además del diluyente inerte, tales como un lubricante, un agente desintegrante, un agente estabilizador o un agente solubilizante o de ayuda a la solubilización. De ser necesario, las tabletas o píldoras pueden ser recubiertas con una capa de azúcar o una película de una sustancia gástrica o entérica.

La composición líquida para la administración oral puede incluir, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, siropes y elixires y puede contener, un diluyente inerte empleado de manera regular, tal como agua purificada o alcohol etílico. La composición puede contener aditivos adicionales al diluyente inerte, tales como agentes humectantes, agentes de suspensión, edulcorantes, sabores y antisépticos.

Las inyecciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones asépticas. Ejemplos de diluyentes para empleo en las soluciones y suspensiones no acuosas incluyen propilén glicol, polietilén glicol, aceite vegetal (p.e. aceite de oliva), alcoholes (p.e. etanol), polisorbato 80 y similares. Tales composiciones pueden contener también un agente humectante, un agente emulsificante, un agente dispersante, un agente estabilizante, un agente solubilizante o de ayuda a la solubilización, un antiséptico o similares. Estas composiciones pueden ser esterilizadas, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, la mezcla de un germicida o irradiación. De manera alternativa, pueden emplearse elaborando primeramente composiciones sólidas estériles y disolviéndolas en agua estéril o en otro solvente estéril para inyección antes de su uso.

La dosis se decide de manera opcional tomado en consideración la fuerza de cada ingrediente activo, o los síntomas, la edad, el sexo o similares en cada paciente al que será administrada.

Por ejemplo, en el caso de la administración oral, la dosis usual para un adulto (de 690 kg de peso) es de alrededor de 0,1 a 100 mg, de preferencia, de 0,1 a 50 mg por día. En el caso de la administración parenteral, la dosis usual es de alrededor de 0,01 a 50 mg, de preferencia de 0,1 a 10 mg por día en forma de inyección.

El polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración puede emplearse para la fabricación de la herramienta de exploración de la presente invención como se describió anteriormente y, además resulta útil para la terapia génica.

Por ejemplo, en una terapia génica empleando el polinucleótido que codifica para el polipéptido para la herramienta de exploración, el polipéptido para la herramienta de exploración se encuentra sobreexpresado de manera específica en páncreas, mediante la introducción específica del polinucleótido en el páncreas. El polipéptido se activa de manera espontánea en ausencia del ligando, y estimula la secreción de insulina a elevada concentración de glucosa. Por tanto, el método resulta útil para el tratamiento de la diabetes. La terapia génica puede llevarse a cabo según los métodos descritos, por ejemplo, en Japan Society of Gene Therapy, "Idenshi chiryou kaihatsu kenkyuu handobukku (Handbook of gene therapy research)", NTS, 1999, o Tadashi Ariga y Yukio Sakiyama, Tanpakushitsu Kakusan Koso, 40 (17), 2772-2780, 1995.

Además, una sustancia que estimula la expresión del polipéptido (en particular un polipéptido natural tal como un polipéptido que posee la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 o 16) para la herramienta de exploración (tal como una sustancia que estimula la actividad transcripcional de un polinucleótido que codifica para el polipéptido de la herramienta de exploración) puede estimular la secreción de insulina a elevadas concentraciones de glucosa, mediante la sobreexpresión del polipéptido para la herramienta de exploración y, por tanto, resulta útil como ingrediente activo de un agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente para la estimulación de la secreción de insulina, con mayor particularidad, un agente que estimule la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa). La sustancia estimuladora de la actividad puede seleccionarse, por ejemplo, mediante la preparación de un vector de expresión obtenido por la fusión de una región promotora del polinucleótido que codifica para el péptido de la herramienta de exploración upstream de un gen reportero adecuado (tal como el gen de la luciferasa), poniendo a las células transformadas con el vector de expresión en contacto con el compuesto de prueba, y analizando los cambios de expresión en el gen reportero.

Ejemplos

La presente invención será mejor ilustrada a continuación a través de, pero no se encuentra de ninguna manera limitada a, los Ejemplos siguientes. Los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos conocidos (Maniatis, T., et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982), a menos que se especifique otra cosa.

Ejemplo 1

Aislamiento del polinucleótido que codifica para el polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2

Un ADNc de tamaño completo que codifica para el polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2 se preparó mediante una reacción en cadena de la polimerasa-reverso transcripción (RT-PCR), empleando un ADN genómico humano (TOYOBO) como molde, de acuerdo con los procedimientos siguientes.

Se empleó un oligonucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 3 como cebador directo, y un oligonucleótido que consiste en la secuencia oligonucleotídica de ID. SEQ. No. 4 como cebador reverso. En cada uno de los extremos 5' de los cebadores existía una secuencia de reconocimiento de XbaI añadida allí. El RT-PCR se llevó a cabo empleando la polimerasa (Pyrobest DNA polymerase; Takara-shuzo) en presencia de dimetilsulfóxido 5% (DMSO), mediante la repetición de un ciclo compuesto por tratamientos de 98ºC durante 10 segundos, a 58ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 2 minutos, 34 veces. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN que poseía alrededor de 1,0 kbp.

El fragmento resultante se digirió con la enzima de restricción XbaI, y el producto resultante se clonó en un plásmido pEF-BOS, y un plásmido pEF-BOS con secuencia señal (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990). Se determinó la secuencia nucleotídica del clon resultante, empleando un secuenciador de ADN (ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems) mediante le método de terminador dideoxi, para encontrar una secuencia nucelotídica de ID. SEQ. No. 1.

Para determinar el extremo 5' y el extremo 3' del ADNc que codificaba para el polipéptido que consistía en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, se llevó a cabo un método RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc), empleando el ADNc de páncreas humano (Human Pancreas Marathon-Ready cDNA; Clontech) como molde. Los procedimientos se condujeron, concretamente. De acuerdo con el manual adjunto al ADNc anterior.

En el primer PCR del 5'-RACE se emplearon un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 5 y un cebador AP1 adjunto al ADNc anterior; y en el segundo PCR se emplearon un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 6 y un cebador AP2 adjunto al ADNc anterior. En el primer PCR del 3'-RACE se emplearon un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 7 y el cebador AP1; y en el segundo PCR se emplearon un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 8 y el cebador AP2.

Se llevó a cabo el primer PCR de los 5'-RACE y 3'-RACE empleando la Taq polimerasa (LA Taq; Clontech) mediante la repetición de un ciclo consistente en tratamientos de 98ºC durante 20 segundos, a 64ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 3 minutos, 27 veces. Se llevó a cabo el segundo PCR empleando la Taq polimerasa (LA Taq; Clontech), mediante la repetición de un ciclo consistente en tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 64ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 3 minutos, 34 veces. Las secuencias nucleotídicas de los productos de PCR resultantes se determinaron mediante un secuenciador de ADN (ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems), de acuerdo con un método de terminadores dideoxi.

Se obtuvo la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 9 a partir del 5'-RACE, como la secuencia del extremo 5', y a partir del 3'-RACE, la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 10, como la secuencia del extremo 3'. En la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 9 existía un codon de terminación (tag, 161ro-163ro) inmediatamente upstream de un codon de iniciación deducido (atg; 200mo-202do), y entre el codon de terminación y de inicio anteriores, no existía ningún codon de iniciación en marco correcto. En la secuencia nucleotídica de la ID. SEQ. No. 10 existía un codon de terminación (taa; 217mo-219no) en una posición esperada. Por tanto, resultaba obvio que la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 1 era una secuencia nucleotídica que codificaba para una secuencia aminoacídica de longitud completa que contenía el codon de iniciación y de terminación. Además, la secuencia aminoacídica (335 aminoácidos) deducida a partir de la secuencia anterior correspondía a la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2. La secuencia aminoacídica deducida contenía regiones hidrofóbicas, que se suponía que correspondieran a siete dominios de transmembrana, o sea, una característica típica de los receptores asociados a proteína G. Por tanto, resultaba obvio que la secuencia nucleotídica de la ID. SEQ. No. 1 codifica para un receptor asociado a proteína G.

Ejemplo 2

Confirmación de la distribución de la expresión del ARN del polipéptido que consistía en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2

La distribución de la expresión del polinucleótido que codifica para el polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2 se analizó mediante un método de RT-PCR, de acuerdo con los procedimientos siguientes.

En un primer paso, se puso a reaccionar un ARN poli A+ (5 \mug; Clontech) preparado a partir de órganos humanos, con mayor particularidad, cerebro, o sea, amígdala, núcleos caudados, hipocampo, cuerpo calloso, susbstantia nigra y cerebelo, médula espinal, hipófisis, corazón, placenta, pulmón, tráquea, hígado, riñón, páncreas, intestino delgado, estómago, bazo, médula ósea, timo, tiroides, glándulas salivares, glándulas adrenales, glándulas mamarias, próstata, testis y ovarios con ADNasa (DNase; Nippon Gene) a 37ºC durante 15 minutos. Una parte (4 \mug) del ARN poli A+ resultante tratado con la ADNasa se empleó para la reacción con la reversotranscriptasa (MMLV Reverse Transcriptase; Clontech) a 42ºC durante 60 minutos y a 94ºC durante 5 minutos, para obtener ADNc. Al ADNc resultante se disolvió en 800 \muL de agua estéril.

La distribución de expresión del ARNm del polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 se analizó mediante un PCR en el que los ADNc obtenidos a partir de los órganos humanos anteriores se emplearon como molde, y un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucelotídica de ID. SEQ. No. 11 y un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 12 se emplearon como juego de cebadores. El PCR se llevó a cabo usando la Taq polimerasa (Ex Taq; Takara-shuzo). En el PCR se repitió 30 veces un ciclo compuesto por tratamientos a 94ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 1 minuto, en presencia de DMSO 5%. Como estándar interno se amplificó el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada (G3PDH) mediante un PCR a las mismas condiciones, empleando los ADNc obtenidos a partir de los órganos humanos anteriores como molde, y un juego de amplificación control de la G3PDH humana (Human G3PDH Control Amplimer Set; Clontech). Los productos de PCR resultantes se analizaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Un producto amplificado de aproximadamente 500 pb y obtenido a partir del UNAM del polipéptido que consistía en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 se halló únicamente en el páncreas.

Ejemplo 3

Aislamiento y confirmación de la distribución de expresión del polinucleótido murino correspondiente al que codifica para el polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2

Un polinucleótido murino correspondiente al polinucleótido humano que codificaba para el polipéptido que consistía en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 aislado en el Ejemplo 1 se obtuvo a partir de los siguientes procedimientos.

Primero se llevó a cabo un PCR empleando el ADN genómico de rata (rat genomic DNA; Clontech) como molde y el oligonucleótido que consistía en la secuencia ID. SEQ. No. 11 y el oligonucleótido que consistía en la ID. SEQ. No. 12, cada uno empleado en el Ejemplo 2, como juego de cebadores. En el PCR se empleó la ADN polimerasa (Pyrobest DNA polymerase; Takara-shuzo), y un ciclo formado por tratamientos a 98ºC durante 10 segundos, a 57ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante un minuto, repetido 34 veces en presencia de DMSO 5%. Luego se llevó a cabo un segundo PCR, empleando los productos resultantes del PCR como molde. En el PCR se empleó la ADN polimerasa (Pyrobest DNA polymerase; Takara-shuzo), y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 10 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 1 minuto, se repitió 34 veces en presencia de DMSO 5%. Se analizaron secuencias parciales de loa fragmentos de PCR resultantes, y cuatro oligonucleótidos, que consistían en las secuencias nucleotídicas de ID. SEQ. No. 21 a No. 24 se diseñaron como cebadores mediante el método de RACE.

En el método de RACE siguiente se empleó ADN de cerebro (Marathon-Ready cDNA; Clontech) como molde. Para el 5'-RACE se emplearon el oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 21 y un cebador AP1 (adjunto al ADNc anterior) en el primer PCR; y un oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de la ID. SEQ. No. 22 y un cebador AP2 (adjunto al ADNc anterior) se usaron en el segundo PCR. Para el 3'-RACE, el oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 23 y el cebador AP1 anterior se emplearon en el primer PCR; y el oligonucleótido que consistía en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 24 y el cebador AP2 anterior se emplearon en el segundo PCR.

En el primer y segundo PCR del 5'-RACE se utilizó una Taq polimerasa (LA Taq; Clontech), y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC, durante 20 segundos,a 65ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 3 minutos, repetido 34 veces, de manera repetitiva. En el primer y segundo PCR del 3'-RACE se utilizó una Taq polimerasa (LA Taq; Clontech), y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 65ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 5 minutos, repetidos 34 veces, respectivamente. Se analizaron las secuencias nucleotídicas de los productos resultantes de los PCR del 5'-RACE y del 3'-RACE.

Un oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de la ID. SEQ. No. 25 y un oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de la ID. SEQ. No. 26 se diseñaron sobre la base de las secuencias nucleotídicas determinadas. Se llevó a cabo un PCR empleando el juego de cebadores diseñados y el ADNc de cerebro de rata como molde. En el PCR se empleó la ADN polimerasa (pfu turbo DNA polymerase; STRATAGENE); y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 64ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 2 minutos, repetidos 12 veces, un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 61ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 2 minutos, repetidos 12 veces, y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 58ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 2 minutos, repetidos 16 veces. Luego se llevó a cabo un segundo PCR, empleando como molde los productos resultantes del PCR. En el PCR se empleó la ADN polimerasa (pfu turbo DNA polymerase; STRATAGENE); y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 64ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 150 segundos, repetidos 12 veces, un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 61ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 150 segundos, repetidos 12 veces, y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 58ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 150 segundos, repetidos 16 veces. Los productos resultantes del PCR (llamados a partir de aquí productos A del PCR) se subclonaron y se confirmó la secuencia nucleotídica de los mismos.

A continuación, se diseñó un oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 13 (un cebador directo) y un oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 14 (un cebador reverso) sobre las bases de las secuencias nucleotídicas determinadas. Existía una secuencia de reconocimiento de XbaI añadida al extremo 5' de cada uno de los cebadores, respectivamente. Se llevó a cabo un PCR empleando el juego de cebadores y los productos A de PCR subclonados como molde. En el PCR se usó la ADN polimerasa (pfu turbo DNA polymerase; STRATAGENE), y un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 20 segundos, a 59ºC durante 30 segundos, y a 74ºC durante 90 segundos, repetidos 25 veces. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kbp. El fragmento resultante se digirió con la enzima de restricción XbaI, y luego se clonó en un plásmido pEF-BOS. Se determinó la secuencia nucleotídica del clon resultante, empleando un secuenciador de ADN (ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems) por el método de terminadores dideoxi, para encontrar una secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 15. La secuencia aminoacídica deducida a partir de la secuencia nucleotídica resultante fue la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16.

A continuación, se llevó a cabo un PCR empleando un oligonucleótido consistente en la secuencia nucelotídica de ID. SEQ. No. 17 y un oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 18, cada uno diseñado sobre la base de las secuencias nucelotídicas resultantes, como un juego de cebadores, y el ADNc preparado a partir de la línea celular RIF-5F (ATCC: CRL-2058) de células \beta de páncreas de rata como molde. El ADNc empleado se sintetizó preparando el ARN total usando un reactivo de purificación de ARN total (ISOGEN; NIPPONGENE), y luego, reaccionando con una reverso transcriptasa. En el PCR se empleó una Taq polimerasa (rTaq; Takarashuzo), y un ciclo compuesto por tratamientos a 94ºC durante 30 segundos, a 57ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 1 minuto, repetido 34 veces, en presencia de DMSO 5%. Los productos resultantes del PCR se analizaron mediante una electroforesis en gel de azarosa al 1%. Se confirmó que el ARNm del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 16 se expresaba en la línea celular de células \beta de páncreas de rata.

A continuación se llevó a cabo un PCR para el ADNc preparado a partir de la línea celular RIN-5F \beta de páncreas, preparando ARN total mediante un reactivo de purificación de ARN total (ISOGEN; NIPPONGENE), y luego reaccionando con la reverso transcriptasa. El PCR se llevó a cabo mediante la repetición del procedimiento descrito en el caso de la línea celular RIN-5F \beta de páncreas, excepto en que el oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 19 y el oligonucleótido consistente en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 20, cada uno diseñado sobre la base de las secuencias nucleotídicas del polipéptido de rata anterior, o sea, la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 15, se emplearon como cebadores para encontrar un fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb. Se presumió que el fragmento de ADN resultante era parte de un polinucleótido de ratón correspondiente al polinucleótido humano consistente en la secuencia nucleotídica de ID. SEQ. No. 15. Además, se confirmó que el ARNm del polinucleótido de ratón correspondiente al polinucleótido que codifica para el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 o No. 16 también se expresaba en la línea celular \beta de páncreas de
ratón.

Los resultados del Ejemplo 2 y del presente Ejemplo muestran que el ARNm del polinucleótido que codifica para el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, o el polinucleótido correspondiente de rata o ratón se expresaba de manera específica en el páncreas, un órgano involucrado de manera profunda en la diabetes, y en las líneas de células \beta de páncreas. Por tanto era posible utilizar una línea de células \beta de páncreas para la selección de sustancias que pudieran activar el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 o similares, en lugar de la expresión del polinucleótido que codifica para el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, o el polinucleótido correspondiente de rata o ratón, mediante la introducción del mismo en diversas líneas celulares.

Ejemplo 4

Expresión del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 en células 293-EBNA y cambio de la concentración intracelular de AMPc por sobrexpresión

Para expresar el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, se empleó el clon preparado en el Ejemplo 1, o sea, el plásmido que contenía la secuencia señal y el ADNc de tamaño completo que codificaba para el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 (llamado a partir de ahora plásmido pEF-BOS SSF-NA). Esto fue debido a que el vector de expresión capaz de añadir la secuencia señal al N-terminal del polipéptido deseado se empleó para expresar el polipéptido deseado a elevada frecuencia en la membrana celular.

Las células 293-EBNA (7 x 10^{4} células/pozo) se sembraron en un plato de 24 pozos recubierto con colágeno, y se cultivaron durante 24 horas. Luego se empleó un reactivo de transfección (FuGENE6; Boeringer Mannheim) para transfectar el plásmido pEF-BOS SSF-NA o el plásmido pEF-BOS (vector de control negativo) a las células. Las células transfectadas se cultivaron a continuación durante 20 horas y luego se aspiró el medio. Luego de añadir 500 \muL de IBMX/DMEM 1mmol/L, la mezcla se incubó a 37ºC durante 40 minutos en presencia de CO_{2} 5%. El IBMX empleado era un inhibidor de la fosfodiesterasa. Luego, el medio se aspiró y se midió la cantidad de AMPc en las células resultantes. Se empleó un sistema de ensayo inmunoenzimático comercialmente disponible (Amersham Pharmacia Biotech) para la medición de la cantidad de AMPc.

Los resultados mostraron que la cantidad de AMPc intracelular se incrementó en dependencia de la cantidad de plásmidos, en las células en las que se habían transfectado plásmidos pEF-BOS SSF-NA, mientras que no se observó cambio en la cantidad de AMPc en las células que se habían transfectado con el plásmido pEF-BOS. El incremento de la cantidad de AMPc por la sobrexpresión del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 mostró que el AMPc es uno de los segundos mensajeros del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2.

Ejemplo 5

Expresión del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 en la línea de células \beta del páncreas NIT-1 y cambio de la cantidad de insulina secretada por sobrexpresión

El polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 o No. 16 se expresaba específicamente en el páncreas, y la expresión del mismo en líneas de células \beta del páncreas se confirmó (ver Ejemplos 2 y 3). Sería posible presumir la función del polipéptido por la expresión del polipéptido en las líneas de células \beta del páncreas, Para expresar el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, se usó en el presente Ejemplo el plásmido pEF-BOS SSF-NA usado en el Ejemplo 4.

Las células NIT-1 (4 x 10^{5} células) se sembraron en un plato de 24 pozos, y se cultivaron durante 24 horas. Luego se empleó un reactivo de transfección (FuGENE6; Boeringer Mannheim) para transfectar el plásmido pEF-BOS SSF-NA o el plásmido pEF-BOS (vector de control negativo) a las células. Las células transfectadas se cultivaron a continuación durante 2 ó 3 días, y luego se aspiró el medio. Luego de lavar con tampón fosfato salino (PBS), se añadió 1 mL de KRBB (Krebs-Ringer bicarbonate buffer) con glucosa a 3,3 mmol/L, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 ó 2 horas, en presencia de CO_{2} 5%. Luego se aspiró el tampón, y se añadió 1 mL de KRBB (Krebs-Ringer bicarbonate buffer) con glucosa a 3,3 mmol/L o 1 mL de KRBB (Krebs-Ringer bicarbonate buffer) con glucosa a 16,8 mmol/L. La mezcla se incubó a 37ºC durante 2 horas en presencia de CO_{2} al 5%. Se midió la cantidad de insulina en el sobrenadante. Se empleó un paquete de radioinmunoanálisis comercialmente disponible (Phadesephinsulin; Pharmacia Upjohn) para la medición de la cantidad de insulina secretada.

Se demostró que la sobrexpresión del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 no provocaba un cambio en la cantidad de insulina secretada en presencia de 3,3 mmol/L de glucosa, pero sí provocaba un incremento en la cantidad de insulina secretada en presencia de 16,8 mmol/L de glucosa.

Los resultados mostraron que el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 era un receptor asociado a proteína G expresado específicamente en el páncreas como se mostró en el Ejemplo 2, y presentaba la función de acelerar la secreción de insulina dependiente de la concentración de glucosa. Por tanto, resultaba posible evitar y/o tratar una enfermedad pancreática, especialmente la diabetes, mediante la activación del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de la ID. SEQ. No. 2.

Ejemplo 6

Exploración de sustancias capaces de modificar la actividad del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, basado en cambios de la concentración intracelular de AMPc - Parte 1

Para expresar el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 se empleó el clon preparado en el Ejemplo 1, o sea, el plásmido pEF-BOS al cual se le había introducido el ADNc de tamaño completo que codifica para el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 (llamado a partir de aquí pEF-BOS-NA).

Se sembraron células 293-EBNA (7 x 10^{4} células/pozo) en una placa de 24 pozos recubierta con colágeno, y se cultivaron durante 24 horas. Luego se utilizó un reactivo de transfección (FuGENE6; Boeringer Manheim) para transfectar 50 ng del plásmido pEF-BOS-NA o del plásmido pEF-BOS (vector control negativo) a las células. Las células transfectadas se cultivaron a continuación durante 20 horas, y luego se aspiró el medio. Luego de añadir 400 \muL de IBMX/DMEM 1mmol/L, se incubó la mezcla a 37ºC durante 10 minutos, en presencia de CO_{2} al 5%. Además, se añadió un compuesto de prueba, tal como un péptido o un anticuerpo, diluido en 100 \muL de IBMK 1 mmol/L, y la mezcla se incubó durante 30 minutos. Luego se aspiró el medio, y las células resultantes se emplearon para la medición de la cantidad de AMPc. Se puede emplear un sistema inmunoenzimático comercialmente disponible de AMPc (Amersham Pharmacia Biotech) para la medición de la cantidad de AMPc, y se puede seleccionar el compuesto de prueba que provoca un incremento en la cantidad de AMPc, específicamente en las células en las que se expresaba el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, como una sustancia capaz de activar el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2.

\newpage

Ejemplo 7

Exploración de sustancias capaces de modificar la actividad del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, basado en cambios de la concentración intracelular de AMPc - Parte 2

El plásmido pEF-BOS-NA empleado en el Ejemplo 6 se utilizó también en el presente Ejemplo.

Se sembraron células 293-EBNA (1 x 10^{4} células por pozo) en placas de 96 pozos, recubiertas con colágeno, y se cultivaron durante toda la noche en un medio de Dulbecco modificado por Tagle (DMEM), que contenía 10% de suero fetal bovino (FCS). Luego se empleó un reactivo de transfección (LIPOFECTAMINE 2000; GIBCO BRL) para trasfectar 0,01 ng del plásmido pEF-BOS-NA o el plásmido pEF-BOS (vector de control negativo) y 5 ng del vector pCRE-Luc (CLONTECH) a las células. Las células transfectadas se cultivaron a continuación durante 18-20 horas, y luego se añadió un compuesto de prueba (un compuesto conocido, pero que no se sabía que poseyera eficacia en el tratamiento de la diabetes) diluido en el medio, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 5-6 horas en presencia de CO_{2} al 5%. A continuación se aspiró el medio, se lisaron las células con un solución de lisado de células (tampón de lisis celular LCb; Toyo Ink Mfg.). Se midió la actividad luciferasa del lisado mediante un paquete comercialmente disponible (PicaGene Luminescent kit; Toyo Ink Mfg.) y un aparato de medición (ML3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories).

Los compuestos de prueba que provocaron un incremento en la actividad reportera específicamente en células en las que el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 se expresaba, se seleccionaron como sustancias capaces de estimular la actividad del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, y se pudieron obtener cuatro compuestos diferentes, incluyendo el 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato (LT-1 Z 0059519; LaboTest). El valor de EC_{50} del 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato fue de 3,2 \muM.

Ejemplo 8

Experimento de secreción de insulina a partir de una línea celular de células \beta de páncreas de ratón - Parte 1

Se sembraron células MIN6 (2 x 10^{5} células) en una placa de 24 pozos, y se cultivaron durante 2 días en un DMEM que contenía FCS al 10%. Se aspiró el medio, y las células se lavaron con KRB-HEPES (140 mmol/L NaCl, 3.6 mmol/L KCl, 0.5 mmol/L NaH_{2}PO_{4}, 0.5 mmol/L MgSO_{4}, 1.5 mmol/L CaCl_{2}, 10 mmol/L Hepes, 2 mmol/L NaHCO_{3}, 0.1% BSA, pH7.4). A continuación se añadió KRB-HEPES que contenía glucosa 2,8 mmol/L (1 mL), la mezcla se incubó a 37ºC durante 30-60 minutos en presencia de CO_{2} 5%.

Luego de aspirar el tampón se añadió uno de los cuatro compuestos obtenidos mediante la exploración del Ejemplo 7, o sea, 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato, en forma de solución (0,5 mL) preparado mediante la dilución del compuesto con KRB-HEPES que contenía glucosa a 2,8 mmol/L o 16, 8 mmol/L, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 20 minutos en presencia de CO_{2} al 5%. Se empleó el sobrenadante para medir la cantidad de insulina secretada.

Se empleó un paquete de radioinmunoensayo comercialmente disponible (Phadeseph insulin; Pharmacia Upjohn) para medir la cantidad de insulina secretada.

Se mostró que la estimulación de 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato no provocaba un incremento en la cantidad de insulina secretada en presencia de glucosa a 2,8 mmol/L, pero sí provocaba un incremento en la cantidad de insulina secretada en presencia de glucosa a 16,8 mmol/L. Por tanto, se demostraba que el 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato puede presentar una función de acelerar la secreción de insulina solo cuando se estimula a elevadas concentraciones de glucosa.

Para uno de los tres compuestos encontrados en el Ejemplo 7, además del 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato se repitieron los procedimientos descritos en el experimento del 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato. Se mostró que la estimulación por el compuesto no provocó un incremento en la cantidad de insulina secretada en presencia de glucosa a 2,8 mmol/L, pero sí provocó un incremento en la cantidad de insulina secretada en presencia de glucosa a 16,8 mmol/L. Por tanto, mostró que el compuesto puede presentar la función de acelerar la secreción de insulina solo cuando es estimulado por una elevada concentración de glucosa.

Ejemplo 9

Pruebas de tolerancia a la glucosa para ratas SD y ratas GK mediante una dosis oral

Se mantuvieron ratas SD (4 semanas de edad; CLEA JAPAN) en ayuno durante la noche y se les administró 2 g/kg de glucosa por vía oral. 100 mg/kg de 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato (LT-1 Z 0059519) se había administrado intraperitonealmente 5 minutos antes de la administración de glucosa. Se tomó una cantidad adecuada de sangre 0 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de la administración de glucosa, y se empleó para la medición del nivel de glucosa en sangre y la concentración plasmática de insulina.

Para la medición del nivel de glucosa sanguínea se empleó el sobrenadante obtenido mediante la mezcla de sangre y ácido perclórico 0,33 mol/L (sangre:0,33 mol/L ácido perclórico=1:10) y se centrifugó la mezcla (3000 x g, 10 minutos, 4ºC). Para medir la concentración plasmática de insulina se empleó un sobrenadante obtenido mediante centrifugación de la sangre (3000 x g, 10 minutos, 4°C). A continuación, se empleó una prueba C de glucosa de Wako (Wako) para medir el nivel de glucosa en sangre, y un sistema de ensayo de insulina de rata (Amersham) se empleó para medir la concentración plasmática de insulina.

Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 ilustra el curso temporal de la concentración plasmática de insulina (unidades=ng/mL) luego de la administración oral de glucosa, y la Figura 2 ilustra el curso temporal del nivel de glucosa sanguínea (unidades=mg/dL) luego de la administración oral de glucosa. La marca "*" en las Figuras 1 y 2 denota que se encontraron diferencias significativas contra el grupo control, o sea, el grupo al que no se le administró 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato, de p<0,05 (prueba t de Student).

Como se muestra en la Figura 1, se observó un incremento significativo de la concentración plasmática de insulina 30 minutos después de la administración de glucosa, en el grupo al que se le había administrado 100 mg/kg de 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato. Además, el incremento del nivel de glucosa sanguínea por la administración de glucosa fue suprimido de manera significativa a los 30 minutos de la administración de la glucosa, en el grupo al que se había administrado 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato.

Por tanto, se confirmó que en ratas SD a las que se administró glucosa el 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato presentó una función de incremento de la cantidad de insulina plasmática, y una función de reducción del nivel de glucosa sanguínea.

Luego se llevó a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa para ratas GK (Goto-Kakizaki) (modelos de diabetes tipo II con secreción incompleta de insulina; 7 semanas de edad; Charles Rivers, Japan) mediante una dosis oral. Se estableció la línea de ratas GK mediante el cruce selectivo de ratas wistar de acuerdo con un índice de pobre tolerancia a la glucosa oral, por Yoshio Goto et al., School of Medicine, Tohoku University, in 1975.

Los procedimientos de las pruebas de tolerancia a la glucosa para ratas SD se repitieron, con excepción de que el 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato se administró por vía oral.

La Figura 3 ilustra el curso temporal del nivel de glucosa en sangre (unidades=mg/dL) luego de la administración oral de glucosa. En la Figura 3 la marca "*" denota que existe una diferencia significativa contra el grupo control, o sea, el grupo al cual no se administró 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato, con p<0,05 (prueba t de Student), y la marca '' denota que la diferencia significativa se encontraba por encima de p<0,01.

Como se muestra en la Figura 3, el incremento en los niveles de glucosa en sangre debidos a la administración de glucosa fueron suprimidos de manera significativa a los 30 y 60 minutos de la administración de glucosa, en el grupo al que se le habían administrado 100 mg/kg de 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato, y por tanto, se confirmó la utilidad del 2-(piridin-4-il)etil tiobenzoato en el modelo de diabetes de ratas.

Ejemplo 10

Exploración de sustancias capaces de modificar la actividad del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, basado ene l cambio de la concentración celular de AMPc - Parte 3

El plásmido pEF-BOS-NA, empleado en el Ejemplo 6 se utilizó también en el presente Ejemplo.

Se sembraron células 293-EBNA (7 x 10^{4} células/pozo) en una placa de 24 pozos recubierta con colágeno, y se cultivaron durante toda la noche en un medio Dulbecco modificado por Tagle (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 1% (FCS). Luego se empleó un reactivo de transfección (LIPOFECTAMINE 2000; GIBCO BRL) para trasfectar 0,1 ng del plásmido pEF-BOS-NA o el plásmido pEF-BOS (vector de control negativo) y 20 ng del vector pCRE-Luc (CLONTECH) a las células. Las células transfectadas se cultivaron a continuación durante 18-20 horas, y luego se añadió un compuesto de prueba diluido en un medio que contenía BSA al 0,1%, y se incubó la mezcla a 37ºC durante 6 horas, en presencia de CO_{2} al 5%. Luego de aspirar el medio, se lisaron las células con una solución de lisado (cell lysis buffer LCb; Toyo Ink Mfg.). Se midió la actividad luciferasa del lisado mediante un paquete comercialmente disponible (PicaGene Luminescence kit; Toyo Ink Mfg.) y un equipo de medición (ML3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories).

Los compuestos de prueba que provocaron un incremento de la actividad reportera, específicamente en células en las que se expresa el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 se seleccionaron como sustancias capaces de estimular la actividad del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2. Se pudo obtener oleil de L-\alpha-lisofosfatidilcolina (L1881; SIGMA), un biocomponente.

\newpage

Ejemplo 11

Exploración de sustancias capaces de modificar la actividad del polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2, basado en los cambios en la concentración intracelular de AMPc - Parte 4

El plásmido pEF-BOS-NA, empleado en el Ejemplo 6, se utilizó también en el presente Ejemplo.

Se sembraron células 293-EBNA (1 x 10^{4} células/pozo) en una placa de 96 pozos recubierta con colágeno, y se cultivaron durante 24 horas. Luego se empleó un reactivo de transfección (LIPOFECTAMINE 2000; GIBCO BRL) para transfectar 3 ng de un plásmido pEF-BOS-NA o un plásmido pEF-BOS (vector de control negativo) a las células. Las células transfectadas se cultivaron a continuación durante 20 horas, y se aspiró el medio. A continuación se añadieron 80 \muL de IBMX a 1 mmol/L /BSA al 0,1%/DMEM, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 10 minutos en presencia de CO_{2} al 5%. Luego se añadió un compuesto de prueba diluido con 20 \muL de IBMX a 1 mmol/L/BSA al 0,1%/DMEM y la mezcla se incubó durante 30 minutos. Luego de que se aspirase el medio, las células resultantes se emplearon para la medición de la cantidad de AMPc. Se utilizó un sistema inmunoenzimático de AMPc comercialmente disponible (cyclic AMP kit; Nihon Schering) para medir la cantidad de AMPc. El compuesto seleccionado en el Ejemplo 10, o sea oleil de L-\alpha-lisofosfatidilcolina mostró un incremento de la cantidad de AMPc específicamente en las células en las que se expresaba el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 y, por tanto, fue seleccionado como sustancia capaz de activar el polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID.
SEQ. No. 2.

Ejemplo 12

Experimento de secreción de insulina a partir de la línea celular MIN6 de células de páncreas de ratón - Parte 2

Se sembraron células MIN6 (2,5 x 10^{5} células) en una placa de 24 pozos recubierta con colágeno, y se cultivaron durante 2 días en un DMEM que contenía FCS al 10% (Cat. No. 11995-065; GIBCO BRL). El medio se aspiró, y se añadió 0,4 mL de un DMEM libre de glucosa que contenía FBS al 10% (Cat. No. 11995-065; GIBCO BRL). La mezcla se incubó a 37ºC durante 2 horas en presencia de CO_{2} al 5%.

Luego de aspirado el medio se añadieron 0,5 mL de una solución de oleil de L-\alpha-lisofosfatidilcolina, el compuesto seleccionado por el método de exploración del Ejemplo 10, diluido en DMEM que contenía glucosa a 2,8 mmol/L o a 16,8 mmol/L (Cat. No. 11966-025; GIBCO BRL), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos, en presencia de CO_{2} al 5%. Se empleó el sobrenadante para medir la cantidad de insulina secretada.

Se empleó un paquete de radioinmunoensayo de insulina comercialmente disponible (Phadeseph insulin; Pharmacia Upjohn) para la medición de la cantidad de insulina secretada.

Se mostró que la estimulación por oleil de L-\alpha-lisofosfatidilcolina provocaba un incremento en la cantidad de insulina secretada en presencia de glucosa a 16,8 mmol/L.

Aplicabilidad industrial

El polipéptido que posee la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 o 16, variaciones funcionalmente equivalentes del mismo y los polipéptidos monólogos son polipéptidos específicos del páncreas y muestran una actividad de estimulación de la secreción de insulina a elevada concentración de glucosa. Por tanto, mediante el empleo de estos polipéptidos se puede construir un sistema de exploración conveniente para la obtención de una sustancia útil como agente para el tratamiento de la diabetes (en particular un agente para la estimulación de la secreción de insulina, con mayor particularidad, un agente para la estimulación de la secreción de insulina específicamente a elevadas concentraciones de glucosa) capaz de controlar la glucosa sanguínea dentro del rango normal.

Además, puede fabricarse una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes (en particular una composición farmacéutica para la estimulación de la secreción de insulina, con mayor particularidad una composición farmacéutica para la estimulación de la secreción de insulina específicamente a elevada concentración de glucosa) que contiene, como ingrediente activo una sustancia activadora que puede obtenerse mediante la herramienta de exploración o el método de exploración de la presente invención, y capaz de controlar la glucosa sanguínea dentro del rango normal.

Más aún, una de las herramientas de exploración de la presente invención, la célula para la herramienta de exploración o la membrana celular de la misma pueden emplearse no solo para le exploración de una sustancia útil como agente para el tratamiento de la diabetes, sino también en una prueba de control de calidad de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes.

Texto libre en el listado de secuencias

Las características de "Secuencia Artificial" se describen con el identificador numérico <223> en el listado de secuencias. Con mayor particularidad, cada una de las secuencias nucleotídica de ID. SEQ. Nos. 3, 4, 13, y 14 es una secuencia cebadora sintetizada de manera artificial.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Método para la exploración de agentes para el tratamiento de la diabetes

\vskip0.400000\baselineskip

<130> Y0128PCT-659

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000-367349

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-12-01

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2001-243841

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-08-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1008

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).. (1008)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

103

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de una secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada de manera artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga atggaatcat ctttctcatt tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de una secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada de manera artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctctaga ttagccatca aactctgagc tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggctgcttg atggcaaggt acc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcggagga agtgacaaat gcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagctttgc tctatcctgg acc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acctctacct agtgctggaa egg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgatccac aagaatgatg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggcaatct tgagcatgtc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de una secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada de manera artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga atggagtcat ctttctcatt tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de una secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada de manera artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatctaga ctagccatcg agctccggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1008

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).. (1008)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

107

108

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

110

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggctgata ccttgattgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacagctgg gaagaagcca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattggcgtg gctatttctg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagaagcc agcacaggag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taagatatca accacagccc tgca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacaagccc attcatgatc tgga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcctctgt cctcacggtc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaggtacct ggccattaag cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagagcacat ctaatcctgt cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagagatga aagtcaggat ccagc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (8)

1. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo constituido por

(1)

un polipéptido consistente en la secuencia aminoacídica de ID. SEQ. No. 2 ó 16,

(2)

un polipéptido que contiene una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16, y presenta (a) actividad de estimulación de la secreción de insulina a partir de las células del páncreas mediante la activación a elevada concentración de glucosa y/o (b) actividad de incremento de la cantidad de AMPc en las células mediante activación,

(3)

un polipéptido que contiene una secuencia aminoacídica en la que 1 a 10 aminoácidos han sido eliminados, sustituidos o añadidos en una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No 2 ó 16, y que presenta

(a)

actividad de estimulación de la secreción de insulina a partir de las células \beta del páncreas mediante activación, a elevada concentración de glucosa y/o (b) actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación, y

(4)

un polipéptido que contiene una secuencia aminoacídica que posee un 90% o más de homología con una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16 y presenta (a) actividad de estimulación de la secreción de insulina por las células del páncreas mediante activación a elevada concentración de glucosa y/o (b) actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación

como método de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

2. El uso, de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el polipéptido contiene una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16.

3. El uso, de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el polipéptido contiene una secuencia aminoacídica que posee un 90% o más de homología con una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No 2 ó 16.

4. El uso, de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido muestra (a) actividad de estimulación de la secreción de insulina por las células \beta del páncreas mediante activación a elevada concentración de glucosa y (b) actividad de incremento de la cantidad intracelular de AMPc en las células mediante activación.

5. El uso, de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en una de las secuencias aminoacídicas de ID. SEQ. No. 2 ó 16.

6. Los usos de una célula que se encuentra transformada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para un polipéptido como se describe de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y que expresa el polipéptido como herramienta de exploración para la búsqueda de un agente para el tratamiento de la diabetes.

7. Un método para la exploración de un agente para el tratamiento de la diabetes, que comprende los pasos de:

poner a una célula como se describe de acuerdo a la Reivindicación 6 o a una membrana celular de la misma en contacto con un compuesto a ser probado; y

analizar si un polipéptido como se describe de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 se activa o no.

8. El método de exploración de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el agente para el tratamiento de la diabetes es un agente que estimula la secreción de insulina.