WO2005009469A1

WO2005009469A1 - 新規血糖調節薬及びそのスクリーニング方法

Info

Publication number: WO2005009469A1
Application number: PCT/JP2004/011002
Authority: WO
Inventors: Mutsuo Taiji; Masakuni Horiguchi
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.
Priority date: 2003-07-28
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2005-02-03

Abstract

　本発明により、EDG2、EDG4もしくはEDG7等のLPA作動GPCRの拮抗剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬、生活習慣病治療薬、及び、LPA作動GPCR、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させ、該GPCR又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを含む、新規LPA作動GPCRリガンドのスクリーニング方法を提供することが可能になった。当該スクリーニング方法は、耐糖能異常改善薬を選別するのために有用である。

Description

明細書

新規血糖調節薬及びそのスクリ一二ング方法技術分野

本発明は LPA作動 GPCR活性抑制剤の新規医薬用途に関する。より詳細には、本発明はインスリン分泌調節のための LPA作動 GPCR活性抑制剤の使用、例えば、耐糖能異常改善及び糖尿病などの生活習慣病の治療のための LPA作動 GPCR活性抑制剤の使用に関する。本発明はまた、上記疾患の治療薬となり得る新規な LPA作動 GPCRリガンドのスクリーニング方法に関する。

¾ 謹

糖尿病はその病態から 1型と 2型に分類される。すなわち、 1型は膝臓におけるインスリン分泌機能不全に基づく病態であり、 2型はィンスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性と降臓におけるィンスリン分泌異常が主たる病態である。近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特に 2型糖尿病患者の増加が著しい。

血糖調節において隙臓は中心的役割をはたすと考えられている。主要な血糖調節ホルモンであるインスリンは膝臓のランゲルハンス島の /3細胞から分泌される。 β 細胞は食後などに一過的に上昇する血糖に応答して迅速に必要量のインスリンを分泌する。筋肉、脂肪等の末梢組織では膝臓から分泌されたインスリンに応答して糖を取り込むことにより、上昇した血糖の調節を行っている。さらに、肝臓ではインスリンに応答して糖新生が抑制され、血糖の調節が行われている。このようなサイクルに破綻が生じることにより糖尿病が発症すると考えられている。事実、 1型糖尿病の多くは、膝臓が自己免疫的に破壊されィンスリン分泌不全になることにより血糖コントロールが不能になるものであり、 2型糖尿病ではインスリン分泌における第一相の分泌不良が高血糖を招来することが知られている。

上述のような観点から、膝臓におけるィンスリン分泌の促進は糖尿病病態の改善効果に大きく貢献すると考えられる。このような作用機序を持つ薬剤としては、現在のところスルホニルゥレア剤などが上巿されている力血糖値に応じたインスリン分泌調節作用がないため、血糖が低下してもなおィンスリン分泌促進効果が持続して低血糖に陥り、昏睡、さらには死亡を招く危険性がある。現在、血糖値に応じたインスリン分泌促進効果が得られるというような特徴をもつ安全な薬剤は上市されておらず、このような薬剤の開発が望まれている。

ところで、リゾフォスファチジン酸（LPA) は、リン脂質の一種であり、ホスホリピッドの生合成中間体として知られていたが、その後様々な生体反応の細胞外シグナル伝達分子であることがわかってきた。該生体反応としては、細胞分裂促進、アポトーシス抑制、ァクチン細胞骨格再構築や細胞の形態変化の誘導、腫瘍細胞浸潤等が挙げられる〔Yoh Takuwaら、 J. Biochem. , 767- 771 (2002)を参照〕。最近になって、 LPAが G蛋白質結合受容体（G protein coupled receptor ; GPCR) ： EDG2 、 EDG4、及び EDG7のリガンド（ァゴ二スト）であることが判明し、該受容体のァゴ二スト及びアンタゴニストについても報告されている [Kevin R. Lynchら、 Bioche mica et Biophysics Acta. , 1582, 289-294 (2002) _s 及び Vineet M. Sardarら、 Bio chemica et Biophysica Acta. , 1582, 309- 317 (2002)を参照〕。また、 L- α _リゾホスファチジルコリンォレオイルがインスリン分泌促進活性を有することが報告されている（国際公開第 0 2ノ0 4 4 3 6 2号パンフレットを参照）。

しかしながら、 EDG2、 EDG4、及び EDG7等の受容体、又は該受容体のリガンド（ァゴニスト）である LPAと、糖代謝制御との関係はこれまで全く知られていなかった

発明の開示

したがって、本発明の目的は、糖代謝調節作用を有する化合物及びそのスクリーニング方法を提供することであり、それらを用いた耐糖能異常の改善方法、糖尿病を初めとする生活習慣病の治療薬を提供することである。

本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、正常人の膝臓ランゲルハンス氏島において発現局在する因子を同定した。すなわち、本発明者らは正常人の膝臓ランゲルハンス氏島に発現する遺伝子と正常状態のその他の諸組織に発現する遺伝子を比較することにより、正常人の膝臓ランゲルハンス氏島において発現局在する遺伝子を同定した。次に、該遺伝子がコードする蛋白質を調べたところ、リゾフォスファチジン酸（Lysophosphatidic acid；以下 LPAと称する。）のレセプター、すなわち LPA作動 GPCRである、 EDG2、 EDG4及び EDG7であることがわかった。

本発明者らは、次に、 EDG2、 EDG4及び EDG7等の LPA作動 GPCRを介したシグナル伝達が膝臓におけるインスリン分泌に関与しているか否かを検討するために、 LPA作動 GPCRのァゴニストリガンドが正常マウスに及ぼす作用を調べた。すなわち、 LPA を正常マウスへ投与したところ、 LPAは糖負荷による血糖値の上昇を亢進する耐糖能増悪因子であることを見出した。

これらの結果は、 LPA作動 GPCRの生理的リガンド（ァゴ二スト）である LPAの作用を拮抗する化合物、すなわち LPA作動 GPCR拮抗剤や、 LPAの産生を抑制する薬剤が耐糖能異常改善作用及び糖尿病を含む生活習慣病の治療活性を有することを示している。

本発明は、 LPA作動 GPCR活性抑制剤を有効成分とする血糖調節薬、詳細には、 LPA 作動 GPCR拮抗剤または LPA産生酵素阻害剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬に関する。すなわち、

〔 1〕 LPA作動 GPCR活性抑制剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬、

〔2〕 LPA作動 GPCR活性抑制剤が LPA産生酵素阻害剤である、〔1〕に記載の耐糖能異常改善薬、

〔 3〕 LPA作動 GPCR活性抑制剤が LPA作動 GPCR拮抗剤である、耐糖能異常改善薬、〔4〕耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の耐糖能異常改善薬、

〔5〕 LPA作動 GPCRが EDG2、 EDG4又は EDG7である、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の耐糖能異常改善薬、

別の本発明は、 LPA作動 GPCR拮抗剤のスクリーニング方法に関する。すなわち、〔 6〕 LPA作動 GPCR、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させ、該 GPCR又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを含む、 LP A作動 GPCR拮抗剤のスクリ一二ング方法、

〔7〕被験試料の存在下及び非存在下で、 LPA作動 GPCR、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントにリガンドを接触させ、該 GPCR又は該フラグメントとリガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む、 LPA作動 GPCR拮抗剤のスタリーニング方法、

〔8〕リガンドが標識された LPAである〔7〕記載のスクリーニング方法、〔9〕 LPA作動 GPCR、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントが、それらが包埋された脂質二重層の形態で提供される、〔6〕〜〔8〕のいずれか記載のスクリーユング方法。

また、 LPA作動 GPCRは三量体 GTP結合タンパク質共役型レセプター（GPCR ) であり、共役する GTPタンパク質 αサブユニット（Ga) についても幾らかの知見が得られている。従って、本発明は、 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層及び共役する Gひを含んでなる反応系において、該 Gaの GDP ■ G TP交換反応又は共役 Gタンパク質の細胞刺激活性を、被験試料の存在下と非存在下で比較することを含む、 LPA作動 GPCR拮抗剤のスクリーニング方法を提供する。すなわち、

〔10〕 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層及び LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質の _αサブュニットを含んでなる反応系において、該サブュニットの GDP · GTP交換反応又は該 G蛋白質の細胞刺激活性を、被験試料の存在下と非存在下で比較することを含む、 LPA作動 GPCR拮抗剤のスクリ一ユング方法、

〔1 1〕上記反応系が、（i) LPA作動 GPCRをコードする DNAを含む発現べクタ一と、 LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質のひサブュニットをコードする DNAを含む発現ベクターとでトランスフエタトした宿主真核生物細胞、（ii) LPA作動 GPCR の C末端側に LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質の αサブユニットが融合したポリペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターでトランスフエクトした宿主真核生物細胞、（iii) LPA作動 GPCRをコードする DNAを含む発現ベクターでトランスフエク卜した、 LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、（iv) LPA作動 GPCR及び LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、〔 10〕記載のスクリーニング方法、

〔12〕上記反応系に、被験試料の存在下及び非存在下で G TPアナログを添加し、 LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質の αサブュニットと GTPアナログとの結合を両条件下で比較することを含む、〔1 1〕記載のスクリーニング方法、

〔1 3〕 LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質のひサブユニットが、アデ二ル酸シクラーゼと相互作用する領域を含むものである、〔1 1〕記載のスクリーニング方法、

〔14〕上記反応系に、被験試料の存在下及び非存在下で AT Pを添加し、アデニル酸シクラーゼ活性を両条件下で比較することを含む、〔13〕記載の方法、〔1 5〕上記（i)〜（iv)の細胞における c AMP量を、被験試料の存在下と非存在下で比較することを含む、〔1 3〕記載の方法、

〔16〕 LPA作動 GPCRに共役し得る G蛋白質の αサブユニットが、ホスホリパーゼ C /3と相互作用する領域を含むものである、〔1 1〕記載のスクリーニング方法〔17〕上記反応系に、被験試料の存在下及び非存在下でホスファチジルイノシトール一 4, 5 _二リン酸を添カ卩し、ホスホリパーゼ C 活性を両条件下で比較することを含む、〔16〕記載のスクリーニング方法、

〔18〕上記（i)〜（iv)の細胞における細胞内カルシウムイオンの量を、被験試料の存在下と非存在下で比較することを含む、〔16〕記載のスクリーニング方法、

〔1 9〕 c AMP応答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリボータ一遺伝子を含む発現べクターをさらに含む上記（i)〜（iv)の細胞における該リポ一ター遺伝子の発現量を、被験試料の存在下と非存在下で比較することを含む、〔 13〕記載のスクリーニング方法、

〔20〕 TP A応答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリボータ一遺伝子を含む発現べクターをさらに含む上記（i)〜（iv)の細胞における該リポーター遺伝子の発現量を、被験試料の存在下と非存在下で比較することを含む、〔1 6〕記載のスクリーニング方法、

〔21〕上記反応系に、被験試料の存在下及び非存在下で BrdUを添加し、細胞内への BrdU取り込み量を両条件下で比較することを含む、〔10〕又は〔1 1〕記載のスクリーニング方法、

〔22] 上記反応系に、被験試料の存在下及び非存在下で [³H]チミジンを添加し、細胞内への [³H]チミジン取り込み量を両条件下で比較することを含む、〔10〕又は〔1 1〕記載のスクリーニング方法、〔2 3〕リガンドの共存下で実施される、〔1 0〕〜〔2 2〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、

〔2 4〕リガンドが LPAである、〔2 3〕記載のスクリーニング方法、

〔2 5〕 LPA作動 GPCRが EDG2、 EDG4又は EDG7である、〔6〕〜〔2 4〕のいずれか記載のスクリ一二ング方法、

〔2 6〕耐糖能異常改善薬の選別のために行われる、〔6〕〜〔2 5〕のいずれかに記載の方法、

〔2 7〕耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である、〔2 6〕に記載の選別方法又、別の本発明は、 LPA産生酵素阻害剤のスクリーニング方法に関する。すなわち、

〔2 8〕被験試料の存在下及び非存在下で、 LPA産生酵素及び基質を接触させ、 L PAの生成量を両条件下で比較することを含む、 LPA産生酵素阻害剤のスクリーニング方法、

〔2 9〕基質が標識されたホスファチジン酸である、〔2 8〕に記載のスクリーニング方法、

〔3 0〕〔2 8〕又は〔2 9〕に記載の方法を含む、耐糖能異常改善薬の選別方法、

〔3 1〕耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である、〔3 0〕に記載の選別方法。

さらに別の本発明は、上記のいずれかのスクリーニング方法により選択される LP A作動 GPCR拮抗剤もしくは LPA産生酵素阻害剤等の LPA作動 GPCR活性抑制剤を有効成分とする医薬品を提供する。すなわち、

〔3 2〕〔6〕〜〔2 5〕のいずれかに記載の方法により選択される LPA作動 GPC R拮抗剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬、

〔3 3〕耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である〔3 2〕に記載の耐糖能異常改善薬、

〔3 4〕〔2 8〕又は〔2 9〕に記載の方法により選択される LPA産生酵素阻害剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬、〔3 5〕耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である〔3 4〕記載の耐糖能異常改

図面の簡単な説明

図 1は、生理食塩水または LPAを個体あたり 0. 5mg静脈内単回投与後、糖負荷を行つた。糖負荷 90分後の血糖値を示した。生理食塩水投与群と比較して、 LPA投与群は有意に（pく 0. 05 Sutudent's t-test) 糖負荷 90分後血糖値は高値を示した。発明を実施するための最良の形態

本発明のさらなる特徴及び本発明の利点について、以下に、より詳細に説明する本明細書において、「LPA作動 GPCR」とは、リゾフォスファチジン酸（LPA) がリガンド（ァゴ二スト）となって活性化され、かつ膝臓ランゲルハンス氏島において有意に発現している GPCRを表し、具体的には EDG2、 EDG4及び EDG7が挙げられる。 ED G2、 EDG4及び EDG7のアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列はそれぞれ公知であり、例えばヒト EDG2の配列は GeneBankに受託番号：醒_001401として登録されている（配列番号： 1及び 2 ) 。またヒト EDG4の配列は GeneBankに受託番号： AF233092として登録されている（配列番号： 3及び 4 ) 。またヒト EDG7の配列は GeneBankに受託番号：匪— 012152として登録されている（配列番号： 5及び 6 ) 。

ここで前記「有意に発現している」とは、他の組織における発現量と比較して、膝臓ランゲルハンス氏島における発現量が、 1. 5倍以上であることを表す。

本発明において「EDG2」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来の EDG2の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードする D N Aを含む組換え細胞から製造される組換え EDG2、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。

また、本発明において「EDG4」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来の EDG4の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードする D N Aを含む組換え細胞から製造される組換え EDG2、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。また、本発明において「EDG7」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来の EDG7の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードする DN Aを含む組換え細胞から製造される組換え EDG7、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。

「LPA作動 GPCR活性抑制剤」とは、 LPA作動 GPCRとリガンド（ァゴ二スト）が結合することによって生ずる活性を抑制する薬剤であれば特に限定はないが、具体的には、 LPA作動 GPCR拮抗剤又は LPA産生酵素阻害剤が挙げられる。

本明細書において「リガンド」とは、特にことわらない限り、生理的リガンド（ァゴニスト）であるリゾフォスファチジン酸（LPA) だけでなく、ァゴニストち、レセプターの生理的リガンド結合部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やアンタゴニスト（レセプターの生理的リガンド結合部位に結合するが、リガンド様の活性を示さない物質）及びインバースァゴニスト（レセプターのいずれかの部位に結合してそのコンフオメーシヨンを変化させ、レセプターを不活性化する物質）をも包含するものとする。

例えば、 LPA作動 GPCRのァゴニストについては、 Biochimica et Biophysica Ac ta, 1582, 289-294 (2002)等に記載されている。具体的には、生理活性リガンドである以下の式（1) ：

で表される LPA (LPA (18:1) ) の他、式（2)

(式中、 R¹ は、炭素数 8〜 20の直鎖アルキル基、又は炭素数 8〜 20で、 1〜 4の二重結合を有する直鎖アルケニル基を表す。）

で表される一連の化合物がァゴニスト活性を有する LPA類として知られている。具体的には、 LPA(18:2)、 LPA (18 : 3) 、 LPA (20 : 4) 、 LPA(12:0)、 LPA(14:0)、 LPA (16:0)又は LPA (18:0) 等が挙げられる。ここで、括弧内の最初の整数は LPAにおいて脂肪酸部分におけるアルキル基もしくはアルケニル基の総炭素数を表し、 2番目の整数は二重結合の数を表す。尚、式（1 ) 及び式（2 ) において、グリセリン骨格における不斉炭素原子の立体配置は、好ましくは R体を表す。

また、式（3 ) ：

で表される D0XP - 0Hなども、 LPA作動 GPCRのァゴュストとして挙げられる（Biochimi ca et Biophysics Acta, 1582， 309-317 (2002) ) 。

また、式（5 ) ：

で表され > 9 (Z) - Octadecenoic acid 2-methoxy-3- (thiophosphonooxy) propyl este r (LXR-1035) 又は 9 (Z) - Octadecenoic acid 2 (S) -methoxy-3- (thiophosphonooxy) p ropyl ester (2 (s) -0MPT) 等の EDG7ァゴニス卜が挙げられる（J Biol Chem 2003， 278 (14)： 11962、 J Med Chem 2003, 46 (26)： 5575、国際公開パンフレツト： W098/ 41213及び W099/47101を参照）。

「 LPA作動 GPCR拮抗剤」とは、 LPA作動 GPCRに結合して該レセプターの活性を抑制する物質（アンタゴニスト又はインバースァゴニスト）の総称として用いられ、 LP A作動 GPCRに対するアンタゴニスト活性又はインバースァゴニスト活性を有する公知及び新規のあらゆる化合物を包含する。

LPA作動 GPCRのアンタゴニストとしては、式（6 ) ： 0

で表されるジァシルグリセロールリン酸（DGPP8:0) が挙げられ、該化合物は EDG7 (LPA₃とも呼ばれる）の選択的なアンタゴニストであり、 EDGSO Ai とも呼ばれる )のアンタゴニスト活性も有する（D.J.Fischerら著、 Mol. Pharmacol. , 60， 776-7 84 (2001)) 。

また、 LPA作動 GPCRのアンタゴニストとして、式（7) ：

で表されるベンジル一 4—ォキシベンジル N-ァシルエタノールアミドリン酸（ VPC12249)が挙げられ、該化合物は EDG2及び EDG7の選択的なアンタゴニストである (C. E.Heise著、 MolecularMol. Pharmacol. , 60， 1173-1180 (2001)) 。

また、国際公開第 02/29001号パンフレツト 35頁〜 39頁に記載の LPAレセプターァンタゴニストも又本発明の LPA作動 GPCRのアンタゴニストとして用いることができる。具体的には、式（8) ：

[式中、 R ^{1 a}は置換もしくは無置換の C8- 22アルキル又は置換もしくは無置換の C 8- 22アルケニルを表し、 R^{2 a}及び R^{3 a}は独立して、水素原子又は式：

〔式中、 R^{6 a} は C3-16アルキル、 C3-16アルケニノレ、 -(C1- 4アルキル）- R^7a、 -（C2- 4アルケニル)- R^7a又は-（C2-4アルキニル) -R^7aを表し、 R^7aは式： 14a R15S

(式中 R^14a及び R^{l 5a}は独立して、水素原子、 C1- 12アルキル、 C2- 6アルケニル、 C2- 6アルキニル又はハロゲン原子を表す。）

を表す。〕

を表し（但し R^{2 a} 及び R^{3 a} が共に水素原子を表すことはない。）、 R^{4 a}は水酸基、 - 0P0₃H (ホスフェート基）又は- CH₂P0₃H (メチレンホスホネート基）を表すで表される化学構造を有し、 LPA作動 GPCR拮抗活性を有する化合物が挙げられ、下

3a 3a

で表される化合物を例示することができる。ここで、上記の式（8) における C8-2 2アルキル及び C8-22アルケニルの置換基としては、それぞれ C1- 10アルキル、 C1- 20 アルコキシ、 C1- 20アルキルチオもしくは C1-20アルキルァミノで置換されていてもよい、 C3-10シクロアルキル、 C3- 15ビシクロアルキル、 C5- 10ヘテロ環基又はフエ二ノレ基が挙げられる。また、 3- [4_ (Benzyloxy) phenyl] - 2 (S) - [9 (Z) -octadecenamid o] - 3 - oxopropyl dihydrogen phosphate (VPC - 32104) . 、 3- [4- (Benzyloxy) phenyl] - 2 (R) - [9 (Z) -octadecenamido] -3-oxopropyl dihydrogen phosphate (VPC - 32163) 、 2 (S) - [0ctadec-9 (Z) -enoylamino] - 3 - [4- (pyridin- 3 - ylmethoxy) phenyl] propyl dih ydrogen phosphate (VPC- 31226) 等を例示することもできる。

また、国際公開第 01/60819号パンフレツトに記載されているリゾフォスファチジン酸（LPA) 受容体拮抗薬（EDG2、 7拮抗薬）も又本発明の LPA作動 GPCRのアンタゴ二ストとして用いることができる。例えば、式（9 ) ：

[式中、 Xは酸素原子もしくは硫黄原子を表し；

R^{l b}は、ハロゲン原子、又はそれぞれ置換基を有していてもよいアルキル基、ァリール基、複素環式基、アルキルォキシ基、ァリールォキシ基、アルキルチオ基もしくはァリ一ルチオ基を表し；

R^{2 b}は、ハロゲン原子、又はそれぞれ置換基を有していてもよい、アルキル基、ァリール基、複素環式基、アルキルォキシ基もしくはァリールォキシ基を表し； R^{3 b}は、水素原子、低級アルキル基又はハロゲン化アルキル基を表し；

R^{4 b}は、それぞれ置換基を有していてもよい、ァリール基、複素環式基、アルキル基もしくはアルケニル基を表し；

但し、 R^{3 b}と R^{4 b}は、それらが結合している炭素原子と一緒になって 5〜 1 0員環構造を形成してもよい。 ]

具体的な R^{l b}としてはハロゲン原子、又はそれぞれ置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数 1〜 4のアルキル基が挙げられ、具体的な R^{2 b}としては、それぞれ置換基を有していてもよいフエニル基、 2-チェニル基、 3-チェニル基、 2-フリル基、 3-フリル基、 4-ピリジル基炭素数 1〜4のアルキル基又は炭素数 2〜 5のアルケニル基が挙げられ、具体的な R^{3 b}としては水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基又は炭素数 1〜4の 1〜5のハロゲン原子を有するハロアルキル基が挙げられ、具体的な R^{4 b}としてはそれぞれ置換基を有していてもよい 2-フリル基、 3-フリル基、 2-チェニル基、 3-チェニル基又はフエエル基が挙げられる。

具体的には、式（1 0 ) ：

(式中、 R^{2 b}は炭素数 1〜4のアルキル基を表し、 R^{3 b}は水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基又はトリフルォロメチル基を表し、 R^{5 b}はハロゲン原子、ニトロ基、炭素数 1〜4のアルキル基、炭素数 1〜4のアルコキシ基、トリフルォロメチル基、トリフルォロメトキシ基又はヒドロキシメチル基を表し、 R^{6 b}は水素原子又はハロゲン原子を表す。）

で表される化合物や、式（1 1 ) ：

[式中、 R^{l b}はハロゲン原子、炭素数 1〜4のアルコキシ基で置換されていてもよい炭素数 1〜4のアルキル基を表し、 R^{2 b}はチェニル基、炭素数 1〜4のアルキル基もしくはハロゲン原子で置換されたチェニル基、フリル基、炭素数 1〜4のアルキル基もしくはハロゲン原子で置換されたフリル基、ピリジル基、炭素数 1〜4のァルキル基もしくはハロゲン原子で置換されたピリジル基、フエニル基、以下の置換基群から選択される基で置換されたフエニル基 [置換基群：炭素数 1〜4のアルキル基、炭素数 1〜4のアルコキシ基、炭素数 1〜4のハロアルキル基、炭素数 1〜 4のハロアルコキシ基、ニトロ基、シァノ基、ハロゲン原子、 -CH₂-モルホリノ、 - CH₂0Ph、 - CH₂0CH₂-フリル、 _CH₂0R^8b、 - CH₂0 (CH₂ ) _n C00R^{8 b}、 -CH₂0 (CH₂ ) _n CONHR^{8 b} 、一 CH₂0C0R^9b、 -CH₂0(CH₂)_nS0₃H、 - CH₂0 (CH₂ ) _n OR^{8 b}、 — CH₂0 (CH₂ ) _n NHCOR^{9 b}、 — CH₂SPh 、 -CH₂SCH₂Ph、 - CH₂SCH₂-フリル、 -CH₂SR^8b、 - CH₂ S (CH₂ ) _n C00R^{8 b}、 -CH₂ S (CH₂ ) _n CON HR^8b、 - CH₂SC0R^9b、 _CH₂S(CH₂)_nS0₃H、 - CH₂ S (CH₂ ) _n OR^{8 b}、 - CH₂ S (CH₂ ) _n NHCOR^{9 b} (ここで ^bは水素原子、炭素数 1〜 4のアルキル基又は炭素数 2〜 4のアルケニル基を表し、 R^9bは炭素数 1〜4のアルキル基を表し、 nは 1〜5の整数を表す。） ] を表し、 R^3bは水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、炭素数 2〜4のアルケニル基又はトリフルォロメチル基を表し、 R^{6 b}は水素原子又はハロゲン原子を表す。 ] で表される化合物が挙げられる。より具体的には、式（1 2) ：

で表される KI-16425を例示することができる。

また、国際公開第 01/71022号パンフレットに開示されている、式（1 3) ： X³

Q¹C CH一 CQ² (¹³)

X¹ X²

[式中、 X¹、 X²及び X³の少なくとも一つが（H0)₂P0- Z¹-又は（H0)₂P0- Z²_P(0H)0-Z にを表すか X¹及び X²が一緒になって -0-P0 (0H) -0-を形成していているか又は X¹及び X³がー緒になつて- 0-P0 (0H) - NH-を形成しており； X¹、 X²及び X³の少なくとも一つが同一もしくは異なって RL -Y¹ - A-を表すか X²及び X

³ が一緒になつて- NH-CO- NR¹ -を形成しており；

X¹、 X²及び X³の一つは水素原子を表していてもよく；

Aは結合、酸素原子又は- (CH₂ )。_ ₃。-を表し；

Y¹は酸素原子、硫黄原子、 _C0-、 -NR² -, 又は-

。-を表し；

Z¹は酸素原子、硫黄原子、 -NH -、 - CH (R³ ) -、 - (CH^ ₅。-又は- 0- (CH₂ )い ₅。-を表し

Z²は酸素原子、 - ((^ 。-、又は- (HCH^ ₅。-を表し；

Q¹及びは独立して、 H₂、 =NR⁴、 =0、または水素原子と- NR⁵ R⁶の組合せを表し； X¹、 X²、 X³における R¹は独立して水素原子、直鎖もしくは分枝の C1-30アルキル、直鎖もしくは分枝の C2- 30アルケニル、 1〜3の置換基を有していてもよい芳香族炭素環もしくは芳香族へテロ環、 C1-30アルキル、芳香族炭素環もしくは芳香族へテロ環を含むァシル基、直鎖もしくは分枝の C1-30アルキルを含むァリールアルキル、直鎖もしくは分枝の C1-30アルキルを含むァリールォキシアルキル、 - CH=NH、 - C0NHR⁷ . -CSNHR⁷、 - C00R⁷、 _C (=NR⁸ ) NHR⁷、式：

H

または、

H

を表し；

R²、 R\ R\ R⁵、 R⁶、 R⁷及び R⁸は独立して水素原子、直鎖もしくは分枝の C1-30ァルキル、直鎖もしくは分枝の C2- 30アルケニル、 1〜3の置換基を有していてもよい芳香族炭素環もしくは芳香族へテロ環、芳香族炭素環もしくは芳香族へテロ環を含むァシル基、直鎖もしくは分枝の C1- 30アルキルを含むァリールアルキル、直鎖もしくは分枝の C1- 30アルキルを含むァリールォキシアルキルを表す。 ] で表される化学構造を有し、かつ LPA作動 GPCR拮抗活性を有する化合物も又本発明の LPA作動 GPCR拮抗剤の範疇である。

また、国際公開第 2004/31118号パンフレツトに開示された EDG2アンタゴニストもまた、本発明における LPA作動 GPCR拮抗剤に含まれる。例えば、式（I-A) ：

〔式中、 R R²、 R³及びは、独立して、 C1- 8アルキル基、 C2-8ァルケ-ル基、 C2- 8アルキニル基、ハロゲン原子、トリハロメチル基、エトロ基、シァノ基、 C1- 8ァノレコキシ基、 C1- 8アルキルチオ基、アミノ基、 C1- 8アルキルアミノ基、ジ- C1- 8ァルキルアミノ基、アミド基、スルファモイル基、 C1- 8アルキルスルホニル基、 C2-8 ァシル基、 C1- 8アルコキシカルボニル基、または C1-8アルコキシ基、 C1-8アルキルチォ基、アミノ基、 C1- 8アルキルアミノ基もしくはジ- C1 - 8アルキルアミノ基で置換された C1- 8アルキル基を表し、 R⁵は水素原子、 C1- 8アルキル基、 C2-8アルケニル基、または C2- 8アルキニル基を表し、環 A、 B及び Dは独立して、 C3- 10の単環又は二環式炭素環又は酸素原子、窒素原子及び硫黄原子から任意に選択される 1〜5個のヘテロ原子を含む 3— 1 0員の単環又は二環式複素環を表し、環 Eは C3- 7の単環式炭素環又は酸素原子、窒素原子及び硫黄原子から任意に選択される 1 -5個のへテロ原子を含む 3- 7員の単環式複素環を表し、 p、 q、 r及び sは独立して 0又は 1一 5の整数を表し（ただし、 p、 q、 r及び/ /又は sが 2以上であるとき、、 R²、 R ³及び/又は R⁴はそれぞれ同一もしくは異なっていてもよい）、 tは 0又は 1を表す。〕

で表される化合物が挙げられる。具体的には、式（1 4 ) ：

で表される 2— [4- [N- (3, 5-Dimethoxybenzoyl)一 N— (3-phenylpropyl) aminomethyl] phe noxvjbenzoic acid、式 (1 5ノ：

で表される 2— [4，— [N- (3-Phenylpropyl) -N— (3， 4, 5-trimethoxybenzoyl) aminomethyl

]biphenyi— 2— y丄」 acetic acid、式、丄 o) ：

で表される 2— L4- [N - (3， 5-Dimethoxy-4-methylbenzoyl)一 N - (3-phenylpropyl) aminom eth i]phenyijacetic acid、式 (1 7) ：

で表される 2 - [4- [5 - Phenyl - 2 - (3， 4, 5-trimethoxybenzoyl) pentylj henoxy] benzoic acidを、例示することができる。 8 また、 Molecular Pharmacology, 50， 616-623 (1996)に記載されている、式（ 8 ) ：

で表される Ν-パルミトイルー L-セリンホスホリックアシッド（NP- Ser-PA) 及び式 ( 1 9 ) ：

で表される N-パルミトイル-チ口シンホスホリックアシッド（NP- Tyr- PA) 、またはスラミン（suramin) も又本発明の LPA作動 GPCR拮抗剤の範疇である。

本明細書において、「LPA産生酵素阻害剤」とは、 LPAの生合成酵素阻害薬を表す。具体的には、ホスファチジン酸を LPAに変換する酵素 [ホスホリパーゼ A (A1，A2 ) ] の阻害剤を表す。該阻害剤としては、 6-クロ口- 9- [ [4- (ジェチルァミノ） - 1- メチルプチル]ァミノ] -2-メトキシァクリジン 2塩酸塩（Mepacrine hydrochlori de) 、 2-ヒドロキシ -3 - [2-ヒドロキシ -3- [4-メチル- 6- (2, 6, 6-トリメチル- 1-シク口へキセニノレ） - 3 (E) -へキセニル] - 2H-5, 6-ジヒドロピラン- 6-ィノレ]フラン- 5 (2H) - オン（Manoalide ； Drugs Fut.， 1990, 15 (5) : 460 ;Mol. Pharmacol. , 1989, 36 (5) : 782-788) 、 Ν- [2- (ェチルスルフォンアミド）- 5- (トリフルォロメチル）ピリジン- 3-ィノレ]シクロへキサンカルボキサミドナトリウム塩（IS-741) 、 3-[1- [2 (Ζ) _カルボキシ -1-メチルビュル] - 4-メチル -6- (2， 6， 6-トリメチノレ- 1-シク口へキセニル） - 1 ( E) , 3 (E) , 5 (E) -へキサトリエニル]ベンゾイツクアシッド（BMS-181162 ； Biohem. Biophys. Res. Commun. , 1992, 189 (1) : 272)、 BMS- 188184、 S-3013、 LY- 333013等を例示することができる。

尚、上記 LPA作動 GPCR活性抑制剤として例示された化合物は適宜薬学上許容される塩、水和物等の溶媒和物等を形成していてもよい。

LPA作動 GPCR活性抑制剤は投与された動物において、血中に存在する LPAによって亢進されている血糖値の上昇を抑制する作用を有する。更に LPA作動 GPCR活性抑制剤は、 LPAの作用のみを阻害するため、低血糖を引き起こすことがなく、安全な耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬として有効である。 LPA作動 GPCR活性抑制剤は膝臓に作用し、 LPAにより阻害されるインシュリンの分泌を回復させることを特徴とする。

LPA作動 GPCR活性抑制剤は、医薬上許容される担体とともに経口的もしくは非経口的投与に適した剤形に製剤化される。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセル口ース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、ァラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、力ルボキシメチ 4/セルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム一グリコールースターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クェン酸、メントール、グリシルリシン ' アンモニゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリゥム、亜硫酸水素ナトリゥム、メチルバラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビエルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の LPA作動 GPCR活性抑制剤を溶解させた液剤、有効量の LPA作動 GPCR活性抑制剤を固体や顆粒として含んでいるカプセノレ剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の LPA作動 GPCR活性抑制剤を懸濁させた懸濁液剤、有効量の LPA作動 GP CR活性抑制剤を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。ここで「有効量」とは、 LPA作動 GPCR活性抑制剤を耐糖能異常患者、糖尿病患者または他の生活習慣病患者の治療のために使用する場合にそれぞれの疾患を改善させるのに十分な量をいう。

非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。

当該 LPA作動 GPCR活性抑制剤の製剤は、ァンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、 LPA作動 GPCR活性抑制剤、及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。

LPA作動 GPCR活性抑制剤を有効成分とする本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、 LPA作動 GPCR活性抑制剤を、例えば、成人 1日あたり約 0 . 0 1〜約 1 0 0 0 m g Z k g、好ましくは約 0 . 1〜約 5 0 0 m g k g投与することができる。

本発明はまた、 LPA作動 GPCR拮抗剤もしくは LPA産生酵素阻害剤等の LPA作動 GPCR 活性抑制剤のスクリーニング系及びそれを用いた耐糖能異常改善薬のスクリーニング方法を提供する。

本発明の、スクリーニング方法の第一の態様は、 LPA作動 GPCR又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させる工程、及び該レセプタ一又はそのフラグメントに結合する化合物を選択する工程を含む。被験試料としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。被験試料は好ましくは分子量 2 0 0 〜2 0 0 0の化合物であり、更に好ましくは分子量 3 0 0〜8 0 0の化合物である。被験試料との結合活性は、例えば、 LPA作動 GPCR又はそのフラグメントを発現する細胞膜画分をチップ上に固定し、該チップ上に被験試料溶液をロードして、表面プラズモン共鳴法により被験試料の膜への結合及び解離を測定し、結合及び解離の速度あるいは結合量から、被験試料と LPA作動 GPCRとの親和性を算出することにより導かれる。本発明のスクリーニング方法の第二の態様は、被験試料の存在下及び非存在下で、 LPA作動 GPCR又はリガンドが結合し得るそのフラグメントにリガンドを接触させ、該レセプター又はそのフラグメントとリガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む。リガンドとしては、 LPA作動 GPCRの生理的リガンドである LPA等を用いることができる。 LPAをリガンドとして用いた場合、例えば LPA作動 GPCRに対する結合活性が、 LPAよりも強い被験試料を LPA作動 GPCR拮抗剤候補物質として選択することができる。該候補物質が LPA作動 GPCR拮抗剤であることは、以下に述べる G蛋白質を用いるスクリーニング方法等により確認することができる。

上記のいずれの態様においても、 LPA作動 GPCR又はそのフラグメントは、それらの発現細胞、該細胞の細胞膜画分、あるいはァフィ二ティーカラムに結合した形態で提供され得る。 LPA作動 GPCRの発現細胞としては、 LPA作動 GPCR又はそのフラグメントをコードする D N Aを含む発現ベクターでトランスフエクトされた細胞等が挙げられる。また、ァフィ二ティーカラムとしては、抗 LPA作動 GPCR抗体カラム、リガンドを用いたカラム、また、 LPA作動 GPCRが組換えタンパク質として提供される場合、 Hisタグや GSTタグと特異的親和性を有する金属キレートもしくはダルタチォンカラムを用いることができる。

LPA作動 GPCRまたはそのフラグメントとリガンドとの結合活性の検出する方法としては、例えば、リガンド量を検出する方法、またはリガンドを標識して、 LPA作動 GPCRまたはそのフラグメントに結合した標識されたリガンドの量を測定する方法が挙げられる。

リガンドの標識方法としては、蛍光標識でラベルする方法や 3H、 14C、 32P及び 33 P等の放射性同位元素で標識する方法等が挙げられる。具体的には、脂肪酸部分の水素原子が 3Hでラベルされた LPAまたはリン原子が 32Pでラベルされた LPA等を用レ、ることができ、例えば、 32P- labelled LPA、及び 1-ォレオイル [ォレオイル- 9, 10- ³ H] LPA (1- OleoyUoleoyl- 9, 10- ³ H] LPA；画 Life Science Products市販品； Song zhu An, et al J Biol Chem, Vol. 273， Issue 14， 7906—7910， April 3, 1998)を用いることができる。

LPA作動 GPCRは、ある種の三量体 G蛋白質と共役して細胞内にシグナルを伝達する。従って、本発明はまた、 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層と、 LPA作動 GPCRと共役する G蛋白質（特に G aサブユニット）とを用いた LPA作動 GPCR拮抗剤のスクリーユング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、 G aにおける GT P - G D P交換反応または共役する G蛋白質の細胞刺激活性を指標として行われる。 G蛋白質の細胞刺激活性を指標とする場合、共役させる G _aの態様に応じて、エフュクターの選択や活性測定方法等の具体的な手順が決定されるが、通常、アデ二ル酸シクラーゼと相互作用する領域を含む Gひ（具体的には G iフアミリーに属する Gひのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えば c AMP量を測定することにより、ホスホリパーゼ C 3と相互作用する領域を含む G a (具体的には G qフアミリーに属する Gひのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えば細胞内カルシウムイオンの量を測定することにより、 LPA作動 GPCR拮抗剤をスクリーニングすることができる。

また、 G e の供給源として該 G aを含む三量体 G蛋白質（G a j3 i ) を内因的に発現する動物細胞（例えば、 HEK 2 9 3細胞、 L 1. 2細胞等）を用いる場合、 LPA作動 GPCRによって活性化された G α ]3 γは G aと G /3 γに解離するが、遊離の G β "/はホスホリパーゼ C ]3に相互作用して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ得るので、共役する G aのファミリーに関係なく細胞内カルシウムイオンを指標にして LPA作動 GPCR拮抗剤のスクリーニングを行うことも可能である。

ここで、「LPA作動 GPCR」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来の LPA作動 GPCR、及びそれらのアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたァミノ酸配列からなり、天然 LPA作動 GPCRと同じリガンドーレセプター相互作用を示し、且つ共役する G e を活性化して該 G aの GD P · GT P交換反応を促進する活性を有するタンパク質をいう。

具体的には、ヒト及び他の哺乳動物由来の「EDG2」、「EDG4」及び「EDG7」、並びに、それらのアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり天然 LPA作動 GPCRと同じリガンド一レセプター相互作用を示し、且つ共役する G aを活性化して該 Gひの G D P · G T P交換反応を促進する活性を有するタンパク質を挙げることができる。

前記「EDG2」は、ヒト及び他の動物由来の EDG2、又はそのフラグメントをコードする DN Aを含む発現ベクターでトランスフエクトされた細胞の膜含有画分から、抗 EDG2抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来の c D N Aライブラリーもしくはゲノミックライブラリ一から、 EDG2の c D N Aクローンをプローブとして単離される D N Aクローンを適当な発現ベクター中にクローユングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗 EDG2抗体や、 His- tag、 GST- tag等を用いたァフィ二ティーク口マトグラフィ一により精製することもできる。また、 GFP等の蛍光物質と EDG2の融合蛋白質を発現させることにより、 GFP陽性細胞、すなわち EDG2がトランスフエクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Xu et al. , Nat. Cell Biol.， 2， 261-267 (2000) )。また、 EDG2の c D N Aクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであつてもよレ、。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者は EDG2の特性を変化させない範囲で、 EDG2に適宜変異を導入することができる。

また、前記「EDG4J は、ヒト及び他の動物由来の EDG4、又はそのフラグメントをコードする D N Aを含む発現ベクターでトランスフエクトされた細胞の JI莫含有画分から、抗 EDG4抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来の c D N Aライブラリーもしくはゲノミツクラィブラリーから、 EDG4の c D N Aクローンをプローブとして単離される D N Aクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗 EDG4抗体や、 His-tag、 GST- tag等を用いたァフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、 GFP等の蛍光物質と E DG4の融合蛋白質を発現させることにより、 GFP陽性細胞、すなわち EDG4がトランスフエクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Xu et al. , Nat. Cell Biol. , 2, 261—267 (2000) )。また、 EDG4の c D NAクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的ァミノ酸置換は周知であり、当業者は EDG4の特性を変化させない範囲で、 EDG4に適宜変異を導入することができる。

また、前記「EDG7J は、ヒト及び他の動物由来の EDG7、又はそのフラグメントをコ一ドする D N Aを含む発現べクターでトランスフエクトされた細胞の膜含有画分から、抗 EDG7抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来の c D N Aライブラリーもしくはゲノミツクラィブラリ一から、 EDG7の c D N Aクローンをプローブとして単離される D N Aク口ーンを適当な発現ベクター中にクローユングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗 EDG7抗体や、 His- tag、 GST- tag等を用いたァフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、 GFP等の蛍光物質と E DG7の融合蛋白質を発現させることにより、 GFP陽性細胞、すなわち EDG7がトランスフエクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Xu et al. , Nat. Cell Biol.， 2, 261-267 (2000) )。また、 EDG7の c D NAクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。し力しな力 Sら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的ァミノ酸置換は周知であり、当業者は EDG7の特性を変化させない範囲で、 EDG7に適宜変異を導入することができる。

LPA作動 GPCRを保持する脂質二重層膜の由来は、当該レセプタ一が本来の立体構造をとることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ゥシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。また、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞の細胞膜におけるそれに近レ、比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。

LPA作動 GPCRと共役する G aは、少なくとも該 G αの G P C Rとの結合に関与する領域及び任意の G αのグァニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を有することが必要である。例えば、 LPA作動 GPCRと共役する G aが G i ファミリーに属する場合（G i α ) には、用いる G aは G i αの G P C R結合領域を少なくとも有し、 G i cのグァニンヌクレオチド結合領域もしくは他のフアミリーに属する Ga由来のグァニンヌクレオチド結合領域を有するものである。の X線結晶構造解析の結果等から、 GPCRとの結合には C末端の約 5アミノ酸程度の配列が重要であり、一方、グァニンヌクレオチド結合領域は、 r a s蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（N末端側から、 Pボックス、 G 'ボックス、 Gボックス、 G〃ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内のひ E ヘリッタスの先頭及び a Fヘリックスなど）であることが明らかになつている。

LPA作動 GPCRに対する生理的リガンド、すなわちァゴニストが該レセプターに結合すると、該レセプターの Ga活性化ドメインと Gaの GPC R結合領域とが相互作用して Gaのコンフオメーシヨン変化を生じ、グァニンヌクレオチド結合領域から GDPが解離して速やかに GTPを結合する。一方、インバースァゴニストが結合すると、レセプターのコンフオメーション変化により Gひ活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型の Ga— GTPレベルが減少する。ここで、 GTPの代わりに 35S標識した GTP γ Sなどの Gaの GTP a s e活性によって加水分解を受けない GTPアナログを系に添加しておけば、被験試料の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定 ·比較することにより、 LPA作動 GPCRのァゴニスト又はインバースァゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で放射活性が増加すれば、該被験試料はァゴニストであり、放射活性が減少すればインバースァゴニストである。 35S標識した GTP y S (GTP [y³⁵ S] ) を用いる方法については、 Heise et al. , olecular Pharmacology, 60， 1173-118 0 (2001)、又は Im et al. , Molecular Pharmacology, 57, 753-759 (2000)に記載されている。

また、生理活性リガンド（例えば LPA)を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定 ·比較することにより、 LPA作動 GPCRのァンタゴ二ストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で、被験試料の非存在下よりも放射活性が減少すれば、該被験試料はアンタゴニストである。

あるいは、 Gaへの GTPアナログの結合を表面プラズモン共鳴法等を用いてモニタリングすることによつてもスクリーニングが可能である。 LPA作動 GPCR拮抗剤の活性は、共役する Gひのェフエクタ一への作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、 LPA作動 GPCR に加えて、さらにエフェクターを含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、共役する G aは該エフェクターと相互作用するための領域をさらに含む必要がある。当該領域はその G et本来のエフヱクタ一相互作用領域であってもよいし、異なるフアミリーに属する G αのエフェクター相互作用領域であってもよい。例えば G i αに対しては異なるファミリーに属する G aとして G q α、 G s ひ、 G 1 2 α等が挙げられ、 G q αに対しては異なるフアミリーに属する Gひとして G i α、 G s a、 G 1 2 α等が挙げられる。異なるファミリーに属する G α (例えば G q a) のエフェクター相互作用領域を含む G a (例えば G i ct) キメラの最も簡便な例としては、 G q αの C末端の約 5アミノ酸程度を、 G i aの C末端配列で置換したもの（G q i α) が挙げられる。

LPA作動 GPCRと共役する G aが G i αのエフェクター相互作用領域を含む場合、エフェクターとしてアデ二ル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられる。一方、共役 G aが G q ひのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてホスホリパーゼを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。尚、共役 G aが G s ひのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてアデ-ル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられ、 G i ひの場合とは逆に、アデニル酸シクラーゼ活性の促進作用を指標としてリガンド活性が評価される。

エフェクターとしてアデ二ル酸シクラーゼ（以下、 ACともいう）を含むスクリ一ユング系においては、 G aのェフエクタ一^ ·の作用は、 AC活性を直接測定することにより評価することができる。 AC活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、 ACを含む膜画分に AT Pを添カ卩し、生成する c AM P量を、抗 c AMP抗体を用いて R I (125 I ) 、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等）、蛍光物質（F I T C、ローダミン等）等で標識した c AMPとの競合ィムノアッセィにより測定する方法や、 ACを含む膜画分に [ひ- 32P] AT Pを添加し、生成する [32 P] c AMPをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、これに限定されない。が G i aの場合、被験試料の存在下及び非存在下で AC活性を測定。比較し、被験試料存在下で AC活性が増加すれば被験試料は LPA作動 GPCRのィンバースァゴニストであり、活性が減少すればァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA)を共存させた系で、被験試料の存在下及び非存在下で AC活性を測定 ·比較し、被験試料存在下で被験試料非存在下よりも AC活性が増加すれば被験試料は LPA作動 GPCRのアンタゴニストである。

一方、 0(¾が03 «の場合、被験試料の存在下及び非存在下で AC活性.を測定 - 比較し、被験試料存在下で A C活性が減少すれば被験試料は LPA作動 GPCRのィンバースァゴニストであり、活性が増加すればァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA)を共存させた系で、被験試料の存在下及び非存在下で AC活性を測定 ·比較し、被験試料存在下で被験試料非存在下よりも AC活性が減少すれば被験試料は LPA作動 GPCRのアンタゴニストである。

スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、 Gaの ACへの作用は、細胞内の cAM P量を測定するか、あるいは細胞を [3H] アデニンで標識し、生成した [3H] c AMPの放射活性を測定することによつても評価することができる。細胞内 c AM P量は、被験試料の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合ィムノァッセィを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。

別の態様として、 c AMP量を cAM P応答エレメント（CRE) の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、 CREを含むプ口モーターの下流にリポーター蛋白質をコードする DNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された動物細胞を、被験試料の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定 ·比較することにより、細胞内 c AMP量を評価するというものである。

従って、 Gaが G i αの場合、被験試料の存在下で細胞内 c AM Ρ量（もしくは CRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験試料は LPA 作動 GPCRのインバースァゴニストであり、減少すればァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での c AMP量を測定.比較することにより、 L P A作動 G PC Rのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりも c AMP量が増加すれば該被験試料はアンタゴニストである。一方、 Gaが G sひの場合、被験試料の存在下で細胞内 cAM P (もしくは CRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験試料は LPA作動 GPCRのインバースァゴ二ストであり、増加すればァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での c AMP量を測定 •比較することにより、 L P A作動 G PC Rのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりも CAM Pi が減少すれば該被験試料はァンタゴ二ストである。

一方、エフェクターとしてホスホリパーゼ C ]3 (以下、 PLC 3ともいう）を含むスクリーニング系（即ち、 Gaが Gq αであるか又は Gq αのエフェクター相互作用領域を含むキメラ蛋白質（キメラ Gq c ) の場合）においては、該 Gq a又はキメラ Gq aのェフエクタ一^ ·の作用は、 P L C ]3活性を直接測定することにより評価することができる。 PLC /3活性は、例えば、 3H標識したホスファチジルイノシトール一 4, 5—二リン酸を PLC 含有膜画分に添カ卩し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験試料の存在下及び非存在下で P L C ]3活性を測定 ·比較し、被験試料存在下で P LC ^活性が増加すれば該被験試料は LPA作動 GPCRのァゴニストであり、活性が減少すればインバースァゴニストである。また、生理活性リガンド (例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での P LC 活性を測定 ·比較することにより、 LP Α作動 GPCRのアンタゴニストをスクリーユングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりも活性が減少すれば該被験試料はアンタゴニストである。

スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、 G q c又はキメラ G q αの P LC ]3への作用は、細胞に [3Η] イノシトールを添加し、生成した [3Η ] イノシトーノレリン酸の放射活性を測定したり、細胞内の C a 2+量を測定することによっても評価することができる。細胞内 C a2+量は、被験試料の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（fura-2、 indo- 1、 fluor-3, Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるェクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、 FLIPR (Molecular Devices社）システムが挙げられる。

別の態様として、 C a ^{2 +}によりアップレギュレートされる T P A (12— O—テトラデカノィルホルボール一 I³—アセテート）応答エレメント（T R E ) の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、 C a 2+量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、 T R Eを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードする D NAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験試料の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破碎して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定 ·比較することにより、細胞内 C a 2+量を評価するというものである。

従って、被験試料の存在下で細胞内 C a ^{2 +}量（もしくは T R E制御下にあるリポ一ター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験試料は LPA作動 GPCRのァゴニストであり、減少すればィンバースァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えばし PA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での P L C /3活性を測定 '比較することにより、 L P A作動 G P C Rのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりも細胞内 C a ^{2 +}量が減少すれば該被験試料はアンタゴニストである。

一方、 LPA作動 GPCRが EDG2又は EDG4である場合、該 GPCRは G α 12/13により活性化され得る。そして G a l2/13と _P115RhoGEFが結合することによって、 Rhoが不活性型の GDP結合型から活性型の GTP結合型に変換される。 GTP結合型 Rhoはエフェクターである Rho-キナーゼと結合し、下流へとシグナルが伝達される。すなわち、 G o^S G α 12/13であるか又は G α 12/13の _P115RhoGEFとの相互作用領域を含むキメラ G α 12 八 3の場合、例えば、組み換え GST付加 ROCK (Rho-キナーゼ）に結合する Rhoファミリ一に属する蛋白質、例えば RhoAを、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる（Onno et al.， Molecular Biology of the Cell. , 10, 1851-1857 (1999) ) 。被験試料の存在下及び非存在下で ROCKに結合する RhoA量を測定'比較し、被験試料存在下で ROCKに結合する RhoA量が増加すれば該被験試料は LPA作動 GPC Rのァゴニストであり、活性が減少すればインバースァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下及び非存在下で ROCKに結合する RhoA量を測定 ·比較し、被験試料存在下で被験試料非存在下よりも ROCKに結合する RhoA量が減少すれば被験試料は LPA作動 GPCRのアンタゴニストである。

上記の LPA作動 GPCRと共役 G aとを用いた LPA作動 GPCRリガンドのスクリーニング方法を、 LPA作動 GPCRに対するリガンド、例えば、 LPA等の共存下で行えば、さらに LPA作動 GPCRに対するニュートラルアンタゴニストを容易に選抜することができるまた、別の態様として、 LPA作動 GPCR依存的な種々の生理作用を指標として、 LPA 作動 GPCR拮抗剤をスクリ一二ングすることも可能である。該生理作用としては、 MA Pキナーゼの一種である ERKの活性化が挙げられる。具体的には、 LPA作動 GPCRの存在下に、被験試料が ERKのリン酸化を促進するか否かを、リン酸化 ERK量をゥエスタンブロッテイング等で検出することによって測定する方法（I shi i et al. , Mol. Ph armacol. 58, 895-902 (2000) ) が挙げられる。

従って、被験試料の存在下でリン酸化 ERK量が増加すれば、該被験試料は LPA作動 GPCRのァゴニストであり、減少すればインバースァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下でのリン酸化 ERK量を測定 ·比較することにより、 L P A作動 G P C Rのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりもリン酸化 ERK量が減少すれば該被験試料はアンタゴニストである。

また、天然リガンドである LPAもしくは LPA作動 GPCRァゴニストの存在もしくは非存在下に、被験試料が LPA作動 GPCR依存的な DNA合成促進活性（細胞増殖促進活性）を抑制するか否かを測定することによって、 LPA作動 GPCRリガンドをスクリーニングする方法が挙げられる。

具体的には、 NIH3T3等の細胞の細胞数を計測する方法、または RH7777等の細胞における [3H]チミジンもしくは BrdUの取り込み量を測定する方法を用いることができる (Fischer et al.， Molecular Pharmacology, 60， 776-784 (2001)； Fukusima e t al. , Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. , 95, 6151〜6156，（1998) ; Laychock S - R ubin RP編、 Lipid Second Messengers, CRC Press, Washington DC)。

従って、被験試料の存在下で [3H]チミジンもしくは BrdUの取り込み量が増加すれば、該被験試料は LPA作動 GPCRのァゴニストであり、減少すればィンバースァゴニストである。また、生理活性リガンド（例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での [3H]チミジンもしくは BrdUの取り込み量を測定 ·比較することにより、 L P A作動 G P C Rのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりも [3H]チミジンもしくは Br dUの取り込み量が減少すれば該被験試料はアンタゴニストである。

また、 LPA作動 GPCRが EDG2又は EDG4の場合、血清応答エレメント（Serum- respons e element ; SRE) の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、 G蛋白質の細胞刺激活性を評価する方法もある（An et al. , J. Biol. , Chem. , 2 73, 7906-7910, (1999) ; An et al. , BBRC.， 231, 619-622 (1997) )。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、 SREを含むプロモータ一の下流にリポーター蛋白質をコードする DNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験試料の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られる抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の方法を用いて測定 ·比較することにより、細胞内 Ca2+量を評価するというものである。従って、 SRE制御下にあるリポーター遺伝子の量が増加すれば、該被験試料は LPA 作動 GPCRのァゴニストであり、減少すればインバースァゴニストである。また、生理活性リガンド (例えば LPA) を共存させた系で、被験試料の存在下と非存在下での細胞内 Ca2+量を測定 ·比較することにより、 L P A作動 G P C Rのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験試料の存在下で被験試料の非存在下よりも細胞内 Ca2+量が減少すれば該被験試料はアンタゴニストである。

本明細書において、「LPA作動 GPCR拮抗活性を有する化合物」とは、上記スクリ一ユング方法においてインバースァゴニスト又はアンタゴニストである任意の化合物を表す。より具体的には、 LPA作動 GPCRとの親和性（LPA作動 GPCR結合活性）が LP A (18 : 0)以上であり、かつ実施例 4に記載の FLIPRを用いる試験方法において、 IC5 0値が 100/iM以下、好ましくは 10 / M以下、更に好ましくは ΙμΜ以下である化合物を挙げることができる。

本発明のスクリーニング法に供される被験試料は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。好ましくは、被験試料は分子量 200〜2000の化合物であり、更に好ましくは分子量 300〜800の化合物である。

本発明のスクリーニング法のために提供される、 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層膜、及び LPA作動 GPCRと共役する Gひを構成要事として含有するスクリ一ユング系の好ましい一実施態様は、 LPA作動 GPCRをコードする DN Αを含む発現ベクターと、共役 Gひの GPCRとの結合に関与する領域及び任意の Gひのグァニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を少なくとも含むポリぺプチドをコ一ドする DNAを含む発現ベクターとでトランスフエクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。

「LPA作動 GPCRをコードする DNA」は、ヒト及び他の哺乳動物由来の LPA作動 GP CR、あるいは該レセプターのアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然 LPA作動 GPC Rと同じリガンド一レセプター相互作用を示し、且つ共役する G αを活性化して該サブュニットの GDP · GTP交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをコードする DNAであれば特に制限はない。ヒト LPA作動 GPCR c DNAのコーディング領域の他、ゥシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来の LP A作動 GPCRをコードする DNA等が例示され、これらは、哺乳動物の膝臓、もしくは腎臓、肺の細胞由来の cDNAライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ヒト LPA作動 GPCRの c DNAクローンをプローブとして単離され得る。また、 L PA作動 GPCRは、ヒト LPA作動 GPCRの c DNAクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。

具体的には、ヒト及び他の哺乳動物由来の「EDG2をコードする DNA」、ヒト及び他の哺乳動物由来の「EDG4をコードする DNA」、ヒト及び他の哺乳動物由来の「EDG 7をコードする DNA」、又はこれらのアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然 LPA 作動 GPCRと同じリガンドーレセプター相互作用を示し、且つ共役する G αを活性化して該サブユエットの GDP · G TP交換反応を促進する活性を有するポリべプチドをコードする DNAが挙げられる。

G αとしては、 LPA作動 GPCRと共役するものであれば特に制限はない。 G αの各遺伝子は公知であり、容易に入手可能である。 LPA作動 GPCRと共役する Gaを含むポリペプチドをコードする DN Aは、少なくとも共役 Gaの GPCRとの結合に関与する領域をコードする配列と、任意の Gaのグァニンヌクレオチドとの結合に関与する領域をコードする配列を有することが必要である。上述の通り、 0ひの線結晶構造解析の結果から、 G P C R結合領域及びグァニンヌクレオチド結合領域はよく知られており、当業者は、所望により Gaのコーディング配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。

Gaのエフェクターへの作用を指標とするスクリーユング系においては、 LPA作動 GPCRと共役する Gaをコードする DNAは、所望のエフェクターと相互作用するための領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む必要がある。エフェクターとしてアデ二ル酸シクラーゼを用いる場合は、該 DNAは G i αもしくは G s e のエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一方、エフェクターとしてホスホリパーゼ C /3を用いる場合には、該 DNAは Gq αのェフエクタ一相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。各 G α遺伝子は公知であり、それらのエフェクター相互作用領域もよく知られている。従って、当業者は、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、容易にキメラ G α蛋白質をコードする DNAを構築することもできる。当該キメラ蛋白質（例えば、 Gq i α ) をコードする DNAの最も簡便な例としては、 Gq αの c DNAの C末端の約 5 アミノ酸をコードする配列を、 PCR等の公知の手法を用いて G i ひの C末端配列をコードする DN A配列に置換したものが挙げられる。

LPA作動 GPCRをコードする D N A、及び LPA作動 GPCRと共役する G αをコードする DNAは、宿主真核生物細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、宿主真核生物細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、 S V 4 0由来初期プ口モーター、サイトメガロウイノレス L T R、ラウス肉 fl重ゥイノレス L T R、 M o M u L V由来 L T R、アデノウイルス由来初期プロモータ一、バキュロウィルス由来ポリヘドリンプロモーター等のウィルスプロモーター、並びに )3—ァクチン遺伝子プ口モーター、 P G K遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ一領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコーディング D N Aを挿入し得るように、適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを 1箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現べクタ一は、選択マーカ一遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。

本発明のスクリーユング系に使用されるベクターとしてはプラスミドベクターの他、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスゥイノレス、ポリォウィルス、シンドビスウィルス、センダイウィルス等、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウィルスベクター等も挙げられる。

LPA作動 GPCRをコードする D N Aと、 LPA作動 GPCRと共役する G aをコードする D

N Aは、 2つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共トランスフエクトされてもよいし、あるいは、 1つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。

宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物細胞、あるいは昆虫細胞であれば特に制限はない。具体的には、 C0P、レ C127、 Sp2/0、 NS- 1 、 NIH3T3、 ST2等のマウス由来細胞、 RH7777等のラット由来細胞、 BHK、 CH0等のハムスター由来細胞、 C0S1、 C0S3、 C0S7、 CV1、 Vero等のサル由来細胞、 HeLa、 HEK29 3、 MCF10A、 HepG2、 A431等のヒト由来細胞、及び Sf9、 Sf21、 High Five等の昆虫由来細胞などが例示される。宿主細胞への遺伝子導入は、真核生物細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクト口ポレーシヨン法、リボソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約 5〜20%のゥシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM) 、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) 、 Ham's F-12培地、 RPM 11640培地、 199培地、 Grace' s昆虫細胞培養用培地等を用いて培養することができる。培地の pHは約 6〜約 8であるのが好ましく、培養温度は、通常約 27〜約 4 0°Cである。

上記のようにして得られる、 LPA作動 GPCRをコードする DNA及び LPA作動 GPCRと共役する Gひをコードする DNAを導入された真核生物細胞は、使用するスクリーユング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートゃ、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約 1， 000 X g程度で遠心して上清を回収した後、約 100， 000 X g程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。

例えば、 GTP γ S結合アツセィや、エフェクターの活性を直接測定することにより、被験試料のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内 cAMP量（もしくは c AMP応答性リポーターの発現量）や細胞内 C a 2+量（もしくは C a 2+応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験試料のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核生物細胞である。

尚、リガンド活性の評価を、 c AMP応答性リポーター（エフェクターがアデ二ル酸シクラーゼの場合）もしくは C a 2+応答性リポーター（エフェクターがホスホリパーゼ C ]3の場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核生物細胞は、 cAMP応答エレメント（CRE) または TPA応答エレメント（TRE) を含むプロモータ一領域の下流にリポーター蛋白質をコードする DNAが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。じ £は。 M Pの存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列として TGACGTCAを含む配列が挙げられるが、 c AM P応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、揷入または付加を含む配列であってもよい。一方、 T R Eは C a 2+の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列として TGACTCAを含む配列が挙げられるが、 C a 2+応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。 C R E 又は T R Eを含むプロモーター配列としては、上記のようなウィルスプロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及び D N Aリガーゼを用いて、あるいは P C R等を利用して、該プロモーター配列の下流に C R Eまたは T R E配列を挿入することができる。 C R E又は T R Eの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出 ·定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、 /3—ガラクトシダーゼ、 β -ヴ) り口ニダーゼ、ァノレ力リホスファターゼ、ぺ /レオキシダーゼ等のリポーター蛋白質をコードする D N Aが挙げられるが、これらに限定されない。リボータ一遺伝子の下流にはターミネータ一配列が配置されることがより好ましい。このような C R E (又は T R E ) —リポーター発現カセットを担持するべクタ一としては、公知のプラスミドベクター又はウィルスベクターを使用することができる。血清応答エレメント（SRE) の制御下にあるリポーター遺伝子含む発現ベクターについても、上記と同様に調製することができる。

本発明のスクリーニング法のために提供される、 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層膜、及び LPA作動 GPCRと共役する G aを構成要素として含有するスクリーニング系の別の好ましい実施態様は、 LPA作動 GPCRの C末端側に、共役 Gひの G P C R結合領域及び任意の G αのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリぺプチドが連結した融合蛋白質をコードする D NAを含む発現ベクターでトランスフエクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。

LPA作動 GPCRをコードする D NA、及び LPA作動 GPCRと共役する G aの G P C R結合領域及び任意の Gひのグァニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドをコードする D N Aは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらの D N A配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、 LPA作動 GPCRと G αとの融合蛋白質をコードする D N Aを構築することができる。簡潔にいえば、 P C R等を用いて LPA作動 GPCRをコードする D NAの終始コドンを除去したものに、 G aをコードする D N Aを読み枠が合うように、即ちインフレ一ムに、 D N Aリガーゼを用いてライゲーシヨンする。この際、 LPA作動 GPCRの C末の一部を欠失させたり、 LPA作動 GPCRと G aとの間に Hisタグ等のリンカ一配列を挿入してもよレ、。

得られた融合蛋白質をコードする D NAは、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主真核生物細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核生物細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現すると、レセプターの細胞内第 3ループ上の G ひ活性化ドメインと共役 G o;のレセプター結合領域とは、 LPA作動 GPCRに対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、 G aにおける G D P ' G T P交換反応を促進し得る。従って、 G aは恒常的に活性化された状態となる。

レセプタ一一 G ひ融合蛋白質発現細胞を、 G aのェフエクタ一^ ·の作用を指標にしたスクリーニングに使用する場合において、 G aがレセプターと連結していることがエフェクターとの相互作用の妨げとなる場合には、レセプターと G aとのジャンクシヨン部位に、特異的なプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列（例えば、トロンビン感受性配列等）を導入し、融合蛋白質を膜上に発現させた後に当該プロテアーゼを作用させてレセプターと G aとを切り離すことができる。

レセプタ一一 G ひ融合蛋白質発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。

本発明のスクリーユング法のために提供される、 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層膜、及び LPA作動 GPCRと共役する G aを構成要素として含有するスクリ一二ング系のさらに別の実施態様は、共役 G蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞を、 LPA 作動 GPCRをコードする D N Aを含む発現ベクターでトランスフエクトすることにより調製される細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。

LPA作動 GPCRをコードする D NA、該 D N Aを挿入する発現ベクター、該発現べクタ一の宿主細胞への導入法は、上述の通りのものを使用することができる。

本発明のさらに別の態様においては、本発明のスクリーニング系は、 LPA作動 GPC R及び LPA作動 GPCRと共役する G蛋白質を内因的に発現する動物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。このような細胞としては、哺乳動物の膝臓もしくは腎臓、肺由来細胞が好ましく例示される。

本発明のさらに別の態様においては、 LPA作動 GPCRを含む脂質二重層膜、及び LPA 作動 GPCRと共役する G aを構成要素として含有するスクリーニング系として、精製した LPA作動 GPCRと共役 G α、あるいは精製した該レセプターと共役 G との融合蛋白質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。 LPA 作動 GPCRは、ヒト又は他の哺乳動物の脖臓もしくは腎臓、肺由来細胞から得られる膜画分から、抗 LPA作動 GPCR抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィー等により精製することができる。あるいは、該レセプターは、 LPA作動 GPCRをコードする D N Aを含む発現べクターを導入された組換え細胞から、抗 LPA作動 GPCR抗体や、 His- tag、 GST- tag等を用いたァフイエティ一クロマトグラフィー等により精製することもできる。同様に、該レセプターと共役 G aとの融合蛋白質も、該融合蛋白質をコードする DN Aを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗 LPA作動 GPCR抗体や、 His- tag、 GST-tag等を用いたァフィ二ティークロマトグラフィー等により精製することができる。

人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン（P C) 、ホスファチジルセリン（P S) 、コレステロール（C h) 、ホスファチジルイノシトール（P I ) 、ホスファチジルエタノールァミン（P E) 等が挙げられ、これら 1 種または 2種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。

例えば、レセプターと G o:、又はレセプタ一一 G a融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリボソーム）は、 P C : P I : C h= 1 2 : 1 2 : lの混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でク口口ホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリゥム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製したレセプターと G a、又はレセプタ一一 G a融合蛋白質を、適量添加し、氷中で時々攪拌しながら 2 0〜 3 0分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約 1 0 0， 000 X gで 3 0〜6 0分間遠心して沈渣を回収することにより、プロテオリボソームを調製することができる。

また、本発明の、スクリーニング方法の第三の態様は、 LPA産生抑制活性を指標として、 LPA作動 GPCR活性抑制剤をスクリーニングするものであり、被験試料の存在下及び非存在下で、 LPA産生酵素及び基質を接触させ、 LPAの生成量を両条件下で比較し、被験試料の存在下における生成量が被験試料の非存在下における生成量よりも大きい被験試料を LPA産生酵素阻害剤として選択する工程を含む。

「LPA産生酵素」とは、具体的にはホスホリパーゼ A (A1, A2) を表し、好ましくはホスホリパーゼ A1を表す。本明細書において「ホスホリパーゼ A (A1, A2) J とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のホスホリパーゼ Al、 A2の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードする DNAを含む組換え細胞から製造される組換えホスホリパーゼ A1もしくは A2、それらの機能的フラグメン卜の全てを包含する意味で使用される。当該ホスホリパーゼ A1として、例えば J. B. C vol. 277 No. 37 pp34 254-34263 (2003)又は J. B. C vol. 273 No. 10 pp5468- 5477に記載されたものを使用することができる。また、ホスホリパーゼ A2として、例えば Cell, vol. 80, p919- 9 27 (1995) に記載されたものを使用することができる。

「基質」としては、標識されたホスファチジン酸（PA) が挙げられる。標識方法としては、蛍光標識でラベルする方法や、 3H、 14C、 32P及び 33Pなどの放射性同位元素で標識する方法等が挙げられる。具体的にスクリーニングに用いられる基質としては、 32P-labeled sn- 1， 2- dioleoyl PA等が挙げられる。

被験物質の LPA産生酵素活性の測定方法は公知であり、例えば実験医学 vol. 9 No

. 3 (3月号) 1991、又は The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, No. 49, P49438-49447 (2003) 等に記載された方法を用いることができる。すなわち、被験試料の存在下における LPA産生酵素活性と、被験試料非存在下における LPA産生酵素活性を比較することにより、被験試料存在下における LPA産生酵素活性が被験試料非存在下における LPA産生酵素活性よりも小さい被験試料を LPA産生酵素阻害剤として選択することができる。

上記の本発明のスクリ一二ング法により選択される LPA作動 GPCR拮抗剤もしくは L PA産生酵素阻害剤等の LPA作動 GPCR活性抑制剤は、耐糖能異常改善作用を示すことは明白であり、従って、これらを適当な添加剤と組み合わせることにより、耐糖能異常改善薬とすることができる。従って、本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜された LPA作動 GPCR活性抑制剤と、医薬上許容される担体とを配合させることによる、耐糖能異常改善薬、又は生活習慣病治療、特に糖尿病治療を提供する。

医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシゥム等の賦开 $剤、セルロース、メチルセノレロース、ヒドロキシプロピノレセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリゥムーグリコール一スターチ、炭酸水素ナトリゥム、リン酸カルシウム、クニン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エア口ジル、タルク、ラウリノレ硫酸ナトリウム等の滑剤、クェン酸、メントール、グリシルリシン . アンモニゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではなレ、。

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の LPA作動 GPCR活性抑制剤を溶解させた液剤、有効量の LPA作動 GPCR活性抑制剤を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の LPA作動 GPCR活性抑制剤を懸濁させた懸濁液剤、有効量の LPA作動 GP CR活性抑制剤を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。

非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。当該 LPA作動 GPC R活性抑制剤の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、 LPA作動 GPCR活性抑制剤及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例

実施例 1

正常人の薛臓ランゲルハンス氏島における EDG2、 EDG4及び EDG7の発現局在

(1)ゥサギ由来ポリクローナル抗体の作成

Edg 2抗原べプチドとして、ァミノ酸配列： KHLATEW TVSKLVM (配列番号： 7 ) の部分ペプチドを公知の方法で合成し、マススペクトル及び HPLCにより配列を確認した。

公知の方法に従い、以下のスケジュールで動物を免疫し、抗血清からポリクロ一ナル抗体の作成を行った。すなわち、ゥサギ（KBL JW 11週齢） 2匹を用い、飼育 1日目に FCA (Completeゥサギ（KBL JW 11週令） 2匹を用い、飼育 1日目に FCA (Complete Freund' s Adjuvant) に溶解させた抗原ペプチド 200 / g/匹を腹腔内に注入した。更に、飼育 1 4、 2 8、 4 2、 5 7、 7 0、 8 4日目に FCA (Complete Freund' s Adjuvant) に溶解させた抗原ペプチド 100 /z g/匹を腹腔内に注入した。飼育 1、 4 9、 6 3日に抗体力価確認のための採血を行った。抗体力価の上昇を確認後、飼育 77日目に 2 0〜 3 O ml/匹、飼育 91日目に 5 0〜 7 O ml/匹の採血を行い、抗血清を得て抗原ペプチドを固定したカラムでァフィ二ティー精製を行い、 1次抗体を得た。精製された抗体は 0. 01% アジ化ナトリウムを含む PBSに置換し使用まで冷凍保存した。

(2)ゥサギ抗体を用いた免疫組織染色

生検組織サンプル（24歳女性、 95歳男性等）のパラフィンブロックから 4〜5 m の厚さで組織切片を作成した。スライドサンプルはキシレンで除パラフィンを行い

、アルコール処理を経て再度水和させた。その後 Target Retrieval Solution (DAK

0社）中でオートクレープ処理による抗原賦活化を行った。以降の操作は Vectastai n ABC-AP kit (Vector社）を用いた。添付試薬でブロッキング後、上記（1)で作成した 1次抗体で 45分インキュベートした。洗浄後、 5 μ 1/πι1に希釈した抗ゥサギ 2 次抗体（ΒΑ- 1000) で 30分インキュベートした。洗浄後 Vector ABC-AP (AK-5000) r eagentを添加し、 Vector Red (SK- 5100)にて発色させた。

結果を表 1に示した。表 1のとおり、 EDG2は他組織と比較して膝臓に強く発現していることがわかった。更に、膝臓組織中での発現分布を詳細に検討したところ、腺房などではほとんど発現しておらず、ランゲルハンス島に発現が局在していることが明らかとなった。

また Edg4を認、識する市販のモノクローナル抗体（Oncogene社）等を用い、同様の手法で発現局在を検討した結果、 Edg4も又、ランゲルハンス氏島に発現局在していることが明らかとなった。

さらに Edg7抗原ペプチドとして VERHMSIMRMRVHSN (配列番号： 8 ) を用い、同様の手法で発現局在を検討した結果、 Edg7も又、ランゲルハンス氏島に発現局在していることが明らかとなった。

実施例 2

経口糖負荷試験

雄性 C57BL/6Jマウス（3週齢、 SPF規格、本クレア）を予備飼育の後、 4週齢より通常飼料（Research Diet社）を与えた。 20週間後、 8時間絶食を施し、 LPA乾燥品（シグマ社）を生理食塩水（大塚製薬）に溶解し 0. 5m_g/匹で静脈内投与を行った。溶媒対照としては生理食塩水 (大塚製薬）を用いた。静脈内投与後速やかに 3g/kgの D-グルコースを経口投与した。糖負荷前（0分）、糖負荷後 15、 45、 90及び 135分後に尾部静脈より採血し、以下の方法により血糖を測定した。すなわち 10 // 1の血液を採取し、 0. 4N過塩素酸水溶液 100 Ai lと混和する。更に 0. 3 7M炭酸カリウム水溶液 50 /x lを添カ卩し、遠心後の上清についてグルコース C I I · テストヮコー（グルコース定量キット、ムタロターゼ ' GOD法、和光純薬）を用いて血糖値を測定した。

その結果、 LPA投与群の糖負荷後 90分後の血糖値は、生理食塩水投与群と比較して有意に高値を示した（p>0. 05) (図 1 ) 。この結果から、 LPAの投与により耐糖能が悪化することが明らかになつた。実施例 3

EDG2、 EDG4、 EDG7の安定発現株の樹立

(1)導入遺伝子ベクターの構築

配列番号： 2で表される EDG2のコード領域、配列番号： 4で表される EDG4のコード領域、及び配列番号： 6で表される EDG7のコード領域を、 AmpliTaq (パーキンェルマ一社）にて PCR法で増幅する。増幅した遺伝子断片を動物細胞で機能するプロモーター（pcDAN4/HisMax (invitrogen社） ) の下流に導入する。

(2)細胞株の樹立

Nature Cell Biology, vol. 2, p261〜p267, (2000) 又は J. Biol. Chem. , Vol. 276, No. 44, _P41325〜p41335に記載された方法で、 EDG2、 EDG4及び EDG7安定発現株を調製することができる。

すなわち、 Jurkat (または HTC4) 細胞を 10cm培養皿に播種し 60〜70%コンフルェントになるまで培養する。その後無血清培地に転換し、上記のとおり構築した EDG2 、 EDG4及び EDG7導入遺伝子を、 Lipoofectamine-Plus (Gibco社製）と複合体を形成させたのちに培地に添加する。 5時間インキュベート後 1 0 %FBSを含む培地に転換後さらに 8時間培養する。その後トリプシン EDTAで細胞を培養皿から剥離させ、 G4 18と 10%FBSを含む培地にけん濁し、 10cm培養皿に播種した。数日後形成されたコロニーを単離し、 EDG2、 EDG4及び EDG7リガンドスクリーニング用安定発現株とする。実施例 4

FLIPRを用いた EDG2、 EDG4及び EDG7リガンドのスクリ一エング (1)細胞の調製

実施例 3で調製した EDG2、 EDG4及び EDG7リガンドスクリ一二ング用安定発現株を 9 6穴培養皿に播種し、 10%FBS (Gibco社製）を含む培地中で 60〜70%コンフルェントになるまで培養する。

(2)蛍光測定による細胞内カルシウムの定量

上記の処理を施した細胞の培地を除去し、 4 // Mの Fluo3AM (Tef lab. ) 及び 2. 5mM の probenecid (20mM HEPES, 0. 1%BSA, lxHBSS緩衝液， pH7. 4) を添加し 37°Cで 60分培養する。上記の処理を施した細胞を氷冷した PBSで洗浄し、 Tyrode's medium (2. 5mMの probenecid 1 %ゼラチンを含む）に懸濁する。これに評価化合物の DMS0溶液 (終濃度 lnM〜100 / m) を加える。 5分後に LPA (18 : 3) (終濃度： 100nM) を加え、添加前後の細胞内カルシウムイオン濃度を FRIPR (Molecular Device) にて測定する（励起波長： 488nm、蛍光波長： 540nm) 。ここで、 LPA (18： 3) ( 1 —リノレノィル LPA)は LPC ( 18 : 3) ( 1 —リノレノィルリゾホスファチジルコリン）（Sedary社製）を用いてホスホリパーゼ Dを用いて合成する。

一方、評価化合物の代わりに DMS0を添加して上記測定を行い、コントロール値を得る。測定値がコント口ール値よりも小さレ、場合に、該評価化合物は LPA作動 GPCR のアンタゴニスト候補化合物であり、測定値を比較することによって LPA作動 GPCR アンタゴニストをスクリーニングすることができる。すなわち、複数の濃度の評価化合物について上記を測定し、測定値がコントロール値の 1/2となる濃度（IC50値 ) を求め、該 IC50値が小さい化合物を耐糖能異常改善薬の候補化合物として選択することができる。実施例 5

(1)細胞膜画分の調製

実施例 3で調製した EDG2、 EDG4及び EDG7リガンドスクリ一ユング用安定発現株をフラスコに播種し、 10%FBS (Gibco社製）を培地中で 60〜70%コンフルェントになるまで培養する。細胞を回収し buffer A (50mM HEPES (pH7. 0) , lOmM 2- ME, ImM PMSF, 0. 25M sucrose)に懸濁する。 Potter型ホモジェナイザーでホモジナイズ（400rpm 、 20ストローク）したのち、 100000 gで 60分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度 buffer Aに懸濁する。この懸濁液を 35% (tnass/vol) sucrose in buffer Aの上に重層し 45000 gで 45分遠心分離を行う。界面の画分を回収し buffer Aに懸濁し、 100000 gで 60分遠心分離を行う。得られた沈殿を 20 /i g/ml aprotininを含む buffer Aに懸濁し以下のアツセィに用いる。

(2)レセプターバインディングアツセィ

MultiscreenGVPlate (Miripore)に反応バッファー（50mM Hepes pH7. 4、 12. 5mM齚酸マグネシウム、 3. 125mM塩化マグネシウム、 0. 125mg/ml BSA)に懸濁した天然リガンド： 1- 01eoyl [oleoyl- 9, 10- ³ H] LPAと種々の濃度に希釈した評価化合物（DMS0溶液）とを添カ卩しする。 30°Cでィンキュベートしたのち上記の手順で調整した膜画分を添加する。 30°Cでインキュベートしたのち等量の 20%TCAを添カ卩し、上清を吸引除去しタンパク質を沈殿させる。 10%TCAで数回洗浄した後、 37°Cで乾燥させた膜をパンチァゥトし yカウンターで測定する。評価化合物の代わりに DMS0を用いたコントロール値と測定値を比較し、天然リガンドの結合阻害活性値を求めることができる。また、評価化合物非存在下における測定値を 1 0 0とし、これを 50%抑制する評価化合物の濃度（IC50値）を求めることができ、 IC50値を、 LPA (18 : 1) と比較することにより、阻害活性の強い化合物を選択することができる。実施例 6

ビアコアを用いたスクリーニング

(1)細胞膜画分の調製

EDG2、 EDG4及び EDG7スクリーニング用安定発現株をフラスコに播種し、 10%FBS ( Gibco) を培地中で 60〜70%コンフルェントになるまで培養する。細胞を回収し buff er A (50mM HEPES (pH7. 0) , lOmM 2- ME, ImM PMSF, 0. 25M sucrose)に懸濁する。 Pot ter型ホモジェナイザーでホモジナイズ（400rpm、 20ストローク）したのち、 10000 0 gで 60分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度 buffer Aに懸濁する。この懸濁液を 35% (tnass/vol) sucrose in buffer Aの上に重層し 45000 gで 45分遠心分離を行う。界面の画分を回収し buffer Aに懸濁し、 100000 gで 60分遠心分離を行う。得られた沈殿を 20 ;u g/ml aprotininを含む buffer Aに懸濁し以下のアツセィに用いる。 (2)ビアコアでの結合測定

文献 [Anal Biochem. 1998 Dec 15 ; 265 (2) : 340- 50. Markgren P0 et al. ]に記載されている一般的な方法を用いる。上記手順で調整した EDG2、 EDG4及び EDG7発現細胞膜画分（例えば 1〜10 μ ₈ ) を 10mMの酢酸バッファ一（pH4) に溶解し、ビアコァのセンサーチップ C M 5の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。

H B Sバッファー（アマシャムフアルマシアバオテク株式会社製）をセンサ一チップに ²0 / 1 分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中から H B Sバッファーに 10 n M〜10 /i Mの濃度で溶解した評価化合物に切り替えて 1分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録する。再び、薬剤を含まない H B Sバッファーに切り替え、結合した薬剤の解離に伴う値の変化を記録する。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から評価化合物と EDG2、 EDG4及び EDG7との親和性を計算する。親和性を LPAと比較することにより、親和性の大きい化合物を選択することができる。実施例 7

[³ H] チミジン取り込み量に基づくスクリーニング

実施例 3で調製した EDG2、 EDG4及び EDG7リガンドスクリ一ユング用安定発現株を 9 6穴培養皿に播種し、 10%FBS (Gibco社製）培地中で翌日無血清培地に交換する。 24時間後に培地を交換して LPA存在もしくは非存在下に 16時間培養した後、 [ ³ H] チミジンを添加する。 [³ H] チミジン添加より 8時間培養したのちに P B S (PHosphate-buffered saline) で細胞を洗浄し、細胞に取り込まれた [³ H] チミジンを Betaplateフイノレターカウンタシステム（アマシャムフアルマシアバイオテク）によって測定する。 LPA添カ卩ゥエルでの [ ³ H] チミジン取り込みと LPA非添加ゥエルでの [³ H] チミジン取り込みの差を LPAによる [³ H] チミジン取り込み促進量とする。上記において評価化合物を添加しない場合の [³ H] チミジン取り込み量を 1 0 0とし、これを 50%抑制する評価化合物の濃度（IC50値）を求めることができる。尚、評価化合物は LPA添加直前に添加する。得られる IC50値が小さい化合物を、血糖調節薬候補化合物として選択することができる。実施例 8

BrdU取り込み量に基づくスクリーニング

実施例 3で調製した EDG2、 EDG4及び EDG7リガンドスクリ一ユング用安定発現株を無血清 DMEM (Dulbecco' s modi fi ed eagl e medium) に懸濁し、 96穴プレートに播種する。 24時間後に評価化合物を添加して LPA (3 μ Μ) の存在もしくは非存在下に 16 時間培養した後、 BrdUを添加する。 BrdU添加より 3時間培養し、 Ce l l prol i ferat i on ELISA system (RPN250, Amersham Life Sc i ence)を用いて細胞に取り込まれた Brd Uを 450nmにおける吸光度で測定する。 LPA添加ゥヱルでの BrdU取り込みと LPA非添加ゥェルでの BrdU取り込みの差を LPAによる BrdU取り込み促進量とする。上記において評価化合物を添加しない場合の BrdU取り込みを 1 0 0とし、これを 50%抑制する評価化合物の濃度（IC50値）を求めることができる。尚、評価化合物は LPA添カロ直前に添加する。得られる IC5(H直が小さい化合物を、血糖調節薬候補化合物として選択することができる。実施例 9

評価化合物の薬効の確認

雄性 C57BL/6Jマウス（3週齢、 SPF規格、日本クレア）を予備飼育の後、 4週齢より高脂肪含有飼料（Research Di et社）を与える。 20週間後、 8時間絶食を施し、評価化合物を生理食塩水（大塚製薬）に溶解し 0. 5mg/匹で静脈内投与を行う。溶媒対照としては生理食塩水（大塚製薬）を用いる。静脈内投与後速やかに 3g/kgの D-ダルコースを経口投与する。糖負荷前（0分）、糖負荷後 15、 45、 90及び 135分後に尾部静脈より採血し、以下の方法により血糖値を測定する。

すなわち 10 1の血液を採取し、 0. 4N過塩素酸水溶液 100 i 1と混和する。更に 0. 3 7M炭酸カリウム水溶液 50 z lを添加し、遠心後の上清についてグルコース C I I · テストヮコー（グルコース定量キット、ムタロターゼ ' G0D法、和光純薬）を用いて血糖ィ直を測定する。

その結果、評価化合物投与群の糖負荷後 90分後の血糖値は、生理食塩水投与群と比較して有意に低い値を示すことが確認できる。産業上の利用可能性

本発明の LPA作動 GPCR拮抗剤は、 LPAにより抑制されているィンスリン分泌を回復させる。また LPAの作用のみを阻害することが期待されるので、過剰な血糖降下をもたらすことのない安全な耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬となり得る。

Claims

請求の範囲

I . LPA作動 GPCR活性抑制剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬。

2 . LPA作動 GPCR活性抑制剤が LPA産生酵素阻害剤である、請求項 1に記載の耐糖能異常改善薬。

3 . LPA作動 GPCR活性抑制剤が LPA作動 GPCR拮抗剤である、請求項 1に記載の耐糖能異常改善薬。

4 . 耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である請求項 1〜 3のいずれかに記載の耐糖能異常改善薬。

5 . LPA作動 GPCRが EDG2、 EDG4又は EDG7である、請求項 1〜 4のいずれか記載の耐糖能異常改善薬。

6 . LPA作動 GPCR、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させ、該 GPCR又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを含む、 LP A作動 GPCR拮抗剤のスクリーニング方法。

7 . 被験試料の存在下及び非存在下で、 LPA作動 GPCR、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントにリガンドを接触させ、該 GPCR又は該フラグメントとリガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む、 LPA作動 GPCR拮抗剤のスクリ一ニング方法。

8 . リガンドが LPAである請求項 7記載のスクリーニング方法。

9 . LPA作動 GPCRが EDG2、 EDG4又は EDG7である、請求項 6〜 8のいずれか記載のスクリーニング方法。

1 0 . 耐糖能異常改善薬の選別のために行われる、請求項 6〜9のいずれかに記載の方法。

I I . 耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である、請求項 1 0に記載の選別方法。

1 2 . 請求項 6〜 9のいずれかに記載の方法で選択される LPA作動 GPCR拮抗剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬。

1 3 . 耐糖能異常が生活習†貫病又は糖尿病である、請求項 1 2に記載の耐糖能異常改善薬。

1 4 . 被験試料の存在下及び非存在下で、 LPA産生酵素及び基質を接触させ、 L PAの生成量を両条件下で比較することを含む、 LPA産生酵素阻害剤のスクリーニング方法。

1 5 . 基質が標識されたホスファチジン酸である、請求項 1 4に記載のスクリ一ユング方法。

1 6 . 請求項 1 4又は 1 5に記載の方法を含む耐糖能異常改善薬の選別方法。

1 7 . 耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である請求項 1 6に記載の選別方法

1 8 . 請求項 1 4又は 1 5に記載の方法により選択される LPA産生抑制剤を有効成分とする耐糖能異常改善薬。

1 9 . 耐糖能異常が生活習慣病又は糖尿病である請求項 1 8に記載の耐糖能異常改善薬。