JP2003180377A - アドレン酸受容体およびその使用 - Google Patents
アドレン酸受容体およびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】このアドレン酸受容体のアゴニストおよびアン
タゴニストを同定するためのスクリーニング法を提供す
る。 【解決手段】アドレン酸の受容体としてのオーファンＧ
タンパク質共役型受容体ＰＦＩ−０１１（およびその変
異体）の同定、およびＰＦＩ−０１１のモジュレーター
としてのアドレン酸（およびその類似体または模倣体）
の使用。
タゴニストを同定するためのスクリーニング法を提供す
る。 【解決手段】アドレン酸の受容体としてのオーファンＧ
タンパク質共役型受容体ＰＦＩ−０１１（およびその変
異体）の同定、およびＰＦＩ−０１１のモジュレーター
としてのアドレン酸（およびその類似体または模倣体）
の使用。
Description
【０００１】発明の技術分野
本発明は、アドレン酸受容体としてのオーファンＧタン
パク質共役型ＰＦＩ−０１１（および構造関連分子）の
同定、およびＰＦＩ−０１１のモジュレーターとしての
アドレン酸の使用に関する。本発明はまた、ＰＦＩ−０
１１に対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定す
るためのスクリーニング方法に関する。
パク質共役型ＰＦＩ−０１１（および構造関連分子）の
同定、およびＰＦＩ−０１１のモジュレーターとしての
アドレン酸の使用に関する。本発明はまた、ＰＦＩ−０
１１に対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定す
るためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】発明の背景
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、広範囲の信
号伝達経路に関与する膜内在タンパク質の大きなスーパ
ーファミリーである。大部分のＧタンパク質共役型受容
体は７回膜貫通型らせんを特色とし、したがって７回膜
貫通受容体（７ＴＭ）とも呼ばれる。このファミリーに
は少なくとも数百のメンバーがあり、これにはペプチ
ド、生物アミン、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ヌク
レオチド、糖ヌクレオチド、サイトカインなどを含めた
広範な異なる刺激に応答する受容体が含まれる。構造的
には、このファミリーの受容体は細胞外アミノ末端ドメ
イン、７回膜貫通疎水性領域、６ループ領域（それらの
うち３つは細胞外、他の３つは細胞内）、および細胞内
カルボキシ末端ドメインからなる。疎水性領域はこのフ
ァミリーの異なるメンバー間でかなりの相同性を示すの
に対し、ループ領域ならびにアミノ末端およびカルボキ
シ末端ドメインはかなり変動し、近縁受容体サブタイプ
間でのみ高い相同性を示す。
号伝達経路に関与する膜内在タンパク質の大きなスーパ
ーファミリーである。大部分のＧタンパク質共役型受容
体は７回膜貫通型らせんを特色とし、したがって７回膜
貫通受容体（７ＴＭ）とも呼ばれる。このファミリーに
は少なくとも数百のメンバーがあり、これにはペプチ
ド、生物アミン、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ヌク
レオチド、糖ヌクレオチド、サイトカインなどを含めた
広範な異なる刺激に応答する受容体が含まれる。構造的
には、このファミリーの受容体は細胞外アミノ末端ドメ
イン、７回膜貫通疎水性領域、６ループ領域（それらの
うち３つは細胞外、他の３つは細胞内）、および細胞内
カルボキシ末端ドメインからなる。疎水性領域はこのフ
ァミリーの異なるメンバー間でかなりの相同性を示すの
に対し、ループ領域ならびにアミノ末端およびカルボキ
シ末端ドメインはかなり変動し、近縁受容体サブタイプ
間でのみ高い相同性を示す。
【０００３】配列相同性の分析により、このスーパーフ
ァミリーはファミリーとサブファミリーに分類できる；
たとえば一般にペプチドリガンドをもつ受容体は、たと
えば生物活性アミンまたは脂質などに応答するものに対
してより、ペプチドリガンドに応答する他のＧＰＣＲに
対して高い配列相同性を示す。
ァミリーはファミリーとサブファミリーに分類できる；
たとえば一般にペプチドリガンドをもつ受容体は、たと
えば生物活性アミンまたは脂質などに応答するものに対
してより、ペプチドリガンドに応答する他のＧＰＣＲに
対して高い配列相同性を示す。
【０００４】クローニング実験、たとえばＧＰＣＲ配列
由来のプローブを用いるディジェネレイト（degenerat
e）ポリメラーゼ連鎖反応またはｃＤＮＡライブラリー
スクリーニングと配列データベースのバイオインフォー
マティック検索との両方により、この受容体ファミリー
の保存構造および疎水性プロフィールからこのファミリ
ーの多数のメンバーを同定およびクローニングできる。
これらの多くの受容体について、それらの天然リガンド
および機能が何であるかはまだ分かっていない。これら
の受容体は”オーファン受容体”と呼ばれる。それらの
配列を詳細に分析し、リガンドが分かっているＧＰＣＲ
の配列と対比して、オーファン受容体が応答する可能性
のあるリガンドのクラスについて仮説を立てることがで
きる。
由来のプローブを用いるディジェネレイト（degenerat
e）ポリメラーゼ連鎖反応またはｃＤＮＡライブラリー
スクリーニングと配列データベースのバイオインフォー
マティック検索との両方により、この受容体ファミリー
の保存構造および疎水性プロフィールからこのファミリ
ーの多数のメンバーを同定およびクローニングできる。
これらの多くの受容体について、それらの天然リガンド
および機能が何であるかはまだ分かっていない。これら
の受容体は”オーファン受容体”と呼ばれる。それらの
配列を詳細に分析し、リガンドが分かっているＧＰＣＲ
の配列と対比して、オーファン受容体が応答する可能性
のあるリガンドのクラスについて仮説を立てることがで
きる。
【０００５】しかしこれらの推定はしばしば実体がな
く、そのようなオーファン受容体が応答する可能性のあ
るリガンドの同定はなお困難である。その理由は主に下
記にある。すなわち、ＧＰＣＲを刺激すると、異なるＧ
タンパク質への結合を介して仲介される多数の異なる細
胞内作用を引き起こす可能性がある。次いでこれらのＧ
タンパク質が、ホスホリパーゼＣ、アルデヒドシクラー
ゼおよびイオンチャンネルを含めた広範囲の信号伝達タ
ンパク質に作用し、これにより細胞内でカスケード事象
が開始する。
く、そのようなオーファン受容体が応答する可能性のあ
るリガンドの同定はなお困難である。その理由は主に下
記にある。すなわち、ＧＰＣＲを刺激すると、異なるＧ
タンパク質への結合を介して仲介される多数の異なる細
胞内作用を引き起こす可能性がある。次いでこれらのＧ
タンパク質が、ホスホリパーゼＣ、アルデヒドシクラー
ゼおよびイオンチャンネルを含めた広範囲の信号伝達タ
ンパク質に作用し、これにより細胞内でカスケード事象
が開始する。
【０００６】Ｇタンパク質はα−およびβγ−サブユニ
ットを含むヘテロ三量体形複合体である。少なくとも２
０のヒト遺伝子がＧＴＰ結合α−サブユニットをコード
することが知られている。α−サブユニットファミリー
は、それらの相同性に基づいて４つのサブファミリーに
分類される： −Ｇsファミリーは一般に、この受容体に結合するアゴ
ニストが結合するとアルデヒドシクラーゼを刺激するこ
とができ、したがって細胞内サイクリックＡＭＰを増加
させる； −ＧqファミリーはＧqα、Ｇ11α、Ｇ14α、Ｇ16αを含
み、ホスホリパーゼＣを活性化する； −Ｇ12およびＧ13は、低分子量Ｇタンパク質の各クラス
ならびにＮａ+−Ｈ+交換を調節すると思われる； −Ｇiファミリーは一般にアルデヒドシクラーゼの阻害
を仲介する。α−サブユニットの半数以上がＧiファミ
リーのメンバーであり、これには遍在性発現するほぼ同
一のＧi1α、Ｇi2αおよびＧi3α、ならびに限られた発
現を示す数種類、たとえばＧzα、Ｇoαおよびトランス
デューシンが含まれる。
ットを含むヘテロ三量体形複合体である。少なくとも２
０のヒト遺伝子がＧＴＰ結合α−サブユニットをコード
することが知られている。α−サブユニットファミリー
は、それらの相同性に基づいて４つのサブファミリーに
分類される： −Ｇsファミリーは一般に、この受容体に結合するアゴ
ニストが結合するとアルデヒドシクラーゼを刺激するこ
とができ、したがって細胞内サイクリックＡＭＰを増加
させる； −ＧqファミリーはＧqα、Ｇ11α、Ｇ14α、Ｇ16αを含
み、ホスホリパーゼＣを活性化する； −Ｇ12およびＧ13は、低分子量Ｇタンパク質の各クラス
ならびにＮａ+−Ｈ+交換を調節すると思われる； −Ｇiファミリーは一般にアルデヒドシクラーゼの阻害
を仲介する。α−サブユニットの半数以上がＧiファミ
リーのメンバーであり、これには遍在性発現するほぼ同
一のＧi1α、Ｇi2αおよびＧi3α、ならびに限られた発
現を示す数種類、たとえばＧzα、Ｇoαおよびトランス
デューシンが含まれる。
【０００７】さらに、β−サブユニットをコードする少
なくとも５つの遺伝子およびγ−サブユニットをコード
する少なくとも１１の遺伝子がある。すなわち、Ｇタン
パク質を伴う信号伝達カスケードの開始には、アゴニス
トリガンドがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に
結合する必要がある。その結果ＧＰＣＲのコンホメーシ
ョンが安定化し、これによりコグネイトＧタンパク質の
Ｇαサブユニットのヌクレオチド結合ポケットから結合
ＧＤＰが解離する速度が増大する。こうしてＧＴＰの結
合が可能となる。ＧＴＰが結合すると、Ｇタンパク質は
ＧＴＰ−ＧαおよびＧβγ部分に解離し、したがって細
胞内信号伝達分子（たとえばサイクリックＡＭＰ）を産
生する数種類の酵素の活性、または一連のイオンチャン
ネルを開放する確率を、直接または他の形で調節できる
（Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，６１４−６４９）。Ｇタ
ンパク質の活性化に伴って、内在ＧＴＰａｓｅ活性によ
り結合ＧＴＰが加水分解されてそれのエフェクターを調
節する能力が失われ、α−ＧＤＰがβγと再会合する。
したがってＧタンパク質は、信号を受容体からエフェク
ターへ伝達するリレーとして、および信号の持続時間を
調節する時計として、二重の役割を果たす。したがっ
て、どのＧタンパク質がＧＰＣＲに結合するかに応じて
著しく異なる分子内作用が生じる可能性がある；たとえ
ば、アデニル酸シクラーゼを刺激または阻害して細胞内
サイクリックＡＭＰ濃度を上昇または低下させる；イオ
ンチャンネルを開くなどである。
なくとも５つの遺伝子およびγ−サブユニットをコード
する少なくとも１１の遺伝子がある。すなわち、Ｇタン
パク質を伴う信号伝達カスケードの開始には、アゴニス
トリガンドがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に
結合する必要がある。その結果ＧＰＣＲのコンホメーシ
ョンが安定化し、これによりコグネイトＧタンパク質の
Ｇαサブユニットのヌクレオチド結合ポケットから結合
ＧＤＰが解離する速度が増大する。こうしてＧＴＰの結
合が可能となる。ＧＴＰが結合すると、Ｇタンパク質は
ＧＴＰ−ＧαおよびＧβγ部分に解離し、したがって細
胞内信号伝達分子（たとえばサイクリックＡＭＰ）を産
生する数種類の酵素の活性、または一連のイオンチャン
ネルを開放する確率を、直接または他の形で調節できる
（Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，６１４−６４９）。Ｇタ
ンパク質の活性化に伴って、内在ＧＴＰａｓｅ活性によ
り結合ＧＴＰが加水分解されてそれのエフェクターを調
節する能力が失われ、α−ＧＤＰがβγと再会合する。
したがってＧタンパク質は、信号を受容体からエフェク
ターへ伝達するリレーとして、および信号の持続時間を
調節する時計として、二重の役割を果たす。したがっ
て、どのＧタンパク質がＧＰＣＲに結合するかに応じて
著しく異なる分子内作用が生じる可能性がある；たとえ
ば、アデニル酸シクラーゼを刺激または阻害して細胞内
サイクリックＡＭＰ濃度を上昇または低下させる；イオ
ンチャンネルを開くなどである。
【０００８】ＧＰＣＲの配列からそれがどのＧタンパク
質を結合するかを推定するのは困難であり、場合によっ
ては生じる細胞内作用を測定するのが困難である。さら
に、クローン化ＧＰＣＲをヘテロロガス発現させるのに
用いる通常の宿主細胞は、特定のタンパク質のみを発現
する；オーファンＧＰＣＲが結合するＧタンパク質がこ
れらの細胞において発現しない場合、この受容体にアゴ
ニストが結合しても測定可能な作用はなく、そのような
系においてそのＧＰＣＲのアゴニストを見出すことはで
きないと思われる。
質を結合するかを推定するのは困難であり、場合によっ
ては生じる細胞内作用を測定するのが困難である。さら
に、クローン化ＧＰＣＲをヘテロロガス発現させるのに
用いる通常の宿主細胞は、特定のタンパク質のみを発現
する；オーファンＧＰＣＲが結合するＧタンパク質がこ
れらの細胞において発現しない場合、この受容体にアゴ
ニストが結合しても測定可能な作用はなく、そのような
系においてそのＧＰＣＲのアゴニストを見出すことはで
きないと思われる。
【０００９】したがって、多数の異なるＧＰＣＲに対し
て測定可能な応答を誘発しうる宿主細胞系を樹立するた
めには、種々のヘテロロガスＧタンパク質を発現する特
殊な宿主細胞系を工学的に作製する必要があった。数ク
ラスのＧＰＣＲをホスホリパーゼＣ経路へ連係させると
思われる、相手を選ばないＧタンパク質、たとえばＧα
15もしくはＧα16（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ ＆ Ｓ
ｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０，１５１７５−１５１８０）、または多数
の異なるＧＰＣＲを同じ経路、たとえばホスホリパーゼ
Ｃ経路へ連係させるように設計されたキメラＧタンパク
質（Ｍｉｌｌｉｇａｍ，Ｇ． ＆ Ｒｅｅｓ，Ｓ．（１
９９９）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０，１１８−１２４）もあ
る。これらのＧタンパク質の１つを発現するように工学
的に作製された宿主細胞が多様なＧＰＣＲのアゴニスト
に対して測定可能な応答を生じる可能性は、それらの内
因性Ｇαサブユニットのみを発現するものより高いと思
われる。
て測定可能な応答を誘発しうる宿主細胞系を樹立するた
めには、種々のヘテロロガスＧタンパク質を発現する特
殊な宿主細胞系を工学的に作製する必要があった。数ク
ラスのＧＰＣＲをホスホリパーゼＣ経路へ連係させると
思われる、相手を選ばないＧタンパク質、たとえばＧα
15もしくはＧα16（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ ＆ Ｓ
ｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０，１５１７５−１５１８０）、または多数
の異なるＧＰＣＲを同じ経路、たとえばホスホリパーゼ
Ｃ経路へ連係させるように設計されたキメラＧタンパク
質（Ｍｉｌｌｉｇａｍ，Ｇ． ＆ Ｒｅｅｓ，Ｓ．（１
９９９）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０，１１８−１２４）もあ
る。これらのＧタンパク質の１つを発現するように工学
的に作製された宿主細胞が多様なＧＰＣＲのアゴニスト
に対して測定可能な応答を生じる可能性は、それらの内
因性Ｇαサブユニットのみを発現するものより高いと思
われる。
【００１０】ＧＰＣＲは医薬介入のためのきわめて重要
なターゲットであり、機能が分かっているＧＰＣＲの多
数のアゴニストおよびアンタゴニストが疾病の処置に重
要である。その例には、高血圧症、狭心症および心不全
の治療に用いられるβ1−アドレナリン受容体アンタゴ
ニスト、精神分裂病の治療に用いられるドーパミンＤ２
アンタゴニスト、喘息の治療に用いられるβ2−アドレ
ナリン受容体アゴニストが含まれるが、これらに限定さ
れない。この１５年間で、ＧＰＣＲをターゲティングす
る療法薬がほぼ３５０種類市販され、臨床処方される薬
物の約３０％がＧＰＣＲにおけるアゴニストまたはアン
タゴニストとして機能すると推定される。
なターゲットであり、機能が分かっているＧＰＣＲの多
数のアゴニストおよびアンタゴニストが疾病の処置に重
要である。その例には、高血圧症、狭心症および心不全
の治療に用いられるβ1−アドレナリン受容体アンタゴ
ニスト、精神分裂病の治療に用いられるドーパミンＤ２
アンタゴニスト、喘息の治療に用いられるβ2−アドレ
ナリン受容体アゴニストが含まれるが、これらに限定さ
れない。この１５年間で、ＧＰＣＲをターゲティングす
る療法薬がほぼ３５０種類市販され、臨床処方される薬
物の約３０％がＧＰＣＲにおけるアゴニストまたはアン
タゴニストとして機能すると推定される。
【００１１】したがって、オーファン受容体には、痛
み、癌、肥満症、摂食障害、高血圧症、低血圧症、心不
全、失禁、喘息、慢性気管支炎、狭心症、潰瘍、精神障
害および神経障害、ウイルス感染症、たとえばＨＩＶ−
１またはＨＩＶ−２、他の感染症、炎症状態、性的機能
不全、尿生殖器障害、ならびに他の多数の障害、疾患ま
たは機能不全を含めた疾患または障害を治療または予防
する際に重要な役割を果たす他の療法ターゲットが含ま
れる可能性がある。したがって各ＧＰＣＲのリガンドお
よび生理学的機能を見出すことが望ましいのは明らかで
ある。
み、癌、肥満症、摂食障害、高血圧症、低血圧症、心不
全、失禁、喘息、慢性気管支炎、狭心症、潰瘍、精神障
害および神経障害、ウイルス感染症、たとえばＨＩＶ−
１またはＨＩＶ−２、他の感染症、炎症状態、性的機能
不全、尿生殖器障害、ならびに他の多数の障害、疾患ま
たは機能不全を含めた疾患または障害を治療または予防
する際に重要な役割を果たす他の療法ターゲットが含ま
れる可能性がある。したがって各ＧＰＣＲのリガンドお
よび生理学的機能を見出すことが望ましいのは明らかで
ある。
【００１２】ＰＦＩ−０１１はＥＰ１ ０９４ ０７５
において公開された；その配列は他の特許出願、たとえ
ばＤＥ１９９３０５１２、ＷＯ００／２６３３９その他
にもみられる。この配列について種々のデータベースに
対比して検索すると、それはＮ−ホルミルメチオニルペ
プチド受容体ファミリー（ｆＭＬＰ受容体および関連受
容体）に最も近似することが示唆される。しかしこの受
容体は意外にもアドレン酸に応答する。
において公開された；その配列は他の特許出願、たとえ
ばＤＥ１９９３０５１２、ＷＯ００／２６３３９その他
にもみられる。この配列について種々のデータベースに
対比して検索すると、それはＮ−ホルミルメチオニルペ
プチド受容体ファミリー（ｆＭＬＰ受容体および関連受
容体）に最も近似することが示唆される。しかしこの受
容体は意外にもアドレン酸に応答する。
【００１３】副腎および腎臓の中性脂質中にアラキドン
酸の代謝産物アドレン酸（２２：４，ｎ−６）が高濃度
で存在する（Ｂｏｊｅｓｅｎ，Ｉ．（１９７４）Ｌｉｐ
ｉｄｓ，９，８３５−４３；Ｃｏｍａｉ，Ｋ．，Ｆａｒ
ｂｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｐａｕｌｓｒｕｄ，Ｊ．Ｒ．
（１９７５）Ｌｉｐｉｄｓ，１０，５５５−６１）。副
腎ではこれはコレステリルエステルプール中に濃縮さ
れ、ＡＣＴＨにより誘発されるコレステリルエステルの
加水分解に際して放出されると思われる；コレステリル
エステルは、摘出したラット副腎皮質細胞によればＡＣ
ＴＨ刺激−プロスタグランジン合成のためのアラキドン
酸の主な供給源であると思われる（Ｇａｒｒｅｎ，Ｌ．
Ｄ．，Ｇｉｌｌ，Ｇ．Ｎ．，Ｍａｓｕｉ，Ｈ．，ａｎｄ
Ｗａｌｔｏｎ，Ｍ．（１９７１）Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，２７，４３３−７８；Ｖａｈｏｕｎｔｙ，Ｇ．
Ｖ．ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄ
ｉｎｓ，１６，２０７−２２０）。腎髄質においては、
アドレン酸は間質細胞の脂質滴のトリグリセリドプール
の主構成成分であり、増殖中の細胞はこのプールの一部
をＰＥＧ２に変換できる（Ｃａｇｅｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｚｕ
ｓｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｐｉｓａｎｏ，Ｊ．Ｊ．
（１９７９）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，１８，６
１７−２１）。アドレン酸はアラキドン酸の酸素化を阻
害し、これによりプロスタグランジンＰＧＦ２、ＰＧＥ
２およびＰＧＤ２の合成を調節することが証明された。
ウサギにおけるこれの生物学的作用は、血圧および腎流
量を低下させることである（Ｄｕｋａ，Ｔ．，Ｗｕｓｔ
ｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈｅｒｚ Ａ．（１９８０）Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２６，７７１−７６）。プロ
スタグランジンＤ２合成をアドレン酸により阻害する
と、ＰＧＤ２シンターゼノックアウトマウスにより証明
されるように神経機能、たとえば睡眠誘導、痛覚および
体温調節が変調する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，９６，７２６−７３０）。
酸の代謝産物アドレン酸（２２：４，ｎ−６）が高濃度
で存在する（Ｂｏｊｅｓｅｎ，Ｉ．（１９７４）Ｌｉｐ
ｉｄｓ，９，８３５−４３；Ｃｏｍａｉ，Ｋ．，Ｆａｒ
ｂｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｐａｕｌｓｒｕｄ，Ｊ．Ｒ．
（１９７５）Ｌｉｐｉｄｓ，１０，５５５−６１）。副
腎ではこれはコレステリルエステルプール中に濃縮さ
れ、ＡＣＴＨにより誘発されるコレステリルエステルの
加水分解に際して放出されると思われる；コレステリル
エステルは、摘出したラット副腎皮質細胞によればＡＣ
ＴＨ刺激−プロスタグランジン合成のためのアラキドン
酸の主な供給源であると思われる（Ｇａｒｒｅｎ，Ｌ．
Ｄ．，Ｇｉｌｌ，Ｇ．Ｎ．，Ｍａｓｕｉ，Ｈ．，ａｎｄ
Ｗａｌｔｏｎ，Ｍ．（１９７１）Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，２７，４３３−７８；Ｖａｈｏｕｎｔｙ，Ｇ．
Ｖ．ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄ
ｉｎｓ，１６，２０７−２２０）。腎髄質においては、
アドレン酸は間質細胞の脂質滴のトリグリセリドプール
の主構成成分であり、増殖中の細胞はこのプールの一部
をＰＥＧ２に変換できる（Ｃａｇｅｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｚｕ
ｓｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｐｉｓａｎｏ，Ｊ．Ｊ．
（１９７９）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，１８，６
１７−２１）。アドレン酸はアラキドン酸の酸素化を阻
害し、これによりプロスタグランジンＰＧＦ２、ＰＧＥ
２およびＰＧＤ２の合成を調節することが証明された。
ウサギにおけるこれの生物学的作用は、血圧および腎流
量を低下させることである（Ｄｕｋａ，Ｔ．，Ｗｕｓｔ
ｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈｅｒｚ Ａ．（１９８０）Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２６，７７１−７６）。プロ
スタグランジンＤ２合成をアドレン酸により阻害する
と、ＰＧＤ２シンターゼノックアウトマウスにより証明
されるように神経機能、たとえば睡眠誘導、痛覚および
体温調節が変調する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，９６，７２６−７３０）。
【００１４】アドレン酸に対する受容体はまだ同定され
ていないが、その生物学的作用からアドレン酸に対する
受容体は存在するにちがいないことが示唆される。ＰＦ
Ｉ−０１１はアドレン酸に応答するＧＰＣＲである。し
たがってＰＦＩ−０１１のモジュレーターが炎症性疾
患、血圧調節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食障害、
肥満症およびストレス関連障害など種々の障害および疾
患に処方される。
ていないが、その生物学的作用からアドレン酸に対する
受容体は存在するにちがいないことが示唆される。ＰＦ
Ｉ−０１１はアドレン酸に応答するＧＰＣＲである。し
たがってＰＦＩ−０１１のモジュレーターが炎症性疾
患、血圧調節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食障害、
肥満症およびストレス関連障害など種々の障害および疾
患に処方される。
【００１５】発明の態様
本発明の１態様は、ＰＦＩ−０１１のリガンドとして
の、好ましくはＰＦＩ−０１１のモジュレーターとして
の、さらに好ましくはＰＦＩ−０１１のアゴニストとし
ての、アドレン酸またはその類似体もしくは模倣体の使
用である。本発明の好ましい態様においては、ＰＦＩ−
０１１における機能性応答を誘発するためにアドレン酸
またはその類似体もしくは模倣体を使用する。好ましく
は、前記の使用はアドレン酸の使用である。
の、好ましくはＰＦＩ−０１１のモジュレーターとして
の、さらに好ましくはＰＦＩ−０１１のアゴニストとし
ての、アドレン酸またはその類似体もしくは模倣体の使
用である。本発明の好ましい態様においては、ＰＦＩ−
０１１における機能性応答を誘発するためにアドレン酸
またはその類似体もしくは模倣体を使用する。好ましく
は、前記の使用はアドレン酸の使用である。
【００１６】本発明の他の態様は、アドレン酸仲介プロ
セスを調節する化合物の同定方法であって：（ａ）ＰＦ
Ｉ−０１１の試料と、アドレン酸またはその類似体もし
くは模倣体とを、被験化合物もしくは被験化合物混合物
の存在下または不存在下で接触させ；（ｂ）その生物学
的作用を測定することを含む方法である。一般的なアッ
セイでは被験化合物は普通はアドレン酸が結合するもの
と同一のＰＦＩ−０１１部位に結合して作用を示すが、
必ずしもそうである必要はないことは当業者に認識され
るであろう。本発明方法を用いて、アドレン酸結合部位
から離れたＰＦＩ−０１１部位に作用する化合物を同定
することもできる。１態様において本発明方法は、
（ａ）ＰＦＩ−０１１とリガンド（アドレン酸またはそ
の機能性類似体もしくは模倣体）とを被験化合物の存在
下で接触させ；そして（ｂ）被験化合物の不存在下でＰ
ＦＩ−０１１に結合したリガンドの量を測定し、（ａ）
と（ｂ）で測定したリガンド結合量が異なる場合、ＰＦ
Ｉ−０１１へのリガンドの結合を調節する化合物が同定
される。１態様において、工程（ａ）で接触させるＰＦ
Ｉ−０１１は細胞表面にある。他の態様において、ＰＦ
Ｉ−０１１は固体表面に固定化される。他の態様におい
て、固体表面はマイクロタイターディッシュである。さ
らに他の態様において、ＰＦＩ−０１１は懸濁状態で用
いられる膜調製物である。
セスを調節する化合物の同定方法であって：（ａ）ＰＦ
Ｉ−０１１の試料と、アドレン酸またはその類似体もし
くは模倣体とを、被験化合物もしくは被験化合物混合物
の存在下または不存在下で接触させ；（ｂ）その生物学
的作用を測定することを含む方法である。一般的なアッ
セイでは被験化合物は普通はアドレン酸が結合するもの
と同一のＰＦＩ−０１１部位に結合して作用を示すが、
必ずしもそうである必要はないことは当業者に認識され
るであろう。本発明方法を用いて、アドレン酸結合部位
から離れたＰＦＩ−０１１部位に作用する化合物を同定
することもできる。１態様において本発明方法は、
（ａ）ＰＦＩ−０１１とリガンド（アドレン酸またはそ
の機能性類似体もしくは模倣体）とを被験化合物の存在
下で接触させ；そして（ｂ）被験化合物の不存在下でＰ
ＦＩ−０１１に結合したリガンドの量を測定し、（ａ）
と（ｂ）で測定したリガンド結合量が異なる場合、ＰＦ
Ｉ−０１１へのリガンドの結合を調節する化合物が同定
される。１態様において、工程（ａ）で接触させるＰＦ
Ｉ−０１１は細胞表面にある。他の態様において、ＰＦ
Ｉ−０１１は固体表面に固定化される。他の態様におい
て、固体表面はマイクロタイターディッシュである。さ
らに他の態様において、ＰＦＩ−０１１は懸濁状態で用
いられる膜調製物である。
【００１７】したがって本発明の１態様は、アドレン酸
またはその類似体もしくは模倣体をリガンドとして用い
て、ＰＦＩ−０１１のリガンド、好ましくはモジュレー
ター、さらに好ましくはアゴニストまたはアンタゴニス
トをスクリーニングする方法である。
またはその類似体もしくは模倣体をリガンドとして用い
て、ＰＦＩ−０１１のリガンド、好ましくはモジュレー
ター、さらに好ましくはアゴニストまたはアンタゴニス
トをスクリーニングする方法である。
【００１８】本発明の他の態様は、アドレン酸受容体の
リガンド、好ましくはモジュレーター、より好ましくは
アゴニストまたはアンタゴニストである化合物をスクリ
ーニングする方法であって： （ａ）ＰＦＩ−０１１の試料と、アドレン酸またはその
類似体もしくは模倣体から選択されるリガンドとを接触
させ；（ｂ）同様なＰＦＩ−０１１の試料と、工程
（ａ）で用いたリガンドおよび被験化合物もしくは被験
化合物混合物の両方とを接触させ；そして（ｃ）（ａ）
と（ｂ）の結果を比較して、用いたリガンドの結合が被
験化合物もしくは被験化合物混合物の存在により影響さ
れたかを判定する工程を含む（これらに限定されない）
方法である。
リガンド、好ましくはモジュレーター、より好ましくは
アゴニストまたはアンタゴニストである化合物をスクリ
ーニングする方法であって： （ａ）ＰＦＩ−０１１の試料と、アドレン酸またはその
類似体もしくは模倣体から選択されるリガンドとを接触
させ；（ｂ）同様なＰＦＩ−０１１の試料と、工程
（ａ）で用いたリガンドおよび被験化合物もしくは被験
化合物混合物の両方とを接触させ；そして（ｃ）（ａ）
と（ｂ）の結果を比較して、用いたリガンドの結合が被
験化合物もしくは被験化合物混合物の存在により影響さ
れたかを判定する工程を含む（これらに限定されない）
方法である。
【００１９】さらに好ましくは、本発明方法は：
（ａ）ＰＦＩ−０１１の試料と、検出可能な標識を含む
アドレン酸（またはその類似体もしくは模倣体）とを、
被験化合物もしくは被験化合物混合物の存在下または不
存在下で接触させ； （ｂ）結合した標識量を測定し、被験化合物もしくは被
験化合物混合物の不存在下で結合した標識量と比較して
被験化合物もしくは被験化合物混合物の存在下で結合し
た標識量が減少したことにより、アドレン酸受容体への
被験化合物もしくは被験化合物混合物の結合を同定する
工程を含む（これらに限定されない）。
アドレン酸（またはその類似体もしくは模倣体）とを、
被験化合物もしくは被験化合物混合物の存在下または不
存在下で接触させ； （ｂ）結合した標識量を測定し、被験化合物もしくは被
験化合物混合物の不存在下で結合した標識量と比較して
被験化合物もしくは被験化合物混合物の存在下で結合し
た標識量が減少したことにより、アドレン酸受容体への
被験化合物もしくは被験化合物混合物の結合を同定する
工程を含む（これらに限定されない）。
【００２０】本発明の他の態様は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１を含むヌクレオチド配列またはその変異体もしく
は相同体によりコードされる受容体を調節するための、
好ましくは作動または拮抗するための、アドレン酸また
はその類似体もしくは模倣体の使用である。
Ｏ：１を含むヌクレオチド配列またはその変異体もしく
は相同体によりコードされる受容体を調節するための、
好ましくは作動または拮抗するための、アドレン酸また
はその類似体もしくは模倣体の使用である。
【００２１】本発明の他の態様は、アッセイにおけるア
ドレン酸受容体の使用であって、受容体がＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２のタンパク質を含むか、またはその変異体も
しくは相同体であるものである。
ドレン酸受容体の使用であって、受容体がＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２のタンパク質を含むか、またはその変異体も
しくは相同体であるものである。
【００２２】本発明の他の態様は、アドレン酸受容体の
発現方法であって、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１またはその変
異体もしくは相同体を含む適切な発現ベクターを適切な
宿主細胞に伝達し、該宿主細胞を該受容体の発現に適し
た条件下で培養することを含む方法である。適切な宿主
細胞は細菌、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビ
シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）もしくはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）、または好ましくは昆虫細胞、または
より好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくは宿
主細胞はヒト細胞である。本発明の他の態様は、アドレ
ン酸受容体の発現方法であって、適切な細胞においてＰ
ＦＩ−０１１の発現をアップレギュレートすることを含
む方法である。これは、ＰＦＩ−０１１遺伝子の前に強
力なプロモーターを挿入することにより、たとえばＥＰ
４１１６７８におけるエリスロポエチンの発現に用いる
のと同様な方法で達成できるが、ＰＦＩ−０１１発現を
アップレギュレートするための他の方法も考慮される。
したがって上記方法におけるＰＦＩ−０１１の試料は、
ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、当技術分野で利用
できるかもしくは将来開発される種々の方法でＰＦＩ−
０１１発現がアップレギュレートされた細胞、あるいは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはその変異体もしく
は相同体あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質
配列をコードする配列を含む発現構築体でトランスフェ
クションした細胞に由来するものであってよい。
発現方法であって、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１またはその変
異体もしくは相同体を含む適切な発現ベクターを適切な
宿主細胞に伝達し、該宿主細胞を該受容体の発現に適し
た条件下で培養することを含む方法である。適切な宿主
細胞は細菌、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビ
シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）もしくはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）、または好ましくは昆虫細胞、または
より好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくは宿
主細胞はヒト細胞である。本発明の他の態様は、アドレ
ン酸受容体の発現方法であって、適切な細胞においてＰ
ＦＩ−０１１の発現をアップレギュレートすることを含
む方法である。これは、ＰＦＩ−０１１遺伝子の前に強
力なプロモーターを挿入することにより、たとえばＥＰ
４１１６７８におけるエリスロポエチンの発現に用いる
のと同様な方法で達成できるが、ＰＦＩ−０１１発現を
アップレギュレートするための他の方法も考慮される。
したがって上記方法におけるＰＦＩ−０１１の試料は、
ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、当技術分野で利用
できるかもしくは将来開発される種々の方法でＰＦＩ−
０１１発現がアップレギュレートされた細胞、あるいは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはその変異体もしく
は相同体あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質
配列をコードする配列を含む発現構築体でトランスフェ
クションした細胞に由来するものであってよい。
【００２３】ＰＦＩ−０１１の試料は、前記の方法で調
製した細胞、ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、また
はＰＦＩ−０１１を発現する任意の細胞から調製した膜
調製物、あるいはそれらの細胞または膜から富化または
精製したＰＦＩ−０１１タンパク質を含む。ＰＦＩ−０
１１を富化または精製する方法は当業者に自明であり、
アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および
複雑な混合物からタンパク質を分離するのに適した他の
方法を含む。
製した細胞、ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、また
はＰＦＩ−０１１を発現する任意の細胞から調製した膜
調製物、あるいはそれらの細胞または膜から富化または
精製したＰＦＩ−０１１タンパク質を含む。ＰＦＩ−０
１１を富化または精製する方法は当業者に自明であり、
アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および
複雑な混合物からタンパク質を分離するのに適した他の
方法を含む。
【００２４】本発明のさらに他の態様は、アドレン酸受
容体のアゴニストをスクリーニングする方法であって： （ａ）被験化合物または被験化合物混合物を、ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞に添加し； （ｂ）機能性応答がみられるかを判定する工程を含む方
法である。
容体のアゴニストをスクリーニングする方法であって： （ａ）被験化合物または被験化合物混合物を、ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞に添加し； （ｂ）機能性応答がみられるかを判定する工程を含む方
法である。
【００２５】本発明の好ましい態様において、機能性応
答は一時的な細胞内カルシウム濃度上昇であり、これは
蛍光色素、たとえばＦｌｕｏ−３またはＩｎｄｏ−１を
用いて、あるいは当業者に既知の他の手段で測定でき
る。本発明の他の好ましい態様において、機能性応答は
マイクロフィジオメトリーにより測定した周囲媒質の酸
性化速度の上昇として測定される、細胞の呼吸速度上昇
である。本発明のさらに他の好ましい態様において、機
能性応答はたとえばレポーター遺伝子生成物の活性増大
により測定した細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の増減で
あり、その際レポーター遺伝子のコード領域は、少なく
とも１つのサイクリックＡＭＰ応答配列を含むプロモー
ターに機能可能な状態で結合している。細胞におけるサ
イクリックＡＭＰ濃度の変化を測定する他の方法は当業
者に周知である。本発明の他の好ましい態様において
は、ＰＦＩ−０１１およびＧＦＰ−β−アレスチン複合
体を同時発現するプラスミド（１以上）で細胞をトラン
スフェクションし、細胞表面における蛍光のクラスタリ
ング、すなわちＧＦＰ−β−アレスチン複合体を観察す
ることにより受容体のアゴニストを同定する。ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞は、ＰＦＩ−０１１を自然
発現する細胞、前記によりＰＦＩ−０１１発現がアップ
レギュレートされた細胞、あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１の配列またはその変異体もしくは相同体あるいは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質配列をコードする
配列を含む発現構築体でトランスフェクションすること
によりＰＦＩ−０１１を発現した細胞から選択される。
答は一時的な細胞内カルシウム濃度上昇であり、これは
蛍光色素、たとえばＦｌｕｏ−３またはＩｎｄｏ−１を
用いて、あるいは当業者に既知の他の手段で測定でき
る。本発明の他の好ましい態様において、機能性応答は
マイクロフィジオメトリーにより測定した周囲媒質の酸
性化速度の上昇として測定される、細胞の呼吸速度上昇
である。本発明のさらに他の好ましい態様において、機
能性応答はたとえばレポーター遺伝子生成物の活性増大
により測定した細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の増減で
あり、その際レポーター遺伝子のコード領域は、少なく
とも１つのサイクリックＡＭＰ応答配列を含むプロモー
ターに機能可能な状態で結合している。細胞におけるサ
イクリックＡＭＰ濃度の変化を測定する他の方法は当業
者に周知である。本発明の他の好ましい態様において
は、ＰＦＩ−０１１およびＧＦＰ−β−アレスチン複合
体を同時発現するプラスミド（１以上）で細胞をトラン
スフェクションし、細胞表面における蛍光のクラスタリ
ング、すなわちＧＦＰ−β−アレスチン複合体を観察す
ることにより受容体のアゴニストを同定する。ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞は、ＰＦＩ−０１１を自然
発現する細胞、前記によりＰＦＩ−０１１発現がアップ
レギュレートされた細胞、あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１の配列またはその変異体もしくは相同体あるいは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質配列をコードする
配列を含む発現構築体でトランスフェクションすること
によりＰＦＩ−０１１を発現した細胞から選択される。
【００２６】本発明は、アドレン酸受容体のアンタゴニ
ストをスクリーニングする方法であって： （ａ）被験化合物または被験化合物混合物を、ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞に添加し；（ｂ）アドレン
酸またはその類似体もしくは模倣体、または前記方法で
同定したアゴニストを添加し；そして（ｃ）機能性応答
がみられるかを判定し、工程（ｂ）で用いたリガンドに
対する機能性応答を低下させる被験化合物または被験化
合物混合物としてアンタゴニストを同定する工程を含む
（これらに限定されない）方法をも含む。
ストをスクリーニングする方法であって： （ａ）被験化合物または被験化合物混合物を、ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞に添加し；（ｂ）アドレン
酸またはその類似体もしくは模倣体、または前記方法で
同定したアゴニストを添加し；そして（ｃ）機能性応答
がみられるかを判定し、工程（ｂ）で用いたリガンドに
対する機能性応答を低下させる被験化合物または被験化
合物混合物としてアンタゴニストを同定する工程を含む
（これらに限定されない）方法をも含む。
【００２７】ＰＦＩ−０１１を発現する適切な細胞は、
ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、前記によりＰＦＩ
−０１１発現がアップレギュレートされた細胞、あるい
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはその変異体もし
くは相同体あるいはＳＥＱＩＤ ＮＯ：２のタンパク質
配列をコードする配列を含む発現構築体でトランスフェ
クションすることによりＰＦＩ−０１１を発現した細胞
である。この方法に使用できる機能性応答の例は前記の
とおりである。
ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、前記によりＰＦＩ
−０１１発現がアップレギュレートされた細胞、あるい
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはその変異体もし
くは相同体あるいはＳＥＱＩＤ ＮＯ：２のタンパク質
配列をコードする配列を含む発現構築体でトランスフェ
クションすることによりＰＦＩ−０１１を発現した細胞
である。この方法に使用できる機能性応答の例は前記の
とおりである。
【００２８】本発明の他の態様は、本発明のいずれかの
方法で同定した化合物、ならびに本発明のいずれかの方
法で同定した化合物および適切な医薬的に許容できるキ
ャリヤーを含む医薬組成物である。
方法で同定した化合物、ならびに本発明のいずれかの方
法で同定した化合物および適切な医薬的に許容できるキ
ャリヤーを含む医薬組成物である。
【００２９】本発明の他の態様は、本発明のいずれかの
方法で化合物がアドレン酸受容体アゴニストまたはアン
タゴニストであるかを判定し、該化合物を医薬的に許容
できるキャリヤーと混合することを含む、医薬組成物の
調製方法である。
方法で化合物がアドレン酸受容体アゴニストまたはアン
タゴニストであるかを判定し、該化合物を医薬的に許容
できるキャリヤーと混合することを含む、医薬組成物の
調製方法である。
【００３０】したがって本発明は、特にアドレン酸関連
障害、たとえば炎症性疾患、血圧調節、睡眠異常、痛
み、体温調節、摂食障害、肥満症およびストレス関連障
害の処置に有用な化合物のスクリーニング方法に関す
る。
障害、たとえば炎症性疾患、血圧調節、睡眠異常、痛
み、体温調節、摂食障害、肥満症およびストレス関連障
害の処置に有用な化合物のスクリーニング方法に関す
る。
【００３１】本発明は、さらにそれらの化合物（たとえ
ばアゴニストまたはアンタゴニスト）の生物活性を解明
し、結果として得られるそれらの有用性を解明するため
のアッセイ方法をも提供する。同定したある種の化合物
は、アドレン酸が関与する障害および状態、たとえば炎
症性疾患、血圧調節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食
障害、肥満症およびストレス関連障害の処置に有用であ
る。
ばアゴニストまたはアンタゴニスト）の生物活性を解明
し、結果として得られるそれらの有用性を解明するため
のアッセイ方法をも提供する。同定したある種の化合物
は、アドレン酸が関与する障害および状態、たとえば炎
症性疾患、血圧調節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食
障害、肥満症およびストレス関連障害の処置に有用であ
る。
【００３２】本発明の他の態様は、哺乳動物においてア
ドレン酸仲介障害を検出する方法であって、患者試料の
ＰＦＩ−０１１遺伝子発現またはＰＦＩ−０１１受容体
のレベルを測定し、その結果、測定レベルが臨床的に正
常な個体からのレベルと異なる場合はアドレン酸／ＰＦ
Ｉ−０１１関連障害が検出される。ＰＦＩ−０１１を測
定するためのキット、たとえばＰＦＩ−０１１を特異的
に認識する抗体（後記参照）を含むか、あるいはＰＦＩ
−０１１ ｍＲＮＡを測定するための手段、たとえばＰ
ＦＩ−０１１ ｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ
またはＰＦＩ−０１１ ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡのＰ
ＣＲベース検出に適したプライマーを含むキットも提供
される。
ドレン酸仲介障害を検出する方法であって、患者試料の
ＰＦＩ−０１１遺伝子発現またはＰＦＩ−０１１受容体
のレベルを測定し、その結果、測定レベルが臨床的に正
常な個体からのレベルと異なる場合はアドレン酸／ＰＦ
Ｉ−０１１関連障害が検出される。ＰＦＩ−０１１を測
定するためのキット、たとえばＰＦＩ−０１１を特異的
に認識する抗体（後記参照）を含むか、あるいはＰＦＩ
−０１１ ｍＲＮＡを測定するための手段、たとえばＰ
ＦＩ−０１１ ｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ
またはＰＦＩ−０１１ ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡのＰ
ＣＲベース検出に適したプライマーを含むキットも提供
される。
【００３３】たとえば、ＰＦＩ−０１１のレベルは、酵
素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学的方法、免
疫細胞化学的方法、ウェスタンブロット、または当業者
に周知の他の方法など、免疫アッセイにより検出でき
る。ＰＦＩ−０１１ ＲＮＡのレベルはハイブリダイゼ
ーションアッセイ（たとえばノーザンブロット、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）により検出でき、Ｐ
ＦＩ−０１１活性は前記のようにｉｎ ｖｉｖｏまたは
ｉｎ ｖｉｔｒｏで結合活性または機能活性を測定する
ことによりアッセイできる。ＰＦＩ−０１１核酸におけ
るトランスロケーション、欠失、および点変異は、サザ
ンブロット、ＦＩＳＨ、ＲＦＬＰ分析、ＳＳＣＰ、好ま
しくは少なくともＰＦＩ−０１１遺伝子の大部分を含む
フラグメントを生成するプライマーを用いるＰＣＲ、患
者から得たＰＦＩ−０１１ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
の配列決定などにより検出できる。
素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学的方法、免
疫細胞化学的方法、ウェスタンブロット、または当業者
に周知の他の方法など、免疫アッセイにより検出でき
る。ＰＦＩ−０１１ ＲＮＡのレベルはハイブリダイゼ
ーションアッセイ（たとえばノーザンブロット、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）により検出でき、Ｐ
ＦＩ−０１１活性は前記のようにｉｎ ｖｉｖｏまたは
ｉｎ ｖｉｔｒｏで結合活性または機能活性を測定する
ことによりアッセイできる。ＰＦＩ−０１１核酸におけ
るトランスロケーション、欠失、および点変異は、サザ
ンブロット、ＦＩＳＨ、ＲＦＬＰ分析、ＳＳＣＰ、好ま
しくは少なくともＰＦＩ−０１１遺伝子の大部分を含む
フラグメントを生成するプライマーを用いるＰＣＲ、患
者から得たＰＦＩ−０１１ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
の配列決定などにより検出できる。
【００３４】たとえば転写に影響を与え、スプライシン
グ事象または翻訳を妨害することによりＰＦＩ−０１１
遺伝子活性に影響を与える化合物も、本発明方法により
同定できる。ＰＦＩ−０１１へのアゴニストの結合によ
り生じる信号伝達を調節する化合物が本発明方法で検出
でき、本発明の範囲に含まれることも留意すべきであ
る。
グ事象または翻訳を妨害することによりＰＦＩ−０１１
遺伝子活性に影響を与える化合物も、本発明方法により
同定できる。ＰＦＩ−０１１へのアゴニストの結合によ
り生じる信号伝達を調節する化合物が本発明方法で検出
でき、本発明の範囲に含まれることも留意すべきであ
る。
【００３５】本明細書において、”相同体”または”変
異体”という用語は、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１および２に
特定したアミノ酸配列およびヌクレオチド配列と一定の
相同性をもつものを表す。相同配列は、特定した配列に
少なくとも７５、８５または９０％、好ましくは少なく
とも９５または９８％同一であるアミノ酸配列、あるい
は特定した配列に少なくとも７５、８５または９０％、
好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるヌク
レオチド配列を含むものとする。そのような配列相同性
／同一性は、公表または市販されたバイオインフォーマ
ティクスソフトウェア、たとえばＢｌａｓｔ２（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０
２）、またはＧＣＧソフトウェアパッケージに含まれる
プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔ ａｌ．（１９８
４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３８７；
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ
１０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＧＣＧ、ウィスコンシン州マディソン））、たと
えばＢｅｓｔｆｉｔもしくはＧａｐによって容易に評価
できる。
異体”という用語は、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１および２に
特定したアミノ酸配列およびヌクレオチド配列と一定の
相同性をもつものを表す。相同配列は、特定した配列に
少なくとも７５、８５または９０％、好ましくは少なく
とも９５または９８％同一であるアミノ酸配列、あるい
は特定した配列に少なくとも７５、８５または９０％、
好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるヌク
レオチド配列を含むものとする。そのような配列相同性
／同一性は、公表または市販されたバイオインフォーマ
ティクスソフトウェア、たとえばＢｌａｓｔ２（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０
２）、またはＧＣＧソフトウェアパッケージに含まれる
プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔ ａｌ．（１９８
４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３８７；
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ
１０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＧＣＧ、ウィスコンシン州マディソン））、たと
えばＢｅｓｔｆｉｔもしくはＧａｐによって容易に評価
できる。
【００３６】本明細書において、”類似体”という用語
は、基準物質、たとえばアドレン酸の構造に類似する物
質を表す。本明細書中で用いる”模倣体”という用語
は、基準物質、たとえばアドレン酸と同じ性質の活性ま
たは作用をもつ物質を表す（ペプチド、ポリペプチド、
抗体、または他の有機化合物が含まれるが、これらに限
定されない）。
は、基準物質、たとえばアドレン酸の構造に類似する物
質を表す。本明細書中で用いる”模倣体”という用語
は、基準物質、たとえばアドレン酸と同じ性質の活性ま
たは作用をもつ物質を表す（ペプチド、ポリペプチド、
抗体、または他の有機化合物が含まれるが、これらに限
定されない）。
【００３７】”受容体／酵素のモジュレーター”という
用語は、各受容体／酵素に結合してそれらに作用する物
質を表す。”受容体のアゴニスト”という用語は、各受
容体を刺激しうる物質を表す。
用語は、各受容体／酵素に結合してそれらに作用する物
質を表す。”受容体のアゴニスト”という用語は、各受
容体を刺激しうる物質を表す。
【００３８】”受容体のアンタゴニスト”という用語
は、アゴニストによる各受容体の刺激を阻害しうる物質
を表す。”機能性応答”という用語は、たとえば受容体
の刺激により細胞に生じる反応を表す。Ｇタンパク質共
役型受容体の場合、これにはたとえばサイクリックＡＭ
Ｐの濃度変化、一時的な細胞内カルシウム濃度上昇、ま
たはイオンチャンネルの開放が含まれる。
は、アゴニストによる各受容体の刺激を阻害しうる物質
を表す。”機能性応答”という用語は、たとえば受容体
の刺激により細胞に生じる反応を表す。Ｇタンパク質共
役型受容体の場合、これにはたとえばサイクリックＡＭ
Ｐの濃度変化、一時的な細胞内カルシウム濃度上昇、ま
たはイオンチャンネルの開放が含まれる。
【００３９】”レポーター遺伝子”という用語は、測定
に好都合なタンパク質をコードする遺伝子を表す。好ま
しくは、レポーター遺伝子として用いる遺伝子は使用す
る細胞において自然発現しない。その例には、β−ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはβ−ラクタマーゼ
である。一般に受容体遺伝子は基本的プロモーターに結
合してプロモーターまたは応答配列もしくは数種類の応
答配列の後に挿入され、刺激信号を受けるとレポーター
遺伝子が翻訳され、対応する酵素の活性が増大し、これ
を容易に測定できる。
に好都合なタンパク質をコードする遺伝子を表す。好ま
しくは、レポーター遺伝子として用いる遺伝子は使用す
る細胞において自然発現しない。その例には、β−ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはβ−ラクタマーゼ
である。一般に受容体遺伝子は基本的プロモーターに結
合してプロモーターまたは応答配列もしくは数種類の応
答配列の後に挿入され、刺激信号を受けるとレポーター
遺伝子が翻訳され、対応する酵素の活性が増大し、これ
を容易に測定できる。
【００４０】”化合物”という用語は任意の化学物質を
表し、これには有機低分子、ペプチド、タンパク質、修
飾タンパク質、たとえば糖タンパク質もしくはリポタン
パク質、抗体もしくはそのフラグメント、核酸、たとえ
ばＤＮＡもしくはＲＮＡ、または修飾核酸、たとえば修
飾主鎖をもつオリゴヌクレオチドが含まれるが、これら
に限定されない。
表し、これには有機低分子、ペプチド、タンパク質、修
飾タンパク質、たとえば糖タンパク質もしくはリポタン
パク質、抗体もしくはそのフラグメント、核酸、たとえ
ばＤＮＡもしくはＲＮＡ、または修飾核酸、たとえば修
飾主鎖をもつオリゴヌクレオチドが含まれるが、これら
に限定されない。
【００４１】発明の詳細な記述
本発明方法は、たとえばアドレン酸またはその類似体も
しくは模倣体の相互作用を調節する化合物、たとえば低
分子有機化合物またはペプチドもしくはタンパク質の同
定に使用できる。したがって本発明方法によりスクリー
ニングできる物質には抗体およびそのフラグメントも含
まれる。たとえば、ＰＦＩ−０１１の細胞外ドメイン
（ＥＣＤ）に結合して、天然リガンドにより誘発される
活性を阻害する（すなわちアンタゴニスト）か、または
天然リガンドにより誘発される活性を模倣する（すなわ
ちアゴニスト）ペプチド模倣有機化合物もスクリーニン
グできる。さらに、ＰＦＩ−０１１の細胞外ドメイン
（またはその一部）が共有結合する有機化合物、ペプチ
ド、抗体またはそのフラグメントもＰＦＩ−０１１リガ
ンドに結合し、したがって”中和”する。そのような複
雑な物質のスクリーニングも本発明に包含される。
しくは模倣体の相互作用を調節する化合物、たとえば低
分子有機化合物またはペプチドもしくはタンパク質の同
定に使用できる。したがって本発明方法によりスクリー
ニングできる物質には抗体およびそのフラグメントも含
まれる。たとえば、ＰＦＩ−０１１の細胞外ドメイン
（ＥＣＤ）に結合して、天然リガンドにより誘発される
活性を阻害する（すなわちアンタゴニスト）か、または
天然リガンドにより誘発される活性を模倣する（すなわ
ちアゴニスト）ペプチド模倣有機化合物もスクリーニン
グできる。さらに、ＰＦＩ−０１１の細胞外ドメイン
（またはその一部）が共有結合する有機化合物、ペプチ
ド、抗体またはそのフラグメントもＰＦＩ−０１１リガ
ンドに結合し、したがって”中和”する。そのような複
雑な物質のスクリーニングも本発明に包含される。
【００４２】スクリーニングに使用できる化合物にはた
とえば下記のものが含まれるが、これらに限定されな
い：ペプチド、たとえば可溶性ペプチド：ランダムペプ
チドライブラリーのメンバー（たとえばＬａｍ ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２−８
４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａ
ｔｕｒｅ，３５４，８４−８６参照）、ならびにコンビ
ナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーであっ
て、Ｄ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸からな
るもの、ホスホペプチド（ランダムまたは部分縮重、指
向性ホスホペプチドライブラリーのメンバーが含まれる
が、これらに限定されない；たとえばＳｏｎｇｙａｎｇ
ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７２，７６７−
７７８参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナ
ル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗
体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂ発現
ライブラリーフラグメント、ならびにそのエピトープ結
合フラグメントが含まれるが、これらに限定されな
い）、ならびに有機または無機の低分子。
とえば下記のものが含まれるが、これらに限定されな
い：ペプチド、たとえば可溶性ペプチド：ランダムペプ
チドライブラリーのメンバー（たとえばＬａｍ ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２−８
４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａ
ｔｕｒｅ，３５４，８４−８６参照）、ならびにコンビ
ナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーであっ
て、Ｄ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸からな
るもの、ホスホペプチド（ランダムまたは部分縮重、指
向性ホスホペプチドライブラリーのメンバーが含まれる
が、これらに限定されない；たとえばＳｏｎｇｙａｎｇ
ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７２，７６７−
７７８参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナ
ル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗
体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂ発現
ライブラリーフラグメント、ならびにそのエピトープ結
合フラグメントが含まれるが、これらに限定されな
い）、ならびに有機または無機の低分子。
【００４３】本発明の１態様においては、本発明方法に
おいてスクリーニングするために用いる被験化合物源と
してペプチドライブラリーを使用できる。多様なライブ
ラリー、たとえばランダムまたはコンビナトリアル−ペ
プチドまたは非ペプチドライブラリーを、ＰＦＩ−０１
１受容体に特異的に結合する分子についてスクリーニン
グできる。化学合成したライブラリー、組換えライブラ
リー（たとえばファージディスプレーライブラリー）、
およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ベースのライブラリーな
ど、当技術分野で既知の多くライブラリーを使用でき
る。
おいてスクリーニングするために用いる被験化合物源と
してペプチドライブラリーを使用できる。多様なライブ
ラリー、たとえばランダムまたはコンビナトリアル−ペ
プチドまたは非ペプチドライブラリーを、ＰＦＩ−０１
１受容体に特異的に結合する分子についてスクリーニン
グできる。化学合成したライブラリー、組換えライブラ
リー（たとえばファージディスプレーライブラリー）、
およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ベースのライブラリーな
ど、当技術分野で既知の多くライブラリーを使用でき
る。
【００４４】化学合成したライブラリーの例は下記に記
載されている：Ｆｏｄｏｒ ｅｔａｌ．（９９１）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅ
ｎｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８
４−８６；Ｌａｍ ｅｔａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５４，８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ（１９９
４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７０９−７
１０；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍ
ｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１２３
３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９
９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９０，１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，９１，１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇ
ｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ，１３，４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１６１４−１６１８；Ｓａ
ｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１１７０８−１
１７１２；ＷＯ９３／２０２４２；およびＢｒｅｎｎｅ
ｒ ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５３８１−５
３８３。
載されている：Ｆｏｄｏｒ ｅｔａｌ．（９９１）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅ
ｎｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８
４−８６；Ｌａｍ ｅｔａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５４，８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ（１９９
４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７０９−７
１０；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍ
ｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１２３
３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９
９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９０，１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，９１，１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇ
ｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ，１３，４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１６１４−１６１８；Ｓａ
ｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１１７０８−１
１７１２；ＷＯ９３／２０２４２；およびＢｒｅｎｎｅ
ｒ ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５３８１−５
３８３。
【００４５】ファージディスプレーライブラリーの例
は、Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４
−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔ ａｌ．（１９９
２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７，７１１−７１
８；Ｌｅｎｓｔｒａ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈ．，１５２，１４９−１５７；Ｋａｙ ｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ，１２８，５９−６５；お
よびＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日付）
に記載されている。
は、Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４
−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔ ａｌ．（１９９
２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７，７１１−７１
８；Ｌｅｎｓｔｒａ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈ．，１５２，１４９−１５７；Ｋａｙ ｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ，１２８，５９−６５；お
よびＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日付）
に記載されている。
【００４６】非ペプチドライブラリーの例として、ベン
ゾジアゼピンライブラリー（たとえばＢｕｎｉｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４７０８−４７１２参照）を使
用できる。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９３６７−９３７１）も使用で
きる。使用できるライブラリーの他の例であって、ペプ
チド中のアミド官能基が完全メチル化されて化学変換し
たコンビナトリアルライブラリーを形成したものがＯｓ
ｔｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１１１３８−
１１１４２に記載されている。
ゾジアゼピンライブラリー（たとえばＢｕｎｉｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４７０８−４７１２参照）を使
用できる。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９３６７−９３７１）も使用で
きる。使用できるライブラリーの他の例であって、ペプ
チド中のアミド官能基が完全メチル化されて化学変換し
たコンビナトリアルライブラリーを形成したものがＯｓ
ｔｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１１１３８−
１１１４２に記載されている。
【００４７】ライブラリーのスクリーニングは、多様な
周知の方法で達成できる。たとえば、ペプチドライブラ
リーのスクリーニングを記載した下記の文献を参照：Ｐ
ａｒｍｌｅｙ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２５１，２１５−２１８；
Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４９，３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１
３，４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔａｌ．
（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８９，５３９３−５３９７；Ｙｕ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ，７６，９３３−９４５；Ｓ
ｔａｕｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４１，５７７−５８０；Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．
（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５５，５６４−５６６；
Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６９８８−６
９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎｅｔ ａｌ．（１９９２）
Ｎａｔｕｒｅ，３５５，８５０−８５２；ＵＳＰ５，０
９６，８１５、ＵＳＰ５，２２３，４０９およびＵＳＰ
５，１９８，３４６（すべてＬａｄｎｅｒらに）；Ｒｅ
ｂａｒ ＆ Ｐａｂｏ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
６３，６７１−６７３；ならびにＷＯ９４／１８３１
８。
周知の方法で達成できる。たとえば、ペプチドライブラ
リーのスクリーニングを記載した下記の文献を参照：Ｐ
ａｒｍｌｅｙ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２５１，２１５−２１８；
Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４９，３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１
３，４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔａｌ．
（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８９，５３９３−５３９７；Ｙｕ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ，７６，９３３−９４５；Ｓ
ｔａｕｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４１，５７７−５８０；Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．
（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５５，５６４−５６６；
Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６９８８−６
９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎｅｔ ａｌ．（１９９２）
Ｎａｔｕｒｅ，３５５，８５０−８５２；ＵＳＰ５，０
９６，８１５、ＵＳＰ５，２２３，４０９およびＵＳＰ
５，１９８，３４６（すべてＬａｄｎｅｒらに）；Ｒｅ
ｂａｒ ＆ Ｐａｂｏ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
６３，６７１−６７３；ならびにＷＯ９４／１８３１
８。
【００４８】本発明方法により検査および同定できる化
合物には下記を含めた業者から市販されている化合物が
含まれるが、これらに限定されない：Ａｌｄｒｉｃｈ
（１００１ Ｗｅｓｔ Ｓｔ．Ｐａｕｌ Ａｖｅ．，Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １４５０８，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１７８）、Ｆｌｕｋａ Ｃ
ｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｉｎｄｕｔｒｉｅｓｔｒａｓｓｅ
２５，ＣＨ−９４７１ Ｂｕｃｈｓ，スイス（Ｆｌｕｋ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，９８０ Ｓｏｕｔ
ｈ ２ｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，Ｎ
Ｙ １１７７９））、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ４３１，Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，ＴＮ
３７６６２）、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ ＧｍｂＨ（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ
１１６，Ｄ−６８２９８ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔａｋ
ａｓａｇｏ（４ ＶｏｌｖｏＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｌｅ
ｉｇｈ，ＮＪ ０７６４７）、ＳＳＴ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ（６３５ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｃｌ
ｉｆｔｏｎ，ＮＪ ０７０１２）、Ｆｅｒｒｏ（１１１
Ｗｅｓｔ Ｉｒｅｎｅ Ｒｏａｄ，Ｚａｃｈａｒｙ，
ＬＡ ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ Ａ
Ｇ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ Ｄ−３０９１８，Ｓｅｅｌｚｅ，
ドイツ）、ＰＰＧ ＩｎｄｕｔｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｎｅ ＰＰＧ Ｐｌａｃ
ｅ，３４ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐ
Ａ １５２７２）。さらに、任意の種類の天然産物を本
発明方法でスクリーニングでき、これには微生物、真
菌、植物または動物の抽出物が含まれる。
合物には下記を含めた業者から市販されている化合物が
含まれるが、これらに限定されない：Ａｌｄｒｉｃｈ
（１００１ Ｗｅｓｔ Ｓｔ．Ｐａｕｌ Ａｖｅ．，Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １４５０８，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１７８）、Ｆｌｕｋａ Ｃ
ｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｉｎｄｕｔｒｉｅｓｔｒａｓｓｅ
２５，ＣＨ−９４７１ Ｂｕｃｈｓ，スイス（Ｆｌｕｋ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，９８０ Ｓｏｕｔ
ｈ ２ｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，Ｎ
Ｙ １１７７９））、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ４３１，Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，ＴＮ
３７６６２）、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ ＧｍｂＨ（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ
１１６，Ｄ−６８２９８ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔａｋ
ａｓａｇｏ（４ ＶｏｌｖｏＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｌｅ
ｉｇｈ，ＮＪ ０７６４７）、ＳＳＴ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ（６３５ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｃｌ
ｉｆｔｏｎ，ＮＪ ０７０１２）、Ｆｅｒｒｏ（１１１
Ｗｅｓｔ Ｉｒｅｎｅ Ｒｏａｄ，Ｚａｃｈａｒｙ，
ＬＡ ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ Ａ
Ｇ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ Ｄ−３０９１８，Ｓｅｅｌｚｅ，
ドイツ）、ＰＰＧ ＩｎｄｕｔｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｎｅ ＰＰＧ Ｐｌａｃ
ｅ，３４ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐ
Ａ １５２７２）。さらに、任意の種類の天然産物を本
発明方法でスクリーニングでき、これには微生物、真
菌、植物または動物の抽出物が含まれる。
【００４９】さらに、低分子被験化合物を含めた多様な
被験化合物ライブラリーを使用できる。たとえばライブ
ラリーは下記から市販されている：Ｓｐｅｃｓ ａｎｄ
ＢｉｏＳｐｅｃｓ Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ、オ
ランダ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｃｏｎｔｒ
ａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏ
ｐｒｕｄｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ Ｒｅｇｉｏｎ，ロシ
ア）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（プリンス
トン、ニュージャージー州）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＰＬ３
４ ＯＨＷ、英国）、およびＡｓｉｎｅｘ（モスクワ、
ロシア）。
被験化合物ライブラリーを使用できる。たとえばライブ
ラリーは下記から市販されている：Ｓｐｅｃｓ ａｎｄ
ＢｉｏＳｐｅｃｓ Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ、オ
ランダ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｃｏｎｔｒ
ａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏ
ｐｒｕｄｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ Ｒｅｇｉｏｎ，ロシ
ア）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（プリンス
トン、ニュージャージー州）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＰＬ３
４ ＯＨＷ、英国）、およびＡｓｉｎｅｘ（モスクワ、
ロシア）。
【００５０】さらに、当技術分野で既知のコンビナトリ
アルライブラリー法を利用でき、これには下記のものが
含まれるが、これらに限定されない：生物ライブラリ
ー；空間アドレス指定可能な並列固相または溶液相ライ
ブラリー；デコンボルージョンを必要とする合成ライブ
ラリー法；”１ビーズ−１化合物”ライブラリー法；お
よびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合
成ライブラリー法。生物ライブラリー法はペプチドライ
ブラリーに限定されるが、他の４方法はペプチド、非ペ
プチドオリゴマーまたは低分子ライブラリーの化合物に
適用できる（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１２，１４５）。低分子を含め
た被験化合物のコンビナトリアルライブラリーを使用で
き、これはたとえばＥｉｃｈｅｒ ＆ Ｈｏｕｇｈｔｅ
ｎ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，１，１７
４−１８０；Ｄｏｌｌｅ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅ
ｒｓ．，２，２２３−２３６；およびＬａｍ（１９９
７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１
２，１４５−１６７の記載に従って作製できる。
アルライブラリー法を利用でき、これには下記のものが
含まれるが、これらに限定されない：生物ライブラリ
ー；空間アドレス指定可能な並列固相または溶液相ライ
ブラリー；デコンボルージョンを必要とする合成ライブ
ラリー法；”１ビーズ−１化合物”ライブラリー法；お
よびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合
成ライブラリー法。生物ライブラリー法はペプチドライ
ブラリーに限定されるが、他の４方法はペプチド、非ペ
プチドオリゴマーまたは低分子ライブラリーの化合物に
適用できる（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１２，１４５）。低分子を含め
た被験化合物のコンビナトリアルライブラリーを使用で
き、これはたとえばＥｉｃｈｅｒ ＆ Ｈｏｕｇｈｔｅ
ｎ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，１，１７
４−１８０；Ｄｏｌｌｅ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅ
ｒｓ．，２，２２３−２３６；およびＬａｍ（１９９
７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１
２，１４５−１６７の記載に従って作製できる。
【００５１】分子ライブラリーの合成方法の例は当技術
分野でたとえば下記にみられる：ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，９０，６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９１，１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，
２６７８；Ｃｈｏｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２６１，１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅ
ｎｇｌ．３３，２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅ
ｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；およびＧａｌｌｏｐ
ｅｔａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３
７，１２３３。
分野でたとえば下記にみられる：ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，９０，６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９１，１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，
２６７８；Ｃｈｏｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２６１，１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅ
ｎｇｌ．３３，２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅ
ｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；およびＧａｌｌｏｐ
ｅｔａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３
７，１２３３。
【００５２】化合物のライブラリーは、溶液中（たとえ
ばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，１３，４１２−４２１）、またはビーズ上
（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８
４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３６４，５５５−５５６）、細菌上（ＵＳＰ５，２
２３，４０９）、胞子上（ＵＳＰ５，５７１，６９８；
ＵＳＰ５，４０３，４８４；およびＵＳＰ５，２２３，
４０９）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１
９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，１８６５−１８６９）、またはファージ上
（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４−
４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６
３７８−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．
（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１
−３１０）に存在してもよい。
ばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，１３，４１２−４２１）、またはビーズ上
（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８
４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３６４，５５５−５５６）、細菌上（ＵＳＰ５，２
２３，４０９）、胞子上（ＵＳＰ５，５７１，６９８；
ＵＳＰ５，４０３，４８４；およびＵＳＰ５，２２３，
４０９）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１
９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，１８６５−１８６９）、またはファージ上
（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４−
４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６
３７８−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．
（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１
−３１０）に存在してもよい。
【００５３】ライブラリーのスクリーニングは、一般に
知られている多様な方法のいずれかにより達成できる。
たとえば下記の参考文献を参照：Ｐａｒｍｌｅｙ ＆
Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉ
ｏｌ．，２５１，２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓ
ｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６
−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３，４２２−４２７；
Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５３
９３−５３９７；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅ
ｌｌ，７６，９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，５７７−５
８０；Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５５，５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８９，６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５
５，８５０−８５２；ＵＳＰ５，０９６，８１５、ＵＳ
Ｐ５，２２３，４０９およびＵＳＰ５，１９８，３４６
（すべてＬａｄｎｅｒらに）；Ｒｅｂａｒ ＆ Ｐａｂ
ｏ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，６７１−６７
３；ならびにＷＯ９４／１８３１８。
知られている多様な方法のいずれかにより達成できる。
たとえば下記の参考文献を参照：Ｐａｒｍｌｅｙ ＆
Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉ
ｏｌ．，２５１，２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓ
ｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６
−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３，４２２−４２７；
Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５３
９３−５３９７；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅ
ｌｌ，７６，９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，５７７−５
８０；Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５５，５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８９，６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５
５，８５０−８５２；ＵＳＰ５，０９６，８１５、ＵＳ
Ｐ５，２２３，４０９およびＵＳＰ５，１９８，３４６
（すべてＬａｄｎｅｒらに）；Ｒｅｂａｒ ＆ Ｐａｂ
ｏ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，６７１−６７
３；ならびにＷＯ９４／１８３１８。
【００５４】コンピューターモデリングおよび検索技術
により、アドレン酸とＰＦＩ−０１１の相互作用を調節
しうる化合物の同定、または既に同定された化合物の改
良が可能となる。そのような化合物または組成物が同定
されると、活性部位または領域を同定する。そのような
活性部位は一般にリガンド結合部位の可能性がある。活
性部位は、当技術分野で既知の方法により、たとえばペ
プチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列か
ら、または関連化合物もしくは組成物とその天然リガン
ドとの複合体の研究から同定できる。後者の場合、化学
的方法またはＸ線結晶学的方法を用いてその因子上に複
合体形成リガンドがある位置を見つけることにより、活
性部位を見出すことができる。
により、アドレン酸とＰＦＩ−０１１の相互作用を調節
しうる化合物の同定、または既に同定された化合物の改
良が可能となる。そのような化合物または組成物が同定
されると、活性部位または領域を同定する。そのような
活性部位は一般にリガンド結合部位の可能性がある。活
性部位は、当技術分野で既知の方法により、たとえばペ
プチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列か
ら、または関連化合物もしくは組成物とその天然リガン
ドとの複合体の研究から同定できる。後者の場合、化学
的方法またはＸ線結晶学的方法を用いてその因子上に複
合体形成リガンドがある位置を見つけることにより、活
性部位を見出すことができる。
【００５５】次いで、活性部位（一般に結合部位）の三
次元幾何学的構造を決定する。これは、Ｘ線結晶学的方
法を含めた、完全な分子構造を決定する既知の方法で実
施できる。他方、固相または液相ＮＭＲを用いると特定
の分子内距離を測定できる。構造決定のための他の任意
の実験法を用いて、部分または完全幾何学的構造を求め
ることができる。幾何学的構造は天然または人工の複合
体リガンドを用いて決定することもでき、これにより決
定する活性部位構造の精度が向上する。
次元幾何学的構造を決定する。これは、Ｘ線結晶学的方
法を含めた、完全な分子構造を決定する既知の方法で実
施できる。他方、固相または液相ＮＭＲを用いると特定
の分子内距離を測定できる。構造決定のための他の任意
の実験法を用いて、部分または完全幾何学的構造を求め
ることができる。幾何学的構造は天然または人工の複合
体リガンドを用いて決定することもでき、これにより決
定する活性部位構造の精度が向上する。
【００５６】決定した構造の精度が不完全または不十分
な場合、コンピューターベースの数値モデリングを用い
て構造を完全なものにし、またはその精度を改善するこ
とができる。認められている任意のモデリング法を採用
でき、これには特定の生体ポリマー（たとえばタンパク
質または核酸）に特異的なパラメーター化したモデル、
分子運動のコンピューター処理に基づく分子動態モデ
ル、熱アンサンブル（ｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｓｅｍｂｌ
ｅ）に基づく統計力学モデル、または組合わせモデモが
含まれる。大部分のタイプのモデルについて、構成原子
および基の間の力を表す標準的分子力場が必要であり、
これは物理化学において既知の力場（ｆｏｒｔｈ ｆｉ
ｅｌｄ）から選択できる。不完全または精度の低い実験
構造は、これらのモデリング法でコンピューター処理し
た完全な、より精度の高い構造に対する拘束となる可能
性がある。
な場合、コンピューターベースの数値モデリングを用い
て構造を完全なものにし、またはその精度を改善するこ
とができる。認められている任意のモデリング法を採用
でき、これには特定の生体ポリマー（たとえばタンパク
質または核酸）に特異的なパラメーター化したモデル、
分子運動のコンピューター処理に基づく分子動態モデ
ル、熱アンサンブル（ｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｓｅｍｂｌ
ｅ）に基づく統計力学モデル、または組合わせモデモが
含まれる。大部分のタイプのモデルについて、構成原子
および基の間の力を表す標準的分子力場が必要であり、
これは物理化学において既知の力場（ｆｏｒｔｈ ｆｉ
ｅｌｄ）から選択できる。不完全または精度の低い実験
構造は、これらのモデリング法でコンピューター処理し
た完全な、より精度の高い構造に対する拘束となる可能
性がある。
【００５７】実験、モデリング、またはその組合わせに
より活性（結合）部位構造が決定されると、最後に、化
合物と共にそれらの分子構造に関する情報を含むデータ
ベースの検索により、候補となる調節化合物を同定でき
る。そのような検索により、決定した活性（結合）部位
構造に一致しかつ活性部位を規定する基と相互作用する
構造をもつ化合物が求められる。そのような検索を手動
で行うこともできるが、好ましくはコンピューター支援
による。この検索で見出したこれらの化合物はアドレン
酸受容体調節化合物の可能性がある。
より活性（結合）部位構造が決定されると、最後に、化
合物と共にそれらの分子構造に関する情報を含むデータ
ベースの検索により、候補となる調節化合物を同定でき
る。そのような検索により、決定した活性（結合）部位
構造に一致しかつ活性部位を規定する基と相互作用する
構造をもつ化合物が求められる。そのような検索を手動
で行うこともできるが、好ましくはコンピューター支援
による。この検索で見出したこれらの化合物はアドレン
酸受容体調節化合物の可能性がある。
【００５８】あるいは、これらの方法を用いて、既知の
調節化合物またはリガンドから改良された調節化合物を
同定することもできる。既知化合物の組成を修飾し、前
記の実験的またはコンピューターモデリング法をこの新
規組成に適用して修飾の構造効果を判定することができ
る。次いでこの変化した構造を化合物の活性（結合）部
位構造と比較して、フィットまたは相互作用が改良され
たかどうかを判定できる。この方法で、たとえば側鎖基
の変更による系統的な組成変化を迅速に評価して、改良
された特異性または活性をもつ修飾された調節化合物ま
たはリガンドを得ることができる。
調節化合物またはリガンドから改良された調節化合物を
同定することもできる。既知化合物の組成を修飾し、前
記の実験的またはコンピューターモデリング法をこの新
規組成に適用して修飾の構造効果を判定することができ
る。次いでこの変化した構造を化合物の活性（結合）部
位構造と比較して、フィットまたは相互作用が改良され
たかどうかを判定できる。この方法で、たとえば側鎖基
の変更による系統的な組成変化を迅速に評価して、改良
された特異性または活性をもつ修飾された調節化合物ま
たはリガンドを得ることができる。
【００５９】前記のＰＦＩ−０１１またはアドレン酸な
らびにその類似体および模倣体の活性（結合）部位同定
に基づいて調節化合物を同定するのに有用な他の実験的
またはコンピューターモデリング法は、当業者に自明で
あろう。
らびにその類似体および模倣体の活性（結合）部位同定
に基づいて調節化合物を同定するのに有用な他の実験的
またはコンピューターモデリング法は、当業者に自明で
あろう。
【００６０】分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲ
ＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムである（Ｐｏｌｙｇ
ｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチュセッツ州ウォ
ルサム）。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子
動態機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、
グラフモデリングおよび分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡ
によれば、分子相互の相互作用構築、修飾、視覚化、お
よび行動分析ができる。
ＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムである（Ｐｏｌｙｇ
ｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチュセッツ州ウォ
ルサム）。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子
動態機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、
グラフモデリングおよび分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡ
によれば、分子相互の相互作用構築、修飾、視覚化、お
よび行動分析ができる。
【００６１】多数の文献に特異的タンパク質と相互作用
する薬物のコンピューターモデリングが概説されてい
る：たとえばＲｏｔｉｖｉｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９
８８）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅ
ｎｎｉｃａ，９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ（１９
８８）Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，５４−５７；Ｍｃ
Ｋｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ（１９８９）
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．，２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄ
ａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏ
ｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｐ．
１８９−１９３，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社（１９８
９）；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ（１９８９）Ｐｒ
ｏ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，２３６，１２５−１４０およ
び１４１−１６２；ならびに核酸化合物に対するモデル
受容体に関して：Ａｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．（１９８
９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，１０８２
−１０９０。化学物質をスクリーニングおよびグラフ表
示する他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓ
ｉｇｎ社（カリフォルニア州パサデナ）、Ａｌｌｅｌｉ
ｘ社（カナダ、オンタリオ州ミシソーガ）、およびＨｙ
ｐｅｒｃｕｂｅ社（オンタリオ州ケンブリッジ）から入
手できる。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬
物に適用するように設計されているが、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの領域が同定されるとそれらに特異的な薬物の設計
にも利用できる。
する薬物のコンピューターモデリングが概説されてい
る：たとえばＲｏｔｉｖｉｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９
８８）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅ
ｎｎｉｃａ，９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ（１９
８８）Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，５４−５７；Ｍｃ
Ｋｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ（１９８９）
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．，２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄ
ａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏ
ｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｐ．
１８９−１９３，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社（１９８
９）；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ（１９８９）Ｐｒ
ｏ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，２３６，１２５−１４０およ
び１４１−１６２；ならびに核酸化合物に対するモデル
受容体に関して：Ａｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．（１９８
９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，１０８２
−１０９０。化学物質をスクリーニングおよびグラフ表
示する他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓ
ｉｇｎ社（カリフォルニア州パサデナ）、Ａｌｌｅｌｉ
ｘ社（カナダ、オンタリオ州ミシソーガ）、およびＨｙ
ｐｅｒｃｕｂｅ社（オンタリオ州ケンブリッジ）から入
手できる。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬
物に適用するように設計されているが、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの領域が同定されるとそれらに特異的な薬物の設計
にも利用できる。
【００６２】ＰＦＩ−０１１タンパク質、ポリペプチド
およびペプチドフラグメント、変異、トランケートもし
くは欠失形のＰＦＩ−０１１、および／またはＰＦＩ−
０１１融合タンパク質を、多様な用途のために調製でき
る。これには抗体産生、診断アッセイの試薬として、ア
ドレン酸関連障害の調節に関与する他の細胞遺伝子生成
物の同定、アドレン酸関連障害の処置に使用できる化合
物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬とし
ての用途が含まれるが、これらに限定されない。さら
に、相互作用するＰＦＩ−０１１およびそれが結合する
アドレン酸または類似体もしくは模倣体から得られる情
報に基づいて、ＰＦＩ−０１１受容体分子への正常なア
ドレン酸結合を阻害するＰＦＩ−０１１ペプチドフラグ
メントをｉｎ ｖｉｖｏ療法用として誘導できる。
およびペプチドフラグメント、変異、トランケートもし
くは欠失形のＰＦＩ−０１１、および／またはＰＦＩ−
０１１融合タンパク質を、多様な用途のために調製でき
る。これには抗体産生、診断アッセイの試薬として、ア
ドレン酸関連障害の調節に関与する他の細胞遺伝子生成
物の同定、アドレン酸関連障害の処置に使用できる化合
物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬とし
ての用途が含まれるが、これらに限定されない。さら
に、相互作用するＰＦＩ−０１１およびそれが結合する
アドレン酸または類似体もしくは模倣体から得られる情
報に基づいて、ＰＦＩ−０１１受容体分子への正常なア
ドレン酸結合を阻害するＰＦＩ−０１１ペプチドフラグ
メントをｉｎ ｖｉｖｏ療法用として誘導できる。
【００６３】ＰＦＩ−０１１ペプチド、ポリペプチドお
よび融合タンパク質を組換えＤＮＡ法で調製できる。た
とえばＰＦＩ−０１１受容体の４つの細胞外ドメインの
うち１以上をコードするヌクレオチド配列を合成または
クローニングし、互いにライゲートさせて、ＰＦＩ−０
１１の可溶性細胞外ドメインをコードさせることができ
る。４つの細胞外ループのうち１以上をコードするＤＮ
Ａ配列を、互いに直接にまたはペプチドスペーサーをコ
ードするリンカーオリゴヌクレオチドを介してライゲー
トさせることができる。そのようなリンカーはグリシン
に富む可変性アミノ酸配列をコードすることができ、こ
れにより互いに連結したドメインが確実にＰＦＩ−０１
１リガンドを結合しうるコンホメーションをとることが
できる。あるいは、細胞外ループ内の各ドメインをコー
ドするヌクレオチド配列を用いてＰＦＩ−０１１ペプチ
ドを発現させることができる。
よび融合タンパク質を組換えＤＮＡ法で調製できる。た
とえばＰＦＩ−０１１受容体の４つの細胞外ドメインの
うち１以上をコードするヌクレオチド配列を合成または
クローニングし、互いにライゲートさせて、ＰＦＩ−０
１１の可溶性細胞外ドメインをコードさせることができ
る。４つの細胞外ループのうち１以上をコードするＤＮ
Ａ配列を、互いに直接にまたはペプチドスペーサーをコ
ードするリンカーオリゴヌクレオチドを介してライゲー
トさせることができる。そのようなリンカーはグリシン
に富む可変性アミノ酸配列をコードすることができ、こ
れにより互いに連結したドメインが確実にＰＦＩ−０１
１リガンドを結合しうるコンホメーションをとることが
できる。あるいは、細胞外ループ内の各ドメインをコー
ドするヌクレオチド配列を用いてＰＦＩ−０１１ペプチ
ドを発現させることができる。
【００６４】多様な宿主発現ベクター系を利用してＰＦ
Ｉ−０１１の適宜な領域をコードするヌクレオチド配列
を発現させ、そのようなポリペプチドを調製することが
できる。得られるペプチドまたはポリペプチドが可溶性
誘導体（たとえば細胞外ドメインに対応するペプチド；
あるいは膜貫通らせんおよび／または細胞ドメインが欠
失したトランケート形または欠失形）である場合、その
ペプチドまたはポリペプチドを培地から回収できる。ペ
プチドまたはポリペプチドが分泌されない場合、ＰＦＩ
−０１１生成物を宿主自体から回収できる。
Ｉ−０１１の適宜な領域をコードするヌクレオチド配列
を発現させ、そのようなポリペプチドを調製することが
できる。得られるペプチドまたはポリペプチドが可溶性
誘導体（たとえば細胞外ドメインに対応するペプチド；
あるいは膜貫通らせんおよび／または細胞ドメインが欠
失したトランケート形または欠失形）である場合、その
ペプチドまたはポリペプチドを培地から回収できる。ペ
プチドまたはポリペプチドが分泌されない場合、ＰＦＩ
−０１１生成物を宿主自体から回収できる。
【００６５】宿主発現ベクター系には、ＰＦＩ−０１１
または機能均等物をｉｎ ｓｉｔｕで、すなわち細胞膜
に結合した状態で発現する、工学的に作製した宿主細胞
も包含される。そのような発現系からのＰＦＩ−０１１
の精製または富化は、適宜な界面活性剤および脂質ミセ
ルならびに当業者に周知の方法を用いて達成できる。た
だしそのような工学的に作製した宿主細胞は、ＰＦＩ−
０１１の構造および機能特性の維持が重要な場合だけで
なく、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおける生
物活性の評価が重要な場合にも使用できる。
または機能均等物をｉｎ ｓｉｔｕで、すなわち細胞膜
に結合した状態で発現する、工学的に作製した宿主細胞
も包含される。そのような発現系からのＰＦＩ−０１１
の精製または富化は、適宜な界面活性剤および脂質ミセ
ルならびに当業者に周知の方法を用いて達成できる。た
だしそのような工学的に作製した宿主細胞は、ＰＦＩ−
０１１の構造および機能特性の維持が重要な場合だけで
なく、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおける生
物活性の評価が重要な場合にも使用できる。
【００６６】本発明の目的に使用できる宿主発現ベクタ
ー系にはたとえば下記のものが含まれるが、これらに限
定されない：ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列を含む組
換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまた
はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（た
とえば大腸菌、枯草菌）；ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド
配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母
（たとえばサッカロミセス、ピチア）；ＰＦＩ−０１１
ヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター
（たとえばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系；ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイ
ルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染
させた、またはＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列を含む
組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミ
ド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞
のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオ
ネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来す
るプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含
む組換え発現構築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえば
ＣＯＳ、ＣＨＫ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）。
ー系にはたとえば下記のものが含まれるが、これらに限
定されない：ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列を含む組
換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまた
はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（た
とえば大腸菌、枯草菌）；ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド
配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母
（たとえばサッカロミセス、ピチア）；ＰＦＩ−０１１
ヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター
（たとえばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系；ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイ
ルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染
させた、またはＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列を含む
組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミ
ド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞
のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオ
ネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来す
るプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含
む組換え発現構築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえば
ＣＯＳ、ＣＨＫ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）。
【００６７】細菌系では、発現させるＰＦＩ−０１１遺
伝子について意図する用途に応じて多数の発現ベクター
を有利に選択できる。たとえばＰＦＩ−０１１タンパク
質の医薬組成物を製造するために、またはＰＦＩ−０１
１タンパク質に対する抗体を産生させるために、そのよ
うなタンパク質を大量に製造したい場合、たとえば容易
に精製される高レベルの融合タンパク質生成物発現を指
令するベクターが望ましいであろう。そのようなベクタ
ーには下記のものが含まれるが、これらに限定されな
い：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ．，２，１７９
１）：融合タンパク質が生成するように、ＰＦＩ−０１
１コード配列をこのベクター内へｌａｃＺコード領域と
読み枠を一致させて個々にライゲートさせることができ
る；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｅ＆ Ｉｎｏｕｅ（１９
８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，
３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈ
ｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６４，５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターを
用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現さ
せることもできる。一般にそのような融合タンパク質は
可溶性であり、溶解した細胞からグルタチオン−アガロ
ースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下
での溶離によって容易に精製できる。ｐＧＥＸベクター
は、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ開裂
部位を含み、これによりクローニングしたターゲット遺
伝子生成物をＧＳＴ部分から放出しうるように設計され
る。
伝子について意図する用途に応じて多数の発現ベクター
を有利に選択できる。たとえばＰＦＩ−０１１タンパク
質の医薬組成物を製造するために、またはＰＦＩ−０１
１タンパク質に対する抗体を産生させるために、そのよ
うなタンパク質を大量に製造したい場合、たとえば容易
に精製される高レベルの融合タンパク質生成物発現を指
令するベクターが望ましいであろう。そのようなベクタ
ーには下記のものが含まれるが、これらに限定されな
い：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ．，２，１７９
１）：融合タンパク質が生成するように、ＰＦＩ−０１
１コード配列をこのベクター内へｌａｃＺコード領域と
読み枠を一致させて個々にライゲートさせることができ
る；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｅ＆ Ｉｎｏｕｅ（１９
８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，
３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈ
ｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６４，５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターを
用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現さ
せることもできる。一般にそのような融合タンパク質は
可溶性であり、溶解した細胞からグルタチオン−アガロ
ースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下
での溶離によって容易に精製できる。ｐＧＥＸベクター
は、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ開裂
部位を含み、これによりクローニングしたターゲット遺
伝子生成物をＧＳＴ部分から放出しうるように設計され
る。
【００６８】あるいは、発現する融合タンパク質に特異
的な抗体を用いることにより、いかなる融合タンパク質
も容易に精製できる。たとえばＪａｎｋｎｅｃｈｔらが
記載した系は、ヒト細胞系で発現した非変性融合タンパ
ク質を容易に精製できる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８８，８９７２−８９７６）。この系で
は、目的遺伝子のオープンリーディングフレームが６ヒ
スチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳時融合する
ように、遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中へサブ
クローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染さ
せた細胞からの抽出物をＮｉ2+・ニトリロ酢酸−アガロ
ースカラムに装入し、ヒスチジン−タグ付きタンパク質
をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。
的な抗体を用いることにより、いかなる融合タンパク質
も容易に精製できる。たとえばＪａｎｋｎｅｃｈｔらが
記載した系は、ヒト細胞系で発現した非変性融合タンパ
ク質を容易に精製できる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８８，８９７２−８９７６）。この系で
は、目的遺伝子のオープンリーディングフレームが６ヒ
スチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳時融合する
ように、遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中へサブ
クローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染さ
せた細胞からの抽出物をＮｉ2+・ニトリロ酢酸−アガロ
ースカラムに装入し、ヒスチジン−タグ付きタンパク質
をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。
【００６９】昆虫系では、オートグラファ・カリフォル
ニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）核ポリヘドローシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）を外来
遺伝子発現のためのベクターとして用いる。このウイル
スをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖させる。ＰＦ
Ｉ−０１１コード配列をウイルスの非必須領域（たとえ
ばポリヘドリン遺伝子）内へ個々にクローニングし、Ａ
ｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモー
ター）の制御下におくことができる。ＰＦＩ−０１１遺
伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝
子が不活性化されて、オクルージョンされない（ｎｏｎ
−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイルス（すなわちポリヘ
ドリン遺伝子がコードするタンパク質コートを欠如した
ウイルス）が生成するであろう。次いでこの組換えウイ
ルスを細胞の感染に用い、そこで挿入遺伝子を発現させ
る（たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６，５８４；Ｓｍｉｔｈ、ＵＳＰ
４，２１５，０５１参照）。
ニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）核ポリヘドローシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）を外来
遺伝子発現のためのベクターとして用いる。このウイル
スをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖させる。ＰＦ
Ｉ−０１１コード配列をウイルスの非必須領域（たとえ
ばポリヘドリン遺伝子）内へ個々にクローニングし、Ａ
ｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモー
ター）の制御下におくことができる。ＰＦＩ−０１１遺
伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝
子が不活性化されて、オクルージョンされない（ｎｏｎ
−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイルス（すなわちポリヘ
ドリン遺伝子がコードするタンパク質コートを欠如した
ウイルス）が生成するであろう。次いでこの組換えウイ
ルスを細胞の感染に用い、そこで挿入遺伝子を発現させ
る（たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６，５８４；Ｓｍｉｔｈ、ＵＳＰ
４，２１５，０５１参照）。
【００７０】哺乳動物宿主細胞には、多数のウイルスベ
ース発現系を使用できる。アデノウイルスを発現ベクタ
ーとして用いる場合、目的とするＰＦＩ−０１１ヌクレ
オチド配列をアデノウイルス転写／翻訳制御コンプレッ
クス、たとえば後期プロモーターおよび三部分（ｔｒｉ
ｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせる。こ
のキメラ遺伝子を次いでｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する
ことができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば
領域Ｅ１またはＥ３）へ挿入すると、感染宿主において
ＰＦＩ−０１１遺伝子生成物を発現しうる生存可能な組
換えウイルスが生成するであろう（たとえばＬｏｇａｎ
＆ Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３６５５−３６５９参
照）。挿入ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列の効率的な
翻訳には、特異的な開始シグナルも必要であろう。これ
らのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が
含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む
ＰＦＩ−０１１遺伝子またはｃＤＮＡ全体を適宜な発現
ベクターに挿入する場合は、追加の翻訳制御シグナルは
必要ないかもしれない。しかしＰＦＩ−０１１コード配
列の一部のみを挿入する場合、おそらくＡＴＧ開始コド
ンを含めた外因性翻訳制御シグナルを供給しなければな
らないであろう。さらに、挿入配列全体が確実に翻訳さ
れるためには、開始コドンは目的コード配列と読み枠が
一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグ
ナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の多様な
由来のものであってよい。適宜な翻訳エンハンサー配
列、転写ターミネーターなどを含有させることにより発
現効率を高めることができる（たとえばＢｉｔｔｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，１５３，５１６−５４４参照）。
ース発現系を使用できる。アデノウイルスを発現ベクタ
ーとして用いる場合、目的とするＰＦＩ−０１１ヌクレ
オチド配列をアデノウイルス転写／翻訳制御コンプレッ
クス、たとえば後期プロモーターおよび三部分（ｔｒｉ
ｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせる。こ
のキメラ遺伝子を次いでｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する
ことができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば
領域Ｅ１またはＥ３）へ挿入すると、感染宿主において
ＰＦＩ−０１１遺伝子生成物を発現しうる生存可能な組
換えウイルスが生成するであろう（たとえばＬｏｇａｎ
＆ Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３６５５−３６５９参
照）。挿入ＰＦＩ−０１１ヌクレオチド配列の効率的な
翻訳には、特異的な開始シグナルも必要であろう。これ
らのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が
含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む
ＰＦＩ−０１１遺伝子またはｃＤＮＡ全体を適宜な発現
ベクターに挿入する場合は、追加の翻訳制御シグナルは
必要ないかもしれない。しかしＰＦＩ−０１１コード配
列の一部のみを挿入する場合、おそらくＡＴＧ開始コド
ンを含めた外因性翻訳制御シグナルを供給しなければな
らないであろう。さらに、挿入配列全体が確実に翻訳さ
れるためには、開始コドンは目的コード配列と読み枠が
一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグ
ナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の多様な
由来のものであってよい。適宜な翻訳エンハンサー配
列、転写ターミネーターなどを含有させることにより発
現効率を高めることができる（たとえばＢｉｔｔｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，１５３，５１６−５４４参照）。
【００７１】さらに、挿入配列の発現を調節する宿主細
胞系、または遺伝子生成物を目的様式で特異的に修飾も
しくはプロセシングする宿主細胞系を選択できる。タン
パク質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル
化）およびプロセシング（たとえば開裂）はタンパク質
の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパ
ク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修
飾のための特徴的かつ特異的な機序をもつ。発現する外
来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実に
するために適宜な細胞系または宿主系を選択できる。し
たがって、一次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生
成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を
もつ真核宿主細胞を使用できる。そのような宿主細胞に
はＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤ
ＣＫ、ＨＥＫ２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８細胞系が含
まれるが、これらに限定されない。
胞系、または遺伝子生成物を目的様式で特異的に修飾も
しくはプロセシングする宿主細胞系を選択できる。タン
パク質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル
化）およびプロセシング（たとえば開裂）はタンパク質
の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパ
ク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修
飾のための特徴的かつ特異的な機序をもつ。発現する外
来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実に
するために適宜な細胞系または宿主系を選択できる。し
たがって、一次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生
成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を
もつ真核宿主細胞を使用できる。そのような宿主細胞に
はＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤ
ＣＫ、ＨＥＫ２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８細胞系が含
まれるが、これらに限定されない。
【００７２】組換えタンパク質を長期的に高収率で産生
するためには、安定な発現が好ましい。たとえば前記Ｐ
ＦＩ−０１１配列を安定に発現する細胞系を工学的に作
製できる。ウイルス由来の複製起点を含む発現ベクター
を用いるのではなく、適宜な発現制御配列（たとえばプ
ロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、
ポリアデニル化部位など）および選択性マーカーにより
制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができ
る。外来ＤＮＡを導入した後、工学的に作製した細胞を
富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切
り替えることができる。組換えプラスミド中の選択性マ
ーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞はその染色
体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖してフォーカ
スを形成し、次いでこれをクローニングして細胞系にま
で拡張することができる。この方法を有利に利用して、
ＰＦＩ−０１１遺伝子生成物を発現する細胞系を工学的
に作製できる。そのような工学的に作製した細胞系は、
ＰＦＩ−０１１遺伝子生成物の内因活性に影響を及ぼす
化合物をスクリーニングおよび評価する際に特に有用で
ある。
するためには、安定な発現が好ましい。たとえば前記Ｐ
ＦＩ−０１１配列を安定に発現する細胞系を工学的に作
製できる。ウイルス由来の複製起点を含む発現ベクター
を用いるのではなく、適宜な発現制御配列（たとえばプ
ロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、
ポリアデニル化部位など）および選択性マーカーにより
制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができ
る。外来ＤＮＡを導入した後、工学的に作製した細胞を
富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切
り替えることができる。組換えプラスミド中の選択性マ
ーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞はその染色
体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖してフォーカ
スを形成し、次いでこれをクローニングして細胞系にま
で拡張することができる。この方法を有利に利用して、
ＰＦＩ−０１１遺伝子生成物を発現する細胞系を工学的
に作製できる。そのような工学的に作製した細胞系は、
ＰＦＩ−０１１遺伝子生成物の内因活性に影響を及ぼす
化合物をスクリーニングおよび評価する際に特に有用で
ある。
【００７３】多数の選択系を使用でき、これには単純ヘ
ルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ，１１，２２３）、ヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（１９
６２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，４８，２０２６）、およびアデニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．（１９８
０）Ｃｅｌｌ，２２，８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ
-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞中で使用すること
が含まれるが、これらに限定されない。下記遺伝子の選
択の基礎として代謝拮抗抵抗性も利用できる：メトトレ
キセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３５６７；Ｏ’Ｈａ
ｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７）；ミコフ
ェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，２０２７）；ア
ミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎ
ｅｏ（Ｃｏｒｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎｅｔ ａｌ．
（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１）；
およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙ
ｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔａｌ．（１９８４）Ｇ
ｅｎｅ，３０，１４７）。
ルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ，１１，２２３）、ヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（１９
６２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，４８，２０２６）、およびアデニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．（１９８
０）Ｃｅｌｌ，２２，８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ
-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞中で使用すること
が含まれるが、これらに限定されない。下記遺伝子の選
択の基礎として代謝拮抗抵抗性も利用できる：メトトレ
キセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３５６７；Ｏ’Ｈａ
ｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７）；ミコフ
ェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，２０２７）；ア
ミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎ
ｅｏ（Ｃｏｒｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎｅｔ ａｌ．
（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１）；
およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙ
ｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔａｌ．（１９８４）Ｇ
ｅｎｅ，３０，１４７）。
【００７４】哺乳動物細胞におけるＰＦＩ−０１１発現
は、ＰＦＩ−０１１の発現をアップレギュレートするこ
とによっても達成できる。これはたとえば、本発明方法
によりＰＦＩ−０１１発現をアップレギュレートする化
合物をスクリーニングすることにより達成できる。ＰＦ
Ｉ−０１１発現のアップレギュレーションは、たとえば
ＥＰ４１１，６７８に記載されるように、組換え法によ
っても達成できる。他の方法、たとえばＡｔｈｅｒｓｙ
ｓｔが開発した、たとえばＷＯ９９／１５６５０または
ＷＯ００／４９１６２に記載の方法も利用できる。
は、ＰＦＩ−０１１の発現をアップレギュレートするこ
とによっても達成できる。これはたとえば、本発明方法
によりＰＦＩ−０１１発現をアップレギュレートする化
合物をスクリーニングすることにより達成できる。ＰＦ
Ｉ−０１１発現のアップレギュレーションは、たとえば
ＥＰ４１１，６７８に記載されるように、組換え法によ
っても達成できる。他の方法、たとえばＡｔｈｅｒｓｙ
ｓｔが開発した、たとえばＷＯ９９／１５６５０または
ＷＯ００／４９１６２に記載の方法も利用できる。
【００７５】ＰＦＩ−０１１の１以上のエピトープ、ま
たはＰＦＩ−０１１の保存変異体のエピトープ、または
ＰＦＩ−０１１のペプチドフラグメントを特異的に認識
する抗体も、本発明に包含される。そのような抗体には
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、
ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライ
ブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタ
イプ（抗−Ｉｄ）抗体、およびそのエピトープ結合フラ
グメントが含まれるが、これらに限定されない。
たはＰＦＩ−０１１の保存変異体のエピトープ、または
ＰＦＩ−０１１のペプチドフラグメントを特異的に認識
する抗体も、本発明に包含される。そのような抗体には
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、
ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライ
ブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタ
イプ（抗−Ｉｄ）抗体、およびそのエピトープ結合フラ
グメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】本発明の抗体は、たとえば生物試料中のＰ
ＦＩ−０１１の検出に使用でき、したがって診断法また
は予後判定法の一部として利用でき、これにより患者の
異常な量のＰＦＩ−０１１を検査できる。変異形ＰＦＩ
−０１１を特異的に認識する抗体は、診断法または予後
判定法の一部として特に有用である。そのような抗体を
たとえば前記の化合物スクリーニング方式と組み合わせ
て、被験化合物がＰＦＩ−０１１遺伝子生成物の発現お
よび／または活性に及ぼす影響を評価するために利用で
きる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と併用し
て、たとえば正常な、および／または工学的に作製した
ＰＦＩ−０１１発現細胞を患者に導入する前に評価する
ことができる。そのような抗体はさらに、異常なＰＦＩ
−０１１活性の阻害方法として利用できる。したがって
そのような抗体をアドレン酸関連障害の処置方法の一部
として利用できる。
ＦＩ−０１１の検出に使用でき、したがって診断法また
は予後判定法の一部として利用でき、これにより患者の
異常な量のＰＦＩ−０１１を検査できる。変異形ＰＦＩ
−０１１を特異的に認識する抗体は、診断法または予後
判定法の一部として特に有用である。そのような抗体を
たとえば前記の化合物スクリーニング方式と組み合わせ
て、被験化合物がＰＦＩ−０１１遺伝子生成物の発現お
よび／または活性に及ぼす影響を評価するために利用で
きる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と併用し
て、たとえば正常な、および／または工学的に作製した
ＰＦＩ−０１１発現細胞を患者に導入する前に評価する
ことができる。そのような抗体はさらに、異常なＰＦＩ
−０１１活性の阻害方法として利用できる。したがって
そのような抗体をアドレン酸関連障害の処置方法の一部
として利用できる。
【００７７】抗体産生のためには、ＰＦＩ−０１１、Ｐ
ＦＩ−０１１ペプチド（たとえば細胞外ループまたは細
胞外ドメインに対応するもの）、トランケート形ＰＦＩ
−０１１ポリペプチド（１以上のドメイン、たとえば膜
貫通ドメインまたは細胞ドメインを欠失したＰＦＩ−０
１１）、ＰＦＩ−０１１の機能均等物、またはＰＦＩ−
０１１の変異体の注射により、種々の宿主動物を免疫化
することができる。そのような宿主動物にはウサギ、マ
ウス、ハムスターおよびラットが含まれるが、これは数
例を挙げたにすぎず、これらに限定されない。免疫応答
を高めるために、宿主種に応じて種々のアジュバントを
使用できる。これにはフロイントアジュバント（完全お
よび不完全）、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウ
ム、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニッ
クポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルショ
ン、キーホールリンペット（スカシガイ）ヘモシアニ
ン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジ
ュバント、たとえばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・
パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖ
ｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない。ポリクロ
ーナル抗体は免疫化動物の血清に由来する不均質抗体分
子集団である。
ＦＩ−０１１ペプチド（たとえば細胞外ループまたは細
胞外ドメインに対応するもの）、トランケート形ＰＦＩ
−０１１ポリペプチド（１以上のドメイン、たとえば膜
貫通ドメインまたは細胞ドメインを欠失したＰＦＩ−０
１１）、ＰＦＩ−０１１の機能均等物、またはＰＦＩ−
０１１の変異体の注射により、種々の宿主動物を免疫化
することができる。そのような宿主動物にはウサギ、マ
ウス、ハムスターおよびラットが含まれるが、これは数
例を挙げたにすぎず、これらに限定されない。免疫応答
を高めるために、宿主種に応じて種々のアジュバントを
使用できる。これにはフロイントアジュバント（完全お
よび不完全）、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウ
ム、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニッ
クポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルショ
ン、キーホールリンペット（スカシガイ）ヘモシアニ
ン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジ
ュバント、たとえばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・
パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖ
ｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない。ポリクロ
ーナル抗体は免疫化動物の血清に由来する不均質抗体分
子集団である。
【００７８】モノクローナル抗体は特定の抗原に対する
均質抗体集団であり、連続培養細胞系により抗体分子を
産生する任意の方法で得ることができる。これらの方法
には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ
法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９
７およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８
３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４，７２；Ｃ
ｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２０２６−２０
３０）、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ
ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社，ｐｐ．７７−９
６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤ、およびその任意のサブクラスを含めた任
意の免疫グロブリンであってよい。本発明のｍＡｂを産
生するハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの
高力価ｍＡｂの産生が現在好ましい製造方法である。
均質抗体集団であり、連続培養細胞系により抗体分子を
産生する任意の方法で得ることができる。これらの方法
には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ
法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９
７およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８
３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４，７２；Ｃ
ｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２０２６−２０
３０）、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ
ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社，ｐｐ．７７−９
６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤ、およびその任意のサブクラスを含めた任
意の免疫グロブリンであってよい。本発明のｍＡｂを産
生するハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの
高力価ｍＡｂの産生が現在好ましい製造方法である。
【００７９】さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，６８５１−６８５５；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３１２，６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５
４）の産生のために開発された方法であって、適宜な抗
原特異性をもつマウス抗体分子に由来する遺伝子と適宜
な生物活性をもつヒト抗体分子に由来する遺伝子のスプ
ライシングによる方法を使用できる。キメラ抗体は異な
る部分が異なる動物種に由来する分子、たとえばネズミ
ｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部をもつ
ものである。
ｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，６８５１−６８５５；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒ
ｅ，３１２，６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５
４）の産生のために開発された方法であって、適宜な抗
原特異性をもつマウス抗体分子に由来する遺伝子と適宜
な生物活性をもつヒト抗体分子に由来する遺伝子のスプ
ライシングによる方法を使用できる。キメラ抗体は異な
る部分が異なる動物種に由来する分子、たとえばネズミ
ｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部をもつ
ものである。
【００８０】あるいは、一本鎖抗体の産生について記載
された方法（ＵＳＰ４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ（１
９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６；Ｈ
ｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５
８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３４，５４４−５４６）を適用してＰＦ
Ｉ−０１１に対する一本鎖抗体を製造することができ
る。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域のＨ鎖フラグメントとＬ鎖
フラグメントをアミノ橋で連結して一本鎖ポリペプチド
を得ることにより形成される。
された方法（ＵＳＰ４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ（１
９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６；Ｈ
ｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５
８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３４，５４４−５４６）を適用してＰＦ
Ｉ−０１１に対する一本鎖抗体を製造することができ
る。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域のＨ鎖フラグメントとＬ鎖
フラグメントをアミノ橋で連結して一本鎖ポリペプチド
を得ることにより形成される。
【００８１】特異的エピトープを認識する抗体フラグメ
ントは、既知の方法で形成できる。たとえばそのような
フラグメントには下記のものが含まれるが、これらに限
定されない：抗体分子のペプシン消化により調製できる
Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラ
グメントのジスルフィド橋を還元することにより、また
は抗体分子のパパイン消化により調製できるＦａｂフラ
グメント。あるいはＦａｂ発現ライブラリーを構築して
（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４６，１２７５−１２８１）、目的特性をもつモ
ノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントを迅速かつ容易に
同定することができる。
ントは、既知の方法で形成できる。たとえばそのような
フラグメントには下記のものが含まれるが、これらに限
定されない：抗体分子のペプシン消化により調製できる
Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラ
グメントのジスルフィド橋を還元することにより、また
は抗体分子のパパイン消化により調製できるＦａｂフラ
グメント。あるいはＦａｂ発現ライブラリーを構築して
（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４６，１２７５−１２８１）、目的特性をもつモ
ノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントを迅速かつ容易に
同定することができる。
【００８２】次いでＰＦＩ−０１１に対する抗体を用い
て、ＰＦＩ−０１１を”模倣”した抗イディオタイプ抗
体を当業者に周知の方法（たとえばＧｒｅｅｎｓｐａｎ
＆Ｂｏｎａ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，４３７
−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ（１９９１）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，２４２９−２４３８参照）
で調製できる。たとえばＰＦＩ−０１１の細胞外ドメイ
ンに結合してＰＦＩ−０１１へのアドレン酸の結合を競
合阻害する抗体を用いて、細胞外ドメインを”模倣”
し、したがってアドレン酸を結合して中和する、抗イデ
ィオタイプ抗体を調製できる。そのような中和性の抗イ
ディオタイプ抗体またはそのような抗イディオタイプ抗
体のＦａｂフラグメントを療法方式に用いて天然リガン
ドを中和し、アドレン酸関連障害、たとえば炎症性疾
患、血圧調節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食障害、
肥満症およびストレス関連障害を処置することができ
る。
て、ＰＦＩ−０１１を”模倣”した抗イディオタイプ抗
体を当業者に周知の方法（たとえばＧｒｅｅｎｓｐａｎ
＆Ｂｏｎａ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，４３７
−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ（１９９１）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，２４２９−２４３８参照）
で調製できる。たとえばＰＦＩ−０１１の細胞外ドメイ
ンに結合してＰＦＩ−０１１へのアドレン酸の結合を競
合阻害する抗体を用いて、細胞外ドメインを”模倣”
し、したがってアドレン酸を結合して中和する、抗イデ
ィオタイプ抗体を調製できる。そのような中和性の抗イ
ディオタイプ抗体またはそのような抗イディオタイプ抗
体のＦａｂフラグメントを療法方式に用いて天然リガン
ドを中和し、アドレン酸関連障害、たとえば炎症性疾
患、血圧調節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食障害、
肥満症およびストレス関連障害を処置することができ
る。
【００８３】あるいはＰＦＩ−０１１活性のアゴニスト
として作用しうるＰＦＩ−０１１抗体を調製できる。そ
のような抗体はＰＦＩ−０１１に結合してこの受容体の
信号伝達活性を高めるであろう。さらに、ＰＦＩ−０１
１活性のアンタゴニストとして作用する、すなわちＰＦ
Ｉ−０１１受容体の活性化を阻害する抗体は、アドレン
酸関連障害、たとえば炎症性疾患、血圧調節、睡眠異
常、痛み、体温調節、摂食障害、肥満症およびストレス
関連障害を処置するのに特に有用である。
として作用しうるＰＦＩ−０１１抗体を調製できる。そ
のような抗体はＰＦＩ−０１１に結合してこの受容体の
信号伝達活性を高めるであろう。さらに、ＰＦＩ−０１
１活性のアンタゴニストとして作用する、すなわちＰＦ
Ｉ−０１１受容体の活性化を阻害する抗体は、アドレン
酸関連障害、たとえば炎症性疾患、血圧調節、睡眠異
常、痛み、体温調節、摂食障害、肥満症およびストレス
関連障害を処置するのに特に有用である。
【００８４】可溶性ＰＦＩ−０１１細胞外ドメインまた
は融合タンパク質、たとえば融合Ｉｇ分子を発現する遺
伝子工学的に作製した細胞をｉｎ ｖｉｖｏ投与するこ
とができ、これらの細胞はこの可溶性分子を供給送達す
る”バイオリアクター”として機能する。そのような可
溶性ＰＦＩ−０１１ポリペプチドおよび融合タンパク質
を適宜な濃度で発現させると、ＰＦＩ−０１１に対する
天然リガンドを中和、または”一掃”するのでＰＦＩ−
０１１活性の阻害薬として作用し、したがってアドレン
酸関連障害、たとえば炎症性疾患、血圧調節、睡眠異
常、痛み、体温調節、摂食障害、肥満症およびストレス
関連障害を処置するのに使用できる。
は融合タンパク質、たとえば融合Ｉｇ分子を発現する遺
伝子工学的に作製した細胞をｉｎ ｖｉｖｏ投与するこ
とができ、これらの細胞はこの可溶性分子を供給送達す
る”バイオリアクター”として機能する。そのような可
溶性ＰＦＩ−０１１ポリペプチドおよび融合タンパク質
を適宜な濃度で発現させると、ＰＦＩ−０１１に対する
天然リガンドを中和、または”一掃”するのでＰＦＩ−
０１１活性の阻害薬として作用し、したがってアドレン
酸関連障害、たとえば炎症性疾患、血圧調節、睡眠異
常、痛み、体温調節、摂食障害、肥満症およびストレス
関連障害を処置するのに使用できる。
【００８５】本発明化合物、すなわちＰＦＩ−０１１受
容体のモジュレーターを用いて、炎症性疾患、血圧調
節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食障害、肥満症およ
びストレス関連障害などの状態を処置できる。
容体のモジュレーターを用いて、炎症性疾患、血圧調
節、睡眠異常、痛み、体温調節、摂食障害、肥満症およ
びストレス関連障害などの状態を処置できる。
【００８６】そのような化合物の毒性および療法効力
は、医薬標準法により細胞培養または実験動物におい
て、たとえばＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）お
よびＥＤ 50（集団の５０％に対する療法有効量）を測定
する方法により判定できる。毒性と療法効果の用量比は
治療指数であり、比ＬＤ50／ＥＤ50として表すことがで
きる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒副
作用を示す化合物も使用できるが、罹患していない細胞
に損傷を与える可能性を最小限に抑えることにより副作
用を少なくするために、そのような化合物が罹患組織部
位をターゲティングする送達システムを設計するように
注意を払うべきである。
は、医薬標準法により細胞培養または実験動物におい
て、たとえばＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）お
よびＥＤ 50（集団の５０％に対する療法有効量）を測定
する方法により判定できる。毒性と療法効果の用量比は
治療指数であり、比ＬＤ50／ＥＤ50として表すことがで
きる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒副
作用を示す化合物も使用できるが、罹患していない細胞
に損傷を与える可能性を最小限に抑えることにより副作
用を少なくするために、そのような化合物が罹患組織部
位をターゲティングする送達システムを設計するように
注意を払うべきである。
【００８７】細胞培養アッセイおよび動物試験で得たデ
ータを用いて、ヒトに使用する投与量の範囲を求めるこ
とができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは
毒性がほとんどまたは全くないＥＤ50を含む循環濃度の
範囲内にある。投与量はこの範囲内で、用いる剤形およ
び採用する投与経路に応じて変更できる。本発明方法に
用いるいずれの化合物についても、療法有効量はまず細
胞培養アッセイから推定できる。細胞培養で測定したＩ
Ｄ50（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する被験化
合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を動物モデルにおい
て達成する量を求めることができる。そのような情報を
用いて、ヒトに有用な量をより正確に決定することがで
きる。血漿濃度は、たとえば高速液体クロマトグラフィ
ーにより測定できる。
ータを用いて、ヒトに使用する投与量の範囲を求めるこ
とができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは
毒性がほとんどまたは全くないＥＤ50を含む循環濃度の
範囲内にある。投与量はこの範囲内で、用いる剤形およ
び採用する投与経路に応じて変更できる。本発明方法に
用いるいずれの化合物についても、療法有効量はまず細
胞培養アッセイから推定できる。細胞培養で測定したＩ
Ｄ50（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する被験化
合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を動物モデルにおい
て達成する量を求めることができる。そのような情報を
用いて、ヒトに有用な量をより正確に決定することがで
きる。血漿濃度は、たとえば高速液体クロマトグラフィ
ーにより測定できる。
【００８８】本発明に従って使用する医薬組成物は、常
法により、１以上の生理学的に許容できるキャリヤーま
たは賦形剤を用いて調製できる。たとえば本発明化合物
ならびにその生理学的に許容できる塩類および溶媒和物
を、吸入または吹入れ（口または鼻から）、または経
口、舌下、非経口もしくは直腸投与による投与のために
配合できる。
法により、１以上の生理学的に許容できるキャリヤーま
たは賦形剤を用いて調製できる。たとえば本発明化合物
ならびにその生理学的に許容できる塩類および溶媒和物
を、吸入または吹入れ（口または鼻から）、または経
口、舌下、非経口もしくは直腸投与による投与のために
配合できる。
【００８９】経口投与のためには、医薬組成物はたとえ
ば医薬的に許容できる賦形剤、たとえば下記のものを用
いて常法により製造した錠剤またはカプセル剤の形をと
ることができる：結合剤（たとえばプレゲル化したトウ
モロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロ
キシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば乳
糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；
滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクま
たはシリカ）；崩壊剤（たとえばバレイショデンプンま
たはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤
（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤を当技術分
野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投
与用の液体配合物は、たとえば液剤、シロップ剤または
懸濁液剤の形をとるか、あるいは使用前に水その他の適
切なビヒクルで調製するための乾燥粉末として提供され
てもよい。そのような液剤は、たとえば下記の医薬的に
許容できる添加物を用いて常法により調製できる：沈殿
防止剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘
導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（たとえばレシチ
ンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえばア
ーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分
留食用油）；および保存薬（たとえばｐ−ヒドロキシ安
息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）。
これらの製剤は緩衝塩類、着香剤、着色剤および甘味剤
を適宜含有してもよい。
ば医薬的に許容できる賦形剤、たとえば下記のものを用
いて常法により製造した錠剤またはカプセル剤の形をと
ることができる：結合剤（たとえばプレゲル化したトウ
モロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロ
キシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば乳
糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；
滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクま
たはシリカ）；崩壊剤（たとえばバレイショデンプンま
たはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤
（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤を当技術分
野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投
与用の液体配合物は、たとえば液剤、シロップ剤または
懸濁液剤の形をとるか、あるいは使用前に水その他の適
切なビヒクルで調製するための乾燥粉末として提供され
てもよい。そのような液剤は、たとえば下記の医薬的に
許容できる添加物を用いて常法により調製できる：沈殿
防止剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘
導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（たとえばレシチ
ンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえばア
ーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分
留食用油）；および保存薬（たとえばｐ−ヒドロキシ安
息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）。
これらの製剤は緩衝塩類、着香剤、着色剤および甘味剤
を適宜含有してもよい。
【００９０】経口投与用製剤は、有効成分を制御放出す
るように適切に配合できる。舌下投与のためには、組成
物は常法により調製した錠剤またはトローチ剤の形をと
ることができる。
るように適切に配合できる。舌下投与のためには、組成
物は常法により調製した錠剤またはトローチ剤の形をと
ることができる。
【００９１】吸入による投与のためには、本発明により
投与する化合物を加圧パックまたはネブライザーから、
適切な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、ト
リクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタ
ン、二酸化炭素その他の適切なガスを用いてエアゾルス
プレー剤の形で送達するのが好都合である。加圧エアゾ
ル剤の場合、投与単位は計量された量を送達する弁を設
けることにより決定できる。吸入器や吹入器に用いるた
めに、化合物および適切な粉末基剤（たとえば乳糖また
はデンプン）を含む粉末ミックスを入れた、たとえばゼ
ラチンのカプセルおよびカートリッジを調製してもよ
い。
投与する化合物を加圧パックまたはネブライザーから、
適切な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、ト
リクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタ
ン、二酸化炭素その他の適切なガスを用いてエアゾルス
プレー剤の形で送達するのが好都合である。加圧エアゾ
ル剤の場合、投与単位は計量された量を送達する弁を設
けることにより決定できる。吸入器や吹入器に用いるた
めに、化合物および適切な粉末基剤（たとえば乳糖また
はデンプン）を含む粉末ミックスを入れた、たとえばゼ
ラチンのカプセルおよびカートリッジを調製してもよ
い。
【００９２】本発明化合物を注射、たとえばボーラス注
射または連続注入による非経口投与のために調製するこ
ともできる。注射用配合物は、保存薬を添加して、たと
えばアンプル中の単位剤形で、または多数回分の容器に
入れて提供することができる。これらの組成物は、油性
または水性ビヒクル中の懸濁液剤、液剤または乳剤の形
をとることができ、沈殿防止剤、安定剤および／または
分散剤形などの製剤助剤を含有してもよい。あるいは有
効成分は適切なビヒクル中、たとえば発熱物質を含有し
ない無菌水中で使用前に調製するための粉末の形であっ
てもよい。
射または連続注入による非経口投与のために調製するこ
ともできる。注射用配合物は、保存薬を添加して、たと
えばアンプル中の単位剤形で、または多数回分の容器に
入れて提供することができる。これらの組成物は、油性
または水性ビヒクル中の懸濁液剤、液剤または乳剤の形
をとることができ、沈殿防止剤、安定剤および／または
分散剤形などの製剤助剤を含有してもよい。あるいは有
効成分は適切なビヒクル中、たとえば発熱物質を含有し
ない無菌水中で使用前に調製するための粉末の形であっ
てもよい。
【００９３】本発明化合物を直腸用組成物、たとえばカ
カオ脂または他のグリセリドなど一般的な坐剤基剤を含
有する坐剤または留置浣腸剤などの製剤にすることもで
きる。
カオ脂または他のグリセリドなど一般的な坐剤基剤を含
有する坐剤または留置浣腸剤などの製剤にすることもで
きる。
【００９４】前記製剤のほかに、本発明化合物をデポ製
剤として配合してもよい。そのような持効性製剤は埋込
みにより（たとえば皮下または筋肉内）または筋肉内注
射により投与できる。たとえば本発明化合物を適切なポ
リマーもしくは疎水性材料（たとえば許容できる油中の
乳剤として）もしくはイオン交換樹脂と共に、または貧
溶解性誘導体、たとえば貧溶解性塩として配合すること
ができる。
剤として配合してもよい。そのような持効性製剤は埋込
みにより（たとえば皮下または筋肉内）または筋肉内注
射により投与できる。たとえば本発明化合物を適切なポ
リマーもしくは疎水性材料（たとえば許容できる油中の
乳剤として）もしくはイオン交換樹脂と共に、または貧
溶解性誘導体、たとえば貧溶解性塩として配合すること
ができる。
【００９５】本発明組成物は所望により、有効成分を含
有する１以上の単位剤形を入れたパックまたはディスペ
ンサー器具中で提供される。パックはたとえば金属また
はプラスチックの箔からなり、たとえばＰＴＰ包装であ
る。パックまたはディスペンサー器具には投与指示書を
添付してもよい。
有する１以上の単位剤形を入れたパックまたはディスペ
ンサー器具中で提供される。パックはたとえば金属また
はプラスチックの箔からなり、たとえばＰＴＰ包装であ
る。パックまたはディスペンサー器具には投与指示書を
添付してもよい。
【００９６】実施例
以下の実施例は、当業者に周知の標準実験法を用いて実
施されるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００１）およびＡｕｓｕｂ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９
９）第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社が
参照される。ＰＣＲはＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ
−Ａ−４８００１９５およびＵＳ−Ａ−４９６５１８８
に記載されている。
施されるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００１）およびＡｕｓｕｂ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９
９）第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社が
参照される。ＰＣＲはＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ
−Ａ−４８００１９５およびＵＳ−Ａ−４９６５１８８
に記載されている。
【００９７】実施例は本発明を説明するためのものであ
り、限定ではない。それらは使用される可能性のある代
表的な方法であるが、当業者に既知の他の方法も使用で
きる。以下の配列表および図面を参照されたい： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＰＦＩ−０１１のｃＤＮＡ配
列； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＰＦＩ−０１１のペプチド配
列； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＰＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを
増幅器するためのフォワードプライマー； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＰＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを
増幅器するためのリバースプライマー； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６：ＰＦＩ−０１１由来
のペプチド：免疫組織化学的試験に用いるためのＰＦＩ
−０１１認識抗体の産生に使用； 図１：アドレン酸に対するＰＦＩ−０１１発現細胞の応
答。
り、限定ではない。それらは使用される可能性のある代
表的な方法であるが、当業者に既知の他の方法も使用で
きる。以下の配列表および図面を参照されたい： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＰＦＩ−０１１のｃＤＮＡ配
列； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＰＦＩ−０１１のペプチド配
列； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＰＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを
増幅器するためのフォワードプライマー； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＰＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを
増幅器するためのリバースプライマー； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６：ＰＦＩ−０１１由来
のペプチド：免疫組織化学的試験に用いるためのＰＦＩ
−０１１認識抗体の産生に使用； 図１：アドレン酸に対するＰＦＩ−０１１発現細胞の応
答。
【００９８】実施例１：ＰＦＩ−０１１のバイオインフ
ォーマティクス分析 ＰＦＩ−０１１の配列のバイオインフォーマティクス分
析はＥＰ−Ａ１０９４０７５に示されている。
ォーマティクス分析 ＰＦＩ−０１１の配列のバイオインフォーマティクス分
析はＥＰ−Ａ１０９４０７５に示されている。
【００９９】（ａ）タンパク質データベースに対比した
Ｂｌａｓｔ ＰＦＩ−０１１の配列を、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔに対比し
てＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ
ｌ．，３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ
ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
２１５，４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，２５，３３８９−３４０２））により検索し、最
も近似するタンパク質一致を同定した。この場合、最上
位ヒットはＰ７９１７７：ｆＭＬＰ関連受容体１に対し
てであった。
Ｂｌａｓｔ ＰＦＩ−０１１の配列を、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔに対比し
てＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ
ｌ．，３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ
ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
２１５，４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，２５，３３８９−３４０２））により検索し、最
も近似するタンパク質一致を同定した。この場合、最上
位ヒットはＰ７９１７７：ｆＭＬＰ関連受容体１に対し
てであった。
【０１００】これらの結果から、ＰＦＩ−０１１がＧＰ
ＣＲファミリーのメンバーであることが確認される。 （ｂ）非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）ヒトＧＰ
ＣＲデータベースに対比したＢＬＡＳＴ検索 ＰＦＩ−０１１をこの受容体に対するアゴニストクラス
同定のために、主にＧｅｎｂａｎｋおよびＤｅｒｗｅｎ
ｔ Ｇｅｎｅｓｅｑデータベースからの配列よりなる非
冗長ヒトＧＰＣＲデータベースに対比して検索した。上
位１０ヒットを以下に示す：
ＣＲファミリーのメンバーであることが確認される。 （ｂ）非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）ヒトＧＰ
ＣＲデータベースに対比したＢＬＡＳＴ検索 ＰＦＩ−０１１をこの受容体に対するアゴニストクラス
同定のために、主にＧｅｎｂａｎｋおよびＤｅｒｗｅｎ
ｔ Ｇｅｎｅｓｅｑデータベースからの配列よりなる非
冗長ヒトＧＰＣＲデータベースに対比して検索した。上
位１０ヒットを以下に示す：
【０１０１】
【化１】
実施例２：ＰＦＩ−０１１の組織分布
（ａ）ＰＦＩ−０１１ ｍＲＮＡ
ＰＦＩ−０１１に対応するｃＤＮＡクローンを、公表お
よび占有ＥＳＴライブラリーのＢｌａｓｔ検索により、
胸部および前立腺由来のｃＤＮＡライブラリー中に見出
した。
よび占有ＥＳＴライブラリーのＢｌａｓｔ検索により、
胸部および前立腺由来のｃＤＮＡライブラリー中に見出
した。
【０１０２】（ｂ）ＰＦＩ−０１１タンパク質
免疫組織化学的試験をＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉ
ｅｎｃｅｓ社（米国シアトル）と共同で実施した。ＰＦ
Ｉ−０１１配列から選択した下記のＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５および６に示す２ペプチドに対して、ウサギポリ
クローナル抗体を産生させた： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：ＲＴＣＨＲＱＱＱＰＡＡＣＲ
ＧＦＡＲＶＡＲ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：ＥＥＲＰＧＳＦＴＰＴＥＰＱ
ＴＱＬＤＳＥＧ ペプチドＲＴＣＨＲＱＱＱＰＡＡＣＲＧＦＡＲＶＡＲ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に対して産生された抗体１
９０４８４−２２１を用いて得た免疫組織化学的試験結
果 中枢神経系由来の試料は、小脳扁桃、大脳皮質および視
床を含めた多数の領域でニューロン染色を示した。視床
下部には、弓状核、傍室核および視索上核にブラッシュ
染色（ｂｌｕｓｈ ｓｔａｉｎｉｎｇ）ニューロンが含
まれていた。海馬は、歯状回細胞およびこれらの細胞か
ら多形層を貫通してアンモン角の錐体細胞にまで突出し
た突起の染色を示した。顆粒細胞層の流出と錐体細胞層
のこの関係は周知であり、この抗体がよく証明してい
る。被殻内の若干のニューロンは陽性であった。髄質内
の多数の核は変動性の陽性であり、これには最後野（ａ
ｒｅａ ｐｏｓｔｒｅｍａ）、舌下神経核、迷走神経背
側核、側索核、および内側副オリーブ核が含まれた。下
垂体前葉は、前部”ムコイドウェッジ（ｍｕｃｏｉｄｗ
ｅｄｇｅ）”領域へのこの抗体の印象的な局在化を示し
た。この領域はＡＣＴＨおよびＴＳＨの供給源であるこ
とが知られている。下垂体前葉の他の領域は局所的なブ
ラッシュ染色を示した。下垂体後葉は多数のニューロン
突起の染色、時には下垂体細胞の染色を示した。後葉は
時には陽性のヘリング小体様構造も含んでいた。
ｅｎｃｅｓ社（米国シアトル）と共同で実施した。ＰＦ
Ｉ−０１１配列から選択した下記のＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５および６に示す２ペプチドに対して、ウサギポリ
クローナル抗体を産生させた： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：ＲＴＣＨＲＱＱＱＰＡＡＣＲ
ＧＦＡＲＶＡＲ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：ＥＥＲＰＧＳＦＴＰＴＥＰＱ
ＴＱＬＤＳＥＧ ペプチドＲＴＣＨＲＱＱＱＰＡＡＣＲＧＦＡＲＶＡＲ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に対して産生された抗体１
９０４８４−２２１を用いて得た免疫組織化学的試験結
果 中枢神経系由来の試料は、小脳扁桃、大脳皮質および視
床を含めた多数の領域でニューロン染色を示した。視床
下部には、弓状核、傍室核および視索上核にブラッシュ
染色（ｂｌｕｓｈ ｓｔａｉｎｉｎｇ）ニューロンが含
まれていた。海馬は、歯状回細胞およびこれらの細胞か
ら多形層を貫通してアンモン角の錐体細胞にまで突出し
た突起の染色を示した。顆粒細胞層の流出と錐体細胞層
のこの関係は周知であり、この抗体がよく証明してい
る。被殻内の若干のニューロンは陽性であった。髄質内
の多数の核は変動性の陽性であり、これには最後野（ａ
ｒｅａ ｐｏｓｔｒｅｍａ）、舌下神経核、迷走神経背
側核、側索核、および内側副オリーブ核が含まれた。下
垂体前葉は、前部”ムコイドウェッジ（ｍｕｃｏｉｄｗ
ｅｄｇｅ）”領域へのこの抗体の印象的な局在化を示し
た。この領域はＡＣＴＨおよびＴＳＨの供給源であるこ
とが知られている。下垂体前葉の他の領域は局所的なブ
ラッシュ染色を示した。下垂体後葉は多数のニューロン
突起の染色、時には下垂体細胞の染色を示した。後葉は
時には陽性のヘリング小体様構造も含んでいた。
【０１０３】この抗体は幾つかの内分泌器官および内分
泌ターゲット器官を染色した。陽性の内分泌器官には副
腎が含まれ、ここでは染色は副腎皮質の球状帯に限定さ
れた。甲状腺試料の１つでは数個の瀘胞細胞が染色され
た。甲状腺試料の１つに偶然に副甲状腺が含まれ、これ
が少数の陽性細胞を含んでいた。卵巣検体の１つでは発
生中の顆粒膜細胞が陽性であり、分泌期の子宮内膜腺も
陽性であった。精巣内の精上皮は発生のすべてのレベル
で陽性であったが、ライジッヒ細胞は陰性であった。エ
クリン分泌要素および毛包を含めた若干の皮膚付属器に
陽性上皮細胞が散在していた。リンパ節においては、こ
の抗体は皮質帯のリンパ結節を染色し、リンパ節の髄帯
には染色はみられなかった。これは成熟Ｂ細胞の染色の
方が強いことを表す。Ｔ細胞に富む領域、たとえば動脈
周囲リンパ鞘は、マクロファージ以外は陰性であった。
口蓋扁桃では胚芽中心が陰性であり、皮質領域は陽性で
あった。胸腺の強い染色は皮質領域に限定されていた。
泌ターゲット器官を染色した。陽性の内分泌器官には副
腎が含まれ、ここでは染色は副腎皮質の球状帯に限定さ
れた。甲状腺試料の１つでは数個の瀘胞細胞が染色され
た。甲状腺試料の１つに偶然に副甲状腺が含まれ、これ
が少数の陽性細胞を含んでいた。卵巣検体の１つでは発
生中の顆粒膜細胞が陽性であり、分泌期の子宮内膜腺も
陽性であった。精巣内の精上皮は発生のすべてのレベル
で陽性であったが、ライジッヒ細胞は陰性であった。エ
クリン分泌要素および毛包を含めた若干の皮膚付属器に
陽性上皮細胞が散在していた。リンパ節においては、こ
の抗体は皮質帯のリンパ結節を染色し、リンパ節の髄帯
には染色はみられなかった。これは成熟Ｂ細胞の染色の
方が強いことを表す。Ｔ細胞に富む領域、たとえば動脈
周囲リンパ鞘は、マクロファージ以外は陰性であった。
口蓋扁桃では胚芽中心が陰性であり、皮質領域は陽性で
あった。胸腺の強い染色は皮質領域に限定されていた。
【０１０４】この抗体を多様な悪性腫瘍の染色にも用い
た。種々の腫瘍タイプにおいて染色はきわめて変動性で
あった。陽性腫瘍細胞は、第１の前立腺腺癌試料では細
胞の２０％、第２試料では細胞の３５％を占めていた。
浸潤性胸部癌の３試料において、陽性腫瘍細胞の割合は
０％から５０％まで変動した。卵巣癌の陽性細胞の範囲
は３０〜７０％であった。大腸癌の３試料においては、
それぞれ０、５および１０％の腫瘍細胞に染色が確認さ
れた。膵癌の１試料では５０％の腫瘍細胞が陽性であっ
たが、他の２試料では５％未満の細胞が陽性であること
が認められた。肺癌の３試料は、それぞれ５、１５およ
び７０％の細胞において陽性となった。小細胞気管支原
性癌はごくわずかに陽性であるか、あるいは陰性であっ
た。悪性黒色腫における陽性腫瘍細胞の割合は４０〜８
０％であった。
た。種々の腫瘍タイプにおいて染色はきわめて変動性で
あった。陽性腫瘍細胞は、第１の前立腺腺癌試料では細
胞の２０％、第２試料では細胞の３５％を占めていた。
浸潤性胸部癌の３試料において、陽性腫瘍細胞の割合は
０％から５０％まで変動した。卵巣癌の陽性細胞の範囲
は３０〜７０％であった。大腸癌の３試料においては、
それぞれ０、５および１０％の腫瘍細胞に染色が確認さ
れた。膵癌の１試料では５０％の腫瘍細胞が陽性であっ
たが、他の２試料では５％未満の細胞が陽性であること
が認められた。肺癌の３試料は、それぞれ５、１５およ
び７０％の細胞において陽性となった。小細胞気管支原
性癌はごくわずかに陽性であるか、あるいは陰性であっ
た。悪性黒色腫における陽性腫瘍細胞の割合は４０〜８
０％であった。
【０１０５】疾病においては、高血圧症および糖尿病の
腎臓試料の曲部尿細管内、喘息の好酸球内、ならびにア
レルギー性鼻炎の好酸球、呼吸上皮および反応性線維芽
細胞内に染色増大がみられた。アテローム性硬化症、パ
ーキンソン病、卒中、潰瘍性大腸炎、うっ血性心不全、
糖尿病性心臓、気管支炎、気腫または肺炎の試料には有
意差がみられなかった。心筋梗塞では傷害のある心筋細
胞にパッチ状の染色増大がみられた。良性前立腺肥大の
試料にも染色増大がみられた。多形性神経膠芽腫、ホジ
キンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫は陽性染色され
る腫瘍細胞群を示した。
腎臓試料の曲部尿細管内、喘息の好酸球内、ならびにア
レルギー性鼻炎の好酸球、呼吸上皮および反応性線維芽
細胞内に染色増大がみられた。アテローム性硬化症、パ
ーキンソン病、卒中、潰瘍性大腸炎、うっ血性心不全、
糖尿病性心臓、気管支炎、気腫または肺炎の試料には有
意差がみられなかった。心筋梗塞では傷害のある心筋細
胞にパッチ状の染色増大がみられた。良性前立腺肥大の
試料にも染色増大がみられた。多形性神経膠芽腫、ホジ
キンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫は陽性染色され
る腫瘍細胞群を示した。
【０１０６】ペプチドＥＥＲＰＧＳＦＴＰＴＥＰＱＴＱ
ＬＤＳＥＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）に対して産生さ
れた抗体１９０４８４−３１９を用いて得た免疫組織化
学的試験結果 中枢神経系においては、この抗体は視床下部内の弓状核
および傍室核細胞群を含めた多数のニューロン細胞タイ
プを染色した。視索上核は陰性であった。下垂体後葉は
陽性であり、下垂体前葉内の細胞群も陽性であり、これ
らは試料の前部および側部の被膜下領域に局在化してい
るように見えた。基底核内において尾状核のニューロン
は陰性であり、被殻ではごくわずかに陽性であった。黒
質のニューロンは変動性の陽性であった。他の陰性ニュ
ーロンタイプには、小脳および小脳扁桃内のすべてが含
まれていた。陽性ニューロンが脳幹の幾つかの核におい
て同定され、これには最後野（ａｒｅａ ｐｏｓｔｒｅ
ｍａ）、舌下神経核、迷走神経背側核および脳幹網様体
形成核が含まれていた。同様に顕著な陽性は視床背部内
のニューロン群に局在化していた。視床内の他の大部分
のニューロンは陰性であったからである。定位ランドマ
ークが無かったので、背部に局在化していたという以上
はこれらの細胞の正確な同定はできなかった。
ＬＤＳＥＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）に対して産生さ
れた抗体１９０４８４−３１９を用いて得た免疫組織化
学的試験結果 中枢神経系においては、この抗体は視床下部内の弓状核
および傍室核細胞群を含めた多数のニューロン細胞タイ
プを染色した。視索上核は陰性であった。下垂体後葉は
陽性であり、下垂体前葉内の細胞群も陽性であり、これ
らは試料の前部および側部の被膜下領域に局在化してい
るように見えた。基底核内において尾状核のニューロン
は陰性であり、被殻ではごくわずかに陽性であった。黒
質のニューロンは変動性の陽性であった。他の陰性ニュ
ーロンタイプには、小脳および小脳扁桃内のすべてが含
まれていた。陽性ニューロンが脳幹の幾つかの核におい
て同定され、これには最後野（ａｒｅａ ｐｏｓｔｒｅ
ｍａ）、舌下神経核、迷走神経背側核および脳幹網様体
形成核が含まれていた。同様に顕著な陽性は視床背部内
のニューロン群に局在化していた。視床内の他の大部分
のニューロンは陰性であったからである。定位ランドマ
ークが無かったので、背部に局在化していたという以上
はこれらの細胞の正確な同定はできなかった。
【０１０７】この抗体は多数の内分泌器官および内分泌
ターゲット器官の細胞を染色した。これには子宮内膜お
よび顆粒膜細胞ならびに卵巣の発生中の濾胞の卵胞膜細
胞、副腎皮質および髄質、消化管の神経内分泌細胞、精
巣の精上皮、ならびに副甲状腺が含まれていた。甲状腺
および一部の副腎皮質、ランゲルハンス島、ならびに精
巣内のライジッヒ細胞を含めた若干の内分泌組織が陰性
であった。内分泌系外で顕著に陽性の細胞は、Ｉ型およ
びＩＩ型型肺細胞であった。
ターゲット器官の細胞を染色した。これには子宮内膜お
よび顆粒膜細胞ならびに卵巣の発生中の濾胞の卵胞膜細
胞、副腎皮質および髄質、消化管の神経内分泌細胞、精
巣の精上皮、ならびに副甲状腺が含まれていた。甲状腺
および一部の副腎皮質、ランゲルハンス島、ならびに精
巣内のライジッヒ細胞を含めた若干の内分泌組織が陰性
であった。内分泌系外で顕著に陽性の細胞は、Ｉ型およ
びＩＩ型型肺細胞であった。
【０１０８】腫瘍においては、検査した前立腺癌および
卵巣癌のすべての試料が少なくとも局所的には陽性であ
った。浸潤性胸部癌の１試料は陽性であった。悪性黒色
腫の３試料すべてが少なくとも局所的には陽性であり、
肺腺癌の３試料のうち１つは陽性であった。小細胞気管
支原性癌の３試料のうち１つは稀に陽性細胞を含み、残
り２試料は陰性であった。浸潤性膵癌の１例を検査し、
陰性であった。大腸腺癌の１例は限定局在性の陽性腫瘍
細胞を示した。
卵巣癌のすべての試料が少なくとも局所的には陽性であ
った。浸潤性胸部癌の１試料は陽性であった。悪性黒色
腫の３試料すべてが少なくとも局所的には陽性であり、
肺腺癌の３試料のうち１つは陽性であった。小細胞気管
支原性癌の３試料のうち１つは稀に陽性細胞を含み、残
り２試料は陰性であった。浸潤性膵癌の１例を検査し、
陰性であった。大腸腺癌の１例は限定局在性の陽性腫瘍
細胞を示した。
【０１０９】疾病状態では、高血圧症の腎臓の例におけ
る曲部尿細管内、喘息の好酸球内、ならびにアレルギー
性鼻炎の好酸球、呼吸上皮および反応性線維芽細胞内に
染色増大がみられた。アテローム性硬化症、パーキンソ
ン病、卒中、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎およびク
ローン病、うっ血性心不全、糖尿病性心臓および糖尿病
性腎臓、心筋梗塞、気管支炎、気腫または肺炎の例には
有意差がみられなかった。神経膠芽細胞腫の２例中１例
は中等度の染色を示した。
る曲部尿細管内、喘息の好酸球内、ならびにアレルギー
性鼻炎の好酸球、呼吸上皮および反応性線維芽細胞内に
染色増大がみられた。アテローム性硬化症、パーキンソ
ン病、卒中、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎およびク
ローン病、うっ血性心不全、糖尿病性心臓および糖尿病
性腎臓、心筋梗塞、気管支炎、気腫または肺炎の例には
有意差がみられなかった。神経膠芽細胞腫の２例中１例
は中等度の染色を示した。
【０１１０】実施例３：哺乳動物細胞系におけるＰＦＩ
−０１１のクローニングおよび一過性発現 ＰＦＩ−０１１をコードするｃＤＮＡを、ヒトゲノムＤ
ＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により得た。ＰＣＲプライマーをＡＴＧ開始コドン
および終止コドンの周囲において設計し、５’または
３’側非翻訳領域を除いたコード配列のみを増幅させ
た。用いたプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および
４に示したものである： フォワードプライマー（＝ＰＦＩ−０１１フォワード） ５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） リバースプライマー（＝ＰＦＩ−０１１リバース） ５’−ＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣ−
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） ＰＣＲ条件：９４℃−３分。次いで９４℃−１分、５８
℃−１分、７２℃−２分を３０サイクル。最終サイクル
＝７２℃−１０分。
−０１１のクローニングおよび一過性発現 ＰＦＩ−０１１をコードするｃＤＮＡを、ヒトゲノムＤ
ＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により得た。ＰＣＲプライマーをＡＴＧ開始コドン
および終止コドンの周囲において設計し、５’または
３’側非翻訳領域を除いたコード配列のみを増幅させ
た。用いたプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および
４に示したものである： フォワードプライマー（＝ＰＦＩ−０１１フォワード） ５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） リバースプライマー（＝ＰＦＩ−０１１リバース） ５’−ＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣ−
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） ＰＣＲ条件：９４℃−３分。次いで９４℃−１分、５８
℃−１分、７２℃−２分を３０サイクル。最終サイクル
＝７２℃−１０分。
【０１１１】次いでＰＣＲ生成物を適切な哺乳動物細胞
発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉ
ｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の
プロトコルを用いて挿入した。このｃＤＮＡ挿入配列
は、たとえば制限部位ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを利用し
てｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター
から容易に切り出すことができ、これを同一酵素で消化
した異なる発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ４ＨＩＳ
ｍａｘＢ中へ分子生物学的標準法（たとえばＳａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク州
ニューヨーク）により、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
ライゲートさせ、これらのフラグメントを結合させるこ
とができる。ベクターｐｃＤＮＡ４ＨＩＳｍａｘＢを用
いるのは、これが遺伝子発現レベルを標準ｐｃＤＮＡ
３．１ベクターよりアップレギュレートする配列を含む
からである。
発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉ
ｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の
プロトコルを用いて挿入した。このｃＤＮＡ挿入配列
は、たとえば制限部位ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを利用し
てｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター
から容易に切り出すことができ、これを同一酵素で消化
した異なる発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ４ＨＩＳ
ｍａｘＢ中へ分子生物学的標準法（たとえばＳａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク州
ニューヨーク）により、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
ライゲートさせ、これらのフラグメントを結合させるこ
とができる。ベクターｐｃＤＮＡ４ＨＩＳｍａｘＢを用
いるのは、これが遺伝子発現レベルを標準ｐｃＤＮＡ
３．１ベクターよりアップレギュレートする配列を含む
からである。
【０１１２】５×１０6個の適切な宿主細胞、すなわち
内因性受容体の発現数が少ないように選択され（たとえ
ばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ−Ｋ１）、かつＧαタンパ
ク質（たとえばマウスＧα15（Ｗｉｌｋｉｅ，Ｔ．Ｍ．
ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，８８，１００４９−１００５３）、キ
メラＧqi5／Ｇqo5α−サブユニット、またはヒトＧα16
（Ａｍａｔｒｕｄａ，ＴＴ ３ｒｄ ｅｔ ａｌ．（１
９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８８，５５８７−５５９１））を安定に発現するよ
うに工学的に作製した細胞を、適切な哺乳動物細胞発現
ベクター中のＰＦＩ−０１１コードｃＤＮＡまたはベク
ターのみ７．５μｇで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によ
り、製造業者のプロトコルに従って一過性トランスフェ
クションした。細胞をリガンド結合アッセイまたはマイ
クロフィジオメトリーに用いる場合、それらをトランス
フェクション後２４〜７２時間インキュベートし、次い
で採集した。マイクロタイタープレートベースのアッセ
イに用いる場合、トランスフェクションの２４時間後、
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬＴＩ）により細胞をフラ
スコから脱着させ、たとえば側面の黒いポリ−Ｄ−リシ
ン処理、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ）に５×１０4個／ウェルの密度で接種し
た。プレートを一夜放置して細胞をウェルの底に付着さ
せた。
内因性受容体の発現数が少ないように選択され（たとえ
ばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ−Ｋ１）、かつＧαタンパ
ク質（たとえばマウスＧα15（Ｗｉｌｋｉｅ，Ｔ．Ｍ．
ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，８８，１００４９−１００５３）、キ
メラＧqi5／Ｇqo5α−サブユニット、またはヒトＧα16
（Ａｍａｔｒｕｄａ，ＴＴ ３ｒｄ ｅｔ ａｌ．（１
９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８８，５５８７−５５９１））を安定に発現するよ
うに工学的に作製した細胞を、適切な哺乳動物細胞発現
ベクター中のＰＦＩ−０１１コードｃＤＮＡまたはベク
ターのみ７．５μｇで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によ
り、製造業者のプロトコルに従って一過性トランスフェ
クションした。細胞をリガンド結合アッセイまたはマイ
クロフィジオメトリーに用いる場合、それらをトランス
フェクション後２４〜７２時間インキュベートし、次い
で採集した。マイクロタイタープレートベースのアッセ
イに用いる場合、トランスフェクションの２４時間後、
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬＴＩ）により細胞をフラ
スコから脱着させ、たとえば側面の黒いポリ−Ｄ−リシ
ン処理、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ）に５×１０4個／ウェルの密度で接種し
た。プレートを一夜放置して細胞をウェルの底に付着さ
せた。
【０１１３】実施例４：高レベルのＰＦＩ−０１１を発
現する安定な細胞系の工学的作製 適切な宿主細胞系、たとえばＨＥＫ２９３細胞またはＣ
ＨＯ細胞（目的とするＧタンパク質を発現しうるように
工学的に処理）を、ＰＦＩ−０１１をコードするｃＤＮ
Ａ（好ましくは５’または３’側非翻訳領域を含まない
もの）を含み、かつ選択性マーカー（たとえばネオマイ
シン耐性遺伝子）を含む適切な哺乳動物細胞発現ベクタ
ーで、実施例３の記載に従ってトランスフェクションし
た。トランスフェクション後、選択負荷をかけた。たと
えば増殖培地に４００〜８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を
添加し、これによりネオマイシン耐性遺伝子を含むベク
ターを取り込まなかった細胞をすべて死滅させた。３〜
４週間の選択後、個々のクローンを採取し、以後の分析
用に増殖させた。
現する安定な細胞系の工学的作製 適切な宿主細胞系、たとえばＨＥＫ２９３細胞またはＣ
ＨＯ細胞（目的とするＧタンパク質を発現しうるように
工学的に処理）を、ＰＦＩ−０１１をコードするｃＤＮ
Ａ（好ましくは５’または３’側非翻訳領域を含まない
もの）を含み、かつ選択性マーカー（たとえばネオマイ
シン耐性遺伝子）を含む適切な哺乳動物細胞発現ベクタ
ーで、実施例３の記載に従ってトランスフェクションし
た。トランスフェクション後、選択負荷をかけた。たと
えば増殖培地に４００〜８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を
添加し、これによりネオマイシン耐性遺伝子を含むベク
ターを取り込まなかった細胞をすべて死滅させた。３〜
４週間の選択後、個々のクローンを採取し、以後の分析
用に増殖させた。
【０１１４】安定な細胞系を作製するための別法には、
Ｆｌｐ−Ｉｎ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる。Ｐ
ＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを、組換えターゲット部位（Ｆ
ＲＴ）を含むベクター中へクローニングする。このｃＤ
ＮＡを含む組換え発現ベクターを修飾Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞
系に標準法（リポフェクタミンまたはこれに類するも
の）により導入する。修飾細胞系は導入時に既にゲノム
中に組換えターゲット部位を含んでおり、発現ベクター
中に含有される第２ＦＲＴを導入するとＦｌｐリコンビ
ナーゼにより仲介される相同組換えが起きる；陽性クロ
ーンをハイグロマイシンで選択する。その結果、発現構
築体がゲノム内の単一部位に安定に組み込まれ、クロー
ン選択の必要性が除かれる。次いでこの安定な細胞系を
以後の分析用に増殖させることができる。全プロセスに
約４週間を要する。
Ｆｌｐ−Ｉｎ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる。Ｐ
ＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを、組換えターゲット部位（Ｆ
ＲＴ）を含むベクター中へクローニングする。このｃＤ
ＮＡを含む組換え発現ベクターを修飾Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞
系に標準法（リポフェクタミンまたはこれに類するも
の）により導入する。修飾細胞系は導入時に既にゲノム
中に組換えターゲット部位を含んでおり、発現ベクター
中に含有される第２ＦＲＴを導入するとＦｌｐリコンビ
ナーゼにより仲介される相同組換えが起きる；陽性クロ
ーンをハイグロマイシンで選択する。その結果、発現構
築体がゲノム内の単一部位に安定に組み込まれ、クロー
ン選択の必要性が除かれる。次いでこの安定な細胞系を
以後の分析用に増殖させることができる。全プロセスに
約４週間を要する。
【０１１５】個々のクローンを、たとえばＰＦＩ−０１
１ ｃＤＮＡ配列から設計した標識プローブを用いるノ
ーザンブロットにより、または前記オリゴ体を用いるＲ
Ｔ−ＰＣＲにより分析できる。
１ ｃＤＮＡ配列から設計した標識プローブを用いるノ
ーザンブロットにより、または前記オリゴ体を用いるＲ
Ｔ−ＰＣＲにより分析できる。
【０１１６】実施例５：リガンド結合アッセイ
実施例３の記載に従って一過性トランスフェクションし
た２４〜７２時間後の、または実施例４の記載に従って
工学的に作製したＰＦＩ−０１１発現細胞を掻き取りに
より採集し、２０ｍｌの氷冷したアッセイ緩衝液（５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）に再懸濁し、ホモジ
ナイズし、得られた懸濁液を２０，０００ｇ、４℃で３
０分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを３ｍｌ
のアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．
４）に再懸濁し、再びホモジナイズした。タンパク質濃
度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によ
り、製造業者の推奨に従って測定した。
た２４〜７２時間後の、または実施例４の記載に従って
工学的に作製したＰＦＩ−０１１発現細胞を掻き取りに
より採集し、２０ｍｌの氷冷したアッセイ緩衝液（５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）に再懸濁し、ホモジ
ナイズし、得られた懸濁液を２０，０００ｇ、４℃で３
０分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを３ｍｌ
のアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．
４）に再懸濁し、再びホモジナイズした。タンパク質濃
度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によ
り、製造業者の推奨に従って測定した。
【０１１７】２００μｇのタンパク質を含有するこの膜
調製物のアリコートを、高い比放射能に放射性標識した
種々の潜在リガンドと共に室温または３０℃で約２時
間、インキュベートした（各リガンドについて最適な条
件、イオン濃度、インキュベーション時間および温度を
判定する必要がある）。インキュベーションを終止させ
るために、試料をＢｒａｎｄｅｌｌ細胞ハーベスターに
よりＷａｌｌａｃ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔへの結合を少なく
するために、予めアッセイ緩衝液中０．３％（ｖ／ｖ）
のＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｓｉｇｍａ）溶液に浸
漬（１時間）したもの）上に速やかに濾過した。直ちに
Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ／ウェルを、ウェル当たり２ｍｌの
アッセイ緩衝液で４回、速やかに連続洗浄した。Ｆｉｌ
ｔｅｒｍａｔを電子レンジで乾燥させ、Ｍｅｌｔｉｌｅ
ｘシンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を
Ｗａｌｌａｃ Ｍｅｌｔｉｌｅｘヒートシーラーにより
Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ上へ溶融させた。Ｆｉｌｔｅｒｍａ
ｔに結合した放射能をＷａｌｌａｃベータプレートシン
チレーション計数器で測定した。
調製物のアリコートを、高い比放射能に放射性標識した
種々の潜在リガンドと共に室温または３０℃で約２時
間、インキュベートした（各リガンドについて最適な条
件、イオン濃度、インキュベーション時間および温度を
判定する必要がある）。インキュベーションを終止させ
るために、試料をＢｒａｎｄｅｌｌ細胞ハーベスターに
よりＷａｌｌａｃ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔへの結合を少なく
するために、予めアッセイ緩衝液中０．３％（ｖ／ｖ）
のＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｓｉｇｍａ）溶液に浸
漬（１時間）したもの）上に速やかに濾過した。直ちに
Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ／ウェルを、ウェル当たり２ｍｌの
アッセイ緩衝液で４回、速やかに連続洗浄した。Ｆｉｌ
ｔｅｒｍａｔを電子レンジで乾燥させ、Ｍｅｌｔｉｌｅ
ｘシンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を
Ｗａｌｌａｃ Ｍｅｌｔｉｌｅｘヒートシーラーにより
Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ上へ溶融させた。Ｆｉｌｔｅｒｍａ
ｔに結合した放射能をＷａｌｌａｃベータプレートシン
チレーション計数器で測定した。
【０１１８】結合した全放射能から過剰の非標識リガン
ドの存在下で測定した放射能を差し引いた差として特異
的結合を定めた。用いたリガンドに対する受容体を宿主
細胞が内因性発現するかを評価するために、模擬トラン
スフェクションした細胞を同様に測定した。
ドの存在下で測定した放射能を差し引いた差として特異
的結合を定めた。用いたリガンドに対する受容体を宿主
細胞が内因性発現するかを評価するために、模擬トラン
スフェクションした細胞を同様に測定した。
【０１１９】実施例６：細胞内カルシウム移動を測定す
る機能アッセイ 蛍光イメージングプレート読取器（ＦＬＩＰＲ（登録商
標））法を、種々の潜在ＧＰＣＲアゴニストによるＰＦ
Ｉ−０１１の活性化を検出する手段として用いた。
る機能アッセイ 蛍光イメージングプレート読取器（ＦＬＩＰＲ（登録商
標））法を、種々の潜在ＧＰＣＲアゴニストによるＰＦ
Ｉ−０１１の活性化を検出する手段として用いた。
【０１２０】細胞を実施例３の記載に従ってトランスフ
ェクションした。トランスフェクションの２４時間後、
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬＴＩ）により細胞をフラ
スコから脱着させ、側面の黒いポリ−Ｄ−リシン処理、
９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）に５×１０4個／ウェルの密度で接種した。プレー
トを一夜放置して細胞をウェルの底に付着させた。細胞
から培地を除去し、１００μｌの温かい（３７℃）色素
添加溶液で交換した（２０μｌのＤＭＳＯ中５０μｇの
Ｆｌｕｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）＋Ｄ
ＭＳＯ中２０％プルロニック酸；１×Ｐｒｏｂｅｎｅｃ
ｉｄ含有ダルベッコ・イーグル培地１１ｍｌに添加（１
００×Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−プレート当たり０．７１
ｇのＰｒｏｂｅｎｅｃｉｄを５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨお
よび５ｍｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）に溶解；Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰｒｏｂｅｓ）はアニオン輸送タンパク質の活性を阻
害することにより色素添加を改善する））。次いでプレ
ートを３７℃で１時間インキュベートした。次いでプレ
ートをウェル当たり２５０μｌの洗浄緩衝液（５ｍｌの
１００×Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ原液＋４９５ｍｌのＰＢ
Ｓ，ｐＨ７．４）で４回洗浄した。プレートを３７℃／
５％ＣＯ2インキュベーターに３０分間戻した後、ＦＬ
ＩＰＲ（登録商標）計測器内で処理した。ＦＬＩＰＲ
（登録商標）処理は全試料の蛍光を２分間読み取るもの
であり、その間に蛍光ベースラインを１０秒間測定し
た。次いで目的量の化合物（すなわち潜在ＧＰＣＲアゴ
ニスト）を自動的にウェルに移し、残りの時間で蛍光を
連続モニターした。すべての化合物を洗浄緩衝液で希釈
した。
ェクションした。トランスフェクションの２４時間後、
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬＴＩ）により細胞をフラ
スコから脱着させ、側面の黒いポリ−Ｄ−リシン処理、
９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）に５×１０4個／ウェルの密度で接種した。プレー
トを一夜放置して細胞をウェルの底に付着させた。細胞
から培地を除去し、１００μｌの温かい（３７℃）色素
添加溶液で交換した（２０μｌのＤＭＳＯ中５０μｇの
Ｆｌｕｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）＋Ｄ
ＭＳＯ中２０％プルロニック酸；１×Ｐｒｏｂｅｎｅｃ
ｉｄ含有ダルベッコ・イーグル培地１１ｍｌに添加（１
００×Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−プレート当たり０．７１
ｇのＰｒｏｂｅｎｅｃｉｄを５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨお
よび５ｍｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）に溶解；Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰｒｏｂｅｓ）はアニオン輸送タンパク質の活性を阻
害することにより色素添加を改善する））。次いでプレ
ートを３７℃で１時間インキュベートした。次いでプレ
ートをウェル当たり２５０μｌの洗浄緩衝液（５ｍｌの
１００×Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ原液＋４９５ｍｌのＰＢ
Ｓ，ｐＨ７．４）で４回洗浄した。プレートを３７℃／
５％ＣＯ2インキュベーターに３０分間戻した後、ＦＬ
ＩＰＲ（登録商標）計測器内で処理した。ＦＬＩＰＲ
（登録商標）処理は全試料の蛍光を２分間読み取るもの
であり、その間に蛍光ベースラインを１０秒間測定し
た。次いで目的量の化合物（すなわち潜在ＧＰＣＲアゴ
ニスト）を自動的にウェルに移し、残りの時間で蛍光を
連続モニターした。すべての化合物を洗浄緩衝液で希釈
した。
【０１２１】化合物が蛍光を一時的に増強し、したがっ
て細胞内カルシウムを増加させることにより、受容体に
対するアゴニストとして作用しうる化合物を同定した。
図１は、アドレン酸に対するＰＦＩ−０１１発現細胞の
応答（黒線、経時的に蛍光が変化）を模擬トランスフェ
クション細胞（灰色の線）と比較して示す。
て細胞内カルシウムを増加させることにより、受容体に
対するアゴニストとして作用しうる化合物を同定した。
図１は、アドレン酸に対するＰＦＩ−０１１発現細胞の
応答（黒線、経時的に蛍光が変化）を模擬トランスフェ
クション細胞（灰色の線）と比較して示す。
【０１２２】実施例７：マイクロフィジオメトリーを用
いる機能アッセイ 大部分の受容体における作動が、この刺激に応答するた
めに細胞に余分なエネルギーを要求する。このエネルギ
ーを産生するために、代謝活性が増大し、わずかではあ
るが測定可能な程度に周囲の培地を酸性化する。このわ
ずかなｐＨ変化を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ
ｓ社が開発したＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒマイクロフィジオ
メーターで測定できる。
いる機能アッセイ 大部分の受容体における作動が、この刺激に応答するた
めに細胞に余分なエネルギーを要求する。このエネルギ
ーを産生するために、代謝活性が増大し、わずかではあ
るが測定可能な程度に周囲の培地を酸性化する。このわ
ずかなｐＨ変化を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ
ｓ社が開発したＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒマイクロフィジオ
メーターで測定できる。
【０１２３】実施例３または４の記載に従って調製した
ＰＦＩ−０１１発現細胞を非酵素性の細胞解離液（Ｓｉ
ｇｍａ）で穏やかに採集し、生理的緩衝液で洗浄し、Ｃ
ｙｔｏｓｅｎｓｏｒアッセイカップ内で低緩衝能培地に
接種し、単層として付着させた。あるいは、製造業者の
プロトコルの記載に従って、高い細胞密度を達成しても
よい。次いでカップをＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒに入れ、低
緩衝能培地を細胞上に穏やかに送入することにより１時
間平衡化した。次いで目的量の潜在アゴニストを含有す
る低緩衝能培地を細胞上に穏やかに送入し、細胞の酸性
化速度を連続モニターした。トランスフェクション細胞
の代謝速度は高めるが各宿主細胞系の代謝速度は高めな
い物質として、発現した受容体に対するアゴニストを同
定した。
ＰＦＩ−０１１発現細胞を非酵素性の細胞解離液（Ｓｉ
ｇｍａ）で穏やかに採集し、生理的緩衝液で洗浄し、Ｃ
ｙｔｏｓｅｎｓｏｒアッセイカップ内で低緩衝能培地に
接種し、単層として付着させた。あるいは、製造業者の
プロトコルの記載に従って、高い細胞密度を達成しても
よい。次いでカップをＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒに入れ、低
緩衝能培地を細胞上に穏やかに送入することにより１時
間平衡化した。次いで目的量の潜在アゴニストを含有す
る低緩衝能培地を細胞上に穏やかに送入し、細胞の酸性
化速度を連続モニターした。トランスフェクション細胞
の代謝速度は高めるが各宿主細胞系の代謝速度は高めな
い物質として、発現した受容体に対するアゴニストを同
定した。
【０１２４】実施例８：組織抽出物および体液のスクリ
ーニング 実施例７のマイクロフィジオメトリーアッセイは、組織
抽出物および体液中のアゴニストの同定にも使用でき
る。実施例７の場合のように単離した物質を細胞に導通
するのではなく、抽出物または体液を使用できる。応答
が得られた場合、次いでその抽出物または体液をカラム
クロマトグラフィーまたは当技術分野で同定のために知
られている他の分離法により（通常は多数サイクルの分
離および画分検査で）、作用を生じた物質を分画する。
こうして、オーファン受容体に対するそれまで未知であ
った天然アゴニストを見出すことができる。
ーニング 実施例７のマイクロフィジオメトリーアッセイは、組織
抽出物および体液中のアゴニストの同定にも使用でき
る。実施例７の場合のように単離した物質を細胞に導通
するのではなく、抽出物または体液を使用できる。応答
が得られた場合、次いでその抽出物または体液をカラム
クロマトグラフィーまたは当技術分野で同定のために知
られている他の分離法により（通常は多数サイクルの分
離および画分検査で）、作用を生じた物質を分画する。
こうして、オーファン受容体に対するそれまで未知であ
った天然アゴニストを見出すことができる。
【０１２５】実施例９：ＣＲＥ−ルシフェラーゼアッセ
イ ＨＥＫ２９３細胞を約８０％集密にまで培養し、この時
点で、脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴ
ＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を製造業者の推奨に従って用いて、プラスミドｐＣ
ＲＥ−Ｌｕｃ（ＣＲＥ4−ルシフェラーゼ、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）およびＰＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを含むプ
ラスミド構築体で同時トランスフェクションした。細胞
をトランスフェクション後２４時間培養し、次いでリン
酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）で洗浄し、ダルベッコ改変
イーグル培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補充）
中に回収し、１００μｌアリコート（５×１０4個）を
白色９６ウェル組織培養プレートに接種した。さらに２
４時間のインキュベーション後、体積２０μｌの化合物
を３重のウェルに添加し、プレートを最低５時間インキ
ュベートした。次いで増殖培地を除去し、細胞をＧｌｏ
溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶解し、続いて１０
０μｌのＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ検出試薬
（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ルシフェラーゼの発現
レベルをＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（商標）読取り器で定
量した（ウェル当たり１秒）。実験を薬物仲介用量応答
効果の測定用に設計した場合、対照用量応答を常に含め
た。化合物について得たデータをその実験で測定した対
照値に対して正規化した。すべての実験を３以上の別個
の機会に実施し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を求めた。４パ
ラメーターロジスチック曲線（Ｌａｂｓｔａｔｓソフト
ウェア、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）を当てはめ
ることにより平均正規化データからＩＣ50値および見掛
け効率を計算した。アンタゴニストについては、Ｓｃｈ
ｉｌｄ分析を行ってｐＡ2値を決定した（Ａｒｕｎｌａ
ｋｓｈａｎａ，Ｏ． ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．Ｏ．
（１９５９）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１
４，４８−５８）。
イ ＨＥＫ２９３細胞を約８０％集密にまで培養し、この時
点で、脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴ
ＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を製造業者の推奨に従って用いて、プラスミドｐＣ
ＲＥ−Ｌｕｃ（ＣＲＥ4−ルシフェラーゼ、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）およびＰＦＩ−０１１ ｃＤＮＡを含むプ
ラスミド構築体で同時トランスフェクションした。細胞
をトランスフェクション後２４時間培養し、次いでリン
酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）で洗浄し、ダルベッコ改変
イーグル培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補充）
中に回収し、１００μｌアリコート（５×１０4個）を
白色９６ウェル組織培養プレートに接種した。さらに２
４時間のインキュベーション後、体積２０μｌの化合物
を３重のウェルに添加し、プレートを最低５時間インキ
ュベートした。次いで増殖培地を除去し、細胞をＧｌｏ
溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶解し、続いて１０
０μｌのＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ検出試薬
（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ルシフェラーゼの発現
レベルをＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（商標）読取り器で定
量した（ウェル当たり１秒）。実験を薬物仲介用量応答
効果の測定用に設計した場合、対照用量応答を常に含め
た。化合物について得たデータをその実験で測定した対
照値に対して正規化した。すべての実験を３以上の別個
の機会に実施し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を求めた。４パ
ラメーターロジスチック曲線（Ｌａｂｓｔａｔｓソフト
ウェア、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）を当てはめ
ることにより平均正規化データからＩＣ50値および見掛
け効率を計算した。アンタゴニストについては、Ｓｃｈ
ｉｌｄ分析を行ってｐＡ2値を決定した（Ａｒｕｎｌａ
ｋｓｈａｎａ，Ｏ． ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．Ｏ．
（１９５９）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１
４，４８−５８）。
【０１２６】実施例１０：β−ラクタマーゼアッセイ
レポーター遺伝子β−ラクタマーゼのコード領域に機能
的に結合したサイクリックＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、
およびレポーター遺伝子β−ラクタマーゼのコード領域
に結合した活性化Ｔ細胞プロモーターＮＦ−ＡＴの核因
子（Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａ
ｔｕｒｅ，３５２，８０３−８０７）を安定に含むよう
に工学的に処理したＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ−ＣＲＥ−Ｎ
ＦＡＴ−ＢＬＡ）を、実施例４の記載に従って、哺乳動
物細胞における発現を誘発するプロモーターに機能的に
結合したＰＦＩ−０１１コードｃＤＮＡを含むプラスミ
ド（たとえばｐｃＤＮＡ３．１）でトランスフェクショ
ンし、ＰＦＩ−０１１の安定発現について選択する。
的に結合したサイクリックＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、
およびレポーター遺伝子β−ラクタマーゼのコード領域
に結合した活性化Ｔ細胞プロモーターＮＦ−ＡＴの核因
子（Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａ
ｔｕｒｅ，３５２，８０３−８０７）を安定に含むよう
に工学的に処理したＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ−ＣＲＥ−Ｎ
ＦＡＴ−ＢＬＡ）を、実施例４の記載に従って、哺乳動
物細胞における発現を誘発するプロモーターに機能的に
結合したＰＦＩ−０１１コードｃＤＮＡを含むプラスミ
ド（たとえばｐｃＤＮＡ３．１）でトランスフェクショ
ンし、ＰＦＩ−０１１の安定発現について選択する。
【０１２７】次いでＰＦＩ−０１１を発現するＣＨＯ−
ＣＲＥ−ＮＦＡＴ−ＢＬＡ細胞をウェル当たり４×１０
3個で９６ウェルプレートに接種し、３７℃でＣＯ2イン
キュベーター（５％ＣＯ2）内において６０時間インキ
ュベートする。次いで培地を除去し、９０μｌの飢餓培
地（ＤＭＥＭ：高グルコース、０．１ｍＭ非必須アミノ
酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ緩衝液を含有する；血清または抗生物質を含有しな
い）を各ウェルに添加し、細胞を一夜インキュベートす
る。次いで、１％透析ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中に
調製したアドレン酸（または陽性対照については１μｍ
のイオノマイシン）をウェル当たり１０μｌ添加するこ
とにより、細胞を刺激する。３７℃／５％ＣＯ2で５時
間のインキュベーション後、２０μｌの６×色素溶液
（Ａｕｒｏｒａから入手したＣＣＦ２Ｌｏａｄｉｎｇキ
ット、カタログ番号００ １００ ０１２；溶液Ａ〜Ｄ
を含有；６×色素溶液の調製のためには３６μｌの溶液
Ａ（ＣＣＦ２−ＡＭ）、１８０μｌの溶液Ｂ、２．８ｍ
ｌの溶液Ｃ、および２２５μＬの溶液Ｄを指示に従って
混和する）を各ウェルに添加し、プレートを揺動プラッ
トフォーム上で暗所において室温で１時間インキュベー
トする（４０サイクル／分で揺動）。次いでＣｙｔｏｆ
ｌｕｏｒ ４０００（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）で励起波長４０５ｎｍを用い、波長４５
０ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光を測定することにより
蛍光を測定する。
ＣＲＥ−ＮＦＡＴ−ＢＬＡ細胞をウェル当たり４×１０
3個で９６ウェルプレートに接種し、３７℃でＣＯ2イン
キュベーター（５％ＣＯ2）内において６０時間インキ
ュベートする。次いで培地を除去し、９０μｌの飢餓培
地（ＤＭＥＭ：高グルコース、０．１ｍＭ非必須アミノ
酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ緩衝液を含有する；血清または抗生物質を含有しな
い）を各ウェルに添加し、細胞を一夜インキュベートす
る。次いで、１％透析ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中に
調製したアドレン酸（または陽性対照については１μｍ
のイオノマイシン）をウェル当たり１０μｌ添加するこ
とにより、細胞を刺激する。３７℃／５％ＣＯ2で５時
間のインキュベーション後、２０μｌの６×色素溶液
（Ａｕｒｏｒａから入手したＣＣＦ２Ｌｏａｄｉｎｇキ
ット、カタログ番号００ １００ ０１２；溶液Ａ〜Ｄ
を含有；６×色素溶液の調製のためには３６μｌの溶液
Ａ（ＣＣＦ２−ＡＭ）、１８０μｌの溶液Ｂ、２．８ｍ
ｌの溶液Ｃ、および２２５μＬの溶液Ｄを指示に従って
混和する）を各ウェルに添加し、プレートを揺動プラッ
トフォーム上で暗所において室温で１時間インキュベー
トする（４０サイクル／分で揺動）。次いでＣｙｔｏｆ
ｌｕｏｒ ４０００（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）で励起波長４０５ｎｍを用い、波長４５
０ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光を測定することにより
蛍光を測定する。
【０１２８】リガンドが受容体を刺激し、その応答によ
り細胞のｃＡＭＰ濃度またはカルシウム濃度が変化した
場合、その細胞ではβ−ラクタマーゼが発現しているで
あろう。色素は、β−ラクタムリンカー基により連結し
た青色（クマリン）成分および緑色（フルオレセイン）
成分からなる。４０５ｎｍで刺激されると、開裂してい
ない分子内では蛍光エネルギー伝達が起き、発光波長は
緑色（約５３０ｎｍ）である。リンカーがβ−ラクタマ
ーゼで開裂されるとエネルギー伝達は起きず、４０５ｎ
ｍで測定される青色の蛍光が生じる。青色と緑色の蛍光
比を測定すると、受容体刺激の指標が得られる。この比
はアゴニスト用量依存性であり、受容体に対するアゴニ
ストをランク付けするのに利用できる。
り細胞のｃＡＭＰ濃度またはカルシウム濃度が変化した
場合、その細胞ではβ−ラクタマーゼが発現しているで
あろう。色素は、β−ラクタムリンカー基により連結し
た青色（クマリン）成分および緑色（フルオレセイン）
成分からなる。４０５ｎｍで刺激されると、開裂してい
ない分子内では蛍光エネルギー伝達が起き、発光波長は
緑色（約５３０ｎｍ）である。リンカーがβ−ラクタマ
ーゼで開裂されるとエネルギー伝達は起きず、４０５ｎ
ｍで測定される青色の蛍光が生じる。青色と緑色の蛍光
比を測定すると、受容体刺激の指標が得られる。この比
はアゴニスト用量依存性であり、受容体に対するアゴニ
ストをランク付けするのに利用できる。
【０１２９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Pfizer Ltd (for GB)
Pfizer Inc
<120> Adrenic acid receptor and uses thereof
<130> PCS22031ABXP
<150> GB 0119928.0
<151> 2001-08-15
<160> 6
<170> FastSEQ for Windows（登録商標） Version 4.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggacacta ccatggaagc tgacctgggt gccactggcc acaggccccg cacagagctt 60
gatgatgagg actcctaccc ccaaggtggc tgggacacgg tcttcctggt ggccctgctg 120
ctccttgggc tgccagccaa tgggttgatg gcgtggctgg ccggctccca ggcccggcat 180
ggagctggca cgcgtctggc gctgctcctg ctcagcctgg ccctctctga cttcttgttc 240
ctggcagcag cggccttcca gatcctagag atccggcatg ggggacactg gccgctgggg 300
acagctgcct gccgcttcta ctacttccta tggggcgtgt cctactcctc cggcctcttc 360
ctgctggccg ccctcagcct cgaccgctgc ctgctggcgc tgtgcccaca ctggtaccct 420
gggcaccgcc cagtccgcct gcccctctgg gtctgcgccg gtgtctgggt gctggccaca 480
ctcttcagcg tgccctggct ggtcttcccc gaggctgccg tctggtggta cgacctggtc 540
atctgcctgg acttctggga cagcgaggag ctgtcgctga ggatgctgga ggtcctgggg 600
ggcttcctgc ctttcctcct gctgctcgtc tgccacgtgc tcacccaggc cacagcctgt 660
cgcacctgcc accgccaaca gcagcccgca gcctgccggg gcttcgcccg tgtggccagg 720
accattctgt cagcctatgt ggtcctgagg ctgccctacc agctggccca gctgctctac 780
ctggccttcc tgtgggacgt ctactctggc tacctgctct gggaggccct ggtctactcc 840
gactacctga tcctactcaa cagctgcctc agccccttcc tctgcctcat ggccagtgcc 900
gacctccgga ccctgctgcg ctccgtgctc tcgtccttcg cggcagctct ctgcgaggag 960
cggccgggca gcttcacgcc cactgagcca cagacccagc tagattctga gggtccaact 1020
ctgccagagc cgatggcaga ggcccagtca cagatggatc ctgtggccca gcctcaggtg 1080
aaccccacac tccagccacg atcggatccc acagctcagc cacagctgaa ccctacggcc 1140
cagccacagt cggatcccac agcccagcca cagctgaacc tcatggccca gccacagtca 1200
gattctgtgg cccagccaca ggcagacact aacgtccaga cccctgcacc tgctgccagt 1260
tctgtgccca gtccctgtga tgaagcttcc ccaaccccat cctcgcatcc taccccaggg 1320
gcccttgagg acccagccac acctcctgcc tctgaaggag aaagccccag cagcaccccg 1380
ccagaggcgg ccccgggcgc aggccccacg tga 1413
<210> 2
<211> 470
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asp Thr Thr Met Glu Ala Asp Leu Gly Ala Thr Gly His Arg Pro
1 5 10 15
Arg Thr Glu Leu Asp Asp Glu Asp Ser Tyr Pro Gln Gly Gly Trp Asp
20 25 30
Thr Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Pro Ala Asn Gly
35 40 45
Leu Met Ala Trp Leu Ala Gly Ser Gln Ala Arg His Gly Ala Gly Thr
50 55 60
Arg Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Ser Asp Phe Leu Phe
65 70 75 80
Leu Ala Ala Ala Ala Phe Gln Ile Leu Glu Ile Arg His Gly Gly His
85 90 95
Trp Pro Leu Gly Thr Ala Ala Cys Arg Phe Tyr Tyr Phe Leu Trp Gly
100 105 110
Val Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ser Leu Asp
115 120 125
Arg Cys Leu Leu Ala Leu Cys Pro His Trp Tyr Pro Gly His Arg Pro
130 135 140
Val Arg Leu Pro Leu Trp Val Cys Ala Gly Val Trp Val Leu Ala Thr
145 150 155 160
Leu Phe Ser Val Pro Trp Leu Val Phe Pro Glu Ala Ala Val Trp Trp
165 170 175
Tyr Asp Leu Val Ile Cys Leu Asp Phe Trp Asp Ser Glu Glu Leu Ser
180 185 190
Leu Arg Met Leu Glu Val Leu Gly Gly Phe Leu Pro Phe Leu Leu Leu
195 200 205
Leu Val Cys His Val Leu Thr Gln Ala Thr Ala Cys Arg Thr Cys His
210 215 220
Arg Gln Gln Gln Pro Ala Ala Cys Arg Gly Phe Ala Arg Val Ala Arg
225 230 235 240
Thr Ile Leu Ser Ala Tyr Val Val Leu Arg Leu Pro Tyr Gln Leu Ala
245 250 255
Gln Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Trp Asp Val Tyr Ser Gly Tyr Leu
260 265 270
Leu Trp Glu Ala Leu Val Tyr Ser Asp Tyr Leu Ile Leu Leu Asn Ser
275 280 285
Cys Leu Ser Pro Phe Leu Cys Leu Met Ala Ser Ala Asp Leu Arg Thr
290 295 300
Leu Leu Arg Ser Val Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Leu Cys Glu Glu
305 310 315 320
Arg Pro Gly Ser Phe Thr Pro Thr Glu Pro Gln Thr Gln Leu Asp Ser
325 330 335
Glu Gly Pro Thr Leu Pro Glu Pro Met Ala Glu Ala Gln Ser Gln Met
340 345 350
Asp Pro Val Ala Gln Pro Gln Val Asn Pro Thr Leu Gln Pro Arg Ser
355 360 365
Asp Pro Thr Ala Gln Pro Gln Leu Asn Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ser
370 375 380
Asp Pro Thr Ala Gln Pro Gln Leu Asn Leu Met Ala Gln Pro Gln Ser
385 390 395 400
Asp Ser Val Ala Gln Pro Gln Ala Asp Thr Asn Val Gln Thr Pro Ala
405 410 415
Pro Ala Ala Ser Ser Val Pro Ser Pro Cys Asp Glu Ala Ser Pro Thr
420 425 430
Pro Ser Ser His Pro Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asp Pro Ala Thr Pro
435 440 445
Pro Ala Ser Glu Gly Glu Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro Glu Ala Ala
450 455 460
Pro Gly Ala Gly Pro Thr
465 470
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
accatggaag ctgacctgg 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cctgtctgac tggctggttc c 21
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Arg Thr Cys His Arg Gln Gln Gln Pro Ala Ala Cys Arg Gly Phe Ala
1 5 10 15
Arg Val Ala Arg
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Glu Arg Pro Gly Ser Phe Thr Pro Thr Glu Pro Gln Thr Gln Leu
1 5 10 15
Asp Ser Glu Gly
20
【図１】アドレン酸に対するＰＦＩ−０１１発現細胞の
応答を示すグラフである。
応答を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 25/04 Ａ６１Ｐ 25/20
25/20 29/00
29/00 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ
1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CB01 DA36 DA77
4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02
EA04 GA11
4B063 QA01 QA05 QA18 QQ03 QQ62
QQ79 QQ89 QR02 QR10 QR77
QS36 QX01 QX02 QX07
4C084 AA07 AA17 MA35 MA52 MA55
NA14 ZA051 ZA081 ZA361
ZA701 ZC781
4C085 AA13 AA14 BB11 CC05 DD22
DD23 EE01
Claims (21)
- 【請求項１】 ＰＦＩ−０１１のリガンドとしてのアド
レン酸またはその類似体もしくは模倣体の使用。 - 【請求項２】 ＰＦＩ−０１１のモジュレーターとして
のアドレン酸またはその類似体もしくは模倣体の使用。 - 【請求項３】 ＰＦＩ−０１１における機能性応答を誘
発するための、アドレン酸またはその類似体もしくは模
倣体の使用。 - 【請求項４】 アドレン酸を使用する、請求項１〜３の
いずれか１項に記載の使用。 - 【請求項５】 ＰＦＩ−０１１のモジュレーターである
化合物をスクリーニングする方法であって、アドレン酸
またはその類似体もしくは模倣体をリガンドとして使用
する方法。 - 【請求項６】 アドレン酸受容体のモジュレーターであ
る化合物をスクリーニングする方法であって： （ａ）ＰＦＩ−０１１の試料と、アドレン酸またはその
類似体もしくは模倣体から選択されるリガンドとを接触
させる工程；（ｂ）同様なＰＦＩ−０１１の試料と、工
程（ａ）で用いたリガンドおよび被験化合物もしくは被
験化合物混合物の両方とを接触させる工程；そして
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果を比較して、用いたリガン
ドの結合が被験化合物もしくは被験化合物混合物の存在
により影響されたかを判定する工程を含む（これらに限
定されない）方法。 - 【請求項７】 アドレン酸受容体のモジュレーターであ
る化合物をスクリーニングする方法であって： （ａ）ＰＦＩ−０１１の試料と、検出可能な標識が結合
しているアドレン酸またはその類似体もしくは模倣体か
ら選択されるリガンドとを、被験化合物もしくは被験化
合物混合物の存在下または不存在下で接触させる工程；
（ｂ）結合した標識量を測定し、被験化合物もしくは被
験化合物混合物の不存在下で結合した標識量と比較して
被験化合物もしくは被験化合物混合物の存在下で結合し
た標識量が減少したことにより、アドレン酸受容体への
被験化合物もしくは被験化合物混合物の結合を同定する
工程を含む（これらに限定されない）方法。 - 【請求項８】 アドレン酸受容体の発現方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはその変異体もしくは相同
体を含む適切な発現ベクターを適切な宿主細胞に伝達
し、該宿主細胞を該受容体の発現に適した条件下で培養
することを含む方法。 - 【請求項９】 細胞が哺乳動物細胞または昆虫細胞であ
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 アドレン酸受容体の発現方法であっ
て、適切な細胞においてＰＦＩ−０１１の発現をアップ
レギュレートすることを含む方法。 - 【請求項１１】 ＰＦＩ−０１１の試料が、請求項８、
９もしくは１０に記載の方法で調製した細胞、ＰＦＩ−
０１１を自然発現する細胞、またはそれらの細胞から調
製した膜、あるいはそれらの細胞または膜から富化また
は精製したＰＦＩ−０１１タンパク質を含む、請求項６
または７に記載の方法。 - 【請求項１２】 アドレン酸受容体のアゴニストをスク
リーニングする方法であって： （ａ）被験化合物または被験化合物混合物を、ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞に添加する工程；（ｂ）機
能性応答がみられるかを判定する工程を含む方法。 - 【請求項１３】 機能性応答が、一時的な細胞内カルシ
ウム濃度上昇である、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 機能性応答が、マイクロフィジオメト
リーにより測定した周囲媒質の酸性化である、請求項１
２に記載の方法。 - 【請求項１５】 機能性応答が、サイクリックＡＭＰ応
答配列に結合したレポーター遺伝子の活性化である、請
求項１２に記載の方法。 - 【請求項１６】 アドレン酸受容体のアンタゴニストを
スクリーニングする方法であって： （ａ）被験化合物または被験化合物混合物を、ＰＦＩ−
０１１を発現する適切な細胞に添加する工程；（ｂ）ア
ドレン酸またはその類似体もしくは模倣体、または請求
項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法で同定したア
ゴニストを添加する工程；そして（ｃ）機能性応答がみ
られるかを判定し、アゴニストに対する機能性応答を低
下させる被験化合物または被験化合物混合物としてアン
タゴニストを同定する工程を含む方法。 - 【請求項１７】 ＰＦＩ−０１１を発現する適切な細胞
が、ＰＦＩ−０１１を自然発現する細胞、または請求項
８、９もしくは１０に記載の方法で調製した細胞であ
る、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 請求項５〜７または１２〜１７のいず
れか１項に記載の方法で同定した化合物。 - 【請求項１９】 請求項５〜７または１２〜１７のいず
れか１項に記載の方法で同定した化合物および医薬的に
許容できる適切なキャリヤーを含む、医薬組成物。 - 【請求項２０】 請求項５〜７または１２〜１７のいず
れか１項に記載の方法で化合物がアドレン酸受容体アゴ
ニストまたはアンタゴニストであるかを判定し、該化合
物を医薬的に許容できるキャリヤーと混合することを含
む、医薬組成物の調製方法。 - 【請求項２１】 哺乳動物においてアドレン酸仲介障害
を診断する方法であって： （ａ）ＰＦＩ−０１１遺伝子発現レベルを測定する工
程；または（ｂ）患者試料のアドレン酸依存性ＰＦＩ−
０１１活性を測定し、その測定値を臨床的に正常な個体
から測定した値と比較する工程を含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GBGB0119928.0A GB0119928D0 (en) | 2001-08-15 | 2001-08-15 | New use |
| GB0119928.0 | 2001-08-15 |
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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