KR101384572B1

KR101384572B1 - Ｐｄｚ 상호작용의 소형 분자 억제제

Info

Publication number: KR101384572B1
Application number: KR1020087018871A
Authority: KR
Inventors: 마이클 피. 벨마레스; 피터 에스. 루; 케네쓰 에이. 멘도자
Original assignee: 아버 비타 코포레이션
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2014-04-24
Also published as: EP1976502B1; CA2641421A1; EP1976502A1; AU2006332535A1; ATE518535T1; WO2007079406A1; CA2641421C; KR20080106404A; AU2006332535B2; RU2008131330A

Abstract

본 발명은 동족 리간드(cognate ligand)와의 PDZ 도메인 상호작용을 조절하는 데에 사용되는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다양한 폴리펩티드로부터 PDZ 도메인 상호작용을 평가하고 특성화하는 방법을 제공한다.

Description

ＰＤＺ 상호작용의 소형 분자 억제제 {SMALL MOLECULE INHIBITORS OF PDZ INTERACTIONS}

본 발명은 2005년 12월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 60/755,315 및 2006년 6월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 11/426,282를 우선권으로 주장하는데, 상기 미국 특허 출원 번호 11/426,282는 2005년 6월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 60/693,988을 우선권으로 주장하며, 상기 언급된 출원 각각은 그 전체내용이 참조로 포함된다.

본 발명은 분자화학적 약리학, 단백질 생화학, 세포 생물학 및 병리학에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 PDZ 도메인 결합의 소형 분자 억제제의 확인 및 이러한 억제제의 진단학적 및 치료학적 용도에 관한 것이다.

PDZ 도메인은 혈장막에서 단백질 복합체의 조직화(organization)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 분극된 상피 세포는 이의 정단(apical) 및 기저-측부(basal-lateral) 표면에서 뿐만 아니라 막 연접부(membrance junction)에서의 독특한 단백질 함량을 특징으로 한다. 막 연접부의 정단 및 기저 도메인 각각은 구별되는 막투과성 성분, 막 결합성 성분 및 세포질성 성분과의 단백질 복합체를 포함하는 특정 조성을 지닌다. 이러한 단백질 복합체는 특정 세포의 부착 특성, 세포주위 장 벽(paracellular barrier)의 형성, 이온 수송 및 인접 세포 간의 신호 (성장, 분화 및 항상성)의 전송을 포함하는 광범위하게 다양한 기능을 매개한다.

이러한 세포 거대분자 단백질 복합체 및 그 밖의 세포 거대분자 단백질 복합체의 형성은 대부분 모듈(modular) 단백질 결합 도메인의 상호작용에 의해 결정된다. 이러한 도메인은 여러가지 상이한 단백질내에서 발견될 수 있는 독특한 분자 특이성을 지닌 구조적으로 보존된 상호작용 요소이다. 이러한 도메인의 예로는 기본 Pro-X-X-Pro 부위 주변의 아미노산 변이를 인식하는 SH3 도메인; 포스포티로신 및 연속된 잔기를 인식하는 SH2 및 PTB 도메인; 및 PDZ 도메인이 있다. 결합 특이성이 수 개의 아미노산 잔기를 기초로 하기 때문에, 이러한 도메인은 도메인 및 표적 펩티드 서열에서 코디네이트 돌연변이(coordinate mutation)에 의한 신규한 단백질 상호작용의 전개를 가능하게 하기에 특히 적합하다. 이러한 도메인은 비유적으로 말하자면 단백질 복합체를 함께 결합시키는 접착제이고, 이의 독특한 특이성 및 조절된 결합은 세포내의 다양한 작용성 복합체의 구별되는 조성을 결정해준다.

PDZ 단백질과 이의 단백질 리간드 (PL) 결합 파트너의 상호작용을 중단시키는 효과는 암, 염증 및 신경학적 장애에 대한 치료제를 개발하기 위한 잠재성을 제공한다. PDZ-리간드 상호작용에 대한 효과에 대해 화합물을 스크리닝하고 분류하는 능력은 가치있는 수단이다.

발명의 개요

본 발명은 구조식 P₀-A-B-C-D-E를 지닌 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 D 및 E는 임의적이고, 이러한 화합물의 구조는 하기 기재되어 있다. P₀는 다음과 같다:

상기 식에서, R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵ 중 하나는 -COOH이고, R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵ 중 나머지는 F, H, OCH₃ 및 CH₃로 구성된 군으로부터 선택되고; X는 A-B-C-D-E이고, 여기서 A, B, C, D 및 E는 단일 결합을 통해 연결되어 있으며,

A는 C=O, NH, SO₂ 및 (CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 m = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

B는, -OCH₂- , C=O,

(상기 식에서, R⁶내지 R¹⁰중 하나는 -C-D-E 에 결합되고, R⁶내지 R¹⁰ 중 나머지는 H, OH, F, Cl, Br, I, CH_3,CH₂CH₃ 및 OCH₃로 구성된 군으로부터 선택되고, n = 0 또는 1임); 또는

포화 또는 불포화 시클로알킬 또는 헤테로사이클로 구성된 군으로부터 선택된 고리 시스템; 또는

(상기 식에서, o 및 p = 0 또는 1이고, q = 0, 1, 2, 3 또는 4이고, R¹¹은 치환되거나 비치환된 저급 알킬, 아미드, 티오에테르, 페닐, 페놀, 인돌, 이미다졸, NH(NH₂)(N(+)H₂), COOH, SH, OH 또는 H로 구성된 군으로부터 선택됨)이고;

C는 -O-, C=O, NH, CONH, S, 프탈아미드, CH₃, H, SO₂ 및 (CH₂)_r로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 r = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

D는 임의적이며, C로 종결되지 않는 경우 D는 -CN-, C=O, NH, S, O, SO₂, (CH₂)_s및 (CH₂)_t-OH, 및 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되는데, 여기서 s = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, t = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고:

;

E는 임의적이며, D로 종결되지 않는 경우 E는 저급 알킬, 저급 알콕시, 케톤, OH, COOH, 니트로소, N-치환된 인돌린 또는 세포막 전위 펩티드(cell membrance translocation peptide)로 치환되거나 비치환된, 시클로헥실 또는 페닐; 또는 -(CH₂)_u-(CHR¹²R¹³) (여기서, u = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이고, R¹² 및 R¹³은 H, OH, 시클로헥산, 시클로펜탄, 페닐, 치환된 페닐, 시클로펜타디엔으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨); 또는 이소프로필, 이소부틸, 1-이소프로필-2-메틸-부틸, 1-에틸-프로필을 포함하는 분지된 저급 알킬; 또는 -NH-COR¹⁴ (여기서, R¹⁴는 (CR¹⁵R¹⁶)_vH이며, 여기서 v = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이고, R¹⁵ 및 R¹⁶은 H, 시클로헥산, 페닐 및 세포막 전위 펩티드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)이다.

대안적으로, P₀는 다음과 같다:

상기 식에서, t = 0, 1 또는 2이고, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 또는 R⁶ 중 어느 하나는 COOH이고, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 중 나머지는 H, CH₃, F 및 OCH₃로 구성된 군으로부터 선택되고, X는 -A-B-C-D-E이며, 여기서 A, B, C, D 및 E는 단일 결합을 통해 연결되어 있고,

A는 C=O, SO₂, NH 및 (CH₂)_m으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 m = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

B는, -OCH₂- , C=O,

(상기 식에서, R⁵내지 R⁹중 하나는 -C-D-E 에 결합되고, R⁶내지 R¹⁰ 중 나머지는 H, OH, F, Cl, Br, I, CH_3,CH₂CH₃ 및 OCH₃로 구성된 군으로부터 선택되고, n = 0 또는 1임); 또는

(상기 식에서, o 및 p = 0 또는 1이고, R¹⁰은 치환되거나 비치환된 저급 알킬, 아미드, 티오에테르, 페닐, 페놀, 인돌, 이미다졸, NH(NH₂)(N(+)H₂), COOH, SH, OH 또는 H로 구성된 군으로부터 선택됨)이고;

C는 C=O, NH, S, 프탈아미드, -O-, CH₃, H, SO₂ 및 (CH₂)_r로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 r = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

D는 임의적이며, C로 종결되지 않는 경우 D는 C=O, -CN-, NH, S, O, SO₂, (CH₂)_s 및 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되는데, 여기서 s = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고:

;

E는 저급 알킬, 저급 알콕시, 케톤, OH, COOH, 니트로소, N-치환된 인돌린으로 치환되거나 비치환된, 페닐 또는 시클로헥실; 또는 -(CHR¹¹R¹²)_u (여기서, u = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이고, R¹¹ 및 R¹²은 H, OH, 시클로헥산, 시클로펜탄, 페닐, 치환된 페닐, 시클로펜타디엔으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨); 또는 이소프로필, 이소부틸, 1-이소프로필-2-메틸-부틸, 1-에틸-프로필을 포함하는 분지된 저급 알킬; 또는 -NH-COR¹¹ (여기서, R¹¹은 (CHR¹²R¹³)_s이며, 여기서 s = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이고, R¹² 및 R¹³은 H, 시클로헥산, 페닐 및 세포막 전위 펩티드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 하기 구조식을 지닐 수 있다:

본 발명의 화합물의 비제한적 용도로는 암, 통증(예를 들어, 만성 또는 급성), 염증 또는 퇴행성 질환 (이로부터 유래되는 임상적 휴우증을 포함함)이 포함된다. 본 발명의 화합물은 부적절한 신경보호 효과에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 통증 및/또는 염증(예를 들어, 관절염, 망막증, SLE, 건선, 수포성 유사천포창, 대상포진 또는 이와 유사한 질병)을 앓고 있는 환자, 미 세혈관 기능장애, 저산소증, 뇌졸중, 죽상경화증의 위험이 있거나 진행중인 환자 및 약하거나 심각한 뇌 외상(미만성 축색 손상, 저산소성 허혈성 뇌병증, 및 두부 손상의 다른 형태를 포함함)이 있는 또 다른 급성 또는 만성 심혈관 및 신경성 허혈 질환 환자, 허혈성 경색, 색전증 및 출혈(예를 들어, 저혈압 출혈)을 앓고 있는 환자, 알츠하이머병, 루이소체 치매, 파킨슨병(PD), 헌팅톤병(HD), 다발성 경화증, 운동신경 질환, 근이영양증, 말초신경병증을 포함하는 신경퇴행질환, 글리코겐 저장 질환을 포함하는 신경계의 대사 이상, 및 뉴우런이 손상되거나 파괴된 그 밖의 질환이 있는 환자, 비정상 면역 활성화, 예컨대, 자가 면역 류마티스 관절염, 수포성 유사천포창, 타입 I 당뇨병 등이 있는 환자에게 투여될 수 있으며, 그 밖의 질병으로는 불충분한 면역 기능에 의해 특징되는 것들이 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 그 밖의 질병에는, 정신의학적 장애, 예컨대, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 우울증, 광장공포증, 거식증, 식욕부진, 양극성 장애, 불안 장애, 자폐증, 치매, 해리장애, 침울증, 충동 조절 장애, 도벽증, 기분 장애, 다중 인격 장애, 만성 피로 증후군, 불면증, 기면발작, 정신분열증, 약물 남용, 외상후 스트레스 장애, 강박반응성 장애, 조울증이 포함된다. 본 발명의 환합물은 또한 중독/중독 회복과 관련된 결과를 개선시키는 데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 아드레날린 수용체 상호작용을, 예컨대 이러한 상호작용을 중단시킴으로써 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 세포 증식을 감소(예를 들어, 억제)시키는 데 사용될 수도 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 유효량의 약제 조성물을 이를 필요로 하는 대상 에게 투여하는 것을 포함하여 통증을 치료하거나 감소시키는 방법으로서, 약제 조성물이 본 발명의 임의의 화합물을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 약제 조성물은 추가로 하기와 같이 정의된다:

특정 구체예에서, 본 발명은 유효량의 약제 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하여 뇌졸중과 관련된 증상을 치료하는 방법으로서, 약제 조성물이 본 발명의 임의의 화합물을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 약제 조성물은 추가로 하기와 같이 정의된다:

본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 이행될 수 있는 것으로 간주된다.

청구의 범위 및/또는 명세서 내 용어 "포함하는"과 연관지어 사용되는 단수 표현은 하나를 의미할 수 있으나, 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 그 초과"를 의미할 수도 있다.

본 발명의 이러한 구체예 및 그 밖의 구체예는 하기 상세한 설명 및 첨부되 는 도면과 함께 고려될 경우에 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 하기 상세한 설명이 본 발명의 여러 구체예 및 이에 대한 많은 구체적인 사항을 나타내나, 이로 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 사상에서 출발하지 않고, 본 발명의 범위내에서 다수의 대체, 변경, 부가 및/또는 재배치가 이루어질 수 있으며, 본 발명은 이러한 모든 대체, 변경, 부가 및/또는 재배치를 포함한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구체예의 구체적인 설명과 함께 이러한 하나 이상의 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.

도 1 - PDZ/PL 상호작용에 대한 억제제를 확인하기 위한 경합 결합 검정. 괄호안의 수치는 PDZ/PL 상호작용 및 하기와 같은 경합 검정에 사용된 테스트 화합물을 나타낸다:

(1) 대조군: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil dl;

(2) 테스트: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil dl + 화합물 8009-5039;

(3) 대조군: PL 펩티드 AA56 (QISPGGLEPPSEKHFRETEV) + PDZ 단백질 Tip 1;

(4) 테스트: PL 펩티드 AA56 (QISPGGLEPPSEKHFRETEV) + PDZ 단백질 Tip 1 + 화합물 3289-2331;

(5) 대조군: PL 펩티드 1965 (YGRKKRRQRRRYIPEAQTRL) + Shank 1;

(6) 테스트: PL 펩티드 1965 (YGRKKRRQRRRYIPEAQTRL) + Shank 1 + 경합물질 0620-005;

(7) 대조군: PL 펩티드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95-d3;

(8) 테스트: PL 펩티드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95-d3 + 화합물 C450-0454;

(9) 대조군: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil-dl;

(10) 테스트: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil-dl + 화합물 3019-0348;

(11) 대조군: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil-dl;

(12) 테스트: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil dl + 화합물 3558-0042;

(13) 대조군: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil-dl;

(14) 테스트: PL 펩티드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 Magil-dl + 화합물 MC 247808;

(15) 대조군: PL 펩티드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95-d3; 및

(16) 테스트: PL 펩티드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95 d3 + 화합물 E544-0129.

예를 들어, 표 1의 8개의 화합물(하기 실시예 3)은 소분자 스크린에서 확인되었다: 1) 8009-5039; 2) 3289-2331; 3) 0620-0057; 4) C450-0454; 5) 3019-0348; 6) 3558-0042; 7) MC 247808; 및 8) E544-0129.

도 2a - 도 1 및 도 2b의 소분자 경합물질의 화학 구조식.

도 2b - 겉보기 IC₅₀ 값이 250μM 미만인 소분자 경합물질의 적정 분석.

(1) 화합물 #3289-2331에 대한 적정;

(2) 화합물 # 0620-0057에 대한 적정;

(3) 화합물 #C450-0454에 대한 적정;

(4) 화합물 #3558-0042에 대한 적정;

(5) 화합물 # MC 247808에 대한 적정; 및

(6) 화합물 # E544-0129에 대한 적정.

도 3a - 소분자-펩티드의 키메라 컨쥬게이트: 소분자 억제제에 연결된 막 전위(translocation) 도메인 펩티드.

도 3b - 소분자-펩티드의 키메라 컨쥬게이트: 소분자 억제제에 연결된 막 전위(translocation) 도메인 펩티드

도 4 - PSD-95 수준이 화합물 0620-0057의 존재 하에 감소됨.

I. 본 발명

본 발명자들은 4개의 상이한 PDZ 도메인 모방체로 650,000 분자 라이브러리(ChemDiv, San Diego, CA; Blanca Pharmaceuticals, Mountain View, CA)를 모델링하고 도킹하기 위해 아쎌리스 소프트웨어(Accelrys software) (Accelrys, San Diego, CA)로 인실리코(in silico) 스크리닝을 사용하였다. 인실리코 스크리닝으로부터 최상의 히트(hit)를 매트릭스/어레이 경합 검정 포맷, 즉, 융합 단백질내 고체상 PDZ 도메인으로의 리간드 도킹이 소분자 경합물질의 존재 및 부재 하에서 평가되는 검정으로 스크리닝 처리하였다. 이후, 이러한 후자의 검정에서 최상의 히트를 적정 결합 시험, 즉, 동일한 경합 검정에서 소분자를 적정하여 IC₅₀ 값을 추정하는 시험으로 처리하였다. PDZ 단백질과의 결합 상호작용에 관련된 공통되는 작용기를 확인하기 위해 설계된 모델링 시험으로 250μM 이하의 IC₅₀ 값을 갖는 히트를 추가로 조사하였다.

본원에 기술된 화합물은 여러 맥락에서 유용하다. 첫째, 본 발명자들은 사람 게놈에 의해 암호화된 단백질의 90% 초과의 PDZ 도메인을 구성하는 PDZ 도메인 단백질을 이미 255개보다 많이 확인하고 클로닝하였으며, 신규의 PDZ 단백질은 일정하게 발견되고 있다. 대부분의 경우에, 이러한 PDZ 도메인은 공지의 기능을 갖지 않는다. 따라서, 소분자 억제제는 표준 약제 기술을 사용하여 세포내 및 생체내 이러한 단백질의 역할을 조사하는 데 특히 유용하다. 또한, 기지의 PDZ 단백질에 대한 정확한 역할이 계속해서 출현함에 따라, 상이한 억제제 패널을 사용함으로써, 어떤 것이 단일 PDZ 단백질, 심지어 PDZ 패밀리에 대해 다수의 역할이 있는 지를 조사할 수 있다. 또한, 매우 특이적인 PDZ 상호작용을 갖는 "커스톰(custom)" 억제제를 보다 정확하게 설계할 수 있도록, 본원에 기술된 억제제를 사용하여 각각 상이한 PDZ 및 PDZ 패밀리의 결합 요건을 보다 명백하게 규정하는 것이 가능하다. 끝으로, 질병 상태와 관련된 생체내 PDZ 관련 과정을 방해하기 위한, 즉, 질병의 치료를 위한 개시된 억제제를 사용하는 것이 가능하다.

보다 구체적으로, PDZ 패밀리의 구성원인 PSD-95의 하향 조절은 다수의 질병 및 질환에 대해 중요한 치료 효과이다. 이러한 약물에 대한 용도 분야를 제한하지 않을 경우, 연구에 따르면, PSD-95 수준의 감소는 세포 및 뇌졸중 동물 모델에서 신경 보호적이라는 것이 입증되었다[참조: Sattler, 1999; Aarts, 2002, 각각의 문헌은 본원에서 참조로 인용됨]. 안티센스 모델 또는 녹아웃 실험에 의한 PSD-95의 감소는 다수의 동물 모델에서 통증을 감소시킨다는 것을 입증하였다[참조: Tao et al., 2003; Garry, 2003, 각각의 문헌은 본원에서 참조로 인용됨]. 또한, 중독에 대한 개선된 결과와 상호관련되는 것으로 나타났다[참조: Roche, 2004; Yao, 2004, 각각의 문헌은 본원에서 참조로 인용됨]. 또한, PSD-95는 아드레날린 수용체 상호작용의 차단을 통해 알츠하이머병 및 심혈관 질병에 대해 표적화될 수 있다.

II. 정의

다르게 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자들에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 문헌은 당업자들에게 본 발명에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 정의를 제공하고 있다[참조: Singleton et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)]. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질이 기술된 것이다. 하기 정의는 독자가 본 발명을 실시하는 데 도움을 주기 위해 제공되는 것이다.

본원에 사용된 용어 "조절"은, 생물활성 (예를 들어, 결합 활성)을 검정함으로써 측정된 PDZ/PL 상호작용을, 예를 들어 작용화 (agonizing)시킴에 의한 상향조절 (즉, 활성화 또는 자극), 및 예를 들어 길항작용화 (antagonizing)시킴에 의한 하향 조절 (즉, 저지 또는 억제) 모두를 지칭한다. 억제제 또는 작용제는 결합의 부분적이거나 완전한 조절을 야기할 수 있다.

"PDZ/PL 경쟁적 억제제"와 번갈아가면서 사용된 "PDZ/PL 억제제"는, 일반적으로 당해 화합물이, 시험 화합물을 포함하지 않는 대조와 비교하여, PDZ 도메인 단백질과 PDZ 리간드 사이의 결합을 적어도 20%, 예를 들어 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 최대 약 99% 또는 100%까지 감소시킴을 의미하도록 의도된다. 일반적으로, 주목되는 제제는 특정 검정에서 약 1 mM 또는 그 미만의 범위내 IC₅₀ 값을 나타내는 것들이다. 더욱 낮은 IC₅₀을 나타내는 화합물들은 약 250 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 5 μM, 2 μM, 1 μM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 또는 그보다 낮은 범위의 값을 가지며, 이러한 특성을 갖는 화합물이 현재 바람직하다.

본원에 사용된 용어 "중추 신경계에 대한 급성 손상"에는 글루타메이트 흥분독성에 의해 매개된 신경 손상의 실질적인 위협을 제기하는 단기 사건, 및 예를 들어 염증에 의해 매개된 발작 유도된 허혈 손상의 장기 증폭이 포함된다. 허혈 사건은 또한 부적합한 혈류, 예컨대 발작 또는 심장 정지, 저산소 사건 (부적절한 산소 공급, 예컨대 익사, 질식 또는 일산화탄소 중독을 포함하는), 뇌 또는 척수에 대한 외상 (기계적 또는 유사 손상 형태의), 흥분독성 독, 예컨대 도모이산 (domoic acid)을 포함하는 특정 유형의 식중독, 및 특정 유형의 중증 간질성 발작을 포함하는 발작 매개된 신경 퇴행을 포함할 수 있다. 이는 또한 신체의 다른 부분에 대해 일어나는 외상을 포함할 수 있는데, 단 이 경우 상기 외상은 뇌로의 혈류를 위태롭게 하기에 충분한 혈액 손실 (예를 들어, 총상, 관통상 또는 자동차 사고 후에 일어날 수 있음)을 야기해야 한다.

"심혈관 허혈"은, 예를 들어 저산소증, 예를 들어 심장 마비, 질식, 일산화탄소 중독, 외상, 폐 기능장애 등으로부터 야기되는 세포사; 예를 들어 폐색, 죽상경화증, 당뇨병 미세혈관 기능부족 등으로부터 야기되는 감소된 혈류; 산화질소 조절이상; 내피 또는 혈관 평활근의 기능이상; 등을 나타내는 순환계에서의 만성 및 급성 손상을 의미하도록 의도된다.

용어 "유사체"는 본원에서, 기준 분자의 특정 치환기를 대안적인 치환기로 대체함으로써, 표적화되고 조절된 방식으로 개질되었으나 주목되는 분자와 구조적으로 유사한 소 분자를 지칭하도록 사용된다. 출발 분자와 비교하여, 유사체는 PDZ/PL 상호작용의 조절에 있어서 동일하거나, 유사하거나, 개선된 유용성을 나타낼 수 있다. 개선된 특성 (예컨대 더욱 높은 결합 친화도, 또는 표적으로의 더욱 높은 결합 선택성, 및 비-표적 분자에 대한 더욱 낮은 활성 수준)을 갖는 공지된 화합물의 변이체를 확인하기 위한 유사체의 합성 및 스크리닝은 약제 화학에서 널리 공지된 방법이다.

본원에 사용된 "접촉"은 일반적인 의미를 지니며, 예를 들어 둘 이상의 성분 (예를 들어, 2개의 단백질, 단백질 및 소분자, 등)을 조합시킴으로써 둘 이상의 성분을 접촉시키는 것을 의미한다. 접촉은 시험관내, 동일 반응계 내 또는 생체 내에서 일어날 수 있다.

대부분의 구체예에서, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 번갈아가면서 사용된다. 상기 용어 "폴리펩타이드"는, 통상적인 주쇄가 비-천연적으로 발생하거나 합성된 주쇄로 대체된 폴리펩타이드, 및 통상적인 아미노산의 하나 이상이 하나 이상의 비-천연적으로 발생하거나 합성된 아미노산으로 대체된 펩타이드를 포함한다.

용어 "융합 단백질" 또는 이의 문법적 등가물은, 사실상 동일한 형태 또는 순도로 나타나지 않거나 이들의 천연 상태에서 그렇게 부착되지 않은 단백질로부터의 복수개의 폴리펩타이드 성분으로 구성된 비-천연 단백질, 예를 들어 펩타이드 결합을 통해 이들의 각각의 아미노 및 카르복시 말단에 의해 결합되어 단일의 연속적인 폴리펩타이드를 형성하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 단백질은 둘, 셋, 또는 심지어 넷 이상의 상이한 단백질의 조합물일 수 있다. 융합 단백질은 하기한 것들을 지닌 폴리펩타이드를 포함하나 이로 제한되지 않는다: 이종의 아미노산 서열, N-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는 이종 및 동종 리더 서열의 융합체; 면역학적으로 태그된 단백질; 및 단일의 생성되는 융합 파트너, 예를 들어 형광 단백질, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제 등을 포함하는 융합 단백질.

"펩타이드"는 일반적으로 2개 초과의 아미노산, 4개 초과의 아미노산, 약 10개 초과의 아미노산, 약 20개 초과의 아미노산, 대개 약 50개 이하의 아미노산으로 구성된다. 몇몇의 구체예에서, 펩타이드는 길이가 5 내지 30개의 아미노산으로 구성된다.

용어 "포획제 (capture agent)"는 이 제제를 결합시키고 다양한 분석물의 동종 혼합물로부터 분석물을 농축시키기에 충분한 상호작용을 통해 분석물을 결합시키는 제제를 의미한다. 결합 상호작용은 포획제의 친화도 영역에 의해 매개될 수 있다. 대표적인 포획제에는 PDZ 폴리펩타이드; 항체 및 수용체 폴리펩타이드; 및 앱타머 (aptamer) 폴리누클레오타이드 등이 포함되며, 예를 들어 항체, 펩타이드, 또는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 단편이 사용될 수 있다.

용어 "특이적인 결합"은 다양한 화합물의 혼합물에서 특정 리간드 화합물에 우선적으로 결합하는 제제의 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 특이적인 결합 상호작용은 샘플에서 요망되거나 요망되지 않는 리간드 사이를 구분하며, 몇몇 구체예에서는 당해 구별 활성이 약 10배 초과 내지 100배 또는 그 초과이다 (예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배 초과). 특정 구체예에서, 결합 파트너와 리간드 화합물 사이의 친화도는 이들이 포획제/분석물 복합체에서 특이적으로 결합되는 경우에 10^-6M 미만, 10^-7M 미만, 10^-8M 미만, 10^-9M 미만, 대개는 약 10^-10M 미만의 K_D (해리 상수)에 의해 특징된다. 본원에 사용된 "결합 파트너" 및 등가물은 제제/리간드 복합체에서 확인될 수 있는, 즉 서로 특이적 결합을 나타내는 분자 쌍을 의미한다.

표현 "표면-결합된 포획제"는 고체 기질의 표면 상에 고정되는 제제를 의미하는데, 여기서 기질은 다양한 구성, 예를 들어 시트, 비드, 스틱, 또는 웰 (well)이 형성된 플레이트와 같은 다른 구조를 지닐 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 사용된 포획제의 수거는, 예를 들어 어레이 형태의 동일한 지지체의 표면 상에서 일어난다.

"분리된" 또는 "정제된"은 일반적으로 사실상 존재하지 않는 제제의 화학적 형태, 예를 들어 물질 (소분자 화합물, 폴리누클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드)이 이것이 존재하는 당해 샘플에서 상당한 백분율 (예를 들어, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 또는 그 이상을 초과하는)로 포함되는 샘플 제조물을 의미한다. 주목되는 폴리누클레오타이드 및 폴리펩타이드를 정제하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 여기에는 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강법이 포함된다. 일반적으로, 물질은, 이것이, 사실상 확인되지 않는 샘플의 다른 성분에 대해 상대적인 양으로 샘플 중에 존재하는 경우에 정제된다.

용어 "평가하는"에는 임의 형태의 평가가 포함되며, 여기에는 구성요소가 존재하거나 존재하지 않지 않는 경우에 측정하는 것이 포함된다. 용어 "결정하는," "측정하는," "가치를 측정하는," "평가하는" 및 "검정하는"은 번갈아가면서 사용되며, 여기에는 정량적 및/또는 정성적 측정이 포함될 수 있다. 평가는 상대적이거나 절대적일 수 있다. "결합을 평가하는"에는 예를 들어, 결합의 양, 결합 친화도에 대해 K_D를 측정하는 것 및/또는 결합이 일어났는지를 (즉, 결합이 존재하거나 존재하지 않는지를) 측정하는 것이 포함된다.

용어 "치료, "치료하는", "치료하다" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방한다는 측면에서는 예방적일 수 있고/있거나, 질병에 대한 부분적이거나 완전한 치유 및/또는 질병으로부터 기인하는 부작용의 측면에서는 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 사람에서의 질병의 임의 치료를 포함하며, 여기에는 하기 의미가 포함된다: (a) 질병에 걸리기 쉬울 수 있으나 아직 이 질병을 가진 것으로 진단되지는 않은 피검체에서 질병의 발병을 예방하는 것; (b) 질병의 억제, 즉 이의 발달을 억제하는 것; 및 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병을 퇴행시키고/시키거나 하나 이상의 질병의 증상을 완화시키는 것. "치료"는 또한 심지어 질병 또는 병태가 부재하는 경우에도 약리학적 효과를 제공하기 위해 제제를 전달하는 것을 포함하도록 의도된다.

"피검체", "개체", "숙주" 및 "환자"는 본원에서 번갈아가면서 사용되며, 이는 본 발명의 방법에 따라 치료가 실시되는 동물, 사람 또는 비-사람을 의미한다. 일반적으로, 피검체는 포유동물 피검체이다. 피검체의 예에는 사람, 사육 및 비-사육 동물, 예를 들어 비-사람 영장류, 마우스, 랫트, 소, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이 및 말이 포함되나 반드시 이들로 제한되는 것은 아니며, 이 중 사람이 특히 주목된다.

본원에 참조된 다양한 생화학 및 분자 생물학적 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이들은 예를 들어 Sambrook et al. (1989) 및 Ausubel et al. (1987-1999)에 기재되어 있다.

"알킬" 기는 직쇄, 분지쇄 및 고리형 알킬기를 포함하는 포화된 지방족 탄화수소를 의미한다. 알킬 기는 비고리형 및 고리형 서브단위의 임의 조합물을 포함할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 용어 "알킬"은 포화된 기 뿐만 아니라 불포화된 기도 명백하게 포함한다. 포화된 기는 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)의 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 함유한다. 용어 "알킬"은 치환되거나 치환되지 않은 알킬 기를 포함한다. "저급 알킬"은 1 내지 7개의 탄소를 갖는 것으로 정의된다. 바람직하게는, 알킬 기는 1 내지 18개의 탄소를 지니며, 직쇄형이거나 분지형일 수 있다.

"알케닐" 기는 직쇄, 분지쇄 및 고리형 기를 포함하는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 불포화된 탄화수소 기를 의미한다. 바람직하게는, 알케닐 기는 1 내지 18개의 탄소를 갖는다. 알케닐 기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.

"알키닐" 기는 직쇄, 분지쇄 및 고리형 기를 포함하는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 불포화된 탄화수소 기를 의미한다. 바람직하게는, 알키닐 기는 1 내지 18개의 탄소를 갖는다. 알키닐 기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.

"알콕시" 기는 "-O-알킬" 기를 의미하는데, 여기서 "알킬"은 상기에서 정의된 바와 같다.

III. PDZ 단백질

PDZ 단백질은 발견된 부류에서 첫 3개 단백질의 첫글자 (PSD-95, DLG 및 ZO-1)를 따서 명명한 것이다. 이들 단백질은 예를 들어, 막 단백질; 세포골격 단백질; 키나아제와 같은 시그널링 효소; 나트륨, 칼륨 및 칼슘 채널과 같은 이온 채널 단백질; 및 다른 단백질의 복합체를 포함하는 거대분자 단백질 복합체의 어셈블리를 개시하고 조절한다. PDZ 단백질은 본원에서 "PDZ 그루브"로서 지칭되기도 하는 5-6 β-가닥 및 2개의 α-나선의 β-샌드위치를 지닌 소수성 틈새 구조 내로 폴딩되는 약 80 내지 90개의 잔기를 함유하는 PDZ 도메인에 의해 특징된다. 천연 PDZ 리간드는 β-가닥 (βB), α-나선, 및 펩타이드 카르복실레이트 기를 결합시키는 루프로 구성된 마지막의 소수성 틈새 내로 결합되는 펩타이드이다. 천연 펩타이드는 일반적으로 βB 가닥에 대해 평행하지 않은 방식으로 PDZ 그루브로 결합하며, 이 경우 C 말단 잔기가 소수성 포켓을 점유한다. PDZ 이종이합체는 파트너 단백질의 어느 하나 상에 내부 인지를 포함하는 선형의 헤드-투-테일 (head-to-tail) 배열을 형성한다. PDZ 도메인은 예를 들어, Pfam에서 생체기술 정보에 대한 국립 센터 (the National Center for Biotechnology Information; 월드 와이드 웹 주소: ncbi.gov) 참조)에 의해 패밀리로 인식되고 있다.

PDZ 도메인은 종종 단백질의 C-말단 4 내지 9개의 잔기를 포함하는 PDZ 리간드 (PL) 아미노산 서열에 결합한다. 이들 PL에서 일치되는 결합 서열은 공통적으로 C-말단에서 소수성 잔기, 일반적으로 Val 또는 Ile를 함유한다. 패닝 앤드 앤더슨 (Fanning & Anderson) (1999)은 PL에서 위치를 계수하는 시스템, 즉 C-말단에서 0 위치로 출발하여 (즉, P(0)) N-말단으로 갈수록 음의 수가 증가하면서 진행되는 시스템을 만들었다. 이 경우, 예를 들어, 예시적 펩타이드의 잔기는 P(0)-Val, P(-1)-Xaa, P(-2)-Ser, 또는 Thr, P(-3)-Xaa이다. 마지막의 "X(S/T)XV" 서열은 클래스 I PL 모티프로 지칭된다. -2 및 -3 위치에서의 잔기가 특이성을 결정하는데 있어 중요하다. PDZ 도메인을 갖는 단백질의 대표적인 예가 본원에 참고로 포함된, 특정 발명자들에 의해 출원된 선행하는 특허 출원서에 기재되어 있으며, 여기에는 본원의 억제제에 대한 추정되는 표적이 포함된다:

IV. PDZ 리간드 및 결합 검정

A. 리간드

예시적인 PDZ 리간드 및 결합 검정이, 예를 들어 하기 특허 출원 및 특허 문헌에서 특정 발명자에 의해 이전에 개시되었으며, 이들 특허 출원 및 특허 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함되었다: PCT/US01/32202 (2001년 10월 15일 출원); PCT/US01/44138 (2001년 11월 9일 출원); PCT/US02/24655 (2002년 8월 2일 출원); PCT/US03/28508 (2003년 9월 9일 출원); PCT/US04/011195 (2004년 4월 12일 출원); 및 미국 특허 제 6,942,981 (2005년 10월 13일 등록).

B. 검정

PDZ 폴리펩타이드의 결합은 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 검정할 수 있다. 예를 들어, 결합은 생화학적으로 검정될 수 있거나, 다른 구체예에서는, 2개의 단백질이 이들 단백질이 함께 결합되는 경우에만 생성되는 신호를 검출함으로써 검정될 수 있다. 후보물질의 시험 시에, 2개의 단백질 사이의 결합을 평가하기 위해 상기한 신호가 평가될 수 있다. 예를 들어, 당해 검정에 사용된 폴리펩타이드는, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 시스템, 생체발광 공명 에너지 전달 (BRET) 시스템, 또는 검정될 수 있는 비색 신호 생성 시스템을 형성할 수 있다. 여기서의 검정은 PDZ 도메인 및 PDZ 리간드를 함유하는 폴리펩타이드를 포함하였다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드 중 하나 이상은 폴리펩타이드 사이에서의 결합의 검출을 촉진시키는 융합 단백질일 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 중 어느 하나는, 예를 들어 친화도 태그 도메인 또는 광학적으로 검출가능한 리포터 도메인을 함유할 수 있다.

적합한 친화도 태그는 다른 분자, 대개는 다른 폴리펩타이드, 가장 일반적으로는 항체에 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 친화도 태그는 에피토프 태그, 예를 들어 V5 태그, FLAG 태그, HA 태그 (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스로부터의), myc 태그 등을 포함한다. 적합한 친화도 태그는 또한, 결합 기질이 알려져 있는 도메인, 예를 들어 HIS, GST 및 MBP 태그 등, 및 특정 결합 파트너, 예를 들어 항체, 특히 단클론 항체가 이용가능한 다른 단백질로부터의 도메인을 포함한다. 적합한 친화도 태그는 또한 임의의 단백질-단백질 상호작용 도메인, 예컨대 IgG Fc 영역을 포함하는데, 상기 도메인은 적합한 결합 파트너, 예를 들어 IgG Fc 수용체를 이용하여 특이적으로 결합되어 검출될 수 있다.

적합한 리포터 도메인은 예를 들어 빛을 방출시키거나 색을 생성함으로써 폴리펩타이드의 존재를 광학적으로 기록할 수 있는 임의의 도메인을 포함한다. 적합한 발광 리포터 도메인에는 루시퍼라아제 (예를 들어, 개똥벌레, 바르굴라 (Vargula), 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 또는 레닐라 뮤엘레리 (Renilla muelleri)로부터의), 또는 이의 발광성 변이체가 포함된다. 다른 적합한 리포터 도메인에는 형광 단백질 (예를 들어, 해파리, 산호, 및 다른 강장동물, 예컨대 아에쿠오리아 (Aequoria), 레닐라 (Renilla), 프틸로스아르쿠스 (Ptilosarcus), 스틸라툴라 (Stylatula) 종으로부터의 그러한 것), 또는 이의 발광성 변이체가 포함된다. 이들 리포터 단백질의 발광성 변이체는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이들은 천연 리포터 단백질과 비교하여 더욱 밝은 이합체일 수 있거나 다양한 여기 및/또는 방출 스펙트럼을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 변이체는, 당업계에 공지된 바대로, 이들이 더 이상 녹색을 나타내지 않고 청색, 청록색, 황색, 향상된 황적색 (각각 BFP, CFP, YFP eYFP 및 RFP로 지칭됨)을 나타낼 수 있거나 다른 방출 스펙트럼을 나타낼 수 있도록 변형된다. 다른 적합한 리포터 도메인은, 생화학적 또는 색채 변화를 통해 폴리펩타이드, 예컨대 β-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 및 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제의 존재를 나타낼 수 있는 도메인을 포함한다.

일부 바람직한 구체예에서, 리포터 도메인은 레닐라 루시페라제 (예를 들어, pRLCMV; Promega, cat. no. E2661)이다.

또한 당해 분야에 공지된 바와 같이, 친화성 태그 또는 리포터 도메인은 고려되는 폴리펩티드에서 임의의 위치에 존재할 수 있다. 그러나, 특정 구체예에서, 이들은 PDZ 단백질 또는 PL의 N-말단; 또는 비-C-말단; 또는 비-간섭 부분에 존재한다.

특정 구체예에서, 폴리펩티드 중 하나 또는 둘모두는 태그 또는 리포터를 함유할 수 있다. 예를 들어, FRET 또는 BRET 방법을 사용하는 경우, 폴리펩티드 둘모두는 상이한 자동형광 폴리펩티드를 이용하여 태그화될 수 있다.

특히 특별한 구체예에서, PDZ 도메인-함유 폴리펩티드는 적어도 Shank-1, Shank-2 또는 Shank-3으로부터의 PDZ 도메인을 함유하며, PDZ 도메인 각각은 COX의 PDZ 리간드에 결합한다. Shank PDZ 도메인은 "야생형" Shank 폴리펩티드의 PDZ 도메인, 또는 COX의 PDZ 리간드에 결합하기 위한 능력을 보유한 이의 변형체를 함유할 수 있다.

Shank-1 및 Shank-2 및 Shank-3 폴리펩티드 및 엔코딩 cDNA는 유전자은행 데이타베이스에 각각 GID 번호: 7025450 및 6049185로서 기탁되어 있으며, Shank-3에 대한 코딩 서열은 유전자은행 수탁번호 XM_037493 (gi: 51476100)에 의해 엔코딩된다.

다른 PDZ 도메인-함유 폴리펩티드는 적어도 Mast-205로부터의 PDZ 도메인을 함유하며, PDZ 도메인은 COX, TLR4 및 NMDA 수용체 2B의 PDZ 리간드에 결합한다. Mast205 PDZ 도메인은 "야생형" Mast-205 폴리펩티드의 PDZ 도메인, 또는 PDZ 리간드에 결합하는 능력을 보유하는 이의 변형체를 함유할 수 있다. Mast-205 폴리펩티드 및 엔코딩 cDNA는 유전자은행 데이타베이스에 수탁번호 KIAA0807로서 기탁되어 있다.

변형체 폴리펩티드는, 여러 단백질의 PDZ 도메인이 결정 및 NMR 구조 수준에서 비교적 잘 특징이 알려져 있기 때문에, 용이하게 디자인된다. 예를 들어, PDZ 도메인의 3차원 구조는 도일 (Doyle, 1996)에 기재되고 논의되었으며, 구아닐레이트 키나제-결합 단백질 (GKAP1a)의 PDZ 리간드 도메인에 결합된 Shank-1의 결정 구조가 보고되어 있다. 변형체는 일반적으로 야생형 PDZ 도메인 아미노 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 특정 구체예에서 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 다시 말해서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 바와 같이, PDZ 도메인-함유 폴리펩티드는 야생형 서열과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상, 및 특정 구체예에서 10개 이하의 아미노산 치환기를 함유할 수 있다. 치환기는 보존적일 수 있거나(즉, 하나의 아미노산을 하기 군내의 다른 아미노산으로 대체시킴: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr), 비보존적일 수 있다. Shank PDZ 도메인 결합 COX는 서열에 있어서 유사하며, 예를 들어 Shank-1 및 Shank-2 PDZ 도메인은 대략 85% 동일하며; Shank-1 및 Shank-3 PDZ 도메인은 대략 79% 동일하며; Shank-2 및 Shank-3 PDZ 도메인은 대략 80% 동일하다. 따라서, 다양한 비-천연 Shank 유도체는, 예를 들어 하나의 서여로부터의 아미노산을 다른 하나로 대체하므로써 구성될 수 있다.

특정 PDZ 도메인-함유 폴리펩티드는 본원에서 기준물로 인용되며, 예를 들어 기준물이 Shank-1, Shank-2, Shank-3 또는 Mast-205 PDZ 도메인-함유 폴리펩티드로 이루어지는 경우, 기준물은 야생형 PDZ 도메인을 함유한 폴리펩티드, 또는 PDZ 리간드 결합 활성을 보유한 이의 모든 변형체를 포함하는 것으로 의도된다.

PDZ 폴리펩티드 및 PL 펩티드는 합성적으로(즉, 기계를 사용하여), 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 조합 수단을 이용하여 제조될 수 있다. 재조합 단백질의 발현을 위한 방법 및 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Sambrook (2000), 및 Ausubel, (1999)]. 통상적으로, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 발현 벡터를 사용하여 발현된다. 발현 벡터는 통상적으로 전사 및/또는 번역 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 리보좀-결합 사이트, 및 ATG 개시 코돈)을 포함한다. 또한, 발현의 효율은 사용시 세포 시스템에 적절한 인헨서(enhancer)를 포함시키므로써 향상될 수 있다. 예를 들어, SV40 인헨서 또는 CMV 인헨서는 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA는 시험관내 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 (예를 들어, 대장균, Bacillus subtilus), 효모 (예를 들어, Saccharomyces), 곤충 (예를 들어, Spodoptera frugiperda), 또는 포유동물 세포 배양 시스템으로 도입시키고, 발현시킬 수 있는 DNA 구조물에 삽입된다. 포유동물 세포 시스템은 많은 적용에 대해 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 생산을 위해 유용한 포유동물 세포 배양 시스템의 예로는 HEK293 세포 (인간 배아 신장 주); CHO 세포 (중국 햄스터 난소); HeLa 인간 자궁경부 암종 (Helen Lane) 세포, 및 당해 분야에 공지된 다른 것을 포함한다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 조직 세포 배양물의 사용은 일반벅으로 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987) and Ausubel (1999)]에서 논의되었다. 일부 구체에에서, 포유동물 유전자로부터 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터는 예를 들어 포유동물 세포에서의 발현을 위하여 사용된다. 적합한 프로모터는 구조적이고, 세포 타입-특이적이고, 단계-특이적이고, 및/또는 변형가능하거나 조절가능(예를 들어, 글루코코르티코이드와 같은 호르몬에 의해)할 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 MLP(major late promoter), 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, 및 당해 분야에 공지된 프로모터-인헨서 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상술된 바와 같이, 대상 검정은 시험관내에서(즉, 여기서 폴리펩티드는 세포가 아닌 용액에 존재함), 또는 세포 환경에서(여기서, 폴리펩티드는 세포에 존재함) 수행될 수 있다.

i. 시험관내 검정

시험관내 검정은 당해 분야에 공지되고 예를 들어 PCT/US01/32202 (10/15/01 출원); PCT/US01/44138 (11/09/01 출원); PCT/US02/24655 (08/02/02 출원); PCT/US03/28508 (09/09/03 출원); PCT/USO4/011195 (04/12/04 출원); 및 미국특허 6,942,981 (10/13/05 등록)에서 몇몇 발명자들에 의해 이미 논의된 다양한 플래트폼을 이용하여 수행되며, 이들 모든 문헌은 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 특정 구체에에서, 이러한 방법들은 기질에 제 1 제제 (PDZ 도메인 폴리펩티드 또는 PDZ 리간드)를 공유적으로 또는 비공유적으로 연결시키고, 기질-결합 제제를 동족 결합 파트너 (PDZ 리간드 또는 도메인)와 접촉시키고, 결합된 파트너의 존재 또는 이의 양을 검출함을 포함한다. 경쟁 검정을 위하여, 이러한 방법은 시험 화합물의 존재하에 수행될 수 있다. 동족 결합 파트너가 검출가능하게 (예를 들어 광학적으로 검출가능한 융합 단백질로서) 라벨링되는 구체예에서, 결합된 파트너의 존재 또는 이의 양은 라벨을 검출하므로써 정량화된다.

"기질"은 고체, 반-고체 또는 불용성 지지체를 의미하는 것으로서 의도되며, 폴리펩티드, 펩티드 또는 소분자 화합물에 연결시키기 위해 적절한 임의의 물질로부터 구성될 수 있다. 유용한 기질은 결합된 파트너의 검출을 방해하지 않는다. 당업자에게 인식되는 바와 같이, 가능한 기질의 수는 크다. 가능한 기질은 유리 및 개질되거나 작용화된 유리, 플라스틱 (아크릴, 폴리스티렌, 및 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 테플론 등), 다당류, 나일론 도는 니트로셀룰로즈; 수지, 실리카, 또는 실리카-계열 물질, 예를 들어 실리콘 및 개질된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 세라믹, 및 다양한 기타 폴리머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 기질은 광학적으로 검출될 수 있지만 스스로 검출할 수 있을 정도로 형광을 내거나 빛을 방출하지 못한다. 또한, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 기질은 임의의 수의 폴리머를 포함하는 물질, 예를 들어 덱스트란, 아크릴아미드, 젤라틴, 아가로즈, 생체적합성 기질, 예를 들어 소 및 다른 포유동물 혈청 알부민과 같은 단백질로 코팅될 수 있다.

기질은 임의적으로 기질에 대한 제제의 결합을 촉진시키기 위하여 제제로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 섹션에 기재된느 바와 같이, 기질은 효소-라벨링된 스트렙타비딘을 이용하여 검출가능한 바이오틴화된 펩티드로 코팅될 수 있다. 대안적으로는, PDZ 융합 단백질에 특이적인 항체는 기질에 부착되며, PDZ 단백질은 GST-PDZ 융합 단백질을 부착시키기 위하여, 항체, 예를 들어 항-GST를 통해 기질에 부착된다.

PDZ 리간드가 신호 발생 리포터에 부착되는 구체예에서, 리간드는 리포터 활성을 검출하므로써 검출될 수 있다. 리포터 활성, 예를 들어 루시페라제 및 GFP 활성을 결정하는 방법은 일반적으로 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [예를 들어, Ramsay et al., 2001]. 검정에서 결합된 PDZ 또는 PL 파트너의 검출은 또한 항체, 예를 들어 라벨링된 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 항체를 이용하여 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 [예를 들어, Ausubel et al., 1999; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1^st Ed. 1988 Cold Spring Harbor, N.Y.].

"A" 및 "G"로 칭하는 두개의 상보적 검정은 예를 들어 PCT/US01/32202 (10/15/01 출원); PCT/US01/44138 (11/09/01 출원); PCT/US02/24655 (08/02/02 출원); PCT/US03/28508 (09/09/03 출원); PCT/USO4/011195 (04/12/04 출원); 및 미국특허 6,942,981 (10/13/05 등록)에 기술된 바와 같이 PDZ-도메인 폴리펩티드와 PDZ 리간드 간의 결합의 조정을 검출하기 위해 특정 발명자들에 의해 개발되었으며, 상기 문헌들은 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 두개의 상이한 검정 각각에서, 결합은 추정 C-말단 PL 서열(즉, 후보 PL 펩티드)의 펩티드 미메틱(mimetic)과 PDZ 도메인 폴리펩티드(통상적으로 PDZ 도메인을 함유한 융합 단백질) 사이에서 검출된다. "A" 검정에서, PL 펩티드는 고정되며, 고정된 펩티드에 가용성 PDZ-도메인 폴리펩티드의 결합은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 검출된다. "G" 검정에서, PDZ-도메인 폴리펩티드는 고정되며, 가용성 PL 펩티드의 결합은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 검출된다. 그러나, 이러한 검정들이 본 발명의 목적을 위하여 유용하는 한 개조될 수 있다는 것으로 당업자는 인식할 것이다. 이러한 검정의 상세한 설명은 미국특허출원번호 10/630,590(2003년 7월 29일 출원, US/2004/0018487로 공개됨)에 기재되어 있다. PDZ:PL 상호작용의 소분자 억제제를 동정하기 위한 고체-상 경쟁 검정 포맷을 포함하는 "G-검정"의 변형예는 하기 실시예에 기재된다.

ii. 세포 검정

세포 검정은 일반적으로 재조합 DNA를 사용하여 PL 및 PDZ 폴리펩티드를 공동-제조함(즉, 이들이 제조되는 시간에 상관없이 동일한 세포에서 제조함)을 포함한다. 통상적으로, 세포에서 PL 및 PDZ의 결합 상호작용은 리포터를 이용하여 검출된다. PDZ 도메인과 리간드를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 적합한 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포, 및 진핵 세포, 예를 들어 동물 세포(예를 들어, 곤충, 포유동물, 어류, 양서류, 조류 또는 파충류 세포), 식물 세포(예를 들어, 옥수수 또는 아라비도프시스(Arabidopsis) 세포), 또는 균류 세포(예를 들어, 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae) 세포)를 포함한다. 대상 폴리펩티드-엔코딩 핵산의 발현을 위해 적합한 임의의 세포는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 대개, 동물 숙주 세포주가 사용되는 예로는 하기와 같다: 원숭이 신장 세포 (COS 세포), SV40에 의해 변형된 원숭이 신장 CVI 세포 (COS-7, ATCC CRL 165 1); 인간 배아 신장 세포 (HEK-293); HEK-293T 세포; 어린 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소-세포 (CHO); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 카닌(canine) 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포; NIH/3T3 세포 (ATCC CRL-1658); 및 마우스 L 세포 (ATCC CCL-1). 추가적인 세포주는 당업자에게, 예를 들어 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)로부터 입수가능한 것으로 자명하게 될 것이다.

특정 구체예에서, 신경 세포, 예를 들어 SHSY5Y (신경아 세포주), 해마 무린 HT-22 세포, 성상 세포로부터의 원시 배양물, 자궁경부 피층 신경-성상세포 ㄷ동시-배양물, 혼합된 신경/신경교 해마 배양물, 소뇌 과립 신경 세포 배양물 또는 랫트 피층 (E15-17)으로부터 유도된 원시 신경 배양물이 이용될 수 있다.

다양한 상이한 리포터 플랫트폼은 세포에서 PL과 PDZ간의 결합 상호작용, 및 세포에서 PDZ/PL 상호작용의 방해를 검출하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, 효모 "두개의 혼성" 방법 및 형광-계열 FRET 또는 BRET-계열 방법). 일반적으로, 경쟁 검정에서, 이러한 방법들은 대상 PDZ 및 PL 폴리펩티드를 생산하는 세포를 시험 제제와 접촉시키고, 시험 제제가 PDZ/PL 결합 상호작용에 대해 임의의 효과를 갖는 지의 여부를 결정함을 포함한다.

다른 리포터 플랫트폼에서, GAL4 시스템은 PDZ/PL 결합 상호작용을 조절할 수 있는 시험 제제를 스크린하기 위해 사용된다. 이러한 방법은 두개 이상의 하기 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터(또는 벡터 시스템)을 사용할 수 있다: 예를 들어, DNA 전사 활성체에 연결된 PDZ 또는 PL을 함유한 DNA 결합 융합 단백질. 후자의 경우에, PDZ/PL 결합 상호작용은 리포터 유전자 또는 선택가능한 마커, 예를 들어 효소 리포터의 발현을 활성시킨다. α- 또는 β-갈라토시다제 또는 β-락타마제와 같은 효소 리포터의 수준은 예를들어 비색 기질, (오르토메틸페닐티오갈라토시드; OMTP), 또는 형광이 광도측정으로 평가되는 X-gal을 이용하여 효소적 활성을 정량화하므로써 측정된다. 조합 방법은 또한 시험 제제의 풀을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다.

다른 대표적인 구체예에서, 형광 공명 에너지 전달 (FRET)은 세포에서 PDZ와 PL 폴리펩티드 간의 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 결합 검정에서, 형광 리포터 분자는 통상적으로, 공여 분자의 방출이 수용 분자의 여기 스펙트럼과 중첩되도록 중찹 스펙트럼 성질을 갖는다. 최종 공여 분자는 이에 의해 여기되고 형광으로서 흡수된 에너지를 방출한다. 경쟁 검정 포멧에서, 공여 분자의 형광 에너지는 시험 분자에 의해 켄칭되거나 공여체와 수용체 사이의 에너지 전달이 억제된다. FRET는 공여체로부터의 형광 신호의 세기의 감소, 이의 여기된 상태의 수명의 감소, 및/또는 수용체의 보다 긴 파장 (보다 낮은 에너지) 특성에서의 형광의 재방출로서 명시될 수 잇다. 형광 단백질이 물리적으로 분리될 때, FRET 효과는 감소되거나 제거될 수 있다(미국특허 5,981,200).

리포터 플랫폼은 또한 생물발광 공명에너지 전달 (BRET) 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 시험 검정에서, BRET 시스템은 레닐라(Renilla)로부터의 루시페라제 및 GFP를 포함한다. 일 구체예에서, BRET 시스템은 레닐라(Renill)로부터의 루시페라제 및 GFP를 포함한다. 대표적인 BRET 방법은 문헌[Kroeger et al. (2001) and Xu et al. (1999)]에 기재되어 있다.

V. PDZ 상호작용의 억제제

A. 이론적 약물 디자인

이론적 약물 디자인의 목적은 생물학적 활성 화합물의 구조적 유사체를 디자인하기 위한 것이다. 이러한 유사체를 구조화하므로써, 천연 분자 보다 더욱 활성적이거나 안정적인 약물을 제조할 수 있거나, 개조에 대한 상이한 감수성을 가질 수 있거나, 상이한 정도의 절대 특이성 또는 결합 친화력을 나타낼 수 있다.

일반적으로, 분자의 3차원 구조는 X-선 결정학 또는 핵자기공명 분광법과 같은 방법을 이용하여 결정된다. 이러한 방법들이 단지 단백질의 액체 구조의 비-예시적 접근법을 나타내지만, 이러한 정보를 가지고 강력한 컴퓨터 프로그램을 이용하는 연구자가 수많은 상이한 화학적 화합물의 구조를 갖는 데이타베이스를 통해 조사할 수 있다. 따라서, 컴퓨터 및 연구자들은 수용체와 가장 잘 상호작용할 수 있는 화합물을 선택할 수 있으며, 이들은 이후 실험실에서 시험될 수 있다. 실제적으로, 하기 실시예 섹션에서 기술된 바와 같이, 이러한 방법의 성공적인 적용은 시간이 걸리는 것으로 종종 인내, 결험 및 많은 직관을 요구한다.

상호작용 화합물이 발견되지 않는 경우, 타겟에 상호작용하는 분자를 디자인하기 위해, 제 1 원리로부터 시도되는 다른 프로그램이 사용될 수 있다. 이후 디자인된 분자에 유사한 성질을 갖는 화합물을 동정하기 위해 추가 데이타베이스 조사를 수행할 수 있거나, 활성화를 위해 스크린될 수 있는 디자인된 분자를 합성할 수 있다.

B. 공지된 PDZ 억제제

아츠 등(Aarts et al. (2002))은 NMDA 수용체와 세포내 PSD95 PDZ 단백질 간의 상호작용의 펩티드-계열 억제제, 및 뇌졸중의 동물 모델에서의 이의 용도를 개재하였다. 뇌졸중의 유발 후에 투여될 때 후자의 화합물들은 실험 동물의 뇌에 전체 허혈증 영역을 효과적으로 감소시켰다. 이러한 화합물들 중 하나는 현재 US FDA- 및 캐나다 CTA-승인된 프로토콜하에서 전임상 시험 중에 있다. 인간 시험은 내년에 예상된다.

세포에서의 PL과의 PDZ 상호작용의 공지된 특성은 본 발명의 소분자를 이용하는 치료 시술로부터 이득을 본 임상 표적 및 피검체를 확인하는데 유용하다. 예를들어, 본 발명의 화합물은 암 및 CNS 질병에 걸린 환자에서의 치료 양상에 사용될 수 있다. 특히, PDZ 단백질은 질병 경과에서 중요한 역할을 지니며, 따라서 소분자 억제제를 이용하여 상기 PDZ/PL 상호작용을 차단하는 것은 임상적 이점을 제공할 수 있다. 이러한 일반적인 관념을 지지하는 발견은 다음과 같다:

1) 예를들어, 하기와 같은 암세포에서의 PDZ/PDZ 리간드 (PL) 상호작용의 차단; 즉

a. 직장결장 암세포에서, TIP1 PDZ 단백질은 β-카테닌 내의 PL 모티프와 상호작용하고, 세포 증식 및 부착 의존성 성장을 변경시킨다 (Kanamori, 2003). 따라서, 부착 의존성 성장의 변경과 같은 PDZ/PL 상호작용의 소분자 억제제를 이용한 치료법이 결장직장암의 치료에 유용한 양상을 이룬다;

b. 간세포 암종 세포에서, EPB50 PDZ 단백질은 β-카테닌 내의 PL 모티프와 상호작용하고, 이러한 상호작용은 β-카테닌 매개 TCF-의존 전사를 증가시켜 종양유전자 전사를 증가시킬 수 있다 (Shibata et al., 2003). 따라서, 상기를 이용한 β-카테닌의 PDZ/PL 상호작용을 차단하는 소분자 억제제, 및 기타 PDZ 결합 파트너, 예를들어 Magi1은 Wnt 경로를 억제하고/하거나; 세포 증식을 감소시키고/시키거나; 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 치료법에 사용될 수 있다. 간세포 암종 세포에 대한 아폽토시스 유도의 효과는 이러한 공격적인 암의 치료에서 유용한 전략을 이룬다;

c. HTLV-1에 의해 유도된 성인 T 세포 백혈병에서, PDZ 단백질 TIP1은 Tax 바이러스 종양단백질 내의 PL 모티프와 상호작용하고, 이러한 상호작용은 (ⅰ) HTLV-1 감염된 세포의 악성 전환을 촉진하고 (Hirata et al., 2004); (ⅱ) 바이러스 매개 T 세포 증식 및 종속을 증가시킨다 (Xie et al., 2005). 따라서, TIP/Tax PDZ/PL 상호작용의 소분자 억제제는 세포 증식 및 악성 전환을 감소시킬 수 있다. 악성 전환 감소의 시술은 성인 T 세포 HTLV-1 유도 백혈병에 대한 치료 양성에서 유용한 전략을 이룬다;

d. 인간 파필로마 바이러스 (HPV)에 의해 유도된 자궁경부암에서, PDZ 단백질 TIP1 및 hDlg는 HPV E6 또는 E6 종양단백질 내의 PL 모티프와 상호작용하고, 이들 PDZ/PL 상호작용은 자궁경부암 세포에서 세포 이동을 촉진할 수 있다 (Hampson et al., 2004; Du et al., 2005). 따라서, TIP/E6 또는 hDlg/E6 PDZ/PL 상호작용을 억제하는 소분자 억제제는 세포 이동 및 전이를 감소시킬 수 있다. 이러한 시술은 자궁경부암의 치료에서 유용한 치료 전략을 이룬다;

e. 또한, 자궁경부암에서, PDZ 단백질 Magi-1　도메인 1은 HPV E6 또는 E6 종양단백질 내의 PL 모티프에 결합하고, 이러한 PDZ/PL 상호작용은 Magi1-d1 분해를 방지함으로써 종양 세포 이동을 촉진할 수 있다. 따라서, Magi-1/E6 PDZ/PL 상호작용을 간섭하는 소분자 억제제는 Magi1 수준을 회복할 수 있으며, 즉 자궁경부암에서 세포 이동 및 전이를 억제할 수 있다. 전이 억제의 시술은 자궁경부암 및 난소암에서의 전이를 방지하기 위한 치료에서 유용한 치료 전략을 이룬다;

f. 아데노바이러스-관련 유방암에서, PDZ 단백질 Magi-1은 E4-ORF1 종양단백질 내의 PL 모티프와 상호작용하여, 세포 극성 및 성장 조절을 손실시킨다 (Latorre, et al., 2005). 따라서, Magi-1/E4 PDZ/PL 상호작용을 차단하는 소분자 억제제는 유방암 세포에서 폐쇄소대 (tight junction), 극성 및 성장 조절을 회복시킬 수 있다. 성장 조절의 회복은 유방암의 치료에서 유용한 치료 전략을 이룬다;

g. 흑색종에서, PDZ 단백질 신테닌(Syntenin)/mda9와 PL의 상호작용은 국소 부착 키나아제, c-Jun-NH2-키나아제, 및 p38를 인산화시킨다. p38의 인산화에 의한 PDZ/PL은 특정 환자의 암세포에서 신테닌의 발현 수준과 관련되는 전이를 촉진시킨다 (Boukerche et al., 2005). 따라서, 고수준의 신테닌을 지니는 흑색종 세포를 지니는 환자를 확인하기 위한 진단 분석을 이용하여 Syntenin-PDZ/PL 상호작용의 수분자 억제제를 이용한 치료로부터 가장 이로울 환자 집단을 선택한다. p38의 인산화와 관련한 시술은 대부분 공격적이고 생명을 위협하는 형태의 흑색종의 전이를 제한하기 위한 유효한 치료 전략을 이룬다;

2) 동통에서의 PDZ/PL 상호작용의 차단, 산 감지 이온 채널 (ASIC)에서의 PL과의 PDZ 단백질 NHERF-1의 상호작용이 동통과 관련된다 (Deval et al., 2005). 따라서, NHERF-1/ASIC PDZ/PL 상호작용을 차단하는 소분자 억제제가 동통을 감소시킬 수 있다;

3) 뇌졸중에서의 PDZ/PL 상호작용의 차단, NMDA 수용체에서의 PL과의 PDZ 단백질 PSD95 상호작용은 흥분독성 손상과 관련된다. 따라서, NMDA 수용체를 이용한 PSD95의 PDZ/PL 상호작용을 억제하는 소분자 억제제는 급성기 뇌졸중, 외상 및 심혈관 허혈에서의 허혈 손상을 감소시킬 수 있다.

C. 예시적인 소분자 억제제

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 분자의 일반적인 구조는 P₀-A-B-C-D-E로 묘사될 수 있다. 하기 페이지에서, 상기 위치 각각에 대한 다수의 추정적인 구조가 제시된다. 이들은 독립적으로 선택될 수 있으나, 화학적으로 조합될 수도 있다.

P(O) 잔기

단편 A 라이브러리

그룹 "B" 잔기

그룹 "C" 잔기

그룹 "D" 잔기

그룹 "E" 잔기

D. 막 전위 서열 (MTS)

본 발명의 치료 소분자 화합물은 추가로 변형되어 보다 가용성성인 화합물을 제조하거나, 세포로의 진입을 촉진하는 화합물이 제조될 수 있다. 예를들어, 화합물은 임의의 이용가능한 위치에서 지방 아실기의 컨쥬게이션 또는 페길화에 의해 변형될 수 있거나; 대안적으로 화합물은 막 전위 서열/도메인 (MTS/MTD)을 포함하는 펩티드, 예를들어 tat, 안테나페디아 (Antennapedia) 또는 N-말단 단백질 신호 서열 펩티드에 컨쥬게이팅될 수 있다. MTS 펩티드는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[U. Langel, Ed. "Cell Penetrating Peptides," CRC Press, Boca Rotan, 2002]에 기재되어 있다. MTS 펩티드에 컨쥬게이팅된 소분자의 예는 하기 실시예에 예시된다.

펩티드 서열에 연결된 펩티드의 형질막을 통한 세포로의 진입을 촉진할 수 있는 다수의 상기 펩티드 서열이 당 분야에 기술되어 있다 (Derossi et al., 1998). 본 발명의 목적상, 상기 펩티드는 집합적으로 "막횡단 전위 서열"로 언급되며, 이는 "세포 관통 펩티드"와 상호교환적으로 사용된다. 세포 관통 펩티드의 예는 HIV로부터 유래된 tat (Vives et al., 1997; Nagahara et al., 1998), 드로소필라로부터의 안테나페디아 (Derossi et al., 1994), 단순헤르페스 바이러스로부터의 VP22 (Elliot and D'Hare, 1997), 항-DNA 항체의 상보성-결정 영역 (CDR) 2 및 3 (Avrameas et al., 1998), 70 KDa의 열충격 단백질 (Fujihara, 1999) 및 트랜스포르탄 (transportan) (Pooga et al., 1998)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 트렁케이팅된 HIV tat 펩티드가 이용될 수 있다.

MTS 펩티드에 본 발명의 소분자 화합물을 부착시키기 위한 링커 기술의 예는 이종이기능성 가교제, 카르보디이미드 커플링제, 글루타르알데히드, 아미드 및 에스테르 결합제, 티오 결합제 등을 포함한다.

Ⅵ. 약제 제형

본 발명의 약제 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 PDZ/PL 상호작용 정조자, 및 임의로 추가 작용제를 포함한다. "약학적" 및 "약리학적으로 허용되는"은 동물, 예를들어 적절한 경우 인간에게 투여시 부작용, 알레르기 또는 기타 원치않는 반응을 야기시키지 않는 분자 부분 및 조성물을 의미한다. 하나 이상의 PDZ/PL 정조자, 및 임의로 추가 활성 성분을 함유하는 약제 조성물의 제제는 본 발명의 기재에 비추어 당업자에게 공지될 것이며, 이는 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시되어 있다. 더욱이, 동물 (예를들어, 인간) 투여를 위해, 상기 제제는 미 식품의약품국의 생물학적 표준에 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반 안정성 및 순도 표준을 충족해야 함이 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제 (예를들어, 항균제 및 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료를 포함하고, 이러한 물질 및 이들의 조합물은 당업자에게 공지되어 있다 (예를들어, 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990] 참조). 활성 성분과 양립가능하지 않는 경우를 제외하고는, 임의의 통상적인 담체가 치료 또는 약제 조성물에 사용되는 것이 고려된다.

PDZ/PL 상호작용 정조자는 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는 지의 여부, 및 주사로서 투여되는 경로에 대해 멸균이 필요한 지의 여부에 따라 다양한 유형의 담체와 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내, 피내, 동맥내, 복막내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 가슴막내, 기도내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근내, 복막내, 피하, 결막하, 수포내, 점막, 심막내, 태반내, 안내, 경구, 구소, 국부, 흡입 (예를들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 지속적 주입, 카테터 및 세척을 통한 표적 세포의 직접적인 국소 관류 세척, 크림 및 지질 조성물 (예를들어, 리포솜) 내의 함유, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법 또는 상술한 경로의 임의의 조합으로 투여될 수 있다 (예를들어, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조). 특정 구체예에서, 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 조합물을 사용함으로써 발생될 수 있다.

동물 환자에 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 요인, 예를들어 체중, 질병의 중증도, 치료되는 질병의 유형, 이전 또는 동반하는 치료 시술, 환자의 특발증 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여를 책임지는 의사는 어떠한 경우에도 개별적 피검체에 대한 조성물 내의 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 투여량(들)을 결정할 것이다.

특정 구체예에서, 약제 조성물은 예를들어 약 0.1% 이상의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 예를들어 이러한 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 한 비제한적인 예로, 활성 화합물의 양은 또한 투여량당 약 1 ㎍/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중, 약 10 ㎍/kg/체중, 약 50 ㎍/kg/체중, 약 100 ㎍/kg/체중, 약 200 ㎍/kg/체중, 약 350 ㎍/kg/체중, 약 500 ㎍/kg/체중, 약 1 mg/kg/체중, 약 5 mg/kg/체중, 약 10 mg/kg/체중, 약 50 mg/kg/체중, 약 100 mg/kg/체중, 약 200 mg/kg/체중, 약 350 mg/kg/체중, 약 500 mg/kg/체중, 약 1000 mg/kg/체중 또는 이 이상, 및 이러한 범위 내에서 유도가능한 임의의 범위로 포함할 수 있다. 상기 기술된 수에 기초한, 본원에 나열된 수로부터의 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 등의 범위로 투여될 수 있다.

조성물은 다양한 항산화제를 포함하여 하나 이상의 성분의 산화를 지연시킬 수 있다. 또한, 미생물 작용의 억제는 비제한적으로, 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이의 조합을 포함하는 다양한 항균제 및 항진균제와 같은 방부제에 의해 유도될 수 있다.

PDZ/PL 조절체는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성되거나, 무기산 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 산부가염을 포함한다. 유기 카르복실기로 형성된 염은 무기 염기 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제 2 철; 또는 유기 염기 예컨대, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다.

조성물이 액체 형태인 구체예에서, 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 리피드 (예를 들어, 트리글리세리드, 식물성 오일, 리포좀) 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유체는 예를 들어, 코팅 예컨대, 레시틴의 사용; 담체 예를 들어, 액체 폴리올 또는 리피드중에 분산시킴으로써 요망되는 입자 크기의 유지; 계면활성제 예를 들어, 히드록시프로필셀룰로오스의 사용; 또는 이러한 방법의 조합에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제 예를 들어, 당, 염화나트륨 또는 이의 조합을 포함하는 것이 바람직할 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서 안약, 비액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로, 표적 조직 유형과 양립가능하도록 고안된다. 비제한적 예로서, 비액은 일반적으로, 점적 또는 스프레이로 비강내로 투여되도록 고안된 수용액이다. 비액은 많은 점에서 비 분비물과 유사하여 정상적인 섬모 작용이 유지되도록 제조된다. 이와 같이, 바람직한 구체예에서, 비 수용액은 일반적으로 등장성이거나 약하게 완충되어 약 5.5 내지 약 6.5의 pH가 유지된다. 또한, 점안 제조물, 약물 또는 적합한 약물 안정화제에 사용되는 것과 유사한 항균 방부제가 필요에 따라 제형중에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다양한 시중의 비 제조물이 공지되어 있으며, 항생제 또는 항히스타민과 같은 약물을 포함한다.

특정 구체예에서, PDZ/PL 조절체는 경구 섭취와 같은 경로에 의해 투여되도록 제조된다. 이들 구체예에서, 고형 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 필, 캡슐 (예를 들어, 경질 또는 연질 쉘 젤라틴, 캡슐), 서방형 제형, 구강 조성물, 트로키 (troches), 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 경구 조성물은 음식물에 직접적으로 혼입될 수 있다. 경구 투여용의 바람직한 담체는 불황성 희석제, 융합가능한 식용 담체 또는 이의 조합을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 경구 조성물은 시럽 또는 엘릭시르로서 제조될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 예를 들어, 적어도 하나의 활성제, 감미제, 방부제, 향미제, 염료, 방부제 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

특정 바람직한 구체예에서, 경구용 조성물은 하나 이상의 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 향미제 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물은 하기중 하나 이상을 포함할 수 있다: 결합제 예를 들어, 검 트래거캔트, 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴 또는 이의 조합; 부형제 예를 들어, 디칼슘 포스페이트, 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 또는 이의 조합; 붕해제 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이의 조합; 윤활제 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트; 감미제 예를 들어, 수크로오스, 락토오스, 사카린 또는 이의 조합; 향미제 예를 들어, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리향, 오렌지향 등; 또는 이들의 조합. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에, 액체 담체와 같은 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅으로서 또는 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 필 또는 캡슐이 셸락 (shellac), 당 또는 이 둘 모두로 코팅될 수 있다.

기타 투여 모드에 적합한 추가적인 제형은 좌약을 포함한다. 좌약은 다양한 일반적으로 직장, 질 또는 요도로 삽입하기 위한, 일반적으로 약용의 다양한 중량 및 형상의 고체 투여 형태로 존재한다. 삽입 후 좌약은 강 유체 (cavity fluid)중에서 연화되거나 용융되거나 용해된다. 일반적으로, 좌약에 있어서, 일시적 담체 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세리드 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 좌약은 예를 들어, 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는, 약 1% 내지 약 2%의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.

멸균 주입 용액은 적합한 용매중에 필요량의 활성 화합물과 필요에 따라, 기타 상기 열거된 성분을 혼입시킨 후, 멸균 여과시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및/또는 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주입액, 현탁액 또는 에멀션의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공-건조 또는 냉동-건조 기법이며, 이는 활성 성분 분말 및 추가적인 요망된 성분을 이의 이전의 멸균 여과된 액체 매질로부터의 생성시킨다. 액체 매질은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주입 전에 충분한 염수 또는 글루코오스에 의해 등장성이 되어야 한다. 직접 주입을 위한 고농도 조성물의 제조가 또한 고려되며, 여기서, 용매로서 DMSO의 사용이 구상되어 소영역으로 고농도의 활성 성분의 극도로 신속한 침투 전달을 유도한다.

조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며, 미생물 예컨대, 박테리아 및 진균류의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 엔도톡시 오염물이 안정적인 수준 예를 들어, 0.5ng/mg 단백질 미만으로 최소로 유지되어야 한다.

VII. 치료법

A. 염증 및 신경 퇴행성 질환

i. 단일 요법

본 발명의 화합물은 암, 통증, 염증 또는 신경퇴행성 질환 및 이들로부터의 만성 후유증을 갖는 환자에서 질환의 하나 이상의 증상을 완화하고자 고안된 치료법에 유용할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 화합물 및 방법은 발작 위험성이 있거나 발작 경험이 있는 피검체를 치료하기 위한 치료법에 유용하다. 발작은 개도국에서 사망 및 장애를 초래하는 원인이다. 미국에서는 연간 약 500,000명이 발작 증상으로부터 고통받고 있으며, 비용은 230억 달러에 해당한다. 발작은 주로 동맥 폐쇄로 인한 뇌 일부로의 혈류의 갑작스러운 중단에 의해 초래된다. 발작의 덜 흔한 원인으로는 파괴된 대뇌 동맥류로 인한 출혈이다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 허혈 경색증, 색전증 및 출혈 예를 들어, 저혈압 출혈로부터 초래된 발작을 치료학 위한 치료법에 유용하다. 발작은 단지 뇌의 한쪽 부분에만 영향을 끼치지 때문에, 증상은 전형적으로 신체의 한쪽 부분에만 관련이 있다. 공통된 증상은 근육 약화, 저림, 감각 또는 진동 감각의 저하, 저하된 반사, 마비, 시력 문제, 균형감 손실, 협동 손실, 및 언어 장애를 포함한다. 본 발명의 화합물은 이러한 증상 및 기타 발작 관련 증상을 치료하고/거나 감소시키는데 사용될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 화합물은 통증 및/또는 염증 (예를 들어, 관절염, 망막병증, SLE, 건선, 물집 유사천포장, 대상포진 또는 유사한 질환)을 갖는 피검체에 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 화합물 및 방법은 미세혈관 부족, 저산소증, 죽상경화증 또는 다른 급성 또는 만성 심장혈관 및 신경계 허혈을 경험했거나 이러한 질환에 걸릴 위험이 있는 피검체를 치료하기 위한 치료법에 유용하다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 화합물은 광범위 축삭 손상, 저산소-허혈성 뇌병증 및 다른 형태의 머리뇌 외상을 포함하는 완만하거나 중증의 외상 뇌 손상을 갖는 환자의 신경 손상을 제한하기 위해 고안된 치료법에 사용될 수 있다. 또한, 본 화합물은 박테리아 또는 바이러스 수막염과 같은 신경계의 감염으로부터 초래된 합병증을 치료하는데 사용될 수 있다. 게다가, 본 화합물 및 방법은 알츠하이머병, 루이 소체 치매, 파킨슨병 (PD), 헌팅턴병 (HD), 다발성 경화증, 운동 신경세포 병, 근육신경 이상증, 말초 신경병증, 신경계의 대사 장애, 글리코겐 저장 질환, 및 신경이 손상되거나 파괴되는 기타 질환을 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료법에 유용할 수 있다.

ii. 병합 요법

특정 구체예에서, 치료가 염증의 하나 이상의 증상을 완화시키기 위한 것인 경우, 본 화합물은 COX (이는 비특이적 또는 특이적 COX일 수 있음)에 의해 프로스타글란딘 합성의 억제제와 함께 공동 투여될 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어, 아스피린, 인도메타신 (indomethacin) (인도신 (Indocin^®)), 이부프로펜 (ibuprofen) (모트린 (Motrin^®), 나프록센 (naproxen) (나프로신 (Naprosyn^®)), 피록시캄 (piroxicam) (펠덴 (Feldene^®)), 나부메톤 (nabumetone) (렐라펜 (Relafen^®), 로페코집 (rofecoxib) (비옥스 (Vioxx^®)), 셀렉코집 (celecoxib) (셀레브렉스 (Celebrex^®)) 또는 발데코집 (valdecoxib) (벡스트라 (Bextra^®))를 포함하는 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)일 수 있다.

또 다른 조합에서, 베타세론 (Betaseron^®), 아보넥스 (Avonex^®), 코팍손 (Copaxone^®), 노바트론 (Novantrone^®) 및 레비프 (Rebif^®)가 예를 들어, 탈수초성 질환 예컨대, 다발성 경화증의 치료에 본 발명의 소분자 화합물과 함께 유용할 수 있으며; 알츠하이머 유형의 치매를 완화시키기 위한 완만한 치료법에서 가역성 아세틸콜린스테라아제 억제제인 아리셉트 (Aricept^®)(도네페질 (donepezil)) 및 엑셀론 (Exelon^®)(리바스티그민 (rivastigmine))이 본 발명의 소분자 화합물과 함께 병합 치료에 사용될 수 있으며; 현재 근육위축가쪽경화증에 걸린 환자에 사용되는 리루테크 (Rilutek^®), 리오레솔 (Lioresol^®), 자나플렉스 (Zanaflex^®), NSAID 및 울트람 (Ultram^®)이 병합 치료에 유용할 수 있다. 파킨슨 병합 치료에는 본 소분자 화합물 및 항-콜린성 (항-무스카린) 약물, COMT 억제제, L-Dopa, 도파민 수용체 아고니스트, 및/또는 MAO-B 억제제가 포함된다.

B. 암

i. 단일 요법

상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 원발성, 전이성, 약물 내성 및 재발 암을 포함하는 암의 치료에 유용할 것이다. 이러한 구체예에서, 본 조성물은 과다증식성 질환 예컨대, 암에 걸린 피검체, 또는 다른 구체예에서는, 암에 걸릴 위험도가 비교적 높은 피검체에 투여될 수 있다.

과다증식성 질환은 세포의 비정상적인 성장 또는 증식과 관련된 질환이다. 예시적인 과다증식성 부위로는 전암병소, 양성 종양 및 암을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 뇌, 머리와 목, 식도, 기관, 폐, 간, 위, 대장, 췌장, 유방, 경부, 자궁, 방광, 전립선, 고환, 피부 또는 직장의 암을 포함하는 고형 암과 관련된 하나 이상의 증상을 완화시키기 위해 고안된 치료법에 사용될 수 있다. 본 화합물 및 방법은 림프종 또는 백혈병의 치료에 사용될 수 있다.

본 조성물의 환자로의 국소적, 국부적 (함께, 국소-국부적 (loco-regional)) 또는 전신 전달이 고려된다. 본 치료법은 하기중 임의의 것으로서 광범위하게 규정되는 질환의 하나 이상의 증상의 완화에 의해 임상 이점을 제공할 중재 방법으로 구성된다: 종양-관련 통증의 저하, 원발성 종양 크기의 감소, 전이의 발생 또는 크기 감소, 종양 성장의 저하 또는 중단, 경감 유도, 재발전까기의 기간의 연장, 종양 세포 분화 억제, 종양 세포 사멸, 종양 세포의 아폽토시스 유도, 종양 재발의 감소 또는 제거, 및/또는 환자 생존율 증가.

암 재발은 하나 이상의 수술, 방사선치료 또는 화학치료 후 암을 갖는 것으로서, 재발 또는 재진단으로서 규정될 수 있다. 환자는 질환에서 벗어난 것으로서 보고되지 않으며, 단지 환자는 일차 치료에 의해 일정 정도의 임상 반응 후 새로운 암 성장을 나타내는 것이다. 임상 반응은 안정된 질환, 종양 퇴행, 종양 괴사, 또는 명백한 암의 부재일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

ii. 병합 요법

본 발명에 있어서, 추가적인 치료법이 추가의 이점을 위해 환자에 적용될 수 있다. 이러한 치료법으로는 방사선, 화학치료, 수술, 사이토킨, 톡신, 약물, 식이요법 또는 유전자 치료를 포함한다. 예들이 상기 및 하기에 논의되어 있다.

암 세포를 치사시키거나, 이들의 성장을 감속시키거나, 상기 논의된 임상 종말점을 달성하기 위해, 암 세포 또는 종양을 이차 항암 치료제와 함께 본 발명의 조성물과 접촉시킬 수 있다. 이러한 두 양식은 암 세포를 치사시키거나 증식을 억제시키기에 유효하거나, 환자 생존을 증가시키는 것을 포함하는 목적하는 임상 종말점을 달성하기에 유효한 조합된 양으로 제공된다. 이러한 과정은 암 세포 또는 종양을 동시에 두 양식과 접촉시키는 것을 포함한다. 이는 두 시약 모두를 포함하는 단일 조성물 또는 약물학적 제형과 암 세포 또는 종양을 접촉시키거나, 암 세포 또는 종양을 두개의 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴으로써 달성되며, 여기서 한 조성물은 일차 치료제를 포함하며, 다른 조성물은 이차 치료제를 포함한다.

대안적으로, 일차 치료는 수분 내지 수주의 간격을 두고 이차 치료에 선행되거나 후속되어 수행될 수 있다. 두 양식이 암 세포 또는 종양에 각각 적용되는 경우, 각 전달 시점 사이에 현저한 시간 간격을 두지 않도록 하여, 두 양식 모두가 암 세포 또는 종양에 유리하게는 혼합된 영향을 발휘할 수 있을 것이다. 이러한 경우, 세포는 두 양식 각각 약 12-24시간내, 더욱 바람직하게는, 약 6-12시간내에 접촉할 것이며, 약 12시간의 간격이 가장 바람직하다. 그러나, 일부 경우에, 처리 기간을 현저하게 연장시키는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 각 투여 사이에는 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주일 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 간격을 두게 된다.

각 양식의 1회 초과의 투여가 요망될 것으로 여겨진다. 다양한 조합이 이용될 수 있으며, 여기서 일차 치료는 "A"이며, 이차 치료는 "B"이다:

A/B/A B/A/B A/B/A A/A/B A/B/B B/A/A B/B/B/A B/A/B/B

B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A

B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B

암 세포 또는 종양에 적용되는 경우 용어 "접촉" 및 "노출"이 시약 또는 시약들이 암 세포 또는 종양에 전달되거나 여기에 직접적으로 인접하여 위치하는 과정을 설명하기 위해 본원에 사용되었다.

a. 후속 수술

암 환자중 약 60%가 수술을 받게될 것이며, 이러한 수술로는 예방 수술, 진단 수술 또는 단계적 수술, 치료 및 완화용 수술을 포함한다. 특히, 절제불가능한 종양을 갖는 환자는 본 발명에 따라 치료될 수 있다. 그 결과, 종양은 그 크기가 감소되거나, 종양 맥관 구조가 절제가능하게 되도록 변화될 수 있다. 이렇게 되는 경우, 표준 절제술이 허용될 수 있다. 수술과 함께 사용될 수 있는 또 다른 특정 모드의 투여는 수술에 의해 초래된 작동성 종양 베드의 치료이다. 이와 같이, 일차 치료시 또는 후속 치료시, 선택적으로 수술 부위로 카테터를 삽입함으로써 수술 동안 및 수술 후에 조성물을 절제된 종양 베드로 관류시킬 수 있다.

근치적 수술은 절제를 포함하며, 그러한 절제에서, 모든 또는 일부의 암 조직이 물리적으로 제거되고/거나, 절제되고/거나, 파괴된다. 종양의 절제는 적어도 일부의 종양의 물리적인 제거를 나타낸다. 종양 절제 외에도, 수술 처리는 레이저 수술, 냉동외과수술, 전기외과수술(electrosurgery), 및 현미경 조절된 수술(모즈 수술: Mohs' surgery)을 포함한다. 본 발명은 표피암, 전암, 또는 정상조직의 우발적인 양의 제거와 결부되어 이용될 수 있음이 추가로 고려된다.

상기된 바와 같이, 모든 암성 세포, 조직, 또는 종양 부분을 절제하는 경우, 신체에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 추가의 항암 치료에 의한 그 부위의 관류, 직접적인 주입 또는 국소적용에 의해서 수행될 수 있다. 그러한 치료는 예를 들어, 매일 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안, 또는 매일 1, 2, 3, 4, 및 5 주 동안, 또는 매일 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 동안 반복될 수 있다. 그러한 치료는 또한 용량을 변화시킬 수 있다.

b. 유전자 치료

또 다른 구체예에서, 2차 치료는 유전자 치료이며, 그러한 유전자 치료에서, 치료 유전자가 대상에게 투여된다. 종양 억제인자, 세포 사이클 조절제, 프로-아포프토틱 유전자(pro-apoptotic gene), 시토카인, 독소, 항-혈관생성 인자, 및 종양유전자, 프로-혈관생성 인자(pro-angiogenic factor) 및 성장인자를 억제하는 분자를 포함한 다양한 분자가 본 구체예에 포함된다.

c. 화학치료

광범위하게 다양한 화학치료제가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 용어 "화학치료법"은 약물을 사용하여 암을 치료함을 나타낸다. "화학치료제"는 암치료에서 투여되는 화합물 또는 조성물을 포함하는 것으로 사용된다. 이들 작용제 또는 약물은 세포내에서의 이들의 활성 방식에 의해서 분류되는데, 이들이 세포 사이클에 영향을 주는지 및 어떠한 단계에서 영향을 주는지에 의해 분류된다. 대안적으로, 작용제는 DNA와 직적접으로 가교하는 능력, DNA 내로 삽입되는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 줌으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 능력을 기준으로 특성화될 수 있다. 대부분의 화학치료제는 하기 부류에 속한다: 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제, 유사분열 억제제 및 니트로소우레아(nitrosourea).

d. 방사선치료

방사선 치료법으로 일컬어지는 방사선 치료는 이온화 방사선으로 암 및 그 밖의 질환을 치료하는 치료법이다. 이온화 방사선은 세포의 유전적 물질을 손상시킴으로써 치료되는 부위내의 세포를 손상 또는 파괴하는 에너지를 방출하여, 이들 세포가 계속 성장하는 것을 불가능하게 한다. 방사선이 암세포와 정상 세포 둘 모두를 손상시키기는 하지만, 정상세포는 그 자신이 회복될 수 있으며 적절히 기능할 수 있다. 방사선치료는 편재된 고형암, 예컨대, 피부, 혀, 후두, 뇌, 유방, 또는 경부의 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 이는 또한 백혈병 및 림프종(각각 혈액-형성 세포 및 림프 시스템의 암)을 치료하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 방사선 치료는 이로 한정되는 것은 아니지만, γ-선, X-선 및 종양 세포로의 직접적인 방사성 동위원소의 전달의 이용을 포함한다. DNA 손상 인자의 그 밖의 형태는 마이크로파 및 UV-조사(irradiation)와 같은 형태이다. 모든 이들 인자는 DNA에, DNA 전구체에, DNA의 복제 및 복구에 및 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 범위의 손상을 주는 것으로 보인다. 용량은 X-선 범위의 경우 지속된 시간(3 내지 4 wk) 동안 50 내지 200 뢰트겐의 일일 용량 내지 2000 내지 6000 뢰트겐(roentgen)의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소의 경우, 용량은 아주 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 길이 및 형태, 신생 세포에 의한 흡수에 좌우된다.

방사선치료는 암 부위에 직접적으로 방사선 용량을 전달하는 방사성 표지된 항체의 사용을 포함한다(방사성면역치료). 항체는 항원(면역시스템에 의해서 외래로 인식되는 물질)의 존재에 대한 반응으로 신체에서 생성된 고도의 특이적 단백질이다. 일부 종양세포는 종양-특이적 항체의 생산을 촉발시키는 특이적 항원을 함유한다. 다량의 이들 항체가 실험실에서 제조될 수 있고, 방사성활성 물질에 부착될 수 있다(방사성표지화로 공지된 공정). 신체내로 주입되면, 항체는 활성적으로 암세포를 찾아내고, 암세포는 방사선의 세포-치사(세포독성) 작용에 의해서 파괴된다. 이러한 방법은 건강한 세포에 대한 방사선 손상 위험을 최소화할 수 있다.

입체조형 방사선치료(conformal radiotherapy)는 표준 방사선치료 처리와 동일한 방사선치료 기계, 즉, 선형 가속기를 사용하지만, 금속 블록이 x-선 빔의 경로에 위치하여 그 모양을 변경시켜서 암의 모양과 일치되게 한다. 이러한 치료는 높은 방사선 용량이 종양에 주어지는 것을 확실하게 한다. 건강한 주변 세포 및 근처의 구조물은 낮은 용량의 방사선을 받게 되고, 그로 인해서 부작용의 가능성이 줄어든다. 멀티-리프 콜리메터(multi-leaf collimator)라 칭하는 장치가 개발되었으며, 금속 블록에 대한 대안으로 사용될 수 있다. 멀티-리프 콜리메터는 많은 금속 시이트로 구성되며, 그러한 시이트는 선형 가속기에 고정된다. 각각의 층은 방사선 빔이 금속 블록 없이 치료 부위에 대한 모양을 할 수 있도록 조정될 수 있다. 방사선치료 기계의 정밀한 정위는 입체조형 방사선치료 처리에 아주 중요하며, 특별한 스케닝 기계가 사용되어 각각의 처리 시작부터 내부 기관의 위치를 체크할 수 있다.

고해상도 강도변환 방사선치료(High-resolution intensity modulated radiotherapy)가 또한 멀티-리프 콜리메터를 사용한다. 이러한 치료 동안, 멀티-리프 콜리메터의 층들이 이동하면서, 처리가 이루어진다. 이러한 방법은 처리 빔의 보다 정밀한 모양을 달성하게 하는 듯하며 방사선치료의 용량을 전체 처리부위에 걸쳐서 일정하게 한다.

연구에서 입체조형 방사선치료 및 강도변환 방사선치료가 방사선치료 처리의 부작용을 줄일 수 있다는 것이 밝혀졌지만, 처리 부위의 모양을 그렇게 정밀하게 잡는 것은 치료부위 바로 밖의 미세한 암 세포가 파괴되는 것을 중지시킬 수 있다는 것이 가능하다. 이는 장래에 재발하는 암의 위험이 이들 특별화된 방사선치료 기술에 의해서 더 높을 수 있음을 의미한다.

정위적 방사선치료는 뇌 종양을 치료하는데 이용된다. 이러한 기술은 많은 상이한 각도로부터 방사선치료를 유도하여 종양에 가해지는 용량을 아주 높게 하고 용량 영향 주변 건강 조직을 아주 적게 한다. 처리 전에, 수회의 스켄이 컴퓨터에 의해서 분석되어 방사선치료가 정밀하게 표적되게 하고, 환자의 머리가 특별히 제조된 프레임에 고정되게 하면서 방사선치료가 수행된다. 수회의 용량이 주어진다.

뇌 종양을 위한 정위적 방사선수술(감마 나이프)는 나이프를 사용하는 것이 아니라 수백의 상이한 각도에서 아주 정밀하게 표적된 감마 방사선치료 빔을 사용한다. 단지 일회 방사선치료는 약 4 시간 내지 5 시간을 필요로 한다. 이러한 치료를 위해서, 환자는 그의 머리에 특별히 제작된 금속 프레임이 부착될 것이다. 이어서, 수회의 스켄과 x-선이 수행되어 처리가 요구되는 정확한 부위를 찾게 된다. 방사선치료 동안, 환자는 그의 머리를 수백개의 구멍이 있어서 방사선치료 빔이 그를 통과하게 하는 큰 헬멧에 넣고 누워있게 된다.

과학자들은 또한 방사선 치료의 효율을 증가시키는 방법을 찾고 있다. 두 가지 형태의 연구 약물이 방사선 진행중인 세포에 대한 이들의 효과에 대해서 연구되고 있다. 방사선감작화제는 종양 세포를 보다 쉽게 손상되게 하며, 방사선억제제는 정상 조직을 방사선의 영향으로부터 보호한다. 발열요법, 즉, 열의 사용이 또한 방사선에 대한 감작화 조직에서의 그 효과에 대해서 연구되고 있다.

e. 그 밖의 치료

면역치료. 면역치료는 일반적으로 암 세포를 표적하고 파괴하는 면역 이펙터 세포(immune effector cell) 및 분자의 사용에 좌우된다. 면역 이펙터는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상의 어떠한 마커에 대해서 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료에 대한 이펙터로서 작용할 수 있거나 다른 세포를 강화시켜서 세포 치사를 작용적으로 수행하게 할 수 있다. 항체는 또한 약물 및 독소(화학치료제, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소, 등)에 컨주게이트될 수 있으며, 단순히 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로는, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 지니는 림프세포일 수 있다. 다양한 이펙터 세포가 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.

일반적으로, 종양 세포는 표적화에 순응하는, 즉, 다른 세포의 대부분에 존재하지 않는 약간의 마커를 지녀야 한다. 많은 종양 마커가 존재하며, 이들 중 어떠한 마커는 본 발명의 개념상 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커는 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen), 전립선 특이항원, 요로 종양 관련된 항원, 태아항원(fetal antigen), 티로시나제(tyrosinase) (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 라미닌 수용체(laminin receptor), erb B 및 p155를 포함한다.

종양 괴사인자는 몇가지 종류의 암 세포를 치사시키며, 시토카인 생성을 활성화하고, 대식세포 및 내피 세포를 활성화하고, 콜라겐 및 콜라게나제의 생성을 촉진하고, 염증 조절제 및 패혈성 쇼크 조절제이며, 이화작용, 발열 및 수면을 촉진하는 글리코단백질이다. 일부의 감염성 작용제는 TNF 생산의 자극을 통해서 종양 퇴행을 유발시킨다. TNF는 유효 용량으로 단독 사용되는 경우에 아주 독성이어서, 최적의 섭생은 다른 약물과 함께 낮은 용량으로 이를 사용하게 할 수 있다. 면역억제 작용은 감마-인터페론에 의해서 강화되어, 조합치료가 잠재적으로는 위험하다. TNF 와 인터페론-α의 하이브리드가 또한 항암 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다.

호르몬 치료. 암의 치료에서 본원에 기재된 방법에 따른 성 호르몬의 사용. 본원에 기재된 방법은 특정의 암의 치료에 한정되지 않지만, 이러한 호르몬의 사용은 유방암, 전립선암, 및 자궁내막암(자궁의 라이닝)과 관련하여 유익하다. 이들 호르몬의 예는 에스트로겐, 항-에스트로겐, 프로게스테론, 및 안드로겐이다.

코르티코스테로이드 호르몬이 일부형태의 암을 치료하는데 유용하다(림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종). 코르티코스테로이드 호르몬은 그 밖의 화학치료제의 효능을 증가시킬 수 있으며, 그 결과, 이들은 병합 치료에서 자주 사용된다. 프레드니손 및 덱사메타손이 코르티코스테로이드 호르몬의 예이다.

C. 면역조절

PDZ 조절제가 면역-기재 질환의 치료에 또한 사용될 수 있다. 그러한 질환은 비정상 면역 활성화가 있는 질환, 예컨대, 자가면역 SLE 류머티스 관절염, 수포성 유천포창(Bullous pemphigoid), 타입-I 당뇨병 등을 포함하며; 다른 질환은 불충분한 면역 기능에 의해서 특성화된 질환을 포함할 수 있다. 전자는 면역억제제(FK506, 시클로스포린, 타크롤리머스(tacrolimus), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 코트리목사졸(cotrimoxazole) 및 MMF)와 PDZ:PL 상호작용의 인스턴트 소분자(instant small molecule) 조절제를 사용한 병합으로 치료될 수 있다.

D. 정신병

본 발명의 조성물에 의한 처리에 주어질 수 있는 그 밖의 질환은 정신과적 장애, 예컨대, 주의력결핍 과다행동 장애, 우울증, 광장공포증, 게걸증, 식욕부진, 양극성 장애(bipolar disorder), 불안장애, 자폐증, 치매, 해리장애, 건강염려증, 충동조절장애, 병적도벽, 기분장애(mood disorder), 다중인격장애, 만성피로증후군, 불면증, 발작수면, 정신분열병, 약물남용, 외상후스트레스 장애, 강박장애(obsessive-compulsive disorder), 및 조울증(manic depression)을 포함한다.

IX. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 입증하기 위해 포함되었다. 하기 실시예에 기술된 기법이 본 발명을 실시하는데 있어서 본 발명자에 의해 발견된 기법을 대표하는 것이며, 따라서, 본 발명을 실시하는데 바람직한 방식을 구성하는 것일 수 있음이 당업자에게는 자명하다. 그러나, 당업자에게 본 발명의 견지에서, 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 수득하는 많은 변형이 기술된 특정 구체예내에서 수행될 수 있음이 또한, 자명할 것이다. 더욱 특히, 화학적으로 그리고, 생리학적으로 관련된 특정 시약이 본원에 기술된 시약을 대체할 수 있으며, 그럼에도 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 자명하다. 당업자에게 자명한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형이 첨부된 청구범위에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 포함되는 것으로 여겨진다.

실시예 1

분자 모델링 프로토콜: 인 실리코 스크리닝

아셀리스 (Accelrys) 분자 모델링 소프트웨어 패키지를 사용하여 분자 모델링을 수행하였다. 간단하게는, 4개의 상이한 PDZ 단백질 즉, 인간 DVL1, PSD95 d1, PSD95 d2 및 PSD95 d3의 구조를 사용하여 대략적/최적/키메라 분자 배위를 구성하는데 사용하고, 이러한 배위를 상이한 소분자 화합물을 도킹 (docking)시키기 위한 인 실리코 PDZ 도메인을 작제하는데 사용하였다. 인간 DVL1의 분자 배위는 부분적으로, 제노푸스 (Xenopus) DVL2 (#1L60.pdb) 결정 구조상에 기초한 상동 모델링으로부터 유래되었다. 분자 배위는 또한, PDS95 d1, PSD95 d2 및 PSD95 d3에 대한 실험적 및 이론적 NMR-규정된 구조를 고려하여 조절되었다. PDZ에서의 소분자의 인 실리코 도킹을 세리우스2의 스트럭쳐 베이스트 포커싱 (SBF)(Accelrys, San Diego, CA) 및 카탈리스트 (Catalyst) 4.9 모델링 프로그램으로 수행하였다. 분자 모델링 공정은 수개의 단계로 나누어질 수 있다:

1) PDZ 결합 그루브의 형상에 근접하도록 배제 부피 표면을 제조;

2) PDZ 결합 그루부내로 약리단 그룹을 한정. 본질적으로, 한 세트의 약리단 필터가 이어서 형성되게 하였다. 즉, 예를 들어, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체 및 소수성 상호작용을 포함하는 그루브내의 아미노산 잔기와 특정한 특이적 소분자/PDZ 상호작용이 요구되었다. 여러번 모델링시킨 후, 분자가 PDZ 그루브의 배제 부피와 충돌되지 않고, 또한, 형성된 약리단 필터에 의해 요구된 상호작용을 충족시키는 경우, 시험 화합물은 "힛츠(hits)"로서 수용되었다. 모든 경우에, 두개의 필수 요건이 요망된다: 즉, 모든 분자에 있어서, (a) 이들은 소수성 상호작용을 통해 PDZ의 제로 포켓 위치 (P0)과 상호작용해야 하며, (b) 이들은 PDZ 그루브의 "GLGF" 루프의 인접부에서 카르복실레이트 작용기를 가져야 한다;

3) 파트-1 (배제 부피) 및 파트-2 (약리단 그룹)으로 이루어진 필터는 카탈리스트 4.9-4.10으로 제공되며, 각 분자에 대한 다중 구조를 함유하는 화학적 데이타베이스를 조사하기 위해 사용되었다.

4) 분자 모델링으로 처리된 약 650,000개의 시험 화합물 (ChemDiv, San Diego, CA; Blanca Pharmaceutical, Mountain View, CA)로부터, 단지 184개의 소분자 화합물을 실험 테스트를 위한 "가능한 힛츠 리스트"로부터 선택하였다. 즉, 하기 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간단하게는, "가능한 힛츠"의 각각을 6개의 상이한 PDZ 도메인에서 PDZ 리간드 결합의 경쟁적 억제에 대해 각각 시험하였다. 즉, PSD95 d1, PSD95 d2, PSD95 d3, Magi1 d1, Tip1 및 Shank1을 포함하는 6개의 상이한 PDZ/PDZ 리간드 검정 각각에서 경쟁적 억제에 대해 시험하였다.

실시예 2

매트릭스 조작 G-에세이

소분자 경쟁 에세이. 시약, 공급품 및 프로토콜은 다음과 같다:

시약 및 공급품:

(1) 눙크 맥시소프(Nunc Maxisorp) 96 웰 면역-플레이트

(2) PBS pH 7.4 (포스페이트 버퍼된 셀린 (saline), 8g NaCl, 0.29g KCl, 1.44g Na₂HPO₄, 0.24g (3) KH₂PO₄, 1L로 H₂O 첨가 및 pH 7.4; 0.2 μ filter)

(4) 에세이 버퍼: PBS 내 2% BSA (PBS 리터 당 20g의 BSA), ICN 바이오메디컬스 (Biomedicals)

(5) 염소 항-GST 다클론 항체, 5 mg/ml 저장 용액, 4℃에서 보관, (아머샴 파마시아); 1:1000 in PBS에서 최종 농도가 5 μg/ml가 되도록 1:1000으로 희석됨

(6) HRP-스트렙타비딘 (Streptavidin), 2.5mg/2ml 저장 용액, 4℃에서 보관, 지메드 (Zymed), 에세이 버퍼로 1:2000으로 희석함, 최종 [0.5 μg/ml]

(7) 비오틴화된 (Biotinylated) 펩타이드 (아나스펙으로부터, -20℃ 냉동고에서 보관)

(8) GST-PRISM 단백질 (-10℃ 냉동고에서 처음 해동 저장 후, -80℃에서 저장 보관)

(9) TMB (3,3',5,5', 테라메틸벤시딘), 사용 전

(10) 0.18M H₂SO₄

(11) 12-w 멀티채널 피펫기

(12) 200 μl LTS 팁

(13) 50 ml 시약 저장기

(14) 50 폴리프로필렌 원뿔형 튜브

(15) 15 ml 폴리프로필렌 둥근-바닥 튜브

(16) 1.5 ml 마이크로튜브

(17) 분자 장치 마이크로플레이트 리더 (450 nm 필터)

(18) 소프트맥스 프로 소프트웨어

(19) 에세이 버퍼 (1x PBS, 0.01% 트리톤 X-100)

프로토콜. 96-웰 플레이트의 18개에서 20개의 웰을 100 μl의 5 μg/ml 항-GST 항체 (각 웰에서)로 코팅하고, 4℃에서 밤새도록 방치하였다. 플레이트들은 다음에 뒤집어 비우고 종이 타월로 두드려 건조하였다. 200 μl의 블로킹 버퍼 (lx PBS/2% BSA)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1-2 시간 동안 방치하였다. 다음에 플레이트를 자동 플레이트 세척기 (3x 실온에서 lx PBS)를 사용하여 세척하고, 플레이트가 마르지 않도록 지켰다. GST-PDZ 융합 단백질을 lx PBS/2% BSA에서 5 μg/ml의 최종 농도로 희석하고 50 μl를 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 1-2 시간 동안 배양한 후 과량의 결합하지 않은 융합 단백질은 자동 플레이트 세척기 (3x 실온에서 lx PBS)를 사용하여 세척하여 제거하였다.

PDZ 리간드 펩타이드, 소분자 테스트 화합물, 및 HRP를 에세이 버퍼에서 다음과 같이 제조하였다:

- 비오틴화된 PDZ 리간드 합성 펩타이드를 1/4 최종 부피, 즉, 4x 최종 농도에서 제조하였고;

- 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트 (Zymed)를 1/4 최종 부피, 즉, 4x 최종 농도로 희석하였으며 (1:500);

- 다음에 비오틴화된 펩타이드 및 스트렙타비딘-HRP를 서로 혼합하고, 실온에서 20분간 배양하여 시그널 생성 리간드 컴플렉스를 형성하였고;

- 펩타이드/HRP 혼합물을 배양하는 동안, 시험 화합물 희석을 1/2 최종 부피, 즉, 2x 최종 농도로 제조하였으며;

최종 펩타이드 리간드 컴플렉스 혼합물을 플레이트에 첨가하고 바로 전에, 약물 적정(drug titration)을 첨가하여 1x 농도 및 최종적으로 정확한 전체 부피를 갖는 혼합물을 얻었다.

다음에 시그널 생성 펩타이드 리간드 시험 화합물 혼합물을 플레이트의 각 웰에 웰 당 50 μl로 첨가하고 각 첨가 시간을 기록하였다. 다음에 정확히 30분 동안 마지막 펩타이드가 첨가된 후, 상기 플레이트를 실온에서 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 자동 플레이트 세척기 (7x 실온에서 lx PBS)를 사용하여 세척하였다. 시그널 생성 펩타이드 리간드를 검출하기 위해 TMB 기질 (HRP에 대한) 플레이트의 각 웰에 웰 당 100 μl로 첨가하고 TMB 첨가 시간을 기록하였다. 다음에 플레이트를 실온에서 최고 30분 동안 암실에서 배양하였다. 비색 반응 (colorimetric reaction)은 다음에 TMB 첨가 후 30분간 100 μl의 0.18M H₂SO₄를 사용하여 중단하였다. 다음에 플레이트 각 웰에서의 시그널은 450 nm에서 광학 밀도를 측정하여 결정하였다.

PDZ 리간드 펩타이드. 도 1 (아래)에 대한 기재는 경쟁 스크리닝 에세이에서 사용되는 6개의 PDZ 단백질 및 비오틴화된-PL 페어를 보여준다. 묘사된 소분자 경쟁 화합물의 화학 구조는 도 2A에서 나타난다.

스크리닝에서 예증이 되는 결과. 소분자는 그들의 능력에 대해 스크린되어 앞의 경쟁적인 결합 에세이에서 PDZ 결합에 대해 펩타이드와 경쟁한다. 예증이 되는 결과를 도 1에 나타내었다, 즉., 8개의 선택된 소분자 억제제의 OD₄₅₀값을 상응하는 8개의 DMSO 비교실시예의 OD₄₅₀값과 함께 보였다. 도 1에서 예증된 특정 PDZ/PL 상호작용은 다음과 같다:

(1) 비교실시예: PL 펩타이드 1857(GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길 (Magil) dl;

(2) 시험: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길 dl + 화합물 8009-5039;

(3) 비교실시예: PL 펩타이드 AA56 (QISPGGLEPPSEKHFRETEV) + PDZ 단백질 팁 1;

(4) 시험: PL 펩타이드 AA56 (QISPGGLEPPSEKHFRETEV) + PDZ 단백질 팁 1 + 화합물 3289-2331;

(5) 비교실시예: PL 펩타이드 1965 (YGRKKRRQRRRYIPEAQTRL) + 생크 1;

(6) 시험: PL 펩타이드 1965 (YGRKKRRQRRRYIPEAQTRL) + 생크 1 + 경쟁자 0620-005;

(7) 비교실시예: PL 펩타이드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95-d3;

(8) 시험: PL 펩타이드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95-d3 + 화합물 C450-0454;

(9) 비교실시예: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길-dl;

(10) 시험: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길-d1 + 화합물 3019-0348;

(11) 비교실시예: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길-dl;

(12) 시험: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길 dl + 화합물 3558-0042;

(13) 비교실시예: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길-dl;

(14) 시험: PL 펩타이드 1857 (GRWTGRSMSSWKPTRRETEV) + PDZ 단백질 마길-dl + 화합물 MC 247808;

(15) 비교실시예: PL 펩타이드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95-d3; 및,

(16) 시험: PL 펩타이드 1916 (YGRKKRRQRRRTKNYKQTSV) + PDZ 단백질 PSD95 d3 + 화합물 E544-0129.

괄호 안 (위)에서 수는 도 1에서 바 그래프 아래의 괄호 안의 수와 일치한다.

실시예 3

소분자는 PDZ 도메인에서 PDZ 리간드의 결합과 경쟁할 수 있다

송양 (Songyang) 등 (1997)은 펩타이드 라이브러리를 스크린하여 LIN-2, p55 및 Tiam-1 PDZ 단백질에 대한 펩타이드 PDZ 리간드의 결합을 평가하였고 카르복실-말단 3 내지 7 아미노산 잔여기가 결합에 기여한다는 것을 발견하였다. 문헌에서 이후의 혼동은 최근에야 문헌 ["A compendium of information regarding PDZ complexes demonstrates that dissimilar C-terminal peptides bind to the same PDZ domain, and different PDZ domains can bind the same peptides." Niv et al. (2005)]으로서 요약되었다. 일반적으로, PDZ 도메인에서 큰 펩타이드와의 도킹에 참여하는 분자의 상호작용은 특히 PDZ/PL 상호작용의 소분자 억제제를 디자인하는데 도움이 되지 않았다.

도 2A에서 화합물, 및 다른, 소분자 억제제의 상대적인 결합 친화도가 동일한 경쟁적 결합 에세이에서 화합물 적정에 의해 결정되었다.

도 2A의 소분자에 대한 예증적인 IC₅₀값 (μM) (즉, 6개의 서로 다른 PDZ 단백질에 대한 적정 연구에서 결정된 바와 같은)을 표 1 (아래)에 나타내었으며 예증적인 적정 결합 커브를 도 2B에서 아래와 같이 나타내었다:

패널 1) 화합물 #3289-2331에 대한 적정;

패널 2) 화합물 # 0620-0057에 대한 적정;

패널 3) 화합물 #C450-0454에 대한 적정;

패널 4) 화합물 #3558-0042에 대한 적정;

패널 5) 화합물 # MC 247808에 대한 적정; 및,

패널 6) 화합물 # E544-0129에 대한 적정.

표 1-적정 분석에 의해 결정된 바와 같은 소분자의 상대적인 결합 친화도.

실시예 4

막 전위 시퀀스

막 전위 시퀀스/도메인 (MTD)은 소분자의 분절과 결합하지만, 바람직하게 분절 E에서만은 아니다. 만약 소분자가 D, C, 또는 B에서 끝나면, 다음에 MTD는 분절 D, C, 또는 B에 각각 공유 결합할 것이다. MTD는 아미드 결합, 에스터 결합, 티오아미드 결합 또는 다른 형태의 공유 결합을 통해 소분자와 결합할 수 있다. 그러나, MTD는 P(0) 카르복실레이트 또는 페닐에 결합할 수 없는데, 이는 이들 결합이 PDZ에 결합하는데 매우 중요하기 때문이다. 도 3A 및 3B는 PDZ/PL 상호작용의 두 개의 서로 다른 소분자 억제제에 대한 MTD의 컨쥬게이션을 도시한다.

실시예 5

세포에서 PSD-95 단백질 수준의 감소

PSD-95는 수많은 질병에 대한 중요한 약물 표적이다. 화합물 0620-0057이 세포를 투과할 수 있고 PSD-95에 영향을 줄 수 있다는 것을 증명하기 위해, 이 약물을 시험관 내의 다양한 세포주에 첨가하였다. 약물 첨가 후에, PSD-95 단백질 수준을 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 평가하였다.

방법:

ㆍ 시험된 약물: 0620-0057 (C₂₈H₄₅N₃O₅ MW=503.6880 g/mol)

ㆍ 10 mM 저장 용액 = DMSO 내 5.0368 mg/ml. 저장 용액은 6.70 mg의 약물 가루의 무게를 재고 1.33 ml의 DMSO로 부피를 조절하여 만들었다.

ㆍ 시험된 세포주: C33A, 293ET, A549, HCT116.

ㆍ 세포는 3 ml의 그들의 성장 배지, 및 37 ℃ 5% CO₂에서 성장한 o/n에서 6 웰 플레이트에서 1 x 10⁶ 세포/웰에서 시드하였다.

ㆍ 실험 세포는 하루에 한 번 2 ml의 1xPBS로 세척하였다.

ㆍ 약물 용액은 따뜻한 성장 배지에서 적당한 약물량의 희석에 의해 10 mM 저장 용액으로부터 80-150 μM의 범위로 제조하였다.

ㆍ 단지 DMSO인 네거티브 비교실시예는 약물 희석에 대한 것과 같은 성장 배지에서 동일한 부피의 TC급 DMSO의 희석에 의해 제조하였다.

ㆍ 3 ml/웰의 약물 용액 및/또는 DMSO만의 용액을 세척한 세포에 첨가한 다음 세포를 37℃에서 6-72 시간 동안 배양하였다.

항-PSD-95 또는 항-DLG1으로의 웨스턴 블랏 및 탐색

ㆍ 라이시스 (lysis) 버퍼 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 억제제 (Calbiochem)) 내 라이스 (lyse) 세포.

ㆍ 10% SDS-PAGE 미니겔에서 샘플 (40μg-150μg의 전체 단백질 용해질)을 전개한다.

ㆍ 운반 25 볼트 45 분간 PVDF 막 (임모빌론-P, 밀리포어, 0.45 μm)으로 운반 (반건조)한다.

ㆍ 5% 비지방 건조 우유 및 2% BSA와 함께 블로킹 버퍼 TBS-T (8.77 g/l NaCl과 25 mM 트리스 pH 7.4 및 0.05 내지 0.1% 트윈-20과 0.2 g/l KCl (150 mM NaCl))로 막을 둔다. 4℃에서 밤새도록, 또는 실온에서 2-4 시간 동안 배양한다. TBS-T로 겔을 세척한다.

ㆍ TBS-T 내 10 μg/ml에서 PSD-95 단클론 항체 (AVC에서 생성된) 또는 항-DLG1을 첨가한다. 흔들어주면서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 흔들어주면서 실온에서 5분 동안 TBS-T로 4회 세척한다.

ㆍ 염소 항-생쥐 IgG-HRP (Jackson Immunoresearch)를 첨가한다. 흔들어주면서 실온에서 5분 동안 TBS-T로 5회 세척한다.

ㆍ 제조자의 프로토콜에 따라 ECL 플러스 (Amersham)와 전개한다. 필름 (코닥 MR)에 노출시킨다.

결론: 도 4는 두 세포주 상에서 본 실험의 결과를 보여준다. PSD-95 수준은 화합물 0620-0057에 대해 시험된 모든 4개의 세포주에서 유사하게 감소되었다. 따라서, 0620-0057은 세포에 침투하는 능력을 가지며 메커니즘에 얽매이지 않고 PSD-95 단백질 수준의 분해라는 결과를 낳는 세포성 리간드를 치환하는 것 같다.

여기서 개시되고 주장된 모든 조성물 및 방법은 만들어질 수 있으며, 본 출원의 공개에 비추어 수행되지 않은 실험을 제외하고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구체예에 의하여 기재되는 동안, 변종이 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여기서 기재된 조성물 및 방법 및 방법의 단계 또는 일련의 단계에 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 좀더 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 달성하는 화학적 및 물리적으로 관련된 어떤 시약이 여기서 기재된 시약에 대해 치환될 수 있음은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환체 및 변형체는 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내인 것으로 간주된다.

참고문헌

하기 참고문헌은 본원에 기재된 기술사항을 보충하는 예시적인 과정 또는 그 밖의 상세사항을 제공하는 정도로 본원에서 특별히 참고문헌으로 통합된다:

SEQUENCE LISTING <110> BELMARES, MICHAEL P. LU, PETER S. MENDOZA, KENNETH A. <120> SMALL MOLECULE INHIBITORS OF PDZ INTERACTIONS <130> ARBV:002WO <140> PCT/US2006/062715 <141> 2006-12-29 <150> 11/426,282 <151> 2006-06-30 <150> 60/755,315 <151> 2005-12-30 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 1 Gly Arg Trp Thr Gly Arg Ser Met Ser Ser Trp Lys Pro Thr Arg Arg 1 5 10 15 Glu Thr Glu Val 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 2 Gln Ile Ser Pro Gly Gly Leu Glu Pro Pro Ser Glu Lys His Phe Arg 1 5 10 15 Glu Thr Glu Val 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile 1 5 10 15 Glu Ser Asp Val 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 15 Gln Thr Ser Val 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 5 Gly Arg Trp Thr Gly Arg Ser Met Ser Ser Trp Lys Pro Thr Arg Arg 1 5 10 15 Glu Thr Glu Val 20

Claims

뇌졸중, 신경계 허혈, 또는 뇌 또는 척수에 대한 외상을 치료 또는 예방하기 위한, NMDRA2B에 대한 PSD95의 특이적 결합을 저해하는 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물:

상기 식에서,

R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵ 중 하나는 -COOH 이고, R¹, R², R³, R⁴, 및 R⁵ 중 나머지는 F, H, OCH₃ 및 CH₃로 이루어진 군에서 선택되며,

X는 -A-B-C-D-E이고, 여기서 A, B, C, D 및 E 는 단일결합을 통해 결합되며,

A는 C=O이며;

B는 -CH₂이고;

C는 C=O이며;

D는 NH이고;

E는 -NH-COR¹⁴이고, 여기서 R¹⁴는 (CR¹⁵R¹⁶)_vH이며, 여기서 v=17이고 R¹⁵ 및 R¹⁶은 수소이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물이

인 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 환자가 뇌졸중을 갖는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 인간의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학적 조성물.
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