WO2004030688A1

WO2004030688A1 - 蛋白間相互作用を調節することによる新規アポトーシス調節方法と、それを用いる医薬

Info

Publication number: WO2004030688A1
Application number: PCT/JP2003/012615
Authority: WO
Inventors: Hideyuki Saya; Shinji Kuninaka; Shin-Ichiro Niwa
Original assignee: Link Genomics, Inc.
Priority date: 2002-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2004-04-15
Also published as: AU2003268727A1; JPWO2004030688A1

Abstract

　本発明は、Omiを介するカスパーゼ非依存性アポトーシス機構の優れた調節法、即ち、WARTS蛋白質とOmi蛋白質の相互作用を亢進または抑制することを含む、細胞の新規アポトーシス調節方法、例えば(1)細胞に外部よりOmiおよび／またはWARTS、またはそれらに実質的に同質な蛋白質を加えること、(2)Omiおよび／またはWARTSをコードするDNAで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、(3)Omiおよび／またはWARTSをコードするDNAで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、等によってWARTSとOmiの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、前記アポトーシス調節方法、を提供するとともに、アポトーシスが関与する各種疾患の治療または予防に有効な新規医薬組成物を提供する。

Description

明細書蛋白間相互作用を調節することによる新規アポトーシス調節方法と、それを用いる医薬技術分野

本発明は,細胞のアポトーシスを誘導する方法、ならびに該方法を用いる各種治療法、予防法、および医薬に関する。背景技術

細胞死は、形態学的な特徴に基づいてアポトーシス（ a p o p 10 s i s； K e r r、 Wyll ie及ぴ Currie : 1972年）とネクローシス（necrosi s) とに分類される。ネクローシスが細胞の障害、酸素欠乏、栄養不足等の刺激による受動的な細胞死 ·細胞崩壊（壊死）であるのに対し、アポドーシスは programed cel l deathとも呼ばれる遺伝子的に制御された細胞死で、多細胞生物の個体発生の過程と恒常性維持に必要な普遍的プロセスである。アポトーシスの過程では、細胞内外の様々な生理的 ·病理的因子が細胞死の開始のシグナルとして働き、多様な経路をたどって細胞中に情報伝達される。（1)核全体の凝縮 ·縮小（染色体凝集、染色体 DNAの断片化）； (2)細胞縮小 ·空胞化（細胞質凝集）；（3)細胞表面の微絨毛消失による平滑化；（4)細胞の断片化によるアポトーシス小体（apoptotic body) の形成；（5)マクロファージ等によるアポトーシス小体の食食；という一連の形態変化を生じるのが特徴である。近年に至って、細胞死制御における変化（抑制、低下等）は、癌、自己免疫疾患、脱髄性疾患等、多くのヒト疾患の病因の一つにであると考えられている。

システィンプロテアーゼのファミリーの一つであるカスパーゼ (caspase) は、アポトーシス機構における中心的蛋白質と考えられてレヽるが、一方で、遺伝子のノックアウトまたは各種阻害剤でカスパーゼを不活性化しても、殆どのアポトーシス刺激剤で細胞死が起きることから、カスパーゼの活性化が細胞死に必ずしも必要ではないことが明らかとなつている。カスパーゼ依存的アポトーシス以外にもカスパーゼ非依存的経路があって、該非依存的経路が並列的に機能していると考えられている。

アポトーシスシグナル伝達において、ミトコンドリアが重要な役割を担うことが知られている。細胞死刺激剤によって、ミトコンドリアはシトクローム c ytochrome-c) 、 AIF poptosis inducing factor) 、カスパーゼ 'チモーゲン（caspase zymogen) 等、様々なアポトーシス誘導因子を遊離する。該因子の一つであるミトコンドリア蛋白質 Smac/DIABLO は、アポトーシスを促進するカスパーゼ活性化蛋白質で、ターゲットシークェンスが切断されて成熟型になると、アポトーシス刺激剤の刺激に応答して細胞質へ放出され、そこでァラニン残基で始まる N 末端部位がアポトーシスタンパク質阻害因子 IAP ( inhibitor of apoptosi s protein) の BIR3および BIR2 ドメインに結合し、 IAPのカスパーゼ阻害作用を抑えることが知られている。ショウジョゥバエ (Drosophi la) のアポトーシス誘導蛋白質である Reaper、 Hid, および Grimも、同様にァラニン残基で始まる自身の N末端部位を通じて IAPと相互作用してカスパーゼを活性化する作用を有し、 Smac/DIABLO は、構造的にも機能的にも、ショウジョゥバエのアポトーシス誘導蛋白質のヒトホモログ蛋白質であると考えられている。

ミトコンドリァのセリンプロテアーゼである 0mi/HtrA2 (以下、「0mi」と略す。 ) も、ショウジヨウバエのアポトーシス誘導蛋白質に対するヒトホモログ蛋白質とされる。 Omiはその C末端に PDZ ドメインとよばれるドメインを有しており、該 PDZ ドメインは、様々な調節蛋白質に見られるドメインで、蛋白質ターゲッティングや蛋白質複合体形成において重要な役割を担っていることで知られる。 Omi は、アポトーシス誘導刺激に応じてミトコンドリアの膜間スペースから細胞質に放出されて、異なる 2つの機序で細胞死を引き起こすことが明らかになつている。第 1 の機序は、 N末端が切り出されて形成された成熟型 Omiの更にこの N末端モチーフが IAPに結合して IAPのカスパーゼ活性化阻害を遮断する機序；第 2の機序は、カスパーゼの活性化を経ずに Omiプロテアーゼ活性依存的に細胞死を誘導する機序である。最近の研究から、 Omi における IAP 結合モチーフが必ずしも全哺乳動物に保存されたものではないことがわかっている。

warts遺伝子（wtsまたは latsとして知られる。 ) は、当初ショウジョゥバエの癌抑制遺伝子として同定され、セリン Zトレオニンリン酸化酵素をコードする遺伝子で、多くの分裂過程に関与する筋緊張性ジスト口フィー蛋白質ジン酸ィ匕酵素 (myotonic dystrophy protein kinase： DMPK) ファミリーとの間に高度な相同性を有する。この wts遺伝子に関して、 wts 遺伝性の突然変異を有するハエの体細胞は巨大化して組織中に大きな腫瘍を形成するとの報告があり、 wts はショウジヨウバエの細胞の形態形成 ·増殖に関わっていると考えられている。

一方、 RTS/LATS1 (以下、「WARTS」と略記する。）は、 wts に対する哺乳類ホモログ遺伝子として同定された（例えば、特許文献 1参照）。ショウジョゥバエの場合と同様、 WARTS 遺伝子が欠損したマウスでも悪性腫瘍の形成がみられたとの報告もあり、 WARTS は哺乳動物細胞において癌抑制遺伝子として機能していると考えられている。本発明者らは、かって、分裂期に WARTSが分裂装置に動的に局在し、そこで Zyxinといぅァクチン重合促進蛋白質と相互作用していることと、 WARTS が Zyxin を含む複合体を形成して分裂制御において中心的働きを担っていることとを報告している。

前記 Omiによる IAP結合とそれによる IAP活性阻害が細胞死（アポト一シス）に必須であるとは必ずしもいえず、 Omi誘導細胞死においては、これ以外に、カスパーゼ非依存性経路が重要な役割を担っていると考えられる。

—方、 RTS が機能しない場合、クロモソーム不安定化に至る通常の細胞分裂が進行しないというだけの事実で、 WARTS 蛋白質の癌抑制作用を説明し解明するのは不可能であり、より詳細な WARTSの機能解明が必要である。

他方、アポトーシスの抑制または低下は、各種癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、等の疾患の病因に関与していると考えられ、アポトーシス機序の解明は、前記各種疾患を治療 ·予防するための方法とそのための薬剤の開発とを可能にすると期待することができる。

即ち、本発明の目的は、 Omiプロテアーゼの活性化機構、および、 Omi を介するカスパーゼ非依存的アポトーシスの経路 ·機序を明らかにすることにより、 Omiを介するカスパーゼ非依存的アポトーシスの調節法（誘導 '抑制法）を探索し見出すこと、並びに、アポトーシスが関与する各種疾患の治療法、予防法およびそのための医薬を見出すこと、にある。

[特許文献 1 ]

特開平 1 1— 0 8 9 5 8 0号公報（配列表における配列番号： 1 ) 発明の開示

本発明者らは、上記事情に鑑みて精力的に検討と研究を重ねた。その結果、予想外にも、

(1) WARTSの C末端 20アミノ酸を使ったスクリ一ユングにより、 WARTS の C末端の 3個のアミノ酸（Val - Tyr - Val) と Omi PDZ ドメインとが直接結合すること；

(2)正常型 Omi/プロテアーゼ不活性型（S306A) Omi のインビトロ（in vitro) アツセィで、全長 WARTSは Omiにより切断されるが、 C末端結合部位を欠失させた WARTSは切断を受けないこと；

(3)細胞質内局在を呈する Omi を過剰発現させると細胞内でも内因性 WARTSが切断を受けること；ならびに -

(4)スタウロスポリン（Staurosporine) によるアポトーシス刺激でも細胞内 WARTSの切断が生じたこと、等を見出した。そして、研究を継続した結果、

(5)成熟型 Omiの基質は WARTS蛋白質であり、両者の相互作用によって Omiが活性化されること；

(6) Omi を介するカスパーゼ非依存性アポトーシス過程には Omi と WARTS の相互作用が必要不可欠であること；とを初めて見出して、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、 [ 1 ] 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「WARTSJ と称する。）と配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「0mi」と称する。）の間における相互作用を亢進または抑制することを含む、細胞のアポトーシス調節方法； [ 2 ] 細胞内における Omiおよび Zまたは WARTSの量を増加させることによりアポトーシスを誘導することを特徴とする、前記

[ 1 ]に記載のアポトーシス調節方法； [ 3 ]細胞内における Omi と WARTS の間における相互作用を阻害することによりアポトーシスを抑制することを特徴とする、前記 [ 1 ] に記載のアポトーシス調節方法； [ 4 ] (1) 細胞に外部より Omiおよび/"または WARTS、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（2) Omiおよび/または WARTS をコードする DNAで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（3) Omiおよび Zまたは WARTSをコードする DNAで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（4)0miおよび Zまたは WARTSのモノクローナル抗体を外部より加えることによって WARTSと Omiの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、前記 [ 1] に記載のアポトーシス調節方法；

[5] (1) WARTS, それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩、または（2)0mi、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩を有効成分として含む、医薬組成物； [6] アポトーシスを調節するための医薬である、前記 [5] に記載の組成物； [7] 各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、前記 [5] 記載の組成物； [8] 前記 [ 1 ] に記載の方法を用いることを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療または予防法。

[9] (1)細胞に外部より Omiおよびまたは WARTS、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えるこ.と、 (2) Omiおよび/または WARTSをコードする DNAで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（3) Omiおよび/または WARTSをコードする DNAで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（4) Omi および/または WARTSのモノクローナル抗体を外部より加えることによって WARTSと Omi の相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、前記 [8] に記載の治療または予防法； [ 1 0] WARTSおよび Zまたは Omi の蛋白質量を定量することにより細胞にアポトーシスの起こる程度を評価することを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の診断方法； [ 1 1 ] Omiおよびまたは WARTSを用いることを特徴とする、アポ小一シス調節活性を有する化合物のスクリーニング方法； [ 1 2] Omi および /または WARTSを用いることを特徴とする、アポトーシス調節活性を有する化合物のスクリーニング用キット； [ 1 3] 前記 [ 1 1 ] に記載のスクリーニング法または前記 [ 1 2] に記載のスクリーエング用キットの使用により得られうる、アポトーシス調節活性を有する化合物またはその塩； [ 1 4] 前記 [ 1 3] に記載の化合物またはその塩を含む医薬組成物； [ 1 5] 各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、前記 [ 1 4] に記載の組成物、に関する。図面の簡単な説明

図 1は、各種試験に用いた WARTSと Omiの各種発現フラグメントを示す。

図 2は、ノキュロウィルスで産生した WARTS全長タンパクと GST - Omi の結合実験を示す。

図 3は、 WARTSが Omiの PDZと特異的に結合することを示す。

図 4は、 WARTSの C末端 3アミノ酸が 0MI との結合に必須であることを示す。

図 5は、 Omiに対する抗体の作成と、その特異性の検定を示す。

図 6は、内在性 Wartsの免疫沈降と Omiの検出を示す。

図 7は、活性型 Omiによる in vitroでの WARTS分解を示す。

図 8は、 WARTSの C末端欠失蛋白質が Omi と結合できず蛋白質分解を受けないことを示す。

図 9は、各種試験に用いた Omiの各種発現フラグメントと細胞内での局在を示す。

図 1 0は、前記図 9の Omiを WARTS全長の発現プラスミドと共にトランスフエタションして WARTSのレベルを比べた結果を示す。

図 1 1は、細胞内 Omi発現による RTS レベルの変化を示す。

図 1 2は、前記図 1 1の定量化を示す。

図 1 3は、 Omiの発現を siRNAで抑えた時の WARTS発現量を示す。図 1 4は、 Omi の発現を siRNAで抑えてスタゥロスポリン刺激を与えた時の細胞死の割合を示す。

図 1 5は、 WARTS分解におけるスタウロスポリンの影響を示す。

図 1 6は、カスパーゼ阻害剤とスタゥロスポリンの存在下で WARTSが分解されることを示す。

図 1 7は、 WARTSの発現が siRNAで抑えられることを示す。

図 1 8は、 WARTSの発現を siRNAで抑え、 z- vad- fmk存在下スタウロスポリン刺激で有意に細胞死が抑制されたことを示す。

図 1 9は、細胞に Omi と WARTSを一緒にトランスフエクションした時の細胞死を示す。

図 2 0は、前記図 1 9の実験の顕微鏡像を示す図である。発明を実施するための最良の形態

次に、本発明の実施の形態について、記号、用語等の意義を示しつつ説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。

本発明にかかるアポトーシス誘導方法は、 WARTS蛋白質と Omi蛋白質との相互作用を用いる点に第 1の特徴がある。これまで、アポトーシス誘導に必要不可欠な Orai蛋白質がどのような機構でアポトーシスを誘導するのかが、全く知られていなかつたが、本発明者らによりそれが明らかとなつた。即ち、本発明者らは、以下の検討と試験の結果、 WARTS 蛋白質が Omiプロテア一ゼの基質であり、 Omiは WARTS との相互作用によつて活性化される機構と、そして、 WARTS蛋白質と WARTS— Omi相互作用がアポトーシス誘導に必要であることとを見出したものである。

なお、 WARTS蛋白質は配列表の配列番号： 1、 Omi蛋白質は配列表の配列番号： 2で示すアミノ酸配列を有する。

( 1 ) WARTSの Omi PDZ ドメインへの結合

以下に示すように、酵母ツーハイブリッド（yeast two-hybrid) スクリーニング法を用いて、 HeLa cDNAライブラリーを探索した。 WARTSの C 末端 20アミノ酸（Ser- Asp- Glu- Asp- Asp- Gin- Asn- Thr- Gly- Ser- Glu- lie - Lys- Asn- Arg- Asp - Leu- Val- Tyr- Val ; 図 1に示される SS フラグメント）を含む Gal4_結合ドメイン融合蛋白質を作製し、該 SSフラグメントを bait として HeLa cDNAライブラリーをスクリーニングした結果、 8個の独立且つ配列の重なった同じ遺伝子の cDNAクローンが得られ、これらはセリンプロテアーゼ 0mi/HtrA2であることがわかつた（図 1 ) 。

Omiが WARTSに直接的に結合することは、以下の in vitro結合ァッセィによって示された。即ち、単離した 0mi/C70の cDNA断片を細菌の発現ベクター pGEXにクローニングし、 GST-Omi/C70または GSTをグルチオンーァガロースビーズ上に固定した。 WARTSに対する Omi PDZ ドメインの特異性を示すために、 NE- digの 3つの PDZ ドメィンを含む GST融合蛋白質も使用した。結果、バキュロウィルスで作製して精製した全長 RTS は GST- 0mi/C70とは共沈したが、 GST- NE- dig PDZや GST単独では見られなかった（図 2 ) 。

また、同由来の WARTSを、全長 GST- Omiまたは GST- Omi A PDZ融合蛋白質とインキュベートしたところ、全長 GST- Omi は WARTS と結合したが GST - Omi A PDZ融合蛋白質はしなかった（図 3 ) 。即ち、 Omi PDZ ドメインは WARTSとの相互作用に特異的なドメィンであることが示された。

PDZ ドメインを含む殆どの蛋白質は、自己の C末端配列を介してターゲットに結合することで知られるが、 WARTS においても、やはり、 PDZ ドメインとの結合に用いられる共通モチーフ（consensus mot if) に同じような C末端 DLVYVが見出されている。 C末端と Omi との相互作用を確認する目的で、 HAタグを有する WARTS Δ Ν1 (図 1 ) 、 Δ Ν1- A SSおよび Δ Ν1- A VYVを発現している C0S7細胞の Lysate (可溶化液）を、クルチオンーァガロースビーズに固定した GST- 0mi/C70とィンキュベートしたところ、 A M- A SSも Δ Ν1 - A VYVも GST- 0mi/C70に結合しなかったが、 Δ Ν1は結合をした（図 4 ) 。即ち、 WARTSの C末端の VYVは Omi蛋白質と相互作用をすることが示された。 ·

更に、 WARTS と Omi との in vivoにおける物理的相互作用を試験する目的で、細菌で精製した Hi s⁶- tagged 0mi/C70蛋白質をラットに注入して、ァフィ二ティーで精製し、抗 Omi抗体 RC70を作製した。 RC70の特異性はウェスターンブロッティングで確認した。 C末を FLAGでタグした全長 Omiを C0S7細胞に発現させ、抗 FLAGモノクローナル抗体（M2) で免疫沈降させたところ、該複合体の Omi_FLAGは RC70抗体により認識された（図 5 ) 。また、内在性の WARTSを抗 WARTS抗体（G3) で HaLa細胞の Lysateを処理したところ、 RC70抗体は当該免疫沈降に内在性 Omiの成熟型をとらえた（図 6 ) 。即ち、 WARTSは in vivoで Omi の成熟型と相互作用していることが示された。

( 2 ) Omiによる WARTSの in vitro加水分解反応

WARTSが Omiプロテア一ゼの基質であるかを確認すべく、 in vitroプ口テアーゼアツセィを行った。全長 WARTSを精製し、細菌に生産させた Omi と 37°Cでインキュベートし、抗 WARTS抗体（C2) とィムノブロッテイングして解析した（図 7 ) 。 WARTS蛋白質量は野生体（wi ld-type) の組換え Omi とのインキュベーションで濃度依存的に減少し、一方で、プ口テアーゼ不活性な Omi変異体（S306：以下、 S/Aと称する。）は WARTS 蛋白質量に何ら影響を与えなかった。更に、セリンプロテアーゼ阻害剤である N— トシルリシンクロロメチルケトン（ N - tosyl lysine chloromethyl ketone : TLCK) が野生体 Omiのプロテアーゼ活性を阻害することが示された。即ち、 Omiは in vitroで WARTSを蛋白質分解することが示された。

次に、 N末が切断された WARTS ( Δ Ν2) と更にこれの C末端 3アミノ酸を欠失させた WARTS (図 1の Δ Ν2— A VYV) を用いて in vitroプロテアーゼアツセィを行った。 HA タグをしたこれらの WARTS 変異体は、 C0S7 細胞に発現され、 HA—ァフィ二ティーマトリックスクロマトグラフィーで精製後、 in vitro プロテアーゼアツセィに用いられた。結果、 Δ Ν2 は Omi野生体によって直接消化されたがプロテアーゼ不活性な S/A Omi には消化されなかった（図 8 ) 。これに対し、 Omi が結合できない変異体 Δ Ν2— A VYVは、 Omi の野生体とィンキュベートしても蛋白質分解を受けなかった。従って、 Omi PDZ ドメインと WARTSの C末端領域は、 Omi による WARTSの消化に必要であることが示された。

( 3 ) Omiの in vivo基質（WARTS) の確認

図 9に示す様々なフォームの Omiを全長 WARTSとともに過剰発現させた時の HEK293T細胞における WARTSの量を調べた。 24時間のトランスフェクションの後、 SDS-PAGEと抗 WARTS抗体 (C2) とのィムノブロッティングを行ったところ、図 1 0に示すように、成熟型 Omiの過剰発現によつて WARTSの発現が減少し（図 1 0の lane 4) 、野生体の全長 Omiをトランスフエタトしたものでも RTSの発現が減少したが（図 1 0の lane 2) 、しかしながら、プロテアーゼ不活性な変異体 Omi (全長または成熟型）では、 WARTSの発現量には何ら影響が見られなかった（図 1 0の lane 3と 5) 。

本発明者らは、ミトコンドリアリーダー配列を欠損する Omiは細胞質に局在するが、全長 Omiは核とミトコンドリァ内に局在することを、実験的に示した（図 1 1 ) 。図 1 1で示されるように、様々な Omi関連蛋白質でトランスフエクトされた HeLa細胞において、成熟型の Omiを発現させると内在性の WARTSの染色が減少するが、プロテアーゼ不活性にした Omi (S/A) では WARTS染色に何ら影響を与えなかった。既に報告されているように、成熟型の wild-type Omiを過剰に発現させると、クロマチン凝集や細胞質凝集といった細胞死の形態を呈することがわかっているが、本発明者らは、 WARTS の染色に対応してこれらの形態変化が発現することを示した（図 1 1 ) 。同時に、全長 wi ld-type Omiの発現により、内在性 WARTSの発現が減少した細胞の割合が増加することを見出した（図 1 2 ) 。図 1 2で示す結果は、図 1 0における解析結果に合致するものである。

更に、本発明者らは、内在性 Omiの WARTS発現調節への関与を確認する目的で、二本鎖 siRNA ( small interfering RNA) を用いる RNA干渉法により、二本鎖 RNAでトランスフエタトして遺伝子発現を抑制（破壌）する試験、ここでは、 HeLa細胞の Omiの発現を破壊して、その効果を見た。その結果、 Omi の発現を抑制（破壊）し内在する Omi の発現量を減少させると、内在性 WARTSの発現量が有意に増加することが示された（図 1 3 ) 。

以上の知見に基づいて、本発明者らは、 WARTSが Omi の生理学的基質であることを見出すことができた。

( 4 ) スタロスポリン（Staurosporine) による Omiプロテアーゼ活性化と WARTS蛋白質分解誘導

本発明者らは、スタロスポリン（Staurosporine；以下、「STS」と略記することがある。）による Omi プロテアーゼ活性の活性化と、 WARTS 蛋白質の分解について試験を行った。 STS には、カスパーゼ阻害剤の存在下で細胞死を誘導すると報告や、 Omi がミトコンドリアから細胞質へ転移するのを誘導するとの報告がある。本発明者らは、これらの知見から、 STSが Omi を介し、且つカスパーゼに非依存的なアポトーシスを活性化することができると考え、 Omi siRNA実験を行って Omi発現が抑制された細胞の STS に対する感受性を調べた。その結果、コントロール siRNAと比較して、 Omi siRNAでトランスフエタトした細胞では、 STSに対する有意な耐性が確認された（図 1 4 ) 。図 1 4で示されるように、特に、カスパーゼ阻害剤である z - VAD- fmk存在下では、 STS に対して 8 倍もの耐性を獲得していた。

この結果に基づいて、本発明者らは、 HEK293細胞を全長 WARTS、または C末端 3アミノ酸を欠失させた WARTS ( A VYV)でトランスフヱクトし、 STSで活性化された Omiプロテアーゼと WARTSの蛋白質分解との関連を調べた。 HEK293細胞にトランスフエクシヨンして 48時間後、該細胞を更に 12時間 STSで処理してから、抗 HA抗体でィムノプロッティング解析をしたところ、全長 WARTS の発現量は、 STS処理に対し濃度依存的に減少し、一方で、 A VYV の発現量には STSによる影響が見受けられなかつた（図 1 5 ) 。この知見から、本発明者らは、 WARTSは、 STSに誘導されたアポトーシスの過程において活性型の Omiプロテアーゼと相互作用し、そして消化されることを見出した。

次に、本発明者らは、カスパーゼ阻害剤である z - VAD - fmkの存在下で WARTSの発現に対する STSの効果を調べた。これは、 WARTSを分解する酵素がカスパーゼであるとする可能性を除くことが目的であった。結果、図 1 6で示すように、ポリ ADP リボースポロメラーゼ（poly ADP- ribose polymerase : PARP) が切断されない条件下で、内在性 WARTSが消化を受けることはなかった（図 1 6の lane 3と 6) 。この知見から、本発明者らは、 STSで誘導されたアポトーシス過程において、全長 WARTSの蛋白質分解にはカスパーゼの活性が必要ではなく、該アポトーシス過程においては、 Omiプロテアーゼが活性化されて Omiが WARTSをカスパーゼ非依存的に分解することを見出した。

( 5 ) WARTS遺伝子発現の抑制実験

本発明者らは、 HeLa細胞を s iRNAで処理して WARTS蛋白質をノックダゥン（knock- down) する試験を行い、 Omi を介するアポトーシスにおける効果を調べた。その結果、 Z- VAD- fmkと 2 μ ΙΑの STSの存在下にてコントロール s iRNAで処理した細胞では、 vi ab i l i tyが 38土 8. 5%であったが (図 1 8 ) 、 WARTS特異的な s iRNAを用いて WARTSの発現を充分に抑えた細胞群では、死に至った細胞数が 10土 1. 9%まで減少した（図 1 7、 1 8 ) 。これに対し、 HEK293細胞を用いた実験で、正常型の WARTS蛋白質を過剰発現させると、 Omiを介する細胞死が増加した（図 1 9、 2 0 ) 。これらの知見より、本発明者らは、 WARTS の発現ならびに WARTS と Omi との相互作用が、 Omi を介するアポトーシスに必要であることを初めて見出すに至った。

本願明細書における「0mi と WARTS の相互作用を亢進または抑制」における「相互作用を亢進」とは、 Omi蛋白質と WARTS蛋白質との相互作用の頻度を実質的に増加させることを意味し、ここでいう実質的にとは、 Omi と WARTSが直接相互作用（結合）する力、または、 WARTSと同質の生理作用を有する物質を Omi と相互作用させることにより Omiを活性化することを意味する。また、「相互作用を抑制」とは、 Omi と WARTS との相互作用の頻度を減少させることにより Omiを不活性化することを意味する。

本願明細書における「アポトーシスを調節する」とは、細胞のアポト一シスを誘導または抑制することを意味する。

( 1 )本発明における「アポトーシスを誘導する」方法とは、 Omi蛋白質と WARTS蛋白質とが相互作用し、且つ、 Omi による WARTS の蛋白質分解反応を亢進する方法に基づく。そのためには、（a)細胞内の Omiの量を増やす方法、 (b) WARTSの量を増やす方法または（c) Omi と WARTSの量いずれをも増やす方法を直接的にまたは間接的に行う手法が有効である。また、 WARTS蛋白質を増やす以外にも、例えば（d) WARTSと同等の生理活性を有する実質的に同質な蛋白質を細胞内に投与し増やす方法や（e) Omi に対して WARTS 蛋白質と同等の生理活性を発揮しうる化合物を投与して RTS活性を事実上亢進し Omi を活性化する方法、等が可能である。蛋白質量を増やす方法としては、蛋白質を直接添加する方法や、該蛋白質をコードする DNAを細胞に組み込んで発現させ間接的に増やす方法、等がある。ここで、実質的に同質な蛋白質とは、 Omi または WARTSそれぞれと活性の性質が同質であることを意味する。

(2)本発明における「アポトーシスを抑制する」方法とは、 Omi蛋白質と WARTS蛋白質との相互作用を抑制 ·阻害して WARTSの蛋白質分解反応を抑制する方法に基づく。そのためには、（a)細胞内の Omiの量を減らす方法、（b) WARTSの量を減らす方法または（c) Omi と WARTSの量いずれをも減らす方法を直接的にまたは間接的に行う手法が有効である。また、 WARTS蛋白質を減らす以外にも、例えば（d) Omiまたは MRTSの特異的抗体（モノクローナル抗体）を投与して Omi と WARTS との相互作用を阻害する方法、（e) Omi と WARTSとの相互作用を拮抗阻害し得るアンタゴニストを投与して Omiを不活性化する方法、等が可能である。

なお、 WARTS、 Omiおよび前記各種モノクローナル抗体は、当業者であれば自体公知の方法に同じかまたはそれに準じて容易に製造することができる。

本発明にかかるアポトーシス調節法は、各種癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等の治療または予防に有用であり、具体的疾患としては、例えば脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膝癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、リンホーマ、白血病、各種急性神経変性疾患、脳血管障害急性期、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素による神経障害、低血糖による神経障害、各種慢性神経変性疾患、ァルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、てんかん、肝性脳症、末梢神経障害、パーキンソン症候群、痙性麻痺、痛み、神経痛、精神分裂病、不安、薬物依存症、嘔気、嘔吐、排尿障害、緑内障による視力障害、抗生物質による聴覚障害、食中毒、感染性脳脊髄炎、脳血管性痴呆、髄膜炎による痴呆、神経症状、 HIV 性脳脊髄炎、各種脱髄性疾患（脳炎、急性散在性脳脊髄炎、多発性硬化症、急.性多発性根神経炎、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、 Marchifava-Bignami病、中心性橋延髄崩壊症、視神経脊髄炎、デビック病、パロ病、 HIV性ミエ口パシー、 HTLV性ミエ口パシー、進行性多巣性白質脳症、二次性脱髄性疾患（CNS エリテマト一デス、結節性多発動脈炎、シヱーダレン症候群、サルコィドーシス、乖離性脳血管炎等）等）等があげられる。また、本発明にかかる前記ァポトーシス調節法は、哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ィヌ、ゥマ、サル等）、特にヒトに用いられるのが好適である。

本発明にかかるアポトーシス調節法を用いれば、細胞内の WARTS蛋白質おょぴ Zまたは Omi蛋白質の量を調節することにより、容易にアポト —シスを誘導し或いは抑制することができる。

(1)例えば、癌細胞では、アポトーシス制御なされず、分裂 ·増殖が進行するが、本発明を癌細胞に適用して、 WARTSまたは Omi のいずれか一方、或いは WARTSと Omiの両方の量を増やすことにより、アポトーシスを誘導して癌細胞を細胞死させることができる。これを利用して抗癌剤を提供することもできる。特に、抗癌剤を投与された患者には耐性によりアポトーシスが起こりにくくなっている患者が多くみられ、該患者には本発明にかかるアポトーシス誘導法や医薬が極めて有効である。 WARTS または Omiの量を増やす方法としては、（a) WARTSまたは Omiを癌患者に投与して該患者の細胞内の WARTSまたは Omiの存在量を増やす方法や、 (b) RTSまたは Omiをコードする DNAを該患者に投与して該患者の生体内で発現させることにより細胞内の WARTSまたは Omiの存在量を増やす方法や、（c)治療等の対象である細胞に WARTSまたは Omiの蛋白質をコードする DNAを組み込んで発現させた後に、該細胞を対象患者の体内に移植して戻してやり、 WARTSまたは Omi の発現量を増やす方法、（e) WARTS または Omi と実質的に同質な蛋白質を投与または発現させる方法、等を用いることができる。

(2)これとは逆に、アポトーシスが亢進していると考えられる疾患（自己免疫疾患等）がある。本発明をこれらの疾患に適用して、 WARTS または Omiのいずれか一方、或いは WARTSと Omiの両方の量を減らすことにより、アポトーシスを抑制して疾患の治療または予防をすることができる。 WARTSまたは Omi の量を減らす方法としては、（a) WARTSまたは Omi の抗体を対象患者に投与して該患者の細胞内における WARTSと Omiの相互作用を阻害する方法や、（b) WARTSまたは Omiの発現を阻害する RNAを直接該患者に投与するか、あるいは該 RNAから逆転写して作成した DNA を該患者に投与して該患者の生体内で発現させることにより、細胞内の WARTSまたは Omiの発現量を減らす方法や、（c)治療等の対象である細胞に前記（b)記載の RNAまたは DNAを組み込んで発現させた後に、該細胞を対象患者の体内に移植して戻してやり、 WARTSまたは Omi の発現量を減らす方法、等を用いることができる。

本発明者らが見出した WARTSと Omi の相互作用を利用すれば、前記癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等、各種疾患の診断が容易に行える。即ち、 WARTSおよび/または Omi の細胞内蛋白質量を定量し、これらの数値を健常者のそれと比較して、数値が増加している被験者ではアポト一シスが亢進され（例えば自己免疫疾患患者）、逆に数値が低下している被験者ではアポトーシスが抑制されている（例えば癌患者）とする診断が可能である。ここで、 WARTSまたは Omi の蛋白質量の定量は、当業者に用いられる定量法を用いて容易に行うことができ、例えば ELISA法はじめ、各種免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、放射性同位元素標識）等の使用が可能である。

また、被験者の WARTSおよびまたは Omiの蛋白質量を定量して、健常者の WARTSと Omiの蛋白質量と比較することにより、該被験者においてアポトーシスが起こる程度を診断することが容易に可能である。更に、該診断に基づいて、癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等の診断も容易に実施可能である。特に、抗癌剤や、放射線治療による癌細胞の感受性の評価 ·診断が容易であるし、また、自己免疫疾患では、 Omiや WARTS の量的増加や活性上昇によりアポトーシスが亢進している可能性があることから、該疾患の診断法として有用である。

本発明は、アポトーシスを誘導または抑制する活性を有する化合物をスクリ一ユングするための新規な方法と、それに使用するスクリ一ニング用キットをも提供する。かかるスクリーニング法は、 WARTS 蛋白質おょぴ Zまたは Omi蛋白質を用いることを特徴とする方法である。例えば、動物の試料（血液、細胞、臓器、その他組織）を採取して、これらをそのまま用いる力、或いは、細胞または組織の粗酵素抽出液を用いるか Omi 蛋白質標本を調製して、適当な条件下において被検化合物を添加し、 Omi による WARTS蛋白質の分解量を定量し、阻害剤不存在下で WARTSを添加した場合の分解量と比較することにより、目的とする化合物をスクリ一ユングすることが容易に可能である。 WARTS の分解量の定量は、 WARTS を直接定量することにより分解量を求めるか、または、分解産物を直接定量することにより求めてもよい。定量法には、 WARTS またはその分解産物のモノクローナル抗体を用いる免疫染色法（ELISA 法を含む）が有効であり、当業者であれば容易に実施することができる。

前記スクリ一ユング法により得られる化合物は、アポトーシスを誘導または抑制する作用を有する化合物であり、前記各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療や予防に有用である。

本発明は新規な医薬組成物をも提供する。本発明にかかる医薬組成物は、（l) WARTS蛋白質、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩、および Zまたは（2) 0mi蛋白質、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩を有効成分として含む医薬組成物と、前記スクリーニング法により得られうる化合物またはその塩を含む医薬組成物であり、医薬の有効成分としては新規な蛋白質または化合物を含有し、該医薬組成物は、前記各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療や予防に有用である。

前記塩は、薬理学的に許容される塩である限りにおいて特に種類は限定されず、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などの無機酸の付加塩；酢酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、トリフルォロ酢酸塩などの有機カルボン酸の付加塩；メタンスルホン酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、タウリン塩などの有機スルホン酸の付加塩；トリメチルァミン塩、トリェチルァミン塩、ピリジン塩、プロ力イン塩、ピコリン塩、ジシクロへキシルァミン塩、 N , N ' —ジベンジルエチレンジァミン塩、 N—メチルダルカミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチルァミノ）メタン塩、フエネチルベンジルァミン塩などのァミンの付加塩；アルギニン塩、リジン塩、セリン塩、グリシン塩、ァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸の付加塩等が好適である。

本発明にかかる医薬組成物を医薬として使用する場合は、投与形態は特に限定されず、経口でも非経口的投与でもよい。哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ィヌ、ゥマ、サル、等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類等によって異なり特に限定されないが、 30 _§ ないし 10g、好ましくは 100 ^ gないし 500mg、さらに好ましくは 100 μ gないし lOOmgを、注射投与で約 1 ないし 3000 μ §/1¾、好ましくは 3ないし lOOO ^ g/kgを、それぞれ 1回または数回に分けて投与することができる。本発明にかかる医薬組成物は、蛋白質またはその塩、あるいは化合物またはその塩をそのまま用いるか、または自体公知の薬学的に許容できる担体等と混合し、慣用される方法により製剤化することが可能である。好ましい剤形としては錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等があげられる。製剤化には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壌剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、 p H調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化可能である。

例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクヮラン、固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸ォクチルドデシル、ミリスチン酸ィソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、ベへニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸ェステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリォキシプロピレンプロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシェチノレセノレロース、ポリアクリル酸、カノレポキシビニノレポリマー、ポリエチレングリコー/レ、ポリビエノレピロリドン、メチノレセノレロースなどの水溶性高分子；ェタノール、ィソプロパノールなどの低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖などの糖；無水ケィ酸、ケィ酸アルミニウムマグネシウム、ケィ酸アルミニウムなどの無機粉体；精製水などがあげられる。賦形剤としては、例えば乳糠、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等；結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビエルエーテル、メチノレセルロース、ェチノレセノレロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シ工ラック、ヒドロキシプロピノレセノレ口ース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ポリビニノレピロリドン、ポリプロピレングリコール · ポリオキシエチレン · ブロックポリマー、メダルミン、クェン酸カルシウム、デキストリン、ぺクチン等；崩壌剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシゥム、炭酸水素ナトリゥム、クェン酸カルシウム、デキストリン、ぺクチン、カルボキシメチルセルロース 'カルシウム等；滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシゥム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油、等；着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものであれば、いかなるものでもよく；矯味矯臭剤としては、ココア末、ハツ力脳、芳香散、ハツ力油、竜脳、桂皮末等；抗酸化剤としては、ァスコルビン酸、 α—トコフエロール、等、医薬品に添加することが許可されているものがそれぞれ用いられる。経口製剤は、賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。

錠剤 ·顆粒剤の場合には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。

シロップ剤、注射用製剤、点眼剤、等の液剤の場合は、 p H調整剤、溶解剤、等張化剤、等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁化剤、抗酸化剤、等を加えて、常法により製剤化する。該液剤の場合、凍結乾燥物とすることも可能で、また、注射剤は静脈、皮下、筋肉内に投与することができる。懸濁化剤における好適な例としては、メチノレセノレロース、ポリソノレべ一ト 8 0、ヒドロキシェチノレセノレロース、ァラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、等；溶解補助剤における好適な例としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート 8 0、ニコチン酸ァミド、ポリォキシエチレンソルビタンモノラウレート等；安定化剤における好適な例としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等；保存剤における好適な例としては、ノラオキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロ口タレゾール等があげられる。

外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能で、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、必要に応じ、 p H調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、' 香料などを添加することができる。さらに、必要に応じて分化誘導作用を有する成分、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤、等の成分を配合することもできる。

以下に示す本発明の参考例、実施例および試験例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。

実施例 1 酵母ツーハイブリット法

WARTS のカルボキシル末端 20 アミノ酸の塩基配列を導入した pAS2-lc/SS発現ベクターを作成した。酵母 CG1945株を用い、 pAS2- lc/SS 安定発現株を樹立した。この株を HeLa cDNA l ibrary発現ベクターを用いて形質転換し、栄養要求性の変化（Hi s+) 、 beta- gal活性の有無を指標にスクリ一二ングを行った。 9. 3 X 10⁶個の独立したクローンより最終的に 540個の発現クローンを得た。

実施例 2 細胞培養、トランスフヱクシヨン

HeLa, C0S7, HEK293, 293T細胞は 10%仔牛血清加 DMEM/F12培地にて 37°C、 5%C0₂の条件下に培養した。トランスフヱクシヨンは FuGENE6または LipofectAMINE, PLUS reagentを用い標準的手法にて行った。

実施例 3 発現ベクター、特異的抗体

培養細胞の発現ベクターは p CGN， pcDNA3 ベクターを用いた。大腸菌発現ベクターは pGEX-2TH， pGEX4T-lベクターを用いた。 PCRにて増幅した塩基断片をこれらベクターに挿入して発現ベクターを得た。変異導入へクターは Stratagene社の s ite directed mutagenes is kitを用レヽ作成した。

各々の特異的抗体は、大腸菌を用いて作成し、精製した以下のリコンビナント蛋白をゥサギ（Newzealand white)またはラット（Wi ster rat)に注入して作成した。

WARTS60 - 4： GST-WARTS (a. a. 136-700) 、ゥサギ

RC70： Hi s- Omi (a. a. 362-458)、ラット

C70： GST-Omi (a. a. 362-458)、ゥサギ

他の市販抗体は以下より得た。

抗 FLAG抗体（M2) ： SIGMA, 抗 HA抗体（ 3 F10) ： Roche, 抗 GST抗体： Pharmacia,

抗 tubul in (B- 5- 1- 2)抗体： SIGMA, 抗 PARP p85抗体： Promega 実施例 4 GSTおよぴ免疫沈降実験

GST 沈降実験は以下の如く行った。細胞に発現ベクターをトランスフェクションした後、 5%NP-401ysi s buffer (0. 5%NP-40, 25mM Tri s - Cl， pH 7. 5， 137mM NaCl, ImM EDTA, 5% glycerol, ImM DTT, 20mM β -glycerophosphate, ImM sod

ium vanadate, 2 μ g/ml aprotinin, ImM AEBSF, 10 M leupeptin, and ImM p

epstatin) を用レヽ可溶ィ匕した。この可溶ィ匕溶液を glutathione-agarose に結合させた GSTまたは GST - Omi (a. a. 362 - 458)と混合沈降した後、 SDS 電気泳動、ウェスタンプロットにて解析した。なお、免疫沈降および試験管内結合試験は Hirotaら（JCB 149, 1073, 2000) の方法に拠った。実施例 5 試験管内プロテアーゼ実験

大腸菌に発現させた全長 0mi、不活性 Omi (S306A)は Ni- agarose beads を用い精製した。これらリコンビナント蛋白の濃度は BCA法にて求めた。バキユウロウィルスを用いて作成した全長 WARTS を前述した Omi また Omi (S306A)と共に 50mM Tri s溶液内で 37°Cで 2時間ィンキュペートし、試験管内プロテアーゼ実験を行った。これらを SDS電気泳動、ゥエスタンプロットにて解析した。実施例 6 細胞蛍光免疫染色

35mm petri dishに培養した細胞を 4% paraf ormaldehyde/PBS (pH7. 5) にて固定したのち、 0. 2% Triton X - 100/PBSにて 15分処理した。 PBSでの洗浄後、一次抗体として rabbit anti-WARTS 抗体（60- 4)， mouse ant:L - F G抗体（M2)、二次抗体として FITC- conjugated ant :i- rabbit IgG ίτΜ本 (Bioresource) まには Texas red-conjugated ant i-mouse IgG 饥体 (Molecular Probes) を用い、免疫染色を行った。これらの検体は共焦点レーザー顕微鏡（Olympus) を用いて観察した。

実施例 7 RNA干渉法

HeLa細胞を 6ゥエルプレートに各ゥエル 2 X 10⁴個ずっ播き、 1 日培養した後に siRNAをトランスフェクションした。 siRNA二量体の作成およぴトランスフエクシヨン手技は Elbashir ら（Nature 411, 494, 2001) の方法に拠った。トランスフエクション後 86時間目に、スタウロスポリンを加え、さらに 12時間培養を行ったのち細胞を回収した。これらの一部を SDS電気泳動、ウェスタンプロットに供し、細胞死判定はトリパンブルー染色排除試験にて行った。 _s iRNA オリゴヌクレオチドは日本バイォサービスより得た。配列は以下の如くである。

Control sense, 5' -AGCCAUCUGAUGCCGCAAAdT dT- 3'；

Control anti sense, 5' -UUUGCGGCAUCAGAUGGCUdTdT-3'；

WARTSsense, 5， - AUUCGGGAAUCCCUUAGGA dTdT- 3'；

WARTS anti sense, 5' - UCCUAAGGGAUUCCCGAAUdTdT - 3' ;

Omi sense, 5' - CGG CUCAGGAUUCGUGGUGdTdT-3'；

Omi anti sense, 5' -CACCACGAAUCCUGAGCCGdTdT-3'

実施例 8 細胞死誘導試験

35mm petri dish 【こ培養した HEK293 糸田月包（こ Lipof ectAMINE, PLUS reagentを用いて以下の発現ベクターを共トランスフエクシヨンした。 0. 1 μ g pEGFP (膜局在 GFP)

0. 05 μ g FLAG-成熟型 Omi

2 μ gの pCGN全長またはカルボキシル末端 3ァミノ酸欠失 A VYV WARTS (非結合型）

トランスフエクシヨン後 24時間目に細胞を固定、 PI染色を行った。死細胞は蛍光顕微鏡観察での細胞胞体および核の形態変化により判定した。

実施例 9

本発明にかかるアポトーシス調節法または医薬の、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患への有効性は、いずれも公知の手法に準じて容易に試験可能である。例えば、ヒト大腸癌に対する抗癌効果は以下のように確認可能であった。即ち、ヒト大腸癌株 HCT15 (ATCC) を、 5% 炭酸ガスインキュベータ一にて RPMIIMO ( 10%FBS含）で約 80%コンフルェントとなるまで培養し、その後細胞を回収して、該細胞懸濁液を用意したヌードマウスの体側皮下に移植した。所定の平均腫瘍体積に成長した後、本発明にかかる医薬を投与して腫瘍体積を観察し、効果を調べた。なお、腫瘍体積 =腫瘍長径（mm) X腫瘍短径（mm) ²/2の計算式にて計算をした。 . その結果、本発明にかかる医薬組成物は優れた抗癌作用を示した。その他の各種自己免疫疾患およぴ神経変性疾患においても同じく優れた治療効果を示した。

産業上の利用可能性

本発明により、新規なアポトーシス調節方法を提供することができ、該方法により、アポトーシスの誘導または抑制ができるようになった。

また、本発明にかかるアポトーシス調節方法を用いることにより、新規な医薬組成物、新規な疾患の治療法および予防法を提供することができた。本発明にかかる前記医薬組成物、治療法および予防法は、アポトーシスの調節が有効な疾患（例えば、癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患）の治療 ·予防に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「WARTS」と称する。）と配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「0mi」と称する。）の間における相互作用を亢進または抑制することを含む、細胞のアポトーシス調節方法。

2 . 細胞内における Omiおよびノまたは WARTSの量を増加させることによりアポトーシスを誘導することを特徴とする、請求項 1に記載のァポトーシス調節方法。

3 . 細胞内における Omi と WARTSの間における相互作用を阻害することによりアポトーシスを抑制することを特徴とする、請求項 1に記載のアポトーシス調節方法。

4 . (1)細胞に外部より Omiおよび Zまたは WARTS、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（2) Omiおよびノまたは WARTSをコードする DNAで組換えた組換えべクターを与えて細胞を形質転換すること、（3) Omiおよびまたは WARTSをコードする DNAで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、まだは（4) 0mi および/または WARTSのモノクローナル抗体を外部より加えることによって RTSと Omi の相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、請求項 1に記載のアポトーシス調節方法。

5 . (1) WARTS, それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩、または（2) 0mi、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩を有効成分として含む、医薬組成物。

6 . アポトーシスを調節するための医薬である、請求項 5に記載の組成物。

7 . 各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、請求項 5記載の組成物。

8 . 請求項 1に記載の方法を用いることを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療または予防法。

9 . (1)細胞に外部より Omiおよび/または WARTS、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（2) Omiおよび Zまたは WARTSをコードする DNAで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（3) Omiおよぴ /または WARTSをコードする DNAで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（4) 0mi および/または WARTSのモノクローナル抗体を外部より加えることによって WARTSと Omi の相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、請求項 8に記載の治療または予防法。

1 0 . WARTSおよび/または Omi の蛋白質量を定量することにより細胞にアポトーシスの起こる程度を評価することを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の診断方法。

1 1 . Omiおよび Zまたは WARTS を用いることを特徴とする、アポト一シス調節活性を有する化合物のスクリ一二ング方法。

1 2 . Omiおよび Zまたは WARTS を用いることを特徴とする、アポト一シス調節活性を有する化合物のスクリ一二ング用キット。

1 3 . 請求項 1 1に記載のスクリ一ユング法または請求項 1 2に記載のスクリーニング用キットの使用により得られうる、アポトーシス調節活性を有する化合物またはその塩。

1 4 . 請求項 1 3に記載の化合物またはその塩を含む医薬組成物。

1 5 . 各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、請求項 1 4に記載の組成物。