JPWO2004030688A1 - 蛋白間相互作用を調節することによる新規アポトーシス調節方法と、それを用いる医薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｏｍｉを介するカスパーゼ非依存性アポトーシス機構の優れた調節法、即ち、ＷＡＲＴＳ蛋白質とＯｍｉ蛋白質の相互作用を亢進または抑制することを含む、細胞の新規アポトーシス調節方法、例えば（１）細胞に外部よりＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳ、またはそれらに実質的に同質な蛋白質を加えること、（２）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（３）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、等によってＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、前記アポトーシス調節方法、を提供するとともに、アポトーシスが関与する各種疾患の治療または予防に有効な新規医薬組成物を提供する。

Description

本発明は細胞のアポトーシスを誘導する方法、ならびに該方法を用いる各種治療法、予防法、および医薬に関する。

細胞死は、形態学的な特徴に基づいてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｋｅｒｒ、Ｗｙｌｌｉｅ及びＣｕｒｒｉｅ：１９７２年）とネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とに分類される。ネクローシスが細胞の障害、酸素欠乏、栄養不足等の刺激による受動的な細胞死・細胞崩壊（壊死）であるのに対し、アポトーシスはｐｒｏｇｒａｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈとも呼ばれる遺伝子的に制御された細胞死で、多細胞生物の個体発生の過程と恒常性維持に必要な普遍的プロセスである。アポトーシスの過程では、細胞内外の様々な生理的・病理的因子が細胞死の開始のシグナルとして働き、多様な経路をたどって細胞中に情報伝達される。（１）核全体の凝縮・縮小（染色体凝集、染色体ＤＮＡの断片化）；（２）細胞縮小・空胞化（細胞質凝集）；（３）細胞表面の微絨毛消失による平滑化；（４）細胞の断片化によるアポトーシス小体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）の形成；（５）マクロファージ等によるアポトーシス小体の貪食；という一連の形態変化を生じるのが特徴である。近年に至って、細胞死制御における変化（抑制、低下等）は、癌、自己免疫疾患、脱髄性疾患等、多くのヒト疾患の病因の一つにであると考えられている。
システインプロテアーゼのファミリーの一つであるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）は、アポトーシス機構における中心的蛋白質と考えられているが、一方で、遺伝子のノックアウトまたは各種阻害剤でカスパーゼを不活性化しても、殆どのアポトーシス刺激剤で細胞死が起きることから、カスパーゼの活性化が細胞死に必ずしも必要ではないことが明らかとなっている。カスパーゼ依存的アポトーシス以外にもカスパーゼ非依存的経路があって、該非依存的経路が並列的に機能していると考えられている。
アポトーシスシグナル伝達において、ミトコンドリアが重要な役割を担うことが知られている。細胞死刺激剤によって、ミトコンドリアはシトクロームｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−ｃ）、ＡＩＦ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、カスパーゼ・チモーゲン（ｃａｓｐａｓｅ ｚｙｍｏｇｅｎ）等、様々なアポトーシス誘導因子を遊離する。該因子の一つであるミトコンドリア蛋白質Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、アポトーシスを促進するカスパーゼ活性化蛋白質で、ターゲットシークエンスが切断されて成熟型になると、アポトーシス刺激剤の刺激に応答して細胞質へ放出され、そこでアラニン残基で始まるＮ末端部位がアポトーシスタンパク質阻害因子ＩＡＰ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＢＩＲ３およびＢＩＲ２ドメインに結合し、ＩＡＰのカスパーゼ阻害作用を抑えることが知られている。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアポトーシス誘導蛋白質であるＲｅａｐｅｒ、Ｈｉｄ、およびＧｒｉｍも、同様にアラニン残基で始まる自身のＮ末端部位を通じてＩＡＰと相互作用してカスパーゼを活性化する作用を有し、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、構造的にも機能的にも、ショウジョウバエのアポトーシス誘導蛋白質のヒトホモログ蛋白質であると考えられている。
ミトコンドリアのセリンプロテアーゼであるＯｍｉ／ＨｔｒＡ２（以下、「Ｏｍｉ」と略す。）も、ショウジョウバエのアポトーシス誘導蛋白質に対するヒトホモログ蛋白質とされる。ＯｍｉはそのＣ末端にＰＤＺドメインとよばれるドメインを有しており、該ＰＤＺドメインは、様々な調節蛋白質に見られるドメインで、蛋白質ターゲッティングや蛋白質複合体形成において重要な役割を担っていることで知られる。Ｏｍｉは、アポトーシス誘導刺激に応じてミトコンドリアの膜間スペースから細胞質に放出されて、異なる２つの機序で細胞死を引き起こすことが明らかになっている。第１の機序は、Ｎ末端が切り出されて形成された成熟型Ｏｍｉの更にこのＮ末端モチーフがＩＡＰに結合してＩＡＰのカスパーゼ活性化阻害を遮断する機序；第２の機序は、カスパーゼの活性化を経ずにＯｍｉプロテアーゼ活性依存的に細胞死を誘導する機序である。最近の研究から、ＯｍｉにおけるＩＡＰ結合モチーフが必ずしも全哺乳動物に保存されたものではないことがわかっている。
ｗａｒｔｓ遺伝子（ｗｔｓまたはｌａｔｓとして知られる。）は、当初ショウジョウバエの癌抑制遺伝子として同定され、セリン／トレオニンリン酸化酵素をコードする遺伝子で、多くの分裂過程に関与する筋緊張性ジストロフィー蛋白質リン酸化酵素（ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：ＤＭＰＫ）ファミリーとの間に高度な相同性を有する。このｗｔｓ遺伝子に関して、ｗｔｓ遺伝性の突然変異を有するハエの体細胞は巨大化して組織中に大きな腫瘍を形成するとの報告があり、ｗｔｓはショウジョウバエの細胞の形態形成・増殖に関わっていると考えられている。
一方、ＷＡＲＴＳ／ＬＡＴＳ１（以下、「ＷＡＲＴＳ」と略記する。）は、ｗｔｓに対する哺乳類ホモログ遺伝子として同定された（例えば、特許文献１参照）。ショウジョウバエの場合と同様、ＷＡＲＴＳ遺伝子が欠損したマウスでも悪性腫瘍の形成がみられたとの報告もあり、ＷＡＲＴＳは哺乳動物細胞において癌抑制遺伝子として機能していると考えられている。本発明者らは、かつて、分裂期にＷＡＲＴＳが分裂装置に動的に局在し、そこでＺｙｘｉｎというアクチン重合促進蛋白質と相互作用していることと、ＷＡＲＴＳがＺｙｘｉｎを含む複合体を形成して分裂制御において中心的働きを担っていることとを報告している。
前記ＯｍｉによるＩＡＰ結合とそれによるＩＡＰ活性阻害が細胞死（アポトーシス）に必須であるとは必ずしもいえず、Ｏｍｉ誘導細胞死においては、これ以外に、カスパーゼ非依存性経路が重要な役割を担っていると考えられる。
一方、ＷＡＲＴＳが機能しない場合、クロモソーム不安定化に至る通常の細胞分裂が進行しないというだけの事実で、ＷＡＲＴＳ蛋白質の癌抑制作用を説明し解明するのは不可能であり、より詳細なＷＡＲＴＳの機能解明が必要である。
他方、アポトーシスの抑制または低下は、各種癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、等の疾患の病因に関与していると考えられ、アポトーシス機序の解明は、前記各種疾患を治療・予防するための方法とそのための薬剤の開発とを可能にすると期待することができる。
即ち、本発明の目的は、Ｏｍｉプロテアーゼの活性化機構、および、Ｏｍｉを介するカスパーゼ非依存的アポトーシスの経路・機序を明らかにすることにより、Ｏｍｉを介するカスパーゼ非依存的アポトーシスの調節法（誘導・抑制法）を探索し見出すこと、並びに、アポトーシスが関与する各種疾患の治療法、予防法およびそのための医薬を見出すこと、にある。
特開平１１−０８９５８０号公報（配列表における配列番号：１）

本発明者らは、上記事情に鑑みて精力的に検討と研究を重ねた。その結果、予想外にも、
（１）ＷＡＲＴＳのＣ末端２０アミノ酸を使ったスクリーニングにより、ＷＡＲＴＳのＣ末端の３個のアミノ酸（Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ）とＯｍｉ ＰＤＺドメインとが直接結合すること；
（２）正常型Ｏｍｉ／プロテアーゼ不活性型（Ｓ３０６Ａ）Ｏｍｉのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイで、全長ＷＡＲＴＳはＯｍｉにより切断されるが、Ｃ末端結合部位を欠失させたＷＡＲＴＳは切断を受けないこと；
（３）細胞質内局在を呈するＯｍｉを過剰発現させると細胞内でも内因性ＷＡＲＴＳが切断を受けること；ならびに
（４）スタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）によるアポトーシス刺激でも細胞内ＷＡＲＴＳの切断が生じたこと、等を見出した。そして、研究を継続した結果、
（５）成熟型Ｏｍｉの基質はＷＡＲＴＳ蛋白質であり、両者の相互作用によってＯｍｉが活性化されること；
（６）Ｏｍｉを介するカスパーゼ非依存性アポトーシス過程にはＯｍｉとＷＡＲＴＳの相互作用が必要不可欠であること；とを初めて見出して、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、［１］配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「ＷＡＲＴＳ」と称する。）と配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「Ｏｍｉ」と称する。）の間における相互作用を亢進または抑制することを含む、細胞のアポトーシス調節方法；［２］細胞内におけるＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳの量を増加させることによりアポトーシスを誘導することを特徴とする、前記［１］に記載のアポトーシス調節方法；［３］細胞内におけるＯｍｉとＷＡＲＴＳの間における相互作用を阻害することによりアポトーシスを抑制することを特徴とする、前記［１］に記載のアポトーシス調節方法；［４］（１）細胞に外部よりＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳ、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（２）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（３）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（４）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳのモノクローナル抗体を外部より加えることによってＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、前記［１］に記載のアポトーシス調節方法；
［５］（１）ＷＡＲＴＳ、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩、または（２）Ｏｍｉ、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩を有効成分として含む、医薬組成物；［６］アポトーシスを調節するための医薬である、前記［５］に記載の組成物；［７］各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、前記［５］記載の組成物；［８］前記［１］に記載の方法を用いることを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療または予防法。
［９］（１）細胞に外部よりＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳ、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（２）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（３）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（４）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳのモノクローナル抗体を外部より加えることによってＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、前記［８］に記載の治療または予防法；［１０］ＷＡＲＴＳおよび／またはＯｍｉの蛋白質量を定量することにより細胞にアポトーシスの起こる程度を評価することを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の診断方法；［１１］Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳを用いることを特徴とする、アポトーシス調節活性を有する化合物のスクリーニング方法；［１２］Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳを用いることを特徴とする、アポトーシス調節活性を有する化合物のスクリーニング用キット；［１３］前記［１１］に記載のスクリーニング法または前記［１２］に記載のスクリーニング用キットの使用により得られうる、アポトーシス調節活性を有する化合物またはその塩；［１４］前記［１３］に記載の化合物またはその塩を含む医薬組成物；［１５］各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、前記［１４］に記載の組成物、に関する。

図１は、各種試験に用いたＷＡＲＴＳとＯｍｉの各種発現フラグメントを示す。
図２は、バキュロウイルスで産生したＷＡＲＴＳ全長タンパクとＧＳＴ−Ｏｍｉの結合実験を示す。
図３は、ＷＡＲＴＳがＯｍｉのＰＤＺと特異的に結合することを示す。
図４は、ＷＡＲＴＳのＣ末端３アミノ酸がＯＭＩとの結合に必須であることを示す。
図５は、Ｏｍｉに対する抗体の作成と、その特異性の検定を示す。
図６は、内在性Ｗａｒｔｓの免疫沈降とＯｍｉの検出を示す。
図７は、活性型Ｏｍｉによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＷＡＲＴＳ分解を示す。
図８は、ＷＡＲＴＳのＣ末端欠失蛋白質がＯｍｉと結合できず蛋白質分解を受けないことを示す。
図９は、各種試験に用いたＯｍｉの各種発現フラグメントと細胞内での局在を示す。
図１０は、前記図９のＯｍｉをＷＡＲＴＳ全長の発現プラスミドと共にトランスフェクションしてＷＡＲＴＳのレベルを比べた結果を示す。
図１１は、細胞内Ｏｍｉ発現によるＷＡＲＴＳレベルの変化を示す。
図１２は、前記図１１の定量化を示す。
図１３は、Ｏｍｉの発現をｓｉＲＮＡで抑えた時のＷＡＲＴＳ発現量を示す。
図１４は、Ｏｍｉの発現をｓｉＲＮＡで抑えてスタウロスポリン刺激を与えた時の細胞死の割合を示す。
図１５は、ＷＡＲＴＳ分解におけるスタウロスポリンの影響を示す。
図１６は、カスパーゼ阻害剤とスタウロスポリンの存在下でＷＡＲＴＳが分解されることを示す。
図１７は、ＷＡＲＴＳの発現がｓｉＲＮＡで抑えられることを示す。
図１８は、ＷＡＲＴＳの発現をｓｉＲＮＡで抑え、ｚ−ｖａｄ−ｆｍｋ存在下スタウロスポリン刺激で有意に細胞死が抑制されたことを示す。
図１９は、細胞にＯｍｉとＷＡＲＴＳを一緒にトランスフェクションした時の細胞死を示す。
図２０は、前記図１９の実験の顕微鏡像を示す図である。

次に、本発明の実施の形態について、記号、用語等の意義を示しつつ説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
本発明にかかるアポトーシス誘導方法は、ＷＡＲＴＳ蛋白質とＯｍｉ蛋白質との相互作用を用いる点に第１の特徴がある。これまで、アポトーシス誘導に必要不可欠なＯｍｉ蛋白質がどのような機構でアポトーシスを誘導するのかが、全く知られていなかったが、本発明者らによりそれが明らかとなった。即ち、本発明者らは、以下の検討と試験の結果、ＷＡＲＴＳ蛋白質がＯｍｉプロテアーゼの基質であり、ＯｍｉはＷＡＲＴＳとの相互作用によって活性化される機構と、そして、ＷＡＲＴＳ蛋白質とＷＡＲＴＳ−Ｏｍｉ相互作用がアポトーシス誘導に必要であることとを見出したものである。
なお、ＷＡＲＴＳ蛋白質は配列表の配列番号：１、Ｏｍｉ蛋白質は配列表の配列番号：２で示すアミノ酸配列を有する。
（１）ＷＡＲＴＳのＯｍｉ ＰＤＺドメインへの結合
以下に示すように、酵母ツーハイブリッド（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）スクリーニング法を用いて、ＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリーを探索した。ＷＡＲＴＳのＣ末端２０アミノ酸（Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ；図１に示されるＳＳフラグメント）を含むＧａｌ４−結合ドメイン融合蛋白質を作製し、該ＳＳフラグメントをｂａｉｔとしてＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、８個の独立且つ配列の重なった同じ遺伝子のｃＤＮＡクローンが得られ、これらはセリンプロテアーゼＯｍｉ／ＨｔｒＡ２であることがわかった（図１）。
ＯｍｉがＷＡＲＴＳに直接的に結合することは、以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって示された。即ち、単離したＯｍｉ／Ｃ７０のｃＤＮＡ断片を細菌の発現ベクターｐＧＥＸにクローニングし、ＧＳＴ−Ｏｍｉ／Ｃ７０またはＧＳＴをグルチオン−アガロースビーズ上に固定した。ＷＡＲＴＳに対するＯｍｉ ＰＤＺドメインの特異性を示すために、ＮＥ−ｄｌｇの３つのＰＤＺドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質も使用した。結果、バキュロウィルスで作製して精製した全長ＷＡＲＴＳはＧＳＴ−Ｏｍｉ／Ｃ７０とは共沈したが、ＧＳＴ−ＮＥ−ｄｌｇ ＰＤＺやＧＳＴ単独では見られなかった（図２）。
また、同由来のＷＡＲＴＳを、全長ＧＳＴ−ＯｍｉまたはＧＳＴ−ＯｍｉΔＰＤＺ融合蛋白質とインキュベートしたところ、全長ＧＳＴ−ＯｍｉはＷＡＲＴＳと結合したがＧＳＴ−ＯｍｉΔＰＤＺ融合蛋白質はしなかった（図３）。即ち、Ｏｍｉ ＰＤＺドメインはＷＡＲＴＳとの相互作用に特異的なドメインであることが示された。
ＰＤＺドメインを含む殆どの蛋白質は、自己のＣ末端配列を介してターゲットに結合することで知られるが、ＷＡＲＴＳにおいても、やはり、ＰＤＺドメインとの結合に用いられる共通モチーフ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｏｔｉｆ）に同じようなＣ末端ＤＬＶＹＶが見出されている。Ｃ末端とＯｍｉとの相互作用を確認する目的で、ＨＡタグを有するＷＡＲＴＳΔＮ１（図１）、ΔＮ１−ΔＳＳおよびΔＮ１−ΔＶＹＶを発現しているＣＯＳ７細胞のＬｙｓａｔｅ（可溶化液）を、グルチオン−アガロースビーズに固定したＧＳＴ−Ｏｍｉ／Ｃ７０とインキュベートしたところ、ΔＮ１−ΔＳＳもΔＮ１−ΔＶＹＶもＧＳＴ−Ｏｍｉ／Ｃ７０に結合しなかったが、ΔＮ１は結合をした（図４）。即ち、ＷＡＲＴＳのＣ末端のＶＹＶはＯｍｉ蛋白質と相互作用をすることが示された。
更に、ＷＡＲＴＳとＯｍｉとのｉｎ ｖｉｖｏにおける物理的相互作用を試験する目的で、細菌で精製したＨｉｓ^６−ｔａｇｇｅｄ Ｏｍｉ／Ｃ７０蛋白質をラットに注入して、アフィニティーで精製し、抗Ｏｍｉ抗体ＲＣ７０を作製した。ＲＣ７０の特異性はウェスターンブロッティングで確認した。Ｃ末をＦＬＡＧでタグした全長ＯｍｉをＣＯＳ７細胞に発現させ、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２）で免疫沈降させたところ、該複合体のＯｍｉ−ＦＬＡＧはＲＣ７０抗体により認識された（図５）。また、内在性のＷＡＲＴＳを抗ＷＡＲＴＳ抗体（Ｇ３）でＨａＬａ細胞のＬｙｓａｔｅを処理したところ、ＲＣ７０抗体は当該免疫沈降に内在性Ｏｍｉの成熟型をとらえた（図６）。即ち、ＷＡＲＴＳはｉｎ ｖｉｖｏでＯｍｉの成熟型と相互作用していることが示された。
（２）ＯｍｉによるＷＡＲＴＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解反応
ＷＡＲＴＳがＯｍｉプロテアーゼの基質であるかを確認すべく、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアーゼアッセイを行った。全長ＷＡＲＴＳを精製し、細菌に生産させたＯｍｉと３７℃でインキュベートし、抗ＷＡＲＴＳ抗体（Ｃ２）とイムノブロッティングして解析した（図７）。ＷＡＲＴＳ蛋白質量は野生体（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の組換えＯｍｉとのインキュベーションで濃度依存的に減少し、一方で、プロテアーゼ不活性なＯｍｉ変異体（Ｓ３０６：以下、Ｓ／Ａと称する。）はＷＡＲＴＳ蛋白質量に何ら影響を与えなかった。更に、セリンプロテアーゼ阻害剤であるＮ−トシルリシンクロロメチルケトン（Ｎ−ｔｏｓｙｌｌｙｓｉｎｅ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ：ＴＬＣＫ）が野生体Ｏｍｉのプロテアーゼ活性を阻害することが示された。即ち、Ｏｍｉはｉｎ ｖｉｔｒｏでＷＡＲＴＳを蛋白質分解することが示された。
次に、Ｎ末が切断されたＷＡＲＴＳ（ΔＮ２）と更にこれのＣ末端３アミノ酸を欠失させたＷＡＲＴＳ（図１のΔＮ２−ΔＶＹＶ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアーゼアッセイを行った。ＨＡタグをしたこれらのＷＡＲＴＳ変異体は、ＣＯＳ７細胞に発現され、ＨＡ−アフィニティーマトリックスクロマトグラフィーで精製後、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアーゼアッセイに用いられた。結果、ΔＮ２はＯｍｉ野生体によって直接消化されたがプロテアーゼ不活性なＳ／Ａ Ｏｍｉには消化されなかった（図８）。これに対し、Ｏｍｉが結合できない変異体ΔＮ２−ΔＶＹＶは、Ｏｍｉの野生体とインキュベートしても蛋白質分解を受けなかった。従って、Ｏｍｉ ＰＤＺドメインとＷＡＲＴＳのＣ末端領域は、ＯｍｉによるＷＡＲＴＳの消化に必要であることが示された。
（３）Ｏｍｉのｉｎ ｖｉｖｏ基質（ＷＡＲＴＳ）の確認
図９に示す様々なフォームのＯｍｉを全長ＷＡＲＴＳとともに過剰発現させた時のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＷＡＲＴＳの量を調べた。２４時間のトランスフェクションの後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗ＷＡＲＴＳ抗体（Ｃ２）とのイムノブロッティングを行ったところ、図１０に示すように、成熟型Ｏｍｉの過剰発現によってＷＡＲＴＳの発現が減少し（図１０のｌａｎｅ４）、野生体の全長ＯｍｉをトランスフェクトしたものでもＷＡＲＴＳの発現が減少したが（図１０のｌａｎｅ２）、しかしながら、プロテアーゼ不活性な変異体Ｏｍｉ（全長または成熟型）では、ＷＡＲＴＳの発現量には何ら影響が見られなかった（図１０のｌａｎｅ３と５）。
本発明者らは、ミトコンドリアリーダー配列を欠損するＯｍｉは細胞質に局在するが、全長Ｏｍｉは核とミトコンドリア内に局在することを、実験的に示した（図１１）。図１１で示されるように、様々なＯｍｉ関連蛋白質でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞において、成熟型のＯｍｉを発現させると内在性のＷＡＲＴＳの染色が減少するが、プロテアーゼ不活性にしたＯｍｉ（Ｓ／Ａ）ではＷＡＲＴＳ染色に何ら影響を与えなかった。既に報告されているように、成熟型のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ Ｏｍｉを過剰に発現させると、クロマチン凝集や細胞質凝集といった細胞死の形態を呈することがわかっているが、本発明者らは、ＷＡＲＴＳの染色に対応してこれらの形態変化が発現することを示した（図１１）。同時に、全長ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ Ｏｍｉの発現により、内在性ＷＡＲＴＳの発現が減少した細胞の割合が増加することを見出した（図１２）。図１２で示す結果は、図１０における解析結果に合致するものである。
更に、本発明者らは、内在性ＯｍｉのＷＡＲＴＳ発現調節への関与を確認する目的で、二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いるＲＮＡ干渉法により、二本鎖ＲＮＡでトランスフェクトして遺伝子発現を抑制（破壊）する試験、ここでは、ＨｅＬａ細胞のＯｍｉの発現を破壊して、その効果を見た。その結果、Ｏｍｉの発現を抑制（破壊）し内在するＯｍｉの発現量を減少させると、内在性ＷＡＲＴＳの発現量が有意に増加することが示された（図１３）。
以上の知見に基づいて、本発明者らは、ＷＡＲＴＳがＯｍｉの生理学的基質であることを見出すことができた。
（４）スタロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）によるＯｍｉプロテアーゼ活性化とＷＡＲＴＳ蛋白質分解誘導
本発明者らは、スタロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ；以下、「ＳＴＳ」と略記することがある。）によるＯｍｉプロテアーゼ活性の活性化と、ＷＡＲＴＳ蛋白質の分解について試験を行った。ＳＴＳには、カスパーゼ阻害剤の存在下で細胞死を誘導すると報告や、Ｏｍｉがミトコンドリアから細胞質へ転移するのを誘導するとの報告がある。本発明者らは、これらの知見から、ＳＴＳがＯｍｉを介し、且つカスパーゼに非依存的なアポトーシスを活性化することができると考え、Ｏｍｉ ｓｉＲＮＡ実験を行ってＯｍｉ発現が抑制された細胞のＳＴＳに対する感受性を調べた。その結果、コントロールｓｉＲＮＡと比較して、Ｏｍｉ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞では、ＳＴＳに対する有意な耐性が確認された（図１４）。図１４で示されるように、特に、カスパーゼ阻害剤であるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ存在下では、ＳＴＳに対して８倍もの耐性を獲得していた。
この結果に基づいて、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞を全長ＷＡＲＴＳ、またはＣ末端３アミノ酸を欠失させたＷＡＲＴＳ（ΔＶＹＶ）でトランスフェクトし、ＳＴＳで活性化されたＯｍｉプロテアーゼとＷＡＲＴＳの蛋白質分解との関連を調べた。ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして４８時間後、該細胞を更に１２時間ＳＴＳで処理してから、抗ＨＡ抗体でイムノブロッティング解析をしたところ、全長ＷＡＲＴＳの発現量は、ＳＴＳ処理に対し濃度依存的に減少し、一方で、ΔＶＹＶの発現量にはＳＴＳによる影響が見受けられなかった（図１５）。この知見から、本発明者らは、ＷＡＲＴＳは、ＳＴＳに誘導されたアポトーシスの過程において活性型のＯｍｉプロテアーゼと相互作用し、そして消化されることを見出した。
次に、本発明者らは、カスパーゼ阻害剤であるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下でＷＡＲＴＳの発現に対するＳＴＳの効果を調べた。これは、ＷＡＲＴＳを分解する酵素がカスパーゼであるとする可能性を除くことが目的であった。結果、図１６で示すように、ポリＡＤＰリボースポロメラーゼ（ｐｏｌｙ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＡＲＰ）が切断されない条件下で、内在性ＷＡＲＴＳが消化を受けることはなかった（図１６のｌａｎｅ３と６）。この知見から、本発明者らは、ＳＴＳで誘導されたアポトーシス過程において、全長ＷＡＲＴＳの蛋白質分解にはカスパーゼの活性が必要ではなく、該アポトーシス過程においては、Ｏｍｉプロテアーゼが活性化されてＯｍｉがＷＡＲＴＳをカスパーゼ非依存的に分解することを見出した。
（５）ＷＡＲＴＳ遺伝子発現の抑制実験
本発明者らは、ＨｅＬａ細胞をｓｉＲＮＡで処理してＷＡＲＴＳ蛋白質をノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）する試験を行い、Ｏｍｉを介するアポトーシスにおける効果を調べた。その結果、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋと２μＭのＳＴＳの存在下にてコントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞では、ｖｉａｂｉｌｉｔｙが３８＋８．５％であったが（図１８）、ＷＡＲＴＳ特異的なｓｉＲＮＡを用いてＷＡＲＴＳの発現を充分に抑えた細胞群では、死に至った細胞数が１０＋１．９％まで減少した（図１７、１８）。これに対し、ＨＥＫ２９３細胞を用いた実験で、正常型のＷＡＲＴＳ蛋白質を過剰発現させると、Ｏｍｉを介する細胞死が増加した（図１９、２０）。これらの知見より、本発明者らは、ＷＡＲＴＳの発現ならびにＷＡＲＴＳとＯｍｉとの相互作用が、Ｏｍｉを介するアポトーシスに必要であることを初めて見出すに至った。
本願明細書における「ＯｍｉとＷＡＲＴＳの相互作用を亢進または抑制」における「相互作用を亢進」とは、Ｏｍｉ蛋白質とＷＡＲＴＳ蛋白質との相互作用の頻度を実質的に増加させることを意味し、ここでいう実質的にとは、ＯｍｉとＷＡＲＴＳが直接相互作用（結合）するか、または、ＷＡＲＴＳと同質の生理作用を有する物質をＯｍｉと相互作用させることによりＯｍｉを活性化することを意味する。また、「相互作用を抑制」とは、ＯｍｉとＷＡＲＴＳとの相互作用の頻度を減少させることによりＯｍｉを不活性化することを意味する。
本願明細書における「アポトーシスを調節する」とは、細胞のアポトーシスを誘導または抑制することを意味する。
（１）本発明における「アポトーシスを誘導する」方法とは、Ｏｍｉ蛋白質とＷＡＲＴＳ蛋白質とが相互作用し、且つ、ＯｍｉによるＷＡＲＴＳの蛋白質分解反応を亢進する方法に基づく。そのためには、（ａ）細胞内のＯｍｉの量を増やす方法、（ｂ）ＷＡＲＴＳの量を増やす方法または（ｃ）ＯｍｉとＷＡＲＴＳの量いずれをも増やす方法を直接的にまたは間接的に行う手法が有効である。また、ＷＡＲＴＳ蛋白質を増やす以外にも、例えば（ｄ）ＷＡＲＴＳと同等の生理活性を有する実質的に同質な蛋白質を細胞内に投与し増やす方法や（ｅ）Ｏｍｉに対してＷＡＲＴＳ蛋白質と同等の生理活性を発揮しうる化合物を投与してＷＡＲＴＳ活性を事実上亢進しＯｍｉを活性化する方法、等が可能である。蛋白質量を増やす方法としては、蛋白質を直接添加する方法や、該蛋白質をコードするＤＮＡを細胞に組み込んで発現させ間接的に増やす方法、等がある。ここで、実質的に同質な蛋白質とは、ＯｍｉまたはＷＡＲＴＳそれぞれと活性の性質が同質であることを意味する。
（２）本発明における「アポトーシスを抑制する」方法とは、Ｏｍｉ蛋白質とＷＡＲＴＳ蛋白質との相互作用を抑制・阻害してＷＡＲＴＳの蛋白質分解反応を抑制する方法に基づく。そのためには、（ａ）細胞内のＯｍｉの量を減らす方法、（ｂ）ＷＡＲＴＳの量を減らす方法または（ｃ）ＯｍｉとＷＡＲＴＳの量いずれをも減らす方法を直接的にまたは間接的に行う手法が有効である。また、ＷＡＲＴＳ蛋白質を減らす以外にも、例えば（ｄ）ＯｍｉまたはＷＡＲＴＳの特異的抗体（モノクローナル抗体）を投与してＯｍｉとＷＡＲＴＳとの相互作用を阻害する方法、（ｅ）ＯｍｉとＷＡＲＴＳとの相互作用を拮抗阻害し得るアンタゴニストを投与してＯｍｉを不活性化する方法、等が可能である。
なお、ＷＡＲＴＳ、Ｏｍｉおよび前記各種モノクローナル抗体は、当業者であれば自体公知の方法に同じかまたはそれに準じて容易に製造することができる。
本発明にかかるアポトーシス調節法は、各種癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等の治療または予防に有用であり、具体的疾患としては、例えば脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、リンホーマ、白血病、各種急性神経変性疾患、脳血管障害急性期、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素による神経障害、低血糖による神経障害、各種慢性神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、てんかん、肝性脳症、末梢神経障害、パーキンソン症候群、痙性麻痺、痛み、神経痛、精神分裂病、不安、薬物依存症、嘔気、嘔吐、排尿障害、緑内障による視力障害、抗生物質による聴覚障害、食中毒、感染性脳脊髄炎、脳血管性痴呆、髄膜炎による痴呆、神経症状、ＨＩＶ性脳脊髄炎、各種脱髄性疾患（脳炎、急性散在性脳脊髄炎、多発性硬化症、急性多発性根神経炎、ギラン−バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、Ｍａｒｃｈｉｆａｖａ−Ｂｉｇｎａｍｉ病、中心性橋延髄崩壊症、視神経脊髄炎、デビック病、バロ病、ＨＩＶ性ミエロパシー、ＨＴＬＶ性ミエロパシー、進行性多巣性白質脳症、二次性脱髄性疾患（ＣＮＳエリテマトーデス、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、乖離性脳血管炎等）等）等があげられる。また、本発明にかかる前記アポトーシス調節法は、哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル等）、特にヒトに用いられるのが好適である。
本発明にかかるアポトーシス調節法を用いれば、細胞内のＷＡＲＴＳ蛋白質および／またはＯｍｉ蛋白質の量を調節することにより、容易にアポトーシスを誘導し或いは抑制することができる。
（１）例えば、癌細胞では、アポトーシス制御なされず、分裂・増殖が進行するが、本発明を癌細胞に適用して、ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉのいずれか一方、或いはＷＡＲＴＳとＯｍｉの両方の量を増やすことにより、アポトーシスを誘導して癌細胞を細胞死させることができる。これを利用して抗癌剤を提供することもできる。特に、抗癌剤を投与された患者には耐性によりアポトーシスが起こりにくくなっている患者が多くみられ、該患者には本発明にかかるアポトーシス誘導法や医薬が極めて有効である。ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの量を増やす方法としては、（ａ）ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉを癌患者に投与して該患者の細胞内のＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの存在量を増やす方法や、（ｂ）ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉをコードするＤＮＡを該患者に投与して該患者の生体内で発現させることにより細胞内のＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの存在量を増やす方法や、（ｃ）治療等の対象である細胞にＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現させた後に、該細胞を対象患者の体内に移植して戻してやり、ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの発現量を増やす方法、（ｅ）ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉと実質的に同質な蛋白質を投与または発現させる方法、等を用いることができる。
（２）これとは逆に、アポトーシスが亢進していると考えられる疾患（自己免疫疾患等）がある。本発明をこれらの疾患に適用して、ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉのいずれか一方、或いはＷＡＲＴＳとＯｍｉの両方の量を減らすことにより、アポトーシスを抑制して疾患の治療または予防をすることができる。ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの量を減らす方法としては、（ａ）ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの抗体を対象患者に投与して該患者の細胞内におけるＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を阻害する方法や、（ｂ）ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの発現を阻害するＲＮＡを直接該患者に投与するか、あるいは該ＲＮＡから逆転写して作成したＤＮＡを該患者に投与して該患者の生体内で発現させることにより、細胞内のＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの発現量を減らす方法や、（ｃ）治療等の対象である細胞に前記（ｂ）記載のＲＮＡまたはＤＮＡを組み込んで発現させた後に、該細胞を対象患者の体内に移植して戻してやり、ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの発現量を減らす方法、等を用いることができる。
本発明者らが見出したＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を利用すれば、前記癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等、各種疾患の診断が容易に行える。即ち、ＷＡＲＴＳおよび／またはＯｍｉの細胞内蛋白質量を定量し、これらの数値を健常者のそれと比較して、数値が増加している被験者ではアポトーシスが亢進され（例えば自己免疫疾患患者）、逆に数値が低下している被験者ではアポトーシスが抑制されている（例えば癌患者）とする診断が可能である。ここで、ＷＡＲＴＳまたはＯｍｉの蛋白質量の定量は、当業者に用いられる定量法を用いて容易に行うことができ、例えばＥＬＩＳＡ法はじめ、各種免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、放射性同位元素標識）等の使用が可能である。
また、被験者のＷＡＲＴＳおよび／またはＯｍｉの蛋白質量を定量して、健常者のＷＡＲＴＳとＯｍｉの蛋白質量と比較することにより、該被験者においてアポトーシスが起こる程度を診断することが容易に可能である。更に、該診断に基づいて、癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等の診断も容易に実施可能である。特に、抗癌剤や、放射線治療による癌細胞の感受性の評価・診断が容易であるし、また、自己免疫疾患では、ＯｍｉやＷＡＲＴＳの量的増加や活性上昇によりアポトーシスが亢進している可能性があることから、該疾患の診断法として有用である。
本発明は、アポトーシスを誘導または抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための新規な方法と、それに使用するスクリーニング用キットをも提供する。かかるスクリーニング法は、ＷＡＲＴＳ蛋白質および／またはＯｍｉ蛋白質を用いることを特徴とする方法である。例えば、動物の試料（血液、細胞、臓器、その他組織）を採取して、これらをそのまま用いるか、或いは、細胞または組織の粗酵素抽出液を用いるかＯｍｉ蛋白質標本を調製して、適当な条件下において被検化合物を添加し、ＯｍｉによるＷＡＲＴＳ蛋白質の分解量を定量し、阻害剤不存在下でＷＡＲＴＳを添加した場合の分解量と比較することにより、目的とする化合物をスクリーニングすることが容易に可能である。ＷＡＲＴＳの分解量の定量は、ＷＡＲＴＳを直接定量することにより分解量を求めるか、または、分解産物を直接定量することにより求めてもよい。定量法には、ＷＡＲＴＳまたはその分解産物のモノクローナル抗体を用いる免疫染色法（ＥＬＩＳＡ法を含む）が有効であり、当業者であれば容易に実施することができる。
前記スクリーニング法により得られる化合物は、アポトーシスを誘導または抑制する作用を有する化合物であり、前記各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療や予防に有用である。
本発明は新規な医薬組成物をも提供する。本発明にかかる医薬組成物は、（１）ＷＡＲＴＳ蛋白質、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩、および／または（２）Ｏｍｉ蛋白質、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩を有効成分として含む医薬組成物と、前記スクリーニング法により得られうる化合物またはその塩を含む医薬組成物であり、医薬の有効成分としては新規な蛋白質または化合物を含有し、該医薬組成物は、前記各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療や予防に有用である。
前記塩は、薬理学的に許容される塩である限りにおいて特に種類は限定されず、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などの無機酸の付加塩；酢酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの有機カルボン酸の付加塩；メタンスルホン酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、タウリン塩などの有機スルホン酸の付加塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン塩、フェネチルベンジルアミン塩などのアミンの付加塩；アルギニン塩、リジン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸の付加塩等が好適である。
本発明にかかる医薬組成物を医薬として使用する場合は、投与形態は特に限定されず、経口でも非経口的投与でもよい。哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類等によって異なり特に限定されないが、３０μｇないし１０ｇ、好ましくは１００μｇないし５００ｍｇ、さらに好ましくは１００μｇないし１００ｍｇを、注射投与で約１ないし３０００μｇ／ｋｇ、好ましくは３ないし１０００μｇ／ｋｇを、それぞれ１回または数回に分けて投与することができる。
本発明にかかる医薬組成物は、蛋白質またはその塩、あるいは化合物またはその塩をそのまま用いるか、または自体公知の薬学的に許容できる担体等と混合し、慣用される方法により製剤化することが可能である。好ましい剤形としては錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等があげられる。製剤化には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化可能である。
例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖などの糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体；精製水などがあげられる。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等；結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等；崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等；滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油、等；着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものであれば、いかなるものでもよく；矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等；抗酸化剤としては、アスコルビン酸、α−トコフェロール、等、医薬品に添加することが許可されているものがそれぞれ用いられる。
経口製剤は、賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
錠剤・顆粒剤の場合には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。
シロップ剤、注射用製剤、点眼剤、等の液剤の場合は、ｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤、等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁化剤、抗酸化剤、等を加えて、常法により製剤化する。該液剤の場合、凍結乾燥物とすることも可能で、また、注射剤は静脈、皮下、筋肉内に投与することができる。懸濁化剤における好適な例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、等；溶解補助剤における好適な例としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等；安定化剤における好適な例としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等；保存剤における好適な例としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等があげられる。
外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能で、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができる。さらに、必要に応じて分化誘導作用を有する成分、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤、等の成分を配合することもできる。
以下に示す本発明の参考例、実施例および試験例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
実施例１ 酵母ツーハイブリット法
ＷＡＲＴＳのカルボキシル末端２０アミノ酸の塩基配列を導入したｐＡＳ２−１ｃ／ＳＳ発現ベクターを作成した。酵母ＣＧ１９４５株を用い、ｐＡＳ２−１ｃ／ＳＳ安定発現株を樹立した。この株をＨｅＬａ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ発現ベクターを用いて形質転換し、栄養要求性の変化（Ｈｉｓ＋）、ｂｅｔａ−ｇａｌ活性の有無を指標にスクリーニングを行った。９．３×１０^６個の独立したクローンより最終的に５４０個の発現クローンを得た。
実施例２ 細胞培養、トランスフェクション
ＨｅＬａ，ＣＯＳ７，ＨＥＫ２９３，２９３Ｔ細胞は１０％仔牛血清加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に培養した。トランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ６またはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ，ＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔを用い標準的手法にて行った。
実施例３ 発現ベクター、特異的抗体
培養細胞の発現ベクターはｐＣＧＮ，ｐｃＤＮＡ３ベクターを用いた。大腸菌発現ベクターはｐＧＥＸ−２ＴＨ，ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターを用いた。ＰＣＲにて増幅した塩基断片をこれらベクターに挿入して発現ベクターを得た。変異導入発現ベクターはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを用い作成した。
各々の特異的抗体は、大腸菌を用いて作成し、精製した以下のリコンビナント蛋白をウサギ（Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ）またはラット（Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ）に注入して作成した。
ＷＡＲＴＳ６０−４：ＧＳＴ−ＷＡＲＴＳ（ａ．ａ．１３６−７００）、ウサギ
ＲＣ７０：Ｈｉｓ−Ｏｍｉ（ａ．ａ．３６２−４５８）、ラット
Ｃ７０：ＧＳＴ−Ｏｍｉ（ａ．ａ．３６２−４５８）、ウサギ
他の市販抗体は以下より得た。
抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）：ＳＩＧＭＡ，抗ＨＡ抗体（３Ｆ１０）：Ｒｏｃｈｅ，抗ＧＳＴ抗体：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
抗ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｂ−５−１−２）抗体：ＳＩＧＭＡ，抗ＰＡＲＰ ｐ８５抗体：Ｐｒｏｍｅｇａ
実施例４ ＧＳＴおよび免疫沈降実験
ＧＳＴ沈降実験は以下の如く行った。細胞に発現ベクターをトランスフェクションした後、５％ＮＰ−４０ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＮＰ−４０，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，２０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｖａｎａｄａｔｅ，２μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１ｍＭ ＡＥＢＳＦ，１０μＭ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ａｎｄ １ｍＭ ｐ
ｅｐｓｔａｔｉｎ）を用い可溶化した。この可溶化溶液をｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ａｇａｒｏｓｅに結合させたＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｏｍｉ（ａ．ａ．３６２−４５８）と混合沈降した後、ＳＤＳ電気泳動、ウエスタンブロットにて解析した。なお、免疫沈降および試験管内結合試験はＨｉｒｏｔａら（ＪＣＢ １４９，１０７３，２０００）の方法に拠った。
実施例５ 試験管内プロテアーゼ実験
大腸菌に発現させた全長Ｏｍｉ、不活性Ｏｍｉ（Ｓ３０６Ａ）はＮｉ−ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを用い精製した。これらリコンビナント蛋白の濃度はＢＣＡ法にて求めた。バキュウロウイルスを用いて作成した全長ＷＡＲＴＳを前述したＯｍｉまたＯｍｉ（Ｓ３０６Ａ）と共に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液内で３７℃で２時間インキュベートし、試験管内プロテアーゼ実験を行った。これらをＳＤＳ電気泳動、ウエスタンブロットにて解析した。
実施例６ 細胞蛍光免疫染色
３５ｍｍ ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈに培養した細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（ｐＨ７．５）にて固定したのち、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳにて１５分処理した。ＰＢＳでの洗浄後、一次抗体としてｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＷＡＲＴＳ抗体（６０−４），ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）、二次抗体としてＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ）またはＴｅｘａｓ ｒｅｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用い、免疫染色を行った。これらの検体は共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。
実施例７ ＲＮＡ干渉法
ＨｅＬａ細胞を６ウエルプレートに各ウエル２×１０^４個ずつ播き、１日培養した後にｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ二量体の作成およびトランスフェクション手技はＥｌｂａｓｈｉｒら（Ｎａｔｕｒｅ ４１１，４９４，２００１）の方法に拠った。トランスフェクション後８６時間目に、スタウロスポリンを加え、さらに１２時間培養を行ったのち細胞を回収した。これらの一部をＳＤＳ電気泳動、ウエスタンブロットに供し、細胞死判定はトリパンブルー染色排除試験にて行った。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは日本バイオサービスより得た。配列は以下の如くである。

実施例８ 細胞死誘導試験
３５ｍｍ ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈに培養したＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ，ＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔを用いて以下の発現ベクターを共トランスフェクションした。
０．１μｇ ｐＥＧＦＰ（膜局在ＧＦＰ）
０．０５μｇ ＦＬＡＧ−成熟型Ｏｍｉ
２μｇのｐＣＧＮ全長またはカルボキシル末端３アミノ酸欠失ΔＶＹＶ ＷＡＲＴＳ（非結合型）
トランスフェクション後２４時間目に細胞を固定、ＰＩ染色を行った。死細胞は蛍光顕微鏡観察での細胞胞体および核の形態変化により判定した。

本発明にかかるアポトーシス調節法または医薬の、各種癌疾患、自已免疫疾患または神経変性疾患への有効性は、いずれも公知の手法に準じて容易に試験可能である。例えば、ヒト大腸癌に対する抗癌効果は以下のように確認可能であった。即ち、ヒト大腸癌株ＨＣＴ１５（ＡＴＣＣ）を、５％炭酸ガスインキュベーターにてＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含）で約８０％コンフルエントとなるまで培養し、その後細胞を回収して、該細胞懸濁液を用意したヌードマウスの体側皮下に移植した。所定の平均腫瘍体積に成長した後、本発明にかかる医薬を投与して腫瘍体積を観察し、効果を調べた。なお、腫瘍体積＝腫瘍長径（ｍｍ）ｘ腫瘍短径（ｍｍ）^２／２の計算式にて計算をした。
その結果、本発明にかかる医薬組成物は優れた抗癌作用を示した。その他の各種自己免疫疾患および神経変性疾患においても同じく優れた治療効果を示した。

本発明により、新規なアポトーシス調節方法を提供することができ、該方法により、アポトーシスの誘導または抑制ができるようになった。また、本発明にかかるアポトーシス調節方法を用いることにより、新規な医薬組成物、新規な疾患の治療法および予防法を提供することができた。本発明にかかる前記医薬組成物、治療法および予防法は、アポトーシスの調節が有効な疾患（例えば、癌疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患）の治療・予防に有用である。

【配列表】

Claims (15)

1. 配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「ＷＡＲＴＳ」と称する。）と配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、「Ｏｍｉ」と称する。）の間における相互作用を亢進または抑制することを含む、細胞のアポトーシス調節方法。
2. 細胞内におけるＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳの量を増加させることによりアポトーシスを誘導することを特徴とする、請求項１に記載のアポトーシス調節方法。
3. 細胞内におけるＯｍｉとＷＡＲＴＳの間における相互作用を阻害することによりアポトーシスを抑制することを特徴とする、請求項１に記載のアポトーシス調節方法。
4. （１）細胞に外部よりＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳ、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（２）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（３）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（４）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳのモノクローナル抗体を外部より加えることによってＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、請求項１に記載のアポトーシス調節方法。
5. （１）ＷＡＲＴＳ、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩、または（２）Ｏｍｉ、それに実質的に同質な蛋白質、もしくはそれらの塩を有効成分として含む、医薬組成物。
6. アポトーシスを調節するための医薬である、請求項５に記載の組成物。
7. 各種癌疾患、自已免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、請求項５記載の組成物。
8. 請求項１に記載の方法を用いることを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療または予防法。
9. （１）細胞に外部よりＯｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳ、あるいはそれらに実質的に同質な蛋白質またはその塩を加えること、（２）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで組換えた組換えベクターを与えて細胞を形質転換すること、（３）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を被検患者に戻すこと、または（４）Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳのモノクローナル抗体を外部より加えることによってＷＡＲＴＳとＯｍｉの相互作用を亢進または抑制することを特徴とする、請求項８に記載の治療または予防法。
10. ＷＡＲＴＳおよび／またはＯｍｉの蛋白質量を定量することにより細胞にアポトーシスの起こる程度を評価することを含む、各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の診断方法。
11. Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳを用いることを特徴とする、アポトーシス調節活性を有する化合物のスクリーニング方法。
12. Ｏｍｉおよび／またはＷＡＲＴＳを用いることを特徴とする、アポトーシス調節活性を有する化合物のスクリーニング用キット。
13. 請求項１１に記載のスクリーニング法または請求項１２に記載のスクリーニング用キットの使用により得られうる、アポトーシス調節活性を有する化合物またはその塩。
14. 請求項１３に記載の化合物またはその塩を含む医薬組成物。
15. 各種癌疾患、自己免疫疾患または神経変性疾患の治療剤または予防剤である、請求項１４に記載の組成物。

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