JP4709383B2 - Ｕｃｐ４ - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、或る種のヒト脱共役タンパク質との相同性を有する新規なＤＮＡの同定及び単離、並びに、ここに「脱共役タンパク質４」又は「ＵＣＰ４」と命名する新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
脱共役タンパク質又は「ＵＣＰｓ」は、代謝プロセスにおいて役割を担うと考えられており、文献に報告されている。ＵＣＰはクマなどの冬眠動物の褐色脂肪細胞で最初に見出され記載された。ＵＣＰはそのような冬眠を助け、他の寒冷気候適応動物は、それらの身体の代謝速度を上げることにより寒冷気候でも中心体温を維持する。ヒトは比較的少量の褐色脂肪組織を持つので、ＵＣＰは最初ヒト代謝では副次的な役割を担うものと考えられた。
幾つかの異なるヒト脱共役タンパク質が現在までに記載されている［一般的には、Gura, Science, 280: 1369-1370 (1998)参照］。ＵＣＰ１と呼ばれるヒト脱共役タンパク質はNicholls等によって同定された。Nicholls等は、褐色脂肪細胞ミトコンドリアの内膜が非常にタンパク質透過性であり、実験者はミトコンドリア膜で観察されたＵＣＰ１と呼ばれるタンパク質透過性を追跡した。Nicholls等は、ＵＣＰ１が、組織因子のような透過性により、食物源からなされる多数のＡＴＰを減らし、身体代謝を上昇させて熱を発生させると報告した［Nichols等, Physiol. Rev., 64: 1-64 (1984)］。
後にＵＣＰ１は褐色脂肪組織のみで発現されることが見出された［Bouillaud等, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 445-448 (1985); Jacobsson等, J. Biol. Chem., 260: 16250-16254 (1985)］。遺伝子マッピング研究により、ヒトＵＣＰ１遺伝子は染色体４に位置することが示された［Cassard等, J. Cell. Biochem., 43: 255-264 (1990)］。
【０００３】
ＵＣＰＨ又はＵＣＰ２と呼ばれる他のヒトＵＣＰも記載されている。［Gimeno等, Diaberes, 46: 900-906 (1997); Fleury等, Nat. genet., 15: 269-272 (1997); Boss等, FEBS Letters, 408-: 39-42 (1997); またWolf, Nutr. Rev., 55: 178-179 (1997)も参照］。Fleury等は、ＵＣＰ２タンパク質がＵＣＰ１と５９％のアミノ酸配列同一性を有し、ＵＣＰ２は高インシュリン血症及び肥満と関連するヒト染色体１１の領域にマッピングされることを教示した［Fleury等, 上掲］。また、ＵＣＰ２は、脳及び筋肉などの種々の成人組織及び脂肪細胞で発現されることも報告された［Gimeno等, 上掲, 及びFleury等, 上掲］。
第３のヒトＵＣＰであるＵＣＰ３は、Boss等, 上掲; Vidal-Puig等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 235: 79-82 (1997); Solanes等, J. Biol. Chem., 272: 25433-25436 (1997); 及び Gong等, J. Biol. Chem., 272: 24129-24132 (1997)に記載された［英国特許第9716886も参照］。Solanes等は、ＵＣＰ１及びＵＣＰ２とは異なり、ＵＣＰ３は主にヒト骨格筋で発現され、ＵＣＰ３遺伝子は及び染色体１１にＵＣＰ２に隣接してマッピングされることを報告した［Soalens等, 上掲］。Gong等は、ＵＣＰ３発現が甲状腺ホルモン、ベータ３-アンドレン性アゴニスト及びレプチンといった公知の発熱性刺激によって調節できることを記載している［Gong等, 上掲］。
【０００４】
（発明の概要）
本出願で「ＵＣＰ４」と命名される新規なポリペプチドをコードし、幾つか公知の脱共役タンパク質と所定の相同性を持つｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ７７５６８−１６２６）が同定された。
一実施態様では、本発明はＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基約１〜約３２３の配列を含むＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む。
他の態様では、本発明は、Ｆｉｇ２（配列番号：２）の約４０〜約１０１１のヌクレオチドを含む核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
【０００５】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３４のｃＤＮＡにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号２０３１３４のｃＤＮＡにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：１）の約１〜約３２３のアミノ酸残基の配列と少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
他の態様では、本発明は、Ｆｉｇ１（配列番号：１）の約１〜３２３の残基のアミノ酸配列と比較したとき少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアをつけられるポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【０００６】
本発明のさらなる実施態様は、ハイブリッド形成プローブとして使用するのに十分長い、ＵＣＰ４コード化配列の断片に係る。好ましくは、このような断片はＦｉｇ２（配列番号：２）の配列における少なくとも約２０〜約８０の連続した塩基を含む。場合によっては、これらの断片は、Ｆｉｇ２（配列番号：２）の配列のＮ-末端又はＣ-末端を含む。
他の実施態様では、本発明はＵＣＰ４又はその変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。このベクターは、上記で定義した単離された核酸分子の任意のものを含んでいてよい。
このようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。さらに、宿主細胞をＵＣＰ４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＵＣＰ４ポリペプチドを回収することを含んでなるＵＣＰ４ポリペプチドの製造方法が提供される。
他の実施態様では、本発明は、上記で定義した単離された核酸配列の任意のものによってコードされる単離されたＵＣＰ４ポリペプチドを提供する。
特別な実施態様では、本発明は単離された天然配列ＵＣＰ４ポリペプチドを提供し、一実施態様では、Ｆｉｇ１（配列番号：１）の残基１〜３２３を含むアミノ酸配列を含む。
他の態様では、本発明はＦｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基１〜約３２３の配列と少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＵＣＰ４ポリペプチドに関する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、Ｆｉｇ１（配列番号：１）の残基１〜３２３のアミノ酸配列と比較したとき少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアをつけられるアミノ酸配列を含んでなる単離されたＵＣＰ４ポリペプチドに関する。
さらに他の態様では、本発明は、Ｆｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基１〜約３２３の配列、又は抗-ＵＣＰ４抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる単離されたＵＣＰ４ポリペプチドに関する。好ましくは、ＵＣＰ４断片は天然ＵＣＰ４ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、緊縮性条件下で、（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：１）の約１〜約３２３のアミノ酸残基の配列含むＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖にハイブリッド形成させ、前記試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合、（ｉｉ）前記ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を当該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、（ｉｉｉ）当該ポリペプチドを細胞培地から回収することにより製造されるポリペプチドを提供する。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＵＣＰ４ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＵＣＰ４ポリペプチドを含む。
【０００８】
他の実施態様では、本発明は、ＵＣＰ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体であってよい。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＵＣＰ４ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＵＣＰ４抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＵＣＰ４ポリペプチドを候補分子と接触させ、所定の活性を監視することを含む天然ＵＣＰ４ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。また本発明は、ＵＣＰ４を用いた治療方法及び診断方法も提供する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＵＣＰ４ポリペプチド、又は上記で定義したアゴニスト又はアンタゴニストを、担体とともに含んでなる組成物にも関する。
【０００９】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＵＣＰ４ポリペプチド」、「ＵＣＰ４タンパク質」及び「ＵＣＰ４」という用語は、天然配列ＵＣＰ４及びＵＣＰ４変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ＵＣＰ４は、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え及び／又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＵＣＰ４」は、天然由来のＵＣＰ４と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＵＣＰ４は、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＵＣＰ４」という用語には、特に、ＵＣＰの自然に生じる切断又は可溶化形態、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＵＣＰ４は、Ｆｉｇ１(配列番号：１)のアミノ酸１〜３２３を含有する成熟又は全長天然配列ＵＣＰ４である。
「ＵＣＰ４変異体」とは天然配列ＵＣＰ４以外の任意のものを意味し、以下に定義されるように、全長天然配列ＵＣＰ４ポリペプチド又はＵＣＰ４ＥＣＤ配列についてＦｉｇ１（配列番号：１）に示すＵＣＰ４ポリペプチド配列の残基１〜３２３を含むアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＵＣＰ４を含む。このようなＵＣＰ４変異体には、例えば、Ｆｉｇ１(配列番号：１)の配列のＮ-又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて一又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失されたＵＣＰ４ポリペプチドが含まれる。通常、ＵＣＰ４ポリペプチド変異体は、Ｆｉｇ１(配列番号：１)の残基１〜３２３を含むアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列同一性を有している。
【００１０】
ＵＣＰ４配列に対してここで同定される「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＵＣＰ４配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。％同一性は［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.htm]から得られるWU-BLAST-2によって決定できる。WU-BLAST-2は、幾つかの検索パラメータを使用するが、その殆どは初期値に設定される。調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳとＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成及び検索される対象の配列を含む特定のデータベースの組成に応じてプログラム自身により確立される；しかしながら、値は感度を向上させるように調節してよい。％アミノ酸配列同一性値は、整列した領域における「より長い」配列の残基総数で同一一致した残基数を除することにより決定される。「より長い」配列は、整列領域において最も実際の残基を有しているものである（アラインメントスコアを最大にするためにWU-Blast-2で導入された間隙は無視される）。
上記のように実施される配列比較の文脈における、「ポジティブ（陽性）」という用語は、比較された配列において、（例えば、保存的置換の結果として）同一ではないが類似の特性を持つ残基を含む。ポジティブの％値は、上記で定義したような、より長い配列中の残基の総数でBLOSUM62マトリクスにおいてポジティブ値とスコアされる残基を除した分率により決定される。
【００１１】
同様にして、「パーセント（％）核酸配列同一性」は、ＵＣＰ４コード化配列におけるヌクレオチド残基と同一な候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。同一性の値は、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションを各々１及び０．１２５にし、初期パラメータに設定したWU-BLAST-2のBLASTNモジュールによって算出される。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ-末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＵＣＰ４ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ＵＣＰ４ポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され、ＵＣＰ４コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＵＣＰ４コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＵＣＰ４コード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＵＣＰ４ポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある通常はＵＣＰ４を発現する細胞に含まれるＵＣＰ４コード化核酸分子を含む。
【００１２】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード化配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えば、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗-ＵＣＰ４モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＵＣＰ４抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００１３】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃でのホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００１４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＵＣＰ４ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、それが融合されるポリペプチドの活性を阻害しないような短かさである。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８−５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０−２０のアミノ酸残基）を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種性タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち「異種性」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００１５】
ここで意図している「活性な」又は「活性」とは、天然又は自然に生じるＵＣＰ４の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＵＣＰ４の形態を意味する。好ましい活性は、ミトコンドリア膜電位に、代謝速度及び／又は熱発生のアップ-又はダウン-レギュレーションをもたらすような方法で影響を与える能力である。そのような活性の一つは、代謝速度における増大をもたらすミトコンドリア膜におけるプロトン漏出の発生を含む。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、ここに開示される天然ＵＣＰ４ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を部分的又は全体的に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に、「アゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、ここに開示される天然ＵＣＰ４ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、ＵＣＰ４ポリペプチドのイムノアドヘシン、天然ＵＣＰ４ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体を含む。
「治療」とは、目的物が標的とする病理的症状又は疾患を防止又は遅延させる(少なくする)予防的又は防止的手段を意味する。治療を必要とするものには、既に疾患を患っているもの並びに疾患を患う傾向があるもの又は疾患が防止されるべきものが含まれる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするように、急性態様とは異なり連続的な態様で薬剤を投与することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭及び農場用動物、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等を含む、哺乳類として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療剤「と組み合わせて」の投与には、同時（同時間）及び任意の順序の連続投与が含まれる。
【００１６】
ＩＩ. 本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＵＣＰ４
本発明は、本出願においてＵＣＰ４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、ＵＣＰ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。単純化するために、本発明の明細書においては、ＤＮＡ７７５６８−１６２６によってコードされるタンパク質並びに上記のＵＣＰ４の定義に包含される天然相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方法に関わらず「ＵＣＰ４」と呼ぶものとする。
下記の実施例で開示されるように、クローンＤＮＡ７７５６８−１６２６はＡＴＣＣに寄託された。クローンの実際のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンの配列決定をすることにより、当業者によって容易に決定される。予測されるアミノ酸配列は、常套的技量を用いてヌクレオチド配列から決定できる。ここでＵＣＰ４について、出願人は、何れがこの出願時に入手可能な配列情報と最も一致するリーディングフレームと考えられるかを同定した。
Megaling DNASTARコンピュータプログラム（及び製造者によって設定されたこのソフトウェアのアルゴリズム及びパラメータ）（Oxford Molecular Group, Inc.）を用いて、全長天然配列ＵＣＰ４（Ｆｉｇ１及び配列番号：１に示す）が、ＵＣＰ３と約３４％のアミノ酸配列同一性、ＵＣＰ２と約３３％のアミノ酸配列同一性、及びＵＣＰ１と約２９％のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＵＣＰ４が新たに同定されたヒト脱共役タンパク質ファミリーのメンバーであり、このタンパク質ファミリーに典型的な活性及び／又は特性、例えばミトコンドリア膜電位に影響を与えることにより代謝速度を向上又は抑制する能力を有すると考えられている。
【００１７】
Ｂ．ＵＣＰ４変異体
ここに記載した全長天然配列ＵＣＰ４ポリペプチドに加えて、ＵＣＰ４変異体も調製できると考えられる。ＵＣＰ４変異体は、ＵＣＰ４ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＵＣＰ４ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＵＣＰ４の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＵＣＰ４又はここに記載したＵＣＰ４の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＵＣＰ４と比較してＵＣＰ４のアミノ酸配列が変化するようなＵＣＰ４をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、少なくとも１つのアミノ酸のＵＣＰ４の一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸での置換による。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＵＣＰ４の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、必要ならば、得られた変異体を当該分野で知られた又はここに記載するようなアッセイにおいて活性について試験することにより決定される。
【００１８】
本発明の一実施態様は、全長ＵＣＰ４の断片であるＵＣＰ４変異体に係る。好ましくは、その断片は全長ＵＣＰ４の所望の活性又は特性を保持している。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発といった当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、ＵＣＰ４変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００１９】
Ｃ．ＵＣＰ４の修飾
ＵＣＰ４ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＵＣＰ４ポリペプチドのアミノ酸残基を標的として、ＵＣＰ４の選択された側鎖又はＮ-又はＣ-末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＵＣＰ４を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＵＣＰ４抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ-末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ-末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＵＣＰ４ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＵＣＰ４に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去あるいは化学的又は酵素的手段によるグリコシル化の除去による）、及び／又は天然配列ＵＣＰ４ポリペプチドに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この表現は、存在する種々の炭化水素部分の性質及び特性における変化を含む天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含む。
【００２０】
ＵＣＰ４ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更によって達成される。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＵＣＰ４（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＵＣＰ４アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＵＣＰ４ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＵＣＰ４ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されるアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術はこの分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
ＵＣＰ４の共有結合的修飾の他の型は、ＵＣＰ４ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００２１】
また、本発明のＵＣＰ４は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＵＣＰ４ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗-タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＵＣＰ４との融合物を含む。エピトープタグは、一般的にはＵＣＰ４のアミノ-又はカルボキシル-末端に位置する。このようなＵＣＰ４のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗-タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＵＣＰ４を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００２２】
もう一つの実施態様において、キメラ分子はＵＣＰ４の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシンとも呼ぶ」）には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子無いの少なくとも一つの可変領域に換えたＵＣＰ４ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態の置換を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、あるいはＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の調製のためには、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号も参照。
本発明のＵＣＰ４は、ロイシンジッパーに融合したＵＣＰ４を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。種々のロイシンジッパーポリペプチドがこの分野で記載されている。例えば、Landschulz等, Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe等, FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis等, Nature, 341: 24 (1989)を参照。当業者は、ロイシンジッパーがＵＣＰ４分子の５'-又は３'-末端のいずれかに融合することを認めるであろう。
【００２３】
Ｄ．ＵＣＰ４の調製
以下の説明は、主として、ＵＣＰ４核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＵＣＰ４を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＵＣＰ４を調製することはできると考えられる。例えば、ＵＣＰ４配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＵＣＰ４ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＵＣＰ４を生産してもよい。
【００２４】
１．ＵＣＰ４をコードするＤＮＡの単離
ＵＣＰ４をコードするＤＮＡは、ＵＣＰ４ｍＲＮＡを保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＵＣＰ４ＤＮＡは、実施例に記載されるような、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＵＣＰ４コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(ＵＣＰ４に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているような標準的な手法を使用して実施することができる。ＵＣＰ４をコードする遺伝子を単離する他の手段はＰＣＲ法を使用することである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００２５】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は充分な長さであり、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられており、上記のＩ欄に記載されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている公知の他の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、BLAST、BLAST2、ALIGN、DNAstar、及びINHERIT等の配列比較についての同一性又はポジティブを測定するための公衆に利用可能なコンピュータソフトウェアプログラム（初期パラメータに設定）を用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めに開示される推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出するための上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００２６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＵＣＰ４産生のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ_４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用できる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００２７】
ここでのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＵＣＰ４コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
グリコシル化ＵＣＰ４の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主系細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓系（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００２８】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
所望のＵＣＰ４をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＵＣＰ４は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＵＣＰ４コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母菌インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００２９】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μｍプラスミド開始点は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＵＣＰ４コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ細胞系である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００３０】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＵＣＰ４コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を指示するプロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＵＣＰ４転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る場合に限られる。
【００３１】
より高等の真核生物によるＵＣＰ４をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＵＣＰ４コード化配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、ときには３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＵＣＰ４をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＵＣＰ４の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞はGething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００３２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む、特異的二重鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二重鎖は表面に結合しており、その結果表面での二重鎖形成の時点でその二重鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＵＣＰ４ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＵＣＰ４ＤＮＡに融合した特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００３３】
５．ポリペプチドの精製
ＵＣＰ４の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＵＣＰ４の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＵＣＰ４を、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＵＣＰ４のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＵＣＰ４ポリペプチドの性質に依存する。
【００３４】
Ｅ．ＵＣＰ４の用途
ＵＣＰ４をコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＵＣＰ４核酸は、ここに記載される組み換え技術によるＵＣＰ４ポリペプチドの調製にも有用であろう。
全長天然配列ＵＣＰ４遺伝子（実施例１に記載；配列番号：２）、又はその断片は、その他のものの中で、全長ＵＣＰ４遺伝子の単離又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたＵＣＰ４配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＵＣＰ４の天然発生変異体又は他の種からのＵＣＰ４をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。
場合によっては、プローブの長さは約２０〜約８０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、Ｆｉｇ２のヌクレオチド配列から、又は天然配列ＵＣＰ４コード化ＤＮＡのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＵＣＰ４遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、^３２Ｐ又は^３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＵＣＰ４遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００３５】
本発明で考慮されるＵＣＰ４ＤＮＡの断片は、配列番号：２のＤＮＡの少なくとも約２０〜３０の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。好ましくは、これらの配列は配列番号：２のＤＮＡの少なくとも約５０の連続したヌクレオチドを含む。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＵＣＰ４コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＵＣＰ４をコードするヌクレオチド配列は、そのＵＣＰ４をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００３６】
ＵＣＰ４のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合、ＵＣＰ４は、結合性相互作用に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法によって、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＵＣＰ４は、下記の実施例２に記載するリガンド以外の他の関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＵＣＰ４又はＵＣＰ４のレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
また、ＵＣＰ４又はその任意の修飾形態をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＵＣＰ４をコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＵＣＰ４をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＵＣＰ４をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＵＣＰ４導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＵＣＰ４をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＵＣＰ４をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で処理し、導入遺伝子を有する未処理の動物に比べて病理学的状態の発症が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【００３７】
あるいは、ＵＣＰ４の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＵＣＰ４をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＵＣＰ４をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＵＣＰ４をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＵＣＰ４「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＵＣＰ４をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＵＣＰ４をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＵＣＰ４をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＵＣＰ４ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００３８】
また、ＵＣＰ４ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205-219）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【００３９】
ＵＣＰ４遺伝子治療は、例えば、代謝状態の治療における用途を持つと考えられる。これは、例えば、上記の技術を用いて及びＵＣＰ４遺伝子を含むウイルス性ベクターを或る種の組織（筋肉又は脂肪）に導入することによりこれらの標的組織における代謝速度を上昇させ、よってエネルギー消費を上げることにより達成される。
一般的に、ＵＣＰ４を用いる治療方法が本発明で考慮される。燃料の燃焼、電子移動、プロトンポンプ及びＯ_２消費（集合的に代謝速度と呼んでもよい）はＡＴＰ合成と関係している。代謝速度の一部（２０％を越えることもある）が、ＡＴＰ合成の無いマトリクス空間へのＨ^＋の「漏れ」戻りに帰するような哺乳動物における「非能率」があり得る。
ＵＣＰ４はＨ^＋漏れの触媒に含まれ、それによりインビボでのエネルギー的非能率において役割を担うと考えられる。従って、哺乳動物（特に、代謝的に重要な組織）におけるＵＣＰ４活性又はＵＣＰ４の量（存在）を変更することは、同時にＨ^＋漏れ、代謝速度及び熱発生を変調させる。哺乳動物における代謝速度を（アップレギュレーション又はダウンレギュレーションの何れかの方式で）変調させることは種々の治療的用途を有し、肥満、発作に関連した徴候、外傷（火傷外傷など）、敗血症及び感染の治療を含む。
【００４０】
肥満の治療において、当業者は、ミトコンドリア膜電位の変調が身体代謝速度を上昇させ、よって個体の体重減少の可能性を増大させるのに使用できることを認めるであろう。ＣＰ４の発現又は活性（脱共役など）をアップレギュレートする分子を同定するためにスクリーニングアッセイを実施してもよい。このように同定された分子は、次いで代謝速度を上昇させ体重減少を促進するために用ることができる。ＵＣＰ４ポリペプチドは、ＵＣＰ４の発現又は活性を変調させる治療的活性剤についてのリード化合物を同定するアッセイにおいて有用である。候補分子又は化合物は、候補分子又は化合物のＵＣＰ４発現又は活性に対する効果を決定するために、哺乳動物の細胞又は組織とともに検定される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用でき、特に小分子薬剤候補の同定に適している。小分子は、限定されないが、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースのアッセイなどを含む種々の方式で実施できる。これらのアッセイ方式は、この分野で良く知られている。
従って、一実施態様では、ＵＣＰ４の発現を促進又はアップレギュレートする分子の同定するスクリーニングアッセイを実施する方法が提供され、それは、ＵＣＰ４を含むと考えられる哺乳動物細胞又は組織試料を候補分子に暴露し、続いて前記試料中でのＵＣＰ４の発現を分析する工程を含む。この方法において、試料はミトコンドリア膜電位について更に分析される。場合によっては、ＵＣＰ４はＦｉｇ１（配列番号：１）のアミノ酸残基１から３２３を含むポリペプチドである。分析される試料は種々の哺乳動物細胞又は組織を含んでよく、限定されないが、ヒト脳組織を含む。スクリーニングアッセイで用いられる候補分子は、合成有機又は無機化合物を含む小分子であってよい。これに換わる実施態様では、スクリーニングアッセイは、ＵＣＰ４の発現を低下又はダウンレギュレートする分子を同定するために実施される。これらの候補分子がＵＣＰ４の発言及び／又は活性に対して持ちうる効果は、例えば、同様の哺乳動物において観察されるＵＣＰ４の発現又は活性といった対照又は参照試料と比較される。
【００４１】
またＵＣＰ４は診断方法においても用いられる。例えば、個体の細胞又は組織におけるＵＣＰ４の存在又は不存在、あるいはＵＣＰ４の過剰-又は過小-発現は、下記の実施例に記載するものを含む当該分野で知られたアッセイを用いて検出できる。よって、本発明は、哺乳動物細胞又は組織試料におけるＵＣＰ４の発現を検出する方法が提供され、それは、哺乳動物細胞又は組織試料をＤＮＡプローブと接触させ、前記試料中でのＵＣＰ４ｍＲＮＡ転写物の発現を分析することを含む。試料は種々の哺乳動物細胞又は組織を含んでよく、限定されないが、ヒト脳組織を含む。熟練実務者は、このような検出アッセイから得た情報を、代謝状態又は肥満発症の危険性の予測における補助に使用できる。例えば、患者におけるＵＣＰ４活性が異常に高い又は低いことが測定された場合、ホルモン治療などの治療を施してＵＣＰ４活性を生理学的に許容できる状態に戻すことができる。
また、哺乳動物における異常なＵＣＰ４機能の検出は、異常な神経活性又は神経変性の診断における補助に使用できる。現在は、ＵＣＰ４が正常な脳機能（及び関連する神経活性）に必要な脳温度又は代謝速度の調節に含まれると考えられている。また現在は、ｃｐが反応性酸素種の生成を制御し、従って神経変性に寄与していると考えられている。スクリーニングアッセイにおいて同定され、ＵＣＰ４発現又は機能を抑制することが見出された分子は、ＵＣＰ４が発熱の発症中にアップレギュレートされると考えられるため、発熱の治療にも用いられる。
【００４２】
Ｆ．抗ＵＣＰ４抗体
本発明は、さらに抗-ＵＣＰ４抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗-ＵＣＰ４抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＵＣＰ４ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００４３】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＵＣＰ４抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＵＣＰ４ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化細胞系は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００４４】
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＵＣＰ４に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
【００４５】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００４６】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＵＣＰ４抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合性サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００４７】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ）。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００４８】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＵＣＰ４に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００４９】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【００５０】
Ｇ．抗-ＵＣＰ４抗体の用途
本発明の抗ＵＣＰ４抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＵＣＰ４抗体は、ＵＣＰ４の診断アッセイ、例えばその特定細胞又は組織での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
また、抗-ＵＣＰ４抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＵＣＰ４のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＵＣＰ４に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＵＣＰ４を含む試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＵＣＰ４以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＵＣＰ４を抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００５１】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【００５２】
実施例１
ヒトＵＣＰ４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
公的なＥＳＴデータベース（例えばGenBank）及び個人的なＥＳＴデータベース（LIFESEQ（商品名）、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含むＥＳＴデータベースをヒトＵＣＰ３と相同性を持つ配列について検索した。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)］を用いて、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳物に対するＵＣＰ３反配列の比較として実施した。
BLASTスコアが７０（９０の場合もある）又はそれ以上となり、周知のタンパク質をコードしない比較物を集団化し、プログラムAssemblyLIGN及びMacVector（Oxford Molecular Group, Inc.）でコンセンサスＤＮＡ配列に組み立てた。
ＤＮＡ配列（「from DNA」）をAssemblyLIGNソフトウェアを用いて他のＥＳＴ配列に対して組み立てた（Ｆｉｇ７；配列番号：５）。IncyteデータベースからのＥＳＴは、以下の登録番号を持つ配列を含んでいた：３４６８５０４；３３６９２６２；４２２０７４７；１２５４７３３；５０１６１６０；３７７０１８９；２２６５３２９；９２８７１７；３７１５９６１；３５２８１０２；９６１５２３；１８６３７２３；３８２５３３；９１８２５２；９１８４０４；４３１３００９；３８０１６０４；ｃ-ｓｗｈ０６；３４６４９５５；ｃ-１ｓｈ０９；０９０４２４；１３１６８９１；１３４２０６９；１４３５５９３；１６０１４０１１；１６６９０９８；１６６８１０３；２２２２４８；２４３２４４；２４６９８４；２７２６６３；３０５６７８；３０５８７１；３３６９２６２；３４６４９５５；及び３７１５９６１。さらに、fromDNA配列をBLAST及びAssemblyLIGNの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、上記のＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
このＤＮＡ配列に基づいて、ＰＣＲによりＵＣＰ４の全長コード化配列のクローンを単離するためにオリゴヌクレオチドを合成した。正及び逆のＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐの長さのＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐの長さである。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐを越えるときに更なるオリゴヌクレオチドが合成される。
【００５３】
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー
CGCGGATCCCGTTATCGTCTTGCGCTACTGC（Ｕ４０１）（配列番号：３）
逆方向ＰＣＲプライマー
GCGGAATTCTTAAAATGGACTGACTCCACTCATC（Ｕ４０６）（配列番号：４）
ＮＨ_２-末端Flagタグを持つＵＣＰ４もｐｃＤＮＡ３にＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位の間にクローニングした（ｐｃＤＮＡ３Ｆｌａｇ-ＵＣＰ４；Invitrogen）。以下の正方向及び逆方向プライマーを合成した。
正方向ＰＣＲプライマー
CGCGGATCCGAAATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTCCGTCCCGGAGGAGGAGG（Ｕ４１０）（配列番号：６）
逆方向ＰＣＲプライマー
GCGGAATTCTTAAAATGGACTGACTCCACTCATC（Ｕ４０６）（配列番号：４）
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト脳組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いられるｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤなど；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)参照）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＵＣＰ４の全長ＤＮＡ配列（ここで、ＤＮＡ７７５６８−１６２６と命名される［Ｆｉｇ２、配列番号：２］）及びＵＣＰ４の誘導タンパク質配列を与えた。
【００５４】
ＵＣＰ４の全核酸配列をＦｉｇ２（配列番号：２）に示す。クローンＤＮＡ７７５６８−１６２６は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４０−４２に見かけの翻訳開始部位、及びヌクレオチド位置１００９−１０１１に見かけの停止コドンを有する（Ｆｉｇ２；配列番号：２参照）。予測されたポリペプチド前駆体は３２３アミノ酸長である。現在は、ＵＣＰ４は膜結合タンパク質であり、少なくとも６つの膜貫通領域を含むと考えられている。ＵＣＰ４のアミノ酸配列における推定膜貫通領域はＦｉｇ３に例示した。ｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）に含まれる、ＤＮＡ７７５６８−１６２６と称されるクローンＤＮＡ７７５６８はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２２９番号２０３１３４が付与されている。ＵＣＰ４ポリペプチドは、寄託されたＡＴＣＣ２０３２２９ベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされる分子を発現させることにより得られ又は得られうる。寄託されたＡＴＣＣ２０３１３４ベクターのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素での消化は、約９７２プラス３４塩基対の挿入物を生じる。Ｆｉｇ１に示した全長ＵＣＰ４タンパク質は、約３６,０６１ダルトンの見積もられた分子量及び約９．２８のｐＩを持つ。
ＵＣＰ４とＵＣＰ１、２及び３との配列のアラインメントをＦｉｇ３に例示する。幾つかの特記すべき相違がＵＣＰ１とＵＣＰ４との間に特定された。ＵＣＰ１がその推定ヌクレオチド結合部位を欠く場合、それはヌクレオチドによる阻害に耐性であり、ＵＣＰ１のＰｈｅ-２６７がＴｙｒ残基で置換されている場合、ＵＣＰ１は向上した脱共役活性を有する。［Gonzalez-Barroso等, Eur. J. Biochem., 239: 445-450 (1996); Mayinger等, Biochem., 31: 10536-10543 (1992)］。さらに、ＵＣＰ２及びＵＣＰ３と同様に、ＵＣＰ４はこの位置にＴｙｒ残基を持つ（Ｆｉｇ３参照）。さらに、ＵＣＰ１のカルボキシ末端は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）によるその脱共役活性の活性化に関係していた。Ｃｙｓ-３０５のＡｌａ又はＳｅｒ残基による置換は、ＦＦＡによる活性化の低下又は向上を各々もたらした。［Gonzalez-Barroso等, 上掲］。ＵＣＰ２はＡｌａ-３０７を持ち、ＵＣＰ３はＳｅｒ-２９８を持ち、そしてＵＣＰ４はＳｅｒ-３２１を持つので、ＵＣＰ４及び他のＵＣＰｓの脱共役活性はヌクレオチド及びＦＦＡによって異なる調節がなされると思われる。
ヒトＵＣＰ４遺伝子は、遺伝子マーカーＳＨＧＣ-３４９５２に近接した染色体位置６ｐ１１．２-ｑ１２にマッピングされた。
【００５５】
実施例２
ノーザンブロット分析
ヒト組織におけるＵＣＰ４ ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析によって試験した。ヒトＲＮＡブロットを、全長ＵＣＰ４ｃＤＮＡに基づく1キロベースの^３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリッド形成させた；プローブは、ｐｃＤＮＡ３ＵＣＰ４を消化し、ＵＣＰ４ｃＤＮＡ挿入物を精製することにより作成した。ヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-ＩＩ（Clontech）（Ｆｉｇ４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆ）、ヒト胎児組織ブロット（Ｆｉｇ４Ｄ及び４Ｈ）、ＰＢＬ（Ｆｉｇ４Ｂ及び４Ｄ）、及び癌細胞（Ｆｉｇ４Ｃ）を、ＤＮＡプローブとともにインキュベートした。Ｆｉｇ４Ｃに見られるように、プローブされた癌細胞は、ＨＬ-６０（前骨髄球性白血病）、ＨｅＬａ細胞、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＭＯＬＴ-４（リンパ芽球性白血病）、Ｒａｊｉ（バーキットのリンパ腫）、ＳＷ４８０（結腸直腸腺癌）、Ａ５４９（肺癌）、及びＧ３６１（黒色腫）を含む。また、ＵＣＰ２の発現もヒト脳多重組織ブロットをヒトＵＣＰ２ｃＤＮＡでプローブすることにより試験した（Ｆｉｇ４Ｇ）。全てのブロットを、次いでβ-アクチンｃＤＮＡでプローブした。
ノーザン分析は、製造者（Clontech）の指示に従って実施した。ブロットは、ｘ-線に終夜暴露した後に現像した。
Ｆｉｇ４Ａ-４Ｈに示すように、ＵＣＰ４ｍＲＮＡ転写物が検出された。発現は、脳組織、脊髄、髄質、脳梁、及び黒質に見られたが、試験した他のヒト組織又は癌細胞系には見られなかった。ＵＣＰ４転写レベルは、脊髄、髄質、脳梁、及び黒質より脳組織において高かったが（Ｆｉｇ４Ａ、４Ｅ、及び４Ｆ）、ＵＣＰ４転写レベルは脊髄及び髄質においてより高かった（Ｆｉｇ４Ｇ）。ヒト胎児組織ブロットにおいては、ＵＣＰ４転写は脳においてのみ見られた（Ｆｉｇ４Ｈ）。
【００５６】
実施例３
ハイブリッド形成プローブとしてのＵＣＰ４の使用
以下の方法は、ＵＣＰ４をコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟ＵＣＰ４（Ｆｉｇ２、配列番号：２に示す）のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類（ＵＣＰ４の天然発生変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして使用される。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＵＣＰ４ポリペプチド誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアルデヒド、5xＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード溶液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列ＵＣＰ４をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【００５７】
実施例４：大腸菌におけるＵＣＰ４の発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による、ＵＣＰ４ポリペプチドの調製を例示する。
全長ＵＣＰ４をコードするＤＮＡ配列（配列番号：２）は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、場合によっては抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、polyhisリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＵＣＰ４コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートにおいて成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
さらに数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。シグナル配列が存在せず、発現されたＵＣＰ４が細胞内である場合、遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＵＣＰ４タンパク質を金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製した。シグナル配列が存在する場合、発現されたＵＣＰ４は細胞の周辺質又は培養培地から得ることができる。ＵＣＰ４ポリペプチドの抽出及び／又は可溶化は、この分野で知られた試薬及び技術を用いて実施できる（例えば、米国特許第5,663,304号；第5,407,810号参照）。
【００５８】
実施例５
哺乳動物細胞におけるＵＣＰ４の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＵＣＰ４の調製を例示する。
発現ベクターとして、ベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＵＣＰ４ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたような結合方法を用いてＵＣＰ４ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＵＣＰ４と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μgのｐＲＫ５-ＵＣＰ４ＤＮＡを約1μgのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982)］と混合し、500μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMＥＤＴＡ、0.227MＣａＣｌ_２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ_４を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロールを30分間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄して新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/mlの^３５Ｓ-システイン及び200μCi/mlの^３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＵＣＰ４ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【００５９】
これに換わる技術において、ＵＣＰ４は、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのｐＲＫ５-ＵＣＰ４ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＵＣＰ４を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＵＣＰ４はＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＵＣＰ４は、ＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は^３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＵＣＰ４ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＵＣＰ４を含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグＵＣＰ４は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＵＣＰ４はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のpoly-hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。poly-hisタグＵＣＰ４挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたpoly-hisタグＵＣＰ４を含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ^２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
これに換わる方法では、ＵＣＰ４は細胞内に発現させてもよい（シグナル配列無しが用いられる場合）。この細胞内発現、それに続く抽出又は可溶化及び精製は、この分野で知られた技術及び試薬を用いて実施してよい。
【００６０】
実施例６
酵母菌でのＵＣＰ４ポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＵＣＰ４の組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＵＣＰ４の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＵＣＰ４をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＵＣＰ４の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＵＣＰ４をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＵＣＰ４シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば、酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＵＣＰ４の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。あるいは、ＵＣＰ４の天然シグナル配列が用いられる。
S.Cerevisiae酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、例えば米国特許第4,775,662号及び第5,010,00号に記載されたような選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分離、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色により分析することができる。
続いて組み換えＵＣＰ４は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＵＣＰ４を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。これに換わる方法では、ＵＣＰ４は細胞内に発現させてもよい（シグナル配列無しが用いられる場合）。この細胞内発現、それに続く抽出又は可溶化及び精製は、この分野で知られた技術及び試薬を用いて実施してよい。
【００６１】
実施例７
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＵＣＰ４の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＵＣＰ４の組換え発現を記載する。
ＵＣＰ４をコードする配列は、発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、poly-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＵＣＰ４コード化配列又はＵＣＰ４コード化配列の所定部分が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。ベクターは、分泌が望まれる場合には、ＵＣＰ４の天然シグナル配列を含んでもよい。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold（商品名）ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4〜5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【００６２】
次に、発現されたpoly-hisタグＵＣＰ４は、例えばＮｉ^２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mLＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMＭｇＣｌ_２；0.1mMＥＤＴＡ；10%グリセロール；0.1%ＮＰ−４０；0.4MＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMＮａＣｌ、10%グリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45ミクロンフィルターで濾過した。Ｎｉ^２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ_２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMＮａＣｌ、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ_２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ^２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ_１０-タグＵＣＰ４を含む分画をプールし、負荷バッファーに対して透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＵＣＰ４の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【００６３】
実施例８
ＵＣＰ４によって誘発されたミトコンドリア膜電位変化の測定
ＵＣＰ４のミトコンドリア膜電位に対する効果を決定するためにアッセイを実施した。
ヒト胚腎臓２９３細胞（ATCC CRL 1573）を培養培地（ＤＭＥＭ、10%ウシ胎児血清、2mMＬ-グルタミン、100単位/mlペニシリン、100マイクログラム/mlストレプトマイシン）中で、6-ウェルプレートにおいて60%-80%の集密度まで増殖させFuGene（商品名）6形質移入試薬（Boehringer Mannheim；製造者の指示通り）を用いて、ＵＣＰ発現作成物（ｐｃＤＮＡ３ＵＣＰ４又はｐｃＤＮＡＵＣＰ３）、ＮＨ_２-末端Flagタグを持つＵＣＰ発現作成物（ｐｃＤＮＡ３Ｆｌａｇ-ＵＣＰ４又はｐｃＤＮＡＦｌａｇ-ＵＣＰ３）、又はベクター対照物（ｐｃＤＮＡ３；Invitrogenから市販）で一過性形質移入させた。
ＵＣＰ４コード化ｃＤＮＡのＮＨ_２-末端Flagタグ有無での発現作成物は、実施例１に従って調製した。ＵＣＰ３コード化ｃＤＮＡの発現作成物は、最初に黒色腫ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲによってヒトＵＣＰ３コード化ｃＤＮＡを得ることにより調製した。ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー
GCGAAGCTTGCCATGGTTGGACTGAAGCCTTCAGA（Ｕ３０１）（配列番号：７）
逆方向ＰＣＲプライマー
CGCGAATTCTCAAAACGGTGATTCCCGTAACAT（Ｕ３０２）（配列番号：８）
ＮＨ_２-末端Flagタグを持つＵＣＰ３コード化ｃＤＮＡの発現作成物は、以下のＰＣＲプライマーによって調製した。
正方向ＰＣＲプライマー
GCGAAGCTTGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGTTGGACTGAAGCCTTCAGACG（Ｕ３０３）（配列番号：９）
逆方向ＰＣＲプライマー
CGCGAATTCTCAAAACGGTGATTCCCGTAACAT（Ｕ３０２）（配列番号：８）
ＮＨ_２-末端Flagタグを持つ又は持たないＵＣＰ３は、ｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３ＵＣＰ３又はｐｃＤＮＡ３Ｆｌａｇ-ＵＣＰ３）に、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位との間にクローニングし、ＤＮＡ配列決定により確認した。２９３細胞で発現されたFlag-タグＵＣＰ３及びＵＣＰ４は、抗-FlagＭ２モノクローナル抗体（Kodak）及びＥＣＬ検出キット（Pietce）を用いたウェスタンブロット分析により検出した。
【００６４】
ミトコンドリア膜電位は、この分野で公知の方法に従って分析した。［Salvioli等, FEBS Lett., 411: 77-82 (1997); Smiley等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3671-3675 (1991)］。形質移入の約24-36時間後、細胞をトリプシン処理し、1.5x10^６を遠心分離によってペレット化した。ペレット化細胞を0.5mlのＪＣ-１染料溶液中に再懸濁し、50μmのＣＣＣＰ（カルボニルシアニドｍ-クロロフェニルヒドラゾン；Sigma）の存在下又は不存在下で、暗中37℃で30分間インキュベートした。ＪＣ-１（５,５',６,６'-テトラクロロ-１,１',３,３'-テトラエチルベンズイミダゾールカルボシアニンヨウ化物；Moleculara Probes, Eugene, OR）は、膜電位感受性の蛍光染料である。染料溶液を調製するために、ＪＣ-１を最初に5mg/mlの濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Sigma）中のストック溶液として調製した。ストック溶液をＤＭＳＯで1mg/mlまで希釈し、次いで37℃に予熱した培養培地で10μg/mlまで更に希釈し、.45μm及び.2μmフィルター両方を通して濾過して凝集したＪＣ-１を除去した。
染色した細胞を洗浄し、1.0mlの培養培地中に再懸濁した。培養培地中に再懸濁した細胞を分光蛍光分析（RF5000U分光蛍光光度計；SHIMADZU, Japan）によって試験した。細胞のサブセットをフローサイトメトリー（Coulter EPICS Elite ESP, Hialeah, FL）によって分析した。分光蛍光分析のために、励起は488nmであり、放射は525nm及び590nmで測定した。フローサイトメトリー分析は、単一の488nm励起のアルゴンレーザー、FL1チャンネルで525+-20nm透過するフィルター、及びFL2チャンネルで590nmより上を透過するフィルターで実施した。試料当たり10,000細胞の最小値で分析した。
統計的分析も行った。分光蛍光分析からの赤色（593nm）対緑色（532nm）蛍光強度ピークの平均比率を処理間で比較した。処理当たり９の独立した形質移入が存在した。相違は、フィッシャーの保護された最少有意差（protected least significant difference）を用いて分析した。
結果をＦｉｇ５Ａ及び５Ｂに例示する。２９３細胞におけるＵＣＰ３の発現は、ミトコンドリア膜電位の低下を示す対照ベクター形質移入細胞に比較して、蛍光ピーク値時チル（593λ／532λ）を約15%減少させた(n=3)（Ｆｉｇ５Ａ）。ＵＣＰ４４で形質移入した細胞では、膜電位低下を示す蛍光強度は、対照ベクター形質移入細胞に比較して19%減少した(n=6)（Ｆｉｇ５Ａ及び５Ｂ）。ＮＨ_２-末端Flag-タグは、ＵＣＰ３又はＵＣＰ４の活性に影響を与えなかった。
またＦＡＣｓ分析は、同様のミトコンドリア膜電位の低下を示した。ＦＡＣｓ分析において、積分した赤色-対-緑色強度比率は、ＵＣＰ３形質移入細胞で18%、ＵＣＰ４形質移入細胞で24%低下した。化学的脱共役剤、ＣＣＣＰで処理した細胞も、赤色-対-緑色強度比率の低下を示した（Ｆｉｇ５Ａ及び５Ｂ）。
これらのデータは、ＵＣＰ３と同様に、ＵＣＰ４が脱共役活性を持つことを示唆している。
【００６５】
実施例９
ＵＣＰ４に結合する抗体の調製
この実施例は、ＵＣＰ４に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＵＣＰ４、ＵＣＰ４を含む融合タンパク質、及び細胞表面に組換えＵＣＰ４を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＵＣＰ４免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫してもよい。抗-ＵＣＰ４抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血によりマウスから血清試料を周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、ＵＣＰ４静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後にマウスを屠殺して脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いでそれをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害させた。
ハイブリドーマ細胞は、ＵＣＰ４に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＵＣＰ４に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＵＣＰ４モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【００６６】
実施例１０
細胞下局在化
ＵＣＰ４の細胞下局在化を試験するために、ヒト乳癌ＭＣＦ７細胞（ATCC HTB 22）を、ｐｃＤＮＡ３Ｆｌａｇ-ＵＣＰ３（実施例８に従って調製）又はｐｃＤＮＡ３Ｆｌａｇ-ＵＣＰ４（実施例１に従って調製）の何れかで、FuGene形質移入試薬（Boehrineger Mannheim）を用いて形質移入した。形質移入細胞を、3%ホルムアルデヒド中で室温において15分間固定し、1%のトリトンＸ-100で15分間透明化した。細胞を抗-Flagモノクローナル抗体（10μg/ml；Kodak）及び抗-チトクロムＣオキシダーゼ抗体（ミトコンドリア性マーカー）（3ng/ml）とともに20分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、Ｃｙ３（商品名）-抱合(ロバ抗-マウス；Jackson Laboratories）及びＦＩＴＣ-抱合（ロバ抗-ウサギ；Jackson Laboratories）二次抗体とともにインキュベートした。次いで細胞を蛍光顕微鏡で検査した。
Ｆｉｇ６Ａ-６Ｆは、ＵＣＰ３及びＵＣＰ４がミトコンドリア性マーカーと共存することを示す。
【００６７】
実施例１１
食物及び温度ストレスを受けたマウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発現
ＵＣＰ４が代謝において重要なその場での脱共役活性を有するか否かを評価するために、食物及び温度ストレス、即ち代謝的負荷を受けたマウスの組織で生成されるＵＣＰ４ｍＲＮＡの量を測定した。ＵＣＰ４が代謝において持ちうる役割に応じて、組織で生成されるＵＣＰ４ｍＲＮＡの量は、絶食、脂肪消費、及び室温未満の温度への暴露といった代謝に対するストレスで変化しうる。
この実験におけるマウスは、特に記さない限り、通常の齧歯類固形飼料（Purina Rodent Chow 5010; Purina, St. Louis, MO）及び水を適宜に与えた。実験したマウスの型は、実験マウスの代謝に負荷するのに用いた条件に応じて変化し、以下に記載される。
一般的に、実験したマウスは、１日に午前6:00から午後6:00まで12時間日光にさらし、続く12時間は暗中にさらした。
組織を取り出す直前にマウスをＣＯ_２下で犠牲にし、それは特に記さない限り午前8:00から12:00の朝方に行った。組織を取り出し、全組織ＲＮＡをBiotecx Lab, Houston, TXからの試薬及びプロトコールを用いて調製した。各マウスから多くの組織が回収されたが、実験は脳におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生量の測定に集中した（脳は高いＵＣＰ４遺伝子発現を有するため）。実験には少なくとも5マウス／処理を使用した。
【００６８】
収集した組織中のＵＣＰ４ｍＲＮＡ量の測定のために、定量的逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）を用いた。ＲＴ-ＰＣＲはｍＲＮＡ試料を用いて実施した［Heid等, Genome Research, 6: 986-994 (1996); Gibson等, Genome Research, 6: 995-1001 (1996)］。一般的に、定量的ＲＴ-ＰＣＲを実施するために、ＵＣＰ４に特異的なプライマー及びプローブを使用した（TaqMan Instrument, PE Biosciences, Foster City, California）。値は、β-アクチンｍＲＮＡ発生量を負荷対照として用いてｍＲＮＡ負荷について補正した。以下のプライマー及びプローブを使用した：
ＵＣＰ４について：
正方向プライマー：5'AAT GCC TAT CGC CGA GGA G3'（配列番号：１０）；
逆方向プライマー：5'GTA GGA ACT TGC TCG TCC GG3'（配列番号：１１）；
プローブ：5'(FAM)TGC TCG CGC TCA CGC AGA GAT G 3'（配列番号：１２）(TAMARA)3'。
ベータ-アクチンについて：
正方向プライマー：5'GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAG3'（配列番号：１３）；
逆方向プライマー：5'CTC CTT CTG CAT CCT GTC AGC AA3'（配列番号：１４）；
プローブ：5'(FAM)：CGG TTC CGA TGC CCT GAG GCT C 3'（配列番号：１５）(TAMARA)3'。
【００６９】
ＵＣＰ４ｍＲＮＡ発現に対する食物消費の影響
第１の実験では、実験マウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡに対する絶食及び食餌の影響を評価するために7週齢の雄マウス（C57BL/6J; BarHarbor, ME）を実験した。マウスを7週齢で得て、7週目に３つの群：自由に食餌させる対照マウス、24時間絶食させるマウス、及び24時間絶食させた後に24時間自由に食餌させるマウスに割り当てた。
第１群ついては自由に食餌させた後、第２群については24時間絶食させた後、そして第３群については最初に絶食させた後自由に食餌させた48時間後に上記のようにしてマウスを犠牲にした。上記のようにして組織を収集した。
上記の方法に従って脳組織に対して定量的ＲＴ-ＰＣＲを実施し、脳で生成されたＵＣＰ４ｍＲＮＡの量を定量化した。群間にある統計学的相違は、保護されたフィッシャーの最小有意差分析（L. Ott, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 3rd Ed., Boston: PWS-Kent Publishing Co., 1988）を用いて決定した。Ｆｉｇ８Ａから８Ｃに提示したデータは、平均+/-SEMを示す。
Ｆｉｇ８Ａは、24時間自由に食餌させたマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。Ｆｉｇ８Ｂは、絶食させたマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。Ｆｉｇ８Ｃは、24時間絶食させ、次いで24時間自由に食餌させたマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。
典型的には、絶食及び食物消費の制限は代謝速度を低下させ、絶食させたマウスでは自由に食餌させたマウスに比較してＵＣＰ４ｍＲＮＡの発現が減少することを示唆している。しかし、Ｆｉｇ８Ｂは、Ｆｉｇ８Ａに示した自由に食餌させたマウスに比較して、絶食させたマウスの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡ発現の現象を示していない。
【００７０】
ＵＣＰ４ｍＲＮＡ発現に対する脂肪消費の影響
第２の実験では、実験マウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡに対する高及び低脂肪食餌の影響を評価するために4週齢の雄マウス（A/J又はC57BL/6J; Jackson Labs, BarHarbor, ME）を実験した。「肥満傾向の」Ｃ５７ＢＬ６／Ｊに比較して、Ａ／Ｊマウスは高脂肪食餌でも「肥満耐性」であることが示されている（上掲のSurwit等参照）。これは、Ａ／Ｊ株における代謝効率の低さ、即ちそれらが明らかに摂取したカロリー当たりに身につけるカロリーが少ないことによる。
マウスを4週齢で得て、各々11%及び58%脂肪（%カロリー）を含むSurwit等, Metabolism, 44(5): 645-651 (1995)によって製剤された高脂肪肪食餌又は高脂肪食餌（Research Diets, Inc., Nwe Brunswick, New Jersey）をパターン化した後に即座にその何れかに配置した。動物を、約3週間自由に食餌させた（22-23日食餌）。ついでそれらを犠牲にし、それらの組織を上記のようにして収集した。上記の方法に従って脳組織に対して定量的ＲＴ-ＰＣＲを実施し、脳で生成されたＵＣＰ４ｍＲＮＡの量を定量化した。群間にある統計学的相違は、保護されたフィッシャーの最小有意差分析（L. Ott, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 3rd Ed., Boston: PWS-Kent Publishing Co., 1988）を用いて決定した。Ｆｉｇ９Ａ〜９Ｄに提示したデータは平均+/-SEMを示す。
Ｆｉｇ９Ａは、低脂肪食餌を与えたＡ／Ｊマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示し、Ｆｉｇ９Ｂは、高脂肪食餌を与えたＡ／Ｊマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。Ｆｉｇ９Ｃは、低脂肪食餌を与えたＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示し、Ｆｉｇ９Ｄは、高脂肪食餌を与えたＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスからの脳組織におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。
【００７１】
ＵＣＰ４に対する温度ストレスの影響
第３の実験では、マウスを温度ストレスにさらす影響を評価するために雄マウス（FVB-NJ; Gemantown, New York）を実験した。典型的には、齧歯類の寒冷暴露は代謝速度の上昇を誘発する。この代謝の向上が安定した体温を維持する。しかし、マウスの温熱中間帯（約30-35℃）内の温度への慢性的な暴露として定義される温暖順応は代謝速度を低下させる［Klaus等, Am. J. Physiol., 274: R287-R293 (1998)］。
この実験におけるマウスは、ケージ当たり2匹を収納し、無作為に次の群に割り当てた：対照群（22℃で3週間収納）、温暖順応群（33℃で3週間収納）、食物制限群（22℃で3週間収納したが、温暖順応マウスが前日に食した食物の平均量を毎日入手できるようにした）、寒冷負荷群（22℃で3週間収納した後、4℃への暴露を開始）。寒冷負荷マウスについては、早朝にマウスを4℃室に1、6、24、又は48時間配置することにより4℃に暴露し、その後マウスを犠牲にして組織を収集した。
上記のように6週齢においてマウスを犠牲にして組織を収集した。上記の方法に従って脳組織に対して定量的ＲＴ-ＰＣＲを実施し、脳で生成されたＵＣＰ４ｍＲＮＡの量を定量化した。群間にある統計学的相違は、保護されたフィッシャーの最小有意差分析（L. Ott, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 3rd Ed., Boston: PWS-Kent Publishing Co., 1988）を用いて決定した。Ｆｉｇ８Ａから８Ｃに提示したデータは、平均+/-SEMを示す。星印は少なくともp＜0.05の統計学的な相違を示す。
Ｆｉｇ１０Ａは、対照群のマウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。Ｆｉｇ１０Ｂ〜１０Ｅは、各々1、6、24、及び48時間の寒冷負荷をしたマウスの群におけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。Ｆｉｇ１０Ｆは、食物制限群のマウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示し、Ｆｉｇ１０Ｇは、温暖順応群のマウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発生率を例示する。
Ｆｉｇ１０Ｂから１０Ｅは全て、Ｆｉｇ１０Ａに示した対照群に比較して、寒冷負荷マウスにおけるＵＣＰ４ｍＲＮＡの発現の増加を示している。Ｆｉｇ１０Ｆ及び１０Ｇは、各々食物制限マウス及び温暖順応マウスについては、Ｆｉｇ１０Ａに示した対照群に比較して、同様のＵＣＰ４ｍＲＮＡの増加が見られないことを示している。
【００７２】
材料の寄託
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Boulevard., Manassas, VA, USA(ATCC)に寄託した：
材料 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日
DNA77568-1626 203134 1998年8 月18日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【００７３】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】 天然配列ＵＣＰ４の誘導アミノ酸配列を示す図である。
【Ｆｉｇ２】 天然配列ＵＣＰ４をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【Ｆｉｇ３】 ＵＣＰ４と他の脱共役タンパク質、ＵＣＰ１（配列番号：１６）、ＵＣＰ２（配列番号：１７）、及びＵＣＰ３（配列番号：１８）とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。６つの推定膜貫通ドメインは下線で示した（各々Ｉ〜ＶＩと標識した）。タンパク質配列の下に示した星印（*）は、３つの（３）推定ミトコンドリア担体タンパク質モチーフを示す。推定ヌクレオチド結合ドメインは二本線を付した。
【Ｆｉｇ４Ａ−Ｈ】 ノーザンブロット分析の結果を示す図である。末梢血白血球（ＰＢＬｓ）、癌細胞、及び胎児組織に加えてヒト成人脳組織（Clontech）をＵＣＰ４ｃＤＮＡでプローブした。図は、ＵＣＰ４転写物がヒト脳組織、脊髄、髄質、脳梁、及び黒質で検出されたことを示す。
【Ｆｉｇ５Ａ−Ｂ】 ミトコンドリア膜電位に対するＵＣＰ４発現の影響し測定するために実施したインビトロアッセイの結果を示す図である。
【Ｆｉｇ６Ａ−Ｆ】 ＵＣＰ４の細胞下局在化を測定するために実施したインビトロアッセイの結果を示す図である。
【Ｆｉｇ７】 選択したＥＳＴ配列から構築した「ｆｒｏｍＤＮＡ」配列を示す図である。
【Ｆｉｇ８Ａ−Ｃ】 ＵＣＰ４ｍＲＮＡ発現に対する食物摂取量の影響を測定するために実施したインビトロアッセイの結果を示す図である。
【Ｆｉｇ９Ａ−Ｄ】 ＵＣＰ４ｍＲＮＡ発現に対する脂肪摂取量の影響を測定するために実施したインビトロアッセイの結果を示す図である。
【Ｆｉｇ１０Ａ−Ｇ】 ＵＣＰ４ｍＲＮＡ発現に対する温度ストレスの影響を測定するために実施したインビトロアッセイの結果を示す図である。
【配列表】

Claims (39)

1. （ａ）配列番号：１に示すアミノ酸残基１〜３２３の配列を含むＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなり；該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドが哺乳動物におけるミトコンドリア膜電位を変調させる単離された核酸分子。
2. 配列番号：２に示す４０〜１０１１のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
3. 配列番号：２に示すヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
4. ＵＣＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなり、配列番号：２に示す４０〜１０１１のヌクレオチドを含む核酸の相補鎖に緊縮性条件下でハイブリッド形成し；コードされたＵＣＰ４ポリペプチドが哺乳動物におけるミトコンドリア膜電位を変調させる単離された核酸分子。
5. （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３４のｃＤＮＡ（ＤＮＡ７７５６８−１６２６）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなり；該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドが哺乳動物におけるミトコンドリア膜電位を変調させる単離された核酸分子。
6. （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３４のｃＤＮＡ（ＤＮＡ７７５６８−１６２６）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む請求項５に記載の単離された核酸分子。
7. （ａ）配列番号：１に示す１〜３２３のアミノ酸残基の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、該ポリペプチドが哺乳動物におけるミトコンドリア膜電位を変調させるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含んでなる単離された核酸分子。
8. （ａ）配列番号：１に示す１〜３２３のアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含んでなる請求項７に記載の単離された核酸分子。
9. 請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
10. 当該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項９に記載のベクター。
11. 請求項１０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
12. 前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 前記細胞が大腸菌細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
14. 前記細胞が酵母菌細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
15. 請求項１１に記載の宿主細胞を、前記ＵＣＰ４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から前記ＵＣＰ４ポリペプチドを回収することを含んでなるＵＣＰ４ポリペプチドの製造方法。
16. 請求項１に記載のＤＮＡによってコードされる単離されたＵＣＰ４ポリペプチド。
17. 配列番号：１に示す１〜３２３のアミノ酸残基の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでなり；該ポリペプチドが哺乳動物におけるミトコンドリア膜電位を変調させる単離されたＵＣＰ４ポリペプチド。
18. 配列番号：１に示す１〜３２３のアミノ酸残基を含んでなる請求項１７に記載の単離されたＵＣＰ４ポリペプチド。
19. 配列番号：１に示す１〜３２３のアミノ酸残基の配列を含んでなる単離されたＵＣＰ４ポリペプチド。
20. ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３４として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物（ＤＮＡ７７５６８−１６２６）にコードされる単離されたＵＣＰ４ポリペプチド。
21. 配列番号：１に示すアミノ酸残基１〜３２３からなる単離されたＵＣＰ４ポリペプチド。
22. 異種アミノ酸配列に融合した請求項１６ないし２１の何れか一項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
23. 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項２２に記載のキメラ分子。
24. 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項２２に記載のキメラ分子。
25. 請求項１６ないし２１の何れか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
26. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２５に記載の抗体。
27. 請求項９に記載のベクター、または、請求項１ないし８の何れか一項に記載の核酸に対するアンチセンスを含む、哺乳動物における代謝速度を変調させるための薬剤。
28. 前記ベクターが肥満哺乳動物における代謝速度の増加を刺激する請求項２７に記載の薬剤。
29. 請求項１ないし８の何れか一項に記載の核酸分子または請求項１６ないし２１の何れか一項に記載のポリペプチドを含む哺乳動物細胞又は組織試料を候補分子と接触させ、続いて前記試料における前記核酸分子またはポリペプチドの発現を分析することを含んでなる、前記核酸分子またはポリペプチドの発現を促進又はアップレギュレートする分子を同定するためのスクリーニングアッセイの実施方法。
30. 前記試料におけるミトコンドリア膜電位を分析することをさらに含む請求項２９に記載の方法。
31. 前記ポリペプチドが、配列番号：１に示すアミノ酸残基１〜３２３を含むポリペプチドである請求項２９に記載の方法。
32. 前記試料がヒト脳組織を含む請求項２９に記載の方法。
33. 前記候補分子が、合成有機又は無機化合物を含む小分子である請求項２９に記載の方法。
34. 請求項１ないし８の何れか一項に記載の核酸分子または請求項１６ないし２１の何れか一項に記載のポリペプチドを含む哺乳動物細胞又は組織試料を候補分子と接触させ、続いて前記試料における前記核酸分子またはポリペプチドの発現を分析することを含んでなる、前記核酸分子またはポリペプチドの発現を低下又はダウンレギュレートする分子を同定するためのスクリーニングアッセイの実施方法。
35. 前記試料におけるミトコンドリア膜電位を分析することをさらに含む請求項３４に記載の方法。
36. 前記ポリペプチドが、配列番号：１に示すアミノ酸残基１〜３２３を含むポリペプチドである請求項３４に記載の方法。
37. 前記試料がヒト脳組織を含む請求項３４に記載の方法。
38. 哺乳動物細胞又は組織試料をＤＮＡプローブと接触させ、続いて前記試料における請求項１６ないし２１の何れか一項に記載のポリペプチドのｍＲＮＡ転写物の発現を分析することを含んでなる、哺乳動物細胞又は組織試料中の前記ポリペプチドの発現を検出する方法。
39. 前記試料がヒト脳組織である請求項３８に記載の方法。

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