ES2297947T3 - Ucp4. - Google Patents

Abstract

Molécula aislada de ácido nucleico, que comprende: (a) ADN codificante de un polipéptido UCP4 y que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con una molécula de ácido nucleico codificante de la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1), (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), (c) ADN codificante de un polipéptido UCP4 que presenta una identidad de secuencia de 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (d) el complemento del ADN de (c).

Description

UCP4.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a la identificación y aislamiento de nuevo ADN que presenta homología con determinadas proteínas desacoplantes humanas, y con la producción recombinante de nuevos polipéptidos, denominados en la presente invención "proteína desacoplante 4" o "UCP4".

Antecedentes de la invención

Se ha informado en la literatura de la existencia de proteínas desacoplantes o "UCPs" que se cree que desempeñan un papel en el proceso metabólico. Se encontraron y describieron UCPs en las células adiposas pardas de animales hibernantes, tales como los osos. Se creía que las UCPs ayudaban a dichos hibernantes y a otros animales adaptados a climas fríos a mantener la temperatura interna corporal en tiempo frío mediante la elevación de la tasa metabólica basal del cuerpo. Debido a que el ser humano posee cantidades relativamente reducidas de tejido adiposo pardo, originalmente se creía que las UCPs desempeñaban un papel menor en el metabolismo humano.

En la actualidad se han descrito varias proteínas desacoplantes humanas diferentes [ver, de manera general, Gura, Science 280:1369-1370, 1998]. La proteína desacoplante humana denominada UCP1 fue identificada por Nicholls et al. Nicholls et al. demostraron que la membrana interna de las mitocondrias de las células adiposas pardas era muy permeable a las proteínas, y los investigadores rastrearon la permeabilidad observada a una proteína, denominada UCP1, presente en la membrana mitocondrial. Nicholls et al. informaron de que la UCP1, al crear dicha permeabilidad, reducía el número de moléculas de ATP que podían ser producidas a partir de una fuente alimenticia, incrementando de esta manera la tasa metabólica corporal y generando calor [Nicholls et al., Physiol. Rev. 64:1-64, 1984].

Posteriormente se encontró que UCP1 en efecto únicamente se producía en el tejido adiposo pardo [Bouillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:445-448, 1985; Jacobsson et al., J. Biol. Chem. 260:16250-16254, 1985]. Los estudios de mapaje genético han demostrado que el gen humano de UCP1 se encuentra situado en el cromosoma 4 [Cassard et al., J. Cell. Biochem. 43:255-264, 1990].

También se ha descrito otra UCP humana, denominada UCPH o UCP2 [Gimeno et al., Diabetes 46:900-906, 1997; Fleury et al., Nat. Genet. 15:269-272, 1997; Boss et al., FEBS Letters 408:39-42, 1997; ver también Wolf, Nutr. Rev. 55:178-179, 1997]. Fleury et al. enseñan que la proteína UCP2 presenta una identidad de aminoácidos de 59% con UCP1, y que UCP2 se localiza en regiones del cromosoma humano 11 que se han asociado a hiperinsulinemia y obesidad [Fleury et al., supra]. También se ha informado de que UCP2 se expresa en una diversidad de tejidos adultos, tales como el cerebro, músculos y células adiposas [Gimeno et al., supra, y Fleury et al., supra].

Una tercera UCP humana, UCP3, ha sido descrita recientemente por Boss et al., supra; Vidal-Puig et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 235:79-82, 1997; Solanes et al., J. Biol. Chem. 272:25433-25436, 1997; y Gong et al., J. Biol. Chem. 272:24129-24132, 1997]. [Ver también la patente británica nº 9716886]. Solanes et al. Informaron de que al contrario que UCP1 y UCP2, UCP3 se expresa preferentemente en músculo esquelético humano, y que el gen de UCP3 se localiza en el cromosoma humano 1, contiguo al gen UCP2 [Solanes et al., supra]. Gong et al. describen que la expresión de UCP3 puede regularse con estímulos termogénicos conocidos, tales como la hormona tiroidea, los agonistas beta3-adrenérgicos y la leptina [Gong et al., supra].

Descripción resumida de la invención

Se ha identificado un clon de ADNc (ADN 77568-1626) que presenta determinadas homologías con algunas proteínas desacoplantes humanas conocidas, que codifican un nuevo polipéptido, denominado en la presente solicitud "UCP4".

En una realización, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN codificante de un polipéptido UCP4.

En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende: (a) ADN codificante de un polipéptido UCP4 y que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, con una molécula de ADN que codifica un polipéptido UCP4 que comprende la secuencia de residuos aminoácidos de 1 a 323, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada codificante de un polipéptido UCP4 que comprende ADN que se hibrida con el complemento del ácido nucleico comprendido entre los nucleótidos 40 y 1.011, ambos inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2). Preferentemente, la hibridación se produce bajo condiciones de hibridación y lavado restrictivas.

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En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (a) ADN codificante de un polipéptido UCP4 y que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, con una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificada por el ADNc en el depósito ATCC nº 203134, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). En una realización preferente, el ácido nucleico comprende un ADN codificante del mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el depósito ATCC nº 203134.

En todavía un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (a) ADN codificante de un polipéptido UCP4 que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, más preferentemente de por lo menos 95% con la secuencia de residuos aminoácidos de 1 a 323, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o el complemento del ADN de (a).

La especificación da a conocer una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (a) ADN codificante de un polipéptido que puntúa por lo menos aproximadamente 80% de positivos, preferentemente por lo menos aproximadamente 85% de positivos, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% de positivos, todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% de positivos en comparación con la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a aproximadamente 323, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento del ADN de (a).

Asimismo, la especificación da a conocer fragmentos de la secuencia codificante de UCP4, que son suficientemente largos para utilizarse como sondas de hibridación. Preferentemente dichos fragmentos contienen por lo menos entre aproximadamente 20 y aproximadamente 80 bases consecutivas incluidas en la secuencia de la figura 2 (SEC ID nº 2). Opcionalmente dichos fragmentos incluyen el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la secuencia de la figura 2 (SEC ID nº 2).

En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende ADN codificante de UCP4 o las variantes del mismo. El vector puede comprender cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas indicadas anteriormente en la presente invención.

También se proporciona una célula huésped que comprende dicho vector. A título de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, E. coli o levaduras. Se proporciona además un procedimiento para producir polipéptidos UCP4 y que comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión de UCP4 y recuperar UCP4 del cultivo celular.

En otra realización, la invención proporciona polipéptido UCP4 aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas indicadas anteriormente en la presente invención.

En un aspecto específico, la invención proporciona polipéptido UCP4 de secuencia nativa aislado, que en una realización incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido UCP4 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos 90%, todavía más preferentemente de por lo menos 95% con la secuencia de los residuos aminoácidos 1 a 323, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1).

Asimismo, la especificación da a conocer un polipéptido UCP4 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que puntúa por lo menos aproximadamente 80% de positivos, preferentemente de por lo menos aproximadamente 85% de positivos, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90% de positivos, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95% de positivos en comparación con la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

Asimismo, la especificación da a conocer un polipéptido UCP4 aislado, que comprende la secuencia de residuos aminoácidos 1 a aproximadamente 323, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o un fragmento de la misma suficiente para, por ejemplo, proporciona un sitio de unión para un anticuerpo anti-UCP4. Preferentemente el fragmento de UCP4 conserva por lo menos una actividad biológica de un polipéptido UCP4 nativo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido UCP4 producido mediante (i) hibridación de una molécula de ADN de ensayo bajo condiciones restrictivas con: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido UCP4 que presenta la secuencia de residuos aminoácidos de 1 a 323, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y si la molécula de ADN de ensayo presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos 90%, todavía más preferentemente de por lo menos 95% con (a) o (b), mediante (ii) cultivo de una célula huésped que comprende la molécula de ADN de ensayo bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, e (iii) la recuperación del polipéptido a partir del cultivo celular.

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En otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden un polipéptido UCP4 fusionado a un polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende un polipéptido UCP4 fusionado a una secuencia de etiqueta epítopo o a una región Fc de una inmunoglobulina.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido UCP4. Opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

La especificación da a conocer agonistas y antagonistas de un polipéptido UCP4 nativo. En una realización particular, el agonista o antagonista es un anticuerpo anti-UCP4.

En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido UCP4 nativo, que comprende poner en contacto el polipéptido UCP4 nativo con una molécula candidata y realizar el seguimiento de la actividad deseada. La especificación da a conocer procedimientos terapéuticos y diagnósticos que utilizan UCP4.

Asimismo, la especificación da a conocer una composición que comprende un polipéptido UCP4, o un agonista o antagonista tal como se ha indicado anteriormente en la presente invención, en combinación con un portador.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos derivada de una UCP4 de secuencia nativa.

La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc codificante de UCP4 de secuencia nativa.

La figura 3 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de UCP4 con otras proteínas desacoplantes conocidas, UCP1 (SEC ID nº 16), UCP2 (SEC ID nº 17) y UCP3 (SEC ID nº 18). Se muestran subrayados los seis putativos dominios transmembranales (marcados I a VI, respectivamente). Los asteriscos (*) mostrados debajo de la secuencia de la proteína indican tres (3) putativos motivos de proteína portadora mitocondrial. Un putativo dominio de unión de nucleótidos se encuentra doblemente subrayado.

Las figuras 4A a 4H muestran los resultados del análisis de transferencia northern. Se sondearon con ADNc de UCP4, tejidos adultos humanos y tejidos cerebrales (Clontech), además de leucocitos de sangre periférica (PBLs), células de cáncer y tejidos fetales. Las figuras ilustran que el transcrito de UCP4 fue detectado en tejidos cerebrales humanos, médula espinal, médula, cuerpo calloso y sustancia negra.

Las figuras 5A a 5B muestran los resultados de los ensayos in vitro llevados a cabo para determinar los efectos de la expresión de UCP4 sobre el potencial de membrana mitocondrial.

Las figuras 6A a 6F muestran los resultados de los ensayos in vitro llevados a cabo para determinar la localización subcelular de UCP4.

La figura 7 muestra una secuencia de "ADN from" ensamblada a partir de secuencias EST seleccionadas.

Las figuras 8A a 8C muestran los resultados de los ensayos in vitro llevados a cabo para determinar el efecto del consumo alimentario sobre la expresión de ARNm de UCP4.

Las figuras 9A a 9D muestran los resultados de ensayos in vitro llevados a cabo para determinar el efecto del consumo de grasas sobre la expresión de ARNm de UCP4.

Las figuras 10A a 10G muestran los resultados de los ensayos in vitro llevados a cabo para determinar el efecto del estrés térmico sobre la expresión de ARNm de UCP4.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes I. Definiciones

Las expresiones "polipéptido UCP4", "proteína UCP4" y "UCP4" tal como se utilizan en la presente invención comprenden UCP4 de secuencia nativa y variantes de UCP4 (que se definen adicionalmente en la presente invención). El UCP4 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tal como tipos de tejido humano, o de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos de recombinación y/o de síntesis.

Una "UCP4 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que una UCP4 derivada naturalmente. Dicha UCP4 de secuencia nativa puede aislarse naturalmente o puede producirse mediante medios recombinantes y/o sintéticos. La expresión "UCP4 de secuencia nativa" específicamente comprende formas truncadas o solubles de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas alternativamente procesadas) y variantes alélicas de origen natural de UCP4. En una realización de la invención, la UCP4 de secuencia nativa es una UCP4 de secuencia nativa madura o de longitud completa, que comprende los aminoácidos 1 a 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

La expresión "variante de UCP4" se refiere a cualquier secuencia que no sea una UCP4 de secuencia nativa, e incluye UCP4 que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80% con la secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 323 de la secuencia del polipéptido UCP4 mostrado en la figura 1 (SEC ID nº 1). Entre dichas variantes de UCP4 se incluyen, por ejemplo, polipéptidos UCP4 en los que se añaden o se delecionan uno o más residuos aminoácidos en el extremo N-terminal o C-terminal, así como dentro de uno o más dominios internos, de la secuencia de la figura 1 (SEC ID nº 1). Habitualmente una variante de UCP4 presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, y más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95% con la secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de UCP4 identificada en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia de UCP4 tras alinear las secuencias e introducir los huecos, si resulta necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El % de identidad puede determinarse con WU-BLAST2, obtenido de [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996; http://blast.wustl/edu/blast/
README.html]. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayor parte de los cuales se fijan en valores por defecto. Los parámetros ajustables se fijan en los valores siguientes: overlap scan=1, overlap fraction=0,125, word threshold (T)=11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y el programa mismo los fija en dependencia de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular frente a la que se está buscando la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para incrementar la sensibilidad. Se determina un % de identidad de secuencia de aminoácidos a partir del número de residuos idénticos correspondientes dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que presenta los residuos más recientes en la región alineada (los huecos introducidos por WU-Blast-2 para maximizar la puntuación de alineación se ignoran).

El término "positivos" en el contexto de la comparación de secuencias llevada a cabo tal como se ha descrito anteriormente, incluye residuos en las secuencias que se comparan no idénticos pero que presentan propiedades similares (por ejemplo como resultado de las sustituciones conservadoras). El valor de % de positivos se determinan a partir de la fracción de residuos que puntúa un valor positivo en la matriz BLOSUM 62 dividido por el número total de residuos en la secuencia más larga, tal como se ha definido anteriormente.

De manera similar, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia codificante de UCP4. Los valores de identidad pueden generarse con el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 configurado con los parámetros por defecto, fijando overlap scan y overlap fraction a 1 y 0,125, respectivamente.

El término "aislado" cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos dados a conocer en la presente invención, se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica (1) en grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminales o internos mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye un polipéptido in situ dentro de células recombinantes, debido a que por lo menos un componente del ambiente natural de UCP4 no se encontrará presente. Sin embargo, habitualmente el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico codificante de un polipéptido UCP4 es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que habitualmente se encuentra asociada en la fuente natural del ácido nucleico codificante de UCP4. La molécula aislada de ácido nucleico codificante de UCP4 es diferente de la forma o ambiente en la que se encuentra en la Naturaleza. Por lo tanto, las moléculas aisladas de ácido nucleico se distinguen de la molécula de ácido nucleico codificante de UCP4 en la forma en que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico codificante de un polipéptido UCP4 incluye moléculas de ácido nucleico codificantes de UCP4 contenidas en células que expresan habitualmente UCP4 en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión ribosómica. Resulta conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligada a ADN de un polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se sitúa de manera que facilite la traducción. Generalmente, "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, a que son contiguas y presentan el mismo marco de lectura. Sin embargo, no resulta necesario que los intensificadores sean contiguos. El ligamiento se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si este tipo de sitios no existe, se utilizan oligonucleótidos adaptadores sintéticos o línkers de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales anti-UCP4 individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpo anti-UCP4 con especificidad poliepitópica. La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación puede ser fácilmente determinada por el experto ordinario en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación correcta, mientras que sondas más cortas requieren temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de hibridarse nuevamente cuando se encuentran presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de la temperatura de fusión de las mismas. Cuando más elevado sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, más elevada puede ser la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se infiere que las temperaturas relativas más elevadas tienden a incrementar la astringencia de las condiciones de reacción, mientras que temperaturas más bajas la reducen. Para más detalles y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.

Las "condiciones restrictivas" o "condiciones de elevada astringencia", tal como se definen en la presente invención, pueden identificarse como aquéllas en las que: (1) se utiliza una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC, (2) se utiliza durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo 50% de formamida (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC, o (3) se utiliza 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de elevada astringencia consistente de 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente restrictivas" pueden identificarse tal como describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos restrictivas que aquéllas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a una temperatura aproximada de entre 37ºC y 50ºC. El experto en la materia conocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según resulte necesario para adaptarse a la longitud de la sonda y similares.

La expresión "etiquetado con epítopo" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido UCP4 fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede fabricarse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido al que se encuentra fusionado. El polipéptido etiqueta preferentemente también es moderadamente único, de manera que el anticuerpo no reacciona cruzadamente en grado sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente presentan por lo menos seis residuos aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Los términos "activo" o "actividad" para los fines de la presente invención se refieren a una o más formas de UCP4 que conservan las actividades biológicas y/o inmunológicas de UCP4 nativo o de origen natural. Una actividad preferente es la capacidad de afectar al potencial de la membrana mitocondrial de una manera que resulta en una regulación positiva o negativa de la tasa metabólica y/o de la producción de calor. Una de estas actividades incluye la generación de fugas de protones en la membrana mitocondrial que resultan en un incremento de la tasa metabólica. La actividad puede medirse o cuantificarse in vitro o in vivo.

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o completamente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica y/o inmunológica de un polipéptido UCP4 nativo dado a conocer en la presente invención. De manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica y/o inmunológica de un polipéptido ICP4 nativo dado a conocer en la presente invención. Entre las moléculas de agonista o antagonista adecuadas se incluyen específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas, o fragmentos de los mismos, inmunoadhesinas de polipéptidos UCP4, o fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos UCP4 nativos.

El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o a medidas preventivas, en el que el objetivo es prevenir o enlentecer (reducir) la condición o trastorno patológico bajo tratamiento. Entre aquellos que requieren tratamiento se incluyen aquellos con el trastorno, así como aquellos con tendencia a presentar el trastorno o aquellos en los que debe prevenirse el trastorno.

La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de una manera continua, y no de un modo agudo, de manera que se mantiene el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo de tiempo prolongado. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se lleva a cabo consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.

El término "mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de competición o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

II. Composiciones y procedimientos A. UCP4 de longitud completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos nuevamente identificados y aislados que codifican polipéptidos denominados en la presente solicitud UCP4. En particular, se ha identificado y aislado ADNc codificante de un polipéptido UCP4, tal como se da conocer en más detalle en los Ejemplos posteriormente. Por simplicidad, en la presente especificación la proteína codificada por el ADN 77568-1626, así como todos los homólogos nativos adicionales y variantes incluidas en la definición anterior de UCP4 se denominarán "UCP4", con independencia del origen o modo de preparación de los mismos.

Tal como se da a conocer en los Ejemplos posteriormente, se ha depositado en la ATCC un clon del ADN 77568-1626. La secuencia de nucleótidos real del clon puede ser fácilmente determinada por el experto en la materia mediante la secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios de la técnica. La secuencia de aminoácidos teórica puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando conocimientos ordinarios de la técnica. Para la UCP4 de la presente invención, los solicitantes han identificado lo que se considera es el marco de lectura más identificable con la información de secuencia disponible en el momento de presentación.

Utilizando el programa informático DNASTAR Megalign (y algoritmos y parámetros en este programa fijados por el fabricante) (Oxford Molecular Group, Inc.), se ha descubierto que una UCP4 de secuencia nativa de longitud completa (mostrada en la figura 1 y SEC ID nº 1) presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 34% con UCP3, una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 33% con UCP2 y una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 29% con UCP1. Por consiguiente, en la actualidad se cree que UCP4 dada a conocer en la presente solicitud es un elemento nuevamente identificado de la familia de las proteínas desacoplantes humanas y puede presentar una o más actividades y/o propiedades típicas de dicha familia de proteínas, tal como la capacidad de intensificar o de suprimir la tasa metabólica al afectar el potencial de membrana mitocondrial.

B. Variantes de UCP4

Además de los polipéptidos UCP4 de secuencia nativa de longitud completa indicados en la presente invención, se contempla que puedan prepararse variantes de UCP4. Las variantes de UCP4 pueden prepararse mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ADN de UCP4 y/o mediante la síntesis del polipéptido UCP4 deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos post-traduccionales de la UCP4, tal como modificar el número o posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.

Pueden realizarse variaciones en la UCP4 de secuencia nativa de longitud completa o en diversos dominios de la UCP4 indicada en la presente invención, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para las mutaciones conservadoras y no conservadoras proporcionadas, por ejemplo, en la patente US nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones codificantes de UCP4 que resultan en un cambio de la secuencia de aminoácidos de la UCP4 en comparación con la UCP4 de secuencia nativa. Opcionalmente la variación se realiza mediante sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de la UCP4. Pueden encontrarse guías para determinar qué residuo aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar negativamente la actividad deseada mediante la comparación de la secuencia de UCP4 con la de moléculas de proteína homólogas conocidas y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos realizados en las regiones de homología elevada. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructuras y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las inserciones o deleciones pueden encontrarse opcionalmente comprendidas en el intervalo de entre 1 y 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y, si se desea, someter a ensayo las variantes resultantes para actividad en ensayos conocidos de la técnica o tal como se describe en la presente invención.

La especificación da a conocer variantes de UCP4 que son fragmentos de la UCP4 de longitud completa. Preferentemente dichos fragmentos conservan una actividad o propiedad deseada de la UCP4 de longitud completa.

Las variaciones pueden realizarse utilizando procedimientos conocidos de la técnica, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (sitio-dirigida), el rastreo de alaninas y la mutagénesis por PCR. La mutagénesis sitio-dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487, 1987], la mutagénesis por inserción de casete [Wells et al., Gene 34:315, 1985], la mutagénesis por selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415, 1986] o pueden llevarse a cabo otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de UCP_{4}.

También puede utilizarse el análisis por rastreo de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferentes se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre estos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido preferente de rastreo de entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y resulta menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989]. La alanina típicamente también resulta preferente debido a que es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se encuentra en posiciones tanto interiores como expuestas [Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1, 1976). Si la sustitución de alaninas no proporciona cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.

C. Modificaciones de UCP4

Las modificaciones covalentes de UCP4 se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoácidos diana de un polipéptido UCP4 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con residuos N-terminales o C-terminales de UCP4. La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil, por ejemplo, para entrecruzar UCP4 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para la utilización en el procedimiento de purificación de los anticuerpos anti-UCP4, y viceversa. Entre los agentes entrecruzantes utilizados comúnmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Entre otras modificaciones se incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo en los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86, 1983], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido UCP4 comprendido dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón nativo de glucosilación del polipéptido. La expresión "alterar el patrón nativo de glucosilación" pretende referirse, para los fines de la presente invención, a la deleción de uno o más grupos carbohidrato en UCP4 de secuencia nativa (mediante eliminación del sitio de glucosilación subyacente o mediante deleción de la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran presentes en la UCP4 de secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implica un cambio en la naturaleza y las proporciones de los diversos grupos carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glucosilación al polipéptido UCP4 puede conseguirse mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la adición o la sustitución por uno o más residuos serina o treonina de la UCP4 de secuencia nativa (para los sitios de glucosilación O-ligados). La secuencia de aminoácidos de UCP4 opcionalmente puede alterarse mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mediante mutación del ADN codificante del polipéptido UCP4 en bases preseleccionadas, de manera que se generen codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados.

Otro medio de incrementar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido UCP4 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptidos. Estos procedimientos se encuentran descritos en la técnica, por ejemplo en la patente WO nº 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306, 1981.

La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el polipéptido UCP4 puede conseguirse química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones codificantes de residuos aminoácidos que sirven de dianas para la glucosilación. Se conocen de la técnica procedimientos de desglucosilación química y se describen, por ejemplo, en Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987, y en Edge et al., Anal. Biochem. 118:131, 1981. El corte enzimático de grupos carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante la utilización de una diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas, tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350, 1987.

Otro tipo de modificación covalente de UCP4 comprende unir el polipéptido UCP4 a una de entre una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera descrita en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337.

La UCP4 de la presente invención también puede modificarse de manera que se forme una molécula quimérica que comprende UCP4 fusionado con otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo.

En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de la UCP4 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epítopo generalmente se sitúa en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de la UCP4. La presencia de dichas formas etiquetadas con epítopo de la UCP4 puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta epítopo permite purificar fácilmente la UCP4 mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta epítopo. Diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas polihistidina (poli-his) o polihistidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165, 1988]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 del mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985], y la etiqueta glucoproteína D (gD) del virus herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210, 1988], el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science 255:192-194, 1992], un péptido epítopo \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991] y la etiqueta péptido de la proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397, 1990].

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de la UCP4 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser con la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig preferentemente incluyen la sustitución de una forma soluble (con deleción o inactivación del dominio transmembranal) de un polipéptido UCP4 en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una realización particularmente preferente, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina, ver también la patente US nº 5.428.130, publicada el 27 de junio de 1995.

La UCP4 de la invención también puede modificarse de manera que forme una molécula quimérica que comprende UCP4 fusionada con una cremallera de leucina. Se han descrito en la técnica diversos polipéptidos de cremallera de leucina. Ver, por ejemplo, Landschulz et al., Science 240:1759, 1988; patente WO nº 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters 344:1991, 1994; Maniatis et al., Nature 341:24, 1989. Los expertos en la materia apreciarán que la cremallera de leucina puede fusionarse en el extremo 3' o 5' de la molécula de UCP4.

D. Preparación de UCP4

La descripción posterior se refiere principalmente a la producción de UCP4 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de UCP4. Evidentemente se encuentra contemplado que puedan utilizarse procedimientos alternativos, que son bien conocidos de la técnica, para preparar UCP4. Por ejemplo, la secuencia de UCP4, o partes de la misma, puede producirse mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 1969; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963]. La síntesis in vitro de proteína puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Pueden sintetizarse químicamente diversas partes de UCP4 separadamente y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir UCP4 de longitud completa.

1. Aislamiento de ADN codificante de UCP4

Puede obtenerse ADN codificante de UCP4 a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que presenta el ARNm de UCP4 y que lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, puede obtenerse convenientemente ADN de UCP4 humano obtenido a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen codificante de UCP4 también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Pueden cribarse bibliotecas con sondas (tales como anticuerpos contra UCP4 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo de aislar el gen codificante de UCP4 es utilizar metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995].

Los Ejemplos posteriormente describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas deben presentar longitud suficiente y ser suficientemente poco ambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido preferentemente se marca de manera que pueda detectarse mediante hibridación con ADN en la biblioteca que se criba. Son bien conocidos de la técnica procedimientos de marcaje, e incluyen la utilización de marcajes radioactivos, tales como ATP marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra, y se han descrito anteriormente en la Sección I.

Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa puede determinarse mediante alineación de secuencias utilizando programas informáticos públicamente disponibles (ajustados a parámetros por defecto), tales como BLAST, BLAST2, ALIGN, DNAstar e INHERIT, que miden la identidad o los positivos en la comparación de secuencias.

Puede obtenerse ácido nucleico que presenta secuencia codificante de proteína mediante cribado de bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionadas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida dada a conocer en la presente invención y, si resulta necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión de cebador tal como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de ARNm que pueden no haberse transcrito inversamente en ADNc.

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2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o se transforman con vectores de expresión o de clonación descritos en la presente invención para la producción de UCP4 y cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como los medios, la temperatura, el pH y similares, pueden ser seleccionados por el experto en la materia sin necesidad de experimentación excesiva. En general, pueden encontrarse principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, editor (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

El experto ordinario en la materia conoce procedimientos de transfección, por ejemplo CaPO_{4} y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándares apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación, se utilizan generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. La infección por Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene 23:315, 1983, y la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457, 1978. Se han descrito aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero en la patente US nº 4.399.216. Las transformaciones de levaduras típicamente se llevan a cabo siguiendo el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, y Hsiao et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537, 1990, y Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988.

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procarióticas, de levadura o de eucarióticas superiores. Entre los procariotas adecuados se incluyen, aunque sin limitación, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo Enterobacteriáceas, tales como E. coli. Se encuentran públicamente disponibles diversas cepas de E. coli, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC nº 31.446), E. coli X1776 (ATCC nº 31.537), E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27.325) y K5 772 (ATCC nº 53.635).

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Además de los procariotas, los microbios eucarióticos, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, resultan huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores codificantes de UCP4. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado comúnmente.

Las células huésped adecuadas para la expresión de UCP4 glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Entre los ejemplos más específicos se incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC nº CRL 1651), la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977), las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), células pulmonares humanas (W138, ATCC nº CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera que se encuentra comprendida dentro de los conocimientos de la técnica.

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3. Selección y utilización de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genómico) que codifica UCP4 puede insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación de ADN) o para la expresión. Se encuentran públicamente disponibles diversos vectores. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en uno o más sitios de restricción de endonucleasa apropiados utilizando técnicas conocidas de la técnica. Entre los componentes del vector de manera general se incluyen, aunque sin limitación, una o más secuencias de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de dichos componentes utiliza técnicas de ligación estándares que son conocidas por el experto en la materia.

La UCP4 puede producirse recombinantemente no sólo directamente, sino también en forma de un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que presente un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN codificante de UCP4 que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o los líderes termoestables de la enterotoxina II. Para la secreción por levaduras, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder factor alfa (incluyendo los líderes factor \alpha de Saccharomyces o de Kluyveromyces; encontrándose descrito éste último en la patente US nº 5.010.182), o el líder fosfatasa ácida, el líder glucoamilasa de C. albicans (patente EP nº 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en la patente WO nº 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como líderes secretorios víricos.

Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayor parte de bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2 \mum resulta adecuado para levaduras y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para la clonación de vectores en células de mamífero.

Los vectores de expresión y de clonación típicamente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que: (a) proporcionan resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas para complemento, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo el gen codificante de la D-alanina racemasa para los bacilos.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico que codifica UCP4, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. Un gen de selección adecuado para la utilización en levaduras es el gen trp1, presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene 7:141, 1979; Tschemper et al., Gene 10:157, 1980]. El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics 85:12, 1977].

Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor operablemente ligado a la secuencia de ácido nucleico que codifica UCP4 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una diversidad de células huésped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas de \beta-lactamasa y de promotor lactosa [Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp) [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983]. Los promotores para la utilización en sistemas bacterianos contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN que codifica UCP4.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para la utilización con huéspedes levaduras se incluyen los promotores 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980] o de otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland, Biochemistry 17:4900, 1978], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de que la transcripción se encuentra controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en la patente EP nº 73.657.

La transcripción de UCP4 a partir de vectores en células huésped de mamífero se encuentra controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de genomas de virus, tales como el virus polioma, virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus 40 del simio (SV40) a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor actina o un promotor inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que dichos promotores resulten compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción de un ADN que codifica la UCP4 por eucariotas superiores puede incrementarse mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de entre aproximadamente 10 y 300 pb, que actúan sobre un promotor incrementando la transcripción del mismo. En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se utiliza un intensificador procedente de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en lado tardío del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus. El intensificador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante de UCP4, pero preferentemente se sitúa en un sitio 5' respecto al promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, células de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducido del ARNm codificante de UCP4.

Todavía otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de UCP4 en cultivo de células recombinantes de vertebrado se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281:40-46, 1979; patentes EP nº 117.060 y nº 117.058.

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4. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencias southern y northern convencionales para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980], transferencia de puntos (análisis del ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo donde el dúplex se encuentra unido a una superficie, de manera que tras la formación de dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido y el ensayo de cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido UCP4 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de UCP4 y codificante de un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación de polipéptido

Pueden recuperarse formas de UCP4 a partir de un medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si se encuentran unidas a membrana, pueden liberarse de las membranas utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o mediante corte enzimático. Las células utilizadas en la expresión de UCP4 pueden alterarse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como el ciclado congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica o agentes de lisado celular.

Puede resultar deseable purificar UCP4 a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los procedimientos siguientes son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato amónico, filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75, columnas de proteína A-sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unirse a formas etiquetadas con epítopo de la UCP4. Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de proteínas y estos procedimientos son conocidos de la técnica y se encuentran descritos por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182, 1990; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción utilizado y de la UCP4 particular producida.

E. Usos de UCP4

Las secuencias de nucleótidos (o el complemento de las mismas) que codifican UCP4 presentan diversas aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en mapaje de cromosomas y de genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de UCP4 también resulta útil para la preparación de polipéptidos UCP4 mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

El gen de UCP4 de secuencia nativa de longitud completa (descrito en el Ejemplo 1; SEC ID nº 2) o fragmentos del mismo, pueden utilizarse como, entre otros, sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de UCP4 de longitud completa o para aislar todavía otros genes (por ejemplo aquellos que codifican variantes de origen natural de UCP4 o UCP4 de otras especies) que presentan una identidad de secuencia deseada con la secuencia de UCP4 dada a conocer en la fig. 1 (SEC ID nº 1). Opcionalmente, la longitud de las sondas es de entre aproximadamente 20 bases y aproximadamente 80 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 2 o de secuencias genómicas, incluyendo promotores, elementos intensificadores e intrones de UCP4 de secuencia nativa. A título de ejemplo, un procedimiento de cribado comprende aislar la región codificante del gen de UCP4 utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con una diversidad de marcajes, incluyendo nucleótidos radioactivos, tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcajes enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina. Las sondas marcadas que presentan una secuencia complementaria a la del gen de UCP4 de la presente invención pueden utilizarse para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué elementos de dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en más detalle en los Ejemplos, posteriormente.

Entre los fragmentos de ADN de UCP4 dados a conocer en la presente invención se incluyen secuencias que comprenden por lo menos entre aproximadamente 20 y 30 nucleótidos consecutivos del ADN de la SEC ID nº 2. Preferentemente dichas secuencias comprenden por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos del ADN de la SEC ID nº 2.

Las sondas también pueden utilizarse en técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la identificación de secuencias codificantes de UCP4 estrechamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos codificantes de UCP4 también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para el mapaje del gen que codifica la UCP4 y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención pueden localizarse en el mapa de un cromosoma y de regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de ligamiento frente a marcadores cromosómicos conocidos y el cribado por hibridación de bibliotecas.

Cuando las secuencias codificantes de UCP4 codifican una proteína que se une a otra proteína, la UCP4 puede utilizarse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante estos procedimientos, pueden identificarse inhibidores de la interacción de unión receptor-ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones de unión también pueden utilizarse para cribar en busca de inhibidores o agonistas péptidos o de molécula pequeña de la interacción de unión. Además, puede utilizarse el receptor UCP4 para aislar uno o más ligandos correlativos. Los ensayos de cribado pueden diseñarse para encontrar compuestos cabeza de serie que imiten la actividad biológica de una UCP4 nativa o de un receptor de UCP4. Estos ensayos de cribado incluyen ensayos que pueden someterse a cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, convirtiéndolos en particularmente adecuados para la identificación de moléculas pequeñas candidatas a fármaco. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, los cuales se encuentran bien caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican UCP4 o las formas modificadas de la misma también pueden utilizarse para generar animales transgénicos o animales "con desactivación génica" que, a su vez, resultan útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón o una rata) es un animal con células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal o en un pariente del animal en un estadio prenatal, por ejemplo embrionario. Un transgén es un ADN que se encuentra integrado en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla un animal transgénico. En una realización, puede utilizarse ADNc codificante de UCP4 para clonar ADN genómico codificante de UCP4 de acuerdo con técnicas establecidas y utilizarse las secuencias genómicas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN codificante de UCP4. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales, tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales de la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes US nº 4.736.866 y nº 4.870.009. Típicamente pueden reconocerse células particulares para la incorporación de transgén de UCP4 utilizando intensificadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén codificante de UCP4 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden utilizarse para examinar el efecto de la expresión incrementada de ADN codificante de UCP4. Dichos animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos que se cree proporcionan protección frente a, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas a la sobreexpresión o infraexpresión de los mismos. De acuerdo con este aspecto de la invención, se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, en comparación con animales no tratados que portan el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición patológica.

Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no humanos de UCP4 para construir un animal con desactivación génica para UCP4 que presenta un gen defectivo o alterado codificante de UCP4 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno codificante de UCP4 y el ADN genómico alterado codificante de UCP4 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc codificante de UCP4 para clonar ADN genómico codificante de UCP4 de acuerdo con técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico codificante de UCP4 puede delecionarse o sustituirse por otro gen, tal como un gen codificante de un marcador seleccionable que puede utilizarse para seguir la integración. Típicamente se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (en ambos extremos, 5' y 3') en el vector [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51:503, 1987 para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell 69:915, 1992]. Las células seleccionadas seguidamente se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo un ratón o una rata) para formar agregados quiméricos [ver, por ejemplo, Bradley, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, editor (IRL, Oxford, 1987), páginas 113 a 152]. A continuación, puede implantarse un embrión quimérico en una hembra pseudoembarazada adoptiva y llevar a término el embrión, creando un animal con desactivación génica. La progenie que porta el ADN recombinado homólogamente en las células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los que la totalidad de las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales con desactivación génica pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defensa frente a determinadas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido UCP4.

También puede utilizarse ácido nucleico que codifica los polipéptidos UCP4 en terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en células con el fin de conseguir la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo para la sustitución de un gen defectivo. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional, en la que se consigue un efecto duradero mediante un solo tratamiento, y la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administación de una vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los ARNs o ADNs antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de determiandos genes in vivo. Anteriormente se ha mostrado que pueden introducirse oligonucleótidos antisentido cortos en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares, causadas por la limitada incorporación de los mismos por parte de la membrana celular [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146, 1986]. Los oligonucléotidos pueden modificarse para incrementar la incorporación de los mismos, por ejemplo mediante la sustitución de los grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Existe una diversidad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro o se transfiere in vivo a células del huésped pretendido. Entre las técnicas adecuadas para la transferencia in vitro de ácido nucleico a células de mamífero se incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, etc. Entre las técnicas de transferencia génica in vivo actualmente preferentes se incluyen la transfección con vectores víricos (típicamente retrovíricos) y la transfección con proteína de cubierta vírica mediada por liposomas (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205-210, 1993). En algunas situaciones resulta deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que reconozca las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína membranal de superficie celular o para la célula diana, un ligando de un receptor sobre la célula diana, etc. En el caso de que se utilicen liposomas, pueden utilizarse las proteínas que se unen a una proteína membranal de superficie celular asociada con la endocitosis para dirigir y/o facilitar la incorporación, por ejemplo proteínas de cápside o fragmentos de las mismas con tropismo para un tipo celular particular, anticuerpos de proteínas que experimentan internalización durante el ciclado, proteínas que dirigen la localización intracelular e incrementan la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptores se describe, por ejemplo, en Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987, y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414,
190. Para una revisión de los protocolos de marcaje y terapia génicos, ver Anderson et al., Science 256:808-813, 1992.

Se cree que la terapia de gen UCP4 presenta aplicaciones en, por ejemplo, el tratamiento de condiciones metabólicas. Ello puede conseguirse, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas anteriormente y mediante la introducción de un vector vírico que contiene un gen UCP4 en determinados tejidos (por ejemplo muscular o adiposo) para incrementar la tasa metabólica en estos tejidos diana y de esta manera incrementar el gasto energético.

De manera general se dan a conocer en la presente invención procedimientos de tratamiento en los que se utiliza UCP4. La combustión energética, el transporte electrónico, el bombeo de protones y el consumo de O_{2} (que puede denominarse colectivamente "tasa metabólica") se acoplan a la síntesis de ATP. Puede existir una "ineficiencia" en mamíferos, de manera que una parte de la tasa metabólica (que en algunos casos puede ser superior al 20%) puede atribuirse a una "fuga" de H^{+} nuevamente hacia el espacio matricial sin síntesis de ATP.

Se cree que UCP4 podría encontrarse implicada en la catálisis de la fuga de H^{+}, desempeñando de esta manera un papel en la ineficiencia energética in vivo. Por consiguiente, la modulación de la actividad o cantidades (presencia) de UCP4 en tejidos de mamífero (particularmente en los tejidos metabólicamente importantes) puede modular concomitantemente la fuga de H^{+}, la tasa metabólica y la producción de calor. Los procedimientos de modulación (en un modo de regulación positiva o negativa) de la tasa metabólica en un mamífero presenta una diversidad de aplicaciones terapéuticas, incluyendo el tratamiento de la obesidad y los síntomas asociados con accidentes cerebrovasculares, traumatismos (tales como los traumatismos por quemadura), sepsis e infecciones.

En el tratamiento de la obesidad, los expertos en la materia apreciarán que la modulación del potencial de la membrana mitocondrial puede utilizarse para incrementar la tasa metabólica corporal, incrementando de esta manera la capacidad de un individuo de perder peso. Pueden llevarse a cabo ensayos de cribado para identificar moléculas que pueden regular positivamente la expresión o actividad (tal como el desacoplamiento) de UCP4. Las moléculas identificadas de esta manera seguidamente pueden utilizarse para incrementar la tasa metabólica y potenciar la pérdida de peso. Los polipéptidos UCP4 resultan útiles en ensayos para identificar los compuestos cabeza de serie para agentes terapéuticamente activos que modulan la expresión o actividad de UCP4. Las moléculas o compuestos candidatos pueden someterse a ensayo con las células o tejidos de mamífero para determinar el efecto o efectos de la molécula o compuesto candidata sobre la expresión o actividad de UCP4. Dichos ensayos de cribado pueden someterse a cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, y resultan particularmente adecuados para identificar moléculas pequeñas candidatas a fármaco. Entre las moléculas pequeñas se incluyen, aunque sin limitación, compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos, ensayos basados en células, etc. Dichos formatos de ensayo son bien conocidos de la técnica.

Por consiguiente, en una realización se proporciona un procedimiento para llevar a cabo un ensayo de cribado in vitro para identificar una molécula que incrementa o regula positivamente la expresión de UCP4, que comprende las etapas de exponer una muestra de células o tejido de mamífero que se cree que comprende UCP4 a una molécula candidata y posteriormente analizando la expresión de UCP4 en dicha muestra. En este procedimiento, la muestra puede analizarse adicionalmente para el potencial de las membranas mitocondriales. Opcionalmente, la UCP4 es un polipéptido que comprende diversas células o tejidos de mamífero, incluyendo, aunque sin limitación, tejido cerebral humano. La molécula candidata utilizada en el ensayo de cribado puede ser una molécula pequeña que comprende un compuesto orgánico o inorgánico sintético. En una realización alternativa, el ensayo de cribado se lleva a cabo para identificar una molécula que reduce o regula negativamente la expresión de UCP4. El efecto o efectos que dicha molécula candidata puede presentar sobre la expresión y/o actividad de UCP4 puede compararse con una muestra de control o de referencia, tal como, por ejemplo, la expresión o la actividad de UCP4 observada en un mamífero similar.

UCP4 también puede utilizarse en procedimientos diagnósticos. Por ejemplo, la presencia o la ausencia de UCP4, o alternativamente la sobreexpresión o la infraexpresión de UCP4, en las células o tejidos de un individuo, puede detectarse utilizando ensayos conocidos de la técnica, incluyendo aquellos descritos en los Ejemplos, posteriormente. De esta manera, la invención también proporciona un procedimiento para detectar la expresión de UCP4 en una muestra de células o tejido de mamífero, que comprende poner en contacto una muestra de células o tejido de mamífero con una sonda de ADN y analizar la expresión del transcrito de ARNm de UCP4 en dicha muestra. La muestra puede comprender diversas células o tejidos de mamífero, incluyendo, aunque sin limitación, el tejido cerebral humano. El experto en la materia puede utilizar información que resulte en dichos ensayos de detección a fin de asistir en la predicción de condiciones metabólicas o de riesgo de aparición de obesidad. Si se determina, por ejemplo, que la actividad de UCP4 en un paciente es anormalmente elevada o reducida, podría administrarse terapia, tal como terapia de hormonas, para devolver la actividad de UCP4 a un estado fisiológicamente aceptable.

La detección de la función alterada de UCP4 en el mamífero también puede utilizarse para asistir en el diagnóstico de actividad neurológica alterada o de degeneración neurológica. En la actualidad se cree que UCP4 podría encontrarse implicada en la regulación de la temperatura cerebral o de la tasa metabólica requerida para la función cerebral normal (y actividad neurológica asociada). En la actualidad también se cree que UCP4 podría controlar la generación de especies de oxígeno reactivo y por lo tanto contribuir a la degeneración neurológica. Las moléculas identificadas en los ensayos de cribado como supresoras de la expresión o función de UCP4 también podrían utilizarse para tratar la fiebre, debido a que se cree que UCP4 se encuentra regulada positivamente durante los episodios de fiebre.

F. Anticuerpos anti-UCP4

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-UCP4. Entre los anticuerpos ejemplares se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-UCP4 también comprenden anticuerpos policlonales. Son conocidos por el experto en la materia procedimientos para preparar anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden cultivarse en un mamífero, por ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectan en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido UCP4 o una proteína de fusión del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que es conocido que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque sin limitación, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvante que pueden utilizarse se incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin necesidad de experimentación excesiva.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti-UCP4 pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975. En un procedimiento de hibridoma, típicamente se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, con un agente inmunizante para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizador típicamente incluye el polipéptido UCP4 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o células de nódulo linfático si se desean de mamífero no humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, páginas 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas habitualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan las líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, que soportan un nivel elevado estable de expresión de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferentes son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, páginas 51-63].

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma seguidamente puede someterse a ensayo para la presencia de anticuerpo monoclonales dirigidos contra UCP4. Preferentemente la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220, 1980.

Tras identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma de ascites en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir de medio de cultivo o líquido ascites mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

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Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente US nº 4.816.567. El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente de dicho ADN. Tras el asilamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio. Las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo mediante la sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humana por las secuencias murinas homólogas [patente US nº 4.816.567; Morrison et al., supra] o mediante unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de la totalidad o de parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, creando un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera de inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc de manera que se evita el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo aminoácido o se delecionan para evitar el entrecruzamiento.

Los procedimientos in vitro también resultan adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede llevarse a cabo utilizando técnicas rutinarias conocidas de la técnica.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos anti-UCP4 de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que presentan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de marco de Fv de inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias de marco. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones de la CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992].

Los procedimientos para inmunizar anticuerpos no humanos son bien conocidos de la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado presenta uno o más residuos aminoácidos que han sido introducidos procedentes de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que típicamente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239.1534-1536, 1988], sustituyendo las CDRs de roedor o las secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

También pueden producirse anticuerpos humanos utilizando diversas técnicas conocidas de la técnica, incluyendo bibliotecas de expresión fágica [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991]. Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, y Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991]. De manera similar, pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la introducción de loci humano de inmunoglobulina en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los que se han inactivado parcial o completamente genes endógenos de inmunoglobulina. Con el reto, se observa producción de anticuerpos humanos, muy similar a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo reorganización génica, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes US nº 5.545.807, nº 5.545.806, nº 5.569.825, nº 5.625.126, nº 5.633.425, nº 5.661.016 y las publicaciones científicas siguientes: Mark et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995.

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que presentan especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para la UCP4, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos de la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos se basan en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que dos cadenas pesadas presentan diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature 305:537-539, 1983]. Debido a que la combinación aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente se produce con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs codificantes de la fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas [patente US nº 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [patentes WO nº 91/00360, nº 92/200373, patente EP nº 03089]. Se encuentra contemplado que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este fin se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los que se dan a conocer en, por ejemplo, la patente US nº 4.676.980.

G. Usos de los anticuerpos anti-UCP4

Los anticuerpos anti-UCP4 de la invención presentan diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-UCP4 pueden utilizarse en ensayos diagnósticos para UCP4, por ejemplo detectando su expresión en células o tejidos específicos. Pueden utilizarse diversas técnicas de ensayo diagnósticos conocidas de la técnica, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 1987, páginas 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos diagnósticos pueden marcarse con un grupo detectable. El grupo detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un isótopo radioactivo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido de la técnica para conjugar el anticuerpo con el grupo detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature 144:945, 1962; David et al., Biochemistry 13:1014, 1974; Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981; y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407, 1982.

Los anticuerpos anti-UCP4 también resultan útiles para la purificación por afinidad de UCP4 a partir de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este procedimiento, los anticuerpos contra UCP4 se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos de la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene UCP4 que debe purificarse, y después el soporte se lava con un solvente adecuado que elimina sustancialmente la totalidad del material en la muestra, excepto la UCP4, que se encuentra unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que libera la UCP4 del anticuerpo.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los ejemplos siguientes, y en toda la especificación, por los números de acceso ATCC, es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc codificantes de UCP4 humana

Se realizaron búsquedas en las bases de datos EST, incluyendo las bases de datos EST públicas (por ejemplo GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA), para secuencias que presentan homologías con la UCP3 humana. La búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996] para comparar las secuencias de la proteína UCP3 con una traducción de 6 marcos de las secuencias EST. Aquellas comparaciones que resultaron en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos, 90) o más que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y se ensamblaron en secuencias de ADN de consenso con el programa AssemblyLIGN/MacVector (Oxford Molecular Group, Inc.).

Se ensambló una secuencia de ADN ("ADN from") respecto a otras secuencias EST utilizando software AssemblyLIGN (figura 7; SEC ID nº 5). Las ESTs de la base de datos Incyte incluían secuencias con los números de acceso siguientes: 3468504, 3369262, 4220747, 1254733, 5016160, 3770189, 2265329, 928717, 3715961, 3528102, 961523, 1863723, 382533, 918252, 918404, 4313009, 3801604, c-swh06, 3464955, c-1sh09, 090424, 1316891, 1342069, 1435593, 16014011, 1668098, 1668103, 222248, 243244, 246984, 272663, 305678, 305871, 3369262, 3464955 y 3715961. Además, la secuencia de ADN from se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y AssemblyLIGN para extender la secuencia lo máximo posible utilizando las fuentes de secuencias EST comentadas anteriormente.

Basándose en dicha secuencia de ADN, se sintetizaron oligonucleótidos para aislar un clon de las secuencias codificantes de longitud completa para UCP4 mediante PCR. Los cebadores de PCR directa e inversa presentan una longitud generalmente comprendida entre 20 y 30 nucleótidos y con frecuencia se diseñan para proporcionar un producto de PCR de longitud comprendida entre aproximadamente 100 y 1.000 pb. Las secuencias de las sondas presentan una longitud de típicamente 40 a 55 pb. En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1-1,5 kpb.

Se sintetizaron los cebadores de PCR (directos e inversos):

cebador PCR directo:
CGCGGATCCCGTTATCGTCTTGCGCTACTGC (U401)	(SEC ID nº 3)
cebador PCR inverso:
GCGGAATTCTTAAAATGGACTGACTGACTCCACTCATC (U406)	(SEC ID nº 4)

La UCP4 con una etiqueta Flag NH2-terminal también se clonó en pcDNA3 (pcDNA3Flag-UCP4; Invitrogen) entre los sitios de restricción BamHI y EcoRI. Se sintetizaron los cebadores PCR directos e inversos siguientes:

cebador PCR directo:
CGCGGATCCGAAATGGACTACAAGGACGACGATG
ACAAGTCCGTCCCGGAGGAGGAGG (U410)	(SEC ID nº 6)
cebador PCR inverso:
GCGGAATTCTTAAAATGGACTGACTCCACTCATC (U406)	(SEC ID nº 4)

Se aisló ARN para la construcción delas bibliotecas de ADNc a partir de tejido cerebral. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándares utilizando reactivos disponibles comercialmente, tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligodT que contenía un sitio NotI, unido en extremo romo con adaptadores SalI semifosforilados, cortados con NotI, clasificados por tamaño apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonaron en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI; ver Holmes et al., Science 253:1278-1280, 1991) en los sitios únicos XhoI y NotI.

La secuenciación del ADN del clon aislado mediante PCR tal como se ha indicado anteriormente proporcionó la secuencia de ADN de longitud completa de UCP4 (denominada en la presente invención ADN 77568-1626 [figura 2, SEC ID nº 2] y la secuencia de proteína derivada de UCP4.

La secuencia codificante completa de UCP4 se muestra en la figura 2 (SEC ID nº 2). El clon de ADN 77568-1626 contiene un solo marco de lectura abierto con un sitio de inicio de traducción aparente en las posiciones nucleótidas 40 a 42, y un codón de parada aparente en las posiciones nucleótidas 1009-1011 (ver la figura 2, SEC ID nº 2). El precursor polipéptido teórico presenta una longitud de 323 aminoácidos. En la actualidad se cree que UCP4 es una proteína unida a membrana y que contiene por lo menos 6 regiones transmembranales. Estas regiones transmembrana putativas en la secuencia de aminoácidos de UCP4 se ilustran en la figura 3. El clon ADN 77568, denominado ADN 77568-1626, contenido en el vector pcADN3 (Invitrogen) ha sido depositado en la ATCC y ha sido asignado el nº de depósito ATCC 203134. El polipéptido UCP4 se obtiene o puede obtenerse mediante la expresión de la molécula codificada por la inserción de ADNc del vector depositado nº ATCC 203134. La digestión del vector depositado nº ATCC 203134 con los enzimas de restricción BamHI y EcoRI proporciona una inserción de aproximadamente 972 más 34 pb. La proteína UCP4 de longitud completa mostrada en la figura 1 presenta un peso molecular estimado de aproximadamente 36.601 daltons y un pI de aproximadamente 9,28.

Se ilustra en la figura 3 una alineación de la secuencia de aminoácidos de UCP4 con las de UCP1, UCP2 y UCP3. Se identificaron algunas diferentes notables entre UCP1 y UCP4. Cuando UCP1 carece de su putativo sitio de unión de nucleótido, resulta resistente a la inhibición por nucleótidos, y cuando se sustituye Phe-267 en UCP1 por un residuo Tyr, UCP1 presenta una actividad de desacoplamiento incrementada [Gonzalez-Barroso et al., Eur. J. Biochem. 239:445-450, 1996; Mayinger et al., Biochem. 31:10536-10543, 1992]. Sin embargo, al igual que UCP2 y UCP3, UCP4 presenta un residuo Tyr en esta posición (ver la figura 3). Además, el extremo carboxi-terminal de UCP1 ha sido implicado en la activación de su actividad desacoplante por los ácidos grasos libres (FFA). La sustitución de Cys-305 por los residuos Ala o Ser resulta en la reducción o incremento de la activación por parte de los FFA, respectivamente [Gonzalez-Barroso et al., supra]. Debido a que UCP2 presenta una Ala-307, UCP3 presenta una Ser-298, y UCP4 presenta una Ser-321, la actividad desacoplante de UCP4 y de las otras UCPs probablemente resulta regulada de manera diferente por los nucleótidos y por los FFA.

El gen UCP4 humano ha sido localizado en el punto cromosómico 6 p11.2-q12, que es el más próximo al marcador genómico SHGC-34952.

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Ejemplo 2 Análisis de transferencia northern

La expresión del ARNm de UCP4 en tejidos humanos se examinó mediante análisis de transferencia northern. Los filtros de ARN humano se hibridaron a una sonda de ADN de 1 kilobase marcada con ^{32}P basada en el ADNc de UCP4 de longitud completa; la sonda se generó mediante digestión de pcADN3UCP4 y purificación de la inserción de ADNc de UCP4. Se incubaron con las sondas de ADN: el filtro MTN-II de ARN adulto humano (Clontech) (figuras 4A, 4B, 4D, 4E y 4F), un filtro de tejido fetal humano (figuras 4D y 4H), PBLs (figuras 4B y 4D) y células de cáncer (figura 4C). Tal como se muestra en la figura 4C, las células de cáncer sondeadas incluían HL-60 (leucemia promielocítica), células HeLa, K562 (leucemia mielógena crónica), MOLT-4 (leucemia linfoblástica), Raji (linfoma de Burkitt), SW480 (adenocarcinoma colorrectal), A549 (carcinoma pulmonar) y G361 (melanoma). También se examinó la expresión de UCP2 mediante el sondeo de un filtro múltiple de tejido cerebral humano con ADNc humano de UCP2 (figura 4G). Todos los filtros posteriormente se sondearon con un ADNc de \beta-actina.

Se llevó a cabo análisis northern de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Clontech). Los filtros se revelaron tras la exposición durante la noche a película de rayos X.

Tal como se muestra en las figuras 4A-4H, se detectaron transcritos de ARNm de UCP4. Se observó expresión en tejidos cerebrales, médula espinal, médula, cuerpo calloso y sustancia negra, pero no en los demás tejidos humanos ni en las líneas celulares de cáncer examinadas. Aunque el nivel de transcrito de UCP4 era más elevado en los tejidos cerebrales que en la médula espinal, médula, cuerpo calloso y sustancia negra (figuras 4A, 4E y 4F), los niveles de transcrito de UCP2 eran más elevados en la médula espinal y médula (figura 4G). En el filtro de tejido fetal humano, el transcrito de UCP4 únicamente se detectó en el cerebro (figura 4H).

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Ejemplo 3 Uso de UCP4 como sonda de hibridación

El procedimiento siguiente describe el uso de una secuencia de nucleótidos codificante de UCP4 como sonda de hibridación.

Se utilizó ADN que comprendía la secuencia codificante de UCP4 de longitud completa o maduro (tal como se muestra en la figura 2, SEC ID nº 2) como sonda para cribar para ADNs homólogos (tales como aquellos codificantes de variantes naturales de UCP4) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y lavado de filtros que contenían los ADNs de ambas bibliotecas se llevó a cabo bajo las condiciones de elevada astringencia siguientes. La hibridación de sonda derivada de UCP4 marcada radioactivamente con los filtros se llevó a cabo en una solución de 50% de formamida, 5xSSC, SDS al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2x solución de Denhardt y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. Se llevó a cabo el lavado de los filtros en una solución acuosa de 0,1xSSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

Los ADNs que presentan una identidad de secuencia deseada con el ADN codificante de UCP4 de secuencia nativa de longitud completa seguidamente pueden identificarse utilizando técnicas estándares conocidas de la técnica.

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Ejemplo 4 Expresión de UCP4 en E. coli

El presente ejemplo ilustra la preparación de UCP4 mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN codificante de UCP4 (SEC ID nº 2) se amplificó inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse una diversidad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es Pbr322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977) que contiene genes para la resistencia a ampicilina y a tetraciclina. El vector se digirió con enzima de restricción y se desfosforiló. Las secuencias amplificadas por PCR seguidamente se introdujeron en el vector mediante ligación. El vector opcionalmente incluía secuencias que codifican para un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia polihis y sitio de corte de enteroquinasa), la región codificante de UCP4, el terminador transcripcional lambda y un gen argU.

A continuación, se utilizó la mezcla de ligación para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Se identificaron los transformantes por su capacidad de crecer en placas LB y seguidamente se seleccionaron las colonias resistentes a antibiótico. El plásmido de ADN puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Los clones seleccionados pueden cultivarse durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de la noche posteriormente puede utilizarse para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se cultivan hasta una densidad óptica deseada, periodo durante el que el promotor de expresión se encuentra activado.

Tras cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. Si no se encuentra presente secuencia de señal, y la UCP4 expresada es intracelular, el pellet celular obtenido mediante centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos de la técnica, y la proteína UCP4 solubilizada seguidamente puede purificarse utilizando una columna de quelación de metales bajo condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína. Si se encuentra presente una secuencia de señal, la UCP4 expresada puede obtenerse a partir del periplasma de la célula o del medio de cultivo. La extracción y/o solubilización de los polipéptidos UCP4 puede llevarse a cabo utilizando agentes y técnicas conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.663.304, nº 5.407.810).

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Ejemplo 5 Expresión de UCP4 en células de mamífero

El presente ejemplo ilustra la preparación de UCP4 mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (ver la patente EP nº 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989), se utiliza como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de UCP4 se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de UCP4 utilizando procedimientos de ligación, tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-UCP4.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC nº CRL 1573) se cultivan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de feto bovino y, opcionalmente, componentes nutritivos y/o antibióticos. Se mezclaron aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-UCP4 con aproximadamente 1 \mug de ADN codificante del gen de ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell 31:543, 1982] y se disolvieron en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añadieron, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se dejó que se formase un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspendió y se añadió a células 293 y se dejó reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. Se separó el medio de cultivo mediante aspiración y se añadieron 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 con medio libre de suero, se añadió medio fresco y las células se incubaron durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se extrajo el medio de cultivo y se sustituyó por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contenía 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recogió el medio condicionado, se concentró en un filtro giratorio, y se cargó en un gel de 15% SDS. El gel procesado puede secarse y exponerse a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido UCP4. Los cultivos que contenían las células transfectadas pueden incubarse adicionalmente (en medio libre de suero) y el medio someterse a ensayo en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, UCP4 puede introducirse en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento de dextrán sulfato descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12:7575, 1981. Las células 293 se cultivan hasta la densidad máxima en un matraz giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRKS-UCP4. En primer lugar las células se concentran a partir del matraz de agitación mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre el pellet celular durante cuatro horas. Las células se tratan con 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos y se reintroducen en el matraz giratorio que contiene medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Tras aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los residuos. La muestra que contiene la UCP4 expresada seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía de columna.

En otra realización, UCP4 puede expresarse en células CHO. pRK5-UCP4 puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal como se ha indicado anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio sustituirse por medio de cultivo (solo) o por medio que contiene un marcaje radioactivo, tal como ^{35}S-metionina. Tras determinar la presencia de polipéptido UCP4, el medio de cultivo puede sustituirse por medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después se recolecta el medio condicionado. El medio que contiene la UCP4 expresada seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

La UCP4 etiquetada con epítopo también puede expresarse en células CHO huésped. La UCP4 puede subclonarse extrayéndola del vector pRK5. La inserción subclonada puede someterse a PCR para fusionarla en el mismo marco de lectura de una etiqueta epítopo seleccionada, tal como una etiqueta polihis en un vector de expresión baculovirus. La UCP4 etiquetada con polihis seguidamente puede subclonarse en un vector regulado por SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector regulado por SV40. El marcaje puede llevarse a cabo, tal como se ha indicado anteriormente, para verificar que se ha producido la expresión. El medio de cultivo que contiene la UCP4 etiquetada con poli-his expresada seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato.

En un procedimiento alternativo, la UCP4 puede expresarse intracelularmente (donde no se utiliza secuencia de señal). Esta expresión intracelular, y la extracción o solubilización y purificación posteriores pueden llevarse a cabo utilizando técnicas y reactivos conocidos de la técnica.

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Ejemplo 6 Expresión de UCP4 en levaduras

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de UCP4 en levaduras.

En primer lugar, se construyeron vectores de expresión levadura para la producción o secreción intracelular de UCP4 a partir del promotor ADH2/GAPDH. Se insertan ADN codificante de UCP4 y el promotor en sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de UCP4. Para la secreción, puede clonarse ADN codificante de UCP4 en el plásmido seleccionado, conjuntamente con ADN codificante del promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal UCP4 nativo u otro péptido de señal de mamífero o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o una señal secretoria de invertasa/secuencia líder, y secuencias línker (si resultan necesarias) para la expresión de UCP4. Alternativamente, puede utilizarse la secuencia de señal nativa de UCP4.

A continuación, pueden transformarse células de levadura, tales como S. cerevisiae cepa AB110, con los plásmidos de expresión indicados anteriormente, y cultivarse en medios de fermentación seleccionados tales como los indicados, por ejemplo, en las patentes US nº 4.775.662 y nº 5.010.000. Los sobrenadantes de levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tinción de azul de Coomassie.

Posteriormente puede aislarse y purificarse UCP4 recombinante mediante la eliminación de células de levadura a partir del medio de fermentación mediante centrifugación y después eliminando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene UCP4 puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas. En un procedimiento alternativo, la UCP4 puede expresarse intracelularmente (donde no se utiliza ninguna secuencia de señal). La expresión intracelular, y la posterior extracción o solubilización pueden llevarse a cabo utilizando técnicas y reactivos conocidos de la técnica.

Ejemplo 7 Expresión de UCP4 en células de insecto infectadas por baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de UCP4 en células de insecto infectadas por baculovirus.

La secuencia codificante de UCP4 se fusiona corriente arriba de una etiqueta epítopo contenida dentro de un vector de expresión. Entre estas etiquetas epítopo se incluyen etiquetas poli-his y etiquetas inmunoglobulina (por ejemplo regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una diversidad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia codificante de UCP4 o la parte deseada de la secuencia codificante de UCP4 se amplifican mediante PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción (seleccionados) flanqueantes. A continuación, el producto se digiere con los enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión. El vector puede contener la secuencia de señal nativa para UCP4 si se desea la secreción.

Se generan baculovirus recombinante mediante cotransfección del plásmido anteriormente indicado y ADN vírico BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC nº CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Tras 4 a 5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectan y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteínas se llevan a cabo tal como describen O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press, 1994.

A continuación, UCP4 expresada etiquetada con poli-his puede purificarse mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato de la manera siguiente. Se preparan extractos a partir de células Sf9 infectadas por virus recombinantes, tal como describen Rupert et al., Nature 362:175-179, 1993. Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (Hepes 25 ml, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40, KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se aclaran mediante centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a un caudal de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base de A_{280} con tampón de carga, momento en el que se inicia la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 6,0), que eluye no específicamente proteína unida. Tras alcanzar nuevamente la línea de base de A_{280}, la columna se revela con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia western con Ni^{2+}-NTA-conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen la UCP4 etiquetada con His_{10} eluida se agrupan y se dializan frente a tampón de carga.

Alternativamente, puede llevarse a cabo purificación de la UCP4 etiqueta con IgG (o etiquetada con Fc) utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de columna de proteína A o de proteína G.

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Ejemplo 8 Medición del cambio de potencial de membrana mitocondrial inducido por UCP4

Se llevaron a cabo ensayos para determinar los efectos de la expresión de UCP4 sobre el potencial de membrana mitocondrial.

Se cultivaron células 293 renales embrionarias humanas (ATCC nº CRL 1573) en medio de cultivo (DMEM, suero de feto bovino al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 microgramos/ml de estreptomicina) hasta una confluencia de 60% a 80% en placas de 6 pocillos y se transfectaron transitoriamente utilizando reactivo de transfección FuGene^{TM} 6 (Boehringer Mannheim; siguiendo las instrucciones del fabricante) con constructos que expresan UCP (pcADN3UCP4 o pcADN3UCP3), constructos que expresan UCP con una etiqueta Flag NH_{2}-terminal (pcADN3Flag-UCP4 o pcADN3Flag-UCP3) o vector de control (pcADN3; disponible de Invitrogen).

Los constructos de expresión para ADNc codificante de UCP4 con o sin una etiqueta Flag NH_{2}-terminal se prepararon según el Ejemplo 1. Se prepararon constructos de expresión para ADNc codificante de UCP3 obteniendo en primer lugar ADNc codificante de UCP3 humana procedente de una biblioteca de ADNc de melanoma mediante PCR. Se sintetizaron cebadores de PCR (directos e inversos):

cebador PCR directo:
GCGAAGCTTGCCATGGTTGGACTGAAGCCTTCAGA (U301)	(SEC ID nº 7)
cebador PCR inverso:
CGCGAATTCTCAAAACGGTGATTCCCGTAACAT (U302)	(SEC ID nº 8)

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Se preparó el constructo de expresión para ADNc codificante de UCP3 con una etiqueta Flag NH2-terminal utilizando los cebadores de PCR siguientes:

cebador PCR directo:
GCGAAGCTTGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG
GTTGGACTGAAGCCTTCA-GACG (U303)	(SEC ID nº 9)
cebador PCR inverso:
CGCGAATTCTCAAAACGGTGATTCCCGTAACAT (U302)	(SEC ID nº 8)

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Se clonó UCP3 con o sin la etiqueta Flag NH2-terminal en pcADN3 (pcADN3UCP3 y pcADN3Flag-UCP3) entre los sitios HindIII y EcoRI, y se confirmó mediante la secuenciación de ADN. Se detectaron UCP3 etiquetada con Flag y UCP4 expresadas en células 293 mediante análisis de transferencia western utilizando anticuerpo monoclonal anti-Flag M2 (Kodak) y el kit de detección ECL.

Se analizó el potencial de membrana mitocondrial de acuerdo con procedimientos conocidos de la técnica [Salvioli et al., FEBS Lett. 411:77-82, 1997; Smiley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3671-3675, 1991]. Aproximadamente 24 a 36 horas tras la transfección, las células se tripsinizaron y se peletizaron 1,5 x 10^{6} células mediante centrifugación. Las células peletizadas se resuspendieron en 0,5 ml de una solución de pigmento JC-1 y se incubaron en presencia o ausencia de CCCP 50 \muM (carbonilcianuro de m-clorofenilhidrazona; Sigma) en la oscuridad durante 30 minutos a 37ºC. JC-1 (yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3',3'-tetraetilbencimidazol-carbocianina; Molecular Probes, Eugene, OR) es un pigmento fluorescente sensible al potencial de membrana. Para preparar la solución de pigmento, en primer lugar se preparó JC-1 en forma de solución madre en dimetil sulfóxido (DMSO; Sigma) a una concentración de 5 mg/ml. La solución madre se diluyó hasta 1 mg/ml con DMSO, y después se diluyó adicionalmente hasta 10 \mug/ml con medio de cultivo precalentado a 37ºC y se filtró a través de filtros tanto de 0,45 \mum como de 0,2 \mum para excluir JC-1 agregado.

Las células teñidas se lavaron y se resuspendieron en 1,0 ml de medio de cultivo. Las células resuspendidas en medio de cultivo se examinaron mediante espectrofluorometría (espectrofluorofotómetro RF5000U; Shimadzu, Japón). Se analizó un subconjunto de células mediante citometría de flujo (Coulter EPICS Elite ESP, Hialeah, FL). Para el análisis espectrofluorométrico, la excitación fue a 488 nm y la emisión se midió a 525 nm y a 590 nm. Se llevó a cabo análisis de citometría de flujo con un láser de argón de 488 nm de excitación, un filtro transmisor de 525 \pm 20 nm en el canal FL1, y un filtro transmisor por encima de 590 nm en el canal FL2. Se analizó un mínimo de 10.000 células por muestra.

También se llevó a cabo un análisis estadístico. Se compararon entre tratamientos las proporciones medias entre picos de intensidad de fluorescencia roja (593 nm) y de fluorescencia verde (532 nm). Se realizaron nueve transfecciones independientes por tratamiento. Las diferencias se analizaron utilizando la diferencia mínima significativa protegida de Fisher.

Los resultados se ilustran en las figuras 5A y 5B. La expresión de UCP3 en las células 293 redujo la proporción de valores pico de fluorescencia (593\lambda/532\lambda) en aproximadamente 15% (n=3) en comparación con la de las células transfectadas con vector de control, indicando una reducción del potencial de membrana mitocondrial (figura 5A). En las células transfectadas con UCP4, la intensidad de fluorescencia indicativa de la reducción de potencial de membrana se redujo en 19% (n=6) en comparación con la de las células transfectadas por el control de vector (figuras 5A y 5B). La etiqueta Flag NH_{2}-terminal no presentó ningún efecto sobre la actividad de UCP3 o de UCP4.

Un análisis de FACS también demostró una reducción similar del potencial de membrana mitocondrial. En el análisis de FACS, las proporciones de intensidad roja a verde integradas cayeron un 18% en las células transfectadas por UCP3 y un 24% en células transfectadas por UCP4. Las células tratadas con el desacoplante químico, CCCP, también mostraron una reducción de la proporción de intensidad roja a verde (figuras 5A y 5B).

Estos datos sugieren que, al igual que UCP3, UCP4 presenta actividad desacoplante.

Ejemplo 9 Preparación de anticuerpos que se unen a UCP4

El presente ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a UCP4.

Son conocidas de la técnica técnicas para producir los anticuerpos monoclonales y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen UCP4, proteínas de fusión que contienen UCP4 y células que expresan UCP4 recombinante sobre la superficie celular. El experto en la materia podrá seleccionar el inmunógeno sin necesidad de excesiva experimentación.

Se inmunizan ratones, tales como Balb/c, con el inmunógeno UCP4 emulsionado en adyuvante completo de Freund y reciben inyecciones subcutáneas o intraperitoneales en una cantidad de entre 1 y 100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas plantares traseras de los animales. A continuación, los ratones inmunizados reciben refuerzos 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir refuerzos con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital para el análisis en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-UCP4.

Tras detectar un título de anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para anticuerpos pueden recibir una inyección intravenosa final de UCP4. Tres a cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recolectan las células de bazo. A continuación, las células de bazo se fusionan (utilizando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como P3X63AgU.1, disponible de la ATCC, nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden sembrarse en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, de mielomas híbridos y de células de bazo híbridas.

Las células de hibridoma se criban en una ELISA para reactividad contra UCP4. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra UCP4 se encuentra comprendida dentro de los conocimientos de un experto en la materia.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascites que contiene los anticuerpos anti-UCP4 monoclonales. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraces de cultivo de tejidos o en botellas de cultivo. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascites puede conseguirse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de la cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o a proteína G.

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Ejemplo 10 Localización subcelular

Para examinar la localización subcelular de UCP4, se transfectaron células MCF7 de carcinoma mamario humano (ATCC nº HTB 22) con pADN3Flag-UCP3 (preparada según el Ejemplo 8) O pcDNA3Flag-UCP4 (preparado según el Ejemplo 1) utilizando reactivo de transfección FuGene (Boehringer Mannheim). Las células transfectadas se fijaron en formaldehído al 3% a temperatura ambiente durante 15 minutos y se permeabilizaron con TritonX-100 al 1% durante 15 minutos. Las células se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-Flag (10 \mug/ml; Kodak) y anticuerpo anti-citocromo C oxidasa (un marcador mitocondrial) (3 ng/ml) durante 20 minutos. A continuación, las células se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 (antiratón de burro; Jackson Laboratories) y con FITC (anticonejo de burro, Jackson Laboratories). A continuación, las células se examinaron mediante microscopía de fluorescencia.

Las figuras 6A-6F muestran que UCP3 y UCP4 se colocalizaban con el marcador mitocondrial.

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Ejemplo 11 Expresión de ARNm de UCP4 en ratones sometidos a estrés alimentario y térmico

Para evaluar si UCP4 presenta actividad desacoplante in situ importante para el metabolismo, se determinó la cantidad de ARNm de UCP4 producida en tejidos de ratones sometidos a estrés alimentario y térmico, es decir, a retos metabólicos. Dependiendo del papel que UCP4 presente en el metabolismo, puede variar la cantidad de ARNm de UCP4 producida en un tejido según el estrés al que se encuentre sometido el metabolismo, tal como el ayuno, el consumo de grasas y la exposición a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente.

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Los ratones en el presente estudio se alimentaron con alimento normal para roedores (Purina Rodent Chow 5010; Purina, St. Louis, MO) y agua ad libitum a menos que se indique lo contrario. El tipo de ratón estudiado variaba dependiendo de la condición utilizada para retar el metabolismo del ratón estudiado y se describe posteriormente.

Generalmente los ratones estudiados se expusieron a luz 12 horas al día entre 6:00 y 18:00, momento en el que se dejaron en la oscuridad durante las 12 horas siguientes.

Los ratones se sacrificaron bajo CO_{2} inmediatamente antes de la recolección de tejidos, que se realizó por la mañana, entre las 8:00 y las 12:00, a menos que se indique lo contrario. Se recolectaron los tejidos y se preparó ARN total de tejido utilizando reactivos y protocolos de Biotecx Lab., Houston, TX. Aunque se recogieron varios tejidos de cada ratón, el estudio se centró en la medición de la abundancia del ARNm de UCP4 en el cerebro (debido a que el cerebro presenta un nivel elevado de expresión del gen UCP4). En los estudios se utilizaron por lo menos 5 ratones/tratamiento.

Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa cuantitativa (PCR-RT) para determinar la cantidad de ARNm de UCP4 en los tejidos recolectados. Se llevó a cabo PCR-RT utilizando muestras de ARNm [Heid et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson et al., Genome Research 6:95-1001, 1996]. Generalmente, para llevar a cabo PCR-RT cuantitativa, se utilizaron cebadores y sondas específicas para UCP4 (TaqMan Instrument, PE Biosciences, Foster City, California). Se corrigieron los valores para la carga de ARNm utilizando la abundancia de ARNm de \beta-actina como control de carga. Se utilizaron los cebadores y sondas siguientes:

Para UCP4:
Cebador directo:	5' AAT GCC TAT CGC CGA GGA G3'	(SEC ID nº 10);
Cebador inverso:	5'GTA GGA ACT TGC TCG TCC GG3'	(SEC ID nº 11);
Para la beta-actina:
cebador directo:	5' GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAG3'	(SEC ID nº 13);
cebador inverso:	5' CTC CTT CTG CAT CCT GTC AGC AA3'	(SEC ID nº 14);
sonda:	5' (FAM) CGG TTC CGA TGC CCT GAG GCT C	(SEC ID nº 15) (TAMARA)3'.

Efecto del consumo alimentario sobre la expresión de ARNm de UCP4

En un primer estudio, se estudiaron ratones macho de siete semanas (C57BL/6J; Bar Harbor, ME) para evaluar el efecto del ayuno y de la alimentación sobre la producción de ARNm de UCP4 en los ratones estudiados. Los ratones se obtuvieron a las seis semanas de edad y a las siete semanas se asignaron aleatoriamente a tres grupos: ratones de control alimentados ad lib., ratones en ayuno durante 24 horas y ratones en ayuno durante 24 horas y alimentados después ad lib. durante 24 horas.

Los ratones se sacrificaron tal como se ha descrito anteriormente tras la alimentación ad lib. para el primer grupo, tras 24 horas de ayuno para el segundo grupo y tras el primer ayuno de 48 horas y la alimentación ad lib. posterior para el tercer grupo. Los tejidos se recolectaron tal como se ha descrito anteriormente.

Se llevó a cabo PCR-RT cuantitativa para el tejido cerebral según los procedimientos descritos anteriormente y se cuantificó la cantidad de ARNm de UCP4 en el cerebro. SE determinaron las diferencias estadísticas entre grupos utilizando un análisis de Fisher protegido de diferencias mínimas significativas (L. Ott, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 3a edición, Boston: PWS-Kent Publishing Co., 1988). Los datos presentados en las figuras 8A a 8C representan medias \pm ES.

La figura 8A ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en el tejido cerebral de ratones alimentados ad lib. durante 24 horas. La figura 8B ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en el tejido cerebral de ratones sometidos a ensayo. La figura 8C ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en el tejido cerebral de ratones sometidos a ensayo de 24 horas y después se alimentaron ad lib. durante 24 horas.

Típicamente, el ayuno y la restricción del consumo de alimentos reduce la tasa metabólica, sugiriendo que la expresión del ARNm de UCP4 se reduciría para los ratones en ayuno en comparación con los ratones alimentados ad lib. Sin embargo, la figura 8B no muestra una reducción de la expresión de ARNm de UCP4 en tejido cerebral de ratones sometidos a ayuno en comparación con ratones alimentados ad lib, tal como se muestra en la figura 8a.

Efecto del consumo de grasas sobre la expresión de ARNm de UCP4

En un segundo estudio, se estudiaron ratones macho de cuatro semanas (A/J o C57BL/6J, Jackson Labs., Bar Harbor, ME) para evaluar el efecto de dietas ricas y pobres en grasa sobre la producción de ARNm de UCP4 en los ratones estudiados. Se ha demostrado que los ratones A/J son "resistentes a la obesidad" bajo una dieta rica en grasas en comparación con las "propensas a la obesidad" C57BL6/J (ver Surwit et al., supra). Lo anterior podría deberse a una eficiencia metabólica más baja en la cepa A/J, es decir, aparentemente acumulan menos calorías por caloría ingerida.

Los ratones se obtuvieron a las cuatro semanas de edad y se sometieron inmediatamente a una dieta pobre en grasas o rica en grasas (Research Diets, Inc., New Brunswick, New Jersey) siguiendo los patrones formulados por Surwit et al., Metabolism 44(5):645-651, 1995, que contenían 11% o 58% de grasas (% calorías), respectivamente. Los animales se alimentaron ad lib. durante aproximadamente tres semanas (días 22-23 sometidos a dieta). A continuación, se sacrificaron y se recolectaron sus tejidos tal como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo PCR-RT para el tejido cerebral de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente y se cuantificó la cantidad de ARNm de UCP4 producida en el tejido cerebral. Se determinaron las diferencias estadísticas entre grupos utilizando un análisis de Fisher protegido de diferencias mínimas significativas (L. Ott, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 3a edición, Boston: PWS-Kent Publishing Co., 1988). Los datos presentados en las figuras 9A a 9D representan medias \pm ES.

La figura 9A ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en tejido cerebral de ratones A/J alimentados con una dieta pobre en grasas, y la figura 9B ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en tejido cerebral de ratones A/J que se alimentaron con una dieta rica en grasas. La figura 9C ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en tejido cerebral de ratones C57BL6/J alimentados con una dieta pobre en grasas, y la figura 9D ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en tejido cerebral de ratones C57BL6/J alimentados con una dieta rica en grasas.

Efecto del estrés térmico sobre UCP4

En un tercer estudio, se estudiaron ratones macho (FVB-N; Taconic, Germantown, New York) para evaluar el efecto de exponer los ratones a estrés térmico. Típicamente la exposición a frío en roedores induce un incremento de la tasa metabólica. Este incremento metabólico podría producirse para mantener una temperatura corporal estable. Sin embargo, la aclimatación cálida, definida como la exposición crónica a temperaturas comprendidas dentro de la zona termoneutra murina (aproximadamente 30ºC a 35ºC) reduce la tasa metabólica [Klaus et al., Am. J. Physiol. 274:R287-R293, 1998].

En el presente estudio se alojaron dos ratones en cada jaula y se asignaron aleatoriamente a los grupos siguientes: grupo de control (alojado a 22ºC durante 3 semanas), grupo con aclimatación cálida (alojado a 33ºC durante 3 semanas), grupo con restricciones alimentarias (alojado a 22ºC durante 3 semanas aunque con acceso diario a la cantidad media de alimentos que han recibido los ratones con aclimatación cálida el día anterior), grupo retado por frío (alojado a 22ºC durante 3 semanas previamente al inicio de la exposición a 4ºC). Para los ratones retados por frío, a partir de la mañana los ratones se expusieron a 4ºC alojándolos en un cuarto a 4ºC durante 1, 6, 24 ó 48 horas previamente al sacrificio de los ratones y a la recolección del tejido.

Los ratones se sacrificaron y los tejidos se recolectaron a las seis semanas de edad tal como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo PCR-RT cuantitativa para el tejido cerebral de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente y se cuantificó la cantidad de ARNm de UCP4 producido en el cerebro. Se determinaron las diferencias estadísticas entre grupos utilizando un análisis de Fisher protegido de diferencias significativas mínimas (L. Ott, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 3a ed., Boston: PWS-Kent Publishing Co., 1988). Los datos presentados en las figuras 10A a 10G representan medias \pm ES. Los asteriscos indican diferencia estadística de por lo menos p<0,05.

La figura 10A ilustra la abundancia del ARNm de UCP4 en el grupo de control de ratones. Las figuras 10B a 10E ilustran la abundancia de ARNm de UCP4 en el grupo de ratones retados por frío durante 1, 6, 24 y 48 horas, respectivamente. La figura 10F ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en el grupo de ratones con restricción de alimento, y la figura 10G ilustra la abundancia de ARNm de UCP4 en el grupo de ratones sometido a aclimatación cálida.

Las figuras 10B a 10E indican un incremento de la expresión de ARNm de UCP4 en los ratones retados por frío en comparación con el grupo de control mostrado en la figura 10A. Las figuras 10F y 10G no muestran un incremento similar de la expresión del ARNm de UCP4 para los ratones con restricción de alimento y los ratones con aclimatación cálida, respectivamente, en comparación con el grupo de control mostrado en la figura 10A.

Depósito de material

Los materiales siguientes han sido depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

	Material	ATCC dep. Nº	Fecha de depósito
	ADN77568-1626	203134	18 de agosto de 1998

Dicho depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y las regulaciones en el mismo (Tratado de Budapest). Lo anterior garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición del público por parte de la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y condicionado a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC que garantiza la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la publicación de la patente US pertinente o tras abrir al público cualquier solicitud de patente US o extranjera, la que se produzca en primer lugar, y garantiza la disponibilidad de la progenie para la persona que determine el comisionado US de patentes y marcas que presenta el derecho para ello según 35 USC '122 y las reglas del comisionado en virtud de la misma (incluyendo la regla 37 CFR '1.14, con particular referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si muere, se pierde o se destruye un cultivo de los materiales en depósito encontrándose bajo condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente sustituidos tras apercibirse de ello por otro cultivo igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para la puesta en práctica de la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la jurisdicción de cualquier gobierno de acuerdo con la legislación de patentes del mismo.

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Referencias citadas en la descripción

La presente lista de referencias citada por el solicitante se proporciona para conveniencia del lector únicamente. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la compilación de las referencias, no puede descartarse que se hayan producido errores u omisiones y la EPO se exime de toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet GB 9716886 A [0006]

\bullet US 5364934 A [0055]

\bullet WO 8705330 A [0063]

\bullet US 4640835 A [0065]

\bullet US 4496689 A [0065]

\bullet US 4301144 A [0065]

\bullet US 4670417 A [0065]

\bullet US 4791192 A [0065]

\bullet US 4179337 A [0065]

\bullet US 5428130 A [0068]

\bullet WO 9410308 A [0069]

\bullet WO 8905859 A [0077]

\bullet US 4399216 A [0077]

\bullet US 5010182 A [0082]

\bullet EP 362179 A [0082]

\bullet WO 9013646 A [0082]

\bullet EP 36776 A [0086]

\bullet EP 73657 A [0088]

\bullet GB 2211504 A [0089]

\bullet EP 117060 A [0092]

\bullet EP 117058 A [0092]

\bullet US 4736866 A [0103]

\bullet US 4870009 A [0103]

\bullet US 4816567 A [0122] [0122] [0126]

\bullet US 5545807 A [0127]

\bullet US 5545806 A [0127]

\bullet US 5569825 A [0127]

\bullet US 5625126 A [0127]

\bullet US 5633425 A [0127]

\bullet US 5661016 A [0127]

\bullet WO 9308829 A [0129]

\bullet US 4676980 A [0131] [0131]

\bullet WO 9100360 A [0131]

\bullet WO 92200373 A [0131]

\bullet EP 03089 A [0131]

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20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgctcgcgct cacgcagaga tg

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 24

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<212> AND

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial 1-24

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<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaatcgtgc gtgacatcaa agag

\hfill

24

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<210> 14

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<211> 23

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<212> AND

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia artificial 1-23

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctccttctgc atcctgtcag caa

\hfill

23

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<210> 15

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<211> 22

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<212> AND

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial 1-22

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggttccgat gccctgaggc tc

\hfill

22

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<210> 16

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<211> 307

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

5

6

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<210> 17

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<211> 309

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

7

8

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<210> 18

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<211> 300

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

9

10

Claims (35)

1. Molécula aislada de ácido nucleico, que comprende:

(a)

ADN codificante de un polipéptido UCP4 y que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con una molécula de ácido nucleico codificante de la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1),

(b)

el complemento de la molécula de ADN de (a),

(c)

ADN codificante de un polipéptido UCP4 que presenta una identidad de secuencia de 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1),

(d)

o el complemento del ADN de (c).

2. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de entre 40 y 1.011 de la figura 2 (SEC ID nº 2).

3. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de la figura 2 (SEC ID nº 2).

4. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende ADN codificante de un polipéptido UCP4 y que se hibrida con el complemento del ácido nucleico que comprende los nucleótidos 40 a 1.011 de la figura 2 (SEC ID nº 2) bajo condiciones que comprenden 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia consistente de 0,1 x SSC que contenía EDTA a 55ºC.

5. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende ADN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con: (a) una molécula de ADN codificante del mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el depósito de la ATCC nº 203134 (ADN 77568 - 1626), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, que comprende ADN codificante del mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el depósito de la ATCC nº 203134 (ADN 77568-162G).

7. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende: (a) ADN codificante de un polipéptido que comprende la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento del ADN de (a).

8. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.

9. Vector según la reivindicación 8 operablemente ligado a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con un vector.

10. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 9.

11. Célula huésped según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula CHO.

12. Célula huésped según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una E. coli.

13. Célula huésped según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula de levadura.

14. Procedimiento para producir un polipéptido UCP4 que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 10 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido UCP4 y recuperar dicho polipéptido UCP4 a partir del cultivo celular.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, que comprende: (i) hibridar una molécula de ADN de ensayo bajo condiciones que comprenden 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,x s SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de elevada astringencia consistente de 0,1 x SSC que contenía EDTA a 55ºC con (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido UCP4 que comprende la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y, si dicha molécula de ADN de ensayo presenta una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 80% con (a) o con (b), (ii) cultivar una célula huésped que comprende dicha molécula de ADN de ensayo bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido, e (iii) recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo
celular.

16. Polipéptido UCP4 aislado codificado por el ADN según la reivindicación 1.

17. Polipéptido UCP4 aislado, que comprende un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

18. Polipéptido UCP4 aislado según la reivindicación 17, que comprende residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

19. Polipéptido UCP4 aislado según la reivindicación 17, en el que el polipéptido UCP4 se encuentra codificado por la inserción de ADNc del vector depositado como depósito de la ATCC nº 203134 (ADN 77568-1626).

20. Polipéptido UCP4 aislado según la reivindicación 17, que consiste esencialmente de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

21. Polipéptido UCP4 aislado según la reivindicación 17, que consiste de los residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

22. Molécula quimérica, que comprende un polipéptido UCP4 según la reivindicación 16 y que se encuentra fusionada con una secuencia heteróloga de aminoácidos.

23. Molécula quimérica según la reivindicación 22, en la que dicha secuencia heteróloga de aminoácidos es una secuencia de etiqueta epítopo.

24. Molécula quimérica según la reivindicación 22, en la que dicha secuencia heteróloga de aminoácidos es una región Fc de una inmunoglobulina.

25. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido UCP4 que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

26. Anticuerpo según la reivindicación 25, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

27. Procedimiento para modular la tasa metabólica en una célula de mamífero in vitro, que comprende la etapa de regular positivamente o regular negativamente la actividad del polipéptido UCP4 en la célula de mamífero, presentando el polipéptido UCP4 una identidad de secuencia de por lo menos 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicha regulación positiva de la actividad del polipéptido UCP4 estimula un incremento de la tasa metabólica en un mamífero obeso.

29. Procedimiento para llevar a cabo un ensayo de cribado in vitro para identificar una molécula que incrementa o regula positivamente o reduce o regula negativamente la expresión de un polipéptido UCP4 que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1), que comprende las etapas de exponer una muestra de células o tejido de mamífero que se cree comprende UCP4 a una molécula candidata y posteriormente analizar la expresión de UCP4 en dicha muestra.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, que comprende además la etapa de analizar el potencial de membrana mitocondrial en dicha muestra.

31. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho polipéptido UCP4 comprende los residuos aminoácidos 1 a 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1).

32. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicha muestra comprende tejido cerebral humano.

33. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicha molécula candidata es una molécula pequeña que comprende un compuesto orgánico o inorgánico sintético.

34. Procedimiento para detectar la expresión in vitro de polipéptido UCP4 que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con la secuencia de residuos aminoácidos de entre 1 y 323 de la figura 1 (SEC ID nº 1) en una muestra de células o tejido de mamífero, que comprende poner en contacto una muestra de células o tejido de mamífero con una sonda de ADN y analizar la expresión del transcrito de ARNm de UCP4 en dicha muestra.

35. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que dicha muestra es de tejido cerebral humano.