MX2012005342A - Uso de derivados benzo-heterociclico para prevenir y tratar el cancer o para inhibir metastasis de cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un uso novedoso de derivados de benzo-heterociclo, y más particularmente, a una composición para evitar y tratar el cáncer, que comprende derivados de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como ingredientes activos. Los inventores de la presente invención han encontrado que KRS interactúa con 67LR para promover la migración de las células cancerígenas (o tumor) y de esta manera afecta la metástasis de cáncer, y también tiene identificado que la sustancia la cual inhibe la interacción entre el KRS y 67LR suprime la metástasis de células cancerígenas, y de este modo pueden utilizarse para prevenir y tratar el cáncer. Por consiguiente, la composición de la presente invención suprime la metástasis de cáncer, y por lo tanto proporciona un medio novedoso para prevenir y tratar el cáncer.

Description

USO DE DERIVADOS BENZO-HETEROCICLO PARA PREVENIR Y TRATAR CANCER O PARA INHIBIR METÁSTASIS DE CÁNCER Campo Técnico Esta solicitud reclama la prioridad de y el beneficio de la Solicitud de Patente Coreana N°. 10-2009 - 0106350 , presentada el 5 de noviembre de 2009 , la cual se incorpora en la presente para referente para todos los propósitos como si se estableciera completamente en la presente.

Técnica Antecedente Esta solicitud se refiere a un derivado benzo-heterociclo novedoso y más particularmente, se refiere a una composición para prevenir y tratar cáncer o para inhibir la metástasis que comprende derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como un ingrediente activo.

Un cáncer (o tumor} se desarrolla por una incontrolable proliferación celular anormal trastornada. Especialmente, si este tumor muestra un crecimiento destructivo, invasión y metástasis, se considera como un cáncer maligno. La invasión es un carácter para infiltrar o destruir los tejidos circundantes, y en particular, una capa basal que forma un límite de tejidos se destruye por el carácter, resultando en la propagación local y algunas veces la entrada de un tumor a través del sistema circulatorio. La metástasis significa la propagación de células tumorales desde el lugar de nacimiento original hasta otras áreas a través de los vasos sanguíneos o linfáticos. En un sentido amplio, la metástasis también significa la extensión directa de las células tumorales a través de la cavidad corporal serosa u otro espacio.

Actualmente, la operación quirúrgica, la radioterapia y la quimioterapia se utilizan ampliamente para el tratamiento de cáncer individualmente o en conjunto. La operación quirúrgica es una forma de remover los tejidos enfermos. De este modo, los tumores en regiones específicas tales como mama, colon y piel pueden removerse efectivamente por la operación quirúrgica. Sin embargo, un tumor en la vértebra o tumor dispersivo como leucemia no pueden tratarse apropiadamente por la operación quirúrgica.

La replicación o metabolismo celular impide la quimioterapia, y se ha utilizado para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer testicular. Sin embargo, los pacientes con cánceres quiénes se han tratado por quimioterapia han sufrido seriamente de los efectos secundarios de la quimioterapia sistémica. Son comunes el mareo y vómito por movimiento pero ejemplos serios de todo. Los efectos secundarios de quimioterapia pueden incluso afectar la vida de un paciente ya que podría caer la adaptabilidad de un paciente rápidamente. Además, la DLT (toxicidad limitante de dosis) también es uno de los efectos secundarios principales de la quimioterapia, que establece una especial atención en la administración de una medicina. La mucositis es un ejemplo de DLT contra agentes cancerígenos tales como 5-fluorouracilo que es un agente citotóxico antimetabólico, y metotrexato, y antibióticos anticáncer, como doxorrubicina . Si un paciente sufre seriamente de tales efectos secundarios de quimioterapia, él o ella debe ser hospitalizado y debe administrársele un calmante para reducir el dolor. Así, los efectos secundarios de quimioterapia y radioterapia son el mayor problema para el tratamiento de pacientes con cáncer.

La propagación metastásica es un determinante crítico para la letalidad del cáncer. El receptor de laminina de 67 kDa (67LR) es un tipo de receptor sin integrina integrado den la membrana de plasma y asociado con la invasión de cáncer y metástasis (Nelson, J. et al. El receptor de laminina de 67 kDa: estructura, función y rol en la enfermedad. Biosci . Rep. 28, 33-48 (2008)). 67LR se genera de dimerización de su precursor 37 kDa (37LRP) aunque el detalle molecular de este proceso de conversión no . se entiende. El 37LRP es idéntica a la subunidad ribosomal p40 que se implica en la formación de polisoma (Auth, D. & Brawerman, G. un polipéptido de 33-kDa con homología en el receptor de laminina: componente de la maquinaria de traducción. Proc. Nati Acad. Sci . USA. 89, 4368-4372 (1992)). 67LR a menudo se observa que niveles elevados en una variedad de cánceres (Nelson, J. et al., receptor de laminina de 67 kDa: estructura, función y rol en enfermedad. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008); Menard, S., Castronovo, V., Tagliabue, E. & Sobel , M.E. Nuevos conocimientos sobre el receptor de laminina de 67 kD asociado con metástasis. J. Cell Biochem. 67, 155-165 (1997)). Sin embargo, el regulador y mecanismo molecular para la residencia de membrana de 67LR no se han determinado aún. En este trabajo, se ha encontrado que lisil-ARNt sintetasa (KRS) mejora la migración celular y la metástasis de cáncer al estabilizar 67LR en membrana de plasma.

KRS pertenece a aminoacil-ARNt sintetasas (ARS) que liga sus aminoácidos cognados y los ARNts para síntesis de proteína. Estas enzimas antiguas muestran funciones pleiotrópicas además de sus actividades catalíticas (Park, S.G., Ewalt, K.L. & Kim, S. Expansión funcional de aminoacil-ARNt sintetasas y sus factores de interacción: nuevas perspectivas en responsables de mantenimiento. Trends Biochem. Sci. 30, 569-574 (2005)). Además, diversos ARS de mamíferos incluyendo KRS forman un complejo macromolecular (Lee, S.W., Cho, B. H., Park, S. G. & Kim, S. complejos de aminoacil-AR t-sintetasa : más allá de la traducción. J". Cell Sci. 117, 3725-3734 (2004), Han, J.M., Kim, J.Y. & Kim, S. red molecular e implicaciones funcionales del complejo macromolecular de ARNt sintetasa. Biochem. Biophys . Res . Commun . 303, 985-993 (2003)), que sirven como depósito molecular (Ray, P.S., Arif, A. & Fox, P complejos Macromolecular como depósitos para proteínas reguladoras liberables. Trends Bioche . Sci. 32, 158-164 (2007).), para controlar las funciones múltiples de las proteínas componentes. El KRS humano contiene una extensión N-terminal única implicada en las interacciones con AR y otras proteínas ( ) .

Descripción Problema Técnico Por consiguiente, se condujo la investigaciones en la diversidad funcional de una lisil-ARN-t sintetasa (KRS) humana, y se encontró que 37LRP/p40 es una de las proteínas capaces de unirse a KRS humana. También, se encontró que KRS facilita la migración celular y la metástasis de cáncer al estabilizar un receptor de laminina (67LR) formado por la dimerización de 37LRP, en una membrana de plasma, en otras palabras, KRS tiene un efecto en la metástasis de cáncer o la migración de células de cáncer a través de un receptor de laminina sobre una membrana de plasma. Puesto que una sustancia que inhibe la interacción entre KRS y 67LR tiene un efecto de prevención/tratamiento contra el cáncer a través de la inhibición de metástasis del cáncer, se encontró un uso novedoso de un derivado benzo-heterociclo que inhibe la interacción, y basado en este hallazgo, completo esta invención .

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un uso de derivado de benzo-heterociclo que previene y trata el cáncer al inhibir la metástasis del cáncer a través de la inhibición de la interacción entre KRS y 67LR.

Solución Técnica Para lograr el objetivo anterior, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para prevenir y tratar el cáncer que comprende un derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo .

Para lograr otro objeto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la metástasis que comprende el derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Para lograr aún otro objeto, la presente invención proporciona un uso de un derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para preparar un agente para prevenir y tratar el cáncer.

Para lograr aún otro objeto, la presente invención proporciona un uso de un derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para preparar un agente para inhibir la metástasis.

Para lograr aún otro objeto, la presente invención proporciona un método para prevenir y tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Para lograr aún otro objeto, la presente invención proporciona un método para inhibir la metástasis que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de derivado de benzo-heterociclo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

A continuación, la presente invención se describirá en detalle.

En primer lugar se confirma que KRS tiene un efecto en la metástasis del cáncer o la migración de células de cáncer. En otras palabras, en la presente invención, se confirmó que KRS tiene un efecto en la metástasis del cáncer o la migración de células de cáncer a través de un receptor de laminina (67LR) sobre una membrana de plasma. También, en primer lugar se confirma que una sustancia que inhibe la interacción entre KRS y 67LR inhibe la metástasis del cáncer, y de este modo puede utilizarse para la prevención y tratamiento de cáncer, y después, se selecciona un compuesto de derivado de benzo-heterociclo al seleccionar una biblioteca de compuestos.

El término "KRS", "Proteína de KRS " o "Polipéptido de KRS" se refiere a un polipéptido conocido como lisil ARNt sintetasa. Tal polipéptido KRS puede ser un polipéptido bien conocido en la técnica pero, de que preferencia puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del GenBank No. de Acceso: NP_005539. Y la KRS de la presente invención incluye equivalentes funcionales de la misma.

El término "equivalentes funcionales" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 70% de homología de secuencia de aminoácido (es decir, identidad) con una secuencia de aminoácidos del GenBank No. de acceso: NP_005539, de preferencia por lo menos 80%, y de mayor preferencia por lo menos 90%, por ejemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% de homología de secuencia de aminoácidos, que muestra una actividad fisiológica sustancialmente idéntica al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido del GenBank No. de acceso: NP_005539. La "actividad fisiológica sustancialmente idéntica" significa interacción con el receptor de laminina de la membrana de plasma y la regulación de metástasis tumoral o migración de células tumorales .

El "receptor de laminina " o el "receptor de laminina de 67 kDa (67LR) " es el receptor sin integrina, integrado en la membrana de plasma y por ejemplo, puede tener una secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos cualquiera descrita en Genbank No. de acceso: NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XP_370865, XP_001083023. Además, el receptor de laminina de la presente invención puede comprender equivalentes funcionales del mismo .

En la presente invención, para la inhibición de la interacción entre KRS y 67LR, un método para detectar la interacción de proteína-proteína conocido en la técnica puede utilizarse, por ejemplo, diversos métodos conocidos en la técnica, tales como ensayos de unión proteína-proteína in vitro (ensayo de co-inmunoprecipitación in vitro) , EMSA (ensayo de cambio de movilidad electroforética) , inmunoensayos para unión de proteína, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.), ensayos de inmunes precipitaciones no inmunes, ensayos de transferencia western por inmunoprecipitación, ensayos de, inmuno-co-localización articulación, afinidad, cromatografía, inmunoprecipitación (IP) , dos híbridos en levadura (Y2H) , transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) , complementación de fluorescencia bimolecular (Bi-FC) , y similar pueden utilizarse.

Para la selección del compuesto de la presente invención, por ejemplo, un ensayo de 2 híbridos de levadura pueden llevarse a cabo al utilizar levadura que expresa KRS y 67LR, o partes u homólogos de las proteínas, fusionados con el dominio de unión de ADN del represor bacteriano LexA o levadura GAL4 y el dominio de transactivación de la proteína GAL4 de levadura, respectivamente (Kim, M. J. et al., Nat. Gent., 34:330-336, 2003). La interacción entre KRS y 67LR reconstruye un transactivador que induce la expresión de un gen reportero bajo el control por un promotor que tiene una unión de secuencia regulatoria al dominio de unión de ADN de la proteína LexA o GAL4.

Como se describe en lo anterior, el gen reportero puede ser cualquier gen conocido en la técnica que codifica un polipéptido detectable. Por ejemplo, CAT (cloranfenicol acetiltransferasa) , luciferasa, beta-galactosidasa, beta-glucositasa, alcalino fosfatasa, GFP (proteína verde fluorescente), etc. pueden utilizarse. Si la interacción entre KRS y 67LR, o parte de homólogos de las proteínas se facilitan o mejoran mediante un agente de prueba, la expresión del gen reportero incrementa más que aquel bajo una condición normal. Por otro lado, si la interacción se inhibe o reduce por un agente de prueba, el gen reportero no se expresa menos que aquel bajo una condición normal.

También, puede seleccionarse un gen reportero que codifica una proteína la cual permite el crecimiento de levadura (es decir, si el gen reportero no se expresa, el crecimiento de levadura se inhibe) . Por ejemplo, pueden utilizarse los genes auxotrópicos que codifican las enzimas implicadas la biosíntesis para obtener aminoácidos o bases de nitrógeno (por ejemplo, genes de levadura tales como ADE3 , HIS3, etc. o genes similares de otras especies). Si la Interacción de AIMP2 y p53, o partes u homólogos de las proteínas, expresadas en este sistema, se inhiben o se reducen por un agente de prueba, el gen reportero no se expresa o se expresa menos. Por consiguiente, bajo tal condición, el crecimiento de levadura se detiene o retarda. Tal efecto por la expresión del gen reportero puede observarse a simple vista o al utilizar un dispositivo (por ejemplo, un microscopio) .

En la presente invención, se seleccionó una biblioteca de compuesto mediante el método de selección. Entonces, se ha determinado que los compuestos derivados de benzoxazol, benzotiazol, y benzopirrolo tienen un efecto de prevención/tratamiento contra el cáncer al inhibir la metástasis de cáncer a través de la inhibición de la interacción entre KRS y 67LR.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para prevenir y tratar el cáncer, la composición farmacéutica comprende un derivado de benzo-heterociclo representado por la Fórmula 1 siguiente o su sal farmacéuticamente aceptable, como un ingrediente activo.

[Fórmula 1] en donde, representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual son aceptables como átomos requeridos) ; A se selecciona del grupo que comprende O, NH y S; X representa C o N; Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, arilalquilo , R4 representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilaquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, "alquilo" indica un grupo hidrocarburo alifático de cadena lineal o ramificada que tiene alrededor de 1 a 20 átomos de carbono en la cadena. De mayor preferencia, un grupo alquilo incluye alrededor de l, 2, 3, 4, 5 Ó 6 átomos de carbono en la cadena. Un grupo ramificado indica que por lo menos un grupo alquilo inferior, por ejemplo, metilo, etilo o propilo, se unen una cadena alquilo lineal. El término "alquilo inferior" indica un grupo de cadena lineal o ramificada que tiene alrededor de 1 a 6 átomos de carbono. "Alquilo" puede ser sin sustituir u opcionalmente sustituido con por lo menos un sustituyente igual o diferente, en el cual cada sustituyente puede ser halógeno, alquilo, arilo, cicloalquilo, ciano, hidroxi, alcoxi, alquiltio, amino, carboxi o similares. De preferencia, el alquilo puede ser metilo, etilo, butilo o isobutilo.

"Alcoxi" indica un grupo alquilo-0 en el cual el grupo alquilo es como se describe previamente. Ejemplos apropiados del grupo alcoxi incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi y n-butoxi . El alcoxi se une a un residuo parental a través de oxígeno. De preferencia, el alcoxi puede ser metoxi o etoxi .

"Arilo" significa un sistema de anillo de hidrocarburo aromático y sus ejemplos incluyen fenilo, indenilo, indanilo, naftilo, fluorenilo y similares.

También, "halógeno" puede incluir un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo, o un átomo de yodo, y de preferencia puede ser un átomo de flúor, un átomo de cloro, o un átomo de bromo.

"Alquilo sustituido con halógeno " significa un grupo alquilo sustituido con 1 a 3 átomos de halógeno, por ejemplo, puede ser fluorometilo , clorometilo, difluorometilo, diclorometilo, dibromometilo, trifluorometilo, triclorometilo, fluoroetilo, cloroetilo, trifluoroetilo, tricloroetilo, fluoropropilo, fluorobutilo , fluorohexilo o similares. De preferencia, puede ser alquilo de (C1-C6) , sustituido con halógeno, y de mayor preferencia puede ser alquilo de (C1-C6) sustituido con cloro o flúor. De mayor preferencia, puede ser trifluorometilo .

Arilo sustituido con halógeno" significa un grupo arilo sustituido con 1 a 3 átomos de halógeno, por ejemplo, puede ser fluorofenilo, difluorofenilo, trifluorofenilo, clorofenilo, diclorofenilo, triclorofenilo, bromofenilo, dibromofenilo, tribromofenilo, difluorobencilo, diclorobencilo, dibromobencilo o similares. De preferencia, puede ser clorofenilo.

"Arilo sustituido con alquilo" o "arilalquilo" significa un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes alquilo, por ejemplo, puede ser bencilo, etilfenilo, propilfenilo, dimetilfenilo, dietilfenilo, trimetilfenilo, trietilfenilo o similares. De preferencia puede ser bencilo.

De preferencia, en el compuesto de la presente invención representado por la Fórmula 1, Ri puede representar hidrógeno, metilo, trifluorometilo, metoxi, etoxi, cloro, nitro o amina, R2 puede representar hidrógeno, 2,4,6-trimetilfenilo (2 , 4, 6-Trimetil-fenilo) , 2 , 6-dimetoxifenilo (2 , 6-Dimetoxi-fenilo) , R4 puede representar hidrógeno o trifluorometilo, R5 puede representar fenilo (fenilo) , 4-etil-fenilo (4-Etil-fenilo) , 3 , 4-dicloro-fenilo (3 , 4-dicloro-fenilo) , o 4-fenilazo-fenilo (4-Fenilazo-fenilo) . También, R3 puede representar hidrógeno, Más específicamente, el compuesto que se determinó para mostrar un efecto anticancerígeno al inhibir la interacción entre KRS y 67LR, y su fuente se indican en la Tabla 1 siguiente.

[Tabla 1] No. de nombre No. de Referencia o Registro fórmula Pandeya, Surendra N. ; Shankar, N- (6-Metoxi- Vinod. Síntesis de derivados 2 benzooxazol-2-il) - de benzotiazol y sus benzamida actividades insecticidas y larvicidas. Fármacos de la India (1985), 23(3), 146-51.

CODEN: INDRBA ISSN: 0019- 462X. CAN 104:124989 AN 1986:124989 CAPLUS Park, Choo Hea Young; Chang, Hyeun Wook; Yoon, Ju Hee; Ju, Hye Kyung. Método para inhibir (5-Nitro- 5-lipoxigenasa utilizando un benzooxazol- 2 -il)- derivado de benzoxazol o un (4-fenilazo- fenil) - análogo del mismo. Publicación amina de Solicitud de Patente Estadounidense (2004), 11 p .

CODEN: USXXCO US 2004198768 Al 20041007 CAN 141:332184 AN 2004: 825136 CAPLUS Kumari, T. Aruna; Rao, P.

Jayaprasad. Una síntesis fácil de 3- N-Benzooxazol -2-il- (aroilimino) benzoxazolo (3,2-benzamida b] [1, 2 , 4] tiadiazolinas 7- sustituidas. Publicación de la India de Química Heterocíclica (2001), 11(1), 9-14-CODEN: IJCHEI ISSN: 0971-1627. CAN 136:232245 AN 2001:808784 CAPLUS [Fórmula 2] [Fórmula 4] [Fórmula 6] [Fórmula 7] [Fórmula 9] [Fórmula 10] [Fórmula 11] [Fórmula 12] [Fórmula 16] De manera más particular, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para prevenir y tratar el cáncer que comprende N- ( 6-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 2, N- ( 5- etoxi-benzooxazol-2-il ) benzamida de la fórmula 3, (5-Cloro-benzooxazol-2-il) -fenil-amina de la fórmula 4, ( 5-Cloro-benzooxazol-2-il ) - ( -etil-fenil ) -amina) de la fórmula 5, (5-Cloro benzooxazol-2-il ) -(3 , 4-dicloro-fenil) -amina) de la fórmula 6, (5-Nitro-benzooxazol-2-il) - (4-fenilazo-fenil) -amina) de la fórmula 7, N-Benzooxazol-2-il-benzamida de la fórmula 8, N-(5-Nitro-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 9, N- ( 5-Metoxi-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 10, N-(5-Metil-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 11, N- (6-Nitro-benzotiazol-2-il ) -4-trifluorometil-benzamida de la fórmula 12, ácido [2- (5-Metil-benzooxazol-2-il) -fenoxi] -acético de la fórmula 13, (2- (2 , 4 , 6-Trimetil-fenil) -benzooxazol-5-ilamina de la fórmula 14, ácido 2- [2- (4-Metil-benzoilimino) -benzotiazol-3-il] -butírico de la fórmula 15, (2- (2, 6-Dimetoxi-fenil ) -benzotiazol de la fórmula 16 y (2-Cloro-4-fluoro-bencil) - (5-fluoro-lH-indol-3-ilmetil) -amina de la fórmula 17 o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas como un ingrediente activo.

El compuesto seleccionado por el método de selección de la presente invención puede aplicarse a diversos cánceres ya que inhibe metástasis de células tumorales primarias. Los cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer pancreático, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de testículos, cáncer de cervical, carcinoma endometrial, coriocarcinoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno, linfoma y anemia aplásica. Además, la prevención y tratamiento de cáncer se realizan al inhibir la metástasis de células tumorales con la interacción de KRS y 67LR de la presente invención que reduce la migración de células tumorales y metástasis.

La composición de la presente invención puede utilizarse como está o en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa que el componente presente en la composición es fisiológicamente aceptable y usualmente no provoca reacciones alérgicas o similares cuando se administra a humanos. Específicamente, la sal puede ser una sal de adición ácida formada a partir de un ácido libre farmacéuticamente aceptable. El ácido libre puede ser un ácido orgánico o inorgánico. El ácido orgánico incluye pero no se limita a ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido trifluoroacético, ácido benzoico, ácido glucónico, ácido metansulfónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido 4-toluensulfónico, ácido glutámico y ácido aspártico. Y, el ácido inorgánico incluye pero no se limita a ácido clorhídrico, ácido brómico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico.

Cuando el compuesto o una composición que comprende el compuesto de la presente invención se administra clínicamente, la composición de la presente invención puede formularse en una forma de dosis unitaria de la formulación farmacéutica apropiada para administración oral o parenteral. Cuando la composición se fórmula en una forma de medicina general, un diluyente o excipiente convencionalmente utilizado, tal como un rellenador, un extendedor, un aglutinante, un agente de humectación, un agente de desintegración, un tensioactivo, etc., se utiliza para la preparación. Ejemplos de una preparación sólida para la administración oral puede incluir tabletas, pildoras, polvos gránulos, cápsulas y similares, y tal preparación sólida se prepara al mezclar el compuesto de la presente invención con por lo menos un excipiente, por ejemplo, almidón, carbonato de calcio, sacarosa, lactosa, gelatina, o similares. También, además de un excipiente simple, los lubricantes tal como talco de estearato de magnesio se utiliza. Ejemplos de una preparación líquida para administración oral puede incluir una suspensión, un líquido para uso interno, una emulsión, un jarabe, y similares, y la preparación líquida puede incluir no solamente un diluyente simple generalmente utilizado, tal como agua, y parafina líquida, sino también diversos excipientes, por ejemplo, un agente de humectación, a agente edulcorante, un agente aromático, un conservador, etc. Ejemplos de una preparación para administración parenteral incluye una solución acuosa esterilizada, un solvente no acuso, una suspensión, una emulsión, a agente de liofilización, un ungüento, y una crema. Como un solvente no acuso, o un solvente de suspensión, propilenglicol , polietilenglicol , aceite vegetal (tal como aceite de oliva), éster inyectable (tal como etiloleato) , o similares pueden utilizarse .

También, el compuesto de la presente invención la composición que comprende el compuesto puede ser parenteralmente administrado, y la administración parenteral se lleva a cabo mediante inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intramuscular o inyección intraesternal . Para la formulación en una forma para administración parenteral, el compuesto de la presente invención representado por las Fórmulas 1 a 17 se preparó en una solución o un liquido de suspensión en mezcla con un agente de estabilización o un regulador en agua, y entonces se fórmula en una forma de dosis unitaria de una muestra o un frasco. La unidad de dosis puede contener, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces de una dosis individual o 1/2, 1/3 ó 1/4 veces de una dosis individual. La dosis individual de preferencia contiene la cantidad de un fármaco efectivo que se administra en una dosis y que corresponde generalmente a un total, una mitad, un tercio o un cuarto de una dosis diaria. La dosis puede variar de acuerdo con el peso corporal, edad, sexo, condición de salud, dieta, duración administración, método de administración, índice de excreción, mezclas de medicinas y severidad de la enfermedad para un cierto paciente.

Estas formulaciones se describen en la referencia general para química farmacéutica (Remington 's Pharmaceutical Science, 15a Edición, 1975, ack Publishing Company, Easton, Pennsylvania) .

Además, como en lo anterior, la composición de la presente invención inhibe la interacción de KRS y 67LR e inhibe la migración o metástasis de células tumorales primarias o células cancerígenas. Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la metástasis que comprende la composición de la presente invención o sales farmacéuticamente aceptables de la misma. La composición puede ser una de las composiciones representado por la fórmula 1 a 17.

Mientras tanto, una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender 0.001 a 99.999 % en peso de la composición representada por la fórmula 1 a 17 y el resto puede ser un portador farmacéuticamente aceptable.

También, una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse junto con una composición bien conocida que tiene efectos en prevenir y tratar el cáncer o inhibir la metástasis.

La presente invención proporciona un uso del derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo para preparar un reactivo para prevenir y tratar el cáncer.

También, la presente invención proporciona un uso del derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo para preparar un reactivo para inhibir la metástasis.

También, la presente invención proporciona un método para prevenir y tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva del derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo .

También, la presente invención proporciona un método para inhibir la metástasis que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva del derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

El derivado de benzo-heterociclo puede ser uno de los compuestos representados por la fórmula 1 a 17.

El derivado de benzo-heterociclo de la presente invención o sales farmacéuticamente aceptables del mismo pueden administrarse a través de varias rutas de administración que comprenden oral, intracutánea, subcutánea, intravenosa o intramuscular. La "cantidad aceptable" se refiere la cantidad que muestra efectos en prevenir y tratar el cáncer o inhibir la metástasis cuando se administra a un paciente y el "sujeto" se refiere a animales, particularmente, mamíferos que comprenden humanos y el sujeto puede ser células, tejidos o órganos originados de los animales. El sujeto puede ser un paciente en necesidad de tratamiento .

El derivado de benzo-heterociclo de la presente invención o su sal farmacéuticamente aceptable puede administrarse como tal, o puede prepararse en diversas formulaciones como se describe en lo anterior para administración. De preferencia, puede administrarse hasta un efecto requerido, es decir, un efecto de prevención/tratamiento de cáncer o a efecto que inhibe la metástasis del cáncer, se obtiene. El compuesto de la presente invención o su sal farmacéuticamente aceptable puede administrarse por varias rutas de acuerdo con un método conocido en la técnica. En otras palabras, puede administrarse oral o parenteralmente, por ejemplo, en forma bucal, intramuscular, intravenosa, intracutánea, intraarterial , intraósea, intratecal, intraperitoneal , intranasal, intravaginal , rectal, sublingual o subcutánea, o puede administrarse por una ruta gastrointestinal, transmucosal o respiratoria. Por ejemplo, el compuesto de la presente invención o su sal farmacéuticamente aceptable puede aplicarse directamente a la piel. De otra manera, el polipéptido puede prepararse en una formulación inyectable, y después inyectada en una cantidad predeterminada en una capa subcutánea con una aguja de inyección delgada de calibre 30, o administrada al punzar ligeramente la piel con la aguja de inyección. De preferencia, puede ser aplicada directamente a la piel. También, el compuesto de la presente invención o su sal farmacéuticamente aceptable puede administrarse en células o tejidos objetivos (por ejemplo, células de la piel o tejidos de la piel) al unirse a una molécula provocando una unión de alta afinidad o ser encapsuladas dentro de la molécula. El compuesto de la presente invención o su sal farmacéuticamente aceptable puede unirse a un esterol (por ejemplo, colesterol) , un lípido (por ejemplo, lípido catiónico, virosoma o liposoma) o un agente de unión específico de célula objetivo (por ejemplo, ligando reconocido por un receptor específico de célula objetivo) a través de la tecnología conocida en la técnica. Como un agente de acoplamiento o un agente de reticulación, por ejemplo, proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) o similares, pueden incluirse apropiadamente .

Estas formulaciones se describen en referencia general para química farmacéutica { (Remington 's Phar aceutical Science, 15a Edición, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania) .

Para referencia, las técnicas de nucleótido y proteína de la presente invención se describen en, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982) ; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990) .

A continuación, las figuras de la presente invención se describirán.

Las FIGURAS 1 a 6 muestran la interacción específica entre la KRS humana y el receptor de laminina. En la FIGURA -1, la interacción entre la KRS humana de longitud completa y 37LRP/p40 se determinó por un ensayo de dos híbridos de levadura. AIMPl y AIMP2, los dos componentes del complejo multi-ARS, se utilizaron como grupos control positivo y negativo, respectivamente. La interacción positiva se indica la formación de colonia azul en un medio de levadura que contiene x-gal . En la FIGURA 2, 37LRP se sintetizó mediante traducción in vitro en la presencia de [35S]metionina, y se sometió a ensayo de pull-down con GST-KRS o GST. El 37LRP co-precipitado con GST-KRS se detectó mediante autorradiografía . En la FIGURA 3, las regiones de péptido implicadas en la interacción entre KRS y 37LRP se determinaron mediante el ensayo de dos híbridos de levadura. El 37LRP que tiene 296 amino ácidos con dominios N-terminal intracelular (amino ácidos 54 a 113) y · C-terminal extracelular (amino ácidos 137 a 210) se dividen por un dominio de transmembrana (amino ácidos 113 a 137). La extensión N-terminal específica (alrededor de 70 amino ácidos) de la KRS humana (597 amino ácidos) se sigue por dominios de unión anticodón de tipo OB-fold (amino ácidos alrededor de 70 a 214) y catalíticos (amino ácidos alrededor de 220 a 574). En la FIGURA 4, las células A549 transfectadas con Myc-KRS se lisaron y se sometieron a i munotransferencia con los anticuerpos indicados (WCL: lisado de célula completa) . Las células se separaron en fracciones citoplásmicas y de membrana, y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Myc. Después, la co-precipitación de 67LR y 37LRP se determinó mediante transferencia western. IgG se utilizó como un control. En la FIGURA 5, los lisados de las células A549 transfectadas con Myc-KRS se sometieron a transferencia western con los anticuerpos indicados. Las células se separaron en fracciones citoplásmicas (C) y de membrana (M) , se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Myc, y co-precipitación de 37LRP y 67LR se determinó por transferencia western. IgG se utilizó como un control. En la FIGURA 6, la interacción dependiente de laminina entre KRS y 67LR se identificó mediante co-precipitación. En otras palabras, se encontró que el tratamiento con laminina (10pg/ml, lh) incrementó la unión de 67 RL y KRS se incrementó. Para identificar esto, la inmunoprecipitación se realizó con el anticuerpo que reconoce 67LR (abcam, cat # ab2508) , y la etiqueta IgG en el lado izquierdo, como IgG total obtenida de un conejo, se utilizó como un control negativo. El precipitado se sometió a 10% de SDS PAGE, mientras se transfirió a la membrana PVDF, y se sometió a inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen KRS y 67LR respectivamente .

Las FIGURAS 7 a 12 muestran la translocación de membrana inducida por laminina, y fosfororilación de KRS. En la FIGURA 7, las células A549 se trataron con laminina (l(^g/ml) , y los niveles de 67LR, 37LRP y KRS se determinaron mediante transferencia western en los tiempos indicados. Hsp90 y cadherina (Cad) se utilizaron como marcadores para citoplasma y membrana, respectivamente. En la FIGURA 8, las células A549 sin tratar o tratadas con laminina durante 1 hora se sometieron a tensión por inmunofluorescencia con anti-67LR (MLuC5, Santacruz, sc-59732) - (rojo) y KRS anticuerpos (verde). En la FIGURA 9, las células A549 se trataron con U73122 (U) , estaurosporina (ST) y LY294002 (LY) que inhiben la PLC-gamma, PKC y PI3K, respectivamente, durante 3 horas, y después se trató con laminina durante 1 hora. Después, se determinó cómo estos inhibidores cinasa pueden afectar el citoplasma y la membrana de 67LR y KRS. En la FIGURA 10, las células A549 se transíectaron con Myc-KRS, y se incubaron durante 24 horas. Después, las células se trataron con los fármacos indicados y después con laminina como lo anterior. Myc-KRS fue inmunoprecipitada, e inmunotransferida con anticuerpos anti-p-Thr, -Ser, y -Tyr. En la FIGURA 11, las células A549 se transíectaron con Myc-KRS, y se cultivaron durante 24 horas. Las células transfectadas se pre-trataron con LY294002 durante 3 horas y después se trataron con laminina durante 1 hora. Myc-KRS se inmunoprecipitó, y la co-precipitación de 67LR se determinó por transferencia western. IgG se utilizó como un control para inmunoprecipitación. En la FIGURA 12, las células A549 se cultivaron en la presencia o ausencia de laminina y LY294002 como se indica. EPRS (glutamil-prolil-tR A sintetasa) se inmunoprecipitó con su anticuerpo específico (AbCam) , y la co-precipitación de KRS se determinó por transferencia western (superior) . El sobrenadante inmunodeficiente (ID) se sometió a transferencia western con anticuerpos anti-KRS y EPRS.

Las FIGURAS 13 a 17 muestran que el nivel de unión de la membrana 67LR depende de KRS. En la FIGURA 13, las células A549 se transfectaron con EV, KRS, si-control (si-cont) , o si-KRS. Las células se separaron en citoplasma y fracciones de membrana, y los niveles de 67LR y KRS en cada fracción se determinaron por transferencia western. Cadherina (rojo) y hsp90 se utilizaron como los marcadores para membrana celular y citoplasma, respectivamente. En la FIGURA 14, las células A549 transfectadas con EV (vector vacío) o KRS se seleccionaron con G418 durante una semana, y la distribución intracelular de 67LR se determinó por tensión por inmunofluorescencia con anticuerpo anti-LR (MluC5) . El LR localizado en la membrana se resaltó con flechas. En la FIGURA 15, en las células A549, el nivel de 67 RL unido a la membrana se monitoreó por citometría de flujo utilizando anticuerpo anti-LR (MluC5) . Las células se transfectaron con el vector vacío o pl smido de KRS, y se incubaron durante 24 horas (superior) . Para ver el efecto de la inhibición de KRS de acuerdo con el nivel de 67LR, las células se transfectaron con si-KRS o si-control, y se incubaron durante 48 horas (inferior) . En la FIGURA 16, para la estabilidad celular de 67LR, la importancia de KRS se determinó por un experimento de pulso-caza. Se transfectaron 293 células con si-KRS o si-control, y se trataron con metionina radioactiva durante 1 hora. 67LR se inmunoprecipitó con un anticuerpo que reconoce específicamente 67LR (F-18, Santacruz) , separado por SDS-PAGE, y, se autorradiografió . La inhibición de KRS por su siR A (ARN de pequeña interferencia) específico se confirmó por transferencia western, y la tubulina se utilizó como un control de carga.

Las FIGURAS 17 a 20 muestran que KRS facilita la migración celular y la metástasis de cáncer a través de 67LR. En la FIGURA 17, las células A549 fueron transfectadas con los plásmidos indicados, e incubadas en la ausencia (FIGURA 21) o presencia (FIGURA 17) de la inina, y su efecto en la migración celular se determinaron al medir las células migradas en una cámara de transwell. El número de las células pasadas a través de la membrana se encontraron y se desplegaron en cada panel. El experimento se condujo tres veces. En la FIGURA 18, las células tratadas como en lo anterior se utilizaron para determinar la actividad de MMP-2 y el nivel mediante zimatografía (superior) y transferencia western (centro) , respectivamente. La actina se utilizó como un control de carga. En la FIGURA 19, las células 4T-1 (linea celular de carcinoma mamario) se transíectaron con siRNA indicado, e inyectado subcutáneamente a la espalda del ratón Balb/C. Después de 27 días, los pulmones de los ratones se extrajeron, y los nodulos tumorales de más de lmm de diámetro se contaron. En la FIGURA 20, dos diferentes células 4T-1 que expresan KRS exógeno (KRS-1 y KRS-2) se inocularon como en lo anterior y después de 4 a 5 semanas de la inyección, los nodulos tumorales se contaron. Las células transíectadas con el vector vacío se utilizaron como un grupo control.

Las FIGURAS 21 a 24 muestran el efecto de KRS intracelular y extracelular en migración celular, la síntesis de proteína y el ciclo celular. En la FIGURA 21, la migración de las células A549 se incubaron en la ausencia de laminina se determinó al medir las células migradas en una cámara de transwell en la misma manera que se describe en la FIGURA 17. En la FIGURA 22, para ver la actividad quimiotáctica extracelular de KRS, el medio libre de suero que contiene KRS en la concentración indicada se colocó en la cámara inferior de una cámara de transwell, y las células A549 se incubaron en la cámara superior. Después, se contó el número de células migradas . En la FIGURA 23, el nivel de KRS en las células A549 se disminuyó o aumentó mediante la inducción de siR A y KRS exógeno. Las células transfectadas se incubaron durante 48 y 24 horas, respectivamente, y se privaron en un medio libre de metionina durante 1 hora, y después, se etiquetaron con metionina etiquetada radioactiva durante 2 horas . Después de lavarse, las células se incubaron durante 4 horas, y se lisaron en una solución de lisis de tritón X-100 al 0.5%, y la radioactividad se midió por un contador de centelleo líquido. En la FIGURA 24, las células A549 se transfectaron como se indica, se fijaron, y se tiñeron con Yoduro de propidio, y después se analizaron por citometría de flujo.

Las FIGURAS 25 a 27 muestran el efecto de la inhibición de KRS en la metástasis de cáncer. En la FIGURA 25, el efecto de si-KRS y si-DRS en la expresión de sus proteínas objetivo se determinó por transferencia western. La tubulina se utilizó como un control de carga. En la FIGURA 26, las células transfectadas siRNA (1 x 106) se inyectaron como se describe en los métodos anteriores, y después de 21 días de la inyección, el efecto de la inhibición de KRS y DRS en la proliferación tumoral primaria se determinó al medir el tamaño y volumen de un tumor. En cada grupo se incluyeron 6 ratones (la FIGURA 19 muestra 1 ratón y la FIGURA 27 muestra 5 ratones) . En la FIGURA 27, los pulmones extraídos de los ratones se fijaron en solución de formalina al 10%. El número de nodulos tumorales metastásicos se muestra en los dibujos.

Las FIGURAS 28 a 30 muestran el efecto de la sobre expresión de KRS en la metástasis de cáncer. En la FIGURA 28, la sobre expresión de líneas celulares de KRS-1 y KRS-2 se determinó mediante transferencia western. En la FIGURA 29, el efecto de la sobre expresión de KRS en la proliferación de tumor primario se comparó como en lo anterior. En la FIGURA 30, el efecto de la sobre expresión de KRS en la metástasis tumoral se determinó en el día 30 después de la inoculación. En cada grupo, 4 ratones se incluyeron (FIGURA 20 muestra 1 ratón representativo y la FIGURA 30 muestra 4 ratones) Las FIGURAS 31 a 36 muestran el efecto de un compuesto en la inhibición de la interacción entre KRS y 67LR, y la estabilidad intracelular de 67LR. La FIGURA 31 muestra la inhibición de crecimiento de las células de levadura que contiene las proteínas apareadas indicadas por el compuesto representado por la fórmula 15 (CA D-KL1, KL1) en 50 pg/ml . Como un control, se midió un nivel de OD de las células tratadas con DMSO. La FIGURA 32 es una fotografía que muestra el crecimiento celular en los pozos que contienen las células de levadura que tienen pares de interacción indicados en la presencia o ausencia de CA D-KLl . En la FIGURA 33, en 293 células, a través de co-inmunoprecipitación, el efecto dependiente de dosificar KLl en la interacción entre KRS y 67LR se probó. Las células se trataron con KL1 durante 3 horas, 67LR se inmunoprecipitó, y co-precipitación de KRS se determinó por transferencia western. En la FIGURA 34, en la presencia de KLl en niveles indicados, un receptor de laminina etiquetado con radioisótopo se mezcló con GST-KRS (l]ig) . GST-KRS se precipitó con cuentas de glutatión-Sefarosa, y el receptor de laminina co-precipitado se detectó con autorradiografía . En la FIGURA 35, en las células A549, el efecto de KLl en el nivel intracelular de 67LR y 37LRP se probó con transferencia western. En la FIGURA 36, la interacción entre KRS y CA D-KLl se probó por un método de resonancia de plasmones superficiales como se describe en un método experimental. GST-KRS se inmovilizó sobre un Chip de Sensor CM5, y la unión se midió por una unidad de resonancia (RU) en concentraciones indicadas (indicadas por diferentes colores) . La proteína GST se utilizó como un control para medir la afinidad de unión específica de KRS. La unión aparente constante se obtuvo al utilizar un programa de evaluación de BIA.

Las FIGURAS 37 a 43 muestran la inhibición de KRS-el receptor de laminina puede inhibir la migración celular y la metástasis de cáncer. Sobre la actividad de MP2 (FIGURA 37) y la migración celular (de las FIGURAS 38 y 39), se midió efecto dependiente de la dosis de la KLl. Para la prueba sobre la migración celular, las células se trataron con KLl durante 8 horas. En la FIGURA 40, para ver el efecto de KLl en la síntesis de proteína de las células, las células A549 se trataron con KLl en concentraciones indicadas, y se privaron en un medio libre de metionina. Después, [35S] metionina se agregó al mismo durante 2 horas. Después, las células se incubaron en un medio completo durante 4 horas, y el nivel de metionina agregada se midió mediante un contador de centelleo. En la FIGURA 41, la citotoxicidad dependiente de la dosis de KLl se midió al utilizar las células A549. En la FIGURA 42, el efecto de KLl sobre la metástasis de cáncer se midió de acuerdo con el método como se describe en lo anterior. En cada grupo, se incluyeron 6 ratones, y KLl se inyectó en forma abdominal durante 3 semanas, en una dosis de 30 mg/kg una vez al día. Después, los ratones se sacrificaron. Los nodulos tumorales con metástasis de más de lmm de diámetro se contaron, y se calculó su promedio (a la izquierda) . La fotografía de un pulmón representativo se muestra en el lado derecho. En la FIGURA 43, en un grupo tratado con KLl y uno no tratado con KLl, se observaron los tumores primarios. Como un resultado, se determinó que entre los dos grupos, no existe diferencia significativa en peso y tamaño .

Efectos Ventajosos Se confirmo que KRS tiene un efecto sobre la metástasis de cáncer al facilitar la migración de células de cáncer (tumor) a través de la interacción con 67LR, y también se encontró que una sustancia que inhibe la interacción entre KRS y 67LR puede prevenir y tratar el cáncer al inhibir la metástasis de células cancerígenas. Por consiguiente, la composición de la presente invención puede inhibir la metástasis de cáncer, y de este modo proporciona un medio novedoso para prevención y tratamiento de cáncer.

Descripción de los Dibujos La FIGURA 1 muestra la interacción entre la KRS humana y 37LRP/p40, que se determinó por un ensayo de dos híbridos en levadura; la FIGURA 2 muestra la interacción entre la KRS humana y 37LRP, que se determinó por un ensayo de pull-down; la FIGURA 3 muestra la región de la interacción entre la KRS humana y 37LRP; la FIGURA 4 muestra el resultado cuando las células A549 transfectadas con Myc-KRS se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos del receptor anti-Myc y anti-laminina para confirmar la unión de KRS a 67LR y 37LRP; la FIGURA 5 muestra el resultado cuando los lisados de las células A549 transfectadas con Myc-KRS se sometieron a análisis de transferencia western para confirmar la unión de KRS a 67LR y 37LRP; FIGURA 6 muestra la unión de KRS y 67LR de acuerdo con el tratamiento de laminina, que se identificó a través de inmunoprecipi ación; la FIGURA 7 muestra niveles de 67LR, 37LRP y KRS en las células A549 tratadas con laminina, que se determinaron mediante transferencia western; la FIGURA 8 muestra la expresión de 67LR y KRS en las células A549 tratadas o sin tratar con laminina, que se determinó mediante la tensión por inmunofluorescencia; la FIGURA 9 muestra el efecto de los inhibidores cinasa sobre la expresión citoplásmica y de membrana de 67LR y KRS; la FIGURA 10 muestra el nivel de fosforilación en las células A549 que expresan KRS, medido al inmunotransferir con anticuerpos p-Thr, -Ser, y -Tyr, cuando se trataron con inhibidores de laminina y cinasa; la FIGURA 11 muestra la unión de KRS fosforilado a 67LR en las células A549 que expresan KRS, que se determinó por transferencia western; la FIGURA 12 muestra el efecto de laminina en la unión de KRS a EPRS, que se determinó por transferencia western; la FIGURA 13 muestra los niveles de 67 L y KRS en las células transíectadas con si-control o si-KRS, que se determinaron mediante transferencia western; la FIGURA 14 muestra la distribución intracelular de 67LR en las células A549 transfectadas con EV (vector vacío) o KRS, que se determinó por tensión por inmunofluorescencia; la FIGURA 15 muestra el nivel de la unión de membrana de 67LR en las células A549, que se midió por citometría de flujo; la FIGURA 16 muestra el efecto de KRS en la estabilidad celular de 67LR, que se determinó mediante experimento de pulso-caza; la FIGURA 17 muestra el efecto sobre la migración celular cuando la expresión de KRS y/o 67LR se inhibió; la FIGURA 18 muestra la actividad de MMP-2 y el nivel, medido mediante zimografía y transferencia western, cuando la expresión de KRS y/o 67LR se inhibió; la FIGURA 19 muestra el número de nodulos tumorales cuando la expresión de KRS se inhibió en ratones trasplantados con líneas celulares de 4T-1; la FIGURA 20 muestra el número de nodulos tumorales cuando la expresión de KRS se mejoró en ratones trasplantados con líneas celulares de 4T-1; la FIGURA 21 muestra el resultado de medición de la migración de las células A549 incubadas en la ausencia de laminina; la FIGURA 22 muestra el resultado de medición de la actividad quimiotáctica de KRS en la célula de migración; la FIGURA 23 muestra el nivel de KRS y el nivel de síntesis de proteína intracelular total. Las células A549 de acuerdo con la introducción del siRNA y KRS exógeno; la FIGURA 24 muestra el nivel de KRS y el ciclo celular en las células A549 de acuerdo con la introducción del siRNA y KRS exógeno; la FIGURA 25 muestra el efecto de si-KRS y si-DRS en la expresión de sus proteínas objetivo, que se determinó por transferencia western; la FIGURA 26 muestra el efecto de la inhibición de KRS y DRS en la proliferación de tumor primario en el trasplante de células tumorales; la FIGURA 27 muestra el número de nodulos tumorales metastásicos en el trasplante de células tumorales; la FIGURA 28 muestra la sobre expresión de KRS en las líneas celulares KRS-1 y KRS-2, que se determinó mediante la transferencia western; la FIGURA 29 muestra el efecto de sobre expresión de KRS sobre la proliferación tumoral primaria en el trasplante de células tumorales; la FIGURA 30 muestra el número de nodulos tumorales metastásicos en trasplante de células tumorales; la FIGURA 31 muestra la inhibición de crecimiento de las células de levadura que contienen proteína apareadas (KRS y 67LR (KRS-LR) ; KRS y AIMP2 (KRS-AIMP2 ) ; y MRS y AIMP3 ( (MRS-AIMP3 ) ) mediante el compuesto de la presente invención (CA D-KL1, KL1) en 50ug/ml; la FIGURA 32 muestra el crecimiento de células de levadura en la presencia o ausencia del compuesto de la presente invención; la FIGURA 33 muestra el resultado cuando el efecto dependiente del nivel de KLl en la interacción entre KRS y 67LR en 293 células se probó a través de co-inmunoprecipitación; la FIGURA 34 muestra la interacción entre KRS y 67LR de acuerdo con el nivel del compuesto de la presente invención, que se determinó mediante co-precipitación de 67LR y KRS; la FIGURA 35 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre el nivel intracelular de 67LR y 37LRP en las células A549, que se determinó mediante la transferencia western; la FIGURA 36 muestra la interacción entre KRS y el compuesto de la presente invención, que se determinó mediante un plasma de superficie sobre el método de resonancia; la FIGURA 37 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre la actividad de MMP2 ; la FIGURA 38 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre la migración celular; la FIGURA 39 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre migración celular, la cual se determinó cuantitativamente; la FIGURA 40 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre la síntesis de proteína de las células ; la FIGURA 41 muestra la citotoxicidad del compuesto de la presente invención, que se determinó al utilizar células A549; la FIGURA 42 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre la metástasis de cáncer; y la FIGURA 43 muestra el efecto del compuesto de la presente invención sobre el peso y volumen del tumor primario .

Modo para la Invención De aquí en adelante, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los ejemplos.

Sin embargo, los ejemplos siguientes son para propósitos ilustrativos solamente y no se interpretan como limitantes del alcance de la presente invención. <Método Experimental> 1. Cultivos celular y materiales Las células A549 y HEK293 se compraron de ATCC . La línea celular 4T-1 de carcinoma de mamífero de ratón se proporciono por Dr. Kim Sung-jin (escuela de medicina de Gachón) . RPMI (para células A549 y 4T-1) y DME (Medio Eagle modificado por Dulbecco, para las otras células) , que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de anticuerpos se utilizaron para cultivo celular. El vector PcDNA3.1 que codifica 37LRP se proporcionó a partir del Dr. Tachibana Hirofumi (Universidad de Kyushu) . La KRS y DRS humana Myc-etiquetadas se clonaron en enzimático de restricción EcoRI/XhoI del vector ADNpc3. El ADNc de KRS murino se obtuvo mediante TR-PCR, y se clonó en el sitio enzimático de restricción HindIII/Xhol del vector ADNpc3.1. El KRS y DRS murino y humano de siR A objetivo se compraron a partir de Invitrogen. Las secuencias para las siRNA se proporcionan bajo ^pedido. El gen portador (GTS) y lipopectamina 2000 (invitrogen) se utilizaron como reactivos de transfección. LY294002, U73122 y estaurosporina se compraron de Calbiochem y cicloheximida y laminina (sarcoma molino de Engelbreth-Holm-Swarm) se compraron de Sigma. 2. Inmunoprecipitación y transferencia westem Las células se lisaron con 20mM de regulador Tris-HCl (pH 7.4, regulador de lisis) que contiene 150mM de NaCl, 0.5% de tritón X-100, 0.1% de SDS e inhibidor de proteasa. Los extractos de proteína se incubaron con IgG normal de proteína G agarosa durante 2 horas, y después se centrifugó para remover las proteínas no específicamente unidas a IgG. Se mezclaron los sobrenadantes con anticuerpos 67LR purificados (F-18, Santacruz) , se incubaron durante 2 horas a 4°C con agitación, y se agregó la proteína A agarosa del mismo. Después de lavar tres veces con un regulador de lisis enfriado con hielo, los precipitados se disolvieron en el regulador de la muestra de SDS, y se separaron por SDS-PAGE. Para determinar la unión de KRS y LR en las fracciones celulares diferentes, se transfectaron en el ADNpc3.1-Myc-KRS, y se separa la membrana de plasma y las fracciones citoplásmicas al utilizar el equipo de proteoextract (Calbiochem) de acuerdo con la instrucción del fabricante. Después, se realizó la co-inmunoprecipitación como se describe en lo anterior. Para analizar el nivel de proteínas, las proteínas se extrajeron de las células, y se separaron mediante 10% SDS-PAGE. A menos que se especifique, el anticuerpo anti-LR (Abcam, ab2508) se utilizó para inmunotransferencia simultánea de 37LRP y 67LR. Los anticuerpos para hsp90 y Pan-cadherina se compraron de Santacruz . 3. Citometría de flujo Para dirigir un ciclo celular, las células de cultivo se transfectaron o se trataron con el vector indicado o compuestos, se fijaron con 70% de etanol a 4°C durante 1 hora, y se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo. Después, las células se tiñeron con yoduro de propidio (50 ug/ml), 0.1% de citrato de sodio, 0.3% de NP40, y RNasaA (50 ug/ml) durante 40 minutos, y se sometió a citometría de flujo (FACS Calibur, Beckton-Dickinson) . Para cada muestra, 20000 células se analizaron al utilizar el software Cell Quest Pro. Para el análisis de la cantidad de 67 kD LR sobre una superficie Celular, 1 x 106 células se incubaron con igG o anticuerpo anti-LR (MLuC5, l g) que reconoce el dominio extracelular de 67LR, y después con el anticuerpo secundario de FITC. Después de lavarse con PBS, la muestra se examinó por FACS. 4. Tensión por inmunofluorescencia Las células A549 sobre un cubre objeto de 9 mm se fijaron con 70% de metilalcohol , y se lavaron brevemente con PBS frío. Después de la incubación con regulador de bloqueo que contiene 1% de CAS , 3% de BSA y 0.5% de tritón X-100 durante 30 minutos, las células se incubaron con anticuerpo (Abcam) contra a KRS, y el anticuerpo (Santacruz) contra LuC-5 durante 1 hora. Alexa 488 y 568 (invitrogen) se agregaron al mismo, y se trataron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavarse con PBS frío durante 30 minutos, los especímenes se monitorearon mediante microscopía de exploración por láser. 5. Experimento de pulso-caza 293 células se transfectaron con si-KRS o si-control (invitrogen) al utilizar lipopectamina 2000. Las células se incubaron con medio libre de metionina durante 1 hora, se agregaron con [35S] metionina (50uCi/ml), y se incubaron durante 1 hora. Después de que se lavó la metionina radioactiva con medio reciente, 67LR se inmunoprecipitó con su anticuerpo específico (Santacruz) , separado por 12% de SDS-PAGE, y se sometió a autorradiografía utilizando BAS (FLA-3000, Fujifilm). La cantidad de 67LR se midió mediante programa de Multi-calibre (V3.0, Fujifilm). 6. Ensayo de dos híbridos en levadura Los ADNc que codifican fragmentos diferentes de la KRS humana se obtuvieron mediante PCR con los cebadores correspondientes . El producto de PCR para KRS se digirió con EcoRI y Xhol, y se ligaron con los sitos correspondientes del vector de pEG202 (para la construcción de proteínas de fusión LexA) y el vector pJG4-5 (para la construcción de las proteínas de fusión B42) . Los ADNc que codifican los fragmentos de 37LRP se proporcionaron a partir del Dr. Barbara J. Ballermann de la (Universidad de Alberta) , y fueron subclonados en los sitios EcoRI y Xhol del vector pJG4-5. Las interacciones entre las dos proteínas de fusión se analizaron mediante la formación de colonias azules en el medio de levadura que contiene X-gal . 7. Ensayo de unión in vitro Se expresaron GST-KRS o GST en la cepa E. coli Rosetta (DE3), y se mezclaron los extractos de proteína con glutation-Sepharosa en el regulador de PBS que contiene 1% de Tritón X-100 y 0.5% de N-laurilsarcosina a 4°C durante 2 horas. Se sintetizó el 37LRP humano mediante la traducción in vitro en la presencia de [35S] metionina al utilizar el sistema de Transcripción/Traducción acoplado de TNT Quick (Promega) y utilizando ADNpc3-37LRP como la plantilla. El 37LRP sintetizado se agregó a la mezcla de proteína GST anterior, incubada a 4°C durante 4 horas con agitación en el regulador de PBS que contiene 1% de Tritón X-100, 0.5% de N laurilsarcosina, lmM DTT, 2mM EDTA y 300uM y 300µ? de fluoruro de fenilmetilsufonilo, y se lavó con el mismo amortiguador que contiene 0.5% de Tritón X-100 6 veces. Cuando se eluyeron las proteínas enlazadas a las cuentas de sefarosa con el amortiguador de muestra de SDS, separado por SDS-PAGE, y se llevó a cabo la medición de radiación (autoradiografía) . 8. Ensayo de migración de células La migración celular se midió al utilizar cámaras transwell de 24 pozos con membranas de policarbonato (tamaño de poro de 8.0 µp?, Costar) como se describe previamente (Park, S. G. et al. sintetasa lisil-AR t humana se secreta para activar la respuesta pro-inflamatoria, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005)). Las células A549 se suspendieron en un medio RPMI libre de suero y se agregaron a la cámara superior a una concentración de 1 x 105 células por pozo. Cada uno de los KRS humanos purificados en las concentraciones indicadas, laminina (10 g/ml) o gelatina 10 g/ml) se colocaron en el pozo inferior, y las células se dejaron migrar durante 6 horas a 37°C en una incubadora C02. Las células se fijaron con el PBS que contiene 70% de alcohol metílico durante 30 minutos y se lavaron con PBS tres veces. Las células se tiñeron con hematoxilina (Sigma) durante 10 minutos y se lavaron con agua destilada. Las células no migradas se removieron de la presión superior de la membrana con un hisopo de algodón. Las membranas se separaron de la cámara, y se montaron a Gel Mount (Biomeda, USA) . Las células migradas (unida a la cara inferior de la membrana) se contaron en cuatro sitios aleatoriamente seleccionados por un microscopio (x20) . 9. Zimografía Las células A549 se transfectaron con los plásmidos que codifican los siRNA indicados y KRS recombinante (o DRS) se incubaron durante 48 y 24 horas, respectivamente, y se inocularon en el medio de RPMI que contiene 10% de FBS (1 x 105 células/pozos) . Las células se privaron en un medio de RPMI libre de suero durante 2 horas, se agregaron con laminina, y se incubaron durante 24 horas a 10 g/ml . 20 µ? del medio de cultivo se mezclaron con amortiguador de FOD 5x (0.125M Tris-HCl, pH 6.8, que contiene 4% de SDS, 20% de glicerol, y 0.01% de azul de bromofenol), y se sometió a 10% de SDS-PAGE que contiene 1 mg/ml de gelatina. El gel se lavó' con 2.5% de tritón X-100 dos veces, cada vez time durante 20 minutos, después con agua destilada dos veces, cada vez durante 20 minutos, y se incubaron con un amortiguador de reacción (SO mM de Tris-HCL, pH 7.5, que contiene 10 niM de CaCl2, 150 mM de NaCl, 1 µ? de ZnCl2, 1% de Tritón X-100, y 0.002% de azida de sodio) durante 24 horas a 37°C. El gel se lavó con agua destilada, y se tiño con azul de Coomassie R250, y se destiño con 35% de metanol . 10. Experimento de metástasis de cáncer in vivo Las células 4T-1 de carcinoma de mamífero de ratón se transfectaron con si-KRS, si-DRS o si-control, y se incubaron durante 24 horas. Las células (1 x 106) se inyectaron subcutáneamente en la espalda de ratones Balb/c hembras de 6 semanas de edad. El efecto de si-RNAs en su expresión genética objetivo se probó en las células restantes después de 48 horas de la transíección, y también en el tumor primario de 3 a 10 días en intervalos de 2 días después de la inyección por transferencia western con sus anticuerpos correspondientes. El crecimiento de un tumor se monitoreó al medir un tamaño de tumor tres veces por semana. Los pesos corporales completos también se midieron simultáneamente. Los ratones se sacrificaron en el día 21 después de la inyección, y el tumor primario y los pulmones se extrajeron de los ratones. Los pulmones se fijaron en 10% de formalina durante 24 horas. El número y tamaño de los nodulos de tumor metastásico en los pulmones se midió, y los nodulos de tumor de más de 1 mm de diámetro se registraron por separado. Los tumores primarios también se pesaron. Al examinar el efecto de la sobre-expresión de KRS en la metástasis de cáncer, el vector de KRS murino o el vector vacío se transfectaron en células 4T-1, y los transfectantes estables se seleccionaron mediante la incubación en la presencia de G418 durante 3 semanas. Después, se recogieron varias colonias simples, y se compararon los niveles de expresión de KRS mediante transferencia western. Dos colonias diferentes (KRS-1 y KRS-2) que expresan KRS en un nivel más alto que las células del grupo control se seleccionaron, y se utilizaron para inyección. Todos los procesos se realizaron como se describe en lo anterior excepto que los ratones se sacrificaron después de 30 días de la inyección. 11. Prueba de actividad inhibitoria de metástasis de cáncer En el compuesto de la presente invención obtenido por la selección de una biblioteca de compuestos, el grado de inhibición en la interacción entre KRS y el receptor de laminina (67LR) se determinó mediante un ensayo de dos híbridos de levadura, como se describe en lo siguiente. KRS, LR, AIMP2, AIMP3 y MRS se clonaron en el vector LexA (clontech) y el vector B42 (clontech) cada uno para producir los vectores requeridos. Dentro de los vectores, el vector LexA-KRS y el vector B42-LR se co-transfectaron en células EGY/SH de levadura, y después las células de levadura se diluyeron en una absorbancia (540 nm de longitud de onda) de 0.2 en el medio de galactosa que no contiene uracilo (Ura) , histidina (Bis), triptofano (Trp) y leucina (Leu), y se coloca en una cantidad de 200u en una placa de 96 pozos. 1 µ? de cada compuesto en una concentración de 10 mg/ml se colocaron en cada pozo, se incubaron durante 6 días, y la absorbancia se midió a 540 nm. Se seleccionó un compuesto que mostró una reducción en el crecimiento por 50% o más cuando se compara con un grupo control. La especificidad inhibidora del compuesto seleccionado se probó al utilizar dos pares de interacción diferente tal como LexA-KRS/B42-AIMP2 y LexA-MRS/B42-AIMP3. 12. Síntesis de proteína celular Las células A549 se trataron con el compuesto de ácido (2- [2- (4-metil-benzoilimino) -benzotiazol-3-il ] -butírico, CAND-KLl o KLl) representado por la fórmula 15, en concentraciones indicadas. Después, las células se cultivaron en un medio libre de metionina durante 30 minutos, se agregaron con [35S] metionina (10 mCi/ml) , y se cultivaron durante 2 horas. Las células se cultivaron nuevamente en un medio completo durante 4 horas, y se recolectaron. Se lisaron, y la dosis de radiación de las células lisada se midió por un contador de centelleo. 13. Análisis de citotoxicidad 104 células A549 se colocaron en una placa de 96 pozos, y se trataron con el compuesto representado por la Fórmula 15, en concentraciones indicadas durante 24 horas. Después, el compuesto EZ-cytox (Daeil Lab, Corea) se agregó en una cantidad de 10 µ? a cada pozo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seguidos por el cultivo durante 2 horas. Un lector de microplaca se utilizó para medir la absorbancia en 420 nm. 14. Ensayo de resonancia de plasmon superficial La interacción entre KRS y el compuesto (Fórmula 15) se probó mediante BIAcore3000 (GE healthcare) . GST y GST-KRS se diluyó a 20 g/ml en 10 mM de acetato de sodio (pH 5.0). Después, cada proteína se inmovilizó sobre la superficie de un chip sensor CM5 (GE healthcare) . CA D-KLl se diluyó para indicar concentraciones con PBS que contienen 1% de DMSO, y se inyectó a 25°C a un índice de 20 µ?/min. Después, la unión se midió por un cambio en la unidad de resonancia (RU) . La actividad de unión específica de CAND-KLl a GST-KRS se midió trayendo la unión GST en sensograma. La constante de unión aparente se obtuvo a través de la unión 1:1 al mover una línea base en un programa de evaluación de BIA. <Resultado de prueba> 1. Interacción específica entre KRS y 67LR La interacción específica entre la longitud completa de KRS y 37LRP se confirmaron por un ensayo de dos híbridos de levadura. LexA-KRS genero colonias azules cuando se aparearon con B42-37LRP así como a AIMP2 , la pareja conocida de KRS (Kim, S.Y. et al. p38 es esencial para el ensamble y estabilidad del complejo de sintetasa ARNt macromolecular : las implicaciones para su significancia fisiológica, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002)), aunque no con AIMP1 (FIGURA 1). En el ensayo de unión in vitro, [35S] metionina etiquetada 37LRP se mezclo con cualquier GST-KRS o GST, precipitado con glutationa-sefarosa, y se sometió a autoradiografía . 37LRP se co-precipito con GST-KRS, pero no con GST (FIGURA 2) . La eliminación del mapeo por el ensayo de dos híbridos de levadura también determinó que la extensión N-terminal de KRS humana y el dominio extracelular C-terminal de LR se implicó en su asociación (FIGURA 3) .

Puesto que 37LRP citoplásmico se convirtió en 67LR integrada en la membrana, se determinó si KRS podría enlazar en forma diferente entre 37LRP y 67LR. yc-KRS se introdujo en células de A549 de carcinoma de pulmón y se inmunoprecipi aron con el anticuerpo anti-Myc. Cuando la célula de lisado se sometió a transferencia western, 67LR existió en un nivel inferior que 37LRP (véase la columna derecha en la FIGURA 4). Sin embargo, Myc-KRS se unió coñ lo más predominante a 67LR que 37LRP (véase la columna central en la FIGURA 4) . Después se separaron las células A549 en fracciones de membrana de plasma y citoplásmica, y se determinó la interacción de Myc-KRS con 37LRP y 67LR. El 37LRP y 67LR se detectaron principalmente en la membrana del citoplasma y plasma, respectivamente (véase el lado derecho en la FIGURA 5) , mientras que KRS existió en ambas fracciones aunque una porción principal se observó en el citoplasma.

Cuando ambas fracciones se sometieron a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-Myc, unido a la membrana 67 RL se co-precipitó principalmente con KRS aunque una baja cantidad de 37LRP en citoplasma también se precipitó, (véase el lado izquierdo en la FIGURA 5) . Este resultado indica que KRS puede unirse potencialmente a ambos tipos de receptores de laminina, pero se refiere la unión intracelular a 67LR. Después, se investigó si el tratamiento de laminina tiene un efecto sobre la interacción entre KRS y 67LR. La interacción entre dos proteínas se incrementó mediante el tratamiento de laminina (véase FIGURA 6) 2. Fosfororilación y disociación de KRS a partir del complejo sintetasa multi-tR A se implicó en translocación de membrana dependiente de laminina de KRS.

Se investigó entonces . si la distribución intracelular de KRS se cambia por el tratamiento de laminina en las células A549 a través de la fraccionación de células y la tinción por inmunofluorescencia . Después del tratamiento de laminina, el nivel de membrana de KRS y 67LR se incrementó gradualmente con pequeños cambios en el KRS citoplásmico y el nivel de 37LRP o su expresión (FIGURA 7, datos no mostrados). La tinción por inmunofluorescencia también demuestra el cambio de 67LR y - KRS hacia los lados de membrana mediante el tratamiento de laminina (véase FIGURA 8, rojo y verde, respectivamente) . Se investigó entonces si la traslocación de la membrana de KRS se ajusta fisiológicamente mediante la transducción de señal activada por laminina. Unas cinasas un poco diferentes tales como fosfoinositida 3-OH cinasa (PI3K) (Shaw, L. . , Rabinovitz, I., Wang, H. H., Toker, A. & Mericurio. A.M. Activación de fosfoinositida 3-OH cinasa mediante la integrina alfa6beta4 promueve la invasión de carcinoma. Cell 91, 949-960 (1997)), la proteína cinasa C (PKC)-(Li, Y. Q. et al. Proteína cinasa C media la señal para la expresión de mRNA interferon-gamma en células T citotóxicas después de su adhesión a laminina. Inmunología 93, 455-461 (1998)), y la fosfolipasa C-gamma (PLC-gamma)-(Vossmeyer, D., Hofmann, W. , Loster, K., Reutter, W. & Danker, K. La fosfolipasa C-gamma une la integrina alfalbetal y modula la adhesión específica de integrina alfalbetal. J. Biol. Chem. 277, 4636-4643 (2002); Kanner, S. B. , Grosmaire, L. S., Ledbetter, J. A. & Damle, N. K. señalización Beta 2-integrina LFA-1 a través de la activación de fosfolipasa C-gamma 1. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 7099-7103 (1993)) se sabe que se activa por laminina. Para ver cualquiera de estas cinasas se implican en la translocación de membrana dependiente de laminina de KRS, se bloquea cada una de estas cinasas con sus inhibidores específicos, y se verifica cómo este tratamiento puede afectar la translocación de membrana dependiente de laminina de KRS. El incremento dependiente de laminina de KRS y 67LR en la fracción de membrana se inhibió en la presencia de LY294002 (inhibidores PI3K) mientras que las células tratadas con U73122 o estaurosporina mostraron un gran incremento dependiente de laminina de 67LR que aquella en el grupo control (el lado superior en la FIGURA 9, datos no mostrados) . Ninguna de estas cinasas afectó el nivel intracelular de KRS (el lado inferior en la FIGURA 9) . Estos resultados implican que PI3K debe implicarse en fosforilación inducida por laminina de KPS. De hecho, la KRS fosforilada en treonina y serina, pero no en tirosina, se incrementó por el tratamiento de laminina, pero se bloqueo en la presencia de LY294002, mientras que la estaurosporina no tuvo ningún efecto (FIGURA 10) . También se verificó si la fosforilación inducida por laminina de KRS podía ser necesaria para su interacción con 67LR. El tratamiento de LY294002 inhibe la asociación inducida por laminina de KRS con 67LR (FIGURA 11). Puesto que la KRS citoplásmica se ancla al complejo de multi-ARS, también se verificó si la fosforilación dependiente de laminina de KRS puede afectar su asociación con el complejo de multi-ARS por la co-inmunoprecipitación de KRS con glutamil-prolil-tRNA sintetasa (EPRS) , otro componente de encima del complejo. En la ausencia del compuesto LY (LY294002), el tratamiento de laminina disminuye la asociación de KRS con EPRS, y al mismo tiempo incrementa KRS en una fracción soluble inmunodeficiente (línea izquierda superior y paneles inferiores en la FIGURA 12). Por otro lado, la unión de KRS no se afectó por el tratamiento de laminina cuando las células se pre-trataron con LY294002 (línea derecha en los paneles superior e inferior en la FIGURA 12). Esto indica que la fosforilación de KRS es necesaria para la disociación dependiente de laminina de KRS del complejo. 3. KRS se requiere para estabilidad intracelular de 67LR.

Se verificó entonces si KRS puede afectar el nivel de membrana de 67LR en células A549. El nivel de 67LR en la membrana de plasma se incrementó mediante KRS (véase el lado izquierdo en la FIGURA 13), pero el efecto de laminina se abolió cuando KRS se suprimió con su siRNA específico (véase el lado derecho en la FIGURA 13). Esto indica la importancia de KRS en el mejoramiento dependiente de laminina de 67LR. La distribución intracelular del receptor de laminina se comparo entre las células A549 transíectadas con el vector vacío (EV) o KRS mediante la tinción por inmunofluorescencia . El receptor de laminina fue teñido fuertemente en las regiones de membrana celular en las células que sobre-expresan KRS comparadas con aquellas en el grupo control (FIGURA 14) . También se investigó 67LR existente en la membrana mediante citometría de flujo. El nivel de membrana de 67LR se incrementó cuando RS se suministro desde el exterior, y por otro lado, el nivel se disminuyo cuando KRS se inhibió por si-KRS (FIGURA 15) .

Se investigó cómo mejora KRS el nivel de membrana de 67LR. Teóricamente, KRS puede facilitar la 67LR a través de la transcripción o conversión de 37LRP. Sin embargo, la transfección de KRS no incrementa la transcripción de LR, excluyendo su rol temporal en el control transcripcional de LR (datos no mostrados) . También se verificó si KRS puede mediar la acilación grasa de 37LRP puesto que la modificación de 37LRP se conoce que es un prerrequisito para la conversión de 37LRP a 67LR (Lando ski, T. H., Dratz, ?.,?. & Starkey, J. R. Estudios de la estructura de la proteína de unión de laminina de 67 kDa asociada con metástasis: acilación de ácido graso y dimerización que soporta la evidencia del producto de gen de 32 kDa para formar la proteína madura. Biochemistry 34, 11276-11287 (1995); Buto, S. et al. Formación del receptor de laminina 67 -kDa mediante la acilación del precursor. J. Cell . Biochem. 69, 244-251 (1998)). Como resultado, KRS no afectó la acilación grasa de 37LRP en todo (datos no mostrados) . También se investigó el efecto de KRS en el cambio metabólico de 67LR mediante un experimento de pulso-caza. La síntesis de proteína inicial se etiquetó con metionina radioactiva, y después se bloqueó con cicloheximida . Después, con la desaparición de 67LR se monitoreó por autoradiografía en un intervalo de tiempo. 67LR se disminuyó rápidamente cuando KRS se suprimió con su siRNA, mientras que su nivel fue bien sostenido en células si-control durante esta trama de tiempo (FIGURA 16) . De este modo, KRS parece extender la vida promedio de 67LR a través de su asociación con 67LR en membrana de plasma. 4. KRS incrementa la migración celular y la metástasis de cáncer a través de 67LR.

Se ha investigado entonces si el nivel de expresión de KRS puede afectar la migración celular de A549 dependiente de laminina al utilizar ensayo de membrana transwell. La migración de las células de grupo control se mejoraron alrededor de 6 veces en promedio por tratamiento de laminina (FIGURAS 21 y 17) . Sin embargo, la migración de células dependientes de laminina se redujo cuando KRS se suprimió con su si-RNA (FIGURA 17, si-control y si-KRS) . Por otro lado, la sobre-expresión de KRS incrementa la migración celular facilitada por el tratamiento de laminina (FIGURA 17, EV y KRS) . Sin embargo, el efecto de KRS en la migración celular se disminuyó cuando el receptor de laminina se suprimió con su si-AR (FIGURA 17, si-LR, panel inferior) . Puesto que KRS también se secreta en algunas células cancerígenas como citoquina (Park, S. G. et al. sintetasa de lisil-AR t humana se secreta para activar la respuesta pro-inflamatoria, Proc .

Nati. Acad. Sci . U S A 102, 6356-6361 (2005)), se verifica si la KRS extracelulares puede afectar la migración celular. Cuando las células A549 se trataron con KRS purificado en concentraciones diferentes, la migración celular se afectó severamente, excluyendo el efecto extracelular de KRS en este ensayo (FIGURA 22). Por otro lado, la síntesis de proteína celular y el ciclo celular no se influenciaron por la supresión y sobre-expresión de KRS durante el período de los experimentos. Esto indica que la migración celular dependiente de KRS no resultó de su efecto en estos procesos (FIGURAS 23 y 24) . Puesto que los resultados del tratamiento en laminina en la activación de MMP-2 (matriz de metilo-proteinasa-2 ) (Givant-Horwitz , V., Davidson, B. & Reich, R. La laminina inducida señala en células tumorales el rol de M(r) 67,000 receptores de laminina. Cáncer Res. 64, 3572-3579 (2004)), verifican el rol de KRS en la activación dependiente laminina de MMP-2 al utilizar el ensayo en zimografía in vitro. La actividad de MMP-2 se mejoró por laminina, la cual se bloquea en la presencia de si-KRS (véase el lado izquierdo en la FIGURA 18), pero además mejorada por la sobre-expresión de KRS (véase el lado derecho de la FIGURA 18) .

Puesto que KRS puede facilitar la migración celular mediante 67LR relacionada con la metástasis de cáncer, se examinó si la metástasis de cáncer puede afectarse por el nivel de expresión de KRS al utilizar células 4T-1 de carcinoma mamario de ratón que son altamente metastásicos en los pulmones . Suprimieron la expresión de cualquier KRS o DRS (sintetasa de aspartil-AR t , otro componente del complejo multi-ARS) , con sus ARN de pequeña interferencia específicos, y comparado cómo disminución de KRS y DRS puede afectar la metástasis de cáncer.

Este efecto de inhibición de si-KRS y si-DRS se confirmó por transferencia western (FIGURA 25) , y cada una de estas células y las células tratadas con si-control se inyectaron subcutáneamente en la piel de la espalda de los ratones Balb/c. Las tres células inyectadas desarrollaron tumores de masa similar y volumen (FIGURA 26) . Esto indica que el nivel de KRS no afectó el crecimiento de tumores primarios. Los pulmones se aislaron en el día 21 después de la inyección, y el número de nodulos tumorales metastásico (más grandes que 1 mm en diámetro) se compararon entre los 3 grupos. El número de nodulos metastásicos se disminuyó significativamente por la supresión de KRS comparado con aquellos obtenidos del grupo control y las células suprimidas de DRS (FIGURAS 19 y 27) . Por el contrario, se examinó si la sobre-expresión de KRS puede mejorar la metástasis de cáncer al utilizar el mismo método como se describe en lo anterior. Se establecen primeramente líneas celulares 4T-1 que establemente sobre-expresan KRS mediante transfección de plásmido que codifica KRS y selección de G418. En las líneas celulares establecidas, la sobre-expresión KRS se confirmó por transferencia western, y se seleccionó las dos células diferentes (KRS-1 y KRS-2) que expresan KRS en una cantidad mayor que aquella transíectada con el vector vacío (FIGURA 28) . Estas células también generaron tumores primarios de masa similar y tamaño (FIGURA 29) . Cuando se examinaron los pulmones en el día 30 después de la inyección de las células, ambas de las células que sobre-expresan KRS generaron más nodulos comparados con aquellas en el grupo control (FIGURAS 20 y 30) . Este resultado indicad que KRS puede inducir metástasis de cáncer in vivo. 5. Determinación de la inhibición de la interacción de KRS y el receptor de laminina por el compuesto de la presente invención Para determinar si el compuesto de la presente invención controla la interacción entre KRS y el receptor de laminina, se determinó la interacción entre KRS y 67LR a través del tratamiento del compuesto de la presente invención. Por esto, se construyó un sistema de dos híbridos de levadura de tal manera que el crecimiento celular pueda causarse por la interacción entre KRS y el receptor de laminina, y después verificar si el compuesto inhibe la interacción. Si el compuesto inhibe la interacción entre KRS y el receptor de laminina, el crecimiento de las células de levadura puede inhibirse. Como resultado, como se nota en la Tabla 2 siguiente, las células mostraron inhibición de crecimiento por alrededor de 50% cuando se compara con aquella del grupo control. De este modo, puede encontrarse que el compuesto puede inhibir efectivamente la interacción entre KRS y 67LR.

[Tabla 2] Después, dos diferentes pares de interacción tal como KRS-AIMP2 (Kim, J.Y. et al. P38 es esencial para el ensamble y estabilidad del complejo de sintetasa de AR t macromolecular : implicaciones de su significancia fisiológica. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 99, 7912-7916 (2002); Han, J. . et al. La red jerárquica entre los componentes del complejo de sintetasa muíti-ARNt: Implicaciones para formación de complejo. J. Biol . Chem. 281, 38663-38667 (2006)) y MRS-AIMP3 (Quevillon, S. & Mirande, M. El componente pl8 del complejo de multisintetasa comparte un motivo de prote na con las subunidades beta y gamma del factor 1 de elongación eucariótica. FEBS Lett. 395, 63-67 (1996); Kim, K.J. et al. Determinación de estructura tridimensional y residuos de supresor tumoral novedoso, AlMP3/pl8, referido para la interacción con ATM. J. Biol. Chem. (2008)) se trataron con cada compuesto. A través de tal prueba, se seleccionó un compuesto que inhibe solamente la interacción de KRS-LR (véase tabla 3 siguiente) .

[Tabla 3] De entre los compuestos, también se examinó si el compuesto representado por la fórmula 15 (indicada por CAND-KLl, y KLl) puede inhibir la interacción intracelular entre KRS y 67LR. Las células A549 se trataron con KLl en diferentes concentraciones. Después, 67LR se inmunoprecipito con su anticuerpo, y la co-inmunoprecipitación de KRS se determinó. El nivel de KRS co-precipitado con 67LR se disminuyo de acuerdo con el incremento del nivel de KLl, y los niveles intracelulares de KRS y 67LR no se cambió (FIGURA 33). La interacción in vitro entre el receptor de laminina etiquetado con radioisótopo y GST-KRS se llevó a cabo, y KLl en diferentes cantidades se agregó al mismo. El nivel del receptor de laminina que se ha sometido a pull-down con GST-KRS se disminuyó de acuerdo con un incremento del compuesto de KLl agregado (FIGURA 34) . Puesto que la estabilidad intracelular de 67LR depende de la unión a KRS, se determinó si el tratamiento de KLl que inhibe la unión entre estas dos proteínas afecta el nivel intracelular de 67LR. El nivel de 67LR se disminuyó por la cantidad de KLl agregada, mientras que el tratamiento no tuvo efectos en 37LRP citoplásmico (FIGURA 35) . Se examinó si KLl se une directamente a KRS al utilizar BIAcore 3000 a través de la resonancia de plasmón superficial . La unión de KLl a KRS se incrementó de acuerdo con un incremento del nivel de KLl, y Kd se midió para ser alrededor de 2.6 uM (FIGURA 36). Parece que KLl se asentó en la superficie de KRS, mientras que inhibe estéricamente KRS de alcanzar el receptor de laminina. 6. inhibición de KRS-67LR inhibe la migración celular Y metástasis del cáncer.

Se examinó si KLl afecta la migración celular y la metástasis de cáncer con lo anterior. Para determinar el efecto en la migración celular, se agregó KLl en diferentes cantidades a MMP2 y el ensayo de membrana de transwell . En los dos ensayos, KLl inhibe la actividad de MMP2 y la migración celular de acuerdo con la cantidad tratada (FIGURAS 37 a 39). La síntesis de proteína intracelular y la viabilidad no se influenciaron por el tratamiento de KLl bajo la misma condición experimental (FIGURAS 40 y 41) . Esto indica que el inhibidor de la migración celular a través del compuesto de tratamiento no es debido a la síntesis de proteína y la viabilidad celular. Se realizó un experimento de la metástasis de cáncer en la presencia o ausencia de KLl, y en la misma forma como se describe en lo anterior. Cuando KLl se inyectó a ratones durante 3 semanas, en una dosis de 30 mg/kg una vez al día, el número de nodulos con metástasis se redujo significativamente (FIGURA 42). Por otro lado, KLl no afectó el crecimiento tumoral (FIGURA 43).

Aplicabilidad Industrial Como puede verse en lo anterior, se confirmó que KRS tiene un efecto en la metástasis de cáncer al facilitar la migración celular de cáncer (o tumor) a través de la interacción con 67LR, y también se encontró que una sustancia que inhibe la interacción entre KRS y 67LR puede prevenir y tratar el cáncer al inhibir la metástasis celular de cáncer. Por consiguiente, la composición de la presente invención puede inhibir la metástasis de cáncer, y de este modo proporciona un medio novedoso para la prevención y tratamiento de cáncer.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para prevenir y tratar el cáncer que comprende un derivado de benzo-heterociclo representado por la Fórmula 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como un ingrediente activo : [Fórmula 1] En donde, -— representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual cuando se requieren átomos son aceptables); A se selecciona del grupo que comprende O, NH y S; X representa C o N; Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina; R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, y -NH-R5, R representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilalquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno,

2. La composición farmacéutica para prevenir y tratar el cáncer de la reivindicación 1, en donde la composición se selecciona del grupo que consiste de N-(6-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 2, N-(5-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 3, (5-Cloro-benzooxazol-2-il) -fenil-amina de la fórmula 4, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) - (4-etil-fenil) -amina) de la fórmula 5, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) - (3 , 4-dicloro-fenil ) -amina) de la fórmula 6, (5-Nitro-benzooxazol-2-il) - (4-fenilazo-fenil) -amina) de la fórmula 7, N-Benzooxazol-2-il-benzamida de la fórmula 8, N- (5-Nitro-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 9, N- ( 5-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 10, N- (5-Metil-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 11, N- (6-Nitro-benzotiazol-2-il) -4-trifluorometil-benzamida de la fórmula 12, ácido [2- ( 5-Metil-benzooxazol-2-il) -fenoxi] -acético de la fórmula 13, (2- (2 , 4 , 6-Trimetil-fenil ) -benzooxazol-5-ilamina de la fórmula 14, ácido 2- [2- (4-Metil-benzoilimino) -benzotiazol-3-il] butírico de la fórmula 15, (2- (2 , 6-Dimetoxi-fenil) -benzotiazole de la fórmula 16 y (2-Cloro-4-fluoro-bencil ) - (5-fluoro-lH-indol-3-ilmetil ) -amina de la fórmula 17 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como un ingrediente activo. [Fórmula 2] [Fórmula 3] [Fórmula 4] [Fórmula 5] [Fórmula 7] [Fórmula 9] [Fórmula 10] [Fórmula 11] [Fórmula 14] [Fórmula 15] [Fórmula 16]

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer pancreático, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de testículos, cáncer cervical, carcinoma endometrial, coriocarcinoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de tiroides, tumor de cerebro, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno, linfoma y anemia aplásica.

4. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en donde la prevención y tratamiento de cáncer se realiza al inhibir la metástasis de células de cáncer.

5. Una composición farmacéutica para inhibir metástasis de cáncer que comprende un derivado de benzo-heterociclo representado por la Fórmula 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como un ingrediente activo: [Fórmula 1] En donde, ===== representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual cuando se requieren átomos son aceptables) ,- A se selecciona del grupo que comprende O, NH y S; X representa C o N Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina; R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, arilalquilo, R4 representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilalquilo sin sustituir o ' sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno,

6. La composición farmacéutica para inhibir la metástasis de la reivindicación 1, en donde la composición se selecciona del grupo que consiste de N- ( 6-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 2, N- (5-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 3, ( 5-Cloro-benzooxazol-2-il ) -fenil-amina de la fórmula 4, (5-Cloro-benzooxazol-2-il) - (4-etil-fenil ) -amina) de la fórmula 5, ( 5-Cloro-benzooxazol-2-il) - (3 , 4-dicloro-fenil ) -amina) de la fórmula 6, (5-Nitro-benzooxazol-2-il ) - ( 4-fenilazo-fenil ) -amina) de la fórmula 7, N-Benzooxazol-2-il-benzamida de la fórmula 8, N- ( 5-Nitro-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 9, N- ( 5-Metoxi-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 10, N- ( 5-Metil-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 11, N-(6-Nitro-benzotiazol-2-il) -4-trifluorometil-benzamida de la fórmula 12, ácido [2- (5-Metil-benzooxazol-2-il) -fenoxi] -acético de la fórmula 13, ( 2- (2 , 4 , 6-Trimetil-fenil ) -benzooxazol-5-ilamina de la fórmula 14, ácido 2- [2- (4-Metil-benzoilimino) -benzotiazol-3-il) -butírico de la fórmula 15, (2- (2, 6-Dimetoxi-fenil ) -benzotiazol de la fórmula 16 y (2-Cloro-4-fluoro-bencil) - (5-fluoro-lH-indol-3-ilmetil) -amina de la fórmula 17 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como un ingrediente activo.

7. El uso de derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para preparar un agente para prevenir y tratar cáncer: [Fórmula 1] En donde, —--— representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual cuando se requieren átomos son aceptables) ; A se selecciona del grupo que comprende 0, NH y S; X representa C o N; Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina; R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, arilalquilo , R4 representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilalquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno,

8. Uso de derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para preparar un agente para inhibir la metástasis [Fórmula 1] En donde, representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual cuando se requieren átomos son aceptables) ; A se selecciona del grupo que comprende 0, NH y S; X representa C o N; Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina; R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, arilalquilo, y -NH-R5, R4 representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilalquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno,

9. Un método para prevenir y tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva del derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. [Fórmula 1] En donde, ¦~—~— representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual cuando se requieren átomos son aceptables); A se selecciona del grupo que comprende 0, NH y S; X representa C o N; Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina; R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, R4 representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilalquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno,

10. Un método para inhibir la metástasis que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva del derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. [Fórmula 1] En donde, --— representa un doble enlace o un enlace simple (en el cual cuando se requieren átomos son aceptables) ; A se selecciona del grupo que comprende 0, NH y S; X representa C o N; Ri se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, alcoxi, halógeno, nitro y amina; R2 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, R4 representa hidrógeno o alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R5 representa arilo sin sustituir o sustituido con halógeno, o arilalguilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R3 se selecciona del grupo que comprende hidrógeno,

11. Uso de la reivindicación 7 u 8, en donde un derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 se selecciona del grupo que consiste de N-(6-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 2, N-(5-Metoxi-benzooxazol-2-il ) benzamida de la fórmula 3, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) fenil-amina de la fórmula 4, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) - (4-etil-fenil) -amina) de la fórmula 5, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) - (3 , 4-dicloro-fenil ) -amina) de la fórmula 6, (5-Nitro-benzooxazol-2-il) - (4-fenilazo-fenil) -amina) de la fórmula 7, N-Benzooxazol-2-il-benzamida de la fórmula 8, N- ( 5-Nitro-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 9, N- (5-Metoxi -benzooxazol -2 - il ) -benzamida de la fórmula 10, N- (5-Metil-benzooxazol-2-il) -benzamida de la fórmula 11, N- ( 6-Nitro-benzotiazol-2-il ) -4- trifluorometil-benzamida de la fórmula 12, ácido [2- (5-Metil-benzooxazol-2-il ) -fenoxi ] -acético de la fórmula 13, (2- (2 , 4 , 6-Trimetil-fenil ) -benzooxazol-5-ilamina de la fórmula 14, ácido 2- [2- (4-Metil-benzoilimino) -benzotiazol-3-il ] -butírico de la fórmula 15, (2- (2 , 6-Dimetoxi-fenil ) -benzotiazol de la fórmula 16 y (2-Cloro-4-fluoro-bencil) - (5-fluoro-lH-indol-3-ilmetil) -amina de la fórmula 17.

12. Uso de la reivindicación 9 ó 10, en donde un derivado de benzo-heterociclo representado por la fórmula 1 se selecciona del grupo que consiste de N-(6-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 2, N- (5-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 3, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) -fenil-amina de la fórmula 4, (5-Cloro-benzooxazol-2-il) - (4-etil-fenil) -amina) de la fórmula 5, (5-Cloro-benzooxazol-2-il ) - (3 , 4-dicloro-fenil ) -amina) de la fórmula 6, (5-Nitro-benzooxazol-2-il) - (4-fenilazo-fenil ) -amina) de la fórmula 7, N-Benzooxazol-2-il-benzamida de la fórmula 8, N- ( 5-Nitro-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 9, N- ( 5-Metoxi-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 10, N- ( 5-Metil-benzooxazol-2-il ) -benzamida de la fórmula 11, N- ( 6-Nitro-benzotiazol-2-il ) -4-trifluorometil-benzamida de la fórmula 12, ácido [2- (5-Metil-benzooxazol-2-il) -fenoxi] -acético de la fórmula 13, (2- (2 , 4 , 6-Trimetil-fenil ) -benzooxazol-5-ilamina de la fórmula 14, ácido 2- [2- (4-Metil-benzoilimino) -benzotiazol-3-il] -butírico de la fórmula 15, (2- (2 , ß-Dimetoxi-fenil) -benzotiazol de la fórmula 16 y (2-Cloro-4-fluoro-bencil) - (5-fluoro-lH-indol-3-ilmetil) -amina de la fórmula 17.

13. Uso de la reivindicación 7 u 8 , en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer pancreático, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de testículos, cáncer cervical, carcinoma endometrial, coriocarcinoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de tiroides, tumor de cerebro, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno, linfoma y anemia aplasica.

14. El uso de la reivindicación 9 ó 10, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer pancreático, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de testículos, cáncer cervical, carcinoma endometrial, coriocarcinoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de tiroides, tumor de cerebro, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno, linfoma y anemia aplásica.