CN102834098A - 苯并杂环衍生物的用于癌预防及治疗或抑制癌转移的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种苯并杂环衍生物的新型用途，尤其涉及包含苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐作为有效成份的癌预防及治疗用组合物。本发明人查明，通过KRS与67LR相互作用，促进癌(或肿瘤)细胞的移动，对癌的转移(metastasis)产生影响，确认了阻抑KRS及67LR的相互作用的物质能够抑制癌细胞的转移，预防及治疗癌。因此，本发明的组合物抑制癌的转移，从而提供用于癌预防及治疗的新途径。

Description

苯并杂环衍生物的用于癌预防及治疗或抑制癌转移的用途
技术领域
本申请以2009年11月5日申请的大韩民国专利申请第10-2009-0106350号为优先权，上述说明书全文是本申请的参考文献。
本发明涉及苯并杂环衍生物的新型用途，尤其涉及包含苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐作为有效成份的癌预防及治疗或癌转移抑制用组合物。
背景技术
癌(或肿瘤)是非正常、非控制性、无秩序的细胞增殖的产物。特别是如果有破坏性的生长性及转移性，则分类为恶性。所谓渗透性，作为渗透或破坏周围组织的性质，一般是指破坏构成组织边界的基底层，肿瘤进行局部传播，并往往流入体内的循环系统。所谓转移，一般是指借助于淋巴管(lymphotic)或血管，肿瘤细胞扩散到不同于原发位置的其他处。转移也意味着通过浆液性体腔或其他空间直接扩张，使肿瘤细胞移动。
目前，癌主要通过3种治疗法，即，通过外科手术、放射线照射及化学疗法中的一种或其组合进行治疗。手术包括去除大部分疾病组织。这种外科手术对去除位于特定部位，例如，位于乳房、结肠及皮肤的肿瘤虽然有效，但无法用于治疗处于诸如脊椎的一部分区域的肿瘤，或诸如白血病的分散性肿瘤疾病。
化学疗法是使细胞复制或细胞代谢瓦解，多用于治疗乳房、肺及精巢的癌，用于治疗肿瘤疾病的全身性化学疗法的副作用对接受癌治疗的患者而言是最大问题。在这种副作用中，恶心和呕吐是最为普遍和严重的副作用。化学疗法的副作用对患者生命产生极大影响，会使患者对治疗的顺应性发生急剧变化。另外，作为与化学治疗剂相关的副作用，一般有这种药物在给药时应注意的剂量限制毒性(DLT,Dose Limiting Toxicity)。例如，粘膜炎对多种抗癌剂，例如，对作为抗代谢物质细胞毒素剂的5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤及抗肿瘤抗生素(例，亚德里亚霉素)等具有剂量限制毒性。在这种源于化学疗法的副作用中，大部分在严重情况下需要住院，或需要用于治疗疼痛的镇痛剂。如上所述，化学治疗剂及放射线治疗的副作用成为癌患者的临床处置时的主要问题。
另一方面，肿瘤的转移是癌治疗的存活率方面的决定性因素。67kDa的层粘连蛋白受体(67LR)作为嵌入原生质膜(embedded)的非整合素蛋白型受体，与癌的侵袭(浸润)及转移有关联(Nelson,J.et al.The 67kDa laminin receptor:structure,function and role in disease.Biosci.Rep.28,33-48(2008))。67LR由37kDa前体(37LRP)的聚合(dimerization)生成，对于这种变化和过程的分子级详细机理尚不清楚。37LRP与参与多聚核糖体形成的核糖体亚基p40相同(Auth,D.& Brawerman,G.A 33-kDa polypeptide with homology to the laminin receptor:component of translation machinery.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,4368-4372(1992))。67LR被在多种类的癌中观察到高浓度(Nelson,J.et al.The 67kDa laminin receptor:structure,functionand role in disease.Biosci.Rep.28,33-48(2008);Menard,S.,Castronovo,V.,Tagliabue,E.&Sobel,M.E.New insights into the metastasis-associated 67kD laminin receptor.J.Cell.Biochem.67,155-165(1997))。但是，在67LR的膜内存在下的调节者或分子级机理尚不明确。
KRS属于为进行蛋白质的合成而使同族的(cognate)氨基酸及tRNA接合的aminoacyl-t-RNA synthetases(ARSs)。这些原始酶除催化酶活性外，还具有多效性(pleiotropic)特征(Park,S.G.,Ewalt,K.L.& Kim,S.Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetasesand their interacting factors:new perspectives on housekeepers.Trends Biochem.Sci.30,569-574(2005))。与此相反，就包含了KRS的几种哺乳类的ARS而言，为调节构成蛋白质的多样功能，形成发挥作为分子库(molecular reservoir)作用的(Ray，P.S.,Arif，A.& Fox,P.Macromolecular complexes as depots for releasable regulatory proteins.Trends Biochem.Sci.32,158-164(2007))大分子复合体(Lee,S.W.,Cho,B.H.,Park,S.G.& Kim,S.Aminoacyl-tRNAsynthetase complexes:beyond translation.J.Cell.Sci.117,3725-3734(2004);Han,J.M.,Kim,J.Y.& Kim,S.Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetasecomplex.Biochem.Biophys.Res.Commun.303,985-993(2003))。人类KRS含有关于RNA与其他蛋白质间相互作用的特有的N端转录激活区(Rho,S.B.et al.Genetic dissection ofprotein-protein interactions in multi-tRNA synthetase complex.Proc.Natl.Sci.Acad.USA 96,4488-4493(1999);Francin,M.,Kaminska,M.,Kerjan,P.&Mirande.M.The N-terminal domainof mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain.J.Biol.Chem.277,1762-1769(2002))。
发明内容
技术课题
因此，本发明人在就人类赖氨酰t-RNA合成酶(lysyl-t-RNA synthetase,KRS)的功能多样性进行研究的过程中，作为具有与该蛋白质结合可能性的蛋白质之一，确认了37LRP/p40；了解到KRS使通过37LRP的聚合而形成的存在于原生质膜的层粘连蛋白受体(67LR)实现稳定化，从而促进细胞移动及癌转移等，KRS通过原生质膜的层粘连蛋白受体，对癌转移或癌细胞移动产生影响；阻抑KRS与67LR相互作用的物质对癌转移进行抑制，从而具有癌预防及治疗效果，因此，获知了对其进行阻抑的苯并杂环衍生物的新用途，完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种苯并杂环衍生物的用途，通过阻抑KRS及67LR的相互作用，抑制癌的转移，从而预防及治疗癌。
技术解决方案
为达成如上目的，本发明提供一种包含苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的癌预防及治疗用药物组合物。
为达成本发明的另一目的，本发明提供一种包含苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的癌转移阻抑用药物组合物。
为达成本发明的另一目的，本发明提供一种苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的用于癌预防及治疗剂制造的用途。
为达成本发明的另一目的，本发明提供一种苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的用于癌转移阻抑剂制造的用途。
为达成本发明的另一目的，本发明提供一种癌预防及治疗方法，其特征在于，把苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐，以有效剂量投药给需要其的个体。
为达成本发明的另一目的，本发明提供一种癌转移阻抑方法，其特征在于，把苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐，以有效剂量投药给需要其的个体。
下面对本发明进行详细说明。
本发明人首次查明了KRS对癌转移或癌细胞移动产生的影响。即，本发明查明：KRS通过原生质膜的层粘连蛋白受体(67LR)对癌转移或癌细胞移动产生影响。另外，首次查明：阻抑KRS与67LR相互作用的物质对癌的转移进行抑制，能够用作癌预防及治疗的目的。并筛选化合物的类库，遴选了苯并杂环衍生物化合物。
在本发明中，“KRS”、“KRS蛋白质”或“KRS多肽”是指被称为赖氨酰tRNA合成酶的多肽。上述KRS多肽可以是本行业众所周知的KRS多肽，但优选可以是具有基因库中注册号NP_005539中标记的氨基酸序列的多肽。另外，本发明的KRS包括其功能性同等物。
在本发明中，所谓功能性同等物，是指与基因库中注册号NP_005539中标记的氨基酸序列至少具有70%以上，优选具有80%以上，更优选具有90%以上的序列相同性(即，同一性)的多肽。例如，是包括具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列相同性的多肽，是指与具有基因库中注册号NP_005539中标记的氨基酸序列的多肽实质上表现出同质的生理活性的多肽。其中，所谓“实质上同质的生理活性”，是指与原生质膜的层粘连蛋白受体相互作用，调节癌转移或癌细胞移动。
在本发明中，“层粘连蛋白受体”或“67kDa的层粘连蛋白受体(67LR)”，作为嵌入原生质膜的(embedded)非整合素蛋白型受体，例如，可以具有基因库中注册号NM_002295、S37431、AF284768、S37431、AF284768、J03799、XP_370865、XP_001083023中记载的碱基序列或氨基酸序列。另外，在本发明中，层粘连蛋白受体包括其功能性同等物。
本发明中的对KRS及67LR相互作用的阻抑可以利用本行业众所周知的蛋白与蛋白相互作用的检测方法，例如，可以利用体外蛋白与蛋白结合试验(in vitro pull-down assay)、EMSA(electrophoretic mobility shift assays)、用于蛋白质结合的免疫试验、功能性试验(磷酸化试验等)、非免疫沉淀试验、免疫沉淀蛋白质印迹试验、免疫-共-定位试验(immuno-co-localization)、交联(cross-linking)、亲和层析(affinity chromatography)、免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)、酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)、双分子荧光互补(bimolecular fluorescencecomplementation,Bi-FC)等本行业众所周知的多种方法执行。
本发明的化合物的筛选方法，例如，可以利用分别融合于细菌阻遏蛋白LexA或酵母GAL4的DNA-结合域及酵母GAL4蛋白质的转录激活(transactivaton)域的、表达KRS与67LR或这些蛋白质的一部分或同系物(homologues)的酵母，执行酵母双杂交试验(KIM,M.J.et al.,Nat.Gent.,34:330-336,2003)。KRS与67LR的相互作用是在具有结合于LexA蛋白质或GAL4的DNA-结合域的调节序列的启动子的控制下，对诱导表达报告基因的转录激活因子进行重新构成。
作为上述报告基因，如上所述记载，可以使用对本行业众所周知的能够任意检测的多肽进行编码的基因(例：CAT(chloramphenicol acetyltransferase：氯霉素乙酰转移酶)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶及GFP(green fluorescent protein：绿色荧光蛋自)等。在KRS与67LR或这些蛋白质的一部分或同系物的相互作用被试验制剂所促进或强化的情况下，上述报告基因的表达则比正常条件进一步增加。相反，在上述相互作用被试验制剂阻抑或削弱的情况下，上述报告基因将不表达或比正常条件减少表达。
另外，作为报告基因，可以选择对能够使酵母生长的蛋白质(即，当上述报告基因不表达时，酵母的生长被抑制)进行编码者。例如，可以是对与氨基酸或含氮碱基的生物合成过程有关的酶进行编码的营养缺陷型(auxotropic)基因(例：ADE3、HIS3等的酵母基因或其他种来源的同等基因)。当在该系统中表达的AIMP2与p53的相互作用或者这些蛋白质的一部分或同系物的相互作用被试验制剂抑制或削弱时，报告基因不表达或减少表达。因此，在上述条件下，酵母的生长停止或变慢。这种报告基因的表达所带来的效果可以通过目视或装置(例：显微镜)进行观察。
在本发明中，利用上述筛选方法筛选了化合物类库，确认了苯并恶唑、苯并噻唑、苯并吡咯衍生物化合物阻抑KRS及67LR的相互作用，阻抑癌的转移，从而具有预防/治疗癌的效果。
因此，本发明提供一种癌预防及治疗用药物组合物，包含以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐作为有效成份。
Figure BDA00001840365900051
[在上述式中，
Figure BDA00001840365900052
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、
Figure BDA00001840365900053
及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、构成的群中选择。
“烷基”是指在链内包含约1个至20个碳原子、可以是直链或侧链的脂肪族烃基团。优选的烷基团在上述链内包含约1个至12个碳原子。更优选的烷基团在上述链内包含约1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子。侧链是指在线形烷基链上带有一个以上低级烷基团，例如，带有甲基、乙基或丙基。“低级烷基团”是指在可以是直链或侧链的链内具有约1个至6个碳原子的基。“烷基”可以不被取代，或者可以被相同或不同的一个以上取代基任意取代，各取代基可以是卤素、烷基、芳基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、烷硫基、氨基、羧基等。优选地，烷基可以是甲基、乙基、丁基或异丁基。
“烷氧基”是指烷基-O-基，其中，烷基团如前所述。作为适合的烷氧基团的示例，包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基,异丙氧基及n-丁氧基。对某基的结合通过氧进行。优选地，烷氧基可以是甲氧基或乙氧基。
“芳基”是指芳香族烃环系，作为其示例，有苯基、茚基、二氢茚基、萘基及芴基等。
“卤素”可以包括氟原子、氯原子、溴原子及碘原子，优选可以是氟原子、氯原子或溴原子。
“被卤素取代的烷基”是指被1至3个卤素原子取代的烷基，例如，氟甲基、氯甲基、二氟甲基、二氯-甲基、二溴甲基、三氟甲基、三氯甲基、氟乙基、氯乙基、三氟乙基、三氯乙基、氟丙基、氟丁基、氟己基等，优选是以卤素取代的(C1-C6)烷基，更优选可以是以氯或氟取代的(C1-C6)烷基。最优选可以是三氟甲基。
“被卤素取代的芳基”是指被1至3个卤素原子取代的芳基，例如，有氟苯基、二氟苯基、三氟苯基、氯苯基、二氯苯基、三氯苯基、溴苯基、二溴苯基、三溴苯基、二氟苄基、二氯苄基、二溴苄基等，优选可以是氯苯基。
“被烷基取代的芳基”或“芳烃烷基”是指被1至3个烷基取代基所取代的芳基，例如，有苄基、乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、二乙基苯基、三甲基苯基、三乙基苯基等，优选可以是苄基。
优选地，本发明的化合物，在化学式1中，R1可以是氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、氯代基、硝基或氨基，R2为氢、2,4,6-三甲基苯基(2,4,6-Trimethyl-phenyl)、2,6-二甲氧基苯基(2,6-Dimethoxy-phenyl)、
Figure BDA00001840365900071
或-NH-R5，R4是氢或三氟甲基，R5可以是苯基(Phenyl)、4-乙基-苯基(4-Ethyl-phenyl)、3,4-二氯-苯基(3,4-Dichloro-phenyl)、4-苯偶氮基-苯基(4-Phenylazo-phenyl)。另外，R3可以是氢、
Figure BDA00001840365900072
更具体而言，确认为阻抑KRS及67LR的相互作用并显现出抗癌效果的化合物及其出处如下表1所示。
【表1】
Figure BDA00001840365900073
Figure BDA00001840365900081
Figure BDA00001840365900101
Figure BDA00001840365900111
Figure BDA00001840365900121
Figure BDA00001840365900131
Figure BDA00001840365900141
更具体而言，本发明提供一种癌预防及治疗用药物组合物，包含化学式2的N-(6-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(6-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide),化学式3的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide),化学式4的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-苯基-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine),化学式5的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(4-乙基-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(4-ethyl-phenyl)-amine),化学式6的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(3,4-二氯-苯基)-胺
((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(3,4-dichloro-phenyl)-amine),化学式7的(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-(4-苯偶氮基-苯基)-胺((5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-(4-phenylazo-phenyl)-amine),化学式8的N-苯并恶唑-2-基-苯甲酰胺(N-Benzooxazol-2-yl-benzamide),化学式9的N-(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide),化学式10的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide),化学式11的N-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-benzamide),化学式12的N-(6-硝基-苯并噻唑基-2-基)-4-三氟甲基-苯甲酰胺
(N-(6-Nitro-benzothiazol-2-yl)-4-trifluoromethyl-benzamide),化学式13的[2-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯氧基]-乙酸([2-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-phenoxy]-acetic acid),化学式14的2-(2,4,6-三甲基-苯基)-苯并恶唑-5-基胺(2-(2,4,6-Trimethyl-phenyl)-benzooxazol-5-ylamine),化学式15的2-[2-(4-甲基-苯甲酰亚胺基)-苯并噻唑基-3-基]-丁酸
(2-[2-(4-Methyl-benzoylimino)-benzothiazol-3-yl]-butyric acid),化学式16的2-(2,6-二甲氧基-苯基)-苯并噻唑(2-(2,6-Dimethoxy-phenyl)-benzothiazole)及化学式17的(2-氯-4-氟-苄基)-(5-氟-1H-吲哚-3-基甲基)-胺((2-Chloro-4-fluoro-benzyl)-(5-fluoro-1H-indol-3-ylmethyl)-amine)或其可允许用作药用的盐作为有效成份。
通过本发明的筛选方法筛选的化合物由于抑制1次肿瘤细胞的转移，所以能够应用于多种癌。虽然并非限定于此，但例如可以是大肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血。而且，由于本发明对KRS及67LR的相互作用的阻抑，癌细胞的移动或转移被减少，从而抑制癌细胞的转移，实现上述癌预防及治疗。
本发明的化合物可以以其本身或盐的形态使用，优选以可允许用作药用的盐的形态使用。在本发明中，所谓“可允许用作药用的”，是指在生理学上允许，当对人类投药时，通常不引起过敏反应或与之类似的反应，作为上述盐，优选是利用可允许用作药用的游离酸(free acid)形成的酸式盐。作为上述游离酸，可以使用有机酸和无机酸。上述有机酸并非限定于此，包括柠檬酸、草酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、蚁酸、丙酸、乙二酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲基磺酸、羟基乙酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、谷氨酸及天冬氨酸。另外，上述无机酸并非限定于此，包括盐酸、溴酸、硫酸及磷酸。
在把本发明的化合物或包括其的组合物用于临床的情况下，本发明的组合物可以制作成适合于经口或非经口给药的单位给药型的药剂学上的剂型进行使用。在制作成普通药品形态的情况下，使用常用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、界面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制造。在用于经口给药的固体制剂中，包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂是在本发明的化合物中至少混合一种以上的赋形剂制造，例如，混合淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等制造。另外，除单纯的赋形剂之外，也使用诸如矽酸镁滑石粉的润滑剂。作为用于经口给药的液体制剂，包括悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除作为常用单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，还可以包括多种赋形剂，例如，润湿剂、增味剂、芳香剂、保鲜剂等。在用于非经口给药的制剂中，包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂、软膏剂、霜剂。作为非水剂溶剂、悬浮溶剂，可以使用诸如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油的植物性油，诸如油酸乙酯的可注射的酯等。
另外，本发明的化合物或包含其的组合物可以非经口进行给药，非经口给药采用皮下注射、静脉注射、肌肉内注射或胸内注射等注入方式。为制作成非经口给药用剂型，把本发明的化学式1至化学式17的化合物与稳定剂或缓冲剂一起混合于水，制造成溶液或悬浮液，将其制成安瓿或小瓶的单位给药型。就给药单位而言，例如，可以含有个别给药量的1、2、3或4倍，或含有1/2、1/3或1/4倍。个别给药量优选含有有效药物1次给药的量，这包括通常1日给药量的全部、1/2、1/3或1/4倍。对特定患者的给药用量水平可以根据患者体重、年龄、姓别、健康状态、膳食、给药时间、给药方法及排泄以及药剂混合及疾病轻重而进行变化。
这些剂型在作为制药化学领域众所周知的处方的文献(Remington's PharmaceuticalScience,15th Edition,1975.Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87:Blaug,Seymour)中已有记载。
而且，如上所述，本发明的化合物阻抑KRS及67LR的相互作用，使1次肿瘤细胞或癌细胞的移动及转移无法顺利实现，因此，本发明提供一种包含本发明的化合物或其可允许用作药用的盐作为有效成份的癌转移阻抑用药物组合物。上述化合物可以是由化学式1至化学式17记载的化合物之一。
另一方面，本发明的组合物可以含有本发明化合物0.001至99.999重量%，即，含有以化学式1至化学式17记载的化合物0.001至99.999重量%、含有载体99.999至0.001重量%的组合物。上述载体可以是可允许用作药用的载体。
而且，本发明的药物组合物可以与具有癌预防及治疗效果的众所周知的化合物或具有癌转移抵制效果的众所周知的化合物联合给药。
本发明提供以化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的用于癌预防及治疗剂制造的用途。
另外，本发明提供以化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的用于癌转移阻抑剂制造的用途。
另外，本发明提供一种癌预防及治疗方法，其特征在于，把以化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐，以有效剂量投药给需要其的个体。
另外，本发明提供一种癌转移阻抑方法，把以化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐，以有效剂量投药给需要其的个体。
上述苯并杂环衍生物可以是化学式1至化学式17记载的化合物之一。
本发明的苯并杂环衍生物及其可允许用作药用的盐可以以有效剂量，通过包括经口、经皮、皮下、静脉或肌肉的多种路径进行给药。上述所谓“有效剂量”，是指当给药于患者时，表现出癌治疗及预防效果或癌转移抑制效果的量，上述所谓“个体(subject)”，可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人类在内的动物，也可以是来源于动物的细胞、组织、器官等。上述个体可以是需要治疗的患者(patient)。
上述本发明的苯并杂环衍生物及其可允许用作药用的盐，可以直接使用其本身进行给药，或制造成如上所述的各种剂型并给药，优选可以给药至出现所期待的效果，即，给药至导出癌预防及治疗效果或癌转移抑制效果。本发明的化合物及其可允许用作药用的盐可根据本行业众所周知的方法，以多种路径给药。即，经口或非经口给药，例如，口腔、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、骨髓内、硬膜内、腹腔内、鼻腔内、阴道内、直肠内、舌下或皮下给药，或通过胃肠道、粘膜或呼吸系统给药。例如，可以通过把本发明的化合物及其可允许用作药用的盐直接涂敷于皮肤的方法给药，或者通过把上述多肽制造成注射用剂型，利用30号的细注射针将其在皮肤皮下层注入既定量，或利用注射针轻刺(prick)皮肤的方法进行给药。优选可以直接涂敷于皮肤。另外，本发明的化合物及其可允许用作药用的盐，可以与对靶细胞或组织(例：皮肤细胞或皮肤组织)诱发高亲合性结合的分子结合，或包埋于上述分子内，以此种形态给药。本发明的化合物及其可允许用作药用的盐可以利用本行业众所周知的技术，与固醇(例：胆固醇)、脂质(例：阳离子脂质、病毒体或脂质体)或靶细胞特异性结合剂(例：因靶细胞特异性受体而认知的配体)结合。作为适合的偶联剂或交联剂，例如，可以包括蛋白质A、碳化二亚胺、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)等。
这些剂型在作为制药化学领域众所周知的处方的文献(Remington's PharmaceuticalScience,15th Edition,1975,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania)中已有记述。
作为参考，在本说明书提到的核苷酸及蛋白质作业中，可以参照以下文献(Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989);Deutscher,M.,Guide to Protein Purification MethodsEnzymology,vol.182.Academic Press.Inc.,San Diego,CA(1990))。
下面对本发明记载的附图进行说明。
图1至图6确认了人类KRS与层粘连蛋白受体的特异性相互作用。在图1中，完整长度的人类KRS与37LRP/p40间的相互作用通过酵母双杂交分析来执行。作为多-ARS复合体两个构成要素的AIMP1及AIMP2分别用作阳性及阴性对照组。阳性相互作用通过在含有X-gal的酵母培养基中的蓝色群落的形成来标记。在图2中，37LRP在35S蛋氨酸的存在下，根据体外翻译来合成，将其与GST-KRS或GST反应(pull-down)。与GST-KRS共沉淀(co-precipitated)的37LRP利用放射自显影进行了测定。在图3中，通过酵母双杂交分析，测定了与KRS及37LRP的相互作用相关联的肽部位。37LRP具有拥有N端的细胞内部位(54至113号氨基酸)及C端的细胞外部位(137至210号氨基酸)的296个氨基酸，37LRP被膜间区(113至137号氨基酸)所区分。在人类KRS(597个氨基酸)的N端特异性扩展(约70个氨基酸)部位以后，是OB-fold反密码子-结合性区(约70至214氨基酸)和催化结构域(约220至574氨基酸)。在图4中，裂解被Myc-KRS感染的A549细胞，以显示的抗体实施了免疫印迹(WCL:whole cell lysate)。细胞分成了细胞质及膜组分，利用抗-Myc抗体进行了免疫沉淀。而且，通过蛋白质印迹确认了67LR及37LRP的共沉淀。IgG用作对照组。在图5中，利用指示的抗体，对被Myc-KRS感染的A549细胞裂解物实施了蛋白质印迹。细胞分离成细胞质(C)及膜组分(M)，利用抗-Myc抗体进行了免疫沉淀，通过蛋白质印迹调查了37LRP及67LR共沉淀。作为对照组，使用了IgG。在图6中，通过共沉淀确认了KRS及67LR的层粘连蛋白-依存性相互作用。在进行了层粘连蛋白(10μg/ml,1h)处理的情况下，确认了67LR与KRS间的结合增加。为对此进行显示，利用识别67LR的antibody(abcam,cat#ab2508)进行了免疫沉淀(immunoprecipitation)，左侧的IgG标记作为从兔子获取的全体IgG(total IgG)，用作阴性对照组。执行10% SDS PAGE，在迁移到PVDF膜后，利用识别KRS和67LR的抗体分别进行了免疫印迹。
图7至图12对层粘连蛋白-诱导性膜转位(translocation)及KRS的磷酸化进行确认。在图7中，利用层粘连蛋白(10μg/ml)处理A549细胞，利用蛋白质印迹，按时段观察了67LR、37LRP及KRS的量(level)。把Hsp90及钙粘蛋白(Cad)分别用作细胞质及膜的标记。在图8中，利用层粘连蛋白处理A549细胞1小时，或不进行处理，使用抗-67 LR(MLuC5,Santacruz,sc-59732)(红色)及KRS抗体(绿色)，实施了免疫荧光染色。在图9中，利用分别抑制PLC-γ、PKC及PI3K的U73122(U)、星形孢菌素(staurosporin,ST)及LY294002(LY)，处理A549细胞3小时，利用层粘连蛋白处理1小时，然后确认这些磷酸化酶抑制剂对67LR及KRS的细胞质及膜产生何种影响。在图10中，利用Myc-KRS使A549细胞染色，培养24小时。然后，利用显示的(indicated)药物进行处理，如上所述，利用层粘连蛋白进行处理。对Myc-KRS进行免疫沉淀，利用抗-p-Thr、-Ser以及-Tyr抗体实施了免疫印迹。在图11中，利用Myc-KRS使A549细胞染色，培养24小时。利用LY294002对被感染细胞进行3小时的预处理，然后利用层粘连蛋白处理1小时。Myc-KRS被免疫沉淀，通过蛋白质印迹调查了67LR的共沉淀。作为免疫沉淀法的对照组，使用了IgG。在图12中，如上所述，在层粘连蛋白及LY294002的存在下或不存在下，对A549细胞进行了培养。EPRS(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase)与对其的特异性抗体(AbCam)发生免疫沉淀，通过蛋白质印迹确认了KRS的共沉淀(上)。利用免疫-缺失上清液(immune-depleted supernatant:ID)，与抗-KRS及EPRS抗体实施了蛋白质印迹。
图13至图17确认了一点，即，膜-结合67LR的水平(level)依存于KRS。在图13中，利用EV或KRS或si-对照组(si-cont)或si-KRS，使A549细胞感染，在把细胞裂解成细胞质与膜组分后，通过蛋白质印迹确认了各个组分中的67LR及KRS的量。把钙粘蛋白(红色)及hsp90分别用作细胞膜及细胞质的标记。在图14中，利用G418，对EV(空载体)或被KRS感染的A549细胞进行为期一周的遴选，利用基于抗-LR抗体(MluC5)的免疫荧光染色，确认了67LR的细胞内分布。分布于膜上的LR利用箭头进行了强调。在图15中，在A549细胞中，利用抗-LR抗体(MluC5)，通过流式细胞分析仪观察了膜-结合性67LR的量。对空载体或被KRS质体感染的细胞进行24小时培养。(上)为在67LR的量方面，观察KRS抑制的效果，利用si-KRS或si-对照组使细胞感染，并培养48小时。(下)在图16中，通过脉冲追踪实验，调查了KRS在67LR的细胞稳定性方面的必要性。利用si-KRS或si-对照组使293细胞感染，利用反射性蛋氨酸反应1小时。使67LR与对67LR发生特异性反应的抗体(F-18,Santacruz)进行免疫沉淀，利用SDS-PAGE分离后，实施了放射自显影。特异性siRNA对KRS的抑制是利用蛋白质印迹执行的，作为负荷(loading)对照组，使用了微管蛋白（tubulin）。
图17至图20确认了一点，即，KRS通过67LR促进细胞移动(cell migration)及癌转移。在图17中，利用显示的(indicated)质体使A549细胞感染，在层粘连蛋白不存在(图21)或存在(图17)下进行培养，通过测量在渗透膜隔离腔中移动的细胞，确认了对细胞移动的效果。对穿过膜的细胞数进行计数并显示于各panel。实验反复进行3次。在图18中，把如上处理的细胞用于为测量MMP-2的活性及量而实施的酶谱分析(上)及蛋白质印迹(中)。肌动蛋白用作负荷对照组。在图19中，利用显示的(indicated)siRNA使乳腺癌细胞株4T-1细胞感染，对Balb/C小鼠等进行皮下注射。经过27天后，摘除小鼠的肺，对直径1mm以上肿瘤结节进行计数。在图20中，对表达外因性KRS(KRS-1，及KRS-2)的2种互不相同的4T-1细胞按如上方式进行接种，经过4-5周后，对肿瘤结节进行计数。把感染空载体的细胞用作对照组。
图21至图24在细胞移动、蛋白质合成及细胞周期方面，确认了细胞内及细胞外KRS的效果。在图21中，对于在层粘连蛋白不存在下培养的A549细胞的移动，测量在渗透膜隔离腔中移动的细胞，如图17所示进行了确认。在图22中，为观察KRS的细胞外趋化(chemotactic)活性，把含有KRS浓度为显示的浓度的无血清培养基放入渗透膜隔离腔的下腔，把A549细胞放入上腔，进行培养后，对移动的细胞进行计数。在图23中，在A549细胞中的KRS量因siRNA和外因性KRS的导入而下调或上调。被感染的细胞分别培养48小时及24小时，在无-蛋氨酸培养基中培养1小时时间，制成缺营养状态后，利用放射性标志的蛋氨酸，标识2小时时间。清洗后，把细胞培养4小时时间，利用0.5%Triton X-100溶液使之裂解，利用液滴闪烁计数仪(liquid scintillation counting)测定了放射性活性。在图24中，如显示的所示，使A549细胞感染，固定并利用碘化吡啶(Propidium iodide)进行染色，在流式细胞分析仪中进行了分析。
图25至图27确认了在癌转移方面的KRS的抑制效果。在图25中，根据蛋白质印迹调查了si-KRS及si-DRS在靶蛋白质的表达方面的效果。作为负荷对照组，使用了微管蛋白。在图26中，如上述方法所示，注射了siRNA感染的细胞(1x106)，经过21天后，测量肿瘤的大小及体积，从而调查了KRS及DRS在1次肿瘤增殖方面的抑制效果。各个组使用了6只小鼠(在图19中显示1只，在图27中显示5只)。在图27中，从上述小鼠摘除的肺固定于10%福尔马林溶液中。转移性肿瘤结节及数量如显示所示。
图28至图30确认了在癌转移方面的KRS超表达的效果。在图28中，根据蛋白质印迹，观察了KRS-1及KRS-2细胞株的超表达。在图29中，相互比较了KRS超表达在1次肿瘤增殖方面的效果。在图30中，在接种后的30天，调查了KRS超表达在肿瘤转移方面的效果。各个组使用了4只小鼠(在图20中显示了的1只，在图30中显示了4只)。
图31至图36显示了化合物对KRS及67LR间相互作用的阻抑及对67LR的细胞内稳定性产生的影响。在图31中，在化学式15的化合物(CAND-KL1,KL1)50μg/ml中，表现出对含有显示的(indicated)对的蛋白质的酵母细胞的生长阻抑。对照组表现为处理了DMSO的细胞的OD值。图32的照片显示出，在CAND-KL1的存在或不存在下，包含了具有显示的相互作用对的酵母细胞在小室中的生长。在图33中，在293细胞中，通过共-免疫沉淀，试验了KL1对KRS及67LR间相互作用的剂量-依存性效果。细胞利用KL1处理3小时时间，对67LR进行了免疫沉淀，利用蛋白质印迹确认了KRS的共沉淀。在图34中，在KL1以显示的量存在的情况下，把利用放射线同位素合成的层粘连蛋白受体与GST-KRS(1μg)进行了混合。利用谷胱苷肽-琼脂糖珠(glutathione-Sepharose beads)使GST-KRS沉淀，利用放射线照相(autoradiography)，检测了共沉淀的层粘连蛋白受体。在图35中，利用蛋白质印迹，检查了在A549细胞中，KL1对67LR及37LRP的细胞内水平的影响。在图36中，如实验方法记载所示，利用表面等离子体共振(surface plasmon resonance)方法，检查了KRS及CAND-KL1间的相互作用。GST-KRS附着于CM5传感器芯片(CM5 Sensor Chip)，在显示的浓度(以互不相同的颜色显示)下，借助共振单元(resonance unit,RU)测量了结合。为测量KRS-特异性结合亲和度，使用GST蛋白质作为对照组。表观结合常数(apparent bindingconstant)利用BIAevaluation程序获得。
图37至图43显示了KRS-层粘连蛋白受体的阻抑对细胞移动及癌转移的抑制。测量了KL1对MMP2活性(图37)及细胞移动(图38及图39)的剂量-依存性效果。对于细胞移动，以KL1处理细胞8小时时间。在图40中，为确认KL1对细胞蛋白质合成的效果，利用KL1，以显示的浓度对A549细胞进行处理后，利用无-蛋氨酸培养基进行饥饿处理(starved)。然后，添加[35S]蛋氨酸2小时时间。之后，把细胞在完全培养基(complete medium)中培养4小时时间后，利用闪烁计数器测量添加的蛋氨酸的量。在图41中，利用A549细胞测量了KL1的剂量-依存性细胞毒性。在图42中，按照上述记载的方法，测量了KL1对癌转移的效果。各个组由6只小鼠构成，在3周期间内，KL1以1天1次、每次30mg/kg的剂量，注射于腹腔内。然后杀死小鼠，对直径1mm以上的转移的肿瘤结节数量进行计数，求出平均值(左侧)。右侧显示了代表性的肺的照片。在图43中，观察处理了KL1的组与未处理的组的1次肿瘤(primarytumor)，确认了重量与大小无较大差异。
有益效果
本发明人查明，KRS与67LR相互作用，从而促进癌(或肿瘤)细胞的移动，对癌的转移(metastasis)产生影响，并确认了阻抑KRS及67LR相互作用的物质能够抑制癌细胞的转移，预防及治疗癌。因此，本发明的组合物由于抑制癌的转移，从而提供用于癌预防及治疗的新途径。
附图说明
图1是通过酵母双杂交分析，确认人类KRS与37LRP/p40间的相互作用。
图2是通过拉下分析，确认人类KRS与37LRP的相互作用。
图3是确认人类KRS与37LRP的相互作用部位。
图4是为确认KRS与67LR及37LRP的结合，针对被Myc-KRS感染的A549细胞，利用抗-Myc及抗-层粘连蛋白受体抗体，进行免疫印迹分析的结果。
图5是为确认KRS与67LR及37LRP的结合，对以Myc-KRS感染的A549细胞的溶解物进行蛋白质印迹分析的结果。
图6是通过免疫沉淀，确认层粘连蛋白处理后的KRS及67LR的结合。
图7是利用蛋白质印迹，确认对A549细胞进行层粘连蛋白处理时的67LR、37LRP及KRS的量(level)。
图8是利用免疫荧光染色，确认以层粘连蛋白对A549细胞进行处理及无处理时的67LR及KRS的表达。
图9是确认磷酸化酶抑制剂对67LR及KRS在细胞质及膜中的表达所产生的影响。
图10是在表达KRS的A549细胞中，当进行层粘连蛋白及磷酸化酶抑制剂处理时，利用p-Thr、-Ser、-Tyr抗体实施免疫印迹，确认磷酸化程度。
图11是在表达KRS的A549细胞中，利用蛋白质印迹，确认磷酸化的KRS是否与67LR结合。
图12是利用蛋白质印迹，确认层粘连蛋白对KRS与EPRS的结合产生的影响。
图13是利用蛋白质印迹，确认si-对照组或si-KRS的转染时的67L及KRS的量。
图14是针对EV(空载体)或以KRS感染的A549细胞，利用免疫荧光染色确认67LR的细胞内分布。
图15是利用流式细胞分析仪，确认在A549细胞中膜-结合性67LR的量。
图16是利用脉冲追踪实验，确认KRS对67LR的细胞稳定性产生的影响。
图17是确认在抑制KRS及/或67LR表达时对细胞移动的影响。
图18是利用酶谱分析及蛋白质印迹，确认在抑制KRS及/或67LR的表达时的MMP-2活性及量。
图19是显示在移植了4T-1细胞株的小鼠中，当抑制KRS表达时的肿瘤结节数量。
图20是显示在移植了4T-1细胞株的小鼠中，当增进KRS表达时的肿瘤结节数量。
图21是测定在层粘连蛋白不存在下培养的A549细胞的移动。
图22是测定KRS对细胞移动的趋化(chemotactic)活性。
图23是在A549细胞中，确认引入siRNA和外因性KRS后的KRS的量及细胞内全体蛋白质合成量。
图24是在A549细胞中，确认引入siRNA和外因性KRS后的KRS的量及细胞周期。
图25是利用蛋白质印迹，确认si-KRS及si-DRS在靶蛋白质的表达方面的效果。
图26是确认KRS及DRS在肿瘤细胞移植后的1次肿瘤增殖方面的抑制效果。
图27是确认肿瘤细胞移植后的转移性肿瘤结节及数量。
图28是利用蛋白质印迹，确认KRS-1及KRS-2细胞株的KRS的超表达。
图29是确认KRS超表达在肿瘤细胞移植后的1次肿瘤增殖方面的效果。
图30是确认肿瘤细胞移植后的转移性肿瘤结节及数量。
图31是显示在本发明的化合物(CAND-KL1,KL1)50μg/ml下，包含KRS及67LR(KRS-LR)、KRS及AIMP2(KRS-AIMP2)、MRS及AIMP3(MRS-AIMP3)蛋白质的酵母细胞的生长阻抑。
图32是显示酵母细胞在本发明的化合物的存在或不存在下的生长。
图33是在293细胞中，借助共-免疫沉淀，试验KL1对KRS及67LR间相互作用的剂量-依存性效果。
图34是使67LR与KRS共沉淀，确认本发明的化合物不同剂量下的KRS及67LR的相互作用。
图35是利用蛋白质印迹，在A549细胞中，确认本发明的化合物对67LR及37LRP的细胞内水平产生的影响。
图36是利用表面等离子体共振(surface plasmon resonance)方法，确认KRS及本发明的化合物间的相互作用。
图37是确认本发明的化合物对MMP2活性产生的影响。
图38是确认本发明的化合物对细胞移动产生的影响。
图39是定量地确认本发明的化合物对细胞移动产生的影响。
图40是确认本发明的化合物对细胞的蛋白质合成产生的影响。
图41是利用A549细胞，确认本发明的化合物具有的细胞毒性。
图42是确认本发明的化合物对癌转移产生的影响。
图43是确认本发明的化合物对1次肿瘤的重量及体积产生的影响。
具体实施方式
下面根据实施例，对本发明进行详细说明。
不过，下述实施例只是本发明的示例而已，本发明的内容并非限定于下述实施例。
<实验方法>
1.细胞培养及材料
A549及HEK293细胞从ATCC购入。小鼠乳腺癌(mammary carcinoma)4T-1细胞株从KimSungjin博士(嘉泉医科大学)处获得。把包含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)及1%抗体的RPMI(针对A549细胞及4T-1细胞的)及DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium,针对其他细胞的)培养基用于细胞培养。对37LRP进行编码的pcDNA3.1载体从立花弘文(九州大学)处获得。带有Myc(Myc-tagged)的人类KRS及DRS克隆于pcDNA3载体的EcoRI/XhoI限制酶部位。啮齿类KRS cDNA通过RT-PCR获得，克隆于pcDNA3.1载体的HindIII/XhoI限制酶部位。靶向(targeting)啮齿类及人类KRS及DRS的siRNA从Invitrogen公司购入。如果需要，将提供siRNA的序列。转染试剂使用Gene porter(GTS)及脂质体转染2000(invitrogen)。LY294002、U73122及星形孢菌素(staurosporin)从Calbiochem购入，环己酰亚胺(cycloheximide)及层粘连蛋白(laminin,Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma)从Sigma购入。
2.免疫沉淀及蛋白质印迹
利用包含150mM NaCl、0.5%Triton X-100、0.1%SDS及蛋白质分解酶阻抑剂的20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4,裂解液)，裂解了细胞。把蛋白质提取物与正常IgG及蛋白质G琼脂糖一同培养(incubation)2小时时间后，为去除非特异性地结合于IgG的蛋白质，进行了离心分离。对上清液进行提纯，与67LR抗体(F-18,Santacruz)混合后，进行晃动并在4℃下培养2小时时间，然后混合蛋白质A琼脂糖。利用以冰块冷却的裂解液清洗3次，然后把沉淀物溶化于SDS-样品稀释液，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳法（SDS-PAGE）进行分离。在互不相同的细胞组分中，为确认KRS及LR的结合，利用pcDNA3.1-Myc-KRS进行转染，利用proteoextract试剂盒(Calbiochem)，按照制造商的指南，分离质膜与细胞质组分后，如上所述地执行共免疫沉淀。为分析蛋白质水平，从细胞中提取蛋白质后，利用10%SDS-PAGE进行分离。只要未另行提及，把抗-LR抗体(Abcam,ab2508)用于了37LRP及67LR的同时免疫印迹。对hsp90及广谱钙粘附蛋白(Pan-cadherin)的抗体从Santacruz购入。
3.流式细胞分析(flow cytometry)
为对细胞周期进行address，利用显示的载体或化合物，对培养的细胞进行转染或处理，用70%乙醇在4℃下固定1小时时间后，利用以冰块冷却的PBS清洗2次。然后，利用碘化吡啶(50μg/ml)、0.1%柠檬酸钠、0.3%NP40及RNaseA(50μg/ml)对细胞染色40分钟后，执行流式细胞分析(FACS Calibur,Beckton-Dickinson)。针对各个样本，使用Cell Quest Pro软件分析了20000细胞。为分析细胞表面的67kD LR的量，把1x106细胞与IgG或识别67LR的细胞外区域的抗-LR抗体(MLuC5,1μg)一同培养后，与FITC 2次抗体进行培养。利用PBS清洗后，利用FACS扫描样本。
4.免疫荧光染色
利用70%甲醇，固定9mm盖玻片(cover slip)上的A549细胞后，用冷PBS简单清洗。利用包含1%CAS、3%BSA及0.5%triton X-100的封闭液处理(incubation)30分钟时间后，利用对KRS的抗体(Abcam)及对MLuC-5的抗体(Santacruz)把细胞培养1小时时间。添加Alexa 488及568(invitrogen)后，在室温下处理30分钟时间。用冷PBS清洗30分时时间后，利用激光扫描显微镜对细胞标本进行观察。
5.脉冲追踪实验(Pulse-chase experiment)
利用脂质体转染2000，使293细胞转染成si-KRS或si-对照组(invitrogen)。将其在不含蛋氨酸的培养基中培养1小时时间后，添加[35S]蛋氨酸(50μCi/ml)，培养1小时时间。利用新鲜的培养基，冲洗掉放射线蛋氨酸后，利用对其的特异性抗体(Santacruz)使67LR免疫沉淀，利用12%SDS-PAGE分离后，利用BAS(FLA-3000,Fujifilm)使之显露(autoradiography)。67LR的量利用Multi-gauge程序(V3.0,Fujifilm)进行测量。
6.酵母双杂交(yeast two hybrid)分析
以PCR方式，利用相应的引物(primer)，获得了对人类KRS多个片段进行编码的cDNA。利用EcoRI及XhoI截断对KRS的PCR产物，连接于pEG202载体(为制造LexA-融合蛋白质)及pJG4-5载体(为制造B42-融合蛋白质)的相应部位。对37LRP片段进行编码的cDNA从Barbara J.Ballermann博士(阿伯塔大学)处获得，将其插入pJG4-5载体的EcoRI及XhoI部位。利用在含有X-gal的酵母培养基上是否形成蓝色群落，分析了两种融合蛋白质间的相互作用。
7.体外结合分析
使GST-KRS或GST在大肠菌Rosetta(DE3)菌株中表达，把上述蛋白质提取物在含有1%Triton X-100及0.5%月桂酰肌氨酸的PBS缓冲液中，在4℃下，与谷胱甘肽琼脂糖混合2小时时间。人类37LRP使用TNT快速转录/翻译偶联系统(TNT Quick coupledTranscription/Translation system，Promega公司)，以pcDNA3-37LRP为株型，在[35S]蛋氨酸的存在下，根据体外翻译进行合成。合成的37LRP添加于上述GST蛋白质混合物，在含有1%Triton X-100、0.5%月桂酰肌氨酸、1mM DTT、2mM EDTA及300μM苯甲磺酰氟化物的PBS缓冲液中，在搅拌状态下，在4℃下培养4小时时间，然后，利用具有0.5%Triton X-100的相同缓冲液清洗6次。然后，利用SDS样品稀释液，把结合于琼脂糖滴的蛋白质溶出，利用SDS-PAGE进行分离，测定放射线(autoradiograph)。
8.细胞移动(cell migration)分析
细胞移动是如在先文献(Park,S.G.et al.Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to triggerpro-inflammatory response,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,6356-6361(2005))中所示记载，利用具有聚碳酸酯膜(8.0μm孔隙大小，Costar公司)的24-小室渗透膜隔离腔进行测定。把A549细胞溶于无血清(serum-free)RPMI培养基后，以每小室1x105的细胞浓度放于上腔。把精制成显示的浓度的人类KRS、层粘连蛋白(10μg/ml)或明胶(10μg/ml)放入下层小室，使细胞在CO2培养器中，在37℃下移动6小时时间。利用含有70%甲醇的PBS，使细胞固定30分钟时间后，利用PBS清洗3次。利用苏木紫(Sigma公司)对细胞染色10分钟时间后，利用蒸馏水进行清洗。用棉棒从膜的上面部分把不移动的细胞去除。把膜从腔内分离，然后放到GelMount(美国Biomeda公司)上。在显微镜下，任意遴选(x20)4处移动的细胞(附着于膜的下面者)进行计量，以这种方法进行测定。
9.酶谱分析(zymography)
把用对显示的siRNA及重组KRS(或DRS)进行编码的质体所转染的A549细胞分别培养48小时及24小时时间后，接种于含有10%FBS的RPMI培养基(1x105细胞/小室)。把细胞在无血清RPMI培养基中进行2小时时间的饥饿处理(starving)后，添加层粘连蛋白，以10μg/ml培养24小时时间。把20μl的培养基与5x FOD缓冲液(含有4%SDS、20%丙三醇及0.01%溴酚蓝的0.125M Tris-HCl，pH 6.8)混合后，执行含有1mg/ml的明胶的10%SDS-PAGE。用2.5%Triton X-100，分别对凝胶进行2次清洗，每次清洗20分钟时间，然后与反应缓冲液(含有10mM CaCl2、150mM NaCl、1μM ZnCl2、1%Triton X-100、0.002%叠氮钠的50mM Tris-HCl，pH 7.5)，在37℃下培养24小时时间。用蒸馏水清洗凝胶，利用考马斯蓝R250进行染色后，利用35%甲醇进行褪色(destain)。
10.活体内癌转移实验
利用si-KRS、si-DRS或si-对照组使小鼠乳腺癌细胞(mammary carcinoma)4T-1细胞转染，培养24小时时间。把细胞(1x106)皮下注射于6周龄雌性Balb/c小鼠的背部。在转染48小时后剩下的细胞中，试验了si-RNA对靶基因表达的效果，在注射3至10日期间，以2天为间隔，在1次肿瘤中，以使用了相应抗体的蛋白质印迹，试验了上述si-RNA的效果。1周3次测量肿瘤大小，以此观察了肿瘤的生长。并同时测量了整体体重。在注射后第21天杀死小鼠，从小鼠体内摘出1次肿瘤及肺。肺用10%福尔马林固定24小时时间。在肺上测量转移性肿瘤结节数量及大小，直径1mm以上肿瘤结节另行记录。并测量了1次肿瘤的重量。为检查KRS超表达对癌转移的效果，使啮齿类KRS及空载体转染于4T-1细胞，把稳定的转染体在G418的存在下培养3周时间，并进行遴选。然后，摘取多个的单一群落，利用蛋白质印迹，比较了KRS的表达。相对于对照组细胞，遴选KRS的表达水平较高的2个不同的群落(KRS-1及KRS-2)，用于注入。除注入30日后杀死小鼠之外，其余所有过程均按上述方式执行。
11.癌转移抑制活性试验
针对筛选化合物类库获得的本发明的化合物，根据酵母双杂交方法，以如下方式确认了对KRS与层粘连蛋白受体(67LR)间相互作用的阻抑程度。在LexA载体(clontech公司)及B42载体(clontech公司)中，分别克隆KRS、LR、AIMP2、AIMP3及MRS，制造了所需的载体。其中，使LexA-KRS及B42-LR载体共转化(co-transformation)于酵母EGY/SH细胞，然后，利用不含脲嘧啶(Ura)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)及亮氨酸(Leu)的半乳糖培养基，把上述酵母细胞稀释为吸光度(540nm波长)为0.2后，按每个孔200u的剂量放入96孔板。把浓度为10mg/ml的各个化合物1μl放入各个小室，培养6日后，在540nm下测量吸光度。本发明人遴选出生长比对照组生长减小50%以上的化合物。使用诸如LexA-KRS/B42-AIMP2及LexA-MRS/B42-AIMP3的不同的2个相互作用对，对遴选的化合物的阻抑特异性进行了试验。
12.细胞蛋白质合成
利用显示的(indicated)浓度的化学式15的化合物(2-[2-(4-甲基-苯甲酰亚胺基)-苯并噻唑基-3-基]-丁酸，简称CAND-KL1或KL1)，对A549细胞进行了处理。然后，把细胞在无-蛋氨酸培养基中培养30分钟时间，添加[35S]蛋氨酸(10mCi/ml)并培养2小时时间。再利用完全培养基(completed medium)对细胞培养4小时时间，然后收集细胞。对其进行裂解，利用闪烁计数器，测量裂解细胞的放射线量。
13.细胞毒性分析
把104A549细胞放入96孔板，利用显示的浓度的化学式15的化合物，处理24小时时间。然后，根据制造商的指南，把EZ-cytox(韩国Daeil Lab公司)化合物按每孔10μl的剂量放入各个孔中，培养2小时时间。利用酶标仪，在420nm下测量了吸光度。
14.表面等离子体共振分析(surface plasmon resonance assay)
利用BIAcore3000(GE healthcare)，检测了KRS及化学式15的化合物间的相互作用。稀释GST及GST-KRS，在10mM乙酸钠(sodium acetate,pH 5.0)中，调成20μg/ml。然后，把各个蛋白质涂于CM5传感器芯片(CM5 sensor chip,GE healthcare公司)的表面。利用含有1%DMSO的PBS，把CAND-KL1稀释成显示的浓度，在25℃下，以20μl/分钟的速度注入后，利用共振单元(resonance unit,RU)的变化测量了结合。在传感图(sensorgram)中，剔除了对GST的结合后，测量了CAND-KL1对GST-KRS的特异性结合活性。使用BIAevaluation程序使基线(baseline)移动，进行1:1结合，获得了表观结合常数。
<实验结果>
1.KRS及67LR间的特异性相互作用
根据酵母双杂交分析，确认了完整长度的KRS与37LRP的特异性相互作用。LexA-KRS不仅与公认为KRS配体(Kim,J.Y.et al.p38 is essential for the assembly and stability ofmacromolecular tRNA synthetase complex:Implications for its physiological significance,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,7912-7916(2002))的AIMP2配对，还与B42-37LRP配对(paired)，形成了蓝色群落，对于AIMP1，则并非如此(图1)。对于体外结合试验，把以[35S]蛋氨酸标识的37LRP与GST-KRS或GST混合，利用谷胱甘肽-琼脂糖进行沉淀后，进行了放射自显影。37LRP与GST-KRS一同沉淀，但与GST则不然(图2)。利用基于酵母双杂交分析的缺失绘图法(deletion mapping)，确认了人类KRS的N端转录激活区和LR的C-端细胞外区与他们的结合有关(图3)。
细胞质内37LRP转换为膜-包埋性67LR，因此，本发明人确认了KRS是否对37LRP及67LR不同地配对。把Myc-KRS导入肺癌细胞株A549细胞，与抗-Myc抗体进行免疫沉淀。根据细胞裂解物的蛋白质印迹结果，67LR存在量少于37LRP(图4右侧柱)。但是，与37LRP相比，Myc-KRS更优先结合于67LR(图4中间柱)。本发明人后来把A549细胞分离成细胞质和原生质膜组分，确认了Myc-KRS与37LRP及67LR的相互作用。在细胞质中微弱观察到37LRP，在原生质膜中微弱观察到67LR(图5右侧)，但是，KRS在细胞质中观察到更多量，不过，在两种组分中均存在。当使两种组分均与抗-Myc抗体进行免疫沉淀时，虽然细胞质内也沉淀了少量的37LRP，但在膜中存在的67LR主要与KRS一同沉淀(图5左侧)。这一结果说明，KRS虽然与层粘连蛋白受体的两种形态均能够潜在性地结合，但是，更偏向于在细胞内与67LR的结合。随后，本发明人通过层粘连蛋白处理，确认了内在的KRS及67LR的相互作用是否受到影响。这两种蛋白质的相互作用因层粘连蛋白处理而增加(参照图6)。
2.KRS的层粘连蛋白-依存性膜转位，关系到从磷酸化及多-tRNA合成酶复合体的游离。
本发明人随后通过细胞组分与免疫荧光染色法，在A549细胞中，调查了KRS的细胞内分布是否因层粘连蛋白处理而变化。在进行层粘连蛋白处理后，KRS与67LR的膜内存在量，在细胞质内的KRS及37LRP量或他们的表达方面，几乎无变化地逐渐增加(图7，结果未示出)。在免疫荧光染色中，也说明了67LR及KRS因层粘连蛋白处理而向膜一侧移动(图8，分别为红色及绿色)。发明人随后调查了KRS的膜转位(translocation)是否因层粘连蛋白触发(triggered)的信号传递而受到生理调节。众所周知，诸如磷酸肌醇3-OH激酶(phosphoinositide3-OH kinase,PI3K)(Shaw，L.M.,Rabinovitz,I.,Wang,H.H.,Toker,A.& Mericurio.A.M.Activation of phosphoinositide 3-OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinomainvasion.Cell 91,949-960(1997))、蛋白质磷酸化酶C(Protein kinase C,PKC)(Li,Y.Q.et al.Protein kinase C mediates the signal for interferon-gamma mRNA expression in cytotoxic T cellsafter their adhesion to laminin.Immunology 93,455-461(1998))以及磷脂酶C-γ(phospholipaseC-gamma,PLC-gamma)(Vossmeyer,D.,Hofmann,W.,Loster,K.,Reutter,W.& Danker,K.Phospholipase C-gamma binds alpha1beta1 integrin and modulates alpha1beta1 integrin-specificadhesion.J.Biol.Chem.277,4636-4643(2002);Kanner,S.B.,Grosmaire,L.S.,Ledbetter,J.A.&Damle,N.K.Beta 2-integrin LFA-1 signaling through phospholipase C-gamma 1 activation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7099-7103(1993))的几种互不相同的磷酸化酶被层粘连蛋白所激活。为了解在这些磷酸化酶中，哪些与KRS的层粘连蛋白依存性膜转位有关，本发明人利用各个激酶的特异性抑制剂，切断了各个磷酸化酶，确认了这种处理是如何对KRS的层粘连蛋白依存性膜转位产生影响的。在膜组分中，KRS与67LR的层粘连蛋白依存性增加，在作为PI3K抑制剂的LY294002的存在下受到抑制，相反，利用U73122或星形孢菌素处理的细胞与对照组细胞相似，显示出67LR的层粘连蛋白依存性增加(图9上，结果未示出)。在这些磷酸化酶中，没有一种对细胞内KRS的量产生影响(图9下)。该结果表明，PI3K与KPS的层粘连蛋白诱导性磷酸化有关。实际上，在并非酪氨酸的苏氨酸和丝氨酸中，磷酸化的KRS因层粘连蛋白处理而增加，相反，在LY294002的存在下受到抑制，在星形孢菌素的存在下，不受任何影响(图10)。本发明人还调查了KRS的层粘连蛋白诱导性磷酸化是否对与67LR的相互作用不可缺少。LY294002处理对KRS与67LR的层粘连蛋白诱导性结合产生抑制(图11)。由于细胞质KRS已固定于多-ARS复合体，因此，本发明人还通过KRS与作为复合体其他酶构成成份的谷酰基-脯氨酰基-tRNA合成酶(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase,EPRS)进行共-免疫沉淀，调查了KRS的层粘连蛋白依存性磷酸化对与多-ARS复合体结合的影响。在LY化合物(LY294002)不存在下，层粘连蛋白处理使KRS与EPRS的结合减少，同时，使免疫-缺失的溶解性组分(immuno-depleted soluble fraction)的KRS增加(图12上、下Panel的左侧lane)。与此相反，结合于EPRS的KRS在细胞经LY294002预处理时，不受层粘连蛋白处理的影响(图12上、下Panel的右侧lane)，这表明，KRS的磷酸化是KRS与复合体的层粘连蛋白-依存性游离所必需的。
3.KRS关系到67LR的细胞内稳定。
本发明人随后在A549细胞中，确认了KRS是否对67LR的膜内存在量产生影响。在原生质膜(plasma membrane)中的67LR的量虽然因KRS而增加(图13，左侧)，但是，对在层粘连蛋白中的效果而言，当KRS被其特异性siRNA抑制时消失(图13，右侧)，这表明KRS在67LR的层粘连蛋白依存性促进方向的重要性。在空载体(EV)或被KRS转染的A549细胞之间，通过免疫荧光染色，比较了层粘连蛋白受体的细胞内分布。与对照组相比，层粘连蛋白受体在KRS超表达细胞的膜部位被强烈染色(图14)。本发明人还通过流式细胞分析仪，调查了在膜中存在的67LR。对在膜中存在的67LR的量而言，当从外部供应KRS时增加，当利用si-KRS对KRS进行抑制时减少(图15)。
本发明人调查了KRS是如何使67LR的膜内存在量增加的。从理论上而言，KRS通过来自37LRP的转录或转化(conversion)，能够促进67LR。但是，KRS的转染除了LR转录调节的临时性作用之外，并不增加LR转录(结果未示出)。另外，由于37LRP的变形被认为是37LRP转化为67LR的先行条件(Landowski,T.H.,Dratz,E.,A.& Starkey，J.R.Studies of the structureof the metastasis-associated 67kDa laminin binding protein:fatty acid acylation and evidencesupporting dimerization of the 32kDa gene product to form the mature protein.Biochemistry 34,11276-11287(1995);Buto,S.et al.Formation of the 67-kDa laminin receptor by acylation of theprecursor.J.Cell.Biochem.69,244-251(1998))，因此，本发明人调查了KRS是否对37LRP的脂肪酰化(fatty acylation)起到媒介作用。结果显示，KRS根本不对37LRP的脂肪酰化产生影响(结果未示出)。本发明人还通过脉冲追踪(pulse-chase)实验，调查了KRS在67LR的代谢转化(turn over)方面的效果。初期蛋白质合成，利用放射性蛋氨酸进行标识，之后利用环己酰亚胺进行抑制。之后，按时间间隔，利用放射自显影，观察了67LR的消失(disappearance)。在KRS被siRNA抑制时，67LR急剧减少，但在si-对照组中，该数值随着时间间隔而保持，形成对照(图16)。因此表明，KRS在原生质膜中与67LR结合，从而增加了67LR的半衰期。
4.KRS通过67LR，增进细胞移动及癌转移。
本研究人随后通过渗透膜分析，调查了KRS的表达程度是否对层粘连蛋白-依存性A549细胞移动产生影响。就对照组细胞的移动而言，经层粘连蛋白处理，平均促进了约6倍(图21及图17)。但是，就层粘连蛋白依存性细胞移动而言，当KRS被si-RNA抑制时，则发生了减少(图17，si-对照组及si-KRS)。与之相反，KRS超表达则增加了经层粘连蛋白处理而促进的细胞移动(图17，EV及KRS)。但是，如果层粘连蛋白受体被si-RNA抑制，则KRS在细胞移动方面的效果消失(图17，si-LR，下Panel)。KRS在一些癌细胞中被作为细胞因子而分泌(Park,S.G.et al.Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,6356-6361(2005)),因此，本发明人调查了细胞外因性KRS是否对细胞移动产生影响。当利用不同浓度的提纯KRS对A549细胞进行处理时，在该分析中，如果去除KRS的细胞外因性效果不算，那么，细胞移动几乎不受影响(图22)。相反，在实验期间内，细胞蛋白质的合成及细胞周期不受KRS的抑制及超表达的影响，这表明，KRS-依存性细胞移动并非起因于上述过程的效果(图23及图24)。由于层粘连蛋白处理会引起MMP-2(matrix metllo-proteinase-2)的激活(Givant-Horwitz,V.,Davidson,B.& Reich,R.Laminin-induced signaling in tumor cells the role of the M(r)67,000 laminin receptor.Cancer Res.64,3572-3579(2004))，因此，通过体外酶谱分析，调查了KRS在MMP-2的层粘连蛋白依存性激活方面的作用。MMP-2活性被层粘连蛋白激活，这在si-KRS的存在下被抑制(图18左侧)，但却因KRS的超表达而进一步增进(图18右侧)。
由于KRS能够通过与癌转移相关的67LR，促进细胞移动，所以，使用容易转移到肺的小鼠乳腺癌4T-1细胞，调查了癌转移是否会受到KRS的表达水平的影响。为此，使KRS或作为多-ARS复合体其他构成要素的DRS(aspartyl-tRNA synthetase)，利用对其的特异性siRNA，对表达进行抑制，然后比较KRS及DRS表达的减少是如何对癌转移产生影响的。利用蛋白质印迹，确认si-KRS及si-DRS的抑制效果后(图25)，通过皮下注射，把这些细胞及利用si-对照组进行处理的细胞分别注入Balb/c小鼠的背部皮肤。注入的3种均诱发了类似质量及体积的肿瘤(图26)，从而了解到，KRS的水平对1次肿瘤的生长不产生影响。在注入肺后的第21天进行了分离，在3组间比较了转移性肿瘤结节(直径大于1mm者)的数量。与在对照组及DRS受到抑制的细胞中获得的转移性结节的数量相比，转移性结节的数量因KRS的抑制而大为减少(图19及图27)。相反，根据上述方法，调查了KRS的超表达是否增进了癌转移。我们通过对KRS进行编码的质体的转染及G418筛选，首先建立了稳定地超表达KRS的4T-1细胞株。在建立的细胞株中，利用蛋白质印迹确认了KRS超表达，遴选了与利用空载体进行转染的细胞相比，以更多的量表达KRS的2个互不相同的细胞(KRS-1及KRS-2)(图28)。这些细胞也生成了类似质量和大小的1次肿瘤(图29)。在注入这些细胞后第30天检查肺部时，两个KRS-超表达细胞均比对照组细胞生成了更多的结节(图20及图30)。这种结果表明，KRS在活体内诱导癌转移。
5.确认本发明化合物对KRS及层粘连蛋白受体间相互作用的阻抑
为考察本发明的化合物能否调节KRS与层粘连蛋白受体间的相互作用，本发明人对本发明的化合物进行了处理，确认了KRS与67LR间的相互作用。为此，本发明人建立了酵母双杂交(yeast two hybrid)系统，以便如果KRS及层粘连蛋白受体间发生相互作用，则细胞会生长，从而考察了化合物是否阻抑相互作用。如果化合物阻抑KRS及层粘连蛋白受体间的相互作用，则说明阻抑了酵母细胞的生长。
其结果如下表2所示，与对照组细胞相比，显示出50%左右的生长阻抑，从而可以获知，能够很好地阻抑KRS与67LR的相互作用。
【表2】
 化合物种类   阻抑率(%)
 化学式2的化合物   54.22
 化学式3的化合物   59.98
 化学式4的化合物   51.78
 化学式5的化合物   47.55
 化学式6的化合物   52.79
 化学式7的化合物   47.63
  化学式8的化合物   47.28
  化学式9的化合物   36.88
  化学式10的化合物   60.04
  化学式11的化合物   49.09
  化学式12的化合物   52.46
  化学式13的化合物   55.22
  化学式14的化合物   49.27
  化学式15的化合物   52.10
  化学式16的化合物   47.56
  化学式17的化合物   36.49
随后，把各个化合物针对诸如KRS-AIMP2(Kim,J.Y.et al.p38 is essential for the assemblyand stability of macromolecular tRNA synthetase complex:Implications for its physiologicalsignificance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,7912-7916(2002);Han,J.M.et al.Hierarchicalnetwork between the components of the multi-tRNA synthetase complex:Implications for complexformation.J.Biol.Chem.281,38663-38667(2006))及MRS-AIMP3(Quevillon,S.& Mirande,M.The p18 component of the multisynthetase complex shares a protein motif with the beta and gammasubunits of eukaryotic elongation factor 1.FEBS Lett.395,63-67(1996);Kim,K.J.et al.Determination of three dimensional structure and residues of novel tumor suppressor,AIMP3/p18,required for the interaction with ATM.J.Biol.Chem.(2008))的2个不同的相互作用对进行了处理。通过这种实验，本发明人遴选了只阻抑KRS-LR相互作用的化合物(参照下述表3)。
【表3】
  KRS-67LR   KRS-AIMP2  MRS-AIMP3
  化学式15的化合物   0.2223   0.9497   1.2443
  对照组   0.4241   1.3204   1.4732
其中，针对化学式15的化合物(CAND-KL1，也显示为KL1)，试验了其是否也阻抑KRS及67LR的细胞内相互作用。使A549细胞以不同浓度的KL1进行处理，以其抗体使67LR免疫沉淀后，考察了KRS的共-免疫沉淀(co-immunoprecipitation)。与67LR共沉淀的KRS的量，随着KL1量的增加而减少，KRS及67LR在细胞内的量无变化(图33)。利用放射线同位素，使合成的层粘连蛋白受体及GST-KRS间实现in vitro相互作用，在其中添加了不同量的KL1。与GST-KRS进行下拉(pull-down)的层粘连蛋白受体的量随着KL1化合物的添加量增加而减少(图34)。67LR的细胞内稳定性取决于KRS的结合，因此，利用阻抑这两种蛋白质结合的KL1处理，确认了67LR的细胞内水平是否受到影响。67LR的水平随着KL1的添加量而减少，细胞质内37LRP则无影响(图35)。本发明人通过表面等离子体共振(surface plasmonresonance)，检查了KL1是否直接与KRS结合。随着KL1量的增加，KL1在KRS上的结合增加，Kd测量值约为2.6μM(图36)。这表明，KL1位于KRS的表面，立体地防碍对层粘连蛋白受体的接近。
6.KRS-67LR的阻抑作用抑制细胞移动及癌转移。
本发明人试验了KL1如上对细胞移动及癌转移产生影响。为确认对细胞移动产生的影响，本发明人在MMP2及渗透膜分析(transwell membrane assay)中测量了不同量的KL1。在两种分析中，KL1随着处理的量而阻抑MMP2活性及细胞移动(图37至图39)。在相同的实验条件下，细胞内蛋白质合成及生存能力不受KL1处理的影响(图40及图41)，这表明，化合物处理对细胞移动的阻抑并非因蛋白质合成及细胞生存能力所导致。本发明人在KL1的存在及不存在时，执行了如上所述的癌转移实验。当以30mg/kg的剂量，每天一次，为期3周，把KL1注入小鼠时，转移的结节(nodule)数量显著减少(图42)。相反，KL1不对肿瘤生长产生影响(图43)。
【产业上利用可能性】
综上所述，本发明人查明，KRS通过与67LR相互作用，促进癌(或肿瘤)细胞的移动，影响癌的转移(metastasis)，确认了阻抑KRS及67LR相互作用的物质能够抑制癌细胞的转移，预防及治病癌。因此，本发明的组合物由于抑制癌的转移，所以提供了用于癌预防及治疗的新途径。

Claims (14)

1.一种癌预防及治疗用药物组合物，包含以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐作为有效成份：
[在上述式中，
Figure FDA00001840365800012
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、
Figure FDA00001840365800013
及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、
Figure FDA00001840365800014
构成的群中选择。]
2.根据权利要求1所述的癌预防及治疗用药物组合物，包含在由以下述物质构成的群中选择的化合物或其可允许用作药用的盐作为有效成份：
化学式2的N-(6-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(6-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)，化学式3的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)，
化学式4的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-苯基-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine)，
化学式5的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(4-乙基-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(4-ethyl-phenyl)-amine)，
化学式6的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(3,4-二氯-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(3,4-dichloro-phenyl)-amine)，
化学式7的(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-(4-苯偶氮基-苯基)-胺((5-Ni tro-benzooxazol-2-yl)-(4-phenylazo-phenyl)-amine)，化学式8的N-苯并恶唑-2-基-苯甲酰胺(N-Benzooxazol-2-yl-benzamide)，化学式9的N-(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide)，
化学式10的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)，
化学式11的N-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-benzamide)，
化学式12的N-(6-硝基-苯并噻唑基-2-基-4-三氟甲基-苯甲酰胺(N-(6-Nitro-benzothiazol-2-yl)-4-trifluoromethyl-benzamide)，
化学式13的[2-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯氧基]-乙酸([2-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-phenoxy]-acetic acid)，
化学式14的2-(2,4,6-三甲基-苯基)-苯并恶唑-5-基胺(2-(2,4,6-Trimethyl-phenyl)-benzooxazol-5-ylamine)，
化学式15的2-[2-(4-甲基-苯甲酰亚胺基)-苯并噻唑基-3-基]-丁酸(2-[2-(4-Methyl-benzoylimino)-benzothiazol-3-yl]-butyric acid)，
化学式16的2-(2,6-二甲氧基-苯基)-苯并噻唑(2-(2,6-Dimethoxy-phenyl)-benzothiazole)及
化学式17的(2-氯-4-氟-苄基)-(5-氟-1H-吲哚-3-基甲基)-胺((2-Chloro-4-fluoro-benzyl)-(5-fluoro-1H-indol-3-ylmethyl)-amine)。
Figure FDA00001840365800021
Figure FDA00001840365800031
Figure FDA00001840365800041
Figure FDA00001840365800051
Figure FDA00001840365800061
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：
所述癌在由大肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血构成的群中选择。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：
所述癌预防及治疗借助于抵制癌细胞的转移来执行。
5.一种癌转移阻抑用药物组合物，包含以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐作为有效成份：
<化学式1>
Figure FDA00001840365800062
[在上述式中，
Figure FDA00001840365800063
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、
Figure FDA00001840365800071
及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、
Figure FDA00001840365800072
构成的群中选择。]
6.根据权利要求5所述的癌转移阻抑用药物组合物，包含在由以下述物质构成的群中选择的化合物或其可允许用作药用的盐作为有效成份：
化学式2的N-(6-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(6-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式3的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式4的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-苯基-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine)、化学式5的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(4-乙基-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(4-ethyl-phenyl)-amine)、化学式6的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(3,4-二氯-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(3,4-dichloro-phenyl)-amine)、化学式7的(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-(4-苯偶氮基-苯基)-胺((5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-(4-phenylazo-phenyl)-amine),化学式8的N-苯并恶唑-2-基-苯甲酰胺(N-Benzooxazol-2-yl-benzamide)、化学式9的N-(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式10的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式11的N-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式12的N-(6-硝基-苯并噻唑基-2-基)-4-三氟甲基-苯甲酰胺(N-(6-Nitro-benzothiazol-2-yl)-4-trifluoromethyl-benzamide)、化学式13的[2-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯氧基]-乙酸([2-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-phenoxy]-acetic acid)、化学式14的2-(2,4,6-三甲基-苯基)-苯并恶唑-5-基胺(2-(2,4,6-Trimethyl-phenyl)-benzooxazol-5-ylamine)、化学式15的2-[2-(4-甲基-苯甲酰亚胺基)-苯并噻唑基-3-基]-丁酸(2-[2-(4-Methyl-benzoylimino)-benzothiazol-3-yl]-butyric acid)、化学式16的2-(2,6-二甲氧基-苯基)-苯并噻唑(2-(2,6-Dimethoxy-phenyl)-benzothiazole)及化学式17的(2-氯-4-氟-苄基)-(5-氟-1H-吲哚-3-基甲基)-胺((2-Chloro-4-fluoro-benzyl)-(5-fluoro-1H-indol-3-ylmethyl)-amine)。
7.以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的用于癌预防及治疗剂制造的用途：
Figure FDA00001840365800081
[在上述式中，
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、构成的群中选择。]
8.以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐的用于癌转移阻抑剂制造的用途：
<化学式1>
[在上述式中，
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、
Figure FDA00001840365800101
及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、
Figure FDA00001840365800102
构成的群中选择。]
9.一种癌预防及治疗方法，其特征在于：
把以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐，以有效剂量投药给需要其的个体。
Figure FDA00001840365800103
[在上述式中，
Figure FDA00001840365800104
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、
Figure FDA00001840365800111
及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、
Figure FDA00001840365800112
构成的群中选择。]
10.一种癌转移阻抑方法，其特征在于：
把以下述化学式1表示的苯并杂环衍生物或其可允许用作药用的盐，以有效剂量投药给需要其的个体。
[在上述式中，
Figure FDA00001840365800114
代表被化合价条件允许的双键或单键；
A在由O、NH及S构成的群中选择；
X为C或N；
R1在由氢、非取代或被卤素取代的烷基、烷氧基、卤素、硝基及氨基构成的群中选择；
R2在由氢、芳烃烷基、及-NH-R5构成的群中选择；
R4为氢或者非取代或被卤素取代的烷基；
R5为非取代或被卤素取代的芳基或者非取代或被卤素取代的芳烃烷基；
R3在由氢、
Figure FDA00001840365800122
构成的群中选择。]
11.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于：
以上述化学式1表示的苯并杂环衍生物是在由化学式2的N-(6-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(6-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式3的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式4的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-苯基-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine)、化学式5的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(4-乙基-苯基)-胺
((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(4-ethyl-phenyl)-amine)、化学式6的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(3,4-二氯-苯基)-胺
((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(3,4-dichloro-phenyl)-amine)、化学式7的(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-(4-苯偶氮基-苯基)-胺
((5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-(4-phenylazo-phenyl)-amine)、化学式8的N-苯并恶唑-2-基-苯甲酰胺(N-Benzooxazol-2-yl-benzamide)、化学式9的N-(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式10的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式11的N-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺(N-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式12的N-(6-硝基-苯并噻唑基-2-基)-4-三氟甲基-苯甲酰胺
(N-(6-Nitro-benzothiazol-2-yl)-4-trifluoromethyl-benzamide)、化学式13的[2-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯氧基]-乙酸
([2-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-phenoxy]-acetic acid)、化学式14的2-(2,4,6-三甲基-苯基)-苯并恶唑-5-基胺(2-(2,4,6-Trimethyl-phenyl)-benzooxazol-5-ylamine)、化学式15的2-[2-(4-甲基-苯甲酰亚胺基)-苯并噻唑基-3-基]-丁酸
(2-[2-(4-Methyl-benzoylimino)-benzothiazol-3-yl]-butyric acid)、化学式16的2-(2,6-二甲氧基-苯基)-苯并噻唑(2-(2,6-Dimethoxy-phenyl)-benzothiazole)及化学式17的(2-氯-4-氟-苄基)-(5-氟-1H-吲哚-3-基甲基)-胺
((2-Chloro-4-fluoro-benzyl)-(5-fluoro-1H-indol-3-ylmethyl)-amine)构成的群中选择的化合物。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：
以上述化学式1表示的苯并杂环衍生物是在由化学式2的N-(6-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺
(N-(6-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式3的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺
(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式4的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-苯基-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-phenyl-amine)、化学式5的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(4-乙基-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(4-ethyl-phenyl)-amine)、化学式6的(5-氯-苯并恶唑-2-基)-(3,4-二氯-苯基)-胺((5-Chloro-benzooxazol-2-yl)-(3,4-dichloro-phenyl)-amine)、化学式7的(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-(4-苯偶氮基-苯基)-胺((5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-(4-phenylazo-phenyl)-amine)、化学式8的N-苯并恶唑-2-基-苯甲酰胺
(N-Benzooxazol-2-yl-benzamide)、化学式9的N-(5-硝基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺
(N-(5-Nitro-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式10的N-(5-甲氧基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺
(N-(5-Methoxy-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式11的N-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯甲酰胺
(N-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-benzamide)、化学式12的N-(6-硝基-苯并噻唑基-2-基-4-三氟甲基-苯甲酰胺
(N-(6-Nitro-benzothiazol-2-yl)-4-trifluoromethyl-benzamide)、化学式13的[2-(5-甲基-苯并恶唑-2-基)-苯氧基]-乙酸
([2-(5-Methyl-benzooxazol-2-yl)-phenoxy]-aceticacid)、化学式14的2-(2,4,6-三甲基-苯基)-苯并恶唑-5-基胺
(2-(2,4,6-Trimethyl-phenyl)-benzooxazol-5-ylamine)、化学式15的2-[2-(4-甲基-苯甲酰亚胺基)-苯并噻唑基-3-基]-丁酸
(2-[2-(4-Methyl-benzoylimino)-benzothiazol-3-yl]-butyricacid)、化学式16的2-(2,6-二甲氧基-苯基)-苯并噻唑
(2-(2,6-Dimethoxy-phenyl)-benzothiazole)及化学式17的(2-氯-4-氟-苄基)-(5-氟-1H-吲哚-3-基甲基)-胺((2-Chloro-4-fluoro-benzyl)-(5-fluoro-1H-indol-3-ylmethyl)-amine)构成的群中选择的化合物。
13.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
上述癌在由大肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血构成的群种选择。
14.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：
上述癌在由大肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌,胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血构成的群中选择。
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