CN114502541A - 诱导抗老化基因klotho的表达的化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诱导抗老化基因klotho的表达的化合物及其制备方法，本发明的由化学式1表示的化合物提高作为老化相关基因的Klotho基因的表达量的效果优秀，由此可用作预防皮肤老化、抑制细胞老化或用于预防、治疗、改善因血管老化诱发的疾病或肾脏疾病的药物组合物、化妆品组合物或食品组合物。

Description

诱导抗老化基因KLOTHO的表达的化合物及其用途
技术领域
本发明涉及诱导抗老化基因klotho的表达的化合物及其用途。
背景技术
在1981年报告的快速老化小鼠(senescence-accelerated mice，SAM)中了解到可能存在能够调节动物的老化的基因。在交配AKR/J系列的大鼠的过程中，偶然生产的该大鼠与相同系列的大鼠相比更加快速老化，经确认，该大鼠具有多个基因变异。之后，于1990年代报告了一组与老化相关的基因。报告的基因属于RecQ家族(RecQ fami ly)，是一种表达称为DNA解旋酶(helicase)的基因。据报告，若在该基因中产生变异，则导致早衰或癌症，已知其影响DNA的修复而产生。与老化相关的单一基因为于1997年报告的klotho基因。Klotho基因在制造高血压大鼠的转化动物模型时偶然发现的，在无法表达该基因的大鼠中，发生早衰现象，寿命缩短。更有趣的是，后来增加该基因的表达的雄性大鼠的寿命延长了20.0％～30.8％，雌性的寿命延长了18.8％～19.0％。这是第一次向世界通报大鼠的寿命可根据单一基因的表达延长或缩短的事实。并且，Klotho基因的碱基序列在动物之间非常相似，据报告，大鼠和人的98％相同。这表示，人也可根据klotho基因的表达调节寿命。
在人类中，klotho基因位于第13个染色体中，生产碱基序列与β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)相似的膜蛋白。据报告，Klotho蛋白主要在肾小管上皮细胞和脑脉络丛(choroid plexus)中表达，在一些甲状旁腺中表达。Klotho基因为与各种老化的表型相关的基因，在缺乏klo tho基因的大鼠中，发生寿命缩短、活动减少、生长迟缓、动脉粥样硬化、动脉钙化、骨质疏松、生殖器不成熟、不孕不育、皮肤萎缩、肺气肿等的与老化过程相似的综合症。在Klotho变异大鼠中，从主动脉至小动脉为止的所有动脉中均观察到与人类老化引起的Monckeberg型的动脉硬化症相似的动脉硬化症，在血管新生(angiogenesis)和血管生成(vasculogenesis)中发生障碍。
Klotho mRNA在肾脏组织中的表达明显高于其他组织，但在高血压、2型糖尿病、糖尿病肾病、慢性肾功能衰竭疾病模型的大鼠肾脏中，klotho mRNA的表达降低。Klotho表达降低的大鼠中，作为血管内皮衍生的松弛因子的一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的产生减少，若使用病毒基因传递载体向同时具有许多心血管疾病的风险因素的Otsuka L ong-EvansTokushima脂肪大鼠(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rat，OLETF)注射klotho基因，则血管内膜功能障碍得以改善，增加NO的生产，抑制血管增厚和纤维化，从而降低血压。并且，klotho基因在大鼠中影响葡萄糖和胰岛素代谢，作为代表性的高胆固醇血症治疗剂他汀类药物(statins)在肾近端小管细胞中增加klotho mRNA的表达。在Klotho表达降低大鼠中，诱发成骨细胞和破骨细胞的分化障碍引起的骨转换低的骨质减少，人类年龄相关性骨质流失和老年性骨质疏松症的特征相似。并且，在Klotho突变大鼠中，观察到骨骺区骨小梁异常伸长和微型计算机断层扫描成像中的异常的骨小梁组织，这是骨吸收过程中的障碍引起的。在人类中观察到的Klotho基因突变引起的临床表型变化是多种多样的。具有Klotho基因exon2的三个位点的突变的klotho的功能变体(functional variant of klotho，KL-VS)变形与脂质代谢、血压、寿命、认知功能、冠状动脉疾病及脑血管疾病相关，Klotho基因的微卫星(microsatellite)多态性和单核苷酸基因多态性与骨密度相关。据报告，在健康成人女性中，Klotho基因的单核苷酸基因多态性还与心血管疾病的风险因素及骨密度相关。近来，由多篇论文报告了Klotho基因与阿尔茨海默氏症的关联。据报告，在阿尔茨海默氏症和痴呆症小鼠模型中，若过表达klotho，则小鼠的寿命延长30％，并抑制认知能力下降。同时观察到，通过klotho的表达，大脑中的β-淀粉样蛋白的产生减少了50％。提交了在人类中，klotho的表达量与阿尔茨海默氏症的进展成反比，klotho蛋白在阿尔茨海默氏症患者的血液中减少炎性细胞因子的量的报告。
已持续努力研发能够诱导这种具有显著的老化抑制效果的klotho基因的表达的物质。在已知物质中，据报告能够诱导klotho表达的物质包括雷帕霉素(rapamycin)、维生素D(vitamin D)、他汀类药物(statin)等。2012年，波士顿大学的研究小组通过使用达到15万个的化合物库筛选能够诱导klotho基因表达的化合物，并报告了3个化合物。本发明人在上述化合物中，选定具有作为药物的研发可能性大的结构的称为化合物H(compound H)的化合物，通过实际实验确认该化合物可在细胞中表达klotho基因，并通过论文发表了关于其作用机制的研究结果。之后，进行分析化合物H(比较例1)的结构的实验，掌握可诱导klotho表达的化合物的结构特性，并基于此制备了活性增加10倍以上的新型化合物。
老化是一种不可避免的渐进式生物过程，导致几乎所有组织和器官的功能障碍和破坏，最终导致死亡。例如，人体的老化与细胞功能的衰退有关，这可导致各种疾病的发展。老化被认为是由遗传和获得因素之间的相互作用驱动的，其特征通常在于，老化的增加、干细胞的定量和定性降低以及组织水平的异常结构。
由此，本发明人合成了用于提高Klotho基因的表达的化合物，并确认了其与以往周知的化合物相比进一步提高Klotho基因的表达，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的再一目的在于，提供由上述化学式1表示的化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于抑制细胞老化的组合物。
本发明的还有一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的化妆品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的保健功能食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的保健食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健功能食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善肾脏疾病的保健功能食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善肾脏疾病的保健食品组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供由下述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
化学式1：
Figure BDA0003580022230000051
(在上述化学式1中，L1为单键或
Figure BDA0003580022230000052
R1及R2分别为-H、-OH、C1-10的直链或侧链烷基，或者C6-8的芳基酰胺，其中，在上述芳基酰胺的芳基中，卤素、-NO2及C1-10的直链或侧链卤代烷中的一种以上可被取代；
上述R1及R2可与它们所连接的碳原子一同形成C6-8的芳基；
R3、R4、R5、R6及R7分别为-H、卤素、-NO2或C1-10的直链或侧链烷基)。
并且，本发明提供由化学式1A表示的化合物的制备方法，其如下述反应式1所示，包括下述步骤：
步骤1，将化合物2溶解于有机溶剂后，添加化合物3，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物4；以及
步骤2，向溶解有超氧化钾(Potassium superoxide)的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物4的有机溶剂后，在15℃至30℃的温度下反应10小时至16小时来获得化合物1A。
反应式1：
Figure BDA0003580022230000053
(在上述反应式1中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1A包含在权利要求1的化学式1中)。
此外，本发明提供由化学式1B表示的化合物的制备方法，其如下述反应式2所示，包括下述步骤：
步骤1：将化合物5溶解于有机溶剂后，添加化合物3，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物6；
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物6的有机溶剂后，反应12小时至24小时来获得化合物7；以及
步骤3，将化合物7溶解于有机溶剂，添加三溴化硼(BBr3)后，在常温条件下反应20小时至28小时来获得化合物1B。
反应式2：
Figure BDA0003580022230000061
(在上述反应式2中，
R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1B包含在权利要求1的化学式1中)。
并且，本发明提供由化学式1C表示的化合物的制备方法，其如下述反应式3，包括下述步骤：
步骤1，将化合物8、二硫化碳(Carbon disulfide)、碘甲烷(Iodomethane)及氢化钠(sodium hydride)溶解在有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应2小时至8小时来获得化合物9；以及
步骤2，将化合物9及化合物2溶解在有机溶剂后，反应2小时至8小时来获得化合物1C。
反应式3：
Figure BDA0003580022230000062
(在上述反应式3中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1C包含在权利要求1的化学式1中)。
此外，本发明提供由化合物1D表示的化合物的制备方法，其如下述反应式4所示，包括下述步骤：
步骤1，将化合物10及化合物3溶解在有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应20小时至28小时来获得化合物11；
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物11的有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应12小时至24小时来获得化合物12；
步骤3，将化合物12与催化剂一同添加至有机溶剂后，填充氢气，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物13；以及
步骤4，将化合物13及化合物14溶解于有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应12小时至24小时来获得化合物1D。
反应式4：
Figure BDA0003580022230000071
(在上述反应式4中，
R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义；
R8为卤素、-NO2及C1-10的直链或侧链卤代烷中的一种以上；
上述化合物1D包含在权利要求1的化学式1中)。
并且，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于抑制细胞老化的组合物。
此外，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的保健功能食品组合物。
此外，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的保健食品组合物。
并且，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物。
并且，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐及血管紧张素II受体阻断剂(angiotensin II receptor blocker)的用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物。
此外，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健功能食品组合物。
并且，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健食品组合物。
此外，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物。
并且，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善肾脏疾病的保健功能食品组合物。
此外，本发明提供包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善肾脏疾病的保健食品组合物。
发明的效果
本发明的由化学式1表示的化合物提高作为与老化相关的基因的Klotho基因的表达量的效果优秀，由此，可用作防止皮肤老化、抑制细胞老化或用于预防、改善或治疗因血管老化诱发的疾病、或者肾脏疾病的药物组合物、化妆品组合物或食品组合物。
附图说明
图1的(a)部分示出比较例1至比较例4的使用包括人klotho基因的起点至1.7kbp前为止的启动子的报告基因的荧光素酶表达实验的结果。
图1的(b)部分示出比较例1至比较例4的使用包括人klotho基因的起点至240bp前为止的启动子的报告基因的荧光素酶表达实验的结果。
图2示出实施例1至实施例6的使用包括人klotho基因的-2.1kb上游为止的启动子的报告基因的荧光素酶表达实验的结果。
图3示出实施例1至实施例3的使用包括人klotho基因的-2.1kb上游为止的启动子的报告基因的荧光素酶表达实验的结果。
图4为通过RT-PCR确认实施例1及实施例2的klotho(KL)基因的mRNA表达量的结果。
图5为确认使用实施例1至实施例2及实施例7至实施例10的化合物处理的RPTEC细胞中的klotho基因的表达的结果。
图6为确认使用实施例1、实施例9及实施例10的化合物处理的HK2细胞中的细胞毒性的结果。
图7a简要示出使用顺铂处理HK-2细胞(人肾细胞)来制备疾病模型的试验方案。
图7b为分析根据图7a的试验方案获得的HK-2细胞中的Klotho蛋白表达程度的结果。
图8a简要示出向单侧输尿管梗阻动物模型注射KS1化合物来获得实验样品的试验方案。
图8b为利用根据图8a的试验方案获得的实验样品分析肾肥大程度的结果。
图9为通过苏木精-伊红(H&E)染色确认单侧输尿管梗阻模型中的核和细胞质变化的结果。
图10为通过天狼星红(Sirius Red)染色确认单侧输尿管梗阻模型中的纤维化程度的结果。
图11为通过TUNEL染色确认单侧输尿管梗阻模型中的细胞凋亡程度的结果。
图12为分析单侧输尿管梗阻模型中的Klotho蛋白表达变化的结果。
图13为分析单侧输尿管梗阻模型中的MMP-9蛋白质表达变化的结果。
图14为分析KS1化合物的高血压降低效果的结果。
图15为分析KS1化合物的细胞老化抑制效果的结果。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
化合物或其药学上可接受的盐
本发明提供由下述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
化学式1：
Figure BDA0003580022230000101
在上述化学式1中，
L1为单键或
Figure BDA0003580022230000102
R1及R2分别为-H、-OH、C1-10的直链或侧链烷基，或者C6-8的芳基酰胺，其中，在上述芳基酰胺的芳基中，卤素、-NO2及C1-10的直链或侧链卤代烷中的一种以上可被取代；
上述R1及R2可与它们所连接的碳原子一同形成C6-8的芳基；
R3、R4、R5、R6及R7分别可以为-H、卤素、-NO2或C1-10的直链或侧链烷基。
在本发明的一实施例中，
上述L1为单键或
Figure BDA0003580022230000103
R1及R2分别为-H、-OH、C1-5的直链或侧链烷基，或者C6-7的芳基酰胺，其中，在上述芳基酰胺的芳基中，卤素、-NO2及C1-5的直链或侧链卤代烷中的一种以上可被取代；
上述R1及R2可与它们所连接的碳原子一同形成C6-7的芳基；
R3、R4、R5、R6及R7分别可以为-H、卤素、-NO2或C1-5的直链或侧链烷基。
在本发明的一实施例中，
上述L1为单键或
Figure BDA0003580022230000111
R1及R2分别为-H、-OH、-CH3或苯基酰胺，其中，在上述苯基酰胺的苯基中，-Cl、-NO2及-CH2Cl中的一种以上可被取代；
上述R1及R2可与它们所连接的碳原子一同形成苯基；
R3、R4、R5、R6及R7分别可以为-H、-F、-Cl、-NO2或-CH2CH3。
在本发明的一实施例中，
上述L1为单键或
Figure BDA0003580022230000112
R1为-H、-OH、-CH3、
Figure BDA0003580022230000113
R2为-H；
上述R1及R2可与它们所连接的碳原子一同形成苯基；
R3为-H或-Cl；
R4为-H、-F或-Cl；
R5为-F、-Cl、-NO2或-CH2CH3；
R6为-H；
R7可以为-H。
作为本发明的由化学式1表示的化合物的优选例，可例举下述化合物组。
1)N-(苯并[d]恶唑-2-基)-2-氯-4-硝基苯甲酰胺；
2)8-甲基-2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑；
3)2-((3,4-二氯苯基)氨基)苯并[d]恶唑-5-醇；
4)N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-2-氯-5-硝基苯甲酰胺；
5)N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3,4-二氯苯甲酰胺；
6)N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3-(氯甲基)苯甲酰胺；
7)2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑；
8)N-(3,4-二氯苯基)萘并[2,3-d]恶唑-2-胺；
9)N-(3,4-二氟苯基)-5-甲基苯并[d]恶唑-2-胺；以及
10)N-(3,4-二氟苯基)苯并[d]恶唑-2-胺。
本发明的由上述化学式1表示的化合物能够以药学上可接受的盐的形式使用，作为盐，通过药学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸加成盐是有用的。表述“药学上可接受的盐”是指以对于患者具有比较无毒无害的有效作用的浓度，该盐引起的副作用不会降低化学式1的碱性化合物的有利功效的化学式1的碱性化合物的任何有机加成盐或无机加成盐。针对这些盐，作为游离酸可使用无机酸和有机酸，作为无机酸可使用盐酸、溴酸、硝酸、硫酸、高氯酸、磷酸等，作为有机酸可使用柠檬酸、乙酸、乳酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、酒石酸、半乳糖醛酸、扑酸、谷氨酸、天冬氨酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、4-甲苯磺酸、水杨酸、柠檬酸、苯甲酸或丙二酸等。并且，这些盐包括碱金属盐(钠盐、钾盐等)及碱土金属盐(钙盐、镁盐等)等。例如，作为酸加成盐可包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸酯、硼酸盐、右旋樟脑磺酸、柠檬酸、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸酯、六氟磷酸盐、高苯甲酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟醋酸盐、铝、精氨酸、苄星、钙、胆碱、二乙胺、二醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、醇胺、钾、钠、氨丁三醇、锌盐等，其中，优选为盐酸盐或三氟醋酸盐。
并且，本发明的由上述化学式1表示的化合物不仅包含药学上可接受的盐，还包含可通过通常的方法制备的所有盐、异构体、水合物及溶剂化物。
本发明的加成盐可通过通常的方法制备，例如，化学式1的化合物可通过将水溶性有机溶剂，溶解在如丙酮、甲醇、乙醇或乙腈等并添加过量的机酸或者添加无机酸的酸水溶液后，沉淀或结晶来制备。接着，在该混合物中，蒸发掉溶剂或过量的酸后，进行干燥来获得加成盐，或者可通过抽滤析出的盐来制备。
制备方法1
本发明提供由化学式1A表示的化合物的制备方法，其如下述反应式1，包括下述步骤：
步骤1，将化合物2溶解于有机溶剂后，添加化合物3，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物4；以及
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物4的有机溶剂后，在15℃至30℃的温度下反应10小时至16小时来获得化合物1A。
反应式1：
Figure BDA0003580022230000131
在上述反应式1中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1A包含在权利要求1的化学式1中。
在本发明的制备方法中，作为上述有机溶剂的例，可单独使用或混合使用甲醇(MeOH)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、1,2-二甲氧基乙烷、苯、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜(DMSO)或二恶烷。
在本发明的制备方法中，作为可通过上述制备方法制备的化合物的例，可以为8-甲基-2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑、2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑、N-(3,4-二氯苯基)萘并[2,3-d]恶唑-2-胺、N-(3,4-二氟苯基)-5-甲基苯并[d]恶唑-2-胺或N-(3,4-二氟苯基)苯并[d]恶唑-2-胺。
制备方法2
本发明提供由化学式1B表示的化合物的制备方法，其如下述反应式2所示，包括下述步骤：
步骤1，将化合物5溶解于有机溶剂后，添加化合物3，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物6；
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物6的有机溶剂后，反应12小时至24小时来获得化合物7；以及
步骤3，将化合物7溶解于有机溶剂，添加三溴化硼后，在常温条件下反应20小时至28小时来获得化合物1B。
反应式2：
Figure BDA0003580022230000141
在上述反应式2中，
R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1B包含在权利要求1的化学式1中。
在本发明的制备方法中，作为上述有机溶剂的例，可单独使用或混合使用甲醇、二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、苯、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜或二恶烷。
在本发明的制备方法中，作为可通过上述制备方法制备的化合物的例，可以为2-((3,4-二氯苯基)氨基)苯并[d]恶唑-5-醇。
制备方法3
本发明提供由化学式1C表示的化合物的制备方法，其如下述反应式3所示，包括下述步骤：
步骤1，将化合物8、二硫化碳、碘甲烷、及氢化钠溶解在有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应2小时至8小时来获得化合物9；以及
步骤2，将化合物9及化合物2溶解在有机溶剂后，反应2小时至8小时来获得化合物1C。
反应式3：
Figure BDA0003580022230000151
在上述反应式3中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1C包含在权利要求1的化学式1中。
在本发明的制备方法中，作为上述有机溶剂的例，可单独使用或混合使用甲醇、二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、苯、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜或二恶烷。
在本发明的制备方法中，作为可通过上述制备方法制备的化合物的例，可以为N-(苯并[d]恶唑-2-基)-2-氯-4-硝基苯甲酰胺。
制备方法4
本发明提供由化合物1D表示的化合物的制备方法，其如下述反应式4所示，包括下述步骤：
步骤1，将化合物10及化合物3溶解在有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应20小时至28小时来获得化合物11；
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物11的有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应12小时至24小时来获得化合物12；
步骤3，将化合物12与催化剂一同添加至有机溶剂后，填充氢气，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物13；以及
步骤4，将化合物13及化合物14溶解于有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应12小时至24小时来获得化合物1D。
反应式4：
Figure BDA0003580022230000161
在上述反应式4中，
R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义；
R8为卤素、-NO2及C1-10的直链或侧链卤代烷中的一种以上；
上述化合物1D包含在权利要求1的化学式1中。
在本发明的制备方法中，作为上述有机溶剂的例，可单独使用或混合使用甲醇、二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、苯、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜或二恶烷。
在本发明的制备方法中，作为可通过上述制备方法制备的化合物的例，可以为N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-2-氯-5-硝基苯甲酰胺、N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3,4-二氯苯甲酰胺或N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3-(氯甲基)苯甲酰胺。
用于抑制细胞老化的组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于抑制细胞老化的组合物。
在本发明的组合物中，上述细胞可以为肾近端肾小管上皮细胞，并不局限于此。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
用于预防或改善皮肤老化的化妆品组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的化妆品组合物。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
本发明的化妆品组合物可通过包含上述的本发明的有效物质的化妆品有效量(cosmetically effective amount)及化妆品可接受的载体来制备。
本发明一实施例的上述化妆品组合物的剂型并没有特别限定，可剂型化为化妆水、化妆乳、爽肤水、收敛剂、乳液、乳霜型乳液、保湿乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、眼霜、保湿霜、护手霜、精华液、滋养精华液、面膜、洁面泡沫、洁面水、洁面乳、洁面霜、身体乳、沐浴露、香皂或粉饼等化妆品。
在本发明的剂型为糊剂、霜剂或凝胶的情况下，作为载体成分可使用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
在本发明的剂型为粉末或喷雾剂的情况下，作为载体成分可使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，尤其，在喷雾剂的情况下，还可包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。
在本发明的剂型为溶液或乳状液的情况下，作为载体成分可使用溶剂、溶解剂或乳化剂，例如，有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。
在本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分可使用如水、乙醇或丙二醇的液相稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯的悬浮剂、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等。
在本发明的剂型为含表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体成分可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、亚麻油衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
用于预防或改善皮肤老化的保健功能食品或保健食品组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善皮肤老化的保健功能食品或保健食品组合物。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
食品的种类没有特别限制。可添加本发明的有效物质的食品的例，有饮剂、肉类、香肠、面包、脆饼干、糕、巧克力、糖果、零食、饼干、披萨、拉面、其他面类、口香糖、包括雪糕的乳制品、各种汤、饮料、酒精饮料及微生物复合物、乳制品及乳加工制品等，可包括通常含义的保健食品及保健功能食品。
包含本发明的有效物质的保健食品及保健功能食品组合物可直接添加至食品或者与其他食品或食品成分一同使用，可根据通常的方法适当使用。有效物质的混合量可根据其使用目的(用于预防或改善)适当确定。通常，相对于整个食品总量，可添加0.1重量份至90重量份的保健食品及保健功能食品中的上述组合物。但是，在以保持健康为目的或控制健康而长期摄入的情况下，上述量可在上述范围以下，由于在安全性方面没有任何问题，有效物质还能够以上述范围以上的量使用。
本发明的保健食品及保健功能食品组合物以所指示的比例包含本发明的有效物质作为必须成分，此外，其他成分没有特殊限制，如通常的饮料，还可包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为追加成分。作为上述的天然碳水化合物的例，有如单糖、二糖及多糖的常规糖以及如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇，上述单糖如葡萄糖、果糖等，上述二糖如麦芽糖、蔗糖等，上述多糖如糊精、环糊精等。作为除上述之外的调味剂，可有利地使用天然调味剂(索马甜)、甜菊提取物(例如，菜鲍迪甙A、甘草甜素等)及合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。上述天然碳水化合物的比例如下，每100g的本发明的保健功能食品组合物，通常约为1g至20g，优选约为5g至12g。
除上述成分之外，包含本发明的有效物质的保健食品及保健功能食品组合物可包含各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等的风味剂、着色剂及增量剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶状增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油，醇、用于碳酸化饮料中的碳酸剂等。除此之外，本发明的保健食品及保健功能食品组合物可包含用于制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。
可单独使用或组合使用这种成分。这种添加剂的比例虽不重要，通常，相对于100重量份的包含本发明的有效物质的保健食品及保健功能食品组合物，可在0.1重量份至约20重量份的范围选择。
用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
并且，本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐及血管紧张素II受体阻断剂的用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物。具体地，上述血管紧张素II受体阻断剂可包含选自由氯沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、阿齐沙坦(azilsartan)及奥美沙坦(olmesartan)组成的组中的一种以上，但并不局限于此。
在与由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐一同联合给药以往用作高血压治疗剂的血管紧张素II受体阻断剂药物的情况下，与单独给药各个药物时相比，可显示出更好的血压减少效果。
在本发明的组合物中，上述因血管老化诱发的疾病可以为高血压、心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、前列腺增生、血管痉挛、血栓形成、脑梗塞或脑出血。
本发明的化合物在临床给药时能够以口服及肠胃外给药的多种剂型给药，在制剂化的情况下，通过使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制备。
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂等，这种固体制剂通过在一种以上的本发明的化合物混合至少一种如淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)或明胶等的赋形剂来配置。并且，除了简单的赋形剂之外，还使用如硬脂酸镁滑石粉的润滑剂。作为用于口服给药的液相制剂，包括悬浮剂、内服溶液剂、乳剂或糖浆剂等，除如水、液体石蜡的经常使用的简单稀释剂之外，还可包含各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等。
作为用于肠胃外给药的制剂，包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冷冻干燥制剂、栓剂等。作为非水溶液、悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油的植物油、如油酸乙酯的可注射的酯等。作为栓剂的基质，可使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可油脂、月桂酸甘油酯、甘油、明胶等。
并且，本发明的化合物对于人体的有效剂量可根据患者的年龄、体重、性别、给药形式、健康状态及疾病程度不同，通常，约为0.001mg/kg/天～100mg/kg/天，优选为0.01mg/kg/天～35mg/kg/天。当以体重为70kg的成人患者为基准时，通常为0.07mg/天～7000mg/天，优选为0.7mg/天～2500mg/天，还可根据医生或药师的判断以规定时间间隔一天给药一次或者一天给药数次。
用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健功能食品或保健食品组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健功能食品或保健食品组合物。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
在本发明的组合物中，上述因血管老化诱发的疾病可以为高血压、心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、前列腺增生、血管痉挛、血栓形成、脑梗塞或脑出血。
用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
在本发明的组合物中，上述肾脏疾病可以为肾炎、肾盂炎、肾病综合征、急性肾盂肾炎、慢性肾盂肾炎、尿路感染、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、急性进行性肾炎、肾病综合症、小肾小球硬化、膜性肾病或膜性增生性肾小球肾炎。
用于预防或改善肾脏疾病的保健功能食品或保健食品组合物
本发明提供包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐的用于预防或改善肾脏疾病的保健功能食品或保健食品组合物。
在本发明的组合物中，上述组合物可提高Klotho基因的表达量。
在本发明的组合物中，上述肾脏疾病可以为肾炎、肾盂炎、肾病综合征、急性肾盂肾炎、慢性肾盂肾炎、尿路感染、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、急性进行性肾炎、肾病综合症、小肾小球硬化、膜性肾病或膜性增生性肾小球肾炎。
以下，通过下述实施例更详细地说明本发明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1：N-(苯并[d]恶唑-2-基)-2-氯-4-硝基苯甲酰胺(N-(Benzo[d]oxazol-2-yl)-2-chloro-4-nitrobenzamide，FCCS-17064)的制备
Figure BDA0003580022230000211
步骤1：二甲基(2-氯-4-硝基苯甲酰基)亚氨基二硫代碳酸酯(Dimethyl(2- chloro-4-nitrobenzoyl)carbonimidodithioate，17064-2-1)的制备
将2-氯-4-硝基苯甲酰胺(2-Chloro-4-nitrobenzamide)(500mg，2.49mmol)、二硫化碳(Carbon disulfide，CS2)(759mg，9.97mmol)、碘甲烷(1.13g，7.97mmol)溶解于二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide)(7mL)后，添加60％的氢化钠(200mg，4.98mmol)，在室温下搅拌5小时。
向反应混合物缓慢加入冰冷的水(ice-cold water)并提取乙酸乙酯(ethylacetate)。利用盐水洗涤有机层，利用Na2SO4干燥后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(Silica-gel column chromatrogra phy)(10％的乙酸乙酯(Ethyl acetate)/正己烷(n-hexane))纯化反应混合物来获得了浅黄色固体的二甲基(2-氯-4-硝基苯甲酰基)亚氨基二硫代碳酸酯(160mg，21％)。
1H NMR(400MHz,acetone-d6)；δ8.34(d,1H,J＝2.0Hz),8.29(dd,1H,J＝2.4,8.8Hz),8.20(d,1H,J＝8.4Hz),2.65(s,6H)。
步骤2：N-(苯并[d]恶唑-2-基)-2-氯-4-硝基苯甲酰胺(N-(Benzo[d]oxazol-2- yl)-2-chloro-4-nitrobenzamide，FCCS-17064)的制备
将在上述步骤1中获得的二甲基(2-氯-4-硝基苯甲酰基)亚氨基二硫代碳酸酯(150mg，0.49mmol)溶解在二甲基甲酰胺(15mL)后，添加2-氨基苯酚(2-aminophenol)(53mg，0.49mmol)。
将反应混合物环流6小时后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(40％的乙酸乙酯/正己烷)纯化向反应混合物添加二乙醚(die thyl ether)并过滤沉淀的固体而获得固体，从而获得了褐色固体的目标化合物N-(苯并[d]恶唑-2-基)-2-氯-4-硝基苯甲酰胺(70mg，30％)。
1H NMR(400MHz,acetone-d6)；δ8.36(d,1H,J＝2.0Hz),8.33(dd,1H,J＝2.0,8.4Hz),8.09(d,1H,J＝8.4Hz),7.62-7.56(m,2H),7.40-7.33(m,2H)。
实施例2：8-甲基-2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑(8-Methyl-2-[N-(3,4-dichlorophenyl)]aminobenzoxazole，FCCS-17065)的制备
Figure BDA0003580022230000221
步骤1：1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基-5-甲基苯基)硫脲(1-(3,4- Dichlorophenyl)-3-(2-hydroxy-5-methylphenyl)thiourea，17065-2-1)的制备
将2-氨基-p-甲酚(2-Amino-p-cresol)(300mg，2.44mmol)溶解于甲醇(methanol)(12mL)后，添加3,4-二氯苯基异硫氰酸酯(3,4-dichlolrophenyl isothiocyanate)(497mg，2.44mmol)并在室温条件下搅拌18小时。利用薄层色谱(thin layerchromatography，TLC)确认反应完成后，在冰箱(0℃～4℃)中冷却(cooling)。过滤沉淀的固体来获得了白色固体(346mg)的1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基-5-甲基苯基)硫脲，未经进一步纯化直接用于下一步骤。
1H NMR(400MHz,acetone-d6)；δ7.98(dd,1H,J＝0.4,2.0Hz),7.55-7.50(m,2H),7.43(br s,1H),6.94-6.90(m,1H),6.85(d,1H,J＝8.4Hz)2.24(s,3H)。
步骤2：8-甲基-2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑(8-Methyl-2-[N-(3,4- dichlorophenyl)]aminobenzoxazole，FCCS-17065)的制备
向超氧化钾(Potassium superoxide，KO2)(375mg，5.29mmol)、乙腈(acetonitrile，MeCN)(15mL)的溶液，缓慢添加将在上述步骤1中获得的1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基-5-甲基苯基)硫脲(346mg，1.06mmol)溶解在乙腈(25mL)的溶液后，在室温条件下搅拌18小时。
向反应混合物添加二氯甲烷(dichloromethane)和水并提取。利用盐水洗涤有机层，利用Na2SO4干燥后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(10％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了白色固体的目标化合物8-甲基-2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑(170mg，24％，步骤2)。
1H NMR(400MHz,acetone-d6)；δ8.29(d,1H,J＝2.8Hz),7.73(dd,1H,J＝2.8,8.8Hz),7.76(d,1H,J＝8.8Hz),7.32-7.20(m,1H),7.28(d,1H,J＝8.0Hz),7.00-6.970(m,1H),2.41(s,3H)。
实施例3：2-((3,4-二氯苯基)氨基)苯并[d]恶唑-5-醇(2-((3,4-dichlorophenyl)amino)benzo[d]oxazol-5-ol，FCCS-17066)的制备
Figure BDA0003580022230000231
步骤1：1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)硫脲(1-(3,4- Dichlorophenyl)-3-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)thiourea，17066-3-1)的制备
将2-氨基-4-甲氧基苯酚(2-Amino-4-methoxyphenol)(1.13g，8.12mmol)溶解于甲醇(40mL)后，添加3,4-二氯苯基异硫氰酸酯(1.99g，9.74mmol)，在室温条件下搅拌18小时。利用薄层色谱确认反应完成后，在冰箱(0℃～4℃)中冷却。过滤沉淀的固体来获得了褐色固体(2g)的1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)硫脲，未经进一步纯化直接用于下一步骤。
1H NMR(400MHz,methanol-d4)；δ7.82(d,1H,J＝2.4Hz),7.48-7.44(m,2H),7.39(dd,1H,J＝1.4,8.8Hz),6.81(d,1H,J＝8.8Hz),6.66(dd,1H,J＝1.6,8.8Hz),3.73(s,3H)。
步骤2：N-(3,4-二氯苯基)-5-甲氧基苯并[d]恶唑-2-胺(N-(3,4- dichlorophenyl)-5-methoxybenzo[d]oxazol-2-amine，17066-3-2)的制备
向超氧化钾(540mg，7.6mmol)、乙腈(20mL)的溶液，缓慢添加将在上述步骤1中获得的17066-3-1(525mg，1.52mmol)溶解在乙腈(30mL)的溶液后，在室温条件下搅拌18小时。向反应混合物添加二氯甲烷和水并提取。利用盐水洗涤有机层，利用Na2SO4干燥后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(20％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了褐色固体的N-(3,4-二氯苯基)-5-甲氧基苯并[d]恶唑-2-胺(230mg，35％)。
1H NMR(400MHz,acetone-d6)；δ8.29(d,1H,J＝2.4Hz),7.70(dd,1H,J＝2.4,8.8Hz),7.55(d,1H,J＝8.8Hz),7.30(d,1H,J＝8.8Hz),7.08(d,1H,J＝2.8Hz),7.74(dd,1H,J＝2.4,8.8Hz),3.84(s,3H)。
步骤3：2-((3,4-二氯苯基)氨基)苯并[d]恶唑-5-醇(2-((3,4-dichlorophenyl) amino)benzo[d]oxazol-5-ol，FCCS-17066)的制备
Ar气体气氛下，将在上述步骤2中获得的17066-3-2(200mg，0.65mmol)溶解于二氯甲烷(15mL，无水(anhydrous))后，在冰浴(ice-bath)中冷却。缓慢添加三溴化硼(3.23mL，1.0M的二氯甲烷溶液(dichloromethane))，将温度升温至室温后搅拌24小时。缓慢添加氢氧化钠(NaOH)溶液(8mL，1.0M的水)来完成反应，移至分液漏斗(separatory funnel)来分离有机层和水层。利用乙酸乙酯提取水层后，利用Na2SO4干燥，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(40％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得褐色固体的目标化合物2-((3,4-二氯苯基)氨基)苯并[d]恶唑-5-醇(97mg，50％)。
1H NMR(400MHz,acetone-d6)；δ8.29(br s,-OH),8.26(d,1H,J＝2.4Hz),7.72(dd,1H,J＝2.4,8.8Hz),7.56(d,1H,J＝8.8Hz),7.21(dd,1H,J＝2.0,7.2Hz),6.95(d,1H,J＝2.0Hz),6.66(dd,1H,J＝2.4,8.8Hz)。
实施例4：N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-2-氯-5-硝基苯甲酰胺(N-(2-(4-Ethylphenylamino)benzo[d]oxazol-5-yl)-2-chloro-5-nitrobenzamide，FCCS-17067)的制备
Figure BDA0003580022230000251
步骤1：1-(4-乙基苯基)-3-(2-羟基-5-硝基苯基)硫脲(1-(4-ethylphenyl)-3- (2-hydroxy-5-nitrophenyl)thiourea，Interm-3-1)的制备
将2-氨基-4-硝基苯酚(2-Amino-4-nitrophenol)(1.88g，12.25mmol)和4-乙基苯基异硫氰酸酯(4-ethylphenyl isothiocyante)(2g，12.25mmol)溶解于甲醇(80mL)后，在室温条件下搅拌一天。在减压条件下去除溶剂后，利用硅胶柱色谱(20％的乙酸乙酯/正己烷)纯化来获得了褐色固体的1-(4-乙基苯基)-3-(2-羟基-5-硝基苯基)硫脲(2.9g，65％)。
1H NMR(400MHz,methanol-d4)；δ9.24(d,1H,J＝2.8Hz),7.88(dd,1H,J＝2.0,9.2Hz),7.36(d,2H,J＝8.4Hz),7.25(d,2H,J＝8.8Hz),6.94(d,1H,J＝9.2Hz),2.66(q,2H,J＝7.6Hz),1.24(t,3H,J＝7.6Hz)。
步骤2：N-(4-乙基苯基)-5-硝基苯并[d]恶唑-2-胺(N-(4-ethylphenyl)-5- nitrobenzo[d]oxazol-2-amine，Interm-3-2)的制备
在冰浴中冷却超氧化钾(2.8g，39.38mmol)、乙腈(130mL)的溶液后，缓慢添加将在上述步骤1中获得的Interm-3-1(2.5g，7.88mm ol)溶解于乙腈(170mL)的溶液，在室温条件下搅拌18小时。向反应混合物添加二氯甲烷和水并提取。利用盐水洗涤有机层，利用Na2SO4干燥后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(10％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了褐色固体的化合物Interm-3-2(1.78g，80％)。
1H NMR(400MHz,methanol-d4)；δ8.20(d,1H,J＝1.0Hz),8.08(dd,1H,J＝0.8,9.6Hz),7.59(d,2H,J＝8.8Hz),7.51(d,1H,J＝8.8Hz),7.22(d,2H,J＝8.8Hz),2.64(q,2H,J＝7.6Hz),1.24(t,3H,J＝7.6Hz)。
步骤3：N-(4-乙基苯基)苯并[d]恶唑-2,5-二胺(N-(4-ethylphenyl)benzo[d] oxazole-2,5-diamine，Interm-3-3)的制备
将钯碳(Palladium on carbon，Pd/C)(1.70g，0.80mmol，10重量百分比，湿载体(wet support))称量并添加至圆烧瓶(round-flask)后，利用Ar气体吹洗(purging)。向其缓慢添加将在上述步骤2中获得的Interm-3-2(1.58g，5.30mmol)溶解在甲醇(80mL)的溶液后，利用H2(g)取代。在将H2(g)鼓泡(bubbling)的同时在室温条件下搅拌18小时。利用薄层色谱确认反应完成后，利用硅藻土片(Celite pad)过滤，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(40％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了浅褐色固体的化合物Interm-3-3(1.21g，90％)。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)；δ7.71(m,2H),7.19(m,2H),7.03(dd,1H,J＝0.8,8.4Hz),6.75(dd,1H,J＝0.8,2.0Hz),6.44(dd,1H,J＝2.0,8.4Hz),2.60(q,2H,J＝7.6Hz),1.19(t,3H,J＝7.6Hz)。
步骤4：N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-2-氯-5-硝基苯甲酰胺(N- (2-(4-Ethylphenylamino)benzo[d]oxazol-5-yl)-2-chloro-5-nitrobenzamide，FCCS- 17067)的制备
将在上述步骤3中获得的Interm-3-3(253mg，1mmol)、2-氯-5-硝基苯甲酰氯(2-chloro-5-nitrobenzoyl chloride)(220mg，1mmol)溶解于二甲基甲酰胺(4mL)后，添加二异丙基乙胺(diisopropylethylamine，DIPEA)(129mg，1mmol)，在室温条件下搅拌18小时。18小时后，各0.5当量的2-氯-5-硝基苯甲酰氯和二异丙基乙胺，并还搅拌8小时。向反应混合物添加10％的HCl(aq.)，并利用乙酸乙酯提取后，利用饱和的NaHCO3水溶液和盐水依次洗涤有机层。利用Na2SO4干燥有机层后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(40％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得浅黄色固体的目标化合物N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-2-氯-5-硝基苯甲酰胺(120mg，27％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)；δ10.71(s,1H),10.53(s,1H),8.48(d,1H,J＝2.8Hz),8.34(dd,1H,J＝2.4,8.8Hz),7.90(d,1H,J＝8.8Hz),7.82(d,1H,J＝2.0Hz),7.64(d,2H,J＝8.8Hz),7.46(d,1H,J＝8.8Hz),7.40(dd,1H,J＝2.0,8.4Hz),7.21(d,1H,J＝8.8Hz),2.58(q,2H,J＝7.6Hz),1.18(t,3H,J＝7.6Hz)。
实施例5：N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3,4-二氯苯甲酰胺(N-(2-(4-Ethylphenylamino)benzo[d]oxazol-5-yl)-3,4-dichlorobenzamide，FCCS-17068)的制备
Figure BDA0003580022230000271
将在上述实施例4的步骤3中获得的Interm-3-3(253mg，1mmol)、3,4-二氯苯甲酰氯(3,4-dichlorobenzoyl chloride)(209mg，1mmol)溶解于二甲基甲酰胺(4mL)后，添加二异丙基乙胺(129mg，1mmol)，在室温条件下搅拌18小时。向反应混合物添加10％的HCl(aq.)，并利用乙酸乙酯提取后，利用饱和的NaHCO3水溶液和盐水依次洗涤有机层。利用Na2SO4干燥有机层后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(40％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了浅白色固体的目标化合物FCCS-17068(270mg，64％)。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)；δ8.18(d,1H,J＝2.4Hz),7.99(t,1H,J＝2.4Hz),7.97(d,1H,J＝2.0Hz),7.80-7.20(m,3H),7.70-7.50(m,1H),7.35(d,1H,J＝8.8Hz),7.24(d,1H,J＝8.8Hz),2.63(q,2H,J＝7.6Hz),1.22(t,3H,J＝7.6Hz)。
实施例6：N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3-(氯甲基)苯甲酰胺(N-(2-(4-Ethylphenylamino)benzo[d]oxazol-5-yl)-3-(chloromethyl)benzamide，FCCS-17069)的制备
Figure BDA0003580022230000281
将在上述实施例4的步骤3中获得的Interm-3-3(253mg，1mmol)、3-(氯甲基)苯甲酰氯(3-(chloromethyl)benzoyl chloride)(189mg，1mmol)溶解在二甲基甲酰胺(4mL)后，添加二异丙基乙胺(129mg，1mmol)，在室温条件下搅拌18小时。向反应混合物添加10％的HCl(aq.)，并利用乙酸乙酯提取后，利用饱和的NaHCO3水溶液和盐水依次洗涤有机层。利用Na2SO4干燥有机层后，在减压条件下去除溶剂。利用硅胶柱色谱(30％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了浅白色固体的目标化合物FCCS-17069(170mg，40％)。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)；δ8.08(t,1H,J＝1.2Hz),8.03(d,1H,J＝2.0Hz),7.98(dt,1H,J＝1.2,7.6Hz),7.80-7.75(m,2H),7.69-7.65(m,1H),7.57-7.52(m,3H),7.34(d,1H,J＝8.8Hz),7.26-7.22(m,2H),2.62(q,2H,J＝7.6Hz),1.22(t,3H,J＝7.6Hz)。
实施例7：2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑(2-[N-(3,4-dichlorophenyl)]aminobenzoxazole，FCCS-17065-A)的制备
Figure BDA0003580022230000282
步骤1：1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基苯基)硫脲(1-(3,4-dichlorophenyl)-3- (2-hydroxyphenyl)thiourea，FCCS-17065-A-2-1)的制备
在Ar气体气氛下，向2-氨基苯酚(2-Aminophenol)(300mg，2.749mmol)添加并溶解甲醇(无水MeOH)(8mL)后，缓慢滴加3,4-二氯苯基异硫氰酸酯(3,4-dichlorophenylisothiocyanate)(0.47mL，3.299mmol)，在常温条件下搅拌14小时。利用薄层色谱确认来确认了起始物质全部消失，并通过减压来去除溶剂后，向粗品(crude)添加二氧化硅(silica)来吸附，执行硅胶柱色谱(30％的EtOAc/己烷(hexane)，Rf＝0.4)来获得了793mg(浅褐色泡沫状的固体(light brown foamy solid)，92％)的1-(3,4-二氯苯基)-3-(2-羟基苯基)硫脲。
1H NMR(400MHz,CD3OD)；δ7.82(d,1H,J＝2.8Hz),7.63(d,1H,J＝7.6Hz),7.45(d,1H,J＝8.8Hz),7.39(dd,1H,J＝8.6,2.2Hz),7.11-7.06(m,1H),6.90(dd,1H,J＝8.0,1.2Hz),6.85(td,1H,J＝7.6,1.2Hz)。
步骤2：2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑(2-[N-(3,4-dichlorophenyl)] aminobenzoxazole，FCCS-17065-A)的制备
在Ar气体气氛下，添加在上述步骤1中获得的FCCS-17065-A-2-1(400mg，1.277mmol)和超氧化钾(454mg，6.386mmol)，并添加乙腈(48mL)，在常温条件下搅拌14小时。利用薄层色谱确认来确认了起始物质全部消失后，向粗品添加二氧化硅并吸附减压。执行硅胶柱色谱(20％的EtOAc/己烷，Rf＝0.4)来获得了231mg(白色固体(white solid)，65％)的目标化合物2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑。
1H NMR(400MHz,CD3OD)；δ8.06(d,1H,J＝2.8Hz),7.55(dd,1H,J＝8.6,2,6Hz),7.48-7.45(m,2H),7.39(d,1H,J＝8.0Hz),7.24(td,1H,J＝7.6,1.2Hz),7.16(td,1H,J＝7.8,1.2Hz)。
实施例8：N-(3,4-二氯苯基)萘并[2,3-d]恶唑-2-胺(N-(3,4-dichlorophenyl)naphtho[2,3-d]oxazol-2-amine，FCCS-17065-B)的制备
Figure BDA0003580022230000301
步骤1：1-(4,5-二氯苯基)-3-(3-羟基萘-2-基)硫脲(1-(3,4-dichlorophenyl)- 3-(3-hydroxynaphthalen-2-yl)thiourea，FCCS-17065-B-2-1)的制备
在Ar气体气氛下，向3-氨基-2-萘酚(3-Amino-2-naphthol)(350mg，2.119mmol)添加甲醇(无水MeOH)(7mL)和氯仿(chloroform，CHCl3)(2mL)，在常温条件下搅拌5分钟后，缓慢滴加3,4-二氯苯基异硫氰酸酯(0.38mL，2.638mmol)，并在常温条件下搅拌13小时。利用薄层色谱确认来确认了起始物质全部消失，通过减压去除溶剂后，添加二氯甲烷(8mL)并搅拌5分钟，并过滤未溶解的固体来获得了792mg(白色固体，99％)的1-(4,5-二氯苯基)-3-(3-羟基萘-2-基)硫脲。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)；δ10.48(s,1H),10.34(s,1H),9.57(s,1H),8.59(s,1H),8.05(d,1H,J＝2.0Hz),7.73(d,1H,J＝8.0Hz),7.67(d,1H,J＝7.6Hz),7.60(d,1H,J＝8.4Hz),7.52(dd,1H,J＝8.6,2.2Hz),7.35(t,1H,J＝7.2Hz),7.27(t,1H,J＝7.6Hz),7.24(s,1H)。
步骤2：N-(3,4-二氯苯基)萘并[2,3-d]恶唑-2-胺(N-(3,4-dichlorophenyl) naphtho[2,3-d]oxazol-2-amine，FCCS-17065-B)的制备
在Ar气体气氛下，添加在上述步骤1中获得的FCCS-17065-B-2-1(400mg，1.101mmol)和超氧化钾(391mg，5.505mmol)，添加乙腈(42mL)并在常温条件下搅拌14小时。利用薄层色谱确认来确认起始物质全部消失后，向粗品添加二氧化硅并吸附减压。执行硅胶柱色谱(20％的EtOAc/己烷，Rf＝0.5)来获得了236mg(白色固体，65％)的目标化合物N-(3,4-二氯苯基)萘并[2,3-d]恶唑-2-胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)；δ11.22(s,1H),8.20(d,1H,J＝2.0Hz),7.98-7.95(m,4H),7.72(dd,1H,J＝8.8,2.4Hz),7.66(d,1H,J＝8.4Hz),7.47-7.41(m,2H)。
实施例9：N-(3,4-二氟苯基)-5-甲基苯并[d]恶唑-2-胺(N-(3,4-difluorophenyl)-5-methylbenzo[d]oxazol-2-amine，FCCS-17065-C)的制备
Figure BDA0003580022230000311
步骤1：1-(3,4-二氟苯基)-3-(2-羟基-5-甲基苯基)硫脲(1-(3,4- difluorophenyl)-3-(2-hydroxy-5-methylphenyl)thiourea，FCCS-17065-C-2-1)的制备
在Ar气体气氛下，向2-氨基-p-甲酚(300mg，2.436mmol)添加并溶解甲醇(无水MeOH)(8mL)后，缓慢滴加3,4-二氟苯基异硫氰酸酯(3,4-difluorophenylisothiocyanate)(0.37mL，2.923mmol)，在常温条件下搅拌13小时。利用薄层色谱确认来确认起始物质全部消失，通过减压去除溶剂后，向粗品添加二氧化硅并吸附，执行硅胶柱色谱(30％EtOAc/己烷，Rf＝0.4)来获得了710mg(白色泡沫状固体(white foamy solid)，99％)的1-(3,4-二氟苯基)-3-(2-羟基-5-甲基苯基)硫脲。
1H NMR(400MHz,CD3OD)；δ7.57-7.52(m,1H),7.40(s,1H),7.25-7.13(m,2H),6.91(dd,1H,J＝8.0,1.6Hz),6.79(d,1H,J＝8.0Hz),2.25(s,3H)。
步骤2：N-(3,4-二氟苯基)-5-甲基苯并[d]恶唑-2-胺(N-(3,4-difluorophenyl)- 5-methylbenzo[d]oxazol-2-amine，FCCS-17065-C)的制备
在Ar气体气氛下，添加在上述步骤1中获得的FCCS-17065-C-2-1(400mg，1.359mmol)和超氧化钾(483mg，6.795mmol)，添加乙腈(52mL)并在常温条件下搅拌14小时。利用薄层色谱确认来确认了起始物质全部消失，向粗品添加二氧化硅并吸附减压。执行硅胶柱色谱(20％EtOAc/己烷，Rf＝0.45)来获得了224mg(白色固体，63％)的目标化合物N-(3,4-二氟苯基)-5-甲基苯并[d]恶唑-2-胺。
1H NMR(400MHz,CD3OD)；δ＝7.83-7.78(m,1H),7.33-7.29(m,1H),7.27-7.20(m,3H),6.97-6.95(m,1H),2.41(s,3H)。
实施例10：N-(3,4-二氟苯基)苯并[d]恶唑-2-胺(N-(3,4-difluorophenyl)benzo[d]oxazol-2-amine，FCCS-19025)的合成
Figure BDA0003580022230000321
步骤1：1-(3,4-二氟苯基)-3-(2-羟基苯基)硫脲(1-(3,4-difluorophenyl)-3- (2-hydroxyphenyl)thiourea，FCCS-19025-2-1)的制备
在Ar气体气氛下，将2-氨基苯酚(150mg，1.37mmol)溶解在甲醇(8mL)后，缓慢添加3,4-二氟苯基异硫氰酸酯(224μl，1.65mmol)，在室温条件下搅拌13小时。利用薄层色谱确认反应完成后，在减压条件下去除甲醇。利用硅胶柱色谱(20％的丙酮/正己烷)纯化反应混合物来获得了浅黄色固体的1-(3,4-二氟苯基)-3-(2-羟基苯基)硫脲(354mg，92％)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)δ7.62(d,J＝8.0Hz,1H),7.55(ddd,J＝2.4Hz,1H),7.25-7.13(m,2H),7.11-7.05(m,1H),6.92-6.82(m,2H)；ESI-(+)281.3[M+H]+。
步骤2：N-(3,4-二氟苯基)苯并[d]恶唑-2-胺(N-(3,4-difluorophenyl)benzo[d] oxazol-2-amine，FCCS-19025)的制备
在Ar气体气氛下，将在上述步骤1中获得的FCCS-19025-2-1(224mg，0.80mmol)、超氧化钾(284mg，4.00mmol)溶解在乙腈(25mL)后，在常温条件下搅拌14小时。利用薄层色谱确认反应完成后，在减压条件下去除乙腈。利用硅胶柱色谱(10％～20％的乙酸乙酯/正己烷)纯化反应混合物来获得了白色固体的目标化合物N-(3,4-二氟苯基)苯并[d]恶唑-2-胺(160mg，82％)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)δ7.82(ddd,J＝2.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.6Hz,1H),7.36(d,J＝8.0Hz,1H),7.34-7.29(m,1H),7.28-7.18(m,2H),7.16-7.10(m,1H)；ESI-(+)247.2[M+H]+。
在下述表1示出实施例1至实施例10的化学结构式。
Figure BDA0003580022230000322
Figure BDA0003580022230000331
比较例1
将N-(2-氯苯基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(N-(2-chlorophenyl)-1H-indole-3-carboxamide)用作比较例1。
Figure BDA0003580022230000332
比较例2
购入2'-氯乙酰苯胺(2'-Chloroacetanilide，C0621)并用作比较例2。
Figure BDA0003580022230000333
比较例3
购入N-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺(N-methyl-1H-indole-3-carboxamide，FCCS-16030)并用作比较例3。
Figure BDA0003580022230000341
比较例4：N-(2-((氯苯基)氨基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(N-(2-((2-chlorophenyl)amino)-2-oxoethyl)-1H-indole-3-carboxamide，FCCS-16031)的制备
Figure BDA0003580022230000342
步骤1：甲基2-(1H-吲哚-3-羧酰胺)乙酸盐(methyl2-(1H-indole-3- carboxamido)acetate，CCS-16031-3-1)的制备
在Ar气体气氛下，将吲哚-3-羧酸(Indole-3-carboxylic acid)(600mg，3.72mmol)和甘氨酸甲酯(glycine methyl ester)(467mg，3.72mmol)溶解于氯仿(11mL)，在冰浴中冷却。追加添加三乙胺(Triethylamine)(1.04mL，7.446mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(N,N-diisopropylcarbodiimide)后，在0℃的温度下搅拌14小时。利用10％的NaHCO3水溶液洗涤后，利用5％的HCl水溶液洗涤，并通过无水Na2SO4片来去除剩余水分，并在减压条件下去除溶剂。执行硅胶柱色谱(70％的乙酸乙酯/正己烷)来获得了430mg(白色固体，50％)的混合物(mixture)状态的甲基2-(1H-吲哚-3-羧酰胺)乙酸盐。未经进一步纯化直接用于下一步骤。ESI-MS:231.2[M-H]-。
步骤2：2-(1H-吲哚-3-羧酰胺)乙酸(2-(1H-indole-3-carboxamido)acetic acid，FCCS-16031-3-2)的制备
将在上述步骤1中获得的2-(1H-吲哚-3-羧酰胺)乙酸盐(220mg，0.947mmol)溶解于四氢呋喃(tetrahydrofuran)(6mL)，并向其添加将氢氧化锂水合物(LiOH monohydrate)(131mg，3.126mmol)溶解于水(2mL)的溶液，并在常温条件下搅拌1小时。通过添加1.0N的HCl水溶液来将pH值调节至2后，利用乙酸乙酯提取。通过无水Na2SO4片来去除剩余水分后，在减压条件下去除溶剂。通过执行硅胶柱色谱(10％的甲醇/二氯甲烷)来获得了147mg(黄色泡沫状固体(yello w foamy solid)，71％)的2-(1H-吲哚-3-羧酰胺)乙酸。
1H NMR(400MHz,CD3OD)；δ8.10-8.08(m,1H),7.92(s,1H),7.43(dt,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.17(quint d,J＝7.2,1.6Hz,2H),4.12(s,2H)。
步骤3：N-(2-((2-氯苯基)氨基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺(N-(2-((2- chlorophenyl)amino)-2-oxoethyl)-1H-indole-3-carboxamide，FCCS-16031)的制备
在Ar气体气氛下，将在上述步骤2中获得的2-(1H-吲哚-3-羧酰胺)乙酸(200mg，0.917mmol)和N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐(N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate，TSTU)(290mg，0.962mmol)溶解于二甲基甲酰胺(4mL，无水)并添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.4mL，2.293mmol)后，在常温条件下搅拌3小时。添加2-氯苯胺(2-chloroaniline)(0.29mL，2.751mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.64mL，3.668mmol)并在60℃的温度下加热4小时。在减压条件下去除溶剂后，添加二氯甲烷和NH4Cl饱和水溶液来提取，并获得有机层，通过无水Na2SO4片来去除剩余水分后，在减压条件下去除溶剂。执行硅胶柱色谱(70％的乙酸乙酯/正己烷)来获得了20mg(白色固体，6.6％)的目标化合物N-(2-((2-氯苯基)氨基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺。
1H NMR(400MHz,CD3OD)；δ8.15-8.12(m,1H),8.04(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.97(s,1H),7.46-7.41(m,2H),7.33-7.28(m,1H),7.23-7.12(m,3H),4.26(s,2H)
实验例1-1：荧光素酶(Luciferase)表达实验(比较例1至比较例4)
为了通过荧光素酶活性评价来评价klotho基因是否表达，从美国龙沙(Lonza)公司购入使用作为人肾的近端小管(proximal tubule)的上皮(epithelium)细胞的RPTEC(人肾近端小管上皮细胞(human renal proximal tubule epithelial cell)，ATCC CRL-4031)细胞。
为了培养，使用了由龙沙(Lonza)公司制造的Renal Epithelial Growth Medium(REGMTM)Bulletkit，在37℃的温度、5％的CO2条件下培养。用于表达荧光素酶的质粒使用以使人的KL(klotho)基因的启动子位点调节荧火虫荧光素酶(firefly luciferase)基因表达的方式配置的质粒。
质粒通过使用罗氏(Roche)公司的X-treme GENE transfection reagent来放入细胞内。通过使用Promega公司制造的Dual-Luciferase reporter assay system测定在细胞中表达的荧光素酶活性。将各化合物在以所显示的浓度培养的细胞中处理24小时后，测定荧光素酶活性。在荧光素酶的活性过高的情况下，间接示出klotho基因的表达可增加。
在RPTEC细胞以5μM的浓度处理比较例1至比较例4，利用包括人klotho基因的起点至1.7kbp前为止的启动子的报告基因或包括人klotho基因的起点至240bp前为止的启动子的报告基因来确认了报告基因的表达。
结果，如图1所示，确认了比较例1的化合物的荧光素酶活性最高。
实验例1-2：荧光素酶表达实验(实施例1至实施例6)
基于上述实验例1-1的结果，合成了具有与比较例1相似的化学结构的实施例1至实施例6，并实施了本实验例1-2。
在作为人肾的近端小管的上皮细胞的RPTEC分别以0.5μM、1μM及5μM的浓度处理实施例1至实施例6，以5μM的浓度处理比较例1，并利用包括人klotho基因的-2.1kb上游为止的启动子的报告基因(pH KP-luc)确认报告基因的表达，将结果示出于图2及图3。
如图2所示，确认了实施例1、实施例2的化合物的报告基因的表达水平与比较例1相似。
如图3所示，在RPTEC细胞以5μM的浓度处理比较例1及实施例1至实施例3，利用包括人klotho基因的-2.1kb上游为止的启动子的报告基因(pHKP-luc)确认报告基因的表达的结果，确认了实施例2的化合物的水平与比较例1相似。
实验例2：利用实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)实验的klotho(KL)基因的表达量定量评价
为了从将比较例1及实施例1至实施例2的化合物处理6小时的作为人肾的近端小管的上皮细胞的RPTEC细胞中提取RNA，使用了Qiagen公司的RNeasy试剂盒。提取的RNA通过利用赛默飞世尔(Thermo)公司的Superscript II试剂盒来制备了cDNA，将利用Appliedbios ystem公司的Taqman Gene Expression assays实施KL(klotho)基因特异性试剂盒的结果示出于图4。
如图4所示，确认了实施例2的化合物的水平与比较例1相似。
基于本实验例2的结果，合成了化学结构与实施例2的化合物相似的实施例7至实施例10的化合物，并用于后续的实验例3。
实验例3：利用常规的聚合酶链式反应(PCR)实验的klotho(KL)基因表达量定量评价
在作为人肾的近端小管的上皮细胞的RPTEC细胞分别以2.5μM处理6小时的实施例7至实施例10，从细胞提取RNA，提取的RNA通过利用赛默飞世尔(Thermo)公司的Superscript II试剂盒制备cDNA后实施常规的聚合酶链式反应。
用于实验的引物信息如下。
KL-F GATAGAGAAAAATGGCTTCCCTCC(序列号1)
KL-R GGTCGGTAAACTGAGACAGAGTGG(序列号2)
GAPDH-F TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG(序列号3)
GAPDH-R AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC(序列号4)
在琼脂糖凝胶中进行电泳后，通过溴化乙锭(Ethidium Bromide)染色来确认了利用聚合酶链式反应扩增的DNA，利用SpeedyQuant程序定量比较带中的DNA量，并示出于图5。
如图5所示，确认了与比较例1相比，实施例8至实施例10的klotho(KL)基因表达量更高，尤其，与比较例1相比，实施例10示出高约10倍的状态。
实验例4：毒性测试
在培养的HK2(人肾(Human kidney-2))细胞，以25μM或12.5μM浓度处理比较例1、实施例2及实施例9至实施例10，24小时后，利用EZ-Cytox试剂盒测定了细胞毒性。EZ-Cytox通过活细胞的线粒体酶生成在450nm中具有吸光度的甲臜(formazan)，因此，活细胞在450nm中示出更高的吸光度。当用于处理化合物的量相同体积的二甲基亚砜(DMSO)处理的细胞的毒性视为1时，确认了通过化合物样品处理细胞毒性减少多少，将其结果示出于图6。
如图6所示，在以12.5μM或25μM的浓度处理的情况下，均示出实施例10的化合物示出最少的毒性，与比较例1比较时，确认了毒性改善20％以上。
实验例5：HK-2细胞中的Klotho蛋白表达量分析
如图7a的试验方案，在HK-2细胞(人肾细胞)处理顺铂(Cisplatin，20μM)来制造疾病模型后，处理了KS1化合物(实施例10)(3μM)。24小时后获取细胞，来确认了Klotho蛋白表达程度。如图7b所示，经确认，HK-2细胞中的Klotho蛋白表达在利用顺铂处理的组中减少，在利用KS1化合物(实施例10)处理的组中增加。
实验例6：单侧输尿管梗阻(Unilateral Ureter Obstruction，UUO)模型中的KS1化合物(实施例10)的效果分析
单侧输尿管梗阻模型使用5周玲雄性C56BL/6小鼠。为了制造单侧输尿管梗阻模型，用线将右侧输尿管捆绑后，24小时后开始，每天腹腔注射KS1化合物(20mg/kg/天)。之后，在第7天及第14天处死并收集样品来进行实验(图8a)。
确认是否肾肥大
实验结果，在单侧输尿管梗阻模型中示出肾脏肥大的结果，在利用KS1化合物处理的肾脏中，示出没有大小差异的结果(图8b)。
确认核和细胞质变化
为了观察单侧输尿管梗阻模型中的核和细胞质的变化，进行H&E染色，将其结果示出于图9。在KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型的1周样品中，可知核的数量增加很多，在2周样品中，示出细胞质被破坏的结果，但是，在利用KS1处理的样品中，示出组织的破坏减少很多的结果(图9)。
确认纤维化是否进展
并且，为了观察单侧输尿管梗阻模型中的根据纤维化进展的变化，进行了天狼星红染色。在KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型的组织1周样品中，可观察到红色的纤维化开始进展，在2周样品中，示出纤维化与1周样品相比进一步进展的结果。但是，在KS1处理组中，示出与KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型相比纤维化更少的结果(图10)。
确认细胞是否凋亡
为了观察单侧输尿管梗阻模型中的细胞凋亡程度，进行了TUNEL染色。在KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型的组织1周样品中，发生细胞凋亡，在2周样品中，示出细胞凋亡与1周样品相比增加的结果。但是，在KS1处理组中，示出与KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型相比细胞凋亡显著减少的结果(图11)。
确认Klotho蛋白表达量
在单侧输尿管梗阻模型的1周样品中，确认Klotho蛋白表达变化的结果，在KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型样品中，Klotho蛋白减少，但在利用KS1化合物处理的情况下，示出Klotho蛋白表达增加的结果(图12)。
MMP-9蛋白表达量分析
在单侧输尿管梗阻模型中确认作为炎症标志物的MMP-9蛋白变化的结果，在KS1未处理的单侧输尿管梗阻模型的1周和2周样品中，MMP-9增加，但在利用KS1处理的情况下，示出MMP-9表达量显著减少的结果(图13)。
实验例7：KS1化合物(实施例10)的高血压减少效果分析
1.实验用大鼠(rat)
使用6周龄雄性大鼠WKY/lzm作为正常对照组，使用6周龄雄性大鼠SHR/lzm作为诱发高血压的实验组。从中央实验动物中购入所有动物，在五松尖端医疗产业振兴财团实验动物中心内的再入区饲育设施中进行实验。实验用大鼠在购入后进行7天的检疫及驯化，在此期间，观察了动物的健康。
2.大鼠的饲育环境
(1)环境条件
本实验在将温度设定为22±2℃、相对湿度设定为50±10％、换气频率设定为10次～15次/小时、照明时间设定为12小时(上午8点点灯～下午8点熄灯)及照度设定为500Lux以上的五松尖端医疗产业振兴财团实验动物中心内的再入区繁殖设施中执行。实验人员均穿着经过高压灭菌(121℃，20分钟)的工作服和防护设备来实施作业。
(2)笼(cage)及饲育密度
针对试验动物的饲育，在单独换气笼(IVCs)系统中，在以根据AAALAC指南为基准的笼(W200×D310×H150)中，以2只/笼在驯化期间及实验期间内饲育。
(3)饲料及水的供给方法
在试验中供给的饲料为通过照射辐射来进行灭菌的试验动物用固体饲料(+40RMM-10，SAFE)，经饲料的成分分析报告的结果，饲料组成成分及污染物质检查中，未观察到影响试验的因素。水将RO水(反渗透蒸馏水)制备及供给装置中生产的超纯水经过次氯酸钠(NaOCl)及UV装置来消毒后，通过水瓶自由饮用，并委托认可机构(忠清北道青原郡五松邑五松生明路1路184，忠北健康环境研究所)定期进行水质检查，结果判定为“符合饮用水质量标准”。
(4)检疫驯化
在进入时，实施动物的外观检查。在驯化期间内，每天一次检查一般症状，并记录在一般症状观察记录日志中。在驯化期间最后一天，确认一般症状来评价动物的健康状态。
(5)个体及饲育箱识别
在驯化期间内，在到手时利用红色油性笔在动物的尾巴进行个体标记，并在附着检疫驯化期间内，在饲育箱附着个体识别卡。在观察期间中，当分离组时，利用蓝色油性笔在动物的尾巴进行个体标记，并在饲育箱附着个体识别卡。
(6)组分离
组分离在一般症状中没有异常的动物中，在仪器驯化结束日(组分离天)实施。在组分离的天，以各组的平均血压均等的方式将动物随机以各5组、每组5只分离。利用CO2安乐死剩余动物。
3.实验组构成
为了判断血压是否上升，将WKY用作正常对照组。将SHR大鼠分为阴性对照组、试验物质给药组、阳性物质给药组、试验物质+阳性物质给药组来进行。
4.制备及给药试验物质
(1)将试验物质及阳性对照物质根据相应浓度以20mL/kg的液体量溶解于赋形剂中。
(2)检疫及驯化后，根据动物的血压及体重进行组分离后，给药赋形剂、试验物质及阳性对照物质。
(3)在所有给药组中，以每周一次测量的体重为基准，以20mL/kg的液体量，利用3mL注射器以7次/1周共口服给药8周。物质的浓度相当于20mg/kg/天。
5.血压测量
药物给药后，在第36天和第64天，将动物放入血压测量用校准架，并将尾巴露出来测量血压。血压测量利用Kent Scientific公司的MODA High Throughput System来记录。
6.实验结果
将在大鼠中测量的药物处理组的收缩压(systolic pressure)显示在图14。实验结果，当在作为高血压动物模型的自发性高血压大鼠(SHR)处理KS1化合物时，示出了收缩压显著减少的结果，由此可知KS1化合物有效地用于预防、治疗高血压。同时，当与以往用作高血压治疗剂的血管紧张素II受体阻断剂药物之一的氯沙坦一同联合给药时，与单独给药各个药物时相比，示出更好的降血压效果，因此，在用于治疗高血压的联合给药时也可利用KS1。
实验例8：KS1化合物(实施例10)的细胞老化抑制效果分析
1.细胞培养和化合物处理
从龙沙(Lonza)公司购入作为人肾近端小管上皮细胞的RPTEC，培养用培养基也使用同一公司提供的REGM试剂盒。细胞培养在37℃的培养箱中以5％的CO2条件培养。当细胞饱和80％时，利用胰蛋白酶(trypsin)处理并转移到新的培养皿来传代培养。将化合物添加到培养基来使最终浓度成为2.5μM，在每次传代培养时添加化合物来保持恒定浓度。为了阴性对照，使用仅添加作为溶剂的DMSO的细胞，使用第9次传代培养的细胞(#9)作为未进行老化的对照组。诱导老化的细胞均使用第17次传代培养的细胞(#17)。
2.老化程度确认
为了确认细胞的老化程度，使用了Cell Signaling Technology公司的“衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Senescenceβ-galactosidase staining kit)”。实验当天，向细胞添加染色液，并在8小时后确认染色的细胞。在200倍显微镜下观察到的总细胞的数量中，确认被染色的细胞的数量并以比例示出，对每个样品中的三个不同位置的染色的细胞数进行计数并取平均值。随着细胞老化的进行，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的表达增加，因此，可将被染色的细胞判断为与未染色的细胞相比老化进行的更多的细胞。
3.实验结果
实验结果，与第9次传代培养的细胞相比，第17次传代培养的细胞的老化程度显著增加。在显微镜下以200倍观察时，在第17次传代培养的细胞中，细胞的90％程度均被染色，但在第9次传代培养的细胞中，仅有50％的细胞被染色(图15)。相同地，在第17次传代培养的细胞中，在将KS1化合物(实施例10)添加至培养基来培养的细胞组中，染色程度减少，细胞中的70％程度被染色(图15)。即，在KS1化合物(实施例10)存在的状态下培养的细胞中，在17次的传达培养期间内，与添加DMSO的培养基中生长的细胞相比，老化程度减少20％程度。
<110> 克洛索科学公司
<120> 诱导抗老化基因KLOTHO的表达的化合物及其用途
<130> KRP22210F
<150> KR 10-2019-0122305
<151> 2019-10-02
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KL-F
<400> 1
gatagagaaa aatggcttcc ctcc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KL-R
<400> 2
ggtcggtaaa ctgagacaga gtgg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-F
<400> 3
tgacaacttt ggtatcgtgg aagg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-R
<400> 4
agggatgatg ttctggagag cc 22

Claims (25)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
上述化合物由下述化学式1表示：
化学式1：
Figure FDA0003580022220000011
在上述化学式1中，
L1为单键或
Figure FDA0003580022220000012
R1及R2分别为-H、-OH、C1-10的直链或侧链烷基，或者C6-8的芳基酰胺，其中，在上述芳基酰胺的芳基中，卤素、-NO2及C1-10的直链或侧链卤代烷中的一种以上能够被取代；
上述R1及R2能够与它们所连接的碳原子一同形成C6-8的芳基；
R3、R4、R5、R6及R7分别为-H、卤素、-NO2或C1-10的直链或侧链烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
上述L1为单键或
Figure FDA0003580022220000013
R1及R2分别为-H、-OH、C1-5的直链或侧链烷基，或者C6-7的芳基酰胺，其中，在上述芳基酰胺的芳基中，卤素、-NO2及C1-5的直链或侧链卤代烷中的一种以上能够被取代；
上述R1及R2能够与它们所连接的碳原子一同形成C6-7的芳基；
R3、R4、R5、R6及R7分别为-H、卤素、-NO2或C1-5的直链或侧链烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
上述L1为单键或
Figure FDA0003580022220000021
R1及R2分别为-H、-OH、-CH3或苯基酰胺，其中，在上述苯基酰胺的苯基中，-Cl、-NO2及-CH2Cl中的一种以上能够被取代；
上述R1及R2能够与它们所连接的碳原子一同形成苯基；
R3、R4、R5、R6及R7分别为-H、-F、-Cl、-NO2或-CH2CH3。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
上述L1为单键或
Figure FDA0003580022220000022
R1为-H、-OH、-CH3、
Figure FDA0003580022220000023
R2为-H；
上述R1及R2能够与它们所连接的碳原子一同形成苯基；
R3为-H或-Cl；
R4为-H、-F或-Cl；
R5为-F、-Cl、-NO2或-CH2CH3；
R6为-H；
R7为-H。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
由上述化学式1表示的化合物为选自由下述化合物组中的一种：
1)N-(苯并[d]恶唑-2-基)-2-氯-4-硝基苯甲酰胺；
2)8-甲基-2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑；
3)2-((3,4-二氯苯基)氨基)苯并[d]恶唑-5-醇；
4)N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-2-氯-5-硝基苯甲酰胺；
5)N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3,4-二氯苯甲酰胺；
6)N-(2-(4-乙基苯基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-3-(氯甲基)苯甲酰胺；
7)2-[N-(3,4-二氯苯基)]氨基苯并恶唑；
8)N-(3,4-二氯苯基)萘并[2,3-d]恶唑-2-胺；
9)N-(3,4-二氟苯基)-5-甲基苯并[d]恶唑-2-胺；以及
10)N-(3,4-二氟苯基)苯并[d]恶唑-2-胺。
6.一种由化学式1A表示的化合物的制备方法，其特征在于，
如下述反应式1所示，包括：
步骤1，将化合物2溶解于有机溶剂后，添加化合物3，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物4；以及
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物4的有机溶剂后，在15℃至30℃的温度下反应10小时至16小时来获得化合物1A，
反应式1：
Figure FDA0003580022220000031
在上述反应式1中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1A包含在权利要求1的化学式1中。
7.一种由化学式1B表示的化合物的制备方法，其特征在于，
如下述反应式2所示，包括：
步骤1，将化合物5溶解于有机溶剂后，添加化合物3，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物6；
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物6的有机溶剂后，反应12小时至24小时来获得化合物7；以及
步骤3，将化合物7溶解于有机溶剂，添加三溴化硼后，在常温条件下反应20小时至28小时来获得化合物1B，
反应式2：
Figure FDA0003580022220000041
在上述反应式2中，
R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1B包含在权利要求1的化学式1中。
8.一种由化学式1C表示的化合物的制备方法，其特征在于，
如下述反应式3所示，包括：
步骤1，将化合物8、二硫化碳、碘甲烷及氢化钠溶解在有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应2小时至8小时来获得化合物9；以及
步骤2，将化合物9及化合物2溶解在有机溶剂后，反应2小时至8小时来获得化合物1C，
反应式3：
Figure FDA0003580022220000042
在上述反应式3中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义，
上述化合物1C包含在权利要求1的化学式1中。
9.一种由化合物1D表示的化合物的制备方法，其特征在于，
如下述反应式4所示，包括：
步骤1，将化合物10及化合物3溶解在有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应20小时至28小时来获得化合物11；
步骤2，向溶解有超氧化钾的有机溶剂，滴加溶解有在上述步骤1中获得的化合物11的有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应12小时至24小时来获得化合物12；
步骤3，将化合物12与催化剂一同添加至有机溶剂后，填充氢气，在10℃至50℃的温度下反应12小时至20小时来获得化合物13；以及
步骤4，将化合物13及化合物14溶解于有机溶剂后，在10℃至50℃的温度下反应12小时至24小时来获得化合物1D，
反应式4：
Figure FDA0003580022220000051
在上述反应式4中，
R3、R4、R5、R6及R7如权利要求1的化学式1中所定义；
R8为卤素、-NO2及C1-10的直链或侧链卤代烷中的一种以上；
上述化合物1D包含在权利要求1的化学式1中。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的制备方法，其特征在于，上述有机溶剂为选自由甲醇、二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、苯、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜及二恶烷组成的组中的一种以上。
11.一种用于抑制细胞老化的组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，上述细胞为肾近端肾小管上皮细胞。
13.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，上述组合物用于提高Klotho基因的表达量。
14.一种用于预防或改善皮肤老化的化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
15.一种用于预防或改善皮肤老化的保健功能食品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
16.一种用于预防或改善皮肤老化的保健食品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
17.一种用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
18.一种用于预防或治疗因血管老化诱发的疾病的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐及血管紧张素II受体阻断剂。
19.一种用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健功能食品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
20.一种用于预防或改善因血管老化诱发的疾病的保健食品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其特征在于，上述因血管老化诱发的疾病选自由高血压、心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、前列腺增生、血管痉挛、血栓形成、脑梗塞及脑出血组成的组中。
22.一种用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
23.一种用于预防或改善肾脏疾病的保健功能食品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
24.一种用于预防或改善肾脏疾病的保健食品组合物，其特征在于，包含权利要求1的由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
25.根据权利要求23至24中任一项所述的组合物，其特征在于，上述肾脏疾病选自由肾炎、肾盂炎、肾病综合征、急性肾盂肾炎、慢性肾盂肾炎、尿路感染、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、急性进行性肾炎、肾病综合症、小肾小球硬化、膜性肾病及膜性增生性肾小球肾炎组成的组中。
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