KR101446301B1 - Cxcr3/cxcl10 길항제 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 골 전이의 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Cxcr3/cxcl10 길항제 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 골 전이의 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키모카인 리간드10(CXCL10)의 합성물인 JN-2와 ION35가 키모카인 리간드10(CXCL10)의 수용체(CXCR3)와의 결합에 있어 서로 경쟁적으로 결합함으로써, 암세포의 골 전이에 따른 골 대사성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 암세포의 골 전이에 의해 증가한 키모카인 리간드10(CXCL10)이 조골세포에 작용하여 파골세포의 분화에 있어 중요한 인자인 RANKL 발현을 증가시켜 결국 파골세포의 분화를 유도한다는 선행 연구 결과를 토대로 암세포 중 골로의 전이가 용이한 유방암 세포(4T1)를 마우스의 정강이뼈에 직접 투여 후 본 합성물을 복강에 일정기간 투여한 결과, 골 내에 정착한 암세포에 따른 골 재구성(bone remodeling)의 저해를 방해함으로써 치료학 상 전이된 암세포에 의한 골 파괴 및 그 대사성 질환을 억제하고 치료하는데 유용하다.

Description

CXCR3/CXCL10 길항제 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 골 전이의 예방 및 치료용 약학 조성물{CXCR3/CXCL10 ANTAGONISTIC COMPOUNDS, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF, AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING BONE METASTASES COMPRISING THE SAME}
본 발명은 4-아미노부타나미드(aminobutanamide) 유도체, 이의 제조방법 및 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합 억제제를 유효성분으로 함유하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다.
[문헌 1] DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer: principles and practice of oncology. 7th ed. Lippincott: Williams and Wilkins Ltd; 2004.
[문헌 2] Deil IJ, Solomayer EF, Bastert G. Treatment of metastatic bone disease in breast cancer, bisphosphonates. Clin Breast Cancer 2000, 1:4351.
[문헌 3] Body JJ, Greipp P, Coleman RE, Facon T, Geurs F, Fermand JP, Harousseau JL, Lipton A, Mariette X, Williams CD, Nakanishi A, Holloway D, Martin SW, Dunstan CR, Bekker PJ. A phase I study of AMGN-0007, a recombinant osteoprotegerin construct, in patients with multiple myeloma or breast carcinoma related bone metastases. Cancer. 2003 Feb 1;97(3 Suppl):887-92.
[문헌 4] Stresing V, DaubinF, Benzaid I, MH, ClP. Bisphosphonates in cancer therapy. Cancer Lett. 2007 Nov 8;257(1):16-35.
[문헌 5] Lee JH, Kim HN, Kim KO, Jin WJ, Lee S, Kim HH, Ha H, Lee ZH. 2012. CXCL10 promotes osteolytic bone metastasis by enhancing cancer outgrowth and osteoclastogenesis. Cancer Res. 2012 72(13):3175-86
[문헌 6] Logan JG, Sophocleous A, Marino S, Muir M, Brunton VG, Idris AI. 2012. Selective tyrosine kinase inhibition of insulin-like growth factor-1 receptor inhibits human and mouse breast cancer induced bone cell activity, bone remodelling and osteolysis. J Bone Miner Res. doi: 10.1002/jbmr.1847. [Epub ahead of print])
[문헌 7] (Nasrazadani A, Van Den Berg CL. 2011. c-Jun N-terminal Kinase 2 Regulates Multiple Receptor Tyrosine Kinase Pathways in Mouse Mammary Tumor Growth and Metastasis.
[문헌 8] Genes Cancer. 2(1):31-45).(Yang JC, Bai L, Yap S, Gao AC, Kung HJ, Evans CP. 2010. Effect of the specific Src family kinase inhibitor saracatinib on osteolytic lesions using the PC-3 bone model. Mol Cancer Ther. 9(6):1629-37).
유방암, 전립선암, 대장암등 다양한 암세포들이 골(뼈)로 전이가 되는 것으로 알려져 있고, 폐, 간에 이어서 세 번째로 흔한 전이 장소로 알려져 있다. 이러한 암들의 골(뼈)전이는 단순한 전이뿐 아니라, 골수에서 골의 생성에 관여하는 조골세포에의 영향, 골의 흡수에 관여하는 파골세포에 영향을 미쳐, 궁극적으로는 과도한 골 흡수를 야기시키며, 이것이 다시 암세포에 영향을 주어 암세포의 증식을 촉진시키는 일련의 악순환 과정을 유도하게 된다. 골 전이암의 하나인 유방암은 2004년 미국에서만 일 년에 41,500의 새로운 유방암 환자가 발생되었으며 이들 중 80%-90%가 골 조직으로 암세포가 전이되어 골 조직을 약화로 쉽게 골절이 발생하여 더욱 큰 고통을 주는 치명적인 질환이 되며(DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer: principles and practice of oncology. 7th ed. Lippincott: Williams and Wilkins Ltd; 2004. 문헌 1), 한국에서도, 최근 식생활이 서구화 되고 인스턴트 음식, 동물성 지방 과다 섭취, 음주, 여성 호르몬의 불균형으로 2001년에 유방암 발생률이 16.1%로 여성 암 중에서 가장 많은 비중을 차지하고 있으며 2004년 우리나라 유방암 환자는 9668명으로 최근 들어 급속도로 유방암 환자가 늘어나고 있다. 그러나 유방암 치료제로 사용되는 엑스메스테인, 타목시펜, 허셉틴(Herceptin), 페마라(femara)등의 시약들은 암세포 뿐 아니라 정상 세포에 악영향을 주는 부작용을 가지고 있으며 암세포의 골 조직 전이에 의한 골 손실을 억제하지 못하고 골 조직 손상 치료제인 비스포스포네이트(Deil IJ, Solomayer EF, Bastert G. Treatment of metastatic bone disease in breast cancer, bisphosphonates. Clin Breast Cancer 2000, 1:4351. 문헌 2)가 사용되지만 이것 역시 부작용이 있고 유방암 환자의 고통을 반감 시키지 못한다. 따라서 암세포가 골 조직으로 전이되는 작용기전을 규명하고 암세포의 전이를 예방 또는 치료할 수 있는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 골전이암에 의한 골소실 연구는 암세포에 의한 파골세포의 분화 촉진 기전연구가 주를 이루고 있으며, 어떠한 기전에 의해 암세포가 뼈로 전이 또는 증식이 촉진되는 지의 연구는 거의 잘 밝혀져 있지 않으며 in vitro 상에서의 결과로의 추측에 의존하고 있다.
최근에 골 생성 및 흡수에 관여하는 세포들로부터 또는 골 흡수에 의한 뼈의 기질로부터 방출된 여러 인자들이 암 전이에 따른 골 소실에의 관여가 다소 밝혀짐으로써 골 흡수 억제제를 통한 골 소실을 감소시키려는 연구가 시도되고 있다. 따라서, 골흡수에 관여하는 파골세포 분화의 중추적 인자인 RANKL의 억제수용체(decoy receptor)로 작용하는 osteoprotegerin(OPG)을 이용한 Fc-OPG를 다발성 골수종 환자와 유방암 환자대상으로 피하 주사한 경우, 골 소실이 감소되는 것을 확인하였다(Body 등, 2003. 문헌 3). 또한, 대표적인 골흡수 억제제로 골다공증 치료제로 사용하고 있는 bisphosphonate 계열의 제제는 암 세포에 의한 골 소실억제와 더불어 암세포들의 뼈에의 부착 및 증식을 억제한다는 보고가 되고 있다(Stresing 등, 2007. 문헌 4). 그러나 기존에 사용되고 있는 골억제제인 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 경우, 투여방법이 까다롭고 심각한 소화계통의 이상반응을 유발하는 등 약물 투여 시 겪는 부작용이 심각하여 새로운 치료제 개발이 절실히 요구된다.
암세포는 분열과 증식과정을 거치며 주변에 새롭게 생성된 신생 혈관을 따라 다른 장기로 이동하게 된다. 혈관을 따라 다른 장기로 이동하면 새롭게 부착하여 다시 분열과 증식을 거쳐 새로운 장기로 전이가 일어나는 것이다. 이렇듯 암세포의 전이에 있어 이동능력이 중요한데 이때 키모카인 리간드10(CXCL10)이 중요하게 작용한다고 잘 알려져 있다.
본원 발명자들은 한국특허등록 제 10-1175416호 (2012.08.13 등록)에서 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합 억제제로서 2-(2-아세틸-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-니트로페닐)에탄온 등의 공지 화합물을 개시한 바가 있으나, 상기 화합물들과 골격 및 그 화학 구조가 상이한 신규 유도체들을 합성하여 이들이 암세포와 골수세포를 이용한 이주(migration)실험 및 스크래치(scratch) 실험을 통한 CXCL10에 의해 증가한 이동능을 현저하게 억제하고,(실험예 1-2); 직접 투여된 전이성 유방암 세포(4T1)에 의한 골 소실 모델을 통하여 생체 내에서도 파골 세포의 형성을 현저히 감소시킴에 따라, 골 융해를 탁월하게 억제하고(실험예 3-5); 골 소실 억제 동물 모델에서 혈청 내 Pyridinoline(PYD) 수준을 감소시키는 효과(실험예 6)를 나타냄을 확인하여, 본 발명의 유도체들이 골전이를 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CXCR3/CXCL10 길항제로서 유용한 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35), 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CXCR3/CXCL10 결합 길항 활성을 나타내는, 하기 구조식 (a)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(I, JN-2) 화합물, 그 이성체 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure 112014045929750-pat00031
(I)
본 발명은 CXCR3/CXCL10 결합 길항 활성을 나타내는, 하기 구조식 (II)의 신규한 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (II, ION-35) 화합물, 그 이성체 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure 112013031504304-pat00002
(II)
또한 본 발명은 4-메틸-2-니트로페놀 (1)을 Pd/C과 수소 조건, Fe/SnCl2, indium 등의 환원조건하에서 환원하여 2-아미노-4-메틸페놀 (2)을 제조하는 1단계; 1단계의 화합물(2)와 4-니트로페닐 이소티오시아네이트 (2a)를 상온에서 반응시켜 1-(5-클로로-2-히드록시페닐)-3-(4-니트로페닐)티오우레아 (3)을 제조하는 제 2단계; 상기 화합물(3)을 KO2 또는 trifluoroacetic acid 등의 시약과 반응시켜 5-클로로-N-(4-니트로페닐)벤조[d]옥사졸-2-아민 화합물(4)을 제조하는 제 3단계; 상기 화합물(4)를 Pd/C과 수소 조건, Fe/SnCl2, indium 등의 환원조건하에서 환원하여 N 1-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일)벤젠-1,4-디아민 (5)을 제조하는 제 4단계; 상기 화합물(5)에 동일 당량의 Boc-β-Ala-OH(5a)를 가하고 PyBOP과 iPr2NEt를 이용하여 커플링(coupling) 반응을 수행하여 tert-부틸3-(4-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐카르바모일) 프로필카르바메이트 (6)을 제조하는 제 5단계; 상기 화합물 (6)을 탈보호기(deprotection) 반응을 수행하는 제 6단계 공정을 포함하는 상기 구조식 (a)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(I, JN-2) 화합물을 제조하는 제조방법을 제공한다.
Figure 112013031504304-pat00003
Figure 112014045929750-pat00032
Figure 112014045929750-pat00033
Figure 112014045929750-pat00034
Figure 112013031504304-pat00007
Figure 112013031504304-pat00008
Figure 112013031504304-pat00009
Figure 112013031504304-pat00010
또한 본 발명은 치환된 벤즈아미드 화합물(7)을 MeI 및 CS2와 실온조건으로 반응시켜 N-(비스-메틸설파닐 메틸렌)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (8)을 제조하는 제 1단계; 상기 화합물 (8)에 치환된 2-아미노 페놀(8a)과 환류(reflux) 반응을 수행하는 제 3단계 공정을 포함하는 상기 구조식 (II)의 신규한 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (II, ION-35) 화합물을 제조하는 제조방법을 제공한다.
Figure 112013031504304-pat00011
Figure 112013031504304-pat00012
Figure 112013031504304-pat00013
본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
또한, 상기 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 상기 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
하기의 반응식들은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 본 발명의 여러 화합물들은 반응식 1 및 2의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다. 본 발명의 몇몇 화합물들은 반응식 1 내지 2의 범주에 포함되지 않는 과정에 따라 합성되었으며, 이러한 화합물들에 대한 상세한 합성 과정은 이들 각각의 실시예에 설명되어 있다.
[반응식 1]
Figure 112014045929750-pat00035
Scheme 1. JN-2의 합성 경로
상업적으로 구매 가능한 4-메틸-2-니트로페올을 5% Pd/C과 수소로 환원하는 과정부터 시작하여 5% Pd/C과 수소로 물질 1의 니트로(nitro)기를 아미노(amino)기로 환원한 물질 2제조한 후에, 2-아미노페놀(Aminophenol)과 4-니트로페닐 이소티오시아네이트(nitrophenyl isothiocyanate)를 상온에서 반응시켜 페닐티오우레아(phenylthiourea) 중간체인 물질 3을 제조한 후에, KO2와 반응시켜 벤즈옥사졸 환(benzoxazole ring)의 물질 4를 제조하고, 5% Pd/C과 수소로 물질 4의 니트로(nitro)기를 아미노(amino)기로 환원한 물질 5를 제조한 후에, 물질 5에 PyBOP과 iPr2NEt를 이용하여 치환된 산(substituted acid)을 커플링 반응(coupling)시켜 물질 6을 얻고 최종적으로 물질 6을 HCl-디옥산(dioxane) 존재하에서 아미노기(amino)의 tert-부틸 카르바메이트(butyl carbamate; boc)기를 탈보호(deprotection)하여 최종 생성물질인 N-페닐벤조[d]옥사졸-2-아민 유도체 (I, JN-2)를 수득가능하다 (반응식 1 참조).
[반응식 2]
Figure 112013031504304-pat00015
Scheme 2. ION -35의 합성 경로
상기 반응식 3와 같이, 치환된 벤즈아미드(Substituted benzamide, 2-클로로-4-니트로 벤즈아미드)를 MeI, 60.0% NaH 분산액(광유) 존재 하에서 MeI 및 CS2와 실온조건으로 반응시켜 물질 8을 얻은 후, 최종적으로 치환된 2-아미노 페놀(amino phenol)과 환류반응(reflux)을 수행하여 최종 생성물인 구조식 (II)의 신규한 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (9, ION-35) 화합물을 수득가능하다.
상기 제조방법으로 얻어진 상기 구조식 (I) 및 (II) 화합물들은 암세포와 골수세포를 이용한 이주(migration)실험 및 스크래치(scratch) 실험을 통한 CXCL10에 의해 증가한 이동능을 현저하게 억제하고,(실험예 1-2); 직접 투여된 전이성 유방암 세포(4T1)에 의한 골 소실 모델을 통하여 생체 내에서도 파골 세포의 형성을 현저히 감소시킴에 따라, 골 융해를 탁월하게 억제하고(실험예 3-5); 골 소실 억제 동물 모델에서 혈청 내 Pyridinoline(PYD) 수준을 감소시키는 효과(실험예 6)를 나타냄을 확인하여 암세포 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 또는 예방할 수 있는 치료제로서 유용함을 확인하였다.
위 결과에 따르면 CXCL10이 암세포의 수용체에 결합함에 따라 골 융해 및 파골 세포의 증가를 조절할 수 있는데, 이때 CXCL10의 합성물인 JN-2와 ION35가 CXCL10과 서로 경쟁적으로 수용체에 결합함으로써 CXCL10과 암세포 수용체가 결합함에 따른 하위 신호체계 활성화의 발생빈도를 조절할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.
따라서, 본 발명은 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 CXCR3/CXCL10 길항제를 제공한다.
본원에서 정의되는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환으로는 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 전이성 간암, 전이성 신장암, 전이성 방광암, 전이성 흑색종, 전이성 다발성 골수종, 전이성 갑상선암 등, 바람직하게는 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 또는 전이성 폐암을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 암질환을 예방, 치료하기 위한 약제학적 조성물과 상기 화합물을 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염를 유효성분으로 하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 인간 객체에 대하여 예방적(preventive) 또는 교정적인(curative) 치료 목적으로 단독 또는 기타 항암제 또는 항암 치료법과의 조합으로 사용가능하다.
따라서, 본 발명은 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 전이성 암질환의 치료 및 예방용 표적 항암보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 및 기존 항암제를 유효성분으로 함유하는 조합물을 제공한다.
본원에서 정의되는 상기 기존 항암제로는 엽산유도체 (methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체 (5-fluorouracil, cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 니트로겐 머스타드계 화합물 (chlorambucil,cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물 (thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물 (busulfan), 니트로소우레아계화합물 (carmustine), 트리아젠계 화합물 (dacarbazine) 등의 알킬화제 (alkylating agent); 악티노마이신 D (actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성항암제, 빈크리스틴, 븐빌라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등의 유사분열억제제 (antimitotic drugs); 또는 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제; 시스플라틴 같은 백금함유 화합물 등의 기존 항암제를 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 효과적인 양의 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 갖는 객체에게 투여함을 포함하는, 상기 전이성 암질환을 치료하기 위한 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, 구조식 (I) 및 (II)의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
상기와 같이, 본 발명의 화합물들은 암세포와 골수세포를 이용한 이주(migration)실험 및 스크래치(scratch) 실험을 통한 CXCL10에 의해 증가한 이동능을 현저하게 억제하고; 직접 투여된 전이성 유방암 세포(4T1)에 의한 골 소실 모델을 통하여 생체 내에서도 파골 세포의 형성을 현저히 감소시킴에 따라, 골 융해를 탁월하게 억제하고; 골 소실 억제 동물 모델에서 혈청 내 Pyridinoline(PYD) 수준을 감소시키는 효과를 나타냄으로서 암세포 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 또는 예방할 수 있는 치료제로서 유용하게 사용가능하다.
도 1은 키모카인 리간드10(CXCL10)에 의한 골수세포 이동능에서 JN2와 ION35의 효과를 Migration 실험을 실시하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 한 후 광학 현미경으로 확인한 그림(좌)과 그래프(우)로서 나타낸 도이며;
도 2는 CXCL10에 의한 골수 세포의 이동능력 증가에서 그(CXCL10)의 합성물인 JN-2와 ION35의 영향을 확인하고자 스크래치 (Scratch) 실험을 실시하여 골수 세포의 이동능을 광학 현미경으로 확인 한 그림(좌)과 그래프(우)로서 나타낸 도이며;
도 3는 전이성 유방암 세포(4T1)에 의해 유도된 생쥐 대퇴골(femur) 소실에 대한 JN2, ION35의 저해 효과를 나타낸 도이며;
도 4는 생쥐 모델에서 증명된 JN2와 ION35의 골 소실 저해 능력의 마이크로CT를 이용한 정량화한 도이며;
도 5는 마이크로 CT와 X-ray를 통해 확인된 JN2와 ION35의 저해 능력에 대한 조직학적 분석 결과를 나타낸 도이며;
도 6는 JN2와 ION35의 골 소실 억제 동물 모델에서 혈청 내 Pyridinoline (PYD) level의 감소효과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용은 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. N -(4-(5- 클로로벤조[ d ]옥사졸 -2- 일아미노 ) 페닐 )-4-아미노부타나미드{ N -(4-(5-chlorobenzo[ d ]oxazol-2-ylamino)phenyl)-4-aminobutanamide ( JN -2)}의 합성
1-1. 2-아미노-4- 메틸페놀 (2- Amino -4- methylphenol ; 2)의 합성
메탄올(Methanol) 20 mL를 4-클로로(chloro) -2-니트로페놀(nitrophenol) (1.31 mmol, 1eq)과 5% Pd/C (0.4 g)에 천천히 적가한 후 수소를 충전시켜 5시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응액을 셀라이트(celitel)로 여과한 후 여액의 용매를 감압 하에서 제거하여 하기 물성치를 갖는 2-아미노-4-메틸페놀 (2)를 얻었다.
갈색 고체상(Brown solid) (96%);
1H-NMR (Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 6.582 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.493 (s, 1H), 6.261 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 2.115 (s, 3H).
1-2. 1-(5- 클로로 -2- 히드록시페닐 )-3-(4- 니트로페닐 ) 티오우레아 (1-(5- Chloro -2- hydroxyphenyl )-3-(4-nitrophenyl)thiourea; 3)의 합성
메탄올(Methanol) 10 mL에 녹인 2-아미노(amino)-4-클로로페놀(chlorophenol) (3.48 mmol, 1eq) 과 4-니트로페닐 이소티오시아네이트(nitrophenyl isothiocyanate) (3.48 mmol, 1eq)를 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 유기 용매를 감압 하에서 증발 제거한 후에 침전을 hexane으로 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 1-(5-클로로-2-히드록시페닐)-3-(4-니트로페닐)티오우레아 (3)을 얻었다.
갈색 분말(Brown powder) (89%);
1H-NMR(Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 8.232 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.030 (m, 3H), 7.102 (dd, J = 8.8 Hz, 1H), 6.972 (d, J = 8.8 Hz, 1H).
1-3. 5- 클로로 - N -(4- 니트로페닐 ) 벤조 [ d ] 옥사졸 -2-아민 (5- Chloro - N -(4-nitrophenyl)benzo[ d ]oxazol-2-amine, 4)의 합성
질소가스 치환 하의 빙욕조(ice bath)에서 KO2 (12.05mmol,5eq)에 아세토니트릴(acetonitrile) 15 mL를 천천히 가하며 교반하였다. 이후 아세토니트릴20 mL에 녹인 물질 1-(2-히드록시페닐)-3-페닐티오우레아(phenylthiourea) 유도체 (2.41 mmol, 1eq)를 천천히 가하였다. 실온에서 16시간 동안 반응시킨 후 얼음물에 부어 희석시켰다. 디클로로메탄(Dichloromethane)으로 추출하고 포화 NaCl 수용액으로 2회 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 제거시켜 얻은 침전물을 EtOAc: hexane = 1: 10으로 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 5-클로로-N-(4-니트로페닐)벤조[d]옥사졸-2-아민 (4)를 얻었다.
황색 분말(Yellow powder) (80%);
1H-NMR(Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 10.353 (s, 1H), 8.329 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 8.098 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.558 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.489 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.235(dd, J = 8.4 Hz, 1H).
1-4. N 1 -(5- 클로로벤조[ d ]옥사졸 -2-일)벤젠-1,4- 디아민 ( N 1 -(5- chlorobenzo [ d ]oxazol-2- yl ) benzene -1,4-diamine, 5)의 합성
메탄올(Methanol) 20 mL를 5-클로로-N-(4-니트로페닐)벤조[d]옥사졸-2-아민 (1.31 mmol, 1eq)과 5% Pd/C (0.4 g)에 천천히 적가한 후 수소를 충전시켜 5시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응액을 셀라이트(celite)로 여과한 후 여액의 용매를 감압 하에서 제거하여 하기 물성치를 갖는 N 1-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일)벤젠-1,4-디아민 (5)를 얻었다.
회색분말(Gray powder) (83%);
1H-NMR (Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 9.176 (s, 1H), 7.480 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.333 (m, 2H), 7.063 (dd, J = 8.8 Hz, 1H), 6.713 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 4.509 (d, J = 8.8 Hz, 2H).
1-5. tert -부틸 3-(4-(5- 클로로벤조[ d ]옥사졸 -2- 일아미노 ) 페닐카르바모일 ) 프로필카르바메이트 ( tert -Butyl 3-(4-(5- chlorobenzo [ d ]oxazol-2- ylamino ) phenylcarbamoyl ) propylcarbamate , 6)의 합성
빙욕조(Ice bath) 하에서 N 1-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일)벤젠-1,4-디아민 (5)(0.42 mmol, 1eq), Boc-β-Ala-OH (0.42 mmol, 1eq), PyBOP (0.46 mmol, 1.2eq) 혼합물에 DMF 10 mL를 가하면서 교반하였다. 여기에 디이소프로필 에틸아민(diisopropyl ethylamine) (0.83 mmol, 2eq)을 가하고 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. EtOAc 10mL를 넣어 희석시키고 10% HCl 수용액으로 2회, 포화 NaHCO3수용액으로 2회, 포화 NaCl 수용액으로 2회 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시켰다. 이후 EtOAc: hexane = 1: 10으로 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 tert-부틸 3-(4-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐카르바모일) 프로필카르바메이트(6)를 얻었다.
백색분말(White powder) (20%);
mp 203.5-206.1℃;
1H-NMR(Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 9.572 (s, 1H), 9.228 (s, 1H), 7.756 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.701 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.421 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.381 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.121 (dd, J = 8.4 Hz, 1H), 6.062 (brs, 1H), 3.159 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.399 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.862 (m, 2H), 1.413 (s, 9H);
HR-FABMS (계산치) C22H26ClN4O4 (M++H):445.1643, (실측치):445.1639.
1-6. N -(4-(5- 클로로벤조[ d ]옥사졸 -2- 일아미노 ) 페닐 )-4- 아미노부타나미드 ( N -(4-(5- chlorobenzo [ d ]oxazol-2-ylamino)phenyl)-4-aminobutanamide, 7)의 합성
tert-부틸 3-(4-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐카르바모일) 프로필카르바메이트(6) (0.23 mmol, 1eq)를 CHCl3 20mL에 녹인 후 HCl-디옥산(dioxane) 3 mL를 가하여 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 용매를 감압 증발하여 제거하고 하기 물성치를 갖는 N-(4-(5-클로로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드 (7)을 얻었다.
회색분말(Gray powder) (99%);
mp 110.3-111℃;
1H-NMR(DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 10.705 (s, 1H), 9.976 (s, 1H), 7.728 (brs, 2H), 7.648 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.588 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 7.496 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.472 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.139 (dd, J = 8.4 Hz, 1H), 2.860 (m, 2H), 2.413 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.851 (m, 2H);
HR-FABMS (계산치) C17H18ClN4O2 (M++H):345.1118, (실측치):345.112.
실시예 2. N -( 벤조[ d ]옥사졸 -2-일)-2- 클로로 -4- 니트로벤즈아미드 ( N -( benzo [ d ]oxazol-2- yl )-2- chloro -4-nitrobenzamide 9, ION -35)의 합성
1-1. N -( 비스 - 메틸설파닐 메틸렌)-2- 클로로 -4- 니트로벤즈아미드 ( N -( Bis - methylsulfanyl methylene )-2-chloro-4-nitrobenzamide, 8)의 합성
질소가스 치환한 상태로 빙욕조(ice bath) 하에서 DMF 11 mL에 2-클로로-4-니트로 벤즈아미드 (2.83 mmol, 1 eq), CS2 (11.33mmol,4eq), MeI (9.07mmol,3.2eq)을 용해한 후 60.0% NaH 분산액(dispersion in mineral oil) (5.67 mmol, 2 eq)을 교반하여 가하였다. 이후 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 얼음물에 이 용액을 가하고 EtOAc 11 mL로 3번 추출하였다. 이 유기층을 모아 포화 NaCl 수용액으로 2번 씻어내고 MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시키고 이를 EtOAc: hexane = 1: 7 용매로 컬럼크로마토그래피(column chromatography)로 분리하여 하기 물성치를 갖는 N-(비스-메틸설파닐 메틸렌)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (8)을 얻었다.
황색 분말(Yellow powder) (18%);
1H-NMR(Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 8.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.28 (dd, J = 8.6 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 2.66 (s, 6H).
1-2. N -( 벤조[ d ]옥사졸 -2-일l)-2- 클로로 -4- 니트로벤즈아미드 ( N -(benzo[ d ]oxazol-2-yl)-2-chloro-4-nitrobenzamide, 9)의 합성
N-(비스-메틸설파닐 메틸렌) 치환 벤즈아미드 (N-(Bis-methylsulfanyl methylene) substituted benzamide, 8 0.44 mmol, 1eq)를 DMF 2 mL에 용해시킨 후 2-아미노페놀(aminophenol; 0.44 mmol, 1eq)를 가하면서 교반하였다. 이 혼합액을 5 시간 동안 환류한 후 반응액을 상온으로 식히고 용매를 감압 증발하여 제거하였다. Ether와 소량의 메탄올로 결정화한 후 에테르(ether)로 세척하면서 여과하여 하기 물성치를 갖는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일l)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (9)을 얻었다.
갈색 분말(Brown powder) (76%);
mp 204.1-205.5℃;
1H-NMR(Acetone-d 6 , 400 MHz) δ 8.368 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.331 (dd, J = 8.6 Hz, 1H), 8.098 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.600-7.577 (m, 2H), 7.406-7.336 (m, 2H);
HR-FABMS (계산치) C14H9ClN3O4(M++H): 318.0282, (실측치): 318.0283.
실험예 1. JN -2, ION35 에 의한 골수세포 이주 억제능 실험
상기 실시예 시료들의 암세포와 골수세포의 이주능을 확인하고자, 문헌에 기재된 이주(migration)실험 및 스크래치(scratch) 실험을 통해 CXCL10에 의해 증가한 이동능이 CXCL10의 합성물인 JN-2와 ION35에 의해 저해되는지를 하기와 같이 확인하였다 (Lee JH, Kim HN, Kim KO, Jin WJ, Lee S, Kim HH, Ha H, Lee ZH. 2012. CXCL10 promotes osteolytic bone metastasis by enhancing cancer outgrowth and osteoclastogenesis. Cancer Res. 2012 72(13):3175-86).
골수세포 획득을 위해 생후 6주인 C57/BL6 수컷 생쥐 (20 g, 오리엔트바이오, 성남, 경기도)의 뒷다리 부위의 경골과 대퇴골을 무균적으로 분리한 다음, 분리된 골 조직에서 연골 및 지방조직 등을 제거하고 주사기를 골수에 주입하여 골수세포를 얻었다. 획득된 세포는 1600 rpm으로 5분간 원심분리를 통해 침전시키고, ACK 완충액 (10-548E, Lonza)을 1분 동안 처리하여 적혈구 및 기타 지방세포 등을 제거시킨 다음 다시 1600 rpm으로 5분간 원심분리를 통해 침전시켜 모아진 세포들을 생쥐 골수세포로 간주하였다. 암세포의 경우 생쥐의 유방암 세포주(4T1, ATCC)를 사용하여 실험을 진행하였다.
위와 같은 방법으로 획득한 생쥐의 골수세포를 하루 동안 50 units/mL의 penicillin 과 50 mg/mL의 streptomycin만 함유된 minimum essential medium (LM 008-01, WelGENE Inc., 대구, 한국) alpha-MEM)에서 배양 후 실험에 사용하였다. 이렇게 얻어진 골수세포는 상위 chamber 인 transwell에 1X105cell/well의 개수로 넣어주고, 하위 배양접시에는 유도물질인 CXCL10 및 그의 합성물인 JN-2와 ION35를 처리하였다. 약 18시간동안 배양 후 상위 chamber에 있던 세포가 micropore (3422, Corning Costar)를 통과해서 ECM (Extracellular matrix) 부분으로 migration 되는 지를 알아보고자 transwell을 Hematoxylin & Eosin 염색 (Hematoxylin, GHS216; Eosin, HT110116; Sigma)을 한 후 광학 현미경(ATC2000, LEICA)으로 확인하였다.
상기 실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이 CXCL10에 의한 ECM으로의 세포 이동이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면에 CXCL10에 의해 이동한 세포수가 함께 처리된 JN-2와 ION35에 의해 그 이동이 저해됨을 확인한 수 있었다. ((좌)측은 Matrigel invasion chamber안의 골수세포는 하위 well에 존재하는 키모카인 리간드10(CXCL10)에 의해 이동능력이 증가하는데, 이때 함께 처리 된 JN-2와 ION35에 의해 chamber 안의 골수세포의 이동능이 감소하는 것을 Hematoxylin & Eosin 염색을 후 광학 현미경으로 확인 한 그림이며 (우)측은 Hematoxylin & Eosin 염색법에 의해 이동된 세포의 수를 측정한 그래프로서 키모카인 리간드10(CXCL10)에 의해 이동한 세포의 수가 JN-2, ION35에 의해 그 이동능력이 저해됨을 수치화 한 그래프임).
실시예2 . JN -2, ION35 에 의한 골수세포 이주 억제 및 스크래치 ( scratch ) 실험
상기 실시예 시료들을 대상으로 문헌에 기재된 암세포의 골 전이에 있어 중요한 능력중 하나인 이동 능력을 스크래치(scratch) 실험을 통해 CXCL10에 의해 증가한 이동능이 CXCL10의 합성물인 JN-2와 ION35에 의해 저해되는지를 하기와 같이 확인하였다. (Lee JH, Kim HN, Kim KO, Jin WJ, Lee S, Kim HH, Ha H, Lee ZH. 2012. CXCL10 promotes osteolytic bone metastasis by enhancing cancer outgrowth and osteoclastogenesis. Cancer Res. 2012 72(13):3175-86.)
암세포의 골 전이에 있어 중요한 능력중 하나인 이동 능력을 스크래치(scratch) 실험을 통해 다시 한 번 더 확인 하였다.
세포는 상기 실험예 1에서 설명한 바와 같이 동일한 세포주를 사용하여 12well 배양접시에 1X105cell/well 개수로 넣고 50 units/mL의 penicillin 그리고 50 mg/mL의 streptomycin이 함유된 minimum essential medium (LM 008-01, WelGENE Inc., 대구, 한국) alpha-MEM)에 10% fetal bovine serum (SH30919.03, HyClone)이 첨가된 배지에서 배양접시에 하루정도 키워 100%로 세포가 채워질 때까지 배양하였다. 배양접시에 세포가 가득 채워지면 배양액을 제거 생리식염수로 한번 헹궈낸 후에 tip을 이용, 일정한 속도와 압력으로 각 well의 위에서 아래로 선을 그어 세포를 떨어뜨린다. 떨어져 나간 세포를 제거하기 위해 다시 한 번 생리 식염수로 헹궈준 다음 50 units/mL의 penicillin 그리고 50 mg/mL의 streptomycin이 함유된 minimum essential medium (alpha-MEM) 배양액에 CXCL10 및 JN-2와 ION35를 각각 넣어 준 다음 약 18시간동안 배양 후 세포가 얼마나 이동하였는지 관찰하였다.
상기 실험 결과, 도 2에서 나타내는 바와 같이 대조군과 비교하여 CXCL10이 존재할 때 이동한 세포를 100으로 보고, JN-2와 ION35가 함께 처리 된 실험군의 세포 이동을 비율로 확인해 본 결과 2배 이상 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과는 이주(migration) 및 스크래치(scratch) 실험을 토대로 미루어보아 JN-2와 ION35가 CXCL10에 의한 세포 이동을 억제하는데 작용하리라는 것을 확인하였다.((좌)측은 12well 배양접시에 100%로 세포가 체워졌을 때 tip을 이용 일정 속도와 힘으로 일직선을 그어 세포를 떼어낸 후 18시간 뒤 세포의 이동 능력을 확인 한 그림이며, (우)측은 CXCL10이 처리된 well을 100%로 지정 후 나머지 배양접시의 세포 이동 능력을 비율(%)로 나타낸 그래프임).
실험예 3. 전이성 유방암 세포(4 T1 )에 의해 유도된 골 소실에 대한 JN -2, ION35의저해 능력
상기 실시예 시료들을 대상으로 문헌에 기재된 전이성 유방암 세포(4T1)에 의해 유도된 골 소실에 대한 저해능을 확인하기 위하여 하기와 같이 확인하였다. (Logan JG, Sophocleous A, Marino S, Muir M, Brunton VG, Idris AI. 2012. Selective tyrosine kinase inhibition of insulin-like growth factor-1 receptor inhibits human and mouse breast cancer induced bone cell activity, bone remodelling and osteolysis. J Bone Miner Res. doi: 10.1002/jbmr.1847. [Epub ahead of print])
암세포의 골 전이에 따른 골 융해 억제를 연구하기 위해서는 골 전이 동물 모델이 필요하나 유방암, 전립선암등과 같은 암세포는 뼈로의 전이가 용이하지만 그 외의 장기인 간과 폐로도 전이가 되기 때문에 뼈로의 이동은 확인이 되나 전이된 암세포에 의한 골 융해를 보이기 전 폐와 간에 전이된 암세포에 의해 동물 모델이 죽은 양상을 나타내는 어려움이 있다(Nasrazadani A, Van Den Berg CL. 2011. c-Jun N-terminal Kinase 2 Regulates Multiple Receptor Tyrosine Kinase Pathways in Mouse Mammary Tumor Growth and Metastasis.
Genes Cancer. 2(1):31-45). 그리하여 본 발명인은 암세포를 생쥐의 대퇴골에 직접적으로 주사하여 골 내에 암세포가 존재하는 동물 모델을 만들어 실험에 사용하였다.
구체적으로 설명하자면 생쥐의 유방암 세포(4T1, ATCC)를 실험군과 대조군으로 나눠 각각 5마리씩 생후 6주인 C57/BL6 암컷 생쥐 (20 g, 오리엔트바이오, 성남, 경기도)의 대퇴골과 경골 사이 연골에서 대퇴골 방향으로 시린지(Hamilton Microliter Syringe; (1705, Hamilton Co.)를 이용, 1X104cell/well/ 5㎕ / head로 직접 주사하였다. 이때 실험군으로 수술 시작 전날부터 생쥐를 희생시키기 전날까지 2일에 한번 씩 20일 동안 JN-2와 ION35를 200 g/head (20 g)의 용량으로 50 ㎕ DMSO + 50 ㎕ 생리식염수 용액에 용해시켜 복강내 주사로 투여하였다. 음성대조군 (비히클처리군)으로는 JN-2와 ION35을 처리한 동일한 양인 50 ㎕ DMSO + 50 ㎕ 생리식염수 용액을 복강 내 주사로 투여하였고 양성 대조군으로는 비스포스포네이트 (A4978, Sigma)를 10㎍/㎏으로 암세포 직접 주사 전 2일 동안 50 ㎕ DMSO + 50 ㎕ 생리식염수 용액에 용해시켜 복강내 주사로 투여하였다. 그 후 20일 경과, 생쥐를 희생시켜 대퇴골을 적출하였고 그 조직을 생리식염수로 3-4회 수세한 다음 4% 파라포름알데하이드 용액에 24시간 고정하였다. 고정이 끝난 생쥐의 대퇴골은 골 융해 정도를 확인하고자, soft X-ray (Softex CMB-2, SOFTEX Co., 일본)와 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, SMX-90CT, Shimadzu, 일본)을 수행하였고, 3차원 이미지를 얻어 그 결과를 도 3에 나타내었다 (Volume Graphics, VG studio Max 1.2.1).
본 실험결과, 도 3에서 나타내는 바와 같이 음성 대조군으로 사용된 비히클 처리군에 비해 4T1이 처리된 생쥐에서는 X-ray와 3차원 이미지에서 보이듯이 골 융해가 활발히 진행 되어 대퇴골의 해면골(trabecular bone)뿐만 아니라 헤드 부분까지도 거의 손실된 양상을 나타내고 있었다. 반면에 본 발명의 화합물이 투여된 실험군에서는 골 융해가 억제되어 해면골(trabecular bone)뿐만 아니라 대퇴골의 헤드도 그 형태가 남아 있는 것을 3차원 이미지를 통해 확인 하였다. 이는 직접 투여된 암세포에 의한 골 소실 모델을 통하여 생체 내에서도 골 융해 억제능이 작용함을 나타내고 있는 것이다. (도 3은 동물실험에서 JN2와 ION35의 저해 능력을 확인하고자 전이성 유방암 세포(4T1)를 생쥐 대퇴골(femur)에 직접적으로 투입시켜 골 소실을 유도하고 20일 경과 후 마이크로CT와 마이크로전산화단층촬영 (micro-computed tomography scan, SMX-90CT, Shimadzu, 일본)로 확인한 그림으로서, (위)는 전이성 유방암 세포에 의한 급격한 골 소실이 일정기간 동안 투여된 JN2와 ION35에 의해 골 소실이 저해됨을 X-ray로 관찰한 것이며, (아래)는 같은 대퇴골 시료를 마이크로전산화단층촬영 (micro-computed tomography scan, SMX-90CT, Shimadzu, 일본)을 수행하였고, 3차원 이미지(Volume Graphics, VG studio Max 1.2.1)를 얻어 골 소실이 감소됨을 확인한 것임).
실험예 4. 생쥐 모델에서 증명된 JN2 와 ION35 의 골 소실 저해 능력의 마이크로 CT 를 이용한 정량화
마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, SMX-90CT, Shimadzu, 일본)을 이용한 상기 3차원 이미지 파일을 TRI 3D-BON (RATOC system Engineering Co. 도쿄, 일본) 프로그램을 이용하여 골 손실 정도를 그래프로 표시하였다.
도 4에서 보듯이 (1) 전제조직 볼륨에서 골조직의 부피 비율% (2) 해면골 (trabecular bone)의 굵기㎛ (3)해면골의 개수1/mm (4)해면골의 분리적인 모든 면에서 4T1에 의해 일어난 골 융해가 JN-2와 ION35에 의해 저해되고 있음을 정량적인 측면에서도 확인할 수 있었다. (도 4는 전이성 유방암 세포(4T1)에 의한 생쥐의 대퇴골(femur) 소실 모델에서 JN2와 ION35의 골 소실 저해 능력을 마이크로 CT를 통해 정량화한 것으로서, (위)는 4T1에 의해 유도된 생쥐 대퇴골(femur) 소실에 대한 JN2와 ION35의한 저해 양상을 3차원 이미지 파일을 TRI 3D-BON (RATOC system Engineering Co. 도쿄, 일본)프로그램을 이용하여 이미지로 나타낸 그림(직접적으로 분석에 사용된 부분이며, (아래)는 각 그룹별 골 소실이 억제된 비율을 정량적으로 나타낸 그래프 (1) 전제조직 볼륨에서 골조직의 부피 비율% (2)해면골(trabecular bone)의 굵기㎛ (3)해면골의 개수1/mm (4)해면골의 분리를 정량적으로 나타낸 결과, JN2와 ION35이 함께 처리된 실험군에서 유의적으로 증가함을 확인한 것임).
실험예 5. 마이크로 CT 와 X- ray 를 통해 확인된 JN2 와 ION35 의 저해 능력에 대한 조직학적 분석
생쥐 골 소실 억제에 대한 JN-2와 ION35의 효과를 조직학적으로 알아보기 위하여, 마이크로전산화단층촬영이 끝난 생쥐 대퇴골 조직을 수세, 고정 과정을 거쳐 탈회를 2-3주 동안 실시하고 파라핀 블록을 제작하였다.
조직학적 분석을 위하여 파라핀 블록을 면도칼이 부착된 회전식 마이크로톰 (microtome, RM2245, LEICA)을 사용하여 6mm 두께로 절단하고 실험용 유리판 위에 부착 시킨 다음 대퇴골 내에 암세포와 해면골(trabecular bone)의 양상을 확인하고자 Hematoxylin & Eosin 염색 (Hematoxylin, GHS216; Eosin, HT110116; Sigma)을 실시하였고, 골 소실과 직접적인 관계가 있는 생체 내 파골세포 형성 및 이에 의한 골 소실 양상을 파악하기 위해 TRACP 염색법을 실시하였다 (Lee JH, Kim HN, Kim KO, Jin WJ, Lee S, Kim HH, Ha H, Lee ZH. 2012. CXCL10 promotes osteolytic bone metastasis by enhancing cancer outgrowth and osteoclastogenesis. Cancer Res. 2012 72(13):3175-86.).
본 실험결과, 4T1에 의해 해면골(trabecular bone)뿐만 아니라 피질골(cortical bone)의 융해까지 일어나는 현상이 본 발명의 합성물인 JN-2와 ION35에 의해 골 소실을 야기하는 파골 세포의 형성을 현저히 감소시킴에 따라 골 융해가 저해되어 해면 골 및 피질 골의 형태가 관찰되고 있는 것을 도 5를 통해 나타내고 있다.((좌)는 생쥐 대퇴골(femur)조직의 파라핀 블록 절단(section)을 이용하여 (위)H&E와 (아래)TRAP(+) 염색을 수행하여 현미경으로 관찰 한 그림이며, (우)는 같은 조직 내에 형성된 단위 면적당 파골세포의 수를 나타낸 그래프임).
실험예 6. JN2 와 ION35 의 골 소실 억제 동물 모델에서 혈청 내 Pyridinoline ( PYD ) 수준의 감소
골 융해와 같은 골 대사 질환의 연구와 진단을 위해 과학자 및 의사들은 골아세포(osteoblast)의 기능과 골 형성(bone formation)이나 골 흡수(bone resorption)를 평가하는 특정 골 대사 마커들의 측정을 통해 이를 판단한다.
다양한 골 대사 마커들은 성장 여러 단계에서 나타나기 때문에, 골아 세포 기능과 골 형성 및 골 흡수의 다양한 양상을 모니터링 하는데 유용하다. 그 중 골 흡수 마커인 Pyridinoline (PYD)는 콜라겐의 파괴에서 파생된 분해산물로 일반적인 골 흡수 마커로 인식되고 있다 (Yang JC, Bai L, Yap S, Gao AC, Kung HJ, Evans CP. 2010. Effect of the specific Src family kinase inhibitor saracatinib on osteolytic lesions using the PC-3 bone model. Mol Cancer Ther. 9(6):1629-37).
그리하여 동물 모델에서 혈액을 얻어 4℃, 4,000 rpm으로 20분간 원심분리를 통해 침전시켜 상층액의 맑은 혈청을 분리한 후 골 흡수 마커인 PYD를 효소 면역 측정법 (PYD EIA, Quidel Corporation, 미국)을 통해 확인하였다.
본 실험 결과, 도 6에서 보듯이, 4T1에 의해 증가한 PYD 수준이 JN-2와 ION35에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다. (도 6은 골 융해와 같은 골 흡수(bone resorption)를 평가하는 특정 골 대사 마커인 PYD (pyridinoline)를 혈청 내에서 측정해 본 결과, 그래프를 통해 알 수 있듯이 4T1에 의해 증가한 PYD가 JN-2와 ION35에 의존적으로 감소하는 것을 나타내는 그래프임).
골 전이성 암세포들이 골로 전이되는 과정에 있어 분비된 키모카인 리간드10(CXCL10)이 암세포에 존재하는 수용체와 결합하여 암세포의 증식능력을 증가시키고 전이된 뼈에 골 대사성 질환을 유발하는 역할을 하는데, 이런 CXCL10의 합성물인 JN-2와 ION35가 CXCL10과 서로 경쟁적으로 작용하여 CXCL10이 암세포 수용체에 결합할 수 있는 빈도 수를 낮춤으로 그 하위 신호전달을 억제하는 효과를 가져와 뼈에서 암세포의 증식 및 부착 능력을 저해하고 종국엔 골 융해를 저해함으로써 암환자의 골 전이 합병증의 예방 및 지연에 기여할 것으로 사료된다. 이런 JN-2와 ION35의 골 전이에 따른 골 흡수 저해능력은 사람과 유전적으로 상동성이 높은 생쥐 모델에서 입증되었으므로 이는 JN-2와 ION35가 골 전이성 골 대사 관련 질환에 있어 약제학적인 조성물로 효율적인 제어 물질이 될 가능성을 제시한다. 뿐만 아니라 본 연구 결과를 토대로 골 전이에 관여하는 유전자나 단백질을 타깃으로 한 치료물질 개발에 기여함으로써 부가가지 창출이 기대되며, 이와 같은 약제학적 조성물을 이용한 국소적, 전신적 골 전이성 골 융해의 발생을 저해함으로서 국민 건강에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.
하기에 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
JN-2 화합물 ---------------------------- 20 mg
유당 ---------------------------------- 100 mg
탈크 ----------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
ION35 화합물 --------------------------- 10 mg
옥수수전분 ---------------------------- 100 mg
유당 ---------------------------------- 100 mg
스테아린산 마그네슘 --------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
JN-2 화합물 ---------------------------- 10 mg
결정성 셀룰로오스 ----------------------- 3 mg
락토오스 ----------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 ----------------- 0.2 mg
통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
ION35 화합물 ---------------------------- 10 mg
만니톨 --------------------------------- 180 mg
주사용 멸균 증류수 -------------------- 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O ---------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
JN-2 화합물 ---------------------------- 20 mg
이성화당 -------------------------------- 10 g
만니톨 ----------------------------------- 5 g
정제수 ---------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 향레몬을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (8)

  1. CXCR3/CXCL10 결합 길항 활성을 나타내는, 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(I, JN-2) 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환으로는 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 전이성 간암, 전이성 신장암, 전이성 방광암, 전이성 흑색종, 전이성 다발성 골수종, 또는 전이성 갑상선암임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1항의 신규한 N-(4-(5-클로벤조[d]옥사졸-2-일아미노)페닐)-4-아미노부타나미드(a, JN-2) 화합물, 또는 N-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-클로로-4-니트로벤즈아미드 (b, ION-35)으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 전이성 암질환의 치료 및 예방용 표적 항암보조제.
  7. 삭제
  8. 삭제
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