JP2003501079A

JP2003501079A - Ｎａｄｅ（ｐ７５ｎｔｒ関連細胞死実行物質）をコードする遺伝子及びその使用

Info

Publication number: JP2003501079A
Application number: JP2001502545A
Authority: JP
Inventors: 孝明佐藤
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2003-01-14
Also published as: US20030079237A1; WO2000075278A9; US6960440B2; EP1198238A2; EP1198238A4; WO2000075278A3; WO2000075278B1; WO2000075278A2; CA2376382A1; AU5468400A; HK1046360A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリペプチドをコードする単離された核酸、及びｐ^７５ＮＴＲ受容体を結合し得る精製された形態の前記ポリペプチドを提供する。本発明は、ｐ^７５ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドを作成する方法を提供する。本発明は、上記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、ｐ^７５ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをベクター中に作成する方法、アポトーシス誘導化合物又は阻害化合物を同定する方法、前記ポリペプチドのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを切断するカスパーゼ−２及びカスパーゼ−３活性、並びに核ＤＮＡの断片化を細胞中に誘導する方法、細胞中のＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法、神経変性疾患を検出する方法、適切なベクター中に単離されたヒトＨＧＲ７４タンパク質を作成する方法、ｐ^７５ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドと薬学的に許容されるポリペプチドとを含む薬学的組成物、並びにアポトーシス阻害剤である化合物を同定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９９年６月７日に出願された米国特許出願第０９／３２７，７
５０号の優先権を出願するものであり、その一部継続出願であって、その内容全
体を参考文献として援用する。

【０００２】ここに記載された本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of H
ealth）助成Ｒ０１−ＧＭ５５１４７により助成された。従って、米国政府は本
発明に一定の権利を有している。

【０００３】本出願を通じて、様々な文献が括弧内に引用される。これらの参考文献の書誌
的事項は、明細書の末尾に記載されている。本発明が属する技術分野の水準をよ
り完全に記述するために、これらの文献の開示内容全体を参考文献として援用す
る。

【０００４】

【発明の背景】

低親和性ニューロトロフィン受容体（ｐ７５^ＮＴＲ）は、神経細胞において、
ＮＧＦ又は他のニューロトロフィンの刺激により、細胞の生存又は細胞死を媒介
することができる（１、２、３）。ｐ７５^ＮＴＲによって媒介されるシグナル伝
達を解明するために、酵母ツーハイブリッドシステムを用い、ラットのｐ７５^Ｎ ^ＴＲＩＣＤ（細胞内ドメイン）を標的として使用して、マウス胚ｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングがなされた。陽性クローンが１つ同定され、ＮＡＤＥ（
ｐ７５^Ｎ ^ＴＲａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｅｘｅｃｕｔｏ
ｒ；ｐ７５^ＮＴＲ関連細胞死実行物質）と名付けられた。ＮＡＤＥは、ヒトＨＧ
Ｒ７４タンパク質に著しい相同性を有し（４）、核外移行シグナル（ＮＥＳ）（
５）とユビキチン化のコンセンサス配列（６）以外には、典型的な生化学的モチ
ーフは有していない。ＮＡＤＥのｍＲＮＡは、脳、心臓、及び肺で最も多く発現
されていた。ＮＡＤＥは、インビトロとインビボの両者で、ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ
に特異的に結合する。ＮＡＤＥをｐ７５^ＮＴＲとともに発現させると、２９３Ｔ
細胞中に、ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）を切断するカス
パーゼ−２とカスパーゼ−３活性及び核ＤＮＡの断片化が劇的に誘導されたが、
ｐ７５^ＮＴＲが存在しないと、ＮＡＤＥはアポトーシスを示さず、ｐ７５^ＮＴＲを介したアポトーシスには、ＮＡＤＥの発現が必要であるが、アポトーシスを引
き起こすのには十分でないことを示唆している。さらに、ＮＡＤＥのｐ７５^ＮＴ ^ＲＩＣＤへのＮＧＦ依存性の動員は、用量依存的に観察され、ＮＡＤＥはＮＦ−
κＢの活性化を著しく阻害する。興味深いことに、ＮＡＤＥタンパク質は、タン
パク質分解経路の基質として、ユビキチン化されることが分かっている。総合す
ると、ＮＡＤＥは、ｐ７５^ＮＴＲによって媒介されるアポトーシスに関与するこ
とが同定された最初のシグナルアダプター分子であり、神経原性疾患の発症にお
いて重要な役割を果たしているかもしれない。

【０００５】

【発明の概要】

本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸分子を提供する。

【０００６】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを生産する方法であ
って、前記ポリペプチドの生産が可能な適切な条件下で、細菌、植物、昆虫、又
は哺乳類細胞からなる群から選択される宿主細胞を増殖させることを備えた方法
を提供する。

【０００７】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードするｍＲＮ
Ａ分子に特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを提供する。

【０００８】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドを提供す
る。

【０００９】本発明は、適切なベクター中にｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド
を作成する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド
をコードする核酸分子を適切なベクター中に挿入することと；（ｂ）適切な宿主
細胞中に、得られた前記ベクターを導入することと；（ｃ）前記導入された宿主
細胞から、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現している細胞を
選択することと；（ｄ）前記選択した細胞を培養して、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結
合し得るポリペプチドを産生させることと；（ｅ）産生されたｐ７５^ＮＴＲ受容
体を結合し得るポリペプチドを回収することとを備えた方法を提供する。

【００１０】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドとの結合（ここで、この結合はｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結
合し得るポリペプチドとの間で複合体を形成する）を阻害し得る化合物を同定す
る方法であって、（ａ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと前
記ｐ７５^ＮＴＲ受容体との結合が可能な条件下で、前記化合物を、前記ｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと接触させて、混合物を形成させることと
；（ｂ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体を工程（ａ）で得られた前記混合物と接触させるこ
とと；（ｃ）複合体を形成したｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合
し得るポリペプチドの量を測定することとを備えた方法を提供する。

【００１１】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドとの結合（ここで、この結合はｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結
合し得るポリペプチドとの間で複合体を形成する）を阻害し得る化合物を同定す
る方法であって、（ａ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと前
記ｐ７５^ＮＴＲ受容体との結合が可能な条件下で、前記化合物を前記ｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体と接触させて、混合物を形成させることと；（ｂ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドを、工程（ａ）で得られた前記混合物と接触させ
ることと；（ｃ）複合体を形成したｐ７５^ＮＴＲ受容体とポリペプチドの量を測
定することとを備えた方法を提供する。

【００１２】本発明は、細胞にアポトーシスを誘導させる方法であって、前記細胞中に、ｐ
７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現させることを備えた方法を提
供する。

【００１３】本発明は、対象にアポトーシスを誘導する方法であって、前記対象中に、ｐ７
５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現させることを備えた方法を提供
する。

【００１４】本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物中に、ｐ７５^ＮＴＲ受容体
を結合し得るポリペプチドを様々なレベルで発現させることの生理的な影響を測
定する方法であって、それぞれ、異なる量の、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチドを発現している一群のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作
成することを備えた方法を提供する。

【００１５】本発明は、対象に細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシス
を誘導するのに有効な量の、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペ
プチドを前記対象に投与することを備えた方法を提供する。本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を適
切な量の前記化合物と接触させることと、（ｂ）前記対象における、ｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベ
ルを測定することとを備え、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド
の遺伝子と前記ｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物がアポ
トーシス誘導化合物であることの指標である方法を提供する。

【００１６】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞を、
適切な量の前記化合物と接触させることと、（ｂ）前記細胞における、ｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レ
ベルを測定することとを備え、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドとｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス誘
導化合物であることの指標である方法を提供する。

【００１７】本発明は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内
ドメインを標的として用いて、ｃＤＮＡライブラリーから、ｐ７５^ＮＴＲ受容体
配列を結合し得るポリペプチドの配列をスクリーニングする方法を提供する。

【００１８】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲとを
同時発現させることによって、カスパーゼ−２とカスパーゼ−３活性を誘導させ
て、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを切断し、細胞中の核ＤＮＡを断片
化する方法を提供する。

【００１９】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲとを
用いて、細胞中でのＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法を提供する。

【００２０】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲの発
現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する方法を提供す
る。

【００２１】本発明は、ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードし、ＤＮＡ分子である単離され
た核酸を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。

【００２２】本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に、様々なレベルの、ヒト
ＨＧＲ７４タンパク質を発現させたときの生理的な影響を決定する方法であって
、各々が異なる量のヒトＨＧＲ７４タンパク質を発現している一群のヒト以外の
トランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法を提供する。

【００２３】本発明は、適切なベクター中に、単離されたヒトＨＧＲ７４タンパク質を作成
する方法であって、（ａ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードする核酸分子を適
切なベクタ−に挿入することと、（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に
導入することと、（ｃ）前記導入された宿主細胞から、ヒトＨＧＲ７４タンパク
質を発現している細胞を選択することと、（ｄ）前記選択された細胞を培養して
、ヒトＨＧＲ７４タンパク質を産生させることと、（ｅ）産生された前記ヒトＨ
ＧＲ７４タンパク質を回収することとを備えた方法を提供する。

【００２４】本発明は、対象中の細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシ
スを誘導するのに有効な量の前記精製されたヒトＨＧＲ７４タンパク質を前記対
象に投与することを備えた方法を提供する。

【００２５】本発明は、精製されたｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと薬学的
に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。

【００２６】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を適
切な量の前記化合物と接触させることと、（ｂ）前記対象における、ヒトＨＧＲ
７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定することと
を備え、前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子と前記ｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の
発現レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標で
ある方法を提供する。

【００２７】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞を、
適切な量の前記化合物と接触させることと、（ｂ）前記細胞における、ヒトＨＧ
Ｒ７４の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定することとを備え、
ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加
が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標である方法を提供す
る。

【００２８】本発明は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内
ドメインを標的として用いて、ヒトＨＧＲ７４配列を得るためにｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングする方法を提供する。

【００２９】本発明は、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲを同時発現させることに
よって、カスパーゼ−２とカスパーゼ−３活性を誘導させて、ポリ（ＡＤＰ−リ
ボース）ポリメラーゼを切断し、細胞中の核ＤＮＡを断片化する方法を提供する
。

【００３０】本発明は、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲを用いて、細胞中でのＮ
Ｆ−κＢの活性化を阻害する方法を提供する。

【００３１】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲの発
現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する方法を提供す
る。

【００３２】本発明は、アポトーシス阻害剤であり、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリ
ペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合を阻害してアポトーシスを抑制
し得る化合物を同定する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチド及びｐ７５^ＮＴＲ受容体を置換し得ることが予め示されている公知
の化合物と、結合したｐ７５^ＮＴＲ受容体とが結合して複合体を形成し得る条件
下で、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを、複数の化合物と接
触させることと；（ｂ）置換された前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペ
プチド又は工程（ａ）で形成された前記複合体を検出することとを備え、置換が
なされることが、前記化合物がｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと
ｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合を阻害し得る化合物であることの指標であ
る方法を提供する。

【００３３】本発明は、アポトーシス阻害剤であり、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体との特異的な結合を阻害してアポトーシスを抑制し得る化合物を同定
する方法であって、（ａ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質及びｐ７５^ＮＴＲ受容体を
置換し得ることが予め示されている公知の化合物と、結合したｐ７５^ＮＴＲ受容
体とが結合して複合体を形成し得る条件下で、前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質を
、複数の化合物と接触させることと；（ｂ）置換されたヒトＨＧＲ７４タンパク
質又は工程（ａ）で形成された前記複合体を検出することとを備え、置換がなさ
れることが、前記化合物がヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲ受容体との
特異的な結合を阻害し得る化合物であることの指標である方法を提供する。

【００３４】本発明は、ニュートロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名さ
れたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコード
する単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＮ末端のアミ
ノ酸１−４０が欠失され、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（４１−１２４）と命名
され、該ＮＡＤＥＮ（４１−１２４）がｐ７５^ＮＴＲの存在下でアポトーシス
を誘導する核酸分子を提供する。

【００３５】本発明は、ニュートロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名さ
れたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコード
する単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ末端のアミ
ノ酸７２−１２４が欠失され、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−７１）と命名
され、該ＮＡＤＥＮ（１−７１）がｐ７５^ＮＴＲの存在下及びｐ７５^ＮＴＲの
非存在下でアポトーシスを誘導する核酸分子も提供する。

【００３６】本発明は、さらに、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異
体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＮ
末端のアミノ酸１−４０とＣ末端のアミノ酸７２−１２４が欠失されており、該
欠失変異体はＮＡＤＥＮ（４１−７１）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下と
ｐ７５^ＮＴＲの非存在下で、ＮＡＤＥＮ（４１−７１）がアポトーシスを誘導
する核酸分子を提供する。

【００３７】本発明は、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名
されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコー
ドする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ末端のア
ミノ酸１２１−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−１
２０）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、ＮＡＤＥＮ（１−１２０）がア
ポトーシスを誘導する核酸分子を提供する。

【００３８】本発明は、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名
されたｐ７５^ＮＴＲと結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコードする
単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ末端のアミノ酸
１１３−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−１１２）
と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、ＮＡＤＥＮ（１−１１２）がアポトー
シスを誘導する核酸分子も提供する。

【００３９】本発明は、さらに、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異
体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ
末端のアミノ酸１０１−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ
（１−１００）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下とｐ７５^ＮＴＲの非存在下で
、ＮＡＤＥＮ（１−１００）がアポトーシスを誘導する核酸分子も提供する。

【００４０】本発明は、さらに、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの変異をコ
ードする単離された核酸分子であって、点変異によって、野生型ＮＡＤＥポリペ
プチドの９９位のアミノ酸ＡｌａがＬｅｕに置換され、該置換変異体ポリペプチ
ドはＮＡＤＥＮ（Ｌ９９Ａ）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、該ＮＡＤ
ＥＮ（Ｌ９９Ａ）がアポトーシスを誘導する核酸分子を提供する。

【００４１】

【発明の詳細な記述】

特定のヌクレオチドを示すために、明細書および図面の全体を通じて、以下の
標準的な略号を使用した。

【００４２】Ｃ＝シトシンＡ＝アデノシンＴ＝チミジンＧ＝グアノシン本明細書では、アミノ酸残基を以下のように略した。

【００４３】Ａ＝アラニンＣ＝システインＤ＝アスパラギン酸Ｅ＝グルタミン酸Ｆ＝フェニルアラニンＧ＝グリシンＨ＝ヒスチジンＩ＝イソロイシンＫ＝リジンＬ＝ロイシンＭ＝メチオニンＮ＝アスパラギンＰ＝プロリンＱ＝グルタミンＲ＝アルギニンＳ＝セリンＴ＝トレオニンＶ＝バリンＷ＝トリプトファンＹ＝チロシン本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸分子を提供する。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコー
ドする上記単離された核酸分子のある態様では、前記単離された核酸はＤＮＡ分
子である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする上記単離
された核酸分子の別の態様では、前記単離された核酸はｃＤＮＡ分子である。ｐ
７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする上記単離されたＤＮＡ
分子のさらなる態様では、前記単離された核酸はＲＮＡ分子である。ｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする上記単離された核酸分子のある
態様では、前記単離された核酸はＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結さ
れている。上記核酸分子のさらに別の態様では、前記単離された核酸分子はニュ
ーロトロフィン関連細胞死実行タンパク質をコードする。上記核酸分子のある態
様では、前記単離された核酸分子は、配列ＡＡＴＴＧＴＣＴＡＣＧＣＡＴＣ
ＣＴＴＡＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＡＣを有する。

【００４４】本明細書で使用する「ポリペプチド」には、ペプチドとタンパク質の両者が含
まれる。「ペプチド」は長さが１０アミノ酸残基未満のポリペプチドを意味し、
「タンパク質」は長さが１０アミノ酸残基以上のポリペプチドを意味する。本発
明において、前記ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、又は組換えポ
リペプチド（すなわち、組換えＤＮＡ技術によって作成されたもの）であり得、
変異（例えば、点変異、挿入及び欠失変異）に加え、他の共有結合的修飾（例え
ば、グリコシル化及び（ビオチン、ストレプトアビジン、フルオラシン（ｆｌｕ
ｏｒａｃｉｎｅ）、^１３１Ｉのような放射性同位体による）標識）を含有し得る
。さらに、本組成物は、各々、１以上のポリペプチド（すなわち、それぞれ、単
量体（重合体に結合した単一のポリペプチド）又は多量体（重合体に、又は互い
に結合した２以上のポリペプチド）であり得る）を含有し得る。

【００４５】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体は、ニュートロフィンに対して低い親和性を有する低
親和性神経成長因子（ＮＧＦ）受容体である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体は、細胞死と
細胞の生存の媒介に関与すると考えられている。

【００４６】「結合し得る」とは、相補的受容体部位（別のタンパク質又は他の種類の分子で
あり得る）を認識し、該部位と相互作用することができるタンパク質分子又は他
のペプチド分子の能力として定義される。

【００４７】本発明のＤＮＡ分子には、ポリペプチド類縁体、断片、又は抗原性ポリペプチ
ドの誘導体をコードし、天然に存在する形態とは１以上のアミノ酸残基の同一性
又は位置が異なり（欠失類縁体は、前記タンパク質の全残基より少ない残基を含
有し、置換類縁体は、１以上の残基が他の残基で置換されており、付加類縁体で
は、前記ポリペプチドの末端又は中間部に、１以上のアミノ酸残基が付加されて
いる）、且つ天然に存在する形態と特性の一部又は全部を共有するＤＮＡ分子も
含まれる。これらの分子には、選択した哺乳類でない宿主による発現に「好適」
なコドンが組み込まれ；制限エンドヌクレア−ゼ酵素による切断部位が与えられ
；易発現ベクタ−（ｒｅａｄｉｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｖｅｃｔｏｒｓ）の
構築を容易にする更なる先頭、末端、又は中間ＤＮＡ配列が与えられる。

【００４８】本明細書に記載され、且つ本明細書の特許請求の範囲に示されているＤＮＡ分
子は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドのアミノ酸配列についての
情報が有用であり、様々な組換え技術によってｐ７５^ＮＴＲ受容体、又はそれら
の断片を結合し得るポリペプチドを大規模に合成するための生成物としても有用
である。前記ＤＮＡ分子は、新規クロ−ニングベクタ−及び発現ベクタ−、形質
転換及びトランスフェクトされた原核及び真核宿主細胞、並びにｐ７５^ＮＴＲ受
容体又はそれらの部分に結合し得るポリペプチド及び関連産物を発現し得るこの
ような宿主細胞を培養して増殖する新規且つ有用な方法を作成するのに有用であ
る。

【００４９】本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結され、ｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドをコードする単離された核酸を有するベクターを
提供する。本発明のある態様では、ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結
され、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする単離された核
酸を有するベクターは、プラスミドである。別の態様では、上記単離された核酸
分子はｃＤＮＡ分子であって、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを
コードするｃＤＮＡ分子は、ヒト又はマウスのタンパク質をコードする。さらに
別の態様では、上記単離された核酸分子はｃＤＮＡ分子であって、前記核酸分子
は図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番号）を有するｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドをコードする。さらなる態様では、上記単離され
た核酸分子はｃＤＮＡ分子であって、前記核酸分子はｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合
し得るポリペプチドをコードする。上記単離された核酸分子がｃＤＮＡ分子であ
る態様では、前記核酸分子はｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドであ
って、マウス、ラット、又はヒトのタンパク質であるポリペプチドをコードする
。さらに、上記単離された核酸分子がｃＤＮＡ分子である別の態様では、前記単
離された核酸分子は図１Ｇー１に示された核酸配列（配列番号）を有する。

【００５０】本発明のタンパク質を発現するためには、数多くのベクターを使用し得る。こ
れらのベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファ
ージベクター、及び当業者に周知の他のウイルスが含まれる。例えば、あるベク
ターのクラスでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイ
ルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭ
ＴＶ、又はＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林ウイルス又はＳＶ４０ウイルスのような
動物ウイルス由来のＤＮＡ要素が使用される。さらに、染色体中に前記ＤＮＡが
安定に組込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする
１以上のマーカーを導入することによって選択し得る。前記マーカーは、例えば
、栄養要求性宿主に原栄養性を与え、殺生物剤耐性又は銅のような重金属に対す
る耐性を与え得る。前記選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ配列に
直接連結されるか、あるいは同時形質転換によって同じ細胞中に導入され得る。
発現に必要な制御要素は、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配
列とリボゾームが結合するための転写開始配列とを含む。ｍＲＮＡの合成を最適
化するためには、更なる要素も必要であり得る。これらの更なる要素には、スプ
ライシングシグナル、エンハンサー、終結シグナルが含まれ得る。例えば、細菌
の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、転写開始のため
のシャイン-ダルガルノ配列、及び開始コドンＡＵＧを含む。同様に、真核生物
の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種又は同種のプロモータ
ー、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、及びリボゾームを脱離
させるための終始コドンを含む。このようなベクターは、市販のものを購入して
もよく、あるいは本分野において周知の方法（例えば、前に概説したベクターを
構築するための方法）によって、既述の配列から組み立ててもよい。

【００５１】これらのベクターは、本発明のタンパク質を生産するための宿主ベクター系を
作成するために、適切な宿主細胞中に導入してもよい。宿主ベクター系の作成法
は当業者に周知である。

【００５２】核酸分子を細胞中に導入する方法は、当業者に周知である。このような方法に
は、例えば、ウイルスベクターの使用及びリン酸カルシウム共沈澱が含まれる。

【００５３】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする核酸分
子を有するベクターを備える宿主細胞を提供する。ある態様では、上記宿主細胞
は、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選択される
。

【００５４】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記核酸分子を発
現することができる「適切な宿主細胞」は、前記核酸分子を取り込んで、該核酸
分子によってコードされるｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る前記ポリペプチドを
安定に発現することができる任意の細胞である。

【００５５】適切な宿主細胞には、細菌細胞（グラム陽性細胞を含む）、酵母細胞、真菌細
胞、昆虫細胞、及び動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な動物
細胞には、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、及び様々な哺乳類の初代細
胞が含まれるが、これらに限定されない。マウスの線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細
胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ⁻細胞及びＣＯＳ細胞を含む多くの哺乳
類細胞を宿主として使用し得るが、これらに限定されない。哺乳類細胞は、リン
酸カルシウム沈澱、電気穿孔、及びマイクロインジェクションのような本分野に
おいて周知の方法によってトランスフェクトし得る。

【００５６】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの生物活性を有する
ポリペプチドを作成する方法であって、該ポリペプチドを作成し得る適切な条件
下で、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類細胞からなる群から選択された宿主細胞を
生育させることを備える方法を提供する。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリ
ペプチドの生物活性を有するポリペプチドを作成する上記方法の別の態様では、
該方法は、さらに、作成されたポリペプチドの回収することを備える。

【００５７】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記核
酸分子の配列中に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズすることが
できる、少なくとも１５の連続するヌクレオチドの単離された核酸分子を提供す
る。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記核酸分子の
配列中に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズすることができる、
少なくとも１５の連続するヌクレオチドの上記単離された核酸分子のある態様で
は、前記単離された核酸分子はＤＮＡ分子である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し
得るポリペプチドをコードする前記核酸分子の配列中に含まれるユニークな配列
と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５の連続するヌクレ
オチドの上記単離された核酸分子の別の態様では、前記単離された核酸分子はＲ
ＮＡ分子である。

【００５８】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記核
酸分子に対して相補的である核酸分子の配列中に含まれるユニークな配列と特異
的にハイブリダイズすることができる単離された核酸分子を提供する。ある態様
では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記核酸分子
に対して相補的である上記単離された核酸分子はＤＮＡ分子である。別の態様で
は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記核酸分子に
対して相補的である核酸分子の配列中に含まれるユニークな配列と特異的にハイ
ブリダイズすることができる核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができ
る上記単離された核酸分子はＲＮＡ分子である。

【００５９】当業者であれば、ｐ７５^ＮＴＲ受容体プラスミドを結合し得るポリペプチド中
にクローニングされたｃＤＮＡからユニークな配列を容易に取得し得るであろう
。このようなユニークな配列は、様々な哺乳類のｃＤＮＡライブラリー及びゲノ
ムＤＮＡ（例えば、マウス、ラット、及びウシ）をスクリーニングして、相同核
酸配列を得るための、及び異なるｃＤＮＡ組織ライブラリーをスクリーニングし
て前記得られた核酸配列のアイソフォームを得るためのプローブとして使用し得
る。さらに、ｐ７５^ＮＴＲ受容体プラスミドを結合し得る前記ポリペプチド中に
クローニングされたｃＤＮＡから得られた核酸プローブは、他のヒトの組織ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングして、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリ
ペプチドをコードする核酸配列のアイソフォームを得るために、及びヒトのゲノ
ムＤＮＡをスクリーニングして、類縁核酸配列を得るためにも使用し得る。前記
相同核酸配列とアイソフォームは、それらがコードするタンパク質を産生するた
めに使用し得る。

【００６０】本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子に結合し得るが、ｐ７
５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードするｐ７５^ＮＴＲ受容体分子
を結合し得るポリペプチドには結合し得ないことを意味する。

【００６１】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体分子を結合し得るポリペプチドをコードするｍ
ＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを提供する。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドのある態様で
は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチドをコードする単離されたｃＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし
得る核酸配列を有する。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の態様では、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリ
ペプチドをコードする単離されたＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得る核
酸配列を有する。

【００６２】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドを提供す
る。ある態様では、上記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチ
ドは、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする単離された核
酸によってコードされる。ある態様では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記
ポリペプチドは、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドの断
片である。別の態様では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記精製されたポリ
ペプチドは、図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番号）と実質的に同
一のアミノ酸配列を有する。さらなる態様では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得
る上記精製されたポリペプチドは、図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番
号）を有する。さらに別の態様では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記
ポリペプチドは、図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番号）を有する
。さらなる態様では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記ポリペプチドは、ｐ
７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る脊椎動物のポリペプチドである。ｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得る上記ポリペプチドのある態様では、ニューロトロフィン関連細
胞死実行タンパク質を含む。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記ポリペプチド
のさらに別の態様では、ＮＣＬＲＩＬＭＧＥＬＳＮを含む。

【００６３】本明細書で使用する精製されたポリペプチドとは、他のいかなるポリペプチド
も除去されたポリペプチドを意味する。

【００６４】本明細書において使用する図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番号）と「実質的に同一の」アミノ酸配列を有するｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチドは、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする核
酸によってコードされ、該核酸は、ホメオドメイン領域（前記タンパク質をコー
ドしている領域）が１００％同一であるが、非コード領域のヌクレオチドは異な
ってもよい。

【００６５】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記ポリペプチドのエピトープに
むけられたモノクローナル抗体を提供する。上記モノクローナル抗体のある態様
では、前記モノクローナル抗体は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るマウス、ラ
ット、又はヒトポリペプチドに対して誘導される。

【００６６】「抗体」という用語には、例えば、天然に存在する抗体と天然には存在しない
抗体の両者が含まれる。具体的には、「抗体」という用語には、ポリクローナル
及びモノクローナル抗体、並びにそれらの断片が含まれる。さらに、「抗体」と
いう用語には、キメラ抗体、完全な合成抗体、及びそれらの断片が含まれる。必
要に応じて、抗体には、検出可能なマーカーを標識することができる。検出可能
なマーカーには、例えば、放射性又は蛍光マーカーが含まれる。

【００６７】本発明は、図１Ｇ−１（配列番号）に示されたアミノ酸配列を有する精製
されたタンパク質のエピトープにむけられたポリクローナル抗体を提供する。さ
らなる態様では、上記モノクローナル又はポリクローナル抗体は、図１Ｇ−１（
配列番号）に示されたアミノ酸配列を有する、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し
得るポリペプチドに対して誘導される。

【００６８】ポリクローナル抗体は、本発明の免疫原（例えば、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合
し得る精製された哺乳類のポリペプチドか、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精
製されたヒトのポリペプチド）を、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス又は他の動物
のような宿主動物に注入することによって産生され得る。前記血清は、前記宿主
動物から抽出され、前記免疫原に特異的なポリクローナル抗体を得るためにスク
リーニングされる。ポリクローナル抗体のスクリーニング方法は、Ｈａｒｌｏｗ
＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：１９８８）に記載されているよ
うに、当業者に周知であって、その内容は、参考文献として、本明細書に組み込
まれる。

【００６９】前記モノクローナル抗体は、例えば、免疫原でマウスを免疫することによって
産生され得る。前記マウスは、免疫原性を示し得る量の上記免疫原を腹腔内に接
種された後、同じような量の該免疫原で追加免疫される。最終追加免疫の数日後
に前記免疫されたマウスから、脾臓を回収し、融合に用いるために該脾臓から細
胞懸濁物を調製する。

【００７０】本発明の実施に際しては、上記抗体は何れも、検出可能な標識で標識し得る。
ある態様では、前記標識された抗体は、精製された被標識抗体である。本発明で
使用する「抗体」という用語には、天然に存在する抗体と天然には存在しない抗
体の両者が含まれるが、これらに限定されない。具体的には、「抗体」という用
語には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにそれらの結合性断片が
含まれる。さらに、「抗体」という用語には、キメラ抗体、完全な合成抗体、及
びそれらの断片が含まれる。

【００７１】さらに、「抗体」という用語には、キメラ抗体及び完全な合成抗体、並びにそ
れらの断片が含まれる。検出可能な標識として機能する「検出可能な部分」は、
当業者に周知であって、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学
発光標識、又は二次酵素の段階若しくは結合の段階によって、検出され得る標識
が含まれるが、これらに限定されない。前記二次酵素の段階若しくは結合の段階
では、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、β−ガラクトシダーゼ、フルオレセイン、又はストレプトアビジン／ビオチン
の使用が含まれる。抗体を標識する方法は、本分野において周知である。

【００７２】前記抗体がこのような複合体を形成するかどうかの決定は、当業者に周知の方
法によってなし得る。好ましい態様では、前記決定は、フローサイトメトリー法
によってなされる。

【００７３】前記抗体は、アフィニティークロマトグラフィーで用いられるような不溶性マ
トリックスに結合し得る。本発明で使用する前記固定化されたモノクローナル抗
体と複合体を形成する細胞の単離は、当業者に周知の標準的な方法によってなし
得る。例えば、単離は、固定化抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー
を具備する。

【００７４】あるいは、前記抗体は、遊離の抗体であり得る。この場合、単離は、遊離の標
識された一次抗体又は二次抗体を用いた細胞分別を備え得る。このような細胞分
別法は標準的なものであり、当業者に周知である。

【００７５】前記標識された抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。
ある態様では、前記標識された抗体は、精製された被標識抗体である。「抗体」
という用語には、例えば、天然に存在する抗体と天然には存在しない抗体の両者
が含まれる。具体的には、「抗体」という用語には、ポリクローナル及びモノク
ローナル抗体、並びにそれらの断片が含まれる。さらに、「抗体」という用語に
は、キメラ抗体、完全な合成抗体、及びそれらの断片が含まれる。検出可能なマ
ーカーは、例えば、放射性又は蛍光マーカーであり得る。抗体を標識する方法は
、本分野において周知である。

【００７６】本発明は、細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞中に、ｐ７
５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記ポリペプチドを発現させることを備えた方法を
提供する。

【００７７】本発明は、対象にアポトーシスを誘導する方法であって、前記対象中に、ｐ７
５^ＮＴＲ受容体を結合し得る上記ポリペプチドを発現させることを備えた方法を
提供する。対象にアポトーシスを誘導する方法のさらなる態様では、前記対象は
ラット、マウス、又はヒトである。

【００７８】本明細書において使用する「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、任意の動物又は
人工的に改変された動物を意味する。人工的に改変された動物には、ヒトの免疫
系を有するＳＣＩＤマウスが含まれるが、これに限定されない。好ましい態様で
は、前記対象は、ヒトである。

【００７９】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸であって、ＤＮＡ分子である核酸を含むヒト以外のトランスジェニック
哺乳動物を提供する。上記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物のある態様で
は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする前記ＤＮＡは、
組織特異的な調節要素に作用可能に連結されている。

【００８０】本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に、様々なレベルの、ｐ７
５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現させたときの生理的な影響を決
定する方法であって、各々が、異なる量の、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポ
リペプチドを発現している一群のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成
することを備えた方法を提供する。

【００８１】本発明は、適切なベクター中に、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドを作成する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドをコードする核酸分子を適切なベクタ−に挿入することと、（ｂ）得られたベ
クタ−を適切な宿主細胞中に導入することと、（ｃ）前記導入された宿主細胞か
ら、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現している細胞を選択す
ることと、（ｄ）前記選択された細胞を培養して、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し
得るポリペプチドを産生させることと、（ｅ）産生された前記ｐ７５^ＮＴＲ受容
体を結合し得るポリペプチドを回収することとを備えた方法を提供する。

【００８２】本発明は、対象中の細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシ
スを誘導するのに有効な量の前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポ
リペプチドを前記対象に投与することを備えた方法を提供する。対象中の細胞に
アポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシスを誘導するのに有効な量の
前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドを前記対象に投与
することを備えた上記方法のある態様では、前記対象は哺乳動物である。対象中
の細胞にアポトーシスを誘導する上記方法の別の態様では、前記対象は、マウス
、ラット、又はヒトである。

【００８３】本明細書で使用する「アポトーシス」とは、細胞のプログラムされた細胞死を
意味する。前記プログラムされた細胞死の機序及び効果は、細胞溶解とは異なる
。アポトーシスの効果としては、ＤＮＡの断片化及びアポトーシス小体と称され
る膜に結合した小断片へのＤＮＡの崩壊等を観察することができる。

【００８４】本明細書で使用する「対象」とは、任意の動物又は人工的に改変された動物を
意味する。人工的に改変された動物には、ヒトの免疫系を有するＳＣＩＤマウス
が含まれるが、これに限定されない。好ましい態様では、前記対象はヒトである
。

【００８５】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドと薬学的
に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。

【００８６】本発明は、有効量の上記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと薬学
的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。本発明において、「有効
量」とは、前記タンパク質が治療に有効であると推定されている疾病又は異常に
罹患している患者に投与したときに有効であり、前記疾病又は異常の減少、軽減
、又は退行をもたらす任意の量の、上記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペ
プチドである。本発明において、「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物
を調合するのに有用な当業者に公知である任意の生理的担体である。

【００８７】ある好ましい態様では、前記薬学的担体は液体であって、前記薬学的組成物は
溶液の形態であり得る。同様に好ましい別の様態では、前記薬学的に許容される
担体は個体であって、前記組成物は粉末又は錠剤の形態である。さらなる態様で
は、前記薬学的担体はゲルであって、前記組成物は坐剤又はクリームの形態であ
る。さらなる態様では、前記化合物は、薬学的に許容される経皮パッチの一部と
して調合され得る。

【００８８】固体の担体には、香料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、賦形剤、流動促進剤（ｇ
ｌｉｄａｎｔ）、圧縮補助剤、結合剤、又は錠剤崩壊剤としても作用し得る１以
上の物質が含まれ得る。固体担体はカプセル化物質でもあり得る。粉末では、前
記担体は、細粉化された活性成分と混合されている細粉化された固体である。錠
剤では、前記活性成分は、適切な比率の必要な圧縮特性を有する担体と混合され
、所望の形状とサイズに圧縮される。好ましくは、前記粉末と前記錠剤は、前記
活性成分を９９％まで含有する。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウ
ム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デン
プン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融解ワックス、及びイ
オン交換樹脂が含まれる。

【００８９】液体担体は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリクシル剤、及び加
圧された組成物を調製するために用いられる。前記活性成分は、水、有機溶媒、
薬学的に許容されるオイルと脂肪の混合物、又は薬学的に許容されるオイル若し
くは脂肪のような薬学的に許容される液体担体中に、溶解又は懸濁し得る。前記
液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味料、香料、懸濁剤、濃縮
剤、色素、粘度調節剤、安定剤、又は浸透圧調節剤のような他の適切な薬学的添
加剤を含有し得る。経口投与及び非経口投与用の液体担体の適切な例には、水（
部分的に上記のような添加物、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシ
メチルセルロースナトリウム溶液を含有する）、アルコール（一価アルコール及
び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、並びにオイ
ル（例えば、ヤシ油とピーナッツ油）が含まれる。非経口投与の場合、前記担体
は、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルのような油状エステルであ
り得る。滅菌された液体担体は、非経口投与用の滅菌された液体形態の組成物に
おいて有用である。加圧された組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素
又は他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。

【００９０】滅菌溶液又は懸濁液である液体の薬学的組成物は、例えば、筋肉内、くも膜下
腔内、硬膜外、腹腔内又は皮下投与に使用し得る。滅菌溶液は、静脈内にも投与
され得る。前記化合物は、滅菌固体組成物として調製され、投与時に、滅菌水、
滅菌生理食塩水、又は他の適切な注射可能な滅菌媒体を用いて、溶解又は懸濁し
得る。担体は、必要な不活性結合剤、懸濁剤、潤滑剤、香料、甘味料、防腐剤、
色素、及びコーティング剤を含み得る。

【００９１】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを有する上記薬学的組成物は、
他の溶質又は懸濁剤（例えば、前記溶液を等張にするのに十分な量の生理食塩水
又はグルコース、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポ
リソルベート８０（エチレンオキサイドと共重合したソルビトールのオレイン酸
エステルとその無水物）等）を含有する滅菌溶液又は懸濁液の形態で、経口投与
され得る。

【００９２】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを有する上記薬学的組成物は、
液体又は固体のうち何れの形態の組成物としても、経口投与することが可能であ
る。経口投与に適した組成物には、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、及び粉末のよ
うな固体形態と、溶液、シロップ、エリクシル剤、及び懸濁液のような液体形態
とが含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、及び懸
濁液が含まれる。

【００９３】投与すべき最適な用量は、当業者によって決定され、使用しているｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体を結合し得るポリペプチドを含む当該上記薬学的組成物、調製物の強度
、投与方法、及び病状又は異常の進行度に応じて変化し得る。患者の年齢、体重
、性別、食事、投与時間を含む、治療を受けている当該患者に応じた更なる要素
によっても、用量を調節する必要性が生じるであろう。

【００９４】本明細書において、投与は、当業者に公知の任意の様々な方法を用いて、実施
又は実行し得る。前記投与は、注入、リポソームを介した送達、エアロゾル送達
；局所、経口、経鼻、経肛門、経眼、又は経耳送達によって、静脈内、腹腔内、
くも膜下腔内、リンパ内、筋肉内、病巣内、非経口、硬膜外、皮下に為し得る。

【００９５】ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとの結合
を阻害し得る化合物を同定する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体に結合
し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体とが結合して複合体を形成し得る条件
下で、前記化合物を、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと接触させ
ることと；（ｂ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を、工程（ａ）で得られた混合物と接
触させることと；（ｃ）形成された複合体、若しくは未結合のｐ７５^ＮＴＲ受容
体、若しくは未結合の前記ポリペプチド、又はこれらのうちの何れかの組み合わ
せの量を測定することとを備えた方法。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結
合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態
様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、ニューロトロフィン関
連細胞死実行物質である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリ
ペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記
ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、ヒトＨＧＲ７４タンパク質である。
ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し
得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得る
ポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ａ配列である。ｐ７
５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る
化合物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリ
ペプチドは、図１Ｈに規定されているｈｕｎａｄｅ３ａ１配列である。ｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合
物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプ
チドは、図１Ｈに規定されているｈｕｎａｄｅ３ａ２配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を
同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチド
は、図１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ａ配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体
とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定す
る上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図
１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ｂ配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７
５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記
方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに
規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ｂ配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^Ｎ ^ＴＲを結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記方法
のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定
されているｈｕｍｎａｄｅ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを
結合し得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記方法のある
態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されて
いるｒａｔｎａｄｅ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し
得るポリペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様で
は、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｍ
ｕｓｎａｄｅ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポ
リペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前
記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｈｕｍｎ
ａｄｅ２配列である。

【００９６】ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとの結合
であり、ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと
の複合体を形成せしめる結合を阻害し得る化合物を同定する方法であって、（ａ
）ｐ７５^ＮＴＲ受容体に結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体とが結合
して複合体を形成し得る条件下で、前記化合物を、ｐ７５^ＮＴＲ受容体と接触さ
せることと；（ｂ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を、工程（ａ）で得られた混合物と
接触させることと；（ｃ）形成された複合体、若しくは未結合のｐ７５^ＮＴＲ受
容体、若しくは未結合の前記ポリペプチド、又はこれらのうちの何れかの組み合
わせの量を測定することとを備えた方法。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを
結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では
、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、ニューロトロフィン関連細胞
死実行タンパク質である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリ
ペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^Ｎ ^ＴＲを結合し得るポリペプチドは、ヒトＨＧＲ７４タンパク質である。ｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定
する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、
図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ａ配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体と
ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法
のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定
されているｈｕｎａｄｅ３ａ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様で
は、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｈ
ｕｎａｄｅ３ａ２配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得る
ポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７
５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３
ａ配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを
阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合
し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ｂ配列である。
ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合
物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプ
チドは、図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ｂ配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する
上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１
Ｈに規定されているｈｕｍｎａｄｅ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５ ^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある
態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されて
いるｒａｔｎａｄｅ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し
得るポリペプチドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記
ｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａ
ｄｅ１配列である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲを結合し得るポリペプチ
ドを阻害し得る化合物を同定する上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲを
結合し得るポリペプチドは、図１Ｈに規定されているｈｕｍｎａｄｅ２配列であ
る。

【００９７】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を、
適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記対象中での、ｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲ受容体の遺伝子の発
現レベルを測定することとを備え、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲ受容体の遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物が
アポトーシス誘導化合物であることの指標である方法を提供する。アポトーシス
誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を、適切な量の前記化合物と接
触させることと；（ｂ）前記対象中での、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリ
ペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲ受容体の遺伝子の発現レベルを測定することと
を備え、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲ受容体の遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物で
あることの指標である上記方法のある態様では、前記対象は哺乳動物である。ア
ポトーシス誘導化合物を同定する上記方法のある態様では、前記哺乳動物の対象
は、マウス、ラット、又はヒトである。

【００９８】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞を、
適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記細胞中での、ｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベ
ルを測定することとを備え、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺
伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス
誘導化合物であることの指標である方法を提供する。

【００９９】アポトーシス誘導化合物は、抗体、無機化合物、有機化合物、ペプチド、ペプ
チド類似化合物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ポリ
ペプチド又はタンパク質、一部又は全ての特性を共有する断片又は誘導体（例え
ば、融合タンパク質）であり得（これらに限定されない）、アポトーシスを誘導
する化合物と定義される。前記化合物は、天然に存在するものであって、精製に
よって取得することができ、あるいは、天然に存在しないものであって、合成に
よって取得することができる。

【０１００】本発明は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内
ドメインを標的として用いて、ｃＤＮＡライブラリーから、ｐ７５^ＮＴＲ受容体
配列を結合し得るポリペプチドの配列をスクリーニングする方法を提供する。酵
母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメインを標的
として用いて、ｐ７５^ＮＴＲ受容体配列を結合し得るポリペプチドを得るために
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする上記方法のある態様では、前記ｃＤ
ＮＡライブラリーは、哺乳動物のものである。酵母ツーハイブリッドシステムを
用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメインを標的として用いて、ｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドを得るためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングする上記方法の別の態様では、前記ｃＤＮＡライブラリーは哺乳動物のもの
であり、該哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーは、ラット、マウス、又はヒトのｃ
ＤＮＡライブラリーに由来する。酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及び
ｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメインを標的として用いて、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し
得るポリペプチドを得るためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする上記
方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的は、哺乳動物のもの
である。酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメ
インを標的として用いて、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを得る
ためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする上記方法のある態様では、前
記ｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的は、ラット、マウス、又はヒトｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的である。

【０１０１】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲとを
同時発現させることによって、カスパーゼ−２とカスパーゼ−３活性を誘導させ
て、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを切断し、細胞中の核ＤＮＡを断片
化する方法を提供する。

【０１０２】カスパーゼは、プロテアーゼファミリーのメンバーであり、線虫致死遺伝子（
ｃｅｄ−３）の哺乳類における相同物であって、哺乳類のアポトーシスに必要と
される。カスパーゼ−２とカスパーゼ−３のレベルの増加は、アポトーシスと関
連している。カスパーゼは、それらの基質のアスパラギン酸残基を切断するシス
テインアスパルターゼである。カスパーゼを活性化させるには、アスパラギン酸
残基で切断して、活性なヘテロ二量体を形成させる必要がある。

【０１０３】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲとを
用いて、細胞中でのＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法を提供する。

【０１０４】ＮＦ−κＢは、外的な刺激によって活性化されて、核に移行し、ここでＤＮＡ
を結合し、遺伝子の転写を調節する一次転写因子である。ラットのシュワン細胞
では、ｐ７５^ＮＴＲニューロトロフィン受容体への神経成長因子の結合は、チロ
シンキナーゼ受容体Ａの非存在下で、ＮＦ−κＢの活性化を誘導し、細胞の生存
をもたらす。ＮＦ−κＢは、細胞表面分子及びサイトカインを含む様々なタンパ
ク質の遺伝子の発現を調節する。

【０１０５】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲの発
現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する方法を提供す
る。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲの発現レベル
を検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する上記方法のある態様で
は、前記対象は哺乳動物である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド
とｐ７５^ＮＴＲの発現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を検
出する上記方法の別の態様では、前記哺乳動物の対象は、マウス、ラット、又は
ヒトである。

【０１０６】本発明は、ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードし、ＤＮＡ分子である単離され
た核酸を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。上記ヒト以
外のトランスジェニック哺乳動物のある態様では、ヒトＨＧＲ７４タンパク質を
コードする前記ＤＮＡは、組織特異的な調節要素に作用可能に連結されている。

【０１０７】本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に、様々なレベルの、ヒト
ＨＧＲ７４タンパク質を発現させたときの生理的な影響を決定する方法であって
、各々が異なる量のヒトＨＧＲ７４タンパク質を発現している一群のヒト以外の
トランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法を提供する。

【０１０８】本発明は、適切なベクター中に、ヒトＨＧＲ７４タンパク質を作成する方法で
あって、（ａ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードする核酸分子を適切な発現ベ
クタ−に挿入することと、（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に導入す
ることと、（ｃ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質を発現している、前記導入された宿
主細胞を選択することと、（ｄ）前記選択された細胞を培養して、ヒトＨＧＲ７
４タンパク質を産生させることと、（ｅ）産生された前記ヒトＨＧＲ７４タンパ
ク質を回収することとを備えた方法を提供する。

【０１０９】本発明は、対象中の細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、アポトーシ
スを誘導するのに有効な量の前記精製されたヒトＨＧＲ７４タンパク質を前記対
象に投与することを備えた方法を提供する。対象中の細胞にアポトーシスを誘導
する方法であって、アポトーシスを誘導するのに有効な量の前記精製されたヒト
ＨＧＲ７４を前記対象に投与することを備えた上記方法のある態様では、前記対
象は哺乳動物である。対象中の細胞にアポトーシスを誘導する上記方法の別の態
様では、前記対象はマウス、ラット、又はヒトである。

【０１１０】本発明は、精製されたヒトＨＧＲ７４タンパク質と薬学的に許容される担体と
を含む薬学的組成物を提供する。

【０１１１】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を、
適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記対象における、ヒトＨＧ
Ｒ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定すること
とを備え、ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レ
ベルの増加が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標である方
法を提供する。アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を
、適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記対象における、ヒトＨ
ＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定するこ
ととを備え、ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現
レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標である
上記方法のある態様では、前記対象は哺乳動物である。アポトーシス誘導化合物
を同定する上記方法のある態様では、前記哺乳動物の対象は、マウス、ラット、
又はヒトである。

【０１１２】本発明は、アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞を、
適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記細胞における、ヒトＨＧ
Ｒ７４の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定することとを備え、
ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加
が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標である方法を提供す
る。

【０１１３】本発明は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内
ドメインを標的として用いて、ヒトＨＧＲ７４配列を得るためにｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングする方法を提供する。酵母ツーハイブリッドシステムを
用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメインを標的として用いて、ヒトＨＧＲ７４
配列を得るためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする上記方法のある態
様では、前記ｃＤＮＡライブラリーは哺乳動物のものである。酵母ツーハイブリ
ッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメインを標的として用いて、
ｃＤＮＡライブラリーからヒトＨＧＲ７４をスクリーニングする上記方法のある
態様では、前記ｃＤＮＡライブラリーは、哺乳動物のものであり、前記哺乳動物
のｃＤＮＡライブラリーは、ラット、マウス、又はヒトのｃＤＮＡライブラリー
に由来する。酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内
ドメインを標的として用いて、ヒトＨＧＲ７４配列を得るためにｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングする上記方法の別の態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲ細胞内
ドメイン標的は、哺乳動物のものである。酵母ツーハイブリッドシステムを用い
て、及びｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメインを標的として用いて、ヒトＨＧＲ７４配列
を得るためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする上記方法のある態様で
は、前記ｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的は、ラット、マウス、又はヒトｐ７５ ^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的である。

【０１１４】本発明は、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲを同時発現させることに
よって、カスパーゼ−２とカスパーゼ−３活性を誘導させて、ポリ（ＡＤＰ−リ
ボース）ポリメラーゼを切断し、細胞中の核ＤＮＡを断片化する方法を提供する
。

【０１１５】本発明は、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲを用いて、細胞中でのＮ
Ｆ−κＢの活性化を阻害する方法を提供する。

【０１１６】本発明は、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲの発
現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する方法を提供す
る。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲの発現レベル
をを検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する上記方法のある態様
では、前記対象は哺乳動物である。ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドとｐ７５^ＮＴＲの発現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を
検出する上記方法の別の態様では、前記対象は哺乳動物であり、前記哺乳動物は
ヒトである。

【０１１７】本発明は、アポトーシス阻害剤であり、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリ
ペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合を阻害してアポトーシスを抑制
し得る化合物を同定する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチド及びｐ７５^ＮＴＲ受容体を置換し得ることが予め示されている公知
の化合物と、結合したｐ７５^ＮＴＲ受容体とが結合して複合体を形成し得る条件
下で、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを、複数の化合物と接
触させることと；（ｂ）置換された前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペ
プチド又は工程（ａ）で形成された前記複合体を検出することとを備え、置換が
なされることが、前記化合物がｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと
ｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合を阻害し得る化合物であることの指標であ
る方法を提供する。上記方法の別の態様では、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合の阻害がレポーター遺伝子
の転写活性に影響を与える。上記方法のさらなる態様では、置換された前記ｐ７
５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド又は前記複合体は、工程（ｂ）におい
て、工程（ａ）で前記化合物と接触させる前及び後にレポーター遺伝子の転写活
性を比較することによって検出され、該活性の変化が、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体
を結合し得るポリペプチドと前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合が阻害さ
れ、且つ前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが置換されることの
指標となる。上記方法のある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体は固相支持体に
結合される。上記方法のさらなる態様では、前記化合物は固相支持体に結合され
る。上記方法のある態様では、前記化合物は、抗体、無機化合物、有機化合物、
ペプチド、ペプチド類似化合物、ポリペプチド又はタンパク質を具備する。上記
方法のある態様では、工程（ａ）の接触はインビトロで行われる。上記方法のさ
らなる態様では、工程（ａ）の接触はインビボで行われる。上記方法のある態様
では、工程（ａ）の接触は酵母細胞中で行われる。上記方法の態様では、工程（
ａ）の接触は哺乳類細胞中で行われる。上記方法のある態様では、前記ｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドは、細胞表面受容体である。上記方法のあ
る態様では、前記細胞表面受容体はｐ７５受容体である。

【０１１８】本明細書において使用する「レポーター遺伝子の転写活性」とは、前記レポー
ター遺伝子の発現レベルが、前記シグナル伝達タンパク質及び前記細胞質タンパ
ク質が結合するとき観察されるレベルとは変化し得ることを意味する。前記シグ
ナル伝達タンパク質と前記細胞質タンパク質との間の結合に依存する他の生物機
能を検出することによって、前記化合物を同定することもできる。レポーター遺
伝子の例は多数存在し、本分野において周知であり、ヒスチジン耐性遺伝子、ア
ンピシリン耐性遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限
定されない。

【０１１９】さらに、前記細胞質タンパク質は、固相支持体に結合してもよい。あるいは、
前記化合物を固相支持体に結合してもよく、抗体、無機化合物、有機化合物、ペ
プチド、ペプチド類似化合物、ポリペプチド、又はタンパク質を有する。

【０１２０】前記方法の例は、以下に記載されている。前記細胞質タンパク質と検出可能な
標識に結合された前記化合物との免疫沈降のような直接的な検出方法を用いるこ
とによって、前記シグナル伝達タンパク質と前記細胞質タンパク質との特異的な
結合を阻害し得る化合物を同定することができる。さらに、遺伝子発現のレベル
の増加又は減少を検出するような間接的な検出方法を用いることもできるであろ
う。以下で論述されているように、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインに融合された
合成ペプチドを構築することができる。適切なレポーター遺伝子を有する適切な
細胞株とともに、Ｌ４０株中にこれらの構築物を形質転換し得るであろう。その
後、前記レポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって、阻害が起こっ
たか否かを検出し得る。当業者であれば、前記レポーター遺伝子の発現レベルを
検出するために、様々な周知の方法、例えば、酵母、哺乳類、又は他の細胞にお
けるツーハイブリッドシステムを使用することができるであろう。

【０１２１】さらに、工程（ａ）の接触は、インビトロ、インビボ、及び適切な細胞（例え
ば酵母細胞又は哺乳類細胞）中で特異的に行い得る。哺乳類細胞の例には、マウ
スの線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ−細胞、Ｃ
ｏｓ細胞等が含まれるが、これらに限定されない。

【０１２２】他の適切な細胞には、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌細胞（グラム陽性
細胞を含む）、真菌細胞、昆虫細胞、及び他の動物細胞が含まれるが、これらに
限定されない。

【０１２３】本発明は、アポトーシス阻害剤であり、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体との特異的な結合を阻害してアポトーシスを抑制する化合物を同定す
る方法であって、（ａ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質及びｐ７５^ＮＴＲ受容体を置
換し得ることが予め示されている公知の化合物と、結合したｐ７５^ＮＴＲ受容体
とが結合して複合体を形成し得る条件下で、前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質を、
複数の化合物と接触させることと；（ｂ）置換されたヒトＨＧＲ７４タンパク質
又は工程（ａ）で形成された前記複合体を検出することとを備え、置換がなされ
ることが、前記化合物がヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲ受容体との特
異的な結合を阻害し得る化合物であることの指標である方法を提供する。上記方
法のある態様では、ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的
な結合の阻害がレポーター遺伝子の転写活性に影響を与える。上記方法のさらな
る態様では、置換された前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質又は前記複合体は、工程
（ｂ）において、工程（ａ）で前記化合物と接触させる前及び後に、レポーター
遺伝子の転写活性を比較することによって検出され、該活性の変化が、前記ヒト
ＨＧＲ７４タンパク質と前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合が阻害され、
且つ前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質が置換されることの指標となる。上記方法の
ある態様では、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体は固相支持体に結合される。上記方法の
さらなる態様では、前記化合物は固相支持体に結合される。上記方法のある態様
では、前記化合物は、抗体、無機化合物、有機化合物、ペプチド、ペプチド類似
化合物、ポリペプチド又はタンパク質を具備する。上記方法のある態様では、工
程（ａ）の接触はインビトロで行われる。上記方法のさらなる態様では、工程（
ａ）の接触はインビボで行われる。上記方法のある態様では、工程（ａ）の接触
は酵母細胞中で行われる。上記方法のある態様では、工程（ａ）の接触は哺乳類
細胞中で行われる。上記方法のある態様では、前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質は
、細胞表面受容体である。上記方法のある態様では、前記細胞表面受容体はｐ７
５受容体である。

【０１２４】本明細書において使用する「レポーター遺伝子の転写活性」とは、前記レポー
ター遺伝子の発現レベルが、前記シグナル伝達タンパク質及び前記細胞質タンパ
ク質が結合するとき観察されるレベルとは変化し得ることを意味する。前記シグ
ナル伝達タンパク質と前記細胞質タンパク質との結合に依存する他の生物機能を
検出することによって、前記化合物を同定することもできる。レポーター遺伝子
の例は多数存在し、本分野において周知であり、ヒスチジン耐性遺伝子、アンピ
シリン耐性遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定さ
れない。

【０１２５】さらに、前記細胞質タンパク質は、固相支持体に結合してもよい。前記化合物
を固相支持体に結合してもよく、前記化合物は抗体、無機化合物、有機化合物、
ペプチド、ペプチド類似化合物、ポリペプチド、又はタンパク質を具備する。

【０１２６】前記方法の例は、以下に記載されている。前記細胞質タンパク質と検出可能な
標識に結合された前記化合物との免疫沈降のような直接的な検出方法を用いるこ
とによって、前記シグナル伝達タンパク質と前記細胞質タンパク質との特異的な
結合を阻害し得る化合物を同定することができる。さらに、遺伝子の発現レベル
の増加又は減少を検出し得る間接的な検出方法を用いることもできるであろう。
以下で論述されているように、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインに融合された合成
ペプチドを構築し得る。これらの構築物は、適切なレポーター遺伝子を有する適
切な細胞株とともにＬ４０株の中に形質転換し得る。その後、前記レポーター遺
伝子の発現レベルを検出することによって、阻害が起こったか否かを検出するこ
とができる。当業者であれば、前記レポーター遺伝子の発現レベルを検出するた
めに、様々な周知の方法、例えば、酵母、哺乳類、又は他の細胞におけるツーハ
イブリッドシステムを使用することができるであろう。

【０１２７】さらに、工程（ａ）の接触は、インビトロ、インビボ、及び適切な細胞（例え
ば、酵母細胞又は哺乳類細胞）の中で特異的に行い得る。哺乳類細胞の例には、
マウスの線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ−細胞
、Ｃｏｓ細胞等が含まれるが、これらに限定されない。

【０１２８】他の適切な細胞には、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌細胞（グラム陽性
細胞を含む）、真菌細胞、昆虫細胞、及び他の動物細胞が含まれるが、これらに
限定されない。

【０１２９】以下の物質についての理解を容易にするために、頻繁に現れる幾つかの方法及
び／又は用語がＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，１９８９に最も詳しく説明さ
れている。

【０１３０】本発明は、ニュートロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名さ
れたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコード
する単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＮ末端のアミ
ノ酸１−４０が欠失され、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（４１−１２４）と命名
され、該ＮＡＤＥＮ（４１−１２４）がｐ７５^ＮＴＲの存在下でアポトーシス
を誘導する核酸分子を提供する。

【０１３１】本発明は、ニュートロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名さ
れたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコード
する単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ末端のアミ
ノ酸７２−１２４が欠失され、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−７１）と命名
され、該ＮＡＤＥＮ（１−７１）がｐ７５^ＮＴＲの存在下及びｐ７５^ＮＴＲの
非存在下でアポトーシスを誘導する核酸分子も提供する。

【０１３２】本発明は、さらに、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異
体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＮ
末端のアミノ酸１−４０とＣ末端のアミノ酸７２−１２４が欠失されており、該
欠失変異体はＮＡＤＥＮ（４１−７１）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下と
ｐ７５^ＮＴＲの非存在下で、ＮＡＤＥＮ（４１−７１）がアポトーシスを誘導
する核酸分子を提供する。

【０１３３】本発明は、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名
されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコー
ドする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ末端のア
ミノ酸１２１−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−１
２０）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、ＮＡＤＥＮ（１−１２０）がア
ポトーシスを誘導する核酸分子を提供する。

【０１３４】本発明は、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ）と命名
されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異体をコー
ドする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ末端のア
ミノ酸１１３−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−１
１２）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、ＮＡＤＥＮ（１−１１２）がア
ポトーシスを誘導する核酸分子も提供する。

【０１３５】本発明は、さらに、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異
体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ
末端のアミノ酸１０１−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ
（１−１００）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下とｐ７５^ＮＴＲの非存在下で
、ＮＡＤＥＮ（１−１００）がアポトーシスを誘導する核酸分子も提供する。

【０１３６】本発明は、さらに、ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの変異をコ
ードする単離された核酸分子であって、点変異によって、野生型ＮＡＤＥポリペ
プチドの９９位のアミノ酸ＡｌａがＬｅｕに置換され、該置換変異体ポリペプチ
ドはＮＡＤＥＮ（Ｌ９９Ａ）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、該ＮＡＤ
ＥＮ（Ｌ９９Ａ）がアポトーシスを誘導する核酸分子を提供する。

【０１３７】本発明は、以下の実験の詳細を通じて、よりよく理解されるであろう。しかし
ながら、当業者であれば、論述されている具体的な方法と結果は、その後に続く
特許請求の範囲により完全に記載されている本発明を単に例示するものにすぎな
いことが容易に理解できるであろう。

【０１３８】

【実験の詳細】

結果と考察ｐ７５^ＮＴＲは最初に単離されたニューロトロフィン受容体であり、ＴＮＦＲ
（ｔｕｍｏｒｎｅｃｔｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリ
ーのメンバーである（７，８）。しかしながら、その機能的役割及びシグナル伝
達経路の多くはなお不明である（９）。ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤは、タイプ２細胞死
誘導領域（１０）によく保存されているＣ末端領域を除いては典型的な生化学的
なモチーフを有していないので、ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ結合タンパク質の存在が想
定されていた。最近、ＴＲＡＦ６がｐ７５^ＮＴＲを介したシグナル伝達に関与し
ていることが報告された（１１）。ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ結合タンパク質をさらに
同定するために、本発明者らは、ラットのｐ７５^ＮＴＲＩＣＤをターゲットとし
て用いた酵母ツーハイブリッドシステムによって、マウスのｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、陽性クローンのうちの１つがｐ７５^ＮＴＲ関連細胞死実
行物質（ｐ７５^ＮＴＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｅｘｃ
ｕｔｏｒ）、ＮＡＤＥとして同定された。

【０１３９】ＮＡＤＥは１２４アミノ酸残基からなり、計算上の分子量は１４，５３２ダル
トンである。ＮＡＤＥは親水性の酸性タンパク質であり、推定ｐＩ値は５．９７
である。ＢＬＡＳＴサーチによって、ＮＡＤＥは公知のヒトのタンパク質ＨＧＲ
７４（４）と著しい相同性を有し（図１ａ）、ロイシンリッチ核外移行シグナル
（ＮＥＳ）（５）（図１ｂ）及びユビキチン結合配列（６）（図１ｃ）以外には
有意なモチーフを有していないことが明らかとなった。ＨＧＲ７４は、ヒトの卵
巣の顆粒膜細胞で豊富に発現されるｍＲＮＡとして以前に報告されたが、その機
能的役割はなお不明である。ＮＡＤＥのアスパラギンリッチな部位（ａ．ａ．３
６−４８）を除いたこれら２つのタンパク質の相同性は９２．８％であり、それ
故、本発明者らは、ＨＧＲ７４がマウスＮＡＤＥのヒトにおける相同物であると
結論付ける。

【０１４０】ノーザンブロット解析により、ＮＡＤＥのｍＲＮＡ（１．３ｋｂｐ）は脳、心
臓、肺を含む幾つかの組織中で最も豊富であることが明らかである（図１ｄ）。
長く感光させることにより、胃、小腸、筋肉にも該ｍＲＮＡの発現を低いレベル
で検出することができた（データは示していない）。しかし、肝臓では該ｍＲＮ
Ａの発現は全く見られなかった。精巣には、この他に大きなバンド（３．０ｋｂ
ｐ）も観察され、これは選択的スプライシング型の存在を示唆している。また、
抗ＮＡＤＥ抗体を用いた免疫沈降法により内在性のＮＡＤＥタンパク質がヒトの
神経芽細胞腫の株細胞、ＳＫ−Ｎ−ＭＣで確認された（図１ｅ）。興味深いこと
に、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＰＣ１２、ＰＣＮＡ細胞では、ＡＬＬＮのようなユビキチ
ン阻害剤の存在下でのみＮＡＤＥタンパク質が検出されたので、ＮＡＤＥがユビ
キチン共役システムによって修飾を受けた後、プロテアソームによって分解され
ることを示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＮＡＤＥの分子量は２２ｋＤ
ａと見積もられており、このサイズは塩基配列から予想される分子量よりもわず
かに大きいようである。しかし、この分子量の差は、低いｐＩ値又はプレニル化
が起こり得る部位での翻訳後修飾によるものかもしれない（図１ａ）。２９３Ｔ
細胞においてＮＡＤＥタンパク質を過剰発現させると、１００ｍＭのジチオスレ
イトールという還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、２２ｋＤａ、４４ｋ
Ｄａの２つのバンドがみられた（図１ｆ）。この問題を明確にするために、２つ
のＮＡＤＥ変異体を構築し、２９３Ｔ細胞中で発現させた。ＮＡＤＥは配列の１
０２位と１２１位にシステイン残基を２つ有するので、本発明者らは、各システ
インをセリン残基に置き換えた。ウェスタンブロット解析によって、ｍｕＮＡＤ
Ｅ（Ｃｙｓ１２１Ｓｅｒ）の分子量は野生型と同一であることが明らかとなった
のに対して、ｍｕＮＡＤＥ（Ｃｙｓ１０２Ｓｅｒ）では、これより小さい２２ｋ
Ｄａの分子量のバンドしかみられなかった（図１ｇ）。これらの結果は、ＮＡＤ
Ｅが、Ｃｙｓ１０２においてジスルフィド結合によりヘテロ二量体を形成して、
４４ｋＤａのバンドを与えることを強く示唆する。

【０１４１】インビトロで翻訳されたマウスのＮＡＤＥタンパク質及び大腸菌で発現させた
ＧＳＴ−ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ融合タンパク質をインビトロＧＳＴプルダウンア
ッセイに用いた。前記アッセイにおいて、前記ＮＡＤＥタンパク質はＧＳＴ−ｐ
７５^ＮＴＲＩＣＤに対して強い結合活性を示した（図２ａ）。インビボでの結
合活性を調べるために、ＭｙｃでタギングしたＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲを２９３
Ｔ細胞に同時発現させ、免疫共沈降実験に供した。結果は、ＮＡＤＥがインビボ
で完全長のｐ７５^ＮＴＲにきわめて強く結合し得ること（図２ｂ）を明確に示し
ており、ＮＡＤＥタンパク質が、ＮＧＦの用量に依存して、ｐ７５^ＮＴＲＩＣ
Ｄに結合することが検出された（図２ｃ）。このことは、ＮＡＤＥタンパク質が
ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤと相互作用するシグナル伝達タンパク質の候補であること
を示唆している。さらに、本発明者らのマッピング調査により、ＮＡＤＥタンパ
ク質はマウス、ラット、及びヒトの間では同一である細胞死誘導領域（アミノ酸
残基３３８−３９３）と相互作用することが示された（データは示していない
）。ＴＲＡＦ６は保存された膜近傍領域に結合するため（１１）、ＮＡＤＥタン
パク質が、ＴＲＡＦ６のｐ７５^ＮＴＲへの結合を阻害する可能性はないと思われ
る。ｐ７５^ＮＴＲの重合はＴＮＦＲファミリーに属する他のメンバーと同様に、
シグナル伝達にとって重要であると推測されている。例えば、ＴＮＦＲＩ（１２
）、ＣＤ４０（１３）、及びＦａｓ（１４）は、細胞外ドメインへの各三量体リ
ガンドの結合を通じて三量体を形成する。しかしながら、ｐ７５^ＮＴＲに関して
は、これまでに同様の報告は存在していない（１５）。ＮＡＤＥのニ量体がｐ７
５^ＮＴＲの細胞内ドメインに結合することによって、ｐ７５^ＮＴＲのニ量体が形
成されることはあり得るかもしれない。

【０１４２】ＮＡＤＥタンパク質の機能的な役割を調べるために、ＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。その結果、共トランスフェクトされ
た２９３Ｔ細胞は皿から剥離し、４８時間後には凝集することが示された（図３
ａ）。しかしながら、対照プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細
胞は有意な相違を示さなかった（図３ａ）ので、この形態的な変化がアポトーシ
スによって引き起こされていることを意味する。本発明者らは、さらに、これら
の細胞に対して、ＴＵＮＥＬアッセイ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰ−
ｂｉｏｔｉｎｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇａｓｓａｙ）（１６）及
びＤＮＡ断片化テストの調査を行った。ＴＵＮＥＬアッセイでは、共トランスフ
ェクトした細胞のみで、死滅細胞の顕著な増加が検出され（図３ｂ）、陽性細胞
の割合の値（３８％）は、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション効率
と一致した。さらに、共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞のみで、ＤＮＡの断
片化が検出された（図３ｃ）。これらの結果から、本発明者らは、ＮＡＤＥとｐ
７５^ＮＴＲの同時発現が、２９３Ｔ細胞にアポトーシスを誘導すると結論付ける
。

【０１４３】ＮＡＤＥタンパク質はｐ７５^ＮＴＲの細胞質領域にリガンド依存的な様式で結
合するが、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下では、共トランスフェクトさ
れた２９３Ｔ細胞にＮＧＦ依存性の細胞死は明確には検出されず（データは示し
ていない）、ＮＧＦ非依存性のアポトーシスに下流のシグナルを伝達するための
ｐ７５^ＮＴＲを介した細胞死の機構において、ＮＡＤＥタンパク質が機能してい
るかもしれないことを示唆している。

【０１４４】ＮＡＤＥタンパク質の生理学的な機能をさらに調べるために、本発明者らはＮ
ＡＤＥ及びｐ７５^ＮＴＲを共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、転写
因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）、カスパーゼ−２、及びカスパーゼ−３の活性を調
べた。ＮＦ−κＢは外部刺激により活性化されて、核に移行し、ここでＤＮＡを
結合し、遺伝子の転写を調節する。（１７）。ラットのシュワン細胞では、ＮＧ
Ｆがｐ７５^ＮＴＲに結合すると、ＴｒｋＡ非依存的にＮＦ−κＢの活性化が誘導
され（１８）、細胞の生存をもたらすので、ＴＲＡＦ６はＮＧＦを介したＮＦ−
κＢの活性化の成分であるかもしれない（１１）。対照的に、ＮＡＤＥタンパク
質の発現は、用量依存的に、ＮＦ−κＢの活性を著しく抑制するが、この効果は
、ＮＧＦ依存性であるとともに、ｐ７５^ＮＴＲの発現と顕著には協調いていなか
った（データは示していない）。ＮＡＤＥタンパク質によるＮＦ−κＢの抑制だ
けではアポトーシスは誘導され得ないので、このことは、ｐ７５^ＮＴＲ／ＮＡＤ
Ｅによって誘導されるアポトーシスは、ＮＦ−κＢ活性の抑制にのみ起因するの
ではなく、未知のシグナル分子の制御にも起因することを示唆している。ＮＦ−
κＢの活性を抑制すると、ｐ７５^ＮＴＲを発現するＰＣ１２細胞において細胞死
が増加することが報告されている（１９，２０）。ＮＡＤＥタンパク質は、ＮＦ
−κＢの活性をダウンレギュレーションするのに中心的な役割を果たしており、
最終的には、ｐ７５^ＮＴＲを発現する神経細胞にアポトーシスを引き起こすかも
しれない。

【０１４５】アポトーシスでは、多くの場合、カスパーゼ−３の活性の上昇が観察された（
２１，２２，２３，２４）。このプロテアーゼは、通常は、細胞の細胞質に３２
ｋＤａの前駆体として存在しており、血清の回収、Ｆａｓの活性化、イオン化に
よる処置、及び様々な薬理学的物質に対して応答してアポトーシスを起こすよう
に、細胞がシグナルを受けたときに、タンパク質分解によって活性化され、２０
ｋＤａと１０ｋＤａのヘテロニ量体になる（２５）。ウェスタンブロット解析に
よって、ＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲを共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におい
てのみ、カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３が著しくプロセッシングを受けるこ
とが明らかとなった（図３ｅ）。さらに、カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３の
両者の基質であるＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ）が部分的に切断され、これらのカスパーゼがｐ７５^ＮＴＲ／ＮＡＤ
Ｅシグナル伝達によって媒介されるアポトーシスに関与していることを示唆する
。

【０１４６】ＮＡＤＥ（図４ａ）に含まれるＮＥＳ配列（５）が、タンパク質を核から細胞
質へ移出する能力を有するかどうかを調べるために、本発明者らは、一連のＮＡ
ＤＥ変異体を用いて、２９３Ｔ細胞に一過的に発現させた。その結果、ＮＥＳ配
列を有するＮＡＤＥタンパク質は細胞質領域に局在するが（図４、ｂの下図、ｃ
及びｄの上図）、ＮＥＳ変異を有するＮＡＤＥタンパク質は核に局在する（図４
、ｃ及びｄの下図）ことが示された。これらのデータはＮＡＤＥタンパク質が核
から細胞質へ移出されること、またプレニル化されたタンパク質として翻訳後修
飾を受けて、ｐ７５^ＮＴＲ／ＮＡＤＥの生理的な相互作用を促進し、制御し得る
という仮説を支持する。

【０１４７】ｐ７５^ＮＴＲを介したシグナルカスケードは長い間不可解なものであった。し
かし、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーとは異なり、ｐ７５^ＮＴＲは二機能的
にシグナルを媒介して、アポトーシスを誘導し、阻害し得ることが、最近の増大
する証拠によって示されている（２６，２７）。本発明者らの結果は、ＮＡＤＥ
がｐ７５^ＮＴＲによって媒介されるアポトーシスのシグナル伝達物質の候補であ
ることを強く支持した。ＮＡＤＥは、ｐ７５^ＮＴＲと協調してアポトーシスを媒
介し得るが、ｐ７５^ＮＴＲによって媒介されるシグナル伝達において、別のエフ
ェクター分子と相互作用するシグナルアダプター分子である可能性がある。さら
に重要なことに、ＮＡＤＥは核外移行シグナル（ＮＥＳ）とユビキチン結合配列
をともに有するので、ユビキチン／プロテアソームによって厳密に制御されて、
別の分子を核から細胞質へ輸送しているのかもしれない。このことは、ＮＡＤＥ
が細胞周期に関連するタンパク質のような制御遺伝子のターンオーバーに関して
極めて重要なタンパク質であることを示唆する。生理的条件下での調査をさらに
行うことによって、ＮＡＤＥがｐ７５^ＮＴＲの発現と共同してアポトーシスを誘
導し得るメカニズムをよりよく理解するための洞察がさらに得られるであろう。

【０１４８】方法酵母ツーハイブリッドシステムにｐ７５^ＮＴＲ関連細胞死実行物質（ＮＡＤＥ
）の単離ｐ７５^ＮＴＲ関連タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するために、本発明
者ら、Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇによって最初に開発された酵母ツーハイブリッ
ドシステム（２８）を用いた。本発明者らはアミノ酸３３８−３９６（ｐ７５^Ｎ ^ＴＲの膜貫通ドメインからＣ−末端までの細胞質ドメイン）に相当するラットｐ
７５^ＮＴＲのｃＤＮＡの細胞質ドメインを標的として用いた。ＰＣＲを用いて、
ＬｅｘＡＤＮＡ結合領域をコードする配列とｉｎ−ｆｒａｍｅになるように、
酵母発現プラスミドｐＢＴＭ１１６の中にｐ７５^ＮＴＲのｃＤＮＡの該部位を組
み込んだ（２９）。次いで、ＬｅｘＡオペレーターの制御下にあるヒスチジン合
成酵素（ＨＩＳ３）及びｂ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）レポーター遺伝子を
含むＬ４０細胞［ａ，ｈｉｓ３，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ａｄｅ２，ｌｙｓ２：（
ｌｅｘＡｏｐ）^４−Ｈｉｓ３，ＵＲＡ３：（ｌｅｘＡｏｐ）^８−ｌａｃＺ］の中
に、該プラスミドを導入した（２９）。ＬｅｘＡに特異的な抗血清を用いたイム
ノブロッティングによりＬｅｘＡ−ｐ７５^ＮＴＲ（３３８−３９６）タンパク質
の発現を確認した後、高効率の酢酸リチウム形質転換法（３０，３１，３２）に
より、これらのＬｅｘＡ／ｐ７５^ＮＴＲ発現細胞の中に、マウス胚ｐＶＰ１６
ｃＤＮＡライブラリーを導入した。５×１０^７の形質転換体のスクリーニングか
ら、６７２個のＨｉｓ^＋コロニーの最初のセットを同定した。次いで、８個のＬ
ｅｘＡオペレーターの制御下にあるｌａｃＺレポーター遺伝子を利用して、β−
ガラクトシダーゼ比色定量法（３３）によって、これら６７２個のコロニーをテ
ストし、候補クローンのプールを１８１個に絞った。トリプトファンを含む培地
で培養することにより、これら１８１個の候補からＬｅｘＡ／ｐ７５^ＮＴＲをコ
ードするプラスミドを取り出し、ＬｅｘＡ／ｐ７５^ＮＴＲ、ＬｅｘＡ／Ｒａｓ、
Ｌｅｘ／ＣＤ４０、ＬｅｘＡ／Ｆａｓ、及びＬｅｘＡ／ｌａｍｉｎを含むＬｅｘ
Ａ融合タンパク質を産生する様々なコントロールプラスミドを導入した一群のＭ
ａｔａタイプの酵母ＮＡ８７−１１Ａ［ａ，ｌｅｕ２，ｈｉｓ３，ｐｈｏ３，ｐ
ｈｏ５］系統と交配させた。１８１個の候補クローン中で、ＬｅｘＡ／ｐ７５^Ｎ ^ＴＲタンパク質と特異的に反応する１つのクローンを更なる解析のために選択し
た。このマウスｃＤＮＡクローン番号５９は、４５０塩基のインサートサイズを
有している。ｐ７５^ＮＴＲの発現を伴う細胞死を誘導する能力があるため、本発
明者らはこのタンパク質をＮＡＤＥ（ｐ７５^ＮＴＲ結合性細胞死誘導物質（ｐ
７５^ＮＴＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｅｘｅｃｕｔｅｒ
））と名付けた。

【０１４９】ＤＮＡの構築ＮＡＤＥｃＤＮＡの一部（７−５２４）と５’−ＲＡＣＥの産物をライゲー
ションさせることにより、完全長のマウスＮＡＤＥｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＩＩベクターに構築した。完全長のＮＡＤＥｃＤＮＡの終始コドンを
置き換え、５’ＸｈｏＩ部位及び３’ＢａｍＨＩ部位を付加するために、ＰＣＲ
クローニング技術を用いた。ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に完全長のＮＡＤＥｃＤＮＡを
挿入することにより、ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ＮＡＤＥを構
築した。ＪｕｒｋａｔＴ細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いて、ヒトのＮＡＤ
ＥｃＤＮＡを増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡにクローニン
グした。ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位に、完全長の
ラットｐ７５^ＮＴＲのｃＤＮＡを挿入することにより、ｐｃＤＮＡ３／ラットｐ
７５^ＮＴＲした。増幅したラットｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ（アミノ酸３３８−３９６
）をｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に挿入することにより、ｐＧＥＸ
４Ｔ−１／ラットｐ７５^ＮＴＲＩＣＤを構築した。ＰＣＲによる部位特異的な突
然変異誘発法（２９）により、変異体ＮＡＤＥ発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３．
１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ｍｕＮＡＤＥ（Ｃｙｓ１０２Ｓｅｒ）とｐｃＤＮＡ
３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ｍｕＮＡＤＥ（Ｃｙｓ１２１Ｓｅｒ）を構築し
た。Ｅ−セレクチンプロモーター領域（−７３０−５２）のＮＦ−κＢ結合部位
をｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ部位に挿入することにより、ル
シフェラーゼレポーターアッセイ用のｐＥＬＡＭ−Ｌｕを構築した。ＧＦＰ融合
ＮＡＤＥタンパク質の発現プラスミドを以下のようにして作成した：ｐＥＧＦＰ
−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いて、プライマー、５”−ＣＴＡＧ
ＣＴＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３”及び５”−ＣＣ
ＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３”を用いて増幅し
たＰＣＲ産物として、ＧＦＰのｃＤＮＡをＮｈｅＩ−ＸｈｏＩで切断したｐｃＤ
ＮＡ３．１−マウスＮＡＤＥにクローニングした。プライマー５”−ＡＴＣＣＴ
ＣＧＡＧＣＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣ−３”（センス鎖）、５”
−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＣＣＴ−３”（アンチセ
ンス鎖）、及び５”−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＣＴ
Ｃ−３”（アンチセンス鎖）を用いて、Ｅｘｐａｎｄｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉ
ｔｙＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）を用いて作成されたＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩで切断したＰＣＲ断片を、Ｘｈｏ
Ｉ−ＢａｍＨＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰに挿入することにより、欠
失変異体Δ１０１−１２４−ＧＦＰ及びΔ９１−１２４−ＧＦＰを構築した。

【０１５０】Ｌｅｕ９４とＬｅｕ９７がＡｌａに置き換わっているＬ９７Ａ−ＧＦＰ及びＬ
９４、９７Ａ−ＧＦＰを得るために、変異誘発プライマー（５’−ＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＡ−３”、５
”−ＴＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴ−３”、５”−
ＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡ−３”。及び５”−Ｔ
ＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴ−３”）を用いた。全て
の構築物において、配列を決定することによって変異を確認した。

【０１５１】ノーザンブロット解析４００ｎｇのＮＡＤＥｃＤＮＡ断片（ｎｔ．５−５１０）を５０μＣｉの［
α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルし、プローブとして用いた。マウスの様々な組織
から抽出した全ｍＲＮＡのうち各々１０μｇをメンブレンに転写し、ｅｘｐｒｅ
ｓｓｈｙｂｒｉｄｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、２時間、６
８℃で、ＮＡＤＥプローブとハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤ
Ｓで５回洗浄し、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。

【０１５２】抗体ＧＳＴ−マウスＮＡＤＥ融合タンパク質をウサギに免疫することにより、抗Ｎ
ＡＤＥポリクローナル抗体を作成した。前記ＮＡＤＥに特異的な抗体は、抗原を
結合したセファロース４Ｂによってアフィニティ精製した。ポリクローナル抗ラ
ットｐ７５^ＮＴＲはＭ．Ｖ．Ｃｈａｏ博士から頂いた。抗Ｍｙｃモノクロ−ン抗
体（９Ｅ１０）はＢＩＯＭＯＬから購入した。抗カスパーゼ−３ポリクローナル
抗体（Ｈ−２７７）は、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙか
ら購入した。カスパーゼ−２ポリクローナル抗体は、ＬｌｏｙｄＡ．Ｇｒｅ
ｅｎｅ博士から頂いた。ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧは、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入
した。

【０１５３】免疫沈降及びイムノブロッティング図１ｅにおいて、１５０ｎｇ／ｍＬのＡＬＬＮ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ）で処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（１×１０^７）を、０．５ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。遠心分離（１００，０００×
ｇ）の上清を、セファロース４Ｂに結合された抗ＮＡＤＥポリクローナル抗体１
μｇと混合し、４℃で４時間インキュベートした。洗浄後、３０μＬのＳＤＳ−
ＰＡＧＥサンプリング緩衝液でゲルを煮沸し、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに
かけた。抗ＮＡＤＥポリクローナル抗体（２μｇ／ｍＬ）により、イムノブロッ
ティングを行った。図１ｆでは、トランスフェクトされた各２９３Ｔ細胞から抽
出した１０μｇの細胞溶解液をイムノブロッティングによりＮＡＤＥを検出する
ために用いた。

【０１５４】２９３Ｔ細胞でのトランスフェクト及びタンパク質発現図１ｆで、２９３Ｔ細胞（２×１０^６）に、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−
）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ＮＡＤＥ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ｍ
ｕＮＡＤＥ（Ｃｙｓ１０２Ｓｅｒ）、又はｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−Ｈｉ
ｓＡ／ｍｕＮＡＤＥ（Ｃｙｓ１２１Ｓｅｒ）をリン酸カルシウム法によりトラン
スフェクトした。図２ｂ、３ａ、ｂ、ｃ、ｅでは、２９３Ｔ細胞（２×１０^６）
に、２０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ、１０μｇのｐｃＤＮ
Ａ３／ラットｐ７５^ＮＴＲ、及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓＡ、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡＮＡＤＥ及び１
０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ、又は１０μｇのｐｃＤＮＡ
３．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ＮＡＤＥ及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３／ラット
ｐ７５^ＮＴＲをトランスフェクトした。図２ｃでは、血清を除いたＤＭＥＭ培地
中で、２９３Ｔ細胞（２×１０^６）に１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ
−ＨｉｓＡ／ＮＡＤＥ及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３／ラットｐ７５^ＮＴＲをトラ
ンスフェクトした。

【０１５５】インビトロ結合アッセイＬ−［^３５Ｓ］メチオニンで標識され、インビトロで翻訳したＮＡＤＥタンパ
ク質５μＬを、５μＬのＧＳＴ−ラットｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ融合タンパク質又は
ＧＳＴ−結合ＧＳＨ−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と、１００μＬ
のＮＥＴＮ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭＮ
ａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％ＮＰ−４０）中で４℃、１８時間混合し
た。洗浄後、ゲルを３０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプリング緩衝液で煮沸し、
１３．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。−７０℃で１６時間フルオログラフィ
ーを行った。

【０１５６】インビボ結合アッセイ図２ｂでは、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を１ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液
中で溶解し、遠心分離した（１００，０００μｇ）。抗Ｍｙｃ抗体が結合された
ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２μｇによって
、４℃で、２時間、上清を免疫沈降した。５回洗浄した後、ゲルを７．５％のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウサギの抗ｐ７５^ＮＴＲポリクローナル抗体でウェスタ
ンブロット解析を行った。

【０１５７】ＮＧＦのライゲーション依存的なＮＡＤＥのｐ７５^ＮＴＲとの相互作用共トランスフェクトの後、様々なＮＧＦを含有するＤＭＥＭ培地中で細胞をイ
ンキュベートした。１２時間後、ＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲとの相互作用活性をイ
ンビボ結合アッセイによって調べた。

【０１５８】ＴＵＮＥＬアッセイＭＥＢＳＴＡＩＮアポトーシスキットダイレクト（ＭＩＣ）をＴＵＮＥＬアッ
セイに用いた。前記アッセイは会社のインストラクションに従って行った。染色
した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）により解析した。

【０１５９】ＤＮＡ断片化アッセイ３５０μＬの１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ中、室温で１０分間、ト
ランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を溶解した。１００μＬの５ＭＮａＣｌを
加えた後、アリコートを４℃で１８時間インキュベートし、遠心分離（１２，０
００×ｇ）した。１ｍｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのポロテイナ
ーゼＫによって、４２℃で、２時間上清を処理した。フェノール・クロロホルム
抽出の後、７０％エタノールでＤＮＡを沈殿させ、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解させ
た。５μＬのサンプルを１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。

【０１６０】ＮＦ−κＢ活性の測定Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓａｙＳｙｓｔ
ｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＮＦ−κＢ活性の測定に用いた。１．５μｇのｐＥＬ
ＡＭ−ｌｕｃレポータープラスミド、０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫ、０．７μｇの
ｐｃＤＮＡ３ラット／ｐ７５^ＮＴＲ、０．３μｇ又は２．８μｇのｐｃＤＮＡ３
．１（−）Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ／ＮＡＤＥ、及び十分量のｐｃＤＮＡ３．１（−）
Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、総ＤＮＡを５．１μｇにするためのコントロールプラスミドを
、２９３Ｔ細胞（４×１０^５）にトランスフェクトした。トランスフェクトの２
４時間後に、ルシフェラーゼ活性を決定し、ｐＲＬ−ＴＫの発現レベルに基づい
て標準化した。ルシフェラーゼ活性は、ＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎｓＬｕｍ
ｉｎｏｍｅｔｅｒＭｏｄｅｌＴＤ２０／２０（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測
定した。

【０１６１】共焦点レーザー顕微鏡リン酸カルシウム沈殿法を用いて、一過性トランスフェクトを行った。カバー
ガラス上の２９３Ｔ細胞（３×１０^５）に、３．０μｇのＤＮＡを一過性にトラ
ンスフェクトさせた。１２−２４時間後に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を
固定し、核を可視化するためにＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物（Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）で染色した。共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ
ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０）を用いて、ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内分布を調
べた。

【０１６２】

【参照文献１】第二シリーズの実験 NGF誘導によるアポトーシスと核因子-κB抑制を誘導するNADEの構造機能分析概要低親和性ニュートロフィン（neurotrophin）受容体であるp75NTRは、神経成長
因子（NGF）によって神経細胞のアポトーシスを媒介できる。我々は最近、p75NT
R関連蛋白質、NADE（p75NTR-associated cell death executor）を同定し、そし
てNADE が293T、PC12およびnnr5細胞でNGFに応答し、p75NTRの細胞内ドメイン（
ICD）と結合した後にアポトーシスを誘導することを示した(Mukai等 (2000) J.
Biol. Chem. 275,17566-17570)。NADE蛋白質の機能的および構造的特性の知見を
さらに得るために、我々はNADEの広範な変異体分析を実施した。41〜71残基を含
む最小領域のトランケーションは、アポトーシス誘導に十分であったが、このプ
ロアポトーティックなドメインは、アポトーシスをNGF/p75NTR非依存的に仲介す
るようである。これとは対照的に、N末端40残基の削除（41-124）は、いまだNGF
依存的なアポトーシスの誘導能力を保持していた。従って、制御ドメインと呼ば
れるC末端アミノ酸残基（72-112）は、NADEに誘導されるアポトーシスのNGF依存
制御に必須である。さらに、制御ドメインに位置しロイシンに富む核外移行シグ
ナル（NES）配列（残基90-100）にアミノ酸置換をもつ変異体では、核から細胞
質へのNADEの移行、二量体化、p75NTRとの結合、およびNGF依存アポトーシスが
損なわれている。興味深いことには、NADE蛋白質の過剰発現は、293T、PC12、お
よびnnr5細胞のNF-κB活性をNGF非依存的に抑制した。これとは対照的に、点突
然変異体（Cys 121→Ser）はドミナントネガティブな様式でNF-κB活性を賦活化
させる。総括すると、別個のドメインはp75NTRシグナル伝達を仲介するために、
NGF依存的な供給およびアポトーシスなどのNADE機能の制御に関与している。

【０１６３】緒論哺乳動物細胞の多くのタイプは、正常な発生の間に、或いはDNA損傷、成長因
子除去、および発ガン遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の異常発現を含む各種の刺激
に応答して、アポトーシスを受ける（1-3）。これらの様々な試薬により誘導さ
れたアポトーシスは、アポトーシス的な細胞死の制御因子およびエフェクターと
して作用する下流因子の共通のセットにより仲介されるようである。ニューロト
ロフィンはまた、神経細胞の正常な発達の間にアポトーシスを促進することが示
された。Trk受容体を経て仲介される生存の機能とは対照的に、ニュートロフィ
ン誘導アポトーシスは共通のニュートロフィン受容体、p75NTRを経て媒介され、
それはTNF受容体スーパーファミリーのメンバーである（4）。p75NTRのプロアポ
トーティックな役割は、ノックアウトおよびトランスジェニックマウスに加えて
、培養細胞を含む各種の系の結果により支持された（5-7）。しかし、p75NTRに
関与するプロアポトーティックなシグナルの分子機構は、よく特性が調べられて
いない。最近、腫瘍壊死因子受容体関連因子（TRAF）ファミリー蛋白質であるFA
P-1およびジンクフィンガー蛋白質が、p75NTR（ICD）と結合することが報告され
た（8-12）。しかし、それらのどれもがNGF依存的アポトーシスに直接的効果が
なかった。

【０１６４】最近、我々は酵母2ハイブリッドスクリーニング（13）により、p75NTR細胞内
ドメイン（ICD）に結合するNADEと名付けられた新規蛋白質を同定した。NADEとp
75NTRの共発現は、293T細胞の細胞死を誘導した。NGF誘導によるNADEのp75NTR（
ICD）への供給は濃度依存的であり、そしてp75NTR/NADE誘導の細胞死はNGFを必
要とするが、BDNF、NT-3、またはNT-4/5を必要としない。同様な結果はまた、PC
12およびnnr5細胞から得られた。NADEは、大型のキャリア蛋白質の核移行の仲介
に必要かつ十分なコンセンサスモチーフである核移行シグナル（NES）を有して
いる（14）。最近、HIV-Rev（15）、PKI（16）およびMAPKK（17）を含む多くの
蛋白質が、それらのNESにより空間的に制御されると報告された。NES仲介の細胞
内輸送システムは、細胞中の蛋白質の細胞内局在を制御する一般的かつ保存され
た機構である。

【０１６５】アポトーシス反応を調節する重要な蛋白質の1つはNF-κBであり、それはアポ
トーシスを防ぐか、またはこれに寄与することができる転写因子である。様々な
刺激により誘導されたアポトーシスの際のNF-κB活性化の役割は、いまだ論争中
の課題である；細胞のタイプによってプロアポトーティック（18）およびアンチ
アポトーティック(19,20)な特性の双方を有することが示唆されている。p75NTR
はシュワン（Schwann）細胞（8）でアンチアポトーティックなシグナルとして、
および稀突起膠細胞（oligodendrocytes）（21）でプロアポトーティックなシグ
ナルとして、NGF誘導性のNF-κB活性化を仲介すると報告されている。対照的に
、NF-κB活性の抑制はラット神経鞘腫（schwannoma）細胞株（22）、PC12細胞（
23）または交感神経ニューロン（20）において、NGFに応答した細胞死を誘導す
る。

【０１６６】この研究において、我々はマウスNADEの機能的および構造上の特性に関する3
つの論点について分析する。第一に、NADEの変異体分析はNGFに応答する細胞死
のための要件を定義した。第二に、我々はNADEが機能的なNESドメインを含み、
そしてこの配列が自己会合、p75NTRとの結合、および細胞死の誘導を招くことを
示した。最後に、我々はNADEの2つの別個のドメインが293T細胞でNF-κB活性を
抑制したことを示した。

【０１６７】実験手順構築物． NADE（WT）(pcDNA3.1/myc-His (-) A/mNADE WT)は、以前に記載した
ようにして構築された（10）。mNADE欠失変異体のための発現ベクターは、示さ
れたオリゴヌクレオチドペアを使って、mNADEコード配列をPCR増幅し、結果とし
て生じた断片をXhoI/BamHIで消化し、そして生じた断片を、XhoI/BamHI消化した
pcDNA3.1/myc-His (-) A中に組み込んで構築された：N (1-120)のために, FX29
(5'-ATCCTCGAGCGATCATGGCCAATGTCCAC-3') および RB360 (5'- ATCGGATCCGAATTCA
TCATGGTGATC-3'); N (1-112)のために, FX29 および RB336 (5'-ATCGGATCCGTTAG
ACAGCTCCCCCAT-3'); N (1-100)のために, FX29 および RB300 (5'-ATCGGATCCTCT
CAGCTGTAGCTCCCT-3'); N (1-90)のために, FX29 および RB270 (5'-ATCGGATCCGA
TCTCTCTCATCTCCTC- 3'); N (1-71)のために, FX29 および RB213 (5'-ATCGGATCC
GTCATTCATCTGCCTGTT-3'); N (1-60)のために, FX29 および RB180 (5'-ATCGGATC
CGAAGTTAGGGGCAAGTCG-3); NADE (1-20)のために, FX29 および RB60 (5'-ATCGGA
TCCTTCCTGTCCATTCTGCAG-3'); N (41-124)のために, FX121 (5'- ATCCTCGAGACCAT
GCACAACCATAACCACAAC-3') および RB27; N (81-124)のために, FX241 (5'-ATCCT
CGAGACCATGGAAATGTTCATGGAGGAG-3') および RB27; N (101-124)のために, FX301
(5'-ATCCTCGAGACCATGAATTGTCTACGCATCCTT-3') および RB27; N (41-71)のため
に, FX121 および RB213である。

【０１６８】 mNADEの点突然変異体は、示されたオリゴヌクレオチドペアを使ってmNADEコー
ド配列をPCR増幅し、結果として生じたPCR産物をDpnI消化して構築された： Cis
-121がSerに置換されたN (C121S)のために, F-C121S (5'-ATGATGAATTCTCTCTTATG
CCTGGA- 3') および R-C121C (5'-TCCAGGCATAAGAGAGAATTCATCAT-3'); Leu-99がA
laで置換されたN (L99A) および GFP-N (L99A)のために, F-L99A (5'-AGGGAGCTA
CAGGCGAGAAATTGTCTA-3') および R-L99A (5'-TAGACAATTTCTCGCCTGTAGCTCCCT-3')
; Leu-94, Leu-97 および Leu-99 がAlaで置換された N (L94A, L97A, L99A) お
よび GFP-N (L94A, L97A, L99A)のために, F-L97A (5'- AAAGCTTAGGGAGGCACAGCT
GAGAAA-3'), R-L97A (5'- TTTCTCAGCTGTGCCTCCCTAAGCTTT-3') および F-L97A, L
99A (5'- AGGGAGGCACAGGCGAGAAATTGTCTA-3'), R-L97A, L99A (5'- TAGACAATTTCT
CGCCTGTGCCTCCCT-3') および F-L94A, L97A (5'-ATCCGGAGAAAGGCTAGGGAGGCACA-3
'), R-L94A, L97A (5'- TGTGCCTCCCTAGCCTTTCTCCGGAT-3')である。

【０１６９】緑色蛍光蛋白質（GFP）融合mNADE蛋白質ための発現プラスミドは以下のように
作成された： GFP cDNAは、プライマーペア5'-CTAGCTAGCATCATGGTGAGCAAGGGCGAG
-3'および 5'-CCGCTCGAGTCTTGTACAGCTCGTCCAT-3'を使用してpEGFP-N2（クロンテ
ック）からPCR増幅された。産物はNheI-XhoI消化されたpcDNA3.1/myc-His (-) A
/mNADEにクローン化された。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合p75NT
R蛋白質のための発現プラスミドは、以前に記載（22）したように使用された。

【０１７０】試薬と抗体．マウス神経成長因子（NGF）はシグマ社から購入した。TO-PRO-3
ヨウ化物はモレキュラープローブ社（Molecular Probes）から購入した。抗-α-
NADE ポリクローナル抗体は以前（10）に記載されたように調整された。

【０１７１】細胞培養とトランスフェクション．293T細胞はアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（American Type Culture Collection）から取得した； PC12とnnr5
細胞は、L. A. Greene博士（病理部門、コロンビア大学）から供与された。293T
細胞は、10％FBSを添加したDMEM中で維持された。PC12およびnnr5細胞は、10％
馬血清および5％子牛血清を添加したRPMI 1640中で維持された。トランスフェク
ションのために293T細胞（100mm培養皿あたり1.5x10⁶ ）は、10％FBSを添加した
DMEM中でリン酸カルシウム法により25μg プラスミドで一時的にトランスフェク
ションされ、そして10時間培養された。血清を追加後に、細胞は100 ng／ml NGF
で36時間処理された。

【０１７２】細胞内局在分析．293T細胞は、カバーガラス上にしかれ、そしてGFPを含む構
築物によってトランスフェクションされた。トランスフェクションの24時間後に
、細胞は3.7％パラホルムアルデヒドで固定され、PBSで洗浄され、核を視覚化す
るためにTO-PRO-3ヨウ化物で染色された。典型的な視野の像が、Zeiss LSM 510
共焦点レーザー走査顕微鏡によって捕捉された。

【０１７３】 In vitro結合分析．試験管内翻訳された［³⁵S］メチオニン標識蛋白質は、TNT
カップルレティキュロサイトライセートシステム（TNT-coupled reticulocyte l
ysate system）（プロメガ社）を使用して産生された。結合分析は以前に記載（
22）のように実施された。

【０１７４】アポトーシス分析とDAPI染色．トランスフェクトされた細胞は、PBSで洗浄さ
れ、3.7％パラフォルムアルデヒドで固定され、そして50μg／mlのDAPIで染色さ
れた。蛍光顕微鏡を使用して、最低400細胞中のアポトーシスに特徴的な核形態
を有する細胞数が、個々の試料において計数された。

【０１７５】レポーターアッセイ． 293T細胞は６穴プレートに5X10⁴細胞／ウェルの濃度で
播種され、そして0.7μgのpELAM-lucレポータープラスミド（MBLより供与された
）および0.1μgのpRL-TK（プロメガ社）を内部標準として含む5μgのプラスミド
で、リン酸カルシウム法により一時的にトランスフェクトされた。トランスフェ
クションの24時間後に、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２回洗浄され、
そして200μlの溶解用緩衝液(デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシ
ステム, プロメガ社)中で溶解した。溶解産物（10μl）は、50μlのルシフェラ
ーゼ分析試薬と混合された。ルシフェラーゼ活性は、モデルLB9507 ルミノメー
タで測定された(EG および G Berthold社, ドイツ）。

【０１７６】ウエスタンブロット．溶解用緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 8.0,100 mM NaCl, 1
mM EDTA, 0.2 % NP-40,1 mM PMSF, 1 mM ベンザミヂン, 50 μg/ml ロイペプチ
ン, 7 μg/ml ペプスタチン A)中で細胞を溶解後に、我々は溶解産物を12.5％SD
S-PAGEゲルで分離した。分離された蛋白質は、そしてPVDF膜（バイオラッド社）
に転写された。膜は室温でブロッキング緩衝液（PBSに10％スキムミルクおよび0
.1％NaN3）によってブロッキングされた。免疫反応性の産物は、ENHANCE ケミル
ミネッセンスシステム（アマシャムファルマシア社）を使用して検出された。

【０１７７】結果アポトーシスにおけるNADE欠失変異体の特性分析。

【０１７８】アポトーシスのために必要なNADEの構造特性を調査するために、我々は一連の
NADE欠失変異体を作成した（図5A）。p75NTR/NADEに仲介されるアポトーシスを
分析するために、我々はTUNEL分析に加えてアポトーシスの核形態分析のためにD
API染色を実施した。293T細胞は、100 ng／ml NGFの処理または未処理条件で、p
cDNA3.1myc-His/mNADE (WT)または/およびpcDNA3p75NTRで一時的にトランスフェ
クトされた。NGF処理下、野生型NADEで共トランスフェクトされた細胞は、核の
濃縮および断片化を含むアポトーシスの典型的な形態的特徴を生じた（図6A）。
対照的に、野生型NADEまたはp75NTRでの単独の形質導入体は、コントロールベク
ターによるものと同様の正常な核形態を示した。形態的な基準に基づいてアポト
ーシス細胞が評価された際に、野生型NADEおよびp75NTRで共トランスフェクトさ
れた293T細胞の約45％は、NGFに応答してアポトーシスの形態を示した（図6B）
。同様な結果はTUNEL分析から得られた（データ示さず）。

【０１７９】アポトーシスについて役割をもつ領域を同定するために、NADEのトランケーシ
ョン変異体がそれらのアポトーシスを誘導する能力について分析された。図7お
よび表1に示したように、我々はN末端欠失変異体、N（81-124）およびN（101-12
4）がアポトーシス誘導できないことを見出した。しかしながら、N末端の40アミ
ノ酸（N（41-124））の削除は、アポトーシス誘導に影響しなかった。一方で、C
末端欠失変異体、N（1-71）はいまだプロアポトーティックな機能を保持してい
るが、N (1-20)ではそうではなかった。さらに、41から71までの残基（N（41-71
））を含む最小領域のトランケーションが、それ自身によるアポトーシス誘導に
おいて十分であった。

【０１８０】

【表１】興味深いことに、p75NTR結合ドメイン（残基81から106）を欠くN（1-71）は、
p75NTR非存在下でさえプロアポトーティック機能を保持していた、ところがp75N
TR非存在下での野生型NADEの発現はアポトーシスを誘導しなかった。同様な結果
は、p75NTRと相互作用できないN（41-71）およびN（1-100）から得られた。これ
とは対照的に、p75NTRと相互作用することができるN（1-120）、N（1-112）、お
よびN（41-124）は、NGF依存のアポトーシスを誘導できる。従って、制御ドメイ
ンと名づけられたC末端アミノ酸残基（72-112）は、NADE誘導アポトーシスのNGF
依存制御に必須である。

【０１８１】 NADE NESは自己会合、p75NTRとの結合、およびアポトーシスに必要である．我
々の以前の報告において、我々はアミノ酸90-100の間のC末端残基が、HIV REVな
どの他の知られているNESに対する類似性により示されるような、機能的NESモチ
ーフに対応することを見出した（図8A、（13））。我々は、完全なNESを有する
野生型NADEは細胞質に局在するが、しかしGFP-NES変異体（Leu-94→AlaおよびLe
u-97→Ala）は核に留まることを示した。NADE NESが残基81-106のp75NTR結合ド
メインを含む制御ドメインに局在するので、NADE NESはNADEにより誘導されたア
ポトーシスの制御において役割をもつであろう。NADE NESの機能を分析するため
に、我々はNADE NES中の94から99までの残基でロイシンからアラニンへの置換を
有する点突然変異体、N（L99A）、およびN（L94A、L97A、L99A）を作成した（図
5 B）。最初に、これらの変異体での発現および細胞内分布は、293T細胞で増強
された緑色蛍光蛋白質GFP-NADE融合蛋白質を使用して視覚化され、そして蛍光顕
微鏡により監視された。GFP-N（L94A、L97A、L99A）は、核および細胞質の双方
において観察できた（図8B）、ところが野生型NADEおよびN（L99A）は細胞質に
局在していた。これらの結果は、NADEのNESコンセンサス配列が、NADE細胞内局
在の重要な決定因子であることを示唆する。

【０１８２】我々は以前、野生型NADEでトランスフェクトされた293T、PC12、およびnnr5細
胞で、2つのバンド（22および44 kDa）が還元条件下のSDS-PAGE（13）により検
出されると報告した。N（1-112）は二量体の形態（データ示さず）として検出で
きるけれども、欠失変異体、N（1-71）は二量体化することができない。次に、
我々はN（L99A）およびN（L94A、L97A、L99A）で一時的にトランスフェクトされ
た293T細胞から調製した、細胞抽出液のイムノブロット分析を実施した（図8C）
。この結果は、還元条件下で野生型NADEおよびNADE L99Aは二量体化するが、N（
L94A、L97A、L99A）は二量体を形成しないことを示しており、このことはNESがN
ADEの自己会合に必要であり、そしてNADEの核移行制御がNADE単量体の相互作用
または解離とリンクしているだろうことを示唆する。NESの重要な疎水性残基の
３つ、Leu 94、Leu 97、およびLeu 99、はNADEのp75NTR結合ドメイン中にあり、
NES変異がNADEとp75NTRの結合にも影響しているだろうことを示唆する。我々は
これらの点突然変異体とp75NTR（ICD）間の結合を評価するために、GST-融合蛋
白質を使用したin vitro結合分析を実施した。図8Dに例示するように、このデー
タはN（L94A、L97A、L99A）がp75NTR（ICD）と結合できないが、N（L99A）はそ
うではないことを示した。さらに、N（L94A、L97A）は、野生型NADEよりずっと
非効率的に、p75NTR（ICD）と会合した（データ示さず）。

【０１８３】 NESのアポトーシスへの効果を調べるために、我々は、NADEの点突然変異体を
使ってアポトーシス分析を実施した（図8E）。この分析は、N（L99A）がアポト
ーシスを誘導したのに対し、N（L94A、L97A、L99A）がアポトーシスを誘導でき
ないことを示した。さらにN（94A、L97A）もまた、アポトーシスを誘導できない
（データ示さず）。これらの結果は、NADE NESモチーフが、核移行、自己会合、
およびp75NTRとの結合において重要であること、そしてNGF依存のp75NTR/NADE誘
導アポトーシスのために必要とされることを示した。

【０１８４】 NADEの過剰発現はNF-κB活性を抑制した．転写因子NF-κBは、細胞タイプによ
ってプロアポトーティック（18）およびアンチアポトーティック（19, 20）双方
の特性を有することが示唆されている。NADE蛋白質のNF-κB活性への影響を調査
するために、我々は293T細胞にpcDNA3.1myc-His (-) A/mNADE (WT)、 pcDNA3p75
NTR、 pELAM-ルシフェラーゼレポーター、および pRL-TK レポーター構築物をト
ランスフェクトした。293T細胞でのp75NTRの過剰発現はNF-κBの若干の活性化を
誘導し、そしてNGF処理はp75NTR存在下でのNF-κB活性を若干増強した（図9A）
。293T細胞でのNF-κBの基礎活性は、野生型mNADEの過剰発現により顕著に減弱
された。NGF処理または未処理条件下でのp75NTRの共トランスフェクションは、
野生型NADEにより誘導されたNF-κB抑制に顕著な変化をもたらさなかった。

【０１８５】我々はまたPC12およびnnr5細胞でルシフェラーゼレポーター分析を実施した。
図9Bに示したように、NGFはPC12細胞で約3倍NF-κB活性を賦活化せた。mNADEの
過剰発現は、NGF存在および非存在下の双方でNF-κB活性を抑制した。同様な結
果はまた、trkA受容体を欠くnnr5細胞でも得られた（図9C）。

【０１８６】 NF-κB活性におけるmNADEの変異分析．さらに我々は、不活性NADE変異体が293
T細胞でのNF-κBのドミナントネガティブ賦活体として機能するかどうかを調査
した（図10）。内在性NADEの発現は、293T、PC12、およびnnr5細胞において抗-
α-NADE抗体により確認された（データ示さず）。293T細胞でNF-κBルシフェラ
ーゼレポータープラスミドと共にNADE変異体、N（1-60）、N（1-120）およびN（
C121S）を導入することは、明らかにルシフェラーゼ活性の6倍（6 toll-fold）
の増加をもたらす。さらにN（C121S）は、PC12およびnnr5細胞においてNGF非存
在下でNF-κB活性を若干賦活化する（データ示さず）。

【０１８７】 NF-κB抑制のために必要なmNADEの構造特性をマップ化するために、我々は一
連のNADE欠失変異体を使用した。表2に示したように、N末端アミノ酸の削除、す
なわちN（41-124）、N（81-124）、およびN（101-124）はNF-κB抑制能力を存続
させた。N（1-120）、N（1-100）、およびN（1-60）はドミナントネガティブな
賦活体として作用する、ところがN（1-90）は完全な分子に匹敵するレベルでNF-
κB活性を抑制した。これらの結果は、2つの別個のドメインである残基61-90お
よび121-124がNF-κB抑制に寄与していることを示している。

【０１８８】考察最近の受容体関連シグナルトランスデューサーの別クラスの分子の同定は、ど
のようなTNF受容体スーパーファミリーのメンバーが下流のシグナル反応（26）
を開始するかにおける洞察を与えた。デスドメイン(death domain)は、p75NTRと
共にスーパーファミリーに属するTNFR/Fasのリガンドにより引き出される、死シ
グナルの伝達に必須である。TNFRおよびFasのデスドメイン(サブタイプ1)のいく
つかの下流の標的が同定された（27）。それらもまたデスドメイン配列を含んで
いる、このことはMORT1/FADDのようなデスドメインの自己会合を含む、デスドメ
インを有する蛋白質の会合により惹起されるシグナル機構を示している（28）。
しかしながら、DAPキナーゼ、アンキリンおよび NF-κBのplOO と pl05を含むp
75NTRデスドメイン(サブタイプ2)の機能的な役割はまだ不明瞭である。NMRによ
る構造分析は、p75NTRのデスドメインがリガンド依存的な下流の標的との結合の
潜在的部位を示すであろうことを示唆した（29）。我々は、NADEがNGF依存的にp
75NTRのデスドメインと相互作用し、そしてアポトーシスを誘導すると報告した
（13）。NADE作用機構のいっそうの理解のために、我々はNADE機能に必要な配列
を定義するための変異体分析を実施した。これらの研究は、別個の活性を仲介す
る調整ドメイン（modular domains）から構成されるNADEの詳細な分析を明らか
にした。

【０１８９】

【表２】欠失変異体によるマッピングは、NADE機能に必要な領域を説明するために試み
る最初の取り組みであった。図5、6A、6B、7、11および表1に示したように、プ
ロアポトーティックドメインと名付けられた41から71の残基を含む最小領域のト
ランケーションは、それ自体でアポトーシスを誘導するために十分であった、し
かしこれはNGFに依存しない。我々の以前の研究は、293T細胞でp75NTR/NADE誘導
アポトーシスがmNADEのp75NTR（13）との結合後にNGF依存的であったということ
を示したので、NADEはこのプロアポトーティック機能のためにNGF依存的な制御
ドメインを必要とする。欠失変異体のさらなる分析は、プロアポトーティックド
メインおよびp75NTR結合ドメインを保持する変異体が、NGF依存的にアポトーシ
スを誘導することを示した。一方、プロアポトーティックドメインを有するが、
p75NTR結合能がない変異体は、p75NTRが存在せずともアポトーシスを誘導した。
これらの結果は、プロアポトーティックドメインが、NGFに応答するp75NTR結合
ドメインを含む制御ドメインと名づけられたC末端領域により制御されることを
示す。我々は、NGFに応答したNADEのp75NTR（ICD）への供給後に（13）、NADE蛋
白質構造の転換がアポトーシスを下流に媒介する未知のシグナル伝達者に対して
、プロアポトーティックドメインの暴露を惹起するとの仮説を提示する。このプ
ロアポトーティックドメインの下流の標的分子が何であるかを決定するために、
将来的な研究が必要であろう。

【０１９０】 NADEのリガンド依存的機能に必要な制御ドメインの構造特性をさらに分析する
ために、我々は一連のNADE NES点突然変異体を作成した、というのもNESモチー
フがNADE制御ドメインに位置するからである（図8A、および11）。我々は点突然
変異体、N（L99A）、およびN（L94A、L97A、L99A）を構築した、なぜなら他のNE
Sを有する蛋白質での類似の変異が、核移行を防止すると報告されたからである
（24、25）。この結果は、N（L94A、L97A、L99A）が核移行の効率、p75NTRとの
結合、および自己会合を減弱させることを示しており、これはNADE NESモチーフ
がそれらの機能にきわめて重要であることを示唆する。NESモチーフは、p53の自
己会合のために必要であると報告され、そして細胞内局在およびp53活性の制御
と結び付けられうる（30）。我々は生理的条件下でNADEの核への移行を観察しな
かったが、NADE NESはまたサブロカリゼーションの制御、p75NTRへの供給、およ
びプロアポトーティック活性の誘導に重要であろう。

【０１９１】図9、10、および11に示したように、我々のデータはNADEのユニークな特性の1
つが、293T、PC12、およびnnr5細胞のNF-κB活性を抑制する能力であることを示
した。いくつかの可能性によりNADEによるNF-κB/Rel抑制の性質が説明されるだ
ろう。NF-κB/Rel活性化の機構は、詳細に調査された（31）。IKKαおよびIKKβ
によるIκBサブユニットの続いて起きるリン酸化は、IκBをユビキチン-プロテ
オソーム系による特異的なユビキチン化および分解に導く。IκBsの分解は、NF-
κB/Rel活性化および核への移行に必要である。NADEがユビキチン化配列を有し
ているので、それが共通のユビキチン基質として競合することによりNF-κB/Iκ
B複合体活性を調整できるだろう。ドミナントネガティブ様式での分析は、NADE
がNF-κBの定常レベルの再構成を生じさせるサプレッサーとしてNF-κBシグナル
に関与する構成因子であるかもしれないことを示唆する。最近、いくつかの細胞
タイプおよび神経系において、NGFによるNF-κB活性化が報告された（8、18-20
、23）。NGFに応答したp75NTR（ICD）へのNADEの供給は、抑制効果を開放し、そ
してNF-κBの活性化を誘導するだろう。NF-κB/RelまたはIκBがNADEの潜在的な
蛋白質基質であるかどうかの試験は興味深いものとなるであろう。

【０１９２】第二シリーズの実験の参照文献

【０１９３】

【参照文献２】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａ−ＨＮＡＤＥのアミノ酸配列及び発現分析。マウス及びヒトＮＡＤＥ（ＨＧＲ７４）（４）タンパク質のアミノ酸配列の比
較。点を付けた配列はアスパラギンリッチな鎖である。アスタリスクはロイシン
リッチな核外移行シグナル（ＮＥＳ）を示す（５）。黒三角は二量体の形成に不
可欠なシステイン残基を示している。下線部はＣ末端のプレニル化配列である。

【図１Ｂ】種々のタンパク質におけるロイシンリッチな核外移行シグナル（ＮＥＳ）（５
）の比較。ＮＥＳのコンセンサス配列には影を付けた。Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号
は、ｃＺｙｘｉｎ、Ｘ６９１９０；ＭＡＰＫＫ、Ｄ１３７００；ＰＫＩ−ａ、Ｌ
０２６１５；ＴＦＩＩＩＡ、Ｍ８５２１１；ＲｅｖＨＩＶ−１、ＡＦ０７５７１
９；ＲａｎＢＰ１、Ｌ２５２５５；ＦＭＲＰ、Ｌ２９０７４；Ｇｌｅ１、Ｕ６８
４７５；ヒトＮＡＤＥ、申請中；マウスＮＡＤＥ、申請中。

【図１Ｃ】ユビキチン化シグナルのコンセンサス配列。

【図１Ｄ】ＮＡＤＥのノーザンブロット分析。

【図１Ｅ】ＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫細胞における外因性ＮＡＤＥタンパク質の発
現。ＡＬＬＮで処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞溶解物を抗ＮＡＤＥ抗体で免疫沈降
し、同抗体によるイムノブロッティングに供する。２９３Ｔ細胞で一過性に発現
させたヒトＮＡＤＥタンパク質及び未処理のゲルを対照として使用した。重鎖の
バンドは免疫沈降に使用した抗体から得られたものである。

【図１Ｆ】マウスＮＡＤＥタンパク質Ａ野生型ＮＡＤＥの突然変異分析。２９３Ｔ細胞で
一過性に発現させたｍｕＮＡＤＥ（Ｃｙｓ１０２Ｓｅｒ）及びｍｕＮＡＤＥ（Ｃ
ｙｓ１２１Ｓｅｒ）タンパク質を、抗ＮＡＤＥ抗体を用いたイムノブロッティン
グによって検出した。トランスフェクションの方法は、材料及び方法に記載され
ている。親ベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から抽出した細胞溶解
物を対照として使用した。

【図１Ｇ】マウスＮＡＤＥ核酸配列、図１Ｇ−１（配列番号：）及びヒトタンパク質
ＨＧＲ７４配列の相同性検索及び比較。

【図１Ｈ】マウスＮＡＤＥ、ヒトＨＧＲ７４タンパク質及びその他の相同なラット、マウ
ス及びヒトのアミノ酸配列の比較。

【図２Ａ】図２Ａ−ＣＮＡＤＥはインビトロ及びインビボでｐ７５^ＮＴＲに強く結合す
る。ＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲのインビトロ結合アッセイ。インビトロで翻訳された
ＮＡＤＥタンパク質に対して、ＧＳＴ−ｐ７５^ＮＴＲＩＣＤ融合タンパク質を用
いたＧＳＴ複合体共沈法（ＧＳＴ−ｐｕｌｌｄｏｗｎａｓｓａｙ）を行った
。ＧＳＴを対照として使用した。

【図２Ｂ】ＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲのインビボ結合アッセイ。Ｍｙｃタグを付けたＮＡＤ
Ｅ及びｐ７５^ＮＴＲを共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から抽出した細胞溶
解物を抗Ｍｙｃ抗体によって共免疫沈降させ、抗ｐ７５^ＮＴＲ抗体によるイムノ
ブロッティングに供した。それぞれのプラスミドと親ベクターをトランスフェク
トした細胞の溶解物を対照として使用した。トランスフェクションの方法は、材
料と方法に記載されている。

【図２Ｃ】ＮＧＦライゲーションに依存したＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲとの相互反応。Ｍｙ
ｃタグを付けたＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲを共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞
を、表記の様々な濃度のＮＧＦで処理した。上図：各試料の抗Ｍｙｃ抗体（ＩｇＧ１）による免疫沈降物に対して、抗ｐ７５ ^ＮＴＲ抗体によるイムノブロッティング分析を行った。中図及び下図は、それぞ
れ、イムノブロッティングによるｐ７５^ＮＴＲ及びＮＡＤＥタンパク質の発現レ
ベルを示している。抗ＦＬＡＧ抗体（ＩｇＧ１）の免疫沈降物を対照として使用
した。

【図３Ａ】図３Ａ−Ｅ２９３Ｔ細胞に対するＮＡＤＥとｐ７５^ＮＴＲの共トランスフェ
クションの影響。それぞれのｃＤＮＡによって、ＮＡＤＥ及びｐ７５^ＮＴＲを２９３Ｔ細胞に共
トランスフェクトすることによって生じる形態学的変化を、トランスフェクショ
ンから４８時間後に観察した。倍率は２００倍である。トランスフェクションの
方法は、材料及び方法に記載されている。

【図３Ｂ】ＴＵＮＥＬアッセイ。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞をＴＵＮＥＬ法で染
色し、フローサイトメトリーで分析した。示したパーセントは陽性集団のもので
ある。

【図３Ｃ】ＤＮＡ断片化分析。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＤＮＡを１．５％ア
ガロースのゲル電気泳動で調べた。

【図３Ｄ】ＮＡＤＥによるＮＦ−κＢ活性の阻害。トランスフェクトした細胞のＮＦ−κ
Ｂ活性は、Ｅ−セレクチンプロモータ−ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポータ
ーアッセイによって測定した。トランスフェクションの２４時間後に、ルシフェ
ラーゼ活性を測定して、ｐＲＬ−ＴＫ発現レベルに基づいて標準化した。

【図３Ｅ】共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるカスパーゼ−２及び３の活性化
とＰＡＲＰの分解。表記のとおり、各ｃＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ
細胞の細胞抽出物を抗カスパーゼ−２、抗カスパーゼ−３及び抗ＰＡＲＰ抗体を
用いたイムノブロッティングによって分析した。α−チューブリンのレベルを対
照として測定した。

【図４Ａ】図４Ａ−ＤＣ末端に保存されたＲｅｖ様ＮＥＳは、ＮＡＤＥタンパク質の核
外移行を媒介する。マウスＮＡＤＥＮＥＳは、Ｃ末端内の８８−１００残基に存在する。マウス
ＮＡＤＥをＮＡＤＥファミリーのメンバーの相同な配列、並びにＨＩＶＲｅｖ
、ＭＡＰＫＫ、ｃＺｙｘｉｎ、及びＰＫＩ−ａのＮＥＳ配列と共に並べた。

【図４Ｂ】トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、野生型ｍＮＡＤＥ−ＧＦＰ及び
対照ＧＦＰベクターの細胞内局在を分析した。

【図４Ｃ】ＧＦＰ融合マウスＮＡＤＥタンパク質の核外移行に対するＮＥＳモチーフ欠失
変異体の影響。ＮＥＳを有する、又は有さない欠失変異体はいずれも、それぞれ
１２４の欠失及びΔ９１−１２４を示す。

【図４Ｄ】ＧＦＰ融合マウスＮＡＤＥタンパク質の核外移行に対するＮＥＳモチーフ内の
点突然変異の影響。残基９４及び残基９７（ＬｅｕからＡｌａ）に、１又は２個
のアミノ酸置換を施した。ＧＦＰ構築物を２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェ
クトした。固定した細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３で染色して核を視覚化し、細胞領域
を表す画像を共焦点レーザー顕微鏡で捕らえた。各構築物につき、１０００個以
上の細胞を分析した。

【図５】ＮＡＤＥ変異体の概略図。Ａ、ＮＡＤＥの欠失突然変異体。完全長マウスＮＡ
ＤＥのドメイン構造を上部に示す。アミノ酸番号は前掲のとおりである。すなわ
ち、核外移行シグナル（ＮＥＳ）ドメイン（９０−１００）及びユビキチン配列
（ＵＳ）ドメイン（９１−１１２）である。様々なＮＡＤＥ欠失変異体を図解し
て示す。Ｂ、ｍＮＡＤＥの点突然変異。Ｃ末端及びＮＥＳの突然変異。野生型Ｎ
ＡＤＥ及び変異体のＣ末端側半分のドメイン配列の概略図。

【図６Ａ】２９３Ｔ細胞における、ｐ７５ＮＴＲ／ＮＡＤＥ誘導性アポトーシスのＮＧＦ
依存性制御。Ａ、２９３Ｔ細胞での形態学的分析。ｐｃＤＮＡ３／ｒａｔ−ｐ７
５ＮＴＲ又は／及びｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ／ｍＮＡＤＥ（
ＷＴ）を用いて、細胞を一過性にトランスフェクトして、１０時間培養した。血
清を除去した後、１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを添加して、又は添加しないで、細
胞を３６時間処理した。細胞を３．７％パラホルムアルデヒドで固定して、核の
形態をＤＡＰＩ染色で分析した。

【図６Ｂ】２９３Ｔ細胞における、ｐ７５ＮＴＲ／ＮＡＤＥ誘導性アポトーシスのＮＧＦ
依存性制御。Ｂ、ＤＡＰＩ染色によって決定したアポトーシス細胞のパーセント
。各試料中の少なくとも４００個の細胞について、蛍光顕微鏡を用いて、アポト
ーシスに典型的な核の形態を有するアポトーシス細胞の数を計数した。示したデ
ータは、別個の４つの実験から得られたアポトーシス細胞のパーセント（平均±
Ｓ．Ｄ．）である。

【図７】アポトーシスに関するＮＡＤＥのマッピング分析。アポトーシスに関するＮＡ
ＤＥの突然変異分析。ｐ７５ＮＴＲとともに、又はｐ７５ＮＴＲなしに表記の構
築物を、２９３Ｔ細胞の中に一過性にトランスフェクトした。細胞を３．７％パ
ラホルムアルデヒドで固定して、核の形態をＤＡＰＩ染色で分析した。示された
データ（平均±Ｓ．Ｄ．）は、計数した細胞の総数に対するアポトーシスが生じ
た細胞のパーセントである（ｎ＝４）。

【図８Ａ】ＮＡＤＥＮＥＳ機能の影響。Ａ、ＮＡＤＥ中の保存されたＲｅｖ様ＮＥＳ。
ＮＡＤＥが、ＮＡＤＥの相同配列、並びにＰＫＩのＮＥＳ、ＨＩＶ、Ｒｅｖ、Ｍ
ＤＭ２及びＭＡＰＫＫと並置されている。

【図８Ｂ】ＮＡＤＥＮＥＳ機能の影響。Ｂ、２９３Ｔ細胞におけるＮＥＳ変異体の細胞
内局在分析。ＧＦＰ−ベクター、ＧＦＰ−ＮＡＤＥ（ＷＴ）、ＧＦＰ−Ｎ（Ｌ９
９Ａ）及びＧＦＰ−Ｎ（Ｌ９４Ａ、Ｌ９７Ａ、Ｌ９９Ａ）で細胞をトランスフェ
クトした。Ｔｏ−ＰＲＯ−３ヨウ素を使用して核を視覚化し、「実験方法」で説
明したように細胞内局在分析を実施した。

【図８Ｃ】ＮＡＤＥＮＥＳ機能の影響。Ｃ、ＮＡＤＥの二量体形成。ｐｃＤＮＡ３．１
／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ／ｍＮＡＤＥ（ＷＴ）、ｐｃＤＮＡｐｃＤＮＡ３．
１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ／Ｎ（Ｌ９９Ａ）、及びｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ
−Ｈｉｓ（−）Ａ／Ｎ（Ｌ９４、Ｌ９７Ａ、Ｌ９９Ａ）を用いて、２９３Ｔ細胞
を３６時間トランスフェクトした。細胞を溶解緩衝液で溶解して、１６，０００
ｇで３０分間遠心した。５０μＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加
えた、又は加えていないＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で、得られた上清を５分
間煮沸し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＮＡＤＥポリクローナル抗体
によるウェスタンブロットで分析した。

【図８Ｄ】ＮＡＤＥＮＥＳ機能の影響。Ｄ、ＮＡＤＥ及びその点突然変異体とｐ７５Ｎ
ＴＲとの相互反応。ＮＡＤＥ又はそのＮＥＳ変異体の何れかとともに、ｐ７５Ｎ
ＴＲ細胞質領域（３３８−３９６）を含有するＧＳＴ融合タンパク質を用いて、
突然変異体とｐ７５ＮＴＲとの相互反応を測定した。ＮＡＤＥ構築物をインビト
ロで翻訳して、［^３５Ｓ］メチオニンで標識した。結合した複合体は材料と方法
で説明したように沈殿させた。

【図８Ｅ】ＮＡＤＥＮＥＳ機能の影響。Ｅ、アポトーシスに対するＮＥＳの変異の影響
。表記の構築物をｐ７５ＮＴＲと共に２９３Ｔ細胞内に一過性にトランスフェク
トした。３．７％パラホルムアルデヒドで細胞を固定して、核の形態をＤＡＰＩ
染色で分析した。示されたデータ（平均±Ｓ．Ｄ．）は、計数した細胞の総数中
のアポトーシが生じた細胞のパーセントである（ｎ＝４）。

【図９Ａ】ＮＡＤＥはＮＦ−κＢ活性を抑制する。Ａ、ＮＡＤＥの過剰発現によって２９
３Ｔ細胞中のＮＦ−κＢの基底活性が抑制される。Ｅセレクチン−ルシフェラー
ゼレポーター遺伝子、ｐＲＬ−ＴＫｒ、ｐｃＤＮＡ３／ｐ７５ＮＴＲ及びｐｃＤ
ＮＡ３．１ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｍＮＡＤＥＷＴ（０．３、３．０μｇ）を用いて
、２９３Ｔ細胞を一過性に共トランスフェクトした。トランスフェクションから
１２時間後に、無処置のまま細胞を放置するか、又は１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ
で２４時間処理した。ダブルルシフェラーゼレポーターシステムを使用して、ト
ランスフェクション効率に対してルシフェラーゼの値を標準化した。

【図９Ｂ】ＮＡＤＥはＮＦ−κＢ活性を抑制する。Ｂ、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼ
レポータープラスミド、ｐＲ−ＴＫ、及び野生型ＮＡＤＥ発現プラスミド（０．
３、１．０μｇ）又はベクターのみをＰＣ１２細胞にトランスフェクトして、１
００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦの存在下で２４時間培養した。示した値はベクター対照
に対するルシフェラーゼ活性を表しており、３連で実施した実験の平均値（棒線
、Ｓ．Ｄ．）として示した。

【図９Ｃ】ＮＡＤＥはＮＦ−κＢ活性を抑制する。Ｃ、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼ
レポータープラスミド、ｐＲ−ＴＫ及び野生型ｍＮＡＤＥ発現プラスミド（０．
３ｇ、１．０μｇ）、又はベクター単独のみをｎｎｒ５細胞にトランスフェクト
して、１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦの存在下で２４時間培養した。示した値はベク
ター対照に対するルシフェラーゼ活性を表しており、３連で実施した実験の平均
値（棒線、Ｓ．Ｄ．）として示した。

【図１０】２９３Ｔ細胞におけるＮＡＤＥ変異体のＮＦ−κＢ活性に対するドミナントネ
ガティブ効果。Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼレポータープラスミド、ｐＲ−
ＴＫ、及び表記のＮＡＤＥ変異体発現プラスミド（０．３、１．０、３．０μｇ
）、又はベクターのみを細胞にトランスフェクトし、２４時間インキュベートし
た。示した値はベクター対照に対するルシフェラーゼ活性を表しており、３連で
実施した実験の平均値（棒線、Ｓ．Ｄ．）として示した。

【図１１】ＮＡＤＥ機能的ドメインの図示。完全長マウスＮＡＤＥのドメイン構造を上部
に示した。アミノ酸番号は前掲のとおりである。すなわち、核外移行シグナルＷ
ＥＳ（９０−１００）ドメイン及びユビキチン配列（ＵＳ）（９１−１１２）ド
メインである。アポトーシス誘発ドメインは、４１と７１の間に位置する。調節
ドメインは、７２と１１２の間に位置し、ｐ７５ＮＴＲ−結合ドメイン（８１−
１０６）を含む。２つの領域（６１−９０、１２１−１２４）が、ＮＦ−κＢの
抑制に寄与する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｐ 21/02 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/566 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ 33/68 15/00 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者佐藤孝明アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07024 フォート・リー、フィフティーンス・ストリート 1275、アパートメント・８ピーＦターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BA14 BB20 BB24 CB01 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FA16 FB02 FB03 FB06 FB07 4B024 AA01 AA11 BA43 BA44 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ20 QQ79 QR55 QR76 QR77 QR80 QS24 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 AG31 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA91Y AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA23 DC50 NA14 ZB212 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA22 EA27 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得るポリペプチドをコードする
単離された核酸分子。
【請求項２】請求項１の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】請求項２の単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項４】請求項１の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質をコードする
請求項１〜４の単離された核酸分子。
【請求項６】ＡＡＴＴＧＴＣＴＡＣＧＣＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＧ
ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＡＣの配列を有する請求項１〜４の単離された核
酸分子。
【請求項７】ＡＡＴＴＧＴＣＴＡＣＧＣＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＧ
ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＡＣの配列を有する請求項５の単離された核酸分
子。
【請求項８】ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結された請求項１
の単離された核酸。
【請求項９】ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結された請求項１
の単離された核酸を有するベクター。
【請求項１０】前記ベクターがプラスミドである請求項９のベクター。
【請求項１１】前記核酸分子が、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るヒト又
はマウスのポリペプチドをコードする請求項３の単離された核酸分子。
【請求項１２】前記核酸分子が、図１Ｇ−１に示された、ｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドをコードする請求項１１の単離された核酸分子（
配列番号５５）。
【請求項１３】前記核酸分子が、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペ
プチドをコードする請求項３の単離された核酸分子。
【請求項１４】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、マウス
、ラット、又はヒトのタンパク質である請求項９の単離された核酸分子。
【請求項１５】図１Ｇ−１に示された核酸配列（配列番号５５）を有する
請求項３の単離された核酸。
【請求項１６】請求項１の核酸分子を有するベクターを備えた宿主細胞。
【請求項１７】前記細胞が、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類
細胞からなる群から選択される請求項１６の宿主細胞。
【請求項１８】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを生産する
方法であって、前記ポリペプチドの生産が可能な適切な条件下で、請求項１７の
宿主細胞を増殖させることを備えた方法。
【請求項１９】前記生産されたポリペプチドを回収することをさらに備え
た請求項１８の方法。
【請求項２０】請求項１の核酸分子の配列中に含まれるユニークな配列と
特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５の連続するヌクレオ
チドの単離された核酸分子。
【請求項２１】ＤＮＡ分子である請求項２０の単離された核酸。
【請求項２２】ＲＮＡ分子である請求項２０の単離された核酸。
【請求項２３】請求項１の核酸分子に対して相補的である核酸分子の配列
中に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズすることができる単離さ
れた核酸分子。
【請求項２４】ＤＮＡ分子である請求項２３の単離された核酸。
【請求項２５】ＲＮＡ分子である請求項２３の単離された核酸。
【請求項２６】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードす
るｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有するアンチセンス
オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】請求項３のｃＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得る
核酸配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】請求項４のＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし得る核
酸配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチド
。
【請求項３０】請求項１の単離された核酸によってコードされるｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチド。
【請求項３１】請求項３０のｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチ
ドの精製されたユニークなポリペプチド断片。
【請求項３２】図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番号５５）と実
質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項３０のｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得
るポリペプチド。
【請求項３３】図１Ｇ−１に示されたアミノ酸配列（配列番号５５）を有
する請求項３０のｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド。
【請求項３４】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る脊椎動物のポリペプチド
である請求項３３のｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド。
【請求項３５】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質を含む請求
項２９〜３４のポリペプチド。
【請求項３６】ＮＣＬＲＩＬＭＧＥＬＳＮというアミノ酸配列を含む請求
項２９〜３４のポリペプチド。
【請求項３７】ＮＣＬＲＩＬＭＧＥＬＳＮというアミノ酸配列を含む請求
項３５のポリペプチド。
【請求項３８】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るマウス、ラット、又はヒ
トのポリペプチドである請求項３４のｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る脊椎動物
のポリペプチド。
【請求項３９】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る請求項３５のポリペプチ
ドのエピトープにむけられたモノクローナル抗体。
【請求項４０】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るマウス、ラット、又はヒ
トのポリペプチドにむけられた請求項３３のモノクローナル抗体。
【請求項４１】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る請求項３２のポリペプチ
ドのエピトープにむけられたポリクローナル抗体。
【請求項４２】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るマウス、ラット、又はヒ
トのポリペプチドにむけられた請求項４１のポリクローナル抗体。
【請求項４３】細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞中
に、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現させることを備えた方
法。
【請求項４４】対象にアポトーシスを誘導する方法であって、前記対象中
に、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現させることを備えた方
法。
【請求項４５】前記対象が、ラット、マウス、又はヒトである請求項４４
の方法。
【請求項４６】請求項２の単離されたＤＮＡ分子を含むヒト以外のトラン
スジェニック哺乳動物。
【請求項４７】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードす
る前記ＤＮＡが組織特異的な調節要素に作用可能に連結されている請求項４６の
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４８】ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に、様々なレベル
の、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを発現させたときの生理的な
影響を決定する方法であって、異なる量の、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポ
リペプチドを発現している一群のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成
することを備えた方法。
【請求項４９】適切なベクター中に、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポ
リペプチドを作成する方法であって、（ａ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドをコードする核酸分
子を適切なベクタ−に挿入することと、（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に導入することと、（ｃ）前記導入された宿主細胞から、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポ
リペプチドを発現している宿主細胞を選択することと、（ｄ）前記選択された細胞を培養して、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る
ポリペプチドを産生させることと、（ｅ）産生された前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドを回収す
ることとを備えた方法。
【請求項５０】対象中の細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、ア
ポトーシスを誘導するのに有効な量のｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得る精製され
たポリペプチドを前記対象に投与することを備えた方法。
【請求項５１】前記対象が哺乳動物である請求項５０の方法。
【請求項５２】前記哺乳動物がマウス、ラット、又はヒトである請求項５
１の方法。
【請求項５３】請求項３２又は３３のうち何れか一方のｐ７５^ＮＴＲ受容
体を結合し得る精製されたポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む薬学
的組成物。
【請求項５４】有効量の請求項３２又は３３のうち何れか一方のｐ７５^Ｎ ^ＴＲ受容体を結合し得る精製されたポリペプチドと薬学的に許容される担体とを
含む薬学的組成物。
【請求項５５】ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポ
リペプチドとの結合を阻害し得る化合物を同定する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体に結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体と
が結合して複合体を形成し得る条件下で、前記化合物を、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容
体を結合し得るポリペプチドと接触させることと；（ｂ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を、工程（ａ）で得られた混合物と接触させる
ことと；（ｃ）形成された複合体、若しくは未結合のｐ７５^ＮＴＲ受容体、若しくは未
結合の前記ポリペプチド、又はこれらのうちの何れかの組み合わせの量を測定す
ることとを備えた方法。
【請求項５６】ｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポ
リペプチドとの結合（ここで、この結合はｐ７５^ＮＴＲ受容体とｐ７５^ＮＴＲ受
容体を結合し得るポリペプチドとの間で複合体を形成する）を阻害し得る化合物
を同定する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体に結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体と
が結合して複合体を形成し得る条件下で、前記化合物を、ｐ７５^ＮＴＲ受容体と
接触させることと；（ｂ）前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を、工程（ａ）で得られた混合物と接触させる
ことと；（ｃ）形成された複合体、若しくは未結合のｐ７５^ＮＴＲ受容体、若しくは未
結合の前記ポリペプチド、又はこれらのうちの何れかの組み合わせの量を測定す
ることとを備えた方法。
【請求項５７】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、ニ
ューロトロフィン関連細胞死実行物質である請求項５５又は５６の方法。
【請求項５８】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、ヒ
トＨＧＲ７４タンパク質である請求項５５又は５６の方法。
【請求項５９】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ａ配列である請求項５５又は５６の方法
。
【請求項６０】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｈｕｎａｄｅ３ａ１配列である請求項５５又は５６の方法
。
【請求項６１】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｈｕｎａｄｅ３ａ２配列である請求項５５又は５６の方法
。
【請求項６２】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ａ配列である請求項５５又は５６の方法。
【請求項６３】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ｂ配列である請求項５５又は５６の方法。
【請求項６４】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ｂ配列である請求項５５又は５６の方法
。
【請求項６５】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｈｕｍｎａｄｅ１配列である請求項５５又は５６の方法。
【請求項６６】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄｅ１配列である請求項５５又は５６の方法。
【請求項６７】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ１配列である請求項５５又は５６の方法。
【請求項６８】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、図
１Ｈに規定されているｈｕｍｎａｄｅ２配列である請求項５５又は５６の方法。
【請求項６９】アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を、適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記対象中での、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝
子とｐ７５^ＮＴＲ受容体の遺伝子の発現レベルを測定することとを備え、ｐ７５ ^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現
レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標である
方法。
【請求項７０】前記対象が哺乳動物である請求項６９の方法。
【請求項７１】前記哺乳動物がマウス、ラット、又はヒトである請求項７
０の方法。
【請求項７２】アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞を、適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記細胞中での、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝
子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定することとを備え、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドの遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベル
の増加が、前記化合物がアポトーシス誘導化合物であることの指標である方法。
【請求項７３】酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴ ^Ｒ細胞内ドメインを標的として用いて、ｃＤＮＡライブラリーから、ｐ７５^ＮＴ ^Ｒ受容体を結合し得るポリペプチドをスクリーニングする方法。
【請求項７４】前記ｃＤＮＡライブラリーが哺乳動物のものである請求項
７３の方法。
【請求項７５】前記哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーが、ラット、マウス
、又はヒトのｃＤＮＡライブラリーに由来する請求項７４の方法。
【請求項７６】前記ｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的が哺乳動物のもので
ある請求項７３の方法。
【請求項７７】前記哺乳動物のｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的が、ラッ
ト、マウス、又はヒトｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的である請求項７６の方法
。
【請求項７８】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^Ｎ ^ＴＲとを同時発現させることによって、カスパーゼ−２とカスパーゼ−３活性を
誘導させて、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを切断し、細胞中の核ＤＮ
Ａを断片化する方法。
【請求項７９】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^Ｎ ^ＴＲとを用いて、細胞中でのＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法。
【請求項８０】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^Ｎ ^ＴＲの発現レベルを検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する方法
。
【請求項８１】前記対象が哺乳動物である請求項８０の方法。
【請求項８２】前記哺乳動物がマウス、ラット、又はヒトである請求項８
１の方法。
【請求項８３】ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードし、ＤＮＡ分子である
単離された核酸を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８４】ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、組
織特異的な調節要素に作用可能に連結されている請求項８３のヒト以外のトラン
スジェニック哺乳動物。
【請求項８５】ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に、様々なレベル
の、ヒトＨＧＲ７４を発現させたときの生理的な影響を決定する方法であって、
異なる量のヒトＨＧＲ７４タンパク質を発現している一群のヒト以外のトランス
ジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法。
【請求項８６】適切なベクター中に、ヒトＨＧＲ７４タンパク質を作成す
る方法であって、（ａ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質をコードする核酸分子を適切なベクタ−に挿
入することと、（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に導入することと、（ｃ）ヒトＨＧＲ７４タンパク質を発現している、前記導入された宿主細胞を
選択することと、（ｄ）前記選択された細胞を培養して、ヒトＨＧＲ７４タンパク質を産生させ
ることと、（ｅ）産生された前記ヒトＨＧＲ７４タンパク質を回収することとを備えた方
法。
【請求項８７】対象中の細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、ア
ポトーシスを誘導するのに有効な量の前記精製されたヒトＨＧＲ７４タンパク質
を前記対象に投与することを備えた方法。
【請求項８８】前記対象が哺乳動物である請求項８６の方法。
【請求項８９】前記哺乳動物がマウス、ラット、又はヒトである請求項８
７の方法。
【請求項９０】精製されたヒトＨＧＲ７４タンパク質と薬学的に許容され
る担体とを含む薬学的組成物。
【請求項９１】アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）対象を、適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記対象における、ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定することとを備え、ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺
伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス
誘導化合物であることの指標である方法。
【請求項９２】前記対象が哺乳動物である請求項９１の方法。
【請求項９３】前記哺乳動物がマウス、ラット、又はヒトである請求項９
２の方法。
【請求項９４】アポトーシス誘導化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞を、適切な量の前記化合物と接触させることと；（ｂ）前記細胞における、ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルを測定することとを備え、ヒトＨＧＲ７４タンパク質の遺
伝子とｐ７５^ＮＴＲの遺伝子の発現レベルの増加が、前記化合物がアポトーシス
誘導化合物であることの指標である方法。
【請求項９５】酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、及びｐ７５^ＮＴ ^Ｒ細胞内ドメインを標的として用いて、ｃＤＮＡライブラリーからヒトＨＧＲ７
４をスクリーニングする方法。
【請求項９６】前記ｃＤＮＡライブラリーが哺乳動物のものである請求項
９５の方法。
【請求項９７】前記哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーが、ラット、マウス
、又はヒトのｃＤＮＡライブラリーに由来する請求項９６の方法。
【請求項９８】前記ｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的が哺乳動物のもので
ある請求項９５の方法。
【請求項９９】前記哺乳動物のｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的が、ラッ
ト、マウス、又はヒトのｐ７５^ＮＴＲ細胞内ドメイン標的である請求項９８の方
法。
【請求項１００】ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲを同時発現さ
せることによって、カスパーゼ−２とカスパーゼ−３活性を誘導させて、ポリ（
ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを切断し、細胞中の核ＤＮＡを断片化する方法
。
【請求項１０１】ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲを用いて、細
胞中でのＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法。
【請求項１０２】ヒトＨＧＲ７４タンパク質とｐ７５^ＮＴＲの発現レベル
を検出することによって、対象の神経変性疾患を検出する方法。
【請求項１０３】前記対象が哺乳動物である請求項１０２の方法。
【請求項１０４】前記哺乳動物がヒトである請求項１０３の方法。
【請求項１０５】アポトーシス阻害剤であり、ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合
し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合を阻害してアポトー
シスを抑制し得る化合物を同定する方法であって、（ａ）ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド及びｐ７５^ＮＴＲ受容体
を置換し得ることが予め示されている公知の化合物と、結合したｐ７５^ＮＴＲ受
容体とが結合して複合体を形成し得る条件下で、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合
し得るポリペプチドを、複数の化合物と接触させることと；（ｂ）置換された前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチド又は工程
（ａ）で形成された前記複合体を検出することとを備え、置換がなされることが
、前記化合物がｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５^ＮＴＲ受
容体との特異的な結合を阻害し得る化合物であることの指標である方法。
【請求項１０６】ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドとｐ７５ ^ＮＴＲ受容体との特異的な結合の阻害がレポーター遺伝子の転写活性に影響を与
える請求項１０５の方法。
【請求項１０７】置換された前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペ
プチド又は前記複合体は、工程（ｂ）において、工程（ａ）で前記化合物と接触
させる前及び後にレポーター遺伝子の転写活性を比較することによって検出され
、該活性の変化が、前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドと前記ｐ
７５^ＮＴＲ受容体との特異的な結合が阻害され、且つ前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を
結合し得るポリペプチドが置換されることの指標となる請求項１０６の方法。
【請求項１０８】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体が固相支持体に結合される請求
項１０５の方法。
【請求項１０９】前記化合物が固相支持体に結合される請求項１０５の方
法。
【請求項１１０】前記化合物が、抗体、無機化合物、有機化合物、ペプチ
ド、ペプチド類似化合物、ポリペプチド又はタンパク質を具備する請求項１０５
の方法。
【請求項１１１】前記工程（ａ）の接触がインビトロで行われる請求項１
０５の方法。
【請求項１１２】前記工程（ａ）の接触がインビボで行われる請求項１０
５の方法。
【請求項１１３】前記工程（ａ）の接触が酵母細胞中で行われる請求項１
１２の方法。
【請求項１１４】前記工程（ａ）の接触が哺乳類細胞中で行われる請求項
１１２の方法。
【請求項１１５】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
細胞表面受容体である請求項１０５の方法。
【請求項１１６】前記細胞表面受容体がｐ７５受容体である請求項１１２
の方法。
【請求項１１７】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
ニューロトロフィン関連細胞死実行物質である請求項１０５の方法。
【請求項１１８】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
ヒトＨＧＲ７４タンパク質である請求項１０５の方法。
【請求項１１９】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、ニ
ューロトロフィン関連細胞死実行物質である請求項１０５の方法。
【請求項１２０】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
ヒトＨＧＲ７４タンパク質である請求項１０５の方法。
【請求項１２１】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ａ配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２２】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｈｕｎａｄｅ３ａ１配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２３】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｈｕｎａｄｅ３ａ２配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２４】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ａ配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２５】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄ３ｂ配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２６】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ３ｂ配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２７】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｈｕｍｎａｄｅ１配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２８】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｒａｔｎａｄｅ１配列である請求項１０５の方法。
【請求項１２９】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｍｕｓｎａｄｅ１配列である請求項１０５の方法。
【請求項１３０】前記ｐ７５^ＮＴＲ受容体を結合し得るポリペプチドが、
図１Ｈに規定されているｈｕｍｎａｄｅ２配列である請求項１０５の方法。
【請求項１３１】ニュートロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異
体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＮ
末端のアミノ酸１−４０が欠失され、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（４１−１２
４）と命名され、該ＮＡＤＥＮ（４１−１２４）がｐ７５^ＮＴＲの存在下でア
ポトーシスを誘導する核酸分子。
【請求項１３２】ニュートロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤＥ
）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変異
体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドのＣ
末端のアミノ酸７２−１２４が欠失され、該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（１−７
１）と命名され、該ＮＡＤＥＮ（１−７１）がｐ７５^ＮＴＲの存在下及びｐ７
５^ＮＴＲの非存在下でアポトーシスを誘導する核酸分子。
【請求項１３３】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤ
Ｅ）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変
異体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドの
Ｎ末端のアミノ酸１−４０とＣ末端のアミノ酸７２−１２４が欠失されており、
該欠失変異体はＮＡＤＥＮ（４１−７１）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下
とｐ７５^ＮＴＲの非存在下で、該ＮＡＤＥＮ（４１−７１）がアポトーシスを
誘導する核酸分子。
【請求項１３４】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤ
Ｅ）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変
異体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドの
Ｃ末端のアミノ酸１２１−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥ
Ｎ（１−１２０）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、該ＮＡＤＥＮ（１−
１２０）がアポトーシスを誘導する核酸分子。
【請求項１３５】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤ
Ｅ）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変
異体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドの
Ｃ末端のアミノ酸１１３−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥ
Ｎ（１−１１２）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、該ＮＡＤＥＮ（１−
１１２）がアポトーシスを誘導する核酸分子。
【請求項１３６】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤ
Ｅ）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの欠失変
異体をコードする単離された核酸分子であって、野生型ＮＡＤＥポリペプチドの
Ｃ末端のアミノ酸１０１−１２４が欠失されており、該欠失変異体はＮＡＤＥ
Ｎ（１−１００）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下とｐ７５^ＮＴＲの非存在下
で、ＮＡＤＥＮ（１−１００）がアポトーシスを誘導する核酸分子。
【請求項１３７】ニューロトロフィン関連細胞死実行タンパク質（ＮＡＤ
Ｅ）と命名されたｐ７５^ＮＴＲ受容体と結合し得る野生型ポリペプチドの変異を
コードする単離された核酸分子であって、点変異によって、野生型ＮＡＤＥポリ
ペプチドの９９位のアミノ酸ＡｌａがＬｅｕに置換され、該置換変異体ポリペプ
チドはＮＡＤＥＮ（Ｌ９９Ａ）と命名され、ｐ７５^ＮＴＲの存在下で、該ＮＡ
ＤＥＮ（Ｌ９９Ａ）がアポトーシスを誘導する核酸分子。