CN111679082A - 一种筛选用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选或鉴定用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法以及由该方法获得的化合物和用途。

Description

一种筛选用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化 合物的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，并且具体地涉及一种筛选或鉴定用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法以及由该方法获得的化合物和用途。

背景技术

许多疾病是由细胞或组织内出现特定的蛋白或特定蛋白水平的水平过高引起的，其中一些影响疾病的特定蛋白的活性未知，因而针对这样的疾病，常见的治疗策略为控制蛋白水平。目前一些用于控制蛋白水平的方法例如RNAi或CRIPSR等生物工具在体内的递送困难，因此，一种可行的治疗策略是通过低分子量化合物(简称化合物)来控制影响疾病的蛋白的水平。通过蛋白裂解靶向嵌合体(PROTAC)技术增强疾病蛋白的泛素化并将其靶向蛋白酶体降解途径是一种新兴方法，但这种方法依赖于某些E3连接酶，这些连接酶可能不存在于疾病细胞中。并且，蛋白酶体的蛋白降解能力有限，对某些大型疾病蛋白或聚集体降解效率较低。

神经退行性疾病(Neurodegenerative Disorder)是指中枢神经元不正常死亡引起神经系统功能障碍而导致的疾病，迄今为止没有可以减缓其发展进程的根本性治疗方法。以其中最常见的亨廷顿病(HD)为例，这是一种单基因遗传的疾病，患者的四号染色体所含基因HTT的exon1外显子的CAG重复区域变异导致合成的变异蛋白(mHTT)的谷氨酰胺重复区域(polyQ)扩增。mHTT易被剪切、聚集并产生毒性，最终导致特定神经元功能障碍和死亡。目前通过低分子量化合物控制mHTT水平的方法缺乏特异性，可能造成副作用，并且是非等位选择性的，无法区分mHTT与野生型HTT蛋白(wtHTT)，会导致具有重要生物学功能的wtHTT水平降低。

因此，本领域亟需有效的筛选或鉴定方法，以获得能够用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物。

发明内容

在一方面，本发明提供一种筛选或鉴定用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法，包括

(I)：使候选化合物与待测体系接触，所述待测体系包含

(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段，和

(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段；和

(II)：测定所述候选化合物调节(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合的能力，并且选择正向调节所述结合的化合物。

在另一方面，本发明提供通过本发明的方法获得的化合物或其药物组合物在制备用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的药物中的用途，或者在制备用于检测被认为患有或易患polyQ相关的神经退行性疾病的受试者的诊断试剂或试剂盒中的用途。

在又一方面，本发明提供正向调节(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合的化合物或其药物组合物在制备用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的药物中的用途。

附图说明

图1.在同时存在全长HTT和LC3B的体系中检测化合物的亲和活性。

图2.化合物对Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元HTT水平的影响。

图3.化合物1和2对Hdh^Q7/Q7小鼠皮质神经元HTT水平的影响。

图4.多种抗体检测化合物处理后Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元HTT水平。

图5.用抗体MW1和3B5H10检测化合物处理后Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元中mHTT的N-端碎片。

图6.化合物处理后Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元细胞活力检测结果。

图7.化合物在100nM浓度下对HD患者原代成纤维细胞mHTT水平的影响。

图8.化合物对HD患者永生化成纤维细胞mHTT水平的影响。

图9.化合物4降低永生化的HD患者成纤维细胞的mHTT水平

图10.化合物对HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元的mHTT水平的影响。

图11.化合物对HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元细胞凋亡的影响。纵坐标跨度50μM。

图12.化合物对HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元细胞凋亡的影响。其中I、II、III、IV分别代表化合物1、化合物2、化合物3、化合物4。

图13.化合物对亨廷顿病果蝇mHTT水平的影响。

图14.化合物对亨廷顿病果蝇生存率的影响。其中I、II、III、IV分别代表化合物1、化合物2、化合物3、化合物4。

图15.化合物对亨廷顿病果蝇爬行能力的影响。其中I、II、III、IV分别代表化合物1、化合物2、化合物3、化合物4。

图16.脑室内注射化合物对亨廷顿病小鼠皮质mHTT和wtHTT水平的影响。

图17.腹腔注射化合物对亨廷顿病小鼠皮质和纹状体mHTT和wtHTT水平的影响。

图18.腹腔注射化合物后，检测亨廷顿病小鼠皮质中的mHTT聚集物。

图19.腹腔注射化合物对亨廷顿病小鼠行为缺陷的影响。

图20.化合物不影响培养的Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元细胞自噬功能和对照蛋白的水平。

图21.腹腔注射化合物不影响小鼠皮质中SQSTM1/p62水平。

图22.化合物选择性增强mHTT与LC3B之间的结合。

图23.化合物影响下mHTT与LC3B在Hela细胞中的共定位。白色箭头表示代表性的共定位点。部分图像放大显示共定位点。纵坐标跨度10μM。

图24.化合物影响下mHTT与LC3B在STHdh^Q111/Q111细胞中的共定位。

图25.化合物在HEK293T细胞中对含有谷氨酰胺重复区域的蛋白水平的影响。

图26.化合物对脊髓小脑共济失调3型患者成纤维细胞的ATXN3蛋白水平的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的技术内容，本领域技术人员可由本说明书公开的内容容易地了解本发明的其他优点与功效。本发明也可以通过其他不同的具体实施例加以施行或应用。本领域技术人员能够在不背离本发明的精神前提下，进行各种修饰与变更。

一般术语和定义

除非另有定义，本文所用所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。若存在矛盾，则以本申请提供的定义为准。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。本文引用的所有专利、已经公开的专利申请和出版物均通过引用并入到本文中。

术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。本领域技术人员应当理解，上述术语如“包括”涵盖“由…组成”的含义。

术语“一个(种)或多个(种)”或者类似的表述“至少一个(种)”可以表示例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(种)或更多个(种)。

当公开了数值范围的下限和上限时，落入该范围中的任何数值和任何包括的范围都被具体公开。特别地，本文公开的值的每个取值范围应理解为表示涵盖于较宽范围中的每个数值和范围。例如，表述“polyQ长度≥40的ATXN1”可以涵盖polyQ长度≥41的情况。例如，“polyQ长度≥33的ATXN2”可以涵盖polyQ长度≥34的情况。例如，“polyQ长度≥41的ATXN3”可以涵盖polyQ长度≥62的情况，并且可以涵盖例如polyQ长度为74的情况。例如，“polyQ长度<41的ATXN3”可以涵盖polyQ长度为27的情况。例如，“polyQ长度≥19的ATXN7”可以涵盖polyQ长度≥38的情况。例如，“polyQ长度≥44的TBP”可以涵盖polyQ长度≥45的情况。例如，“polyQ长度≥39的ATN1”可以涵盖polyQ长度≥49的情况。例如，“polyQ长度≥36的HTT”可以涵盖polyQ长度为47、49、55、68、72、73、111、128或140等的情况。又例如，“polyQ长度<36的HTT”可以涵盖polyQ长度为7、16、19、23或25等的情况。例如，“polyQ长度≥37的AR”可以涵盖polyQ长度≥38的情况。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

术语“神经退行性疾病”指神经元和/或其髓鞘的丧失或病变所致的疾病。神经退行性疾病患者的脑神经元内可以观察到特征性的病理结构物，例如蛋白组成的不溶性聚集体。不溶性聚集体可能产生细胞毒性，进而导致神经元丧失和疾病发生。

术语“polyQ”或“polyglutamine”指蛋白中的谷氨酰胺重复区域。谷氨酰胺由基因中的胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)编码，谷氨酰胺重复区域的长度与基因外显子中的CAG重复数目有关，因此基因外显子中CAG重复数目增多会造成合成的蛋白谷氨酰胺重复区域扩增。已知polyQ异常扩增蛋白与一些神经退行性疾病相关。如本文中所使用的，基因名称中可以通过“Q+数字”的形式来表示外显子中CAG重复数目，例如Q25或Q72，分别表示外显子中CAG的25个重复或72个重复。蛋白名称中可以通过如上“Q+数字”的形式来表示谷氨酰胺重复区域的长度，例如Q27或Q73，分别表示谷氨酰胺重复区域的长度为27个Q(glutamine)或73个Q。本文中“Q+数字”的形式标示的CAG重复或谷氨酰胺重复均为连续重复。除非特别指明，本文中的polyQ长度均指连续重复的谷氨酰胺区域长度。

术语“polyQ相关的神经退行性疾病”指与polyQ异常扩增相关的神经退行性疾病，或对含扩增的polyQ的蛋白水平响应的神经退行性疾病，是一组临床和遗传上异质性的神经退行性疾病。

“正常polyQ”是指正常生理状态下的蛋白具有长度小于特定数目的polyQ。与之对应地，“polyQ异常扩增”是指蛋白的polyQ长度大于正常长度。对于疾病或病理状态，polyQ长度会更长。

如本文所用，“正常polyQ蛋白”包含长度正常的polyQ(即其polyQ部分)。

如本文所用，“polyQ异常扩增蛋白”包含长度异常的polyQ(即其polyQ部分)。例如，polyQ长度≥40、≥33、≥41、≥19、≥46、≥44、≥39、≥36或≥37的polyQ部分。

作为示例，正常或异常polyQ蛋白的片段的长度可以是对应的蛋白全长的1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高、5％或更高、10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高或者95％或更高，但包含完整的长度正常或异常的polyQ部分。

在优选的实施方案中，当用于本发明的方法，特别是高通量方法时，可以使用polyQ异常扩增蛋白的片段。其含有该蛋白的polyQ部分，并且长度可以仅为对应蛋白的1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高。在示例性实施方案中，所用的“polyQ异常扩增蛋白”或其片段可以包含SEQ ID No:1或2的氨基酸序列。在另一示例性方案中，所用的“正常polyQ蛋白”或其片段可以包含SEQ ID No:3或4或5的氨基酸序列。

“正常polyQ蛋白”或“polyQ异常扩增蛋白”可以是天然存在的蛋白，其中包含长度正常或异常的polyQ部分，例如可以来自人(例如为ATXN1、ATXN2、ATXN3、ATXN7、ATXN12、TBP、ATN1、HTT或AR)或来自其他动物，例如来自小鼠(例如小鼠HTT蛋白，其polyQ长度可以例如为140或111)，或来自昆虫、鱼类、啮齿类、偶蹄类、灵长类动物。

“正常polyQ蛋白”或“polyQ异常扩增蛋白”也可以是人工改造或修饰的蛋白，但仍然带有其相应的polyQ部分。这样的改造或修饰可以是为了加工、纯化、表征、示踪等目的，例如加入MBP标签或与绿色荧光蛋白融合，或者引入各种氨基酸取代、增加或缺失。这样的技术为本领域技术人员所熟知。优选地，这样的蛋白包含对应的正常或异常polyQ部分，并且与对应的正常或polyQ异常扩增蛋白的具有15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高或者95％或更高的序列相同性。这样的蛋白可以是由对应的正常或polyQ异常扩增蛋白的全长或片段截取或拼接得到的，并且任选地包含改造或修饰，也可以是从头设计的。

作为示例，polyQ相关的神经退行性疾病包括但不限于脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia,SCA)1型(polyQ长度≥41)、2型(polyQ长度≥34)、3型(polyQ长度≥62)、7型(polyQ长度≥38)、12型(polyQ长度≥46)、17型(polyQ长度≥45)；以及齿状核-黑质-红核-苍白球-丘脑底核萎缩症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy,DRPLA，polyQ长度≥49)、亨廷顿病(Huntington's Disease,HD，polyQ长度≥36)和脊髓延髓肌肉萎缩(spinal-bulbar muscular atrophy,SBMA，polyQ长度≥38)。这些疾病分别由在ATXN1、ATXN2、ATXN3、ATXN7、ATXN12、TBP、ATN1、HTT和AR基因上的CAG重复区域的扩增引起(Lesley Jones等，DNA repair in the trinucleotide repeat disorders,LancetNeurol.2017；16:88–96)。其中脊髓小脑共济失调3型(SCA3，又称为Machado-Josephdisease,MJD)是全世界最常见的常染色体显性脊髓小脑共济失调和仅次于HD的常见polyQ相关疾病，由Ataxin-3基因(ATXN3；又称为MJD1基因)CAG重复数目增多导致编码蛋白ATXN3的C末端形成异常扩增的polyQ引起。本文所述的正常polyQ蛋白的实例包括但不限于polyQ长度<40的ATXN1、polyQ长度<33的ATXN2、polyQ长度<41的ATXN3、polyQ长度<19的ATXN7、polyQ长度<46的ATXN12、polyQ长度<44的TBP、polyQ长度<39的ATN1、polyQ长度<36的HTT，和polyQ长度<37的AR。与之对应地，本文所述的polyQ异常扩增蛋白的实例包括但不限于polyQ长度≥40的ATXN1、polyQ长度≥33的ATXN2、polyQ长度≥41的ATXN3、polyQ长度≥19的ATXN7、polyQ长度≥46的ATXN12、polyQ长度≥44的TBP、polyQ长度≥39的ATN1、polyQ长度≥36的HTT，和polyQ长度≥37的AR。

人微管相关蛋白1轻链3β(MAP1LC3B,LC3B)属于Atg8蛋白家族中的微管相关蛋白1轻链3(LC3)家族，其定位于前自噬体和自噬体的膜上，并能控制自噬体形成，是自噬过程中的关键蛋白。

本文所用的LC3B蛋白的同源物可以来自真核生物，例如酵母或非人的其他动物，例如昆虫(例如果蝇)、鱼类、啮齿类、偶蹄类、灵长类等。LC3B蛋白的同源物也可以来自于其他类似结构功能的蛋白，例如LC3A、LC3C、GABARAP和GABARAPL1。

在示例性实施方案中，LC3B蛋白或其同源物或者它们的片段与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高或者100％的序列相同性。

术语“亲和活性筛选”是检测样品与靶标之间的亲和结合的过程。亲和活性筛选采用的检测方法可以例如是吸光度法、放射法(例如接近闪烁分析)、荧光法(例如荧光共振能量转移、荧光偏振检测，尤其例如时间相关荧光技术)、化学发光法(例如放大化学发光亲和均相检测，ALPHAScreen)、表面等离子体共振(SPR，可以例如采用GE公司的Biacore系列实施)、等温滴定量热法(ITC)、微量热泳动(MST)或斜入射光反射差法。

如本文所用，两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。“序列同源性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，将测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分数。适合用于确定序列相同性和序列相似性百分比的算法实例包括但不限于BLAST和BLAST 2.0算法。实施BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得。

术语“目标样品”包括含有从受试者获得的并可用于诊断分析的各种样品类型。本文中的目标样品可以例如是任何细胞样品、生物流体(包括血液、血清、脊髓液，等)或从受试者的组织获得的任何活检样品。

筛选方法

本发明的概念至少是部分地基于以下新机制的发现：能够与自噬过程中的关键蛋白LC3B以及polyQ异常扩增蛋白亲和结合的化合物可以促进polyQ异常扩增蛋白经由细胞自噬而降解，从而达到降低polyQ异常扩增蛋白水平、治疗或预防相应疾病的目的。

因此，在一方面，本发明提供一种筛选或鉴定用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法，包括

(I)：使候选化合物与待测体系接触，所述待测体系包含

(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段，和

(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段；和

(II)：测定所述候选化合物调节(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合的能力，并且选择正向调节所述结合的化合物。

所述的体系包括但不限于溶液体系、亚细胞体系、细胞(细胞培养物)体系、组织体系、器官体系、或动物体系。

在一实施方案中，候选化合物可以以化合物库的方式提供。这样的库可以是商购的或者设计合成的。候选化合物可以包括肽、拟肽和有机小分子等。例如以选自设计合成的化合物、数据库(例如Pubmed)中结构确定的化合物或从头合成的化合物。在一个具体的实施方式中，候选化合物选自有机小分子。

术语“有机小分子”或“低分子量化合物”是指大小与通常用于药物的有机分子相当的分子。该术语排除生物大分子(例如蛋白质、核酸等)，但是涵盖小分子量蛋白或其衍生物，例如二肽、三肽、四肽、五肽等。

在一具体的实施方案中，有机小分子的大小为约100-约2000Da，优选为约200-约1000Da，例如约200-约900Da、约200-约800Da、约200-约700Da、约200-约600Da、约200-约500Da。

本发明的方法使用的polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段由针对的polyQ相关的神经退行性疾病决定。

在一实施方案中，根据针对的polyQ相关的神经退行性疾病，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ的长度≥40、≥33、≥41、≥19、≥46、≥44、≥39、≥36或≥37的polyQ部分。在一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥40的ATXN1或其含有polyQ部分的片段。在一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥33的ATXN2或其含有polyQ部分的片段。在另一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥41的ATXN3或其含有polyQ部分的片段。在又一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥19的ATXN7或其含有polyQ部分的片段。在一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥46的ATXN12或其含有polyQ部分的片段。在另一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥44的TBP或其含有polyQ部分的片段。在又一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥39的ATN1或其含有polyQ部分的片段。在一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥36的HTT或其含有polyQ部分的片段。在另一优选的实施方案中，polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥37的AR或其含有polyQ部分的片段。

对结合的“正向调节”是指在相同条件下进行测定，与化合物不存在时相比，化合物存在时，所述结合涉及的蛋白或其片段之间的结合强度变大，或结合量变大。在一实施方案中，可以在分子水平测定化合物对所述结合的正向调节，例如测定蛋白或其片段之间结合亲和力在化合物存在的条件下的增大。

本发明对于步骤(II)的实施方法没有特别的限制。在一实施方案中，步骤(II)通过以下方式实施：分别在存在/不存在候选化合物的条件下，测定表征(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合强度的参数，并将存在/不存在候选化合物时进行的相同试验中获得的参数相比较，选择正向调节(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的结合的化合物。取决于所进行的结合试验，上述“参数”可以是各种各样的，但特别可以例如是吸光度值、放射性信号和/或在样品中的分布、荧光信号强度和/或在样品中的分布、热量变化、反射光强度、反射光相位变化，等。

在一实施方案中，(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合为亲和结合，步骤(II)包括：测定存在/不存在所述候选化合物的条件下，(1)与(2)之间的结合亲和力大小，和/或测定存在/不存在所述候选化合物的条件下，(1)与(2)的结合量；对存在/不存在候选化合物时得到的测定值进行比较，如果当存在候选化合物时，上述蛋白或其片段之间的结合出现正向变化，则选择该候选化合物。

在一实施方案中，步骤(II)中测定蛋白或其片段之间的结合的方法选自体外拉下实验(pull-down assay)、Split-TEV、免疫共沉淀(co-IP)、亲和层析(AP)、复合物共纯化(Copurification)、酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光分子筛(Fluorescence-SEC)、酵母双杂交、HIP-HOP(haploinsufficiency profiling and homozygous deletion profiling)法、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)、化学发光法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、微量热泳动及其任意组合。在一优选的实施方案中，测定所述结合的方法选自体外拉下实验、免疫共沉淀、酶联免疫吸附法、荧光分子筛和时间分辨荧光共振能量转移及其任意组合。

在另一实施方案中，在步骤(I)之前还包括对候选化合物进行亲和活性预筛选的步骤；包括：

(A)：检测候选化合物与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的亲和结合，和/或(B)：检测候选化合物与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的亲和结合；

以及(C)：选择与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段和/或(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段能够亲和结合的化合物。

其中步骤(A)和步骤(B)可以以任何顺序独立地进行。例如步骤(A)和步骤(B)可以同时分别在不同的体系中进行。可以先进行步骤(A)，然后进行步骤(B)，反之亦然。在优选的方案中，选择与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段和(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段都能够亲和结合的化合物。

按需要，步骤(A)和步骤(B)可以独立地进行或不进行，也可以以各自独立的方式进行至少一次(例如各自独立地1次、2次、3次或更多次)。这样的方式，根据需要可以各自独立地是定性或定量的。

在一优选的实施方案中，步骤(A)可以包括：测定候选化合物与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的亲和反应平衡解离常数(K_d)，选择亲和反应平衡解离常数为100μM以下的化合物，优选10μM以下，特别优选1μM以下，例如600nM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、100nM以下，等。

在一优选的实施方案中，步骤(B)可以包括：测定候选化合物与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的亲和反应平衡解离常数，选择亲和反应平衡解离常数为100μM以下的化合物，优选10μM以下，特别优选1μM以下，例如600nM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、100nM以下，等。

在一个替代方案中，步骤(A)和步骤(B)同时在同一体系中进行，即，使候选化合物同时与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段和(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段接触，检测候选化合物分别与所述蛋白或其片段的亲和结合。

在一实施方案中，步骤(A)或步骤(B)用于测定亲和结合的方法选自接近闪烁分析、荧光共振能量转移、荧光偏振检测、荧光分子筛、微量热泳动、化学发光法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、斜入射光反射差法及其任意组合。在一优选的实施方案中，步骤(A)或步骤(B)用于测定亲和结合的方法选自荧光共振能量转移、荧光偏振检测、斜入射光反射差法及其任意组合。在一特别优选的实施方案中，步骤(A)或步骤(B)用于测定亲和结合的方法为斜入射光反射差法。

在一优选的实施方案中，对候选化合物进行亲和活性预筛选的步骤通过采用斜入射光反射差法的高通量筛选进行；包括：

(a)对候选化合物进行固定化以制备化合物芯片，扫描芯片，得到孵育前的图像；

(b)将化合物芯片与靶蛋白进行孵育，扫描芯片，得到孵育后的图像；

其中靶蛋白为(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段或者(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段；和

(c)对差异图像(孵育后的图像-孵育前的图像)进行分析，选择与(1)和(2)都能够亲和结合的化合物。

在另一实施方案中，步骤(A)或步骤(B)用于测定平衡解离常数的方法选自表面等离子体共振、等温滴定量热法和微量热泳动。

在另一实施方案中，本发明的方法还可以包括步骤(D)：测定候选化合物与正常polyQ蛋白或其含有polyQ部分的片段的结合。该步骤例如可以在步骤(II)之后，或在步骤(C)之后进行。

在一实施方案中，所述结合为亲和结合。在一实施方案中，选择不与正常polyQ蛋白或其含有polyQ部分的片段亲和结合的化合物。步骤(D)可以按需要进行或不进行，也可以进行至少一次(例如1次、2次、3次或更多次)。当进行多于一次时，每次所用的正常polyQ多肽可以独立地为正常polyQ蛋白或其含有polyQ部分的片段。

步骤(D)所用的正常polyQ蛋白为步骤(I)中所用的polyQ异常扩增蛋白对应的正常polyQ蛋白。在一实施方案中，步骤(I)中所用的polyQ异常扩增蛋白包含polyQ异常扩增的HTT或其含有polyQ部分的片段。与之相应地，如果存在步骤(D)，其中所用的正常polyQ蛋白包含正常HTT或其含有polyQ的部分。在一示例性的实施方案中，步骤(I)中所用的polyQ异常扩增蛋白为polyQ异常扩增的HTT或其含有polyQ部分的片段，例如为polyQ长度≥36的HTT或其含有polyQ部分的片段，例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列(HTTexon1-Q72)。与之相应地，如果存在步骤(D)，其中所用的正常polyQ蛋白为polyQ长度正常的HTT或其含有polyQ部分的片段，例如为polyQ长度<36的HTT或其含有polyQ部分的片段，例如SEQ ID NO:3的氨基酸序列(HTT-Q23)或SEQ ID NO:4的氨基酸序列(HTTexon1-Q25)。

在又一实施方案中，步骤(I)中所用的polyQ异常扩增蛋白包含polyQ异常扩增的ATXN3或其含有polyQ部分的片段。与之相应地，如果存在步骤(D)，其中所用的正常polyQ蛋白包含正常ATXN3或其含有polyQ的部分。在一示例性的实施方案中，步骤(I)中所用的polyQ异常扩增蛋白为polyQ异常扩增的ATXN3或其含有polyQ部分的片段，例如为polyQ长度≥41的ATXN3或其含有polyQ部分的片段，例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列(ATXN3-Q74)。与之相应地，如果存在步骤(D)，其中所用的正常polyQ蛋白为polyQ长度正常的ATXN3或其含有polyQ部分的片段，例如为polyQ长度<41的ATXN3或其含有polyQ部分的片段，例如SEQID NO:5的氨基酸序列(ATXN3-Q27)。

在一实施方案中，LC3B蛋白或其同源物或它们的片段与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高或者100％的序列相同性。在一优选的实施方案中，LC3B蛋白的同源物来自果蝇或小鼠。

在一特别的实施方案中，LC3B蛋白的同源物为果蝇中的Atg8蛋白(与人LC3B的序列相同性为31％)。

在又一方面，本发明还提供一种筛选或鉴定用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法，包括

(1)：测定候选化合物在细胞中对polyQ异常扩增蛋白的水平的影响，选择能降低所述蛋白水平的化合物；或

(2)：测定候选化合物在细胞中对polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的亚细胞定位的影响，选择能促进polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段定位至具有自噬功能的细胞亚结构例如自噬小体的化合物；优选地，选择能促进polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与LC3B蛋白共定位的化合物，

其中polyQ异常扩增蛋白、其含有polyQ部分的片段、LC3B蛋白等术语如上文所定义。

在一实施方案中，步骤(1)选择在细胞中能够使polyQ异常扩增蛋白的水平降低10％以上的化合物，优选20％以上，例如约20％、约30％、约40％、约50％，等。

术语“多肽”是指一定长度的氨基酸的聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白质包括在“多肽”的定义中，且这些术语在本文中可互换使用。术语“多肽”或“蛋白”不排除翻译后修饰，其包括但不限于磷酸化、乙酰化、糖基化等。本发明的蛋白或蛋白片段可通过本身是本领域已知的任何技术产生，例如但不限于单独或组合使用的任何化学、生物学、遗传学或酶学技术。

知道所需序列的氨基酸序列后，本领域技术人员可以容易地通过产生蛋白或蛋白片段的标准技术来制备所述蛋白或蛋白片段。例如，它们可以通过用众所周知的固相法，优选用可商购的肽合成仪器(例如由Applied Biosystems，Foster City，California制备的那些)并根据厂商指导来合成。

或者，本发明的蛋白或蛋白片段可通过本领域众所周知的重组DNA技术来合成。例如，在将编码所需(多)肽的DNA序列引入表达载体并将这种载体引入表达所需蛋白或蛋白片段的适当的真核或原核宿主后，这些片断可作为DNA表达产物获得，随后可以用众所周知的技术将它们从宿主中分离出来。

多种宿主/表达载体组合可用于表达编码本发明蛋白或蛋白片段的核酸。可使用的表达载体包括例如染色体片断、非染色体和合成DNA序列。适当的载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物；和已知的细菌质粒，例如col EI、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物；质粒，例如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体I的众多衍生物，例如NM989，以及其他的噬菌体DNA，例如M13和细丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，例如2微米质粒或2微米质粒的衍生物，以及着丝粒和整合酵母穿梭载体；用于真核细胞中的载体，例如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如已修饰以使用噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。

因此，哺乳动物和典型的人细胞，以及细菌、酵母、真菌、昆虫、线虫和植物细胞可用于本发明中，且可通过此处定义的核酸或重组载体来转染。适当细胞的实例包括但不限于，VERO细胞；HELA细胞，例如ATCC No.CCL2；CHO细胞系，例如ATCC No.CCL61；COS细胞，例如COS-7细胞和ATCC No.CRL 1650细胞；W138、BHK、HepG2、3T3，例如ATCC No.CRL6361；A549、PC12、K562细胞、293T细胞、Sf9细胞，例如ATCC No.CRL1711和Cv1细胞，例如ATCCNo.CCL70。可用于本发明的其他适当的细胞包括但不限于原核宿主细胞菌株，例如大肠杆菌(例如菌株DH5-[α])、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的菌株。可用于本发明的其他适当的细胞包括酵母细胞，例如酵母属细胞，例如酿酒酵母。

本领域技术人员可以理解，为了例如方便试验操作、增加溶解度、便于结晶、纯化等目的，可以对本发明的蛋白或蛋白片段进行修饰或改造，但并不影响蛋白或蛋白片段的功能，这样的蛋白或蛋白片段及其应用同样属于本发明的范畴。

在一实施方案中，(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段或者(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段可以被可检测的分子标记以用于筛选目的。

可检测的分子可以由能通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的任何化合物或物质组成。例如，有用的可检测分子包括放射性物质(包括含有32P、25S、3H或125I的那些)、荧光染料(包括5-溴脱氧尿苷、荧光素、乙酰氨基芴或毛地黄毒苷)、荧光蛋白(包括GFP和YFP)。

在一实施方案中，可检测标记位于或结合至位于(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段或者(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的序列外部的氨基酸残基上，从而最小化或阻止任何对所述蛋白或蛋白片段之间或者候选化合物和任何所述蛋白或蛋白片段之间的结合产生人为影响。

在一具体实施方案中，本发明的蛋白或蛋白片段与荧光蛋白例如GFP标签(绿色荧光蛋白)融合。在又一具体实施方案中，本发明的蛋白或蛋白片段按照适用于荧光能量转移分析的方式，分别被合适的荧光基团标记。

不管本发明的筛选方法的步骤(I)、(II)、(A)、(B)、(C)、(b)、步骤(1)或步骤(2)的实施方式，完整的polyQ异常扩增蛋白和完整的LC3B蛋白或其同源物可用于所述测定。或者，包括结合位点的polyQ异常扩增蛋白片段和LC3B蛋白或其同源物的片段可用于所述测定。

在进一步的方面，本发明提供一种筛选系统，包含两个以上的部分，其中(A)部分包含非标记或以适当形式标记的polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段，并且(B)部分包含非标记或以适当形式标记的LC3B蛋白或其同源物或它们的片段，每个部分各自独立地相互隔离或不隔离。每个部分各自独立地任选包含合适的缓冲液和/或检测试剂。在一具体实施方案中，本发明的筛选系统为试剂盒的形式。在另一具体实施方案中，将制备好的化合物芯片放置于本发明的试剂盒中，与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段和(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段孵育后，用合适的读板仪器分析信号，筛选得到与(1)和(2)都能够结合的化合物。

本发明的化合物

本发明还涉及通过本发明的方法获得的化合物。本发明的化合物涵盖其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物、多晶型、互变异构体、同位素化合物、代谢产物或前药。

术语“药学上可接受的”是指在正常的医学判断范围内与患者的组织接触而不会有不适当毒性、刺激性、过敏反应等。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。用于制备本发明的化合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。

本发明的化合物可以溶剂化物(优选水合物)的形式存在，其中本发明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。

本发明还涵盖本发明的化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。

在本发明的范围内还包括本发明的化合物的代谢产物，即在给药本发明的化合物时体内形成的物质。这样的产物可由例如由给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、酶解等产生。

本发明在其范围内进一步包括本发明的化合物的前药，其为自身可具有较小药理学活性或无药理学活性的本发明的化合物的某些衍生物当被给药至身体中或其上时可通过例如水解裂解转化成具有期望活性的本发明的化合物。

术语“多晶型”或“多晶型物”是指单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。

术语“晶型”或“晶体”是指呈现三维排序的任意固体物质，与无定形固体物质相反，其产生具有边界清楚的峰的特征性X-射线粉末衍射图谱。

术语“无定形”是指三维上无排序的任意固体物质。

本发明的化合物可以以药物组合物的方式应用。所述药物组合物包含所述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物、多晶型、互变异构体、同位素化合物、代谢产物或前药，以及至少一种药学上可接受的载体。

术语“药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些物质。“药学上可接受的载体”包括但不限于助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、稳定剂、溶剂或乳化剂。

在一方面，本发明提供本发明的化合物或其药物组合物在制备用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的药物中的用途。

在又一方面，本发明提供本发明的化合物，用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病。

在另一方面，本发明提供治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的方法，包括向有此需要的个体给药本发明的化合物。

在一优选的实施方案中，polyQ相关的神经退行性疾病选自脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、脊髓小脑共济失调2型(SCA2)、脊髓小脑共济失调3型(SCA3)、脊髓小脑共济失调7型(SCA7)、脊髓小脑共济失调12型(SCA12)、脊髓小脑共济失调17型(SCA17)、齿状核-黑质-红核-苍白球-丘脑底核萎缩症(DRPLA)、亨廷顿病(HD)和脊髓延髓肌肉萎缩(SBMA)，特别是亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型。在一更优选的实施方案中，polyQ相关的神经退行性疾病选自亨廷顿病和SCA3；特别是亨廷顿病。

在进一步的方面，本发明提供一种制品，例如以试剂盒形式提供。本发明的制品包含本发明的化合物或药物组合物，并任选地包括包装盒和说明书。

在又一方面，本发明提供本发明的化合物用于筛选或鉴定可以通过自噬途径降解的靶蛋白的用途。在一实施方案中，例如可以通过以下方法用筛选得到的化合物寻找靶蛋白。1)筛选或鉴定能够与所述化合物亲和结合的蛋白；2)测定所述化合物调节1)中得到的蛋白与LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合的能力，其中如果所述化合物能够正向调节所述结合，则1)中得到的蛋白可以通过自噬途径降解。

在另一方面，本发明提供本发明的化合物或其药物组合物在制备用于检测被认为患有或易患polyQ相关的神经退行性疾病的受试者的诊断试剂或试剂盒中的用途。在一实施方案中，上述测试包括分析从所述受试者获得的目标样品的步骤，包括：

i)将所述化合物用可检测标记例如荧光基团进行标记；

ii)用i)中得到的化合物处理目标样品；

iii)检测目标样品中可检测信号的位置和/或强度，获得目标样品中polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的位置和/或含量。

在一优选的实施方案中，目标样品选自细胞样品、血液、血清、脊髓液；或从受试者的组织中获得的任何活检样品。

在进一步的方面，本发明提供一种检测试剂盒。所述试剂盒包含本发明的化合物或其药物组合物，并且任选地包含检测需要的试剂，例如水溶液、溶剂、合适的检测试剂例如化学发光试剂，等。

在一具体的实施方案中，本发明的化合物选自：

有益效果

本发明的方法筛选得到的化合物可以通过靶向自噬，选择性地降低polyQ异常扩增蛋白在细胞内的水平，并且对细胞的自噬功能没有影响。因此，本发明的方法能够有效地筛选治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物。

自噬是一种高度遗传保守的蛋白降解途径，普遍存在于真核细胞中，蛋白降解能力强，但选择性较低。目前的研究主要为自噬调节剂，没有解决非特异性调节自噬功能带来的全局效应问题，因而存在潜在的副作用。发明人出人意料地发现，本发明的筛选方法可以得到特异性和自噬依赖性降低polyQ异常扩增蛋白水平的化合物，其具有较低的副作用和良好的安全性，易于透过BBB，有利于通过口服给药。并且，本发明的筛选方法还具有容易实施、筛选效率高的优点。

实施例

除非特别说明，本文使用的仪器和试剂均为可商购的。

除非特别说明，本文的所有统计分析中，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001,****表示p<0.0001。对两组之间的比较，所使用的统计分析方法为双尾非配对t检验。对三组或以上组之间的比较，在只有一个变量影响的情况下，所使用方法为双尾单向方差分析，在有两个变量影响的情况下，所使用方法为双尾双向方差分析。

缩写

实验材料、试剂与方法步骤

化合物

实施例中所用化合物库由Selleck公司提供，含有3375种生物活性化合物。其中包括美国食品药品管理局(FDA)批准的1527种药物、1053种来自中药的天然产物和795种已知的抑制剂。其中：

化合物1：GW5074，可以购自DC Chemicals，目录号DC8810；

化合物2：ispinesib，PubChem CID:6851740，可以购自Selleck，目录号S1452；

化合物3：PubChemID 1759437，可以购自Specs，目录号AN-655/15003575；

化合物4：PubChem CID 5398649，可以购自ChemDiv，目录号D715-2435。

抗体

HTT抗体2B7(Weiss et al.Anal Biochem 2009,395,8-15)，4C9，ab1(Sapp etal.J Biol Chem 2012,287,13487-13499)和MW1(Ko et al.Brain research bulletin2001,56,319-329)采用现有技术的方法制备；用于免疫染色检测HTT聚集体的抗体S830获赠自Gillian Bates博士；其他抗体购自Millipore、Sigma等公司。

重组人LC3B的制备

(1)在pGEX-6P1(来自GE Healthcare)中添加His8标签和TEV蛋白酶切割位点，制备原核表达载体pGHT。编辑LC3B基因(GenBank:NM_022818.4)以在LC3B的N端移除Met并增加两个Gly，扩增基因并克隆到制备的pGHT中。

(2)将表达质粒pGHT-LC3B导入大肠杆菌BL21(DE3)pLsyS中表达。用HisTrap HP柱(GE Healthcare，17524701)纯化。然后与TEV蛋白酶(Sigma，T4455)混合，透析过夜。依次用HisTrap HP柱、Superose 6Increase 10/300GL尺寸排阻柱(GE Healthcare)纯化。

(3)LC3B的验证：通过MALDI-TOF-MS和X射线衍射，验证制备得到的人LC3B。X射线衍射验证LC3B的方法为：定点突变得到缺失G120脂化位点的突变体LC3BΔG120蛋白，将该更稳定的蛋白用于高分辨X射线衍射。用已知LC3蛋白晶体结构(PDB ID:1UGM)作为分子置换的搜索模型，通过分子置换来解析公开的LC3BΔG120的结构(PDB ID:6J04,

)，进行结构对齐。

重组人HTTexon1-MBP蛋白的制备

(1)从头合成25Q或72Q的HTTexon1cDNA，克隆到哺乳动物表达载体pTT5SH8Q2中，在HTTexon1序列后加入C末端MBP标签，得到pTT-HTTexon1-Q72-MBP和pTT-HTTexon1-Q25-MBP质粒。

(2)用线性化聚乙烯亚胺(Polysciences,24765)将质粒转染到HEK293T细胞中表达。用HisTrap HP柱和Superose 6Increase 10/300GL尺寸排阻柱纯化蛋白。

(3)通过Superose 6Increase尺寸排阻柱将纯化的HTTexon1-MBP蛋白透析到5mMNH₄Ac中，用Bruker FLEX MALDI-TOF验证。

重组人全长HTT蛋白的制备

(1)具有(CAG)₂₃或(CAG)₇₃的人HTT基因(GenBank:NM_002111.8)由Genewiz Inc.从头合成。将人HTT基因克隆到具有N末端蛋白A标签的修饰的pCAG载体(来自Addgene)中。

(2)使用聚乙烯亚胺(PEI，来自Polysciences，23966)将质粒转染到人胚胎肾E293细胞中表达。用IgG单抗-琼脂糖(Smart-lifesciences,SA030010)纯化，用TEV蛋白酶消化去除蛋白A标签，用来自GE healthcare的Mono Q和Superose 6(5/150GL)柱进一步纯化蛋白。通过考马斯蓝染色和蛋白印迹验证。

用于试验的细胞

原代培养的皮质神经元：Hdh^Q140/Q7和Hdh^Q7/Q7新生小鼠(P0)的大脑解剖后，消化、解离后培养得到。

一些原发性患者成纤维细胞和野生型细胞来自蒙古亨廷顿病家族的HD患者(Q47,Q55)和健康对照(WT,Q19)。SCA3细胞系来自患者(Q74)。HD Q68成纤维细胞系来自CoriellCell Repositories(Camden,NJ,USA)。永生化的成纤维细胞和iPS细胞(iPSC)由原代成纤维细胞制备得到。小鼠纹状体细胞(STHdh)来自Coriell Cell Repositories(Camden,NJ,USA)。HEK293T细胞和HeLa细胞来自ATCC。

用于试验的动物

亨廷顿病果蝇

神经系统驱动品系elav-GAL4(c155)、表达HTT的品系UAS-fl-HTT-Q16和UAS-fl-HTT-Q128来自印第安纳大学的Bloomington Drosophila Stock Center(http://flystocks.bio.indiana.edu/)，并保持在25℃培养箱中。

通过elav-GAL4处女蝇和UAS-fl-HTT-Q16或UAS-fl-HTT-Q128雄性果蝇杂交，获得由elav-GAL4驱动在神经系统中表达人HTT全长蛋白(Q16)或(Q128)的转基因果蝇。

亨廷顿病小鼠

表达野生型HTT基因的小鼠(Hdh^Q7/Q7)，来自哈佛大学麻省总医院Marian Difiglia实验室。按照现有技术(Menalled等，J Comp Neurol,2003,465:11-26)的方法制备Q140基因敲入杂合小鼠(Hdh^Q140/Q7)。

蛋白分析

均相时间分辨荧光(HTRF)分析：用原始裂解缓冲液PBS+1％(v/v)Triton X-100+1×cOmplete^TM蛋白酶抑制剂稀释细胞或组织裂解物，裂解样品，然后用HTRF测定缓冲液(50mM NaH₂PO₄,400mM NaF,0.1％BSA,0.05％(v/v)Tween-20,1％(v/v)Triton X-100,pH7.4)稀释的指定的抗体对，进行检测。在HTRF缓冲液中，供体抗体浓度为0.023ng/μL，受体抗体浓度为1.4ng/μL。

蛋白的量的测定：通过上述方法测定蛋白的量。通过空白样品进行背景校正。对于所有样品均测定蛋白的浓度，以校正蛋白的量。测定每孔的不同蛋白浓度或细胞数以确保信号在线性范围内。

细胞分析

免疫荧光：将细胞洗涤固定、透化、封闭后，在4℃下与一抗孵育过夜，然后用封闭缓冲液洗涤三次，在室温下与二抗孵育1小时。用DAPI染色，封固后，用Zeiss Axio Vert A1共聚焦显微镜成像，用ImageJ分析TUBB3或共定位情况。

实施例1化合物对蛋白亲和活性的高通量筛选

1.1亲和活性筛选

(1)使用接触式微阵列点印机(SmartArrayer 136,CapitalBio Corporation)，按照现有技术(Zhu et al.,Sensors(Basel)2016,16(3),378；Fei et al.,J Biomed Opt2010,15(1),016018)的方法制备化合物芯片。每个化合物各点印两份。洗去未固定在芯片表面的化合物，封闭、清洗芯片。用OI-RD显微镜扫描图像。以HTTexon1-Q72-MBP(添加了MBP标签的SEQ ID NO:1，其中使用MBP标签以增加溶解度)为靶蛋白。将化合物芯片与靶蛋白(浓度为238nM)一起孵育2小时。清洗、扫描芯片。

(2)以HTTexon1-Q25-MBP(添加了MBP标签的SEQ ID NO:4)为靶蛋白(浓度454nM)，按照(1)的方法，获取与靶蛋白孵育前、孵育后的OI-RD图像。

(3)以LC3B(SEQ ID NO:6)为靶蛋白(浓度680nM)，按照(1)的方法，获取与靶蛋白孵育前、孵育后的OI-RD图像。

分别分析以上步骤(1)、(2)、(3)的差异图像(孵育后的图像-孵育前的图像)，选择与HTTexon1-Q72-MBP和LC3B结合、不与HTTexon1-Q25-MBP结合的化合物(OI-RD显微镜检测限为约0.001mV)。得到能够与LC3B和具有异常扩增的polyQ的HTTexon1结合、不与具有正常polyQ的HTTexon1结合的化合物：化合物1(GW5074)和化合物2(ispinesib)。

按照上述方法用化合物1和2制备芯片。每个化合物各点印三份。用OI-RD测量化合物与HTTexon1-Q72、HTTexon1-Q25的亲和反应参数。

化合物与HTTexon1-Q25没有亲和结合，与HTTexon1-Q72的亲和反应参数如表1所示。

表1.化合物与HTTexon1-Q72的亲和反应的结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数

由可商购的已知化合物中，选取数目不大于20个的具备如化合物1和2的双环结构和含苯环的侧链，以及包含制备小分子芯片所需的反应官能团(例如OH，SH，NH等)的化合物，按照上文的方法，筛选得到两个能够与HTTexon1-Q72和LC3B结合，并且不与HTTexon1-Q25结合的化合物：化合物3和化合物4。

按照上述方法用化合物1、2、4制备芯片。每个化合物各点印三份。用OI-RD测量化合物与LC3B、全长mHTT(flHTT-Q73)和全长HTT-Q23(flHTT-Q23)的亲和反应参数。

化合物与flHTT-Q23(SEQ ID NO:3)没有亲和结合，与flHTT-Q73和LC3B的亲和反应参数分别如表2和表3所示。

表2.化合物与flHTT-Q73的亲和反应的结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数

表3.化合物与LC3B的亲和反应的结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数

1.2化合物与全长HTT、LC3B的亲和活性的MST检测

用微量热泳动仪(MST，其中Monolith NT.115仪器来自NanoTemperTechnologies)对化合物与全长HTT和LC3B的亲和活性进行验证。反应缓冲液为20mMHEPES,pH7.4,150mM NaCl，蛋白浓度500nM。化合物与flHTT-Q23(SEQ ID NO:3)没有亲和结合，与flHTT-Q73和LC3B的K_d分别如表4所示。

表4.化合物与待测蛋白的亲和反应平衡解离常数

发明人还通过MST验证了化合物在同时存在全长HTT和LC3B的体系中，对二者分别的亲和活性(图1)。

综上，OI-RD检测和MST检测结果均表明化合物能与LC3B亲和结合；对于HTT，化合物选择性地亲和结合mHTT(HTTexon1-Q72或flHTT-Q73)。

实施例2化合物对HD模型小鼠皮质神经元的作用

2.1对mHTT和wtHTT水平的影响

(1)用化合物处理原代培养的Hdh^Q140/Q7和Hdh^Q7/Q7小鼠皮质神经元细胞，2天后通过蛋白印迹(2166抗体)检测mHTT、wtHTT水平(图2和图3)。化合物使Q140基因敲入杂合小鼠(Hdh^Q140/Q7)皮质神经元mHTT水平降低，而几乎不影响wtHTT水平。化合物1和2不降低Hdh^Q7/Q7小鼠皮质神经元wtHTT水平。其中化合物1在30-300nM范围内(100nM较佳)、化合物2在30-100nM范围内(100nM较佳)、化合物3在10-300nM范围内(50nM较佳)、化合物4在15-150nM范围内(75nM较佳)均观察到选择性降低mHTT水平的效果。

(2)使用与(1)相似的方法，分别用多种抗体(2166、ab1、D7F7、3B5H10)检测化合物处理后Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元细胞中的mHTT水平(图4)。多种抗体检测得到相对一致的结果，因此检测到的mHTT水平降低不是由于mHTT对特定抗体的亲和力的变化。

用抗polyQ抗体MW1和3B5H10检测mHTT，并且观察分子量较小的蛋白的条带，结果没有观察到mHTT的N-端碎片的增加(图5)。检测到的mHTT水平降低不是由于位点特异性剪切的增加。

2.2细胞毒性测试

按照试剂盒中提供的方案，通过CellTiter-glo(Promega，G7570)测定化合物处理后Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元细胞的活力(图6)。化合物在2.1所述试验浓度下，对Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元没有细胞毒性。检测到的mHTT水平降低不是由于神经元细胞丧失。

综上，本发明的方法筛选得到的化合物在细胞内均表现出优异的等位基因选择性地降低mHTT水平的作用。其中从含有3375个生物活性化合物的结构多样性化合物库中筛选得到2个经验证在细胞水平具有活性的化合物，阳性率0.6‰。

实施例3化合物对亨廷顿病患者成纤维细胞HTT水平的影响

3.1对HD患者原代成纤维细胞的mHTT和wtHTT水平的影响

进行预实验，确定化合物在100nM浓度下表现出最佳的降低mHTT水平的效果。

试验方法：用100nM浓度的化合物处理HD患者成纤维细胞(Q49、Q55、Q68)，2天后通过HTRF检测mHTT(抗体对：2B7/MW1)和总HTT(抗体对：2B7/2166)，结果如图7所示。在HD患者原代成纤维细胞(Q49、Q55、Q68)上观察到mHTT水平降低。在野生型原代成纤维细胞上没有观察到HTT水平降低。

3.2对HD患者永生化成纤维细胞mHTT水平的影响

采用与3.1中所述相似的试验方法，通过HTRF(抗体对：2B7/MW1)检测化合物在存在/不存在自噬抑制剂的条件下对HD患者永生化成纤维细胞mHTT水平的影响(图8)。不存在自噬抑制剂的条件下，化合物显著降低HD患者永生化成纤维细胞的mHTT水平，与在HD患者原代成纤维细胞上观察到的结果一致。而在存在自噬抑制剂(NH₄Cl或氯喹)的条件下，没有观察到mHTT水平的降低。

据报道，化合物1还具有c-Raf抑制剂活性，化合物2还具有驱动蛋白纺锤体激酶(KSP)抑制活性。为此发明人对一些c-Raf抑制剂和KSP抑制剂进行了检测(包括GSK923295、BAY1217389、PLX-4720、Dabrafenib、Sorafenib Tosylate)。使用100nM浓度的上述c-Raf抑制剂和KSP抑制剂分别处理HD患者永生化成纤维细胞，没有观察到mHTT水平的降低。使用PLX-4720(c-Raf抑制剂)、BAY1217389(KSP抑制剂)与化合物4进行对照，PLX-4720和BAY1217389在低于微摩尔级的浓度下不能降低mHTT水平(图9)。因此，化合物对mHTT的作用不是由c-Raf或KSP抑制活性带来的。

综上，筛选得到的化合物对mHTT水平的降低是自噬依赖性的。

实施例4化合物对HD患者诱导干细胞分化神经元mHTT水平和神经元凋亡的影响

4.1对mHTT和wtHTT水平的影响

采用与3.1中所述相似的试验方法，通过HTRF(抗体对：2B7/MW1)检测化合物对HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元(Q47)的mHTT水平的影响(图10)。在HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元细胞上观察到mHTT水平降低，并且在存在自噬抑制剂NH₄Cl时没有观察到该效果。化合物通过自噬作用拯救了HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元细胞中的疾病相关表型。

4.2对神经元凋亡的影响

(1)免疫染色

用100nM化合物1，或100nM化合物2，或100nM化合物3或50nM化合物4处理HD患者诱导干细胞(iPSC)分化的神经元(Q47)，1天后对细胞进行应激(去除BDNF)。

用DAPI对神经元特异性微管蛋白标记物TUBB3染色。以细胞核计数对TUBB3信号覆盖面积进行归一化，并以野生型为对照，对数据进行归一化，分析神经元凋亡(图11)。

(2)胱天蛋白酶-3活性检测

在去除BDNF后，观察到HD神经元停滞，并出现了神经元收缩。

用NucView 488(Biotium,30029)检测活性胱天蛋白酶-3。去除BDNF后，使用Incucyte(Essen Bioscience,IncuCyte FLR)在培养箱内每3小时捕获图像，用Incucyte2011A软件分析。共测试三批，结果一致(图12)。化合物对于去除BDNF后HD神经元的停止进展和神经元收缩有明显的改善。

实施例5化合物对亨廷顿病果蝇的作用

5.1对mHTT水平的影响

实验方法：将Q128果蝇和Q16果蝇分别随机分为阴性对照组、阳性药物组(化合物1、化合物2、化合物3、化合物4)，每组75只。阴性对照组给药相应的溶剂DMSO，阳性药物组给药相应的阳性药物。

果蝇保持在25℃的标准食物中。将新孵化的果蝇转移到所分配的食物含有阳性药物(10μM在400的DMSO中)或对照用的DMSO的小瓶中，每隔一天更换一次食物。

连续喂养6天。第7天提取果蝇头部蛋白，通过HTRF(抗体对：2B7/MW1)测量mHTT水平，其中每个样品包括5只果蝇头部提取的蛋白(图13)。化合物使表达人HTT全长蛋白(Q128)的转基因果蝇mHTT水平降低。

5.2化合物对生存率的影响

将75只年龄匹配的处女蝇放入含有标准食物的空的塑料小瓶中，并每天记录每个小瓶的存活情况，以测量其寿命(图14)。Q128果蝇阳性药物组相对于对照组的生存率改善。

5.3对爬行能力的影响

将15只年龄匹配的处女蝇放入空瓶中并轻拍使它们处于瓶底。记录15秒后爬过7厘米高的果蝇的百分比。每天对每个小瓶记录五个观察值的平均值，并且记录来自包含不同批次的果蝇的多个小瓶的数据并分析(图15)。括号中的数字表示测试的小瓶的数量。Q128果蝇阳性药物组相对于对照组的爬行能力改善。

在以上5.2和5.3的试验中，没有观察到化合物对Q16果蝇有影响。

实施例6化合物对HD模型小鼠的作用

将小鼠分组饲养于具有12小时光照/黑暗循环的单独通风笼中，每笼最多5只成年小鼠。

6.1脑室内注射化合物对HD小鼠皮质mHTT和wtHTT水平的影响

实验动物：Hdh^Q140/Q7小鼠(3月龄)，每组4只

实验方法：每天进行一次脑室内注射，每次注射给药2μL含有浓度为25μM的化合物的人造脑脊液(ACSF：1mM葡萄糖，119mM NaCl，2.5mM KCl，1.3mM MgSO₄，2.5mM CaCl₂，26.2mM NaHCO₃，1mM NaH₂PO₄)。将含有等量DMSO的2μL ACSF用作对照。

注射10天后，提取小鼠脑皮质神经元蛋白，通过蛋白印迹(2166抗体)检测mHTT和wtHTT水平。每个样品重复检测3次，计算平均值(图16)。化合物1、3和4显著降低Hdh^Q140/Q7小鼠皮质mHTT水平，并相对于wtHTT表现出mHTT选择性。

6.2腹腔注射给药化合物1或4

实验方法：将化合物或对照用的DMSO用0.9％NaCl静脉内输注溶液稀释至0.05μg/μL，每天进行一次腹腔注射(0.5mg/kg)，注射14天后，进行组织提取或行为学实验。

腹腔注射小鼠脑组织的体内化合物检测：小鼠腹腔注射给药DMSO或化合物(化合物1或化合物4)之后2小时，解剖取脑，称重，提取脑组织内的化合物，用UPLC-MS(Acquity超高效液相色谱系统、Acquity UPLC BEH C18(1.7μm,2.1×50mm)柱和Xevo TQ-S质谱仪，Waters Corporation,Milford,MA,USA)进行LC-MS/MS分析。结果表明到达脑组织的化合物1水平为81.0ng/g。到达脑组织的化合物4水平为9.48ng/g。对照(DMSO)组未观测到化合物质谱信号。化合物能顺利透过BBB递送至小鼠的脑，有利于通过口服给药化合物。

6.3腹腔注射化合物对HD小鼠皮质和纹状体mHTT和wtHTT水平的影响

(1)取Hdh^Q140/Q7小鼠(5月龄)，共20只，分为3组。

按照6.2所述步骤给药。每天进行一次腹腔注射，注射14天后，提取蛋白，通过蛋白印迹检测mHTT和wtHTT水平(图17a)。

(2)取Hdh^Q140/Q7小鼠(10月龄)，共21只，每组6-8只。

按照上述方法给药并获取小鼠脑纹状体神经元蛋白，通过蛋白印迹检测mHTT和wtHTT水平(图17b)。

(3)通过dot-blot实验(抗体：4C9，条形图示出重复检测两次的结果)和HTRF(抗体对：4C9/4C9)检测Hdh^Q140/Q7小鼠皮质中的mHTT聚集物。每只小鼠平均重复取样两到三次(图18)。没有观察到mHTT聚集物的增加。化合物给药组的mHTT水平降低不是由于mHTT溶解度变化。

综上，腹腔注射给药化合物降低Hdh^Q140/Q7小鼠皮质和纹状体mHTT水平，并相对于wtHTT表现出mHTT选择性。因此化合物具有开发为口服药物的前景。

6.4腹腔注射化合物对HD小鼠行为缺陷的影响

实验动物：Hdh^Q140/Q7小鼠，共42只，分为3组；Hdh^Q7/Q7小鼠，共48只，分为3组。

实验方法：按照6.2所述步骤给药。每天进行一次腹腔注射，注射14天后，进行行为学实验。

所有的行为学实验均在光照阶段进行。在开始实验之前，将所有小鼠在昏暗的红光下保持在行为测试室中一小时。

旋转棒试验：连续3天对小鼠进行预训练(旋转棒上以4rpm旋转2分钟)。然后在2分钟内以4至40rpm的加速速度测试小鼠5天。每次实验结果记录为在棒时间(旋转棒上的时间)，直到从棒上跌落或直到任务结束。每次测试包括三次重复，试验间隔60分钟以减少压力和疲劳。分析每只小鼠三次试验的平均值(图19a)。

平衡梁试验：2厘米厚、总长度为100厘米的带刻度的棒，两侧悬挂于平台上。起点处有一道明亮的灯光，终点点处有一个装有食物的暗盒子。记录每只小鼠走过平衡梁的总时间(图19b)。

旋转棒试验中，F(2,195)＝4.963；平衡梁试验中，F(2,195)＝37.31。本发明化合物能够改善HD模型小鼠的亨廷顿病相关行为缺陷，并且对野生型小鼠不产生影响。

实施例7化合物不影响自噬功能和对照蛋白的水平

7.1化合物对培养的Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元细胞的影响

按照与2.1相似的方法，检测化合物处理后Hdh^Q140/Q7小鼠皮质神经元细胞中的LC3B、其他已知的自噬选择性底物蛋白(包括SQSTM1/p62，NBR1和Ncoa4)、具有野生型长度polyQ的其他polyQ蛋白(Atxn3和Tbp)和几种对照管家蛋白的水平，蛋白印迹的结果如图20所示。化合物不影响原代培养的皮质神经元中的LC3B表达水平，被测的其他蛋白的水平也不受化合物影响(蛋白水平变化<10％)。

7.2检测腹腔注射化合物的影响

使用与6.2相似的方法，对Hdh^Q140/Q7小鼠注射给药，使用与7.1相似的方法，检测腹腔注射化合物对Hdh^Q140/Q7小鼠皮质组织中其他已知的自噬选择性底物蛋白(SQSTM1/p62)的影响。蛋白印迹的结果如图21所示。腹腔注射化合物1或化合物4后，HD小鼠的皮质中SQSTM1/p62水平没有改变。

综上，检测到的mHTT降低作用不是由于改变了自噬功能。

实施例8化合物对mHTT和LC3B之间的结合的影响

8.1化合物对HTTexon1与LC3B之间的结合的影响

蛋白质体外结合实验(in vitro pull-down assay)

(1)在直链淀粉树脂(New England BioLabs，E8021L)上分别亲和固化纯化的重组人HTTexon1-MBP(添加了MBP标签的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4)和用于对照的MBP。

(2)取含有约10μg MBP-融合蛋白或MBP的(1)中得到的树脂，分别与化合物(1μM的化合物1或100nM的化合物4)或相应的溶剂DMSO孵育。然后加入40μg纯化的LC3B，孵育。然后去除未结合蛋白。

(3)洗脱树脂结合的蛋白质，用抗-LC3抗体通过SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析(图22a)。化合物1和化合物4能够增强HTTexon1-Q72-MBP与LC3B之间的结合，而不增强HTTexon1-Q25-MBP与LC3B之间的结合。

8.2化合物对flHTT-Q73和LC3B之间的结合的影响

将GST-LC3B和用于对照的GST固定在小鼠抗GST抗体偶联磁珠(Cell SignalingTechnology,11847S)上，使用与8.1相似的方法，将全长HTT(flHTT-Q73或flHTT-Q23)分别与GST-LC3B或GST进行拉下实验(图22b)。其中上样量为：GST-LC3B或GST上样量为100％，全长HTT上样量为10％。用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液洗脱。化合物能够增强全长mHTT和LC3B之间的结合。

实施例9化合物对mHTT和LC3B在细胞中的定位的影响

9.1化合物影响下HTTexon1和LC3B在Hela细胞中的共定位

(1)将HTTexon1cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体pTT-MBP-His中，制备pTT-HTTexon1-Q72-MBP-His和pTT-HTTexon1-Q25-MBP-His。

(2)将pEX-GFP-hLC3WT(Addgene,24987)、(1)中制备的pTT-HTTexon1-Q72-MBP-His和pTT-HTTexon1-Q25-MBP-His瞬时转染到HeLa细胞中表达HTTexon1-MBP-His(添加了MBP-His标签的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4)和LC3B-GFP。

(3)用100nM浓度的化合物1，或50nM化合物4处理(1)或(2)中制备的细胞，4小时后封固细胞。使用Zeiss Axio Vert A1共聚焦显微镜，分别通过抗His免疫荧光检测HTTexon1-MBP-His，通过GFP荧光检测LC3B-GFP。在His通道中检测了单独转染LC3B-GFP的细胞，在GFP通道中检测了单独转染HTTexon1-MBP-His的细胞，以验证检测方法的特异性。对两个通道得到的图像中的聚集点进行计数，分析共定位(图23)。

9.2化合物影响下mHTT和LC3B在HD小鼠纹状体细胞中的共定位

HD小鼠纹状体细胞STHdh^Q111/Q111的来源如上文所述。

使用与9.1相似的方法，通过抗体2166检测mHTT，并且通过特异性检测LC3B的抗LC3抗体检测内源性LC3B。分别测量各种荧光的像素并分析STHdh^Q111/Q111细胞中内源性mHTT和LC3B之间的共定位(图24)。本发明的方法筛选得到的化合物在细胞中能促进polyQ异常扩增蛋白与LC3B共定位，由此证实了化合物能够通过同时与polyQ异常扩增蛋白和LC3B结合，促进polyQ异常扩增蛋白向具有自噬功能的细胞亚结构富集，从而通过自噬降低所述polyQ异常扩增蛋白在细胞中的水平。

发明人还出人意料地发现，常见的可检测标记例如GFP等可以有效地用于本发明的筛选方法中。因此，虽然非标记的检测方法，例如非标记的斜入射光反射差法具备对检测对象无干扰的优点，但本发明的筛选方法也可以采用已知的其他检测方法，例如荧光法等。

实施例10化合物在细胞中对含有较长谷氨酰胺重复区域的蛋白水平的影响

(1)从头合成polyQ-GFP序列(表达Met-polyQ-GFP，其中polyQ为Q72或Q25)并亚克隆到pcDNA载体中。正向转染cDNA到HEK293T细胞(ATCC，CRL-3216)中，分别得到表达Q72-GFP的细胞和表达Q25-GFP的细胞。

(2)用100nM浓度的化合物1，或100nM化合物3或50nM浓度的化合物4处理细胞，2天后通过Incucyte检测荧光计数测量polyQ-GFP水平(图25)。按照本发明的方法筛选得到的化合物能够在细胞中选择性地降低含有较长谷氨酰胺重复区域的蛋白的水平。说明筛选得到的化合物具有扩展的药理作用，能够用于治疗或预防含有较长谷氨酰胺重复区域的蛋白引起的疾病。

实施例11化合物对脊髓小脑共济失调3型患者成纤维细胞的ATXN3蛋白水平的影响

用100nM浓度的化合物1，或100nM化合物2，或100nM化合物3或50nM浓度的化合物4处理SCA3患者成纤维细胞(Q74)、野生型细胞(Q27)，2天后通过蛋白印迹测定变异ATXN3蛋白(ATXN3-Q74,SEQ ID NO:2)、野生型ATXN3蛋白(ATXN3-Q27,SEQ ID NO:5)水平(图26)。在SCA3患者成纤维细胞(Q74)上观察到变异ATXN3蛋白水平降低，而没有观察到野生型ATXN3蛋白水平降低，因此化合物可用于治疗SCA3。

序列表

[SEQ ID NO:1]HTTexon1-Q72:

MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPPPPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHR

[SEQ ID NO:2]ATXN3-Q74:

MESIFHEKQEGSLCAQHCLNNLLQGEYFSPVELSSIAHQLDEEERMRMAEGGVTSEDYRTFLQQPSGNMDDSGFFSIQVISNALKVWGLELILFNSPEYQRLRIDPINERSFICNYKEHWFTVRKLGKQWFNLNSLLTGPELISDTYLALFLAQLQQEGYSIFVVKGDLPDCEADQLLQMIRVQQMHRPKLIGEELAQLKEQRVHKTDLERMLEANDGSGMLDEDEEDLQRALALSRQEIDMEDEEADLRRAIQLSMQGSSRNISQDMTQTSGTNLTSEELRKRREAYFEKQQQKQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQRDLSGQSSHPCERPATSSGALGSDLGKACSPFIMFATFTLYLT

[SEQ ID NO:3]HTT-Q23:

MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPPPPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHRPKKELSATKKDRVNHCLTICENIVAQSVRNSPEFQKLLGIAMELFLLCSDDAESDVRMVADECLNKVIKALMDSNLPRLQLELYKEIKKNGAPRSLRAALWRFAELAHLVRPQKCRPYLVNLLPCLTRTSKRPEESVQETLAAAVPKIMASFGNFANDNEIKVLLKAFIANLKSSSPTIRRTAAGSAVSICQHSRRTQYFYSWLLNVLLGLLVPVEDEHSTLLILGVLLTLRYLVPLLQQQVKDTSLKGSFGVTRKEMEVSPSAEQLVQVYELTLHHTQHQDHNVVTGALELLQQLFRTPPPELLQTLTAVGGIGQLTAAKEESGGRSRSGSIVELIAGGGSSCSPVLSRKQKGKVLLGEEEALEDDSESRSDVSSSALTASVKDEISGELAASSGVSTPGSAGHDIITEQPRSQHTLQADSVDLASCDLTSSATDGDEEDILSHSSSQVSAVPSDPAMDLNDGTQASSPISDSSQTTTEGPDSAVTPSDSSEIVLDGTDNQYLGLQIGQPQDEDEEATGILPDEASEAFRNSSMALQQAHLLKNMSHCRQPSDSSVDKFVLRDEATEPGDQENKPCRIKGDIGQSTDDDSAPLVHCVRLLSASFLLTGGKNVLVPDRDVRVSVKALALSCVGAAVALHPESFFSKLYKVPLDTTEYPEEQYVSDILNYIDHGDPQVRGATAILCGTLICSILSRSRFHVGDWMGTIRTLTGNTFSLADCIPLLRKTLKDESSVTCKLACTAVRNCVMSLCSSSYSELGLQLIIDVLTLRNSSYWLVRTELLETLAEIDFRLVSFLEAKAENLHRGAHHYTGLLKLQERVLNNVVIHLLGDEDPRVRHVAAASLIRLVPKLFYKCDQGQADPVVAVARDQSSVYLKLLMHETQPPSHFSVSTITRIYRGYNLLPSITDVTMENNLSRVIAAVSHELITSTTRALTFGCCEALCLLSTAFPVCIWSLGWHCGVPPLSASDESRKSCTVGMATMILTLLSSAWFPLDLSAHQDALILAGNLLAASAPKSLRSSWASEEEANPAATKQEEVWPALGDRALVPMVEQLFSHLLKVINICAHVLDDVAPGPAIKAALPSLTNPPSLSPIRRKGKEKEPGEQASVPLSPKKGSEASAASRQSDTSGPVTTSKSSSLGSFYHLPSYLKLHDVLKATHANYKVTLDLQNSTEKFGGFLRSALDVLSQILELATLQDIGKCVEEILGYLKSCFSREPMMATVCVQQLLKTLFGTNLASQFDGLSSNPSKSQGRAQRLGSSSVRPGLYHYCFMAPYTHFTQALADASLRNMVQAEQENDTSGWFDVLQKVSTQLKTNLTSVTKNRADKNAIHNHIRLFEPLVIKALKQYTTTTCVQLQKQVLDLLAQLVQLRVNYCLLDSDQVFIGFVLKQFEYIEVGQFRESEAIIPNIFFFLVLLSYERYHSKQIIGIPKIIQLCDGIMASGRKAVTHAIPALQPIVHDLFVLRGTNKADAGKELETQKEVVVSMLLRLIQYHQVLEMFILVLQQCHKENEDKWKRLSRQIADIILPMLAKQQMHIDSHEALGVLNTLFEILAPSSLRPVDMLLRSMFVTPNTMASVSTVQLWISGILAILRVLISQSTEDIVLSRIQELSFSPYLISCTVINRLRDGDSTSTLEEHSEGKQIKNLPEETFSRFLLQLVGILLEDIVTKQLKVEMSEQQHTFYCQELGTLLMCLIHIFKSGMFRRITAAATRLFRSDGCGGSFYTLDSLNLRARSMITTHPALVLLWCQILLLVNHTDYRWWAEVQQTPKRHSLSSTKLLSPQMSGEEEDSDLAAKLGMCNREIVRRGALILFCDYVCQNLHDSEHLTWLIVNHIQDLISLSHEPPVQDFISAVHRNSAASGLFIQAIQSRCENLSTPTMLKKTLQCLEGIHLSQSGAVLTLYVDRLLCTPFRVLARMVDILACRRVEMLLAANLQSSMAQLPMEELNRIQEYLQSSGLAQRHQRLYSLLDRFRLSTMQDSLSPSPPVSSHPLDGDGHVSLETVSPDKDWYVHLVKSQCWTRSDSALLEGAELVNRIPAEDMNAFMMNSEFNLSLLAPCLSLGMSEISGGQKSALFEAAREVTLARVSGTVQQLPAVHHVFQPELPAEPAAYWSKLNDLFGDAALYQSLPTLARALAQYLVVVSKLPSHLHLPPEKEKDIVKFVVATLEALSWHLIHEQIPLSLDLQAGLDCCCLALQLPGLWSVVSSTEFVTHACSLIYCVHFILEAVAVQPGEQLLSPERRTNTPKAISEEEEEVDPNTQNPKYITAACEMVAEMVESLQSVLALGHKRNSGVPAFLTPLLRNIIISLARLPLVNSYTRVPPLVWKLGWSPKPGGDFGTAFPEIPVEFLQEKEVFKEFIYRINTLGWTSRTQFEETWATLLGVLVTQPLVMEQEESPPEEDTERTQINVLAVQAITSLVLSAMTVPVAGNPAVSCLEQQPRNKPLKALDTRFGRKLSIIRGIVEQEIQAMVSKRENIATHHLYQAWDPVPSLSPATTGALISHEKLLLQINPERELGSMSYKLGQVSIHSVWLGNSITPLREEEWDEEEEEEADAPAPSSPPTSPVNSRKHRAGVDIHSCSQFLLELYSRWILPSSSARRTPAILISEVVRSLLVVSDLFTERNQFELMYVTLTELRRVHPSEDEILAQYLVPATCKAAAVLGMDKAVAEPVSRLLESTLRSSHLPSRVGALHGVLYVLECDLLDDTAKQLIPVISDYLLSNLKGIAHCVNIHSQQHVLVMCATAFYLIENYPLDVGPEFSASIIQMCGVMLSGSEESTPSIIYHCALRGLERLLLSEQLSRLDAESLVKLSVDRVNVHSPHRAMAALGLMLTCMYTGKEKVSPGRTSDPNPAAPDSESVIVAMERVSVLFDRIRKGFPCEARVVARILPQFLDDFFPPQDIMNKVIGEFLSNQQPYPQFMATVVYKVFQTLHSTGQSSMVRDWVMLSLSNFTQRAPVAMATWSLSCFFVSASTSPWVAAILPHVISRMGKLEQVDVNLFCLVATDFYRHQIEEELDRRAFQSVLEVVAAPGSPYHRLLTCLRNVHKVTTC

[SEQ ID NO:4]HTTexon1-Q25:

MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPPPPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHR

[SEQ ID NO:5]ATXN3-Q27:

MESIFHEKQEGSLCAQHCLNNLLQGEYFSPVELSSIAHQLDEEERMRMAEGGVTSEDYRTFLQQPSGNMDDSGFFSIQVISNALKVWGLELILFNSPEYQRLRIDPINERSFICNYKEHWFTVRKLGKQWFNLNSLLTGPELISDTYLALFLAQLQQEGYSIFVVKGDLPDCEADQLLQMIRVQQMHRPKLIGEELAQLKEQRVHKTDLERMLEANDGSGMLDEDEEDLQRALALSRQEIDMEDEEADLRRAIQLSMQGSSRNISQDMTQTSGTNLTSEELRKRREAYFEKQQQKQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQRDLSGQSSHPCERPATSSGALGSDLGKACSPFIMFATFTLYLT

[SEQ ID NO:6]LC3B:

MPSEKTFKQRRTFEQRVEDVRLIREQHPTKIPVIIERYKGEKQLPVLDKTKFLVPDHVNMSELIKIIRRRLQLNANQAFFLLVNGHSMVSVSTPISEVYESEKDEDGFLYMVYASQETFGMKLSV

Claims (17)

1.一种筛选或鉴定用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的化合物的方法，包括

(I)：使候选化合物与待测体系接触，所述待测体系包含

(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段，和

(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段；和

(II)：测定所述候选化合物调节(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合的能力，并且选择正向调节所述结合的化合物。

2.权利要求1的方法，其中步骤(II)包括：

测定存在/不存在所述候选化合物的条件下，(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合亲和力大小，和/或

测定存在/不存在所述候选化合物的条件下，(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的结合量。

3.权利要求1或2的方法，其中所述polyQ异常扩增蛋白包含polyQ长度≥40、≥33、≥41、≥19、≥46、≥44、≥39、≥36或≥37的polyQ部分；

优选地，所述polyQ异常扩增蛋白包含

polyQ长度≥40的ATXN1或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥33的ATXN2或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥41的ATXN3或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥19的ATXN7或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥46的ATXN12或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥44的TBP或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥39的ATN1或其含有polyQ部分的片段，

polyQ长度≥36的HTT或其含有polyQ部分的片段，或

polyQ长度≥37的AR或其含有polyQ部分的片段。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段与SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高或者100％的序列相同性。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中测定所述结合的方法选自体外拉下实验、Split-TEV、免疫共沉淀、亲和层析、复合物共纯化、酶联免疫吸附法、荧光分子筛、酵母双杂交、HIP-HOP法、时间分辨荧光共振能量转移、化学发光法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、微量热泳动及其任意组合；优选地，测定所述结合的方法选自体外拉下实验、免疫共沉淀、酶联免疫吸附法、荧光分子筛和时间分辨荧光共振能量转移及其任意组合。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中在步骤(I)之前还包括对候选化合物进行亲和活性预筛选的步骤，包括：

(A)：检测候选化合物与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的亲和结合，和/或(B)：检测候选化合物与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的亲和结合；以及

(C)：选择与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段和/或(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段能够亲和结合的化合物；

其中步骤(A)和步骤(B)可以以任何顺序独立地进行。

7.权利要求6的方法，其中

步骤(A)包括：测定候选化合物与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的亲和反应平衡解离常数，选择所述亲和反应平衡解离常数为100μM以下的化合物，优选10μM以下，特别优选1μM以下；和/或

步骤(B)包括：测定候选化合物与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段的亲和反应平衡解离常数，选择所述亲和反应平衡解离常数为100μM以下的化合物，优选10μM以下，特别优选1μM以下。

8.权利要求6或7的方法，其中用于测定亲和结合的方法选自接近闪烁分析、荧光共振能量转移、荧光偏振检测、荧光分子筛、微量热泳动、化学发光法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、斜入射光反射差法及其任意组合；优选地选自荧光共振能量转移、荧光偏振检测、斜入射光反射差法及其任意组合；特别优选为斜入射光反射差法。

9.权利要求6-8中任一项的方法，其中

所述对候选化合物进行亲和活性预筛选的步骤通过采用斜入射光反射差法的高通量筛选进行；包括：

(a)对候选化合物进行固定化以制备化合物芯片，扫描芯片，得到孵育前的图像；

(b)将化合物芯片与靶蛋白进行孵育，扫描芯片，得到孵育后的图像；

其中靶蛋白为(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段或者(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段；和

(c)对差异图像(孵育后的图像-孵育前的图像)进行分析；选择与(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段和(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段都能够亲和结合的化合物。

10.权利要求1-9中任一项的方法，还包括以下步骤：

(D)：测定候选化合物与正常polyQ蛋白或其含有polyQ部分的片段的结合，选择不与正常polyQ蛋白或其含有polyQ部分的片段亲和结合的化合物。

11.通过权利要求1-10中任一项的方法获得的化合物或其药物组合物在制备用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的药物中的用途，或者在制备用于检测被认为患有或易患polyQ相关的神经退行性疾病的受试者的诊断试剂或试剂盒中的用途；

优选地，其中所述polyQ相关的神经退行性疾病选自脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调12型、脊髓小脑共济失调17型、齿状核-黑质-红核-苍白球-丘脑底核萎缩症、亨廷顿病和脊髓延髓肌肉萎缩，特别是亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型。

12.权利要求11的用途，其中所述检测包括分析从所述受试者获得的目标样品的步骤，包括：

i)将所述化合物用可检测标记例如荧光基团进行标记；

ii)用i)中得到的化合物处理目标样品；

iii)检测目标样品中可检测信号的位置和/或强度，获得目标样品中polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段的位置和/或含量。

13.化合物或其药物组合物在制备用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的药物中的用途，或者在制备用于检测被认为患有或易患polyQ相关的神经退行性疾病的受试者的诊断试剂或试剂盒中的用途，所述化合物选自：

14.一种药物组合物、检测试剂或试剂盒，其包含通过权利要求1-11中任一项的方法获得的化合物。

15.一种药物组合物、检测试剂、试剂盒或筛选系统，其包含至少一种选自以下的化合物：

16.一种筛选系统，其包含

(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段，和

(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段；

优选地，所述筛选系统为试剂盒的形式。

17.正向调节(1)polyQ异常扩增蛋白或其含有polyQ部分的片段与(2)LC3B蛋白或其同源物或它们的片段之间的结合的化合物或其药物组合物在制备用于治疗或预防polyQ相关的神经退行性疾病的药物中的用途。

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