ES2300516T3 - Receptor flk-1 dominante negativo unido a la membrana del factor de crecimiento endotelial vascular. - Google Patents

Receptor flk-1 dominante negativo unido a la membrana del factor de crecimiento endotelial vascular. Download PDF

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Axel Prof. Dr. Ullrich
Werner Prof. Dr. Risau
Birgit Millauer, Ph.D.
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Abstract

Receptor Flk-1 membranario comprendiendo una mutación por deleción en el dominio de la quinasa citoplasmática del receptor Flk-1, en el que dicho receptor Flk-1 tiene una actividad negativa dominante que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular).

Description

Receptor Flk-1 dominante negativo unido a la membrana del factor de crecimiento endotelial vascular.
1. Introducción
La presente invención se refiere al uso de ligandos para el receptor FLK-1 para la modulación de la angiogénesis y de la vasculogenesis. La invención se basa, en parte, en la demostración de que la expresión del receptor de tirosina quinasa Flk-1 está asociada a las células endoteliales y a la identificación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como el ligando de gran afinidad de Flk-1. Estos resultados indican una función del Flk-1 más importante en el sistema de señales durante la vasculogénesis y la angiogénesis. Se describe la ingeniería de las células huéspedes que expresan el Flk-1 y las utilizaciones del Flk-1 para valorar y seleccionar medicamentos y análogos del VEGF implicados en la modulación del Flk-1 mediante actividades agonistas o antagonistas.
La invención también se refiere al uso de ligandos para FLK-1, incluyendo agonistas y antagonistas, en el tratamiento de enfermedades, incluyendo cáncer, por vasculogénesis y angiogénesis de modulación.
2. Base de la invención
Las tirosinas quinasas receptoras están constituidas por una gran familia de receptores transmembrana para los factores del crecimiento polipéptido con diversas actividades biológicas. Su función intrínseca de tirosina quinasa se activa por el enlace con el ligando que produce la fosforilación del receptor y múltiples substratos celulares, y posteriormente, una variedad de respuestas celulares (Ullrich A. y Schlessinger, J., 1990, Cell 61:203-212).
Un ADNc receptor de la tirosina quinasa denominado quinasa del hígado fetal 1 (Flk-1), fue clonado a partir de unas poblaciones celulares de ratón enriquecidas para células madre y progenitoras hematopoyéticas. Se sugirió la implicación del receptor en la renovación de la célula madre hematopoyética (Matthews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030). El análisis de las secuencias del clon Flk-1 reveló una homología considerable con la subfamilia c-Kit de quinasas receptoras y en particular al producto genético Flt. Todos estos receptores tienen en común un dominio extracelular que contiene estructuras del tipo de la inmunoglobulina.
La formación y la extensión de los vasos sanguíneos, o vasculogénesis y angiogénesis respectivamente, tienen unas funciones importantes en una variedad de procedimientos fisiológicos como, por ejemplo, el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la regeneración de órganos y los procedimientos de reproducción femeninos, tales como el desarrollo folicular en el cuerpo lúteo durante la ovulación y el crecimiento de la placenta después del embarazo. La angiogénesis descontrolada puede ser patológica tal y como sucede en el crecimiento de tumores sólidos que dependen de la vascularización para el crecimiento.
La angiogénesis implica la proliferación, migración e infiltración de células endoteliales vasculares, y puede ser regulada por factores de crecimiento de los polipéptidos. Se han identificado varios polipéptidos con crecimiento de célula endotelial in vitro que aceleran la actividad. Algunos ejemplos son: el factor de crecimiento fibroblástico ácido y básico, el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento de la placenta. Aunque se han caracterizado cuatro receptores diferentes para los distintos miembros de la familia FGF (factor de crecimiento fibroblástico), hasta el momento no se ha notificado que ninguno de estos se exprese en los vasos sanguíneos in vivo.
Aunque los FGFs parecen ser mitógenos para una gran variedad de células diferentes, se ha notificado recientemente que el VEGF es un mitógeno específico de la célula endotelial (Ferrara, N. and Henzel, W.J., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:851-858). Recientemente, se ha demostrado que el receptor de la tirosina del tipo fms llamado flt, tiene afinidad para el VEGF (DeVries, C. et al. 1992, Science 255:989-991).
3. Resumen de la invención
El objeto de la presente invención está definido en las reivindicaciones. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el receptor de la tirosina quinasa Flk-1 es expresado en la superficie de las células endoteliales y la identificación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como un ligando de gran afinidad de Flk-1. El papel de la proliferación y de la migración de las células endoteliales durante la angiogénesis y la vasculogénesis indica una función importante del Flk-1 en estos procesos. Se describe la invención a modo de ejemplo para el Flk-1 murino, no obstante, se pueden aplicar los principios a otras especies, seres humanos incluidos.
Los reactivos farmacéuticos diseñados para inhibir la interacción Flk-1/VEGF pueden ser útiles en la inhibición del crecimiento tumoral. Se puede utilizar VEGF y/o agonistas de VEGF para promover el cicatrizado de heridas. Las líneas celulares creadas por ingeniería genética que expresan Flk-1 en su superficie pueden ser ventajosamente empleadas para seleccionar e identificar a los agonistas y antagonistas de VEGF.
4. Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Comparación de la secuencia de aminoácidos Flk-1 con RTKs (receptores de membrana con actividad intrínseca tirosínquinasa) relacionados. Comparación de la secuencia de aminoácidos de Flk-1 con KDR humano y TKr-C de rata. Se compara una sección de la secuencia conocida para los tres receptores y sólo se muestran diferencias en la secuencia de Flk-1.
Fig. 2. Análisis por "transferencia de Northern" de la expresión genética de Flk-1. (A) Expresión del ARN del Flk-1 en embriones de ratón de entre 9,5 días y 18,5 días. Se analizaron muestras (10 \mug) del ARN total de embriones de ratón enteros por cada parte. Se marcaron las posiciones de ARNs ribosomales 28S y 18S. (B) Expresión del ARNm de Flk-1 en un cerebro postnatal de 4 días y de un adulto, en comparación con fragmentos capilares del cerebro postnatal de 4 días. Se colocó 1 \mug de ARN poli (A+) en cada parte. Se usaron 5'2619 pares de bases (bp) del ADNc del Flk-1 como sonda. Se muestra una hibridación de control con una sonda de ADNc del GAPDH (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa) en el panel inferior.
Fig. 3. Abundante expresión genética de Flk-1 en tejidos embrionarios. Análisis de la hibridación in situ de la expresión de Flk-1 en un embrión de ratón de 14,5 días. (A) Iluminación del campo luminoso de una sección parasagital a través del embrión entero hibridizado con una sonda antisentido marcada ^{35}S (5'2619 pares de bases). (B) Iluminación del campo oscuro de la misma sección. (C) Hibridación de control de una sección adyacente con una sonda sentido. Abreviaturas: Ao. aorta; At, atrio; L, pulmón; Li, hígado; Ma, mandíbula; Min, meninges; Ms, mesencéfalo; T, telecéfalo; V, ventrículo; Vt, vértebras.
Fig. 4. La expresión del ARN del Flk-1 en órganos embrionarios está restringida a células específicas. Expresión de ARN de Flk-1 en un embrión de ratón de 14,5 días con gran aumento. (A) La zona del corazón fue evaluada con una sonda antisentido marcada ^{35}S. (B) Sección adyacente hibridizada con la sonda sentido. (C) Parte de la pared de la aorta mostrada en el nivel celular. La capa de la célula endotelial está indicada por una flecha. (D) Pulmón, sondado con la sonda antisentido del Flk-1. (E) Hibridación de control de una sección adyacente hibridizada con la sonda sentido. Abreviaturas: At, atrio; B, bronquio; Ed, capa celular endotelial; En, endocardio; L, pulmón, Li, hígado; Lu, lúmina de la aorta; MI, muscular; Mi, miocardio.
Fig. 5. Expresión genética de Flk-1 en el cerebro del ratón en vías de desarrollo. Análisis de la hibridación in situ de la expresión genética de Flk-1 en el cerebro en distintas fases del desarrollo. Todas las secciones fueron sondadas con la sonda antisentido de Flk-1. (A) Sección sagital del telencéfalo de un embrión de ratón de 11,5 días. Un único vaso sanguíneo expresa el Flk-1, el cual brota de las meninges en el neuroectodermo, indicado por una flecha. (B) Secciones sagitales del cerebro del embrión de 14,5 días y (C) de uno postnatal de 4 días. Se muestran las regiones del mesencéfalo. Se indican con una flecha los capilares ramificados y los vasos sanguíneos que expresan el Flk-1. (D) Sección sagital de un cerebro adulto; se muestra una región del mesencéfalo. Las células que expresan el Flk-1 están indicadas con una flecha. Abreviaturas: M, meninges; V, ventrículo.
Fig. 6. Expresión de Flk-1 en el plexo coroideo del cerebro adulto. (A) Iluminación del campo oscuro del plexo coroideo del cerebro de un ratón adulto hibridizado con una sonda antisentido de Flk-1. (B) Plexo coroideo mostrado con un mayor aumento. Las flechas indican unas células individuales, las cuales muestran una fuerte expresión de Flk-1. Abreviaturas: CP, plexo coroideo; E, ependimo; Ep, células epiteliales; V, ventrículo.
Fig. 7. Flk-1 está expresado en la glomérula renal. (A) Sección parasagital de un riñón posnatal de 4 días, hibridado con la sonda antisentido de Flk-1. La señal de hibridación se acumula en la glomérula, tal y como indican las flechas. (B) Hibridación de control de una sección adyacente con la sonda sentido. (C) Sección sagital de un riñón adulto sondado con Flk-1. Las flechas señalan la glomérula. (D) Glomérula de un riñón adulto con un mayor aumento. Las flechas en (A) y (D) indican las células alineadas en cadena en la región yuxtaglomerular que expresa el Flk-1.
Fig. 8. Análisis de la hibridación in situ de la expresión de Flk-1 en embriones tempranos y tejidos extraembrionarios. (A) Sección sagital de un embrión de ratón de 8,5 días en el deciduum maternal sondado con Flk-1. (B) Mayor ampliación del deciduum. Las flechas indican el endotelio de los vasos sanguíneos maternos expresando fuertemente el Flk-1 del ARN. (C) Gran ampliación del saco vitelino y del trofectodermo de un embrión de ratón de 9,5 días. (D) Gran ampliación de un islote de Wolff y Pander. Abreviaturas: A, alantoide; Bi, islote de Wolff y Pander; Bv, vaso sanguíneo materno; D, deciduum; En, capa endodérmica del saco vitelino; M, mesenquima; Ms, capa mesodérmica del saco vitelino; NF, pliegue neural; T, trofoblasto; Y, saco vitelino.
Fig. 9. El Flk-1 es un receptor de VEGF (A) Se incubó un enlace cruzado del ^{125}I-VEGF a células COS que expresan transitoriamente el receptor Flk-1 y las células de control con ^{125}I-VEGF a 4°C durante la noche, luego se lavaron dos veces con suero salino tamponado con fosfato (PBS) y se expusieron en 0,5 mM del agente de enlace cruzado DSS (4,4'-diamino difenilsulfona) en PBS durante 1 hora a 4°C. Las células fueron lisadas, el receptor de Flk-1 inmunoprecipitado, y se realizó un análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida seguido de autorradiografía. Los marcadores del tamaño molecular están indicados en kilodaltons. (B) Enlace específico de ^{125}I-VEGF con células COS que expresan Flk-1. Se eliminaron de la placa las células COS que expresaban transitoriamente Flk-1 y se volvieron a suspender en un medio de unión (DMEM: Medio MEM modificado por Dulbeco, 25 mM Hepes, 0,15% gelatina). Se realizó la unión a 15°C durante 90 minutos en un volumen total de 0,5 ml que contenía 2x10^{5} células, 15,000 cpm de ^{125}I-VEGF, y las concentraciones indicadas del ligando no marcado. Se lavaron las células dos veces con PBS/0,1% de BSA y se contaron en un gammámetro.
Fig. 10. Autofosforilación de Flk-1 inducida por VEGF. Se subalimentaron durante 24 horas las células COS que expresaban transitoriamente el receptor Flk-1 y las células de control en DMEM con un contenido del 0,5% de suero de ternero fetal y luego se estimularon con VEGF durante 10 minutos según lo indicado. Las células fueron solubilizadas, el receptor Flk-1 inmunoprecipitado con un anticuerpo policlonal contra su C-terminal, separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida, y transferidas a nitrocelulosa. La transferencia fue sondada con anti anticuerpos de fosfotirosina (5B2). Los enlaces proteínicos fueron visualizados usando un anticuerpo secundario acoplado a una peroxidasa de rábano y un ensayo de detección BCL^{TM} (Amersham).
Fig. 11. Secuencia nucleótida de Flk-1 Murino.
Fig. 12. Mapas plásmidos de constructos del vector retrovírico. El pLXSN Flk-1 TM CI.1 y el pLXSN Flk-1 TM cl.3 contienen de 1 a 806 aminoácidos de Flk-1. El pNTK-cfms-TM contiene los 541 aminoácidos del N-terminal de c-fms.
Fig. 13. Inhibición del crecimiento tumoral del glioblastoma C6 por inhibición transdominante negativa de Flk-1. Las células C6 fueron implantadas solas o bien coimplantadas con células productoras de virus. Los números celulares son los que se indican en cada panel. Se usaron dos líneas celulares productoras de virus diferentes: una que expresaba el mutante TM (transdominante negativo) de Flk-1 y una que expresaba un mutante c-fms transdominante negativo (c-fms TM) como control. Comenzando al mismo tiempo que aparecieron los primeros tumores, se midieron los volúmenes tumorales cada 2 a 3 días para obtener una curva de crecimiento. Cada grupo está representado por cuatro ratones.
Fig. 14. Inhibición del crecimiento tumoral del glioblastoma C6 por inhibición transdominante negativa de Flk-1. Las células C6 fueron implantadas solas o bien coimplantadas con células productoras de virus. Los números celulares equivalen a lo indicado en cada panel. Se usaron dos líneas celulares productoras de virus diferentes: una que expresaba el mutante TM (transdominante negativo) de Flk-1 y una que expresaba un mutante c-fms transdominante negativo (cfms TM) como control. Comenzando al mismo tiempo que apareció el primer tumor, se midieron los volúmenes tumorales cada 2 a 3 días para obtener la curva de crecimiento. Cada grupo está representado por cuatro ratones.
5. Descripción detallada de la invención
La invención, está basada, en parte, en los resultados de la hibridación in situ y de los análisis por transferencia de Northern que indican que el Flk-1 es un RTK específico de las células endoteliales. Además, los experimentos cruzados han demostrado que el Flk-1 es un receptor de gran afinidad para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que indica que el Flk-1 tiene un papel crucial en el desarrollo y en la diferenciación del hemangioblasto y en el posterior crecimiento de las células endoteliales durante la vasculogénesis y la angiogénesis.
La invención está basada, asimismo, en el descubrimiento de que la expresión de una forma mutante transdominante negativa de la molécula de Flk-1 puede inhibir la actividad biológica del Flk-1 endógeno de tipo salvaje. Se describen aquí los experimentos en los que se mezclaron y se inyectaron en ratones células tumorales y células productoras de un retrovirus recombinante codificador de un receptor de Flk-1 truncado. Se observó la inhibición de la vasculogénesis y del crecimiento de las células tumorales inyectadas a los ratones que expresaban la forma truncada del receptor Flk-1. La expresión de las formas transdominantes negativas de la molécula de Flk-1 puede ser útil para el tratamiento de las enfermedades resultantes de la proliferación anormal de vasos sanguíneos, tales como: artritis reumatoide, retinopatías y crecimiento de tumores sólidos.
Según se explica en los siguientes ejemplos prácticos, se usó el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar las nuevas tirosinas quinasas receptoras expresadas específicamente en embriones para la post-implantación y en las células endoteliales. Se descubrió que este clon codificaba un RTK con una homología secuencial prácticamente idéntica al clon de ADNc previamente identificado aislado de las poblaciones de células enriquecidas para las células hematopoyéticas y se designaron kinasa-1 de hígado fetal (Flk-1) (Mattews et al., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88:9026-9030) (Fig. 11).
Para explicar su análisis, se describe la invención abajo en subsecciones a modo de ejemplo para el Flk-1 murino. No obstante, se pueden aplicar los principios análogamente a clonaciones y expresiones del Flk-1 de otras especies, incluidos los seres humanos.
5.1. Secuencia de codificación de Flk-1
La secuencia de codificación de nucleótidos y la secuencia deducida de aminoácidos del gen del Flk-1 murino está ilustrada en la Figura 11 (secuencia ID N°. 1) y recientemente ha sido descrita en Mattews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:9026-9030. La secuencia nucleótida de la proteína de Flk-1 o su equivalente funcional en mamíferos, incluidos los seres humanos, puede utilizarse para generar moléculas recombinantes que dirijan la expresión del Flk1; a partir de ahora se hará referencia a este receptor como "Flk-1", siendo indiferente la especie de la cual proceda. Se aisló el gen del Flk-1 murino mediante la realización de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos grupos precursores de oligonucleótidos degenerados diseñados en base a unas secuencias muy bien conservadas dentro del dominio quinasa de las tirosinas quinasas receptoras (Hanks et al., 1988). Se usó como muestra el ADN de un banco de ADNc de \lambdagt10 preparado a partir de embriones de ratón de 8,5 días. En un procedimiento paralelo, se utilizaron unos precursores similares para aumentar las secuencias de ADNc del RTK de células capilares endoteliales aisladas de los cerebros de ratones post-natales de 4-8 días. Este es un período en el que la proliferación de las células endoteliales del cerebro es máxima. Ambos procedimientos produjeron secuencias de ADNc que codificaban el RTK del hígado fetal anteriormente descrito, el Flk-1 (Mattews et al., 1991). Basándose en la homología del aminoácido, este receptor es un elemento de la subclase de RTKs de tipo III (Ullrich y Schlessinger) el cual contiene repeticiones del tipo de la inmunoglobulina en sus dominios extracelulares (Fig. 1).
También se describen genes de Flk-1 aislados de otras especies, incluidos los seres humanos, en los que existe actividad de Flk-1. Los miembros de la familia de Flk-1 se definen aquí como aquellos receptores que enlazan el VEGF o los fragmentos del péptido. Tales receptores pueden mostrar aproximadamente el 80% de homología en el nivel de aminoácidos en extensiones sustanciales de la secuencia de ADN. Se puede seleccionar un banco de ADNc bacteriófago, bajo condiciones poco rigurosas, utilizando un fragmento marcado radioactivamente del clon de Flk-1 de ratón. De forma alternativa, la secuencia de Flk-1 de ratón puede utilizarse para diseñar fas sondas oligonucleótidas degeneradas o completamente degeneradas que pueden utilizarse como sondas de PCR o para seleccionar los bancos de ADNc bacteriófago. Se puede utilizar una estrategia basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para clonar el Flk-1 humano. Se pueden diseñar dos grupos de oligonucleótidos degenerados correspondientes a un motivo conservado entre el Flk-1 de ratón y las tirosinas quinasas receptoras que sirven como precursores en una reacción de PCR. La muestra para la reacción consiste en ADNc obtenido a partir de la transcripción inversa de ARNm preparada a partir de líneas celulares o de tejido conocido por el hecho de expresar el Flk-1 humano. El producto de la PCR puede ser subclonado y secuenciado para asegurar que las secuencias amplificadas representen las secuencias de Flk-1. Se puede utilizar el fragmento de PCR para aislar un clon de ADNc de Flk-1 de una longitud total marcando radioactivamente el fragmento amplificado y seleccionando un banco de ADNc bacteriófago. De forma alternativa, el fragmento marcado puede ser utilizado para seleccionar un banco genómico. Para revisar las estrategias de clonación que se pueden utilizar, ver por ej., Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
También se puede conseguir el aislamiento de un ADNc de Flk-1 humano mediante la construcción de un banco de ADNc en un vector de expresión mamífero como por ejemplo el pcADN1, que contiene un origen SV40 de secuencias de replicación que permiten la expresión de un elevado número de copias de plásmidos cuando se transfieren a las células COS. Puede detectarse la expresión de Flk-1 en la superficie de las células COS transfectadas de varias maneras, incluyendo el uso de un ligando marcado como el VEGF o un agonista de VEGF marcado con una encima o una marca fluorescente radioactivamente detectable. Las células que expresan el Flk-1 humano pueden ser enriquecidas para someter las células modificadas a una clasificación con un FAGS (clasificador de células activado por fluorescencia).
Se pueden utilizar secuencias nucleótidas de Flk-1 que codifiquen el Flk-1, fragmentos péptidos de Flk-1, proteínas de fusión de Flk-1 o equivalentes funcionales de estos para generar moléculas de ADN recombinante que dirijan la expresión de la proteína de Flk-1, o un equivalente funcional de éste, en células huéspedes apropiadas. De forma alternativa, también se pueden utilizar las secuencias nucleótidas que hibridan unas partes de la secuencia de Flk-1 en ensayos de hibridación de ácido nucleico, análisis de transferencia de Southern y Northern, etc.
Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden utilizar otras secuencias de ADN que codifiquen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente, para la clonación y la expresión de la proteína de Flk-1. Estas secuencias de ADN incluyen aquellas que son capaces de hibridar la secuencia de Flk-1 murino bajo condiciones rigurosas.
Las secuencias alteradas de ADN que pueden ser usadas incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de nucleótidos diferentes que producen una secuencia que codifica el mismo producto genético o uno funcionalmente equivalente. El propio producto genético puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de Flk-1 que produzcan un cambio silencioso así como un Flk-1 funcionalmente equivalente. Tales sustituciones de aminoácidos pueden hacerse basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o a la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo: los aminoácidos con carga negativa comprenden ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva comprenden lisina y arginina; los aminoácidos con grupos principales polares sin carga con unos valores similares de hidrofilicidad comprenden: leucina, isoleucina, valina; glicina, analina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Un Flk-1 funcionalmente equivalente, según se utiliza en este caso, se refiere a un receptor que se enlaza a VEGP o a fragmentos, pero no necesariamente con la misma afinidad de enlace de su Flk-1 equivalente nativo.
Las secuencias de ADN de la invención pueden ser creadas por ingeniería genética con el objetivo de alterar la secuencia de codificación del Flk-1 para varios extremos incluyendo pero sin limitarse a alteraciones que modifiquen el procesamiento y la expresión del producto genético. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones utilizando técnicas bien conocidas en la materia como, por ej., mutagénesis dirigida al sitio para introducir nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación, fosforilación, etc. En determinados sistemas de expresión, como la levadura por ejemplo, las células huéspedes pueden glicosilar en exceso al producto genético. Cuando se usan tales sistemas de expresión sería preferible alterar la secuencia de codificación de Flk-1 para eliminar cualquier sitio de N-glicosilación.
En otra forma de realización de la invención, la secuencia de codificación de Flk-1 o de Flk-1 modificado puede ser ligada a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para seleccionar bibliotecas péptidas podría ser útil codificar una expresión de proteína Flk-1 quimérica que exprese un epítopo heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo comercialmente disponible. Una proteína de fusión puede también ser creada genéticamente para contener un sitio de seccionamiento localizado entre la secuencia de Flk-1 y la secuencia de proteína heteróloga, de modo que el Flk-1 pueda ser seccionado de la fracción heteróloga.
La secuencia de codificación de Flk-1 podría ser sintetizada completa o parcialmente, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Caruthers, et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10):2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; y Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817. De forma alternativa, la propia proteína podría producirse mediante métodos químicos para sintetizar total o parcialmente la secuencia de aminoácidos de Flk-1. Por ejemplo, se puede sintetizar los péptidos mediante técnicas de fase sólida, desprendidos de la resina y purificados por cromatografía líquida de alto rendimiento preparatoria. (P. ej., ver Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H Freeman and Co., N.Y. págs. 50-60). La composición de los péptidos sintéticos puede ser confirmada mediante análisis de aminoácidos o por secuenciación (p. ej., el procedimiento de degradación de Edman; ver Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., págs. 34-49.
5.2. Expresión del receptor de Flk-1 y generación de lineas celulares que expresan Flk-1
Con el objetivo de expresar un Flk-1 biológicamente activo, la secuencia nucleótida de codificación de Flk-1 o un equivalente funcional, tal y como se describe en la Sección 5.1 arriba mencionada, es insertada en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para transcribir y traducir la secuencia de codificación insertada. Se pueden utilizar para una variedad de objetivos los productos genéticos de Flk-1, así como las células huéspedes o las líneas celulares modificadas o transformadas con los vectores de expresión de Flk-1 recombinante. Estos incluyen pero no se limitan a la generación de anticuerpos (es decir, monoclonales o policlonales) que se enlazan al receptor, incluso aquellos que inhiben competitivamente la unión de VEGF y "neutralizan" la actividad de Flk-1 y la filtración y selección de análogos de VEGF o de medicamentos que actúan mediante el receptor Flk-1; etc.
5.2.1. Sistemas de expresión
Los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica pueden utilizarse para construir vectores de expresión conteniendo la secuencia de codificación de Flk-1 y señales de control transcripcionales/traduccionales apropiadas. Estos métodos comprenden técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology: Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Se pueden utilizar varios sistemas de vectores de expresión de huéspedes para expresar la secuencia de codificación de Flk-1. Estos comprenden pero no se limitan a microorganismos como bacterias transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o de ADN cósmido que contienen la secuencia de codificación de Flk-1; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante conteniendo la secuencia de codificación de Flk-1; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) conteniendo la secuencia de codificación de Flk-1; sistemas celulares vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión del plásmido recombinante (p. ej. plásmido Ti) conteniendo la secuencia de codificación de Flk-1; o sistemas celulares de animales infectados con vectores de expresión del virus recombinante (p. ej., adenovirus, virus vaccinia) incluyendo líneas celulares creadas por ingeniería genética para contener múltiples copias del ADN del Flk-1 amplificadas establemente (CHO/dhfr) o inestablemente en cromosomas de doble-minuto (p. ej. líneas celulares murinas).
Los elementos de expresión de estos sistemas varían en resistencia y especificidad. Dependiendo del sistema huésped/vector empleado, se puede utilizar cualquiera de los elementos adecuados de transcripción y de traducción en el vector de expresión, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se produce la clonación en sistemas bacterianos, se pueden emplear promotores inducibles como el pL de \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) del bacteriófago y similares; cuando se produce la clonación en sistemas celulares de insectos, se pueden emplear promotores como el promotor de la polihedrina del baculovirus; cuando se produce la clonación en sistemas celulares vegetales, se pueden emplear los promotores derivados del genoma de células vegetales (p. ej., los promotores del choque térmico; el promotor para la subunidad pequeña de la RUBISCO; el promotor para la proteína de enlace a/b de la clorofila) o de virus vegetales (p. ej., el promotor de ARN 35S de CaMV; el promotor de la proteína de revestimiento de TMV); cuando se produce la clonación en sistemas celulares mamíferos, se pueden emplear los promotores derivados del genoma de células mamíferas (p. ej. el promotor de la metalotioneina) o de virus mamíferos (p. ej., el promotor último del adenovirus; el promotor del virus vaccinia 7,5K); cuando se generan líneas celulares que contienen copias múltiples del ADN de Flk-1, se pueden utilizar los vectores con base SV4O, BPV y EBV con un marcador seleccionable apropiado.
En los sistemas bacterianos se pueden seleccionar varios vectores de expresión de forma ventajosa, dependiendo del uso destinado al Flk-1 expresado. Por ejemplo, cuando se deben producir grandes cantidades de Flk-1 para la generación de anticuerpos o para seleccionar bancos peptídicos, pueden ser deseables los vectores controladores de la expresión de niveles elevados de productos de la proteína de fusión purificados rápidamente. Tales vectores comprenden, aunque no se limitan al vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el cual la secuencia de codificación de Flk-1 puede ser enlazada en el vector formado con la región de codificación lac Z de modo que se produce un híbrido de la proteína AS-lac Z; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. También se pueden emplear los vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños, como las proteínas de fusión, con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas de células lisadas por adsorción a nódulos de glutationa-agarosa seguido de la elución en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir trombina o lugares de disociación de la proteasa de factor Xa de modo que el polipéptido clonado en cuestión pueda ser liberado de la fracción GST.
En la levadura, se pueden utilizar varios vectores conteniendo promotores constitutivos o inducibles. Para una revisión ver, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988; Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Cap. 3; y Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II.
En los casos en los que se utilizan vectores de expresión vegetales, la expresión de la secuencia de codificación de Flk-1 puede ser controlada por cualquiera de los promotores. Por ejemplo, se pueden emplear promotores víricos tales como los promotores de CaMV de 35S ARN y 19S ARN (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), o el promotor de la proteína de revestimiento de TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307-311); de forma alternativa, se pueden emplear promotores vegetales como, por ejemplo, la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984; EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843); o promotores del choque térmico, p. ej., soja hspl 7.5-E o hspl 7.3-B (Gurley et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estas construcciones pueden ser introducidas en células vegetales utilizando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisar tales técnicas ver, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, págs. 421-463; y Grierson & Corey, 1988: Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Cap. 7-9.
Se podría emplear un sistema de expresión alternativo para la expresión del Flk-1, como por ejemplo, un sistema de insectos. En un sistema de este tipo, se emplea un virus de la polihidrosis nuclear de la Autographa californica (AcNPV) a modo de vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación de Flk-1 puede ser clonada en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocada bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina). La inserción exitosa de la secuencia de codificación del Flk-1 provocará la inactivación del gen de polihedrina y producirá un virus recombinante no ocluido (es decir, virus carente de revestimiento proteínico codificado por el gen de polihedrina). Estos virus recombinantes se usan después para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado (Ver p. ej. Smith et al., 1983, J. Viol. 46:584; Smith, Patente estadounidense No. 4,215,051).
En las células huéspedes mamíferas, se pueden utilizar varios sistemas de expresión víricos. En los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de codificación de Flk-1 puede unirse a un complejo de control de transcripción/traducción del adenovirus, por ej., el promotor último y la secuencia líder tripartita. Luego, se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante una recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (p. ej., región E1 o E3) producirá un virus recombinante capaz de expresar el Flk-1 en huéspedes infectados. Ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 81:3655-3659). De forma alternativa, se puede usar el promotor de vaccinia 7,5K. (Ver, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Viral. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
También se pueden necesitar señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de las secuencias de codificación de Flk-1 insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio de ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que todo el gen de Flk-1, incluido su codón de inicio propio y sus secuencias adyacentes, está insertado en el vector de expresión apropiado, no será necesaria ninguna señal de control traduccional adicional. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserte una parte de la secuencia de codificación de Flk-1, se tendrá que proporcionar señales de control traduccionales exógenas, incluido el codón de inicio de ATG. Además, el codón de inicio debe estar sincronizado con el marco de lectura de la secuencia de codificación de Flk-1 para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales exógenas de control traduccional y estos codones de iniciación pueden tener muchos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede ser realzada por la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (ver Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
Además, se puede elegir una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto genético en la forma específica deseada. Tales modificaciones (p. ej. la glicosilación) y el tratamiento (p. ej. la disociación) de productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huéspedes tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas. Las líneas celulares apropiadas o los sistemas huéspedes pueden ser seleccionados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden utilizar células huéspedes eucarióticas que posean la maquinaria celular para el tratamiento apropiado de la transcripción primaria, la glicosilación y la fosforilación del producto genético. Tales células huéspedes mamíferas incluyen pero no se limitan a CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, W138, etc.
Para una producción elevada y a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, se pueden crear mediante ingeniería genética unas líneas celulares que expresen de manera estable el Flk-1. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes viricos de replicación, se pueden transformar las células huéspedes con el ADN de Flk-1 controlado por elementos apropiados de control de la expresión (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, lugares de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN extraño, se puede permitir que las células creadas por ingeniería genética se desarrollen durante 1-2 días en un medio enriquecido, cambiándose después a un medios selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y lleguen a formar focos que a su vez puedan clonarse y extenderse en líneas celulares. Este método puede utilizarse de forma ventajosa para crear por ingeniería genética líneas celulares que expresen el Flk-1 en la superficie de la célula, y que respondan a la transducción de la señal mediada de VEGF. Estas líneas celulares creadas por ingeniería genética son particularmente útiles para seleccionar los análogos de VEGF.
Se pueden usar varios sistemas de selección incluyendo, sin limitarse, la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), con la posibilidad de utilizar genes de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 48:2026) y de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, se puede utilizar la resistencia a la antimetabolita como base de selección para dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. EEUU 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 78:1527); gpt que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981), Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 78:2072); neo que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e hygro que confiere resistencia a los genes de higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147). Recientemente, se han descrito genes adicionales seleccionables, concretamente el trpB que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; el hisD que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU:8047); y el ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DEMO (McConlogue L., 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
5.2.2. Identificación de transfectantes o transformantes que expresan el Flk-1
Se pueden identificar células huéspedes que contengan la secuencia de codificación y que expresen el producto genético biológicamente activo a través de al menos cuatro procedimientos generales; (a) hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de las funciones del gen "marcador"; (c) evaluación del nivel de transcripción medido por la expresión de las transcripciones de ARNm de Flk-1 en la célula huésped; y (d) detección del producto genético medido por inmunoensayo o por su actividad biológica.
En el primer procedimiento, se puede detectar la presencia de la secuencia de codificación de Flk-1 insertada en el vector de expresión por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN mediante unas sondas que comprenden secuencias nucleótidas homólogas a la secuencia de codificación de Flk-1, respectivamente, o sus porciones o derivados.
En el segundo procedimiento, el sistema de la expresión recombinante del vector/huésped puede ser identificado y seleccionado en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ej., actividad de la timidina quinasa, resistencia a los antibióticos, resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación de un cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si se inserta la secuencia de codificación de Flk-1 dentro de una secuencia de genes marcadores del vector, los recombinantes que contengan la secuencia de codificación de Flk-1 podrán ser identificados por la ausencia de la función del gen marcador. De forma alternativa, se puede colocar en serie un gen marcador con la secuencia de Flk-1 bajo control del mismo promotor o de uno diferente empleado para controlar la expresión de la secuencia de codificación de Flk-1. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o a la selección indica la expresión de la secuencia de codificación de Flk-1.
En el tercer procedimiento, se puede evaluar la actividad transcripcional para la zona de codificación de Flk-1 mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, se puede aislar y analizar el ARN mediante transferencia de Northern aplicando una sonda homóloga a la secuencia de codificación de Flk-1 o a ciertas partes de ésta. De forma alternativa, los ácidos nucleicos totales de la célula huésped pueden ser extraídos y analizados para hibridar tales sondas.
En el cuarto procedimiento, la expresión del producto proteínico de Flk-1 puede constatarse inmunológicamente, por ejemplo por transferencia de Western, por inmunoensayos tales como la radioinmunoprecipitación, inmunoensayos de enzimas y similares. La prueba definitiva del éxito del sistema de expresión, no obstante, implica la detección del producto genético de Flk-1 biológicamente activo. Se pueden emplear varios ensayos para detectar la actividad receptora incluyendo pero sin limitarse a ensayos de unión del VEGF y a ensayos biológicos del VEGF los cuales utilizan líneas celulares creadas por ingeniería genética como sustrato de prueba.
5.3. Usos del receptor de Flk-1 y de las líneas celulares creadas por ingeniería genética
La angiogénesis, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares, es necesaria para varios procesos fisiológicos que van desde la cicatrización de heridas, regeneración de tejidos y órganos, hasta la formación de placenta tras el embarazo y el desarrollo embrionario. La proliferación anormal de los vasos sanguíneos es un importante componente de una variedad de enfermedades como la artritis reumatoide, retinopatías y psoriasis. La angiogénesis constituye también un importante factor en el crecimiento y actividad metastática de tumores sólidos que dependen de la vascularización. En consecuencia, se pueden usar inhibidores de la angiogénesis terapéuticamente para el tratamiento de enfermedades resultantes o acompañadas de un crecimiento anormal de los vasos sanguíneos y para tratamientos de malignidades que incluyan el crecimiento y extensión de tumores sólidos.
Se puede usar el receptor Flk-1 y/o líneas celulares que expresan el receptor Flk-1 para seleccionar anticuerpos, péptidos, u otros ligandos que hacen de agonistas o antagonistas de angiogénesis o vasculogénesis mediada por el receptor Flk-1. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-Flk-1 capaces de neutralizar la actividad de VEGF, para inhibir la función de Flk-1. Adicionalmente, se pueden seleccionar anticuerpos anti-Flk-1 que imiten la actividad de VEGF para usos en la cicatrización de heridas. De forma alternativa, puede ser útil la selección de bibliotecas péptidas con proteínas Flk-1 solubles recombinantemente expresadas o proteínas Flk-1 de expresión de líneas celulares para la identificación de moléculas terapéuticas que funcionen inhibiendo la actividad biológica de Flk-1.
Se pueden usar líneas celulares creadas por ingeniería genética que expresen toda la región de codificación de Flk-1 o su dominio de unión de ligandos para seleccionar e identificar antagonistas de VEGF así como agonistas. Se pueden seleccionar compuestos sintéticos, productos naturales, y otras fuentes de materiales potencialmente biológicamente activos de varias maneras. La capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la unión de VEGF a Flk-1 puede ser medida usando técnicas estándares de unión del receptor, tal como aquellas descritas en la Sección 6.1.9. Se puede medir la capacidad de los agentes para prevenir o imitar el efecto de unión de VEGF en respuestas de transducción de señales en células de expresión de Flk-1. Por ejemplo, se pueden monitorizar las respuestas tales como la activación de la actividad Flk-1 quinasa, modulación de la producción de un segundo mensajero o cambios en el metabolismo celular. Estos ensayos pueden ser realizados usando técnicas convencionales desarrolladas para estos objetivos.
5.3.1. Selección de la biblioteca peptídica con proteína Flk-1 o líneas celulares creadas por ingeniería genética
Se pueden usar bibliotecas peptídicas aleatorias consistentes en todas las combinaciones posibles de aminoácidos unidos a un soporte en fase sólida para identificar péptidos capaces de unirse al sitio de unión del ligando de un receptor dado u otros dominios funcionales de un receptor tales como dominios de quinasa (Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84). La selección de bibliotecas peptídicas pueden tener un valor terapéutico en el descubrimiento de agentes farmacéuticos que actúen para inhibir la actividad biológica de receptores a través de sus interacciones con el receptor dado.
Se puede lograr la identificación de moléculas capaces de enlazar con el Flk-1 seleccionando una biblioteca peptídica con proteína Flk-1 recombinante soluble. En la Sección 5.2.1 se describen los métodos para la expresión y purificación de Flk-1 y pueden ser usados para expresar toda la longitud de Flk-1 recombinante o fragmentos de Flk-1 dependiendo de los dominios funcionales de interés. Por ejemplo, la quinasa y los dominios de unión de ligandos extracelulares de Flk-1 pueden ser separadamente expresados y usados para seleccionar bibliotecas peptídicas.
Para identificar y aislar el soporte de péptidos/fase sólida que interactúa y forma un complejo con Fk-1, es preciso marcar o "etiquetar" la molécula Flk-1. La proteína Flk-1 puede ser conjugada con enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano o con otros reactivos tales como marcadores fluorescentes que pueden incluir isotiiocinato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) o rodamina. La conjugación de cualquier marcador dado, para Flk-1, puede ser realizada usando técnicas habituales en la materia. Alternativamente, se pueden crear vectores de expresión de Flk-1 por ingeniería genética para expresar una proteína Flk- 1 quimérica conteniendo un epítopo para el que exista un anticuerpo comercialmente disponible. El anticuerpo específico del epítopo puede ser marcado usando métodos bien conocidos en la técnica incluyendo el marcado con enzimas, tintes fluorescentes o perlas coloreadas o magnéticas.
El conjugado de Flk-1 "marcado" es incubado con la biblioteca peptídica aleatoria durante 30 minutos durante una hora a 22°C para permitir la formación del complejo entre Flk-1 y las especies peptídicas dentro de la biblioteca. La biblioteca es luego lavada para eliminar cualquier proteína de Flk-1 no enlazada. Si Flk-1 ha sido conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano la biblioteca entera es vertida en una placa de Petri conteniendo sustratos para bien fosfatasa alcalina o peroxidasa, por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato (BCIP) o 3,3',4,4''-diamnobenzidina (DAB), respectivamente. Tras la incubación durante varios minutos, el complejo Flk-1-péptido/fase sólida cambia de color y puede ser fácilmente identificado y aislado físicamente bajo un microscopio de disección con un micromanipulador. Si se ha usado una molécula de Flk-1 marcada fluorescente, los complejos pueden ser aislados por clasificación con activación fluorescente. Si se ha usado una proteína Flk-1 quimérica que expresa un epítopo heterólogo, se puede realizar la detección del complejo péptido/Flk-1 usando un anticuerpo específico del epítopo marcado. Una vez aislado, la identidad del péptido fijado al soporte de fase sólida puede ser determinada por secuenciación peptídica.
Además de usar moléculas de Flk-1 solubles, es posible detectar péptidos que enlacen con receptores de superficie celular usando células intactas. Se prefiere usar células intactas para el uso con receptores que son subunidades múltiples o lábiles o con receptores que requieran el dominio lipídico de la membrana celular para ser funcional. En las Secciones 5.2.1. y 5.2.2 se describen los métodos para generar Flk-1 de expresión de líneas celulares. Las células usadas en esta técnica puede ser bien células vivas o fijas. Las células serán incubadas con la biblioteca peptídica aleatoria y enlazará con determinados péptidos en la biblioteca para formar una "roseta" entre las células diana y el soporte de fase sólida/péptido pertinente. La roseta puede luego ser aislada por centrifugado diferencial o retirada físicamente bajo un microscopio de disección.
Como alternativa a los ensayos de célula completa para los receptores unidos a la membrana o receptores que requieren el dominio lipídico de la membrana celular para ser funcional, las moléculas del receptor pueden ser reconstruidas en liposomas a los que se puede unir el marcador o "etiqueta".
5.3.2. Producción y selección de anticuerpos
Se pueden usar varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos para epítopos del receptor Flk-1 producido por recombinación. Los anticuerpos de este tipo incluyen pero no se limitan a fragmentos Fab policlonales, monoclonales, quiméricos monocatenarios y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos de neutralización, es decir, los que compiten por el sito de unión de VEGF del receptor son especialmente preferidos para el diagnóstico y la terapéutica.
Los anticuerpos monoclonales que enlazan Flk-1 pueden ser radioactivamente marcados permitiendo seguir su localización y distribución en el cuerpo después de la inyección. Los anticuerpos marcados con radioactividad pueden ser usados como una herramienta diagnóstica no invasiva para la formación de imágenes de una nueva vascularización asociada a varia enfermedades incluyendo artritis reumatoide, degeneración macular y formación de tumores y metástasis.
También se pueden diseñar inmunotoxinas que dirijan agentes citotóxicos a sitios específicos en el cuerpo. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales específicos de Flk-1 de alta afinidad pueden formar complejos covalentemente con toxinas bacterianas o vegetales, tales como toxina de difteria, abrina o ricina. Un método general de preparación de moléculas de anticuerpo/híbridas puede implicar el uso de reactivos de interconexión de tiol tal como SPDP, que atacan los grupos amino primarios en el anticuerpo y unen la toxina al anticuerpo por intercambio de bisulfuro. Los anticuerpos híbridos pueden ser usados para eliminar específicamente Flk-1 de expresión de células endoteliales.
Para la producción de anticuerpos, varios animales huéspedes pueden ser inmunizados por inyección con la proteína Flk-1 incluyendo pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huéspedes, incluyendo pero si limitarse a geles minerales de Freund (completos e incompletos) tales como hidróxido de aluminio, sustancias surfactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes potencialmente útiles para los humanos tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corinebacterium parvum.
Se pueden preparar anticuerpos monoclonales para Flk-1 usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen pero sin limitarse a la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein, (Nature, 1975, 256:495-497), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030) y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) uniendo los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Alternativamente, se pueden adaptar técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente U.S. 4,946,778) para producir anticuerpos monocatenarios específicos de Flk-1.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que contengan sitios de enlace específicos de Flk-1 por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a: los fragmentos F(ab')_{2} que pueden ser producidos por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden ser generados reduciendo los puentes de bisulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. De forma alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para Flk-1.
5.4. Usos de la secuencia de codificación de Flk-1
La secuencia de codificación de Flk-1 puede ser usada para detectar la expresión de Flk-1 para el diagnóstico.
También se describen secuencias oligorribonucleotidas, que incluyen moléculas y ribozimas de ADN y ANR antisentido que funcionan para inhibir la traducción de Flk-1. Además, se pueden expresar formas mutadas de Flk-1, con un efecto negativo dominante en poblaciones de células diana para inhibir la actividad del Flk-1 tipo salvaje endógenamente expresado.
5.4.1. Uso de la secuencia de codificación de Flk-1 en el diagnóstico y la terapéutica
El ADN de Flk-1 puede tener varios usos para el diagnóstico de enfermedades producidas por la expresión aberrante de Flk-1. Por ejemplo, se puede usar la secuencia de ADN de Flk-1 en ensayos de hibridación de biopsias o autopsias para diagnosticar anomalías en la expresión de Flk-1; p. ej., análisis de Southern o Northern, incluyendo ensayos de hibridación in situ.
Se puede usar el ADNc de Flk-1 como sonda para detectar la expresión del ARNm de Flk-1. En un ejemplo específico descrito aquí, se analizó la expresión de ARNm de Flk-1 en embriones de ratón de diferentes estadios de desarrollo. El análisis por transferencia de Northern indicó la expresión abundante de un ARNm importante de 5,5 kb entre el día 9,5 y el día 18,5, con descenso aparente hacia el final de la gestación (Fig. 2A). En los días 4-8 tras el nacimiento, se halló que el ARNm de Flk-1 de los capilares del cerebro resultó estar altamente enriquecido en comparación con el ARN de todo el cerebro (Fig. 2B), sugiriendo un papel de Flk-1 en la proliferación de las células endoteliales.
Para obtener información más detallada sobre la expresión de Flk-1 durante el desarrollo embrionario y durante los estadios tempranos del desarrollo vascular se realizaron experimentos de hibridación in situ como se describe en la Sección 6.1.4. Las hibridaciones in situ demostraron que la expresión de Flk-1 in vivo durante el desarrollo embrionario del ratón está ampliamente restringida a las células endoteliales y sus precursores (Fig. 3 y Fig. 4). El Flk-1 es expresado en células endoteliales durante los procesos fisiológicos que están caracterizados por la proliferación de células endoteliales y el patrón de expresión espacial y temporal encontrado en el cerebro embrionario está correlacionado precisamente con el desarrollo del sistema neural vascular como ha sido descrito por Bar (1980). Los brotes vasculares originados en el plexo perineural crecen radialmente en el neuroectodermo ramificándose, descubriéndose que estos brotes expresaban cantidades altas de ARNm de Flk-1 (Fig. 5). En los estadios postnatales tempranos la proliferación de células endoteliales sigue siendo evidente y Flk-1 es expresado, mientras que en el organismo adulto, después de finalizar el proceso de vascularización, el descenso de la proliferación de células endoteliales discurre en paralelo a la reducción de la expresión de Flk-1.
También se describen secuencias oligorribonucleotidas, que incluyen moléculas y ribozimas de ADN y ARN antisentido que funcionan para inhibir la traducción de ARNm de Flk-1. Las moléculas de ADN y ARN antisentido actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm uniéndose al ARNm diana e impidiendo la traducción de la proteína. En lo que respecta al ADN antisentido, se prefieren los oligorribonucleotidos derivados del sitio de iniciación de traducción, p. ej., entre las regiones -10 y +10 de la secuencia nuecleótida de Flk-1.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar el seccionamiento específico del ARN. El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguido de un seccionamiento endonucleolítico. Las moléculas de ribozima en cabeza de martillo creadas por ingeniería genética que catalizan específica y eficazmente el seccionamiento endonucleolítico de las secuencias de ANR de Flk-1 están incluidas en el campo de la invención.
Los sitios específicos de seccionamiento de la ribozima dentro de cualquier ARN diana potencial son inicialmente identificados escaneando la molécula diana para los sitios de seccionamiento de la ribozima que incluyen las secuencias siguientes, GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, se pueden evaluar secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen objetivo que contiene el sitio de seccionamiento en cuanto a las características estructurales previstas tales como la estructura secundaria que puede hacer la secuencia oligonucleótida inadecuada. También se puede evaluar la idoneidad de los objetivos candidatos probando su accesibilidad para la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de ribonucleasa.
Tanto las moléculas como las ribozimas de ADN y ARN antisentido pueden ser preparadas por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ARN. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligorribonucleótidos bien conocidas en la materia tal como por ejemplo síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN pueden ser generadas por transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN de codificación de la molécula de ANR antisentido. Tales secuencias de ADN pueden ser incorporadas en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores adecuados de ANR polimerasa tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. De forma alternativa en las lineas celulares se pueden introducir de forma estable constructos de ADNc antisentido que sinteticen el ANR antisentido constitutiva o induciblemente, dependiendo del promotor usado.
Se pueden introducir varias modificaciones a las moléculas de ADN como medio para incrementar la estabilidad intracelular y la vida media. Las modificaciones posibles incluyen pero no se limitan a la adición de secuencias flanqueantes de ribo- o deoxinucleótidos de los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces de fosfodiesterasa dentro del esqueleto oligodeoxiribonucleótido.
5.4.2 Uso de mutantes de Flk-1 negativos dominantes en la terapia genética
La dimerización del receptor inducida por ligandos está pensada para proporcionar una señal reguladora alostérica que funcione para unir los enlaces del ligando para la estimulación de la actividad quinasa. Los receptores defectuosos pueden funcionar como mutaciones negativas dominantes suprimiendo la activación y la respuesta de receptores normales mediante la formación de heterodímeros no productivos. En consecuencia, se pueden crear por ingeniería genética los receptores defectuosos en vectores víricos recombinantes y se pueden usar para la terapia genética en individuos que expresen el Flk-1 de forma inadecuada.
En una forma de realización de la invención, se pueden identificar las formas mutantes de la molécula de Flk-1 con efectos dominantes negativos por la expresión en células seleccionadas. Se pueden usar mutantes de deleción o sin sentido de Flk-1 que conserven la capacidad para formar dimeros con la proteína de Flk-1 de tipo natural pero que no puedan funcionar en la transducción de señales, para inhibir la actividad biológica del Flk-1 endógeno de tipo natural. Por ejemplo, se puede eliminar el dominio de la quinasa citoplasmática de Flk-1 dando como resultado una molécula de Flk-1 truncada que mantiene la capacidad de experimentar la dimerización con receptores endógenos de tipo natural pero es incapaz de realizar la transducción de una señal.
La proliferación anormal de los vasos sanguíneos es un componente importante de muchos trastornos patógenos, tales como la artritis reumatoide, retinopatías y psoriasis. La angiogénesis descontrolada también representa un factor importante en el crecimiento y en la metástasis de tumores sólidos. Se pueden crear virus recombinantes por ingeniería genética para expresar formas dominantes negativas del Flk-1 que se pueden emplear para inhibir la actividad del Flk-1 endógeno de tipo natural. Estos virus se pueden emplear terapéuticamente para el tratamiento de enfermedades resultantes de una expresión o actividad aberrante de Flk-1.
Se pueden usar vectores de expresión derivados de virus como los retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, herpes virus o virus del papiloma bovino para depositar el Flk-1 recombinante en la población celular dirigida. Se pueden utilizar los métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores víricos recombinantes que contengan una secuencia de codificación del Flk-1. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989: Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. De forma alternativa, se pueden reconstruir moléculas de Flk-1 recombinante en liposomas para su suministro en células diana.
En una forma de realización específica de la invención, se creó por ingeniería genética un mutante de deleción del receptor Flk-1 en un vector retrovírico recombinante. Dos aislamientos clonales designados pLXSN Flk-1 TM cl.1 y pLXSN Flk-1 TM cl.3 contienen un receptor de Flk-1 truncado carente de aminoácidos 561 COOH-terminales. Con el fin de obtener virus productores de líneas celulares, se transfectaron las células PA37 con los vectores recombinantes y, posteriormente, se utilizaron unos medios acondicionados conteniendo virus para infectar las células GPE.
Para probar si la expresión de los mutantes con muestras defectuosas inhibían la actividad receptora del Flk-1 endógeno, se mezclaron células C6 de gliobastoma de rata (células tumorales) y células de ratón productoras de los retrovirus recombinantes y se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Normalmente, la inyección de células tumorales en ratones desnudos provocaría la proliferación de las células tumorales y la vascularización de la masa tumoral resultante. Puesto que se piensa que el Flk-1 es esencial en la formación de vasos sanguíneos, el bloqueo de la actividad de Flk-1 por la expresión de un receptor truncado puede funcionar para inhibir la vascularización del tumor en desarrollo e inhibir así su crecimiento. Tal y como se ilustra en las Figuras 13 y 14, la coinyección de virus productores de células, los cuales expresan un receptor Flk-1 truncado, inhibe de forma significativa el crecimiento del tumor en comparación con los controles que reciben únicamente células tumorales.
5.5. Uso de ligandos o receptor Flk-1
Se cree que la interacción receptor/ligando entre Flk-1 y VEGF juega un papel importante en el sistema de señalización durante la vascularización y la angiogénesis. La proliferación anormal de vasos sanguíneos es un componente importante de varias enfermedades.
La expresión de ARN de Flk-1 está correlacionada con el desarrollo del cerebro y con la proliferación de células endoteliales sugiriendo que Flk-1 puede ser un receptor implicado en la mediación de eventos de señalización en el proceso de vascularización. Se ha mostrado que el VEGF es un factor de crecimiento mitogénico conocido que actúa exclusivamente en células endoteliales (Ferrara, N. y Henzel, W.J., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:851-858). Se realizaron experimentos cruzados y de unión de ligandos, como se describe en la Sección 6.1.9 y 6.1.10 respectivamente, para determinar si VEGF es un ligando para Flk-1 y los resultados indican que Flk-1 es un auténtico receptor de VEGF de gran afinidad (FIG 9).
Se podrían administrar ligandos para Flk-1, el propio receptor Flk-1, o un fragmento conteniendo su sitio de unión de VEGF, in vivo para modular la angiogénesis y/o vasculogénesis. Por ejemplo, la administración del receptor Flk-1 o un fragmento conteniendo el sitio de unión de VEGF, podría competitivamente enlazar con VEGF e inhibir su interacción con el receptor nativo Flk-1 in vivo para inhibir la angiogénesis y/o vasculogénesis. De forma alternativa, se pueden usar ligandos para Flk-1, incluyendo anticuerpos anti-Flk-1 o fragmentos de los mismos, para modular la angiogénesis y/o vasculogénesis. Se pueden usar agonistas de la actividad de VEGF para promover la cicatrización de heridas mientras que se pueden usar antagonistas de la actividad de VEGF para inhibir el crecimiento tumoral.
Dependiendo de las condiciones específicas que se estén tratando, estos agentes pueden ser formulados y administrados sistémica o localmente. Las Técnicas de formulación y administración pueden ser encontradas en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Las vías adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, transmucosa, o intestinal; suministro parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales directas, intraventriculares, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares, por nombrar algunas. Para la inyección, los agentes de la invención pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tal como solución Hanks, solución Ringer, o tampón de suero salino fisiológico. Para este tipo de administración transmucosa, en la formulación se usan penetrantes apropiados para permear la barrera. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
6. Ejemplo: patrones de clonación y expresión de Flk-1, un receptor de gran afinidad para el VEGF
La siguiente subsección describe la clonación y la caracterización del clon de ADNc de Flk-1. Los análisis de transferencia de Northern y de hibridación in situ indican que el Flk-1 es expresado en células endoteliales. Los experimentos cruzados y de enlace de ligandos indicaron además que el Flk-1 es un receptor de gran afinidad para el VEGF.
6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Clonación del ADNc de Flk-1
El ADN extraído de un banco de ADNc de Xgt10 de embriones de ratones de 8,5 días (Fahrner et al., 1987, EMBO. J. 6: 1497-1508) se empleó como patrón para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki, R.K. et al., 1985 Science 230:1350-1354). En un proceso independiente, se empleó el ADNc de células endoteliales capilares que fueron aisladas del cerebro de ratones posnatales de 4-8 días para la amplificación (Risau, W., 1990 En: development of the Vascular system. Issues Biomed. Basel Karger 58-68 y Schnürch et al., inédito). Se diseñaron cebadores degenerados en base a grandes homologías de aminoácidos dentro del dominio de la quinasa compartido por todos los RTKs (Wilks, A.F, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 1603-1607).
Se aislaron clones de toda la longitud de ADNc de Flk-1 de otro banco de ADNc de un embrión de ratón de 8,5 días, preparado según el método de Okaiama y Berg (1983) y de un banco de \lambdagt11 de embrión de ratón de 11,5 días (Clonetech) usando el fragmento de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) marcado con ^{32}P de 210 pares de bases (Feinberg, A.R y Vogelstein, B. 1983 Anal. Biochen. 132:6-13).
6.1.2. Embriones de ratón
Se dejó aparear ratones balb/c durante la noche y se definió la mañana en la que se detectó el tapón vaginal como 1/2 día de gestación. Para el análisis de transferencia de Northern, se homogenizaron los embriones congelados en 5 M de guanidinio tiocianato y se aisló el ARN tal y como está descrito (Ullrich, A. et al., 1985, Nature 313:756-761). Para la hibridación in situ, los embriones fueron introducidos en Tissue-Tek (Miles), congelados en la superficie de nitrógeno líquido y almacenado a -70°C antes del uso.
6.1.3. Preparación de sondas
Los 2619 pares de bases localizados en la posición 5' del ADNc del receptor fueron subclonados en el vector pGem3Z (Promega) como un fragmento EcoR1/BamH1. Se preparó la sonda para la hibridación por transferencia de Northern mediante la marcación del fragmento de ADNc con \alpha-^{32}PdATP (Amersham) mediante el cebado aleatorio de hexanucleótidos (Boehringer; Feinberg, A. P and Vogelstein, B., 1983 Anal. Biochem. 132:6-13).
Para la hibridación in situ, se preparó una sonda de ADN antisentido monocatenario, tal y como describen Schnürch y Risau (Development, 1991111:1143-54). Se linealizó el plásmido en el extremo 3' del ADNc y se sintetizó una transcripción sentido mediante la ARN polimerasa SP6 (Boehringer). El ADN fue degradado mediante una DNAasa (preparación libre de RNAasa, Boehringer Mannheim). Con la transcripción, se realizó una síntesis de ADNc iniciado aleatoriamente con un \alpha-^{32}S dATP (Amersham) mediante la transcripción inversa con la transcriptasa inversa del MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney) (BRL). Para obtener pequeños fragmentos de ADNc de aproximadamente 100 pares de bases de media adecuados para la hibridación in situ, se utilizó un gran exceso de iniciador. Posteriormente la transcripción de ARN fue parcialmente hidrolizada en 100 mM de NaOH durante 20 minutos a 70°C, y la sonda fue neutralizada con la misma cantidad de HCl y purificada con una columna de Sephadex C50. Tras la precipitación del etanol, se disolvió la sonda en una actividad final específica de 5x10^{5} cpm. Para controlar la hibridación, se preparó una sonda sentido con el mismo método.
6.1.4. Extracción del ARN y análisis de Northern
Se aisló el ARN citoplásmico total según el método del fenol ácido de Chromczynski y Sacchi (1987). Se sometieron las partes alícuotas del ARN Poli(A+) a electroforesis en un 1,2% de geles de formaldehido-agarosa (Sambrook, J. et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell). Se realizaron las hibridaciones por la noche en un 50% de formamida, ***5 x SSC (750 mM de cloruro sódico, 75 mM de citrato sódico), 5 x solución Denhardt (0,1% de Ficoll 400, 0,1% de polivinilpirrolidona, 0,1% de BSA: albúmina sérica bovina) y -0,5% de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 42°C con 1-3x10^{6} cpm-ml-^{1} de una sonda de ADN iniciado aleatoriamente ^{32}P, seguido de lavados muy rigurosos en 0,2 x SSC, 0,5% de SDS a 52°C. Los filtros fueron expuestos durante un período de 4 a 8 días.
6.1.5. Hibridación in situ
La post-fijación y la hibridación de la subclonación fue esencialmente realizada de acuerdo con Hogan et al. (1986). 10 \mum de secciones gruesas fueron cortadas a una temperatura de -18°C en un criostato Leitz. Para el proceso de prehibridación no se realizó ninguna incubación con 0,2 M de HCl para eliminar las proteínas básicas. Se incubaron las secciones con la sonda de ADNc ^{35}S (5x10^{4} cpm/ml) a 52°C en un tampón del 50% de formamida, 300 mM de NuCl, 10 mM de tris-HCl, 10 mM de NaPO_{4} (pH 6,8), 5 mM de EDTA (ácido etilendiamino tetraacético), 0,02% de Ficoll 400, 0,01% de polivinilprolidona, 0,02% de BSA, 10 m/ml de ARN de levadura, 10% de dextrano sulfato, y 10 mM de NaCl, 10 mM de tris-HCl, 10 mM de NaPO_{4} (pH 6.8), 5 mM de EDTA, 10 Mm de DTT (ditiotreitol) a 52°C. Para la realización de una autorradiografía, se cubrieron las láminas con una emulsión de película Kodak NTB2 y fueron expuestas durante ocho días. Después del revelado, se realizó una coloración de contraste en las secciones y un azul de toluidina o May-Grinwald.
6.1.6. Preparación de antisueros
Se subclonó un fragmento de EcoRV/HindII iniciado en 3' que comprendía 128 aminoácidos C-terminales de Flk-1 en el vector de expresión de la proteína de fusión pGEX3X (Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1990 Gen. 67:31-40; Pharmacia). La proteína de fusión fue purificada tal y como se describe y usada para inmunizar conejos. Después del segundo impulso, los conejos fueron desangrados y se utilizó el antisuero para la inmunoprecipitación.
6.1.7. Expresión transitoria de Flk-1 en células COS-1
La transfección de células COS-1 se realizó esencialmente tal y como describen Chen y Okayama (1987 Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752) y Gorman et al. (1989 Virology 171:377-385). En resumen, las células fueron cultivadas a una densidad de 1,0 x 10^{6} por cada plato de 10-cm e incubadas durante la noche en DMEM con un contenido de suero de ternero fetal (Gibco) del 10%. Se clonaron 20 Mg de ADNc del receptor en un vector de expresión dirigido por el promotor del citomegalovirus y se mezclaron en 0,5 ml de 0,25 M de CaCa_{2}, 0,5 ml de 2 x BBS (280 mM de NaCl, 1,5 mM de Na_{2}HPO_{4}, 50 mM de BES, pH 6,96 y se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la solución de fosfato de calcio/ADN a las células, se agitó suavemente, y se incubó durante 18 horas a 37°C en CO_{2} al 3%. En los experimentos de unión de ligandos se eliminaron las células de la placa y se trataron tal como se describe abajo.
Con el fin de obtener medios acondicionados de VEGF, se modificaron las células en unos platos de 15-cm. Se recogió el medio transcurridas 48 h y el VEGF fue purificado parcialmente por cromatografía de afinidad con columnas de MT "High Trap" de heparina (Pharmacia) y concentrado por ultrafiltración (Ferrara, N. y Henzel, W.J. 1989 Biochem. Biofis. Res. Comm. 161:851-858). La concentración de VEGF fue determinada por un ensayo de competición de ligando con células bovinas endoteliales aórticas.
Para los ensayos de autofosforilación, se cultivaron las células en platos de 6 pocillos (2x10^{5} células por pocillo), se modificaron según el modo descrito anteriormente, y se alimentaron durante 24 h en DMEM con un contenido del 0,5% de suero de ternero fetal. A continuación, las células fueron tratadas con 500 pM de VEGF durante 10 min. a 37°C o bien, permanecieron sin tratar y posteriormente fueron lisificadas según lo descrito por Kris et al. (1985). El Flk-1 fue inmunoprecipitado con un antisuero aumentado en conejos contra el C-terminal del receptor. Los inmunoprecipitados fueron separados en un gel SDS poliacrilamida al 7,5%, transferidos a nitrocelulosa e incubados con un anticuerpo de ratón monoclonal dirigido contra la fosfotirosina (Fendly, B.M. et al., 1990 Cancer Research 50: 1550-1558). Se visulizaron las bandas proteínicas utilizando peroxidasa de rábano acoplada con un anticuerpo de cabra anti-ratón y el sistema de detección de ECL^{TM} (Amersham).
6.1.8. Radioyodación de VEGF
El VEGF recombinante humano (5 \mug; proporcionado por gentileza del Dr. H. Welch) fue disuelto en 110 \mul de un tampón de fosfato sódico de pH 76 y fue yodado por el procedimiento de Hunter y Greenwood (1962). Se separaron los productos reactivos de la proteína marcada por su paso sobre una columna de Sephadex G50, pre-equilibrados con suero salino tamponado con fosfato (PBS) con un contenido del 0,7% de albúmina de suero bovino (BSA) y se contaron las partes alícuotas de las fracciones recogidas, antes y después de la precipitación con un 20% de ácido tricloroacético. Se estimó que la pureza del producto yodado era superior al 90%, tal como lo determinó la electroforesis en gel y su actividad específica fue de 77000 cpm/ng. La bioactividad del VEGF yodado fue confirmada por comparación con las bioactividades del VEGF nativo a través del ensayo de la introducción del factor tisular descrito por Clauss, M. et al. (1990 J. Exp. Med. 172:1535-1545).
6.1.9. Reticulación del VEGF al Flk-1
Las células COS-1 que expresan transitoriamente el Flk-1 y las células COS-1 no modificadas fueron incubadas con 200 pM de ^{125}I-VEGF a 4°C durante la noche, luego fueron lavadas dos veces con PBS y expuestas a 0,5 mM de disuccinimidilo suberato (DSS) en PBS durante 1 h a 4°C. Las células fueron lisadas y el Flk-1 inmunoprecipitado y se analizó por electroforesis en un 7% de gel politarcilamida seguido de una autorradiografía.
6.1.10. Unión del VEGF
Se realizaron experimentos de unión de ligando tal y como se ha descrito previamente (Schumacher, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:19288-19295), las células COS-1 fueron cultivadas en un plato de cultivo de 15-cm en DMEM durante 48h tras la transfección. A continuación, se lavaron las células cuidadosamente con PBS y se incubaron con 5 ml de 25 mM de EDTA en PBS durante 10 min. A continuación se eliminaron las células de la placa, se lavaron una vez con un tampón de unión (DMEM, 25 mM HEPES, pH 7,5, 0,15% de gelatina) y se suspendieron nuevamente en 5 ml de un tampón de unión para determinar el número celular. En un volumen total de 500 ml, se incubó esta suspensión celular durante 90 min. a 15°C con 10 pM de ^{125}I-VEGF y una concentración mayor del ligando no marcado (de 0 a 7 x 10^{-9}), purificado parcialmente de unos medios acondicionados de células COS-1 que expresan transitoriamente VEGF (164 formas de aminoácidos; Breier et al., 1992). Tras la incubación, se lavaron las células con PBS al 0,1% de PBS en frío. El ligando libre se eliminó por centrifugación repetida y por resuspensión en un tampón de unión. Finalmente, se determinó mediante un gammámetro (Riastar) la radioactividad ^{125}I unida a las células. Los datos obtenidos fueron analizados según el método de Munson, P.J. y Rodbard, D. (1980 Anal. Biochem. 107:220-235).
6.1.11. Vectores retroviricos codificadores de mutantes transdominantes negativos de Flk-1
Se construyeron los vectores retrovíricos recombinantes conteniendo la región de codificación para aminoácidos desde 1 hasta 806 del receptor Flk-1 (pLX Flk-1 cl.1 y cl.3, Figura 12). Se utilizó un virus recombinante conteniendo un mutante receptor de cfms truncado (pNTK cfms Tm cl.7) como control. Con el fin de obtener células productoras de virus, se infectaron células GPE de ratón con un virus anfotrófico conteniendo medios acondicionados de células PA317 modificadas con ADN retrovírico recombinante. Se implantaron células tumorales del gliobastoma C6 en ratones desnudos, ya fueran solas o bien coimplantadas con células productoras de virus. Se indican los números celulares inyectados en ambos conjuntos de experimentos. Comenzando al mismo tiempo en que aparecieron los primeros tumores, se midieron los volúmenes tumorales cada 2 a 3 días para obtener una curva de crecimiento.
Experimento N°.1
1 
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Experimento N°.2
2
6.2. Resultados 6.2.1. Aislamiento del Flk-1
Para identificar los RTKs expresados durante el desarrollo del ratón, se realizaron los ensayos de PCR usando dos depósitos precursores de oligonucleótidos degenerados diseñados en base a unas secuencias altamente conservadas dentro del dominio de la quinasa de los RTKs (Hanks, S.K. et al. 1988, Science 241:42-52). Se utilizó el ADN extraído de un banco de ADNc de \lambdagt10 de embriones de ratón de 8,5 días (Fahrner, K. et al., 1987, EMBO. J., 6:1497-1508), fase del desarrollo del ratón en la cual se inician muchos procedimentos de diferenciación, como patrón en los ensayos de PCR. En un procedimiento paralelo y con la intención de identificar los RTKs reguladores de la angiogénesis, se utilizaron precursores similares para la amplificación de secuencias de ADNc de RTK de células capilares endoteliales que fueron aisladas de cerebros de ratones posnatales de 4-8 días, periodo en el que la proliferación de las células endoteliales cerebrales es máxima (Robertson, P1. et al., 1985, Devel. Brain Res. 23:219-223). Ambos procedimientos produjeron secuencias de ADNc (Fig. 11, Secuencia. ID N°.:) codificadoras del RTK del hígado fetal recientemente descrito, el Flk-1 (Mattews, W. et al., 1991: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9026-9030). Basándose en la homología de aminoácidos, este receptor es un elemento de la subclase de RTKs de tipo III (Ullrich, A. y Schlessinger, J. 1990, Cell 61:203-212) y está relacionado estrechamente con el flt humano que también contiene siete repeticiones tipo inmunoglobina en su dominio extracelular a diferencia de otros RTKs de esta subfamilia, la cual contiene únicamente cinco estructuras de repetición de este tipo (Mattews, W. et al., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88: 9026-9030). Las comparaciones de las secuencias de Flk-1 con KDR (Terman, B.I. et al., 1991, Oncogene 6:1677-1683) y TKr-C (Sarzani, R. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 186:706-714) sugieren que son homólogos del Flk-1 del ser humano y del ratón, respectivamente (Figura 1).
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6.2.2. Expresión del ARNm de Flk-1 durante el desarrollo embrionario
Como una primera fase hacia la elucidación de la función biológica del Flk-1, se analizó la expresión del ARNm de Flk-1 en embriones de ratón en diferentes fases del desarrollo. Los experimentos de hibridación por transferencia de Northern indicaron una expresión abundante de un ARNm mayor de 5,5 kb entre el día 9,5 y el día 18,5, con un descenso evidente hacia el final de la gestación (Figura 2A). En el Flk-1 de los capilares cerebrales posnatales de 4-8 días, el ARNm resultó estar altamente enriquecido en comparación con el ARNm total del cerebro (Figura 2B).
Se realizaron experimentos de hibridación in situ para obtener más información detallada acerca de la expresión del Flk-1 durante las diferentes fases embrionarias. Se utilizó una sonda de ADN antisentido monocatenario de 2619 nucleótidos comprendiendo el dominio extracelular de Flk-1 porque generaba la mayoría de las señales de hibridación específicas. Como ejemplo, se muestra una sección parasagital de un embrión de 14,5 días en la Figura 3. Se detectaron niveles de hibridación elevados en el ventrículo del corazón, del pulmón y de las meninges; otros tejidos como el del cerebro, del hígado y de la mandíbula parecían tener menor contenido de células que expresaban el ARNm de Flk-1. También se observaron unas finas cadenas de la expresión de Flk-1 en las regiones intersegmentales de las vértebras y en la superficie interna del atrio y de la aorta. Una ampliación más grande demostró que la expresión del Flk-1 parecía estar restringida a los vasos capilares y sanguíneos. Por ejemplo, un estudio del corazón más estricto mostró señales positivas sólo en los revestimientos capilares ventriculares y endoteliales del atrio (Figura 4A). En el pulmón se detectó la expresión del Flk-1 en los capilares peribronquiales, sin presencia en el epitelio bronquial (Figura 4D). La aorta mostró una fuerte hibridación en las células endoteliales, pero no en la capa muscular (Figura 4C).
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6.2.3. Expresión del Flk-1 durante la angiogénesis de un órgano
El neuroectodermo en el telencéfalo de un embrión de ratón de 11,5 días es ampliamente avascular; los primeros brotes vasculares empiezan a invadir radialmente el órgano originario del plexo vascular perineural (Bar, J., 1980, Adv. Anat. Embriol. Cell. Biol. 59:1-62; Risau, W. y Lemmon, V. 1988, Dev. Biol. 125:441-450). En esta fase, la expresión del Flk-1 en el plexo perineural vascular y en la invasión de brotes vasculares fue elevada, según se indica en la Figura 5A. Estos análisis de hibridación in situ indicaron que las células endoteliales proliferantes de un brote angiogénico expresaban el ARNm de Flk-1. En el día 14,5, cuando el neuroectodermo ya estaba bien vascularizado, varios vasos radiales, así como la ramificación de los vasos del plexo intraneural, contenían grandes cantidades de ARNm de Flk-1 (Figura 5B). En el día posnatal 4, cuando la germinación y la proliferación de la célula endotelial estaban al máximo, se observó una fuerte expresión del ARNm de Flk-1 en las células endoteliales (Figura 5C). Recíprocamente, cuando cesó la angiogénesis en el cerebro adulto, la expresión del Flk-1 fue muy baja (Figura 5D) y pareció estar restringida principalmente al plexo coroideo (Figura 6). En el plexo coroideo, las células en la capa vascular interna expresaron el ARNm de Flk-1, mientras que las células epiteliales no lo hicieron (Figura 6A, B).
El riñón embrionario se vasculariza por un proceso angiogénico (Ekblom, P. et al. 1982, Cell Duff. 11:35-39). Los capilares glomerulares y peritubulares se desarrollan de forma sincronizada con la morfogenesis epitelial. En el riñón posnatal de 4 días, además de otros capilares, se observó una expresión prominente de Flk-1 en los presuntos capilares glomerulares (Figura 7A). Esta expresión persistió en el riñón adulto (Figura 7C y D) y luego pareció estar más limitada al glomerular en comparación con el anterior riñón posnatal.
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6.2.4. Expresión del Flk-1 en los progenitores de células endoteliales
Con el fin de indagar en la posible involucración de Flk-1 en las fases tempranas del desarrollo vascular, se realizaron unos análisis de embriones en diferentes fases durante la formación de un islote sanguíneo. En una sección sagital del deciduum de un embrión de ratón de 8,5 días, se detectó una expresión de Flk-1 en los vasos sanguíneos maternos en el deciduum, en el saco vitelino y en el trofectodermo. También se encontró ARNm de Flk-1 en el alantoide y dentro del embrión, localizado sobretodo en la parte donde se encuentra el mesenquima (Figura 8A). Al realizar un mayor aumento del deciduum materno, se encontraron niveles elevados de la expresión de ARNm de Flk-1 en el revestimiento interno de los vasos sanguíneos que consisten en células endoteliales (Figura 8B). En el saco vitelino, las señales de hibridación se limitaron a la capa mesodermal, en la que se distinguen los hemangioblastos (Figura 8C). La Figura 8D muestra un islote sanguíneo con mayor aumento, donde los angioblastos periféricos expresaban un nivel de ARNm de Flk-1 elevado.
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6.2.5. El Flk-1 es un receptor de gran afinidad para el VEGF
Un estudio detallado de los resultados de la hibridación in situ y una comparación con los del VEGF recientemente realizado por Breier, G. et al. (1992, Development 114:521-532) reveló una similitud destacable en el patrón de expresión. Además, la expresión del Flk-1 en el endotelio glomerular y del VEGF en las células epiteliales circundantes (Breier, C. et al., 1992, Development 114:521-532) incrementó la posibilidad de una relación paracrina entre estos tipos de células y sugirió en consecuencia una relación receptor-ligando para el VEGF y el Flk-1, respectivamente. Para probar esta hipótesis, se clonó todo el ADNc de Flk-1 en el vector de expresión mamífero pCMV, el cual contenía elementos de control transcripcional del citomegalovirus humano (Gorman, CM. et al., 1989, Virology 171:377-385). Para la expresión transitoria del receptor, se modificó posteriormente el Flk-1 con una expresión de plásmidos en los fibroblastos COS-1.
Se demostró el enlace específico del VEGF al RTK de Flk-1 mediante unos experimentos de enlace por reticulación y competición. El VEGF purificado marcado ^{125}I fue incubado con células COS-1 modificadas con el vector de expresión pCMV-Flk-1. La reticulación con DSS y el posterior análisis de inmunoprecipitación, la PAGE, y la autorradiografía revelaron una banda de aproximadamente 220 kD que no fue detectada en el experimento de control con células COS-1 no modificadas y que puede representar el complejo receptor VEGF/Flk-1 (Figura 9A). Además, se comparó el VEGF con la unión del ^{125}I-VEGF al Flk-1 que expresaba las células COS-1 (Figura 9B), mientras que las células COS-1 no modificadas no se unieron al ^{125}I-VEGF. La interacción del VEGF con el receptor en células modificadas fue específica, cuando el PDGF-BB no competía con la unión del ^{125}I-VEGF. El análisis de los datos de unión reveló un Kd de aproximadamente 10^{-10} M, lo cual sugiere que el Flk-1 es un receptor de VEGF de gran afinidad. Este hallazgo, junto con los resultados de la hibridación in situ del Flk-1 y del VEGF sugiere sin duda que el Flk-1 es un receptor de VEGF fisiológicamente relevante.
Se realizó un ensayo de autofosforilación para confirmar la relevancia biológica de la unión del VEGF al receptor Flk-1. Se privó de alimento a las células COS-1 que expresaron Flk-1 de forma transitoria en DMEM con un contenido del 0,5% de suero de ternero fetal durante 24 h, y se estimularon con 0,5 mM de VEGF, y se lisaron. Los receptores fueron inmunoprecipitados con el anticuerpo CT128 policlonal específico de Flk-1 y luego analizados mediante la PAGE SOS e inmunomanchados posteriormente mediante el anticuerpo de antifosfotiroxina 5E2 (Fendly, B.M. et al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558). Según se muestra en la Figura 10, la estimulación del VEGF de las células que expresaban Flk-1 condujo a una inducción significante de fosforilación de tirosina del receptor Flk-1 de 180 kD.
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6.2.6. Inhibición de crecimiento tumoral por inhibición negativa transdominante de Flk-1
Se cree que el receptor Flk-1 tiene un papel aún más importante en la vasculogénesis y la angiogénesis. En consecuencia, la inhibición de la actividad del Flk-1 puede inhibir la vasculogénesis de un tumor en desarrollo e inhibir su crecimiento. Para probar esta hipótesis, se mezclaron células tumorales (glioblastoma C6 de rata) y células de ratón productoras de un retrovirus recombinante codificador de un receptor Flk-1 truncado y se implantaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Las células de glioblastoma C6 implantadas segregaron VEGF para enlazar y activar a los receptores Flk-1 expresados en la superficie de células endoteliales de ratón. En ausencia de cualquier inhibidor de la vasculogénesis, las células endoteliales proliferarán y emigrarán hacia las células tumorales. De forma alternativa, si en el momento de la inyección se co-inyectan las células tumorales con células productoras de retrovirus recombinantes codificadoras del Flk-1 dominante negativo, entonces, las células endoteliales que se desarrollan hacia las células tumorales implantadas serán infectadas con retrovirus recombinantes que podrán producir una expresión mutante del Flk-1 dominante negativo y la inhibición de la señalización del Flk-1 endógeno. La supresión de la proliferación y la migración de las células endoteliales dará como resultado que las células tumorales implantadas no serán vascularizadas lo cual conducirá a la inhibición del crecimiento tumoral. Según se indica en las Figuras 12 y 13, el crecimiento tumoral se encuentra significativamente inhibido en los ratones receptores de implantes de células productoras de un receptor Flk-1 truncado que indica que la expresión de un receptor Flk-1 truncado puede actuar de forma negativa dominante para inhibir la actividad del Flk-1 de tipo salvaje endógeno.
La presente invención no debe estar completamente limitada por las formas de realización ejemplificadas destinadas a ilustrar los aspectos individuales de la invención y cualquier clon, ADN o secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente estará incluido en el campo de la invención. De hecho, los expertos en la materia deducirán varias modificaciones de la invención además de las aquí descritas de la lectura de la precedente descripción y los dibujos anexos. Tales modificaciones formarán parte del campo de las reivindicaciones anexas.
También debe entenderse que todas las dimensiones de los pares de base proporcionados para los nucleótidos son aproximadas y se usan por motivos descriptivos.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Ullrich, et al 
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(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: FLK-1 ES UN RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO VASCULAR ENDOTELIAL
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
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(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
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(A)
DESTINATARIO: Pennie & Edmonds
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(B)
CALLE: 1155 Avenue of the Americas
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(C)
CIUDAD: Nueva York
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(D)
ESTADO: Nueva York
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(E)
PAÍS: E.E.U.U.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 10036-2711
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(v)
FORMATO INFORMÁTICO:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS-MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: PatentIn Edición #1.0, Versión #1.25
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(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: Por asignar
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-MAR-1993
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
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(A)
NOMBRE: Coruzzi, Laura A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30,742
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(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7683-034-999
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(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
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(A)
TELÉFONO: (212) 790-9090
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(B)
TELEFAX: (212) 869-8864/9741
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX: 66141 PENNIE
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO:1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5470 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocida
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(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
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(ix)
CARACTERÍSTICA:
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(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 286..4386
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA 10 N°:1:
3
4
5
6
7
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID N°:2:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 1367 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA ID N°:2:
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10
11
12
13
14

Claims (9)

1. Receptor Flk-1 membranario comprendiendo una mutación por deleción en el dominio de la quinasa citoplasmática del receptor Flk-1, en el que dicho receptor Flk-1 tiene una actividad negativa dominante que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular).
2. Receptor Flk-1 membranario según la reivindicación 1, donde dicho receptor carece de quinasa citoplásmica C-terminal.
3. Receptor según la reivindicación 2, conteniendo los aminoácidos desde 1 hasta 806 de Flk-1, pero no los aminoácidos desde 807 hasta 1367 de Flk-1.
4. Secuencia de nucleótidos que codifica un receptor Flk-1 membranario con una mutación por deleción en el dominio de la quinasa citoplasmática del receptor Flk-1, en el que dicho receptor Flk-1 tiene una actividad negativa dominante que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF.
5. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4 donde dicho receptor carece de de dominio de quinasa citoplasmática C-terminal.
6. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5, conteniendo una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos desde 1 hasta 806 de Flk-1, pero no los aminoácidos desde 807 hasta 1367 de Flk-1.
7. Método para la producción del Flk-1 recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo:
(a)
cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de ADN recombinante comprendiendo la secuencia de nucleótidos de una de las reivindicaciones 4 a 6 y que expresa el Flk-1; y
(b)
recuperar el producto genético de Flk-1 del cultivo celular.
8. Método para la producción de una proteína de fusión de Flk-1 recombinante, que comprende el receptor Flk-1 de una de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo:
(a)
cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de ADN recombinante comprendiendo la secuencia de nucleótidos de una de las reivindicaciones 4 a 6 y que expresa la proteína de fusión Flk-1; y
(b)
recuperar la proteína de fusión Flk-1 del cultivo celular.
9. Método para seleccionar e identificar un receptor Flk-1 con actividad negativa dominante comprendiendo:
(a)
inyectar células tumorales y células que expresan un receptor Flk-1 de prueba teniendo una mutación antisentido o por deleción en el dominio de la quinasa citoplasmática en un animal no humano; y
(b)
medir la proliferación o vascularización de la masa tumoral resultante de la inyección de las células.
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