DE69332907T2 - Flk-1 ist ein rezeptor für den wachstumsfaktor der vaskularen endothelzellen - Google Patents

Flk-1 ist ein rezeptor für den wachstumsfaktor der vaskularen endothelzellen Download PDF

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Description

  • 1. Einführung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von einem rekombinanten Vektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die einen Flk-1 Rezeptor kodiert, der eine Mutation in der zytoplasmatischen Kinasedomäne hat, für die Modulierung der Angiogenese und Vaskulogenese. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Demonstration, dass Flk-1 Tyrosinkinaserezeptor-Expression mit Endothelzellen assoziiert ist, und der Identifizierung von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) als dem Hochaffinitätsliganden von Flk-1. Diese Ergebnisse zeigen eine wichtige Rolle für Flk-1 im Signalsystem während Vaskulogenese und Angiogenese. Manipulation von Wirtszellen, die Flk-1 exprimieren, und die Verwendungen von exprimiertem Flk-1 zum Evaluieren und Screenen von Wirkstoffen und Analogen von VEGF, die in der Flk-1 Modulierung durch entweder Agonisten- oder Antagonistenaktivitäten involviert sind, wird beschrieben.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Rezeptortyrosinkinasen umfassen eine große Familie von Transmembranrezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren mit verschiedenen biologischen Aktivitäten. Ihre intrinsische Tyrosinkinasefunktion wird durch Ligandenbindung aktiviert, was in einer Phosphorylierung des Rezeptors und verschiedener zellulärer Substrate und einschließend in einer Vielzahl von zellulären Antworten resultiert (Ullrich A. and Schlessinger, J., 1990, Cell 61: 203-212).
  • Eine Rezeptortyrosinkinase-cDNA, die als fötale Leberkinase 1 (Flk-1) bezeichnet wird, wurde von Mauszellpopulationen kloniert, die auf hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen angereichert wurden. Es wurde vorgeschlagen, dass der Rezeptor in hämatopoetischer Stammzellerneuerung involviert ist (Matthews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030). Sequenzanalyse des Flk-1 Klons zeigte erhebliche Homologie mit der c-Kit-Unterfamilie von Rezeptorkinasen und insbesondere zu dem Flt-Genprodukt. Diese Rezeptoren haben alle eine extrazelluläre Domäne, die immunoglobulinartige Strukturen enthält, gemeinsam.
  • Die Bildung und Ausbreitung von Blutgefäßen bzw. Vaskulogenese und Angiogenese spielt bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, wie beispielsweise embryonale Entwicklung, Wundheilung, Organregeneration und weibliche reproduktive Prozesse wie Follikelentwicklung in dem Corpus luteum während der Ovulation und plazentales Wachstum nach Schwangerschaft, wichtige Rollen. Unkontrollierte Angiogenese kann pathologisch sein, wie beispielsweise bei dem Wachstum von festen Tumoren, die auf eine Vaskularisierung zum Wachstum angewiesen sind.
  • Angiogenese schließt die Proliferation, Migration und Infiltration von vaskulären Endothelzellen ein und wird wahrscheinlich durch Polypetid-Wachstumsfaktoren reguliert. Verschiedene Polypeptide mit wachstumsfördernder Aktivität für Endothelzellen wurden identifiziert. Beispiele umfassen den sauren und basischen fibroblastischen Wachstumsfaktor, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und den plazentalen Wachstumsfaktor. Obwohl vier verschiedene Rezeptoren für die verschiedenen Mitglieder der FGF-Familie charakterisiert wurden, wurde von keinem von diesen bisher berichtet, dass er in Blutgefässen in vivo exprimiert wird.
  • Während die FGFs Mitogene für eine große Anzahl von verschiedenen Zelltypen zu sein scheinen, wurde kürzlich berichtet, dass VEGF ein für Endothelzellen spezifiches Mitogen ist (Ferrara, N. and Henzel, W. J., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851-858). Kürzlich wurde gezeigt, dass der fms-artige Tyrosinrezeptor flt Affinität für VEGF hat (DeVries, C. et al., 1992, Science 255: 989-991).
  • 3. Zusammenfassung der Erfindung>
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines rekombinanten Vektors, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die einen Flk-1 Rezeptor kodiert, der eine Mutation in der zytoplasmatischen Kinasedomäne hat, für die Modulierung der Angiogenese und Vaskulogenese. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass der Flk-1 Tyrosinkinaserezeptor auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert wird, und der Identifizierung von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) als dem Hochaffinitätsliganden von Flk-1. Die Rolle von Endothelzellproliferation und Migration während Angiogenese und Vaskulogenese zeigt eine wichtige Rolle von Flk-1 in diesen Prozessen. Die Erfindung wird beispielhaft für den murinen Flk-1 beschrieben, aber die Prinzipien können auf andere Spezies, einschließlich Menschen, angewandt werden.
  • Die Erfindung betrifft Expressionssysteme, die so angelegt sind, dass sie Flk-1 Protein produzieren, und/oder Zelllinien, welche den Flk-1 Rezeptor gemäß der Erfindung exprimieren. Eine Expression von löslichem rekombinantem Flk-1 Protein kann verwendet werden, um Peptidbibliotheken auf Moleküle zu screenen, die die Flk-1/VEGF-Interaktion inhibieren. Manipulierte Zelllinien, die Flk-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, können vorteilhafterweise verwendet werden, um VEGF-Agonisten und -Antagonisten zu screenen und zu identifizieren.
  • 4. Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. Vergleich der Flk-1 Aminosäuresequenz mit verwandten RTKs. Aminosäuresequenzvergleich von Flk-1 mit humanem KDR und Ratten-TKr-C. Ein Abschnitt der Sequenz, welcher für alle drei Rezeptoren bekannt ist, wird verglichen, und nur Unterschiede zu der Flk-1 Sequenz sind gezeigt.
  • 2. Northernblot-Analyse der Flk-1 Genexpression. (A) Expression von Flk-1 RNA in Mausembryonen von Tag 9,5 – Tag 18,5. Proben (10 μg) von Gesamt-RNA von ganzen Mausembryonen wurden in jeder Spur analysiert. Die Positionen von 28S und 18S ribosomalen RNAs sind markiert. (B) Expression von Flk-1 mRNA in postnatalem Tag 4 und adultem Gehirn im Vergleich mit kapillaren Fragmenten von postnatalem Tag 4-Gehirn. 1 μg poly(A+)-RNA wurde auf jede Spur geladen. Die 5' 2619 bp der Flk-1 cDNA wurden als eine Probe benutzt. Kontrollhybridisierung mit einer GAPDH cDNA-Probe ist im unteren Abschnitt gezeigt.
  • 3. Abundante Flk-1 Genexpression in embryonalen Geweben. In situ-Hybridisierungsanalyse von der Flk-1 Expression in einem Tag 14,5-Mausembryo.
  • (A) Hellfeld-Ausleuchtung von einem parasagittalen Schnitt durch den gesamten Embryo, der mit einer 35S-markierten Antisenseprobe (5' 2619 bp) hybridisiert ist. (B) Dunkelfeld-Ausleuchtung des selben Schnitts. (C) Kontrollhybridisierung eines angrenzenden Schnitts mit einer Senseprobe. Abkürzungen: Ao, Aorta; At, Atrium; L, Lunge; Li, Leber; Ma, Mandibula; Mn, Hirnhaut, Ms, Mesencephalon; T, Telencephalon; V, Ventrikel; Vt, Wirbel.
  • 4. Eine Expression von Flk-1 RNA in embryonalen Organen ist auf spezifische Zellen beschränkt. Expression von Flk-1 RNA in einem Tag 14,5-Mausembryo bei höherer Vergrößerung. (A) Die Herzregion wurde mit einer 35S-markierten Antisenseprobe behandelt. (B) Angrenzender Schnitt, der mit der Senseprobe hybridisiert wurde. (C) Teil der Aortawand, gezeigt auf der zellulären Ebene. Die Endothelzellschicht ist durch einen Pfeil angezeigt. (D) Die Lunge, die mit der Flk-1 Antisenseprobe behandelt wurde. (E) Kontrollhybridisierung von einem angrenzenden Schnitt, der mit der Senseprobe hybridisiert wurde. Abkürzungen: At, Atrium; B, Bronchie; Ed, Endothelzellschicht; En, Endocardium; L, Lunge; Li, Leber; Lu, Lumina der Aorta; Ml, muskulär; My, Myocardium.
  • 5. Flk-1 Genexpression in dem Gehirn der sich entwickelnden Maus. In situ-Hybridisierungsanalyse der Flk-1 Genexpression in dem Gehirn bei verschiedenen Entwicklungsstadien. Alle Schnitte wurden mit der Flk-1 Antisenseprobe behandelt. (A) Sagittaler Schnitt des Telencephalon eines Tag 11,5-Mausembryos. Ein einzelnes Blutgefäß, welches Flk-1 exprimiert, welches von der Hirnhaut in das Neuroektoderm sprießt, ist durch einen Pfeil angezeigt. (B) Sagittaler Schnitte des Gehirns eines Embryos von Tag 14,5 und (C) von postnatalem Tag 4. Gezeigt sind Regionen des Mesencephalon. Verzweigte Kapillaren und Blutgefäße, die Flk-1 exprimieren, sind durch einen Pfeil angezeigt. (D) Sagittale Schnitte eines adulten Gehirns; eine Region des Mesencephalon ist gezeigt. Zellen, die Flk-1 exprimieren, sind durch einen Pfeil angezeigt. Abkürzungen: M, Hirnhaut; V, Ventrikel.
  • 6. Expression von Flk-1 in dem choroiden Plexus des adelten Gehirns. (A) Dunkelfeld-Ausleuchtung des choroiden Plexus eines adelten Mausgehirns, welches mit einer Flk-1 Antisenseprobe hybridisiert wurde. (B) Choroider Plexus, gezeigt bei einer höheren Vergrößerung. Pfeile zeigen einzelne Zellen an, die eine starke Expression von Flk-1 zeigen. Abkürzungen: CP, choroider Plexus; E, Ependym; Ep, Epithelzellen; V, Ventrikel.
  • 7. Flk-1 wird in den Glomeruli der Niere exprimiert. (A) Parasagittaler Schnitt einer Niere vom postnatalen Tag 4, die mit der Flk-1 Antisenseprobe hybridisiert wurde. Das Hybridisierungssignal akkumuliert in den Glomeruli, wie durch Pfeilköpfe angezeigt. (B) Kontrollhybridisierung von einem angrenzenden Schnitt mit der Senseprobe. (C) Sagittaler Schnitt einer adelten Niere, die mit Flk-1 behandelt wurde. Pfeilköpfe zeigen Glomeruli an. (D) Glomerulus einer adelten Niere bei einer höheren Vergrößerung. Die Pfeile in (A) und (D) zeigen Zellen an, die in Strängen in der juxtaglomulären Region ausgerichtet sind, die Flk-1 exprimieren.
  • B. In situ-Hybridisierungsanalyse der Flk-1 Expression in frühen Embryonen und extraembryonalen Geweben. (A) Sagittaler Schnitt von einem Tag 8,5-Mausembryo im maternalen Deciduum, behandelt mit Flk-1. (B) Höhere Vergrößerung des Deciduums. Pfeilköpfe zeigen das Endothelium von maternalen Blutgefäßen an, welche Flk-1 RNA stark exprimieren. (C) Hohe Vergrößerung des Dottersacks und des Trophoektoderms eines Tag 9,5-Mausembryos. (D) Hohe Vergrößerung einer Blutinsel. Abkürzungen: A, Allantois; Bi, Blutinsel; Bv, maternales Blutgefäß; D, Deciduum; En, endodermale Schicht des Dottersacks; M, Mesenchym; Ms, mesodermale Schicht des Dottersacks; NF, Neuralfalte; T, Trophoblast; Y, Dottersack.
  • 9. Flk-1 ist ein Rezeptor für VEGF. (A) Quervernetzen von 125I-VEGF mit COS-Zellen, die den Flk-1 Rezeptor transient exprimieren, und Kontrollzellen wurden mit 125I-VEGF bei 4°C über Nacht inkubiert, dann zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen und 0,5 mM des Quervernetzungs-Agens DSS in PBS für eine Stunde bei 4°C ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert, der Flk-1 Rezeptor immunopräzipitiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, analysiert. Molekulare Größenmarker sind in Kilodalton angezeigt. (B) Spefizische Bindung von 125I-VEGF an COS-Zellen, die Flk-1 exprimieren. COS-Zellen, die Flk-1 transient exprimieren, wurden von der Platte entfernt und in Bin dungsmedium (DMEM, 25 mM Hepes, 0,15% Gelatine) resuspendiert. Die Bindung wurde bei 15°C für 90 Minuten in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml, welches 2 × 105 Zellen, 15.000 cpm 125I-VEGF und die angezeigten Konzentrationen von unmarkiertem Liganden enthielt, durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS/0,1% BSA gewaschen und in einem Gammazähler gezählt.
  • 10. VEGF-induzierte Autophosphorylierung von Flk-1. COS-Zellen, die den Flk-1 Rezeptor transient exprimieren, und Kontrollzellen wurden für 24 Stunden in DMEM, welches 0,5% fötales Kälberserum enthielt, ausgehungert und dann mit VEGF für l0 Minuten wie angezeigt stimuliert. Die Zellen wurden solubilisiert, der Flk-1 Rezeptor mit einem polyklonalen Antikörper gegen seinen C-Terminus immunopräzipitiert, durch Polyacrylamidgelelektrophorese abgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Der Blot wurde mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern (5B2) behandelt. Die Proteinbanden wurden durch Verwendung eines Meerrettichperoxidasegekoppelten zweiten Antikörpers und eines BCLT M (Amersham)-Detektionstests visualisiert.
  • 11. Nukleotidsequenz von murinem Flk-1.
  • 12. Plasmidkarten von retroviralen Vektorkonstrukten. pLXSN Flk-1 TM Cl.1 und pLXSN Flk-1 TM cl. 3 enthalten Flk-1 Aminosäuren 1 bis 806. pNTK-cfms-TM enthält die 541 N-terminalen Aminosäuren von c-fms.
  • 13. Inhibierung von C6-Glioblastoma-Tumorwachstum durch transdominant-negative Inhibierung von Flk-1. C6-Zellen wurden entweder allein implantiert oder mit Virus-produzierenden Zellen koimplantiert. Die Zellanzahlen waren wie in jedem Abschnitt angezeigt. Zwei verschiedene Virus-produzierende Zelllinien wurden benutzt: eine, die die Flk-1 TM (transdominant-negative)-Mutante exprimiert und als eine Kontrolle eine, die eine transdominant-negative c-fms-Mutante (c-fms TM) exprimiert. Beginnend zu der Zeit, als die ersten Tumore erschienen, wurden Tumorvolumina alle 2 bis 3 Tage gemessen, um eine Wachstumskurve zu erhalten. Jede Gruppe wird durch vier Mäuse repräsentiert.
  • 14. Inhibierung von C6-Glioblastoma-Tumorwachstum durch transdominantnegative Inhibierung von Flk-1. C6-Zellen wurden entweder allein implantiert oder mit Virus-produzierenden Zellen koimplantiert. Die Zellanzahlen waren wie in jedem Abschnitt angezeigt. Zwei verschiedene Virus-produzierende Zelllinien wurden benutzt: eine, die die Flk-1 TM (transdominant-negative)-Mutante exprimiert, und als eine Kontrolle eine, die eine transdominant-negative c-fms-Mutante (cfms TM) exprimiert. Beginnend mit der Zeit, als der erste Tumor erschien, wurden Tumorvolumina alle 2 bis 3 Tage gemessen, um eine Wachstumskurve zu erhalten. Jede Gruppe wird durch vier Mäuse repräsentiert.
  • 5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinanten Vektoren, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die einen Flk-1 Rezeptor kodiert, der eine Mutation in der zytoplasmatischen Kinasedomäne hat, um Angiogenese und/oder Vaskulogenese zu modulieren.
  • Die Erfindung basiert zum Teil auf Ergebnissen von in situ-Hybridisierung und Northernblot-Analysen, die anzeigen, dass Flk-1 eine Endothelzell-spezifische RTK ist. Zusätzlich haben Quervernetzungs-Experimente gezeigt, dass Flk-1 ein Hochaffinitätsrezeptor für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ist, dies zeigt an, dass Flk-1 eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Differenzierung von Hämangioblasten und in nachfolgendem Endothelzellwachstum während Vaskulogenese und Angiogenese spielt.
  • Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass eine Expression einer transdominant-negativen mutanten Form des Flk-1 Moleküls die biologische Aktivität des endogenen Wildtyp Flk-1 inhibieren kann. Es werden hierin Experimente beschrieben, in welchen Tumorzellen und Zellen, die einen rekombinanten Retrovirus produzieren, der einen trunkierten Flk-1 Rezeptor kodiert, gemischt werden und in Mäuse injiziert werden. Es wurde eine Inhibition von Vaskulogenese und Wachstum der injizierten Tumorzellen in Mäusen beobachtet, die die trunkierte Form des Flk-1 Rezeptors exprimierten. Eine Expression von transdominant-negativen Formen des Flk-1 Mole küls kann für eine Behandlung von Krankheiten, die aus anormaler Proliferation von Blutgefäßen resultieren, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Retinopathien und Wachstum von festen Tumoren, nützlich sein.
  • Wie in den Ausführungsbeispielen unten erklärt, wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR)-Methode benutzt, um neue Rezeptortyrosinkinasen zu isolieren, die spezifisch in post-Implantationsembryonen und Endothelzellen exprimiert werden. Es wurde gefunden, dass ein solcher Klon eine RTK kodiert, die fast identische Sequenzhomologie mit dem kürzlich identifizierten c-DNA-Klon hatte, der aus Zellpopulationen isoliert wurde, die auf hämatopoetische Zellen angereichert waren, und als fötale Leberkinase-1 (Flk-1) bezeichnet wurde (Matthews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9026-9030) (11).
  • Für die Klarheit der Diskussion wird die Erfindung in den folgenden Unterabschnitten beispielhaft für den murinen Flk-1 beschrieben. Die Prinzipien können jedoch analog angewendet werden, um den Flk-1 von anderen Spezies, einschließlich Menschen, zu klonieren und zu exprimieren.
  • 5.1. Die Flk-1 kodierende Sequenz
  • Die kodierende Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des murinen Flk-1 Gens ist in 11 (SEQ. ID NO. 1) dargestellt und wurde kürzlich in Matthews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 9026-9030 beschrieben. Gemäß der Erfindung kann die Nukleotidsequenz des Flk-1 Proteins oder dessen funktionale Äquivalente in Säugetieren, einschließlich Menschen, benutzt werden, um rekombinante Moleküle zu generieren, welche die Expression von Flk-1 leiten: nachstehend wird dieser Rezeptor als „Flk-1" bezeichnet, unabhängig von der Spezies, von welcher er abgeleitet ist.
  • In einer spezifischen Ausführungsform, die hier beschrieben ist, wurde das murine Flk-1 Gen durch Durchführen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert, wobei zwei degenerierte Oligonukleotid-Primerpools benutzt wurden, die auf der Basis von hochkonservierten Sequenzen innerhalb der Kinasedomäne von Rezeptortyrosin kinasen (Hanks et al., 1988) entworfen wurden. Als ein Template wurde DNA von einer λgt10 cDNA-Bibliothek verwendet, die aus Tag 8,5-Mausembryonen hergestellt worden war. In einem parallelen Ansatz wurden gleiche Primer benutzt, um RTK cDNA-Sequenzen von Kapillar-Endothelzellen zu amplifizieren. die von den Gehirnen von postnatalen Tag 4-8-Mäusen isoliert worden waren. Dies ist eine Zeit, zu der die Endothelzell-Proliferation im Gehirn maximal ist. Beide Ansätze ergaben cDNA-Sequenzen, die die kürzlich beschriebene fötale Leber-RTK. Flk-1 (Matthews et al., 1991), kodieren. Basierend auf Aminosäurehomologie ist dieser Rezeptor ein Mitglied der Typ III-Unterklasse von RTKs (Ullrich and Schlessinger), welche in ihren extrazellulären Domänen immunoglobulinartige Wiederholungen enthalten (1).
  • Die Erfindung betriftt auch Flk-1 Gene, die von anderen Spezies. einschließlich Menschen, in welchen Flk-1 Aktivität existiert, isoliert wurden. Mitglieder der Flk-1 Familie werden hier als solche Rezeptoren definiert, die VEGF oder Fragmente von diesem Peptid binden. Solche Rezeptoren können auf der Aminosäureebene etwa 80% Homologie in wesentlichen Teilen der DNA-Sequenz zeigen. Eine cDNA-Bibliothek aus Bakteriophagen kann unter Bedingungen von reduzierter Stringenz gescreent werden, wobei ein radioaktiv markiertes Fragment des Flk-1 Klons aus der Maus verwendet wird. Alternativ dazu kann die Flk-1 Sequenz aus der Maus verwendet werden, um degenerierte oder völlig degenerierte Oligonukleotidproben zu entwerfen, welche als PCR-Proben oder zum Screenen von cDNA-Bibliotheken aus Bakteriophagen benutzt werden können. Eine Strategie, die auf einer Polymerasekettenreaktion (PCR) basiert. kann benutzt werden, um humanen Flk-1 zu klonieren. Zwei Pools von degenerierten Oligonukleotiden, die mit konservierten Motiven zwischen dem Flk-1 aus der Maus und Rezeptortyrosinkinasen korrespondieren, können entworfen werden, um als Primer in einer PCR-Reaktion zu dienen. Das Template für die Reaktion is cDNA, welche durch reverse Transkription von mRNA erhalten wird, welche aus Zelllinien oder Gewebe hergestellt wird, welches dafür bekannt ist, humanen Flk-1 zu exprimieren. Das PCR-Produkt kann subkloniert und sequenziert werden, um sicherzustellen, dass die amplifizierten Sequenzen die Flk-1 Sequenzen repräsentieren. Das PCR-Fragment kann verwendet werden, um durch radioaktives Markieren des amplifizierten Fragments und Screenen einer cDNA-Bibliothek aus Bakteriophagen einen Flk-1 cDNA-Klon voller Länge zu isolieren. Alternativ dazu kann das markierte Fragement verwendet werden, um eine genomische Bibliothek zu screenen. Für einen Überblick über Klonierungsstrategien, welche verwendet werden können, siehe z. B. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; und Ausubel et al.., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
  • Eine Isolierung einer humanen Flk-1 cDNA kann auch durch Konstruktion einer cDNA-Bibliothek in einem Säugetier-Expressionsvektor, wie beispielsweise pcDNAI, erreicht werden, der SV40-Replikationsursprungssequenzen enthält, die eine Expression von Plasmiden in hoher Kopienanzahl erlauben, wenn sie in COS-Zellen transferiert werden. Die Expression von Flk-1 auf der Oberfläche von transfizierten COS-Zellen kann in einer Anzahl von Wegen delektiert werden, einschließlich der Verwendung eines markierten Liganden, wie beispielsweise VEGF oder einem VEGF-Agonisten, der mit einem Radiolabel, fluoreszierendem Label oder einem Enzym markiert ist. Zellen, die den humanen Flk-1 exprimieren, können angereichert werden, indem transfizierte Zellen einer FACS-Sortierung (Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) unterzogen werden.
  • Gemäß der Erfindung können Flk-1 Nukleotidsequenzen, welche Flk-1, Peptidfragmente von Flk-1, Flk-1 Fusionsproteine oder funktionale Äquivalente davon kodieren, benutzt werden, um rekombinante DNA-Moleküle gemäß der Erfindung in geeigneten Wirtszellen zu generieren. Alternativ dazu können Nukleotidsequenzen, welche mit Teilen der Flk-1 Sequenz hybridisieren, auch in Nukleinsäure-Hybridisierungstests, Southern- und Northernblot-Analysen etc. verwendet werden.
  • Wegen der inhärenten Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, welche im wesentlichen die gleiche oder eine funktional äquivalente Aminosäuresequenz kodieren, in der Praxis der Erfindung für die Klonierung und Expression des Flk-1 Proteins benutzt werden. Derartige DNA-Sequenzen umfassen solche, welche in der Lage sind, mit der murinen Flk-1 Sequenz unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
  • Veränderte DNA-Sequenzen, welche gemäß der Erfindung benutzt werden können, umfassen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten, was in einer Sequenz resultiert, die das gleiche oder ein funktional äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Flk-1 Sequenz aufweisen, was in einem stillen Austausch resultiert und damit einen funktional äquivalenten Flk-1 produziert. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipatischen Natur der involvierten Reste gemacht werden. Zum Beispiel umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilizitätswerte haben, umfassen die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin. Wie hier verwendet, bezieht sich ein funktionaläquivalenter Flk-1 auf einen Rezeptor, welcher an VEGF oder Fragmente, aber nicht notwendigerweise mit der selben Bindungsaffinität von seinem Gegenstück, dem nativen Flk-1, bindet.
  • Die DNA-Sequenzen der Erfindung können gestaltet werden, um die Flk-1 kodierende Sequenz für eine Vielzahl von Zwecken zu verändern, dies umfasst Veränderungen, welche ein Prozessieren und eine Expression des Genprodukts modifizieren, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Zum Beispiel können Mutationen unter Verwendung von Techniken, die in der Technik wohlbekannt sind, eingeführt werden, z. B. site-directed Mutagenese, um neue Restriktionsstellen einzuführen, um Glycosylierungsmuster, Phosphorylierung etc. zu verändern. Zum Beispiel können in bestimmten Expressionssystemen, wie beispielsweise Hefe, Wirtszellen das Genprodukt überglycosylieren. Bei Verwendung solcher Expressionssysteme kann es bevorzugt sein, die Flk-1 kodierende Sequenz zu verändern, um jede N-verknüpfte Glycosylierungsstelle zu eliminieren.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann die kodierende Sequenz von Flk-1 unter Verwendung von chemischen Methoden, die in der Technik wohlbe kannt sind, im Ganzen oder in Teilen synthetisiert werden. Siehe z. B. Caruthers, et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215-233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; und Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817. Alternativ dazu kann das Protein selbst unter Verwendung chemischer Methoden produziert werden, um die Flk-1 Aminosäuresequenz im Ganzen oder in Teilen zu synthetisieren. Zum Beispiel können Peptide durch Festphasentechniken synthetisiert, von der Säule gespalten und durch präparative Hochdurchsatz-Flüssigkeitschromatographie gereinigt werden (siehe zum Beispiel Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzieren bestätigt werden (z. B. die Edman Abbau-Methode; siehe Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49).
  • 5.2. Expression von Flk-1 Rezeptor und Generierung von Zelllinien, die Flk-1 exprimieren
  • Um einen biologisch aktiven Flk-1 zu exprimieren, wird die Nukleotidsequenz, die für Flk-1 oder ein funktionales Äquivalent, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, in einen geeigneten Expressionsvektor, z. B. einen Vektor, welcher die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten kodierenden Sequenz aufweist, inseriert. Sowohl die Flk-1 Genprodukte als auch Wirtzellen oder Zelllinien, die mit rekombinanten Flk-1 Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert sind, können für eine Vielzahl von Zwecken benutzt werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, das Herstellen von Antikörpern (z. B. monoklonal oder polyklonal), die an den Rezeptor binden, einschließlich solcher, die ein Binden von VEGF kompetitiv inhibieren und die Aktivität von Flk-1 „neutralisieren", und das Screenen und Selektieren von VEGF-Analogen oder Wirkstoffen, die über den Flk-1 Rezeptor wirken; etc.
  • 5.2.1. Expressionssysteme
  • Methoden, die Fachleuten wohl bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Flk-1 kodierende Sequenz und geeignete transkriptionale/translationale Kontrollsignale aufweisen. Diese Methoden umfassen rekombinante in vitro-DNA-Techniken, synthetische Techniken und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination. Siehe z. B. die Techniken, die in Maniatis et al.., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al.., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., beschrieben sind.
  • Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektorsystemen kann verwendet werden, um die Flk-1 kodierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht Geschränkt darauf, Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die die Flk-1 kodierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Hefe, die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren transformiert ist, die die Flk-1 kodierende Sequenz enthalten; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Baculovirus), die die Flk-1 kodierende Sequenz enthalten; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabak-Mosaikvirus, TMV) oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die die Flk-1 kodierende Sequenz enthalten; oder tierische Zeitsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Adenovirus, Vaccinia-Virus), einschließlich Zelllinien, die so gestaltet sind, dass sie multiple Kopien der Flk-1 DNA entweder stabil amplifiziert (CHO/dhfr) oder instabil amplifiziert in „douple-minute"-Chromosomen (z. B. murine Zelllinien) enthalten.
  • Die Expressionselemente dieser Systeme variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirtswektorsystem kann jedes von einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, in dem Expressionsvektor verwendet werden.
  • Zum Beispiel können beim Klonieren in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren wie beispielsweise pL des Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac Hybrid-Promotor) und dergleichen verwendet werden; beim Klonieren in Insektenzellsystemen können Promotoren wie der Baculovirus-Polyhedrinpromotor verwendet werden; beim Klonieren in Pflanzenzellsystemen können Promotoren, die vom Genom von Pflanzenzellen abgeleitet sind (z. B. Hitzeschockpromotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promoter für das Chlorophyll a/b-Bindungsprotein) oder von Pflanzenviren (z. B. der 35S RNA-Promotor von CaMV; der Hüllprotein-Promotor von TMV) benutzt werden; beim Klonieren in Säugetierzellsystemen können Promotoren, die vom Genom von Säugetierzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugetier-Viren (z. B. der Adenovirus späte Promotor; der Vaccinia-Virus 7,5K-Promotor) stammen, benutzt werden; beim Generieren von Zelllinien, die multiple Kopien der Flk-1 DNA enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierenden Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker benutzt werden.
  • In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise selektiert werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung für das exprimierte Flk-1. Wenn z. B. große Quantitäten von Flk-1 für die Generierung von Antikörpern oder zum Screenen von Peptid-Bibliotheken zu produzieren sind, können Vektoren, welche die Expression von hohen Leveln von Fusionsprotein-Produkten leiten, die leicht zu reinigen sind, gewünscht sein. Solche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al.., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem die Flk-1 kodierende Sequenz in den Vektor in frame mit der lac Z kodierenden Region ligiert sein kann, so dass ein hybrides AS-lac Z-Protein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1935, Nucleic acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); und derartige. pGEX-Vektoren können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide, wie beispielsweise Fusionsproteine mit Glutathione S-Transferase (GST), zu exprimieren. Im allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht von lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarosekügelchen, gefolgt von einer Elution in der Gegenwart von freien Glutathion, gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so gestaltet, dass sie Thrombin- oder Faktor Xa-Protease-Spaltungsstellen umfassen, so dass das klonierte Polypeptid von Interesse von dem GST-Rest freigesetzt werden kann.
  • In Hefe kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, verwendet werden. Für einen Überblick siehe Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al.., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al.., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press. N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C., Ch. 3; und Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press. N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I und II.
  • In Fällen, wo Pflanzenexpressionsvektoren benutzt werden, kann die Expression der Flk-1 kodierenden Sequenz von irgendeinem von einer Anzahl von Promotoren geführt werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie beispielsweise die 35S RNA- und 19S RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511-514), oder der Hüllprotein-Promotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307-311) benutzt werden; alternativ dazu können Pflanzenpromotoren wie die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al.., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838-843) oder Hitzeschockpromotoren, z. B. hsp17.5-E oder hsp17.3-B aus Sojabohne (Gurley et al.., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559-565) benutzt werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzen-Virusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation etc. eingeführt werden. Als Übersichtartikel für diese Techniken siehe z. B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463 und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9.
  • Ein alternatives Expressionssystem, welches zum Exprimieren von Flk-1 benutzt werden kann, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird der nukleäre Polyhidrosis-Virus aus Autographa californica (AcNPV) als ein Vektor zum Exprimie ren fremder Gene benutzt. Der Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Flk-1 kodierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen (z. B. das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. der Polyhedrinpromotor) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion der Flk-1 kodierenden Sequenz wird in einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und einer Produktion eines nicht verdeckten (non-occluded) rekombinanten Virus (z. B. ein Virus, dem die proteinöse Hülle fehlt, die durch das Polyhedrin-Gen kodiert wird) resultieren. Diese rekombinanten Viren werden dann benutzt, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das inserierte Gen exprimiert wird (siehe z. B. Smith et al.., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051).
  • In Säugetier-Wirtszellen können eine Anzahl von auf Viren basierenden Expressionssystemen benutzt werden. In Fällen, in welchen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor benutzt wird, kann die Flk-1 kodierende Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. die späte Promotor und Tripartite-Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination inseriert werden. Eine Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, der lebensfähig ist und in der Lage ist, Flk-1 in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe z. B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655-3659). Alternativ dazu kann der Vaccinia 7,5K-Promotor benutzt werden (siehe z. B. Macken et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419; Macken et al.., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931).
  • Spezifische Initierungssignale können ebenso für eine effiziente Translation von inserierten Flk-1 kodierenden Sequenzen benötigt werden. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, in welchen das gesamte Flk-1 Gen, einschließlich dessen eigenen Initiationscodons und angrenzende Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, werden möglicherweise keine weiteren Translations-Kontrollsignale benötigt. Dennoch müssen in Fällen, in welchen nur ein Teil der Flk-1 kodierenden Sequenz inseriert wird, exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, bereitgestellt wer den. Weiterhin muss das Initiationscodon in Phase mit dem reading frame der Flk-1 kodierenden Sequenz sein, um eine Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiationscodons können viele Ursprünge haben, sowohl natürliche als auch synthetische. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss von geeigneten Transkriptions-Verstärkerelementen, Transkriptions-Terminatoren etc. verstärkt werden (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).
  • Weiterhin kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, welcher die Expression der inserierten Sequenzen moduliert, oder der das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Art modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten kann für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für das post-translationale Prozessieren und Modifizieren von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die korrekte Modifizierung und Prozessierung des fremden exprimierten Proteins zu gewährleisten. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen, welche die zelluläre Maschinerie für eine korrekte Prozessierung des primären Transkripts, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen, benutzt werden. Solche Säugetier-Wirtszellen umfassen CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc., sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Für eine Langzeitproduktion mit hoher Ausbeute von rekombinanten Proteinen ist eine stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, welche den Flk-1 stabil exprimieren, hergestellt werden. Eher als dass Expressionsvektoren benutzt werden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit der Flk-1 DNA, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (z. B. Promotor, Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylisierungsstellen etc.) kontrolliert wird, und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Im Anschluss an die Einführung von fremder DNA können die manipulierten Zellen für ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium kultiviert werden und dann auf ein selektives Medium umgestellt werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz für die Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid in ihre Chromosomen stabil zu integrieren und zu wachsen, um Klone (foci) zu bilden, welche wiederum kloniert und zu Zelllinien expandiert werden können. Dieses Verfahren kann mit Vorteil eingesetzt werden, um Zelllinien herzustellen, welche den Flk-1 auf der Zelloberfläche exprimieren, und welche auf VEGF-vermittelte Signaltransduktion reagieren. Solche hergestellten Zelllinien sind insbesondere beim Screening von VEGF-Analogen nützlich.
  • Eine Anzahl von Selektionssystemen kann benutzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, können die Gene für Herpes Simplex Virus Thymidin-Kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), Hypoxanthinguanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) in tk-, hgprt- bzw, aprt Zellen eingesetzt werden. Antimetabolit-Resistenzen können ebenfalls als die Basis einer Selektion für die Gene dhfr, welches eine Resistenz für Methotrexat verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, welches eine Resistenz für Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, welches eine Resistenz für das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) und hygro, welches eine Resistenz für Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147), benutzt werden. Kürzlich wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, und zwar trpB, welches den Zellen ermöglicht, Indol anstatt Tryptophan zu verwerten; hisD, welches den Zellen ermöglicht, Histinol anstatt Histidin zu verwerten (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047), und ODC (Ornithin-Decarboxylase), welches eine Resistenz für den Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor, 2-(Difluoromethyl)-DL-Ornithin, DFMO (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.), verleiht.
  • 5.2.2. Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, die Flk-1 exprimieren
  • Die Wirtszellen, welche die kodierende Sequenz enthalten, und welche das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch zumindest vier allgemeine Ansätze identifiziert werden; (a) DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung; (b) die Gegenwart oder Abwesenheit von „Marken"-Genfunktionen; (c) Feststellen des Transkriptionslevels, wie er durch die Expression von Flk-1 mRNA-Transkripten in der Wirtszeile gemessen wird; und (d) Defektion des Genprodukts, wie es durch einen Immunotest oder durch dessen biologische Aktivität gemessen wird.
  • In dem ersten Ansatz kann die Gegenwart der Flk-1 kodierenden Sequenz, die in den Expressionsvektor inseriert ist, durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung bei Verwendung von Proben, die Nukleotidsequenzen umfassen, die homolog zu der Flk-1 kodierenden Sequenz bzw. Teilen oder Derivaten davon sind, delektiert werden.
  • In dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirts-Expressionssystem auf der Basis der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten „Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz für Antibiotika, Resistenz für Methotrexat, Transformationsphenotyp, Occlusionskörperbildung in Baculovirus etc.) identifiziert und selektiert werden. Zum Beispiel können, wenn die Flk-1 kodierende Sequenz innerhalb einer Markergensequenz des Vektors inseriert ist, Rekombinante, die die Flk-1 kodierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Marken-Genfunktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markengen in Tandemanordnung mit der Flk-1 Sequenz unter der Kontrolle desselben oder eines anderen Promotors platziert werden, der benutzt wird, um die Expression der Flk-1 kodierenden Sequenz zu kontrollieren. Eine Expression des Markers als Antwort auf eine Induktion oder Selektion indiziert eine Expression der Flk-1 kodierenden Sequenz.
  • In dem dritten Ansatz kann eine transkriptionale Aktivität für die Flk-1 kodierende Region durch Hybridisierungstests bewertet werden. Zum Beispiel kann RNA isoliert und durch Northernblot unter Verwendung einer Probe, die homolog zu der Flk-1 kodierenden Sequenz oder bestimmten Teilen davon ist, analysiert werden. Alternativ dazu können die gesamten Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und auf eine Hybridisierung mit solchen Proben getestet werden.
  • In dem vierten Ansatz kann die Expression des Flk-1 Proteinprodukts immunologisch bewertet werden, z. B. durch Westernblots, Immunotests, wie beispielsweise Radioimmunopräzipitation, enzymverknüpfte Immunotests und derartiges. Der endgültige Test des Erfolgs des Expressionssystems umfasst jedoch die Defektion des biologisch aktiven Flk-1 Genprodukts. Eine Anzahl von Tests kann eingesetzt werden, um eine Rezeptoraktivität zu delektieren, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, VEGF-Bindungstests und biologische VEGF-Tests unter Verwendung von manipulierten Zelllinien als das Testsubstrat.
  • 5.3. Verwendung des Flk-1 Rezeptors und manipulierter Zelllinien
  • Angiogenese, das Wachstum von neuen Blutkapillargefäßen, wird für eine Anzahl von physiologischen Prozessen benötigt, die von Wundheilung, Gewebe- und Organregeneration, Plazentabildung nach Schwangerschaft bis zur embryonalen Entwicklung reichen. Eine anormale Proliferation von Blutgefäßen ist eine wichtige Komponente bei einer Vielzahl von Krankheiten, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Retinopathien und Psoriasis. Angiogenese ist ebenfalls ein wichtiger Faktor beim Wachstum und der metastatischen Aktivität von festen Tumoren, die auf eine Vaskularisierung angewiesen sind. Daher können Inhibitoren der Angiogenese therapeutisch für die Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die aus anormalem Wachstum von Blutgefäßen resultieren oder davon begleitet sind, und für Behandlungen von malignen Erkrankungen, die ein Wachstum und Ausbreiten von festen Tumoren mit sich bringen.
  • 5.4. Verwendung von dominant-negativen Flk-1 Mutanten in der Gentherapie
  • Es wird überlegt, dass Rezeptordimerisierung, die durch Liganden induziert ist, ein allosterisches regulatorisches Signal bereitstellt, das so funktioniert, dass eine Ligandenbindung mit einer Stimulierung von Kinaseaktivität gekoppelt wird. Fehlerhafte Rezeptoren können als dominant-negative Mutationen funktionieren, indem die Aktivierung und Antwort von normalen Rezeptoren durch Bildung von unproduktiven Heterodimeren unterdrückt wird. Daher können fehlerhafte Rezeptoren in rekombinante virale Vektoren eingefügt werden und in einer Gentherapie in Individuen verwendet werden, die Flk-1 unangemessen exprimieren.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung können mutante Formen des Flk-1 Moleküls, die einen dominant-negativen Effekt aufweisen, durch Expression in selektierten Zellen identifiziert werden. Deletions- oder Missens-Mutanten von Flk-1, die die Fähigkeit zum Formen von Dimeren mit dem Wildtyp Flk-1 Protein beibehalten haben, aber nicht in der Signaltransduktion funktionieren können, können benutzt werden, um die biologische Aktivität des endogenen Wildtyp Flk-1 zu inhibieren. Zum Beispiel kann die zytoplasmatische Kinasedomäne von Flk-1 deletiert werden, was in einem trunkierten Flk-1 Molekül resultiert, das immer noch in der Lage ist, sich einer Dimerisierung mit endogenen Wildtyp Rezeptoren zu unterziehen, aber nicht in der Lage ist, ein Signal zu vermitteln.
  • Eine anormale Proliferation von Blutgefäßen ist eine wichtige Komponente einer Vielzahl von pathogenen Funktionsstörungen, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Retinopathien und Psoriasis. Eine unkontrollierte Angiogenese ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei dem Wachstum und bei Metastasen von festen Tumoren. Rekombinante Viren können hergestellt werden, um dominant negative Formen von Flk-1 zu exprimieren, welche verwendet werden können, um die Aktivität des endogenen Wildtyp Flk-1 zu inhibieren. Diese Viren können therapeutisch für eine Behandlung von Krankheiten benutzt werden, die aus einer abweichenden Expression oder Aktivität von Flk-1 resultieren.
  • Expressionsvektoren, die von Viren wie beispielsweise Retroviren, Vaccinia-Virus, Adeno-assoziierter Virus, Herpes-Viren oder bovinem Papilloma-Virus abstammen, können für eine Abgabe von rekombinantem Flk-1 in die angezielte Zellpopulation benutzt werden. Verfahren, die Fachleuten wohl bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren, die eine Flk-1 kodierende Sequenz enthalten, zu konstruieren. Siehe z. B. die Techniken, die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.. Alternativ dazu können rekombinante Flk-1 Moleküle zur Abgabe in Zielzellen in Liposomen rekonstituiert werden.
  • In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung wurde eine Deletionsmutante des Flk-1 Rezeptors in einen rekombinanten retroviralen Vektor eingefügt. Zwei klonale Isolate, bezeichnet als pLXSN Flk-1 TM cl.1 und pLXSN Flk-1 TM cl.3, enthalten einen trunkierten Flk-1 Rezeptor, dem die 561 COOH-terminalen Aminosäuren fehlen. Um Virus-produzierende Zelllinien zu erhalten, wurden PA37-Zellen mit den rekombinanten Vektoren transfiziert und anschließend wurden konditionierte Medien, welche Viren enthielten, zum Infizieren von GPE-Zellen benutzt.
  • Um zu testen, ob eine Expression von in der Signalgebung defekten Mutanten endogene Flk-1 Rezeptoraktivität inhibiert, wurden C6-Glioblastomazellen aus der Ratte (Tumorzellen) und Mauszellen, die die rekombinanten Retroviren produzierten, gemischt und subkutan in nackte Mäuse injiziert. Normalerweise würde eine Injektion von Tumorzellen in nackte Mäusen in einer Proliferation der Tumorzellen und einer Vaskularisierung der resultierenden Tumormasse resultieren. Da angenommen wird, dass Flk-1 essentiell für die Bildung von Blutgefäßen ist, könnte ein Blockieren von Flk-1 Aktivität durch Expression eines trunkierten Rezeptors so wirken, dass eine Vaskularisierung des sich entwickelnden Tumors inhibiert und dabei dessen Wachstum inhibiert würde. Wie in den 13 und 14 dargestellt, inhibiert eine Koinjektion von Virus-produzierenden Zellen, die einen trunkierten Flk-1 Rezeptor exprimieren, signifikant das Wachstum des Tumors verglichen mit Kontrollen, die nur Tumorzellen erhielten.
  • 6. BEISPIEL: Klonierung und Expressionsmuster von Flk-1, ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF
  • Der Unterabschnitt unten beschreibt das Klonieren und eine Charakterisierung des Flk-1 cDNA-Klons. Northernblot- und in situ-Hybridisierungsanalysen zeigen, dass Flk-1 in Endothelzellen exprimiert wird. Quervernetzungs- und Ligandenbindungsexperimente zeigen weiterhin, dass Flk-1 ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF ist.
  • 6.1. Material und Methoden 6.1.1. cDNA-Klonierung von Flk-1
  • DNA, die aus einer λgt10 cDNA-Bibliothek von Tag 8,5-Mausembryonen (Fahrner et al., 1987, EMBO. J. 6: 1497-1508) extrahiert wurde, wurde als Template für eine Polymerasekettenreaktion (PCR; Saiki, R. K. et al., 1985 Science 230: 1350-1354) benutzt. In einem unabhängigen Ansatz wurde cDNA von kapillaren Endothelzellen, die aus dem Gehirn von postnatalen Tag 4-8-Mäusen isoliert worden war, für eine Amplifikation benutzt (Risau, W., 1990 In: development of the Vascular System. Issues Biomed. Basel Karger 58-68 und Schnürch et al., unveröffentlicht). Degenerierte Primer wurden auf der Basis von hohen Aminosäurehomologien innerhalb der Kinasedomäne entworfen, die von allen RTKs geteilt wird (Wilks, A. F., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 1603-1607).
  • cDNA-Klone von Flk-1 voller Länge wurden von einer anderen Tag 8,5-Mausembryo-cDNA-Bibliotek isoliert, welche gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg (1983) präpariert worden war, und von einer Tag 11,5-Mausembryo-λgt11-Bibliothek (Clonetech) unter Verwendung des 32P-markierten 210 by PCR-Fragments (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. 1983 Anal. Biochem. 132: 6-13).
  • 6.1.2. Mausembryonen
  • Balb/c-Mäuse wurden über Nacht gepaart und der Morgen der vaginalen Plugdetektion wurde als 1/2 Tag der Trächtigkeit definiert. Für Northernblot-Analysen wurden die gefrorenen Embryonen in 5 M Guanidiniumthiocyanat homogenisiert, und RNA wurde wie beschrieben isoliert (Ullrich, A. et al., 1985, Nature 313: 756-561). Für eine in situ-Hybridisierung wurden die Embryonen in Tissue-Tek (Miles) eingebettet, an der Oberfläche von flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C vor der Verwendung gelagert.
  • 6.1.3. Präparation von Proben
  • Die 5'-lokalisierten 2619 by der Rezeptor-cDNA wurden in den pGem3Z-Vektor (Promega) als ein EcoRl/BamHI-Fragment subkloniert. Die Probe für Northernblot-Hybridisierung wurde durch Markieren des cDNA-Fragments mit α-32P dATP (Amersham) durch zufälliges Hexanukleotid-Priming (Boehringer; Feinberg, A. P. and Vogelstein, B., 1983 Anal. Biochem. 132: 6-13) hergestellt.
  • Für eine in situ-Hybridisierung wurde eine einzelsträngige Antisense-DNA-Probe, wie von Schnürch und Risau (Development, 1991 111: 1143-54) beschrieben, hergestellt. Das Plasmid wurde an dem 3'-Ende der cDNA linearisiert, und ein Sense-Transkript wurde unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase (Boehringer) synthetisiert. Die DNA wurde unter Verwendung von DNAase (RNAase-freie Präparation, Boehringer Mannheim) degradiert. Mit dem Transkript wurde eine zufällig geprimte cDNA-Synthese mit α-35S dATP (Amersham) durch reverse Transkription mit MMLV reverser Transkriptase (BRL) durchgeführt. Um kleine cDNA-Fragmente von etwa 100 by im Durchschnitt zu erhalten, die für eine in situ-Hybridisierung geeignet sind, wurde ein hoher Überschuss an Primer benutzt. Anschließend wurde das RNA-Transkript partiell in 100 mM NaOH für 20 Minuten bei 70°C hydrolysiert, und die Probe wurde mit derselben Menge von HCl neutralisiert und mit einer Sephadex C50-Säule gereinigt. Nach Ethanolfällung wurde die Probe mit einer finalen spezifischen Aktivität von 5 × 105 cpm aufgelöst. Für eine Kontrollhybridisierung wurde eine Sense-Probe mit der gleichen Methode präpariert.
  • 6.1.4. RNA-Extraktion und Northern-Analyse
  • Gesamte zytoplasmatische RNA wurde gemäß der sauren Phenol-Methode von Chromczynski und Sacchi (1987) isoliert. Aliquots von Poly(A+)-RNA wurden einer Elektrophorese in 1,2% Agaroseformaldehydgelen (Sambrook, J. et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press) unterzogen und auf Nitrozellulosemembranen (Schleicher & Schuell) übertragen, Hybridisierungen wurden über Nacht in 50% Formamid, 5 × SSC (750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat), 5 × Denhardt's (0,1% Ficoll 400, 0,1% Polyvinylpryollidon, 0,1% BSA) und –0,5% SDS bei 42°C mit 1-3 × 106 cpm-ml-1 von mit 32P zufällig geprimter DNA-Probe durchgeführt, gefolgt von hochstringenten Waschgängen in 0,2 × SSC, 0,5% SDS bei 52°C. Die Filter wurden für 4 bis 8 Tagen exponiert.
  • 6.1.5. In situ-Hybridisierung
  • Subklonierungs-Postfixierung und Hybridisierung wurde im wesentlichen gemäß Hogan et al. (1986) durchgeführt. 10 μm dicke Schnitte wurden bei –18°C auf einem Leitz-Cryostat geschnitten. Für eine Prähybridisierungsbehandlung wurde keine Inkubation mit 0,2 M HCl zum Entfernen der basischen Proteine durchgeführt. Die Schnitte wurden mit der 35S-cDNA-Probe (5 × 104cpm/μl) bei 52°C in einem Puffer inkubiert, der 50% Formamid, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaPO4(pH 6,8), 5 mM EDTA, 0,02% Ficoll 400, 0,01% Polyvinylprolidon, 0,02% BSA 10 m /ml Hefe-RNA, 10% Dextransulfat, und 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaPO4 (pH 6,8), 5 mM EDTA, 10 mM DTT (bei 52°C) enthielt. Für eine Autoradiographie wurden Objekträger mit Kodak NTB2 Filmemulsion beschichtet und für acht Tage exponiert. Nach der Entwicklung wurden die Schnitte mit Toluidinblau oder May-Grinwald gegengefärbt.
  • 6.1.6. Herstellung von Antiseren
  • Das 3' geprimten EcoRV/HindII-Fragment, das die 128 C-terminalen Aminosäuren von Flk-1 umfasst, wurde in den Fusionprotein-Expressionsvektor pGEX3X (Smith, D. B. and Johnson, K. S., 1990 Gene. 67: 31-40; Pharmacia) subkloniert. Das Fusionsprotein wurde wie beschrieben gereinigt und zum Immunisieren von Kaninchen benutzt. Nach dem zweiten Boost wurden die Kaninchen ausgeblutet und das Antiserum wurde für eine Immunopräzipitation benutzt.
  • 6.1.7. Transiente Expression von Flk-1 in COS-1-Zellen
  • Eine Transfektion von COS-1-Zellen wurde im wesentlichen wie von Chen und Okayama (1987 Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752) und Gorman et al. (1989 Virology 171: 377-385) beschrieben, durchgeführt. Kurz dargestellt wurden Zellen bei einer Dichte von 1,0 × 106 pro 10 cm-Schale ausgesät und über Nacht in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum (Gibco), inkubiert. 20 μg von Rezeptor-cDNA, die in einen Expressionsvektor unter der Führung eines Cytomegalovirus-Promotors kloniert war, wurde in 0,5 ml 0,25 M CaCa2, 0,5 ml 2 × BBS (280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 mM BES, pH 6,96) gemischt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kalziumphosphat/DNA-Lösung wurde dann zu den Zellen gegeben, vorsichtig verwirbelt und für 18 Stunden bei 37°C und 3% CO2 inkubiert. Für Ligandenbindungsexperimente wurden die Zellen von der Platte entfernt und wie unten beschrieben behandelt.
  • Um VEGF-konditionierte Medien zu erhalten, wurden Zellen in 15 cm-Schalen transfiziert. Medium wurde nach 48 Stunden gesammelt, und VEGF wurde durch Affinitätschromotographie unter Verwendung von Heparin High Trap TM-Säulen (Pharmacia) teilweise gereinigt und durch Ultrafiltration (Ferrara, N. and Henzel, W. J. 1989 Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851-858) konzentriert. Die Konzentration von VEGF wurde durch einen Ligandenkompetitionstest mit bovinen aortischen Endothelzellen bestimmt.
  • Für Autophosphorylierungstests wurden Zellen in 6-Lochplatten (2 × 105 Zellen pro Loch) ausgesät, wie oben beschrieben transfiziert und für 24 Stunden in DMEM, enthaltend 0,5% fötales Kälberserum, ausgehungert. Die Zellen wurden dann mir 500 pM VEGF für 10 Minuten bei 37°C behandelt oder unbehandelt gelassen und wurden anschließend, wie von Kris et al. (1985) beschrieben, lysiert. Flk-1 wurde mir einem Antiserum immunopräzipitiert, welches in Kaninchen gegen den C-Terminus des Rezeptors erzeugt worden war. Die Immunopräzipitate wurden auf einem 7,5% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit einem monoklonalen Antikörper aus der Maus, der gegen Phosphotyrosin gerichtet ist (5E2; Fendly, B. M. et al., 1990 Cancer Research 50: 1550-1558), inkubiert. Proteinbanden wurden unter Verwendung von mit Merrettichperoxidase-gekoppeltem Ziege Anti-Maus Antikörper und dem ECLTM (Amersham)-Detektionsystem sichtbar gemacht.
  • 6.1.8 Radioiodierung von VEGF
  • Rekombinanter humaner VEGF (5 μg; großzügigerweise von Dr. H. Weich zur Verfügung gestellt) wurde in 110 μl Natriumphosphat-Puffer pH 7,6 gelöst und nach dem Verfahren von Hunter und Greenwood (1962) iodiert. Diese Reaktionsprodukte wurden von dem markierten Protein durch eine Passage über eine Sephadex G50-Säule, die mit phosphatgepufferte Saline (PBS), enthaltend 0,7% bovines Serumalbumin (BSA), vorequilibriert war, getrennt, und Aliquots von den gesammelten Fraktionen wurden vor und nach Präzipitation mit 20% Trichloressigsäure gezählt. Die Reinheit des iodierten Produktes wurde höher als 90% eingeschätzt, wie durch Elektrophorese bestimmt wurde, und die spezifische Aktivität war 77000 cpm/ng. Die Bioaktivität des iodierten VEGF wurde durch Vergleich mit den Bioaktivitäten von nativem VEGF unter Verwendung des Gewebefaktor-Einführungstest, wie von Clauss, M. et al. (1990 J. Exp. Med. 172: 1535-1545) beschrieben, bestätigt.
  • 6.1.9. Quervernetzung von VEGF an Flk-1
  • COS-1-Zellen, die Flk-1 transient exprimieren, und nicht transfizierte COS-1-Zellen wurden mit 200 pM 125I-VEGF bei 4°C über Nacht inkubiert, dann zweimal mit PBS gewaschen und 0,5 mM Disuccinimidylsuberat (DSS) in PBS für eine Stunde bei 4°C ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert, Flk-1 immunopräzipitiert und durch Elektrophorese auf einem 7% Polyacrylamidgel gefolgt von Autoradiographie analysiert.
  • 6.1.10. VEGF-Bindung
  • Ligandenbindungexperimente wurden wie früher beschrieben (Schumacher, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 19288-19295) durchgeführt, COS-1-Zellen wurden in einer 15 cm-Kulturschale in DMEM für 48 Stunden nach Transfektion kultiviert. Die Zellen wurden dann vorsichtig mit PBS gewaschen und mit 5 ml 25 nM EDTA in PBS für 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann von der Platte entfernt, einmal mit Bindungspuffer (DMEM, 25 mM HEPES, pH 7,5, 0,15% Gelatine) gewaschen und in 5 ml Bindungspuffer zum Bestimmen der Zellzahl resuspendiert. In einem gesamten Volumen von 500 μl wurde diese Zensuspension für 90 Minuten bei 15°C mir 10 pM 125I-VEGF und ansteigender Konzentration von nicht markiertem Liganden (von 0 bis 7 × 10-9) inkubiert, welcher aus konditionierten Medien von COS-1-Zellen, die transient VEGF exprimierten (164 Aminosäureform; Breier et al., 1992), teilweise gereinigt war. Nach Inkubation wurden die Zellen mit PBS 0,1% PBS in der Kälte gewaschen. Freie Liganden wurden durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension in Bindungspuffer entfernt. Schließlich wurde die 125I-Radioaktivität, die an die Zellen gebunden war, in einem Gammacounter (Riastar) bestimmt. Erhaltene Daten wurden durch die Methode von Munson, P. J. und Rodbard, D. (1980 Anal. Biochem. 107: 220-235) analysiert.
  • 6.1.11. Retrovirale Vektoren, die transdominant-negative Mutanten von Flk-1 kodieren
  • Rekombinante retrovirale Vectoren, die die kodierende Region für die Aminosäuren 1 bis 806 des Flk-1 Rezeptors (pLX Flk-1 cl.1 und cl.3, 12) enthalten, wurden konstruiert. Ein rekombinanter Virus, der eine trunkierte c-fms-Rezeptormutante (pNTK cfms TM cl. 7) enthielt, wurde als eine Kontrolle verwendet. Um Virusproduzierende Zellen zu erhalten, wurden GPE-Zellen aus der Maus mit amphotropischen Virus-enthaltenden konditionierten Medien von PA317-Zellen, die mit rekombinanter retrovitaler DNA transfiziert worden waren, infiziert. C6-Glioblastoma-Tumorzellen wurden in nackte Mäuse entweder allein implantiert oder mit Virusproduzierenden Zellen koimplantiert. Anzahlen der injizierten Zellen für die zwei Ansätze von Experimenten sind unten angezeigt. Beginnend mit der Zeit, als die ersten Tumoren erschienen, wurden alle 2 bis 3 Tage Tumorvolumina gemessen, um eine Wachstumskurve zu erhalten.
  • Experiment Nr. 1
    Figure 00290001
    Experiment Nr. 2
    Figure 00290002
  • 6.2. Ergebnisse
  • 6.2.1. Isolierung von Flk-1
  • Um RTKs zu identifizieren, die während der Mausenentwicklung exprimiert werden, wurden PCR-Tests einer Verwendung von zwei degenerierten Oligonukleotidprimer-Pools durchgeführt, die auf der Basis von hochkonservierten Sequenzen innerhalb der Kinasidomäne von RTKs entworfen worden waren (Hanks. S. K. et al., 1988. Science 241: 42-52). DNA, die von einer λgr10 cDNA-Bibliothek von Tag 8.5-Mausembryonen (Fahrner, K. et al., 1987, EMBO. J., 6: 1497-1508) extrahiert worden war, ein Stadium in der Mausentwicklung, bei welchem viele Differenzierungsprozesse beginnen, wurde als ein Template in den PCR-Tests verwendet. In einem parallelen Ansatz mit dem Ziel, RTKs zu identifizieren, die Angiogenese regulierien, wurden ähnliche Primen für die Amplifizierung von RTK cDNA-Sequenzen aus Kapillar-Endothelzellen benutzt, die von den Gehirnen von postnatalen Tag 4–8-Mäusen isoliert worden waren, einer Zeit, zu welcher die Proliferation von Endothelzellen im Gehirn maximal ist (Robertson, P. L. et al., 1985. Devel. Brain Res. 23: 219-223). Beide Ansätze ergaben cDNA-Sequenzen (11, SEQ. ID No.:), die die kürzlich beschriebene fötale Leber-RTK, Flk-1 (Matthews, W. et al., 1991, Proc. Natl.
  • Acad. Sci. U.S.A. 88: 9026-9030), kodieren. Basierend auf Aminosäurehomologie ist dieser Rezeptor ein Mitglied der Typ III-Unterklasse von RTKs (Ullrich, A. and Schlessinger, J. 1990, Cell 61: 203-212), und ist nahe verwandt nur humanem flt, welches ebenfalls sieben immunoglobinartige Wiederholungen in seiner extrazellulären Domäne im Gegensatz zu anderen RTKs dieser Unterfamilie enthält, welche nur fünf solcher Wiederholungsstrukturen enthalten (Matthews, W. et al., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A 88: 9026-9030). Sequenzvergleiche von Flk-1 mit KDR (Terman, B. I. et al., 1991, Oncogene 6: 1677-1683) und TKr-C (Sarzani, R. et al., 1992, Biochem, Biophys. Res. Comm. 186: 706-714) weisen darauf hin, dass diese die humanen Homologe bzw. Homologe aus der Ratte von Flk-1 sind (1).
  • 6.2.2. Expression von Flk-1 mRNA während der embryonalen Entwicklung
  • Als ein erster Schritt zu der Erhellung der biologischen Funktion von Flk-1 wurde die Expression von Flk-1 mRNA in Mausembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien analysiert. Northernbtot-Hybridisierungsexperimente zeigten eine abundante Expression von einer hauptsächlichen 5,5 kb mRNA zwischen Tag 9,5 und Tag 18,5 mit einer apparenten Abnahme zum Ende der Trächtigkeit hin (2A). Es wurde gefunden, dass Flk-1 mRNA in postnatalen Tag 4–8-Kapillargefäßen des Gehirns verglichen mit gesamter mRNA des Gehirns hoch angereichert ist (2B).
  • In situ-Hybridisierungsexperimente wurden durchgeführt, um detailliertere Information über die Expression von Flk-1 während verschiedener embryonaler Stadien zu erhalten. Eine einzelsträngige Antisense-DNA-Probe von 2619 Nukleotiden Länge, die die Flk-1 extrazelluläre Domaine umfasst, wurde als eine Probe verwendet, da sie die am meisten spezifischen Hybridisierungssignale ergab. Als ein Beispiel ist ein parasagittaler Schnitt von einem Tag 14,5 – Embryo in 3 gezeigt. Hohe Hybridisierungslevel wurden in den Ventrikeln des Herzens, in der Lunge und der Hirnhaut delektiert; andere Gewebe wie beispielsweise Gehirn, Leber und Mandibula schienen weniger Zellen zu enthalten, die Flk-1 mRNA exprimieren. Dünne Stränge von Flk-1 Expression wurden auch in den intersegmentalen Regionen der Wirbel und an der inneren Oberfläche des Atriums und der Aorta beobachtet. Eine höhere Vergrößerung zeigte, dass die Expression von Flk-1 auf Kapillaren und Blutgefäße beschränkt zu sein scheint. Eine nähere Untersuchung des Herzens z. B. zeigte nur in den ventrikulären Kapillaren und in der endothelialen Auskleidung des Atriums positive Signale (4A). In der Lunge wurde eine Flk-1 Expression in peribronchialen Kapillaren delektiert, war aber in bronchialem Epithelium abwesend (4D). Die Aorta zeigte eine starke Hybridisierung in Endothelzellen, aber nicht in der muskulären Schicht (4C).
  • 6.2.3. Expression von Flk-1 während Organangionese
  • Das Neuroektoderm in dem Telencephalon von einem Tag 11,5-Mausembryo ist weitgehend avaskulär; die ersten vaskulären Sprossen beginnen, entspringend von dem perineuralen vaskulären Plexus, radial in das Organ einzudringen (Bär, J., 1980, Adv. Anal. Embryol. Cell. Biol. 59: 1-62 ; Risau, W. and Lemmon, V. 1988, Dev. Biol. 125: 441-450). In diesem Stadium war die Expression von Flk-1 in dem perineuralen vaskulären Plexus und in eindringenden vaskulären Sprossen hoch, wie in 5A gezeigt. Diese in situ-Hybridisierungsanalysen zeigen, dass die proliferierenden Endothelzellen einer angiogenen Sprosse die Flk-1 mRNA exprimierten. Am Tag 14,5, wenn das Neuroektoderm bereits hoch vaskularisiert ist, enthielten zahlreiche radiale Gefäße sowie auch abzweigende Gefäße des intraneuralen Plexus große Mengen von Flk-1 mRNA (5B). Am postnatalen Tag 4, wenn Sprossung und Endothelzellprolifereition an ihrem höchsten Punkt ist, wurde eine starke Expression von Flk-1 mRNA in Endothelzellen beobachtet (5C). Umgekehrt war die Flk-1 Expression in dem adulten Gehirn, wenn die Angionese beendet ist, sehr niedrig (Fig. SD) und schien hauptsächlich auf den choroiden Plexus beschränkt zu sein (6). In dem choroiden Plexus exprimierten Zellen in der inneren vaskulären Schicht Flk-1 mRNA, während Epithelzellen dies nicht taten (6A, B).
  • Die embryonale Niere wird durch einen angionetischen Prozess vaskularisiert (Ekblom, P. et al., 1982, Cell Diff. 11: 35-39). Glomuläre und peritubuläre Kapillaren entwickeln sich synchron mit epithelialer Morphogenese. In der Niere des postnatalen Tags 4 wurde zusätzlich zu anderen Kapillaren eine prominente Expression von Flk-1 in den mutmaßlichen glomerulären Kapillaren beobachtet (7A). Diese Ex pression dauerte in der adulten Niere an (7C und D) und schien dann im Vergleich mit der frühen postnatalen Niere mehr auf die glomulären (Kapillaren) begrenzt zu sein.
  • 6.2.4. Flk-1 Expression in Endothelzellvorläufern
  • Um die mögliche Beteiligung von Flk-1 in den frühen Stadien der vaskulären Entwicklung zu untersuchen, wurden Analysen von Embryonen in verschiedenen Stadien während der Blutinselbildung durchgeführt. In einem sagittalen Schnitt des Deciduums von einem Tag 8,5-Mausembryo wurde eine Flk-1 Expression auf maternalen Blutgefäßen in dem Deciduum, im Dottersack und im Trophoektoterm delektiert. Flk-1 mRNA wurde ebenfalls in der Allantois und innerhalb des Embryos gefunden, wobei dies hauptsächlich in dem Teil lokalisiert war, wo Mesenchym gefunden wird (8A). Bei einer höheren Vergrößerung des maternalen Deciduums wurden hohe Level von Flk-1 mRNA-Expression in der inneren Auskleidung von Blutgefäßen gefunden, welche aus Endothelzellen besteht (8B). In dem Dottersack waren die Hybridisierungssignale auf die mesodermale Schicht begrenzt, in welcher die Hämangioblasten differenzieren (8C). 8D zeigt eine Blutinsel bei höherer Vergrößerung, in welcher die peripheren Angioblasten einen hohen Level von Flk-1 mRNA exprimierten.
  • 6.2.5. Flk-1 ist ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF
  • Eine detaillierte Untersuchung von in situ-Hybridisierungsergebnissen und Vergleich mit denen für VEGF, die kürzlich von Breier, G. et al. (1992, Development 114: 521-532) berichtet wurden, zeigte eine bemerkenswerte Ähnlichkeit in Expressionsmustern. Weiterhin ergab eine Flk-1 Expression in dem glomulären Endothelium und VEGF in den umgebenden Epithelzellen (Breier, G. et al., 1992, Development 114: 521-532) die Möglichkeit einer parakrinen Beziehung zwischen diesen Zelltypen und deutet daher eine Liganden-Rezeptorbeziehung für VEGF bzw. Flk-1 an. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Flk-1 cDNA voller Länge in den Säugetier-Expressionsvektor pCMV kloniert, welcher transkriptionale Kontrollelemente des humanen Cytomegalovirus (Gorman, C. M. et al., 1989, Virology 171: 377-385) ent hält. Für eine transiente Expression des Rezeptors wurde dann das Flk-1 exprimierende Plasmid in COS-1-Fibroblasten transfiziert.
  • Eine spezifische Bindung von VEGF an die Flk-1 RTK wurde durch Quervernetzen und Kompetitionsbindungsexperimente gezeigt. Gereinigter 125I-markierter VEGF wurde mit COS-1-Zellen inkubiert, die mit dem pCMV-Flk-1 Expressionsvektor transfiziert worden waren. Quervernetzen mit DSS und anschließende Analyse von einer Immunopräzipitation, PAGE und Autoradiographie zeigte eine etwa 220 kD-Bande, welche in dem Kontrollexperiment mit nicht transfizierten COS-1-Zellen nicht delektiert wurde, und die wahrscheinlich den VEGF/Flk-1 Rezeptorkomplex repräsentiert (9A). Zusätzlich kompetitierte VEGF mit einer 125I-VEGF-Bindung an Flk-1 exprimierende COS-1-Zellen (9B), wohingegen nicht transfizierte COS-1-Zellen 125I-VEGF nicht banden. Die Interaktion von VEGF mit dem Rezeptor auf transfizierten Zellen war spezifisch, da PDGF-BB nicht mit einer Bindung von 125I-VEGF kompetitierte. Eine Analyse der Bindungsdaten zeigte einen Kd von etwa 10–10 M, was anzeigt, dass Flk-1 ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF ist. Dieser Befund zusammen mit den in situ-Hybridisierungsergebnissen von Flk-1 und VEGF zeigt deutlich an, dass Flk-1 ein physiologisch relevanter Rezeptor für VEGF ist.
  • Ein Autophosphorylierungstest wurde durchgeführt, um die biologische Relevanz einer VEGF-Bindung an den Flk-1 Rezeptor zu bestätigen. COS-1-Zellen, welche Flk-1 transient exprimierten, wurden in DMEM, enthaltend 0,5% fötales Kälberserum, für 24 Stunden ausgehungert, mit 0,5 mM VEGF stimuliert und lysiert. Die Rezeptoren wurden mit dem für Flk-1 spezifischen polyklonalen Antikörper CT128 immunopräzipitiert und dann durch SDS-PAGE und anschließendes Immunoblotten unter Verwendung des Antiphosphotyrosin-Antikörpers 5E2 (Fendly, B. M. et al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558) analysiert. Wie in 10 gezeigt, führte eine VEGF-Stimulierung von Flk-1 exprimierenden Zellen zu einer signifikanten Induktion einer Tyrosinphosphorylierung des 180 kD Flk-1 Rezeptors.
  • 6.2.6. Inhibierung von Tumorwachstum durch transdominant-negative Inhibierung von Flk-1
  • Es wird angenommen, dass der Flk-1 Rezeptor eine wichtige Rolle in der Vaskulogenese und Angiogenese spielt. Daher kann möglicherweise eine Inhibierung von Flk-1 Aktivität eine Vaskulogenese eines sich entwickelnden Tumors inhibieren und dessen Wachstum inhibieren. Um diese Hypothese zu testen, wurden Tumorzellen (C6-Glioblastoma aus der Ratte) und Mauszellen, die einen rekombinanten Retrovirus produzieren, der einen trunkierten Flk-1 Rezeptor kodiert, gemischt und subkutan in nackte Mäuse implantiert. Die implantierten C6-Glioblastomazellen sekretieren VEGF, welches an die Flk-1 Rezeptoren, die an der Oberfläche von Mausendothelzellen exprimiert werden, binden wird und diese aktivieren wird. In der Abwesenheit von jedweden Inhibitoren der Vaskulogenese werden die Endothelzellen proliferieren und in Richtung der Tumorzellen migrieren. Alternativ dazu, wenn zu dem Injektionszeitpunkt die Tumorzellen mit Zellen, die rekombinanten Retrovirus, der den dominant-negativen Flk-1 kodiert, produzieren, koinjiziert werden, werden die Endothelzellen, die in Richtung der implantierten Tumorzellen wachsen, mit rekombinantem Retrovirus infiziert werden, was in einer dominant-negativen Flk-1 Mutantenexpression und Inhibierung von endogener Flk-1 Signalisierung resultieren kann. Eine Unterdrückung der Endothelzellproliferation und Migration wird in einer Erfolglosigkeit der implantierten Tumorzellen resultieren, vaskularisiert zu werden, was zu einer Inhibierung von Tumorwachstum führen wird. Wie in 12 und 13 gezeigt, wird das Tumorwachstum in Mäusen, die Implantationen von Zellen erhalten haben, die trunkierten Flk-1 produzieren, signifikant gehemmt, was anzeigt, dass eine Expression von einem trunkierten Flk-1 Rezeptor in einer dominant-negativen Weise wirken kann, so dass die Aktivität von endogenem Wildtyp Flk-1 inhibiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung ist im Umfang nicht durch die ausgeführten Ausführungsformen beschränkt, welche als Veranschaulichungen von einzelnen Aspekten der Erfindung gemeint sind, und irgendwelche Klone, DNA- oder Aminosäuresequenzen, welche funktional äquivalent sind, werden vom Umfang der Erfindung umfasst. In der Tat erschließen sich verschiedenen Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen den Fachleuten aus der vorangehenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen. Solche Modifikationen fallen bestimmungsgemäß in den Umfang der angefügten Ansprüche.
  • Es ist ebenfalls so zu verstehen, dass alle Basenpaargrößen, die für Nukleotide angegeben sind, Näherungswerte sind und für Zwecke der Beschreibung verwendet werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • Figure 00360001
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Claims (14)

  1. Ein rekombinanten Vektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die einen Flk-1 Rezeptor kodiert, dem die C-terminale zytoplasmatische Kinasedomäne fehlt, in welchem besagter Flk-1 Rezeptor dominant-negative Aktivität hat, welche die zellulären Effekte der VEGF-Bindung inhibiert.
  2. Der rekombinante Vektor von Anspruch 1, der eine Nukleotidsequenz enthält, die die Aminosäuren 1 bis 806 von Flk-1 kodiert, aber nicht die Aminosäuren 807 bis 1367 von Flk-1.
  3. Ein rekombinanter Vektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die einen Flk-1 Rezeptor kodiert, der eine Mutation in der zytoplasmatischen Kinasedomäne des Flk-1 Rezeptors hat, in welchem besagter Flk-1 Rezeptor dominant-negative Aktivität hat, welche die zellulären Effekte der VEGF-Bindung inhibiert.
  4. Der rekombinante Vektor von Anspruch 1, 2 oder 3, in welchem der Vektor ein viraler Vektor ist.
  5. Der rekombinante Vektor von Anspruch 4, in welchem der vitale Vektor ein Retrovirus-Vektor ist.
  6. Eine manipulierte Zelllinie, die den rekombinanten Vektor von Anspruch 4 enthält.
  7. Eine manipulierte Zelllinie, die den rekombinanten Vektor von Anspruch 5 enthält.
  8. Verwendung einer wirksamen Menge der rekombinanten Vektoren der Ansprüche 1, 2 oder 3 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Modulierung der zellulären Effekte von VEGF in einem Säuger.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 8, in welcher die Vektoren in Liposomen rekonstituiert sind.
  10. Verwendung einer wirksamen Menge des rekombinanten Vektors von Anspruch 4 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Modulierung der zellulären Effekte von VEGF in einem Säuger.
  11. Verwendung einer wirksamen Menge des rekombinanten Vektors von Anspruch 5 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Modulierung der zellulären Effekte von VEGF in einem Säuger.
  12. Verwendung einer wirksamen Menge eines trunkierten Flk-1 Re zeptors für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Modulierung der zellulären Effekte von VEGF in einem Säuger, in welcher besagter Flk-1 Rezeptor dominant-negative Aktivität hat, welche die zellulären Effekte der VEGF-Bindung inhibiert.
  13. Verwendung einer wirksamen Menge eines trunkierten Flk-1 Rezeptors, der eine Mutation in der zytoplasmatischen Kinasedomäne des Flk-1 Rezeptors hat, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Modulierung der zellulären Effekte von VEGF in einem Säuger, in welcher besagter Flk-1 Rezeptor dominant-negative Aktivität hat, welche die zellulären Effekte der VEGF-Bindung inhibiert.
  14. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, in welcher der Flk-1 Rezeptor in Liposomen rekonstituiert ist.
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