DE69628652T3 - Vegf-verwandtes protein - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Rezeptorprotein-Tyrosin-Kinase-(rPTK-)Liganden. Genauer gesagt betrifft die Erfindung einen neuen Liganden mit der Bezeichnung ”mit VEGF verwandtes Protein” (”VEGF-related protein”; VRP) oder VH1, der sich an den Flt4-Tyrosin-Kinase-Rezeptor (auch als Sal-S1-Rezeptor bekannt) bindet und seine Phosphorylierung stimuliert, sowie die Isolierung und rekombinante Produktion desselben.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Bildung neuer Blutgefäße entweder aus differenzierenden Endothelzellen während der embryonalen Entwicklung (Vaskulogenese) oder aus bereits bestehenden Gefäßen im Erwachsenenalter (Angiogenese) ist ein wesentliches Merkmal der Organentwicklung, Reproduktion und Wundheilung bei höheren Organismen. Folkman und Shing, J. Biol. Chem. 267, 10931–10934 (1992); Reynolds et al., FASEB J. 6, 886–892 (1992); Risau et al., Development 102, 471–478 (1988). Angiogenese ist auch für bestimmte pathologische Prozesse erforderlich, darunter Tumorgenese (Folkman, Nature Medicine 1, 27–31 (1995)) und Retinopathie (Miller et al., Am. J. Pathol. 145, 574–584 (1994)).
  • Während mehrere Wachstumsfaktoren die Angiogenese stimulieren können (Klagsbrun und D'Amore, Ann. Rev. Physiol. 53, 217–239 (1991); Folkman und Klagsbrun, Science 235, 442–447 (1987)), ist Gefäß-Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) (Ferrara et al., Endo. Rev. 13, 18–32 (1992)) ein wirkungsvoller angiogenetischer Faktor, der über die Endothelzellen-spezifische Rezeptor-Thyrosin-Kinasen-fms-artige Tyrosin-Kinase (Flt1) (Shibuy et al., Oncogene 5, 519–524 (1990); deVries et al., Science 255, 989–991 (1992)) und fötale Leberkinase (Flk1) (auch als KDR bezeichnet) wirkt. Quinn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7533–7537 (1993); Millauer et al., Cell 72, 835–846 (1993); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9026–9030 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579–1586 (1992); Terman et al., Oncogene 6, 1677–1683 (1991); Oelrichs et al., Oncogene 8, 11–18 (1993). Diese beiden VEGF-Rezeptoren und ein dritter Orphan-Rezeptor, Flt4 (Pajusola et al., Cancer Res. 52, 5738–5743 (1992); Galland et al., Oncogene 8, 1233–1240 (1993); Finnerty et al., Oncogene 8, 2293–2298 (1993)) bilden eine Unterfamilie von Klasse III-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, die mehrere extrazalluläre Immunglobulin-artige Domänen und eine gespaltene intrazelluläre Tyrosin-Kinase-Domäne enthalten. Mustonen und Alitalo, J. Cell. Biol. 129, 895–898 (1995). Sie auch die am 11. Mai 1994 veröffentlichte WO 94/10202 und die am 22. Jänner 1993 eingereichte PCT/US93/00586 (Avraham et al.). Diese drei Rezeptoren weisen 31 bis 36% Aminosäure-Identität in ihren extrazellulären Liganden-bindenden Domänen auf.
  • Mäuse mit Flt1-Defizienz (Fong et al., Nature 376, 66–70 (1995)) oder Flk1-Defizienz (Shalaby et al., Nature 376, 62–66 (1995)) (erzeugt durch Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen) weisen schwere Defekte in der Vaskulogenese auf und sterben in utero am embryonalen Tag 8–9. Der Phänotyp der Rezeptor-defizienten Mäuse ist jedoch sehr unterschiedlich. Mäuse, denen Flt1 fehlt, weisen ein desorganisiertes Gefäß-Endothel auf, das sich bis zu den Hauptgefäßen sowie bis zur Mikrovaskulatur erstreckt, während die Endothelzellen-Differenzierung normal zu sein scheint. Fong et al., oben. Mäuse, denen Flk1 fehlt, weisen einen beträchtlichen Defekt bei der Entwicklung von reifen Endothelzellen sowie eine beträchtliche Reduktion der hämatopoetischen Zell-Vorläufer auf. Shalaby et al., oben. Somit kann VEGF in mehr als einem Stadium der Vasculogenese auf Endothelzellen wirken.
  • Flt4 wird ebenfalls spezifisch in Endothelzellen exprimiert; es wird erstmals bei Mäuseembryos im Alter von 8,5 Tagen in Endothelzellen-Vorläufern beobachtet. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3566–3570 (1995); Kaipainen et al., J. Exp. Med. 178, 2077–2088 (1993). Siehe auch Hatva et al., Am. J. Pathol. 146, 368–378 (1995). Mit fortschreitender Entwicklung wird die Flt4-Expression auf das venöse und lymphatische Endothel eingeschränkt und schließlich auf die lymphatischen Gefäße beschränkt. Im Einklang mit diesem Ergebnis weisen erwachsene humane Gewebe Flt4-Expression in lymphatischen Endothelen auf, während Expression in Arterien, Venen und Kapillaren fehlt. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, oben. Klone, die für humanes und Mäuse-Flt4 kodieren, sind entweder durch PCR mit Primern für konservierte Tyrosin-Kinase-Regionen (Finnery et al., oben, PCT/US93/00586 , oben; Aprelikova et al., Cancer Res. 52,. 746–748 (1992)) oder durch Hybridisierung unter erleichterten Bedingungen mit einer Flk2-Sonde isoliert worden. Galland et al., Genomics, 13, 475–478 (1992). Alternatives Spleißen der Flt4-mRNA erzeugt zwei Varianten des Proteins, die sich um 65 Aminosäuren am C-Terminus unterscheiden. Pajusola et al., Oncogene 8, 2931–2937 (1993). Diese Varianten wandern als Bande mit 170–190 kDa, die in der extrazellulären Domäne teilweise proteolytisch gespalten werden, um eine Form mit etwa 25 kDa zu erzeugen. Pajusola et al., Oncogene 8, oben; Pajusola et al., Oncogene 9, 3545–3555 (1994). Die Expression der längeren gespleißten Form von Flt4 als Chimäre mit der extrazellulären Domäne des CSF-1-Rezeptors zeigt, dass die intrazelluläre Flt4-Domäne bei Nagetier-Fibroblasten eine Liganden-abhängige Wachstumsreaktion signalisieren kann. Pajusola et al., Oncogene 9, oben; Borg et al., Oncogene 10, 973–984 (1995). Flt4 ist am humanen Chromosom 5q34–q35 lokalisiert worden (Aprelikova et al., oben; Galland et al., Genomics, oben); Flt1 und Flk1 befinden sich an 13q12 (Imbert et al., Cytogenet. Cell Genet. 67, 175–177 (1994)) und 4q12. Salt et al., Cytogenet. Cell Cenet. 70, 145–146 (1995); Spatz et al., Genomics 22, 431–436 (1994).
  • VEGF ist ein homodimeres, Cystein-reiches Protein, das aufgrund von alternativem Spleißen seiner mRNA in zumindest vier Formen auftreten kann. Ferrra et al., oben. Während VEGF ist Ligand mit hoher Affinität für Flt1 und Flk1 ist, wird Flt4 dadurch weder gebunden noch aktiviert. Pajusola et al., Oncogene 9, oben. Das einzige andere eng verwandte Mitglied der VEGF-Familie ist Placenta-Wachstumsfaktor (PIGF), der zu 47% Aminosäure-Identität mit VEGF aufweist. Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 9267–9271 (1991). PIGF tritt ebenfalls in zwei alternativen gespleißten Formen auf, die sich durch das Vorhandensein oder Fehlen einer basischen Heparin-Bindungsdomäne mit 21 Aminosäuren unterscheiden. Maglione et al., Oncogene 8, 925–931 (1993); Hauser und Weich, Growth Factors, 9, 259–268 (1993). PIGF bindet sich an Flt1, nicht aber an Flk1 (Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646–25654 (1993); es wird angenommen, dass seine Bindung an Flt4 nicht bestimmt worden ist. PIGF kann die Kapillar-Endothelzellen-Mitogenese oder Gefäß-Permeabilitätsaktivitäten von VEGF nicht duplizieren, was darauf hinweist, dass diese Aktivitäten durch den Flk1-Rezeptor vermittelt werden. Parker et al., oben.
  • Moleküle, die den Flk1-Rezeptor modulieren oder die Aktivierung eines VEGF-Rezeptors neutralisieren, werden in der Patentliteratur offenbart. Beispielsweise offenbart die am 17. August 1995 veröffentlichte WO 95/21613 Verbindungen, die die KDR/Flk1-Rezeptorsignaltransduktion modulieren, so das die Vasculogenese und Angiogenese reguliert und/oder moduliert wird, und offenbart die Verwendung von Flk1 zur Bewertung und zum Screenen bezüglich Arzneimitteln und Analogen von VEGF, die an der Flk1-Modulation durch Agonist- oder Antagonist-Aktivitäten beteiligt sind; die am 17. August 1995 veröffentlichte WO 95/21865 offenbart Moleküle, die mit Tier-Neuroepithel-Kinase (NYK)/Flk1 immunreaktiv sind, wobei diese Moleküle verwendet werden können, um Mittel für die Behandlung, Prophylaxe und Diagnose eines von Angiogenese abhängigen Phänotyps bereitzustellen; und die am 17. August 1995 veröffentlichte WO 95/21868 offenbart monoklonale Antikörper, die spezifisch an eine extrazelluläre Domäne eines VEGF-Rezeptors binden und die Aktivierung des Rezeptors neutralisieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Nun sind cDNA-Klone identifiziert worden, die für ein neues Protein mit der Bezeichnung VRP kodieren, das sich an die Rezeptor-Tyrosin-Kinase Flt4 bindet und deren Phosphorylierung stimuliert. VRP ist, was seine Aminosäuresequenz betrifft, mit VEGF verwandt, tritt aber nicht in nennenswerte Wechselwirkung mit den VEGF-Rezeptoren Flt1 und Flk1.
  • Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung isoliertes biologisch aktives humanes VRP bereit, wie in den Ansprüchen definiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die als die Reste –20 bis einschließlich 399 oder die Reste +1 bis einschließlich 399 aus 1 gezeigt wird.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die dieses biologisch aktive VRP und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Gemäß einer spezifischeren Ausführungsform stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die zur Förderung von Gefäß- oder Lymphendothezellwachstum nützlich ist und eine therapeutisch wirksame Menge des VRP in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 4 definiert bereit, welche des weiteren einen weiteren Zellwachstumsfaktor, wie z. B. VEGF und/oder PDGF umfasst.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül wie in den Ansprüchen definiert bereit, das für VRP kodiert. Das Nucleinsäuremolekül umfasst gegebenenfalls die Regionen der Nucleinsäuresequenzen aus 1, die für Signalsequenzen kodieren. Die Nucleinsäuresequenz umfasst daher (a) oder (b), und (c):
    • (a) der Kodierungsregion der Nucleinsäuresequenz aus 1, die für das Präprotein von Rest –20 bis Rest 399 kodiert oder die für reifes Protein von Rest 1 bis Rest 399 kodiert (d. h. die Nucleotide 372 bis einschließlich 1.628 oder die Nucleotide 432 bis einschließlich 1.628 der in 1 als Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz);
    • (b) einer Sequenz, die der Sequenz von (a) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht.
    • (c) einen heterologen induzierbaren Promotor
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen replizierbaren Vektor bereit, der das Nucleinsäuremolekül umfasst. Die Erfindung stellt weiters eine Wirtszelle bereit, die das Nucleinsäuremoleküle umfasst. Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung von VRP bereitgestellt, das das Kultivieren einer Wirtszelle, die das Nucleinsäuremolekül umfasst, und das Gewinnen des Proteins aus der Wirtszellenkultur umfasst.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A–1D zeigen die Nucleotid-Kodierungssequenz (Seq.-ID Nr. 1), die Nucleotid-Komplementärsequenz (Seq.-ID Nr. 2) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) des hierin beschriebenen humanen VRP.
  • 2 stellt die Bindung von Flt4/IgG und von Rse/IgG (eines nicht verwandten Rezeptorfusionsproteins) an die humane Gliom-Zelllinie G61 dar, wobei diese Bindung durch FACS-Analyse bewertet wurde.
  • Die 3A und 3B zeigen eine Karte von cDNA-Klonen dar, die für humanes VRP kodieren, bzw. eine Ausrichtung der Proteinsequenz VRP (Seq.-ID Nr. 3) mit jener von VEGF121 (Seq.-ID Nr. 4) und P1GF131 (Seq.-ID Nr. 5) dar. 3A zeigt das Ausmaß von vier VRP-cDNA-Klonen; strichlierte Linien zeigen die fehlenden Abschnitte von VH1.1 und VH1.3. Pfeile zeigen Restriktionsenzymstellen an; das schattierte Kästchen markiert die mutmaßliche Sekretionssignalsequenz; das leere Kästchen markiert das reife Protein; Y-Typ-Bezeichnungen innerhalb des offenen Kästchens zeigen die potentiellen N-gebundenen Glykosylierungsstellen; und vertikale Linien zeigen die Cysteinreste. Zum Vergleich wird ein Diagramm von VEGF121 gezeigt. Das Hydropathie-Diagramm (Kyle und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982)) dient für VRP. In 3B zeigt ein Strich oberhalb die Region, für die eine exprimierte Sequenzmarkierung (EST) kodiert (Sequenz eines Abschnitts eine cDNA-Klons) von GenBank mit der Bezeichnung HSC1WF111.
  • 4 zeigt eine Karte des cDNA-Klons für humanen VRP voller Länge gemäß vorliegender Erfindung im Vergleich zu 11 bekannten ESTs. Die 11 partiellen EST-Aminosäuresequenzfragmente sind H07991 und H07899 (5'- bzw. 3'-Ende des gleichen klonierten Fragments), HSC1WF112 und HSC1WF111 (3'- bzw. 5'-Ende des gleichen klonierten Fragments), 181481 und 181690 (3'- bzw. 5'-Ende des gleichen klonierten Fragments), R77495 (ein 3'-Ende eines klonierten Fragments) sowie T84377 und T89295 (5'- bzw. 3'-Ende des gleichen klonierten Fragments).
  • 5 stellt die Bindung von 125I-Flt4/IgG an gereinigtes VRP dar. Die Bindung wurde in Abwesenheit (–) oder Gegenwart (+) von 100 nM Rezeptor-IgG-Fusionsprotein (5A) oder mit zunehmenden Konzentrationen an Flt4/IgG (5B) vorgenommen.
  • 6 zeigt einen Graph der Zellzählung von humanen Lungenmikrogefäß-Endothelzellen als Funktion der Konzentration von VEGF oder VRP im Zellkulturmedium, um die mitogene Aktivität zu bewerten und zu vergleichen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • 1. Definitionen
  • Die folgenden Begriffe werden verwendet, und sie sind wie nachstehend angeführt definiert.
  • Abhängig vom Zusammenhang, wie in den Ansprüchen 1 und 4 angegeben, ist ”Humanes VRP” hierin definiert als (a) eine biologisch aktive Polypeptidsequenz, die zumindest die Reste –20 bis einschließlich 399 oder die Reste +1 bis einschließlich 399 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz enthält, einschließlich der Reste –5 bis einschließlich 399 und der Reste –4 bis einschließlich 399 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz, oder (b) biologisch aktiver Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten der obigen Sequenzen mit zumindest 265 Aminosäure und vorzugsweise zumindest den Resten +1 bis einschließlich 29 aus 1. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Proteinsequenz zumindest die Reste +1 bis einschließlich 137 aus 1, mehr bevorzugt zumindest die Reste –20 bis einschließlich 29 aus 1 und am meisten bevorzugt zumindest die Reste –20 bis einschließlich 137 aus 1 auf. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die biologisch aktiven Varianten eine Länge von 265 bis etwa 450 Aminosäurereste, mehr bevorzugt von etwa 300 bis 450, noch mehr bevorzugt von etwa 350 bis 450 und am meisten bevorzugt von etwa 399 bis 419 Aminosäureresten auf. Bei einem weiteren bevorzugten Satz von Varianten handelt es sich um Varianten, die Insertions- oder Substitutionsvarianten sind, oder Deletionsvarianten, wenn die Deletion in der Signalsequenz vorliegt und/oder nicht in der N-terminalen Region des Moleküls vorliegt (d. h. die Reste 1–29, vorzugsweise die Reste 1–137). Die Definition von VRP schließt alle bekannten EST-Sequenzen, wie beispielsweise H07991, H05134, H05177, HSC1WF112, HSC1WF111, T81481, R77495, H07899, T84377, T81690 und T89295 sowie alle Formen von VEGF und PIGF aus.
  • ”Biologisch aktiv” bedeutet für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung die Fähigkeit, sich an den Flt4-Rezeptor zu binden und seine Phosphorylierung zu stimulieren. Im Allgemeinen bindet sich das Protein an die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptors und aktiviert oder hemmt dadurch sein intrazelluläre Tyrosin-Kinase-Domäne. Als Folge kann die Bindung des Proteins an den Rezeptor zu einer Verstärkung oder Hemmung der Vermehrung und/oder Differenzierung und/oder Aktivierung von Zellen in vivo oder in vitro führen, die den Flt4-Rezeptor für das VRP aufweisen. Die Bindung des Proteins an den Flt4-Rezeptor kann unter Einsatz herkömmlicher Techniken bestimmt werden, einschließlich kompetitiver Bindungsverfahren, wie RIAs, ELISAs und anderer kompetitiver Bindungstests. Liganden/Rezeptor-Komplexe können unter Einsatz von Trennungsverfahren wie Filtration, Zentrifugation, Strömungszytometrie (siehe beispielsweise Lyman et al., Cell 75, 1157–1167 (1993); Urdal et al., J. Biol. Chem, 263, 2870–2877 (1988); und Gearing et al., EMBO J. 8, 3667–3676 (1989)) und dergleichen identifiziert werden. Die Ergebnisse von Bindungsuntersuchungen können unter Einsatz jeder beliebigen herkömmlichen graphischen Darstellung der Bindungsdaten analysiert werden, wie Scatchard-Analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51, 660–672 (1949); Goodwin et al., Cell, 73, 447–456 (1993)) und dergleichen. Da das VRP die Phosphorylierung des Flt4-Rezeptors hervorruft, können als Indikator für die Bildung eines Flt4-Rezeptor/VRP-Komplexes auch herkömmliche Tyrosinphosphorylierungstests, wie der in Beispiel 5 gemäß vorliegender Erfindung beschriebene Test, eingesetzt werden.
  • Der Begriff ”Epitop-markiert” bezieht sich, wenn er hierin verwendet wird, auf ein chimäres Polypeptid, das das gesamte VRP oder einen Abschnitt davon an ein ”Marker-Polypeptid” fusioniert umfasst. Das Marker-Polypeptid besitzt genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein dagegen gerichteter Antikörper hergestellt werden kann, ist aber dennoch dahingehend ausreichend kurz, um die Aktivität des Antikörpers nicht zu stören. Das Marker-Polypeptid ist vorzugsweise auch ausreichend einmalig, so dass der dagegen gerichtete Antikörper im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide besitzen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und für gewöhnlich ungefähr 8 bis 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 9 und 30 Resten).
  • ”Isoliert” bedeutet, wenn es verwendet wird, um verschiedene hierin offenbarte Proteine zu beschreiben, Protein, das aus einem Bestandteil seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder rückgewonnen worden ist. Kontaminierende Bestandteile seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen für das Protein stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nicht-proteinische, gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) in einem Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Drehbecher-Sequenzierers zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes Protein umfasst Protein in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des VRP nicht vorhanden ist. Für gewöhnlich wird das isolierte Protein jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
  • Mit ”im Wesentlichen reines” Protein ist eine Zusammensetzung gemeint, die zumindest etwa 90 Gew.-% des Proteins, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise zumindest etwa 95 Gew.-%, umfasst. Mit ”im Wesentlichen homogenes” Protein ist eine Zusammensetzung gemeint, die zumindest etwa 99 Gew.-% Protein, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, umfasst.
  • Ein ”isoliertes” VRP-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem kontaminierenden Nucleinsauremolekül getrennt worden ist, mit dem es in der natürlichen Quelle der VRP-Nucleinsäure üblicherweise assoziiert ist. Ein isoliertes VRP-Nucleinsäuremolekül liegt anders als in der Form oder Anordnung vor, in der es in der Natur zu finden ist. Isolierte VRP-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher vom VRP-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorliegt. Der Begriff ”isoliertes VRP-Nucleinsäuremolekül” umfasst jedoch VRP-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die üblicherweise VRP exprimieren, worin sich das Nucleinsäuremolekül beispielsweise an einer anderen chromosomalen Position findet als bei natürlichen Zellen.
  • Das isolierte VRP-Polypeptid oder die isolierte VRP-Nucleinsäure können für Diagnose- und Sondenzwecke unter Einsatz einer Markierung markiert werden, wie nachstehend beschrieben und definiert.
  • Der Ausdruck ”Kontrollsequenzen” bezeichnet DNA-Sequenzen, die für die. Expression einer operabel gebundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Zu den Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, gehören beispielsweise ein Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosom-Bindungsstelle und möglicherweise anderes bisher noch kaum erforschte Sequenzen. Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer einsetzen.
  • Nucleinsäure ist ”operabel gebunden”, wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht ist. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet ”operabel gebunden”, dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Fall eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen erreicht. Wenn derartige Stellen nicht vorliegen, werden die synthetischen Oligonucleotidqadaptoren oder -linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet ”Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor” oder ”VEGF” einen Säugetier-Wachstumsfaktor, der ursprünglich von Rinder-Hirnanhangdrüsen-Follikelzellen mit der Aminosäuresequenz aus 2 der WO90/13649 stammt und die humane Aminosäuresequenz aus 10 der WO 90/13649 hat. Siehe auch US-Patent Nr. 5.194.596 , das Rinder-VEGF mit 120 Aminosäuren und humanen VEGF mit 121 Aminosäuren offenbart. Die biologische Aktivität von nativem VEGF kann das selektive Wachstum von Gefäßendothelzellen, nicht aber von Rinder-Hornhaut-Endothelzellen, Linsen-Epithelzellen, Nebennierenrindenzellen, VHK-21-Fibroblasten oder Keratinozyten fördern.
  • Der Ausdruck ”das Gefäßendothel betreffendes Trauma” bezieht sich auf ein Trauma, wie etwa Verletzungen an Blutgefäßen oder am Herzen, einschließlich des Gefäßnetzwerks von Organen, die eine Tier oder ein Mensch, vorzugsweise ein Säugetier, und am meisten bevorzugt ein Mensch, erlitten hat. Beispiele für derartige Traumata sind Wunden, Schnitte und Geschwüre, am meisten bevorzugt Diabetes-Geschwüre und Wunden oder Risswunden der Blutgefäße oder des Herzens. Traumata umfassen sowohl Zustände, die durch Ereignisse im Inneren verursacht werden, als auch jene, die durch ein äußerliches Agens, wie z. B. ein Pathogen, verursacht werden, und die durch die Förderung des Gefäßendothelzellenwachstums verbessert werden können. Es betrifft auch die Behandlung von Wunden, bei denen Neovaskularisation oder Re-Endothelisation für die Heilung erforderlich ist.
  • ”Förderung des Gefäß- oder Lymphendothelzellenwachstums” bezeichnet das Herbeiführen oder Verstärken des Wachstums von Gefäß- oder Lymphendothelzellen, einschließlich humaner Lungen-Mikrogefäßendothelzellen.
  • ”Mit Vaskulogenese und Angiogenese verbundene Störungen” sind Krebs, Diabetes, Hämangiom und Kaposi-Sarkom.
  • ”Erkrankungen oder Störungen, die durch unerwünschte übermäßige Gefäßneubildung oder Gefäß-Durchlässigkeit gekennzeichnet sind” bezieht sich auf Erkrankungen oder Störungen, zu denen beispielsweise übermäßige Gefäßneubildung, Tumoren und insbesondere massive bösartige Tumoren, primärchronische Polyarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, Diabetes und andere Retinopathien, retrolental Fibroplasie, altersbedingte Makula-Degeneration, neovaskuläres Glaukom, Hämangiome, Schilddrüsen-Hyperplasien (einschließlich Grave-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebstransplantation sowie chronische Entzündung gehören. Beispiele für Erkrankungen oder Störungen, die durch gewünschte übermäßige Gefäß-Durchlässigkeit gekennzeichnet sind, sind mit Gehirntumoren verbundene Ödeme, mit Malignität verbundene Aszites, Meigs-Syndrom, Lungenentzündung, nephrotisches Syndrom, Perikarderguss (wie der mit Pericarditis verbundene) und Pleuraleffusion.
  • ”Dysfunktionalitätszustände, die durch übermäßige Aktivierung oder Hemmung eines Rezeptors für VRP gekennzeichnet sind” (wie Rezeptor, der Flt4 einschließt) bezeichnet Störungen oder Erkrankungen, die vorteilhaft behandelt werden können, indem einem Säugetier mit einem solchen pathologischen Zustand ein Antagonist für Flt4 verabreicht wird, wie eine Fl4-Chimäre oder ihre extrazellulare Domäne (z. B. eine IgG-Fusion mit Flt4) oder ein Antikörper für VRP.
  • ”Dysfunktionalitätszustände, die durch das Fehlen von Aktivierung oder das Fehlen von Hemmung eines Rezeptors für VRP gekennzeichnet sind” (wie Flt4 umfassender Rezeptor) bezieht sich auf Störungen oder Erkrankungen, die vorteilhaft behandelt werden können, indem VRP oder ein VRP-Rezeptoragonist für ein Säugetier mit einem derartigen pathologischen Zustand bereitgestellt wird.
  • ”Behandlung” umfasst sowohl therapeutische Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die Behandlung benötigen, sind sowohl jene, die die Störung bereits aufweisen, als auch jene, die für die Störung anfällig sind, oder jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
  • ”Säugetier” umfasst für die Zwecke der Behandlung jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- oder Nutztiere, sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe usw. Vorzugsweise ist das Säugetier hier der Mensch.
  • ”Wirksame Menge” oder ”therapeutisch wirksame Menge” des VRP oder der VRP-Zusammensetzung ist eine Menge, mit der sich der behandelte Zustand entweder wirksam verhindern, eindämmen, erleichtern oder heilen lässt. Beispielsweise umfasst die wirksame VRP-Menge jene Menge, die ausreicht, um das Wachstum von Gefäß-Endothel in vivo zu verstärken oder Trauma zu behandeln.
  • II. Arten der Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen VRP, der sich an den Flt4-Rezeptor bindet und seine Phosphorylierung stimuliert.
  • Es wurden drei Ansätze eingesetzt, um Protein zu identifizieren, das sich an den Flt4-Rezeptor bindet und seine Phosphorylierung stimuliert. Zunächst wurde Rezeptor voller Länge stabil in 293 Zellen exprimiert, um einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Phosphorylierungstest der Flt4-Aktivierung einzurichten. Dieser Test wurde eingesetzt, um etwa 400 Zellüberstände und Gewebeextrakte zu screenen, ohne positive Ergebnisse.
  • Zweitens wurde die extrazelluläre Domäne des Rezeptors als Fusionsprotein mit einer Immunglobulin-Fc-Domäne exprimiert. Durch den Einsatz dieses Fusionsproteins (Flt4/IgG) zum Screenen von Zelllinien für Membran-gebundene Liganden durch FACS-Analyse wurde eine positive Zelllinie identifiziert. Die humane Gliom-Linie, G61, ergab etwa eine 10fache Verschiebung der Peak-Fluoreszenzintensität, die für Flt4/IgG spezifisch war (2). Versuche der Expressionsklonierung dieses mutmaßlichen Membran-gebundenen Liganden durch die Transfektion von Pools von cDNA-Klonen in COS-Zellen, gefolgt von Screenen mit markiertes Flt4/IgG ergab keine Positiva von 640 Pools von jeweils 1.000 bis 5.000 Klonen. Flt4/IgG wurde auch verwendet, um polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper zu erzeugen, die Agonisten-Aktivität aufwiesen und die verwendet wurden, um den Flt4-Tyrosin-Phosphorylierungstest zu entwickeln, wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
  • Dritten wurden Kandidaten-Ligadenproteine auf ihre Fähigkeit getestet, sich an Flt4/IgG zu binden oder den Flt4-Phosphorylierungstest zu aktivieren. Markierte VEGF band sich nicht an Flt4/IgG, obwohl die erwartete Bindung von VEGF an Flt1/IgG oder Flk1/IgG routinemäßig detektiert wurde. Das Versagen von VEGF, sich an Flt4 zu binden oder seine Phosphorylierung zu stimulieren, ist von Pajusola et al., Oncogene 9, oben, berichtet worden. Durch die Verwendung von Klonierungstechiken wurde ein weiteres Kandidaten-Ligandenprotein gefunden, und Details davon sind dem nachstehenden Beispiel 3 zu entnehmen. Die humane VRP-cDNA-Sequenz ist in 1A–1D dargestellt. Das vorhergesagte Molekulargewicht des Proteins ist 44,8 kDa.
  • Nun folgt eine Beschreibung, wie das biologisch aktive humane VRP hergestellt werden kann.
  • 1. Herstellung von VRP
  • Ein Großteil der nachstehenden Erörterung betrifft die Produktion von VRP durch das Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der die VRP-Nucleinsäure enthält, und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur. Weiters ist daran gedacht, dass das VRP gemäß vorliegender Erfindung durch homogene Rekombination hergestellt werden kann, wie in der am 16. Mai 1991 veröffentlichten WO 91/06667 vorgesehen.
  • Kurz zusammengefasst umfasst dieses Verfahren die Transformation primärer menschlicher Zellen, die ein humanes VRP-Kodierungsgen enthalten, mit einem Konstrukt (z. B. einem Vektor), das ein amplifizierbares Gen [wie Diyhdrofolatreduktase (DHFR) oder andere, wie nachstehend erörtert] und zumindest eine Flankierungsregion mit einer Länge von zumindest etwa 150 bp umfasst, die mit einer DNA-Sequenz am Ort der Kodierungsregion des VRP-Gens homolog ist, um für die Amplifizierung des VRP-Gens zu sorgen. Das amplifizierbare Gen muss sich an einer Stelle befinden, die die Expression des VRP-Gens nicht stört. Die Transformation wird so durchgeführt, dass das Konstrukt homolog in das Genom der primären Zelle integriert wird, um eine amplifizierbare Region zu definieren.
  • Selektion bezüglich primärer Zellen, die das Konstrukt umfassen, erfolgt dann durch das amplifizierbare Gen oder einer anderen Markierung, die im Konstrukt vorliegt. Das Vorhandensein des Markierungsgens ermittelt das Vorhandensein und die Integration des Konstrukts in das Wirtsgenom. Es muss keine weitere Selektion der primären Zellen durchgeführt werden, da die Selektion im zweiten Wirt erfolgt. Falls gewünscht, kann das Auftreten des homologen Rekombinationsereignisses bestimmt werden, indem PCR eingesetzt wird und entweder die resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen sequenziert werden oder die angemessene Länge des PCR-Fragments bestimmt wird, wenn DNA von korrekten. homologen Integranten vorhanden ist und nur jene Zellen expandiert werden, die derartige Fragmente enthalten. Auch können, falls gewünscht, die ausgewählten Zellen an diesem Punkt amplifiziert werden, indem die Zellen mit dem angemessenen Amplifzierungsmittel (wie Methotrexat, wenn das amplifizierbare Gen DHFR ist) belastet werden, so dass mehrere Kopien des Zielgens erhalten werden. Vorzugsweise jedoch wird der Amplifizierungsschritt erst nach der zweiten nachstehend beschriebenen Transformation durchgeführt.
  • Nach dem Selektionsschritt werden DNA-Abschnitte des Genoms, die ausreichend groß sind, um die gesamte amplifizierbare Region zu umfassen, von den ausgewählten primären Zellen isoliert. Sekundäre Säugetier-Expressionswirtszellen werden dann mit diesen genomischen DNA-Abschnitten transformiert und kloniert, und es werden Klone ausgewählt, die die ampflizierbare Region enthalten. Die amplifizierbare Region wird dann durch ein Amplifizierungsgen amplifiziert, wenn sie nicht bereits in den primären Zellen amplifiziert wurde. Schließlich werden die sekundären Expressionswirtszellen gezüchtet, die nun mehrere Kopien der amplifizierbaren Region umfassen, die VRP enthält, um das Gen zu exprimieren und das Protein zu erzeugen.
  • A. Isolierung von für VRP kodierender DNA
  • Die für VRP kodierende DNA kann aus jeder cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die VRP-mRNA aufweist, und dass sie sie in einer detektierbaren Menge exprimiert. Demgemäß kann humane VRP-DNA zweckmäßig aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus humanem Gehirngewebe, beispielsweise einer Gliazellenlinie, erhalten wird. Das für VRP kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotid-Synthese erhalten werden.
  • Bibliotheken werden mit Sonden (wie Antikörpern gegen das VRP oder Oligonucleotide mit etwa 20 bis 80 Basen) gescreent, die dazu bestimmt sind, das Gen von Interesse oder das Protein zu identifizieren, für das es kodiert. Das Screenen der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren durchgeführt werden, wie in Kapitel 10 bis 12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben. Ein alternatives Mittel zum isolieren das für VRP kodierenden Gens besteht darin, PCR-Methodik einzusetzen, wie in Abschnitt 14 von Sambrook et al., oben, beschrieben.
  • Ein bevorzugtes. Verfahren zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung besteht darin, sorgfältig ausgewählte Oligonucleotidseqenzen zu verwenden, um cDNA-Bibliotheken von verschiedenen humanen Geweben, vorzugsweise Gehirnzelllinien, zu screenen. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, um falsche positive Ergebnisse zu minimieren.
  • Das Oligonucleotid muss so markiert sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek detektiert werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren besteht darin, 32P-markiertes ATP mit Polynucleotidkinase zu verwenden, wie nach dem Stand der Technik wohlbekannt, um das Oligonucleotid Radiomarkierung zu unterziehen. Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, um das Oligonucleotid zu markieren, darunter, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotinylierung oder Enzymmarkierung.
  • Bei manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nucleinsäuresequenz die native VRP-Signalsequenz. Nucleinsäure, die die gesamte Proteinkodierungssequenz aufweist, wird durch das Screenen von ausgewählter cDNA oder genomischer Bibliotheken erhalten, wobei erstmals die hierin offenbarte abgeleitete Aminosäuresequenz verwendet wird und, falls erforderlich, herkömmliche Primerverlängerungsverfahren eingesetzt werden, wie in Abschnitt 7.79 von Sambrook et al., oben, beschrieben, um Vorläufer zu detektieren und mRNA-Zwischenprodukte zu verarbeiten, die nicht reverse Transkription in cDNA erfahren haben.
  • Aminosäuresequenzvarianten für VRP werden hergestellt, indem geeignete Nucleotid-Veränderungen in die VRP-DNA eingebracht werden, oder durch die Synthese des erwünschten VRP-Polypeptids. Derartige Varianten stellen Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen von Resten innerhalb von oder an einem oder beiden der Enden der Aminosäuresequenz dar, die für das VRP in 1 gezeigt wird. Vorzugsweise stellen diese Varianten Insertionen und/oder Substitutionen innerhalb von oder an einem oder beiden Enden der reifen Sequenz und/oder Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen innerhalb oder an einem oder beiden der Enden der Signalsequenz für VRP dar, wie in 1 gezeigt. Jede beliebige Kombination aus Insertion, Substitution und/oder Deletion wird vorgenommen, um das Endkonstrukt zu erreichen, mit der Maßgabe, dass das Endkonstrukt die gewünschte biologische Aktivität wie hierin definiert aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch die posttranslationalen Prozesse des VRP verändern, wie die Anzahl oder Position der Glykoslierungsstellen ändern, die Membran-Verankerungseigenschaften ändern und/oder die intrazellulare Position des VRP ändern, indem die Leadersequenz des VRP insertiert, gelöscht oder auf andere Weise beeinflusst wird.
  • Variationen in der nativen Sequenz wie oben beschrieben können vorgenommen werden, indem eine beliebige der Techniken und Richtlinien für konservative und nicht konservative Mutationen eingesetzt werden, wie in US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt. Dazu gehören Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Sie auch beispielsweise Tabelle 1 der vorliegenden Beschreibung und die Erörterung zu dieser Tabelle für eine Anleitung zur Auswahl von Aminosäuren zum Ändern, Hinzufügen oder Löschen.
  • B. Insertion von Nucleinsäure in replizierbaren Vektor
  • Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für nativen oder varianten VRP kodiert, wird für weiters Klonieren (Amplifizierung der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert. Es stehen viele Vektoren zu Verfügung. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • (i) Signalsequenzkomponente
  • Die VRPs gemäß vorliegender Erfindung können rekombinant nicht nur direkt sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, bei dem es vorzugsweise um eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids handelt. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der VRP-DNA sein, der in den Vektor insertiert wird. Bei der ausgewählten heterologen Signalsequenz handelt es sich vorzugsweise um eine, die von der Wirtszelle erkannt und verarbeitet wird (d. h. Spaltung durch eine Signalpeptidase). Bei prokaryotischen Wirtszellen, die das native VRP-Signal nicht erkennen und verarbeiten, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkaliphosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin II-Leadern ausgewählt wird. Für die Hefe-Sekretion kann die native Signalsequenz beispielsweise durch den Hefe-Invertaseleader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer in dem am 23. April 1991 ausgegebenen US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird), oder Saure-Phosphatase-Leader, den C.albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das Signal, das in der am 15. November 1990 veröffentlichten WO 90/13646 beschrieben wird, substituiert werden. Bei Säugetier-Zellexpression ist die native Signalsequenz (z. B. die VRP-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von VRP von menschlichen Zellen in vivo lenkt) zufriedenstellend, es können jedoch auch andere Signalsequenzen geeignet sein, wie z. B. Signalsequenzen von anderen Tier-VRPs, und Signalsequenzen von sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpes simplex-gD-Signal.
  • Die DNA für eine solche Vorläuferregion wird in Leserahmen an DNA ligiert, die für das reife VRP kodiert.
  • (ii) Replikatikonsursprung-Komponente
  • Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. im Allgemeinen Ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und sie umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsursprung vom Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist die Replikationsursprungkomponente für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden, weil er den frühen Promotor enthält).
  • Die meisten Expressionsvektoren sind ”Shuttle”-Vektoren, d. h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird in Vektor in E.coli kloniert, und dann wird der gleiche Vektor zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht unabhängig vom Wirtszellenchromosom replizieren kann.
  • DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Das lässt sich leicht unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte erreichen, beispielsweise indem in den Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer Sequenz komplementär ist, die genomischer Bacillus-DNA zu finden ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor führt zu homogener Rekombination mit dem Genom und Insertion von VRP-DNA. Die Gewinnung von genomischer DNA, die für VRP kodiert, ist jedoch komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzym-Verdau erforderlich ist, um die VRP-DNA auszuschneiden.
  • (iii) Selektionsgenkomponente
  • Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Diese Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Züchten transformierter Wirtszellen erforderlich ist, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden. Nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transfomierte Wirtszellen überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrcat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe zuführen, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z. B. das Gen, das für D-Analin-Racemase für Bacilli kodiert.
  • Bei einem Beispiel für ein Selektionsschema wird ein Arzneimittel eingesetzt, um das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert werden, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht, und überleben so die Selektionsbedingungen. Bei Beispielen für eine solche dominante Selektion werden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin verwendet. Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985). Bei den drei oben angeführten Beispielen werden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle eingesetzt, um Resistenz gegen das entsprechende Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
  • Ein weiteres Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der VRP-Nucleinsäure kompetent sind, wie DHFR oder Thymidin-Kinase. Die Säugetier-Zelltransformanten werden Selektionsdruck ausgesetzt, den allein nur die Transformanten aufgrund dessen überleben können, dass sie den Marker aufgenommen haben. Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Selektionsmittel-Konzentration im Medium daraufhin verändert wird, was sowohl zur Amplifizierung des Selektionsgens als auch der DNA führt, die für VRP kodiert. Amplifizierung ist das Verfahren, durch das Gene, bei denen ein größerer Bedarf für die Produktion eines für Wachstum entscheidenden Proteins besteht, im Tandem innerhalb der Chromosome nachfolgender Generationen rekombinanter Zellen wiederholt werden. Aus der amplifizierten DNA werden erhöhte Mengen an VRP synthetisiert. Andere Beispiele für amplizierbare Gene sind Metallothionein-I- und -II-, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosin-Desaminase, Ornithin-Decarboxylase usw.
  • Beispielsweise werden Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transfomiert werden, zunächst durch Kultivieren all der Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven DHFR-Antagonisten, enthält. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die China-Hamster-Eierstock(CHO-)Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und verbreitet, wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Methotrexat-Mengen ausgesetzt. Das führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und damit einhergehend mehrerer Kopien anderer DNA, die die Expressionsvektoren umfasst, wie für VRP kodierender DNA. Diese Amplifizierungstechniken können bei jedem ansonsten geeigneten Wirt eingesetzt werden, z. B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet des Vorhandenseins von endogenem DHFR, wenn beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen eingesetzt wird, das in hohem Maße resistent gegen Mtx ist ( EP 117.060 ).
  • Alternativ dazu können Wirtszellen [insbesondere Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten], die mit DNA-Sequenzen transformiert oder co-transformiert sind, die für VRP, DHFR-Protein der Wildform und einen anderen selektierbaren Marker wie Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase (APH) kodieren, durch Zellwachstum in Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker enthält, wie Aminoglykosidin-Antibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199 .
  • Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung bei Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder Peptid4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Das Vorhandensein der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellengenom liefert dann eine wirksame Umgebung für die Detektion der Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Auf ähnliche Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide ergänzt, die das Leu2-Gen aufweisen.
  • Außerdem können Vektoren, die vom zurkulären 1,6 μm-Plasmid pKD1 abgeleitet sind, für die Transformation von Gluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). In jüngerer Vergangenheit wurde ein Expressionssystem für die Produktion von rekombinantem Kälber-Chymosin in großem Maßstab für K. lactis berichtet. Van den Berg, Bio/Technology, 8, 135 (1990). Stabile Mehrfachkopie-Expressionsvektoren für die Sekretion von reinem rekombinantem humanem Serumalbumin durch industrielle Kluyveromyces-Stämme wurde ebenfalls offenbart. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
  • (iv) Promotor-Komponente
  • Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die VRP-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind stromauf (5') vom Startcodon eines strukturellen Gens (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1.000 bp) angeordnete untranslatierte Sequenzen, die die Transkription und Translation bestimmter Nucleinsäuresequenz, wie der VRP-Nucleinsäuresequenz, steuern, an die sie operabel gebunden sind. Derartiger Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen, z. B. Vorhandensein oder Fehlen eines Nährstoffs oder Veränderung der Temperatur, erhöhte Mengen an Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle in Gang setzen. Zur Zeit ist eine große Anzahl von Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an für VRP kodierende DNA gebunden, indem der Promotor von der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt wird und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird. Sowohl die native VRP-Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren können verwendet werden, um die Amplifizierung und/oder Expression der VRP-DNA zu lenken. Es werden jedoch heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im Allgemeinen im Vergleich zum nativen VRP-Promotor eine größere Transkription und höhere Ausbeuten an VRP zulassen.
  • Promotoren, die zur Verendung bei prokaryotischen Wirten geeignet sind, sind die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybrid-Promotoren, wie der tac-Promotor. DeBoer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983). Es eignen sich jedoch auch andere bekannte bakterielle Promotoren. Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch es einem Fachmann ermöglicht wird, sie operabel an DNA zu ligieren, die für VRP kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), indem Linker oder Adaptoren verwendet werden, um erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten üblicherweise auch eine Shine-Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die operabel an die für VRP kodierende DNA gebunden ist.
  • Promotorsequenzen für Eukaroyten sind bekannt. So gut wie alle eurkaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle befindet, wo die Transkription in Gang gesetzt wird. Eine weitere Sequenz, die 70 bis 80 Basenpaare stromauf vom Transkriptionsstar vieler Gene zu finden ist, ist eine CXCAAT-REgion, worin X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodierungssequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
  • Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefe-Wirten sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren sind, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkohol-Dehydrogenase 2, Iscytochrom C, Saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoff-Stoffwechsel in Zusammenhang stehen, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase sowie Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Nutzung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefe-Expression werden näher in der EP-A-73.657 beschrieben. Hefe-Enhancer werden bei Hefe-Promotoren ebenfalls vorteilhaft verwendet.
  • Die VRP-Transkription von Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die von den Genomen von Viren wie Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt Simian Virus 40 (SV40), von heterologen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulin-Promotor, von Hitzeschock-Promotoren und von dem Promoter erhalten wird, der normalerweise mit der VRP-Sequenz assoziiert ist, mit der Maßgabe, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellensystemen verträglich sind.
  • Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus werden zweckmäßig als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Aad. Sci. USA 78, 2398–7402 (1981). Der unmittelbar frühe Promotor des Human-Cytomegalovirus wird zweckmäßig als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugetier-Wirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor wird in US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems wird in US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982) bezüglich der Expression von cDNA, die für Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982) bezüglich der Expression von Human-β-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Kontrolle eines Thymidin-Kinase-Promotors von Herpes simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982) bezüglich der Expression des Human-Interferon β1-Gens in kultivierten Mäuse- und Kaninchenzellen; sowie Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982) bezüglich der Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, China-Hamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter Einsatz der langen terminalen Wiederholung von Rous-Sarcomavirus als Promotor.
  • (v) Enhancerelementkomponente
  • Die Transkription einer DNA, die für das VRP gemäß vorliegender Erfindung durch höhere Eukaryoten kodiert, wird häufig durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise etwa von 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und sind 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit gefunden worden, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) ebenso wie innerhalb der Kodierungssequenz selbst. Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984). Heute sind viele Enhancersequenzen von Säugetier-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise jedoch wird ein Enhancer von einem eukaryotischen Zellvirus eingesetzt. Beispiele sind der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikatikonsursprungs (bp 100–270), der frühe Promoter-Enhancer von Cytomegalovirus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982) bezüglich Verstärkungselemente für die Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann einer Position 5' oder 3 zur VRP-Kodierungssequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promoter.
  • (vi) Transkriptionsterminationskomponente
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Menschen- oder kernhältigen Zellen von anderen mehrzelligen Organismen) enthalten auch Sequenzen, die für die Beendigung der Transkription und zur Stabilisation der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise von den untranslatierten 5'- und gegebenenfalls 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für VRP kodierenden mRNA transkribiert werden.
  • (vii) Konstruktion und Analyse von Vektoren
  • Für die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, werden Standard-Ligationstechniken eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der Form wieder ligiert, mit der die erforderlichen Plasmide erzeugt werden sollen.
  • Zur Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E.coli-K12-Stamm 294 (ATCC 3.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Plasmide von den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleasedigestion analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
  • (vii) Vorübergehende Expressionsvektoren
  • Besonders nützlich in der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression in Säugetierzellen von für VRP kodierender DNA sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der effizient in einer Wirtszelle replizieren kann, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors ansammelt und wiederum hohe Mengen eines gewünschten Polypeptids synthetisiert, für das der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., oben, S. 16.17–16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die zweckmäßige positive Identifizierung von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren, sowie das rasche Screenen derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. So sind vorübergehende Expressionssysteme gemäß vorliegender Erfindung besonders nützlich, um Analoge und Varianten von VRP zu identifizieren, die biologisch aktiver VRP sind.
  • (ix) Geeignete exemplarische Wirbeltierzellvektoren
  • Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Anpassung an die Synthese von VRP in rekombinierter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); der EP 117.060 ; und der EP 117.058 beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid für die Säugetier-Zellkulturexpression von VRP ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B. WO 91/02891 , Veröffentlichungsdatum 13. Juni 1991.
  • C. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Geeignete Wirtszellen für die Klonierung oder Expression der DNA in den Vektoren gemäß vorliegender Erfindung sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren eukaryotischen Zellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck sind Eubakterien, wie z. B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie Escherichia, z. B. E.coli, Enterobacter, Erwinia, Kiebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli wie B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in der DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989). Pseudomonas, wie P. aeruginosa und Streptomyces. Ein bevorzugter E.coli-Klonierungswirt ist E.coli 294 (ATCC 41.446), es eignen sich jedoch auch andere Stämme, wie z. B. E.coli B, E.coli X1776 (QTCC41.537) und E.coli W3110 (ATCC27.235). Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da es sich um einen üblichen Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen handelt. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen ausscheiden. Beispielsweise kann Stamm 3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen zu bewirken, die für Proteine kodieren, wobei Beispiele für derartige Wirte E.coli W3110-Stamm 27C7 umfassen. Der vollständige Genotyp von 27C7 ist tonAΔptr3 phoAΔE15 (argF-lac)169 ompTΔ deg P41kan'. Stamm 27C7 wurde am 30 Oktober 1991 in der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der Stamm von E. coil mit mutierter periplasmatischer Protease eingesetzt werden, der im am 7. August 1990 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.946.783 offenbart wird. Als weitere Alternative dazu eignen sich Klonierungsverfahren, beispielsweise PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen.
  • Neben Prokaryoten eignen sich auch eukaryotische Mikrobe, wie Fadenpilze oder Hefe als Klonierungs- oder Expressionswirte für für VRP kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Backhefe ist der am häufigsten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Es sind jedoch auch eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme leicht erhältlich und gemäß vorliegender Erfindung nützlich, wie Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139,383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., oben), wie beispielsweise K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., oben), K. thermotoleans und K. marxianus; Yarowia [ EP 402.22 ]; Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie Schwanniomyces occidentalis ( EP 394,538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie beispielsweise Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991), sowie Aspergillus-Wirte wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger, Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985).
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem VRP werden von mehrzelligen Organismen abgeleitet. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur einsetzbar, gleichgültig, ob sie aus Wirbeltier- oder Wirbellosen-Kultur stammt. Beispiele für Wirbellosen-Zellen sind Pflanzen- und Insektenzellen. Es sind zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten sowie entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila meanogaster (Obstfliege) und Bonbyx mori identifiziert worden. Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279; sowie Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Vielzahl viraler Stämme für die Transfektion sind allgemein erhältlich, beispielsweise die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können hierin als Virus gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden, insbesondere für die Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen.
  • Pflanzenzellkulturen aus Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bacteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das zuvor manipuliert worden ist, um die für VRP kodierende DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellenkultur mit A. tumefaciens wird die für das VRP kodierende DNA auf den Pflanzenzellenwirt übertragen, so dass sie transfiziert wird und unter angemessenen Bedingungen die für VRP kodierende DNA exprimiert. Außerdem sind Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie die Nopalinsynthasepromotor- und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem können DNA-Segmente, die von der stromauf befindlichen Region des T-DNA 780-Gens isoliert werden, die Transkriptionsmengen der Pflanzen-exprimierbaren Gene in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe aktivieren oder erhöhen. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
  • Jedoch war das Interesse an Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist heute ein Routineverfahren. Siehe z. B. Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson (Hrsg.) (1973). Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszellenlinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humane embryonale Nierenlinie (293 oder 2983-Zellen, subkloniert für das Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); China-Hamster-Eierstockzellen(-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)), Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Afrikanische Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane Zervikalkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34), Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); Menschen-Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), Menschen-Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Milchdrüsentumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383; 44–68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; und eine humane Hepatomlinie (Hep G2).
  • Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren für die VRP-Produktion transfiziert und vorzugsweise transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die auf angemessene Weise modifiziert waren, um Promotoren zu induzieren, Transfomanten auszuwählen oder die für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren.
  • Transfektion bezeichnet die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob tatsächlich irgendwelche Kodierungssequenzen exprimiert werden. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind zahlreiche Verfahren zur Transfektion bekannt, beispielsweise CaPO4 und Elektroporation.
  • Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen festgestellt, wenn irgendein Hinweise für die Tätigkeit dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
  • Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einem Organismus, so dass die DNA entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Einsatz von Standardtechniken, die derartigen Zellen zu eigen sind. Die Kalziumbehandlung unter Einsatz von Kalziumchlorid, wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., oben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zeilen eingesetzt, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transformation bestimmter Pflanzenzellen eingesetzt, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben. Außerdem können Pflanzen unter Einsatz von Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie in der am 10. Jänner 1991 veröffentlichten WO 91/00358 beschrieben.
  • Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das Kalziumphosphat-Fällungsverfahren von Graham und von der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen sind im am 16. August 1983 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen eingesetzt werden, etwa durch Nucleus-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, beispielsweise Polybren, Polyornithin usw. Verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen sind Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988), zu entnehmen.
  • D. Kultivieren der Wirtszellen
  • Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um das VRP-Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung zu erzeugen, werden in geeigneten Medien kultiviert, wie von Sambrook et al., oben, beschrieben.
  • Die Säugetier-Wirtszellen, die verwendet werden, um das VRP gemäß vorliegender Erfindung zu erzeugen, können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma); Minimal Essential Medium ([Membran], Sigma. RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) eignen sich zum Kultivieren der Wirtszellen. Außerdem können beliebige der Medien, die in Ham und Wallace Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); den US-Patenten Nr. 4.767.704 ; Nr. 4.657.866 ; Nr. 4.927.762 ; Nr. 4.560.655 ; oder Nr. 5.122.469 ; WO 90/03430 ; WO 87/00195 ; oder US-Patent Re. 30.985 beschrieben werden, können als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Alle diese Medien können nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. HEPES), Nucleosiden (wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. GentamycinTM-Arzneimittel), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolekularen Bereich vorliegen) und Glucose- oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Alle anderen erforderlichen Ergänzungen können in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die zuvor bei der für die Expression gewählten Wirtszelle eingesetzt wurden, und sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar.
  • Im Allgemeinen sind Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Säugetier-Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.) (IRL Press, 1991) zu finden.
  • Die Wirtszellen, auf die in der vorliegenden Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die innerhalb eines Wirtstieres vorliegen.
  • E. Detektion von Genamplifizierung/Expression
  • Genamplifizierung und/oder Expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder Hybridisierung in situ, wobei eine angemessen markierte Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen eingesetzt wird. Es können verschiedene Markierungen eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere 32P. Es können jedoch auch andere Techniken eingesetzt werden, wie die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zum Einbringen in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Stelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl von Markierungen markiert sein können, wie Radionuclide, Fluoreszenzmittel, Enzyme oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche das Vorhandensein von an den Duplex gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
  • Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, beispielsweise immunhistochemisches Färben von Gewebeabschnitten und Test von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Genprodukt-Expression direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbungstechniken wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratation und Fixierung, gefolgt von Umsetzung mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Markierungen üblicherweise visuell detektierbar sind, wie enzymatische Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbungstechnik, die sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignet, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
  • Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder den Test von Probenfluids nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem Säugetier hergestellt werden. Zweckmäßigerweise können die Antikörper gegen ein natives VRP-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen hergestellt werden, wie im nachstehenden Abschnitt 4 detaillierter beschrieben.
  • F. Reinigung von VRP-Polypeptid
  • VRP wird aus dem Kulturmedium vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid gewonnen, es kann jedoch auch aus Wirtszellen-Lysaten gewonnen werden, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal erzeugt wird. Wenn das VRP Membrangebunden ist, kann es aus der Membran unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z. B. Triton-X 100) freigesetzt werden.
  • Wenn VRP in einer rekombinanten Zelle erzeugt wird, die nicht humanen Ursprungs ist, ist das VRP vollständig frei von Proteinen oder Polypeptiden humanen Ursprungs. Es ist jedoch notwendig, VRP aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen sind, was VRP betrifft. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zelltrümmer zu entfernen. VRP wird daraufhin von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren für geeignete Reinigungsverfahren exemplarisch sind: durch Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule; Ethanol-Fällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselsäure oder einem Kationen-Austauschharz wie DEAE; Chromatofokusssierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration beispielsweise unter Einsatz von Sephade G-75; sowie Protein A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen wie IG zu entfernen.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform ist die Flt4-Rezeptor-IgG-Fusion auf einer Affinitätschromatographiesäule immobilisiert, und das VRP kann durch Affinitätsreinigung unter Einsatz dieser Säule isoliert werden. Alternativ dazu wird das VRP an seinem N-Terminus an eine Glykoprotein D-Sequenz gebunden und wird über eine Affinitätschromatographiesäule geschickt, auf der ein monoklonaler Anti-gD-Antikörper wie 5B6 immobilisiert ist, der für eine Glykoprotein D-Sequenz spezifisch ist.
  • VRP-Varianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, werden auf die gleiche Weise wie natives VRP gewonnen, wobei jegliche wesentliche Änderungen der Eigenschaften berücksichtigt werden, für die die Variation Anlass gibt. Beispielsweise erleichtert die Herstellung einer VRP-Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, beispielsweise einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Immunaffinitätssäule, die Antikörper gegen das Antigen enthält, kann eingesetzt werden, um das Fusionspolypeptid zu adsorbieren. Immunaffinitätssäulen, wie eine polyklonale Kaninchen-Anti-VRP-Säule, kann eingesetzt werden, um die VRP-Variante zu absorbieren, indem sie an zumindest ein verbleibendes Immunepitop gebunden wird.
  • Ein Protease-Inhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann ebenfalls nützlich sei, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und Antibiotika können enthalten sein, um das Wachstum zufälliger Verunreinigungen zu verhindern, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird klar sein, dass Reinigungsverfahren, die für native VRP geeignet sind, eine Modifikation erfordern können, um Veränderungen im Charakter von VRP oder seiner Varianten bei der Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
  • G. Kovalente Modifikationen von VRP-Polypeptiden
  • Kovalente Modifikationen von VRP-Polypeptiden fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Sowohl natives VRP als auch Aminosäuresequenzvarianten des VRP können kovalent modifiziert werden. Ein Typ kovalenter Modifikation des VRP wird in das Molekül eingeführt, indem Target-Aminosäurereste des VRP mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das fähig ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des VRP zu reagieren.
  • Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen) umgesetzt, wie z. B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, was Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate ergibt. Cysteinylreste werden ebenfalls durch die Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophonol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert. Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat mit pH 5,5 bis 7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidyl-Seitenkette relativ spezifisch ist. p-Bromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
  • Lysinyl und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-aminohältigen Resten sind Imidoester, wie Methylpicolinimidat, Pyrodoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten macht es aufgrund des hohen PKa der funktionellen Guanidingruppe erforderlich, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt werden. Weiters können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Arginin-ε-Aminogruppe reagieren.
  • Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann durchgeführt werden, wobei besonderes Interesse daran besteht, durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan Spektralmarkierungen in Tyrosylreste einzubringen. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Einsatz von 125I oder 131I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung bei Radioimmuntest herzustellen, wobei das Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
  • Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' unterschiedliche Alyklgruppen sind, wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
  • Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, um VRP zur Verwendung beim Verfahren zur Reinigung von Anti-VRP-Antikörpern mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zu vernetzen und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel sind beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, darunter Disuccinimidylester, wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben lichtaktivierbare Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht Vernetzungen bilden können. Alternativ dazu werden reaktive Wasser-unlösliche Matrizen, wie Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten Nr. 3.969.287 ; Nr. 3.691.128 ; Nr. 4.247.642 ; Nr. 4.229.537 ; und Nr. 4.330.440 beschrieben werden, zur Protein-Immobilisierung eingesetzt.
  • Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen desamidiert. Die desamidierte Form dieser Reste fällt in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
  • Andere Modifikationen sind die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), die Acetylierung von N-terminalem Amin und die Amidierung einer C-terminalen Carboxylgruppe.
  • Ein weiterer Typ kovalenter Modifikation des VRP-Polypeptids, der in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fällt, umfasst das Abändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Mit Abänderung ist die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydrat-Gruppierungen, die im nativen VRP zu finden sind, und/oder die Addition einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen gemeint, die im nativen VRP nicht vorhanden sind.
  • Die Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezeichnet die Bindung der Kohlenhydrat-Gruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Bindung der Kohlenhydrat-Gruppierung an die Asparagin-Seitenkette. Somit schafft das Vorhandensein einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine potentielle Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezeichnet die Bindung eines der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, es können jedoch auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden.
  • Die Addition von Glykosylierungsstellen zum VRP-Polypeptid wird zweckmäßig erreicht, indem die Aminosäuresequenz so abgeändert wird, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-gebundene Glykosylierungsstellen) enthält, Die Änderung kann auch durch die Addition von oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste an der nativen VRP-Sequenz (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) vorgenommen werden. Zur Erleichterung wird die VRP-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Veränderungen auf DNA-Ebene geändert, insbesondere durch Mutieren der für das VRP-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatieren. Die DNA-Mutation(en) kann bzw. können unter Einsatz von Verfahren vorgenommen werden, die oben und im oben genannten US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden.
  • Ein weiteres Mittel zum Erhöhen der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen auf dem VRP-Polypeptid ist jenes durch chemisches oder enzymatisches Koppeln von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als sie nicht die Produktion des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die Glykosylierungsfähigkeiten für N- oder O-gebundene Glykosylierung aufweist. In Abhängigkeit von der verwendeten Kopplungsart, kann/können der bzw. die Zucker an (a) Arginin und Hidistin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen wie jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen wie jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste wie jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren werden in der am 11. September 1987 veröffentlichten WO 87/05330 und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, S. 259–306 (1981) beschrieben.
  • Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem VRP-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erreicht werden. Chemische Deglykosylierung erfordert das Einwirken der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung auf das Polypeptid. Diese Behandlung führt zur Spaltung eines Großteils der oder aller Zucker mit Ausnahme des Bindungszuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt belassen wird. Chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys, 259, 52 (1987) und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben, Enzymatische Spaltung der Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben.
  • Die Glykosylierung an potentiellen Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin verhindert werden, wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 25705 (1982) beschrieben. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glykosid-Bindungen.
  • Ein weiterer Typ kovalenter Modifikation von VRP umfasst das Binden des VRP-Polypeptids an eines aus einer Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, beispielsweise Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, auf die Weise, wie in den US-Patenten Nr. 4.640.835 , Nr. 4.496.689 ; Nr. 4.301.144 ; Nr. 4.670.417 , Nr. 4.791.192 oder Nr. 4.179.337 dargelegt.
  • Da es häufig schwierig ist, im Voraus die Eigenschaften eines varianten VRP vorherzusagen, ist festzustellen, dass ein gewisses Screenen der gewonnenen Variante erforderlich ist, um die optimale Variante auszuwählen. Eine Veränderung der immunologischen Charakters des VRP-Moleküls, wie Affinität für einen bestimmten Antikörper, kann auch durch einen kompetitiven Immuntest gemessen werden. Die Variante wird durch Vergleich mit der Aktivität, die bei nativem VRP im gleichen Test beobachtet wird, auf Änderungen in der Unterdrückung oder Verstärkung ihrer mitogenen Aktivität getestet. Beispielsweise kann bezüglich der Fähigkeit des varianten VRP gescreent werden, Protein-Kinase-Aktivität des Flt4-Rezeptors wie im Beispiel 5 der vorliegenden Beschreibung beschrieben zu stimulieren. Andere potentielle Modifikationen von Protein- oder Polypeptid-Eigenschaften, wie Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder die Tendenz zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden nach Verfahren getestet, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind.
  • H. Epitop-markiertes VRP
  • Die vorliegende Erfindung umfasst chimäre Polypeptide, die an ein anderes Polypeptid fusioniertes VRP umfassen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das chimäre Polypeptid eine Fusion des VRP mit einem Marker-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden kann. Der Epitop-Marker wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyl-Terminus des VRP angeordnet. Derartige Epitop-Marker-Formen des VRP sind wünschenswert, da ihr Vorhandensein unter Einsatz eines markierten Antikörpers gegen das Marker-Polypeptid detektiert werden kann. Ebenso ermöglicht es das Bereitstellen des Epitop-Markers, dass das VRP leicht durch Affinitätsreinigung unter Einsatz des Anti-Marker-Antikörpers gereinigt wird. Affinitätsreinigungstechniken und Diagnosetests, an denen Antikörper beteiligt sind, werden weiter unten beschrieben.
  • Marker-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele sind das fluHA-Marker-Polypeptid und sein Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); der c-myc-Marker und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dafür (Evan et al., Molecular und Cellular Biology, 5, 3610–3616 (1985)); und der Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein D-(gD-)Marker und sein Antikörper. Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6), 547–553 (1990). Andere Marker-Polypeptide sind offenbart worden. Beispiele sind das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology, 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und der T7-Gen-10-Proteinpeptid-Marker. Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87-6393-6397 (1990). Sobald das Marker-Polypeptid ausgewählt worden ist, kann ein Antikörper dagegen unter Einsatz von hierin offenbarten Techniken erzeugt werden.
  • Die allgemeinen Verfahren, die sich für die Konstruktion und Produktion von VRP mit Epitop-Marker eignen, sind die gleichen wie oben in Bezug auf (natives oder variantes) VRP offenbart. VRP-Marker-Polypeptidfusionen werden am zweckmäßigsten konstruiert, indem die cDNA-Sequenz, die für den VRP-Abschnitt kodiert, im Rahmen an die Marker-Polypeptid-DNA-Sequenz fusioniert wird und das resultierende DNA-Fusionskonstrukt in geeigneten Wirtszellen exprimiert wird. Üblicherweise wird, wenn die VRP-Marker-Polypeptid-Chimären gemäß vorliegender Erfindung hergestellt werden, Nucleinsäure, die für das VRP kodiert, an ihrem 31 Ende an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Marker-Polypeptids kodiert, es sind jedoch auch 5'-Fusionen möglich.
  • VRP mit Epitop-Marker kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie unter Einsatz des Anti-Marker-Antikörpers gereinigt werden. Die Matrix, an die der Affinitätsantikörper gebunden ist, ist am häufigsten Agarose, es stehen jedoch auch andere Matrizen zur Verfügung (z. B. Glas mit kontrollierten Poren oder Poly(styroldivinyl)benzol). Das VRP mit Epitop-Marker kann von der Affinitätssäule eluiert werden, indem beispielsweise der Puffer-pH oder die Ionenstärke variiert wird oder chaotrope Mittel zugegeben werden.
  • 2. Therapeutische Verwendungen, Zusammensetzungen und Verabreichung von VRP
  • Es wird angenommen, das VRP therapeutische Anwendung bei der Behandlung von Säugetieren über die Stimulation oder Hemmung des Wachstums und/oder der Differenzierung und/oder Aktivierung von Zellen findet, die den Flt4-Rezeptor oder einen oder mehrere andere VRP-Rezeptoren aufweisen. Exogenes VRP kann einem Patienten unter diesen Umständen verabreicht werden. Das humane VRP ist klar insofern nützlich, als es einem Menschen mit verringertem Spiegel an endogenem VRP verabreicht werden kann, vorzugsweise in der Situation, wo ein derartige verringerte Mengen zu einer pathologischen Störung führen oder wo keine Aktivierung oder Hemmung des Flt4-Rezeptors in einem oder mehreren anderen VRP-Rezeptoren vorliegt.
  • Verschiedene potentielle therapeutische Verwendungen für VRP sind jene, bei denen VEGF nützlich ist. Beispiele dafür sind Verwendungen, die mit dem Gefäß-Endothel verbunden sind, wie die Behandlung von Traumata am Gefäßnetzwerk, in Anbetracht der gezeigten raschen Förderung der Vermehrung von die Traumata umgebenden Gefäß-Endothelzellen durch VEGF und in Anbetracht der Beziehung zwischen VEGF und dem VRP, wie hierin ermittelt. Beispiele für derartige Traumata, die so behandelt werden können, sind, ohne darauf beschränkt zu sein, chirurgische Einschnitte, insbesondere jene, die das Herz betreffen, Wunden, einschließlich Risswunden, Einschnitte und Penetration von Blutgefäßen, sowie oberflächliche Geschwüre, die das Gefäßendothel betreffen, wie Diabetes-, Haemophilie- und Krampfadern-Geschwüre. Andere physiologische Zustände, die auf Basis des selektiven mitogenen Charakters des VRP verbessert werden können, fallen ebenfalls in diesen Bereich.
  • Für die oben angeführten traumatischen Indikationen wird das VRP-Molekül in einer Weise formuliert und dosiert, die mit der guten medizinischen Praxis in Einklang steht, wobei die spezifische zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle dar Abgabe des VRP, das Verabreichungsverfahren und andere Faktoren berücksichtigt werden, die Praktikern bekannt sind.
  • Weitere Indikationen für das VRP finden sich bei der Behandlung von Wunden voller Dicke, wie Hautgeschwüre, einschließlich der Kategorien der Druckgeschwüre, Venengeschwüre und Diabetesgeschwüre, sowie Verbrennungen und Verletzungen voller Dicke, wo Angiogenese erforderlich ist, um die verbrannte oder verletzte Stelle für Hauttransplantation oder -lappen vorzubereiten. In diesem Fall wird das VRP entweder direkt an der Stelle angewandt oder verwendet, um die Haut der den Lappen, die transplantiert werden, vor der Transplantation einzuweichen. Auf ähnliche Weise kann das VRP bei plastischer Chirurgie, wenn Rekonstruktion nach einer Verbrennung oder einem anderen Trauma erforderlich ist, oder für kosmetische Zwecke verwendet werden.
  • Angiogenese ist auch wichtig, um Wunden sauber und infektionsfrei zu halten. Das VRP kann daher in Verbindung mit Allgemeinchirurgie und nach der Wiederherstellung von Schnitten und Risswunden verwendet werden. Es ist besonders nützlich bei der Behandlung von Bauchwunden mit einem hohen Infektionsrisiko. Gefäßneubildung ist auch ein Schlüssel für die Wiederherstellung von Brüchen, da sich Blutgefäße an der Stelle der Knochenverletzung entwickeln. Die Verabreichung des VRP an die Stelle eines Bruchs ist daher ein weiteres Einsatzgebiet.
  • In Fällen, wo das VPR für topische Wundheilung eingesetzt wird, kann es auf dem nachstehend beschriebenen Wege für die Re-Endothelisierung von Gefäßgewebe oder mehr bevorzugt durch topische Mittel verabreicht werden. In diesen Fällen wird es entweder als Lösung, Spray, Gel, Creme, Salbe oder trockenes Pulver direkt an die Verletzungsstelle verabreicht. Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung, die das VRP auf die verletzte Stelle lenken, werden ebenfalls verwendet. Bei topischen Anwendungen wird das VRP in einer Konzentration, die in einem Bereich von etwa 50 bis 1.000 μg/ml liegt, entweder in einer einzelnen Anwendung oder in Dosis-Verabreichungen angewandt, die täglich oder im Abstand weniger Tage für einen Zeitraum von 1 Woche bis mehreren Wochen liegen. Im Allgemeinen ist die Menge der verabreichten topischen Formulierung jene, die ausreicht, um von etwa 0,1 bis 100 μg/cm2 des VRP, bezogen auf die Oberfläche der Wunde, aufzutragen.
  • Das VRP kann als post-operatives Wundheilungsmittel bei Ballon-Angioplastie eingesetzt werden, ein Verfahren, bei dem Gefäßendothelzellen entfernt oder beschädigt werden, gemeinsam mit dem Zusammenpressen atherosklerotischer Plaques. Das VRP kann durch systemische oder lokale intravenöse Anwendung entweder als intravenöse Bolusinjektion oder Infusionen auf Gefäßinnenflächen aufgebracht werden. Falls erwünscht, kann das VRP im Lauf der Zeit unter Einsatz einer Mikrometerpumpe verabreicht werden. Geeignete Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung umfassen das VRP in einer Menge, die wirksam Endothelzellenwachstum fördert, und ein parenterales Trägermaterial. Das VRP kann in der Zusammensetzung über einen weiten Bereich von Konzentrationen vorhanden sein, beispielsweise von etwa 50 μg/ml bis etwa 1.000 μg/ml, wobei Injektionen mit 3 bis 10 ml pro Patient verabreicht werden, die einmal oder in Dosis-Verabreichungen verabreicht werden, die mehrere Anwendungen ermöglichen. Es können alle bekannten parenteralen Trägervehikel verwendet werden, wie normale Kochsalzlösung oder 5 bis 10% Dextrose.
  • Das VRP kann auch eingesetzt werden; um Endothelisierung bei Gefäßtransplantationschirurgie zu fördern. Im Fall von Gefäßtransplantationen, bei denen entweder transplantierte Gefäße oder synthetisches Material verwendet wird, kann das VRP beispielsweise auf die Oberflächen des Transplantats und/oder an den Verbindungsstellen des Transplantats mit der bestehenden Vaskulatur aufgetragen werden, um das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern. Für solche Anwendungen kann das VRP intravenös wie oben für Ballon-Angioplastie beschrieben angewandt werden, oder es kann entweder vor dem oder während des chirurgischen Eingriffs direkt auf die Oberflächen des Transplantats und/oder die bestehende Vaskulatur aufgetragen werden. In solchen Fällen kann es wünschenswert sein, das VRP in einem verdickten Trägermaterial anzuwenden, so dass es an der betroffenen Oberfläche haftet. Geeignete Trägermaterialien umfassen beispielsweise 1–5% Carbopol. Das VRP kann im Träger über einen weiten Konzentrationsbereich enthalten sein, beispielsweise von etwa 50 μg/mg bis etwa 1.000 μg/mg. Alternativ dazu kann das VRP durch eine Mikromesspumpe als parenterale Lösung an die Stelle abgegeben werden.
  • Das VRP kann auch eingesetzt werden, um Gefäßschädigung nach Myocardinfarkt zu reparieren und um die Notwendigkeit für einen Koronar-Bypass-Eingriff zu umgehen, indem das Wachstum eines kollateralen Kreislaufs stimuliert wird. Das VRP wird für diesen Zweck intravenös verabreicht, entweder in einzelnen Injektionen oder durch Mikromesspumpe über einen Zeitraum, wie oben beschrieben, oder durch direkte Infusion oder Injektion in die Stelle des geschädigten Herzmuskels.
  • Therapeutische VRP-Formulierungen werden zur Lagerung hergestellt, indem VRP mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit gegebenenfalls physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Hrsg. A. Osol, (1980)) in Form von lyophilisiertem Kuchen oder wässrigen Lösungen gemischt wird. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Oxidationshemmer wie Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Polypeptide; Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobulin; hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Salz-bildende Gegenionen, wie Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside, wie Tween, Puronics oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Das VRP kann auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden (beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]mikrokapseln) in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Alumbin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nano-Teilchen und Nanokapseln), oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, oben, offenbart.
  • VRP zur Verwendung bei der Verabreichung in vivo muss steril sein. Das lässt sich leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution erreichen. VRP wird normalerweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
  • Therapeutische VRP-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise einen Beutel oder eine Phiole für intravenöse Lösung mit einem Stöpsel, der mit einer Hyperdermalinjektionsnadel durchstochen werden kann.
  • Der Weg der VRP-Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, beispielsweise jenen Wegen, die oben für spezifische Indikationen angeführt sind, sowie den allgemeinen Wegen zur Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intraarterielle oder intraläsionale Mittel, oder Retard-Systeme wie nachstehend angeführt. VRP wird kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolusinjektion verabreicht. Im Allgemeinen sollte das VRP, wenn es die Störung zulässt, für ortsspezifische Abgabe formuliert und dosiert sein. Das ist im Fall von Wunden und Geschwüren zweckmäßig.
  • Geeignete Beispiele für Retard-Präparate sind halbdurchlässige Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formteilen vorliegen, z. B. Filme oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen sind Polyester, Hydrogele [z. B. Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981) und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982) beschrieben, oder Poly(vinylalkohol)], Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 , EP 58.481 ), Copolymere aus L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie Lupron DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen) sowie Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
  • Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte Proteine für längere Zeit im Körper verbleiben, können sie als Ergebnis des Einwirkens von Feuchtigkeit bei 37°C denaturiert werden oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen der immunogenität führt. In Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus können zweckmäßige Strategien für die Proteinstabilisierung entwickelt werden. Wenn beispielsweise entdeckt wird, dass der Aggregationsmechanismus intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann Stabilisierung erreicht werden, indem Sulfhydrylreste modifiziert werden, aus sauren Lösungen lyophilisiert wird, der Feuchtigkeitsgehalt reguliert wird, wobei geeignete Additive eingesetzt und spezifische Polymermatrixzusammensetzungen entwickelt werden.
  • Retard-VRP-Zusammensetzung umfassen auch liposomal festgehaltenes VRP. Liposome, die VRP enthalten, werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; japanische Patentanmeldung Nr. 83-118008 ; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545 ; und EP 102.324 . Üblicherweise gehören die Liposome dem kleinen (etwa 200 bis 800 Angstrom) unilamellaren Typ an, bei dem der Lipidgehalt über etwa 30 Mol-% Cholesterol liegt, wobei das gewählte Verhältnis für die optimale VRP-Therapie eingestellt wird.
  • Bei topischer Verabreichung wird das VRP geeigneterweise mit anderen Komponenten kombiniert, wie Trägern und/oder Adjuvanzien. Es gibt keine Beschränkungen für die Art derartiger anderer Ingredienzen, außer jener, dass sie pharmazeutisch annehmbar und für ihre beabsichtigte Verabreichung wirksam sein müssen und die Aktivität der aktiven Komponenten der Zusammensetzung nicht beeinträchtigen können. Beispiele für geeignete Vehikel sind Salben, Cremes, Gele oder Suspensionen, mit oder ohne gereinigtes Collagen. Es können auch Hautbinden, -pflaster und -bandagen mit den Zusammensetzungen imprägniert werden, vorzugsweise in flüssiger oder halbflüssiger Form.
  • Um eine Gelformulierung zu erhalten, kann das in einer flüssigen Zusammensetzung formulierte VRP mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder synthetischen Polymers wie PEG gemischt werden, um ein Gel mit einer angemessenen Viskosität zur topischen Anwendung zu bilden. Das Polysaccharid, das verwendet werden kann, umfasst beispielsweise Cellulosederivate, wie veretherte Cellulosederivate, einschließlich Alkylcellulosen, Hydroxyalkylcellulosen und Alkylhydroxyalkylcellulosen, beispielsweise Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar; Algininsäure und Alginate; Gummi Arabicum; Pullullan; Agarose; Carrageenan; Dextrane; Dextrine; Fructane; Insulin, Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glykogene; Glucane; sowie synthetische Biopolymere; sowie Kautschuke, wie Xanthanlösung; Guar Gum; Johannisbrotgummi; Gummi Arabicum; Traganthgummi; und Karayagummi, sowie Derivate und Gemische davon. Das bevorzugte Gelierungsmittel gemäß vorliegender Erfindung ist eines, das für biologische Systeme inert, nicht toxisch, einfach herzustellen und nicht zu verlaufend oder viskos ist und das darin gehalten VRP nicht destabilisiert.
  • Vorzugsweise ist das Polysaccharid eine verethertes Cellulosederivat, mehr bevorzugt eines, das gut definiert, gereinigt und in der USP angeführt ist, beispielsweise Methylcellulose und Hydroxyalkylcellulosederivate, wie Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose. Am meisten bevorzugt wird gemäß vorliegender Erfindung Methylcellulose.
  • Das für die Gelierung nützliche Polyethylenglykol ist typischerweise ein Gemisch aus PEGs mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, um die entsprechende Viskosität zu erzielen. Beispielsweise ist ein Gemisch aus einem PEG mit einem Molekulargewicht von 400 bis 600 und einem mit einem Molekulargewicht von 1.500 für diesen Zweck wirksam, wenn es im geeigneten Verhältnis gemischt ist, um eine Paste zu erhalten.
  • Der Begriff ”wasserlöslich” in Bezug auf die Polysaccharide und PEGs ist so zu verstehen, dass damit kolloidale Lösungen und Dispersionen gemeint sind. Im Allgemeinen wird die Löslichkeit der Cellulosederivate durch den Grad der Substitution von Ethergruppen bestimmt, und die gemäß vorliegender Erfindung nützlichen stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge derartiger Ethergruppen pro Anhydroglucoseeinheit in der Cellulosekette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Grad der Ethersubstitution von zumindest 0,35 Ethergruppen pro Anhydroglucloseinheit ist im Allgemeinen ausreichend. Außerdem können die Cellulosederivate in Form von Alkalimetallsalzen, beispielsweise der Li-, Na-, K- oder Cs-Salze, vorliegen.
  • Wenn Methylcellulose im Gel eingesetzt wird, umfasst es vorzugsweise etwa 2 bis 5%, mehr bevorzugt etwa 3% des Gels, und das VRP ist in einer Menge von etwa 300 bis 1.000 mg pro ml Gel vorhanden.
  • Eine wirksame Menge an VRP zum therapeutischen Einsatz hängt beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Demgemäß ist es notwendig, dass der Therapeut die Dosis titriert und den Verabreichungsweg nach Bedarf modifiziert, um die optimale therpeutische Wirkung zu erzielen. Typischerweise verabreicht der Kliniker das VRP, bis eine Dosis erreicht ist, die die gewünschte Wirkung erzielt. Eine typische Tagesdosis für die systemische Behandlung kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis zu 10 mg/kg oder mehr betragen, in Abhängigkeit von den oben genannten Faktoren. Als alternativer allgemeiner Vorschlag wird das VRP in einer Dosis formuliert und an den Zielort abgegeben, mit der im Gewebe eine VRP-Menge über etwa 0,1 ng/cm3 bis zu einer maximalen Dosis erzielt werden kann, die wirksam aber nicht übermäßig toxisch ist. Diese Konzentration innerhalb des Gewebes sollte falls möglich durch kontinuierliche Infusion, nachhaltige Freisetzung, topische Anwendung oder Injektion in empirisch ermittelten Häufigkeiten beibehalten werden. Der Fortschritt dieser Therapie lässt sich durch herkömmliche Tests leicht überwachen.
  • Es liegt im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, die VRP-Therapie mit anderen neuen oder herkömmlichen Therapien (z. B. Wachstumsfaktoren, wie VEGF, saurem oder basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF bzw. bFGF), von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumfaktor (PDGF), Insulin-artigem Wachstumsfaktor (IGF-I oder IGF-II), Nervenwachstumsfaktor (NGF), anabolischen Steroiden, EGF oder TGF-α) zu kombinieren, um die Aktivität eines der Wachstumsfaktoren, einschließlich des VRP, bei der Förderung von Zellvermehrung und -reparatur zu verstärken. Es ist nicht notwendig, dass solche Cobehandlungsarzneimittel an sich in der Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung enthalten sind, obwohl das zweckmäßig ist, wenn derartige Arzneimittel proteinhältig sind. Derartige Gemische werden geeigneterweise auf die gleiche Weise und für die gleichen Zwecke verabreicht wie das allein verwendete VRP. Das sinnvolle Molverhältnis zwischen VRP und solchen sekundären Wachstumsfaktoren beträgt typischerweise 1:0,1 bis 10, wobei etwa äquimolare Mengen bevorzugt werden.
  • 3. Nicht therapeutische diagnostische Verwendungen für VRP
  • Die für das VRP kodierende Nucleinsäure kann als Diagnostikum für gewebespezifische Typisierung verwendet werden. Beispielsweise können Verfahren wie Hybridisierung in situ, Northern- und Southern-Blotting und PCR-Analyse eingesetzt werden, um zu bestimmen, ob DNA und/oder RNA, die für VRP kodiert, in der bzw. den bewerteten Zelltype(n) vorhanden ist. VRP-Nucleinsäure oder Polypeptid können ebenfalls als diagnostische Marker verwendet werden. Beispielsweise kann das VRP markiert werden, indem die hierin beschriebenen Techniken eingesetzt werden, und die Expression von Nucleinsäuremolekülen, die für einen Flt4-Rezeptor oder einen anderen VRP-Rezeptor kodieren, können unter Einsatz des markierten VRP quantifiziert werden.
  • Wenn die humane, für VRP kodierende Nucleinsäure an einem humanen Chromosom lokalisiert ist, kann die Nucleinsäure für humanes VRP als Marker für dieses humane Chromosom verwendet werden.
  • VRP-Nucleinsäure ist auch für die Herstellung von VRP-Polypeptid durch rekombinante Techniken nützlich, wie hierin beispielhaft angeführt.
  • Isoliertes VRP-Polypeptid kann in quantitativen Diagnosetests als Standard oder Kontrolle verwendet werden, denen gegenüber Proben, die unbekannte Mengen ans VRP enthalten, hergestellt werden können.
  • VRP-Präparate sind auch nützlich bei der Erzeugung von Antikörpern als Standards in Tests für VRP (z. B. durch Markierung von VRP zur Verwendung als Standard in Radioimmuntests, Radiorezeptortests oder Enzym-gebundenem Immuntest), um das Vorhandensein des Flt4-Rezeptors oder eines oder mehrerer anderer VRP-Rezeptoren in einer biologischen Probe zu detektieren (z. B. unter Verwendung eines markierten VRP), in Affinitätsreinigungstechniken und in Rezeptorbindungstests vom kompetitiven Typ, wenn sie mit Radioiod, Enzymen, Fluorphoren, Spinmarkierungen oder dergleichen markiert werden.
  • Das VRP ist auch nützlich als Diagnosewerkzeug. Beispielsweise kann das VRP in prokaryotischen Zellen unter Einsatz der hierin ausgeführten Techniken hergestellt werden, und das so hergestellte unglykosylierte Protein kann als Molekulargewichtsmarker verwendet werden. Das abgeleitete Molekulargewicht (mw) des VRP beträgt etwa 44,8 kDa. Um das VRP als Molekulargewichtsmarker zu verwenden, wird beispielsweise Gelfiltrationschromatographie oder SDS-PAGE eingesetzt, um Protein(e) abzutrennen, für das/die das Molekulargewicht im Wesentlichen auf normale Weise bestimmt werden soll. Das VRP und andere Molekulargewichtsmarker werden als Standards verwendet, um einen Molekulargewichtsbereich bereitzustellen. Beispielsweise können als MG-Marker Phosphorylase b (MG = 97.400), Rinderserumalbumin (MG = 68.000), Ovalbumin (MG = 46.000), VRP (MG = 44.800), Trypsininhibitor (MG = 20.100) und Lysozym (MG = 14.400) verwendet werden. Die anderen hier genannten Molekulargewichtsmarker sind im Handel beispielsweise von Amersham Corporation, Arlington Heights, IL, USA erhältlich. Häufig werden die Molekulargewichtsmarker markiert, um die einfache Detektion nach der Trennung zu ermöglichen. Techniken zum Markieren von Antikörpern und Proteinen werden hierin erörtert und sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispielsweise können die Molekulargewichtsmarker biotinyliert werden, und nach der Trennung auf SDS-PAGE kann beispielsweise das Blot mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase inkubiert werden. Die Banden können dann durch Lichtdetektion detektiert werden.
  • Es kann auch nützlich sein, bestimmte Zellen, die den Flt4-Rezeptor oder einen oder mehrere andere VRP-Rezeptoren aufweisen, ex vivo unter Einsatz des VRP als angiogener Faktor oder Wachstumsfaktor zu züchten. So kann beispielsweise das VRP als Wachstumsfaktor bei der in-vitro-Kultivierung von Endothelzellen verwendet werden. Für solche Verwendungen kann das VRP dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von etwa 10 pg/ml bis etwa 10 ng/ml zugegeben werden.
  • Diese Zellen, die ex vivo zu züchten sind, können gleichzeitig anderen bekannten Wachstumsfaktoren oder Zytokinen ausgesetzt werden. Beispiele für Zytokine sind die Interleukine (z. B. IL-3), Granulozytenmakrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), VEGF, Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozytenmakrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Erythropoietin (Epo), Lymphotoxin, Stahlfaktor (SLF), Tumornekrosefaktor (TNF) und γ-Interferon. Das führt zur Vermehrung und/oder Differenzierung der Zellen, die den Flt4-Rezeptor oder einen oder mehrere andere VRP-Rezeptoren aufweisen.
  • Gemäß wieder einem anderen Aspekt der Erfindung kann das VRP für die Affnitätsreinigung des Flt4-Rezeptors oder eines oder mehrerer anderer VRP-Rezeptoren verwendet werden. Kurz zusammengefasst umfasst diese Technik die kovalente Bindung des VRP an einer inerten und porösen Matrix (z. B. mit Bromcyan umgesetzter Agarose). Eine Lösung, die den Flt4-Rezeptor oder (einen) andere(n) VRP-Rezeptor(en) enthält, kann durch das chromatographische Material hindurchgeschickt werden und kann daraufhin freigesetzt werden, indem die Elutionsbedingungen verändert werden (beispielsweise durch Änderung des pH oder der Ionenstärke).
  • Das gereinigte VRP und die dafür kodierende Nucleinsäure kann auch als Reagens für Mechanismus-Untersuchungen von VRP und seiner verwandten Rezeptoren verkauft werden, um die Rolle des VRP und des Flt4-Rezeptors oder anderer VRP-Rezeptoren bei normalem Wachstum und normaler Entwicklung sowie bei anormalem Wachstum und abnormaler Entwicklung, beispielsweise bei malignen Erscheinungen, zu untersuchen.
  • Das VRP kann für das kompetitive Screenen potentieller Agonisten oder Antagonisten für die Bindung an den Flt4-Rezeptor oder andere VRP-Rezeptoren verwendet werden. VRP-Varianten sind nützlich als Standards oder Kontrollen in Tests für das VRP, mit der Maßgabe, dass sie vom verwendeten analytischen System, z. B. einem Anti-VRP-Antikörper, erkannt werden.
  • III. Experimenteller Teil
  • Nachstehend folgenden Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Isolierung von cDNA-Klonen, die für Human-Flt4-Rezeptor kodieren
  • cDNA, die aus mRNA synthetisiert ist, die von der humanen Megakaryozyten-Leukämie-Zelllinie CMK11-5 synthetisiert ist, wurde mit redundanten PCR-Primern auf Basis der konservierten Regionen von Thyrosin-Kinase-Rezeptoren amplifiziert. Wilks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607. (1989). Ein amplifizierte Fragment mit etwa 180 bp mit einer einzigartigen DNA-Sequenz (mit der Bezeichnung SAL-S1 oder tk1; PCT/US 93/00586 , oben) wurde verwendet um cDNA-Bibliotheken von CMK11-5 und DAMI-Zellen zu screenen (Janssen et al., oben), um überlappende Klone zu erhalten, die für die Kurzform voller Länge von Flt4-Rezeptor (1.298 Aminosäuren) kodiert. Die Sequenz der zusammengebauten Flt4-Kodierungsklonie passte zu jener, die von einer Anerythroleukämie-Zelllinie berichtet wurde (Pajusola et al., Cancer Res. oben); sie kodiert für 8 Aminosäure-Unterschiede von einer anderen berichteten Flt4-Sequenz. Galland et al., Oncogene, oben. Klone, die für die lange Form von Flt4 (1.363 Aminosäuren) kodieren, wurden konstruiert, indem die differierende 3'-DNA-Sequenz mit etwa 200 bp auf Basis der veröffentlichten Sequenz synthetisiert wurde. Pajusola et al., Oncogene, 8, oben.
  • BEISPIEL 2
  • Rezeptor-IgG-Fusionsproteine, Flt4/IqG-Antiserum und G61-FACS-Analyse
  • Flt1/IgG (Park et al., oben), Flk1/IgG (Park et al., oben), Rse/IgG (Godowski et al., Cell 82, 355–358 (1995)) und Htk/IgG (Bennett et al., J. Bio. Chem. 269, 14211–14218 (1994)) wurden wie in diesen Literaturstellen beschrieben erzeugt. Für Flt4/IgG wurde DNA, die für die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptors (Aminosäuren 1–775) kodiert, an die Fc-Region einer humanen IgG-Schwerkette an der einzigartigen BstEII-Stelle im Plasmid pBSSK-Fc (pBSSK-CH2CH3) gespleißt. Bennett et al., J. Bio. Chem. 266, 23060–23067 (1991). Der offene Leserahmen, der für Flt4/IgG kodiert, wurde in den Säugetier-Expressionsvektor pRK5 kloniert (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987)), was das Plasmid pRKS.tklig1.1 ergab. Dieses Plasmid wurde durch Elektroporation (Jannsen et al., oben) in 293 Zellen (ATCC CRL 1651) transfiziert, und nach 3 bis 4 Tagen wurde Flt4/IgG aus dem serumfreien konditionierten Medium mit Protein A-Agarose (Calbiochem) gereinigt. Flt4-Antiserum wurde durch Injektion von gereinigtem Flt4/IgG in Kaninchen erzeugt.
  • Unter Verwendung dieses Fusionsproteins, um Zelllinien für Membran-gebundenes VRP- durch FACS-Analyse zu screenen, wurde eine positive Zelllinie identifiziert, G61, wie nachstehend beschrieben.
  • Die humane Gliomzelllinie, G61 (Hamel et al., J. Neurosci. Res. 34, 147–157 (1993)) wurde in F12-DMEM (50:50) (glucosereich) kultiviert, die 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika enthielt. Für die FACS-Analyse von Flt4/IgG, das sich an G61-Zellen bindet, wurde 1 Million Zellen mit 70 nM Rezeptor-IgG-Fusionsprotein in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 5% Ziegenserum, 2% Kaninchenserum 60 min lang bei 4°C inkubiert und dann mit 10 μg/ml Biotin-SP-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-Fc-Antikörper und 10 μg/ml R-Phykoerythrinkonjugiertem Streptavidin (Jackson Immuno Research) gefärbt. G61 verursachte im Vergleich zu Rse/IgG, einem nicht verwandten Tyrosin-Kinase-Rezeptorkomplex, einen etwa 10fachen Anstieg der Peak-Fluoreszenzintensität, die für Flt4/IgG spezifisch war (2). Versuche der Expressionsklonierung dieses mutmaßlichen Membran-gebundenen VRP durch Transfektion von Pools von cDNA-Klonen in COS-Zellen, gefolgt vom Screenen mit markiertem Flt4/IgG ergaben keine positiven Ergebnisse von 640 Pools mit jeweils 1.000 bis 5.000 Klonen,
  • BEISPIEL 3
  • Isolierung von cDNA-Klonen, die für Human-VRP kodieren
  • Eine cDNA-Bibliothek wurde aus polyA+RNA hergestellt, die wie in Cathala et al., DNA 2, 329–335 (1983), und Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408–1412 (1972), beschrieben von der Human-Gliomzelllinie, G61, Hamel et al., oben, isoliert wurde. cDNA wurde aus dieser RNA mit Reagenzien von GiBCO/BRL (SuperScript) hergestellt und in das mit XhoI und NotI verdaute Plasmid pRK5B (Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) kloniert. Für VRP kodierende Klone wurden isoliert, indem die cDNA-Bibliothek mit synthetischen Oligonucleotidsonden auf Basis einer EST-Sequenz gescreent wurden (GenBank-Locus HSC1WF111), was ziemliche Übereinstimmung mit VEGF zeigte. Die EST-Sequenz von HSC1WF111 ist 299 bp lang und ist über 50 Reste zu 36% identisch mit VEGEF, einschließlich einer 11-von-13-Übereinstimmung, beginnend mit der VEGF-Aminosäure 56. Die Sequenz ist folgende:
    Figure 00570001
  • Die Sequenzen der eingesetzten Oligonucleotidsonden ovh1.4 und ovh1.5 sind nachstehend angeführt:
    Figure 00570002
  • Diese beiden Sonden wurden 32P-markiert und in 20% Formamid bei 42°C hybridisiert, mit einer abschließenden Wäsche in 30 mM NaCl/3 mM Trinatriumcitrat bei 55°C. C. Janssen, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995). Aus 650.000 gescreenten Klonen wurden sieben positive identifiziert und charakterisiert. Die Positiven fielen nach Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung in drei Gruppen.
  • Die Klone VH1.4 (pRK.vh1.4.1) und VH1.6 umfassten die volle Kodierungsregion (3A) und wurden vollständig sequenziert. Sie unterscheiden sich nur in der Länge und durch das Fehlen von zwei T's vor der 3'-Poly A-Sequenz in VH1.6. Klon VH1.2 ist kollinear mit VH1.4. Die Klone VH1.3, VH1.5 und VH1.7 sind identisch und weisen im Vergleich zu VH1.4 eine 557-bp-Deletion auf (eine Deletion von bp 519–1075), und Klon VH1.1 weist im Vergleich zu VH1.4 eine 152-bp-Deletion (eine Deletion von bp 924–1075) auf. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von VH1.4 werden in 1 gezeigt.
  • Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen aus 419 Aminosäuren beginnend mit einem ATG-Codon, dem ein Purinrest an Position –3 vorangeht, wie für eine Translationsinitiationsstelle erwartet. Kozak, Nucl. Acids Res. 12, 857–872 (1984). Etwa 250 bp 5' von diesem ATG befinden sich zwei ATG-Codons im Rahmen, kurz (4 oder 10 Aminosäuren) gefolgt von einem Stop-Codon. Beide dieser ATGs weisen ein Pyrimidin an Position –3 auf, und es ist nicht zu erwarten, dass sie als starke Translationsinitiationsstelle fungieren. Kozak, oben. Die kodierte Aminosäuresequenz unmittelbar nach dem Start des 419-Aminosäure-Leserahmens ist hydrophob, was eine aminoterminale Sekretionssignalsequenz anzeigt. Perlman und Halvorson, J. Mol. Biol. 167, 391–409 (1983). Siehe 3A. Die wahrscheinlichste Spaltungsstelle für diese Sequenz befindet sich nach Aminosäure 20, obwohl Spaltung nach den Resten 15 oder 16 nicht ausgeschlossen werden kann (von Heijne, Nuc. Acids Res. 14, 4683–4690 (1986)). Dem offenen Leserahmen geht eine GC-reiche untranslatierte 5'-Region mit etwa 380 bp voraus und folgt eine untranslatierte 3'-Region mit etwa 400 bp.
  • Die vorhergesagte reife Aminosäuresequenz von Human-VRP enthält 399 Aminosäurereste (translatiert Mr = 44,8 kDa), wovon 37 (9,3%) Cysteinreste sind: es gibt drei potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen (3A). Eine Ausrichtung der Aminosäuresequenz von VRP mit den sechs Formen von VEGF und PIGF zeigt, das es die größte Ähnlichkeit mit VEGF121 (32% identisch) und PIGF131 (27% identisch) aufweist (3B); die Positionen von 8 der 9 Cysteinreste werden konserviert. Während VRP die Regionen von Basis-Aminosäuren, die in einigen Formen von VEGF und PIGF zu finden sind, nicht enthält, ist es wesentlich größer als VEGF und enthält eine Cystein-reiche C-terminale Hälfte des Moleküls, die in VEGF nicht zu finden ist. Diese Cystein-reiche Domäne weist vier Kopien des Musters Cys gefolgt von 10 Nicht-Cys-Resten, gefolgt von Cys-X gefolgt von Cys-X und dann von Cys auf (3B), eine Wiederholung, die mehr als 50-mal in einem Diptran-Balbiani-Ring 3-Protein zu finden ist. Paulsson et al., J. Mol. Biol. 211, 331–349 (1990). Ohne sich an eine Theorie zu binden, reagiert VRP möglicherweise über die Cystein-Reste mit anderen Membran-gebundenen Proteinen auf diesen Zellen; eine derartige intermolekulare Wechselwirkung ist für Balbiani-Protein vorgeschlagen worden. Paulsson et al., oben.
  • Zwei der cDNA-Klone (VH1.1 und VH1.3) enthielten eine 152- oder 557-bp-Deletion, wenn sie mit VH1.4 vergleichen wurden (3A). Beide Deletionen enden am selben Nucleotid, und es wird angenommen, dass sie das Ergebnis von alternativem Spleißen sind. Von beiden Deletionen ist zu erwarten, dass sie für das gleiche Rahmen-verschobene Protein 3' von der Deletion kodieren, das an einem Stop-Codon innerhalb von 15 Aminosäuren endet. Das Protein, für das VH1.3 kodiert, enthält ähnliche wie VEGF. nichts von der Kern-Cysteinregion. VH1.1 enthält einen Großteil der Region, die VEGF ähnlich ist; seine Deletion ist jedoch analog u den verschiedenen bekannten Formen von VEGF oder PIGF. Ferrara et al., oben; Maglione et al., oben; Hauser und Weich, oben.
  • 4 offenbart eine Ausrichtung von VH1.4 (oben) mit 11 EST cDNA-Sequenzen von GenBank. Es ist anzumerken, dass sich die 3' ESTs am PolyA-Ende befinden und dass die ESTs nur wenig mehr als die Hälfte der Sequenz voller Länge von VH1.4 abdecken.
  • BEISPIEL 4
  • Rezeptor-IgG-Fällung von 35S-markiertem VRP
  • Um zu bestimmen, ob VRP ein Ligand für Flt4 ist, wurden Expressionsplasmide, die den VH1.4 cDNA-Klon enthielten, sowie Kontroll-Plasmide (der Expressionsvektor allein oder mit VEGF oder PIGF DNA) in COS7-Zellen transfiziert und die Protein mit 35S-Aminosäuren markiert. Konditioniertes Medium von diesen Zellen wurde mit Flt4/IgG und Flk1/IgG gefällt. Spezifisch wurde das VRP-Expressionsplasmid, pRK.vh1.4.2 konstruiert, indem etwa 360 bp 5' untranslatierte Sequenz (5' von der Agel-Stelle (3A) von VH1.4) deletiert wurden. Diese DNA und Kontrollplasmide, die für VEGF165 kodieren (Houck et al., Mol. Endocrinol. 5, 1806–1814 (1991)), PIGF152 (Park et al., oben) oder der Vektor allein (pRK5; Suva et al., oben) wurden in COS7-Zellen mit DEAE-Dextran transfiziert. Janssen et al., oben. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in 10-cm-Näpfen 5 h lang mit 5 ml Methionin- und Cystein-freiem DMEM, ergänzt mit 100 μCi/ml 35S-Aminosäuren (Pro-MixTM Marke: Amersham Nr. SJQ0079) bei 37°C Impuls-markiert und dann 7 h lang mit DMEM verfolgt. Das markierte konditionierte Medium wurde durch Spin-Konzentration (Centricon-10TM Marke: Amicaon Nr. 4203) 10fach eingeengt. 50 μl des konzentrierten Mediums wurden mit 3 μg Rezeptor-IgG und 80 μl 50%iger Aufschlämmung von Protein A-Agarose (Calbiochem) über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Präzipitate wurden mit PBS/0,1% Triton X-100 gewaschen, in SDS-Probenpuffer gekocht und auf 12% SDS-Polyacrylamidgelen (Novex Nr. EC60052) elektrophoresiert. Die Gele wurden mit Autoradiographieverstärker (DuPont Nr. NEF974) behandelt und über Nacht bei –70°C belichtet.
  • Zwei spezifische Banden mit 53 kDa und 33 kDa wurden aus der VRP-Transfektion durch Flt4/IgG gefällt; diese Banden fehlten bei der Vektortransfektion. Geringe oder keine spezifische Fällung dieser beiden Banden wurde bei Flt1/igG oder Flk1/IgG festgestellt. Manchmal wurde gewisse VRP-Fällung bei Flk1/IgG festgestellt, was darauf hinweist, dass VRP eine Wechselwirkung mit geringer Affinität mit Flk1 aufweist. Transfektion mit einem für VEGF exprimierenden Plasmid zeigte die erwartete Fällung einer starken Bande mit etwa 22 kDa mit Flt1/IgG und Flk1/IgG (DeVries et al., oben; Quinn et al., oben; Millauer et al., oben; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., oben) aber keine Fällung mit Flt4/IgG. Ähnliche Versuche mit markiertem PIGF zeigten keine Fällung durch Flt4/IgG, ergaben aber die erwartete Fällung durch Flt1/IgG, aber nicht durch Flk1/IgG, Parker et al., oben. Diese Daten weisen darauf hin, dass sich VRP an die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptor bindet, aber nicht mit den VEGF-Rezeptoren Flt1 und Flk1 in Wechselwirkung tritt (oder dies viel schwächer tut). Sie bestätigen auch das Fehlen von Wechselwirkung von VEGF mit Flt4 (Pajusola et al., Oncogene, 9, oben) und weisen darauf hin, dass PIGF ebenfalls kein Ligand für diesen Rezeptor ist.
  • BEISPIEL 5
  • Tyrosin-Phosphorylierung von Flt4-Rezeptor
  • Um Flt4-Tyrosin-Phosphorylierung zu testen (auch in der PCT/UD93/00586, oben, beschrieben) wurde Flt4 in 293 Zellen exprimiert und die Flt4-Phosporylierung durch Phosphotyrosin-Immunblot überwacht. Spezifisch wurde DNA, die für die lange Form von Human-Flt4 kodiert, in den Säugetier-Expressionsvektor pRK5 (Suva et al., oben) kloniert, was das Plasmid pRK.tk1-3.1 ergab. Dieses Plasmid wurde mit einem Plasmid, das eine Mikroglykosidphosphotransferase-(neo-)Transkriptionseinheit enthielt, durch Kalziumphosphat-Fällung in 293-Zellen co-transfiziert (Janssen et al., oben), und stabil transfizierte Linien wurden durch das Wachstum auf G418 (Gibco) ausgewählt. Eine klonale Zelllinie, die für Flt4 (Klon 31) exprimiert, wie durch FACS-Analyse mit Flt54/IgG-Antiserum bestimmt, und untransfizierte 293-Zellen wurden in den Flt4-Tyrosin-Phosphorylierungstests verwendet. 1 Million Zellen in 100 μl PBS/0,1% Rinderserumalbumin (BSA) wurden mit 100 μl Probe gemischt und bei 37°C 15 min lang inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 250 μl 0,15 M NaCl, 10% Glycero, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES pH 7,3, 4 μg/ml PMSF, 0,02 μ/ml Aprotinin (Sigma A6279) und 20 mM Natriumorthovanadat lysiert. Flt4 wurde durch Zugabe von 8 μl Kaninchen-Flt4/IgG-Antiserum und 30 μl Protein A-Agarose immungefällt. Gewaschene Präzipitate wurden in SDS-Probenpuffer gefällt, auf Polyarcylamidgelen (Novex) elektrophoresiert, zu Nitrocellulose (Janssen et al., oben) transfiziert und mit einem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Upstate Biotechnology) und einem Alkalische-Phosphatase-Detektionssystem (Promega) sondiert.
  • Proben, die VRP oder VEGF enthielten, wurden durch die Elektroporation von Expressionsplasmiden, die für VH1.4 (pRK.vh1.4.2) oder VEGF (Houck et al., oben) kodieren, in 293-Zellen und eine 20fache Konzentration (Centricon-10, Amicon) des 3-Tage-serumfreien konditionierten Mediums hergestellt. In den Rezeptor-IgG-Konkurrenzversuchen wurden die konzentrierten konditionierten Medien 1 h lang bei 4°C mit Rezeptor-IgG vorinkubiert.
  • Ohne Stimulierung wiesen 293-Zellen, die Flt4 exprimieren oder nicht exprimieren, geringe oder keine Flt4-Tyrosinphosphorylierung auf. Stimulierung der Flt4-exprimierenden Zellen durch Flt4/IgG-Antiserum zeigte die Tyrosin-Phosphorylierung von zwei Banden mit 180 und 120 kDa. Mit Präimmunserum wurde keine Zunahme über die Basis-Phosphorylierung beobachtet, und keine Bande wurden bei Flt4/IgG-Antiserum-Stimulierung nicht exprimierender Zellen festgestellt. Es ist berichtet worden, dass zwei Flt4-Banden mit etwa dieser Größe von DAMI- und HEL-Zellen exprimiert werden. Pajusola et al., Oncogene 8, oben. Außerdem zeigt SDS-Gel-Analyse von gereinigtem Flt4/IgG, dass es aus Peptiden mit 150, 80 und 70 kDa besteht. Die N-terminale Aminosäuresequenz der Flt4/IG-Peptide zeigt, dass die 150 und 70 kDa-Banden die Aminosäuresequenz YSMTPPTL (Seq.-ID Nr. 9) aufweisen (die zur Flt4-Sequenz passt, die an Rest 25 beginnt) und dass die 80 kDa-Bande die Sequenz SLRRRQQQD (Seq.-ID Nr. 10) aufweist (die zur Flt4-Sequenz passt, die an Rest 473 beginnt). So scheinen sowohl Flt4/IgG als auch Flt4 voller Länge teilweise in der extrazellulären Domäne gespalten zu werden, und die Tyrosinphosphorylierten Banden mit 180 und 120 kDa, die in den Flt4-Phosphorylierungstets zu beobachten sind, entsprechen den 150- und 80-kDa-Peptiden von Flt4/IgG. Die Zugabe eines polyklonalen Antiserums zu den Flt4 exprimierenden Zellen zeigte die Tyrosin-Phosphorylierung von zwei Flt4-Banden mit 180 und 120 kDa; in nicht exprimierenden Zellen wurden keine Bande beobachtet. Diese Daten zeigten, dass polyklonale Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptors erzeugt wurden, fähig sind, Flt4-Tyrosin-Phosporylierung zu aktivieren.
  • Um zu bestimmen, ob VRP die Tyrosin-Phosporylierung von Flt4 aktivieren kann, werden konditionierte Medien von Säugetier-Zellen getestet, die mit dem VRP-Expressionsplasmid transfiziert worden waren. Dieses konditionierte Medium stimulierte die Tyrosin-Phosphorylierung der gleichen 180- und 120-kDa-Banden, wie sie bei den polyklonalen Agonisten-Antikörpern zu finden sind, was zeigt, dass VRP die Phosphorylierung von Flt4 stimulieren kann und sich auch daran binden kann. Konditioniertes Medium von den für VEGF exprimierenden Zellen war nicht in der Lage, Flt4-Tyrosin-Phosphorylierung zu aktivieren.
  • Um die Spezifität von VRP zu bestätigen, dass sich an die Rezeptoren der VEGF-Familie bindet, wurden Flt4/IgG, Flt1/IgG, Flk1/IgG und Htk/IgG auf ihre Fähigkeit getestet, um die VRP-stimulierte Flt4-Phosphorylierung zu konkurrieren. Wenn VRP ein Ligand für Flt4 ist, verhinderte Flt4/IgG wie erwartet die VRP-stimulierte Phosphorylierung, während Flt1/IgG, Flk1/IgG und Htk/IgG, ein Fusionsprotein von einem nicht verwandten Tyrosin-Kinase-Rezeptor, wenig oder keine Wirkung hatten. Diese Daten zeigen, dass VRP die Tyrosin-Phosphorylierung von Flt4 induzieren kann.
  • BEISPIEL 6
  • Reinigung von VRP und Bindung an markiertes Flt4/IgG
  • Der Leserahmen, der für die N-terminale Sekretionssignalsequenz und etwa 30 Aminosäuren des Herpes-Glykoproteins D kodiert (Lasky und Bowbenko, DNA 3, 23–29 (1984); Pennies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1142–1146 (1995)) wurden mit einer kurzen Linkersequenz an die mutmaßliche reife Sequenz von VRP fusioniert. Nach der Sekretion aus Säugetierzellen wird erwartet, dass dieses Konstrukt die N-terminale Glykoprotein D-Sequenz: KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLLEGGAAHYALLP (Seq.-ID Nr. 11) gefolgt von der reifen VRP-Sequenz GPREAPAAAAAFE (Seq.-ID Nr. 12) ergibt. DNA, die für dieses Fusionsprotein kodiert, wurde in den Vektor pRK5 kloniert, was das Plasmid pRK.vh1.4.5 ergibt. Dieses Plasmid wurde durch Elektroporation (Janssen et al., oben) in 293-Zellen transfiziert und VRP durch monoklonale Antikörper-(5B6-)Affinitätschromatographie aus dem 3 bis 4 Tage serumfreien konditionierten Medium gereinigt und durch Kolorimetrietest (Bio-Rad) quantifiziert. Dieser Antikörper ist für die an den N-Terminus von VRP fusionierte Glykoprotein D-Sequenz spezifisch.
  • Flt4/IgG wurde mit iodierten Perlen der Marke IodobeadsTM (Pierce) auf eine spezifische Aktivität von 1.000 bis 1.500 Ci/mMol iodiert. Bindung wurde mit 20.000 cpm 125I-Flt4/IgG und 12 ng VH1.4 gD-Fusionsprotein in PBS, 0,5% BSA, 0,02% Tween-20TM-Tensid, 1 μg/ml Heparin (Bindungspuffer), der 20 μl einer 50%igen Aufschlämmung von Glasperlen, konjugiert an monoklonalen ~30 μg Anti-gD-Antikörper (5B6) enthielt, in einem Endvolumen von 100 μl 4 bis 6 h lang bei 22°C durchgeführt. Die Perlen wurden abfiltriert (Millipore Multiscreen-HV), fünfmal mit 200 μl Bindungspuffer gewaschen und gezählt. Zur Bindung mit zunehmenden Konzentrationen an Flt4/IgG (5B) war der Bindungspuffer DMEM (glucosearm):F12 (50:50), 20 mM Natrium-HEPES, pH 7,2, 10% Rinderfötenserum, 0,2% Gelatine und 1 μg/ml Heparin.
  • Das gereinigte VRP band sich spezifisch an 1251-Flt4/IgG, und die Bindung wurde von unmarkiertem Flt1/IgG oder Flk1/IgG (5A) nicht konkurriert. Bindungskonkurrenz mit zunehmenden Konzentrationen an unmarkiertem Flt4/IgG (5B) ergab eine EC50 für diese Wechselwirkung von ~0,7 nM, was darauf hinweist, dass die Bindung von VRP an Flt4 hohe Affinität aufweist und zu erwarten ist, wenn VRP ein biologisch relevanter Ligand für Flt4 ist.
  • RNA-Blots
  • Blots, die Poly(A)+-Human-RA enthielten, stammten von Clontech. Für die G61-Gliomzelllinie wurden 5 μg Poly(A)+ und Poly(A)–-RNA in einem 1% Agarose/2,2 M-Formaldehyd-Gel elektrophoresiert und auf Nitrocellulose (Janssen et al., oben) übertragen. Blots wurden mit den 32P-markierten Sonden ovh1.4 und ovh1.5 hybridisiert und in 30 mM NaCl/3 mM Trinatriumcitrat bei 55°C gewaschen.
  • Die G6-Gliom-Zelllinie bei der Klonierung von VRP exprimiert eine Haupt-VRP-RNA-Bande mit etwa 2,5 kb. Eine Neben-Bande mit etwa 2,2 kb kann ebenfalls vorhanden sein. Eine 2,4-kb-Bande wurde in erwachsenen humanen Geweben von Herz, Plazenta, Eierstöcken und Eingeweide exprimiert; eine schwächere Bande wurde in Lunge, Skelettmuskel, Milz, Prostata, Hoden und Darm gefunden. Die Expression einer mRNA mit 2,4 kb wurde auch in fötaler Lunge und Niere festgestellt.
  • BEISPIEL 7
  • Mitogene Aktivität von VRP
  • Um zu testen, ob VRP mitogene Aktivität aufweist, wie sie für VEGF festzustellen ist, wurde das Wachstum von humanen Lungen-Endothelzellen bei zunehmenden Konzentrationen an VRP oder VEGF (6) getestet. Spezifisch wurden humane mikrovaskuläre Lungen-Endothelzellen (HMVEC-L, Clonetics, San Diego, CA, USA) im empfohlenen Wachstumsmedium (EGM-MV mit 5% Kalbsfötenserum) gehalten. Zum Testen der Mitogenese wurden langsam (< 6) passierende Zellen mit 6.500 Zellen/Napf in 48 Napf-Platten (Costar) gesät und über Nacht im empfohlenen Wachstumsmedium gehalten. Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden im Wachstumsmedium (2% Kalbsfötenserum) ohne Rindergehirnextrakt und ergänzt mit VEGF oder VRP gehalten. Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit Trypsin entfernt und mit einem Coulter-Zähler (Hialea, FL) gezählt.
  • VRP förderte das Wachstum dieser Endothelzellen (siehe 6) und hat somit seine mitogene Aktivität mit VEGF gemeinsam. Das steht im Gegensatz zu PIGF, von dem berichtet worden ist, dass ihm derartige mitogene Aktivität (bei ≤ 35 nM) fehlt (Park et al., oben). Hingegen war in diesem Test ein wirksames mitogenes Mittel, VRP, etwa 100-mal weniger stark war als VEGF.
  • Als Schlussfolgerung ist nun ein neues ausgeschiedenes Protein, VRP, identifiziert worden, das ein Flt4-Ligand ist und die Tyrosin-Phosphorylierung des Rezeptor-Tyrosin-Kinase Flt4 stimuliert. VRP ist ein drittes Mitglied der VEGF-Proteinfamilie und weist etwa 30% Aminosäure-Identität mit VEGF und PIGF auf. zusätzlich zur VEGF-artigen Domäne enthält VRP eine C-terminale, Cystein-reiche Domäne mit ~180 Aminosäuren, die in anderen Elementen der VEGF-Familie nicht zu finden ist. VRP tritt nicht wesentlich mit den VEGF-Rezeptoren Flt1 und Flk1 in Wechselwirkung.
  • Materialhinterlegung
  • Das folgende Plasmid ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt worden:
    Plasmid ATCC-Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum
    pRK.vh1.4.1 97249 6. September 1995
  • Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren und dessen Vorschriften (Budapester Vertrag). Das gewährleistet die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre ab dem Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von der ATCC gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens und entsprechend einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC zur Verfügung gestellt, wodurch permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung einer US- oder ausländischen Patentanmeldung, was auch immer davon zuerst erfolgt, gewährleistet und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jene gewährleistet, die vom U.S. Commissioner of Patents and Trademarks als gemäß 35 USC § 122 und den betreffenden Regeln des Commissioners (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter spezieller Bezugnahme auf 886 OG 638) dazu berechtigt ausgewiesen sind.
  • Der Zessionär der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass, wenn eine Kultur des Plasmids oder der Hinterlegung absterben oder verloren gehen sollte, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, das Plasmid umgehend bei Benachrichtigung durch eine andere des gleichen Plasmids ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Plasmids ist nicht als Lizenz zur praktischen Umsetzung der Erfindung entgegen der Rechte, die gemäß der Genehmigung einer Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen erteilt werden, zu verstehen. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (8)

  1. Isoliertes, biologisch aktives, menschliches, mit dem Gefäßendothelwachstumsfaktor verwandtes Protein (VRP), das die Reste 1 bis einschließlich 399 aus 1 oder die Reste –20 bis einschließlich 399 aus 1 enthält und Rezeptortyrosinkinase Flt4 bindet und die Phosphorylierung der Rezeptortyrosinkinase Flt4 stimuliert.
  2. Zusammensetzung, umfassend das Protein nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Förderung der Gefäßendothelzellenvermehrung nützlich ist, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes, biologisch aktives, menschliches VRP-Protein, das zumindest 265 Aminosäuren aus 1 enthält und an Rezeptortyrosinkinase Flt4 bindet und dessen Phosphorylierung stimuliert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei die Zusammensetzung einen weiteren Zellvermehrungsfaktor umfasst, bei dem es sich nicht um das VRP-Protein handelt.
  5. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für das Protein nach Anspruch 1 kodiert und weiters einen heterologen, induzierbaren Promotor umfasst, der an das Nucleinsäuremolekül operabel gebunden ist.
  6. Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5.
  7. Wirtszelle, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5.
  8. Verfahren zur Herstellung von VRP, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 7 und das Gewinnen von VRP aus der Wirtszellenkultur.
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