JP2008228730A - Vegf−関連タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】受容体型チロシンキナーゼFlt4に結合しそのリン酸化を刺激するヒトVEGF関連タンパク質(VRP)を単離し同定した。このVRPは、VEGFタンパク質ファミリーの第3のメンバーと仮定される。VRPに結合してVRPの生物学的活性を無効にする抗体、VRPまたは抗体を含む組成物、使用方法、キメラポリペプチドおよびVRPのシグナルポリペプチドを、該VRPから生産した。
【選択図】なし
Description
VEGFは、そのmRNAのオルタナティブスプライシングにより、少なくとも4つの形態で生じ得るホモ二量体のシステインを多く含むタンパク質である。Ferrara et al、前出。VEGFはFlt1およびFlk1に高親和性のリガンドであるが、それはFlt4に結合せず、活性化もしない。Pajusola et al., Oncogene,9、前出。他の非常に関連のある唯一のVEGFのメンバーは、胎盤増殖因子(PlGF)であり、それはVEGFと47%のアミノ酸同一性がある。Maglione et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9267-9271(1991)。PlGFはまた2つの異なる部位でスプライシングされた形態で生じ、それらは21アミノ酸の塩基性ヘパリン結合ドメインの存在または不在という点で異なっている。Maglione et al., Oncogene,8:925-931(1993):Hauser and Weich, Growth Factors, 9:259-268(1993)。PlGFはFlt1には結合するがFlk1には結合しない(Park et al., J.Biol.Chem., 269:25646-25654[1994]);そのFlt4への結合は測定されていないと考えられている。PlGFは、VEGFの毛細管内皮細胞有糸分裂誘発または血管透過性作用を反復することはなく、それはこれらの作用がFlk1受容体によって仲介されていることを示唆する。Park et al.前出。
(a)図1の核酸配列のコード領域であって、残基−20から残基399のプレタンパク質をコードするか、あるいは残基1から残基399の成熟タンパク質をコードするコード領域(すなわち、図1にSEQ ID NO:1として示した核酸配列の、ヌクレオチド372から1628(両端を含む)あるいはヌクレオチド432から1628(両端を含む));または
(b)遺伝的コードの縮重の範囲内で(a)の配列に相当する配列
から選択される。
本発明を記載する場合、以下の用語を用い、それらは以下に示すように定義されることが意図される。
本発明は、Flt4受容体に結合し、そのリン酸化を刺激する新規なVRPを見出したことに基づく。
3つの方法が、Flt4受容体に結合し、そのリン酸化を刺激するタンパク質を同定するために採用された。最初に、完全長受容体を293細胞内で安定に発現させてFlt4活性化の受容体型チロシンキナーゼリン酸化アッセイを確立した。このアッセイを用いて約400の細胞上清および組織抽出物をスクリーニングしたが陽性の結果はなかった。
1.VRPの調製
以下の考察の大部分は、VRP核酸を含むベクターによって形質転換された細胞を培養し、その細胞培養物からポリペプチドを回収することによるVRPの産生に関する。さらに、本発明のVRPが、1991年5月16日に公開されたWO91/06667において提供された相同組換えにより産生され得ることももくろまれている。
VRPをコードするDNAは、VRPmRNAを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製した任意のcDNAライブラリーから得ても良い。したがって、ヒトVRP DNAは、ヒト脳組織、例えば、グリア細胞系から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得られ得る。VRPをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、またはオリゴヌクレオチド合成によって得られても良い。
ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(例えば、VRPに対する抗体または約20−80塩基のオリゴヌクレオチド)を用いてスクリーニングされる。cDNAまたはゲノムライブラリーの選択されたプローブによるスクリーニングは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)の10〜12章に記載されたような標準的な手法を用いて行うことが出来る。VRPをコードする遺伝子を単離する他の手段は、Sambrook et al.前出の14節に記載されたようなPCR法を用いることである。
天然または変種VRPをコードする核酸(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)は、さらなるクローニング(そのDNAの増幅)または発現のために複製可能なベクターに挿入される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は一般に、1またはそれ以上の次のものを含むがこれらに限定されない:シグナル配列、複製の起点、1またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
本発明のVRPは、直接的にだけでなく、異種ポリペプチドであって、好ましくはシグナル配列もしくは成熟タンパク質もしくはポリペプチドのN末端に特異的な開裂部位を有する他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換えにより産生されてもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよいし、またはそれはベクターに挿入されるVRP DNAの一部であってもよい。好適に選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される)ものである。天然のVRPシグナル配列を認識もプロセシングすることもない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌については、天然のシグナル配列は、例えば、酵母のインベルターゼリーダー、α因子リーダー(SaccharomycesおよびKluyveromycesのα因子リーダー、後者は1991年4月23日に発行された米国特許第5,010,182号に記載されている、を含む)または酸ホスファターゼリーダー、C.albicansグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日に公開されたEP362,179号)または1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されたシグナルにより置換されてもよい。哺乳動物細胞発現では、天然のシグナル配列(例えば、通常in vivoでVRPのヒト細胞からの分泌を行わせるVRPプレ配列)で十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列、例えば、他の動物VRP由来のシグナル配列およびその動物または関連する種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルもまた適切であり得る。
発現およびクローニングベクターはどちらも、そのベクターが1またはそれ以上の選択された宿主細胞内で複製するのを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列はベクターが宿主の染色体DNAとは独立して複製するのを可能にするものであり、複製の起点または自律的に複製する配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドpBR322由来の複製の起点はほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2μプラスミドの起点は酵母に適切であり、そして種々のウイルスの起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)は、哺乳動物細胞内でのクローニングベクターに有用である。一般に、複製の起点構成要素は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない(SV40起点が代表的に用いられるのは、それはそれが初期プロモーターを有しているからである)。
DNAはまた、宿主のゲノムへの挿入によって増幅されてもよい。これは、Bacillus種を宿主として用いて、例えば、BacillusのゲノムDNAに見られる配列に相補的なDNA配列をベクター内に含むことにより、容易に行われる。このベクターによるBacillusのトランスフェクションは、結果としてゲノムとの相同組換えおよびVRP DNAの挿入になる。しかしながら、VRPをコードするゲノムDNAの回収は、外生で複製したベクターのそれと比べてより複雑である。なぜなら制限酵素消化がVRP DNAの切り出しに必要とされるからである。
発現およびクローニングベクターは、選択遺伝子(選択マーカーとも呼ばれる)を含むべきである。この遺伝子は、選択培養培地内で増殖する形質転換された細胞の生存もしくは増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、その培養培地内で生存しない。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンへの耐性を与える、(b)栄養要求性欠損を補足する、あるいは(c)複合培地からは利用できない必須栄養分を供給するタンパク質をコードし、例えば、BacilliについてはD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、VRP核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流(5')(一般に約100〜1000bp以内)に位置する非翻訳配列であり、それらが作動可能に連結されているVRP核酸配列のような特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する。そのようなプロモーターは代表的に2つのクラス、すなわち誘導および構成に分類される。誘導プロモーターは、それらの制御下で培養条件における変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在あるいは温度の変化、に応答して増加したレベルのDNAからの転写を開始させる。現在、可能性のある種々の宿主により認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、VRPをコードするDNAに、このプロモーターを供給源DNAから制限酵素消化により取り出して、その単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することにより、作動可能に連結されている。天然のVRPプロモーター配列および多くの異種プロモーターはどちらも、VRP DNAの増幅および/または発現を行わせるために用いることができる。しかしながら、異種プロモーターが好ましいのは、それらが一般に、天然のVRPプロモーターと比べてVRPのより高い転写とより高い収率を可能にするからである。
この発明のVRPをコードするDNAの高等真核生物による転写は、しばしばエンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加される。エンハンサーは、シスに作用するDNAの要素で、通常約10〜300bpであり、プロモーターの作用してその転写を増加させる。エンハンサーは、比較的方向性および位置に非依存性であり、転写ユニットに対して5'(Laimins et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78:993[1981])および3'(Lusky et al., Mol.Cell Bio., 3:1108[1983])、イントロン内(Banerji et al., Cell, 33:729[1983])、ならびにコード配列自身の中に見出されてきた。Osborne et al., Mol.Cell Bio., 4:1293(1984)。哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が現在では知られている。しかしながら、代表的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。例は、複製起点の後期側(bp100−270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための要素の強化についてのYaniv, Nature, 297:17-18(1982)もまた参照されたい。エンハンサーは、VRPをコードする配列の5'または3'の位置でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから5’側に位置する。
真核生物宿主細胞内(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物から凝集した細胞)で用いられる発現ベクターはまた、転写の終結とmRNAの安定化に必要な配列を含む。そのような配列は、真核生物またはウイルスのDNAもしくはcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から通例利用可能である。これらの領域は、ポリアデニル化されたフラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを、VRPをコードするmRNAの非翻訳部分に含んでいる。
1またはそれ以上の上に挙げた構成要素を含む適切なベクターの構築には、標準的な連結技術を用いる。単離されたプラスミドまたはDNAフラグメントを開裂し、調整し、そして必要とされるプラスミドを生成するために望ましい形態に再連結する。
構築されたプラスミド内の正しい配列を確認するための分析には、連結混合物を用いて、E.coli K12株294(ATCC 31,446)を形質転換し、適切ならば、成功した形質転換体をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性で選択する。形質転換体由来のプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、および/またはMessing et al., Nucleic Acid Res., 9:309(1981)の方法により、あるいはMaxam et al., Methods in Enzymology, 65:499(1980)の方法により配列決定する。
本発明の実施において特に有用なのは、哺乳動物細胞内でVRPをコードするDNAの一過性の発現を提供する発現ベクターである。一般に、一過性の発現には、宿主細胞内で効率的に複製し得、その結果その宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次いでこの発現ベクターによってコードされる高レベルの所望のポリペプチドを合成するような発現ベクターの使用が包含される。Sambrook et al.,前出、pp.16.17-16.22。一過性発現系は、適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含み、クローン化されたDNAによりコードされるポリペプチドの便利な陽性同定、ならびにそのようなポリペプチドの所望の生物学的および生理学的特性についての迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、生物学的に活性なVRPであるVRPの類似体および変種を同定するという目的のために、本発明において特に有用である。
組換え脊椎動物細胞培養物におけるVRPの合成への適合化にとって適切な他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625(1981);Mantei et al., Nature, 281:40-46(1979);EP 117,060;およびEP 117,058に記載されている。VRPの哺乳動物細胞培養発現にとって特に有用なプラスミドは、pRK5(EP 307,247)またはpSVI6Bである。1991年6月13日に発行されたWO91/08291。
本明細書中のベクター中のDNAをクローニングするかまたは発現させるのに適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌、例えば、Escherichiaのような腸内細菌、例えば、E.coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、 Proteus、Salmonella(例えば、Salmonella typhimurium)、Serratia(例えば、Serratia marcescans)、およびShigella、ならびにB.subtilisおよびB.licheniformis(例えば、1989年4月12日に公開されたDD 266,710に開示されたB.licheniformis)のようなBacilli、P.aeruginosaのようなPseudomonas、およびStreptomycesを含む。1つの好ましいE.coliクローニング宿主は、E.coli 294(ATCC 31,446)であるが、E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)およびE.coli W3110(ATCC 27,325)のような株が適切である。これらの例は、限定ではなくむしろ例示である。W3110株が特に好ましい宿主または親宿主であるのは、それが組換えDNA生成発酵のための一般的な宿主株であるからである。好ましくは、この宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、W3110株は、タンパク質をコードする遺伝子内で遺伝的変異を起こすように改変されてもよく、そのような宿主の例にはE.coli W3110の27C7株がある。27C7の完全な遺伝子型はtonAΔptr3 phoAΔE15Δ(argF-lac)169ompTΔdegP41kanrである。27C7株は、1991年10月30日にAmerican Type Culture CollectionにATCC No.55,244として寄託された。あるいは、1990年8月7日に発行された米国特許第4,946,783号に開示された変異ペリプラズムプロテアーゼを有するE.coliの株が用いられてもよい。あるいはまた、クローニング方法、例えば、PCRまたは他の核酸ポリメラーゼ反応でも適切である。
この発明のVRPポリペプチドを産生するために用いられる原核生物細胞は、Sambrook et al.前出に一般に記載されたような適切な培地内で培養される。
この発明のVRPを産生するために用いられる哺乳動物宿主細胞は、種々の培地内で培養することができる。Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium([MEM], Sigma)、RPMI-1640(Sigma)およびDalbecco's Modified Eagle's Medium([DMEM],Sigma)のような市販の培地が宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ham and Wallace, Meth.Enz., 58:44(1979)、Barnes and Sato, Anal.Biochem., 102:255(1980)、米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第4,560,655号;または同第5,122,469号;WO90/03430;WO87/00195;または米国特許Re.30,985号に記載された任意の培地を、宿主細胞のための培養培地として用いてもよい。これらの培地の任意のものは、ホルモン、および/または他の増殖因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、緩衝液(例えば、HEPES)、ヌクレオシド(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えば、GentamycinTM薬)、微量元素(無機化合物として定義され、通常最終濃度でマイクロモルの範囲で存在する)、およびグルコースまたは同等のエネルギー源が必要なものとして一緒に補充されてもよい。他のいかなる必要な補充物も当業者に公知の適切な濃度で含まれてもよい。温度、pH等のような培養条件は、発現のために選択された宿主に先に用いた条件であり、当業者には明らかであろう。
遺伝子増幅および/または発現は、試料中で直接的に、例えば、従来のサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するためのノーザンブロッティング(Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:5201-5205[1980])、ドットブロッティング(DNA分析)、またはin situハイブリダイゼーションにより、適切に標識されたプローブを用いて、本明細書中に提供された配列に基づいて、測定することができる。種々の標識を用いることができるが、最も一般的には放射性元素、特に32Pである。しかしながら、他の技術も用いてもよく、例えば、ポリヌクレオチドへの導入にはビオチン−修飾ヌクレオチドを用いてもよい。このときビオチンは、アビジンまたは抗体への結合のための部位を提供し、それは、幅広い種々の標識、例えば、放射性核種、蛍光色素、酵素などで標識することができる。あるいは、特定の二本鎖(DNA二本鎖、RNA二本鎖、およびDNA−RNAハイブリッド二本鎖、またはDNA−タンパク質二本鎖を含む)を認識する抗体が用いられてもよい。次に、この抗体は標識されて、その二本鎖が表面に結合しているところでアッセイが行われ、その結果、表面上での二本鎖の形成の際に、その二本鎖に結合した抗体の存在が検出される。
免疫組織化学染色および/または試料流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、いかなる哺乳動物においても調製できる。便利なことに、抗体は、天然のVRPポリペプチドに対して、または本明細書中に提供されるDNA配列に基づく合成のポリペプチドに対して、以下の第4節にさらに記載するように、調製することができる。
VRPは、好ましくは、培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、それはまた、分泌シグナルなしに直接産生された場合には、宿主細胞破砕物から調製されてもよい。VRPが膜に結合している場合には、それは膜から、適切な界面活性剤溶液(例えば、Triton-X 100)を用いて離すことができる。
VRPがヒト起源のもの以外の組換え細胞内で産生される場合、このVRPはヒト起源のタンパク質もしくはポリペプチドを全く持たない。しかしながら、VRPを組換え細胞タンパク質もしくはポリペプチドから精製して、VRPと実質的に均一な調製物を得ることが必要である。第1段階として、培養培地または破砕物を遠心分離して粒状の細胞破片を取り除く。その後VRPを混在する可溶性タンパク質およびポリペプチドから、適切な精製手法の例である以下の手法を用いて精製する:イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC、シリカまたはDEAEのような陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー;等電点クロマトグラフィー;SDS−PAGE;硫安沈殿;例えば、Sephadex G-75を用いるゲルろ過;およびIgGのような混入物を取り除くプロテインA Sepharoseカラム。
VRPポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれる。天然のVRPおよびVRPのアミノ酸配列変種は共有結合修飾されてもよい。VRPの共有結合修飾の1つの型は、VRPの標的化されたアミノ酸残基と、VRPの選択された側鎖またはN−もしくはC−末端の残基と反応し得る有機誘導体化剤(organic derivatizing agent)とを反応させることにより分子に誘導される。
二官能性物質による誘導体化は、VRPが、抗−VRP抗体を精製する方法における使用のための水不溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋するのに、有用であり、逆もまた同じである。一般に用いられている架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4−アジドサリチル酸とのエステル、3,3−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタンのような二官能性マレイミドを含む。メチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光で活性化される中間体を生じる。あるいは、シアノゲンブロミド活性化炭水化物のような反応性の水不溶性のマトリックス、および米国特許第3,969,287号;同第3,691,016号;同第4,195,128号;同第4,247,642号;同第4,229,537号;および同第4,330,440号に記載された反応性基質がタンパク質の固定に用いられる。
この発明は、別のポリペプチドに融合されたVRPを含むキメラポリペプチドを包含する。1つの好ましい実施態様において、このキメラポリペプチドは、VRPと、抗標識抗体がそれに対して選択的に結合するエピトープを提供する標識ポリペプチドとの融合物を含む。エピトープ標識は、一般に、VRPのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に配置される。そのようなエピトープ標識した形態のVRPが望ましいのは、その存在が、標識ポリペプチドに対する標識抗体を用いて検出され得るからである。また、エピトープ標識の提供により、VRPが抗標識抗体を用いるアフィニティー精製によって容易に精製されるようになる。抗体を含むアフィニティー精製技術および診断アッセイは本明細書中で後で記載する。
エピトープ-標識VRPは、抗標識抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に精製され得る。アフィニティー抗体を付着させるマトリックスは、最もしばしばアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である(例えば、制御された孔のガラスもしくはポリ(スチレンジビニル)ベンゼン)。エピトープ-標識VRPは、アフィニティーカラムから、例えば、緩衝液のpHまたはイオン強度を変化させることにより、あるいはカオトロピック剤を添加することにより溶出される。
VRPは、Flt4受容体または1つ以上の他のVRP受容体を有する細胞の増殖および/または分化および/または活性化の促進または阻害により、哺乳動物を処置するための治療用途を提供すると考えられる。外因性VRPは、こういう状況で患者に投与することができる。ヒトVRPは、内因性VRPのレベルが低下しているヒト、好ましくはこのようなレベルの低下が病気をもたらす状況にあるか、またはFlt4受容体若しくは1つ以上の他のVRP受容体の活性化若しくは阻害が欠損している状況にあるヒトに投与することができる限り、明らかに有用である。
VRPをコードする核酸は、組織特異的分類のための診断薬として使用することができる。例えば、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンおよびサザンブロッティング、並びにPCR分析のような方法は、VRPをコードするDNAおよび/またはRNAが、評価される細胞型に存在するかどうかを決定するのに使用することができる。VRP核酸またはポリペプチドはまた、診断マーカーとして使用することができる。例えば、VRPを、本明細書に記載される方法を用いて標識して、Flt4受容体または別のVRP受容体をコードする核酸分子の発現を標識VRPを使用して定量することができる。
本明細書で明確化される抗体例の産生に関して以下に記す。これらの抗体例は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性(bispecific)、またはヘテロ結合(heteroconjugate)抗体を含む。
VRPに対するポリクローナル抗体は、一般にVRPとアジュバントの多数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により動物において産生させる。VRPを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター)に二官能性試薬または誘導体化剤[例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基により結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(ここでRおよびR1は、異なるアルキル基である)]を用いて結合させることは有用である。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる、ということは即ち、集団を構成する個々の抗体が、微量に存在する起こりうる天然の突然変異以外には同一であるということである。したがって修飾語句の「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではない抗体の性質を示している。
目的の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、クローンは限界希釈法によりサブクローン化して、標準法により増殖させることができる。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104 (Academic Press, 1986)。この目的に適切な培地は、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's MediumまたはRPMI−1640培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイで使用することができる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野ではよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からそれに導入した1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入(import)」残基と呼ばれており、典型的には「輸入(import)」可変ドメインからとられる。ヒト化は、本質的にはWinterとその共同研究者達の方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986];Riechmann et al., Nature, 332:323-327 [1988];Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 [1988])にしたがって、齧歯類CDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることにより、実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号、前出)、実質的に完全長ヒト可変ドメインより短い配列が、ヒト以外の種からの対応する配列により置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのCDR残基、および恐らく幾つかのFR残基が、齧歯類抗体中の類似部位からの残基により置換されているヒト抗体である。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、好ましくはヒトまたはヒト化されたモノクローナル抗体である。この場合、結合特異性の一方は、VRPに対するものであり、もう一方は、任意の他の抗原、そして好ましくは受容体または受容体サブユニットに対するものである。例えば、Flt4受容体とVRPに特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明の範囲に含まれる。
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ結合抗体は、2つの共有結合した抗体よりなる。このような抗体は、例えば、不必要な細胞に対する免疫系細胞を標的とする(米国特許第4,676,980号)ため、およびHIV感染症の治療のために提案されてきた。WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089。ヘテロ結合抗体は、任意の便利な架橋法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は、当該分野でよく知られており、例えば、米国特許第4,676,980号に多くの架橋法と共に開示されている。
i.治療用途
VRP抗体は、幾つかの治療適応症において、VRPの活性を遮断するため(例えば、Flt4受容体またはVRPに結合する別の受容体の過剰な活性化または阻害を遮断するため、並びに新生血管形成、再内皮化、および新血管形成を遮断するため)に有用であろう。具体的には、VRP抗体は、種々の腫瘍および非腫瘍疾患および障害の治療に有用である。治療しやすい腫瘍および関連症状は、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、莢膜細胞腫、アレノブレストーマ、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭部および頸部癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、シュワン鞘腫、乏突起細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に伴う異常血管増殖、水腫(例えば脳腫瘍に伴う)、およびメージュ症候群を含む。
本発明のVRP抗体はまた、アフィニティー精製用物質として有用である。この過程において、VRPに対する抗体は、セファデックス樹脂または濾紙のような適切な支持体に、当該分野で周知の方法を用いて固定化される。次に固定化抗体を、精製すべきVRPを含有する試料と接触させ、次いでこの支持体を、固定化抗体に結合しているVRP以外の、実質的に全ての試料中の物質を除去する適切な溶媒により洗浄する。最後に、グリシン緩衝液(pH5.0)のようなVRPを抗体から離す別の適切な溶媒で、この支持体を洗浄する。
以下は、本発明を実施するための具体的な実施態様の例である。実施例は、例示目的でのみ提供されるものであり、本発明の範囲を何ら限定しようとするものではない。
前出のまたは後出の本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願を、その全体を参考として本明細書に援用する。
ヒトFlt4受容体をコードするcDNAクローンの単離
ヒト巨核球白血病細胞株CMK11−5から精製したmRNAから合成したcDNAを、チロシンキナーゼ受容体の保存領域に基づく重複PCRプライマーにより増幅した。Wilks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1603-1607 (1989)。ユニークDNA配列を含む約180bpの1つの増幅フラグメント(SAL−S1またはtk1と呼ばれる;PCT/US93/00586、前出)を使用して、完全長の短型のFlt4受容体(1298アミノ酸)をコードする重複クローンを得るために、CMK11−5およびDAMI細胞由来のcDNAライブラリーをスクリーニングした(Janssen et al.,前出)。集めて整理したFlt4をコードするクローンの配列は、欠性赤白血病(anerythroleukemia)細胞株から報告されたクローン(Pajusola et al., Cancer Res.、前出)に適合し;別の報告されたFlt4配列とは8アミノ酸異なってコードする。Galland et al., Oncogene、前出。長型のFlt4(1363アミノ酸)をコードするクローンは、発表された配列(Pajusola et al., Oncogene, 8、前出)に基づき約200bpの異なる3’DNA配列を合成することにより構築した。
受容体IgG融合タンパク質、Flt4/IgG抗血清、およびG61 FACS解析
Flt1/IgG(Park et al.,前出)、Flk1/IgG(Park et al.,前出)、Rse/IgG(Godowski et al., Cell, 82:355-358 [1995])、およびHtk/IgG(Bennett et al., J. Biol. Chem., 269:14211-14218 [1994])をこれらの引用文献に記載されたように作製した。Flt4/IgGについては、Flt4受容体の細胞外ドメイン(アミノ酸1〜775)をコードするDNAを、プラスミドpBSSK-Fc中のユニークBstEII部位でヒトIgG重鎖のFc領域にスプライシングした(pBSSK-CH2CH3)。Bennett et al., J. Biol. Chem., 266:23060-23067 (1991)。Flt4/IgGをコードするオープンリーディングフレームを、哺乳動物発現ベクターpRK5(Suva et al., Science, 237:893-896 [1987])にクローン化して、プラスミドpRK5.tk 1 ig 1.1を得た。このプラスミドをエレクトロポレーション(Janssen et al.,前出)により293細胞(ATCC CRL 1651)中にトランスフェクションして、3〜4日後、プロテインAアガロース(Calbiochem)により無血清順化培地からFlt4/IgGを精製した。精製したFlt4/IgGのウサギへの注射によりFlt4抗血清を作製した。
この融合タンパク質を使用して、FACS解析により膜結合VRPに関して細胞株をスクリーニングすることにより、以下に記載した1つの陽性細胞株G61を同定した。
ヒト膠腫細胞株G61(Hamel et al., J. Neurosci. Res., 34:147-157[1993])を、10%ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、および抗生物質を含有するF12:DMEM(50:50)(高グルコース)中で培養した。G61細胞へのFlt4/IgG結合のFACS解析のため、100万個の細胞を、リン酸緩衝化食塩水(PBS)、5%ヤギ血清、2%ウサギ血清中で70nM受容体−IgG融合タンパク質と共に4℃で60分間インキュベーションし、次に10μg/mLビオチン−SP−結合ヤギ抗ヒトFc抗体および10μg/mL R−フィコエリトリン−結合ストレプトアビジン(Jackson Immuno Research)で染色した。G61は、関連のないチロシンキナーゼ受容体複合体のRse/IgGに比べてFlt4/IgGに特異的なピーク蛍光強度に約10倍のシフトを引き起こした(図2)。COS細胞へのcDNAクローンのプールのトランスフェクションにより、この推定膜結合VRPを発現クローン化しようと試み、次いで標識Flt4/IgGでのスクリーニングにより、各1000〜5000クローンの640個のプールからは陽性クローンは得られなかった。
ヒトVRPをコードするcDNAクローンの単離
ヒト膠腫細胞株G61(Hamel et al.,前出)から、Cathala et al., DNA: 2:329-335 (1983)およびAviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:1408-1412 (1972)に記載されたように単離したポリA+RNAからcDNAライブラリーを調製した。cDNAは、このRNAからGIBCO/BRLの試薬(SuperScript)により調製して、XhoIおよびNotIで消化したプラスミドpRK5B(Holmes et al., Science, 253:1278-1280 [1991])にクローン化した。VRPをコードするクローンは、EST配列(GenBank locus HSC1WF111)に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブでcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより単離し、それはVEGFとの妥当な適合を示した。HSC1WF111のEST配列は、299bpであり、そしてVEGFアミノ酸56で始まる13残基の内の11残基のマッチを含めて、50残基でVEGFに36%同一である。配列は以下のとおりである:
5'-CCGTCTACAGATGTGGGGGTTGCTGCAATAGTGAGGGGCTGCAGTGCATGAACACCAGCACGAGCTACCTCAGNAAGACGTTATTTGAAATTACAGTGCCTCTCTCTCAAGGCCCCAAACCAGTAACAATCAGTTTTGCCAATCACACTTCCTGCCGATGCATGTCTAAACTGGATGTTTACAGACAAGTTCATTCCATTATTAGACGTTCCCTGCCAGCAACACTACCACAGTGTCAGGCAGCGAACAAGACCTGCCCCACCAATTACATGTGGAATAATCACATCTGC AGATGCCTG(SEQ ID NO:6)
使用したオリゴヌクレオチドプローブovh1.4およびovh1.5の配列を以下に示す。
ovh1.4:5'-CTGGTGTTCATGCACTGCAGCCCCTCACTATTGCAGCAACCCCCACATCT(SEQ ID NO:7)
ovl1.5:5'-GCATCTGCAGATGTGATTATTCCACATGTAATTGGTGGGGCAGGTCTTGT(SEQ ID NO:8)
これら2つのプローブを32P標識し、42℃で20%ホルムアミド中でハイブリダイズさせて55℃で30mM NaCl/3mMクエン酸三ナトリウム中で最後に洗浄した。Janssen, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1995)。スクリーニングした650,000クローンから、7個の陽性クローンを同定して特徴づけした。制限地図化およびDNA配列決定により、陽性クローンは3群に分かれた。
クローンVH1.4(pRK.vh1.4.1)およびVH1.6は、全コード領域を含んでおり(図3A)、完全に配列決定した。これらは、長さのみ異なっており、VH1.6には3’ポリA配列に先立つ2個のTの欠失がある。クローンVH1.2は、VH1.4と同一線上にある。クローンVH1.3、VH1.5、およびVH1.7は、同一であり、VH1.4と比較すると557bpの欠失(bp519〜1075の欠失)があり、そしてクローンVH1.1は、VH1.4と比較すると152bpの欠失(bp924〜1075の欠失)がある。VH1.4のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、図1に示す。
この配列は、翻訳開始部位と予測される−3位のプリン残基に続くATGコドンで始まる419アミノ酸のオープンリーディングフレームを含んでいた。Kozak, Nucl. Acids Res., 12:857-872 (1984)。このATGの約250bp5’側には、2個のインフレームATGコドンがあり、それに終止コドンが短く続いていた(4または10アミノ酸)。これらのATGは両方とも、−3位にピリミジンがあり、強い翻訳開始部位として機能するとは考えられない。Kozak、前出。419アミノ酸のリーディングフレームの開始点に直接続くコードされるアミノ酸配列は、疎水性であり、アミノ末端分泌シグナル配列であることを暗示している。Perlman and Halvorson, J. Mol. Biol., 167:391-409 (1983)。図3Aを参照のこと。この配列の最も可能性高い切断部位は、残基15または16の後の切断を排除することはできないが、アミノ酸20の後であろう。von Heijne, Nucl. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)。オープンリーディングフレームの前には、約380bpのGCの豊富な5’非翻訳領域があり、後には約400bpの3’非翻訳領域がある。
ヒトVRPの予測される成熟アミノ酸配列は、399アミノ酸残基(翻訳されたMr=44.8kDa)を含み、その内37個(9.3%)はシステイン残基である;N結合グリコシル化の可能性ある部位が3つある(図3A)。6つの形態のVEGFおよびPlGFとのVRPのアミノ酸配列のアラインメントにより、VRPはVEGF121(32%同一)およびPlGF131(27%同一)と最も類似していることが判った(図3B);9個のシステイン残基の内8個の位置が保存されている。VRPは、幾つかの形のVEGFおよびPlGFで見られる塩基性アミノ酸の領域を含有しないが、それは、VEGFよりかなり大きく、かつVEGFには見られないシステインの豊富な分子のC末端の半分を含有する。このシステインの豊富なドメインは、双翅類のバルビアニ環の3つのタンパク質に50回以上見られる反復である、Cys、次に10個の非Cys残基、次にCys−X、次にCys−X、そして次にCysのパターン4コピーを含む(図3B)。Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211:331-349 (1990)。いずれかの理論に限定されることなく、VRPは、システイン残基を介してこれらの細胞上の他の膜結合タンパク質と相互作用するであろう;このような分子間相互作用は、バルビアニタンパク質に関して提唱されている。Paulsson et al.,前出。
2つのcDNAクローン(VH1.1およびVH1.3)は、VH1.4と比較すると152または557bp欠失していた(図3A)。これらの欠失体は両方とも、同じヌクレオチドで終わり、オルタナティブスプライシングの結果であろうと推定される。両方の欠失体は、15アミノ酸以内の終止コドンで終結する、欠失の3’側の同じフレームシフトしたタンパク質をコードすることが予測される。VH1.3によりコードされるタンパク質は、VEGFと類似したコアのシステイン領域を全然含まないであろう。VH1.1は、VEGFと類似の領域の多くを含有する;しかし、その欠失は、種々の公知の形のVEGFまたはPlGFと類似していない。Ferrara et al.,前出;Maglione et al.,前出;Hauser and Weich、前出。
図4は、GenBankからの11個のEST cDNAとのVH1.4(上)のアラインメントを開示する。3’ESTがポリA末端にあり、ESTがVH1.4の完全長配列の半分と少しを占めるだけであることに注目されたい。
35 S標識VRPの受容体IgG沈降
VRPがFlt4のリガンドであるかどうか決定するために、VH1.4cDNAクローンを含有する発現プラスミド、さらには対照プラスミド(単独の、またはVEGF若しくはPlGF DNAを含む、発現ベクター)をCOS7細胞中にトランスフェクションして、タンパク質を35Sアミノ酸で標識した。これらの細胞からの順化培地をFlt4/IgGおよびFlk1/IgGと共に沈降させた。具体的には、約360bpの5’非翻訳配列(VH1.4のAgeI部位(図3A)の5’)を欠失させることにより、VRP発現プラスミドのpRK.vh1.4.2を構築した。このDNA、およびVEGF165(Houck et al., Mol. Endocrinol., 5:1806-1814 [1991])、PlGF152(Park et al.,前出)をコードするか、またはベクター単独(pRK5;Suva et al.,前出)の対照プラスミドを、DEAE−デキストランによりCOS7細胞中にトランスフェクションした。Janssen et al.,前出。トランスフェクションの2日後、100μCi/mLの35Sアミノ酸(Pro-Mix)TMブランド;Amersham #SJQ0079)を補足したメチオニン−およびシステイン−非含有DMEM5mLにより、37℃で5時間10cmシャーレ中で細胞を瞬間標識し、次いで7時間DMEMを追加した。標識した順化培地をスピン濃縮(Centricon-10TMブランド;Amicon #4203)により10倍濃縮した。濃縮培地50μLを受容体IgG 3μgおよびプロテインAアガロース(Calbiochem)の50%スラリー80μLと共に4℃で一晩インキュベートした。沈降物をPBS/0.1%TritonX-100で洗浄し、SDS試料緩衝液中で煮沸して、12%SDSポリアクリルアミドゲル(Novex #EC60052)で電気泳動した。このゲルをオートラジオグラフィー増強剤(duPont #NEF974)で処理して−70℃で一晩感光した。
53kDaと33kDaの2つの特異的バンドが、Flt4/IgGによるVRPトランスフェクション物から沈降した;これらのバンドはベクタートランスフェクション物では存在しなかった。これら2つのバンドの特異的な沈降は、Flt1/IgGまたはFlk1/IgGではほとんどまたは全然見られなかった。時々、幾つかのVRP沈降物をFlk1/IgGで検出したが、これはVRPがFlk1と低親和性相互作用しうることを示唆している。VEGF発現プラスミドによるトランスフェクションでは、Flt1/IgGおよびFlk1/IgGにより約22kDaの強いバンドの予測された沈降が見られた(DeVries et al.,前出;Quinn et al.,前出;Milauer et al.,前出;Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.前出)が、Flt4/IgGによる沈降はなかった。標識PlGFによる同様な実験では、Flt4/IgGによる沈降はなく、Flt1/IgGによる予測された沈降はあったが、Flk1/IgGによる沈降はなかった。Park et al.,前出。これらのデータは、VRPが、Flt4受容体の細胞外ドメインに結合するが、VEGF受容体のFlt1またはFlk1とは相互作用しない(またははるかに弱く相互作用する)ことを示している。またこれらは、Flt4とのVEGFの相互作用がないこと(Pajusola et al., Oncogene, 9前出)を確認し、PlGFもこの受容体のリガンドではないことを示している。
Flt4受容体のチロシンリン酸化
Flt4のチロシンリン酸化(PCT/US93/00586、前出、にも記載されている)をアッセイするために、Flt4を293細胞で発現させて、ホスホチロシン免疫ブロットによりFlt4リン酸化をモニターした。具体的には、長型のヒトFlt4をコードするDNAを哺乳動物発現ベクターpRK5(Suva et al.,前出)中にクローン化して、プラスミドpRK.tk1-3.1を得た。このプラスミドを、ミログリコシドホスホトランスフェラーゼ(ネオ)転写単位を含有するプラスミドと共に293細胞中にリン酸カルシウム沈降により同時トランスフェクションし(Janssen et al.,前出)、安定にトランスフェクションされた株をG418(Gibco)での増殖により選択した。Flt4/IgG抗血清でのFACS解析により決定されたFlt4を発現する1つのクローンの細胞株(クローン31)、およびトランスフェクションしていない293細胞を、Flt4チロシンリン酸化アッセイにおいて使用した。PBS/0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)100μL中の100万細胞を試料100μLと混合して、37℃で15分間インキュベーションした。次に細胞を遠心分離により回収し、0.15M NaCl、10%グリセロール、1%Triton X-100、50mM HEPES(pH7.3)、4μg/mL PMSF、0.02u/mLアプロチニン(Sigma A6279)、および20mMオルトバナジン酸ナトリウム250μL中で溶解した。ウサギFlt4/IgG抗血清8μLおよびプロテインAアガロース30μLの添加により、Flt4を免疫沈降した。洗浄した沈降物をSDS試料緩衝液中で煮沸して、ポリアクリルアミドゲル(Novex)で電気泳動し、ニトロセルロースに移して(Janssen et al.,前出)、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体(Upstate Biotechnology)およびアルカリホスファターゼ検出系(Promega)を用いて調べた。
VH1.4(pRK.vh1.4.2)またはVEGF(Houck et al.,前出)をコードする発現プラスミドの293細胞中へのエレクトロポレーション、および3日間の無血清順化培地の20倍濃縮(Centricon-10, Amicon)により、VRPまたはVEGFを含有する試料を調製した。受容体IgG競合実験では、濃縮順化培地を受容体IgGと共に4℃で1時間プレインキュベートした。
刺激がない場合、Flt4発現または非発現293細胞は、Flt4チロシンリン酸化をほとんどまたは全然示さなかった。Flt4/IgG抗血清によるFlt4発現細胞の刺激により、180および120kDaの2つのバンドのチロシンリン酸化が見られた。免疫前血清では基線リン酸化を超える上昇は観察されず、非発現細胞のFlt4/IgG抗血清刺激ではバンドは見られなかった。およそこのサイズの2つのFlt4バンドは、DAMIおよびHEL細胞により発現されることが報告されている。Pajusola et al., Oncogene, 8、前出。さらに、精製Flt4/IgGのSDSゲル解析により、これが、150、80、および70kDaのペプチドよりなることが判った。Flt4/IgGペプチドのN末端アミノ酸配列により、150および70kDaバンドが、アミノ酸配列:YSMTPPTL(SEQ ID NO:9)(残基25で開始するFlt4配列に適合する)を有し、80kDaバンドが、配列:SLRRRQQQD(SEQ ID NO:10)(残基473で始まるFlt4配列に適合する)を有することが判った。即ち、Flt4/IgGおよび完全長Flt4の両方とも、細胞外ドメインで部分的に切断されていると考えられ、そしてFlt4リン酸化アッセイで観察された180および120kDaのチロシンリン酸化バンドは、Flt4/IgGの150および80kDaペプチドに対応するものであろう。Flt4発現細胞にポリクローナル抗血清を添加すると、180および120kDaの2つのFlt4バンドのチロシンリン酸化が見られた;非発現細胞ではどのバンドも観察されなかった。これらのデータは、Flt4受容体の細胞外ドメインに対して生成したポリクローナル抗体が、Flt4チロシンリン酸化を活性化することができることを示している。
VRPが、Flt4のチロシンリン酸化を活性化できるかどうかを決定するために、VRP発現プラスミドでトランスフェクションした哺乳動物細胞からの順化培地をアッセイした。この順化培地は、アゴニストのポリクローナル抗体により見られた同じ180および120kDaバンドのチロシンリン酸化を促進したが、このことは、VRPが、Flt4に結合できるだけでなく、Flt4のリン酸化を促進することができることを証明している。VEGF発現細胞からの順化培地では、Flt4チロシンリン酸化を活性化することができなかった。
VEGFファミリーの受容体へのVRP結合の特異性を確認するために、Flt4/IgG、Flt1/IgG、Flk1/IgG、およびHtk/IgGを、VRP刺激Flt4リン酸化に競合するこれらの能力に関して試験した。VRPがFlt4のリガンドであならば予測されるとおり、Flt4/IgGは、VRP刺激リン酸化を妨害し、一方Flt1/IgG、Flk1/IgG、および無関係のチロシンキナーゼ受容体からの融合タンパク質であるHtk/IgGは、ほとんどまたは全然作用しなかった。これらのデータは、VRPが、Flt4のチロシンリン酸化を誘導することができることを示している。
VRPの精製および標識Flt4/IgGへの結合
ヘルペスグリコプロテインDのN末端分泌シグナル配列および約30アミノ酸をコードするリーディングフレーム(Lasky and Dowbenko, DNA, 3:23-29 [1984];Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1142-1146 [1995])を、短いリンカー配列によりVRPの推定成熟配列に融合した。哺乳動物細胞からの分泌後、この構築物からN末端グリコプロテインD配列:KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLLEGGAAHYALLP(SEQ ID NO:11)とそれに続く成熟VRP配列:GPREAPAAAAAFE(SEQ ID NO:12)が得られることが期待される。この融合タンパク質をコードするDNAを、ベクターpRK5にクローン化して、プラスミドpRK.vh1.4.5を得た。このプラスミドをエレクトロポレーションにより293細胞中にトランスフェクションして(Janssen et al.,前出)、VRPを、3〜4日の無血清順化培地からモノクローナル抗体(5B6)アフィニティークロマトグラフィーにより精製して、比色アッセイ(Bio-Rad)により定量した。この抗体は、VRPのN末端に融合したグリコプロテインD配列に対して特異的である。
Flt4/IgGを、IodobeadsTMブランドのヨウ素化ビーズ(Pierce)により1000〜1500Ci/mmolの比活性までヨウ素化した。結合は、〜30μg抗gDモノクローナル抗体(5B6)に結合したガラスビーズの50%スラリー20μLを含有する、PBS、0.5% BSA、0.02%Tween-20TM界面活性剤、1μg/mLヘパリン(結合緩衝液)中の、〜20,000cpm125I−Flt4/IgGおよびVH1.4 gD融合タンパク質12ngにより、最終容量100μLで22℃で4〜6時間行った。ビーズを濾過(Millipore Multiscreen-HV)により回収し、結合緩衝液200μLで5回洗浄して、計数した。Flt4/IgGの濃度を増加させながらの結合(図5B)には、結合緩衝液は、DMEM(低グルコース):F12(50:50)、20mM HEPESナトリウム(pH7.2)、10%ウシ胎児血清、0.2%ゼラチン、および1μg/mLヘパリンとした。
精製VRPは、125I−Flt4/IgGに特異的に結合し、この結合は、未標識Flt1/IgGまたはFlk1/IgGにより競合を受けなかった(図5A)。未標識Flt4/IgGを増加させながらの結合競合(図5B)は、〜0.7nMのこの相互作用のEC50を与えたが、これは、Flt4へのVRPの結合が、VRPがFlt4の生物学的に相当するリガンドであるならば予測されるような高親和性であることを示唆している。
RNAブロット
ポリ(A)+ヒトRNAを含有するブロットは、Clontechから入手した。G61膠腫細胞株について、ポリ(A)+およびポリ(A)−RNA5μgを1%アガロース/2.2Mホルムアルデヒドゲルで電気泳動して、ニトロセルロースに移した(Janssen et al.,前出)。ブロットを、32P標識プローブのovh1.4およびovh1.5とハイブリダイズさせて、30mM NaCl/3mMクエン酸三ナトリウム中で55℃で洗浄した。
VRPのクローニングに使用したG61膠腫細胞株は、約2.4kbの主要なVRP RNAバンドを発現する。約2.2kbの小さなバンドも存在し得る。2.4kbバンドは、心臓、胎盤、卵巣、および小腸由来の成人ヒト組織で発現していた;弱い方のバンドは、肺、骨格筋、脾臓、前立腺、精巣、および結腸で見い出された。2.4kb mRNAの発現は、胎児肺および腎臓でも見い出された。
VRPの分裂促進活性
VRPが、VEGFで見られるような分裂促進活性を有するかどうか試験するために、VRPまたはVEGFの濃度を増加させながらヒト肺内皮細胞の増殖をアッセイした(図6)。具体的には、ヒト肺微小血管内皮細胞(HMVEC−L、Clonetics, San Diego, CA)を、推奨される増殖培地(5%ウシ胎児血清を含むEGM−MV)で維持培養した。分裂促進性のアッセイのため、継代数の少ない(<6)細胞を48ウェルプレート(Costar)に6500細胞/ウェルで接種して、推奨される増殖培地で一晩維持培養した。培地を除き、ウシ脳抽出物を含まずVEGFまたはVRPを補足した増殖培地(2%ウシ胎児血清)で細胞を維持培養した。4日後、細胞をトリプシンで取り出し、クールター計数器(Hialeah, FL)で計数した。
VRPは、これら内皮細胞の増殖を促進し(図6を参照のこと)、そしてVEGFとこの分裂促進活性を共有している。このことは、PlGFとは対照的であり、PlGFはこのような分裂促進活性を欠いている(≦35nMで)ことが報告されている。Park et al.,前出。有効な分裂促進剤ではあっても、VRPは、このアッセイではVEGFより約100倍活性が弱かった。
結論として、今や、Flt4リガンドであり、かつ受容体型チロシンキナーゼFlt4のチロシンリン酸化を促進する、新規な分泌タンパク質のVRPが同定された。VRPは、VEGFタンパク質ファミリーの第三のメンバーであり、VEGFおよびPlGFと約30%のアミノ酸同一性がある。VEGF様ドメインに加えて、VRPは、VEGFファミリーの他のメンバーには見られない、〜180アミノ酸のC末端のシステインの豊富なドメインを含有する。VRPは、VEGF受容体のFlt1およびFlk1とは認めうる相互作用はできない。
下記のプラスミドは、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA(ATCC)に寄託した:
プラスミド ATCC寄託番号 寄託日
pRK.vh1.4.1 97249 1995年9月6日
この寄託は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその規則」(ブダペスト条約)の規定のもとに行った。これにより、寄託の日から30年間寄託物の生存培養物の保存を確保する。寄託物は、ブダペスト条約に基づきATCCにより利用可能とされ、ジェネンテク社(Genentech, Inc.)とATCCとの間の契約の対象となるが、この契約は、米国特許の発行に基づき、または任意の米国若しくは外国特許出願の公衆への公開に基づき、いずれが先に来ようと、公衆への寄託培養継代物の永久的かつ無制限の利用可能性を確保するものであり、そして米国特許法(35USC)§122およびその施行規則(Commissioner's rules)(特に886OG638に関する特許法施行規則(37CFR)§1.14を含む)により特許付与するために米国特許商標庁長官が決定した者へのその培養継代物の利用可能性を確保するものである。
本出願の譲受人は、寄託したプラスミドの培養物が、適切な条件下で培養したときに死滅または消失または崩壊したならば、通知により、そのプラスミドを別の同じプラスミドで迅速に置き換えることに同意している。寄託したプラスミドの利用可能性は、いずれの政府の当局のもとでも、その特許法により付与される権利に反して、本発明を実施するための実施権を構成するものではない。
前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分な内容であると考えられる。寄託した実施態様が本発明のある側面の1つの例示として意図されたものであり、同等に機能する任意の構築物は本発明の範囲に含まれるので、本発明は、寄託した構築物により範囲を限定されるものではない。本発明の材料の寄託は、本明細書に含まれる記述が、本発明の任意の側面(その最良の実施態様を含む)の実施を可能にするのに不適切であることの承認を構成するものでも、また、これが表す具体的な例示に請求の範囲を限定するものと解釈すべきものでもない。実際、本明細書に示し記載したものに加えて本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者には明らかとなるであろうが、これらも添付した請求の範囲に含まれる。
(1) 一般情報:
(i) 出願人: ジェネンテク,インコーポレイテッド
(ii) 発明の名称: VEGF−関連タンパク質
(iii) 配列の数: 12
(iv) 照会先:
(A) 名宛人:ジェネンテク,インコーポレイテッド
(B) 通り:ポイント サン ブルーノ ブールバード 460
(C) 市:サウス サン フランシスコ
(D) 州:カリフォルニア
(E) 国:アメリカ合衆国
(F) 郵便番号:94080
(v)コンピューター読みとり形態:
(A) 媒体タイプ: 3.5インチ、1.44Mbフロッピーディスク
(B) コンピューター: IBM PC互換機
(C) オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS
(D) ソフトウエア: WinPatin (Genentech)
(vi) 現出願のデータ:
(A) 出願番号:
(B) 出願日:
(C) 分類:
(viii) 代理人情報:
(A)氏名: リー,ウェンディー エム.
(B)登録番号: P-40,378
(C)照会番号: P0963PCT
(ix) 通信情報:
(A) 電話: 415/225-1994
(B) FAX: 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168
(2) SEQ ID NO:1の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 2031塩基対
(B) 型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:1:
CGCGGGGTGT TCTGGTGTCC CCCGCCCCGC CTCTCCAAAA AGCTACACCG 50
ACGCGGACCG CGGCGGCGTC CTCCCTCGCC CTCGCTTCAC CTCGCGGGCT 100
CCGAATGCGG GGAGCTCGGA TGTCCGGTTT CCTGTGAGGC TTTTACCTGA 150
CACCCGCCGC CTTTCCCCGG CACTGGCTGG GAGGGCGCCC TGCAAAGTTG 200
GGAACGCGGA GCCCCGGACC CGCTCCCGCC GCCTCCGGCT CGCCCAGGGG 250
GGGTCGCCGG GAGGAGCCCG GGGGAGAGGG ACCAGGAGGG GCCCGCGGCC 300
TCGCAGGGGC GCCCGCGCCC CCACCCCTGC CCCCGCCAGC GGACCGGTCC 350
CCCACCCCCG GTCCTTCCAC CATGCACTTG CTGGGCTTCT TCTCTGTGGC 400
GTGTTCTCTG CTCGCCGCTG CGCTGCTCCC GGGTCCTCGC GAGGCGCCCG 450
CCGCCGCCGC CGCCTTCGAG TCCGGACTCG ACCTCTCGGA CGCGGAGCCC 500
GACGCGGGCG AGGCCACGGC TTATGCAAGC AAAGATCTGG AGGAGCAGTT 550
ACGGTCTGTG TCCAGTGTAG ATGAACTCAT GACTGTACTC TACCCAGAAT 600
ATTGGAAAAT GTACAAGTGT CAGCTAAGGA AAGGAGGCTG GCAACATAAC 650
AGAGAACAGG CCAACCTCAA CTCAAGGACA GAAGAGACTA TAAAATTTGC 700
TGCAGCACAT TATAATACAG AGATCTTGAA AAGTATTGAT AATGAGTGGA 750
GAAAGACTCA ATGCATGCCA CGGGAGGTGT GTATAGATGT GGGGAAGGAG 800
TTTGGAGTCG CGACAAACAC CTTCTTTAAA CCTCCATGTG TGTCCGTCTA 850
CAGATGTGGG GGTTGCTGCA ATAGTGAGGG GCTGCAGTGC ATGAACACCA 900
GCACGAGCTA CCTCAGCAAG ACGTTATTTG AAATTACAGT GCCTCTCTCT 950
CAAGGCCCCA AACCAGTAAC AATCAGTTTT GCCAATCACA CTTCCTGCCG 1000
ATGCATGTCT AAACTGGATG TTTACAGACA AGTTCATTCC ATTATTAGAC 1050
GTTCCCTGCC AGCAACACTA CCACAGTGTC AGGCAGCGAA CAAGACCTGC 1100
CCCACCAATT ACATGTGGAA TAATCACATC TGCAGATGCC TGGCTCAGGA 1150
AGATTTTATG TTTTCCTCGG ATGCTGGAGA TGACTCAACA GATGGATTCC 1200
ATGACATCTG TGGACCAAAC AAGGAGCTGG ATGAAGAGAC CTGTCAGTGT 1250
GTCTGCAGAG CGGGGCTTCG GCCTGCCAGC TGTGGACCCC ACAAAGAACT 1300
AGACAGAAAC TCATGCCAGT GTGTCTGTAA AAACAAACTC TTCCCCAGCC 1350
AATGTGGGGC CAACCGAGAA TTTGATGAAA ACACATGCCA GTGTGTATGT 1400
AAAAGAACCT GCCCCAGAAA TCAACCCCTA AATCCTGGAA AATGTGCCTG 1450
TGAATGTACA GAAAGTCCAC AGAAATGCTT GTTAAAAGGA AAGAAGTTCC 1500
ACCACCAAAC ATGCAGCTGT TACAGACGGC CATGTACGAA CCGCCAGAAG 1550
GCTTGTGAGC CAGGATTTTC ATATAGTGAA GAAGTGTGTC GTTGTGTCCC 1600
TTCATATTGG AAAAGACCAC AAATGAGCTA AGATTGTACT GTTTTCCAGT 1650
TCATCGATTT TCTATTATGG AAAACTGTGT TGCCACAGTA GAACTGTCTG 1700
TGAACAGAGA GACCCTTGTG GGTCCATGCT AACAAAGACA AAAGTCTGTC 1750
TTTCCTGAAC CATGTGGATA ACTTTACAGA AATGGACTGG AGCTCATCTG 1800
CAAAAGGCCT CTTGTAAAGA CTGGTTTTCT GCCAATGACC AAACAGCCAA 1850
GATTTTCCTC TTGTGATTTC TTTAAAAGAA TGACTATATA ATTTATTTCC 1900
ACTAAAAATA TTGTTTCTGC ATTCATTTTT ATAGCAACAA CAATTGGTAA 1950
AACTCACTGT GATCAATATT TTTATATCAT GCAAAATATG TTTAAAATAA 2000
AATGAAAATT GTATTAAAAA AAAAAAAAAA A 2031
(2) SEQ ID NO:2の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 2031 塩基対
(B) 型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:2:
TTTTTTTTTT TTTTTTAATA CAATTTTCAT TTTATTTTAA ACATATTTTG 50
CATGATATAA AAATATTGAT CACAGTGAGT TTTACCAATT GTTGTTGCTA 100
TAAAAATGAA TGCAGAAACA ATATTTTTAG TGGAAATAAA TTATATAGTC 150
ATTCTTTTAA AGAAATCACA AGAGGAAAAT CTTGGCTGTT TGGTCATTGG 200
CAGAAAACCA GTCTTTACAA GAGGCCTTTT GCAGATGAGC TCCAGTCCAT 250
TTCTGTAAAG TTATCCACAT GGTTCAGGAA AGACAGACTT TTGTCTTTGT 300
TAGCATGGAC CCACAAGGGT CTCTCTGTTC ACAGACAGTT CTACTGTGGC 350
AACACAGTTT TCCATAATAG AAAATCGATG AACTGGAAAA CAGTACAATC 400
TTAGCTCATT TGTGGTCTTT TCCAATATGA AGGGACACAA CGACACACTT 450
CTTCACTATA TGAAAATCCT GGCTCACAAG CCTTCTGGCG GTTCGTACAT 500
GGCCGTCTGT AACAGCTGCA TGTTTGGTGG TGGAACTTCT TTCCTTTTAA 550
CAAGCATTTC TGTGGACTTT CTGTACATTC ACAGGCACAT TTTCCAGGAT 600
TTAGGGGTTG ATTTCTGGGG CAGGTTCTTT TACATACACA CTGGCATGTG 650
TTTTCATCAA ATTCTCGGTT GGCCCCACAT TGGCTGGGGA AGAGTTTGTT 700
TTTACAGACA CACTGGCATG AGTTTCTGTC TAGTTCTTTG TGGGGTCCAC 750
AGCTGGCAGG CCGAAGCCCC GCTCTGCAGA CACACTGACA GGTCTCTTCA 800
TCCAGCTCCT TGTTTGGTCC ACAGATGTCA TGGAATCCAT CTGTTGAGTC 850
ATCTCCAGCA TCCGAGGAAA ACATAAAATC TTCCTGAGCC AGGCATCTGC 900
AGATGTGATT ATTCCACATG TAATTGGTGG GGCAGGTCTT GTTCGCTGCC 950
TGACACTGTG GTAGTGTTGC TGGCAGGGAA CGTCTAATAA TGGAATGAAC 1000
TTGTCTGTAA ACATCCAGTT TAGACATGCA TCGGCAGGAA GTGTGATTGG 1050
CAAAACTGAT TGTTACTGGT TTGGGGCCTT GAGAGAGAGG CACTGTAATT 1100
TCAAATAACG TCTTGCTGAG GTAGCTCGTG CTGGTGTTCA TGCACTGCAG 1150
CCCCTCACTA TTGCAGCAAC CCCCACATCT GTAGACGGAC ACACATGGAG 1200
GTTTAAAGAA GGTGTTTGTC GCGACTCCAA ACTCCTTCCC CACATCTATA 1250
CACACCTCCC GTGGCATGCA TTGAGTCTTT CTCCACTCAT TATCAATACT 1300
TTTCAAGATC TCTGTATTAT AATGTGCTGC AGCAAATTTT ATAGTCTCTT 1350
CTGTCCTTGA GTTGAGGTTG GCCTGTTCTC TGTTATGTTG CCAGCCTCCT 1400
TTCCTTAGCT GACACTTGTA CATTTTCCAA TATTCTGGGT AGAGTACAGT 1450
CATGAGTTCA TCTACACTGG ACACAGACCG TAACTGCTCC TCCAGATCTT 1500
TGCTTGCATA AGCCGTGGCC TCGCCCGCGT CGGGCTCCGC GTCCGAGAGG 1550
TCGAGTCCGG ACTCGAAGGC GGCGGCGGCG GCGGGCGCCT CGCGAGGACC 1600
CGGGAGCAGC ACAGCGGCGA GCAGAGAACA CGCCACAGAG AAGAAGCCCA 1650
GCAAGTGCAT GGTGGAAGGA CCGGGGGTGG GGGACCGGTC CGCTGGCGGG 1700
GGCAGGGGTG GGGGCGCGGG CGCCCCTGCG AGGCCGCGGG CCCCTCCTGG 1750
TCCCTCTCCC CCGGGCTCCT CCCGGCGACC CCCCCTGGGC GAGCCGGAGG 1800
CGGCGGGAGC GGGTCCGGGG CTCCGCGTTC CCAACTTTGC AGGGCGCCCT 1850
CCCAGCCAGT ACCGGGGAAA GGCGGCGGGT GTCAGGTAAA AGCCTCACAG 1900
GAAACCGGAC ATCCGAGCTC CCCGCATTCG GAGCCCGCGA GGTGAAGCGA 1950
GGGCGAGGGA GGACGCCGCC GCGGTCCGCG TCGGTGTAGC TTTTTGGAGA 2000
GGCGGGGCGG GGGACACCAG AACACCCCGC G 2031
(2) SEQ ID NO:3の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 419 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:3:
Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Phe Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala
35 40 45
Gly Glu Ala Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu
50 55 60
Arg Ser Val Ser Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro
65 70 75
Glu Tyr Trp Lys Met Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp
80 85 90
Gln His Asn Arg Glu Gln Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu
95 100 105
Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Thr Asn Thr Glu Ile Leu Lys
110 115 120
Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu
125 130 135
Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr
140 145 150
Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys
155 160 165
Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr
170 175 180
Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly
185 190 195
Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg
200 205 210
Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile
215 220 225
Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn
230 235 240
Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg
245 250 255
Cys Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp
260 265 270
Asp Ser Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu
275 280 285
Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg
290 295 300
Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys
305 310 315
Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala
320 325 330
Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg
335 340 345
Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys
350 355 360
Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys
365 370 375
Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys Thr Asn
380 385 390
Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu Val
395 400 405
Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser
410 415 419
(2) SEQ ID NO:4の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 147 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:4:
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala
20 25 30
Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp
35 40 45
Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp
50 55 60
Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
65 70 75
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
80 85 90
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln
95 100 105
Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met
110 115 120
Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp
125 130 135
Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg
140 145 147
(2) SEQ ID NO:5の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 149 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:5:
Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gly Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser
20 25 30
Ala Gly Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu
35 40 45
Val Trp Gly Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp
50 55 60
Val Val Ser Glu Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro
65 70 75
Ser Cys Val Ser Leu Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu
80 85 90
Asn Leu His Cys Val Pro Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln
95 100 105
Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu
110 115 120
Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu
125 130 135
Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg
140 145 149
(2) SEQ ID NO:6の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 299 塩基対
(B) 型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:6:
CCGTCTACAG ATGTGGGGGT TGCTGCAATA GTGAGGGGCT GCAGTGCATG 50
AACACCAGCA CGAGCTACCT CAGNAAGACG TTATTTGAAA TTACAGTGCC 100
TCTCTCTCAA GGCCCCAAAC CAGTAACAAT CAGTTTTGCC AATCACACTT 150
CCTGCCGATG CATGTCTAAA CTGGATGTTT ACAGACAAGT TCATTCCATT 200
ATTAGACGTT CCCTGCCAGC AACACTACCA CAGTGTCAGG CAGCGAACAA 250
GACCTGCCCC ACCAATTACA TGTGGAATAA TCACATCTGC AGATGCCTG 299
(2) SEQ ID NO:7の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 50 塩基対
(B) 型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:7:
CTGGTGTTCA TGCACTGCAG CCCCTCACTA TTGCAGCAAC CCCCACATCT 50
(2) SEQ ID NO:8の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 50 塩基対
(B) 型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:8:
GCATCTGCAG ATGTGATTAT TCCACATGTA ATTGGTGGGG CAGGTCTTGT 50
(2) SEQ ID NO:9の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 8 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:9:
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu
1 5 8
(2) SEQ ID NO:10の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 9 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:10:
Ser Leu Arg Arg Arg Gln Gln Gln Asp
1 5 9
(2) SEQ ID NO:11の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 40 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:11:
Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn
1 5 10 15
Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Leu Glu
20 25 30
Gly Gly Ala Ala His Tyr Ala Leu Leu Pro
35 40
(2) SEQ ID NO:12の情報:
(i) 配列の性質:
(A) 長さ: 13 アミノ酸
(B) 型: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列: SEQ ID NO:12:
Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe Glu
1 5 10 13
Claims (39)
- 少なくとも265アミノ酸を含む単離された生物学的に活性なヒトVEGF関連タンパク質(VRP)。
- 265から約450アミノ酸を含む請求項1に記載のタンパク質。
- 約300〜450アミノ酸を含む請求項1に記載のタンパク質。
- 約350〜450アミノ酸を含む請求項1に記載のタンパク質。
- 約399〜419アミノ酸を含む請求項1に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基+1〜29(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項1に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基+1〜137(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項6に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基−20〜29(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項6に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基−20〜137(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項1に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基+1〜29(両端を含む)を含むアミノ酸配列を含む単離された生物学的に活性なヒトVEGF関連タンパク質(VRP)。
- 図1の少なくとも残基+1〜137(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項10に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基−20〜29(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項10に記載のタンパク質。
- 図1の少なくとも残基−20〜137(両端を含む)を有するアミノ酸配列を含む請求項10に記載のタンパク質。
- 図1の残基−20〜399(両端を含む)もしくは残基1〜399(両端を含む)として示されるアミノ酸配列を含む単離された生物学的に活性なヒトVEGF関連タンパク質(VRP)。
- 前記配列が、図1の残基−20〜399(両端を含む)として示される、請求項14に記載のタンパク質。
- 前記配列が、図1の残基1〜399(両端を含む)として示される、請求項14に記載のタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質および薬学的に受容可能な担体を含む組成物。
- 治療的に有効量の請求項1に記載のタンパク質を、薬学的に受容可能な担体中に含む脈管内皮細胞成長を促進するのに有用な医薬組成物。
- さらに、前記タンパク質以外の細胞増殖因子を含む、請求項18に記載の組成物。
- 脈管内皮に影響を及ぼす損傷を処置する方法であって、該損傷を受けている哺乳動物に有効量の請求項18に記載の組成物を投与することを包含する方法。
- 前記哺乳動物に前記タンパク質以外の有効量の細胞増殖因子を投与することをさらに包含する、請求項20に記載の方法。
- 哺乳動物においてVRPに対する受容体の活性化の欠如または阻害の欠如により特徴付けられる機能不全状態を処置する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項17に記載の組成物を投与することを包含する方法。
- Flt4受容体のチロシンキナーゼドメインのリン酸化を刺激する方法であって、該Flt4受容体の細胞外ドメインを請求項1に記載のタンパク質と接触させることを包含する方法。
- 標識ポリペプチド配列に融合された請求項1に記載のタンパク質を含むキメラポリペプチド。
- 請求項1に記載のタンパク質に結合して該タンパク質の生物学的活性を無効にするモノクローナル抗体。
- 前記タンパク質の生物学的活性が、哺乳動物における新生血管形成もしくは血管透過性もしくは脈管内皮細胞成長を促進する請求項25に記載の抗体。
- 請求項25に記載の抗体および薬学的に受容可能な担体を含む組成物。
- 哺乳動物における望ましくない過剰な新生血管形成もしくは血管透過性により特徴付けられる疾患もしくは障害の処置方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項27に記載の組成物を投与することを包含する方法。
- 哺乳動物においてVRPに対する受容体の過剰な活性化または阻害により特徴付けられる機能不全状態を処置する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項27に記載の組成物を投与することを包含する方法。
- 図1に示されるアミノ酸配列のN−末端部分の残基−20〜137(両端を含む)、もしくは残基1〜137(両端を含む)に結合するモノクローナル抗体。
- 図1の残基−20〜−1(両端を含む)として示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 哺乳動物においてVRPに対する受容体の過剰な活性化または阻害により特徴付けられる機能不全状態を処置する方法であって、該哺乳動物に有効量のVRPアンタゴニストを投与することを包含する方法。
- 哺乳動物においてカポジ肉腫を処置する方法であって、該哺乳動物に有効量のVRPアンタゴニストを投与することを包含する方法。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- さらに前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む請求項34に記載の核酸分子。
- 請求項34に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターによって形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に連結された請求項34に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項34に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 請求項38に記載の宿主細胞を培養する工程、および該宿主細胞培養物からVRPを回収する工程を包含するVRPの産生方法。
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US6403088B1 (en) | 1995-08-01 | 2002-06-11 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3) |
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WO1998033917A1 (en) * | 1994-11-14 | 1998-08-06 | The Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor c (vegf-c) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
US6221839B1 (en) | 1994-11-14 | 2001-04-24 | Helsinki University Licensing Ltd. Oy | FIt4 ligand and methods of use |
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US6818220B1 (en) | 1994-11-14 | 2004-11-16 | Licentia Ltd. | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof |
US6245530B1 (en) | 1995-08-01 | 2001-06-12 | Ludwig Institute For Cancer Research | Receptor ligand |
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US7727761B2 (en) * | 1995-08-01 | 2010-06-01 | Vegenics Limited | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
DK0848755T4 (da) * | 1995-09-08 | 2011-05-23 | Genentech Inc | VEGF relateret protein |
WO1997017442A1 (en) | 1995-11-08 | 1997-05-15 | Immunex Corporation | Flk-1 binding protein |
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ES2242227T5 (es) | 1996-07-15 | 2011-12-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Nuevo factor de tipo vegf. |
ES2251740T3 (es) * | 1996-08-23 | 2006-05-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Factor de crecimiento de celulas de endotelio vascular d recombinante (vegf-d). |
US6051698A (en) * | 1997-06-06 | 2000-04-18 | Janjic; Nebojsa | Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes |
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US20050163818A1 (en) * | 1996-11-05 | 2005-07-28 | Hsing-Wen Sung | Drug-eluting device chemically treated with genipin |
US7351421B2 (en) * | 1996-11-05 | 2008-04-01 | Hsing-Wen Sung | Drug-eluting stent having collagen drug carrier chemically treated with genipin |
US7125714B2 (en) | 1997-02-05 | 2006-10-24 | Licentia Ltd. | Progenitor cell materials and methods |
EP1062319A4 (en) * | 1998-03-13 | 2003-04-23 | Human Genome Sciences Inc | VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR 2 |
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DE69942981D1 (de) | 1998-10-09 | 2011-01-05 | Vegenics Ltd | Flt4 (vegfr-3) als ziel für tumornachweis (imaging) und antitumortherapie |
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EP1155117A4 (en) * | 1998-12-30 | 2003-05-14 | Millennium Pharm Inc | SECRETED PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS ENCODING THESE PROTEINS |
US7223724B1 (en) | 1999-02-08 | 2007-05-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells |
US6764820B2 (en) * | 1999-03-26 | 2004-07-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Screening for lymphatic disorders involving the FLT4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3) |
WO2000058511A1 (en) * | 1999-03-26 | 2000-10-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Screening and therapy for lymphatic disorders involving the flt4 receptor tyrosine kinase (vegfr-3) |
GB9918057D0 (en) * | 1999-07-30 | 1999-10-06 | Univ Bristol | Therapeutic agents |
ATE377081T1 (de) * | 2000-02-25 | 2007-11-15 | Ludwig Inst Cancer Res | Material und verfahren die hybridvaskularendothelwachstumfaktoren dns und proteine enthalten und screeningverfahren für modulatoren |
AUPQ592100A0 (en) * | 2000-02-29 | 2000-03-23 | Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The | A method of treatment and prophylaxis |
AU8473401A (en) * | 2000-08-04 | 2002-02-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
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WO2002083849A2 (en) * | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
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US20060204512A1 (en) | 2004-09-23 | 2006-09-14 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
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CA2599004C (en) | 2005-02-28 | 2015-05-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Anti-angiogenic methods and compositions |
US9073997B2 (en) * | 2007-02-02 | 2015-07-07 | Vegenics Pty Limited | Growth factor antagonists for organ transplant alloimmunity and arteriosclerosis |
BRPI0815399A2 (pt) | 2007-08-13 | 2019-09-24 | Vasgene Therapeutics Inc | tratamento de câncer usando anticorpos humanizados que se ligam ephb4 |
US20100029491A1 (en) * | 2008-07-11 | 2010-02-04 | Maike Schmidt | Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment |
WO2010150213A1 (en) * | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Danisco A/S | Protein |
AU2010273585B2 (en) | 2009-07-13 | 2015-04-23 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer |
US20110064670A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Genentech, Inc. | Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent |
WO2011056494A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations |
US8486397B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-07-16 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF-C antibodies and methods using same |
AU2011274423B2 (en) | 2010-07-09 | 2016-02-11 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric clotting factors |
US8472271B2 (en) | 2011-02-18 | 2013-06-25 | International Business Machines Corporation | Systems and methods for memory device precharging |
WO2013012733A1 (en) | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto |
JP6247226B2 (ja) | 2012-01-10 | 2017-12-13 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドBiogen MA Inc. | 血液脳関門を越える治療分子の輸送の向上 |
MY170528A (en) | 2013-02-18 | 2019-08-09 | Vegenics Pty Ltd | Vegfr-3 ligand binding molecules and uses thereof |
TWI745671B (zh) | 2013-03-15 | 2021-11-11 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ix多肽調配物 |
EP2994758B1 (en) | 2013-05-08 | 2017-12-20 | Opthea Limited | Biomarkers for age-related macular degeneration (amd) |
CA2915255A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Ophthotech Corporation | Methods for treating or preventing ophthalmological conditions |
KR102131370B1 (ko) | 2013-10-18 | 2020-07-08 | 삼성전자주식회사 | Vegf-c에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도 |
US11761951B2 (en) | 2015-02-04 | 2023-09-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of selecting therapeutic molecules |
MX2017010066A (es) | 2015-02-04 | 2017-11-01 | Hoffmann La Roche | Oligomeros antisentido de tau y usos de los mismos. |
EP3749678A1 (en) | 2018-02-07 | 2020-12-16 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Cell-permeable stapled peptide modules for cellular delivery |
Family Cites Families (77)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4943529A (en) | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
AU2353384A (en) | 1983-01-19 | 1984-07-26 | Genentech Inc. | Amplification in eukaryotic host cells |
DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
AU3145184A (en) | 1983-08-16 | 1985-02-21 | Zymogenetics Inc. | High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
US4946783A (en) | 1987-01-30 | 1990-08-07 | President And Fellows Of Harvard College | Periplasmic protease mutants of Escherichia coli |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
EP0321196A3 (en) | 1987-12-18 | 1990-07-18 | Mycogen Plant Science, Inc. | 780 t-dna gene transcription activator |
US5169770A (en) | 1987-12-21 | 1992-12-08 | The University Of Toledo | Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds |
US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5147638A (en) | 1988-12-30 | 1992-09-15 | Oklahoma Medical Research Foundation | Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system |
ATE144281T1 (de) | 1989-04-28 | 1996-11-15 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Hefezellen der gattung-schwanniomyces |
US5332671A (en) | 1989-05-12 | 1994-07-26 | Genetech, Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
DK168302B1 (da) | 1989-06-29 | 1994-03-07 | Danisco | Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller |
FR2649120B1 (fr) | 1989-06-30 | 1994-01-28 | Cayla | Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede |
US5219739A (en) | 1989-07-27 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121 |
US5194596A (en) | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
DE69024369T2 (de) | 1989-11-22 | 1996-06-13 | Genentech Inc | Latenz assoziierte peptide und deren verwendung |
US5206161A (en) | 1991-02-01 | 1993-04-27 | Genentech, Inc. | Human plasma carboxypeptidase B |
ATE221915T1 (de) | 1991-02-22 | 2002-08-15 | American Cyanamid Co | Identifizierung eines menschlichen rezeptor- tyrosinkinasegens |
CA2064331C (en) | 1991-03-28 | 2003-02-18 | Marvin L. Bayne | Vascular endothelial cell growth factor c subunit |
US5185438A (en) * | 1991-04-02 | 1993-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2 |
CA2128722A1 (en) | 1992-01-22 | 1993-08-05 | William I. Wood | Novel protein tyrosine kinases |
US5326695A (en) | 1992-05-15 | 1994-07-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Platelet derived growth factor agonists |
US6228609B1 (en) | 1992-07-09 | 2001-05-08 | Systemix, Inc. | Soluble Flk-2 sequence |
US6107046A (en) | 1992-10-09 | 2000-08-22 | Orion Corporation | Antibodies to Flt4, a receptor tyrosine kinase and uses thereof |
US5776755A (en) * | 1992-10-09 | 1998-07-07 | Helsinki University Licensing, Ltd. | FLT4, a receptor tyrosine kinase |
US6824777B1 (en) * | 1992-10-09 | 2004-11-30 | Licentia Ltd. | Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
ES2278663T3 (es) | 1992-10-28 | 2007-08-16 | Genentech, Inc. | Antagonistas del factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares vegf. |
US6177401B1 (en) | 1992-11-13 | 2001-01-23 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften | Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis |
CN1173991C (zh) | 1992-11-13 | 2004-11-03 | 马克斯普朗克科学促进协会 | 作为血管内皮生长因子受体的f1k-1 |
JPH09504689A (ja) * | 1993-10-01 | 1997-05-13 | ニューヨーク ユニバーシティー | 新規な受容体型ホスホチロシンホスファターゼσ |
AUPM379394A0 (en) | 1994-02-10 | 1994-03-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Immunointeractive molecules - i |
US5840301A (en) | 1994-02-10 | 1998-11-24 | Imclone Systems Incorporated | Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors |
US6040157A (en) * | 1994-03-08 | 2000-03-21 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
US5932540A (en) | 1994-03-08 | 1999-08-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
ATE309360T1 (de) * | 1994-03-08 | 2005-11-15 | Human Genome Sciences Inc | Vaskularer endothelialer wachstumsfaktor 2 |
US7109308B1 (en) * | 1994-03-08 | 2006-09-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human vascular endothelial growth factor 2 |
US7186688B1 (en) * | 1994-03-08 | 2007-03-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of stimulating angiogenesis in a patient by administering vascular endothelial growth factor 2 |
US6608182B1 (en) | 1994-03-08 | 2003-08-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human vascular endothelial growth factor 2 |
US6734285B2 (en) * | 1994-03-08 | 2004-05-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 proteins and compositions |
US7153827B1 (en) | 1994-03-08 | 2006-12-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 and methods of use |
WO1995033772A1 (en) | 1994-06-09 | 1995-12-14 | Kari Alitalo | Flt4 receptor tyrosine kinase and its use in diagnosis and therapy |
US6645933B1 (en) | 1995-08-01 | 2003-11-11 | Helsinki University Licensing Ltd. Oy | Receptor ligand VEGF-C |
US6130071A (en) * | 1997-02-05 | 2000-10-10 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) ΔCys156 protein and gene, and uses thereof |
US6245530B1 (en) * | 1995-08-01 | 2001-06-12 | Ludwig Institute For Cancer Research | Receptor ligand |
US6403088B1 (en) * | 1995-08-01 | 2002-06-11 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3) |
US6818220B1 (en) * | 1994-11-14 | 2004-11-16 | Licentia Ltd. | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof |
US6221839B1 (en) * | 1994-11-14 | 2001-04-24 | Helsinki University Licensing Ltd. Oy | FIt4 ligand and methods of use |
WO1998033917A1 (en) * | 1994-11-14 | 1998-08-06 | The Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor c (vegf-c) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
US5928939A (en) | 1995-03-01 | 1999-07-27 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor |
US5607918A (en) * | 1995-03-01 | 1997-03-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor-B and DNA coding therefor |
BR9607628A (pt) | 1995-03-02 | 1999-11-30 | Amrad Operations Pty Ltd | Mólecula proteinácea biologicamente isolada, molécula recombinante, fragmento de peptìdeo, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, e, processos para preparar uma molécula recombinante e para induzir a proliferação astroglial em um mamìfero |
EP0873348A4 (en) | 1995-06-06 | 2000-11-08 | Human Genome Sciences Inc | GROWTH FACTOR 3 OF THE HUMAN VASCULAR ENDOTHELIUM |
US7727761B2 (en) | 1995-08-01 | 2010-06-01 | Vegenics Limited | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
US6361946B1 (en) * | 1997-02-05 | 2002-03-26 | Licentia Ltd | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
DK0848755T4 (da) | 1995-09-08 | 2011-05-23 | Genentech Inc | VEGF relateret protein |
AU7142996A (en) | 1995-09-29 | 1997-04-28 | Universita' Degli Studi Di Siena | Regulated genes and uses thereof |
WO1997017442A1 (en) * | 1995-11-08 | 1997-05-15 | Immunex Corporation | Flk-1 binding protein |
US6994989B1 (en) * | 1995-11-08 | 2006-02-07 | Immunex Corp. | FLK-1 binding proteins |
ES2242227T5 (es) * | 1996-07-15 | 2011-12-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Nuevo factor de tipo vegf. |
ES2251740T3 (es) | 1996-08-23 | 2006-05-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Factor de crecimiento de celulas de endotelio vascular d recombinante (vegf-d). |
AU5439998A (en) | 1996-12-06 | 1998-06-29 | Zymogenetics Inc. | Vascular endothelial growth factor |
KR100244853B1 (ko) * | 1996-12-31 | 2000-02-15 | 구자홍 | 가변형 광원과 그를 이용한 이종 광디스크용광픽업 장치 |
US7125714B2 (en) * | 1997-02-05 | 2006-10-24 | Licentia Ltd. | Progenitor cell materials and methods |
CN1680442A (zh) | 1997-04-25 | 2005-10-12 | 科莱特诺医疗公司 | 截短的vegf相关蛋白质 |
DE19748734A1 (de) | 1997-11-05 | 1999-05-06 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-Familie sowie Verwendung der gewonnenen Dimere |
EP1062319A4 (en) | 1998-03-13 | 2003-04-23 | Human Genome Sciences Inc | VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR 2 |
FR2777904B1 (fr) * | 1998-04-24 | 2000-12-15 | Millipore Sa | Cassette ainsi que procede et appareil d'analyse de l'air l'utilisant |
DE69942981D1 (de) | 1998-10-09 | 2011-01-05 | Vegenics Ltd | Flt4 (vegfr-3) als ziel für tumornachweis (imaging) und antitumortherapie |
CA2435503C (en) | 2001-01-19 | 2011-02-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
US7142876B2 (en) * | 2003-03-03 | 2006-11-28 | Nokia Corporation | Location dependent services |
TW200829215A (en) | 2007-01-03 | 2008-07-16 | Univ Nat Chiao Tung | Micro probe array and manufacturing method of the trans-print mold thereof |
-
1996
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