JPH09505730A - Ｂｃｒ−ａｂｌ関連白血病および他の細胞増殖性疾患の治療方法ならびに組成物 - Google Patents

Ｂｃｒ−ａｂｌ関連白血病および他の細胞増殖性疾患の治療方法ならびに組成物

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JPH09505730A JP7510456A JP51045695A JPH09505730A JP H09505730 A JPH09505730 A JP H09505730A JP 7510456 A JP7510456 A JP 7510456A JP 51045695 A JP51045695 A JP 51045695A JP H09505730 A JPH09505730 A JP H09505730A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アダプタータンパク質のＳＨ２および／またはＳＨ３ドメイン含有ファミリーのメンバーと複合体化し得るプロテインチロシンキナーゼまたはプロテインチロシンホスファターゼが関与している細胞増殖性疾患を予防および治療するための組成物ならびに方法に関するものである。本発明は、一部には、アダプタータンパク質ＧＲＢ−２が in vivoで細胞内のＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ産物と結合し、かつＢＣＲ／ＡＢＬ産物の潜在的な発がん能力の活性化にとって必要である、という驚くべき発見に基づいている。本発明はさらに、プロテインチロシンキナーゼ／アダプタータンパク質複合体ならびに該複合体のメンバー間の相互作用を軽減または阻止することができる作用物質を同定するための該複合体の使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 ＢＣＲ−ＡＢＬ関連白血病および 他の細胞増殖性疾患の治療方法ならびに組成物 本発明は、1994年5月20日出願の米国出願 No．08/246,441 の一部継続出願で あり、その全体を参考文献として本明細書に含める。米国出願 No.．08/246,441 は、1993年9月28日出願の米国出願 No．08/127,922 の一部継続出願である。 １．序論 本発明は、アダプタータンパク質のＳＨ２−および／またはＳＨ３ドメイン含 有ファミリーのメンバーと複合体化し得るプロテインチロシンキナーゼまたはプ ロテインチロシンホスファターゼが関与している細胞増殖性疾患を予防および治 療するための組成物ならびに方法に関する。本発明は、一部には、アダプタータ ンパク質ＧＲＢ−２が in vivoで細胞内のＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ産物 と結合し、かつＢＣＲ−ＡＢＬ産物の潜在的な発がん能力の活性化にとって必要 であること、およびＧＲＢ−２のシグナル能の破壊が細胞の形質転換された表現 型を逆にし、動物での腫瘍増殖を減少させる、という驚くべき発見に基づいてい る。本発明はさらに、プロテインチロシンキナーゼ／アダプタータンパク質複合 体ならびに該複合体のメンバー間の相互作用を破壊することができる作用物質を 同定するための該複合体の使用に関する。 ２．背景 ２．１．タンパク質のリン酸化およびシグナル形質導入 細胞は、細胞がじかに接触する環境からの刺激を受け取る手段として、かなり の部分を細胞外分子に頼っている。これらの細胞外のシグナルは、分化、収縮性 、分泌、細胞分裂、接触阻止および代謝などの種々の細胞プロセスの正しい調節 に必須である。例えばホルモン、成長因子、リンフォカインまたは神経伝達物質 などの細胞外分子は、特定の細胞表面受容体と結合するリガンドとして作用する 。これらのリガンドがそれらの受容体に結合すると、最初の刺激の増殖および上 述した個々の細胞プロセスの協調の両方をもたらすカスケード反応を誘発する。 正常な細胞プロセスの他に、受容体およびそれらの細胞外リガンドは、ウィルス − 受容体相互作用、炎症、およびがんの状態への細胞の形質転換などの異常または 潜在的に有害なプロセスにも関与するかもしれない。 シグナル形質導入（最近の総説として、Posadaら、1992，Mol．Biol．Cell 3: 583-592; Hardie，D．G.，1990，Symp．Soc．Exp．Biol．44:241-255）と呼ばれ るこのプロセスの中心的な特徴は、ある種のタンパク質の可逆的リン酸化である 。 アミノ酸残基のリン酸化または脱リン酸化は、調節されるタンパク質の生物学 的特性を変える該タンパク質の立体変化を誘発する。タンパク質は、プロテイン キナーゼによってリン酸化され、プロテインホスファターゼによって脱リン酸化 される。プロテインキナーゼおよびホスファターゼは、それらが作用するアミノ 酸残基に従って分類される。一つの種類は、セリン−トレオニンキナーゼおよび ホスファターゼであって（scottら、1992，2:289-295）、セリンおよびトレオニ ン残基に作用する。他の種類はチロシンキナーゼおよびホスファターゼであって （Fischer ら、1991，Science 253:401-406; Schlessinger ら、1992，Neuron 9 :383-391; Ullrich ら、1990，Cell 61:203-212）、チロシン残基に作用する。 リン酸化は、競合するリン酸化および脱リン酸化反応を含む動的プロセスであり 、ある瞬間のリン酸化レベルは、その瞬間において、これらの反応を触媒するプ ロテインキナーゼおよびホスファターゼの相対的な活性を表す。 タンパク質のリン酸化の大部分はセリンおよびトレオニンアミノ酸残基で生じ るが、チロシン残基でのリン酸化も生じ、これは、多くのがん遺伝子産物および 成長因子受容体が固有のプロテインチロシンキナーゼ活性を有するという発見以 来、かなり関心が集まり始めている。成長因子のシグナル形質導入、細胞サイク ルの進行および悪性形質転換におけるプロテインチロシンリン酸化の重要性は、 現在、かなり確立されている（Cantley ら、1991，Cell 64:281-302; Hunter T. ，1991，Cell 64:249-270; Nurse，1990，Nature 344:503-308; Schlessingerら 、1992，Neuron 9:383-391; Ullrich ら、1990，Cell 61:203-212）。発がんに 導く正常な成長コントロール経路の破壊は、支配的な発がんタンパク質の大きな 集団を構成するプロテインチロシンキナーゼの活性化または過発現によって引き 起こされることが分かっている（Hunter，T.，1991，Cell 64:249-270）。 ２．２．プロテインチロシンキナーゼ プロテインチロシンキナーゼは、多くの成長因子受容体および潜在的ながん遺 伝子を含むタンパク質の大きなファミリーを含み、セリン／トレオニン特異的プ ロテインキナーゼと起源は共通であるが、それとは異なる（Hanks ら、1998，Sc ience 241:42-52）。そのプロテインキナーゼはさらに、受容体型または非受容 体型として定義することができる。 受容体型のプロテインチロシンキナーゼは膜内外トポロジーを有し、広く研究 されている。受容体型プロテインチロシンキナーゼの細胞外ドメインへの特異的 リガンドの結合は、受容体の二量化および自身のチロシン残基のリン酸化を誘発 すると考えられる。受容体の細胞質ドメインの個々のホスホチロシン残基は、細 胞質シグナル化分子の宿主と相互作用し、それによって種々のシグナル形質導入 経路を活性化する特異的な結合部位として作用すると考えられる（Ullrich ら、 1990，Cell 61:203-212）。 細胞内の細胞質非受容体型プロテインチロシンキナーゼは、疏水性の膜貫通ド メインを含まないプロテインチロシンキナーゼとして広く定義することができる 。この広い分類では、公知の細胞質プロテインチロシンキナーゼを４種類の異な る形態に分けることができる。すなわち、ＳＲＣファミリー（Martinezら、1987 ，Science 237:411-414; Sukegawa ら、1987，Mol．Cell．Biol．7:41-47; Yama nishi ら、1987，7:237-243; Marthら、1985，Cell 43:393-404; Dymeckiら、19 90，Science 247:332-336）、ＦＥＳファミリー（Ruebroekら、1985，EMBOJ．4: 2897-2903; Haoら、1989，Mol．Cell．Biol．9:1587-1593）、ＡＢＬファミリー （Shtivelmanら、1986，Cell 47:277-284; Kruh ら、1986，Science 234:1545-1 548）およびＪＡＫファミリーである。それらは、全体の分子構造が異なるが、 細胞質プロテインチロシンキナーゼのこれらの形態学上のファミリーの各メンバ ーは、触媒キナーゼドメインを共有する他に、非触媒ドメインも共有する。その ような非触媒ドメインは、ＳＨ２（ＳＲＣホモロジードメイン２；Sadowskiら、 Mol．Cell．Biol．6:4396-4408; Kochら、1991，Science 252:668-674）ドメイ ンおよびＳＨ３ドメイン（Mayer ら、1998，Nature 332:269-272）である。非触 媒ドメインは、シグナル形質導入中のタンパク質−タンパク質相互作用の調節に 重要であると考えられる（Pawsonら、1992，Cell 71:359-362）。 細胞質プロテインチロシンキナーゼの代謝上の役割は、受容体型プロテインチ ロシンキナーゼに比べてあまり理解されていないが、この種の分子が関与するい くつかのプロセスの説明において、かなり進展があった。例えば、ｓｒｃファミ リーのメンバーであるｌｃｋおよびｆｙｎは、ＣＤ４／ＣＤ８およびＴ細胞受容 体複合体と相互作用することが分かっており、従って、Ｔ細胞の活性化に関係が あるとされている（Veillette ら、1992，TIG 8:61-66）。ある種の細胞質プロ テインチロシンキナーゼは、ある段階の細胞サイクルに結合している（Morganら 、1989，Cell 57:775-786; Kipreosら、1990，Science 248:217-220; Weaver ら 、1991，Mol．Cell．Biol．11:4415-4422）。細胞質プロテインチロシンキナー ゼは、ニューロンの発生に関係があるとされている（Maness，P.，1992，Dev．N eurosci．14:257-270）。突然変異または過発現によるキナーゼ活性の規制解除 は、細胞形質転換の基礎をなす十分確立された機構である（Hunterら、1985，前 出; Ullrich ら、前出）。 ２．３．Ｇ−タンパク質およびシグナル形質導入 Ｒａｓ（Lowyら、1993，Ann Rev．Biochem．62:851-891参照）などのグアニン −ヌクレオチド−結合タンパク質（Ｇ−タンパク質; Simon ら、1991，Science 252:802-808; kaziroら、1991，Ann．Rev．Biochem．60:349-400）は、受容体型 チロシンキナーゼからのミトゲンシグナルの伝達において重要な役割を果たす。 一例としてＲａｓを挙げると、リガンド結合による受容体型チロシンキナーゼの 活性化により、Ｒａｓ分子の活性ＧＴＰ結合形が蓄積する（Gibbs ら、1990，J ．Biol．Chem．265:20437-2044; Satohら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:5993-5997; Li ら、1992，Science 256:1456-1459; Budayら、1993，Mol．Ce ll．Biol．13:1903-1910; Medema ら、1993，Mol．Cell．Biol．13:155-162）。 Ｒａｓ活性化は、また、ウィルス性発がんチロシンキナーゼによる形質転換に対 しても必要である（Smith ら、1986，Nature 320:540-43）。 Ｒａｓ活性は、ＧＴＰase−活性化タンパク質（ＧＡＰｓ）およびグアニンヌ クレオチド交換因子の対立する作用によって調節され、ＧＡＰｓは、Ｒａｓ上で のＧＴＰ加水分解の遅い固有速度を刺激し、交換因子は、Ｒａｓ上でのＧＴＰに 対するＧＤＰ交換の基底速度を刺激する。すなわち、ＧＡＰｓは、Ｒａｓ機能の 負のレギュレータとして作用し、交換因子はＲａｓ活性化剤として作用する。 最近、活性化された受容体型チロシンキナーゼとＲａｓとの間の直接の連結が 確立されるとともに、１個のＳＨ２ドメインと２個のＳＨ３ドメインから成る２ ６キロダルトンのタンパク質である哺乳類のＧＲＢ−２タンパク質（Lowenstein ら、1992，Cell 70:431-442）が、哺乳類およびショウジョウバエにおいて、受 容体型チロシンキナーゼをＲａｓ交換因子Ｓｏｓに直接結合させることが発見さ れた（Budayら、1993，Cell 73:611-620; Egan ら、1993，Nature 363:45-51; L iら、1993，Nature 363:85-87; Galeら、1993，Nature 363:88-92; Rozakis-Adc ockら、1993，Nature 363:83-85; Chardin ら、1993，Science 260:1338-1343; Oliver ら、Cell 73:179-191; Simonら、1993，Cell 73:169-177）。ＧＲＢ−２ ＳＨ２ドメインは、受容体チロシンキナーゼの特定のチロシンリン酸化配列に 結合し、ＧＲＢ−２ ＳＨ３ドメインは、Ｓｏｓ交換因子に存在するプロリンが 豊富な配列に結合する。従って、ＧＲＢ−２の受容体キナーゼへの結合は、Ｒａ ｓが位置する血漿膜へのＳｏｓの補充を準備する（Schlessinger，J.，1993，TI BS 18:273-275）。 ２．４．白血病の発生におけるＢＣＲ−ＡＢＬ プロテインチロシンキナーゼなどの正常な細胞タンパク質の発がん能力の活性 化は、タンパク質の対応する酵素活性の変化、上記第２．３．節で挙げたような 他の細胞成分への不適切な結合またはその両方によって生じると考えられる。 例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬプロテインチロシンキナーゼ腫瘍タンパク質は、酵素 活性の変化および／または非共有的なタンパク質−タンパク質相互作用により細 胞を形質転換すると考えられる。ＢＣＲ−ＡＢＬ腫瘍タンパク質をコードする遺 伝子は、染色体９上のｃＡＢＬプロテインチロシンキナーゼから染色体２２上の ＢＣＲ配列へ配列を移動することにより発生するキメラがん遺伝子である（Kurz ock ら、1988，N．Engl．J．Med．319:990-998 およびRosenbergら、1988，Adv ．in Virus Res．35:39-81）。ＢＣＲ−ＡＢＬがん遺伝子は、フィラデルフィフ 染色体（Ｐｈ1）陽性ヒト白血球の病因に関係があるとされている。すなわち、 Ｐｈ1染色体は、造血幹細胞の悪性形質転換から生じるクローン癌である慢性骨 髄性白血病（ＣＭＬ）患者の少なくとも９０〜９５％に見られ（Fialkow ら、19 77，Am．J．Med．63,:125-130）、また、成人の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ） 患者の約２０％、小児のＡＬＬ患者の５％および成人の急性骨髄性白血病（ＡＭ Ｌ）患者の２％に認められる（Whang-Pengら、1970，Blood 36:448-457; Look， A．T.，1985，Semin．Oncol．12:92-104）。ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子は、二つの別 のキメラタンパク質、すなわち、各々ＣＭＬおよびＡＬＬの特徴であるＰ２１０ ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＰ１８５ ＢＣＲ−ＡＢＬを産生する。さらに、最近、 ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子産物がＣＭＬの原因物質であることが直接示された（Skor ski ら、1993，J．Clin Invest．92:194-202; Snyderら、1993，Blood 82:600-6 05）。 ＣＭＬは、臨床的には、２段階的経過をとることを特徴とする。その病気は、 成熟していない骨髄前駆細胞のプールがかなり増加することを特徴とする慢性期 で始まる。最終分化が保持されるので、この結果、循環する成熟顆粒球のプール がかなり増加する。数週間〜何年かの後、骨髄増殖が加速された状態が生じ、骨 髄細胞は、次第に最終分化能を失う。この間に、血小板増加症、好塩基球増加症 およびクローン細胞遺伝異常がしばしば現れる。これらの異常は、最終の急性転 化段階のシグナルであり、その間に、未成熟芽細胞が急激に増殖し、患者の死は 避けられなくなる。 以前に、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質は、正常なｃ−ＡＢＬタンパク質と比較し て高まったチロシンキナーゼ能および形質転換能を示すことが分かった（Konopk aら、1984，Cell 37:1035-1042）。ＢＣＲの第一エキソン配列が、ＢＣＲ−ＡＢ Ｌのチロシンキナーゼ能および形質転換能を特異的に活性化する（Mullerら、19 91，Mol．Cell．Biol．11:1785-1792; McWhirterら、1991，Mol．Cell．Biol．1 1:1553-1565）。ＢＣＲの第一エキソンは、ホスホチロシンとは無関係な方法で ＡＢＬ ＳＨ２ドメインに結合することができ（Pendergastら、1991，Cell 66: 161-171）、ＡＢＬ ＳＨ２−結合に必須のＢＣＲ配列の欠失は、ＢＣＲ−ＡＢ Ｌを非形質転換にする（Pendergastら、1991，Cell 66:161-171）。さらに、Ｂ ＣＲは、in vitroで、他のタンパク質によってコードされるいくつかの他のＳＨ ２ドメインに結合することが示された（Mullerら、1992，Mol．Cell．Biol．12: 5087-5093）。これらの結果から、ＳＨ２ドメインのＢＣＲへの結合のいくつか の点が、ＢＣＲ−ＡＢＬ腫瘍タンパク質の発がん性に関与すると推論されるが、 そのようなＢＣＲ−ＡＢＬ発がんが生じる機構はまだはっきりしていない。例え ば、多数のＳＨ２ドメイン含有タンパク質の存在が知られており、ＢＣＲ−ＡＢ Ｌエフェクターの同定はさらにかなりの研究が必要である。 ３．発明の要旨 本発明は、アダプタータンパク質のＳＨ２−および／またはＳＨ３ドメイン含 有ファミリーのメンバーと複合体化し得るプロテインチロシンキナーゼまたはプ ロテインチロシンホスファターゼが関与している細胞増殖性疾患を予防および治 療するための組成物ならびに方法に関する。本発明はさらに、プロテインチロシ ンキナーゼ／アダプタータンパク質複合体、プロテインチロシンホスファターゼ ／アダプタータンパク質複合体ならびに該複合体の成分間の相互作用を破壊する ことができる作用物質を同定するための該複合体の使用に関する。 「プロテインチロシンキナーゼ」は、本明細書では「ＰＴＫ」と略称し、「プ ロテインチロシンホスファターゼ」は、本明細書では「ＰＴＰ」と略称する。理 解されるように、「ＰＴＫ」は、特に断らない限り、膜貫通の受容体型プロテイ ンチロシンキナーゼまたは細胞質プロテインチロシンキナーゼを意味し、同様に 、「ＰＴＰ」は、特に断らない限り、膜貫通の受容体型プロテインチロシンホス ファターゼまたは細胞質プロテインチロシンホスファターゼを意味する。 本発明は、一部には、アダプタータンパク質ＧＲＢ−２が in vivoで細胞内の ＢＣＲ−ＡＢＬ ＰＴＫ産物と結合し、かつＢＣＲ−ＡＢＬ産物の潜在的な発が ん能力の活性化にとって必要である、という驚くべき発見に基づいている。本発 明者らは、第一に、シグナル形質導入経路のメンバー間の相互作用の生理的関連 性を、一部には、このシグナル形質導入の破壊により、細胞の形質転換された表 現型が逆転し、動物におけるがんの増殖が抑制されることを示すことにより説明 する。この発見を表すデータは、以下の第６〜１４節の実施例に示す。従って、 本発明は、最初の例で、タンパク質のＳＨ２−および／またはＳＨ３ドメイン含 有アダプターファミリー、特にタンパク質のＧＲＢサブファミリーのＧＲＢ−２ メンバーが細胞増殖／活性化の発生および維持に関係あることを表し、本明細書 では、発がん、形質転換プロセスおよびヒトのがんの発生に関与する異常な細胞 増殖に対して説明する。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換に関して、本発明は、 ＢＣＲ−ＡＢＬ産物に対する第一エフェクター（すなわち、ＧＲＢ−２）を開示 する。 ３．１．略号 下記表に、タンパク質化学者の間で一般に使用され、本明細書で使用する一文 字および三文字の略号を示す。 ４．図の記載 図１：ＢＣＲ−ＡＢＬ〜Ｒａｓによる転写活性の刺激は、ＢＣＲの第一エキソ ンにチロシン１７７が存在することが必要である。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、１μ ｇのｐＢ４Ｘ−ＣＡＴリポータープラスミドとともに、０．５μｇの指示したＢ ＣＲ−ＡＢＬ ｃＤＮＡ ＋／− ５μgのＨ−Ｒａｓ（１７Ｎ）ｃＤＮＡをト ランスフェクションさせた。４８時間トランスフェクションを行った後、細胞を 採取し、下記の第９．１．１．節で概説するようにＣＡＴ活性のアッセイを行っ た。データを任意の単位で記録した。基底シグナルは、リポーターの活性による 。 図２：ＢＣＲ−ＡＢＬ〜Ｒａｓによる転写活性の刺激は、ＧＲＢ２ ＳＨ３ド メインの存在を必要とする。ｐ２１０ ＢＣＲ／ＡＢＬ細胞を発現するＲａｔ１ 細胞に、１μｇのｐＢ４Ｘ−ＣＡＴリポータープラスミドとともに、ＧＲＢ２欠 失変異株のいずれかをトランスフェクションさせた。４８時間トランスフェクシ ョンを行った後、細胞を採取し、下記の第９．１．１．節で概説するようにＣＡ Ｔ活性のアッセイを行った。レーン１：ＲＡＴ１；レーン２：ＲＡＴ１／ｐ２１ ０／ｐＣＥＮベクター；レーン３：ＲＡＴ１／ｐ２１０／ｐＣＥＮ ＧＲＢ２ ΔＮ’；レーン４：ＲＡＴ１／ｐ２１０／ｐＣＥＮ ＧＲＢ２ ΔＣ’。データ は、ＲＡＴ１を１に規格化して、任意の単位で記録した。基底シグナルは、リポ ーターの活性による。値は、重複＋／−範囲の平均である。 図３：野生型および変異体ＧＲＢ２タンパク質を発現するＫ５６２中のヘモグ ロビン含量。細胞溶解産物を調製し、記載されたベンジジン染色を使用してヘモ グロビン含量を測定した（Feinstein ら、1992，Oncogene 7:1853-1857）。３個 のサンプルの各細胞集団を分析した。データは、指示した構成体でトランスフェ クションした全細胞タンパク質１μｇに対するヘモグロビンの量を表す。 ５．発明の詳細な説明 以下に、タンパク質のアダプターファミリーのＳＨ２−および／またはＳＨ３ ドメイン含有メンバーと複合体化し得るプロテインチロシンキナーゼまたはプロ テインチロシンホスファターゼが関与している細胞増殖性疾患を予防および治療 するための組成物ならびに方法を記載する。さらに、プロテインチロシンキナー ゼ／アダプタータンパク質複合体、プロテインチロシンホスファターゼ／アダプ タータンパク質複合体、このような複合体の製造法およびこれらの複合体の使用 をここに記載する。そのような使用としては、それらに限定されないが、該複合 体の成分間の相互作用を破壊することができる作用物質の同定が挙げられる。 本発明は、一部には、アダプタータンパク質ＧＲＢ−２が in vivoで細胞内の ＢＣＲ−ＡＢＬ産物と結合し、かつＢＣＲ−ＡＢＬ産物の潜在的な発がん能力の 活性化にとって必要であること、およびＧＲＢ−２シグナル形質導入の破壊が細 胞の形質転換された表現型を逆にし、動物での腫瘍増殖を減少させる、という驚 くべき発見に基づいている。この発見を表すデータは、下記の第６〜１４節の実 施例に示す。 ５．１．プロテインチロシンキナーゼ／アダプタータンパク質複合体 本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体は、後述するように、タンパク 質のＰＴＫファミリーの少なくとも１つのメンバーおよびタンパク質のアダプタ ーファミリーの少なくとも１つのメンバーを含む。標準的な生理的条件下では、 該複合体の成分は、他のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体成分の１個以上と ともに、安定して非共有的な結合を形成することができる。 本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体のＰＴＫ成分は、細胞内細胞質 非受容体型ＰＴＫｓ、細胞内核非受容体型ＰＴＫｓまたは膜貫通受容体型ＰＴＫ のいずれかであり、それらは各々、１個以上の特徴的なペプチドドメインを含む 。そのようなドメインは１個以上の触媒ドメインを含むことができ、それらに限 定されないが、チロシンキナーゼドメインが挙げられる。チロシンキナーゼ触媒 ドメインの長さは、一般に、約２５０〜約３００アミノ酸の範囲であり、これは 約３０ｋＤａの分子量に相当する。チロシンキナーゼ触媒ドメインの位置は、固 定されてはいないが、一般に、タンパク質のカルボキシ末端付近である。チロシ ンキナーゼドメイン内に、短く、保存されたアミノ酸残基の範囲が存在してもよ い。それは、高レベルの保存性を示さない、長さが可変のアミノ酸残基の範囲と 順次交互に現れる。最も高度に保存されたチロシンキナーゼ触媒ドメインアミノ 酸残基に対応するコンセンサス配列が収集されており、当業者には周知である。 例えば、Hanks ら、（Hanks ら、1991，Science 241:42-52）およびWilks（Wilk s，A.F.，1990，Prog．Growth Factor Res．2:97-111）参照（それらの全体を参 考 文献として本明細書に含める。）。該コンセンサス配列は、ＰＴＫに特異的な配 列である D-L-R-A-A-Nまたは D-L-A-A-R-N、および P-I/V-K/R-W-T/M-A-P-Eであ る。さらに、該配列モチーフの別の例として、Wilks，A.F.，1990，Progress in Growth Factor Res．2:97-111参照。 本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体のＰＴＫ成分は、さらに、１個 以上の非触媒ドメインを含むことができ、例えば、それらに限定されないが、１ 個以上のＳＨ２および／または１個以上のＳＨ３ドメイン、１個以上のＳＨ２結 合および／または１個以上のＳＨ３結合ペプチドドメイン、および／または（受 容体型ＰＴＫの場合）疏水性膜貫通ドメインが挙げられる。ＳＨ２（すなわち、 ｓｒｃホモロジー２）非触媒ドメインは、一般に、長さが約１００アミノ酸残基 である。そのようなＳＨ２ドメインは、いくつかの、好ましくは５個の十分保存 されたアミノ酸配列モチーフ内に、高度に保存された、または不変の多数のアミ ノ酸残基を含むことができ、それらは、当業者には周知である。例えば、Kochら 、（kochら、1991，Science 252:668-674）（その全体を参考文献として本明細 書に含める。）参照。例えば、アミノ酸コンセンサス配列としては、それらに限 定されないが、F-L-I-R-E-S および F-L-V-R-E-Sが挙げられる。これらのコンセ ンサス配列のＲ残基は、ＳＨ２ドメイン間で不変である。そのような十分保存さ れたアミノ酸配列モチーフは、可変であるけれども、一般には１個以上のＧまた はＰ残基を含む、より可変のアミノ酸配列要素の範囲によって分離される。 ＳＨ３（すなわち、ｓｒｃホモロジー３）非触媒ドメインは、一般に、長さが 約５０アミノ酸残基である。ＳＨ３ドメイン内のアミノ酸配列は可変であっても よいが、そのドメインの三次元構造は十分保存される。そのようなＳＨ３三次元 構造は、当業者には周知である。例えば、Koyamaら、（Koyamaら、1993，Cell 7 2:945-952）（その全体を参考文献として本明細書に含める。）参照。 ＳＨ２−結合ペプチドドメインは周知である。例えば、Songyangら、（Songya ngら、1993，Cell 72:767-778）、Rotin ら、（Rotin ら、EMBO J．11:559-567 ）および Skolnick ら、（Skolnickら、1993，EMBO J．12:1929-1936）（これら は、その全体を参考文献として本明細書に含める。）参照。ＳＨ２ドメインは、 あるＳＨ２−結合ドメインに対して特異性を示す。例えば、ＳＨ２−結合ペプチ ドド メインとしては、それらに限定されないが、ホスホ Tyr−疏水性−疏水性−Ile/ Proアミノ酸配列モチーフ（一般に、該配列モチーフは、例えばｓｒｃ、ｆｙｎ 、ｌｃｋ、ｆｇｒ、ａｂｌ、ｃｒｋおよびｎｃｋタンパク質に見られる型のＳＨ ２ドメインに対して好ましい。）、およびホスホ Tyr−疏水性−X-疏水性および ／または−ホスホ Tyr−Met −Ｘ−Met（一般に、該配列モチーフは、例えばｐ ８５、ホスホリパーゼＣ−γおよびＳＨＰＴＰ２タンパク質に見られる型のＳＨ ２ドメインに対して好ましい。）が挙げられる。さらに、ＧＲＢ−２タンパク質 のＳＨ２ドメインを結合するいくつかのタンパク質のドメインの分析から明らか にされたコンセンサス配列は、X-P-X-Y-V/I-N-V/I であると決定された。さらに 、ＳＨ２−結合ペプチドドメインは、Ser およびThr 残基（それらのいくつかま たは全部はリン酸化されている）に富む領域を含むことができる（Pendergastら 、1991，Cell 66:161-171）。 ＳＨ３-結合ペプチドドメインもまた当業者に周知である。例えば、Renら（Re nら，1993，Science 259:1157-1161）および Cicchettiら(Cicchettiら，1992， Science 257:803-806)を参照されたい。これらは、参照としてその全体をここに 組み入れてある。そのようなＳＨ３-結合ペプチドドメインは、プロリン以外の 他のアミノ酸残基もまたＳＨ３結合にとって重要ではあるが、一般にアミノ酸残 基プロリンに富んでいる。ＳＨ３-結合ドメインの考えうる１つの共通配列は、X -P-X-X-P-P-P-疎水性残基-X-Pである。さらに、ＧＲＢ−２のＳＨ３ドメインは 、ＳＯＳタンパク質に見いだされるアミノ酸配列モチーフである P-P-P-V-P-P-R -Rであることが確定している(Liら，1993，Nature 363:8588; Schlessinger，19 93，TIBS，18:273-275)。 本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体の細胞内の細胞質ＰＴＫ成分は 、例えば、Ｓｒｃファミリーのメンバー（src，yes，fgr，fyn，lyn，hck，lck およびblk等の分子）；Ｆｅｓファミリーのメンバー（fes およびfer 等）；Ａ ｂｌファミリーのメンバー（abl およびarg 等）；およびＪａｋファミリーのメ ンバー（jak1およびjak2等）を含みうる。本発明の好ましい態様において、ＰＴ Ｋ／アダプタータンパク質複合体のＰＴＫ成分は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の細胞 内ＰＴＫ産物である。本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体の膜貫通の 受容体ＰＴＫ成分は、例えば、増殖因子受容体のＦＧＦ受容体、セブンレス(Sev enless)／ＲＯＳ、インスリン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体ファミリ ーのメンバー等の分子、またはｈｅアダプタータンパク質に関連する他の任意の 分子を含みうる（例えば、Lowensteinら，1992，Cell 70:431-442 参照）。 本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体のアダプタータンパク質成分は 、１つ以上のＳＨ２および／または１つ以上のＳＨ３非触媒ドメインを含む。ア ダプタータンパク質の一部でありうるＳＨ２およびＳＨ３ドメインは、上記のよ うに、ＰＴＫ成分のためのものである。本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質 複合体の成分でありうるアダプタータンパク質は、例えば、ｐ８５、ｃ−Ｃｒｋ 、ＳＨＣ、Ｎｃｋ、ＩＳＧＦ３α、グアニントリホスファターゼ活性化タンパク 質（ＧＡＰ）、およびタンパク質のＧＲＢサブファミリーのメンバー（ＧＲＢ１ 、ＧＲＢ−２、ＧＲＢ−３、ＧＲＢ−４、ＧＲＢ−７およびＧＲＢ−１０等）を 含 みうる。好ましい態様において、本発明のＰＴＫ／アダプタータンパク質複合体 はＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のＰＴＫ産物およびＧＲＢ−２タンパク質を含む。 本発明の複合体および／または該複合体の個々の成分は、後述の第5.3.1.節に 記載の方法を用いて実質的に精製することができる。さらに、本発明の複合体の ＰＴＫおよび／またはアダプター成分は、化学的合成または後述の第5.3.2.節に 記載の組換えＤＮＡ技法を含むが、これらに限定されない種々の方法を用いて作 成することができる。 ５．２．プロテインチロシンホスファターゼ／アダプタータンパク質複合体 本発明のＰＴＰ／アダプタータンパク質複合体は、タンパク質のＰＴＰファミ リーの少なくとも１つのメンバーおよびタンパク質のアダプターファミリーの少 なくとも１つのメンバーを含む。標準的な生理的条件のもとで、このような複合 体の諸成分は一以上の他のＰＴＰ／アダプタータンパク質複合体成分との安定し た、非共有結合を形成することが可能である。 本発明のＰＴＰ／アダプタータンパク質複合体のＰＴＰ成分は、細胞質、細胞 内、非受容体ＰＴＰ、または膜貫通、受容体型ＰＴＰであって、これらはそれぞ れ１つ以上の特徴的なペプチドドメインを含む。そのようなドメインは、チロシ ンホスファターゼドメインを含むが、これらだけに限定されない１つ以上の触媒 ドメインを含みうる。一般に、チロシンホスファターゼ触媒ドメインは長さが約 230アミノ酸である。触媒ホスファターゼドメインのアミノ酸残基の約40は高度 に保存されており、そしてこれらのうちには、共通配列 I/V-H-C-X-A-G-X-X-R-S /T-Gを有する11アミノ酸残基からなる非常に高度に保存されている分節が一般に 存在する。非受容体ＰＴＰは一般にそのような触媒ドメインを１個含有し、他方 、膜貫通受容体ＰＴＰは長さ約58アミノ酸残基のペプチド分節によって分けられ ているそのような触媒ドメイン２個を一般に含有している。 本発明のＰＴＰ／アダプタータンパク質複合体のＰＴＰ成分は、さらに、１つ 以上のＳＨ２ドメイン、１つ以上のＳＨ３ドメイン、１つ以上のＳＨ２-結合ド メイン、および／または１つ以上のＳＨ３-結合ドメインを含むがこれらだけに 限定されない、１つ以上の非触媒ドメインを含みうる。これら非触媒ドメインの それぞれは、第5.2.節に記載のものでありうる。 本発明のＰＴＰ／アダプタータンパク質複合体の膜貫通の受容体ＰＴＰ成分は 、例えば、CD45、LAR、RPTPα、RPTPβ、RPTPχおよびRPTPκを含みうる。本発 明のＰＴＰ／アダプタータンパク質複合体の細胞内の細胞質ＰＴＰ成分は、例え ばPTP1C、PTP1Dおよびコルクスクリュー(corkscrew)を含みうる。 ５．３．ＰＴＫ／アダプター複合体およびＰＴＰ／アダプター複合体の精製なら びに作製 ５．３．１．精製法 本発明のＰＴＫ／アダプター複合体およびＰＴＰ／アダプター複合体を実質的 に精製する、すなわち、それが関連する他のタンパク質、糖タンパク質、および 他の巨大分子から少なくとも90%（重量に基づいて）、そして所望であれば少な くとも99%精製することができる。そのような精製は、当業者に周知の種々の手 順を用いて達成することが可能である。例えば、ＰＴＫ／アダプター複合体また はＰＴＰ／アダプター複合体を含有する細胞、組織または流体を標準的方法の組 合せ（例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、分子ふるいクロマトグラフィー、およ び／またはイオン交換クロマトグラフィー）に付す、等である。別な方法として 、もしくはそれらに加えて、ＰＴＫ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプタ ー複合体の１つ以上の成分と結合可能な抗体を固定化した免疫吸着カラムを使用 したイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、ＰＴＫ／アダプター複 合体またはＰＴＰ／アダプター複合体を精製することができる。そのような抗体 は、起源がモノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよい。ＰＴＫ ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプター複合体のための他の有用な種類の アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、触媒ドメイン（すなわち、ＰＴ ＫのキナーゼドメインまたはＰＴＰのホスファターゼドメイン）に結合する固相 基質、または複合体を分断しないような様式で結合する複合体のＰＴＫ，ＰＴＰ および／またはアダプター成分の非触媒ドメインの固定化結合部位を利用しうる 。 本発明のＰＴＫ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプター複合体は、種々 の細胞または組織の供給源より生化学的に精製することができる。天然に存在す るＰＴＫ／アダプター複合体を精製するためには、細胞の供給源は、例えばバキ ュロウイルス感染ＳＦ９細胞、Ａ−４３１、ＣＨＯおよび／または３Ｔ３細胞を 含みうる。本発明の好ましい態様において、ＰＴＫ／アダプター複合体はＢＣＲ −ＡＢＬ ＰＴＫおよびＧＲＢ２タンパク質を含む。このようなＰＴＫ／ＧＲＢ −２複合体の精製のための供給源は、Ｋ５６２、ＮＭＧ−０１およびＡＬＬ−１ 細胞系を含みうるが、これらに限定されない。 ５．３．２．合成法 本発明のＰＴＫ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプター複合体の成分と して作用しうるポリペプチドまたはその断片の合成法は、当業者に周知である。 例えば、参照としてここに全体を組み入れるCreighton，1983，Proteins: Struc tures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，NYを参照されたい。 別々に合成された、または組換えによって作製されたＰＴＫ／アダプター複合体 またはＰＴＰ／アダプター複合体の成分を、当業者に周知の標準的生化学技法に より再構成して、複合体を形成することができる。例えば、ＰＴＫ／アダプター 複合体の諸成分を含有する複数のサンプルを、約150 mM以上のNaClを用いて緩衝 化した溶液中で、7の範囲内の生理的pHで、室温で組み合わせることができる。 例えば、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、137 mM NaCl、10% グリセリン、1% Triton X -100、0.1% SDS、0.5% デオキシコール酸および2 mM EDTA を含む緩衝液が使用 可能であろう。このような手順は、ＰＴＰ／アダプター複合体の再構成にも使用 できる。 ＰＴＫ、ＰＴＰおよび／またはアダプタータンパク質をコードする核酸を発現 させることによる、本発明のＰＴＫ／アダプター複合体の成分の調製方法は本明 細書に記述されている。当業者に周知の方法を用いて、ＰＴＫ、ＰＴＰおよび／ またはアダプタータンパク質のコード配列および適切な転写／翻訳制御シグナル を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組換えＰＮＡ技法、合成技法およびin vivo 組換え／遺伝子組換えを含む 。ＤＮＡおよびＲＮＡの合成は、さらに自動合成機を用いて行なうこともできる 。 例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold S pring Harbor Laboratory，N.Y.およびAusubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing AssociatesおよびWiley Interscience N.Y．に記載の技法を参照されたい。 本発明のＰＴＫ／アダプター、ＰＴＰ／アダプター複合体の成分のコード配列 を発現させるため、種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。これらの系は以 下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、ＰＴＫ、ＰＴＰまたは アダプタータンパク質のコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ 、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された 細菌（例、大腸菌、枯草菌）等の微生物；ＰＴＫ、ＰＴＰおよび／またはアダプ タータンパク質のコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転 換された酵母〔例、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピヒア(Pichia)］；ＰＴ Ｋ、ＰＴＰおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列を含有する組換え ウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ＰＴ Ｋ、ＰＴＰおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列を含有する組換え ウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコ モザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、または、組換えプラスミド発現ベク ター（例、Ｔｉプラスミド）によって形質転換させた植物細胞系；または、哺乳 動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例、メタロチオネインプロモーター）ま たは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例、アデノウイルス後期プロモータ ー；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有す る哺乳動物細胞系である。 細菌系においては、ＰＴＫ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプター複合 体発現の意図された使用によって、多数の発現ベクターが有利に選択できる。例 えば、抗体作製のため、またはペプチドライブラリーのスクリーニングのため、 大量のＰＴＫ／アダプターまたはＰＴＰ／アダプター複合体を生産する場合は、 容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルな発現を引き出すベクターが望 ましい。そのようなベクターには以下のものが含まれるが、それらだけに限定さ れない。すなわち、融合タンパク質が産生されるように、ＰＴＫ、ＰＴＰおよび ／またはアダプタータンパク質のコード配列が lac Zコード領域の枠に合わせて 個々にベクターに連結されうる大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら，1983，EMB O J．2:1791); pIN ベクター(Inouyeら，1985，Nucleic Acids Res．13:3101-31 09; Van Heekeら，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509)等である。pGEXベクタ ーもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融 合タンパク質として発現させるために使用できる。一般に、このような融合タン パク質は可溶性で、グルタチオン-アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグ ルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解した細胞から容易に精製でき る。pGEXベクターは、クローン化ＰＴＫおよび／またはアダプタータンパク質が ＧＳＴ部分から解放されうるように、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ開裂 部位を含むように設計されている。 昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californic a)核多角体病ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用さ れる。このウイルスは、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda) 細胞中で増殖する。ＰＴＫ／アダプターまたはＰＴＰ／アダプター複合体の成分 のコード配列を、このウイルスの非必須領域〔例えば、ポリヒドリン(polyhedri n)遺伝子〕に個別にクローン化し、そしてAcNPV プロモーター（例えば、ポリヒ ドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。コード配列の上首尾な挿入 は、ポリヒドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖組換えウイルス（すなわち、ポ リヒドリン遺伝子によってコードされるタンパク質外被を欠くウイルス）の産生 をもたらす。次に、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子が発現されて いるスポドプテラ・フルジペルダ細胞を感染させる（例えば、Smithら，1983，J ．Viol．46:584; Smith，米国特許第4,215,051号参照）。 哺乳動物宿主細胞においては、ウイルスに基づく多数の発現系が使用できる。 アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、ＰＴＫ／アダプターまた はＰＴＰ／アダプター複合体の成分のコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳 調節複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分リーダー配列、に連結するこ とができる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによりア デノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例 えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、生存可能で、かつ感染宿主中でＰＴＫ 、 ＰＴＰおよび／またはアダプタータンパク質を発現可能な組換えウイルスをもた らす（例えば、Loganら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．81:3655-3659 参照）。挿入されたＰＴＫ、ＰＴＰおよび／またはアダプターコード配列の効率 的な翻訳のためには、特異的開始シグナルもまた必要とされる。これらのシグナ ルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。自身の開始コドンおよび隣接配列 を含む完全なＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータンパク質遺伝子が適切な発現ベ クターに挿入される場合は、付加的翻訳制御シグナルは何ら必要ではない。しか し、ＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプターコード配列の一部分のみが挿入される場合 は、ATG 開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを備えていなければならな い。さらに、全挿入配列の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード 配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル および開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものでありうる。適切な転 写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等を含めることにより、発現の効率 を増大させることができる（Bittnerら，1987，Methods in Enzymol．153:516-5 44 参照）。 さらに、所望の特定の様式で挿入配列の発現をモジュレートする、または遺伝 子産物を修飾およびプロセスする、宿主細胞株を選択することができる。遺伝子 産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば開裂 ）は、タンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク 質の転写後プロセシングおよび修飾のための特徴的で、かつ特異的な作用機構を 有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にす るために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のため 、適切な一次転写産物のプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン 酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用できる。そのような哺乳動物 宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３ 、３Ｔ３ ＷＩ３８、等を含むが、これらだけに限定されない。組換えタンパク 質の長期間の高収量生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、ＰＴＫ およびアダプタータンパク質、またはＰＴＰおよびアダプタータンパク質の両方 を安定的に同時発現する細胞系を遺伝子工学的に作出することができる。ウイ ルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御 要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリア デニル化部位、等）によってそれぞれ独立して、または整合的に制御されている 、ＰＴＫおよびアダプタータンパク質ＤＮＡ、またはＰＴＰおよびアダプタータ ンパク質ＤＮＡならびに選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することがで きる。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子工学的に作出した細胞を富化培地で１〜２日 間増殖させることができる。そして次にこれらの細胞を選択培地に移す。組換え プラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そして細胞が安定 的にプラスミドを染色体中に組み入れ、増殖してフォーカスを形成するのを可能 とする。次に、これらのフォーカスをクローン化し、細胞系に発展させることが 可能である。この方法は、ＰＴＫおよびアダプタータンパク質、またはＰＴＰお よびアダプタータンパク質の両方を同時発現する細胞系を遺伝子工学的に作出す るのに有利に使用できる。このような遺伝子工学的に作出された細胞系は、本発 明の複合体によって媒介されるシグナルに影響を与える化合物のスクリーニング および評価に特に有用である。 以下のものを含むが、それらだけに限定されない多数の選択系が使用できる。 すなわち、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら，1977，Cell 11:2 23)、ヒポキサンチン-グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（Szybalsk aら，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．48:2026)およびアデニンホスフォ リボシルトランスフェラーゼ(Lowyら，1980，Cell 22:817)遺伝子が、それぞれt k-、hgprt-、またはaprt-細胞に使用できる。また、代謝拮抗物質耐性も、メト トレキセートへの耐性を付与するdhfr遺伝子(Wiglerら，1980，Natl．Acad．Sci ．USA 77:3567; O'Hareら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:1527);ミ コフェノール酸(mycophenolic acid)への耐性を付与するgpt遺伝子(Mulliganら ，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:2072); アミノグリコシドG-418 へ の耐性を付与するneo遺伝子(Colberre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol．150:1) ; およびハイグロマイシンへの耐性を付与するhygro遺伝子(Santerreら，1984， Gene 30:147)の選択の基礎として使用できる。 本発明の複合体を形成することのできる、ＰＴＫ、ＰＴＰおよび／またはアダ プタータンパク質ファミリーの新規なメンバーは、当技術分野で周知の分子生物 学的技法によって同定および単離することが可能である。例えば、ＰＴＫ、ＰＴ Ｐまたはアダプタータンパク質ファミリーのメンバーに共通なドメイン内にある 高度に保存された配列に基づいて設計した２つの縮重したオリゴヌクレオチドプ ライマープールを用いてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を実施す ることにより、以前には知られていなかったＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータ ンパク質の遺伝子を単離することができる。ＰＣＲ反応の鋳型は、ＰＴＫ／アダ プター複合体および／またはＰＴＰ／アダプター複合体を発現することが知られ ている細胞系または組織より調製したｍＲＮＡの逆転写によって得たｃＤＮＡで あってよい。増幅された配列がＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプターサブファミリー のメンバーの配列を表していることを確実にするため、ＰＣＲ産物をサブクロー ン化し、配列決定することができる。次に、ＰＣＲ断片を使用して、増幅された 断片を放射標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング することにより、全長ＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータンパク質ｃＤＮＡクロ ーンを単離することができる。または、標識化断片を用いてゲノムライブラリー をスクリーニングすることができる。使用できるクローニング戦略の総論につい ては、例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual， Cold Springs Harbor Press，N.Y.;およびAusubelら、1989，Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing Associates およびWiley Interscie nce，N.Y.）を参照されたい。 それまで未知であったアダプタータンパク質をクローン化する一般的な方法は 、Skolnick（Skolnick，E.Y.，1991，Cell 65:75）およびSkolnickら（米国特許 出願第07/643,237号）によって記述されている。これらは、参照として全体をこ こに組み入れてある。簡単に述べると、タンパク質のアダプターファミリーの新 しいメンバーは、アダプター-タンパク質-結合領域を含むチロシンリン酸化ペプ チドの少なくとも一部分に特異的に結合する能力によって同定することができる 。そのような領域は、ＳＨ２-結合ドメインを含みうるが、これだけに限定され ない。 ５．４．ＰＴＫ／アダプター複合体およびＰＴＰ／アダプター複合体の誘導体 本明細書にはまた、ＰＴＫ／アダプター複合体およびＰＴＰ／アダプター複合 体の機能性誘導体が提供される。「機能性誘導体」という用語は、ＰＴＫ／アダ プター複合体およびＰＴＰ／アダプター複合体の「化学的誘導体」、「断片」、 「変異体」、「キメラ」または「ハイブリッド」を意味する。これらの用語は以 下に定義される。機能性誘導体は、その誘導体に本発明による有用性を与える、 ＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータンパク質の機能の少なくとも一部を保持する 。この機能とは、例えば、ＰＴＫ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプター 複合体に特異的な抗体との反応性、非触媒ドメインによって媒介されるＰＴＫま たはＰＴＰの酵素活性または結合活性、等である。 ＰＴＫ／アダプター複合体またはＰＴＰ／アダプター複合体の「化学的誘導体 」は、通常は該タンパク質の一部ではない付加的化学部分を含有する。上記タン パク質複合体またはペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれる。ペプ チドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と下記のように反応 することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、そのような修飾を分 子に導入することができる。 最も一般的には、システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミド等 のα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチル またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせる。システイニル残基はまた、 ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β（5-イミダゾイル）プロピオン酸、 クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジ スルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、 2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキ サ-1,3-ジアゾールとの反応により誘導体化される。 ヒスチジル残基は、pH 5.5〜7.0でジエチルプロカーボネートとの反応により 誘導体化される。なぜなら、この作用物質はヒスチジル側鎖に比較的特異的だか らである。パラ-ブロモフェナシルブロマイド(para-bromophenacyl bromide)も また有用である。その反応は、好ましくは0.1 M カコジル酸ナトリウム中で、pH 6.0で実施される。 リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反 応させる。これらの作用物質を用いた誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆にす る効果を有する。α-アミノ-含有残基を誘導体化するのに適する他の試薬は、メ チルピコリニミデート等のイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリ ドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；0-メチルイ ソ尿素；2,4-ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼによって触媒されるグ リオキシル酸との反応を含む。 アルギニル残基は、１種、または数種の通常の試薬との反応によって修飾され る。それらの試薬には、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シク ロヘキサンジオンおよびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化は 、グアニジン官能基の高いｐＫaのため、反応をアルカリ性状態で実施すること が必要である。さらに、これらの試薬はアルギニンのε-アミノ基はもとよりリ シンの基とも反応しうる。 チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反 応によりスペクトル標識を導入するための修飾の、周知の標的である。最も一般 的には、N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、0-アセチ ルチロシル種および3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。 カルボキシル側の基（アスパルチルまたはグルタミル）は、1-シクロヘキシル -3-(2-モルホリニル(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4 ,4-ジメチルペンチル)カルボジイミド等のカルボジイミド(R'-N-C-N-R')との反 応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、 アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変 換される。 グルタミニルおよびアスパラギニル残基は頻繁に脱アミド化されて、対応する グルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は弱酸性条 件下で脱アミド化される。こ、れらの残基のどちらの形態も、本発明の範囲内に 入る。 二官能作用物質を用いた誘導体化は、例えば、ＰＴＫ／アダプターまたはＰＴ Ｐ／アダプター複合体の成分ペプチドを相互に架橋させるのに、またはＰＴＫ／ アダプター受容体複合体を水に不溶性の支持マトリックスあるいは他の巨大分子 キャリアーに架橋させるのに有用である。一般に用いられる架橋剤は、例えば、 1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、3,3'-ジチ オビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを 含むN-ヒドロキシスクシンアミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸を有す るエステル、ホモ二官能イミドエステル、ならびにビス-N-マレイミド-1、8-オ クタン等の二官能マレイミドを含む。メチル-3-(p-アジドフェニル)ジチオール プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができ る光活性化可能な中間体をもたらす。または、臭化シアン活性化炭水化物等の反 応性で水に不溶性なマトリックス、および米国特許第3,969,287号;3,691,016号; 4,195,128号；4,247,642号;4,229,537号;および4,330,440号に記載の反応性基質 がタンパク質固定化のために使用される。 上記以外の修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはト レオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖 のα-アミノ基のメチル化(Creighton，T.E.，Proteins: Structure and Molecul ar Properties，W.H．Freeman & Co.，San Francisco，pp．79-86(1983))、N-末 端アミンのアセチル化、および、ある場合にはC-末端カルボキシル基のアミド化 を含む。 そのように誘導体化された部分は、安定性、溶解性、吸収、生物的半減期、等 を改善することができる。または、これらの部分はタンパク質複合体等の望まし くない副作用を除去または軽減することができる。そのような効果を媒介可能な 部分は、例えば、Remington著のPharmaceutical Sciences，1990，18版，Mack P ublishing Co.，Easton，PAに開示されている。 「断片」という用語は、ＰＴＫ／アダプターまたはＰＴＰ／アダプター複合体 のＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータンパク質のアミノ酸配列から得られるポリ ペプチドであって、それが由来する全長ポリペプチドよりも長さの短いポリペプ チドを示すのに使われている。そのような断片は、例えば、全長タンパク質のタ ンパク質加水分解開裂によって作成することができる。好ましくは、この断片は ＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータンパク質をコードするＤＮＡ配列を適切に修 飾して１個以上のアミノ酸をC-末端、N-末端、および／または天然の配列内で１ つ以上の部位において欠失させることにより、組換えによって得られる。天然に 存在するＰＴＫ／アダプターまたはＰＴＰ／アダプター複合体に似た複合体中に 存在する場合、ＰＴＫ、ＰＴＰまたはアダプタータンパク質の断片は、下記のよ うにシグナル伝達をモジュレートするように作用する化合物をスクリーニングす るのに有用である。そのような断片は、複合体中に存在する場合、天然のＰＴＫ ／アダプターまたはＰＴＰ／アダプター複合体の特徴的部分を１つ以上保持する ことができると理解される。このように保持される特徴の例は、触媒活性；基質 特異性；完全な細胞内におけるたの分子との相互作用；調節機能；または天然の ＰＴＫ／アダプターまたはＰＴＰ／アダプター複合体に特異的な抗体、またはそ の抗原決定基との結合を含む。 本発明の範囲内に含まれる別の機能性誘導体は、天然のポリペプチドに関して １またはそれ以上のアミノ酸が欠けているか、付加されているか、または置換さ れている、少なくとも１つの「変異型」ポリペプチド（例えば、PTK、PTP、また はアダプター）を含むPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体である。変 異型は、Ｃ末端、Ｎ末端、および／または天然の配列の内部の１以上の部位で、 １以上のアミノ酸のコドンを付加、除去、および／または修飾するために、PTK 、PTP、および／またはアダプタータンパク質ＤＮＡコード配列を適当に修飾す ることによって、天然に存在しているPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複 合体成分に由来するものであってもよい。付加されたアミノ酸、置換されたアミ ノ酸および／または追加のアミノ酸を有するこのような変異型は、上記の天然の PTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体の１以上の特徴をあらわしている 部分を保持していると理解される。 アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有するPTK、PTP、および／ またはアダプタータンパク質を含むPTK／アダプターまたはPTP／アダプターの複 合体の機能性誘導体は、当業者に公知の標準的な技術を用いて調製することがで きる。例えば、機能性誘導体の修飾された成分は、部位特異的突然変異技術を用 いて産生してもよく（Adelman et al.，1983，DNA 2:183で例示されているよう に）、ＤＮＡコーディング配列中のヌクレオチドは修飾されたコーディング配列 が修飾されるように修飾され、その後この組換えＤＮＡを、上述のような技術を 用いて、宿主である原核細胞または真核細胞中で発現させる。代替と、して、欠 失、挿入および／または置換を有するPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複 合体の機能性誘導体の成分は、当業者に公知の方法を用いて、直接的に化学合成 することによって、簡便に調製してもよい。PTK／アダプターまたはPTP／アダプ ター複合体の機能性誘導体は、典型的には、天然の複合体と同質の生物学的活性 を示す。 5.5 PTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体に対する抗体 本発明は、さらに、PTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体またはそれ らのエピトープを特異的に認識する抗体、またはPTK、PTP、またはアダプター成 分がPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体と離れて個別に存在している ときは抗体によって認識されないはずである複合体のPTK、PTP、またはアダプタ ー成分のいずれかのエピトープを特異的に認識する抗体に関する。このような抗 体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、ヒト化またはキメラ 抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、FAb発現ライブラリーで産生される 断片、抗イディオタイプ(抗-Id)抗体、および上記いずれかのエピトープ結合性 断片を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、生体試料中 のPTK／アダプター複合体の検出に使用してもよく、または、代替として、PTK／ アダプター複合体形成の阻害のための方法として使用してもよく、こうして細胞 増殖障害の進行を阻害する。 ポリクローナル抗体は、PTK／アダプター複合体、またはそれらの抗原性のあ る機能性誘導体などの抗原で免疫された動物の血清に由来する抗体分子の均一で ない集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、種々の宿主動物がPTK／ アダプターまたはPTP／アダプター複合体の注射によって免疫され、これらの動 物は、ウサギ、マウス、ラット等が含まれるが、これらに限定されるものではな い。宿主の種に応じて、免疫応答を増強するために、種々のアジュバントが使用 され、フロイントのアジュバント（完全、不完全）、リゾレシチンなどの鉱物ゲ ル、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、 キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（baci lle Calmette-Guerin）などの潜在的に有用なヒトアジュバントおよびコリネバ クテリウムパルバム（Corynebacterium parvum）等を含むが、これらに限定され るものではない。 モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であり 、細胞株の連続的培養によって抗体分子を産生するいかなる方法によっても得る ことができる。これらは、Kohlerらのハイブリドーマ技術(Kohler et al.，Natu re 256:495-497(1975)および米国特許番号4,376,110)、ヒトＢ細胞ハイブリドー マ技術（Kosber et al.，1983，Immunology Today 4:72; Cole et al.，1983，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 80:2026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技 術（Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan，R ． Liss.，Inc．pp 77-96）を含むが、これらに限定されるものではない。こうした 抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスをも含んでもよい 。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitro、in vivoのいずれで培養 してもよい。in vivoでの高力価のmAbsの産生は、これを目下好適な産生方法に する。 加えて、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と適当な生物 学的活性を有するヒト抗体からの遺伝子とをいっしょにスプライスすることによ る「キメラ抗体」の産生のために開発された方法（Morrison et al.，1984，Pro c．Natl．Acad．Sci.，81:6851-6855; Neuberger et al.，1984，Nature 312:60 4-608; Takeda et al.，1985，Nature 314:452-454）を用いることができる。キ メラ抗体は、例えばマウスのmAbsに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常 領域とを有するような、異なる動物種に由来する異なる部分を含む分子である。 代替として、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（米国特許4,946,778; Bird，1988，Science 242:423-426; Huston et al.，1988，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 85:5879-5883; およびWard et al.，1989，Nature334:544-546）をP TK／アダプター複合体特異的一本鎖抗体またはPTP／アダプター複合体特異的一 本鎖抗体の産生に適用することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸結合を介する Fv領域の重鎖および軽鎖断片をつなぐことによって形成され、一本鎖ポリペプチ ドを生じる。 PTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体の特異的結合部位を含む抗体断 片を、既知の方法で形成させてもよい。例えば、下記の断片が含まれるが、これ らに限定されるものではない：抗体分子のペプシン消化によって産生され得るF( ab')2断片、F(ab')2断片のジスルフィド結合を還元することによって生じ得るFa b断片。代替として、Fab発現ライブラリーは、PTK／アダプターまたはPTP／アダ プター複合体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の速やかで 簡便な同定を可能にするために構築してもよい（Huse et al.，1989，Science 2 46:1275-1281）。 5.6 PTK／アダプタータンパク質およびPTP／アダプタータンパク質関連細胞 増殖障害 本発明は、最初に、アダプタータンパク質のSH2-および／またはSH3-ドメイン を含むファミリーのメンバーの結合が発がんおよびトランスフォーメーションの 過程において必須のステップであることを証明する。より詳細には、以下の６〜 12節における実施例で示されたデータは、アダプタータンパク質のGRBサブファ ミリーのGRB2メンバーのヒトBCR-ABL遺伝子の細胞内PTK産物への結合を詳述する 。 この節においては、このようなPTKおよびアダプタータンパク質および／また はPTPおよびアダプタータンパク質の結合がこのような複合体を包含する細胞の 増殖障害の治療のために使用され得る様々な使用のいくつかが記載されている。 ここで記載された使用は、こうした複合体を破壊する（すなわち、複合体におけ るPTKまたはPTPの成分とアダプターメンバーとの間の相互作用を減少させるか、 または阻害する）ことができる薬剤、およびアダプタータンパク質のSH2-および ／またはSH3-を含むファミリーのメンバーと複合体を形成することができるPTK またはPTPを含む細胞増殖障害の治療のためのこうした化合物の利用に焦点が絞 られているが、これらに限定されるものではない。ここで使用されている「破壊 する」という用語は、こうした複合体が、物理的に形成可能のままで残存するか 否かにかかわらず、タンパク質複合体成分の物理的な解離のみならず、複合体の 活性の撹乱をも意味する。ここで使用されている「活性」は、このような複合体 が形成される細胞中のシグナル伝達カスケードにおけるタンパク質複合体の機能 を意味し、すなわち、細胞中への細胞外のシグナルの伝達を効率的にするか阻害 することにおける複合体の機能を意味する。このような細胞増殖障害の例は、例 えば、乾せんやアテローム硬化のみならず、慢性骨髄性白血病および急性リンパ 性白血病などのガン性障害を含むが、これらに限定されるものではない。本発明 の複合体はまた、こうした細胞の活性化、分化、および生存といった細胞過程に おいても含まれる。 個々のPTK／アダプタータンパク質複合体またはPTP／アダプタータンパク質複 合体に依存しつつ、このような複合体の成分メンバー間の相互作用を破壊するこ とは、包含されるシグナルの伝達イベント上における異なるモジュレート効果を 有するかもしれず、すなわち、複合体破壊の該効果により、細胞内に正常に伝達 されるシグナルを活性化するか、減少させるか、ブロックするかもしれない。細 胞増殖障害に依存するのと同様に、細胞へ正常に導入されるシグナルの活性化、 還元、またはブロックは、障害の治療のために望ましい。例えば、BCR-ABL PTK とGRB-2アダプタータンパク質の複合体形成の１つの効果は、Rasシグナリング経 路の活性化をひき起こすことである（下記８節の実施例を参照せよ）。こうして 、BCR-ABL PTK/GRB-2アダプタータンパク質複合体の破壊は、異常なシグナルの 伝達を阻害し、Ras経路の活性化を妨げる。代替として、例えば、PTK／アダプタ ーまたはPTP／アダプター複合体を含む細胞増殖障害は、こうした複合体が正常 なシグナル伝達イベントの異常型の阻害を引き起こすために、進行するかもしれ ない。こうした場合、複合体の破壊は、通常のシグナル伝達イベントを回復させ るはずである。さらに、異常型の複合体は、変更されたサブ細胞アダプタータン パク質の局在化を引き起こす可能性があり、このことは、アダプタータンパク質 の6RB サブファミリーのGRB-2メンバーの場合にあったように、例えば、細胞骨 格の再構成といった機能不全性細胞イベントを生じさせる可能性がある。この場 合にPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体の阻害は、正常な細胞の構造 を回復させるはずである。さらにまた、PTK／アダプターまたはPTP／アダプター 複合体の破壊の原因となる１つまたは複数の薬剤は、このような複合体の他の強 力な成分の間の相互作用の破壊を引き起こすかもしれない。こうした成分は、SO Sタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。 複合体のPTK またはPTP 成分が膜貫通であって、受容体型PTK またはPTP 分子 であるPTK／アダプタータンパク質複合体およびPTP／アダプタータンパク質複合 体を考える場合、該受容体またはそれらのリガンドを、細胞の増殖障害の進行を 導くシグナル伝達イベントをモジュレートするために、直接使用してもよい。例 えば、PTK、可溶性PTK、細胞外PTKドメインを示すペプチド、またはリガンドに 結合することが知られている細胞外PTKドメインの部分を示すペプチドは、有用 なリガンドに対して内因性膜貫通PTK受容体分子と競合的に作用することのでき る目的のPTK発現細胞に暴露されるとき、当業者に公知の方法を用いて投与して もよく、こうして、内因性PTK へのリガンドの結合を低下させるか、阻害する。 このような操作の結果、PTK分子のためのアダプタータンパク質の親和性を順番 に低下させることができるPTKの自己リン酸化をできる限り阻害することによっ て、PTKとアダプタータンパク質との間の相互作用の低下または阻害を生じさせ ることができるはずである。同様な状況は、PTPの場合でも保持される。 加えて、受容体型PTKを考えるときは、そのようなPTKに結合することができる 細胞外分子であって、PTK への結合により活性化しない該分子を当業者に公知の 方法を用いて投与してもよい。この型の細胞外分子は、例えば、受容体結合は未 だ生じていてもよいが、キナーゼの活性化が生じていないといった、目的のPTK のための天然のリガンドの修飾された形態を含んでもよい。このような設計の分 子は、可溶性PTKの投与と同様に作用するはずであり、これらの手順はPTK／アダ プタータンパク質複合体形成の低下または阻害という最終的効果を有するはずで ある。再び、同様の状況はPTP の場合においても生じる。 さらにまた、本発明のPTK／アダプター複合体の受容体PTK またはPTP／アダプ ター複合体の受容体PTPの天然リガンドに結合できる分子を、当業者の公知の方 法を用いて投与してもよい。このクラスの分子は、リガンドの対応する受容体へ の結合能を阻害するために作用するはずであり、こうしてPTK／アダプターまた はPTP／アダプタータンパク質複合体の形成を低下させるか阻害する最終効果を 有するはずである。 治療される特別の条件に応じて、このような薬剤は製剤化され、全身的にまた は局所的に投与される。製剤化および投与の方法は、"Remington's Pharmaceuti cal Science"，1990，18版、Mack Publishing Co.，Easton，PAに中に見出され る。好適な経路は、経口、直腸内、口内粘膜、または小腸内投与を含む；非経口 的投与は、２、３の例を挙げれば、硬膜下、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔 内、または眼内注射と同様に、筋肉内、皮下、骨髄内注射を含む。投与のために は、薬剤を水溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食 塩水緩衝液等の生理学的に交換可能な緩衝液中で製剤化する。口内粘膜投与のた めには、透過すべきバリヤに適合した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸 透剤は、一般的に当業者に公知である。 本発明のPTK／アダプター複合体および／またはPTP／アダプター複合体の形成 を直接的に妨害するように細胞内で働く薬剤を、細胞の増殖障害の治療のために 使用してもよい。このような薬剤は、SH2及び／又は、SH3ドメイン、又はSH2に 結合するドメインおよび／またはSH3に結合するドメイン、小さな有機分子、ま たは複合体成分と競合的に作用して結合し、複合体形成を減少させるか阻害する ように作用するはずである天然物の抽出物を含むがこれらに限定されるものでは なく、これらもまた、目的の細胞増殖障害の進行を低下させるか阻害するはずで ある。SH2ペプチドドメインおよびSH3ペプチドドメイン、およびSH2に結合する ペプチドドメインおよびSH3に結合するペプチドドメインは、上述したように、 第5.1節に記載されている。このような薬剤はまた、複合体形成の代わりにまた は複合体形成に加えて下流のシグナリング能を妨害することによって複合体を破 壊する。 細胞内に投与しようとする薬剤は、当業者に公知の方法で投与してもよい。例 えば、このような薬剤は、リポソーム中に封入されてもよく、その後上述のよう に投与されてもよい。リポソームは、内部に水溶液を有する球状の脂質二重層で ある。リポソームが形成されたときに水溶液中に存在するすべての分子は、内部 の水溶液中に取り込まれる。リポソームに含まれるものは外部の小環境から保護 され、そしてリポソームが細胞膜と融合するために効率的に細胞の細胞質内に輸 送される。加えて、小さな有機分子は疎水性であるため、それらは直接に細胞内 に投与してもよい。 細胞内で利用されるペプチド物質をコードするヌクレオチド配列は、当業者に 公知の方法を用いて、対象の細胞中で発現されてもよい。例えば、レトロウイル ス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ 乳頭腫ウイルス等のウイルスに由来する発現ベクターを標的とする細胞集団に輸 送し、これらの細胞中でこのようなヌクレオチド配列を発現させるために使用し てもよい。このようなベクターの構築法は公知である。例えば、Maniatis et al .，1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labor atory，N.Y.およびAusubel et al.，1989，Current Protocols in Molecular Bi ology，Greene Publishing Associates and Wily Interscience，N.Y.を参照せ よ。 あるいは、PTK／アダプターおよび／またはPTP／アダプター複合体形成を妨害 し得る抗体を、アダプタータンパク質との複合体を形成し得るPTKまたはPTPを包 含する細胞増殖障害の治療のために投与してもよい。例えば、リガンドの受容体 型PTKsまたはPTPsへの結合を妨害することができる中和抗体を、上述したような 技術を用いて投与してもよい。このような投与の効果は、可溶性PTKsまたはPTPs の投与にとっては、上述した効果と同様である。加えて、細胞内のエピトープに 結合してPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体形成を破壊する効果を有 する中和抗体を投与してもよい。このような抗体は、例えば、細胞内で作用する 薬剤の投与のために上記の技術を利用して、投与してもよい。あるいは、一本鎖 抗体をコーディングするヌクレオチド配列は、標的となる細胞集団の中で、例え ば、Marascoらに記載された方法を用いて発現させてもよい（Marasco et al.，1 993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7889-7893）。 本発明のPTK／アダプター複合体および／またはPTP／アダプター複合体は、こ うした複合体の構成メンバーの活性を破壊するように作用し得る付加的な分子を スクリーニングするために使用してもよく、かくしてこのような複合体の効果な どの該シグナル伝達イベントをモジュレートすることができるかもしれない。こ のような化合物は、D-および／またはL-配置のアミノ酸からなるペプチド（例え ば、ランダムペプチドライブラリの形態で；Lam，et al.，1991，Nature 354:82 -84を参照せよ）、ホスホペプチド（phosphopeptide，例えば、ランダムまたは 一部縮重、ホスホペプチド指向性ライブラリの形態で、Songyang et al.，1993 ，Cell 767-778を参照せよ）、抗体、および小さな有機分子を含むが、これらに 限定されるものではない。 例えば、PTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体の個々の成分、または 個々の成分の官能基部分に結合する（そしてさらに複合体形成を破壊することが できるかもしれない）化合物を同定してもよい。複合体の個別の官能性部分は、 ここで、複合体の別のメンバーと尚も安定な複合体を形成できる個別の複合体成 分のペプチド部分として定義されてもよい。例えば、PTKのSH2に結合するドメイ ンのペプチド部分は尚もアダプタータンパク質のSH2ドメインに安定して結合す ることができ、こうしてアダプタータンパク質のSH2ドメインと複合体を尚も形 成する。さらに、本発明のPTKまたはPTP成分が触媒ドメインである場合には、触 媒ドメインの官能性部分は、未だに基質分子に安定して結合できるペプチドとし てもよい。 このようなPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体成分に結合する分子 の単離に実行されるこのアプローチを有用化する１つの方法は、成分分子または それらの官能基部分の、アガロース、プラスチックビーズ、マイクロタイターウ ェル、シャーレ、または、例えば、ナイロンやニトロセルロースからなる膜など の固相支持体への接着、ついで１種類の強力な成分に結合する化合物または複数 の化合物の存在下における、接着した成分分子のインキュベーションを含むはず である。インキュベーションの後、未結合の化合物を洗い流し、成分に結合した 化合物を回収する。この手順を使用することにより、多数の型の分子をPTK／ア ダプターまたはPTP／アダプター複合体成分に結合する活性のために同時にスク リーニングしてもよい。 上記のスクリーニング方法で利用されてもよいPTK／アダプター複合体成分は 、PTK分子又はそれらの官能基部分、例えばPTK触媒ドメイン、リン酸化ドメイン 、SH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2に結合するドメイン、又はSH3に結合するドメ イン、およびアダプタータンパク質、またはそれらの官能基部分、例えばSH2ド メインおよびSH3ドメインを含んでもよく、特に限定されない。使用されるペプ チドは、リン酸化されていてもいなくてもよく、リン酸化されている場合には、 少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくはリン酸化されたTyrを含む。リン酸 ドメインは、あるアミノ酸残基が特異的にリン酸化されたペプチド領域として定 義してもよい。このようなリン酸ドメインの官能性部分は、特異的PTKによって あるアミノ酸が特異的にリン酸化されたペプチドとして定義してもよい。SH2ド メインの官能性部分は、SH2に結合するドメインに特異的に結合することができ るSH2ドメインの少なくとも１つの部分を含むペプチドとして定義してもよい。 同様に、SH3ドメインの官能性部分は、SH3に結合するドメインに特異的に結合す ることができるSH3ドメインの少なくとも１つの部分を含むペプチドとして定義 してもよい。SH2に結合するドメインの官能性部分は、SH2に結合することができ るペプチドとして定義してもよく、少なくとも４アミノ酸残基長を有していても よ い。SH3に結合するドメインの官能性部分は、SH3に結合することができるペプチ ドとして定義してもよく、少なくとも４アミノ酸残基長、好ましくは10アミノ酸 残基長を有する。 上記のスクリーニング方法で利用されてもよいPTP／アダプター複合体は、PTP 分子またはそれらの官能基部分、例えば、PTP触媒ドメイン、リン酸化ドメイン 、SH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2に結合するドメイン、SH3に結合するドメイン 、およびアダプタータンパク質、またはそれらのSH2ドメインおよびSH3ドメイン といった官能基部分を含んでもよく、特に限定されない。使用されるペプチドは 、リン酸化されていてもされていなくてもよく、リン酸化されている場合には、 少なくとも１つのリン酸されたアミノ酸残基を含み、リン酸化されたTyrアミノ 酸残基を含むことが好ましい。リン酸ドメインは、あるアミノ酸残基を特異的に リン酸化したペプチドとして定義してもよい。このようなリン酸ドメインの官能 性部分は、特異的PTKによってアミノ酸を特異的にリン酸化され得るペプチドと して定義してもよい。SH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2に結合するドメイン、お よびSH3に結合するドメインの官能性部分は上記のものであってもよい。 結合活性を示す分子を、さらにPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体 を破壊する能力を調べるためにスクリーニングしてもよい。二者択一的に、分子 を、PTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体を破壊能のために直接スクリ ーニングしてもよい。例えば、in vitro複合体形成を、最初に、固相支持体に固 定化された目的の複合体のうちの１つの成分、またはそれらの官能性部分によっ てアッセイする。第二に、固定化された複合体成分を、上記のように同定した化 合物、および目的の複合体の第二の成分、またはそれらの官能性成分に接触させ る。第三に、化合物の存在下で、第二の成分が固定化された成分と安定した複合 体を未だに形成できるか否かを測定する。 加えて、in vivoでの複合体形成を、当業者に公知の免疫共沈法を利用してア ッセイしてもよい。簡単にいえば、目的のPTK／アダプターまたはPTP／アダプタ ー複合体を形成できる細胞株を上記のように同定した化合物に接触させ、細胞ラ イセートをこのよう接触させた細胞株から調製する。目的の複合体の成分の１つ に対して上昇した抗体を細胞ライセートに添加し、標準的な免疫沈降法に供する 。 複合体が破壊された場合に複合体の成分だけに対して上昇した抗体が沈降するの に対して、複合体がまだ形成される場合には免疫沈降では複合体が沈降する。 目的のPTK／アダプターまたはPTP／アダプター複合体のトランスフォーメーシ ョン能に対する薬剤の効果を直接にアッセイしてもよい。このような薬剤は、必 ずしも必要ではないが、上述のスクリーニング法を利用して同定された薬剤を含 んでもよい。例えば、１またはそれ以上の薬剤は、阻害剤がなければ、細胞のト ランスフォーメーションを生じるPTK／アダプター複合体を形成できる繊維芽細 胞または造血幹細胞に投与してもよい（Muller et al.，1991，Mol．Cell．Biol ．11:1785-1792; McLaughlin et al.，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:6 558-6562）。細胞のトランスフォーメーション状態は、その後、例えば、in vit roで軟寒天でのコロニー形成能をモニターすることにより測定してもよい（Lugo et al.，1989,Mol．Cell．Biol．9:1263-1270; Gishizky et al.，1992，Scien ce 256:836-839）。二者択一的に、細胞のトランスフォーメーション状態を、in vivoで、重篤な複合免疫不全状態（SCID）の免疫不全ヌードマウスでの腫瘍の 形成能を測定することにより、モニターしてもよい（Sawyers et al.，1992，Bl ood 79:2089-2098）。さらに、BCR-ABLの場合には、１つまたはそれ以上の薬剤 を、当業者に公知のALLおよび／またはCMLの動物モデルに投与してもよく（Gish izky et al.，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 3755-3759）および／ま たはガン性障害の進行を逆転するかもしれない。 PTK／アダプターおよび／またはPTP／アダプター複合体形成を破壊することが でき、そしてこうした複合体形成から生じる細胞増殖障害を低下させるか阻害す ることのできる薬剤を、こうした障害を示している患者またはこのような障害を 示すおそれのある患者の治療に使用してもよい。上記の１つまたはそれ以上の薬 剤を有効な濃度で患者に投与すると、PTK／アダプターまたはPTP／アダプタータ ンパク質複合体を含むはずの細胞増殖能は、このような薬剤の存在下で、低下す るかまたは消失する。 また、白血病のような造血細胞増殖性疾患の場合には、患者への直接投与より もむしろ、作用物質または薬剤は当技術分野で公知の自己骨髄移植および化学放 射線療法とともに使用することができる。簡単に述べれば、一般に骨盤から採取 される骨髄細胞のアリコートを患者から取り出す。次に、細胞をＰＴＫ／アダプ ターまたはＰＴＰ／アダプター複合体を効率よく破壊し得る濃度の作用物質また は薬剤の存在下で培養する。かかる複合体を形成する能力がある骨髄細胞のシグ ナル伝達経路をブロックすることにより、これら細胞のクローン子孫の存在に対 して選択し、治療対象の造血細胞増殖性疾患に関与しているこれら細胞の培養物 を効果的に排除する。骨髄細胞を培養して、発がん性の高い細胞を取り除いてい る間、当技術分野で公知の技法および線量を用いて、その疾患に適した化学放射 線療法で患者を治療する。こうした化学放射線療法による治療の終了時に、患者 は発がん性細胞を一掃しておいた骨髄細胞培養物の自己由来の注入液を受け取る 。 本発明の好ましい態様において、ＰＴＫ／アダプター複合体は破壊または妨害 されており、そして該複合体はそのＰＴＫ成分がヒトＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の細 胞内ＰＴＫ産物で、アダプタータンパク質成分がアダプタータンパク質のＧＲＢ サブファミリーのＧＲＢ−２メンバーであるものである。さらに、このような薬 剤の投与により治療される細胞増殖性疾患としては、この好ましい態様では慢性 骨髄性白血病と急性リンパ性白血病が挙げられるが、これらに限らない。 5.7 結合相手間の相互作用を破壊する能力がある化合物の同定 活性化チロシンキナーゼ分子とアダプタータンパク質分子（ここでは「結合相 手」と呼ぶことにする）との相互作用を妨げる（すなわち、破壊または阻止する ）能力について化合物を試験するにあたって、多くのアッセイ系のどれを使用し てもよい。活性化チロシンキナーゼ分子のほかに、アダプタータンパク質と結合 して複合体を形成する他の分子が結合相手のこの定義に含まれることを認識すべ きである。それゆえ、別の結合相手としては、例えばＧＲＢ−２アダプタータン パク質と結合することが知られているＳＨ２ドメイン含有タンパク質のＳＨＣが ある（Tauchi，T.ら，1994，J．Exp．Med．179:167-175; Rozakis-Adcock，M． ら，1992，Nature 360:689-692; Pelicci，G．ら，1992，Cell 70:93-104）。し かし、リガンド（天然または合成）、ペプチドまたは小さな有機分子を含むがこ れらに限らない多数の化合物をスクリーニングできる迅速で高処理量のアッセイ が好ましいものである。こうして結合相手間の相互作用を妨げることが確認され た化合物はここに記載される阻害活性についてさらに評価され得る。 結合相手間の相互作用を妨げる化合物の同定に用いられるアッセイ系の基礎的 な原理は、２種のタンパク質を相互作用させ、結合させ、複合体を形成させるの に十分な条件下および時間において結合相手を含有する反応混合物を調製するこ とを包含する。阻害活性について化合物を試験するためには、反応を試験化合物 の存在下または不在下で実施する。すなわち、試験化合物は反応混合物中に最初 に添加しておいてもよいし、結合相手の添加後のある時点で添加してもよい。対 照は試験化合物の不在下でまたはプラシーボとともにインキュベートされる。そ の後、結合相手タンパク質の複合体の形成を検出する。対照反応混合物中に複合 体が形成されるが、試験化合物を含む反応混合物中では複合体が形成されないこ と、または対照反応と比較して反応混合物中での複合体形成のレベルが低下して いることは、該化合物が結合相手間の相互作用を妨げることを示している。利用 しうるアッセイ成分および各種フォーマットを以下に述べる。 アッセイの成分として用いられる結合相手は、天然源から得られるものであっ てよく、例えば当技術分野で公知のタンパク質分離法を用いて細胞から精製した り、当技術分野で公知の技法を用いて組換えＤＮＡ法により作製したり（例えば 、Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories Press，Cold Spring Harbor，N.Y．参照）、かつ／または 当技術分野で公知の技法を用いて全部または一部を化学合成したりすることがで きる。例えば、ペプチドを固相法で合成し、樹脂から切り離し、分離用の高性能 液体クロマトグラフィーで精製する（例えば、Creighton，1983，Proteins:Stru ctures and Molecular Principles，W.H．Freeman & Co.，N.Y.，pp．50-60 参 照）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析またはシークエンシングによって確認 することができ、例えばエドマン分解法が用いられる（例えば、Creighton，198 3,前掲を参照）。 ペプチド断片はそれぞれのタンパク質の結合ドメインに対応するように作製し うる。例えば、このような断片にはＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ＳＨ２ド メインに結合するペプチド断片および／またはＳＨ３ドメインに結合するペプチ ド断片が含まれるが、これらに限らない。タンパク質の結合部位を同定および単 離するには、当技術分野で常用されている多くの方法を採用することができる。 こうした方法として、タンパク質をコードする遺伝子の１つの突然変異誘発およ び同時免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングがあるが 、これらに限らない。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析によ り、相互作用結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が明らかにな るだろう。 また、あるタンパク質を固体表面に固定し、トリプシンのようなタンパク質分 解酵素で処理しておいたその標識結合相手と相互作用させて、それに結合させる こともできる。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識ペプチドは固体材料に結合 されたままで残り、それを単離した後アミノ酸配列決定により同定する。また、 ひとたびタンパク質の遺伝子が得られたら、短い遺伝子セグメントを遺伝子工学 的に作製してそのタンパク質のペプチド断片を発現させ、その後ペプチド断片を その結合活性について試験し、精製し、または合成することができる。 本発明のアッセイにおいて使用しうる結合相手のアミノ酸配列は、分子クロー ニング法で作製されようと、化学合成法で合成されようと、それらをコードする 遺伝子の既知配列に同一である必要はない。結合相手はアミノ酸残基が欠出、付 加または置換されているが機能的に等しい産物をもたらす変更配列を含んでいて もよい。 例えば、配列内の残基の代わりに機能的に等しいアミノ酸残基を用いて配列を 変えることができる。こうした置換残基はそのアミノ酸が属するクラスの他のメ ンバーから選択することができ、例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としてはア ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ プトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸としてはグリシン、セ リン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含 まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リシンおよびヒス チジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸および グルタミン酸が含まれる。 アッセイ系で用いられる結合相手の１つは、結合相手間で形成される複合体の 検出を容易にするために、直接または間接的に標識されるべきである。適当な標 識系のどれを使用してもよく、125Iのような放射性同位元素、基質にさらしたと き検出可能な比色分析シグナルまたは光を発生する酵素標識系、それに蛍光標識 が含まれるが、これらに限らない。 アッセイの結合相手を作製するために組換えＤＮＡ法を用いる場合は、標識づ け、固定化および／または検出を容易にする融合タンパク質を遺伝子工学的に作 製することが有利である。例えば、チロシンキナーゼまたはアダプタータンパク 質のコード配列を、酵素活性を有するかまたは酵素基質として作用する異種タン パク質のコード配列に融合させることにより、標識づけおよび検出が簡単になる 。融合構築物は、融合産物の異種成分が結合相手の結合を妨げないように設計す べきである。 間接標識は、結合相手のひとつに特異的に結合する、標識抗体のような第３の タンパク質の使用を伴う。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクロ ーナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによ り生産されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されることはない。 アッセイは、不均一または均一な形態で行うことができる。不均一アッセイは 、結合相手のひとつを固相に固定し、固相に固定された複合体を反応の最後に検 出することを伴う。均一アッセイにおいては、全反応は液相中で行われる。どち らの方法においても、反応物の添加の順序を変えて、試験される化合物に関する 異なる情報を得ることができる。例えば、試験物質の存在下で反応を行う、すな わち、結合相手の前または結合相手と同時に反応混合物に試験物質を添加するこ とにより、例えば、競合により結合相手間の相互作用を妨害する試験化合物を同 定することができる。一方、複合体が形成した後に試験化合物を反応混合物に添 加することにより、前形成された複合体を分断する試験化合物、例えば、複合体 から結合相手のひとつにとって代わるより高い結合定数を有する化合物を試験す ることができる。 不均一アッセイ系においては、一方の結合相手が固体表面に固定され、その結 合相手（固定されていない）が直接あるいは間接的に標識される。実際には、マ イクロタイタープレートが好都合に利用される。固定種は、非共有または共有結 合により固定化されうる。非共有結合は、固体表面をタンパク質の溶液でコーテ ィングして乾燥することにより、簡単に達成されうる。あるいはまた、タンパク 質に特異的な固定化抗体を使用して、タンパク質を固体表面に固定してもよい。 この表面を前もって調製し、保存しておいてもよい。 上記のようなアッセイを行うために、試験化合物とともに、あるいは試験化合 物なしに、固定化種の結合相手はコーティングされた表面に添加される。反応が 完了した後に、（例えば、洗浄により）未反応の成分を除去すると、形成した複 合体は固体表面に固定化されたままでいる。固体表面に固定された複合体の検出 はいくつかの方法でなされる。結合相手が予備標識されている場合には、表面に 固定化された標識の検出により、複合体の形成が示される。結合相手が予備標識 されていない場合には、間接標識を使用して、例えば、結合相手に特異的な標識 抗体（この抗体は、今度は、標識抗Ｉｇ抗体により直接的にあるいは間接的に標 識されうる。）を用いて、表面に固定された複合体を検出することができる。反 応成分の添加の順序に依存して、複合体の形成を抑制するか、あるいは、前形成 された複合体を分断する試験化合物を検出することができる。 あるいはまた、試験化合物の存在下または不存在下で、液相中で反応を行い、 反応生成物を未反応成分と分離し、そして、例えば、溶液中に形成した複合体を 固定するための一方の結合相手に特異的な固定化抗体および固定された複合体を 検出するための他の結合相手に特異的な標識抗体を用いて、複合体を検出するこ とができる。ここでも、反応物の液相への添加の順序に依存して、複合体を抑制 するか、あるいは、前形成された複合体を分断する試験化合物を同定することが できる。 本発明の他の態様において、、均一アッセイを使用することができる。この方 法においては、結合相手の前形成された複合体が調製され、ここでは、結合相手 のひとつが標識されるが、この標識により生じるシグナルは複合体の形成により 消失する（例えば、イムノアッセイのためのこの方法を利用するRubensteinの米 国特許第4,109,496号を参照のこと）。結合相手のひとつと競合し、前形成され た複合体からこれにとって代わる試験物質の添加により、バックグラウンドより 高いシグナルが発生する。このようにして、ウイルスタンパク質−宿主細胞タン パク質相互作用を壊す試験物質を同定することができる。 ６．実施例：ＢＣＲ−ＡＢＬはＧＲＢ−２とin vitroでもin vivo でも会合する この節で提示する実施例において、アダプタータンパク質のGRB サブファミリ ーのGRB-2 メンバーがBCR-ABL 細胞内PTK にin vitroでもin vivo でも結合する ことが実証される。 ６．１．材料および方法 ６．１．１ 細胞およびウイルス Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞を完全Grace 培地(Smith，G.E.，1983 ，Mol．Cell．Biol．3:2156-2165)中で増殖させた。Ph1陽性白血病細胞系K562お よびNMG-01を慢性骨髄性白血病患者から誘導し、P210 BCR-ABLを発現させた。PH1 陽性細胞系ALL-1 を急性リンパ性白血病患者から誘導し、P185 BCR-ABLを発現さ せた。これらのPH1陽性細胞系を10% 牛胎児血清含有RPMI 1640 培地中で培養し た。COS アフリカミドリザル細胞(COS African green monkey cells)およびRat1 繊維芽細胞を5%牛胎児血清含有DMEM培地中で増殖させた。 Pendergastら，1991，Cell 66:161-171; Pendergast ら，1991，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 88:5927-5931 に記載のように、野生型バキュロウイルスDNA の 存在下で、pAcCI2バキュロウイルスベクター中にクローニングされた対応するcD NAを同時トランスフェクションすることにより、cBCR、cABLおよびBCR-ABL の発 現用の組換えバキュロウイルスを作製した。 先に記載した方法(Mullerrら，1991，Mol．Cell．Biol．11:1785-1792)に従い 、COS 細胞での一過性の高発現(hyperexpression)により、無ヘルパー(Helper-f ree)レトロウイルスのストックを調製した。免疫組織化学的方法(Muller ら，19 91，Mol．Cell．Biol．11:1785-1792)を用いて、野生型および変異型のBCR-ABL 遺伝子産物をRat1繊維芽細胞へ移入する能力に従い、レトロウイルスのストック の特性付けを行った。これらの染色法において、内在性レベルのrat c-abl タン パク質は検出されなかった。BCR-ABL タンパク質発現のレベルを測定する（ウェ スタンブロット）ことにより、遺伝子移入のレベルをさらに評価した。比較でき るレベルの遺伝子移入を示すレトロウイルスのストックのみをこれらの検討に使 用した。ウイルスストックの限界希釈へさらした後のG418耐性Rat1コロニーの頻 度により測定したところ、力価はml当たり105 感染粒子の範囲であった。 ６．１．２ 抗体 cBCRのアミノ末端、cABLのアミノおよびカルボキシ末端配列に対するウサギポ リクローナル抗体については先に記載した(Pendergast ら，1991，Cell 66: 161 -171; Konopka ら，1984，Cell 37:1035-1042)。マウスモノクローナル抗-ABL(2 1-63)抗体を免疫ブロット法(Pendergast ら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 88:5927-5931)に採用した。GRB-2(Ab50)のＣ末端SH3 ドメインに対するウサギ ポリクローナル抗体およびGRB-2(Ab86)のＮ末端SH3 ドメインから誘導された合 成ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を、それぞれ、免疫沈降法および 免疫ブロット法(Lowenstein ら，1992，Cell 70:431-442)に使用した。 ６．１．３ プラスミドの構築 650 塩基対のヒトGRB-2 CDNA(Lowensteinら，1992，Cell 70:431-442: Matuok aら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:9015-9019)を、ヒト胎盤cDNAライ ブラリーから、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、(5')SH3-SH2 および(3')SH3 フラグメントとしてクローニングした。完全長のGRB-2 cDNAを生成するために 、GRB-2 のコドン154 のユニークなKpnI部位を採用した。GRB-2 の全コーディン グ配列およびGRB-2 の(3')SH3 ドメインをpGEX-2T ベクター(Pharmacia)のBam H I部位にフレーム内でサブクローニングした。Skolnikら，1993，EMBO J．12:192 9-1936に記載のように、GRB-2 の単離された(5')SH3 および SH2ドメインを調製 した。 野生型P185 BCR-ABL(McLaughlinら，1989，Mol．Cell．Biol．9:1866-1874)お よびP185(Δ176-426)(Mullerら，1991，Mol．Cell．Biol．11:1785-1792)につい てのｃＤＮＡの調製ならびに対応するcDNAのpSRα(Pendergastら，1991，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 88:5927-5931)およびpSRα MSVtKneo(Muller ら，1991， Mol．Cell．Biol．11:1785-1792)ベクターへのクローニングは、先に記載したよ うに行った。Muta-Gene Phagemid in vitro mutagenesis system(Bio Rad)を用 いるオリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発により、P185 BCR-ABL(Y177F) 変異体を創製した。pGEM4/cBCR由来のcBCRの1.6 Kbの EcoRI-SacI フラグメント をpBlueScript SK+ ベクター(Stratagene)のEcoRI およびSacI部位にサブクロー ニングし、XL-1 Blue バクテリアをヘルパーファージR408（Stratagene）で同時 感染させて一本鎖DNA を守ることにより、鋳型を作成した。この突然変異オリゴ ヌクレオチド5'-AAG CCC TTC TTC GTT AAC GTC GAG-3’を採用して、ヌクレオチ ド530 をA からT に変更することにより、チロシンの代わりにフェニルアラニン コドンを生成した。さらに、ヌクレオチド534 にサイレントな塩基の変更を導入 し、ユニークなHpaI部位を作成した。このユニークなHpaI部位の存在のために突 然変異誘発されたプラスミドが選択された。突然変異は、両方向でのジデオキシ 読み終わり配列分析により証明された。突然変異したBCR 配列を野生型P185 BCR -ABL cDNA に導入した。P185 BCR-ABL(Y177F)をpSRαおよびpSRα MSVtK neo 哺 乳類発現ベクターならびにバキュロウイルス発現用のAcC12 ベクターにサ ブクローニングした。野生型cABLのためのcDNAのpSRαベクターへのクローニン グは、先に記載した(Pendergast ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5927-593 1)。BCR(Δ872-1271)も、Pendergastら，1991，Cell 66:161-171 に記載されて いるように、pSRαにクローニングした。 ６．１．４．ＧＳＴ融合タンパク質の発現と精製 既に記載されたように（Pendergast et al.，1991,Cell 66:161-171）、GST融 合タンパク質を発現させて、グルタチオン-セファロース4Bビーズ(Pharmacia)を 用いて精製した。融合タンパク質は樹脂上に残したままで４℃で保存した。 ６．１．５．代謝による標識化と免疫沈降 示された組換えバキュロウイルスにSf9細胞を感染させた。感染の３日後、細 胞をメチオニンを含まない培地中で0.1m Ci/ml［35S］メチオニン（ICN）ととも に４〜６時間、27℃でインキュベートした。5 mM EDTA，1 mM PMSF，50μg/mlロ イペプチン、25μg/mlアプロチニン、25 mM NaF，1 mM Na3VO4および0.1 mM Na2 MoO4を補ったKLB（10 mMリン酸ナトリウム pH7.0，150 mM NaCl，1 % Triton X- 100）またはPCLB（50 mM HEPES，pH 7.0，150 mM NaCl，1 mM MgCl2，1 % Trito n X-100，10 %グリセロール）のいずれかで、標識細胞を溶解した。溶解物を100 ，000×ｇで１時間遠心することにより清澄とした。溶解物を示された抗体とと ともに直接またはインキュベーション緩衝液（20 mM HEPES，pH 7.0，150 mM Na Cl，0.1 % Triton X-100，10 %グリセロール，0.5 mM Na3VO4，0.1 mM Na2MoO4 ，25 mM NaF,1 mM PMSF，25 μg/mlロイペプチン）で３倍希釈後、示されたよう にインキュベートした。プロテインＡ-セファロースビーズ（Pharmacia）ととも に120分間、４℃でインキュベーションすることにより免疫複合体を集めた。ビ ーズをインキュベーション緩衝液で十分に洗浄し、結合していない物質を除去し た。結合したタンパク質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、フル オログラフィーで肉眼で確認した。未標識の溶解物を用いるときはいつでも示さ れた抗体によるイムノブロットによりそのタンパク質を検出した。 ６．１．６．バインディングアッセイ タンパク質溶解物をインキュベーション緩衝液で３倍に希釈し、グルタチオン -セファロースビーズに結合させたＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質とともに インキュベートした。４℃での９０分間のインキュベーション後、ビーズをイン キュベーション緩衝液またはRIPA緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，137 mM NaC l，10 %グリセロール，1 % Triton X-100，0.1 % SDS，0.5%デオキシコール酸塩 および2 mM EDTA）で、示されたように十分に洗浄した。結合したタンパク質はS DSポリアクリルアミド後の放射能標識化タンパク質のフルオログラフィーにより 分析した。 ６．１．７．イムノブロット、IN VITRO自己リン酸化および脱リン酸化反応 イムノブロットおよび［γ32P］ATPによるin vitro標識化の方法は基本的には 以前に記載されたように行なった（Pendergast et al.，1991,Cell66:161-171; Pendergast et al.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:5927-5931）。ジャ ガイモ酸性ホスファターゼによる脱リン酸化は記載されたように行なった（Pend ergast et al.，1991,Cell66:161-171; Pendergast et al.，1991，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA88:5927-5931）。 ６．２．結果 ６．２．１．BCR-ABLはGRB-2とIN VIVOで会合する BCR-ABLチロシンキナーゼがGRB-2アダプタータンパク質とそのままの細胞中で 物理的複合体を形成するかどうかを決定するために、これらの２種類のタンパク 質が共免疫沈降するかどうかを調べた。細胞溶解物をPh1陽性白血病細胞系、K56 2、MEG-01、およびALL-1 Ph1造血細胞系それにRat1繊維芽細胞から調製し、抗AB L pEx4、抗GRB-2または対照抗体との免疫沈降に供した。十分な洗浄の後、免疫 沈降物をプロテインＡ-セファロースビーズ上に集め、［γ32P］ATPとMnCl2存在 下でin vitroリン酸化に供した。そのような条件はBCR-ABLキナーゼの自己リン 酸化を促進する。反応は30分後に30℃で停止させ、洗浄し、SDS／８％ポリアク リルアミドゲル電気泳動により分析した。32Ｐ標識タンパク質はオートラジオグ ラフィーにより検出した。匹敵する量のBCR-ABLタンパク質を抗GRB-2または抗AB L抗体のいずれかを用いて沈降させた。さらに両形態のBCR-ABL（P210とP185）は 対応するBCR-ABLタンパク質を発現するRat1繊維芽細胞のGRB-2と会合した。 同様に、GRB-2タンパク質との免疫沈降は、BCR-ABLを発現している細胞系の抗 ABL抗体により沈降させることができる。具体的には、細胞溶解物をMEG-01細胞 から調製し、対照（前免疫血清）、抗ABL pEX4抗体および抗GRB-2抗体との免疫 沈降に供した。免疫沈降タンパク質をSDS／12％ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により分離し、ニトロセルロースに移し、抗GRB-2抗体を用いてイムノブロッ トした。結合した抗体は［125Ｉ］プロテインＡを用いて肉眼で確認し、抗GRB-2 と抗ABL免疫沈降物質を含有する両レーンで検出することができた。 BCR-ABLを発現する細胞を35Ｓ-メチオニンで代謝的に標識した後、抗ABL抗体 か抗GRB-2抗体による免疫沈降により、細胞中で利用できるBCR-ABLキナーゼの50 ％〜90％が上記の結果と一致してGRB-2と複合体を形成する。興味あることに、G RB-2と発がん性v-ablキナーゼとの会合は観察されなかった。これらの実験から 、GRB-2アダプタータンパク質は両形態のBCR-ABLチロシンキナーゼと安定な複合 体を形成するが、v-ablキナーゼとは複合体を形成しないこと、およびBCR-ABL／ GRB-2複合体はBCR-ABLのin vitroリン酸化後そのままの状態にあることが分かっ た。 ６．２．２．BCR-ABLはIN VITROでGRB-2と結合する BCR-ABLとGRB-2との会合の分子的基礎を調べるために、全長GRB-2 cDNA配列を pGEX-2Tにクローン化して細菌中でグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（GST） 融合タンパク質として発現させた。GST-GRB-2タンパク質を精製して、in vitro でBCR-ABLと結合する能力について調べた。具体的には、P185 BCR-ABL組換えバ キュロウイルスで感染させたSf9昆虫細胞の分解物からの35Ｓメチオニン標識タ ンパク質を、プロテインＡ-セファロースビーズに結合させた等量の固定化GSTの み、GST-GRB-2全長、GSTアミノ末端、GRB-2 SH3ドメイン、GST-GRB-2 SH2ドメイ ンGST カルボキシ末端、GRB-2 SH3ドメインおよび抗ABL抗体とともにインキュベ ートした。90分間、４℃でのインキュベーション後、ビーズをインキュベーショ ン緩衝液で４回、RIPA緩衝液で２回洗浄して、結合していない物質を除去した。 結合したタンパク質はSDS／７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、フ ルオログラフィーで検出した。バキュロウイルス感染の昆虫細胞中に発現された P185 BCR-ABLは、グルタチオンセファロースビーズ上に固定化された全長GRB-2 に結合することが分かった。GSTのみへの結合は検出されなかった。BCR-ABLとGS T-GRB-2との複合体は、SDSとデオキコール酸塩洗浄剤を含有する緩衝液での洗浄 後も、もとのままの状態にあった。 どのGRB-2ドメインがBCR-ABLと結合するのかを同定するために、単離されたGR B-2 SH3ドメインとSH2ドメインを有するGST融合タンパク質を調製した。BCR-ABL 結合はGST-GRB-2 SH2融合タンパク質と結合した。GRB-2のアミノ末端とカルボキ シ末端のSH3ドメインを有するGST融合タンパク質もバキュロウイルス産生BCR-AB Lタンパク質とin vitroで結合した。GRB-2のSH2とSH3のドメインとBCR-ABLとの 相互作用はSDSとデオキシコール酸塩を含有する緩衝液での洗浄に抗するもので あった。BCR-ABLをジャガイモ酸性ホスファターゼで処理することにより、GRB-2 SH2ドメインと会合するその能力は完全に取り除かれたが、GRB-2 SH3ドメイン へのその結合が影響されることはなかった。 ７．実施例： SH2を仲介とするGRB-2のBCR-ABLへの結合に必要なBCR-ABL配列 本節に紹介する実施例において、GRB-2 SH2ドメインを経るBCR-ABL/GRB-2結合 に必要なアミノ酸配列を調べる。具体的には、結合はTyr-リン酸化アミノ酸残基 の存在を必要とすることが示され、さらにBCRの第一エキソン変異はSH2を仲介と するBCR/GRB-2結合を消滅させることができることが示される。 ７．１．材料と方法 本実施例で紹介する実験に用いられた材料と技術は上記の第６．１節に記載し た通りである。 ７．２．結果 ７．２．１．SH2を仲介とするGRB-2のBCR-ABLへの結合はBCR配列のチロシンリン 酸化を必要とする BCR-ABLのどの領域がGRB-2結合に関与しているかを同定するために、バキュロ ウイルスに感染させた昆虫細胞でBCRとABL配列を別々に発現させ、全長GRB-2な らびに単離されたGRB-2 SH2及びSH3ドメインに結合するそれらの能力について調 べた。バキュロウイルスの産生したcABLは全長GRB-2にin vitroで結合したが、G RB-2 SH2ドメインだけでは結合しなかった。具体的には、Sf9昆虫細胞を単独でc ABL組換えバキュロウイルスに感染させた。感染の３日後に細胞を35Ｓ-メチオニ ンで標識した。標識細胞を溶解させ、溶解タンパク質を、プロテインＡ-セファ ロースビーズの存在下で、GSTのみ、GST-GRB-2全長、GST-GRB-2アミノSH3、GST- GRB-2 SH2、GST-GRB-2カルボキシSH3、および対応する抗ABL抗体とインキュベー トした。90分間４℃でのインキュベーション後、ビーズをインキュベーション緩 衝液で４回、RIPA緩衝液で２回洗浄した。結合したタンパク質をSDS／10％ポリ アクリルアミドゲル電気泳動で分析し、フルオログラフィーで検出した。昆虫 細胞中で過剰発現したcABLはチロシン残基上でリン酸化されている（Pendergast et al.，1991,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 5927-5931）。よって、バキュ ロウイルス産生cABLタンパク質に対してGRB-2 SH2ドメインが結合不能なのはチ ロシンリン酸化の欠如によるものではなかった。 in vitroでのcABLのGRB-2への結合は、GRB-2のアミノ末端とカルボキシ末端の SH3ドメインのみを経て仲介されているようである。SH3ドメインはプロリンに富 む特定の部分に結合する（Cicchetti et al.，1992，Science 257:803-806; Re n et al.，1993,Science 259:1157-1161）。最近、Sos1のカルボキシ末端領域に 存在するプロリンに富む配列（PPPVPPR）とGRB-2 SH3ドメインとの直接の相互作 用により、GRB-2はSos1グアニンヌクレオチド交換体に結合することが示されて いる（Li et al.，1993,Nature 363:85-87; Rozakis-Adcock et al.，1993，Nat ure 363 :83-85）。cABLのカルボキシ末端はプロリンに富むいくつかの伸長部分 を含有する。しかし、PPPVPPR配列はcABLタンパク質に見られない。in vitro で のGRB-2 SH3ドメインのcABLへの結合は、cABLカルボキシ末端ドメインの大部分 を欠くcABL欠失変異タンパク質において著しく減少しているが、完全にはなくな ってはいない。後記する通り、タンパク質溶解物からの免疫沈降後の通常のcABL とGRB-2との検出可能な会合の欠如とともに、これらのデータから、in vitro で 観察されるcABL／GRB-2相互作用は特異的なものではなく、in vivoで起こらない ことが示唆される。しかし、cABL中のプロリンに富むドメインは他のSH3ドメイ ンの結合部位として働くことが可能である。 in vitroでのGRB-2の全長または単離されたドメインへのcBCRの結合の同様な 分析から、全長GRB-2のみが、およびそれよりも少ない程度でGRB-2のＮ末端SH3 ドメインが、in vitroでcBCRに結合することが明らかとなった。具体的には、Sf 9昆虫細胞を単独でcBCR組換えバキュロウイルスに感染させ、次にcABL組換えバ キュロウイルスで既に記載のように処理した。興味深いことに、GRB-2のSH2ドメ インへのcBCRの結合は検出されなかった。 in vitroでGRB-2 SH2ドメインがcABLとcBCRにまったく結合しないことは、こ のドメインのキメラBCR-ABLチロシンキナーゼへの強い結合とは対照的である。c BCR配列のリン酸化状態は、BCR-ABLキメラとは全長cBCRタンパク質の点において 異なる。cBCRタンパク質は、昆虫細胞での過剰発現後でさえ調べられたすべての 種類の細胞のセリン／スレオニン残基においてのみリン酸化されているだけであ る（Timmons et al.，1989，Oncogene 4:559-567; Pendergast et al.，1991，C ell 66 : 161-171）。対照的に、BCR-ABLキメラにおいて、活性化ABLキナーゼはB CR の第一エキソン配列をチロシン上でリン酸化する（Liu et al.，1993，Oncog ne 8 : 101-109）。BCR配列のチロシンリン酸化が、単離されたGRB-2 SH2ドメイ ンへの結合の原因となっているかどうかを評価するために、全長cBCRとcABLのタ ンパク質をコードするバキュロウイルスを昆虫細胞に共感染させた。具体的には 、Sf9昆虫細胞にcABLとcBCRの組換えバキュロウイルスを共感染させ、cABL組換 えバキュロウイルスについて既に記載したように処理した。cABLチロシンキナー ゼによるcBCRのトランス−リン酸化の結果、GRB-2 SH2ドメインはcBCRに結合し た。抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットにより、cABLバキュロウ イルスとcBCRバキュロウイルスを共感染させたSf9細胞中でcBCRはチロシンのリ ン酸化を受けた。GRB-2の単離されたアミノ末端またはカルボキシ末端のSH3ドメ インへのcBCRの低いレベルのin vitro結合も検出された。これらの結果から、BC R配列へのGRB-2 SH2ドメインの結合はチロシンリン酸化が必要であることが示さ れた。 ７．２．２．GRB-2はIN VIVOでBCR-ABL配列と相互作用を行なうが、CABLとCBCR 配列とは相互作用を行なわない GRB-2のcABLとcBCRへのin vitro結合がin vivoでも起こっているのかどうかを 調べるために、対応するｃＤＮＡの発現構築物をCOS細胞に移入した。これらの ｃＤＮＡのトランスフェクションの結果、cABLとcBCRの発現は対応する内因性タ ンパク質レベルを超えて約50〜200倍に増加する（Pendergast et al.，1991,Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 88 :5927-5931）。これらの条件下で、cABLは認知でき る量でGRB-2と共免疫沈降することはなかった。同様に、GRB-2とBCR配列との相 互作用は、COS細胞でのP210 BCR-ABLキメラに保持されたBCR配列の過剰発現後に 検出することはできなかった。対照的に、顕著な量のP185 BCR-ABLが同じ実験で 抗GRB-2抗体により沈降した。 具体的には、pSRαベクター中にクローン化したcABL cDNAおよびP185野生型を COS細胞に移入した。このトランスフェクションの３日後に細胞を溶解させ、溶 解物を２時間、４℃で通常のウサギ血清、抗ABL 2/3抗体および抗GRB-2抗体とと もにインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡビーズ上に集め、インキュ ベーション緩衝液で６回洗浄した。結合したタンパク質をSDS／８％ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、フィルターを抗 ABLマウスモノクローナル抗体とともにインキュベートした。免疫反応性バンド は増強化学発光（ECL）検出システム（Amersham）を用いて肉眼で確認した。さ らに、pSRγベクター中にクローン化したＢＣＲ（△872-1271）ｃＤＮＡをCOS細 胞に移入した。この感染の３日後に細胞を溶解させ、溶解物を対照血清、抗BCR 抗体または抗GRB-2抗体とともに２時間４℃でインキュベートした。免疫沈降物 をプロテインＡ−セファロースビーズで集め、インキュベーション緩衝液で４回 洗浄し、50 mM Tris-HCl、pH 7.0で２回洗浄し、次にγ-32P ATPとMnCl2存在下 でin vitroリン酸化に供した。タンパク質はSDS／８％ポリアクリルアミドゲル 電気泳動とオートラジオグラフィーにより分析した。 これらのデータは、通常の細胞からの抗GRB-2免疫沈降物中の検出可能な内因 性cABLとcBCRタンパク質の欠如とともに、cABL/GRB-2とcBCR/GRB-2複合体はin v ivoでは観察されないとの主張を支持するものである。これらの知見から、BCR-A BLキメラはそのBCRおよびABLタンパク質配列成分から識別できる新規なタンパク 質結合性を示すことが実証された。 ７．２．３．BCRの第一エキソンの点変異はGRB SH2ドメインのBCRへの結合を消 滅させる 特定のチロシンリン酸化タンパク質へのSH2ドメインの結合は、リン酸化チロ シンに対する一次配列Ｃ末端に依存する（Fanti et al.，1992，Cell 69:413-42 3; Kashishian et al.，1992，EMBO J．11:1373-1382; Sonyang et al.，1993，Cell 72 :767-778）。BCRの第一エクソン内の11の潜在的チロシンリン酸化部位の まわりの配列を調べることにより、チロシン177がCRB-2 SH2ドメインの最適結合 部位に対応する配列YVNV内に見られることが明らかとなった（Sonyang et al.， 1993，Cell 72:767-778; Skolnik et al.，1993,EMBO J．12:1929-1936）。BCR の第一エクソン中の他の10個のチロシンのまわりの配列は、GRB-2 SH2ドメイン または調べられた他のSH2ドメインの最適結合部位と一致しない（Sonyang et al .，1993，Cell 72:767-778）。BCR-ABLをGRB-2 SH2ドメインに結合させるために チロシン177が必要であるかどうかを決定するために、部位特異的変異によりBCR -ABL中のチロシン177をフェニルアラニンに置換し、この変異タンパク質を昆虫 細胞で発現させ、GRB-2に対する結合について調べた。in vitro自己リン酸化後 のP185（Y177F）変異タンパク質とP185野生型タンパク質とのホスホペプチドマ ップのパターンの比較から、P185（Y177F）では少なくとも一つの主要なホスホ ペプチドの欠如が明らかとなった。具体的には、pSRαMSVtkneoベクターにクロ ーン化したP185野生型とP185（Y177F）をCOS細胞に移入した。このトランスフェ クションの３日後に、細胞を溶解させ、溶解物を抗ABL抗体とともにインキュベ ートした。免疫沈降物をγ-32P ATPとMnCl2存在下でin vitro自己リン酸化に供 した。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ニトロ セルロースに移し、ホスホペプチドマップ作製に供した。 結合の研究により、野生型P185 BCR-ABLとは対照的に、BCRの第一エクソン中 のチロシン177をフェニルアラニンで置換したP185 BCR-ABL（Y177F）変異タンパ ク質は、in vitroでGRB-2 SH2ドメインと相互作用しないことが示された。具体 的には、Sf9昆虫細胞に、pAcC12ベクターを用いてクローン化した野生型P185 BC R-ABL cDNAと野生型バキュロウイルスＤＮＡを共に移入するか、またはpAcC12ベ クター中にクローン化したP185 BCR-ABL（Y177F）ｃＤＮＡと野生型バキュロウ イルスＤＮＡを共に移入した。このトランスフェクションの６日後、細胞を、35 Ｓ- メチオニンで代謝を通して標識した。細胞を溶解し、溶解物をGST-GRB-2SH2 または抗ABL pEX4抗体とともにプロテインＡ-セファロースビーズの存在下でイ ンキュベートした。結合したタンパク質はSDS／７％ポリアクリルアミドゲル電 気泳動とフルオログラフィーにより分析した。 次に、in vivoでGRB-2と相互作用するP185 BCR-ABL（Y117F）変異体の能力を 評価した。P185（Y117F）は、変異タンパク質を安定に発現するCOS細胞またはRa t1繊維芽細胞で過剰発現されたときに内因性GRB-2と相互作用を行なわなかった 。同様に、チロシン177を欠くBCR-ABL欠失変異体はGRB-2に結合しなかった。具 体的には、pSRα MSVtkneoベクター中にクローン化したP185野生型とP185（Y177 F ）のｃＤＮＡをCOS細胞に移入した。このトランスフェクションの３日後、細胞 を溶解させ、溶解物を通常のウサギ血清（NRS）、抗ABL 2/3抗体、または抗GRB- 2抗体とともに２時間、４℃でインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡ- セファロースビーズ上に集め、［γ32P］ATPとMnCl2存在下でのin vitroリン酸 化に供した。タンパク質をSDS 10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラ ジオグラフィーにより分析した。さらに、P185野生型とP185（Y177F）を発現す るG418選択Rat1細胞の溶解物を、抗GRB-2抗体、抗ABL2/3抗体または通常のウサ ギ血清とともに２時間、４℃でインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡ - セファロースビーズ上に集めた。結合したタンパク質をSDS 10％ポリアクリル アミドゲル電気泳動およびその後の抗ABLマウスモノクローナル抗体によるイム ノブロットにより分析した。免疫反応性バンドはECL検出システム（Amersham） で肉眼で確認した。 これらのデータから、BCR-ABLとGRB-2とのin vivoでの相互作用は、BCR-ABL中 のリン酸化チロシン177へのGRB-2 SH2ドメインの結合により仲介されていること が示された。GRB-2 SH3ドメインは、全長GRB-2とBCR-ABLとの間のin vivo結合に 明らかに寄与していない。 8. 実施例：GBR-2結合を欠損しているBCR-ABLタンパク質 はトランスフォーメーション能力の減少を呈する この実施例に示すデータにより、BCR-ABL細胞内PTKのトランスフォーメーショ ンポテンシャルは、タンパク質のアダプターファミリーのGRBサブファミリーのG RB-2 へのこのPTK の結合に依存していることが示される。この結果により、こ のようなPTK へのアダプタータンパク質の結合がトランスフォーメーション／発 がん過程における１つのステップとして関与していることを表している。 8.1. 材料および方法 8.1.1 トランスフォーメーションアッセイ Rat 1 繊維芽細胞の感染を前記のように実施した（Lugoら，1989，Mol．Cell ．Biol ．9:1263-1270）。力価は、繊維芽細胞への遺伝子転移の頻度により測定 した場合、ml当たりの感染粒子が＞105の範囲である。半固体培地でRat 1 コロ ニー形成を、15％子牛胎児血清および0.4％ノーブル(Noble)寒天を補給した、Is cove 5ml中の６-cm2皿当たり５×104個の細胞を塗布して測定した（Lugoら，198 9，Mol．Cell．Biol．9:1263-1270）。G418-耐性集団を感染細胞をG518(0.5mg/m l)で12〜15日間培養して樹立した。選択した後、G418-耐性培養物の細胞をml当 たり104個の細胞の濃度で寒天に塗布した。寒天に形成したコロニーの数を細胞 塗布の２週間後に記録した。 新たに単離したマウス骨髄からの造血細胞培養物の感染および樹立を前記のよ うに実施した(McLaughlinら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:6558-6562 )。簡単には、４〜６週令雌BALB/cマウスからの骨髄成分を、ml当たりPolybrene ４μg を補給した適切なレトロウイルス原液にml当たり２×106個の細胞で再懸 濁した。細胞を37℃で４時間インキュベートした。感染後、細胞を洗浄しそして ５％子牛胎児血清および50μM β−メルカプトエタノールを補給したRPMI 1640 培地に再懸濁した。ml当たり106個の細胞の濃度で細胞懸濁液５mlを各６cm2皿に 塗布した。培養物を８週間まで維持し、新鮮な培地を１週間に１度添加した。非 粘着性造血細胞の濃度がml当たり106個を越える場合に、培養物が形質転換した と考えた。 8.1.2. 種々の方法 セクション8.1.1 に記載したトランスフォーメーションアッセイとは別の技術 は上記のセクション6.1 に記載されているものである。 8.2. 結 果 BCR-ABL-誘導発がん誘発に対するGRB-2 結合の生物学的関連性を測定するため に、BCR-ABL が繊維芽細胞および造血細胞をトランスフォームする能力に対する 、GRB-2 と会合するのに必要な突然変異チロシン-177の影響を調べた。ヘルパー フリーの野生型のレトロウイルス原液および突然変異BCR-ABL 型を使用してRat 1 繊維芽細胞および新たに単離したマウス骨髄細胞に感染させた。GRB 2 および hSos-1の両者ともこれらの細胞型で発現することが示された（Lowensteinら，19 92，Cell．70:431-442; Bowtellら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．89:65 11-6515; Chardin ら，1993，Science 260:1338-1343）。Rat 1 繊維芽細胞のト ランスフォーメーションを軟寒天でのコロニー形成により検定した（Lugoら，19 89，Mol．Cell．Biol．9:1263-1270）。造血細胞トランスフォーメーションをpr e-B-リンパ球の成長を支持する条件下で感染マウス骨髄細胞を培養することによ り検定した（McLaughlinら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．84:6558-6562 ）。野生型BCR-ABL と対照的に、P185(Y177F)タンパク質は造血細胞を形質転換 せず、Rat 1 細胞を形質転換する能力の減少を示した（下の表１を参照されたい ）。これらの結果は、Y177を欠失しているP185(Δ176-426)突然変異体がRat 1 繊維芽細胞および造血細胞の両者でトランスフォーミング活性の減少を呈すると いう以前の観察と一致する（Mullerら，1991，Mol．Cell．Biol．11:1785-1792; 表１）。P185(Δ176-426)はP185(Y177F)より、特にG418選択の後でRat 1 繊維 芽細胞のトランスフォーメーションにおいてさらに顕著な欠失を示す。BCR 第一 エクソンのY177の下流にある配列はホスホセリン／ホスホトレオニン依存形式で SH2-ドメインに結合していることが示された（Peudergastら，1991，Cell66:161 -171; Mullerら，1991，Mol．Cell．Biol．11:1785-1792）。２種のSH2-結合部 位がこの領域内で同定され（ＡおよびＢと名付けられた）、そしてこれらの部位 の除去により繊維芽細胞のBCR-ABL-媒介トランスフォーメーションにとって重要 な特異的タンパク質相互作用を停止できるであろう。P185(Y177F)および P185(Δ176-426)の両者とも造血細胞でトランスフォーミング活性を示さなかっ た。BCR-ABL タンパク質の形質転換活性における差異はタンパク質発現のレベル 差によるものではなかった。 種々のBCR-ABL 型を発現する細胞の溶解物のウェスタンブロット分析により、 相当するレトロウイルスでRat 1 繊維芽細胞を感染後の、比較できる定常的なタ ンパク質の値が示された。ウェスタンブロット分析では、RAT 1 細胞を、P185BC R-ABC の野生型および突然変異体(Y177F)型またはコントロールベクターをコー ドするレトロウイルスで感染させた。感染３日後に、細胞を溶解し、そして抗-A BLマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法を実施した。免疫反 応帯をECL検出系（Amersham）を用いて可視化した。 9. 実施例：ras 反応性エレメントプロモーターからの ras 依存的なBCR-ABL 活性の転写 本節に記した実施例において BCR-ABL細胞内PTK/GRB-2 結合は rasシグナル伝 達経路を活性化することが示されている。 9.1. 材料と方法 9.1.1. 転写活性化アッセイ ras 反応性エレメント(ets/AP-1)プロモーターからの発現の転写活性化は本質 的には既述の方法に従った（Clark ら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 4887-4891; Hauserら，1993，Methods in Enzymology，印刷中）。簡単に記せば 、NIH 3T3 細胞を１μg のpB4X-CATクロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼレポータープラスミド(Wasylykら，1989，Mol．Cell．Biol. 9:2247-2250 )及び５μg のpZIP H-ras(17N)(Feigら，1988，Mol．Cell．Biol. 8:3235-3243) の存在または不在下で明示したBCR-ABL 変異体を含有する0.5μg の pSRαMSVTk neoを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションは60mmの皿を用いて ２通りずつ行い、細胞は48時間後に採取した。250mM トリス塩酸（pH7.8）100μ l 中で凍結融解して細胞を溶解した後、遠心して細胞の破片を取り除き、上清を 62℃で加熱して内在性のアシルトランスフェラーゼを変性させた。さらに遠心し た後、上清を50μl ずつ取り、0.1 μCiの14C クロラムフェニコール(NEN)及び2 50mM トリス塩酸中に0.34mMアセチルCoA を含む液で最終反応容量を140μl とし て45分間インキュベートし、CAT 活性を測定した。反応は500μl の酢酸エチル 抽出によって終わらせ、真空下で蒸発させ、残存したペレットを再溶解し、シリ カゲルプレートで薄層クロマトグラフィーをおこなった。溶剤としては、５％メ タノール／95％クロロホルム(v/v)を用いた。AMBIS ベータスキャナーで定量し た。 9.1.2. その他の技法 第8.1.1 節に記載したトランスフォーメーションアッセイ以外の技法について は、上記の第6.1節に記載したとおりである。 9.2. 結 果 GRB-2のBCR-ABLとの結合が発癌性の形質転換を可能とする作用機作は、Sos -1グアニンヌクレオチド交換因子を経由して rasを直接的に刺激することによる ものである。BCR-ABLとGRB-2との相互作用が、ras経路に直接的に作用するか否 かを調べるため、転写活性化アッセイを行った。発癌性のras は ras反応性エレ メント（例えば、ets-1 及びAP-1 ＤＮＡモチーフ；Hauserら，1993，Methods i n Enzymology ，印刷中）からの転写率を増加させる。さらに、プロテインチロシ ンキナーゼおよびセリン／トレオニンキナーゼを含む広範な機能を有するガン遺 伝子は、ras 反応性エレメント、例えば ets/AP-1 モチーフを有するプロモータ ーからの転写を活性化しうる（Schweighofferら，1992，Science．256:825-827 ）。各種のガン遺伝子の ets/AP-1 含有プロモーターからの転写活性化能と細胞 形質転換能との間には相関関係がある(Wasylykら，1988，EMBO．J. 7:2475-2483 )。上述のとおり、トランス活性化アッセイは、ガン遺伝子機能の分析のための 細胞増殖及び腫瘍原性研究を補完するものである。 BCR-ABL の野生型と変異型について、ets/AP-1 からの転写活性化能を比較し た。CAT レポーターはβ−グロビンプロモーターの制御下にあり、４個の縦列の ras反応性エレメントを有している（pB4X-CAT）。発癌性の rasはこのエレメン トからの転写率を15倍増加させることが示されている（Schweighoffer,Science, 256:825-827）。図１に示すとおり、野生型BCR-ABL で誘導した活性化は、ras( 17N)、これは最も強力な阻害性の変異体で、ras 機能を中和することが示されて いるものであるが（Feigら，1988，Mol．Cell．Biol.，8:3235-3243; Thomasら ，1992，Cell，68:1031-1040; Woodら，1992，Cell，68:1041-1050）この ras(1 7N)のコトランスフェクションによって消失する。このことは、BCR-ABL によっ て誘導された転写活性化が rasによって媒介されることを示している。BCR-ABL 変異体のP185(Y177F)及び P185(Δ176-425)はGRB-2 結合を欠いているが、それ らの変異体はこのプロモーターからの転写トランス活性化にほとんど影響を及ぼ さないことは意義深いことである。これらの BCR-ABL変異体で示された低いレベ ルのトランス活性化は、これらの変異体が野生型P185 BCR-ABLに比し低い形質転 換能を有することと相関している（上記の表１参照）。 さらに、野生型 BCR-ABL含有レトロウイルスをRat 1 の繊維芽細胞に感染させ るとras-GTP 画分が増加する。すなわち、Rat 1 細胞にP185 BCR-ABL野生型のヘ ルパーフリーレトロウイルス又はベクター（対照）を感染させた。感染の２日後 に、リン酸塩不含の培地で32P-オルトリン酸(0.5mCi/ml)で16時間、細胞をラベ ルした。細胞を溶解させ、抗ras モノクローナル抗体でras-免疫沈降させた。ra sに結合したグアニンヌクレオチドは、解離させた後、0.75M KH2PO4（pH3.5）中 のPEI-セルロースプレートで薄層クロマトグラフィーにより分離した。ras に結 合したGDP 及びGTP 量のAMBIS ベータスキャナーによる定量では中程度だが再現 性のある増加を示した。 10. 実施例：シグナル伝達能のないGRB2は形質転換された 細胞の表現型を復帰させる 次の例は、BCR/ABL とGRB2が関与するシグナル伝達経路が分断されると、形質 転換によって生じた表現型が復帰され得ることを示している。シグナル伝達能の ないGRB2変異体の発現が増大すると、Rat 1 細胞のBCR/ABL で誘導された増殖が 復帰する。また、シグナル伝達経路の分断によって、慢性骨髄性白血病患者から 得られた BCR/ABLを発現する細胞（K562細胞）及びPDGFレセプター依存性の形質 転換細胞の増殖も阻害される。 10.1. 材料と方法 GRB2遺伝子の変異体は、Ｎ末端又はＣ末端のどちらかからSH3 ドメインを欠失 することによって構築された。GRB2の完全長型及び末端切断型は、改変pCGNプラ スミドベクター（Tanakaら，Cell，60:375-386，1990）のBamH1 部にPendergast ら、Cell，75:175-183，1993記載の方法で挿入した。このベクターにはヒグロマ イシン抵抗性遺伝子をSV40複製起点の上流に挿入してある。トランスフェクトさ れた構築物からの内在性のGRB2タンパク質を区別するため、インフルエンザウイ ルスのヘマグルチニンエピトープをコードする配列(Pati，U.K.，Gene，114:285 -288，1992)を変異体タンパク質のＮ末端に同じ読み枠で融合させてある。これ と同じ抗原性標識を野生型GRB2遺伝子にも融合させた。 BCR/ABL で形質転換されたRat 1 繊維芽細胞は上記実施例8.1.1 に記載の方法 で確立した。GRB2構築物はRat 1-BCR/ABL細胞系及びラットグリオーム細胞系C6 （ATCC CCL 107）に標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法（Molecu lar Cloning Techniques，Laboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook ら編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,及びMuller）を用いてトランスフェクトした 。トランスフェクト後、Rat 1 細胞を24時間培養し、G418薬剤＋ヒグロマイシン (Sigma)に７−９日間さらした。２種の薬剤によって選択された細胞群を軟寒天 にまき、内在性 BCR/ABL，GRB2，トランスフェクトされたGRB2のレベルをウエス タンブロットで測定した。相異なるGRB2構築物を発現している個々のクローン由 来の細胞系も確立した。トランスフェクトされたC6細胞の場合には、Muller（上 述参照）の方法に従ってヒグロマイシン含有培地で10日間培養することにより、 細胞を選択した。薬剤による選択の後、細胞を0.5％ FCSとPDGF(１ng/ml)を含有 する軟寒天培地にまいた。10日目に0.4mmより大きいコロニー数を数えた。 GRB2構築物の発現は、Pendergastら，Cell．75:175-185，1993の方法に従って 免疫沈降反応で調べた。簡単に記せば、BCR/ABL-GRB2を発現しているRat 1 細胞 を溶解させ、抗ABL pEx4抗体で免疫沈降反応させ、免疫沈降物をin vitroオート キナーゼアッセイにかけた（Pendergastら，上述参照）。サンプルは、SDS-PAGE ゲルで分析し、オートラジオグラフィーで目視可能なものとした。２つ目の実験 においては、細胞を10mMトリス塩酸(pH7.4)、１％ SDS、１mM PMSF 中で溶解し 、各サンプルからの15μg のタンパク質をSDS-PAGE（15％）を用いて分離した。 得られたタンパク質は、電気泳動でニトロセルロースフィルターに移し、抗GRB2 マウスモノクローナル抗体（Trandsduction Laboratories）で免疫ブロットした 後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスモノクローナル 抗体(Bio Rad)とインキュベートした。タンパク質はEnhanced Chemiluminescenc e検出システム（Amersham）で目視可能とした。 軟寒天アッセイは既述の方法（Lugoら，Mol．Cell．Bio.，9:1263-1270）に従 って行った。薬剤によって選択された細胞群は、それぞれの細胞型のクローニン グ効率によって103〜５×104個/６cm2皿の範囲の密度でプレートした。サンプル は20％ウシ胎児血清を含有する培地に２通りずつまいた。肉眼で見えるコロニー （0.4mm より大）を14日後に数えた。データはトランスフェクトされ、薬剤で選 択された細胞群について行った３ないし５回の独立した実験でのコロニー数の平 均を示している。Rat 1-BCR/ABL の増殖に関するデータは、適当な構築物 でトランスフェクトした３つの独立したRat 1-BCR/ABL のクローンからの細胞系 についてそれぞれ２〜３回の別の実験を繰り返して得たものである。上記のとお り、このデータは７つの独立した実験で観察されたコロニー数の平均を示してい る。 K562（ATCC CRL 243）細胞は標準的なエレクトロポレーション法を用いて、GR B2構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトした後、18〜24時間培養し 、ヒグロマイシン(500μg/ml)に２日間さらした。薬剤による選択後、生細胞数 はトリパンブルー染色されない細胞数を数えることによって決定した。軟寒天に 同数の生細胞をまいた。 10.2. 結 果 10.2.1. Rat 1 細胞におけるGRB2の発現 Rat 1-BCR/ABL 細胞での GRB2 Ｎ末端変異タンパク質の発現は、正常な表現型 への復帰をひきおこす。GRB2 Ｎ末端変異体を発現する細胞群は液体培養で単層 をなし、集密状態に達すると接触阻害を示した。GRB2 Ｎ末端変異体を発現するR at 1-BCR/ABL 細胞は、空のベクターを発現している細胞と比較すると、軟寒天 中にコロニーを形成する能力がはるかに低いことは重要である（表２参照）。GR B2Ｃ末端変異体を発現する細胞は液体培養で単層をなすが、集密状態になっても 休止しなかった。GRB2 Ｃ末端変異体を発現するRat 1 -BCR/ABL繊維芽細胞の軟 寒天中での増殖は、GRB2 Ｎ末端変異体で見られた程ではないが抑制された。Ｎ 末端変異体及びＣ末端変異体を発現する細胞群には変異型タンパク質と野生型GR B2タンパク質の類似した比が示されているので、Ｎ末端変異体がBCR/ABL によっ て誘導される形質転換をより強く抑制することは単に２種の変異体のレベルの差 によるものではないであろう。詳細には、p210 BCR-ABLのみ、あるいはさらに野 生型GRB2又は末端切断型GRB2を共に発現しているRat 1 細胞を溶解し、抗ABL 抗 体と免疫沈降反応をさせた。沈降反応生成物をin vitroオートキナーゼアッセイ し、サンプルはSDS-PAGE（８％ゲル）で分析した。対照に比しGRB-2 発現の増大 している細胞においてもABL キナーゼ活性に変化は認められなかった。さらにp2 10 BCR- ABL のみ、あるいはさらに野生型GRB2又は末端切断型GRB-2 を共に発現 しているRat 1 細胞を溶解させ、１つのクローンの細胞溶解物から得たタンパク 質を電気泳動でニトロセルロースフィルターに移し、抗GRB-2 モノクローナル抗 体を用いて免疫ブロットした。GTB-2 形質転換体はすべてほぼ同程度のGRB2タン パク質を発現した。これらの相異はむしろ２つの SH3ドメインがSOS と異なる親 和性で結合するか、あるいは異なる基質と結合することを示しているのかもしれ ない。このようにGRB-2 の SH3欠失変異タンパク質は、細胞中で内在性の野生型 GRB2と等モル量又はより多量に存在する場合、BCR/ABL によって誘導される形質 転換の主たる負の阻害剤となる。 Ｎ’末端又はＣ’末端GRB2変異体と対照的に、Rat 1-BCR/ABL 繊維芽細胞中で 野生型GRB2の発現が増大した場合は、形質転換された表現型をより目立たせると 考えられる。トランスフェクトされた野生型GRB2構築物を発現している、薬剤に よって選択された細胞群は、空のベクターでトランスフェクトされた細胞と比較 すると軟寒天中のコロニー数が常に25〜30％多かった（表２）。これらのデータ は、Rat 1 繊維芽細胞のBCR/ABL によって誘導される形質転換においてGRB2タン パク質が制限エフェクターである可能性を示唆している。 10.2.2. K562細胞でのBRB2変異体の発現 GRB2の SH3部分の変異体はヒト白血病細胞の増殖も阻害する。GRB2構築物をK5 62細胞に導入した。K562細胞は、p210 BCR/ABLを発現している細胞で芽球発症の 慢性骨髄性白血病患者から確立した系である。トランスフェクション及び48時間 薬剤選択を行った後、内在性のBCR/ABL，GRB2 及びトランスフェクトされたGRB2 のレベルをウエスタンブロット法で求めた。同時に生細胞を軟寒天にまいた。 GRB2 Ｎ末端変異体タンパク質を発現しているK562細胞の培養では、空のもの を トランスフェクトした対照に比べ、軟寒天中のコロニー数が1/10であった（表２ ）。Rat 1-BCR/ABL 繊維芽細胞で認められたと同様に、GRB2 Ｃ末端変異体もK56 2のコロニー形成を阻害したが、その程度はＮ末端変異体より低かった。これら のデータは、GRB2によって媒介されるシグナル伝達が、BCR/ABL によって引き起 こされるヒトの悪性腫瘍発生において重要不可欠な要素であることを示唆してい る。 10.2.3. C6グリオーム細胞でのGRB2の発現 GRB2構築物をラットC6グリオーム細胞にも導入した。C6グリオーム細胞の形質 転換された増殖性の表現型はPDGF受容体活性依存性である(Zhangら，Neurol．Re s. 14(5):397-401，1992)。PDGF受容体がGRB2と相互作用することは知られてい る（Lowensteinら，1992，Cell 70:431-442）。表２に示すとおり、シグナル伝 達能のないGRB2変異体の発現はコロニー形成を顕著に阻害する。このデータは、 GRB2シグナル伝達の阻害は、受容体チロシンキナーゼ活性化に依存する形質転換 細胞の増殖を阻害するために使用しうることを示している。 11. 実施例：シグナル伝達能のないGRB2はモデル動物での腫瘍増殖を妨げる 本実施例は、シグナル伝達能のないGRB2を発現している細胞は、もはや動物に 腫瘍を形成しえないことを示しており、BCR/ABL シグナル伝達経路の分断によっ て動物のがんを治療しうることを示唆している。 11.1. 材料と方法 GRB2（野生型及び変異型）及びBCR/ABL を発現しているRat 1 細胞は上記第10 .1節に記載の方法で調製した。ヌードマウス（１群４匹）の左側腹部の皮下に、 野生型GRB2、Ｎ末端切断GRB2、Ｃ末端切断GRB2のいずれかとp210 BCR/ABLを共に 発現しているRat 1 細胞を注射した。p210 BCR/ABLのみを発現している細胞（10 0μl 中２×106細胞）は各マウスの右後肢に皮下注射し、その個体における対照 とした。マウスは移植３週間後に屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。 11.2. 結 果 表３に示した結果は、シグナル伝達能のないGRB2タンパク質の発現によってin vivo の腫瘍細胞の増殖が減少することを明瞭に示している。 12. 実施例：ras 活性化に及ぼすシグナル伝達能のないGRB2の影響 本実施例は、ここに記載したシグナル伝達能のないGRB2分子はその形質転換阻 害活性に比例してBCR/ABL によって誘導される ras活性化を阻害することを示し ており、GRB2と下流のシグナル伝達要素（ras 活性化へ導く）との相互作用が分 断されることを示唆している。 12.1. 材料と方法 ras 反応性エレメント（ets/AP-1）プロモーターからの発現の転写活性化は上 記第9.1 節記載の方法で行った。Rat 1 細胞の形質転換、軟寒天アッセイ、免疫 ブロッティング実験は上記第10.1 節記載の方法で行った。 12.2. 結 果 GRB2変異体の増殖阻害効果が、ras 活性化を阻害するためであるか否かを調べ るため、野生型又は変異型GRB2を過剰に発現しているRat 1-BCR/ABL 細胞の溶解 物を調製し、ras 活性化能を調べた。ras 依存性転写活性化アッセイを用いるこ とにより、Ｎ末端変異GRB2を発現しているRat 1-BCR/ABL 細胞の溶解物は、空の ベクターをトランスフェクトをした対照と比較して1/10〜1/15の低いras 活性化 能を示した（図２）。Ｃ末端変異GRB2を発現している細胞の溶解物もＮ末端変異 体で見られた程ではないが ras活性化能の低下を示した。このＮ末端変異体とＣ 末端変異体の阻害効果の差はそれぞれの持つBCR/ABL 形質転換表現型を復帰させ る能力と整合するものであった。 もしGRB2変異体タンパク質がシグナル伝達経路のras より前の中間段階をブロ ックするのであれば、ras 活性化を回避する遺伝子による形質転換は影響を受け ないはずである。この仮説を検証するために、GRB2構築物を、活性型raf で形質 転換したRat 1 細胞にトランスフェクトさせた。raf はセリンキナーゼであり、 同じシグナル伝達経路でras の下流で、マイトジェン作用を示す（Kolch ら，Na ture ．349:426，1991）。ヒグロマイシンで選択した後、細胞群を寒天にまいた 。Ｎ末端又はＣ末端GRB2変異体を発現しているRat 1/v-raf細胞は軟寒天中で空 のベクターでトランスフェクトした対照の細胞と同数のコロニーを形成した（表 ４）。さらに、SH3変異体を野生型GRB2の２倍以上発現している細胞系は、軟寒 天中でのそれ自体の増殖能を阻害しなかった。これらのデータは、GRB2変異タン パク質が、BCR/ABL のマイトジェンシグナルをraf の上流のシグナル伝達経路を 切断することにより阻害することを示唆している。 13. 実施例：GRB2変異体はヒトPh1陽性白血病細胞系K562 の増殖を阻害し、分化を誘導する 下記の実施例において、GRB2のSH3 変異体タンパク質は、BCR/ABLで誘導され る造血系細胞の発がん性表現型を復帰させる能力があるのみならず、K562細胞の 赤血球系への分化をひきおこす能力があることを示している。 13.1. 材料と方法 形質転換アッセイ：軟寒天アッセイは上記の第8.1.1 節記載の方法で行った。 各細胞型のクローニング効率によって103〜５×104個/６cm2皿の範囲の密度で同 数の生細胞を軟寒天中にまいた。サンプルは20％ウシ胎児血清を含有する培地に ２通りずつプレートした。14日後に肉眼で見えるコロニー（>0.4mm）の数を数え た。コロニー数は細胞数が計104となるように調整した。 転写活性化アッセイ： ras反応性エレメント（ets/AP-1）プロモーターからの 発現の転写活性化は既述の方法（Pendergastら，1993）に従って行った。簡単に 記せば、正常Rat 1 細胞及びGRB2タンパク質を発現している形質転換Rat 1/BCR- ABL 細胞とを１μg のpB4x-CATレポータープラスミドでトランクフェクトし、ト ランスフェクションの48時間後に細胞を採取し、CAT 活性を第9.1.1 節記載の方 法で測定した。 結合アッセイ、in vitro自己リン酸化と免疫ブロッティング： in vitroの結合アッセイ、in vitroの〔γ32P〕ATP ラベル及び免疫ブロッテ ィングの方法は本質的には上記の第6.1.6 節及び第6.1.7 節記載のとおりに行っ た。 ヘモグロビンタンパク質の定量：トランスフェクトされたK562細胞群に存在す るヘモグロビン量は本質的にはFeinsteinら，1992，Oncogene 7:1853-1857 に記 載の方法で定量した。簡単に記せば、各細胞群から溶解物を調製し、総タンパク 量をBradfordアッセイ法で求めた。各サンプルについて、20μg の総細胞性タン パク質を90％酢酸中に１％ベンジジンを含む溶液及び新たに調製した過酸化水素 と混合した。室温で20分間インキュベートした後、10％酢酸溶液を加え、515nm の吸光度を測定した。比較対照としてヒトのヘモグロビンを用いた。 腫瘍増殖アッセイ：Rat 1/BCR-ABL 繊維芽細胞の腫瘍形成性について本質的に は、既述の方法(Lugoら，1989，Mol．Cell．Biol. 9:1263-1270)に従って評価し た。簡単に記せば、野生型又は変異GRB2構築物でトランスフェクトしたRat 1/BC R-ABL 繊維芽細胞群から２×106個の細胞を取り、ヌードマウスの左後側腹部に 接種した。その個体での対照として空のベクターでトランスフェクトしたRat 1/ BCR-ABL 細胞を各マウスの右後側腹部に接種した。各Rat 1／BCY-ABL 細胞群あ たり４匹のマウスを用いた。接種３週間後、マウスを屠殺し、左右の側腹部の腫 瘍の大きさを比較し、湿重量（グラム）で記録した。 13.2. 結 果 下記の実験で、GRB2の SH3変異体タンパク質が造血系細胞においてBCR/ABL に よって誘導される発癌性表現型を復帰しうるか否かを評価した。GRB2構築物をPh1 陽性のK562細胞に導入した。トランスフェクション及びヒグロマイシン存在下 で48時間培養後、免疫ブロット法で内在性及びトランスフェクトされたGRB2タン パ ク質を定量した。同時に細胞を液体培地から採取し、生細胞を同数ずつ軟寒天中 にまいた。各実験においてトランスフェクトされたGBR2変異体のレベルは内在性 のGRB2より少なくとも５倍は多かった。GRB2 Ｎ末端切断変異体を発現しているK 562細胞をまいた培養では空のベクターでトランスフェクトした対照に比べ1/10 のコロニー数を示した（上記表２）。Rat 1/BCR-ABL 繊維芽細胞で見られたのと 同様に、GRB2 Ｃ末端切断変異体も、Ｎ末端変異体より程度は低いもののK562の コロニー形成を阻害した（上記 表２）。これらのデータは、GRB2によって媒介 されるBCR-ABL 誘導ras 活性化はBCR-ABL が誘導するヒトの悪性腫瘍発生に重要 不可欠な要素であることを強く示唆する。 K562細胞系は高レベルの野生型GRB2タンパク質を安定に発現しており、培地中 で維持されうるとはいえ、Ｎ末端切断又はＣ末端切断GRB2タンパク質を発現する １つのクローンから由来する細胞系を確立することは不可能であった。K562細胞 は分化能とヘモグロビン合成能を保持している(Anderson，L.C ら，1979，Int.J ．Cancer 23:143-147; Rowley，P.T.ら，1981，Exp．Hematol．9:32-37; Feins tein，E．ら，1992，Oncogene 7:1853-1857)。以前の研究によれば、チロシンキ ナーゼ活性阻害剤はK562細胞を赤血球系へ分化させうることを示していた（Fuka zawa，H.ら，1991，Biochem．Pharm.，42:1661-1671; Anafi，M.ら，1993，Bloo d 82:3524-3529）。 GRB2変異体の発現が同様の分化過程をおこすか否かを調べるため、軟寒天アッ セイに用いたトランスフェクトされたK562細胞の一部を取って溶解させ、ヘモグ ロビンタンパク量を各細胞群毎に定量した。Ｎ末端切断又はＣ末端切断変異体を 発現している細胞ではヘモグロビンタンパク量の劇的な増加が認められた。これ に対し、野生型GRB2タンパク質を高レベルで発現しているK562細胞では、空のベ クターでトランスフェクトした対照と比較してヘモグロビンの増加は認められな かった。このように、ここで用いられたGRB2変異体はBCR/ABL 形質転換表現型を 復帰させるのみならず、K562細胞を赤血球系へ分化させる能力も持っている。こ れらのデータは、BCR-ABL が、部分的に通常の分化を ras依存的にブロックする ことにより、造血系細胞を形質転換しうることを示唆している。 １３．実施例：タンパク質／チロシンキナーゼの相互作用を妨害する化合物を特 定するスクリーニングアッセイ ここに提示する実施例では、試験物質が、結合相手である複合体との相互作用 を阻害するポテンシャルを検定する手段を記載する。こうした結合相手は、たと えば、アダプタータンパク質と、こうしたアダプタータンパク質に結合する分子 、たとえば、活性化されたチロシンキナーゼ分子、ならびに他のタンパク質、た とえばＳＨＣタンパク質を含むものとすることができる。この実施例で特定する 化合物は、細胞の成長制御をモジュレートしうる可能性があり、腫瘍形成ならび に細胞増殖性疾患を調節しうる可能性がある。 ここに記載する特定のアッセイでは、リン酸化したチロシンキナーゼタンパク 質と結合しうるアダプター−ＧＳＴ融合タンパク質を、リン酸化したチロシンキ ナーゼタンパク質を固相に固定化しておいたものとともに、試験物質の存在下で インキュベートする。試験物質が、アダプタータンパク質−ＧＳＴ融合タンパク 質と、チロシンキナーゼ分子との相互作用を阻害しうる場合には、固定化したチ ロシンキナーゼ分子に結合するアダプター−ＧＳＴ融合タンパク質の量が、試験 物質が存在しない場合にチロシンキナーゼ分子に結合するアダプター−ＧＳＴ融 合タンパク質の量と比べて、検出が可能な程度に減少する。 こうした例を、ＧＲＢ−２とＥＧＦ−Ｒとの相互作用を阻害する物質のスクリ ーニングに関して詳しく例示する。しかし、これと同一の原理を、任意のチロシ ンキナーゼタンパク質あるいはチロシンキナーゼのチロシンリン酸化基質（たと えば、ＳＨＣ、ホスファターゼ１Ｄ）と、このものと相互作用しうるアダプター タンパク質との相互作用を阻害する物質を検出する際にも適用することができる 。 アダプター−ＧＳＴ融合タンパク質： ここで使用するアダプター−ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ ）融合タンパク質は、ＧＲＢ−２／ｐＧＥＸ構築物で形質転換した大腸菌での発 現によって産生したＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパク質とした。こうした融合タ ンパク質のＧＲＢ−２部分は、ＧＲＢ−２タンパク質のＳＨ２ドメインのみから 構成されるものとした。形質転換細胞は、アンピシリンを加えたルリアブロス （ＬＢ）中で生育させる。６００nmでのＯＤ（光学濃度）が０．３に達した後、 細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で６時間にわ たって誘導して、融合タンパク質を発現させる。 ６時間の発現期間の後、細胞を沈殿させ、４°Ｃにて１０分間にわたって１０ ，０００×ｇでペレット化し、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再 度懸濁させた。次に、細胞を、超音波処理（６ストローク、５秒／ストローク） によって破壊した。不溶性の物質を、４°Ｃにて１０分間にわたって１０，００ ０×ｇで遠心分離することによって取り除き、得られた上清を、グルタチオン− セファロースカラムに通した。結合したＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパク質を、 ５mMの還元グルタチオンでカラムから溶出させ、ＰＢＳに対して透析した。 固定化したチロシンキナーゼ分子： ここで使用するチロシンキナーゼ分子は、上皮増殖因子受容体チロシンキナー ゼ（ＥＧＦ−Ｒ）である。ＥＧＦ−Ｒは、ＥＧＦ−Ｒを過度に発現している細胞 、たとえばＡ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５５１）細胞系から単離する。細胞 を、ＨＮＴＧ緩衝液（２０mMヘペス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１５０mMＮａＣｌ； １．０％トリトンＸ−１００；５％グリセロール；１mMフェニルメチルスルホニ ルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１mg/Lアプロトニン、１mg/Lロイペプチン；１０mg /Lベンズアミジン）中で溶解する。 ＥＧＦ−Ｒタンパク質を、以下に説明するようにしてマイクロタイタープレー トに固定することによって、細胞溶解産物から単離する。その後、ＥＧＦ−Ｒを 以下に説明するようにしてin vitroでリン酸化する。 ＥＧＦ−Ｒ分子のマイクロタイタープレートへの固定化を行う。マイクロタイ タープレートの調製にあたっては、まず、プレートのウェルを、４°Ｃにて一晩 、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対して誘導された抗ＥＧＦ−Ｒモノクローナル抗 体（ＵＢＩ、♯０５−１０１）（ＰＢＳ中の濃度：最終容量１５０μl／ウェル で、０．５μg／ウェル）でコーティングする。 一晩のコーティングの後、マイクロタイタープレートのウェルからコーティン グ用溶液を取り除き、かわりに、ブロッキング用緩衝液（ドライミルク５％のＰ ＢＳ溶液）を加えて室温で３０分間おき、その後ブロッキング用緩衝液を取り除 き、ウェルをＴＢＳＴ緩衝液（１５０mMＮａＣｌ；５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．２；０．１％トリトンＸ−１００）で４回洗浄する。 ＥＧＦ−Ｒ発現細胞の細胞溶解産物を、各ウェルに、１５０μlのＰＢＳへの 溶液として加え、室温で振とうしながら３０分間インキュベートする。結合しな かったＥＧＦ−Ｒを、ウェルをＴＢＳＴ緩衝液で５回洗浄することによって取り 除く。ウェル１つあたり、約５０−１００ngのＥＧＦ−Ｒタンパク質が結合する 。 内在性ホスファターゼ活性が高い、ＥＧＦ−Ｒを過度に発現する細胞系、たと えばＡ４３１株化細胞を使用することが重要である。これは、細胞溶解及び固定 化抗体とのインキュベーションの間に、ホスファターゼによってリン酸基がＥＧ Ｆ−Ｒ分子から除去され、内在性のアダプタータンパク質、たとえばＧＲＢタン パク質がＥＧＦＲと結合し、場合によって人為的な結果が生じることが防止され るからである。また、使用する細胞系が容易に飢餓化しうるものである場合には 、細胞溶解を行う前に、細胞を飢餓化しておくこともできる。 自己リン酸化ＥＧＦ−Ｒの作成： 以下に記載するin vitroのキナーゼ反応によって、自己リン酸化されたＥＧＦ −Ｒが得られた。キナーゼ反応は、１５μlのＡＴＰ／Ｍｎ2+ミックス（５０mM のＭｎＣｌ2、最終濃度１０μMＡＴＰ、総容量１５０μl）を加えることによっ て開始した。プレートは、室温にて５分間、振盪しつつインキュベートし、上清 を吸引し、次に、プレートをＴＢＳＴで５回洗浄した。 アッセイの手順： ３０ngのＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパク質（すなわち、ＥＧＦ−Ｒ：ＧＲＢ −２タンパク質の比で１：１）、あるいは５ngのＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパ ク質（すなわち、ＥＧＦ−Ｒ：ＧＲＢ−２タンパク質の比で４：１）を、リン酸 化したＥＧＦ−Ｒでコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに、イ ンキュベーション用緩衝液（０．１Mのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５）中 で、室温にて３０分にわたって、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した 試験物質の存在下で加える。対照のウェルは、試験物質を用いずに、ＧＲＢ−２ −ＧＳＴ融合タンパク質とともにインキュベートする。 インキュベーションの後、ウェルをＴＢＳＴで十分に洗浄する。次に、固定化 ＥＧＦ−Ｒと結合したＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパク質の量を、好ましくは融 合タンパク質のＧＳＴ部分に対する精製ウサギ抗血清（AMRAD，オーストラリア 、ニュービクトリア、カタログ番号００００１６０５）を用いて測定する。イン キュベーションは、室温にて３０分間行う。インキュベーションの後、抗体を除 去し、ウェルをＴＢＳＴで十分に洗浄する。次に、結果が目に見えるようにする ために、ウェルを、ＴＡＧＯヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ抗体とともに、室温 にて３０分間インキュベートする。インキュベーションの後、抗体を除去し、ウ ェルを水道水、次にＴＢＳＴで洗浄する。基質溶液であるＡＢＴＳ（２，２’− アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸））／Ｈ2Ｏ2（１０mlのＡ ＢＴＳに対して１．２μl のＨ2Ｏ2）をウェルに加え、室温にて２０分間インキ ュベートする。５ＮＨ2ＳＯ4を加えることによって反応を停止する。４１０nmで のＯＤを各ウェルについて測定する。この方法を用いると、ＧＲＢ−２−ＧＳＴ がバックグラウンドに対して２ngという少量であっても、検出を行うことが可能 である。 また、試験物質とＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパク質をＥＧＦ−Ｒのウェルで インキュベートしてから、ビオチニル化したモノクローナル抗体、たとえばＥＬ −６あるいはＥＬ−１２を使用して、融合タンパク質の結合を検定することもで きる。こうした抗体によって認識されるエピトープは、ＧＲＢ−２のＳＨ２ドメ インに位置しているものの、ＧＲＢ−２のリン酸化ＥＧＦＲとの結合を妨害しな い。次に、これらの抗体の結合を、ストレプトアビジン−ビオチニル化したホー スラディッシュペルオキシダーゼ反応物質を使用して測定する。 さらにまた、試験物質とＧＲＢ−２−ＧＳＴ融合タンパク質をＥＧＦ−Ｒのウ ェルでインキュベートしてから、融合タンパク質の固定化ＥＧＦＲとの結合につ いての検定を、インキュベーション用緩衝液中で１mM１−クロロ−２，４−ジニ トロベンゼン（ＣＤＮＢ）及び１．５４mg/mlの還元グルタチオンとともにイン キュベートすることによって行うこともできる。次に、ＯＤを３４０nmで測定す る。この反応は、ＯＤが１．０となるまで線形であり、競合性のＧＳＴ阻害物質 を用いて、マナービックおよびダニエルソン(Mannervik，B．and Danielson，U ．H.，1988，CRC Critical Reviews in Biochemistry 23: 238)に記載されたよ うににして停止することができる。 本明細書に記載した本発明に、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく数 多くの改変や変更を加えうることは、明らかである。以上で説明した特定の実施 態様は、例として挙げただけであって、本発明は、添付した請求の範囲の用語に よってのみ限定されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 ドューク ユニバーシティー メディカル センター アメリカ合衆国 27708 ノースカロライ ナ州 ダラム，アラン ビルディング 001イー (72)発明者 シュレシンガー，ジョセフ アメリカ合衆国 10011 ニューヨーク州 ニューヨーク，ウエスト，ワシントン スクエア 37番地 (72)発明者 ギシツキー，ミカイル エル. アメリカ合衆国 94301 カリフォルニア 州 パロ アルト，ブライアント ストリ ート 3001 ビー番地 (72)発明者 ペンダーガスト，アン エム. アメリカ合衆国 27707 ノースカロライ ナ州 ダラム，ベイカーズ ミル ロード 5420番地 (72)発明者 アップ，ハラルド アメリカ合衆国 94117 カリフォルニア 州 サン フランシスコ，ベルヴェデレ ストリート 581番地

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力について試験すべき化合 物を同定する方法であって、 (a) 少なくとも１種の化合物を、プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／ アダプターポリペプチド複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドに、該化 合物を該メンバーの機能性部分に結合させるのに十分な時間さらし、 (b) 結合しなかった化合物を取り除き、そして (c) プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合 体のメンバーの機能性部分に結合した化合物の存在を検出し、それによりプロテ インチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体が関与して いる細胞増殖性疾患をモジュレートする能力について試験すべき化合物を同定す る、 ことを含んでなる方法。 ２．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力のある化合物を同定する 方法であって、該化合物をプロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプタ ーポリペプチド複合体に該複合体を破壊させるのに十分な時間さらし、そしてプ ロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体の破壊 を検出する、ことを含んでなる方法。 ３．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドが膜貫通の受容体プロテインチロシ ンキナーゼポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。 ４．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドが細胞内の細胞質プロテインチロシ ンキナーゼポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。 ５．細胞内の細胞質プロテインチロシンキナーゼポリペプチドがＢＣＲ／ＡＢＬ 細胞内の細胞質プロテインチロシンキナーゼポリペプチドである、請求項４に 記載の方法。 ６．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドが細胞内の核プロテインチロシンキ ナーゼポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。 ７．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のアダプターポリペプチドがＧＲＢポリペプチドである、請求項１または２に記 載の方法。 ８．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−２ポリペプチドである、請求項７に記載の方 法。 ９．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−１、ＧＲＢ−４、ＧＲＢ−７またはＧＲＢ− １０ポリペプチドである、請求項７に記載の方法。 10．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドがＢＣＲ／ＡＢＬ細胞内の細胞質プ ロテインチロシンキナーゼポリペプチドであり、プロテインチロシンキナーゼポ リペプチド／アダプターポリペプチド複合体のアダプターポリペプチドがＧＲＢ −２ポリペプチドであり、かくしてプロテインチロシンキナーゼポリペプチド／ アダプターポリペプチド複合体がＢＣＲ／ＡＢＬポリペプチド／アダプターポリ ペプチド複合体となる、請求項１または２に記載の方法。 11．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のメンバーの機能性部分を含むペプチドが少なくとも１個のリン酸化チロシンア ミノ酸残基を有するペプチドを含むものである、請求項１または２に記載の方法 。 12．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のメンバーの機能性部分を含むペプチドがリン酸化ドメインの機能性部分を含む ものである、請求項１または２に記載の方法。 13．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ２ドメインの機能性部分を含むも のである、請求項１または２に記載の方法。 14．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ３ドメインの機能性部分を含むも のである、請求項１または２に記載の方法。 15．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ２結合ドメインの少なくとも４個 の連続したアミノ酸残基を含むものである、請求項１または２に記載の方法。 16．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ３結合ドメインの機能性部分を含 むものである、請求項１または２に記載の方法。 17．ＳＨ３結合ドメインの機能性部分が少なくとも４個のアミノ酸残基の鎖長を 有するものである、請求項16に記載の方法。 18．ＳＨ３結合ドメインの機能性部分が少なくとも10個のアミノ酸残基の鎖長を 有するものである、請求項16に記載の方法。 19．同定された化合物がさらにプロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダ プターポリペプチド複合体を破壊する能力を有する、請求項１または２に記載の 方法。 20．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 を破壊する能力をもつ化合物がさらに、プロテインチロシンキナーゼポリペプチ ド／アダプターポリペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレー トする能力を有する、請求項１または２に記載の方法。 21．同定された化合物がさらにＢＣＲ／ＡＢＬポリペプチド／ＧＲＢ−２ポリペ プチド複合体を破壊する能力を有する、請求項20に記載の方法。 22．ＢＣＲ／ＡＢＬポリペプチド／ＧＲＢ−２ポリペプチド複合体を破壊する能 力を有する化合物がさらに、ＢＣＲ／ＡＢＬポリペプチド／ＧＲＢ−２ポリペプ チド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力を有する、請 求項21に記載の方法。 23．細胞増殖性疾患が慢性骨髄性白血病である、請求項22に記載の方法。 24．細胞増殖性疾患が急性リンパ性白血病である、請求項22に記載の方法。 25．細胞増殖性疾患が急性骨髄性白血病である、請求項22に記載の方法。 26．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力について試験すべ き化合物を同定する方法であって、 (a) 少なくとも１種の化合物を、プロテインチロシンホスファターゼポリペプ チド／アダプターポリペプチド複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドに 、該化合物を該メンバーの機能性部分に結合させるのに十分な時間さらし、 (b) 結合しなかった化合物を取り除き、そして (c) プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチ ド複合体のメンバーの機能性部分に結合した化合物の存在を検出し、それにより プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合 体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力について試験すべき化 合物を同定する、 ことを含んでなる方法。 27．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力のある化合物を同 定する方法であって、該化合物をプロテインチロシンホスファターゼポリペプチ ド／アダプターポリペプチド複合体に該複合体を破壊させるのに十分な時間さら し、そしてプロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペ プチド複合体の破壊を検出する、ことを含んでなる方法。 28．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のプロテインチロシンホスファターゼポリペプチドが膜貫通の受容体プロ テインチロシンホスファターゼポリペプチドである、請求項26または27に記載の 方法。 29．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のプロテインチロシンホスファターゼポリペプチドが細胞内の細胞質プロ テインチロシンホスファターゼポリペプチドである、請求項26または27に記載の 方法。 30．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のアダプターポリペプチドがＧＲＢポリペプチドである、請求項26または 27に記載の方法。 31．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−２ポリペプチドである、請求項30に記載の方 法。 32．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−１、ＧＲＢ−４、ＧＲＢ−７またはＧＲＢ− １０ポリペプチドである、請求項30に記載の方法。 33．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドが少なくとも１個のリン酸化アミ ノ酸残基を有するペプチドを含むものである、請求項26または27に記載の方法。 34．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ２ドメインの機能性部分を 含むものである、請求項26または27に記載の方法。 35．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ３ドメインの機能性部分を 含むものである、請求項26または27に記載の方法。 36．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ２結合ドメインの少なくと も４個の連続したアミノ酸残基を含むものである、請求項26または27に記載の方 法。 37．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のメンバーの機能性部分を含むペプチドがＳＨ３結合ドメインの機能性部 分を含むものである、請求項26または27に記載の方法。 38．ＳＨ３結合ドメインの機能性部分が少なくとも４個のアミノ酸残基の鎖長を 有するものである、請求項37に記載の方法。 39．ＳＨ３結合ドメインの機能性部分が少なくとも10個のアミノ酸残基の鎖長を 有するものである、請求項37に記載の方法。 40．膜貫通の受容体プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリ ペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力について 試験すべき化合物を同定する方法であって、 (a) 該化合物と、受容体チロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペ プチド複合体を形成する能力がある細胞とを、受容体プロテインチロシンキナー ゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体の受容体プロテインチロシンキ ナーゼポリペプチドに該化合物を結合させるのに十分な時間接触させ、 (b) 工程(a)の細胞に存在する受容体プロテインチロシンキナーゼポリペプチ ド／アダプターポリペプチド複合体のレベルを検出し、 (c) 該化合物に接触していない工程(a)のタイプの細胞に存在する受容体プロ テインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体のレベル を検出し、そして (d) 工程(b)で検出された受容体プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／ アダプターポリペプチド複合体のレベルと工程(c)で検出された該レベルとを比 較し、その際、工程(c)で検出された該レベルが工程(b)で検出された該レベルよ り高い場合は、受容体プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポ リペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力につい て試験すべき化合物が同定される、 ことを含んでなる方法。 41．膜貫通の受容体プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプタ ーポリペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする能力に ついて試験すべき化合物を同定する方法であって、 (a) 該化合物と、受容体チロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポ リペプチド複合体を形成する能力がある細胞とを、受容体プロテインチロシンホ スファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体の受容体プロテイン チロシンホスファターゼポリペプチドに該化合物を結合させるのに十分な時間接 触させ、 (b) 工程(a)の細胞に存在する受容体プロテインチロシンホスファターゼポリ ペプチド／アダプターポリペプチド複合体のレベルを検出し、 (c) 該化合物に接触していない工程(a)のタイプの細胞に存在する受容体プロ テインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体の レベルを検出し、そして (d) 工程(b)で検出された受容体プロテインチロシンホスファターゼポリペ プチド／アダプターポリペプチド複合体のレベルと工程(c)で検出された該レベ ルとを比較し、その際、工程(c)で検出された該レベルが工程(b)で検出された該 レベルより高い場合は、受容体プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド ／アダプターポリペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレート する能力について試験すべき化合物が同定される、 ことを含んでなる方法。 42．アダプターポリペプチドがＧＲＢポリペプチドである、請求項40または41に 記載の方法。 43．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−２ポリペプチドである、請求項42に記載の方 法。 44．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−１、ＧＲＢ−４、ＧＲＢ−７またはＧＲＢ− １０ポリペプチドである、請求項42に記載の方法。 45．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする方法であって、プロテインチ ロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体を形成する能力が ある細胞を、細胞増殖性疾患がモジュレートされるように該細胞のプロテインチ ロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体を破壊するのに十 分な量の化合物と接触させる、ことを含んでなる方法。 46．哺乳動物においてプロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポ リペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする方法であっ て、哺乳動物に、細胞増殖性疾患がモジュレートされるようにプロテインチロシ ンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体を破壊するのに十分な 量の化合物を投与する、ことを含んでなる方法。 47．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドが膜貫通の受容体プロテインチロシ ンキナーゼポリペプチドである、請求項45または46に記載の方法。 48．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドが細胞内の細胞質プロテインチロシ ンキナーゼポリペプチドである、請求項45または46に記載の方法。 49．細胞内の細胞質プロテインチロシンキナーゼポリペプチドがＢＣＲ／ＡＢＬ 細胞内の細胞質プロテインチロシンキナーゼポリペプチドである、請求項48に記 載の方法。 50．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドが細胞内の核プロテインチロシンキ ナーゼポリペプチドである、請求項45または46に記載の方法。 51．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のアダプターポリペプチドがＧＲＢポリペプチドである、請求項45または46に記 載の方法。 52．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−２ポリペプチドである、請求項51に記載の方 法。 53．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−１、ＧＲＢ−４、ＧＲＢ−７またはＧＲＢ− １０ポリペプチドである、請求項51に記載の方法。 54．プロテインチロシンキナーゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 のプロテインチロシンキナーゼポリペプチドがＢＣＲ／ＡＢＬ細胞内の細胞質プ ロテインチロシンキナーゼポリペプチドであり、プロテインチロシンキナーゼポ リペプチド／アダプターポリペプチド複合体のアダプターポリペプチドがＧＲＢ −２ポリペプチドであり、かくしてプロテインチロシンキナーゼポリペプチド／ アダプターポリペプチド複合体がＢＣＲ／ＡＢＬポリペプチド／アダプターポリ ペプチド複合体となる、請求項45または46に記載の方法。 55．モジュレートされる細胞増殖性疾患が慢性骨髄性白血病である、請求項54に 記載の方法。 56．モジュレートされる細胞増殖性疾患が急性リンパ性白血病である、請求項54 に記載の方法。 57．モジュレートされる細胞増殖性疾患が急性骨髄性白血病である、請求項54に 記載の方法。 58．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする方法であって、プロテ インチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体 を形成する能力がある細胞を、細胞増殖性疾患がモジュレートされるように該細 胞のプロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体を破壊するのに十分な量の化合物と接触させる、ことを含んでなる方法。 59．哺乳動物においてプロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプ ターポリペプチド複合体が関与している細胞増殖性疾患をモジュレートする方法 であって、哺乳動物に、細胞増殖性疾患がモジュレートされるようにプロテイン チロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド複合体を破壊す るのに十分な量の化合物を投与する、ことを含んでなる方法。 60．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のプロテインチロシンホスファターゼポリペプチドが膜貫通の受容体プロ テインチロシンホスファターゼポリペプチドである、請求項58または59に記載の 方法。 61．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のプロテインチロシンホスファターゼポリペプチドが細胞内の細胞質プロ テインチロシンホスファターゼポリペプチドである、請求項58または59に記載の 方法。 62．プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド／アダプターポリペプチド 複合体のアダプターポリペプチドがＧＲＢポリペプチドである、請求項58または 59に記載の方法。 63．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−２ポリペプチドである、請求項62に記載の方 法。 64．ＧＲＢポリペプチドがＧＲＢ−１、ＧＲＢ−４、ＧＲＢ−７またはＧＲＢ− １０ポリペプチドである、請求項58または59に記載の方法。 65．単離されたＢＣＲ／ＡＢＬポリペプチド／ＧＲＢ−２アダプターポリペプチ ド複合体。 66．第１の結合相手分子と第２の結合相手分子との特異的相互作用を阻止する物 質を同定するためのアッセイであって、 (a) 第１の結合相手分子の結合ドメインに対応するアミノ酸配列を含むタン パク質またはペプチドと、第２の結合相手分子の結合ドメインに対応するアミノ 酸配列を含むタンパク質またはペプチドとを、第１および第２の結合相手分子を 結合させて結合相手分子複合体を形成させるのに十分な条件下および時間にわた り試験物質の存在下に接触させ、そして (b) 該複合体の形成を検出し、その際、第１の結合相手と第２の結合相手との 相互作用を阻止する試験物質の能力が、該試験物質の不在下で形成された複合体 の量と比べたときの複合体形成の減少により示される、 ことを含んでなるアッセイ。 67．第１の結合相手分子の結合ドメインがＳＨ２結合ドメインであり、第２の結 合相手分子の結合ドメインがＳＨ２ドメインである、請求項66に記載のアッセイ 。 68．第１の結合相手分子が活性化されたチロシンキナーゼ分子であり、第２の結 合相手分子がアダプタータンパク質分子である、請求項66に記載のアッセイ。 69．活性化されたチロシンキナーゼ分子が活性化されたＢＣＲ−ＡＢＬ分子であ り、アダプタータンパク質分子がＧＲＢ−２分子である、請求項68に記載のアッ セイ。 70．上記複合体の一方の結合相手分子が固定化されており、他方の結合相手分子 がシグナル発生化合物で標識されている、請求項66に記載のアッセイ。 71．上記複合体の一方の結合相手分子が工程(a)の前に固定化されており、かく して工程(a)における接触が固−液相で行われる、請求項70に記載のアッセイ。
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