JPH11502517A

JPH11502517A - Ｂｃｒ−ａｂｌ指向性組成物およびフィラデルフィア染色体刺激性細胞増殖を阻害するための使用

Info

Publication number: JPH11502517A
Application number: JP8525151A
Authority: JP
Inventors: ビー．アーリングハウス，ラルフ; リウ，ジアシン; ベルステイン−ロペス，ガブリエル; ルー，ダイ
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 1999-03-02
Also published as: EP0811078A4; US20040022772A1; US6537804B1; CA2213132A1; EP0811078A1; WO1996025520A1; US6107457A

Abstract

(57)【要約】 Bcr-Ablオンコプロテインを阻害し、そしてBcr-Abl機能に関与する分子と結合する、一つ以上のペプチドを含むかまたはコードする、組成物を開示する。ペプチドおよびポリペプチドは、Bcr-Ablオンコプロテインを発現するフイラデルフィア染色体陽性白血病細胞の増殖を阻害し、そしてその細胞死を誘導する。白血病(例えば、CML，ALL，およびAML)を処置するための方法がまた提供され、この方法は、本発明のペプチドおよびポリペプチド組成物を用いる、骨髄自己移植療法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 BCR-ABL 指向性組成物およびフィラデルフィア染色体刺激性細胞増殖を阻害するための使用本出願は、1995年２月16日に出願された同時継続中の米国出願番号08/390,353 の一部継続である。米国政府は、国立衛生研究所からの許可番号CA65611に準ずる本発明における権利を所有する。発明の分野本発明は、概して、悪性細胞増殖の分野に関する。より詳細には、Bcr-Ablオンコプロテイン駆動性の悪性細胞増殖を制限する組成物および方法を提供する。種々のBcr-Ablシグナル伝達経路（例えば、Rasタンパク質の活性化）を阻害するペプチドおよびタンパク質分子が提供される。細胞群中のフィラデルフィア染色体陽性細胞を減少するための方法（骨髄培養を包含する）および種々の白血病を処置する方法もまた提供される。発明の背景フィラデルフィア染色体(Ph¹)は、大部分の慢性骨髄性白血病(CML)患者(95％を越える)、10〜25％の急性リンパ球白血病(ALL)患者、および約２〜３％の急性骨髄性白血病(AML)に関連する。この異常染色体は、大部分のABL遺伝子を5'の２／３のBCR遺伝子を融合する。多くの異なる種類の証拠により、Bcr-Ablオンコプロテイン(例えば、p210およびp185 BCR-ABL)が、これらの白血病において原因因子であることを支持される( Campbellら、1991)。有害な活性は、大部分がBcr-Ablタンパク質により高度に活性化されたタンパク質チロシンキナーゼ活性およびタンパク質基質とのその異常な相互作用が原因である(Campbellら、1991、Arlinghausら、1990)。Bcr-Ablオンコプロテインp210 Bcr-AblはCMLおよびALLの両方と会合され、より小さなオンコプロテインであるp185 BCR-ABLはALL患者に関連されるが、いくつかのCML患者はまた、p185を発現する(Campbellら、1991)。いくつかの報告により、Bcr-Ablオンコプロテインであるp210およびp185 BCR −ABLが、Ras経路を活性化することにより、少なくとも一部分が機能することが示唆されている。RAS遺伝子は、正常な細胞増殖の制御に関与するプロトオンコジーンである。継続的に活性化した場合、Rasタンパク質は、潜在的なオンコジーン産物になる。Bcr-Ablオンコプロテインが、正常なRas機能を乱すことが本発明者らおよび他の者によって観察された(Pendergastら、1993)。 Bcr-Ablオンコプロテインが、p21 Rasを活性化するメカニズムは、いくつかの因子を包含すると考えられている。１つの事象は、Bcr第１エキソンのコーディング配列内のチロシン残基上のBcr-Ablオンコプロテインの自己リン酸化を包含する(Liuら、1993)。この発見は、Bcr-Ablが、Bcrチロシン残基ではなく、Ablチロシン上のそれ自身をリン酸化すると以前は仮定されていたので予想外であった。いくつかのアダプタータンパク質は、Ras活性化に包含されてきた。図２は、S H2/SH3モチーフを含むいくつかのこのようなアダプタータンパク質を挙げる。このようなドメインは、核への増殖シグナルに関与するタンパク質において観察されている(Pawsonら、1992)。 Grb2は、チロシンリン酸化レセプタータンパク質に結合するアダプタータンパク質である。Bcr-Ablで誘導された腫瘍形成はまた、Grb2のSH2ドメインとの直接的な相互作用によって媒介されると報告されてきた(Pendergastら、1993；Puil ら、1994)。Grb2はまた、GTP交換因子であるmSos1に結合する(図３を参照のこと )。後者は、GTP/Rasを形成することによってRasを活性化する。次いでGTP/Rasは、Mekを活性化するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼであるRafを活性化する。Mekは、MAPキナーゼをリン酸化し、そして活性化するキナーゼである。後者は、種々の転写ファクター(つまり、c-Jun)を活性化および／または調節して、その結果細胞が増殖すると考えられている(図４)。 Bcr-Ablの有害な影響を包含する別のペプチドは、Shcを含む(Puilら、1994)。 Crklは、Bcr-Ablと共にタンパク質／タンパク質相互作用を形成する別のアダプター分子である(Reichmanら、1992；Ten Hoeveら、1993；1994)。Bcr-Ablと相互作用するさらに別のアダプター分子は、p120 Ras Gapである(Drukerら、1992)。 Bcr-Ablで誘導された悪性腫瘍に関して試験されてきた別のタンパク質／タンパク質相互作用は、四量体構造の形成に関与する。フィラデルフィア染色体陽性ヒト白血病において、第９染色体上のc-ablプロトオンコジーンは第22染色体上のbcr遺伝子に融合し、そしてキメラなBcr-Ablタンパク質が産生される。融合されたBcr配列は、チロシンキナーゼ、アクチン結合、およびAblの形質転換機能を活性化する。 Abl形質転換機能の活性化は、Bcrの２つの明確なドメイン：ドメイン１(Bcrアミノ酸１〜63)およびドメイン２(Bcrアミノ酸176〜242)(McWhirterら、1993)が必要であると考えられる。Bcrのドメイン１は、ホモ四量体を形成することが示された(McWhirterら、1993)。Bcr-Abl四量体は、その固有のAblチロシンキナーゼ活性、そのアクチン結合機能、およびその細胞形質転換機能を活性化する(McW hirterら、1993)。挿入性変異誘発による超らせんの崩壊は、オリゴマー化(olig imerization)機能およびRat-1線維芽細胞を形質転換するBcr-Ablの能力を不活化する。その遺伝子産物の活性に関連するBcr/Abl機能および病理学に関与すると考えられる特定の事象および分子が記載されているにも関わらず、Bcr/Ablを制御するための包括的なストラテジー(および例えば、そのRasオンコジーンの活性化) は開発されていなかった。従って、Bcr/Ablを効率よく標識化し、そして特異的に阻害するアプローチの必要が、科学分野および医学分野において存在し続けている。このような技術は、骨髄内のような組織内のフィラデルフィア染色体陽性細胞を阻害するための新しい治療を提供する。発明の要旨本発明は、Bcr-Abl機能および活性化を阻害するBcr-Abl由来の特定のペプチド配列を規定することにより、先行技術の一定の制限を克服する。従って、本発明のペプチドおよび組成物は、Bcr-Ablを阻害する方法、骨髄サンプル中のフィラデルフィア染色体陽性細胞の骨髄を除去する方法、および種々の白血病(慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ性白血病(ALL)、および急性骨髄性白血病(AML)を含む)を処置する方法において有用である。本発明のペプチドは、Bcr-Abl機能において重要であることが、本発明者らによって見出された数個のチロシン残基の組合せのうち少なくとも１つを含むBcr- Ablアミノ酸配列のセグメントに基づく配列を含有するペプチドである。これらは、本明細中で「チロシン含有ペプチド」と呼ばれる。一般に、本発明の組成物および方法は、少なくとも１つのチロシン含有ペプチドが存在することが必要である。 p160 Bcrの第１のエキソンのアミノ酸配列は、配列番号１に与えられる。チロシンは、残基58、70、177、231、246、276、279、283、316、328、および360に存在する。本発明の文脈において特に重要なチロシンは、177位、283位、および 360位のチロシンであり、そしてまたチロシン328である。従って、本発明は、約４アミノ酸と約500アミノ酸との間の長さの、(配列番号１の)BCr-Ablタンパク質由来の連続アミノ酸配列を有するまたは含む精製ペプチドおよびポリペプチドを提供する。この配列は、チロシン177、チロシン283、チロシン360、またはチロシン328のうちの少なくとも１つを含むかまたは囲み、このペプチドまたはポリペプチドは、活性化Bcr-Ablとの接触の際にチロシン177、 283、360、および／または328上でリン酸化される。従って、これらのペプチドは、Bcr-Ablのチロシンリン酸化活性についての基質であるとして特徴づけられる。これらのペプチドはまた、Bcr-Ablについての基質としてBcrと効率よく競争し得るとして、そしてBcr-Ablを含む無傷の細胞中のBcrのBcr-Abl媒介性チロシンリン酸化を減少し得るとして特徴づけられる。チロシン177を含む例示の有用なペプチドは、配列番号８の配列(配列番号１の 164〜181位)を含むペプチドである。チロシン283を含む例示の有用なペプチドは、配列番号11の配列(配列番号１の255〜293位)を含むペプチドである。ペプチドは、一般に、ペプチドの最先端よりも中央の領域中にチロシンを含むことが一般に好ましい。任意の所定のペプチドの作用機構を理解することは、本発明の実施のために必要ではないが、チロシン177またはチロシン283を含むペプチドが、Bcr-Ablのオンコジーンの影響を阻害することによって同様に機能することは、注目すべきである。これは、Bcr-Ablによってリン酸化されるために他の基質(特に、Bcr)と競争するペプチドによって、達成されると考えられる。要するに、これは、他の細胞標的のBcr-Abl駆動性リン酸化を減少し、そしてBcr-Ablの有害な影響を制限する。なおさらに有用なチロシン含有ペプチドは、チロシン360を含むペプチドである。この群の例示の有用なペプチドは、配列番号10(配列番号１の353〜364位)および配列番号22(配列番号１の350〜366位)の配列を含有するペプチドを包含する。セリン354に対応するリン酸化セリンが、これらのペプチド中で提供されることが一般に好ましい。チロシン360を含むペプチドの有利な効果は、Bcrの有益な効果(Bcr-Ablを中和する)の刺激に基づくと考えられる。このようなBcr中和は、そのセリン／スレオニンキナーゼ活性によって、部分的に達成される。Bcr-AblによるBcrチロシン36 0およびチロシン328のリン酸化は、本発明者らによって、そのセリン／スレオニンリン酸化活性を減少することが示された。重要なことに、チロシン360含有ペプチドのSer 354形態は、Bcr-Ablオンコプロテインのチロシンキナーゼ活性の直接的なインヒビターであることが本明細書中に示される。従って、チロシン360配列、またはチロシン328配列を含むペプチドは、Bcr-Ab lの基質としてBcrと競争し、そしてBcr-Tyr-360-Pのレベルを減少させ、それによりBcrの有益な効果を促進する。しかし、この提唱された作用機能は、完全に正確であることを証明しなくても、本発明がさらに有用であることは再び理解される。本発明のチロシン含有ペプチドに関して、少なくとも４マー配列または５マー配列を含む、あるいは好ましくは、少なくとも６マー配列または７マー配列(これは、重要なチロシンを有する)を含む、ペプチドは、Bcr-Abl阻害のための組成物中に有効な分子を提供することが期待される。例えば、少なくとも配列番号24 のアミノ酸配列(配列番号１の176〜180位)を含む配列が用いられ得る。例示の５マーおよび７マーは、配列番号25(配列番号１の359位〜363位)および配列番号26 (配列番号１の279〜285位)によって示される。しかし、約10〜12から、15〜20、約50、100、150、200、250、300、350、400 、または約500残基までなどのより長いペプチドもまた使用され得る。例示の13 マーは、配列番号27であり、これは配列番号１の168位〜180位に対応する。一般的に好まれるより長いペプチドは、配列番号28のペプチドである。配列番号10および配列番号22のようなより短いペプチドは、一般に、ペプチドまたはリポソーム-ペプチド製剤として細胞または患者に投与される。配列番号2 8のようなより長いペプチドおよびポリペプチドは、一般的に、ペプチドまたはポリペプチドを発現するベクターを用いる遺伝子療法を用いて細胞または患者に投与される。所定のペプチドは単独でBcr-Ablを阻害するのに有用であるが、本発明の組成物および方法は、２つ以上のこのようなペプチドを含み得る。２つのペプチドが用いられる場合、異なるチロシン領域を含む配列を有するペプチド、好ましくは、177位、283位、および／または360位を含む配列番号１のそれらの配列から選択されるペプチドを使用することが好ましくあり得る。前述の種々のチロシン領域を含む３つの異なるペプチドもまた、利益を与えるために使用され得る。 177位、283位、および360位の３つのチロシンのうち２つを囲む配列を、それ自体に含む単一のペプチドがまた使用され得る。このようなペプチドは、連続的なBcr-Abl配列のみを含み得るか、または無関係な(好ましくは、柔軟な)リンカー配列によって、作動可能に連結されたBcr-Abl配列の２つの連続的な範囲を含み得る。さらに、177位、283位、および360位の３つのチロシンの各々を含む連続配列を含む単一のペプチドの使用もまた意図される。連続的なBcr-Abl配列のみを含む例示のペプチドは配列番号28であり、このペプチドは、配列番号１の残基64で始まり、そして残基413で終わる。ペプチドはまた、より長い範囲のBcr-Abl配列または他の配列を所望に応じて含み得る。少なくとも１つのチロシン含有ペプチドに加えて、使用され得る本発明の他のペプチドは、アダプター分子(すなわち、Bcr-Ablオンコプロテインの分子標的) に対するBcr-Abl上の重要な結合部位の配列を含むペプチドである。これらは、「結合部位ペプチド」と呼ばれる。本発明における使用のための結合部位ペプチドは、Bcr-Abl配列由来の連続アダプター分子結合部位配列を有するかまたは含む、約４アミノ酸と約500アミノ酸との間の長さの精製ペプチドおよびポリペプチドであり、このペプチドまたはポリペプチドはアダプター分子に結合する。この結合部位ペプチドはまた、チロシン残基を含み得る。しかし、結合部位ペプチドは、アダプター分子(例えば、Grb2、Shc，Crkl、Ras Gap、またはBcrのＮ末端超らせん領域)に結合するとして特徴づけられる。好ましくは、それらは、アダプター分子へのBcr-Ablの結合を阻害するとして、および無傷の細胞におけるBcr-Ablアダプター分子の相互作用を減少し得るとして特徴づけられる。本発明の組成物および方法における使用のための結合部位ペプチドは、一般に重要なオンコプロテインに結合するBcr-Abl上の部位を模倣する。これらの実施態様において、１つ以上のシグナル伝達分子(例えば、Shc、Crkl、Ras Gap、および／またはGrb2/mSos1)に結合してこれらの分子がそれらの増殖促進機能を行することを妨げる補充的なペプチドが提供される。従って、本発明のチロシン含有ペプチド組成物は、以下の１つ以上の結合タンパク質をさらに含み得る：ShcのAbl SH3結合タンパク質リッチ領域に結合する精製ペプチド；Crkl上のプロリンリッチなABl結合部位に結合する精製ペプチド；p 120 Ras GapのSH2ドメインに結合する精製ペプチド；および／またはBcrのＮ末端超らせん領域に結合する精製ペプチドまたはタンパク質。本発明の例示の組成物は、ShcのAbl SH3結合タンパク質リッチ領域を結合する１つ以上のペプチドをさらに含む組成物である。ShcはGrb2に結合し、そしてこの複合体は、Rasを活性化する潜在性を有する。Shcに結合するペプチドは、Bcr 領域由来の配列ではなく、Abl領域に由来の配列を含む。本発明のさらなる結合ペプチドは、Bcr-AblへのCrklの結合を阻害するペプチドである。Crklは、AblおよびBcr/Ablの両方と複合体を形成する38kDaのタンパク質であり、そしてAblおよびBcr-Ablによってチロシンがリン酸化される。従って、CRKL上のプロリンリッチなAbl結合部位を模倣するペプチドはまた、本発明のいくつかの実施態様の成分である。これらの実施態様に含まれるなおさらなるBcr/Ablペプチドは、p120 Ras Gap に相互作用するペプチドである。この性質のペプチドは、p120 Ras GapのSH2ドメインを結合するペプチドとしてさらに詳細に記載される。これらのペプチドは、チロシン279およびBcrの第１のエキソンの外側にチロシンを含む。例示の有用なペプチドは、配列番号11(配列番号１の255位〜293位)および配列番号12の配列を含むペプチドである。さらなる実施態様において、本発明の組成物は、BcrのＮ末端超らせん領域を結合する１つ以上のペプチドまたはタンパク質を含む。これらのペプチドおよびタンパク質は、配列番号２(配列番号１の１位〜63位)に対応する配列；配列番号３(配列番号１の１位〜71位)に対応する配列；配列番号４(配列番号１の28位〜5 8位)に対応する配列；配列番号５(配列番号１の１位〜159位)に対応する配列；配列番号６(配列番号１の１位〜221位)に対応する配列；または配列番号７(配列番号１の１位〜413位)に対応する配列；を含むペプチドによって例示される。本発明者らは、Bcrタンパク質が、Bcr-AblオンコプロテインがGrb2と複合体を形成し得るGrb2に対するコンセンサス結合部位Y^*VNV(配列番号13)を含むことを観察した。チロシン177位でのBcr配列のチロシンリン酸化は、Grb2/mSos1を生じて膜結合Bcr-Ablを結合し、そしてp21 Rasを活性化する(図５)。従って、特に１つ以上のShc、Crkl、SH2、またはp120 Ras Gap結合配列と組合せに使用した場合、Y^*VNVコンセンサス結合部位(配列番号13；配列番号１の177 残基〜180残基)を含むペプチドは、Bcr-Ablに対するGrb2の結合を妨げ、Bcr-Abl に誘導される有害な影響をブロックする。BcrペプチドGHGQPGADAEKPFp.Y₁₇₇VNVE (配列番号８(配列番号１の残基164〜181))はまた、Grb2上のSH2結合部位に強く結合し、そして本発明の組成物において使用され得る。従って、本明細書中に記載のように、ペプチドが有効な結合部位を含むための十分な長さである限り、本発明の結合部位ペプチドは、約４アミノ酸と約500アミノ酸との間の任意の長さであり得る。本発明の任意のペプチド組成物は、薬学的に受容可能なキャリア(例えば、Rin gers溶液、生理食塩水など)をさらに含み得る。このようなキャリアは、薬学の分野における当業者に公知である。本発明の別の実施態様は、リポソーム製剤とともに上記の１つ以上のチロシン含有ペプチドを含む組成物を提供する。このペプチドは、リポソーム内にカプセル化され得るか、または単にリポソームと機能的に結合した状態で維持され得る。前述のペプチド組成物は、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む細胞の混合物中のフィラデルフィア染色体陰性細胞を富化する行程において使用され得る。本発明によって、少なくとも１つの本発明のチロシン含有ペプチドをコードおよび発現する第１のDNA配列を含む第１の発現ベクター(例えば、プラスミド、アデノウイルス、またはレトロウイルス)がさらに提供される。配列番号１のアミノ酸配列をコードするDNA配列は、当業者に公知であり、そして本明細書中にさらに記載される。１つ以上のチロシン含有ペプチドをコードする特定のコード領域の同定は、当業者には簡単なことである。第１の発現ベクターは、以下のうちの少なくとも１つをコードして発現する第２のDNA配列をさらに含み得る：ShcのAbl SH3結合タンパク質リッチ領域を結合するペプチド；Crkl上のプロリンリッチAbl結合部位を結合するペプチド；p120 Ras GapのSH2ドメインを結合するペプチド；BcrのＮ末端超らせん領域を結合するペプチドまたはタンパク質；および／またはGrb2上のSH2結合部位を結合するペプチド。また、第２の発現ベクター(例えば、プラスミド、アデノウイルス、またはレトロウイルス)は、上記の第１の発現ベクターとともに使用するために提供され得る。第２の発現ベクターは、一般に、以下のうちの少なくとも１つをコードして発現するDNA配列を含む、プラスミド、アデノウイルス、またはウイルスである：ShcのAbl SH3結合タンパク質リッチ領域を結合するペプチド；Crkl上のプロリンリッチAbl結合部位を結合するペプチド；p120 Ras GapのSH2ドメインを結合するペプチド；BcrのＮ末端超らせん領域を結合するペプチドまたはタンパク質；および／またはGrb2上のSH2結合部位を結合するペプチド。特定の実施態様において、単独でまたは融合ポリペプチドの一部としてのいずれかで本発明の１つ以上のペプチドを発現する両種向性レトロウイルス(複製を欠損するが、動物または患者由来の骨髄細胞を感染し得る)が、提供される。リポソームと結合するアデノウイルスベクターおよびプラスミドベクターであるAA Vもまた提供される。本発明の方法は、フィラデルフィア染色体陽性細胞の阻害、傷害、または表現型の効果的な逆転を提供する。この方法は、一般に、フィラデルフィア染色体陽性細胞またはフィラデルフィア染色体陽性細胞を含む細胞の集団を、本明細書中に記載の任意のチロシン含有ペプチド組成物のいずれか１つ、または組み合わせの生物学的に有効な量を、含むかまたはコードする組成物と接触させる工程を包含する。組成物は、フィラデルフィア染色体陽性細胞の阻害および傷害を生じるに有効な期間、細胞を接触して維持される。この方法が、１つ以上のフィラデルフィア染色体陽性細胞を有効な量の１つ以上のチロシン含有ペプチド自身と接触させることによって達成され得ることが理解される。また、細胞は、１つ以上の発現ベクター(１つ以上のこのようなチロシン含有ペプチドをコードして発現するウイルスベクターを含む)と接触され得る。このような方法に使用するための組成物は、一般に、配列番号１由来のチロシン残基177、283、または360のうちの少なくとも１つを含む配列を有するかまたは含む少なくとも１つのペプチドを含むかまたはコードする。特定の実施態様において、組成物は以下をさらに含むかまたはコードする：ShcのAbl Sh3結合タンパク質リッチ領域を結合するペプチド；Crkl上のプロリンリッチAbl結合部位を結合するペプチド；p120 Ras GapのSH2ドメインを結合するペプチド；BcrのＮ末端超らせん領域を結合するペプチドまたはタンパク質；および／またはGrb2上の SH2結合部位を結合するペプチド。フィラデルフィア染色体陽性細胞の阻害、傷害、または表現型を逆転する方法において、細胞または細胞の集団は、インビボまたはインビトロのいずれかで接触され得る。従って、この方法は、インビボ処置およびインビトロ/エクスビボプロトコルの両方を包含する。インビボおよびインビトロ両方において、細胞は、ペプチドの組成物、リポソーム結合ペプチドの組成物、および/あるいはペプチドをコードして発現する発現ベクターまたはウイルスを含む組成物と接触され得る。この組成物は、一般に、薬学的に受容可能である。従って、本発明は、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含有する細胞の混合物中の、フィラデルフィア染色体陰性細胞を富化するための方法をさらに提供する。この方法は、一般に、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含むか、または含むと推測される細胞の混合物(例えば、骨髄サンプル)を、本発明の任意のチロシン含有ペプチド組成物のいずれか１つまたは組み合わせのBcr-Ablを阻害する量を含むかまたはコードする組成物と有効な期間接触させる工程を包含する。特定の実施態様において、骨髄はCML、AML、またはALLを有する患者から得られる。本発明は、本発明のペプチドで処理された骨髄サンプルが、それを得た患者に再投与されることを特に意図する。従って、本発明は、エクスビボ処置および骨髄自己移植前の骨髄を取り出すのための方法を提供する。処置された骨髄サンプルは、移植受容者の免疫担当性(immunocompetency)を増強する。フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む細胞混合物中のフィラデルフィア染色体陰性細胞を富化する方法において、フィラデルフィア染色体陰性細胞は、一般に、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含むサンプル中に存在する数に対して富化する。１つの例は、CML、AML、またはALLを有する患者由来の骨髄サンプル中に存在する数に比例するフィラデルフィア染色体陰性細胞の富化である。なおさらなる実施態様において、本発明は、骨髄サンプルからフィラデルフィア染色体陽性細胞を除去する方法を提供する。この方法は、一般に、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む骨髄サンプルを、骨髄サンプル中のフィラデルフィア染色体陽性細胞の数を減少させるのに有効な量で、任意の本発明のチロシン含有ペプチド組成物のいずれか１つ、または組み合わせを含むかまたはコードする組成物に、有効な期間、曝露する工程を包含する。本発明のなおさらなる実施態様は、フィラデルフィア染色体陽性白血病を有するかまたは有すると推測される患者を処置する方法を提供し、この方法は、本質的に白血病細胞のない自己骨髄サンプルを調製するのに有効な量(すなわち、白血病細胞の細胞傷害性量を用いる)で、本発明のチロシン含有ペプチドの少なくとも１つを含むかまたはコードする組成物で患者の骨髄サンプルを処置する工程および処置されたサンプルを患者に投与する工程を包含する。この処置方法はまた、骨髄サンプルを患者から得る工程、骨髄サンプルからフィラデルフィア染色体陽性細胞を除去するのに有効な治療量および期間、１つ以上の本発明の任意のチロシン含有ペプチドを含むかまたはコードする組成物と、この骨髄サンプルとをエクスビボで接触させる工程、および取り出された骨髄サンプルを患者に再投与する工程を包含する。本発明の目的によって、自己骨髄サンプルは、体外での処置の後に患者への再投与を意図された患者由来の骨髄のサンプルとして規定される。本発明による患者における白血病を処置するための規定された方法は、以下の工程：白血病を有する患者に、患者における少なくともいくつかの細胞遺伝学的寛解(cytogenetic remission)を生じるのに十分な化学療法レジメを投与する工程；寛解中の患者から骨髄サンプルを得る工程；骨髄サンプルを、フィラデルフィア染色体陽性細胞に細胞傷害性な濃度のチロシン含有ペプチドに曝露し、本質的にフィラデルフィア染色体陽性細胞のない骨髄サンプルを提供する工程；および患者に本質的なフィラデルフィア染色体陽性細胞のない骨髄サンプルを再導入する工程を包含し、ここで再導入により、フィラデルフィア染色体陽性骨髄細胞を正常な造血始原細胞と置換する。本発明のアプローチは、Bcr-Ablオンコプロテインの１つ以上の重要な標的を同時に中和しながら、Bcr-Ablの活性が阻害されると言う点で現在のストラテジー(例えば、アンチセンスBcr-Ablアプローチ)よりも優れた改良を提供する。本発明はまた、そのペプチドが、分子量マーカーとして、タンパク質染色スタンダードとして、および放射性ヨウ素化についてのスタンダードとして使用され得る実質的な用途を有する。図面の簡単な説明以下の図面は本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すために包含される。本発明は、本明細書中に示す特定の実施態様の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することにより、より十分に理解され得る。図１Ａおよび図１Ｂは、BcrおよびBcr-Abl相互作用についてのモデルを提供する。図１Ａは、正常な始原細胞を示す。図１Ｂは、白血性始原細胞を示す。図２は、シグナル伝達に関与するSH2/SH3含有タンパク質の図を提供する。図３は、リガンドレセプター相互作用によるRASの活性化を概略する。図４は、レセプター／リガンド相互作用による転写因子の活性化の経路を概略する。図５は、Bcr-AblによるRasの活性化経路を概略する。図６Ａおよび図６Ｂ。短縮型Bcr第１エキソン配列のBcr-Ablによるインビボチロシンリン酸化。Bcr150、Bcr221、およびBcr413タンパク質をそれぞれ発現する COS-1ベクターを、p20 Bcr-Ablの存在下および非存在下、COS-1細胞中で発現させた。図６Ａは、抗-Tyr抗体を用いたウェスタンブロットを示す。Bcr-Ablは、B cr221およびBcr413のチロシンリン酸化を誘導するが、Bcr159のリン酸化は誘導しない。このことは、Bcrの最初の２つのチロシンがBcr-Ablの標的ではないことを示している。次のチロシンは残基177であり、そしてBcr-Ablによりリン酸化されると予想される（Puilら、1994）。Bcr221は、チロシンリン酸化されるが、Bc r413と同様にBcr-Ablの存在下でのみリン酸化される。図６Ｂは、抗-Bcr 1-16でプローブした同じ抽出物のウェスタンブロットを示す。３つ全てのBcrタンパク質フラグメントが、両方の条件下で特異的に発現されることに注意されたい。図７は、BCR欠失変異体の模式図を提供する。図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄは、インビトロリン酸化Bcr-Ablタンパク質の二次元トリプシン処理（tryptic）マップを示す。変異体および野生型B cr-Ablタンパク質は、記載のようにCOS-1細胞において発現された。Bcr-Ablタンパク質を、抗-Abl（52-64）免疫複合体を用いてインビトロでリン酸化し、そしてマップした。破線の丸は、変異体において欠損したタンパク質を示す。図８Ａ、p210野生型；図８Ｂ、p210-F283；図８Ｃ、p210-F276；図８Ｄ、p185-F360。図９Ａおよび図９Ｂは、F283および野生型p210 Bcr-Ablのトリプシン／V8マッピングを示す。COS-1細胞において発現されたp210 Bcr-AblのF283変異体（図９Ｂ）を、K562細胞由来のp210 Bcr-Ablのマップ（図９Ａ）と比較した。インビトロ標識化およびマッピングを行った。破線の丸またはＸは、変異体において欠損したペプチドを示す。図10Ａおよび図10Ｂは、p210の吸収されたトリプシン処理マップを示す。GST- Abl SH2は、ホスホチロシントリプシン処理ペプチド３（これは、チロシン283を含む）に結合する。K562細胞由来のインビトロキナーゼアッセイにおいて標識されたp210 Bcr-Ablを、SDSゲル上で精製してトリプシンで消化し、そして消化物を２つの部分に分離した。一方をGSTで吸収させ（図10Ａ）、そして他方をGST-A bl SH2で吸収させた（図10Ｂ）。ビーズに結合しなかったペプチドは、通常のように薄層プレート上で分離した。破線の丸は、GST-Abl SH2で吸収された画分において欠損するペプチドを示す。図11は、本発明のペプチドを細胞に導入するのに有用なレトロウイルスベクターpG7CHTを示す。図12は、センスまたはアンチセンス３'BCRで処理したSUP-B15細胞におけるBcr -Ablタンパク質発現を示す。SUP-B15細胞はp185 BCR-ABLを発現する；これらは、フィラデルフィア染色体陽性ALLを有する患者に由来した。図13に示した研究において採集した細胞の10分の１を、抗-Ablモノクローナル抗体8E9を用いるウェスタンブロッティングにより、Bcr-Abl発現についてアッセイした。これらの結果の定量により、センス処理培養物（レーン２）に比べるとアンチセンス処理培養細胞（レーン１）においてBcr-Ablタンパク質が35％減少したことが示される。同様に、Ablタンパク質は、センス処理培養細胞に比べるとアンチセンス処理培養細胞において、約26％減少した。デンシトメーターSIユニット（Molecula r Dynamics）により定量を行った。図13は、SU PB15 ALL細胞の３'アンチセンスBCRオリゴヌクレオチド処理によるp160 BCR発現の阻害を示す。SUP B15細胞を、図12におけるように、アンチセンスBCRオリゴヌクレオチドで処理した。センス処理培養細胞およびアンチセンス処理培養細胞からプロセスした等量の細胞を、７日目に採集した。記載（Liu ら、1993）noように、Bcrのカルボキシ末端に対する抗体でアッセイすることにより、細胞をBcrタンパク質およびBcr/Bcr-Abl複合体について分析した。レーン１は、センス処理した培養細胞のSDSゲルパターンである；レーン２は、ペプチドブロック抗体を用いて行ったアッセイである。レーン３は、アンチセンス処理した培養細胞のパターンである；レーン４は、ペプチドブロックコントロールである。レーン１とレーン３との比較により、Bcrタンパク質のレベルならびにBcr /Bcr-Abl複合体を形成するその能力が、３'BCRアンチセンス処理によりひどく阻害されたことを示す。定量測定により、培養細胞におけるAblタンパク質の量について規格化された場合、センス処理に比べてアンチセンス処理により、Bcrタンパク質のレベルが約10倍減少したことが示される。図14は、３'BCRアンチセンスオリゴでの処理が、低血清中で維持されたp185 B CR-ABLを発現するSUP-B15細胞の生存を増強することを示す。SUP-B15細胞（２× 10⁶細胞）を、５%ウシ胎児血清を含有するRPMI培地中で維持した。細胞増殖は20 %の血清を必要とするので、細胞はこれらの条件下では増殖せず、そして緩やかに死滅する。細胞を、10μMの濃度で３'BCRアンチセンスオリゴ（白丸）または３'BCRセンスオリゴ（黒丸）で処理した。生存細胞の数を、トリパンブルー色素排除により測定した。データを、３連の平均（+/-SEM）として表す。図15は、Bcr-AblチロシンキナーゼによるBcrセリン/スレオニン自己キナーゼ活性の低下を示す。（Bcr-AblによるBcrのインビトロリン酸基転移）。３×10⁸S MS-SB細胞（Bcr-Ablを欠く）由来の等量の細胞抽出物を３つの部分に分け、そして抗Bcr（1256-1271）を用いる免疫沈降のためにプロセスした。第１の部分（１ ×10⁸細胞）を、イムノキナーゼアッセイのためにProtein A Sepharoseビーズ上に回収した。第２の部分（１×10⁸細胞）を、１×10⁶ SUP-B15（p185 BCR ABL発現細胞）から得られたProtein A Sepharoseビーズに結合された抗-Abl（51-64）免疫複合体に添加した。これらの抗-Abl免疫複合体は、高量のp185 BCR-ABLを有するが、トレースレベルのp160 BCRを有するだけである。Bcr免疫複合体の第３のバッチ（１×10⁸）を、２×10⁷ SUP-B15細胞から得られたBcr-Abl免疫複合体に添加した。全ての手順は、記載（Liuら、1993）のように行った。低レベルおよび高レベルのBcr-Ablによるリン酸基転移後にゲル精製したp160 BCRのホスホアミノ酸分析。パネルＡ由来の３つのp160 BCRバンドを、SDS緩衝液によりゲルから溶出し、そして90分間、110℃にて、６N HClで処理した。これらの条件は、ホスホセリン／スレオニンおよびホスホチロシン値の両方を得るための合理的な折衷案である。加水分解産物を、ホスホセリン／スレオニンおよびホスホチロシンを分離する条件下、薄層プレート上で分画した（Liuら、1993）。p160 SMS-SB バンド由来の約200cpm（Cerenkov）の酸加水分解産物、200cpmのSMS-SB/5%SUP-B 15 p160バンド、および500cpmのSMS-SB/100% SUP-B15 p160バンドを、プレート上に載せた。規格化後、セリン／スレオニンスポットの強度は、p160単独については、4,421；低レベルのBcr-Abl（５%）とともにインキュベートしたp160 BCR については、1763、および高レベルのBcr-Ablとともにインキュベートしたp1 60 BCRについては、142であった。ホスホセリン／スレオニンは、比較的高レベルのBcr-Ablキナーゼにより30倍を超えて減少し、そして５%のBcr-Ablレベルでは、2.5倍減少した。図16は、BcrおよびBcr/Ablによるカゼインのリン酸基転移を示す。COS１細胞のT-150フラスコを、pSG5 BCRまたはpSG5 BCR-ABLのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を採集し、そしてキナーゼを、Li uら、1993に記載のように行った。レーン３において、レーン２のBcr複合体を有する同量のProtein A Sepharoseビーズを、抗-Abl（51-64）p6Dモノクローナル抗体を用いて採集したBcr-Abl複合体を有するProtein A Sepharoseビーズに添加した。カゼイン（10μg）を、標識ATPと共に各反応混合物に添加した。氷上で15 分後、反応を停止し、そしてサンプルを加熱SDSサンプル緩衝液で処理した。Pro tein A Sepharoseビーズの除去後、上清液を８% SDSゲル上で分画した。レーン１、カゼイン非存在下のp160 BCR自己リン酸化；レーン２、Bcrによる添加されたカゼインのリン酸基転移、レーン３、p160 BCRおよびp210 BCR-ABLの混合物によるカゼインのリン酸基転移。図17は、BcrおよびBcr/Bcr-Ablによりリン酸化されたカゼインのホスホアミノ酸分析を示す。各反応混合物由来のほぼ等しいcpmのカゼインを、６N HClを用いて90分間処理してホスホセリン／スレオニンおよびホスホチロシンの両方の検出に好ましくした。Bcrによりリン酸化されたカゼインを、レーン１に示す；レーン２は、Bcr/Bcr-ABl混合物によりリン酸化されたカゼインの分析を示す。Bcrキナーゼが等量に添加されたにもかわらず、Bcrによるカゼインのセリンリン酸化は、添加されたBcr-Ablによってひどく阻害された。Bcr-Ablが存在し、そして活性であったことは、Bcr-Ablの存在下、添加されたカゼイン分子におけるホスホチロシンの強いシグナルによって示される。図18は、p160 BCRおよびp145 c-ABLの両方を過剰発現するCOS1細胞におけるチロシンリン酸化p160 BCRとシミアンGrb2タンパク質との物理的相互作用を示す。抗Grb2ウェスタンブロッティングを、COS1細胞溶解物（レーン１）、またはヒト完全長c-ABL（1b）でトランスフェクトしたCOS1細胞由来の抗-BCR（1256-1271）抗体免疫沈降物（レーン２および３）、ヒト完全長BcrでトランスフェクトしたC OS1細胞由来の抗-BCR（1256-1271）抗体免疫沈降物（レーン４および５）、またはヒト完全長Bcrおよびc-ABl（1b）の両方で同時トランスフェクトしたCOS1細胞由来の抗-BCR（1256-1271）抗体免疫沈降物（レーン６および７）に対して行った。レーン３、５、および７は、予めブロックした抗-BCR（1256-1271）抗体を用いて得られた免疫沈降物である。バンドをECL法を用いて検出した。露光時間：30秒。図19は、p160 BCRのホスホチロシン 177が、シミアンGrb2タンパク質とのその相互作用に必要不可欠であることを示す。抗-Grb2ウェスタンブロッティングを、野生型 p160 BCR（レーン１および２）またはp160 BCR（F177）（レーン３および４）変異体のいずれかとともにp145 c-ABLを同時トランスフェクトしたCOS1 細胞由来の溶解物の抗-BCR（1256-1271）抗体免疫沈降物に対して行った。レーン２および４は、予めブロックした抗BCR（1256-1271）抗体を用いた免疫沈降物である。図20Ａおよび20Ｂは、p185 BCR-ABLを発現するSUP-B15細胞およびp210 BCR-AB Lを発現するM3.16細胞の増殖に対する３'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す。図20Ａ、20% FCSを含有するRPMI培地中で、３'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチド（10μM、１日目）（白四角）またはセンスオリゴヌクレオチド（10μM、１日目）（黒四角）のいずれかとともに培養したB15細胞。図20Ｂ、 10%FCSを含有するDMEM培地中で、上述の３'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチド（白四角）またはセンスオリゴヌクレオチド（黒四角）のいずれかとともに培養したM3.16細胞。オリゴヌクレオチドは、１日目に10μMの最終濃度で添加し、そして５日目に最初の濃度の半量を再度添加した。細胞生存率をトリパンブルー色素排除により決定した。データは３連分析の平均+/-SEMである。図21。ホスホセリンBcrペプチドpS354 S17K（配列番号22）は、Bcr-Ablチロシンキナーゼ活性を阻害する。Bcr-Abl陽性急性リンパ性白血病（ALL）を有する患者由来のSUP B15細胞株を培養液中で増殖した；細胞を溶解し、そしてBcr-Ablオンコプロテイン（oncoprotein）をモノクローナル抗体p6D（抗-Abl 51-64）で免疫沈降した。免疫複合体を、[γ-³²P]ATPを含有するキナーゼ活性化緩衝液の添加の前に、ペプチドなし、または50μgのペプチドとともにのいずれかで混合した。アッセイが完了した後、タンパク質をSDSゲル電気泳動により分画した。放射性タンパク質をホスホイメージ解析により検出した。レーン１、ペプチドなし；レーン２、50μgのpS354 S17K；レーン３、50μgの非リン酸化S17K。図22。Bcr-Ablタンパク質チロシンキナーゼを阻害するBcrフラグメントの構造。使用したBcrフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号28のアミノ酸配列であり、これは配列番号１の残基64で始まり、そして残基413で終わる。Bcrコード配列（Mc WhirterおよびWang、1991）を、ベクターpLNL SLX CMVに、このベクターのBamHI部位でリンカー配列とともに挿入した。翻訳産物は、AKE---で始まるアミノ末端のBcr配列に融合された５つのアミノ酸で始まる；３'末端でのリンカー配列は、Bcr配列のカルボキシル末端（----GQI）に停止コドンの前にLVを付加する。図23Ａ、図23Ｂ、および図23Ｃ。COS-1細胞において発現されるBcrフラグメントは、Bcr-Ablチロシンキナーゼをインビトロで阻害する。これらの研究において、Bcrフラグメントは、COS-1細胞において発現され、次いで抗-Bcr 181-194抗体を用いる免疫沈降により単離された。この免疫複合体は、Protein A Sepharos eビーズへの結合により単離された；これらの免疫複合体を、抗Abl 51-64を用いてSUP B15白血病細胞から採集されたP185 BCR-ABLを含有するProtein A Sepharo seビーズに添加した。自己キナーゼ反応を行い、Bcr-Ablのチロシンキナーゼ活性を測定した。図23Ａ、レーン１、P185 BCR-ABLと混合した煮沸Bcrフラグメント；レーン２、P185 BCR-ABLと混合した未処理のBcrフラグメント；レーン３、P 185 BCR-ABLに添加した50μgのBcr S17K（リン酸化されず）；レーン４、P185 B CR-ABL単独。図23Ｂ、P185 BCR-ABLを含有する免疫複合体のウェスタンブロッティング。図23Ａのレーン２およびレーン４に存在するP185タンパク質を、抗Bcr1 81-194を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。レーン１、図23Ａのレーン２で検出されたP185；レーン２、図23Ａのレーン４で検出されたP185。これは、Bcr-Ablのキナーゼ活性は、Bcrフラグメントタンパク質により劇的に減少されたが、反応混合物中のBcr-Ablの量は同様であったことを示す。図23Ｃ。抗-Bcr 181-194抗体は、Bcr-Ablチロシンキナーゼ活性を阻害しない。この研究において、抗Bcr 181-194抗体を、P185 BCR-ABLを含有する反応混合物に添加して、抗体自身が抗体/Bcrフラグメント複合体により示される阻害活性を担ったのか否かを決定した（図23Ａ、レーン２）。レーン１、P185 BCR-ABL単独；レーン２、P185 BCR-ABL＋抗-Bcr 181-194を含有するProtein A Sepharoseビーズ。一番上のパターンは、P185自己キナーゼ活性である；下の部分は、免疫複合体の抗 Abl 8E9ウェスタンブロットである。これらの結果は、抗Bcr抗体自身がBcr-Abl キナーゼ活性を阻害しないことを示す。好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、Bcr-Ablオンコジーン活性の阻害のための、Y¹⁷⁷、Y²⁸³および／またはY³⁶⁰、あるいはさらにY³²⁸を含むBCR配列を含む１つ以上のペプチドを提供する。このペプチドはまた、BCR-Abl-アダプタータンパク質相互作用（図１Ａおよび図１Ｂ）を阻害する。この阻害は、アダプタータンパク質が、有害な影響（例えば、Rasオンコジーン活性化）に導くカスケードに関係することを防止する。１．チロシン含有ペプチド本発明において好ましいチロシン含有ペプチドは、配列番号８、配列番号11、配列番号10、配列番号22、およびより長いペプチドである配列番号28の配列を含むペプチドである。しかし、配列番号１〜配列番号28の任意の１つ以上の配列を含むペプチドが、本発明において使用され得る。これらのペプチドは、それらの配列内のチロシンを、最初、中間または最後で有し、一般に、ペプチドの中間が好ましい。ペプチドはチロシン残基でリン酸化されてもよく、またはそれらは非リン酸化形態で提供されてもよい。なぜなら、標的細胞が、ペプチドをリン酸化する能力を有するからである。Y¹⁷⁷およびY²⁸³を含むペプチドは、チロシンキナーゼ活性について競合するために、一般に、非リン酸形態で提供される。Y³⁶⁰を含むペプチドは、最も有効であるために、一般に、リン酸化セリン（例えば、354位に対応する）を含む形態で提供される。Y³²⁸を含むペプチドが、さらに提供され得る。本明細書中上記で論じた機構に加えて、チロシン328および360のリン酸化は、 Bcrの構造を変化させることが意図される。Bcrは、他のSer／Thrキナーゼに構造的に関連しない、新規なSer／Thrキナーゼである。チロシン328および360は、Bc rの機能において重要な２対のシステインの周囲に位置する。チロシン360および／または328がリン酸化されると、それが、Bcrの機能を妨害する立体構造変化を誘導することが、本発明者らにより意図される。従って、チロシン328周囲の配列を含むペプチドは、本発明の別の局面を形成する。本発明のBcr-Ablペプチドは、約３〜４アミノ酸から約５、６、７、８、９、1 0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または約20アミノ酸長までの、事実上任意の長さであり得る。長さ約25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 、250、300、350、400、450、または約500アミノ酸のペプチドもまた使用され得る。例示的なより短いペプチドは、配列番号24の配列に基づくペプチドである。配列番号９（配列番号１の314〜320位）（チロシン３１６の周囲）が、さらに特定の実施態様において使用され得る。例示的なより長いペプチドは、配列番号23（配列番号１の299〜351位）および配列番号28を含む。本発明のさらなる実施態様は、完全長正常Bcrタンパク質の使用である。正常B crタンパク質は、1271アミノ酸を有し、そしてその配列はCampbellおよびArling haus（1991）（本明細書中に参考として援用される）中に示される。２．結合部位ペプチド Bcr-Abl上の、アダプター分子のために重要な結合部位の配列を含む結合部位ペプチドもまた、本発明において使用され得る。一般に、結合部位ペプチドは、アダプター分子（例えば、Grb2、Shc、Crkl、Ras GapまたはBcrのＮ末端超らせん領域）に結合することで特徴付けられる。好ましい結合部位ペプチドは以下のとおりである：ShcのAbl SH3結合プロリン（protein）-リッチ領域に結合するペプチド；Crkl上のプロリン-リッチAbl結合部位に結合するペプチド；p120 Ras GapのSH2ドメインに結合するペプチド；およびBcrのＮ末端超らせん領域に結合するペプチドまたはタンパク質。BcrのＮ末端超らせん領域に結合するペプチドまたはタンパク質は、配列番号２〜配列番号７のいずれか１つのペプチドを包含する。３．生物学的機能等価物改変および変化が、リン酸化の部位であるチロシン残基および他の重要な残基以外で、本発明のペプチドの配列においてなされ得、そしてなお同様なまたは他の所望の特徴を有するペプチドを得ることができる。当業者は、本願の開示のもとに、ペプチドのリン酸化のチロシン部位も、他の重要な残基（例えば、配列番号１の179位のアスパラギン、または配列番号22におけるセリン354等価物）も、置換を受けることができないことを理解するはずである。しかし、他のアミノ酸の機能等価物は、本発明において受容可能である。機能等価物において、特定のアミノ酸が、タンパク質構造において、構造（例えば、基質分子上の結合部位）との相互作用結合能力の認識可能な損失なしに、他のアミノ酸に置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列（または、もちろん、その基礎をなすDNAコード配列）においてなされ得、そしてそれでも同様な（アゴニスト性の）性質を有するタンパク質を得ることができる。従って、種々の変化が、チロシン含有タンパク質またはペプチド（あるいは基礎をなすDNA）の配列において、それらの生物学的有用性または活性の認識可能な損失なしになされ得ることが、本発明者らにより意図される。同様に、同じ考察が、拮抗する（例えば、アンタゴニスト性の）性質を有するタンパク質またはペプチドを作製するために使用され得る。機能等価物に関して、分子の定義された部分内になされ得、そしてなお受容可能なレベルの等価な生物学的活性を有する分子を生じ得る変化の数に対する限界が存在するという概念が、生物学的機能等価タンパク質またはペプチドの定義において固有であることは、当業者により十分に理解される。従って、生物学的機能等価ペプチドは、本明細書において、その中で特定の（大部分でもすべてでもない）アミノ酸が置換され得るペプチドとして定義される。特に、より短いペプチドに関する場合、より少ない変化が寛容されることが意図される。もちろん、異なる置換を有する複数の異なるタンパク質／ペプチドが容易に作製され得、そして本発明に従って使用され得る。特定の残基が、タンパク質またはペプチドの生物学的または構造的特性に対して特に重要であると示される場合（例えば、本発明のチロシン）、一般に、そのような残基は交換されないかもしれないこともまた、十分に理解される。これは、先に詳細に記載したように、明らかに本発明における場合である。一般に、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。アミノ酸側鎖置換基の大きさ、形および型の解析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて正に荷電した残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンはすべて類似の大きさであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはすべておおむね類似の形を有していることが示される。それゆえ、これらの考察に基づき、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが、本明細書において生物学的機能等価物として定義される。より定量的な変化をもたらすために、アミノ酸の疎水親水指数（hydropathic index）が考慮され得る。各々のアミノ酸に、それらの疎水性および電荷特性に基づいて、疎水親水指数が割り当てられている。それらは以下のとおりである：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1 .8）；グリシン（-0.4)；スレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）：トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）。タンパク質に相互作用性生物学的機能を与えることにおける疎水親水アミノ酸指数の重要性は、一般に、当該分野において理解されている（KyteおよびDoolit tle，1982、本明細書中に参考として援用される）。特定のアミノ酸が類似の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を保持し得ることが知られている。疎水親水指数に基づいて変化を作製する際に、その疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、 ±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして±0.5以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた理解される。米国特許第4,554,101号（本明細書中に参考として援用される）は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるような、タンパク質の最大の局所的平均親水性が、その免疫原性および抗原性（すなわち、タンパク質の生物学的特性）と相関すると記載する。アミノ酸が類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお生物学的等価物、そして特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解される。米国特許第4,554,101号において詳細に記載されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0±１）；グルタミン酸（+3.0±１）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；スレオニン（-0.4 ）；プロリン（-0.5±１）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。類似の親水性値に基づいて変化を作製する際に、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして±0.5以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。議論が、アミノ酸変化から生じる機能等価ポリペプチドに集中したが、これらの変化が、遺伝コードが縮重性（degenerate）であり、そして２つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードし得ることも考慮して、コードするDNAの変化によりもたらされ得ることが理解される。このような実施態様における使用のために、そして他の使用（例えば、プローブおよびプライマーなどの設計における使用）のために、アミノ酸およびそれらのコドンの表を本明細書中に示す（表１）。本明細書中に記載のペプチド性化合物に加えて、本発明者らはまた、他の立体的に類似の化合物が、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように作製（formul ate）され得ることを意図する。そのような化合物（これはペプチド模倣物と称され得る）は本発明のペプチドと同じ方法で使用され得、そして従ってそれらもまた機能等価物である。構造的機能等価物の生成は、当業者に公知のモデリングおよび化学的設計の技術により達成され得る。モデリングの技術は現在周知であり、そしてそのような方法により、所定のペプチドの機能を模倣する化合物が設計され得、次いで合成され得る。すべてのそのような立体的に類似の構築物が、本発明の範囲内にあることが理解される。４．ペプチド合成一般に、約45アミノ酸未満のペプチドが、化学的に合成される。ペプチドの合成は、固相法のような従来のペプチド合成技術を用いて（例えば、Applied Bios ystems Model 430A Peptide Synthesizer，Foster City，CaliforniaまたはVega Synthesizer，DuPont Inc.，Wilmington，Delawareのような市販のペプチド合成機の使用により）容易に達成される。固相技術は、標準的なt-ブトキシカルボニル（t-Boc）化学作用を用いた自動ペプチド合成機を用いるMerrifieldの方法（Merrifield，1963、本明細書中に参考として援用される）を使用する。合成されるペプチドのアミノ酸組成を、アミノ酸分析により（例えば、Waters Pico-tag analyzer（Medford，Massachusetts ）を用いて）測定して、それらが予想される組成に対応することを確かめる。ペプチドの純度は、配列分析またはHPLCにより測定される。一般に、合成ペプチドのアミノ末端が、Ｎ末端アセチル基を有することにより、分解から保護されることが所望される。これは、ペプチドの合成の間に、無水酢酸を使用してＮ末端をアセチル化することにより、達成され得る。同様に、カルボキシル末端についての保護は、実施例２に記載のように、アミド結合を形成することにより達成され得る。一般に、そのような保護基は、一旦合成ペプチドが細胞内に導入されると、タンパク質分解酵素による合成ペプチドの分解を軽減する。リン酸化形態のペプチドは、インビトロで、ペプチドの合成のための標準的な方法を用いることにより得られる。リン酸化されるべきアミノ酸は、側鎖保護なしに導入される。末端残基は、Boc保護アミノ酸の直接取り込みか、または遊離アミノ基のBoc₂Oでのアシル化のいずれかによりBoc保護されるべきである。樹脂を洗浄し、そして反応容器中に入れる。ペプチド樹脂および反応容器を、高度の減圧下で40℃で一晩乾燥し、ゴム隔壁で密封し、そして乾燥アルゴンでフラッシュする。 DNAグレードのテトラゾールのアンプルを、乾燥DMF、DMAまたはCH₃CNおよび50 eq.中に溶解し、そして乾燥したアルゴンでフラッシュした気密シリンジを用いて反応容器に移す。10 eq.のジ-t-ブチル-N,N,-ジソプロピルホスホルアミダイトを、乾燥した、アルゴンでフラッシュした気密シリンジを用いて再度反応容器に添加し、そして１時間おだやかに撹拌する。反応容器の内容物を、焼結ガラス漏斗に移し、そして樹脂を十分量の溶媒で洗浄する。DMF中の20 eq.のt-ブチルペルオキシドを樹脂に添加し、そして30分間放置する。通常の方法で樹脂を洗浄しそして乾燥する。標準的な方法をクリーベイジ（cleavage）のために使用する。次いで、これらの方法で合成されるペプチドは、所定の量にアリコートされ、そして従来の方法で（例えば、水溶液中で、あるいはさらにより好ましくは、粉末または凍結乾燥状態で）使用まで保存される。一般に、ペプチドの相対的な安定性のため、これらは、所望であれば、滅菌水溶液中で、かなり長期間の間（例えば、６ヶ月以上まで、事実上任意の水溶液中で）、認識可能な分解も免疫原性活性の損失もなしに、容易に保存され得る。しかし、延長された水性の保存が意図される場合、一般に、7.0〜7.5のpHを維持するための緩衝液（例えば、Tris-HClまたはリン酸緩衝液）を包含する薬剤を含むことが所望される。さらに、微生物増殖を阻害する薬剤（例えば、アジ化ナトリウムまたはメルチオレート（merthiolate））を含むことが所望され得る。水性状態での延長された保存のために、溶液を４℃で、より好ましくは凍結して保存することが所望される。もちろん、ペプチド（単数または複数）が凍結乾燥された状態または粉末化された状態で保存される場合、ペプチドは、例えば、計量されたアリコートで（これは所定量の水（好ましくは蒸留水）または緩衝液で使用前に再水和される）、事実上無期限に保存され得る。約50アミノ酸ぐらいより長いペプチドは、好ましくは、本明細書に記載のように、プラスミドまたはウイルス発現系により提供される。５．遺伝子治療１つ以上のチロシン含有ペプチド、または正常Bcrをコードし、そして発現するベクターは、本発明のさらなる局面を形成する。組換え体の発現を使用して、所望のような任意のチロシン含有ペプチドを提供し得るが、一般に中間またはより長い長さのペプチドを提供するのが好ましい。例示のベクターは、Bcr-159フラグメント（配列番号５）または正常Bcrを発現するベクターであり、Bcr-Ablキナーゼを阻害してBcr-Ablの悪性形態を直接中和するために使用され得る。さらなるベクターは、配列番号28に記載のポリペプチドを発現するベクターである。本発明において使用するための適切なBcr-Abl DNA配列は、当業者に公知である。さらに、当該分野における標準的な知識および本明細書に記載の情報（例えば、表１）があれば、例えば、所望のペプチド配列をコードする任意の所定のDN AフラグメントのクローニングまたはPCRによる合成または作製は容易である。本発明の意味する遺伝子治療のための第一のアプローチは、化学的または物理的のいずれかで細胞膜を透過することによって、目的の遺伝子を含むDNAを細胞へトランスフェクトすることである。このアプローチは、一般に身体から一時的に取り出し得、そしてこの処置の細胞傷害性に耐性であり得る細胞（すなわち、リンパ球）に制限される。しかし、それは本発明の使用に極めて適切である。リポソームまたは特定の脂質および両親媒性ペプチドで形成されるタンパク質コンジュゲートが、本明細書に記載のように、トランスフェクションに使用され得る（Stewartら、1992；Torchilinら、1992；Zhuら、1993）。遺伝子材料を細胞へ直接移入するための裸のDNAおよびプラスミドの使用もまた可能である（Wol feら、1990）。第２のアプローチは、細胞に侵入するウイルスの本来の能力を利用し、ウイルスとともにウイルス自身の遺伝子材料を運ぶ。レトロウイルスは、それら自身の遺伝子を宿主のゲノムに組み込むそれらの能力のため、遺伝子送達ベクターとして期待されており、大量の外来遺伝予材料を移入し、広いスペクトルの種および細胞タイプに感染し、そして特定の細胞株においてパッケージングされる（Mill er、1992）。第３の方法は、アデノウイルス；ヘルペス単純ウイルス（HSV）（米国特許第5 ,288,641号、本明細書中に参考として援用される）；サイトメガロウイルス（CM V）；およびアデノ随伴ウイルス（AAV）（例えば、本明細書中に参考として援用される、Kotin（1994）により、および米国特許第5,139,941号に記載のウイルス）のような他のウイルスを使用し；これらのウイルスを操作して遺伝子移入のためのベクターとする。多くのウイルスが、首尾良く遺伝子発現を行うことが実証されている。用語「ヘルペルウイルス」は、本明細書では、特にヘルペス単純ウイルス（HSV）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、サイトメガロウイルス（C MV）および仮性狂犬病ウイルス（PRV）をいうために使用される。レトロウイルスアプローチを用いる場合、所望のBCRコード配列をレトロウイルスベクターに挿入し；このベクターを、両種向性宿主範囲欠損ウイルス（amph otropic host range defective virus）を生成するパッケージング細胞株にトランスフェクトする。このウイルスは、自己移植患者の骨髄由来の幹細胞に感染するのに用いられる。第２世代のレトロウイルスベクターを用いる遺伝子送達が報告されている。Ka saharaら（1994）は、通常、マウス細胞にのみ感染するモロニーマウス白血病ウイルスの操作された変異体を調製し、そしてウイルスがエリスロポエチン（EPO ）レセプターを有するヒト細胞に特異的に結合し、そして感染するようにエンベロープタンパク質を改変した。このことは、EPO配列の一部をエンベロープタンパク質に挿入して、新規の結合特異性を有するキメラタンパク質を作製することによって達成された。腫瘍細胞マーカーを標的にするウイルスベクターを操作することは、Kasaharaら（1994）の研究を考慮すれば、現在容易である。もちろん、いずれかのウイルス送達システムを用いる場合、ビリオンを十分に精製して、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよびその他の発熱物質のような所望しない混入物を実質的に含まないようにする。それにより、ベクター構築物を投与された細胞、動物または個体において、所望しないずれの反応も生じない。ベクターを精製する好適な手段は、塩化セシウム勾配遠心分離のような浮遊密度勾配の使用を包含する。（ａ）アデノウイルスヒトアデノウイルスは、核酸発現ベクターを組織に導入するためのさらなる手段である。アデノウイルスは、約36kbのゲノムサイズを有する二本鎖DNA腫瘍ウイルスである。真核生物遺伝子発現のためのモデルシステムとして、アデノウイルスは広範に研究されており、そしてよく特徴付けされ、このことは、アデノウイルスを、遺伝子移入システムとしてのアデノウイルスの開発に注目されるシステムにしている。このグループのウイルスは、増殖および操作するのに容易であり、そしてそれらはインビトロおよびインビボにおいて広い宿主範囲を示す。溶解的に感染された細胞では、アデノウイルスは、宿主タンパク質の合成を停止し、細胞機構に大量のウイルスタンパク質の合成を指令し、そして多量のウイルスを産生し得る。一般に、アデノウイルス遺伝子移入システムは、組換え操作されたアデノウイルスに基づく。このアデノウイルスは、そのゲノムの一部分（例えば、E1）の欠失によって、複製不能にされているが、なお感染に対するその能力を保持する。さらなる欠失がアデノウイルスゲノム中に作製されるとき、相対的に大きな外来タンパク質が発現され得る。例えば、E1およびE3領域の両方を欠失したアデノウイルスは、10kbまでの外来DNAを保有し得、そして高い力価で増殖し得る。移入遺伝子の持続性発現は、アデノウイルス感染後に生じる。外来遺伝子およびそれらのタンパク質産物を細胞に送達するためのアデノウイルスシステムの特定の利点は、（ｉ）ウイルスDNAの比較的大きな断片を外来DNA で置換する能力；（ii）組換えアデノウイルスの構造的安定性；（iii）アデノウイルスのヒトへの投与の安全性；（iv）アデノウイルス感染と、ガンまたは悪性疾患とに任意の既知の関連性がないこと；（ｖ）組換えウイルスの高力価を得る能力；および（vi）アデノウイルスの高い感染性を包含する。アデノウイルスベクターのレトロウイルスに勝るさらなる利点は、より高いレベルの遺伝子発現を包含する。さらに、アデノウイルスの複製は、レトロウイルスの配列とは異なり、宿主遺伝子の複製に依存しない。E1領域内のアデノウイルストランスフォーミング遺伝子は、容易に欠失し、そしてなお効率的な発現ベクターを提供し得るので、アデノウイルスベクターからのオンコジーンの危険性は、無視し得ると考えられる。フィラデルフィア染色体について陽性の試験結果を示し、そしてアデノウイルス媒介性遺伝子移入に対する医学的適応症が確定されているヒト被験体を、アデノウイルスに対する抗体の存在について試験する。抗体が存在し、そして患者が薬理学的物質または天然に存在する物質のいずれかに対してアレルギーの病歴を有する場合、厳密な臨床観察の下で、10³〜10⁶のオーダーの組換えアデノウイルスの試験用量の適用が示唆される。本発明のBCRペプチドまたは融合ペプチドを提供する組換えアデノウイルスは、食品医薬品局に許容され得る任意の方法によって、ヒト被験体に投与するために、調製され、そして精製される。その方法は、塩化セシウム密度勾配遠心分離、ならびにそれに続く効力および純度についての試験を包含するが、これらに限定されない。ウイルスは、任意の薬理学的に受容可能な溶液中で、ボーラスとしてまたは経時的な注入としてのいずれかで、骨髄への投与によって患者に投与される。一般的に言えば、投与される機能的ウイルス粒子の有効数は、５×10¹⁰〜５×10¹²の範囲であり得ると考えられる。患者は、少なくとも48時間入院させ、急性および遅延型の副作用をモニターし得る。フィラデルフィア染色体陽性細胞の骨髄レベルをモニターし得る。処置の調節は、異なるプロモーターを用いるアデノウイルス構築物または投与されるpf uの数の変化を包含し得る。６．薬学的処方物（ａ）リポソーム本発明のペプチドは、リポソームと組み合わせ得る。これらのリポソーム調製物は、インビボおよびエクスビボプロトコルの両方、例えば、骨髄パージングにおいて使用され得る。リポソームは、水性媒体中に分散するリン脂質から形成され、そして自発的に多重薄膜状の（multilamellar）同心二重層小胞体（マルチラメラ小胞（MLV）とも呼ばれる）を形成する。MLVは、一般に、25nm〜４μmの直径を有する。MLVの音波処理は、コア中に水溶液を含む、200〜500Åの範囲の直径を有する小さな単ラメラ小胞（SUV）の形成をもたらす。リポソームは、細胞膜と多くの類似点を有し、そしてBCRペプチドのためのキャリアとして本発明とともに使用することが意図される。それらは、水溶性物質および脂溶性物質の両方として広く適切であり、そして捕獲、すなわち、それぞれ、水性空間中および二重層自体の中に捕獲され得る。薬物を保有するリポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することによって、活性薬剤の部位特異的送達にさえ使用され得る。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に公知である。リン脂質は、水中に分散するとき、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比でリポソームは好適な構造である。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度、および２価の陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、高温では、相転移を行い、それはそれらの透過性を顕著に改変させる。相転移は、ゲル状態として知られる、密接に詰め込まれた規則正しい構造から、流体状態として知られる、緩く詰め込まれた規則性に乏しい構造への変化を包含する。これは、特徴的な相転移温度で生じ、そしてイオン、糖および薬物に対する透過性の増加をもたらす。温度に加えて、タンパク質への曝露は、リポソームの透過性を改変し得る。シトクロムｃのような特定の可溶性タンパク質は、二重層に結合し、これを変形させ、そして貫通し、それによって透過性の変化を引き起こす。コレステロールは、見かけ上、リン脂質をよりきつく詰め込むことによって、このようなタンパク質の貫通を阻害する。溶質を捕獲する能力は、異なるタイプのリポソーム間で変動する。例えば、ML Vは、溶質を捕獲することにおいて適度に効率的であるが、SUVは、極めて非効率的である。SUVは、サイズの分布において均一性および再現性の利点を与えるが、サイズと捕獲効率との間の妥協点は、大きな単ラメラ小胞（LUV）によって与えられる。これらは、エーテル蒸発によって調製され、そして溶質の捕獲ではML Vよりも３〜４倍効率的である。リポソームの特徴に加えて、化合物の捕獲における重要な決定因子は、化合物自体の物理化学的特性である。極性の化合物は、水性空間中に捕獲され、そして非極性の化合物は、小胞の脂質二重層に結合する。極性の化合物は、透過によるか、または二重層が破壊されるときに放出されるが、非極性の化合物は、温度によりまたはリポタンパク質への曝露によって二重層が破壊されなければ、二重層と結びついたままである。両方のタイプは、相転移温度で最大流出速度を示す。リポソームは、４つの異なる機構によって細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球のような細網内皮系の貧食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水的もしくは静電的な力、または細胞表面成分との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；細胞質中へのリポソーム内容物の同時放出を伴う、リポソームの脂質二重層の原形質膜中への挿入による原形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容物をなんら伴うことなく、リポソーム脂質の細胞膜または細胞下膜への移入、またはその逆。どのメカニズムが働くのか、そして１つを超えるメカニズムが同時に働き得るのかを決定することは、しばしば困難である。静脈内に注射されたリポソームの運命および性質は、サイズ、流動性、および表面電荷のようなそれらの物理的特性に依存する。それらは、それらの組成および血液内での半減期（数分から数時間の範囲）に依存して、何時間または何日間にもわたって組織に持続し得る。MLVおよびLUVのようなより大きなリポソームは、急速に細網内系の貧食細胞によって取り込まれるが、循環系の生理機能はほとんどの部位でそのような大きな種の排出を抑制する。それらは、肝臓または脾臓の洞様血管のような大きな開口部または孔が毛細管内皮に存在する場所でのみ排出され得る。それゆえ、これらの器官は、取り込み優先部位である。一方、SUV は、より広い組織分布を示すが、なお肝臓および脾臓に高度に局在化される。一般に、このインビボでの挙動は、リポソームの標的能力を、リポソームの大きなサイズにアクセス可能な器官および組織のみに制限する。これらは、血液、肝臓、脾臓、骨髄およびリンパ系器官を包含する。標的化は、一般に、本願発明の見地からは制限ではない。しかし、特異的な標的化を所望するのであれば、これを達成すべき方法を利用し得る。抗体は、リポソーム表面に結合し、そして抗体およびその薬物内容物を、特定の細胞タイプ表面上に位置する特異的抗原レセプターに向かわせるために使用され得る。炭水化物決定基（細胞-細胞認識、相互作用および接着における役割を果たす糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）はまた、それらがリポソームを特定の細胞タイプに向かわせる能力を有するとき、認識部位として使用され得る。ほとんどの場合、リポソーム調製物の静脈内注射を使用することが意図されるが、他の投与経路もまたあり得る。もちろん、エクスビボプロトコルによる投与は容易である。（ｂ）注射可能物質本発明の組成物は、有効量のチロシン含有ペプチド（単数または複数）、リポソーム、またはウイルスベクターを含み、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に溶解されるか、または分散される。用語「薬学的または薬理学的に受容可能な」は、動物または適切にはヒトに投与する場合、副作用、アレルギー作用または他の所望しない作用を引き起こさない分子実体および組成物をいう。本明細書において使用される「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。従来の任意の媒体または薬剤が有効成分と配合禁忌である場合を除いて、治療組成物中におけるその使用が意図される。補助有効成分もまた、組成物に取り込まれ得る。活性な化合物は、一般に、非経口投与用に処方され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹膜腔内経路を介する注射用に処方される。活性成分または有効成分としてチロシン含有ペプチドまたは発現ベクターを含む水性組成物の調製は、本明細書の開示内容を考慮すると当業者に公知である。代表的には、このような組成物は、流体溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物質として調製され得る；溶液または懸濁液を調製する（注射前に流体を添加することに基づく）ため使用するのに適切な固体形態もまた調製され得る；そして調製物はまた、乳化され得る。注射可能物質の使用に適切な薬学的剤形としては、滅菌水性溶液または分散液；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む処方物；および滅菌注射溶液または分散体の用時調製のための滅菌散剤が挙げられる。全ての場合において、剤形は、滅菌状態であるべきであり、そして容易な注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。遊離の塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と、適切に混合されて水中で調製され得る。分散体はまた、グリセロール、流体のポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含む。チロシンベースのペプチドは、中性または塩の形態で組成物中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ酸基で形成される）を含み、そしてそれは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および流体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散体媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散体の場合必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の活動の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むのが好ましい。注射組成物の遅延型吸収は、吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中における使用によって行われ得る。滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙した種々の他の成分とともに取り込み、続いて滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散体は、塩基性の分散媒体および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む種々の滅菌された有効成分を、滅菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌散剤の場合、調製の好適な方法は、減圧乾燥およびフリーズドライ技術であり、これらは、その予め滅菌濾過した溶液から、有効成分と任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる。筋肉内注射のための、さらなるまたは高度に濃縮された溶液の調製もまた意図される。この点について、溶媒としてのDMSOの使用が好ましく、これは、極めて急速な貫通を生じ、高濃度の活性ペプチドまたは薬剤を小さな領域に送達する。処方に際し、用量処方物と適合可能な様式および治療上有効な量で溶液が投与される。処方物は、上記の注射溶液のタイプのような種々の用量剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた用いられ得る。水性溶液での非経口投与のために、例えば、必要ならば、溶液を適切に緩衝化すべきであり、そして最初に流体の希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースで等張化する。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹膜腔内投与に特に適切である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本明細書の開示内容を考慮すれば、当業者に公知である。例えば、１回の用量を１mLの等張NaCl溶液中に溶解し得、そして1000mLの皮下注入液に添加するか、または適切な注射部位で注射するかのいずれかである（例えば、「Remington's Pharmace utical Sciences」15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照のこと）。試験される被験体の状態に依存して、用量におけるいくらかの改変が必然的に生じる。投与の担当者は、いずれにせよ、個々の被験体について適切な用量を決定する。静脈内または筋肉内注射のような非経口投与のため処方される化合物に加えて、他の薬学的に受容可能な剤形としては、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体；経時放出カプセル；およびクリーム、ローション、含嗽剤、吸入剤、座剤などを含む、現在使用されている他の任意の剤形が挙げられる。７．骨髄除去本発明は、白血病患者のヒト骨髄サンプルを取り出すための最も実際的な系を提供する。標準的なヒト骨髄移植のための一般的なプロトコルは、医学分野では既に確立されており、従ってそれは当業者には利用可能な技術である。白血病患者の代表的な臨床的治療技術において、患者は一般的に化学療法(例えば、ダウノマイシン、Ara-C、GMCSF)がなされる。化学療法処置は、代表的には処置した患者の50％に細胞遺伝学的寛解を生じる。細胞遺伝学的寛解は、白血病細胞(フィラデルフィア染色体陽性)と正常細胞(フィラデルフィア染色体陰性) との比の、約10,000/1から1/1への減少により定義される。次いでこれらの患者の骨髄が、患者の免疫表現型に基づいて分離に供される。本発明者らは、DR陰性系列CD33陰性のDC34陽性表現型(すなわち、DR陰性CD34細胞株の分画を通じて)を定義する。免疫表現型に基づくこの分離は、ほとんどの場合、正常細胞に対する白血病細胞の比をさらに２log(100×)引き下げる。次いで、記載したBCR-ペプチド処置法を本明細書中に記載の患者の骨髄サンプルに用いることにより、正常細胞に対する白血病細胞(フィラデルフィア染色体陽性)の比を、なお、さらに２または３logまでにさえ有利に減少させることが予想され得る。一般的には、骨髄サンプルを約10μMのチロシン含有BCRペプチド( 単数または複数)に曝す次いで、この処理した骨髄を患者に移植し戻す。それゆえ、この方法は、患者の正常な細胞を損傷または阻害することなしに、患者の白血病を処置する高度に選択的な方法を提供する。本技術は、CMLを患う全患者集団に適応し得ない一方(高齢(すなわち、ほとんどのメディカルセンターで50才を超える年齢)またはドナーの利用率（CML患者の 25％または(of)30％がドナーを有する）による、異種遺伝子骨髄移植に適したCM L患者の少ないパーセントの理由による)、それにもかかわらず本発明は、現在用いられている非前処置骨髄サンプルを用いる手順に比較して、白血病患者を処置するための骨髄移植手順の全体の効率に顕著な向上を提供する。８．放射性ヨウ素化のための標準物としてのペプチドチロシン残基を有する本発明のBcr/Ablペプチドをまた放射性ヨウ素化用の標準物として提供する。チロシン含有ペプチドは、少なくとも３〜４アミノ酸長、好ましくは10〜12アミノ酸長であり、そして14〜16または20〜25アミノ酸長もしくはそれより長いものであり得る。これらのペプチドは、試験放射性ヨウ素化ペプチドまたはタンパク質の特異的放射活性を本発明の放射性ヨウ素化ペプチドと比較することによる、試験ペプチドまたはタンパク質の放射性ヨウ素化の効率をテストするためのコントロールとして有用である。タンパク質の放射性ヨウ素化はBailey 1984中(本明細書中に参考として援用される)で議論されている。放射性ヨウ素化分子は、例えば、中間代謝の研究、レセプターに結合しているアゴニストおよびアンタゴニストの決定、そして組織および生物学的体液中の生理学的活性分子の定量的測定において主に重要である。これらの研究においては、非常に低濃度の特定の物質を測定することが必要とされ、そしてそれは高い比放射活性の放射活性標識されたトレーサー分子を必要とする。そのようなトレーサーは、特にペプチドおよびタンパク質の場合、放射性ヨウ素化により容易に生成される。ヨウ素の２つのγ線放射性ラジオアイソトープである、¹²⁵Iおよび¹³¹Iが広範に利用され得る。γ線放射物に関して、これらはサンプル調製する必要なしにγ カウンターで直接測定され得、これは³Hおよび¹⁴Cのようなβ線放射性核種とは対照的である。¹²⁵Iの計数効率は、¹³¹Iの計数効率の約２倍である。従って、ほとんどの状況下で、¹²⁵Iが放射性ヨウ素化のための核種として選択される。タンパク質の放射性ヨウ素化のためのいくつかの異なる方法が開発されている (Bolton 1977；本明細書中に参考として援用される)。これらは、¹²⁵I^-を反応性種¹²⁵I₂または¹²⁵I⁺に転換する酸化剤の性質において主に異なる。これらの反応性種はタンパク質のチロシン残基中に置換を生じるが、ヒスチジン、システイン、およびトリプトファンのような他の残基中の置換が生じ得る。 HunterおよびGreenwoodにより開発されたクロラミン-Ｔ法(1962；本明細書中で参考として援用する)が、タンパク質またはペプチドの放射性ヨウ素化のために一般的に用いられる技術である。これは放射活性ヨウ化物が水溶液中でクロラミン-Ｔにより酸化される簡単な方法である。酸化は過剰な還元剤の添加により短時間の後に停止される。いくつかのタンパク質またはペプチドは、比較的強い酸化条件下で変性してしまうため、より穏やかな条件を用いる他の放射性ヨウ素化の方法、例えば、ラクトペルオキシダーゼ法(Marchalonis，1969)が考案されている、材料：１．Na¹²⁵I：1mCi、濃度100 mCi/mL。２．緩衝液Ａ：0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4) ３．緩衝液Ｂ：0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4) ４．緩衝液Ｃ：1M 塩化ナトリウム、0.1％ウシ血清アルブミン、および1%ヨウ化カリウム含有0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(最終pH 7.4) ５．クロラミン-Ｔ溶液：緩衝液Ｂ中で２mg/mLの溶液を使用直前に作製する。６．還元剤：緩衝液Ｃ中で１mg/mlのメタ重亜硫酸ナトリウムを使用直前に作製する。７．ヨウ素化されるべきタンパク質またはペプチド：0.5〜2.5mg/mL溶液を緩衝液Ｂで作製する。方法：１．小型のプラスチック試験管(1×5.5cm)中に、ヨウ素化されるべきタンパク質またはペプチド(10μg)、放射活性ヨウ化物(５μL)、緩衝液Ａ(50μL)、およびクロラミン-Ｔ溶液(25μL)を連続的に添加する。２．穏やかな振盪による混合の後、その溶液を放射性ヨウ素化が生じるように 30秒間放置する。３．メタ重亜硫酸ナトリウム溶液(500μL)を添加し、放射性ヨウ素化を停止させ、そして得られた溶液を混合する。次いで精製の準備をする。放射性ヨウ素化タンパク質またはペプチドの精製：放射性ヨウ素化タンパク質またはペプチドのほとんどの使用について、精製ができるだけ迅速に達成される制約を有しつつ、できるだけ純粋な標識種を有することが所望される。この目的のために、全ての分離技術で最も広範に用いられる技術はゲル濾過である。種々のタイプのセファデックス樹脂（例えば、G-50、G-75、およびG-100）が、混合物中に存在する分子のサイズの差に依存して使用され得る。代表的には、この混合物をセファデックス樹脂のカラム(1×25 cm)に添加し、そして0.15M塩化ナトリウムおよび0.1％ウシ血清アルブミンを含むpH7.4の0.05M リン酸ナトリウム緩衝液で溶出する。画分(0.5〜1.0mL)をプラスチック試験管に回収しそしてアリコート(10μL)を計数する。これらの結果を用いて、溶出プロフィールを描く。いくつかのパラメーターを用いて、標識タンパク質またはペプチドの質を評価する。タンパク質の比放射活性が、タンパク質またはペプチドの単位質量当たりに取り込まれた放射活性の量である。それを、用いた総放射活性、ゲル濾過カラムに移したヨウ素化混合物の量、ならびに標識タンパク質またはペプチド、損傷成分、および残存放射性ヨウ素中に存在する放射活性の量により計算し得る。しかし、実際には、計算は、通常、損傷および非損傷タンパク質を考慮には入れない。従って、比活性は、放射性ヨウ素化手順の収率、放射性ヨウ化物の量、および用いたタンパク質またはペプチドの量から、それら２反応成分の顕著な損失がないものと仮定して、計算する。反応収率は、単にタンパク質中への放射性核種の取り込みパーセントである。クロマトグラフィーカラムからの溶出ピークに生じる物質の性質を、放射性ヨウ素化されるタンパク質またはペプチドに対する特異的抗血清を用いることにより確認し得る。２つのピークを生じる異なる画分のアリコート(10μL)を、それぞれが同じカウント数(100μL当たり(例えば、5000〜10,000カウント/分))を与えるように希釈する。それらのサンプルを過剰の抗血清とともにインキュベートする。免疫反応性タンパク質を含むサンプルのみが、抗血清と反応する。次いで抗体分子と会合する放射活性タンパク質の量を、ラジオイムノアッセイにより測定し得る。放射性ヨウ素化タンパク質またはペプチドを含むピーク(単数または複数)を同定すれば、放射性ヨウ素化の収率を、ヨウ化物ピークに関連する総カウントの総計に対するタンパク質またはペプチドピークに関連する総カウントの比により計算し得る。放射性ヨウ素化タンパク質またはペプチドはできる限り未標識種と同じ性質を有するべきであることが重要である。それゆえ両分子の挙動を電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーで確認し得る。特異的な抗体へのこの２種の結合能をラジオイムノアッセイにより評価し得る。標識タンパク質またはペプチドを保存するために、精製後直ちに、サンプルを小さなアリコートに分割し、次いで急速凍結し、そして-20℃に保存する。あるいは、このアリコートを凍結乾燥し得る。各アリコートを融解し、そして１回のみ使用する。放射性ヨウ素化タンパク質またはペプチドは、その安定性に顕著な差がある。数週間保管し得るものもあれば(それは約60日の¹²⁵I半減期を有する) 、数日しか保存し得ないものもある。必要であるなら、標識化タンパク質を使用前に、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより再精製し得る。クロラミン-Ｔ法によるタンパク質残基のチロシン残基のヨウ素化の最適pHは約pH7.4である。より低い収率のヨウ素化タンパク質は、約6.5より下および約8. 5より上のpH値で得られる。実際には、pH8.5より上では、ヒスチジン残基のヨウ素化に好適であるようである。クロラミン-Ｔ反応混合物の総容量を、放射活性ヨウ素のタンパク質またはペプチドへの迅速且つ効率的な取り込みを達成し得るように実際にできる限り低くするべきである。用いる反応物質は小容量であるため、反応開始時の適切な混合を確実にすることが必須である。不適切な混合は、この手順による放射性ヨウ素化タンパク質の収率を低下させる最も一般的な原因の１つである。もしタンパク質またはペプチドが50μgのクロラミン-Ｔの使用により深刻な損傷を受けた場合、さらに少量の酸化剤(10μg未満)を用いて放射性ヨウ素化を繰り返すことが有用であり得る。用い得るクロラミン-Ｔの最小量は、他の要因のうち、ヨウ素化されるべきタンパク質の性質および量に依存する。通常、クロラミン-Ｔ法は室温で実施される。しかし、もしタンパク質が特に不安定であるなら、その手順を低温で行うことが有益であり得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すことに包含される。本発明の実施において十分機能するために、本発明者らが発見した代表的な技術に従った実施例に開示された技術は当業者に理解されるはずであり、それゆえその実施についての好ましい様式を構成することが考慮され得る。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が開示される特定の実施態様においてなされ得ること、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様なまたは類似した結果が得られることを理解する。実施例Ｉ材料および方法細胞株K562：供給源；アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、Rock ville、MD。単離；急性転化CMLの女性の胸膜滲出液由来。LozzioおよびLozzio（ 1975）により確立された。この細胞株は、Mbcr（b3/a2転座）内の染色体22上の切断点を有するPh¹の複数のコピーを含有する。細胞を、37℃および５％ CO₂にて、10％ウシ胎児血清（Gibco Laboratories、Grand Island、NY）を供給したRP MI1640増殖培地中で増殖させる。細胞株SUP-B13およびSUP-B15：供給源：細胞株を、Steve D.Smith博士、Departm ent of Pediatrics、University of Chicagoから得た。単離：細胞株を、1983年にCaliforniaのStanfordの小児病院に入院していた８歳の男児の第１および第２の骨髄再発サンプルからそれぞれ得た（Naumovskiら、1988）。細胞株は、mbcr中の染色体22上のALL特異的切断点を有するPh¹染色体を含有する。しかし、これらの細胞株は、それらを関連させるが独特である、いくつかの細胞表面抗原の発現において異なる。細胞を、37℃および５％ CO₂にて、20％ウシ胎児血清（Gibco Laboratories、 Grand Island、NY）を供給したRPMI1640増殖培地中で増殖させる。最初の培養条件では、これらの細胞が６ウェルの培養プレートにおいて、最適な細胞密度（0. 5×10⁶/ml）で、10日〜14日の期間増殖されることが必要である。この期間中、培養物の過増殖を防ぐために細胞を毎日に数え、そして培地を補給しなければならない。次いで、細胞を新鮮な培養培地で適切な容量に希釈し、そして懸濁液を、１ウェル当たり約６mlの培地でウェル中に分注する。十分な数のウェルに播種し、そして培地を衛生的に保持した後、ストックを、一般的な増殖のためのT75またはT 150培養フラスコに入れる。しかし、培養物が最適細胞濃度から濃すぎるかまたは薄すぎるかいずれかの場合、これらの細胞は極度に弱く、そして、アポトーシスの形成またはプログラム細胞死の形態を受けるように見える。この状態は、培養フラスコが細胞残骸の小さい粒子で細菌的に汚染されるように見えるので直ちに認識され得る。この状態は、細胞培養物をゆっくりと遠心分離することでウシ胎児血清2mlにより、改善され得る。得られる細胞ペレット（細胞残骸は存在しない）を、新鮮な培養培地中に適切な細胞濃度において再懸濁する。さらに、適切な細胞の生存率を保証するために、この細胞培養物の状態の注意深いモニターを必要とする。細胞株SMS-SB：供給源：R.Peter Gale、Los Angeles、CA。細胞を、リンパ芽球リンパ腫を再発した17歳の女性の末梢血から単離した。細胞は、u-鎖を合成するが分泌せず、そしてu-鎖分泌の欠如を除いて、SMS-SB細胞の表現型は骨髄プレＢ細胞の主要な集団と同一である（Smithら、1981を参照のこと）。細胞を、37℃ および５％ CO₂にて、10％ウシ胎児血清（Gibco Laboratories、Grand Island、 NY）を供給したRPMI1640培地中で増殖させる。細胞株HL60：供給源：American Type Culture Collection(ATCC)、Rockville、M D。単離：末梢血白血球を、急性前骨髄細胞性白血病の成人女性から得た。Wrigh t-Giemsa法により染色された細胞の大部分は、アズール親和性顆粒を有する骨髄芽細胞および前骨髄細胞であったが、より成熟した骨髄細胞もまた見られた（Co llinsら、1977）。細胞を、37℃および５％ CO₂にて、10％ウシ胎児血清（Gibco Laboratories、Grand Island、NY）を供給したRPMI1640増殖培地中で増殖させる。細胞株3.16：供給源：細胞を、Hospital Royal Victoria Hospital in Montreal 、CanadaのPierre Laneuville博士から得た。単離： M-07E細胞と命名されたIL3 /GM-CSF依存性細胞株を、急性巨核芽球性白血病の患者由来の一次培養の早期の過程から得た。M3.16細胞株を、P210 BCR-ABLを発現するレトロウイルスベクターを含むM-07E細胞から得た。M3.16細胞はDMEM/10％ FCS中で、IL3/GM-CSFを添加することなく増殖する（Sirardら、1994）。細胞を、37℃および５％ CO₂にて、10％ウシ胎児血清（Gibco Laboratories、Grand Island、NY）を供給したDMEM 中で増殖させる。細胞株COS1：供給源：ATCC（Rockville、MD）。単離：COS1は、サル腎臓細胞(CV 1）から確立された線維芽細胞様の細胞株であり、これは野生型Ｔ抗原をコードするSV40の起点欠失変異体によって形質転換された。細胞を、37℃および５％ C O₂にて、10％ウシ胎児血清（Gibco Laboratories、Grand Island、NY）を供給したDMEM中で増殖させた。プラスミドPsp65 BCR：このプラスミドを、John Groffen博士（Childrens Hospi tal of Los Angeles、CA）から得た。これを、インビトロにおける転写（SP6ポリメラーゼを使用する）および翻訳のために使用する。プラスミドPsp65 c-ABL(1b)およびPsp65/P210 BCR-ABL：これらのプラスミドはそれぞれ、全長c-ABL(1b)またはP210 BCR-ABL cDNAを含む。これらはEli Canaan i博士(Weissman Institute、Israel)から得られた。そしてこれらをインビトロにおける転写（SP6ポリメラーゼを使用する）および翻訳のために使用し得る。プラスミドpSG5BCR：オリジナルのヒト全長BCR cDNAは、John Groffen博士（Chi ldren's Hospital of Los Angeles、CA）から得た。BCRの完全コード領域と約15 0bpの5'非翻訳領域とを有するB3クローンを、psp65ベクターのEcoRI部位にクローン化した。オリジナルのヒト全長p210 BCR-ABL cDNAを、Eli Canaani博士(The weizmann Institute of Science、Israel)から得た。完全コード領域と約10bpの5'非翻訳領域を有するp210 BCR-ABLの構築物を、psp65ベクターのEcoRI/HindIII部位に配置した。より良好な発現のため、BCRの5'非翻訳配列を減少させるために、p210B CR-ABL由来のEcoRI-XhoIフラグメントを使用して、B3クローンのEcoRI-XhoIフラグメントを置き換えた。新規に構築された、約10bpの5'非翻訳配列を含むヒト全長BCR cDNAを、EcoRI 消化によりpsp65ベクターから切り出し、そして続いて、真核生物発現ベクターp SG5（Stratagene、La Jolla、CA）のEcoRI部位に挿入した。pSG5ベクターは、細胞中でインビボ発現を促進し、かつＴ抗原を発現する、初期SV40プロモーターを含む。プラスミドPSG5BCR-ABL：ヒト全長p210 BCR-ABLを、EcoRIの完全消化およびSacI の部分消化により、psp65ベクターから切り出した。次いで、全長cDNAを使用して、pSG5ベクター中でBCRのEcoRI-SacIフラグメントを置き換えた。この構築物は、p210 BCR-ABLの停止コドンに続く大きなC-末端BCR配列を含む。BCR配列の大部分のこのC-末端部分を、BamHIの部分消化フラグメントの切り出しにより除去した。プラスミドPSG5ABL(1b)：ヒト全長p145 c-Abl(1b)cDNAは、Eli Canaani博士(The weizman Institute of Science、Israel)から得た。c-Abl(1b)挿入物を、StuI （平滑末端）部分消化に続くEcoRIの完全消化により、psp65ベクターから切り出した。次いで、EcoRI-StuIフラグメントを、EcoRIおよびBalI（平滑末端）消化により線状化したPSG5と連結した。プラスミドPSG5BCRN553、PSG5BCRN413、PSG5BCRN221、PSG5BCRN159：これらの欠失変異体を、全ての３つの読み枠において停止コドン（CTAGTCTAGACTAG、配列番号14、Stratagene、La Jolla、CA）を含むXbaIリンカーを、BCRの第１のエキソンをコードする配列においてSacI、BglII、XhoIまたはBamHI部位にそれぞれ挿入することにより得た（図７）。変異：TyrからPheへの変異をBCRの177残基および360残基に有するp185 BCR-ABL およびp160 BCR構築物は、Groffen博士のグループ（Childrens Hospital of Los Angeles、CA）より供給された。他の変異体を、下記の方法により、野生型BCR で最初に作製した。次いで、p210 BCR-ABL変異体を、野生型p210 BCR-ABLのXhoI /SacIフラグメントを、変異体p160 BCR由来の同一のフラグメントと交換することにより得た。 TRANSFORMER^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(CloneTech Laboratories、Pal o Alto、California)を、TyrからPheへの変異を発生させるために使用した。BCR の第１のエキソン中のチロシン残基を変異させるために使用した変異プライマーを、Operon Technologies（Alameda、CA）から得た。そして、それらの配列を以下に示す。これらの変異プライマーを使用して、チロシンからフェニルアラニンへ変異させる。pSG5BCR構築物の変異のための選択プライマー（5'TGGTCGACTCGCGACTCTTCC 3 '（配列番号19））を使用して、ベクターpSG5中の独特な制限部位XbaIを除去する。変異の全てを、変異領域の直接の配列決定により確かめた。イムノキナーゼアッセイ：イムノキナーゼアッセイを、改変を加えて、Campbell ら(1990)により記載されるように行った。細胞ペレットを２つの異なる溶解緩衝液（0.1％ Triton-X100、100mM NaCl、5mM EDTA、10mMリン酸ナトリウム(pH7.2) または１％ Triton-X100、100mM NaCl、0.5％デオキシコレートナトリウム、0.1 ％SDS、5mM EDTA、10mMリン酸ナトリウム(pH7.2)のいずれか）中で、０℃において、しっかりと固定したWheatonホモジナイザーによりホモジナイズすることによって、細胞を溶解させる。両方の緩衝液に、30mMピロリン酸ナトリウム、100K IUのアプロチニン、1mMベンズアミジン、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび0.2mMのバナデートナトリウムを供給した。次いで、細胞溶解物を、100,000×Ｇにおいて30分〜60分、４℃で遠心分離することにより清澄化した。清澄化した上清を回収し、そして免疫沈降のためにサンプル間で均等に分配した。免疫沈降反応を、それぞれの抗ペプチドウサギ血清20μl〜40μlまたはモノクローナル抗体５μlを使用して、０℃で１時間行った。ブロックされた免疫沈降は、特異的に抗ペプチド抗体をブロックするために、過剰な同族のペプチドでプレインキュベートされた抗血清を用いて行われるこれらの免疫沈降反応を意味する。得られる抗原-抗体免疫沈降物を、50％タンパク質Ａ-セファロース（Pharmaci a、Uppsala、Sweden）30μlを用いて回収し、ペレット化し、そしてRIPA緩衝液（10mMリン酸緩衝液(pH7.2)中の0.1％ Triton X-100、0.05％ SDS、0.5％デオキシコレートナトリウム、100mM NaCl）で洗浄し、洗浄緩衝液（10mMリン酸緩衝液(pH7.2)中の0.1％ Triton X-100、100mM NaCl）で洗浄し、そして最後に50mM トリス緩衝液(pH7.2)で洗浄した。免疫沈降ペレットを、0.02mCi[γ-³²P]アデノシン三リン酸を含む50μlのキナーゼアッセイ緩衝液（100mM NaCl、0.1％ Triton X-100、10mM MnCl₂を含む20mM HEPES緩衝液(pH7.2))中に、10分間０℃にて懸濁させた。標識化ペレットを１度 RIPA緩衝液で洗浄し、次いでメルカプトエタノール/ドデシル硫酸ナトリウム（S DS）サンプル緩衝液（１％ SDS、10％ 2-メルカプトエタノール、10％グリセロール、1mM EDTAを含むトリス緩衝液(pH8.0)）中で煮沸させて変性させた。煮沸した上清を、6.5％ポリアクリルアミドゲルでのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分離した。乾燥ゲルを、増強スクリーンを用いて、Ｘ線フィルムに曝した。イムノブロットアッセイ：細胞を、10％ 2-メルカプトエタノールを含むLaemmli ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）サンプル緩衝液中に溶解した。溶解物を３分間煮沸し、次いで100,000×ｇで１時間、室温において、遠心分離により清澄化した。上清液を回収し、そして分配した。サンプルを、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分離した。４℃において、転写緩衝液（192mM グリシン、25mM トリス-HCl（pH 7.5）、および１％のメタノール）中で４時間〜５時間、1.2ampで、ゲルをImmobilon P膜（Millipore Corp.、Bedford、MA）上に電気ブロットした。ブロットを、１％〜３％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む洗浄緩衝液（150mM NaCl、0.1％ NONADET^TMP40、50mM トリス-HCl（pH 7.5）、または0.01M トリス（pH7.5）、0.1M NaCl、0.1％ TWEEN^TMM20）、または10％無脂肪ミルクを含む洗浄緩衝液（20mM トリス-HCl塩基（pH7.6）、137mM NaCl、3.8mM HCl、および0.1 ％ TWEEN^TM20）で、１時間〜２時間、37℃における洗浄によりブロックした。次いで、フィルターを適切な希釈の抗体（8E9に対して1:20,000；抗ペプチド抗体に対して1:1,000；抗Grb2 抗体に対して1:250；抗ホスホチロシン抗体に対して1 :1,000〜2,500）と共に、ブロッキング緩衝液中で室温で２時間、または４℃で一晩反応させた。フィルターを洗浄緩衝液中で洗浄し、そしてI¹²⁵-タンパク質Ａ（Amersham Co .、Arlinton Hts.、IL.）を用いて、ウサギ抗体について直接評価するか、またはブロッキング緩衝液中で１時間、室温において、モノクローナル抗体（1μg/1 0uCiのI¹²⁵-タンパク質Ａ）についてウサギ抗マウスIgGと混合した。フィルターを洗浄緩衝液で洗浄し、風乾し、そしてＸ線フィルムに曝した。別の方法は、フィルターを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgまたは抗マウスIgと共にインキュベートし、次いで洗浄緩衝液で洗浄した後、ECL試薬（Amersham Co.、Arlington Hts.、IL.）と反応させることである。シグナルを、フィルターをhyperfilm（Amersham）に曝すことにより検出する。ホスホペプチドのトリプシンペプチドマッピング：インビトロキナーゼアッセイからの³²Ｐ標識化タンパク質を、SDS-6.5％ PAGEゲルでの電気泳動により分離した。電気泳動の後、ゲルを乾燥し、そしてKodak RP-1 Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフを鋳型として用いて、³²Ｐ標識化タンパク質を乾燥ゲルから切り出した。ブロッキング紙を、小片に切った乾燥ゲルバンドから除去し、そして2ml緩衝液/1cm²乾燥ゲルに対応する溶出緩衝液（0.05M NH₄CO₃、pH 8.5、0. 1％ SDS、0.5％ 2-メルカプトエタノール）容量中で膨潤した。膨潤したゲル片を、ガラス撹拌棒でさらに粉砕した。ホモジネート溶液を５分間煮沸し、そして回転しているホイールミキサー中で、37℃において一晩振とうして、標識化タンパク質を溶出した。ゲルフラグメントを、10,000×Ｇにおける10分間の遠心分離によりペレット化し、そして上清液を注意深くデカンテーションし、そして保存した。次いで、最初の容量の半分の容量の新鮮な溶出緩衝液をゲルフラグメントに添加し、そしてこの溶液を、前述のように37℃で４時間混合した。ゲルフラグメントを遠心分離により再びペレット化し、そして上清液をデカンテーションし、保存した。溶出画分をプールし、そして合わせた溶出物を、0.2μポアサイズのミリポアシリンジフィルターを通して濾過した。ウシ血清アルブミン（75μg）を溶出物に加え、そして完全に混合した。BSAキャリアおよび溶出した³²Ｐ標識化タンパク質を、トリクロロ酢酸中で20％の溶液を作製し、そして氷上で４時間インキュベートすることによりペレット化した。沈澱させたタンパク質を遠心分離によりペレット化し、氷冷エタノールで連続的に洗浄し、続いてエタノール：エーテル（1:1）の氷冷溶液で洗浄し、そして洗浄したペレットを遠心分離し、風乾した。乾燥したタンパク質ペレットを、15 0μlの冷却した過ギ酸（30％ H₂O₂および98％ギ酸[1:9]）に溶解させ、先に室温で１時間インキュベートし、そして、２時間０℃でインキュベートした。過ギ酸酸化溶液を水で希釈し、そして高速真空乾燥器で凍結乾燥した。得られた酸化タンパク質を、0.5mlの0.05M NH₄HCO₃中の30μgのL-(1-トシルアミド-2-フェニル)エチルクロロメチルケトンで処理したトリプシン（TPCKトリプシン）で18時間、室温において消化した。28時間後、さらなるTPCKトリプシン 20μgを溶液に添加し、そして消化をさらに４時間続けた。消化されたタンパク質を水で希釈し、そしてNH₄HCO₃塩が除去されるまで、繰り返して凍結乾燥した。塩が存在しない消化物を、電気泳動緩衝液（pH2.1）（蒸留水、ギ酸、および酢酸[90:2:8]（pH2.1)）15μl中に溶解し、そしてセルロース薄層プレート（Kodak #13255、Rochester、N.Y.）にスポットとして添加し、そしてHunter systems電気泳動ユニット（HTLE 7000、CBS Scientific Co.、D el Mar、CA.）上で、１時間、1000Vで電気泳動した。電気泳動の後、プレートを風乾し、そしてN-ブタノール、酢酸、水、およびピリジン[75:15:60:50]からなるクロマトグラフィー緩衝液を使用して薄層クロマトグラフィータンク中で、クロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィーを、クロマトグラフィー緩衝液がプレートの長さに達するまで行うか、または約４時間行った。トリプシンペプチドのホスホアミノ酸分析を、オートラジオグラフを鋳型として用いて、セルロースマトリックスを削り取ることによって、注意深く標識化トリプシンペプチドをクロマトグラフィープレートから取り出すことにより、達成した。標識化トリプシンペプチドを20％アセトニトリルを用いてセルロースマトリックスから溶出し、そして90分間、110℃において6N HClで処理した。清澄化した上清液を、標準ホスホセリン、ホスホスレオニン、およびホスホチロシンの存在下で、薄層プレート（蛍光指示物質が存在しないChromogram、East man Kodak、Rochester、N.Y.）上で分画した。放射性ホスホアミノ酸をオートラジオグラフィーにより検出し、そして標準ホスホアミノ酸の位置をニンヒドリン処理により検出した。 V8プロテアーゼ消化：³²Ｐ標識化タンパク質バンドをポリアクリルアミドゲルから切り取り、そして緩衝液Ａ（0.125Mトリス-HCl（pH6.8）、0.1％ SDS、および 1mM EDTA）で再水和した。ゲルスライスを10.5％ポリアクリルアミドゲルのウェルにロードし、そしてウェルを、20％グリセロールおよびV8プロテアーゼ1μgを含む緩衝液Ａで覆った。次いで、ゲルを20mAで20分間泳動し、そして30分間停止した。その後、電気泳動を続けた。実施例II アダプタータンパク質を結合するBcr-Ablペプチド本発明者らは、本明細書中で、互いに結合アフィニティーを示すアダプタータンパク質-Bcrペプチド対の組を提供する。従って、これらのBcrペプチドは、過剰に供給された場合、アダプタータンパク質上のそれらそれぞれの結合部位に結合し、そしてアダプタータンパク質が内因性のBcr-Ablと相互作用することを防止する。この相互作用は、アダプタータンパク質が、シグナル伝達において（最も詳細には、Ras活性化経路において）その役割に影響をおよぼすことを防止する。ペプチドは、リン酸化形態または非リン酸化形態で提供され得る。リン酸化は、細胞内で起こると予想される。アダプタータンパク質に結合するペプチドの形態は、リン酸化形態である。本発明により提供されるアダプタータンパク質-Bcrペプチドの対は、以下を包含する： Bcrペプチド 164-181（配列番号８）およびアダプタータンパク質Grb2/mSos1：B cr-Abl中のBcr結合部位は、本発明者らにより同定された。以下のBcrペプチド配列は、Grb2のSH2ドメインを結合する： GHGQPGADAEKPFpY¹⁷⁷VNVE(残基164-181)(配列番号８)。177位のチロシン残基は、 Bcr-Abl内のAblチロシンキナーゼによりリン酸化される。 pY¹⁷⁷を含むBcrペプチド（配列番号８）を使用する場合、少なくともその４量体のフラグメント（例えば、Bcr 176-180（配列番号24））が使用されるべきである。例として、13量体は、168-180 Bcr（配列番号27）に対応する。 AblのSH3ドメイン、およびアダプタータンパク質Shc： AblのSH3ドメインは、Sh cのプロリンリッチ配列を結合する配列を含む。 Ablペプチド、およびアダプタータンパク質Crkl： Crklは、Crkと同様の構造を有する(V-Crkのオンコジーン)(図２)(Reichmanら、1992；Ten Hoeveら、1993)。 Crkは、鳥類肉腫ウイルス中で最初に発見されたSH2/SH3含有アダプタータンパク質である（Reichmanら、1992）。 Crklタンパク質産物は、いくつかの細胞型において発現される38-kDaタンパク質である。このp38は、AblおよびBcr/Ablによりチロシン上でリン酸化され、そしてAblおよびBcr/Ablの両方と共にインビボで複合体を形成する。Crklは、Bcr- Ablを発現する細胞株中で、およびBcr-Ablオンコプロテインを発現する患者由来の非培養血液細胞中でチロシンリン酸化される（Ten Hoeveら、1994）。さらに、Crklは、mSos1への結合が可能である（Ten Hoeveら、1993）。 Crkは、p145Ablにより、Ｙ²²¹上でリン酸化される。CRKLは、Bcr/Ablのための生物学的に重要な基質であることが提案されている。CRKLのSH3ドメインの１つは、Bcr-AblのAblドメイン内のプロリンリッチ配列に結合する。従って、CRKL上のAbl結合部位を模倣するペプチドは、本発明のいくつかの実施態様における構成要素である。 Bcrペプチド353-364（配列番号10）およびアダプタータンパク質のSH2ドメイン：Bcr内の別のホスホチロシンペプチド(VSPSPTTpY³⁶⁰RMFR、配列番号10)（残基3 53-364)もまた、アダプターSH2含有タンパク質の結合に関連する。Bcrのチロシン360およびＹ³⁶⁰の周囲のこの配列もまた、Bcr-Abl内のAblチロシンキナーゼによりリン酸化される。 353-364（配列番号10）に基づくBcrペプチドの使用において、少なくともその４量体フラグメント（例えば、Bcr 359-363（配列番号25））が使用されるべきである。配列番号22もまた有用である。従って、本発明の好ましいペプチドの組み合わせは、ペプチドの組あるいはＹ¹⁷⁷ 、Ｙ²⁸³、およびＹ³⁶⁰を含むBcr由来の配列（例えば、配列番号８、配列番号 11、および/または配列番号10のペプチド）を有するかまたは含有するポリペプチドである。この結合部位の組を含むペプチドは、少なくとも３または４アミノ酸長であり、そして好ましくは、約10または12または15アミノ酸長である。カルボキシ末端側の配列はペプチド結合に特に重要（例えば、Ｙ¹⁷⁷を含むペプチドのAsn179）であり得るので、チロシンは、ペプチドのおよそ中間に存在する。これらの配列を含むポリペプチドは、スペーサーアミノ酸を有し、最適な結合のために分子を可撓性にする。本発明のペプチドは、好ましくは、NH₂-末端をプロテアーゼ分解からブロックするためのアミノ末端アセチル基、およびカルボキシ末端のアミド基と共に提供される。アミノ末端のアセチル化を、ペプチドの合成後、無水酢酸を用いることにより達成する。アセチル化を、合成の間に樹脂に結合している発生期のペプチド上で行う。カルボキシ末端アミドを、誘導体化樹脂（すなわち、PAL支持体；Millipo re #GENO77483；Medford、Massachusetts）上で、ペプチド合成を開始することにより達成する。このペプチドがこのタイプの樹脂から除去される場合、これは C-末端にアミド基を有する。実施例III オリゴマー化を防止するためのBcr-Abl分子間の超らせん相互作用を阻害するためのBcrペプチド Bcr-AblのBcr部分のＮ末端領域由来の配列を含むペプチドは、Bcr-AblモノマーのBcr部分間の超らせん相互作用を阻害する。この相互作用は、Bcr-Ablの四量体活性形態の形成に関与する。過剰のこれらのＮ末端ペプチドは四量体形成を阻害し、それによって、Bcr-Ablの自己リン酸化、それに続くその腫瘍性機能を阻害する。配列番号１はBcrの第１エキソンのアミノ酸配列を提供する。本発明で使用されるＮ末端ペプチドは、アミノ酸１〜63（配列番号２）、またはアミノ酸１〜71 （配列番号３）、またはアミノ酸28〜58（配列番号４）、またはアミノ酸１〜15 9（配列番号５）、またはアミノ酸１〜221（配列番号６）、またはアミノ酸１〜 413（配列番号７）またはこれらの等価物の配列を含み得る。 159アミノ酸アミノ末端フラグメントBcrをコードするBCR遺伝子のフラグメントが、特定の使用において好ましい。正常なBcrタンパク質はBcr-Ablと安定な複合体を形成するので、Bcr159の過剰発現は、１分子のBcr-Ablおよび３分子のBcr 159から構成されるヘテロ四量体構造を生成すると予測される。この四量体は、 Bcr-Ablの自己リン酸化のためのチロシンキナーゼとして不活性であるべきであるばかりでなく、リン酸化基質（例えば、ShcおよびCrkl）のためのキナーゼとして不活性化であるべきである。実施例IV ペプチド255〜293の変異の研究本発明者らは、Ras Gapのアミノ末端SH2ドメインがグルタチオンSトランスフェラーゼタンパク質（GST）を含む融合タンパク質として発現することに関する研究を行った。これらの研究は、GST-Gap SH2とBcr-Ablのホスホチロシントリプチックペプチドとの混合に関与する。図8A、図8B、図8Cおよび図8Dは、インビトロにおいてリン酸化したBcr-Ablタンパク質の２つのD-トリプチックマップを示す。Bcr-Ablタンパク質は、抗Abl(5 2-64)免疫複合体を用いてインビトロでリン酸化され、そしてマッピングされる。破線の円は、変異を欠くペプチドを示す。図9Aおよび図9Bは、F238および野生型p210 Bcr-Ablのトリプシン/V8のマッピングを示す。COS細胞由来のp210 Bcr-AblのF283変異体は、K562細胞由来のp210B cr-Ablのマップと比較される（図9A）。破線の円または×は、変異体を欠くペプチドを示す。図10Aおよび図10Bにおいて、スポット#3および#8はGST-Ras Gap SH2融合タンパク質に特異的に結合するが、GSTには結合しない。スポット#3は、255-293（配列番号11）で表されるペプチド（チロシン283、279および276（リン酸化されていない）を有する）を含む。チロシン283はRas Gapへの結合には関与しない。従って、チロシン残基279は、Ras Gapと結合するBcrのペプチド部分であるように思われる。配列255-293（配列番号11）はRas GapおよびAblのSH2ドメインに結合する。少なくともBcr278-284またはBcr278-282を含むこのペプチドのフラグメント（例えば、Bcr278-290）は、Bcr-Ablの阻害に有用なペプチドを提供する。 283位におけるさらなるチロシン（残基255〜293、配列番号11）もまた、Bcr-A bl内でAblチロシンキナーゼによってリン酸化される。Bcr内の他のチロシンもまたBcr-Ablでリン酸化される。これらはY⁷⁰およびY²⁷⁹、またはおそらく58、231 または246位におけるチロシンであるようである。Y²⁷⁶、Y³¹⁶およびY³²⁸はリン酸化部位ではないようである。実施例Ｖ Abl SH2ドメインは Bcr-Ablの第１エキソン内でBcrペプチドに結合する本発明者らは、AblのSH2ドメインを用いて同様の研究を行った。これらの研究は、マウスc-Abl SH2配列（SH2ドメインの範囲内でヒト配列と２つのアミノ酸のみが異なる）を用いて行われた。これらの結果は、ホスホチロシントリプチックペプチド#3および#8がGST-Abl SH2に結合するが、GSTには結合しないことを示す（図10Aおよび図10B）。Ras Ga p SH2およびAbl SH2が非常に類似のホスホチロシントリプチックペプチドと結合する理由は知られていない。ペプチド８の配列は、637 NSLETLLYK 644（配列番号12）であり、その位置は第１エキソン（p185 Bcr-Abl中に存在しないが、p210 Bcr-Abl中に存在する；前者はBcrの第１エキソンのみを含むが、一方、後者はBcrの900より多いアミノ酸を含む）の外側にある。ペプチド#3はアミノ酸255 FLKDNLIDANGGSRPPWPPLEYQPYQ SIYVGGMMEGEGK 293（配列番号11、下線を付した残基はトリプシン耐性の部位である）。実施例VI p160BcrはGrb2に結合する以下の研究は、チロシン177リン酸化されたp160 BcrがサルのGrb2分子（Rasシグナル化経路のアクチベーター）に結合することを示すために行った。 Bcr-Abl内のBcr配列のホスホチロシン177はGrb2のSH2ドメイン、SH2およびSH3 ドメイン含有アダプター分子と直接相互作用するために必要であることが示されている（Pendergastら、1993）。この相互作用は、Ras機能の活性化およびBcr-A blによる形質転換のために重要である（Pendergastら、1993）。 p210 Bcr-Ablはp160 Bcrをチロシン177でリン酸基転移し得るので、チロシン1 77リン酸化p160 Bcrもまた、細胞内のGrb2タンパク質に結合し得るかどうかを試験することは重要であった。p210 Bcr-Ablはp160 BcrおよびGrb2タンパク質の両方と相互作用するので、そのような複合体の調査はp210 Bcr-Ablおよびp160 BCR の両方が発現する細胞では困難である。チロシンリン酸化p160 BcrとGrb2タンパク質との間の直接相互作用を示すために、p146 c-Abl、およびp160 BcrまたはGrb2のいずれかを含むp145 c-ABLの物理的相互作用の欠如によって、p160 BCRがチロシンリン酸化され得る事実を利用することは妥当である。 COS1細胞は、ウェスタンブロッティングによって検出される内因性サルGrb2タンパク質を発現する（図18、レーン１）。P160 BCRおよびp145 c-ABL(1b)は、CO S1細胞中で、別々にまたは同時に発現された。トランスフェクションの２日後、細胞を回収した。細胞溶解産物を超遠心分離によって清澄化し、そしてその上清を抗BCR c-末端（1256〜1271）抗体（図18、レーン２、４および６）またはペプチドプレブロック化抗体（図18、レーン３、５および７）のいずれかと共にインキュベートした。次いで、免疫沈降したタンパク質を、10%ポリアクリルアミドS DS PAGEで分画し、次いでp-インモブリン（p-immoblin）膜に移した。次いで、この膜を抗Grb2抗体でブロットした（図18）。その結果は、Grb2タンパク質は、COS1細胞（p160 BCRおよびp145 c-ABL(1b)の両方を過剰発現する（図18、レーン６と７とを比較のこと））由来の抗BCR c-末端（1256〜1271）抗体によって、チロシンリン酸化p160 BRCと共に、特異的に共免疫沈降（co-immunoprecipitate）され得る。しかし、p160 BCR単独（図18、レーン２および３）またはp145 c-ABL単独（図18、レーン４および５）のいずれかの発現は、抗BCR c-末端（1256〜1271）抗体による、有意なGrb2タンパク質の特異的共免疫沈降を生じない。弱くブロックされた24 kdタンパク質のバンドは、ポリクローナル抗BCR c-末端（1256〜1271）ウサギ血清によるサルGrb2分子の非特異的な免疫沈降および少量のチロシンリン酸化内因性BCRタンパク質の存在から生じるようである。この結果は、p145 c-ABLによってチロシンリン酸化される場合のp160 BCRは、内因性の類似のGrb2タンパク質と相互作用し得る。 p145 c-ABL(1b)によるp160 BCRのチロシン177のリン酸化がp160 BCRとサルGrb 2タンパク質との相互作用の原因であるかどうかを決定するために、p160 BCRのチロシン177からフェニルアラニンへの変異体のGrb2結合能を試験した。本研究では、p145 c-ABLを、COS1細胞中で野生型p160 BCRまたは変異体 p160B CR(F177)のいずれかと共に同時発現させた（coexpress）。細胞溶解産物を抗BCR C-末端（1256〜1271）抗体で免疫沈降に供し、そして免疫沈降物を、抗Grb2抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。予想されるように、p145 c-ABL(1b)によるチロシンリン酸化された野生型p160 PCRは、サルGrb2タンパク質に特異的に結合し得た（図19のレーン１と２とを比較のこと）。しかし、p145 c-ABL(1b)とチロシン177を欠くp160 BCRとのCOS1細胞中での同時発現は、抗BCR C-末端（1256〜1271）抗体によってかなり減少したレベルで共免疫沈降するサルGrb2タンパク質を生じた（図19のレーン３および４とレーン１と２とを比較のこと）。図19のレーン３および４で観測されるこのような弱い共免疫沈降は、抗GBCR（1256〜1271）抗体、および内因性の野生型BCR の存在による非特異的な免疫沈降の結果であるようである。これらの結果は、Bcr-Ablのホスホチロシン177だけでなくp160 BCRのホスホチロシン177もまた、Grb2タンパク質に結合し得ることを示す。活性化された場合、正常なc-Ablタンパク質がp160 BCRのチロシン177のリン酸化を経由するRas経路を活性化し得ることもまた意図する。実施例VII 短いペプチドによるBcr-Ablの阻害本実施例は、試験管内キナーゼ反応において、BCR遺伝子の第１エキソン（配列番号22）によってコードされる短いペプチド配列が、Bcr-Ablタンパク質チロシンキナーゼ活性を著しく阻害することを示す。このBcrペプチドは、阻害剤として機能するために、セリン残基上（おそらく、いくつかの中の１つだけ）でリン酸化されなければならない。配列番号10（Bcr 353-364）（これはTyr 360を含む）は、本明細書中において有用な阻害性ペプチドとして同定される。次に、本発明者らは、より長い形態のこのペプチド（配列番号22）を用いて研究を始めた。SH2ドメインは、一般にリン酸化チロシン残基の前後に配列を含むモチーフ必要とするので、このペプチドを選択した。本発明者らは、ホスホセリンを含む配列番号22の改変形態にまず注目した。このペプチドはpS254 S17Kとも呼ばれる。Bcr-Ablキナーゼに対するpS354 S17Kの影響および阻害性活性を測定した。 pS354 S17Kは、350-SSRVpS^*PSPTTYRMFRDK-366（配列番号22）である。この配列はBcr残基350で始まり、そしてBcr残基366で終結し、BCR遺伝子の第１エキソンコード領域内に位置する。pS^*はホスホセリンを示す。ペプチドは、Merrified chemistryで作製され、そしてカラムクロマトグラフィーおよびHPLCで約95%の純度まで精製された。 Bcr-Ablキナーゼ活性を測定するアッセイには、自己リン酸化反応（この反応では、Bcr-Ablチロシンの１分子が別のBcr-Abl分子をリン酸化する）が頻繁に利用される。このBvrペプチドは、自己キナーゼアッセイにおいてP185 BCR-ABLを含む免疫複合体への添加によって測定されるように、Bcr-Ablチロシンキナーゼを阻害することを示した（図21）。 pS354 S17K ペプチド配列はBcr-Ablキナーゼ活性を著しく阻害する（レーン１と２とを比較のこと）が、非リン酸化S17Kにはほとんど影響はなかった（レーン３）。Bcr-Ablオンコプロテイン(p210 BCR-ABL)の他の形態を用いて同様の結果が得られた。実施例VIII 長いペプチドによるBCr-Ablの阻害本実施例は、試験管内キナーゼ反応において、Bcrタンパク質のより長いセグメント（BCR遺伝子の第１エキソンによってコードされる）がBcr-Ablオンコプロテインのチロシンキナーゼ活性を阻害することを示す。このBcrタンパク質は、細胞内のBcr-Ablチロシンキナーゼの強力な阻害剤である。本発明者らは、Bcrのセリンリッチボックスを両方とも含むBcrタンパク質のフラグメントもまた、Bcr-Ablチロシンキナーゼの強力な阻害剤として機能し得ると考えた。本発明者らは、アミノ酸64〜413由来のBcr配列をコードするDNAベクター（配列番号28：図22）を構築した。この構築物は、ＡセリンリッチボックスおよびＢセリンリッチボックスの両方を含む短いBcrタンパク質を産生する（Pendergast ら、1991）。アミノ酸64〜413をコードするDNAセグメントは、Dr.Jean Wang（Mc WhirterおよびWang（1991））によって提供されたBcr-Abl DNAクローンに由来した。Bcrコード配列をベクターpLNL SLX CMVに挿入した。図22に示されるBcrフラグメントベクター構築物を用いた一過性トランスフェクトにより、BcrフラグメントをCOS-1細胞中に発現させた。合成Bcrペプチド（B cr残基 EFHHERGLVKVNDKE（配列番号１の181〜194）を含む）に対して調製されたウサギ抗体を用い、トランスフェクトされたCOS-1細胞の溶解産物を免疫沈降させた。他の研究において、本発明者らは、この構築物が、NIH 3T3細胞中の適切なサイズの予期されるサイズのBcrタンパク質フラグメントを、抗Bcr 181-194抗体を用いるウェスタンブロッティングによって産生した。 Bcrフラグメント（64〜413）でトランスフェクトされたCOS-1細胞由来の免疫沈降物を、白血病細胞株SUP B15由来のp185 BCR-ABLの免疫沈降物に加えた。その結果は、BcrフラグメントがBcr-Ablチロシンキナーゼ活性の強力な阻害剤であることを示した（図23A、レーン４とレーン２とを比較のこと）。免疫沈降物を数分間煮沸して、キナーゼアッセイに添加した場合、阻害活性は著しく減少した（レーン１と２とを比較のこと）。このことは、この阻害剤が実際にBcrフラグメントタンパク質である場合に予想される結果である。なぜなら、100℃に達する温度によって、タンパク質コンホメーション（confirmation）はかなり破壊されるからである。キナーゼアッセイにおけるBcr-Ablオンコプロテインのレベルを測定するために、レーン２および４由来の抗Abl免疫複合体を、抗Bcr 181-194抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。その結果は、Bcr-Ablタンパク質（P18 5）の量は本質的に量を変化させないが（図23B）、自己リン酸化のレベルは、Bc rフラグメントタンパク質を含む抗Bcr免疫複合体への暴露によって劇的に減少した（図23A、レーン２）。抗Bcr 181-194抗体自身がBcr-Ablに対して阻害性である可能性を排除するために、本発明者らは、Bcr-Ablを有するBcrフラグメントに暴露されていない抗体を混合した（図23C）。その結果は、抗体自身がBcr-Ablに対して阻害性でなかったことを示す（図23Cのレーン１と２とを比較のこと）。さらに、本発明者らは免疫複合体中のBcr-Ablタンパク質のレベルを測定した（ただし、この時点での抗A bl 8E9抗体を用いたウェスタンブロッティングよる）（図４の図23Cの下側）。B cr-Ablタンパク質ののレベルは変化しなかった。この研究（図23A）において、COS-1細胞中のBcrフラグメントタンパク質のレベルは、ほとんどの細胞株中のBcr-Ablタンパク質に対して観測されたレベルと同じであるようであった。従って、Bcrタンパク質フラグメントの量は、これらのキナーゼアッセイにおけるBcr-Ablタンパク質の量と同様のモル量であるようであった。従って、本発明者らは、配列番号28のBcrフラグメントタンパク質がBcr-Ablチロシンキナーゼの非常に強力な阻害剤であると結論する。Bcrフラグメントは、C OS-1細胞での発現の結果としてセリン残基上（少なくともセリン354で）でリン酸化されるようであった。本発明者らは、そのリン酸化が、COS-1細胞中に存在する細胞性セリンキナーゼ（おそらく、セリン/スレオニンキナーゼである内因性Bcr）によって触媒されたと推定する。他のキナーゼに対するBcrペプチドの影響を測定し、そしてその結果は、Bcr阻害性ペプチドはBcrキナーゼを刺激するが、p60 Srcチロシンキナーゼにはほとんど影響しないことを示唆する。これらの結果は、正常なBcrがBcr-Ablの成長効果を妨害し得るという提案を支持する。重要なことに、Bcr-Ablオンコプロテインの白血病効果を中和するために、これらは特定の薬物の生産のストラテジーを強化する。薬物は、リポソーム /ペプチド処方物または配列番号22のBcrフラグメントタンパク質および本明細書中に記載される他のペプチドの発現を誘発する遺伝子治療を包含する。実施例IX チロシンリン酸化によるBcrセリンキナーゼの阻害 Bcrは本質的なセリン/スレオニンキナーゼ活性を有することが知られている。本実施例において、本発明者らは、セリン/スレオニンキナーゼ活性に対するそれらの影響についてBcrアミノ末端内のチロシン残基の重要性を試験した。Bcr-A blによるチロシン残基（T-360を含む）上でのBcrのリン酸化は、Bcrのセリン/スレオニンキナーゼ機能を著しく阻害した。 P160^BCR（Y360F）は、リン酸基転移活性を減少させるが、その自己リン酸化活性は影響を受けない：異なるBcrエキソン１の残基のチロシンリン酸化はBcrの酵素活性に影響し得る。さらに、チロシン残基は、Bcrのセリン/スレオニンキナーゼ活性の調節に関与し得る。これを試験するために、本発明者らは、いくつかの残基に対するY>>F BCR cDN Aを作製し、そしてこれらのBcrタンパク質変異体をセリン/スレオニンキナーゼ活性について試験した。P160^BCRの変異体形態は、COS-1細胞中に発現され、そして免疫複合体キナーゼアッセイにおいてセリン/スレオニンキナーゼ活性について試験した。変異体Y360F Bcr P160は、野生型Bcrのものと比較して、外因的に添加した基質（カゼイン）をリン酸基転移するその能力を著しく阻害した。対照的に、Y360 F変異体によるP160^BCR自己リン酸化は検出可能には変化しなかった。このような抽出物のウェスタンブロッティンゲは、Y360F Bcr変異体タンパク質が安定であることを示した。免疫複合体中の活性P160^BCRの量の指標としてのP 160^BCRバンドの強度、およびリン酸基転移活性の尺度としてのカゼインバンドの強度を用いて、Y360F Bcr変異体のリン酸基転移活性は、野生型のものと比較して約７倍減少した。同様に、Y360F Bcr変異体はまた、別の外因性基質（ヒストンHl）のリン酸基転移が欠損していた。 Bcrエキソン１中の他のチロシン残基がBcrのセリン/スレオニンキナーゼ活性に対して同じように重要であるかどうかを決定するために、本発明者らはY238F 変異体のBcrタンパク質をアッセイした。Bcr Y283Fは、カゼインをリン酸化する能力において顕著に改変されていなかった。これらの免疫複合体内のBcrの量を２つの方法で定量した。第１の方法では、B cr変異体の量を、野生型のものと比較して約10%少なく見積もった。これらの測定に基づいて、Y360F Bcr変異体のトランスキナーゼ活性（カゼイン強度/P160^BC ^R 強度）の比活性（0.03）は、本研究において野生型のものと比較して20倍を超えて減少した。免疫複合体中のP160^BCRの量を見積もる第２の方法は、抗Bcr抗体を含むこれらの免疫複合体のウェスタンブロッティングを包含した。Y360Fの比活性は約６倍減少した。従って、これら２つの方法は、Y360F Bcrタンパク質が野生型Bcrのものに比ベて添加基質をリン酸化する能力を顕著に減少させたことを証明した。相対量の尺度としてBcrタンパク質の自己リン酸化を用いることによって、Y360F変異体によるBcrのトランスキナーゼの減少は約７倍であって、これはウェスタンブロット方法によって得られた結果を裏付ける。 Bcr-AblによるBcrのセリンキナーゼ活性の低下：Y-360残基は、Bcrのリン酸基転移活性に重大に関与し、そして野生型Bcr-AblはY360F欠損を減少させないので、本発明者らは、野生型Bcrのチロシンリン酸化のセリン/スレオニンキナーゼ活性に対する影響を試験した。COS-1細胞の分離アリコート由来のBcr-AblおよびBcr の免疫複合体を混合し、Bcr-AblによるBcrのチロシンリン酸化を可能にした。次いで、本発明者らは、Bcrのチロシンリン酸化のセリン/チロシンキナーゼ活性に対する影響をアッセイした。低レベルのスレオニンを含み、大部分のセリン上でカゼインがリン酸化されたコントロールBcr P160、P160^BCR自身はまた、セリン/スレオニン残基上でリン酸化された。しかし、Bcr-Abl免疫複合体へのBcr免疫複合体の添加は、カゼイのセリン/スレオニンリン酸化のレベルを著しく低減させ、そしてチロシン残基上でのカゼインのリン酸化を引き起こした。 Bcr-AblのBcr免疫複合体への添加はまた、チロシン残基上のBcrのリン酸基転移をもたらし、そして同時にBcrのセリン/スレオニン自己リン酸化活性をブロックした。これらの研究において、本発明者らは、Bcr免疫複合体をBcr-Ablで処理したP160^BCR中および処理しないP160^BCR中でのホスホアミノ酸含有量を測定した。これらの研究において、BcrおよびBcr-Ablタンパク質は抗Bcrを用いて免疫沈降し、これはBcrおよびBcr-Ablタンパク質と直接反応する。自己リン酸化P160^BCRはホスホセリン/スレオニンを含有した。対照的に、Bcr- Abl処置したP160^BCRは、主に、低レベルのホスホセリン/スレオニンのみを伴うホスホチロシンを含む。これらの結果は、インビトロでの野生型Bcrのチロシンリン酸化は、そのセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ（オートキナーゼおよびトランスキナーゼ活性の両方を含む）を著しく阻害することを示す。無傷の細胞から単離されたチロシン-リン酸化されたBcrは、トランスキナーゼ活性を欠損している：Bcr-Ablを同時発現する細胞から回収されたBcrもまた、トランスキナーゼ活性を欠損しているどうかを決定するために、本発明者らは、ホスホチロシンの保持が好ましい条件下で、細胞からBcrを単離した。これらの研究において、本発明者らは、Bcr-Ablを欠く細胞の抽出物またはBcr -Ablを発現する細胞のいずれかから、抗Bcrを用いてBarを免疫沈降させた。これらの条件下で、Bcr-AblはBcrと共に共免疫沈降する。本発明者らは、チロシンリン酸化をブロックし、したがってBcrを有するホスホチロシンを維持するために0 .4mMバナジン酸塩を含む緩衝液中で細胞を溶解した。 P210^BCR-ABLのいずれかと共にBcrを同時発現する細胞は、カゼインリン酸化活性を顕著に欠損していた。定量的測定は、Bcr-Ablを欠くCOS-1細胞由来のBcrよりも、カゼインリン酸化に対する活性は25倍小さいことを示した。これらの結果は、 Bcr-AblによるBcrのチロシンリン酸化は、Bcrのセリン/スレオニンキナーゼ活性を減少させる主要なファクターであることを示す。実施例Ｘ BcrはBcr-Abl機能の負の調節因子であるこの実施例では、3'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理することによる、Bcrキナーゼ活性およびBcr/Bcr-Abl複合体の減少を証明する。 p160 BCRが、BCR-ABLタンパク質チロシンキナーゼの標的であるという事実、およびチロシンリン酸化p160 BCRが生細胞内でRasシグナリング経路の活性化因子であるGrb2分子と相互作用し得るという事実は、p160 BCRがPh¹-陽性白血病の病因において役割を果たすという仮説と一致する。 p145 c-ABLの活性型チロシンキナーゼによるp160 BCRのチロシンリン酸化およびその後のGrb2タンパク質との相互作用は、p160 BCRが、特定の正常な生理学的過程において極めて重要なシグナリング分子でもあり得ることを示している。 BCR-ABLの発ガン作用におけるBCRの役割を検討するために、BCR-ABLを発現する細胞内で、BCRタンパク質発現を特異的に排除または減少させた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは塩基対形成によって特定のmRNAに結合し、次いでそのmR NAの分解により、タンパク質発現を妨害し得る。BCR-ABLは3'BCRコード配列（アミノ酸残基927-1271）を欠くので、3'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチドは、B CR-ABL発現を妨害することなく、BCR発現を選択的に減少させることにおいて有用なはずである。 3'BCR配列は、p21 RasGAPおよびABR遺伝子のようないくつかのヒト遺伝子と相同性を有する。したがって、選択した3'BCRセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を、GeneBankデータベースのFASTAサーチにより調べ、既知のヒト遺伝子と有意な相同性を持つオリゴヌクレオチドを排除した。プライマー選択プログラムによるオリゴヌクレオチドの試験は、有意な二次構造形成を示さなかった。以下のオリゴヌクレオチド配列を選択した：BCR3351アンチセンス，5'ATCATCA CCGACACATCC3'（配列番号20）；BCR3351センス、5'GGATGTGTCGGTGATGAT3'（配列番号21）。これらのオリゴヌクレオチド配列は、BCRコード配列3351-3368に対応し、BCR-ABL配列および他の既知のヒト遺伝子配列中には認められない。これらのオリゴヌクレオチドは、Genosys Biotechnologies，Inc．（Houston, TX 77380-3600）により合成した。エンドヌクレアーゼ消化に対するそれらのオリゴヌクレオチドの耐性を増し、それらの効果を長続きさせるため、各オリゴヌクレオチドの両末端に２つのリン酸トリエステル結合を配置した。このセンスおよびアンチセンス3'BCRオリゴヌクレオチドの効果を、SUP-B15細胞（p185BCR-ABLを発現するPh¹陽性急性リンパ球性白血病患者に由来する細株）におけるBCR発現について試験した。抗BCR（1256-1271）ペプチド抗体（この抗体はBcrタンパク質を検出するが、Bcr-Ablタンパク質を検出しない）を用いてイムノキナーゼアッセイを行ない、センスまたはアンチセンス3'BCRオリゴヌクレオチドいずれかによる処理の７日後に、B15細胞中でのBCR発現のレベルを決定した（図13、レーン１および３）。その結果は、アンチセンス処理したB15細胞が、センス処理した細胞に比べて、非常により低いレベルのBCRタンパク質を発現することを示した。そのＣ末端Bcr抗体は、Bcr-Ablを検出しないために、Bcrと共沈したBcr-Ablのレベルは、Bcr/Bcr-Abl複合体量の見積もりを与える。重要なことに、これらのアッセイは、アンチセンス処理したB15細胞では、センス処理した細胞に比べて、p160 BCR/p185 BCR-ABL複合体の量も減少していることを示した（図13、レーン１よび３）。この研究では、等量のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したB15細胞を分析した。抗Ablモノクローナル抗体によるウェスタンブロット分析は、p185BCR-ABLの発現がアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチド処理によって有意に変化しないことを示した（図12）。これらの結果は、3'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチドが、BCR-ABLの発現を妨害することなく、正常なBCRの発現を特異的に減少させることを示した。図13のレーン１および３に見られるp160BCRのデンシトメーター（Melecular D ynamics）による定量分析は、アンチセンスで処理したB15細胞がセンス処理した細胞より約14倍少ないBcrを含むことを示した。しかし、図12の定量分析は、アンチセンス処理したB15細胞のBcr-Ablおよびc-Ablのレベルが、センス処理した細胞より、それぞれ約1.6倍および1.35倍減少していることを示した。c-Ablを内部対照として用いると、アンチセンス処理によるB15細胞中のp160BCRの実際の減少は約10倍である。 3'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の生物学的効果を、SUP-B15細胞で試験した。SUP-B15細胞を、３連のウェルに1.6×10⁵細胞/mlの濃度（20%FCSを補充したRPMI培地200μl容量中）に接種した。オリゴヌクレオチドを10μMの最終濃度で細胞に加えた。トリパンブルー排除アッセイにより９日間細胞数をモニターした。３連の平均細胞数を各日測定した（図20A）。 Ras経路の刺激におけるBcrリン酸化チロシン177の立証された役割（Pendergas tら,1993；Puilら,1994；図18および図19）のために、アンチセンス3'BCRオリゴはBcr-Abl発現細胞の増殖を増大させることが予想された。結果は、SUP-B15細胞のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理が、センスオリゴヌクレオチド処理と比べより高い増殖密度を持続させることを示した。 M3.16細胞（p210BCR-ABLでトランスフェクションされたヒト巨核球）の処理からも同様の結果が得られた（図20B）。この特定の研究では、細胞数を長期間（1 1日間）追跡し、そして第５日に初期濃度の半分にあたるオリゴヌクレオチドをさらに添加した。第９日の細胞培養を光学顕微鏡による試験は、アンチセンスで処理したM3.16細胞が、センス処理した細胞よりコンフルエントであることを示した。要約すると、本発明者らは、Bcrタンパク質が3'BCRアンチセンス処理により減少するかどうかを決定する研究を行なった。つまり、十分量のp185BCR-ABLを発現するSUP-B15細胞を、センス3'BCRオリゴおよびアンチセンス3'BCRオリゴで７日間培養物中で処理した。アンチセンス処理した培養物は、センス処理した培養物より２倍多い生細胞を有していた。これらの培養物に対して２つの型のアッセイを実施した。第１に、Bcr-Ablタンパク質のレベルをウェスタンブロッティングでアッセイした。アンチセンス処理培養は、センス処理培養と比べて、Bcr-Ablタンパク質の発現に有意な変化を持たなかった（図12）。したがって、増殖速度の増大は、 Bcr-Abl発現が増大した結果ではなかった。第2に、アンチセンス処理培養とセンス処理培養の溶解物を、Bcrのカルボキシ末端に対する抗体（これらはBcr/Bcr-Abl複合体を検出することがわかっている；Campbellら，1990；Liuら，1993）を用いる免疫複合体キナーゼアッセイ法でアッセイした。これらの抗体はBcrを直接検出するが、Bcr-Ablタンパク質を直接検出することはない。しかし、BcrはBcr-Ablと複合体化し得るので、このアッセイ法は、Bcrと共に共沈するBcr-Ablをも検出する。これらの免疫複合体を標識したATPと共にインキュベートすると、Bcr-AblによるBcrのチロシンリン酸化およびBcr-Ablの自己リン酸化が起こる（Liuら,1993）。センス処理培養とアンチセンス処理培養から得た溶解物を比較したところ、アンチセンスによるBcrおよびBcr/Bcr-Abl複合体の劇的な減少が明らかになった（図13）。リン画像装置（phosphorimager）による分析は、アンチセンス3'BCRによってBcrの量が約14倍減少することを示した。Ablウェスタンブロットデータを質量に関する内部対照として使用すると、Bcrの特異的減少は約10倍であると見積もられる。したがって、図12および図13のデータは、アンチセンス3'BCRオリゴが機能的なBcrとBcr/Bcr-Abl複合体の量を劇的に減少させ、一方Bcr-Ablタンパク質のレベルには有意な影響を与えないことを示している。これらの結果は、BcrがBcr-A bl機能の負の調節因子であることの根拠となる。実施例XI 正常なBcrタンパク質は負の調節因子役割を有する本実施例は、低血清に維持した、3'BCRアンチセンスで処理したBcr-Abl発現細胞は、センス処理細胞と比較して生存率が高いことを証明する。センスオリゴヌクレオチド処理細胞の増殖パターンとアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞の増殖パターンのとの間の相違は、培養サイクルの後期まで観測されない。これらの結果は、培地中の何らかの因子がアンチセンス3'BCRオリゴヌクレオチドの効果を克服し得ることを示唆している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によって誘導される効果には、血清レベルを減少させる必要がある可能性がある。 B15細胞を低血清含有培地［５％ウシ胎児血清（FCS）］中で培養した。通常これらの細胞には20%FCSが必要である。B15細胞の1バッチ（2.2×10⁶/ml）を、５％ FCSを含むRPMI中で培養した。その懸濁液200μlを96ウェル培養プレートの各ウェルに接種した。その培養物に、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを10μMの最終濃度で添加した。３連の平均値として細胞数を決定し、それを図14にプロットした。低血清含有培地で培養したB15細胞は、センスオリゴヌクレオチドで処理した後より、3'BCRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した後の方が、生存率が高いことを見出した。すなわち、アンチセンス3'BCRによる処理の5日後の生存細胞数は、センス処理細胞の場合の約２倍であった。これらの結果は、細胞増殖を阻害する血清条件下で、正常なBcrタンパク質がB cr-Abl発現細胞の生存を阻害することを示している。したがって、この結果は、正常なBcrタンパク質が、細胞死を刺激することにより、細胞に対して負の効果を有することと一致する。要約すると、センス処理Bcr-Abl発現培養物とアンチセンス処理Bcr-Abl発現培養物の増殖速度パターンを調べたが、数日の遅延期間までアンチセンスの増殖刺激効果は認められなかった。この遅延期間の間は、２つの細胞株で、センス処理細胞とアンチセンス処理細胞との間に増殖速度の相違が認められなかった。この遅延は、培地中の高血清濃度により提供された至適増殖刺激のためであり得る。そこで、血清レベルを減じ、細胞が細胞数を増やし得ない条件下で、アンチセンス3'オリゴの効果を調べた。アンチセンス処理培養物は、センス処理培養物に比べ高い生存率を示した（図14）。これらの結果は、Bcrタンパク質がBcr-Ablの存在下に細胞死を刺激し得ること、およびBcrの除去がBcr-Abl発現細胞の生存を促進することを示唆している。実施例XII Bcrのリン酸化はそのSer/Thrキナーゼ活性を阻害し、Bcrの負の調節役割を遮断するこの実施例は、Bcr-AblによるSer-Thr Bcr自己リン酸化活性の阻害を証明する。正常なBcrタンパク質は、Bcr-Ablの増殖刺激効果を促進することに加えて、本明細書中に示すように、負の調節的役割を有する。本実施例の結果は、正常なBc rがBcr-Ablの増殖効果を妨げること、およびこのBcrの負の効果がBcr-Ablによる Bcrのチロシンリン酸化により中和されることを示す。 Bcr-AblおよびBcrは、細胞内で抗争しているようである。Bcr-Ablが悪性増殖を刺激するのに対し、非チロシンリン酸化Bcrは増殖を阻害する。さらに、Bcr-A blはチロシンリン酸化によってBcrのキナーゼ活性を阻害し得る。BcrのSer/Thr キナーゼ機能は、その負の増殖効果を担っていると推定される。したがって、Bc rのチロシンリン酸化は、そのSer/Thrキナーゼ活性を阻害するので、BcrのSer/T hrキナーゼ機能の遮断は、その負の増殖機能を遮断する。 Bcr-Ablは、Bcr（Bcr-Abl欠損細胞から収集したもの）のインビトロリン酸化を触媒し、Bcr自己リン酸化のレベルを減少させる。そこで、以下の研究を行なった。イムノキナーゼアッセイにおいて、Bcr-Abl免疫複合体を添加せずに［³²P ］ATPで標識したゲル精製Bcrのリン酸化アミノ酸比を、比較的高レベルのBcr-Ab l免疫複合体を用いて標識した場合、および少量のBcr-Abl（高レベルの５％）を添加した場合と比較した。キナーゼアッセイにおけるBcr免疫複合体へのBcr-Abl免疫複合体の添加は、Bc r-AblおよびBcrのリン酸化を示した（図15）。リン酸化Bcr-Ablのレベルは、Bcr -Abl免疫複合体のレベルが増大するにつれて増大したが、リン酸化Bcrのバンドの強度には目にみえるほどの変化がなかった。しかし、これらの異なる条件下でのBcrバンドのリン酸化アミノ酸分析は、比較的低レベルのBcr-Abl複合体で、Bc rのバンドのリン酸化セリン/スレオニン含量における劇的な減少を示した（図15 ）。定量分析は、低レベルのBcr-Acl（５％）により、Bcrのセリン/スレオニン自己リン酸化が2.5倍以上減少することを示した。高レベルのBcr-Abl複合体では、Bcr自己リン酸化のレベルが約30倍減少した。これらの結果は、Bcrのチロシンリン酸化のレベルが、Bcr自己リン酸化活性の阻害のレベルと直接相関し得ることを示す。 Bcr-Ablが触媒するチロシンリン酸化により、Bcrのリン酸基転移機能が同様に阻害されるかどうかを決定するために研究を行なった（図16および図17）。これらの研究では、キナーゼ反応混合物にカゼイン（10μg）を加えて、BcrまたはインビトロでBcr-Ablと混合したBcrによる、この添加した基質のリン酸基転移を起こさせた（図16および図17）。その結果、Bcrによるカゼインのリン酸基転移が極めて効果的であることを示した（図16のレーン１および２を比較のこと）。さらに、リン酸化アミノ分析は、カゼインがセリンおよびスレオニン残基上でリン酸化されることを確立した（図17のレーン1）。興味深いことに、BcrにBcr-Ablを加えると、添加したカゼインのリン酸化が刺激されたが（図16のレーン3）、カゼインセリン/スレオニンリン酸化のレベルは著しく阻害され、同時にカゼインがチロシン残基上で強くリン酸化された（図17 のレーン2）。これらの結果は、Bcr-Ablオンコプロテインが正常なBcrのリン酸基転移機能を阻害することを極めて明瞭に示している。これらの結果は、Bcr-Ablが、Bcr内の第１エキソン配列のチロシンリン酸化により、実際にBcrの負の効果を中和し得るという仮説を支持している。Ser/Thrタンパク質キナーゼとして機能するのは、Bcrの第１エキソンである。Bcrのキナーゼドメイン内またはその近傍にある数個のチロシンがBcr-Ablによってリン酸化される。Bcrのキナーゼドメインは、残基163-355を含む（CampbellおよびArling haus，1991）；本開示は、Bcr-Ablが触媒するリン酸化の結果として、正常なBcr タンパク質内の177、283および360位のチロシンがリン酸化されることを証明する。いくつかの他の第１エキソンのチロシンもリン酸化されそうである。これらのチロシンリン酸化のうち1またはそれ以上が、Bcrタンパク質の形状をいくらか変化させ、それがそのセリン/スレオニンキナーゼ活性を阻害し得る。実施例XIII Bcrフラグメントの発現材料および方法：COS1細胞ATCC番号CRL1650（Rockville,MD）COS1は、野生型Ｔ抗原をコードするSV40の起点欠損突然変異体により形質転換されたサル腎臓細胞（CV1）から樹立された繊維芽細胞様細胞株である。COS1細胞は、10%ウシ胎児血清（Gibco Laboratories，Grand Island，NY）を補充したDMEM（Grand Island B iological Co.（Gibco），Grand Island,NY）中で、5%CO₂で37℃で培養した。 COS1細胞の一過性のトランスフェクションを、ジエチルアミノエチル（DEAE） -デキストラン手順により行なった。トランスフェクションは、COS1細胞が約60% 〜80%コンフルエントになった時に開始した。リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で 1回およびトリス緩衝化生理食塩水-0.02%デキストロース（TBS-D）で1回洗浄した後、0.2mg/ml DEAE-デキストランおよび2μg/mlの各添加プラスミドとを含有するTBS-Dで、細胞をインキュベートした。細胞が集合および萎縮を始めた5〜10 分後に上清を除去した。 TBS-Dで1回およびPBSで1回洗浄した後、10%ウシ胎児血清および100μg/mlのクロロキンを補充したDMEM中で、37℃で細胞をインキュベートした。3〜5時間後にクロロキン含有培地を除去し、ウシ胎児血清を含まないDMEMで細胞を3回洗浄した。次いで、細胞を回収する前に、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM中で、37℃ で2〜3日間、インキュベートした。 Bcr159、Bcr221、およびBcr413タンパク質をそれぞれ発現するCOS-1ベクターを、p210Bcr-Ablの存在下または非存在下で、COS-1細胞中で発現させた。図6Aは、抗pTyr抗体を用いたウェスタンブロットを示す。Bcr-Ablは、Bcr221およびBcr 413のチロシンリン酸化を誘導するが、Bcr159のチロシンリン酸化を誘導せず、これはBcrの最初の2つのチロシンがBcr-Ablの標的でないことを示している。次のチロシンは残基177にあり、そしてこれはBcr-Ablによってリン酸化されると予想される（Pendergastら，1993）。Bcr221はチロシンリン酸化されるが、それはBcr413と同様に、Bcr-Ablの存在下でのみ起こった。図6Bは、抗Bcr1-16でプローブした同じ抽出物のウェスタンブロットを示す。両方の条件下でも、3種類のBcrタンパク質フラグメントの全てが特異的に発現されることに注意せよ。要約すると、Bcr159は、２つのチロシンの存在にもかかわらず、Bcr-Ablを発現する細胞内でリン酸化されない（図6Aおよび図6B）。対照的に、Bcrの221残基 N末端フラグメントおよび413残基N末端フラグメントは、Bcr-Ablを発現する細胞中で発現され、そして両方ともチロシン177がリン酸化される。実施例XIV レトロウイルスを介したBCR-ABLペプチドの送達この実施例では、フィラデルフィア陽性細胞が存在する白血病の処置における本発明の使用について記載する。 BCR合成遺伝子のコピーを供給しそして、またそれにより、アダプタータンパク質に結合しそしてrasオンコジーン経路を阻害しそして、BCR-ABLの超らせん領域に結合して自己リン酸化を阻害するBCRペプチドまたは融合ペプチドを含むタンパク質産物を供給するために、BCRペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を骨髄に導入する。 BCR-ABL遺伝子を含むレトロウイルスベクターpG7CHT（図11）を、Albert Deis seroth博士から入手した。高力価ウイルスの生産には、pA317アンホトロピックレトロウイルスパッケージング細胞株（American Type Culture Collection，Ro ckville，MD；＃CRL9078）を用いる。EcoRIおよびSphI制限エンドヌクレアーゼによる消化で、BCR-ABL遺伝子を上記プラスミドから切り出す。次に、EcoRIおよびSphI制限酵素による消化でpSG5BCRプラスミドから切り出した全長BCR遺伝子を、pG7CHTベクターのEcoRIおよびSphI部位に挿入する。このBCR遺伝子はMoMSV/LT R下で発現される。このベクターは、CMVプロモーター（Pcmv）下で発現するハイグロマイシン耐性遺伝子（HyTK）も含む。BCRのN-末端フラグメントも上記と同じストラテジーで発現させる。 Bcr421フラグメントはBcr-Ablのオリゴマー化を妨害しそして、天然のBcr-Abl のリン酸化部位をすべて含む。したがって、このフラグメントの過剰発現は、Bc rの第１エキソンの阻害活性の全てを有する。しかし、これはShc効果およびCrkl 効果に直接干渉するわけではなく、Bcr-Ablのオリゴマー化を阻害するので、Bcr -Ablのキナーゼ活性が著しく減少する。したがって、CrklとShcが著しくチロシンリン酸化されることはないはずである。３つのリーディングフレームのいずれにおいてもコドン422に停止コドンを持つ完全長BCRをベクターに挿入したことに注意せよ。したがって、421フラグメントのみが生産される。同様に、それぞれコドン159および221の後に停止コドンを挿入することによって、Bcr159フラグメントとBcr221フラグメントを作成した。実施例XV フィラデルフィア染色体陽性細胞を選択的に阻害するための Bcr-Ablペプチドによる骨髄サンプルの処理この実施例では、インビボ注射に先立ってインビトロで白血病（フィラデルフィア染色体陽性）細胞を除去するための自己骨髄浄化（パージング）について概説する。この方法はまた、骨髄の二倍体（正常）細胞数を富化させ、それゆえその投与を受ける白血病患者における治療能力を増大させるという利点があり得る。この実施例において使用される「正常細胞」とは、骨髄中のフィラデルフィア染色体陰性細胞をいう。「正常細胞」はまた、増殖がその細胞内のABLに依存する骨髄細胞としても定義される。したがって、2×10¹⁰又は2×10⁸/kgの有核細胞を含む少なくとも1000mlの骨髄サンプルを、滅菌条件下の白血病患者から集める。次にその試料をFicoll hypaq ueまたはPercoll不連続勾配分離にかける。有核細胞（未分化）をその界面から集める。これによって有核細胞の数が５倍(4×10⁷/kgへ)減少する。次にその細胞を、免疫付着分離によりDR（分化中の造血細胞に発現するクラスII HLA抗原ファミリー）陽性細胞を除去することによって、抗体分離にかける。これにより、細胞数が2〜5×10⁷細胞に減少する。次に、この残った細胞を、HLl培地の組織培養培地（40〜100cc）の、1ccあたり5×10⁵細胞で再懸濁し、1000UのGMCSFおよび IL3を補充し、そしてBCRペプチドと共に３日間インキュベートする。次に、Bcr-Ablペプチド（またはリン酸化ペプチド）（例えばリポソームにパッケージングしたもの）を、骨髄細胞および細胞支持培地の細胞培養物に、1〜1 00μMの濃度で添加する。最も好ましくは、BCRペプチドを10μMの濃度で骨髄細胞培養系に加えるべきである。毎日培地を変えながら、約３日間培養した後、培養を調べて正常細胞に対する白血病細胞の比を決定する。１白血病細胞：100正常細胞を超えない比率なら、治療用骨髄移植物として白血病患者に対する使用のために受容可能と考えされる。正常細胞対白血病細胞の比がそれぞれに100対１より有意に低くなれば、移植後の緩解が長続きすることが臨床試験によって示されているので、この比率を選択した。次いで、上述のように処理された「浄化した」フィラデルフィア染色体陽性細胞枯渇/二倍体細胞「富化」（フィラデルフィア染色体陰性細胞）自己骨髄試料を移植物受容患者に再導入する。実施例XVI BCRペプチド-処置した組織移植物でのヒトの白血病の処置方法本実施例は、白血病を処置するためのBCRペプチド療法を用いる方法を記載する。具体的には、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む骨髄サンプルの処理および浄化の方法におけるBCRペプチド療法の使用を記載する。１つの実施態様に従い、処置組織をフィラデルフィア染色体陰性細胞について富化し、そして自己移植物として白血病動物に再導入し得る。そうして、白血病患者を処置するための治療手段を提供する。患者のための全体的な臨床的処置プロトコルの一部として、非前処理骨髄組織移植物を用いる従来の処置レジメで達成し得る、正常細胞に対する白血病細胞の 10,000/1から1/1への減少(化学療法から)、および２logの減少(それに続く骨髄細胞画分から)に加えて、この方法は正常細胞に対する白血病細胞の比率において少なくとも２-log(100倍)の減少を提供する。その結果このレジメは、骨髄移植処置の治療指数を増強するレベルに、患者中の白血病細胞の数を効果的に減少させる。いくつかの場合で、患者の骨髄細胞集団中のフィラデルフィア染色体陽性細胞数の３log(1000倍)までの減少を、前処理した骨髄サンプルの再導入の際に達成し得る。患者の前処理した自己骨髄サンプルの再導入はまた、CML疾患を治癒するための方法および慢性期からより重篤な形態の急性白血病への白血病の移行を防ぐための方法を提供する。本明細書中に記載に従って処理された自己骨髄サンプルは、骨髄細胞のフィラデルフィア染色体陽性集団を枯渇させる一方、組織サンプルの正常な造血前駆細胞(二倍体細胞)の集団を富化させる。一旦、調製した骨髄サンプルを本明細書中に記載の方法に従い処理すると、CM Lにおける骨髄移植物を実施する一般的技術のために用いられる標準的なプロトコルを、最初の骨髄サンプルを得るため、および患者に処理した骨髄を再導入するために用い得る。そのような一般的な臨床的技術は、Canaaniら(1990)により記載される(この参考文献は、この目的のために本明細書中で参考として特に援用される)。精製した骨髄の約50〜100ccの容量(2.5×10⁷細胞を含む)が、請求の範囲の処置をもたらすために患者に与えられる処理した骨髄組織の容量である。好ましい患者プロフィール適格性以下に、予期されるBCRペプチド療法患者において最も所望の特性を規定する一般化した患者プロフィールを提示する。１．慢性期初期、あるいは加速期または芽細胞危機(blast crisis)後の第２慢性期のインターフェロン治療抵抗性CML患者が、記載の本発明に従う療法に特に良好に適している。慢性期に採取および貯蔵された骨髄を有する患者、または慢性期へと再誘導された患者が、特に処置対象として好ましい。２．患者は最も好ましくは、BCRペプチドで前処理されるべき自己骨髄サンプルの貯蔵に先立ち約４週間インターフェロン治療を控えるべきである。しかし、インターフェロンでの前処理は、そのようなレジメが骨髄採取の少なくとも４週間前に中断された場合、BCRペプチド療法に対する適格性について患者を失格にすることはない。３．患者はZubrodスケールにおいて＜３の動作(表２-Zubrodスケールを参照のこと)、1.6mg％未満のクレアチニンレベル、受容可能な心臓の状態(クラスIまたは II)、２mg未満のビリルビンを有する正常な肝機能、および受容可能な肺の状態( FEVおよびDLCO＞予想の50％)を有しなければならない。患者は処置時に感染なしであるべきである。４．1.6未満の血清クレアチニンおよび正常範囲内のSG0Tが必要である。処置計画１．骨髄の吸引および末梢血幹細胞の回収ならびに貯蔵：患者が慢性期初期にあるとき、または化学療法による慢性期への再導入後に、骨髄を標準的技術に従い吸引しそして貯蔵する。インビボ法(化学療法)を用いて、移植細胞集団中のフィラデルフィア染色体陽性細胞のレベルを引き下げ、引き続き骨髄を採取しそしてBCRペプチドで処理する。２．BCRペプチド処置のための手順は以下の通りである：ａ．骨髄サンプルの有核細胞(70kgの体重のヒト患者当たりおよそ1.4×10¹⁰有核細胞)を、制限された増殖能の細胞を除去するために、ficoll hypaque勾配上で濃縮する(これは総細胞数を５分の１に低下させる)。次いで残存細胞(約2.8× このように処理した骨髄調製物は、迅速な造血の回復を生じさせることが観察された。これは細胞の総数を10分の１(2.8×10⁸)に引き下げる。次いで、この細胞を1,000ユニットのGMCSFおよびIL-3を補充した50ccのHL1培地に希釈する(細胞濃度は5.6×10⁶/cc)。ｂ．細胞を３日間、リポソームとしての10mMの各BCRペプチドの存在下で、37 ℃で滅菌培地中でインキュベートする。ｃ．すすぎの後、BCRペプチドを細胞から洗い流す。次いで細胞を標準的な手順により低温保存する。もしもこれまたは他のインビトロ技術を、フィラデルフィア染色体陽性細胞を除去するために利用できないならば、慢性期に採取した、または化学療法を受けた患者の慢性期の再誘導後に採取した,末梢血と骨髄との組み合わせが利用され得る。患者の腸骨稜からの複数の骨髄吸引を、サイトキサン、VP-16およびTBIのような薬剤の投与前に実施する。第２の骨髄貯蔵は、4×10⁸の総有核細胞/kg未満の場合に考慮し、2×10⁸細胞/kgをBCRペプチドインキュベーション用に用い、そして2×10⁸細胞/kgをバックアップとして用いる。患者から採取した骨髄サンプルの有核細胞の量の十分さの別の基準は、4×10⁴ CFUGM/kgである。あるいは、末梢血由来の細胞をバックアップとして再構築用に回収し得る。末梢血由来の6×10⁸の単核細胞/kgまたは2×10⁴/kgのCFUGMの用量がバックアップとして必要とされる。処置計画調製的骨髄奪格レジメは以下の全身化学療法を含む：シクロホスファミド：0.5リットルのD5W中の60mg/kgを２日間毎日３時間にわたり静脈内で−第１日〜２日(総量120mg/kg)。 VP-16：通常の生理食塩水１リットル中の125mg/m²を、毎日12時間ごとに３時間にわたり静脈内投与を３回(第１日〜３日に６用量)(総量750mg/m²)。 V16およびシクロホスファミドとともに与えられる水和は24時間ごとに４リットルである(寛容されれば)。これは患者の血管内液容量および尿の出量を維持するために必要に応じて補充される。全身照射：全身照射は約1020センチグレイである。患者を仰向けに置き、そして TBIを170ラド/フラクションの計算した中心平面線量(mid plane dose)(各フラクションは、正に第６日〜８日に始めるようにされる)で右側から指向させる。次いで自己骨髄を、アナフィラキシー反応を防ぐために、再注入前30分にベナドリル(benadryl)25mgおよびソルコルテフ(solucortef)100mgでの前投薬後、TBIの最後の線量後９日目に再注入する。 12LP(保護された環境)における処置が最も好ましい。患者は、500顆粒球/mm³ が達成されるまで、最も好ましくはそこに残る。患者は入院中、バクトリム(bac trim)DS po BID およびケトコナゾール200mg poq8hを受容する。血液産物全てを、処置の開始時からそして移植後３か月間照射する。維持療法：インターフェロン維持療法を移植後６週目に始める(0000/デシリットルより高い血小板数および2,000/デシリットルより高い絶対顆粒計数への回復) ；１用量３〜９×10⁶ユニットで、その用量を血小板数＞50×10³/μlとともに、 WBC数2×10³/μlと4×10³/μlとの間に維持するように調整する。前処置の評価形態学、病理学、および細胞遺伝学用の骨髄吸引物およびバイオプシーを最も好ましくは処置の前に得る。EKGおよびCXRを全ての患者に対して実施する。また尿検査を療法前に行う。また、拡散能を用いる肺機能の調査を(許容される場合)行う。研究期間中の評価 CBC、血小板、および分別測定(differential measurement) を最初の誘導期間中１〜２日ごとに得た。形態学的病状のための骨髄吸引物およびバイプシーは骨髄回収時に実施する(W BC数＞1.5 K/μlの場合)。骨髄回収の際には、CBC、血小板数および分別、SMA 12、ならびに細胞遺伝学を含む骨髄研究を包含する完全な精密検査を実施する。緩解時の調査事項は、CB C、血小板数、1〜4週ごとの分別およびSMA 12、1〜3月ごとの細胞遺伝学を用いる骨髄研究を含み、そして疾患の状態のより示される。応答および毒性のための基準応答の基準は疾患の全ての相について以下のように類似している：完全な血液学的緩解−骨髄(５％未満の芽細胞)ならびにWBC＜10×10³/μlかつ末梢芽細胞、前骨髄球、または骨髄球を含まない末梢血の少なくとも４週間の正常化。これはその疾患のすべての徴候および症状の消失に加えてである。完全な血液学的緩解は、フィラデルフィア染色体(Ph)の抑制に従いさらに分類される：ａ）細胞遺伝学的応答無し−Ph陽性100％ｂ）最小の細胞遺伝学的応答−Ph陽性35〜95％ｃ）部分的細胞遺伝学的応答−Ph陽性5〜30％ｄ）完全な細胞遺伝学的応答−Ph陽性０％これは、総好中球数1000/mm³が移植後に達成された後に、その後６か月の間隔をあけて行われる。進行中の疾患は、WBC数の増加が慢性期において40×10³/μlより多いか、または加速した疾患または芽細胞危機の特徴出現として、本発明の目的のために定義される。処置された患者全てが、毒性および応答の両方に対して有用である。患者は、骨髄および末梢血中の白血病細胞：正常細胞の比率を補足および/またはさらに引き下げるために、引き続き処理された自己骨髄移植物を与えられ得る。実施例XVII フィラデルフィア染色体陽性白血病患者のインビボ処置リポソーム/Bcr-Ablペプチド(適切な場合、チロシンリン酸化されているかまたはされていない)あるいはp160 BCRまたはBCR N-Tフラグメントを発現するレトロウイルスベクターのいずれかを、白血病を処置するために、定期的に(毎日または週に２回)i.v.注射する。リポソーム/ペプチドの用量は、体重10kg当たり、各ペプチド100 μmolである。ウイルスの用量は、体重150kg当たり10⁹感染単位である。患者を化学的応答について上記のようにモニターする。＊＊＊本明細書中に開示したまたは請求の範囲に請求した組成物および方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なしに作製および実施され得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施態様により記載されているが、変形が、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物、方法、および方法の工程、または工程の順序に適用され得ることは、当業者には明らかである。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連している特定の薬剤が、同じまたは類似の結果が達成されて、本明細書中に記載の薬剤を置換し得ることは明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変の全ては、添付の請求の範囲により規定されたように本発明の精神、範囲、および概念内であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベルステイン−ロペス，ガブリエルアメリカ合衆国テキサス 77401，ベレイアー，ベレイアーコート 1222 (72)発明者ルー，ダイアメリカ合衆国テキサス 77054，ヒューストン，ケンブリッジナンバー５−２エイ 7900

Claims

【特許請求の範囲】１．約４と約500アミノ酸との間の長さであり、チロシン177、チロシン283、またはチロシン360を含むBcr-Ablタンパク質由来の連続アミノ酸配列を含有する精製ペプチドまたはポリペプチドを含み、該ペプチドまたはポリペプチドがBcr-Ab lと接触する際にチロシン上でリン酸化される、組成物。２．前記組成物が、チロシン177を含むペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。３．前記ペプチドが、配列番号８の配列を含有する、請求項２に記載の組成物。４．前記組成物が、チロシン283を含むペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。５．前記ペプチドが、配列番号11の配列を含有する、請求項４に記載の組成物。６．前記組成物が、チロシン360を含むペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。７．前記ペプチドが、配列番号10の配列を含有する、請求項６に記載の組成物。８．前記ペプチドが、配列番号22の配列を含有する、請求項６に記載の組成物。９．前記ペプチドが、セリン354に対応するリン酸化されたセリンをさらに含む、請求項６に記載の組成物。１０．前記組成物が、チロシン177を含む第１のペプチドおよびチロシン283を含む第２のペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。１１．前記組成物が、チロシン177を含む第１のペプチド、チロシン283を含む第２のペプチド、およびチロシン360を含む第３のペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。１２．前記組成物が、チロシン177およびチロシン283を含む単一のペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。１３．前記組成物が、チロシン177、チロシン283、およびチロシン360を含む単一のペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。１４．前記ペプチドが、配列番号28の配列を含有する、請求項13に記載の組成物。１５．前記ペプチドが、約10と約350アミノ酸との間の長さである、請求項１に記載の組成物。１６．前記ペプチドが、約10と約100アミノ酸との間の長さである、請求項15に記載の組成物。１７．前記ペプチドが、約10と約50アミノ酸との間の長さである、請求項16に記載の組成物。１８．前記請求項のいずれかに記載の組成物であって： (a)ShcのAbl SH3結合プロテイン−リッチ領域に結合する、精製Shc結合タンパク質； (b)Crkl上のプロリン−リッチAbl結合部位に結合する、精製Crkl結合ペプチド； (c)pl20Ras GapのSH2ドメインに結合する、精製Ras Gap結合ペプチド； (d)BcrのN末端超らせん領域に結合する、精製Bcr結合ペプチドまたはタンパク質；または (e)BcrのN末端超らせん領域に結合する、精製Grb2結合ペプチドまたはタンパク質、をさらに包含する、組成物。１９．前記Ras Gap結合ペプチドが、配列番号11または配列番号12の配列を含有する、請求項18に記載の組成物。２０．前記Bcr結合ペプチドが、配列番号２から配列番号７のいずれかの配列を含有する、請求項18に記載の組成物。２１．前記Grb2結合ペプチドが、配列番号13または配列番号８の配列を含有する、請求項18に記載の組成物。２２．前記ペプチドまたはポリペプチドが、さらにリポソームと会合する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。２３．前記ペプチドまたはポリペプチドが、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。２４．フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む細胞の混合物において、フィラデルフィア陰性細胞を富化する使用のための、前記請求項のいずれかに記載の組成物。２５．チロシン177、チロシン283、またはチロシン360を含むBcr-Ablタンパク質由来の連続アミノ酸配列を含有する、約４と約500アミノ酸との間の長さのペプチドまたはポリペプチドを発現するDNA配列を含み、該ペプチドまたはポリペプチドはBcr-Ablとの接触する際にチロシン上でリン酸化される、発現ベクター。２６．レトロウイルスベクターとしてさらに規定される、請求項25に記載のベクター。２７．アデノウイルスベクターとしてさらに規定される、請求項25に記載のベクター。２８．リポソームと会合したプラスミドとしてさらに規定される、請求項25に記載のベクター。２９．フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む細胞の混合物において、フィラデルフィア染色体陰性細胞を富化する使用のための、請求項25〜28のいずれかに記載のベクター。３０．フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む細胞の混合物においてフィラデルフィア染色体陰性細胞を富化するための方法であって、該細胞を、前記混合物においてフィラデルフィア染色体陰性細胞を富化するに有効な量の請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターと接触する工程を包含する、方法。３１．前記細胞が骨髄細胞を含む、請求項30に記載の方法。３２．フィラデルフィア染色体陰性細胞が、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む骨髄サンプルにおいて天然に存在する数に比例して富化される、請求項30に記載の方法。３３．骨髄サンプルのフィラデルフィア染色体陽性細胞を除去する方法であって、フィラデルフィア染色体陽性細胞を含む骨髄サンプルを、該骨髄サンプル中のフィラデルフィア染色体陽性細胞の数を減少するに有効な量の請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターと、接触する工程を包含する、方法。３４．前記骨髄サンプルを、CML、AML、またはALLを有するかまたは有すると予測される患者から得る、請求項33に記載の方法。３５．フィラデルフィア染色体陽性白血病を有する患者を処置する方法であって、白血病細胞が本質的に存在しない自己移植骨髄サンプルを調製するに有効な量の請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターで、該患者の骨髄サンプルを処理する工程、および処置サンプルを該患者に投与する工程を包含する、方法。３６．フィラデルフィア染色体陽性白血病を有する患者を処置する方法であって、患者から骨髄サンプルを得る工程、およびエクソビボにおいて該サンプルを、該サンプルからフィラデルフィア染色体陽性細胞を除去するに有効な量を十分な期間、請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターと接触する工程、および除去サンプルを該患者に再投与する工程を包含する、方法。３７．フィラデルフィア染色体陽性白血病を有する患者を処置する方法であって、請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターの、治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。３８．フィラデルフィア染色体陽性細胞に関連する白血病を有する動物を処置するための薬物の製造における、請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターの使用であって、ここで、組織サンプル中のフィラデルフィア染色体陰性細胞を富化するに有効な量で、薬剤は該動物から取り出した組織サンプルに投与され、そして処理された組織サンプルは、該動物に再投与される、使用。３９．フィラデルフィア染色体陽性細胞に関連する白血病を有する動物を処置するための薬物の製造における、請求項１〜23のいずれかに記載の組成物または請求項25〜28のいずれかに記載のベクターの使用であって、ここで、薬剤は、該動物におけるフィラデルフィア染色体陰性細胞を富化するに有効な量で白血病を有する動物に投与される、使用。