DE69427364T2

DE69427364T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von mit bcr-abl assoziierter leukämie und anderen zellproliferativen störungen

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Publication number: DE69427364T2
Application number: DE69427364T
Authority: DE
Inventors: Harald App; L. Gishizky; M. Pendergast; Joseph Schlessinger
Original assignee: University of Durham; New York University Medical Center; Sugen LLC; Duke University
Current assignee: Sugen LLC; New York University NYU; Duke University
Priority date: 1993-09-28
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2014-09-29
Also published as: EP0721586A1; DE69427364D1; DK0721586T3; WO1995009365A1; EP0721586A4; JPH09505730A; AU7846494A; CN1137826A; EP0721586B1; ATE201772T1; CA2172961A1; US6066463A; JP3606579B2; AU693808B2; US20030092079A1; US6528270B1; CN1132011C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren für die Verhinderung und Behandlung von zellproliferativen Störungen, bei denen eine Tyrosin-Proteinkinase oder Tyrosin-Proteinphosphatase beteiligt ist, die in der Lage ist, mit einem Element aus der Familie von Adaptor-Proteinen, die SH2- und/oder SH3-Domänen enthalten, Komplexe zu bilden. Zum Teil basiert die Erfindung auf der überraschenden Entdeckung, dass das Adaptor-Protein GRB-2 in vivo an das intrazelluläre Produkt der Tyrosinkinase von BCR-ABL bindet und für die Aktivierung des oncogenen Potentials des BCR-ABL-Produktes erforderlich ist, und dass eine Blockierung der Signalübermittlung von GRB-2 den transformierten Phänotyp von Zellen rückgängig macht sowie ein Tumorwachstum in Lebewesen reduzieren kann. Die Erfindung betrifft ferner Tyrosin-Proteinkinase/Adaptor-Protein-Komplexe und die Verwendung dieser Komplexe zum Identifizieren von Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen solcher Komplexe zu blockieren.

2. HINTERGRUND

2.1. Proteinphosphorylation und Signalübermittlung

Zellen sind für die Aufnahme von Reizen aus der unmittelbaren Umgebung weitgehend auf extrazelluläre Moleküle angewiesen. Diese extrazellulären Signale sind für die einwandfreie Steuerung so unterschiedlicher Zellprozesse wie Spezialisierung, Kontraktilität, Sezernierung, Zellteilung, Kontakthemmung und Metabolismus unabdingbar. Die extrazellulären Moleküle, zu denen beispielsweise Hormone, Wachstumsfaktoren, Lymphokine, oder Neurotransmitter gehören, wirken als Liganden, die an spezifische Oberflächenrezeptoren der Zelle binden. Die Bindung dieser Liganden an ihre Rezeptoren löst eine ganze Reihe von Reaktionen aus, was sowohl die Verstärkung des ursprünglichen Stimulus als auch die koordinierte Steuerung der einzelnen oben erwähnten Zellvorgänge zur Folge hat. Über reguläre Zellprozesse hinaus können Rezeptoren und deren extrazelluläre Liganden an abnormalen oder potentiell gesundheitsschädlichen Prozessen wie der Virus-Rezeptor-Wechselwirkung, Entzündungen, und der Überführung von Zellen in ein kanzeröses Stadium beteiligt sein.
Ein zentraler Aspekt dieses Prozesses, der als Signalübermittlung bezeichnet wird (neuere Überprüfungen lassen sich Posada et al., 1992, Mol. Biol. Cell 3: 583-592 und Hardie, D. G., 1990, Symp. Soc. Exp. Biol. 44: 241-255 entnehmen), ist die reversible Phosphorylierung gewisser Proteine.
Die Phosphorylierung oder Dephosphorylatierung von Aminosäureresten löst Konformationsänderungen in geregelten Proteinen aus, die deren biologische Eigenschaften verändern. Proteine werden durch Proteinkinasen phosphoryliert und durch Proteinphosphatasen dephosphoryliert. Proteinkinasen und -Phosphatasen werden nach den jeweiligen Aminosäureresten, auf die sie wirken, klassifiziert, wobei zu der einen Klasse die Serin-Threonin-Kinasen und -Phosphatasen (siehe Scott et al., 1992, 2: 289-295), die auf Serin- und Threoninreste wirken, gehören, und die andere Klasse durch die Tyrosin-Kinasen und -Phosphatasen (siehe Fischer et al., 1991, Science 253: 401-406; Schlessinger et al., 1992, Neuron 9: 83-391; Ullrich et al., 1990, Cell 61: 203- 212), die auf Tyrosinreste wirken, gebildet wird. Phosphorylierung ist ein dynamischer Prozess, an dem Phosphorylierungs- und Dephosphorylationsreaktionen konkurrierend beteiligt sind, und das Ausmaß der Phosphorylierung spiegelt zu jedem gegebenen Zeitpunkt das Verhältnis der Aktivitäten von Proteinkinasen und -Phosphatasen, die diese Reaktionen katalysieren, in diesem Zeitpunkt wider.
Während Protein-Phosphorylierung hauptsächlich an Serin- und Threonin-Aminosäureresten auftritt, kommt es daneben auch zu Phosphorylierung an Tyrosinresten, worauf sich großes Interesse richtet, seitdem entdeckt wurde, dass viele oncogene Produkte und Wachstumsfaktor-Rezeptoren wesensgemäße eine Tyrosin-Proteinkinase-Aktivität aufweisen. Die Bedeutung der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung für die Signalübermittlung des Wachstumsfaktors, das Fortschreiten des Zellzyklusses und die neoplastische Transformation ist inzwischen allgemein akzeptiert (Cantley et al., 1991, Cell 64: 281-302; Hunter T., 1991, Cell 64: 249-270; Nurse, 1990, Nature 344: 503-508 Schlessinger et al., 1992, Neuron 9: 383-391; Ullrich et al., 1990, Cell 61: 203-212). Es hat sich gezeigt, dass eine zur Oncogenese führende Subversion der normalen Pfade der Wachstumskontrolle durch Aktivierung oder überhöhte Expression von Tyrosin-Proteinkinasen, die eine große Gruppe von dominanten oncogenen Proteinen bilden, hervorgerufen wird (siehe Runter, T., 1991, Cell 64: 249-270). Liebow et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2003-2007 berichteten, dass eine Inhibierung von Wachstum der menschlichen Pankreaskrebs-Zell-Linie MiaPaCa- 2 mittels Verbindungen, die zu Somatostatin analog sind, mit einer erhöhten Dephosphorylation korreliert ist.

2.2. Tyrosin-Proteinkinasen

Zu den Tyrosin-Proteinkinasen zählt eine große Familie von Proteinen, zu denen viele Wachstumsfaktor-Rezeptoren und potentielle Oncogene gehören, die zwar von Serin/Threonin-spezifischen Proteinkinasen abstammen, sich aber dennoch von diesen unterscheiden (Hanks et al., 1988, Science 241: 42-52). Die Proteinkinasen lassen sich ferner danach einteilen, ob sie Rezeptoren oder Nicht-Rezeptoren sind.
Tyrosin-Proteinkinasen vom Rezeptortyp, die eine transmembrane Topologie aufweisen, sind bereits gründlich erforscht. Man nimmt an, dass die Bindung eines spezifischen Liganden an die extrazelluläre Domäne einer Rezeptor- Tyrosin-Proteinkinase die Rezeptor-Dimerisation und - Phosphorylierung ihrer eigenen Tyrosinreste induziert. Individuelle Phosphotyrosinreste der Zytoplasmadomänen von Rezeptoren können als spezifische Bindungsstellen dienen, die mit einem Wirt aus signalisierenden Zytoplasmamolekülen interagieren, wodurch verschiedene Signalübermittlungswege aktiviert werden (Ullrich et al., 1990, Cell 61: 203-212).
Die intrazellulären Zytoplasma-nicht-Rezeptor-Tyrosin- Proteinkinasen lassen sich im Wesentlichen als jene Tyrosiri-Proteinkinasen definieren, die keine hydrophobe transmembrane Domäne enthalten. Innerhalb dieser breiten Klassifizierung lassen sich die bekannten Zytoplasma- Tyrosin-Proteinkinasen weiter in vier unterschiedliche Morphotypen untergliedern: die SRC-Familie (Martinez et al., 1987, Science 237: 411-414; Sukegawa et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 41-47; Yamanishi et al., 1987, 1: 237-243; Marth et al., 1985, Cell 43: 393-404; Dymecki et al., 1990, Science 247: 332-336), die FES-Familie (Ruebroek et al., 1985, EMBO J. 4: 2897-2903; Hao et al., 1989 Mol. Cell. 51- ol. 9: 1587-1593), die ABL- Familie (Shtivelman et al., 1986, Cell 47: 277-284; Kruh et al., 1986, Science 234: 1545- 1548), und die JAK- Familie. Während sich die Elemente dieser morphotypischen Familien von zytoplastischen Tyrosin- Proteinkinasen in der Gesamtmolekularstruktur unterscheiden, sind ihnen allen neben den nicht-katalytische Domänen auch die katalytischen Kinase-Domänen gemeinsam. Derartige nicht-katalytische Domänen sind die SH2-Domänen (SRC-Homologiedomäne 2; Sadowski et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4396- 4408; Koch et al., 1991, Science 252: 668-674) und SH3-Domänen (Mayer et al., 1988, Nature 332: 269-272). Man nimmt an, dass die nicht-katalytischen Domänen eine wichtige Funktion bei der Steuerung von Wechselwirkungen zwischen den Proteinen während der Signalübermittlung ausüben(Pawson et al., 1992, Cell 71: 359-362).
Während die Beteiligung von zytoplastischen Tyrosin- Proteinkinasen am Zellmetabolismus weniger erforscht ist als jene der Tyrosin-Proteinkinasen vom Rezeptor-Typ, sind inzwischen bedeutende Fortschritte für das Verständnis einiger der Vorgänge erzielt worden, bei denen diese Klasse von Molekülen eine Rolle spielt. Beispielsweise wurde für lck und fyn, beides Elemente der src-Familie, nachgewiesen, dass diese in Wechselwirkung mit CD4/CD8 und dem Rezeptor- Komplex von T-Zellen treten und damit eine Rolle bei der Aktivierung von T-Zellen spielen (Veillette et al., 1992, TIG 8: 61-66). Bestimmte Zytoplasma-Tyrosin-Proteinkinasen wurden mit bestimmten Phasen des Zellzyklus in Verbindung gebracht (Morgan et al., 1989, Cell 57: 775-786; Kipreos et al., 1990, Science 248: 217-220; Weaver et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 4415-4422). Die Beteiligung von zytoplastischen Tyrosin-Proteinkinasen an neuronaler Entwicklung wurde festgestellt (Maness, P., 1992, Dev. Neurosci. 14: 257- 270). Die Deregulation von Kinaseaktivität durch Mutation oder überhöhte Expression ist ein allgemein akzeptierter, der Zelltransformation zugrundeliegender Mechanismus (Hunter et al., 1985, supra; Ullrich et al., supra).

2.3. G-Proteine und Sipnalübermittlung

Guanin-Nucleotid-Bindungsproteine, (G-Proteine; Simon et al., 1991, Science 252: 802-808; Kaziro et al., 1991, Ann. Rev. Biochem. 60: 349-400) wie z. B. Ras (siehe Lowy et al., 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 851-891), spielen eine unentbehrliche Rolle bei der Übertragung von die Mitose auslösenden Signale, die von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ausgehen. So führt beispielsweise die Aktivierung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen durch Ligandenbindung zur Akkumulation der aktiven GTP-gebundenen Form von Ras-Molekülen (Gibbs et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 20437?-2044; Satoh et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5993-5997; Li et al., 1992, Science 256: 1456-1459; Buday et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 1903-1910; Medema et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 155-162). Die Ras-Aktivierung ist ebenfalls für die Transformation durch virale oncogene Tyrosin-Kinasen erforderlich (Smith et al., 1986, Nature 320: 540-543?).
Die Ras-Aktivität wird durch die entgegengesetzten Wirkungen der GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) und der Guanin-Nucleotid-Austauschfaktoren gesteuert, wobei die GAPs die langsame intrinsische Rate der GTP-Hydrolyse auf Ras stimulieren und die Austauschfaktoren die Grundrate des Austausches von GDP gegen GTP auf Ras anregen. Auf diese Weise treten die GAPs als negative Regulatoren bei der Ras- Funktion auf, während die Austauschfaktoren als Ras-Aktivatoren wirken.
Vor kurzem wurde eine unmittelbare Verkoppelung zwischen aktivierten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und Ras hergestellt, mit der Erkenntnis, dass das GRB-2-Protein von Säugern, ein Protein von 26 Kilodalton, das aus einer einzigen SH2- und zwei SH3-Domänen besteht (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442), die Rezeptor-Tyrosin-Kinasen in Säugern und in Drosophila direkt an den Ras Austauschfaktor Sos koppelt (Buday et al., 1993, Cell 73. 611-620; Egan et al., 1993, Nature 363: 45-51; Li et al., 1993, Nature 363: 85-87; Gale et al., 1993, Nature 363: 88-92; Rozakis- Adcock et al., 1993, Nature 363: 83-85; Chardin et al., 1993, Science 260: 1338-1343; Oliver et al., Cell 73: 179- 191; Simon et al., 1993, Cell 73: 169-177). Die SH2-Domäne des GRB-2 bindet an spezifische Tyrosin-phosphorylierte Sequenzen in Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, während die SH3-Domänen des GRB-2 an Prolin-reiche Sequenzen binden, die in dem Sos-Austauschfaktor vorhanden sind. Die Bindung von GRB-2 an die Rezeptor-Kinasen gestattet daher die Rekrutierung von Sos an der Plasmamembrane, wo Ras loziiert ist (Schlessinger, J., 1993, TIBS 18: 273-275).

2.4. BCR-ABL bei der Entstehung von Leukämien

Eine Aktivierung des oncogenen Potentials normaler Zellproteine, zu denen Tyrosin-Proteinkinasen zählen, kann aufgrund einer Veränderung der enzymatischen Aktivitäten, die den Proteinen entsprechen, durch deren ungeeignete Bindung an andere Zellkomponenten, wie z. B. die oben in Abschnitt 2.3. genannten, oder durch beides hervorgerufen werden.
So können beispielsweise Onkoprotein-Zellen durch die BCR-ABL-Tyrosin-Proteinkinase mittels Veränderungen der Enzymaktivität und/oder Abänderung der nichtkovalenten Wechselwirkungen zwischen Proteinen transformiert werden. Das Gen, das für das BCR-ABL-Onkoprotein codiert, ist ein chimäres Oncogen, das durch die Translokation von Sequenzen von der cABL-Tyrosin-Proteinkinase auf Chromosom 9 in BCR- Sequenzen auf Chromosom 22 entsteht (siehe Kurzock et al., 1988, N. Enql. J. Med. 319: 990-998, und Rosenberg et al., 1988, Adv. in Virus Res. 35: 39-81). Das BCR-ABL-Oncogen wurde mit der Pathenogenese bei menschlicher Leukämie in Zusammenhang gebracht, die hinsichtlich des Philadelphiachromosoms (Ph¹) positiv ist. Das Ph¹-Chromosom ist nämlich in wenigstens 90 bis 95 Prozent der Fälle von chronisch-myelogener Leukämie (CML) nachzuweisen, einem klonalen Krebs, der durch neoplastische Transformation von haematopoietischen Stammzellen verursacht wird (Fialkow et al., 1977, Am. J. Med. 63: 125-130), und lässt sich ebenfalls bei ca. 20 Prozent der Erwachsenen mit akuter lymphozytischer Leukämie (ALL), 5 Prozent der Kinder mit ALL, und 2 Prozent der Erwachsenen mit akuter myelogener Leukämie (AML) beobachten (Whang-Peng et al., 1970, Blood 36: 448- 457; Look, A. T., 1985, Semin. Oncol. 12: 92-104). Das BCR- ABL-Gen bringt zwei alternative chimäre Proteine, P210-BCR- ABL, und P185-BCR-ABL, hervor, die für CML beziehungsweise ALL charakteristisch sind. Weiter wurde kürzlich unmittelbar nachgewiesen, dass das Gen Produkt BCR-ABL der verursachende Wirkstoff in CML ist (Skorski et al., 1993, J. Clin Invest. 92: 194-202; Snyder et al., 1993, Blood 82: 600-605).
Klinisch ist CML durch einen zweiphasigen Verlauf gekennzeichnet. Die Erkrankung beginnt mit einer chronischen Phase, die durch einen beträchtlich erhöhten Spiegel von nicht spezialisierten Progenitormyeloidzellen charakterisiert ist. Da die terminale Differenzierung aufrecht erhalten wird, führt dies zu einem stark erhöhten Spiegel von zirkulierenden reifen Granulozyten. Nach einer Zeitspanne von mehreren Wochen bis mehreren Jahren kommt es zu einem Stadium beschleunigter Myeloproliferation, wobei die Knochenmarkszellen zunehmend ihre Fähigkeit zur terminalen Differenzierung verlieren. In diesem Zeitraum treten häufig Thrombozytose, Basophilie und klonale zytogene Anomalien auf. Diese Anomalien signalisieren das endgültige Blast- Krisen-Stadium, im Laufe dessen die Vermehrung unreifer Stammzellen rapide ansteigt, und der Patient unausweichlich stirbt.
Es wurde bisher nachgewiesen, dass die BCR-ABL-Proteine im Vergleich zu normalen c-ABL Protein erhöhte Tyrosin- Kinase und verstärktes Transformierungspotential aufweisen (Konopka et al., 1984, Cell 37: 1035-1042). Die ersten Exon- Sequenzen von BCR aktivieren spezifisch die Tyrosin-Kinase und das Transformierungspotential von BCR-ABL (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792; McWhirter et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1553-1565). Das erste Exon von BCR ist in der Lage, auf eine von Phosphotyrosin unabhängige Weise an die ABL-SH2-Domäne zu binden (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171), und die Deletion von BCR-Sequenzen, die für ABL-SH2-Bindung unentbehrlich ist, führt zu nicht-transformierendem BCR-ABL (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171). Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass BCR in vitro an einige andere SH2-Domänen, die durch andere Proteine codiert sind, bindet (Muller et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5087-5093). Während diese Ergebnisse Grund zur Annahme bieten, dass ein bestimmter Aspekt der SH2-Domänen-Bindung an BCR an der Oncogenizität des BCR- ABL-Onkoproteins beteiligt ist, ist der Mechanismus, der eine derartige BCR-ABL-Oncogenese bewirkt, noch ungeklärt. Beispielsweise wird bei der riesigen Anzahl von SH2-Domänen aufweisenden Proteinen, deren Existenz nachgewiesen ist, die Identifizierung von einem (oder mehreren) BCR-ABL-Effektoren noch erheblich vertiefende Forschung erfordern.

3. KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Verhinderung und Behandlung von zellproliferativen Störungen, bei denen eine Tyrosin-Proteinkinase oder eine Tyrosin-Proteinphosphatase beteiligt ist, die in der Lage ist, mit einem Element der Familie der SH2- und/oder SH3-Domänenaufweisenden Adaptorproteine Komplexe zu bilden. Die Erfindung betrifft ferner Tyrosin-Proteinkinase/Adaptor-Protein-Komplexe, Tyrosin-Proteinphosphatase/Adaptor-Protein-Komplexe und die Verwendung dieser Komplexe zum Identifizieren von Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen den Komponenten derartiger Komplexe zu unterbinden.
Für die "Tyrosin-Proteinkinase" wird hierin die Abkürzung "PTK", und für die "Tyrosin-Proteinphosphatase" die Abkürzung "PTP" verwendet. Es versteht sich, dass sich "PTK", falls nicht anderweitig angezeigt, entweder auf eine transmembrane Tyrosin-Proteinkinase vom Rezeptor-Typ oder eine Zytoplasma-Tyrosin-Proteinkinase beziehen kann, und "PTP" in gleicher Weise, falls nicht anderweitig angezeigt, entweder eine transmembrane Tyrosin-Proteinphosphatase vom Rezeptor-Typ oder eine zytoplastische Tyrosin-Proteinphosphatase betreffen kann.
Zum Teil basiert die Erfindung auf der überraschenden Entdeckung, dass das Adaptor-Protein GRB-2 in vivo an das intrazelluläre Produkt der BCR-ABL bindet und für die Aktivierung des oncogenen Potentials des BCR-ABL-Produktes erforderlich ist. Die Erfinder beweisen als Erste die physiologische Bedeutung der Wechselwirkungen zwischen den Elementen eines Signalübermittlungsweges, und zwar teilweise durch den Nachweis, dass eine Blockierung dieser Signalübermittlung zur Umkehrung des transformierten Phänotyps von Zellen und zur Verhinderung von Tumorwachstum in Lebewesen führen kann. Die Daten, die die Grundlage für diese Entdeckung bilden, sind nachstehend in den Ausführungsbeispielen der Abschnitte 6 bis 14 aufgeführt. Die Erfindung führt daher das erste Beispiel vor, anhand dessen der Zusammenhang der SH2- und/oder SH3-Domänen-aufweisende Adaptorfamilie von Proteinen, insbesondere des GRB-2-Elementes der GRB-Unterfamilie von Proteinen, mit der Entstehung und Aufrechterhaltung der Proliferation/Aktivierung von Zellen hergestellt wird -- hierin nachgewiesen für die abnorme Zellproliferation, die an der Oncogenese, dem Transformationsprozess und der Entstehung von Krebs beim Menschen beteiligt ist. Darüber hinaus offenbart die vorliegende Erfindung hinsichtlich der BCR-ABL-Transformation den ersten Effektor (nämlich GRB-2) für das BCR-ABL-Produkt.

3.1. ABKÜRZUNGEN

Die folgende Tabelle gibt die Ein- und Dreibuchstabenabkürzungen für Aminosäuren wieder, die Proteinchemikern geläufig sind und hierin Verwendung finden.

4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1. Die Stimulation der Aktivierung der Transkription durch BCR-ABL über Ras erfordert die Anwesenheit von Tyrosin 177 in dem ersten Exon von BCR. NIH-3T3 Zellen wurden mit 0,5 ug der angegebenen BCR-ABL-cDNA +/- 5 ug H-Ras- (17N)-cDNA, zusammen mit dem 1 ug pB4X-CAT Reporterplasmid transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion, wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität, wie unten in Abschnitt 9.1.1 erläutert, getestet. Die Einheiten für die Daten wurden willkürlich festgelegt, das Grundsignal gemäß der Aktivität des Reporters.
Fig. 2. Die Stimulation der Aktivierung der Transkription durch BCR-ABL über Ras erfordert die Anwesenheit einer SH3-Domäne von GRB2. Rat1-Zellen, die p210-BCR/ABL Zellen exprimieren, wurden gemeinsam mit dem 1 ug pB4X-CAT Reporterplasmid mit jedem der beiden GRB2-Deletionsmutanten transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität, wie unten in Abschnitt 9.1.1 ausgeführt, getestet. SÄULE 1: RAT 1; SÄULE 2: RAT 1/p210/pCEN Vektor; SÄULE 3: RAT 1/p210/pCEN GRB2 ΔN'; SÄU- LE 4: RAT 1/p210/pCEN GRB2 ΔC'. Die Einheit für die Daten wurde willkürlich gewählt, mit RAT 1 normiert als 1. Das Grundsignal entspricht der Aktivität des Reporter. Die Werte stellen Durchschnittswerte der Duplikate des +/- Bereich dar.
Fig. 3. Der Hämoglobingehalt in K562-Zellen, die Wild- Typ- und mutierende GRB2-Proteine exprimieren. Zell-Lysate wurden präpariert und der Hämoglobingehalt unter Verwendung eines Benzidinfärbemittels festgestellt, wie beschrieben (Feinstein et al., 1992, Oncogene 7: 1853-1857). Dreifach- Proben wurden für jede Zellpopulation analysiert. Die Daten geben die Menge von Hämoglobin pro 1 Mikrogramm aus dem gesamten Zellproteins wieder, das mit den angegebenen Konstrukten transfiziert wurde.

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nachstehend sind Zusammensetzungen und Verfahren für die Verhinderung und Behandlung von zellproliferativen Störungen beschrieben, bei denen eine Tyrosin-Proteinkinase oder eine Tyrosin-Proteinphosphatase beteiligt ist, die in der Lage ist, Komplexe mit einem SH2- und/oder SH3-Domänenaufweisenden Element der Adaptorfamilie von Proteinen zu bilden. Weiter werden hierin Tyrosin-Proteinkinase/Adaptor- Protein-Komplexe, Tyrosin-Proteinphosphatase/Adaptor- Protein-Komplexe, Verfahren für die Herstellung derartiger Komplexe und Verwendungen dieser Komplexe beschrieben. Zu derartigen Verwendungen kann, jedoch ohne Beschränkung darauf, das Identifizieren von Wirkstoffen zählen, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen den Komponenten solcher Komplexe zu unterbinden.
Die Erfindung basiert teilweise auf der überraschenden Entdeckung, dass das Adaptor-Protein GRB-2 in vivo an das intrazelluläre Produkt von BCR-ABL bindet und für die Aktivierung des oncogenen Potentials des BCR-ABL-Produktes erforderlich ist, und dass durch eine Blockierung der Signalübermittlung des GRB-2 der transformierte Phänotyp von Zellen rückgewandelt sowie das Tumorwachstum in Lebewesen reduziert werden kann. Die dieser Entdeckung zugrundeliegenden Daten sind den nachstehenden Arbeitsbeispielen in Abschnitt 6 bis 14 zu entnehmen.

5.1. TYROSINE-PROTEIN-KINASE/ADAPTOR-PROTEIN-KOMPLEXE

Die PTK/Adaptor-Protein-Komplexe der Erfindung weisen, wie unten beschrieben, wenigstens ein Element der PTK-Familie von Proteinen und wenigstens ein Element der Adaptorfamilie von Proteinen auf. Unter physiologischen Standardbedingungen sind die Komponenten derartiger Komplexe in der Lage, stabile, nichtkovalente Anlagerungen mit einer oder mehreren Komponenten des anderen PTK/Adaptor-Protein-Komplexes zu bilden.
Die PTK-Komponenten des PTK/Adaptor-Protein-Komplexes der Erfindung sind entweder intrazelluläre Zytoplasma-non- Rezeptor-PTKs, intrazelluläre Nukleo-non-Rezeptor-PTKs oder transmembrane PTKS vom Rezeptor-Typ, wobei jede von diesen eine oder mehrere charakteristische Peptid-Domänen enthält. Zu derartigen Domänen können eine oder mehrere katalytische Domänen gehören, zu denen, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, eine Tyrosin-Kinase-Domäne zählen kann. Im Allgemeinen weist eine Tyrosin-Kinase-katalytische Domäne eine Länge von ca. 250 bis ca. 300 Aminosäuren auf, was einem Molekulargewicht von ca. 30 kDa entspricht. Die Position der katalytischen Domäne der Tyrosin-Kinase während des nicht fixierten Zustandes liegt im Allgemeinen in der Nähe des Carboxyl-Terminus des Proteins. Kurze, konservierte, Abschnitte von Aminosäureresten können innerhalb der Tyrosin-Kinase-Domäne vorhanden sein, die sich mit Abschnitten von Aminosäureresten verschiedener Länge, die keinen hohen Grad von Konservierung zeigen, abwechseln. Die Consensus-Sequenzen, die den am stärksten konservierten Aminosäureresten der Tyrosin-Kinase-katalytischen Domäne entsprechen, sind kompiliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Siehe beispielsweise Hanks et al. (Hanks et al., 1991, Science 241: 42-52) und Wilks (Wilks, A. F., 1990, Prog. Growth Factor Res. 2: 97-111). Zu derartigen Consensus-Sequenzen zählen die PTK-spezifischen Sequenzen D-L-R-A-A-N oder D-L-A-A-R-N, und P-I/V-K/R-W-T/M-A-P-E. Siehe auch Wilks, A. F., 1990, Progress in Growth Factor Res. 2: 97-111, hinsichtlich weiterer Beispiele solcher Sequenzmotive.
Die PTK-Komponente des PTK/Adaptor-Protein-Komplexes der Erfindung kann ferner eine oder mehrere nicht-katalytische Domänen enthalten, zu denen, allerdings ohne Beschränkung darauf, eine oder mehrere SH2- und/oder eine oder mehrere SH3-Domänen, eine oder mehrere SH2-bindende, und/oder eine oder mehrere SH3-bindende Peptid-Domänen, und/oder (im Fall von Rezeptor-PTKs) eine hydrophobe transmembrane Domäne gehören können. Eine SH2-(d. h. Scr-Homologie-2)-nichtkatalytische Domäne weist im Allgemeinen eine Länge von ca. 100 Aminosäureresten auf. Derartige SH2-Domänen können innerhalb von mehreren, vorzugsweise fünf, gut-konservierten Aminosäuresequenzmotiven eine Reihe von in hohem Maße konservierten oder invarianten Aminosäureresten, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, enthalten. Siehe, beispielsweise Koch et al. (Koch et al., 1991, Science 252: 668-674). Zu den Aminosäure-Consensus-Sequenzen können beispielsweise, allerdings ohne Beschränkung darauf, F-L-I-R-E-S und F- L-V-R-E-S gehören. Der R-Rest dieser Consensus-Sequenzen ist unter SH2-Domänen invariant. Derartige stark konservierte Aminosäuresequenzmotive sind durch Abschnitte variablerer Aminosäuresequenzelementen getrennt, wobei die Abschnitte, obwohl variable, im Allgemeinen eine oder mehrere G- oder P-Reste enthalten.
Eine SH3-(d. h. Scr-Homologie 3)-nicht-katalytische Domäne weist eine Länge von ca. 50 Aminosäureresten auf. Während die Aminosäuresequenz innerhalb einer SH3-Domäne variable sein kann, ist die 3-dimensionale, tertiäre Struktur der Domäne gut konserviert. Eine derartige SH3-tertiäre Struktur ist dem Fachmann hinlänglich bekannt. Siehe beispielsweise Koyama et al. (Koyama et al., 1993, Cell 72: 945-952)
SH2-bindende Peptid-Domänen sind in der Technik hinlänglich bekannt. Siehe beispielsweise Songyang et al. (Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778), Rotin et al. (Rotin et al., EMBO J. 11: 559-567), und Skolnick et al. (Skolnick et al., 1993, EMBO J. 12: 1929-1936). SH2-Domänen können eine Spezifität für bestimmte SH2-bindende Domänen zeigen. Beispielsweise können zu den SH2-bindenden Peptid-Domänen, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, ein Phosphotyr-hydrophiles-hydrophiles-Ile/Pro-Aminosäuresequenzmotiv (im Allgemeinen ist ein derartiges Sequenzmotiv für SH2-Domänen des Typs bevorzugt, der beispielsweise in den src-, fyn-, lck-, fgr-, abl-, crk- und nck-Proteinen zu finden ist) und Phosphotyr-hydrophobe-X-hydrophobe und/oder Phosphotyr-Met-X-Met gehören(im Allgemeinen sind solche Sequenzmotive für SH2-Domänen des Typs bevorzugt, die beispielsweise in p85, Phospholipase-C-γ-, und SHPTP2-Proteinen zu finden sind). Ferner wurde festgestellt, dass eine Consensus-Sequenz, die aus der Analyse der Domänen mehrerer Proteine, die an die SH2-Domänen des GRB-2-Proteins binden, entwickelt wurde, die Sequenz X-P-X-Y-V/I-N-V/I ist. Zusätzlich können SH2-bindende Peptid-Domänen Ser- und Thr- Reste-reiche Regionen aufweisen, von denen einige oder sämtliche phosphoryliert sind (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171).
SH3-bindende Peptid-Domänen sind dem Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt. Siehe beispielsweise Ren et al. (Ren et al., 1993, Science 259: 1157-1161) und Cicchetti et al. (Cicchetti et al., 1992, Science 257: 803-806). Derartige SH3-bindende Peptid-Domänen sind im Allgemeinen reich an Pro-Aminosäureresten, obwohl sich Aminosäurereste zusätzlich zu Pro allein ebenfalls kritisch auf die SH3-Bindung auswirken. Eine der möglichen Consensus-Sequenzen für eine SH3-bindende Domäne ist: X-P-X-X-P-P-P-hydrophober Rest-X- P. Weiter wurden festgestellt, dass die SH3-Domänen von GRB-2 P-P-P-V-P-P-R-R sind, ein Aminosäuresequenzmotiv, das in dem SOS-Protein zu finden ist (Li et al., 1993, Nature 363: 8588; Schlessinger, 1993, TIBS, 18: 273-275.
Zu den intrazellulären Zytoplasma-PTK-Komponenten des PTK/Adaptor-Protein-Komplexes der Erfindung können beispielsweise Elemente der Src-Familie, Moleküle wie src, yes, fgr, fyn, lyn, hck, lck, und blk; Elemente der Fes- Familie, wie z. B. fes und fer; Elemente der Abl-Familie, wie z. B. abl und arg; und Elemente der Jak-Familie, wie z. B. jak1 und jak2, gehören. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die PTK-Komponente des PTK/Adaptor-Protein-Komplexes das intrazelluläre PTK-Produkt des BCR-ABL-Gens. Zu den transmembranen Rezeptor-PTK- Komponenten des PTK/Adaptor-Protein-Komplexes der Erfindung können beispielsweise Moleküle wie Elemente der FGF- Rezeptor-, Sevenless/ROS-, Insulin-Rezeptor-, PDGF- Rezeptor-Familie, der EGF-Rezeptor-Familie von Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder beliebige sonstige Moleküle zählen, die sich mit dem Adaptor-Protein verbinden (siehe beispielsweise Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442).
Die Adaptor-Protein-Komponenten der PTK/Adaptor- Protein-Komplexe der Erfindung weisen eine oder mehrere SH2- und/oder eine oder mehrere SH3-nicht-katalytische Domänen auf. Die SH2- und SH3-Domänen, die ein Teil der Adaptorproteine sein können, sind, wie vorstehend beschrieben, den PTK-Komponenten zugeordnet. Zu Adaptor-Proteinen, die Komponenten der PTK/Adaptor-Protein-Komplexe der Erfindung sein können, können beispielsweise p85, c-Crk, SHC, Nck, ISGF3α, Guanin-Triphosphatase-Aktivator-Protein (GAP) und Elemente der GRB-sub-Familie von Proteinen, wie z. B. GRB- 1, GRB-2, GRB-3, GRB-4, GRB-7, und GRB-10 gehören. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel gehört zu dem PTK/Adaptor- Protein-Komplex der Erfindung das PTK-Produkt des BCR-ABL- Gens und GRB-2-Proteins.
Die Komplexe der Erfindung und/oder die individuellen Komponenten der Komplexe der Erfindung können mit Hilfe von Verfahren, die untenstehend in Abschnitt 5.3.1. beschrieben sind, gründlich gereinigt werden. Ferner können die PTK- und/oder Adaptor-Komponenten der Komplexe der Erfindung durch Anwendung einer Vielzahl von Verfahren erzeugt sein, zu denen, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, chemische Synthese oder rekombinante DNA-Techniken gehören, wie unten in Abschnitt 5.3.2 beschrieben.

5.2. Tyrosin-Proteinphosphatase/Adaptor-Protein-Komplexe

Die erfindungsgemäßen PTP/Adaptor-Protein-Komplexe weisen wenigstens ein Element der PTP-Familie von Proteinen und wenigstens ein Element der Adaptorfamilie von Proteinen auf. Unter physiologischen Standardbedingungen sind die Komponenten derartiger Komplexe in der Lage, stabile, nicht-kovalente Bindungen mit einer oder mehreren der übrigen PTP/Adaptor-Protein-Komplex-Komponenten zu bilden.
Die PTP-Komponenten der PTP/Adaptor-Protein-Komplexe der Erfindung sind entweder intrazelluläre Zytoplasma-non- Rezeptor-PTPs oder transmembrane PTPs vom Rezeptor-Typ, von denen jede eine oder mehrere charakteristische Peptid-Domänen enthält. Zu derartigen Domänen können eine oder mehrere katalytische Domänen zählen, die, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, auch Tyrosin-Phosphatase-Domänen sein können. Im Allgemeinen weist eine Tyrosin-Phosphatase-katalytische Domäne etwa eine Länge von 230 Aminosäuren auf. Etwa 40 der Aminosäurereste der katalytischen Phosphatase- Domäne sind in hohem Maße konserviert, und unter diesen ist im Allgemeinen ein in sehr hohem Maße konserviertes Segment aus 11 Aminosäureresten mit der Consensus-Sequenz I/V-H-C- X-A-G-X-X-R-S/T-G vorhanden. Non-Rezeptor-PTPs weisen im Allgemeinen eine einzige katalytische Domäne dieser Art auf, während die Transmembran-Rezeptor-PTPs allgemein zwei derartige katalytische Domänen, die durch ein Peptid-Segment mit einer Länge von ca. 58 Aminosäureresten getrennt sind, enthalten.
Die PTP-Komponente der PTP/Adaptor-Protein-Komplexe der Erfindung kann ferner eine oder mehrere nicht-katalytische Domänen einschließen, zu denen, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, eine oder mehrere SH2-Domänen, eine oder mehrere SH3-Domänen, eine oder mehrere SH2-bindende Domänen und/oder eine oder mehrere SH3-bindende Domänen gehören können. Jede dieser nicht-katalytischen Domänen kann, wie vorstehend in Abschnitt 5.1. beschrieben, gestaltet sein.
Zu den Transmembran-Rezeptor-PTP-Komponenten der PTP/Adaptor-Protein-Komplexe der Erfindung können beispielsweise CD45, LAR, RPTPα, RPTPβ, RPTPχ?, und RPTPκ gehören. Zu den intrazellulären Zytoplasma-PTP-Komponenten der PTP/Adaptor-Protein-Komplexe der Erfindung können beispielsweise PTPIC, PTPID, und Corkscrew gehören.

5.3. REINIGUNG UND HERSTELLUNG DER PTK/ADAPTOR- UND PTP/ADAPTOR-KOMPLEXE

5.3.1. REINIGUNGSVERFAHREN

Die erfindungsgemäßen PTK/Adaptor- und PTP/Adaptor- Komplexe können gründlich gereinigt werden, d. h. es lassen sich hierfür wenigstens 90% (Gewichtsprozent) und, falls gewünscht, wenigstens 99% der sonstigen Proteine, Glycoproteine, und anderen Makromoleküle, mit denen sie assoziiert sind, entfernen. Eine derartige Reinigung lässt sich mittels einer ganzen Reihe von in der Fachwelt hinlänglich bekannter Verfahren durchführen, indem die Zellen, Gewebe oder Flüssigkeiten, die den PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor- Komplex enthalten, einer Kombination von Standardverfahren, beispielsweise Ammoniumsulfatabscheidung, Molekularsiebchromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie, unterworfen werden.
Alternativ oder zusätzlich kann ein PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex mittels Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden, wobei eine immunoadsorbierende Säule verwendet wird, in der ein Antikörper immobilisiert wird, der in der Lage ist, an eine oder mehrere Komponenten des PTK/Adaptors oder PTP/Adaptor-Komplexes zu binden. Ein derartiger Antikörper kann monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs sein. Andere geeignete Arten der Affinitätsreinigung für einen PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex können beispielsweise ein Substrat in fester Phase, das die katalytische Domäne (d. h. die Kinase-Domäne von PTK oder Phosphatase-Domäne von PTP) bindet, oder eine immobilisierte Bindungsstelle für nicht-katalytische Domänen der PTK-, PTP- und/oder Adaptor-Komponenten des Komplexes verwenden, die auf eine Weise binden, die den Komplex nicht aufbricht.
Die PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe der vorliegenden Erfindung können von Zellen oder Geweben vielfältiger Herkunft biochemisch befreit werden. Für die Reinigung eines natürlich vorkommenden PTK/Adaptor-Komplexes können zu den Ursprungszellen beispielsweise Baculovirus-infizierte SF9-Zellen, A-431-, CHO- und/oder 3T3-Zellen gehören. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung enthält der PTK/Adaptor-Komplex ein BCR-ABL-PTK- und ein GRB2-Protein. Zu den Quellen für die Reinigung eines derartigen PTK/GRB-2-Komplexes können, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, K562-, NMG-01- und ALL-1-Zell- Linien gehören.

5.3.2. SYNTHESEVERFAHREN

Verfahren für die Synthese von Polypeptiden oder Fragmenten davon, die in der Lage sind, als Komponenten der erfindungsgemäßen PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe aufzutreten, sind dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann hinlänglich bekannt. Siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY. Komponenten eines PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes, die gesondert synthetisiert oder rekombinant erzeugt wurden, können durch biochemische Standardtechniken, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, rekonstituiert werden, um wieder einen Komplex zu bilden. Beispielsweise können Proben, die die Komponenten des PTK/Adaptor-Komplexes aufweisen, in einer mit mehr als ca. 150mM NaCl gepufferten Lösung, bei einem physiologischen pH-Wert im Bereich von 7, bei Raumtemperatur kombiniert werden. Beispielsweise kann ein Puffer mit 20mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 137mM NaCl, 10% Glyzerin, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% Desoxycholat und 2 mN EDTA verwendet werden. Eine derartiges Verfahren kann auch für die Rekonstitution eines PTP/Adaptor-Komplexes angewandt werden.
Verfahren zum Präparieren der Komponenten von PTK/Adaptor-Komplexen der Erfindung durch Exprimieren von Nukleinsäuren, die für PTK-, PTP- und/oder Adaptorproteine codiert, sind hierin beschrieben. Verfahren, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren aufzubauen, die PTK-, PTP- und/oder Adaptorprotein-codierende Sequenzen und geeignete Steuersignale für die Transkription/Translation aufweisen. Zu diese Verfahren zählen beispielsweise in vitro rekombinante DNA-Techniken, synthetische Techniken und in vivo Rekombination/gentechnische Rekombination. DNA- und RNA-Synthese können zusätzlich mittels eines automatischen Synthetisators durchgeführt werden. Siehe beispielsweise die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. beschriebenen Techniken.
Vielfältige Vektorverfahren für Wirtsstammzellen-Expression können verwendet werden, um die codierenden Sequenzen der Komponenten der PTK/Adaptor PTP/Adaptor Komplexe der Erfindung zu exprimieren. Zu diesen gehören, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen wie z. B. Bakterien (z. B. E.coli, B.subtilis), die mit rekombinanter DNA von Bakteriophagen transformiert sind, Plasmid- DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die PTK-, PTP- oder Adaptor-Protein-codierende Sequenzen aufweisen; Hefe (z. B. Saccharomyzete, Pichia), die mit rekombinanten Hefe- Expressionsvektoren, die PTK-, PTP-, und/oder Adaptor- Protein-codierende Sequenzen enthalten, transformiert ist; Zellsysteme von Insekten, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus), die PTK-, PTP- und/oder Adaptor-Protein-codierende Sequenzen aufweisen, infiziert sind; pflanzliche Zellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), die die PTK-, PTP-, und/oder Adaptor-Protein-codierenden Sequenzen-codierende Sequenz aufweisen, transformiert sind; oder Zellsysteme von Säugern (z. B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), in denen rekombinante Expressionskonstrukte vorkommen, die Promoter enthalten, die aus dem Genom von Säuger- Zellen (z. B. Metallothionein-Promoter) oder von Säuger- Viren (z. B. dem Adenovirus-late-Promoter; dem Kuhpockenvirus 7.5K-Promoter) abgeleitet wurden.
In bakteriellen Systemen können, abhängig von dem Verwendungszweck des PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes, der exprimiert wird, eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhaft ausgewählt werden. Beispielsweise, wenn große Mengen von PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex-Proteine für die Erzeugung von Antikörpern generiert werden sollen, oder um Peptid-Bibliotheken zu screenen, können Vektoren erwünscht sein, die die Expression von hohen Spiegeln von Fusionsproteinprodukten, die sich leicht reinigen lassen, steuern. Zu derartige Vektoren gehören, allerdings ohne Beschränkung auf diese, der E.coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), bei dem die PTK-, PTP- und/oder Adaptor-Proteincodierende Sequenz individuell in den Vektor im Frame mit der Lac-Z-codierenden Region ligiert sein kann, so dass ein Fusionsprotein entsteht; pIN Vektoren (Inouye et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101- 3109; Van Heeke et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503- 5509); u. dgl.. pGEX-Vektoren können ebenfalls dazu verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind derartige Fusionsproteine löslich und können ohne Weiteres durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen, mit anschließender Eluierung in Anwesenheit von freiem Glutathion von lysierten Zellen befreit werden. Die pGEX-Vektoren sind so konstruiert, dass sie Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltungsregionen aufweisen, so dass das klonierte PTK- und/oder Adaptor-Protein von dem GST-Anteil gelöst werden kann.
In einem Insektensystem wird der Autographacalifornica-Nukleopolyhidrose Virus (AcNPV) als ein Vektor für die Expression fremder Gene verwendet. Der Virus vermehrt sich auf Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Sequenzen, die PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex-Komponenten codieren, können individuell in nicht-essentielle Regionen (beispielsweise in das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promoters (beispielsweise des Polyhedrin-Promoters) gestellt sein. Erfolgreiche Insertion der codierenden Sequenzen führt dann zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und Produktion von einem nichtokkludierten rekombinanten Virus (d. h. einem Virus, dem die proteinhaltige Hülle, für die das Polyhedrin-Gen codiert, fehlt). Diese rekombinanten Viren werden anschließend dazu eingesetzt, um Spodoptera frugiperda-Zellen, in denen das inserierte Gen exprimiert wird, zu infizieren. (siehe z. B. Smith et al., 1983, J. Viol. 46: 584; Smith, US Patent 4 215 051).
In Säuger-Wirtszellen können eine Reihe von auf Viren basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, können die Sequenzen, die PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex-Komponenten codieren, an einen Transkriptions/Translationskontrollkomplex des Adenovirus, z. B. den späten Promoter und die dreiteilige Leadersequenz ligiert werden. Dieses chimäre Gen kann dann in vitro oder in vivo durch Rekombination in das Genom des Adenovirus inseriert werden. Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) ergibt dann einen rekombinanten Virus, der lebensfähig ist und in der Lage ist, PTK-, PTP-, und/oder Adaptorproteine in infizierten Wirtssubstanzen zu exprimieren. (siehe beispielsweise Logan et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655- 3659). Spezifische Initiationssignale können für eine effiziente Translation von inserierten PTK-, PTP-, und/oder Adaptorcodierende Sequenzen ebenfalls erforderlich sein. Zu diesen Signalen zählen das ATG-Initiations-Codon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen ein komplettes PTK-, PTP-, oder Adaptor-Protein-Gen einschließlich seines eigenen Initiations-Codons und benachbarter Sequenzen in den passenden Expressionsvektor inseriert wird, kann es vorkommen, dass keine zusätzlichen Translationkontrollsignale benötigt werden. Allerdings müssen in Fällen, in denen lediglich ein Abschnitt der PTK-, PTP-, oder Adaptor-codierenden Sequenz inseriert wird, exogene translationale Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiations-Codons, zur Verfügung stehen. Weiter muss das Initiations-Condon mit dem Leserahmen der gewünschten codierenden Sequenz in Phase liegen, um eine Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiations-Condone können vielfältiger, sowohl natürlicher als auch synthetischer Herkunft sein. Die Effizienz der Expression kann durch Einbeziehung von geeigneten Transkriptionsverbesserungselementen, Transkriptionsterminatoren, etc. erhöht werden (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).
Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert, oder das Genprodukt in der speziell gewünschten Weise moduliert und prozessiert. Derartige Modifikationen (z. B. Glykosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins von Bedeutung sein. Unterschiedliche Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Prozessierung und Modifikation von Proteinen auf. Es lassen sich geeignete Zell-Linien oder Wirtssysteme auswählen, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins zu gewährleisten. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen, die den zellulären Mechanismus für eine geeignete Prozessierung der primären Transkription, Glykosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts aufweisen, verwendet werden. Zu derartigen Säuger- Wirtszellen gehören, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, etc. Für die langfristige Herstellung von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute ist eine stabile Expression erwünscht. Beispielsweise können Zell-Linien, die sowohl das PTK- und Adaptor-Protein als auch das PTP- und Adaptor-Protein stabil co-exprimieren, hergestellt werden. Anstelle der Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Herkunftsanteile der Replikation enthalten, lassen sich Wirtszellen besser unabhängig oder durch geeignete Expressionskontrollementen (z. B. Promoter, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylationsstellen, etc.) koordiniert mit dem PTK- und Adaptor-Protein-DNA oder PTP- und Adaptor-Protein-DNA und einem auswählbaren Marker transformieren. Nach dem Einschleusen von Fremd-DNA kann man die behandelten Zellen 1 bis 2 Tage in angereicherten Medien wachsen lassen, bevor man zu einem Selektivnährboden wechselt. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht der Selektion Resistenz und ermöglicht den Zellen, das Plasmid stabil in deren Chromosomen zu integrieren und zu Foci heranzuwachsen, die ihrerseits kloniert und zu Zell-Linien expandiert werden können. Dieses Verfahren lässt sich vorteilhaft einsetzen, um Zell-Linien anzufertigen, die sowohl das PTK- als auch das Adaptor-Protein oder sowohl das PTP- als auch das Adaptor-Protein coexprimieren. Solche gentechnisch erzeugten Zell-Linien sind insbesondere nützlich für das Screenen und die Bewertung von Verbindungen, die Einfluss auf die durch die Komplexe vermittelten Signale nehmen.
Eine Reihen von Selektionsverfahren lassen sich einsetzen, zu denen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die Thymidin-Kinase des Herpes-simplex-Virus (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska et al., 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) gehören, und Gene der Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) können in tk-, hgprt- beziehungsweise aprt-Zellen eingesetzt werden. Antimetabolit-Resistenz kann ebenfalls als Basis der Selektion nach dhfr verwendet werden, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); nach gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure vermittelt (Mulligan et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); nach Neo, das Resistenz gegen das Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); und nach hygro, das Resistenz gegen Hygromycin-Gene (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147) vermittelt.
Neue Mitglieder der PTK-, PTP-, und/oder Adaptor- Protein-Familien, die in der Lage sind, die erfindungsgemäBen Komplexe zu bilden, können mittels in der Technik hinlänglich bekannter molekularbiologischer Techniken identifiziert und isoliert werden. Beispielsweise kann ein bisher unbekanntes PTK-, PTP-, oder Adaptor-Protein-Gen mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung zweier degenerierter Oligonukleotidprimer-Poole isoliert werden, die auf der Grundlage von in hohem Maße konservierter Sequenzen innerhalb von Domänen, wie sie bei Mitgliedern der PTK-, PTP-, oder der Adaptor-Protein-Familie gewöhnlich vorhandenen sind, angefertigt werden. Als Matrize für die Reaktion kann cDNA dienen, die durch Umkehrtranskription aus mRNA erhalten wird, die wiederum aus Zell-Linien oder Geweben gewonnen wird, bei denen Expression von PTK/Adaptor- und/oder PTP/Adaptor-Komplexen bekannt ist. Das PCR-Produkt kann subkloniert und sequenziert werden, um zu gewährleisten, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenzen eines Elementes der PTK-, PTP- oder Adaptor-Unterfamilie repräsentieren. Das PCR-Fragment kann anschließend verwendet werden, um einen cDNA-Klon aus PTK-, PTP- oder Adaptor-Protein durch radioaktive Markierung des amplifizierten Fragmentes und Screenen einer Bibliothek von Bakteriophagen-cDNA mit vollständiger Länge zu isolieren. Alternativ kann das markierte Fragment verwendet werden, um eine Genombibliothek zu screenen. Eine Überblick von Klonierungsstrategien, die sich einsetzen lassen, lässt sich beispielsweise aus Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; und aus Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.) entnehmen.
Ein allgemeines Verfahren für die Klonierung bisher unbekannter Adaptorproteine ist von Skolnick (Skolnick, E. Y., 1991, Cell 65: 75) und von Skolnick et al., (US Patent Application Serial No. 07/643,237) beschrieben worden. Kurz gesagt, neue Elemente der Adaptorfamilie von Proteinen können anhand deren Fähigkeit, spezifisch an wenigstens einen Abschnitt eines Tyrosin-phosphorylierten Peptids zu binden, das eine Adaptor-Protein-Bindungsstelle enthält, identifiziert werden. Eine derartige Region kann, allerdings ohne Beschränkung darauf, eine SH2-bindende Domäne sein.

5.4 DERIVATE VON PTK/ADAPTOR- UND PTP/ADAPTOR-KOMPLEXEN

Hier ebenfalls sind funktionale Derivate von PTK/Adaptor- und PTP/Adaptor-Komplexen vorgesehen. Unter "funktionalem Derivat," ist ein "chemisches Derivat", ein "Fragment", eine "Variante", eine "Chimäre", oder ein "Hybrid" des PTK/Adaptor- und PTP/Adaptor-Komplexes zu verstehen, wobei die Begriffe nachstehend definiert werden. Ein funktionales Derivat hat die Eigenschaft, wenigstens teilweise die Funktion des PTK-, PTP-, oder Adaptor-Proteins beizubehalten, beispielsweise die Reaktivität mit einem Antikörper, der für den PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex, die PTK- oder PTP-enzymatische Aktivität oder die durch nicht-katalytische Domänen vermittelte Bindungsaktivität spezifisch ist, wodurch dessen erfindungsgemäße Verwendbarkeit ermöglicht wird.
Ein "chemisches Derivat" des FTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes enthält zusätzliche chemische Mengen, die normalerweise nicht Bestandteil des Peptids sind. Kovalente Modifikationen des Protein-Komplexes oder der Peptide fallen in den Schutzbereich der Erfindung. Wie unten beschrieben, können solche Modifikationen in das Molekül eingefügt werden, indem man die Aminosäurereste des Peptids, auf die gezielt wird, mit einem organischen derivierenden Wirkstoff reagieren lässt, der in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Bausteinen zu reagieren.
Für gewöhnlich lässt man Zysteinbausteine mit alpha- Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), beispielsweise Chloressigsäure oder Chloroacetamin) reagieren, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu erhalten. Zysteinreste werden durch Reaktion mit Bromotrifluoroazeton, α-Bromo-β-(5-Imidozoyl)Propionsäure, Chloroacetylphosphat, N-Alkylmaleimid, 3-Nitro-2-Pyridyldisulfid, Methyl-2- Pyridyldisulfid, p-Chloromercuribenzoat, 2-Chloromercuri-4- Nitrophenol oder Chloro-7-Nitrobenzo-2-Oxa-1,3-Diazol deriviert.
Histidylbausteine werden durch Reaktion mit Diehtylprokarbonat bei einem pH-Wert von 5,5-7,0 deriviert, da dieser Wirkstoff für die Histidylseitenkette verhältnismäßig spezifisch ist. Parabromophenacylbromid ist ebenfalls brauchbar; diese Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0 ausgeführt.
Lysinyl- und Amino-terminale Bausteine lässt man mit Succin oder anderen Karboxylsäureanhydriden reagieren. Eine Derivatbildung mit diesen Wirkstoffen führt zu einer Umkehrung der Ladung der Lysinylbausteine. Andere geeignete Wirkstoffe zur Derivatbildung bei den α-Amino enthaltenden Bausteinen sind Imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chloroborohydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Methylisurea; 2,4 Pentandion; und die Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Die Arginylbausteine werden durch Reaktion mit einem oder mehreren konventionellen Wirkstoffen modifiziert, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin gehören. Die Derivatbildung bei Argininbausteinen erfordert, dass die Reaktion wegen des hohen pKa der Guanidinfunktionsgruppe unter alkalischen Bedingungen ausgeführt wird. Ferner können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der E-Amino Gruppe von Arginin reagieren. Ferner können diese Wirkstoffe mit den Gruppen von Lysin ebenso wie mit der Arginin-&epsi;-Aminogruppe reagieren.
Tyrosylbausteine sind gut bekannte Modifikationsziele für das Einfügen von spektralen Labeln, indem man erstere mit aromatischen Diazonverbindungen oder Tetranitromethan reagieren lässt. Für gewöhnlich werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezien bzw. 3-Nitroderivate zu bilden.
Die Carboxylseitengruppe (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), beispielsweise 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinyl-(4-Ethyl)-Carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4 Azon-4, 4-Dimethylpentyl)-Carbodiimid selektiv modifiziert. Ferner werden Aspartyl- und Glutamylreste in Asparaginyl- und Glutaminylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen konvertiert.
Glutaminyl- und Asparaginylbausteine werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylbausteinen deamidiert. Alternativ werden diese Reste unter essigsauren Bedingungen deamidiert. Jede Form dieser Bausteine fällt in den Bereich der Erfindung.
Die Derivatbildung mit bifunktionalen Wirkstoffen ist beispielsweise zum Cross-Linken der Komponentenpeptide der PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe miteinander oder des PTK/Adaptor-Rezeptor-Komplexes mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder anderen makromolekularen Trägern zweckmäßig. Zu den gebräuchlichen Cross-Linkwirkstoffen gehören z. B. 1,1-Bis(Diazoacetyl)-2-Phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithio-
bis(Succinimidylproprionat) und bifunktionale Maleimide, wie Bis-N-Maleimido-1,8-Octan. Derivat bildende Wirkstoffe, wie Methyl-3-(p-Azidophanyl) Dithio-Propioimidat führen zu fotoaktivierbaren Zwischenstufen, die in der Lage sind, unter dem Einfluss von Licht Cross-Links zu bilden. Alternativ werden reaktionsfähige wasserunlösliche Matrizen, wie Cyanogenbromid aktivierte Karbohydrate und die reaktionsfähigen Substrate, wie sie in den US-Patenten 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 und 4 330 440 beschrieben sind, verwendet, um das Protein zu immobilisieren.
Zu anderen Modifikationen gehören die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl und Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 5.79-86 (1983)), die Acethylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
Solche derivierten Teile können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit u. dgl. verbessern. Diese Teile können alternativ unerwünschte Nebeneffekte des Protein-Komplexes u. dgl. eliminieren oder abschwächen. Teile, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind beispielsweise in Reminuton's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) veröffentlicht.
Der Begriff "Fragment" wird zum Bezeichnen eines Polypeptids verwendet, das von der Aminosäuresequenz der PTK-, PTP-, oder Adaptorproteine der PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe deriviert ist, dessen Länge kürzer ist, als die volle Länge des Polypeptids, von dem es deriviert wurde. Ein derartiges Fragment kann beispielsweise durch proteolytische Spaltung des Proteins mit vollständiger Länge erzeugt werden. Vorzugsweise wird das Fragment rekombinant durch geeignete Modifizierung der DNA-Sequenz gewonnen, die die PTK-, PTP- oder Adaptorproteine codiert, um eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und/oder innerhalb der nativen Sequenz zu deletieren. Fragmente eines PTK-, PTP- oder Adaptor-Proteins, so diese in einem Komplex, der dem natürlich auftretenden PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex ähnelt, vorhanden sind, lassen sich für das Screenen nach Verbindungen einsetzen, die bei der Modulation der Signalübermittlung wirksam sind, wie nachstehend erläutert. Es versteht sich, dass derartige Fragmente, so diese in einem Komplex vorhanden sind, eine oder mehrere kennzeichnenden Abschnitte des nativen PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes beibehalten können. Beispiele solcher beibehaltener Charakteristiken sind: katalytische Aktivität; Substratspezifität; Wechselwirkung mit anderen Molekülen in der intakten Zelle; regulatorische Funktionen; oder Bindung mit einem Antikörper, der für den nativen PTK/Adaptor- oder den PTP/Adaptor-Komplex oder ein Epitop davon spezifisch ist.
Ein weiteres funktionales Derivat, das in den Schutzbereich der Erfindung fallen soll, ist ein PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex, der wenigstens ein "variantes" (z. B. PTK-, PTP-, oder Adaptor-) Polypeptid enthält, dem entweder eine oder mehrere Aminosäuren fehlen oder das im Verhältnis zu dem nativen Polypeptid zusätzliche oder substituierte Aminosäuren enthält. Die Variante kann von einer Komponente eines natürlich auftretenden PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes durch geeignete Modifizierung der Sequenz, die DNA des PTK-, PTP- und/oder Adaptor-Proteins codiert, abgeleitet werden, um Codone für eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und/oder innerhalb der nativen Sequenz hinzufügen, zu entfernen und/oder zu modifizieren. Es ist klar, dass derartige Varianten, die hinzugefügte, substituierte und/oder zusätzliche Aminosäuren aufweisen, eine oder mehrere kennzeichnende Abschnitte des nativen PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes, wie vorstehend beschrieben, beibehalten.
Ein funktionales Derivat von PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexen, die PTK-, PTP- und/oder Adaptorproteine mit deletierten, inserierten und/oder substituierten Aminosäureresten enthalten, kann mit Hilfe von in der Fachwelt hinlänglich bekannten Standardtechniken präpariert werden. Beispielsweise gelingt die Herstellung modifizierter Komponenten der funktionalen Derivate durch stellenspezifische Mutagenesetechniken (siehe z. B. Adelman et al., 1983, DNA 2: 183), bei denen Nucleotide in der DNA, die die Sequenz codiert, derart modifiziert werden, dass eine modifizierte Codierungssequenz modifiziert wird, mit anschlieBender Expression dieser rekombinanten DNA in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, wobei Techniken, wie die vorstehend beschriebenen, eingesetzt werden. Alternativ können Komponenten von funktionalen Derivaten der PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe, die Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen von Aminosäure aufweisen, durch direkte chemische Synthese mittels hinlänglich bekannter technischer Verfahren problemlos hergestellt werden. Die funktionalen Derivate der PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe zeigen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität, wie die nativen Komplexe.

5.5. ANTIKÖRPER GEGEN PTK/ADAPTOR- ODER PTP/ADAPTOR-KOMPLEXE

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antikörper, die in der Lage sind, einen PTK/Adaptor-Komplex oder PTP/Adaptor-Komplex oder ein Epitop davon spezifisch zu erkennen, oder ein Epitop spezifisch zu identifizieren, das entweder auf den PTK-, den PTP- oder den Adaptor-Komponenten des Komplexes liegt, und durch den Antikörper nicht erkannt werden würde, wenn die PTK-, PTP- und/oder Adaptor- Komponente getrennt und abseits von dem PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex vorliegt. Zu derartigen Antikörpern können, allerdings ohne Beschränkung darauf, zählen: polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, einzelsträngige Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, durch eine Fab-Expressionsbibliothek erzeugte Fragmente, anti-idotypische (anti- Id-) Antikörper, sowie Epitop-bindende Fragmente von beliebigen der vorstehend aufgeführten. Derartige Antikörper können beispielsweise für den Nachweis eines PTK/Adaptor- Komplexes in einer biologischen Probe verwendet werden, oder alternativ in einem Verfahren zur Verhinderung einer PTK/Adaptor-Komplexbildung, um so die Entstehung einer zellproliferativen Störung auszuschließen.
Polyklonale Antikörper stellen heterogene Populationen von Antikörpermolekülen dar, die aus Seren von Lebewesen gewonnen werden, die mit einem Antigen, wie z. B. einem PTK/Adaptor-Komplex, oder einem antigenen funktionalen Derivat davon immunisiert wurden. Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern können unterschiedliche Wirtslebewesen durch Injektion des PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor- Komplexes immunisiert werden, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. Abhängig von den Wirtsspezies können die verschiedensten Hilfsmittel verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, zählen: Freunds (vollständige und unvollständige) Mineralgele, wie z. B. Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Hämocyanin der Keyhole-Napfschnecke, Dinitrophenol, und potentiell nützliche menschliche Adjuvanten, wie z. B. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Ein monoklonaler Antikörper, der eine hauptsächlich homogene Population von Antikörpern gegen ein spezielles Antigen darstellt, lässt sich mit Hilfe eines beliebigen Verfahrens gewinnen, das für die Herstellung von Antikörpermolekülen kontinuierliche Zell-Linien auf einem Nährmedium vorsieht. Dazu zählen, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, das Hybridomverfahren von Kohler et al. (Kohler et al., Nature 256: 495-497 (1975) und US Patent 4 376 110), das Hybridomverfahren für menschliche B-Zellen (Kosbor et al., 1983, Immunoloay Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), und das EBV-Hybridomverfahren (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seite 77- 96). Derartige Antikörper können einer beliebigen Klasse von Immunoglobulinen, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, sowie einer jeden Unterklasse von diesen angehören. Das Hybridom, das das erfindungsgemäße mAb produziert, kann in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Ausbeuten mit hohem Titer von mAbs in der in vivo Produktion macht dieses zum gegenwärtig bevorzugten Herstellungsverfahren.
Zusätzlich lassen sich Verfahren einsetzen, die für die Herstellung "chimärer Antikörper" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.. 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) durch Verspleißen der Gene aus einem Maus-Antikörpermolekül mit geeigneter Antigenspezifität mit Genen aus einem menschlichen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität entwickelt sind. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei dem diverse Abschnitte aus verschiedenen Spezien von Lebewesen abgeleitet sind, beispielsweise solche, die eine variable Region, die aus einem murinen mAb abgeleitet ist, und eine konstante Region menschlichen Immunoglobulins aufweisen.
Alternativ können Verfahren, wie sie für die Herstellung von einzelsträngigen Antikörpern beschrieben sind (US Patent 4 946 778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; und Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546), adaptiert werden, um PTK/Adaptor-Komplex-spezifische oder PTP/Adaptor- Komplex-spezifische einzelsträngige Antikörper zu erzeugen. Einzelsträngige Antikörper werden durch Verbindung des schweren und leichten Kettenfragments der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, wodurch eine einzelsträngiges Polypeptid entsteht.
Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen eines PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes enthalten, können durch bekannte Techniken generiert werden. Zu derartigen Fragmenten zählen, ohne auf diese beschränkt zu sein, beispielsweise die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsindigestion des Antikörpermoleküls erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die sich durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente erzeugen lassen. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken aufgebaut werden (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281), um ein rasches und bequemes Identifizieren von monoklonalen Fab-Fragmenten, die die gewünschte Spezifität für den PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex aufweisen, zu ermöglichen.

5.6. BEHANDLUNG VON PTK/ADAPTOR-PROTEIN- UND PTP/ADAPTORPROTEIN-BEZOGENEN ZELLPROLIFERATIVEN STÖRUNGEN

Die vorliegende Erfindung weist erstmalig nach, dass die Bindung eines Elementes aus der Familie von Adaptorproteinen, die SH2- und/oder SH3-Domänen aufweisen, einen entscheidenden Schritt für die Oncogenese und den Transformationprozess darstellen kann. Insbesondere geben die in den Arbeitsbeispielen unten stehend in Abschnitt 6 bis 12 aufgeführten Daten die Bindung des GRB2-Elements der GRB- Unterfamilie von Adaptorproteinen an das intrazelluläre PTK-Produkt des menschlichen BCR-ABL-Gens detailliert wieder.
Im folgenden Abschnitt werden einige der vielfältigen Verwendungsmöglichkeiten beschrieben, für die sich die Bindung zwischen solchen PTKs und Adaptorproteinen und/oder PTPs und Adaptorproteinen zur Behandlung zellproliferativer Störungen, bei denen derartige Komplexe beteiligt sind, einsetzen lässt. Die hierin beschrieben Einsatzmöglichkeiten konzentrieren sich, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, auf das Identifizieren von Wirkstoffen, die in der Lage sind, derartige Komplexe aufzubrechen (d. h. die Wechselwirkung zwischen der Komponente PTK bzw. PTP und den Adaptor-Elementen der Komplexe zu mindern oder zu inhibieren) und auf die Verwendung solcher Verbindungen für die Behandlung von zellproliferativen Störungen, an denen eine PTK oder eine PTP beteiligt ist, die in der Lage ist, mit einem Element der SH2- und/oder SH3-aufweisenden Familie von Adaptorproteinen Komplexe zu bilden. Der Begriff "Aufbrechen/Störung" bezieht sich hier nicht ausschließlich auf eine physische Abspaltung von Komponenten von Protein-Komplexen, sondern auch auf eine Störung der Aktivität der Komplexe, wobei es keine Rolle spielt, ob derartige Komplexe physisch weiter in der Lage sind, sich zu formen oder nicht. "Aktivität" in der hier verwendeten Bedeutung betrifft die Funktion des Protein-Komplexes innerhalb der Signalübermittlungskaskade der Zelle, in der ein derartiger Komplex gebildet wird, d. h. bezieht sich auf die Funktion des Komplexes bei der Durchführung oder Inhibierung der Übermittlung eines extrazellulären Signals in eine Zelle hinein. Zu den Beispielen solcher zellproliferativer Störungen gehören, allerdings ohne Beschränkung darauf, oncogene Störungen, wie beispielsweise chronische myelogene und akute lymphozytische Leukämien, sowie Psoriasis und Atherosklerose. Die Komplexe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls an Vorgängen in Zellen, wie z. B. Aktivierung, Differenzierung und Weiterleben, beteiligt sein.
Abhängig von dem jeweiligen PTK/Adaptor-Protein-Komplex oder PTP/Adaptor-Protein-Komplex, kann die Blockierung der Wechselwirkung zwischen Elementen von Komponenten solcher Komplexe voneinander abweichende modulatorische Auswirkungen auf das betreffenden Signalübermittlungsereignis haben, d. h. die Wirkung des Aufbrechens eines Komplexes kann in einer Aktivierung, Verringerung oder Blockierung des normalerweise in die Zelle übermittelten Signals bestehen. In gleicher Weise wird, abhängig von der betreffenden zellproliferativen Störung, entweder eine Aktivierung, eine Schwächung oder eine Blockierung des normalerweise in die Zelle übermittelten Signals für die Behandlung der Störung angestrebt sein. Beispielsweise besteht eine Wirkung der Komplexbildung der BCR-ABL-PTK mit dem GRB-2-Adaptor- Protein darin, dass die Aktivierung des Ras-Signalisierungsweges ausgelöst wird (siehe das untenstehend in Abschnitt 8 aufgeführte Arbeitsbeispiel). Daher würde das Aufbrechen eines solchen Adaptor-Protein-Komplexes zwischen BCR-ABL und PTK/GRB-2 die Übermittlung des anomalen Signals inhibieren und eine Aktivierung des Ras-Weges verhindern. Alternativ kann sich eine zellproliferative Störung, an der ein PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex beteiligt ist, beispielsweise entwickeln, da die Anwesenheit solcher Komplexe die fälschliche Inhibierung eines normalen Signalübermittlungsereignisses zur Folge hat. In einem derartigen Fall würde das Aufbrechen des Komplexes die Wiederherstellung des üblichen Signalübermittlungsereignisses ermöglichen. Ferner kann ein abweichender Komplex eine veränderte Lokalisierung von subzellulärem Adaptor-Protein zur Folge haben, was beispielsweise zu funktionsgestörten Zellereignissen wie z. B. der Reorganisation eines Zellgerüsts führen kann, wie es bei dem GRB-2-Element der GRB-Unterfamilie der Adaptorproteine möglich ist. Eine Inhibierung des PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes würde in diesem Falle eine Wiederherstellung oder Aufrechterhaltung einer normalen Zellarchitektur ermöglichen. Darüber hinaus können ein oder mehrerer Wirkstoffe, die ein Aufbrechen des PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes bewirken, zu denen, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, ein SOS-Protein gehören kann, die Blockierung der Wechselwirkungen zwischen anderen potentiellen Komponenten eines solchen Komplexes hervorrufen.
Wenn PTK/Adaptor- und PTP/Adaptor-Protein-Komplexe, bei denen die PTK- oder die PTP-Komponente des Komplexes ein transmembranes PTK- oder PTP-Molekül vom Rezeptor-Typ ist, in Betracht kommen, können die Rezeptoren oder deren Liganden direkt für die Modulation der Signalübermittlungsereignisse verwendet werden, die zur Entstehung von zellproliferativen Störungen führen können. Beispielsweise können im Falle von PTKs lösliche PTKs, Peptide, die extrazelluläre PTK-Domänen repräsentieren, oder Peptide, die jene Abschnitte von extrazellulären PTK-Domänen, von denen bekannt ist, dass sie Liganden binden, repräsentieren, mit Hilfe von im vorliegenden Gebiet bekannten Techniken verabreicht werden, mit der Wirkung, dass diese, wenn sie den betreffenden PTK-exprimierenden Zellen ausgesetzt sind, mit endogenen Transmembran-PTK Rezeptor-Molekülen um verfügbare Liganden konkurrieren könnten, und auf diese Weise eine Ligandenbindung an endogene PTKs reduzieren oder unterbinden könnten. Die Wirkung eines solchen Vorganges könnte, möglicherweise durch Blockieren der Autophosphorylation der PTK, was wiederum die Affinität des Adaptor-Proteins für das PTK-Molekül reduzieren könnte, eine Abschwächung oder Inhibierung der Wechselwirkung zwischen der PTK und dem Adaptor-Protein mit sich bringen. Im Fall von PTPs läge eine analoge Situation vor.
Zusätzlich können, wenn wiederum PTKs vom Rezeptor-Typ in Betracht kommen, mittels in der Fachwelt hinlänglich bekannter Verfahren extrazelluläre, an derartige PTKs bindende Moleküle verabreicht werden, die trotz der Bindung an die PTK das Molekül dennoch nicht aktivieren. Extrazelluläre Moleküle dieses Typs lassen sich für die betreffende PTK beispielsweise aus modifizierten Formen eines nativen Liganden in der Weise zusammensetzen, dass zwar noch Rezeptor-Bindung, jedoch keine Aktivierung der Kinase auftreten kann. Ein Molekül mit einem derartigen Aufbau könnte weitgehend ähnlich wirken, wie die Verabreichung von löslicher PTK, insofern, als beide Vorgehensweisen schließlich eine Reduktion oder Inhibierung der Bildung von PTK/Adaptor-Protein-Komplexen hervorrufen können. Im Falle der PTPs würde eine hierzu analoge Situation auftreten.
Darüber hinaus können Moleküle, die in der Lage sind, native Liganden der Rezeptor-PTKs der PTK/Adaptor-Komplexe oder der Rezeptor-PTPs der PTP/Adaptor-Komplexe der Erfindung zu binden, mittels fachlich hinlänglich bekannter Verfahren verabreicht werden. Moleküle aus dieser Klasse würden dann auf die Fähigkeit der Liganden, an den jeweiligen Rezeptor zu binden, inhibierend wirken, was schließlich zu einer Reduktion oder Inhibierung der Bildung von PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Protein-Komplexen führen würde.
Abhängig von den speziell behandelten Zuständen, können derartige Wirkstoffe systemisch oder lokal formuliert und verabreicht werden. Verfahren für die Formulierung und Verabreichung lassen sich "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA. entnehmen. Zu den geeigneten Verabreichungsformen zählen: orale, rektale, transmucosale oder intestinale Verabreichung; parenterale Verabreichung einschließlich intramuskulärer, subcutaner, intramedullärer Injektionen, sowie intrathekale, direkt intraventriculäre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraoculäre Injektionen, um nur einige aufzuführen. Für die Injektion können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Form von wässrigen Lösungen formuliert sein, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie z. B. Hanks's Lösung, Ringers Lösung, oder in einem physiologischen salzhaltigen Puffer. Im Falle einer transmucosalen Verabreichung werden Durchdringungssubstanzen in der Formulierung eingesetzt, die für die zu überwindende Barriere geeignet sind. Derartige Durchdringungssubstanzen sind in der Fachwelt allgemein bekannt.
Im Falle der Behandlung von zellproliferativen Störungen können intrazellulär wirkende Wirkstoffe verabreicht werden, um unmittelbar auf die Bildung der PTK/Adaptor- und/oder PTP/Adaptor-Komplexe der Erfindung Einfluss zu nehmen. Zu derartigen Wirkstoffen können, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, Peptide und/oder Phosphopeptide, die SH2- und oder SH3-Domänen, oder SH2- und/oder SH3-bindende Domänen enthalten, kleine organische Moleküle oder Extrakte natürlicher Produkte zählen, deren Wirkung darin bestehen würde, dass sie mit den Komponenten der Komplexe um die Bindung konkurrieren, und so die Bildung von Komplexen reduzieren oder inhibieren, was wiederum die Entstehung der interessierenden zellproliferativen Störung bremsen oder verhindern würde. SH2- und SH3-Peptid-Domänen sowie SH2-bindende und SH3-bindende Peptid-Domänen sind von der Art, wie vorstehend in Abschnitt 5.1. beschrieben. Derartige Wirkstoffe können den Komplex auch aufbrechen, indem sie anstelle von oder zusätzlich zu der Komplexbildung in die stromabwärts gerichtete Signalisierungsfähigkeit eingreifen.
Intrazellulär zu verabreichende Wirkstoffe können mittels in der Fachwelt hinlänglich bekannter Verfahren zugeführt werden. Beispielsweise können derartige Wirkstoffe in Liposome eingekapselt werden, um dann, wie vorstehend beschrieben, verabreicht zu werden. Liposome sind sphärische Lipid-Doppelschichten mit wässrigem Zwischenraum. Sämtliche Moleküle, die zum Zeitpunkt der Liposombildung in wässriger Lösung vorhanden sind, werden in den wässrigen Zwischenraum aufgenommen. Der Inhalt der Liposome wird sowohl gegen die externe Mikroumgebung geschützt als auch wirkungsvoll in das Zytoplasma der Zelle transportiert, da Liposome mit Zellmembranen fusionieren. Außerdem können kleine organische Moleküle aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften unmittelbar intrazellulär verabreicht werden.
Nucleotidsequenzen, die für die intrazellulär einzusetzenden Peptid-Wirkstoffe codieren, können in den interessierenden Zellen mit Hilfe von Verfahren, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, exprimiert werden. Beispielsweise können für Transport und Expression solcher Nucleotidsequenzen in die Ziel-Zellpopulation Expressionsvektoren verwendet werden, die von Viren, wie z. B. Retroviren, dem Kuhpockenvirus, dem Adeno-assoziierten Virus, Herpesviren, oder Rinderpapillomvirus, abgeleitet sind. Verfahren für den Aufbau solcher Vektoren sind hinlänglich bekannt. Es sei beispielsweise auf Verfahren verwiesen, wie sie in Maniatis et al., 1989, Molecular Klonierung Eine Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. beschrieben sind.
Alternativ können Antikörper, die in der Lage sind, in die PTK/Adaptor- und/oder PTP/Adaptor-Komplexbildung einzugreifen, für die Behandlung solcher zellproliferativen Störungen verabreicht werden, bei denen eine PTK bzw. PTP beteiligt ist, die fähig ist, einen Komplex mit einem Adaptor-Protein zu bilden. Beispielsweise können neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, in die Ligandenbindung an PTKs oder PTPs vom Rezeptor-Typ einzugreifen, mit Hilfe von Verfahren, wie den oben beschriebenen, verabreicht werden. Die Wirkung einer derartigen Darreichung würde derjenigen ähneln, die oben im Falle der Verabreichung von löslichen PTKs oder PTPs beschrieben ist. Darüber hinaus können auch neutralisierende Antikörper, die an intrazelluläre Epitope binden, verabreicht werden, um eine Blockierung der PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexbildung zu bewirken. Derartige Antikörper können beispielsweise mit Hilfe von Verfahren verabreicht werden, wie sie vorstehend für die Verabreichung von intrazellulär eingreifenden Wirkstoffen beschrieben sind. Alternativ können Nucleotidsequenzen, die für einzelsträngige Antikörper codieren, innerhalb der Population der Zielzelle beispielsweise mit Hilfe von Verfahren exprimiert werden, wie sie in Marasco et al. (Marasco et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893) beschrieben sind.
Die PTK/Adaptor-Komplexe und/oder PTP/Adaptor-Komplexe der Erfindung können verwendet werden, um nach zusätzlichen Molekülen zu screenen, die in der Lage sind, die Aktivität der Elemente, aus denen sich solche Komplexe zusammensetzen, zu blockieren, um auf diese Weise das Signalübermittlungsereignis, das solche Komplexe hervorrufen, modulieren zu können. Zu derartigen Verbindungen können, allerdings ohne Beschränkung darauf, aus Aminosäuren der D- und/oder L-Konfiguration hergestellte Peptide (beispielsweise in Form von Random-Peptid-Bibliotheken; siehe Lam et al., 1991, Nature 354: 82-84), Phosphopeptide (beispielsweise in Form von Random- oder teilweise degenerierten, ausgerichteten Phosphopeptid-Bibliotheken, siehe Songyang et al., 1993, Cell 767-778), Antikörper und kleine organische Moleküle gehören.
Beispielsweise können Verbindungen, die an individuelle Komponenten oder funktionale Abschnitte der individuellen Komponenten des PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes binden (und möglicherweise zusätzlich in der Lage sind, Komplexbildung zu stören) identifiziert werden. Ein funktionaler Abschnitt einer individuellen Komponente der Komplexe kann hier als ein Peptidabschnitt einer individuellen Komponente eines Komplexes definiert werden, der noch in der Lage ist, mit einem weiteren Element des Komplexes einen stabilen Komplex zu bilden. Beispielsweise ein Peptid- Abschnitt der SH2-bindenden Domäne einer PTK, die noch in der Lage ist, eine SH2-Domäne eines Adaptor-Proteins stabil zu binden, und so noch fähig ist, einen Komplex mit jenem Adaptor-Protein zu bilden. Ferner kann im Falle der katalytischen Domänen der individuellen PTK- oder PTP-Komponenten der Erfindung mit einem funktionalen Abschnitt einer katalytische Domäne ein Peptid bezeichnet sein, das noch in der Lage ist, ein Substratmolekül stabil zu binden.
Zu einem Verfahren, das sich dieses Ansatzes bedient, der in der Isolierung von solchen Molekülen liegen kann, die Komponenten von PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexen binden, würde die Anlagerung des Moleküls einer Komponente oder eines funktionalen Abschnitts davon an eine feste Matrix, wie z. B. Agarose oder Kunstoffperlen, Mikrotitrationstüpfel, Petrischalen oder Membranen aus beispielsweise Nylon oder Nitrocellulose, und die anschließende Inkubation des angehängten Moleküls der Komponente in Anwesenheit einer oder mehrerer potentieller Komponenten-bindender Verbindungen gehören. Nach der Inkubation werden ungebundene Verbindungen weggespült, an Komponenten gebundene Verbindungen werden aufgefangen. Mittels dieser Prozedur ist es möglich, eine große Anzahl von Molekülarten gleichzeitig nach ihrer Aktivität für die Bindung an PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex-Komponenten zu screenen.
Zu den PTK/Adaptor-Komplex-Komponenten, die sich in dem obigen Screening-Verfahren verwenden lassen, können, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, PTK-Moleküle oder funktionale Abschnitte davon, wie z. B. PTK-katalytische Domänen, Phosphorylierungsdomänen, SH2-Domänen, SH3- Domänen, SH2-bindende Domänen oder SH3-bindende Domänen, und Adaptorproteine oder funktionale Abschnitte davon, wie z. B. SH2-Domänen und SH3-Domänen, gehören. Die verwendeten Peptide können phosphoryliert sein, d. h. beispielsweise wenigstens einen phosphorylierten Aminosäurerest - vorzugsweise einen phosphorylierten Tyr-Aminosäurebaustein - enthalten oder unphosphoryliert sein. Eine Phosphorylierungsdomäne kann eine Peptidregion bezeichnen, die spezifisch an bestimmten Aminosäureresten phosphoryliert ist. Ein funktionaler Abschnitt einer solchen Phosphorylierungsdomäne kann ein Peptid bezeichnen, das sich mittels einer spezifischen PTK spezifisch an bestimmten Aminosäuren phosphorylieren lässt. Ein funktionaler Abschnitt einer SH2-Domäne kann ein Peptid bezeichnen, das wenigstens einen Abschnitt einer SH2-Domäne enthält, die in der Lage ist, eine SH2- bindende Domäne spezifisch zu binden. In gleicher Weise kann ein funktionaler Abschnitt einer SH3-Domäne als ein Peptid definiert werden, das wenigstens einen Abschnitt einer SH3-Domäne enthält, die in der Lage ist, eine SH3- bindende Domäne spezifisch zu binden. Ein funktionaler Abschnitt einer SH2-bindenden Domäne lässt sich als ein Peptid definieren, das in der Lage ist, eine SH2-Domäne zu binden, und kann eine ungefähre Länge von wenigstens 4 Aminosäureresten aufweisen. Ein funktionaler Abschnitt einer SH3-bindenden Domäne lässt sich als ein Peptid definieren, das in der Lage ist, eine SH3-Domäne zu binden, und kann eine ungefähre Länge von wenigstens 4 Aminosäuren aufweisen, wobei eine Länge von ca. 10 Aminosäureresten bevorzugt ist.
Zu den Komponenten eines PTP/Adaptor-Komplexes, die sich in obigem Screening-Verfahren verwenden lassen, können, allerdings ohne Beschränkung darauf, PTP-Moleküle oder funktionale Abschnitte davon, wie z. B. PTP-katalytische Domänen, Phosphorylierungsdomänen, SH2-Domänen, SH3-Domänen, SH2-bindende Domänen oder SH3-bindende Domänen, und Adaptorproteine oder funktionale Abschnitte davon, wie z. B. SH2-Domänen und SH3-Domänen, gehören. Die verwendeten Peptide können phosphoryliert sein, d. h. beispielsweise wenigstens einen phosphorylierten Aminosäurerest, vorzugsweise einen phosphorylierten Tyr-Aminosäurerest, enthalten oder können unphosphoryliert sein. Eine Phosphorylierungsdomäne kann eine Peptidregion bezeichnen, die spezifisch an bestimmten Aminosäureresten phosphoryliert ist. Ein funktionaler Abschnitt einer solchen Phosphorylierungsdomäne kann ein Peptid bezeichnen, das sich mittels einer spezifischen PTK spezifisch an bestimmten Aminosäuren phosphorylieren lässt. Funktionale Abschnitte von SH2, SH3, SH2-bindenden und SH3-bindenden Domänen können, wie vorstehend beschrieben, gestaltet sein.
Moleküle, die eine Bindungsaktivität zeigen, können ferner auf die Fähigkeit hin gescreent werden, PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe aufzubrechen. Alternativ können Moleküle unmittelbar auf die Fähigkeit, PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexe aufzubrechen, gescreent werden. Beispielsweise kann in vitro-Komplexbildung getestet werden, indem erstens die eine Komponente des interessierenden Komplexes oder ein funktionaler Abschnitt dieser Komponente auf einem festen Träger immobilisiert wird. Zweitens kann die immobilisierte Komplex-Komponente einer Verbindung, wie z. B. einer, die als eine der obenstehenden identifiziert wurde, und der zweiten Komponente des interessierenden Komplexes oder einem funktionalen Abschnitt dieser Komponente ausgesetzt werden. Drittens kann ermittelt werden, ob die zweiten Komponente noch in der Lage ist, in Anwesenheit der Verbindung mit der immobilisierten Komponente einen Komplex zu bilden oder nicht.
Darüber hinaus kann in vivo-Komplexbildung durch Anwendung von auf dem Fachgebiet hinlänglich bekannter Co- Immunopräzipitationsverfahren getestet werden. Kurz gesagt, eine Zell-Linie, die in der Lage ist, einen interessierenden PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex zu bilden, kann einer Verbindung, wie z. B. einer, die als eine der obenstehenden identifiziert wurde, exponiert werden, und es kann ein Zell-Lysat aus dieser exponierten Zell-Linie präpariert werden. Ein gegen eine der Komponenten des interessierenden Komplexes gezüchteter Antikörper kann dem Zell- Lysat hinzugefügt und Standardverfahren der Immunopräzipitation unterzogen werden. In Fällen, in denen es noch zu Komplexbildung kommt, wird die Immunopräzipitation den Komplex ausfällen, wohingegen für dem Fall, dass der Komplex aufgebrochen wurde, lediglich die Komplex-Komponente, gegen die der Antikörper gezüchtet wurde, ausgefällt wird.
Die Wirkung eines Wirkstoffes auf die Transformationsfähigkeit des interessierenden PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplexes kann unmittelbar getestet werden. Zu derartigen Wirkstoffen können, jedoch nicht notwendig, jene Wirkstoffe gehören, die mittels des obigen Screening-Verfahrens identifiziert wurden. Beispielsweise ist es möglich, einen oder mehrere Wirkstoffe einer Zelle zu verabreichen, beispielsweise einem Fibroblasten oder einer haematopoietischen Zelle, die in der Lage ist, einen PTK/Adaptor-Komplex zu bilden, der bei Abwesenheit jeglichen inhibitorischen Wirkstoffs die Transformation der Zelle hervorrufen würde (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792; McLaughlin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6558-6562). Der Zustand der Transformation der Zelle lässt sich dann in vitro messen, beispielsweise durch eine Untersuchung ihrer Fähigkeit, Kolonien auf weichem Agar zu bilden, (Lugo et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1263-1270; Gishizky et al., 1992, Science 256: 836-839). Alternativ kann der Transformationsstatus einer Zelle in vivo untersucht werden, indem ihre Tendenz ermittelt wird, in immungeschwächten Nacktmäusen mit schwerer kombinierter Immunschwäche (SCID) Tumoren zu bilden (Sawyers et al., 1992, Blood 79: 2089-2098). Weiter ist es möglich, im Fall von BCR-ABL-Tiermodellen von ALL und/oder CML, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, einen oder mehrere Wirkstoffe zu verabreichen (Gishizky et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3755-3759) und/oder die Progression dieser oncogenen Störung umzukehren.
Wirkstoffe, die in der Lage sind PTK/Adaptor- und/oder PTP/Adaptor-Komplexbildung zu blockieren und zellproliferative Störungen zu reduzieren oder zu verhindern, die auf die Bildung solcher Komplexe zurückzuführen sind, lassen sich bei der Behandlung von Patienten einsetzen, bei denen derartige Störungen auffällig sind oder die für diese disponiert sind. Eine ausreichende Konzentration eines oder mehrerer Wirkstoffe, wie sie z. B. oben beschrieben sind, kann einem Patienten verabreicht werden, um die Zellproliferationsfähigkeit von Zellen, die bei Abwesenheit solcher Wirkstoffe PTK/Adaptor- und/oder PTP/Adaptor-Protein-Komplexe aufweisen würden, zu schwächen oder zu eliminieren.
Alternativ kann im Fall von proliferativen Störungen von haematopoietischen Zellen, wie z. B. Leukämien, anstelle einer direkten Verabreichung an den Patienten, eine Verwendung des Wirkstoffes oder der Wirkstoffe in Verbindung mit Transplantationsverfahren von autologem Knochenmark und Chemoradiotherapieverfahren, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, angezeigt sein. Kurz gesagt, es wird dem Patienten ein Aliquot von Knochenmarkszellen, im Allgemeinen des Beckens, entnommen. Die Zellen werden dann in Anwesenheit einer Konzentration eines oder mehrerer Wirkstoffe in Kulturen gezüchtet, die in der Lage sind, PTK/Adaptor- oder PTP/Adaptor-Komplex effizient aufzubrechen. Durch eine Blockade des Signalübermittlungsweges jener Knochenmarkszellen, die in der Lage sind derartige Komplexe zu bilden, wird auf die Anwesenheit klonaler Abkömmlinge dieser Zellen hin selektiert, wodurch eine effektive Reinigung der Kulturen von jenen Zellen bewirkt wird, die für die behandelte haematopoietische zellproliferative Störung verantwortlich sind. Während die Knochenmarkszellen in Kulturen gezüchtet und von Zellen mit hoher oncogener Kapazität befreit werden, erfährt der Patient eine für die entsprechende Erkrankung geeignete Chemoradiotherapiebehandlung, wobei Verfahren und Dosierungen eingesetzt werden, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Mit Abschluss einer solchen chemoradiotherapeutischen Behandlung erhält der Patient eine autologe Infusion der gezüchteten, von oncogenen Zellen befreiten Knochenmarkszellen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein PTK/Adaptor-Komplex aufgebrochen oder dessen Bildung verhindert, wobei es sich um einen Komplex handelt, bei dem die PTK-Komponente ein intrazelluläres PTK-Produkt des menschlichen BCR-ABL-Gens ist, und die Adaptor-Protein- Komponente ein GRB-2-Element der GRB-Unterfamilie der Adaptorproteine ist. Ferner gehören, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, zu den zellproliferativen Störungen, die durch Verabreichung solcher Wirkstoffe therapiert werden, in diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel chronische myelogene Leukämie und akute lymphozytische Leukämie.

5.7 IDENTIFIZIERUNG VON VERBINDUNGEN, DIE IN DER LAGE SIND, WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN BINDUNGSPARTNERN ZU BLOCKIEREN

Es können beliebige aus einer Reihe von Versuchsanordnungen verwendet werden, um Verbindungen auf ihre Fähigkeit zu testen, in die Wechselwirkung zwischen dem aktivierten Tyrosin-Kinase-Molekül und einem Adaptor-Protein-Molekül einzugreifen (d. h. deren Wechselwirkung zu stören oder zu inhibieren), die hier als "Bindungspartner" bezeichnet werden. Es versteht sich, dass zusätzlich zu aktivierten Tyrosin-Kinase-Molekülen auch sonstige Moleküle, die an einen Komplex mit Adaptorproteinen binden und diesen bilden, in diese Definition von Bindungspartnern einzubeziehen sind. Zu den zusätzlichen Bindungspartnern kann daher beispielsweise SHC oder ein SH2-Domänen aufweisendes Protein zählen, von dem nachgewiesen ist, dass es an das GRB-2- Adaptor-Protein bindet (Tauchi, T. et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 167-175; Rozakis-Adcock, M. et al., 1992, Nature 360: 689-692; Pelicci, G. et al., 1992, Cell 70: 93-104). Jedoch sind rasch durchzuführende Tests mit hohem Durchsatz für das Screenen großer Zahlen von Verbindungen, einschließlich (natürlicher oder synthetischer) Liganden, Peptide oder kleine organische Moleküle bevorzugt, jedoch ohne auf diese beschränkt zu sein. Verbindungen, die auf diese Weise als solche identifiziert werden, die in die Wechselwirkung zwischen Bindungspartnern eingreifen, können einer weiteren Überprüfung auf inhibitorische Aktivität zugeführt werden, wie hierin beschrieben.
Das grundlegende Prinzip der Versuchsanordnungen, die verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die in die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern eingreifen, umfasst die Zubereitung einer Reaktionsmischung, in der die Bindungspartner unter Bedingungen und über eine ausreichend große Zeitspanne hin enthalten sind, um es den beiden Proteinen zu ermöglichen, zu interagieren und aneinander zu binden, um auf diese Weise einen Komplex zu bilden. Um eine Verbindung auf ihre inhibitorische Aktivität zu testen, wird die Reaktion jeweils in Anwesenheit und Abwesenheit der Prüfverbindung ausgeführt, d. h. die Prüfverbindung kann von Anfang an in die Reaktionsmischung einbezogen sein, oder zu einem Zeitpunkt nach der Zugabe der Bindungspartner hinzugefügt werden; Kontrollproben werden ohne die Prüfverbindung oder mit einem Plazebo inkubiert. Anschließend wird die Bildung von Komplexen zwischen den Bindungspartnerproteinen erfasst. Wenn in der Kontrollreaktion ein Komplex gebildet wurde, hingegen nicht in der Reaktionsmischung, die die Prüfverbindung enthält, oder im Vergleich zur Kontrollreaktion in der Reaktionsmischung ein Sinken des Levels der Komplexbildung festgestellt wird, ist eine Störung der Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern durch die Verbindung indiziert. Die Komponenten sowie verschiedene Formate der Tests, die verwendet werden können, sind nachstehend beschrieben.
Die in dem Test als Komponenten verwendeten Bindungspartner können aus natürlichen Quellen abgeleitet werden, beispielsweise mittels in der Fachwelt hinlänglich bekannter Proteinabscheidungsverfahren von Zellen gereinigt werden; durch dem Fachmann bekannte Verfahren auf der Basis von rekombinanter DNA erzeugt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); und/oder mittels bekannter Verfahren teilweise oder vollständig chemisch synthetisiert werden; beispielsweise können Peptide durch Festphasenverfahren synthetisiert, von dem Harz abgespalten und mittels präparativer Hochdruckflüssigchromatographie gereinigt werden (siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., Seite 50- 60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann mittels Aminosäureanalyse oder Sequenzierung bestätigt werden; beispielsweise mit Hilfe des Degradationsverfahrens von Edman (siehe z. B. Creighton, 1983, supra).
Peptidfragmente können so erzeugt werden, dass sie den Bindungsdomänen der jeweiligen Proteine entsprechen. Beispielsweise können zu derartigen Fragmenten, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, SH2-Domänen, SH3-Domänen, SH2-Domänen-bindende und/oder SH3-Domänen-bindende Peptidfragmente gehören. Eine Reihe von in der Fachwelt routinemäßig angewandter Verfahren kann eingesetzt werden, um die Bindungsstelle der Proteine zu identifizieren und zu isolieren. Zu diesen Verfahren zählen, allerdings ohne darauf beschränkt zu sein, Mutagenese bei einem der Gene, die für das Protein codieren und Screenen nach Disruption der Bindung in einem Co-Immunopräzipitationstest. Eine Sequenzanalyse der Gene, die für die jeweiligen Proteine codieren, deckt dann die Mutationen auf, die der Region des Proteins entsprechen, das an der interaktiven Bindung beteiligt ist.
Alternativ kann ein Protein auf einer festen Oberfläche verankert und diesem ermöglicht werden, mit dessen markierten Bindungspartner, der mit einem proteolytischen Enzym, beispielsweise Trypsin, behandelt wurde, zu interagieren und an diesen zu binden. Nach dem Spülen kann ein kurzes markiertes Peptid, das die Bindungsdomäne enthält, an dem festen Material fixiert zurückbleiben und durch Aminosäuresequenzierung isoliert und identifiziert werden. Ebenso können nach Gewinnung des für das Protein verantwortlichen Gens kurze Gensegmente so angefertigt werden, dass sie Peptidfragmente des Proteins exprimieren, die anschließend auf Bindungsaktivität getestet und gereinigt oder synthetisiert werden können.
Unabhängig davon, ob die Aminosäuresequenz der Bindungspartner, die sich in den erfindungsgemäßen Tests verwenden lässt, durch molekulare Klonierungsverfahren oder durch chemische Synthetisierungsverfahren erzeugt wurde, braucht diese nicht identisch mit der aufgeschienenen Sequenz der Gene zu sein, für die sie codieren. Die Bindungspartner können abgeänderte Sequenzen aufweisen, bei denen nach Deletion, Addition oder Substitution von Aminosäureresten das sich ergebende Produkt funktional äquivalent ist.
Beispielsweise können Reste innerhalb der Sequenz durch funktional äquivalente Aminosäurereste mit dem Resultat einer Sequenzabänderung substituiert werden. Derartige Substitute können unter sonstigen Mitgliedern der Gruppe, aus der die Aminosäure stammt, ausgewählt werden; beispielsweise gehören zu den nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leuzin, Isoleuzin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; zu den polar neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren zählen Arginin, Lysin, und Histidin; zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Asparagin- und Glutaminsäure.
Einer der in dem Testsystem verwendeten Bindungspartner sollte entweder direkt oder indirekt markiert sein, um die Erfassung eines zwischen den Bindungspartnern gebildeten Komplexes zu erleichtern. Jedes der vielfältigen geeigneten Markierungsverfahren kann eingesetzt werden, darunter, allerdings ohne Beschränkung darauf, der Einsatz von Radioisotopen, wie beispielsweise ¹²&sup5;I; Enzymmarkierungsverfahren, bei denen nach Exposition in einem Substrat ein nachweisbares colorimetrisches Signal oder Licht generiert wird; oder fluoreszierende Label.
Im Falle des technologischen Einsatzes von rekombinanter DNA für die Herstellung der Bindungspartner des Tests kann es vorteilhaft sein, Fusionsproteine anzufertigen, die die Markierung, Immobilisierung und/oder Erfassung erleichtern können. Beispielsweise kann die codierende Sequenz eines Tyrosin-Kinase- oder Adaptor-Proteins mit derjenigen eines heterologen Proteins, das Enzymaktivität aufweist oder als Enzymsubstrat dient, fusioniert werden, um die Markierung und Detektion zu erleichtern. Die Fusionskonstrukte sollten so aufgebaut sein, dass die heterologe Komponente des Fusionsprodukts sich nicht störend auf die Bindung der Bindungspartner auswirkt.
Eine indirekte Markierung bedient sich der Verwendung eines dritten Proteins, das spezifisch an einen der beiden Bindungspartner bindet, beispielsweise eines markierten Antikörpers. Zu derartigen Antikörpern zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelsträngige, Fab-Fragmente oder durch eine Fab-Expressionsbibliothek erzeugte Fragmente.
Der Test kann in einer heterogenen oder homogenen Form ausgeführt werden. Bei heterogenen Tests wird einer der Bindungspartner an einer festen Phase verankert, und die Komplexe werden erfasst, die nach Abschluss der Reaktion an der festen Phase verankert sind. Bei homogenen Tests wird die gesamte Reaktion in der flüssigen Phase durchgeführt. In beiden Versuchsansätzen kann die Reihenfolge der Zugabe von Reaktionspartnern variiert werden, um verschiedene Informationen über die zu testenden Verbindungen zu erhalten. Beispielsweise können Prüfverbindungen identifiziert werden, die in die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern beispielsweise konkurrierend eingreifen, indem die Reaktion in Anwesenheit der Prüfsubstanz ausgeführt wird; d. h. indem die Prüfsubstanz der Reaktionsmischung vor dem Hinzufügen der Bindungspartner oder gleichzeitig mit diesen zugegeben wird. Andererseits können Prüfverbindungen getestet werden, die vorgeformte Komplexe aufbrechen, beispielsweise Verbindungen, die mit ihren höheren Bindungskonstanten einen der Bindungspartner aus den Komplex herausdrängen, indem die Prüfverbindung der Reaktionsmischung nach der Komplexbildung hinzugefügt wird.
Bei einer heterogenen Testanordnung wird der eine Bindungspartner auf einer festen Oberfläche verankert, und sein nicht verankerter Bindungspartner entweder direkt oder indirekt markiert. In der Praxis werden hierzu zweckmäßigerweise Mikrotiterplatten verwendet. Die verankerten Spezies können durch nicht-kovalente oder kovalente Anlagerungen immobilisiert werden. Nicht-kovalente Anlagerung lässt sich problemlos erreichen, indem die feste Oberfläche mit einer Lösung des Proteins beschichtet und anschließend getrocknet wird. Alternativ kann ein immobilisierter Antikörper verwendet werden, der für das Protein spezifisch ist, um das Protein auf der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können im Voraus präpariert und gelagert werden.
Zur Durchführung des Tests wird der Bindungspartner der immobilisierten Spezies gemeinsam mit oder ohne die Prüfverbindung auf die beschichtete Fläche aufgetragen. Nach Ablauf der Reaktion werden nicht in Verbindung gegangene Komponenten entfernt (z. B. durch Spülen), wobei eventuell gebildete Komplexe auf der festen Oberfläche immobilisiert zurückbleiben. Die Erfassung der auf der festen Oberfläche verankerten Komplexe lässt sich auf verschiedenen Wegen erreichen. Wenn der Bindungspartner vormarkiert war, zeigt die Detektion von immobilisierten Labeln auf der Oberfläche an, dass Komplexe gebildet wurden. Falls der Bindungspartner nicht vormarkiert ist, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe zu ermitteln; beispielsweise mittels eines markierten Antikörpers, der spezifisch für den Bindungspartner ist (der Antikörper wiederum kann mit einem markierten anti-Ig-Antikörper direkt markiert oder indirekt markiert seinj. Abhängig von der Reihenfolge des Hinzufügens von Reaktionskomponenten können Prüfverbindungen, die Komplexbildung inhibieren oder solche, die vorgeformte Komplexe aufbrechen, erfasst werden.
Alternativ ist es möglich, die Reaktion in einer flüssigen Phase in Anwesenheit oder Abwesenheit der Prüfverbindung auszuführen, die Reaktionsprodukte von nicht in Verbindung gegangenen Komponenten zu trennen, und die Komplexe zu erfassen; beispielsweise mittels eines immobilisierten Antikörpers, der für den einen Bindungspartner spezifisch ist, um eventuell in der Lösung gebildete Komplexe zu verankern, sowie eines markierten Antikörpers, der für den anderen Bindungspartner spezifisch ist, um verankerte Komplexe zu erfassen. Wiederum können, abhängig von der Reihenfolge des Hinzufügens von Reaktionspartnern in die flüssige Phase, Prüfverbindungen identifiziert werden, die Komplexe inhibieren oder zuvor gebildete Komplexe aufbrechen.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel der Erfindung kann ein homogener Test verwendet werden. In diesem Ansatz wird ein als Vorprodukt gebildeter Komplex der Bindungspartner präpariert, bei dem einer der Bindungspartner markiert ist, jedoch das durch die Markierung erzeugte Signal wegen der Komplexbildung gequericht ist (siehe beispielsweise US Patent 4 109 496 von Rubenstein, das diesen Ansatz für Immuntests verwendet). Die Zugabe einer Prüfsubstanz, die mit einem der Bindungspartner konkurriert und diesen aus dem als Vorprodukt gebildeten Komplex verdrängt, führt zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals. Auf diese Weise lassen sich Prüfsubstanzen, die die Wechselwirkung zwischen Virusprotein und Wirtszellenprotein stören, identifizieren.

6. BEISPIEL: BCR-ABL ASSOZIIERT MIT GRB-2 SOWOHL IN VITRO ALS AUCH IN VIVO

In dem in diesem Abschnitt aufgeführten Arbeitsbeispiel wird nachgewiesen, dass das GRB-2-Element der GRB- Unterfamilie der Adaptorproteine an intrazelluläre PTK von BCR-ABL sowohl in vitro als auch in vivo bindet.

6.1. MATERIAL UND VERFAHREN

6.1.1 ZELLEN UND VIREN

Insektenzellen von Spodoptera frugiperda (Sf9) wurden in vollständigen Nährmedien von Grace vermehrt (G. E. Smith, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165). Die Ph¹-positiven Leukämie-Zell-Linien K562 und NMG-01 wurden aus Patienten mit chronischer myelogener Leukämie abgeleitet und exprimieren BCR-ABL P210. Die PH¹-positive Zell-Linie ALL-1 wurde aus einem Patienten mit akuter lymphozytischer Leukämie abgeleitet und exprimiert BCR-ABL P185. Die PH¹-positiven Zell-Linien wurden in einem RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum gezüchtet. COS-Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze und Rat1-Fibroblasten wurden in DMEM-Medium mit 5% fötalem Kälberserum gezüchtet.
Rekombinante Baculoviren wurden für die Expression von cBCR, cABL und BCR-ABL durch Co-Transfektion der entsprechenden cDNAs präpariert, die wie beschrieben in Anwesenheit von Wild-Typ-Baculovirus-DNA in den Baculovirus-Vektor pAcCI2 kloniert waren (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931).
Helfer-freie retrovirale Mischungen wurden durch vorübergehende Hyperexpression in COS-Zellen, gemäß bereits beschriebener Verfahren, präpariert (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792). Die retroviralen Mischungen wurden hinsichtlich deren Fähigkeit mittels immunohistochemischer Verfahren charakterisiert, Wild-Typ- und mutierte Formen des BCR-ABL-Genprodukts zu Rat1-Fibroblasten zu transferieren (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792). Endogene Anteile von c-Abl-Protein der Ratte wurden in diesen Anfärbeverfahren nicht nachgewiesen. Das Maß des Gentransfers wurde weitergehend durch Messung der Level von BCR-ABL-Proteinexpression bewertet (Western- Blot). Es wurden lediglich retrovirale Mischungen, die vergleichbare Level von Gentransfer zeigten, in diesen Studien verwendet. Die Titer bewegten sich im Bereich von 105 infektiösen Partikel pro ml, wie anhand der Häufigkeit von G418-resistenten Rat1-Kolonien nach Exposition in Grenzlösungen der viralen Mischungen ermittelt wurde.

6.1.2. ANTIKÖRPER

Polyklonale Antikörper von Kaninchen, die gegen den Amino-Terminus von cBCR gerichtet sind, sowie Amino- und Carboxyterminalsequenzen von cABL sind bislang beschrieben (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Konopka et al., 1984, Cell 37: 1035-1042). Eine monoklonaler anti-ABL-(21- 63)-Antikörper der Maus wurde für das Immunoblotting eingesetzt (Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen die C-terminale SH3-Domäne von GRB-2-(Ab50) und gegen ein synthetisches Peptid, das von der N-terminalen SH3-Domäne von GRB-2 (Ab86) abgeleitet wurde, wurden für die Immunpräzipitation beziehungsweise das Immunoblotting verwendet (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442).

6.1.3. PLASMID-KONSTRUKTIONEN

Die menschliche GRB-2-CDNA mit 650-Basenpaaren (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442 Matuoka et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9015-9019) wurde aus einer cDNA-Bibliothek menschlicher Plazenta mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als (5')-SH3-SH2- und (3')- SH3-Fragmente kloniert. Eine nur einmal vorkommende KpnI- Stelle bei Codon 154 von GRB-2 wurde verwendet, um GRB-2- cDNA mit vollständiger Länge zu erzeugen. Die gesamte codierende Sequenz von GRB-2 und die (3')-SH3-Domäne von GRB- 2 wurden in die Bam-HI-Stelle des pGEX-2T-Vektors im Frame subkloniert (Pharmacia). Die isolierten (5')-SH3- und SH2- Domänen von GRB-2 wurden, wie beschrieben, präpariert (Skolnik et al., 1993, EMBO J. 12: 1929-1936).
Die Herstellung von cDNAs für BCR-ABL vom Wild-Typ P185 (McLaughlin et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1866- 1874) und P185 (Δ176-426) (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792) und die Klonierung der entsprechenden cDNAs in pSRα-(Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931) und pSRα-MSVtKneo- (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792) Vektoren wurde, wie bisher beschrieben, vorgenommen. Die P185-BCR-ABL-(Y177F)- Mutante wurde durch auf Oligonucleotidregion gerichtete Mutagenese mittels des in vitro Muta-Gene-Phagemid- Mutagenese-Systems (Bio Rad) geschaffen. Die Matrix wurde erzeugt, indem ein 1,6 Kb langes EcoRI-SacI-Fragment des cBCR aus dem pGEM4/cBCR in die EcoRI- und SacI-Stellen des Vektors pBlueScript-SK+ (Stratagen) subkloniert, und die einsträngige DNA durch Co-Infizierung der Blue-Bakterien XL-1 mit dem Helfer-Phagen R408 (Stratagen) geborgen wurde. Das mutagene Oligonukleotid 5'-AAG-CCC-TTC-TTC-GTT-AAC-GTC- GAG-3' wurde verwendet, um ein Phenylalanin-Codon anstelle von Tyrosin zu schaffen, indem das A-Nukleotid 530 gegen ein T getauscht wurde. Zusätzlich wurde ein stiller Basenaustausch bei Nukleotid 534 herbeigeführt, um eine nur einmal vorkommende HpaI-Stelle zu schaffen. Die mutagenisierten Plasmide wurden hinsichtlich des Vorkommens der nur einmal vorkommende Hpal-Stelle selektiert. Die Mutationen wurden durch Dideoxy-Ketten-Terminations-Sequenzanalyse nach beiden Richtungen hin verifiziert. Die mutierte BCR- Sequenz wurde in die Wild-Typ-P185-BCR-ABL-cDNA eingeschleust. P185-BCR-ABL (Y177F) wurde in die Säuger-Expressionsvektoren pSRα und pSRα-MSVtKneo, und den AcC12-Vektor für Baculovirusexpression subkloniert. Die Klonierung der cDNA für Wild-Typ-cABL in den pSRα-Vektor ist bereits beschrieben (Pendergast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). BCR-("872-1271) wurde ebenfalls in pSRα, wie beschrieben, kloniert (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171).

6.1.4. EXPRESSION UND REINIGUNG DES GST-FUSIONSPROTEINS

GST-Fusionsproteine wurden mittels Glutathion- Sepharose-4B-Kügelchen (Pharmacia), wie bisher beschrieben, exprimiert und gereinigt (Pendergast et al., 1991, Cell 56: 161-171). Die Fusionsproteine wurden auf dem Harz zurückgelassen und bei 4ºC gelagert.

6.1.5. METABOLISCHE MARKIERUNG UND IMMUNOPREZIPITATION

Die Sf9-Zellen wurden mit den angegebenen rekombinanten Baculoviren infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellen mit 0,1 mCi/ml [³&sup5;S]-Methionin (ICN) in Methionin-freien Medium für 4 bis 6 Stunden bei 27ºC inkubiert. Die markierten Zellen wurden entweder mit KLB (10mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, 150mM NaCl, 1% Triton X-100) oder mit PCLB (50 mM HEPES, pH-Wert 7,0, 150 mm NaCl, 1mM MgCl&sub2;, 1% Triton X-100, 10% Glyzerin)lysiert, das mit 5mM EDTA, 1mM PMSF, 50 ug/ml Leupeptin, 25 ug/ml Aprotinin, 25mM NaF, 1mM Na&sub3;VO&sub4; und 0,1mM Na&sub2;MoO&sub4; ergänzt war. Die Lysate wurden durch einstündiges Zentrifugieren mit 100.000 g geklärt. Die Lysate wurden mit den angezeigten Antikörpern direkt oder nach einer 3-fachen Dilution mit Inkubationspuffer (20mM HEPES, pH-Wert 7,0, 150mM NaCl, 0,1% Triton X- 100, 10% Glyzerin, 0,5mM Na&sub3;VO&sub4;, 0,1mM Na&sub2;MoO&sub4;, 25mM NaF, 1mM PMSF, 25 ug/ml Leupeptin), wie angezeigt, inkubiert. Die Immunkomplexe wurden durch Inkubation mit Protein-A- Sepharose-Kügelchen (Pharmacia) 120 Minuten lang bei 4ºC aufgefangen. Die Kügelchen wurden gründlich mit Inkubationspuffer gespült, um ungebundene Stoffe zu entfernen. Die gebundenen Proteine wurden mittels Elektrophorese mit SDS-Polyakrylamid-Gel analysiert und durch Fluorographie sichtbar gemacht. Im Falle der Verwendung unmarkierter Lysate fand der Nachweis der Proteine durch Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern statt.

6.1.6. BINDUNGSTESTS

Die Proteinlysate wurden 3-fach mit Inkubationspuffer Verdünnt und mit GST- oder GST-Fusionsproteinen inkubiert, die an Glutathion-Sepharose-Kügelchen angehängt waren. Nach 90 Minuten Inkubation bei 4ºC wurden die Kügelchen mit Inkubationspuffer oder mit RIPA-Puffer (20 mN Tris-HCl, pH- Wert 7,4, 137mM NaCl, 10% Glyzerin, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% Deoxycholat und 2 mN EDTA), wie angegeben, gründlich gespült. Gebundene Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamid analysiert und anschließend mittels Fluorographie auf radiomarkierte Proteine untersucht.

6.1.7. IMMUNOBLOTTING, IN VITRO AUTOPHOSPHORYLATIONS- UND DEPHOSPHORYLATIONSREAKTIONEN

Die Verfahren für Immunoblotting und in vitro Markierung mit [γ³²P]ATP wurden, im Wesentlichen wie bisher beschrieben, durchgeführt (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). Die Dephosphorylation mit Kartoffel- Säure-Phosphatase wurde durchgeführt, wie beschrieben (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931).

6.2. ERGEBNISSE

6.2.1. BCR-ABL ASSOZIIERT IN VIVO MIT GRB-2

Um festzustellen, ob die BCR-ABL-Tyrosin-Kinase einen physischen Komplex mit dem GRB-2-Adaptor-Protein in intakten Zellen bildet, wurde überprüft, ob die beiden Proteine co-immunopräzipitieren. Die Zell-Lysate wurden aus den Ph¹- positiven Leukämie-Zell-Linien K562, MEG-01, und ALL-1-Ph¹- haematopoietischen Zellen und Rat-1 Fibroblastzellen präpariert, und wurden einer Immunopräzipitation mit anti-ABL- pEx4, anti-GRB-2 oder Kontrollantikörpern unterzogen. Nach gründlichem Spülen wurden die Immunopräzipitate auf Protein-A-Sepharose-Kügelchen aufgefangen und einer in vitro Phosphorylierung in Gegenwart von [γ³²P]-ATP und MnCl&sub2; unterworfen. Derartige Bedingungen fördern die Autophosphorylation der BCR-ABL-Kinase. Nach 30 Minuten bei 30ºC wurden die Reaktionen terminiert, gespült und mittels Elektrophorese mit SDS/8%-Polyacrylamid-Gel analysiert. Die mit ³²P markierten Proteine wurden durch Autoradiographie erfasst. Vergleichbare Spiegel von BCR-ABL-Protein wurden entweder mittels anti-GRB-2- oder anti-ABL-Antikörpern ausgefällt. Ferner assoziierten beide Formen von BCR-ABL (P210 und P185) mit GRB-2 in Rat1-Fibroblasten, die die entsprechenden BCR-ABL-Proteine exprimieren.
Auf ähnliche Weise kann Immunopräzipitation mit GRB-2- Protein durch anti-ABL-Antikörper in Zell-Linien ausgefällt werden, in denen BCR-ABL exprimiert wird. Insbesondere wurden Zell-Lysate aus MEG-01-Zellen präpariert und einer Immunopräzipitation mit Kontroll-(Prä-Immunseren), anti-ABL- pEX4- und anti-GRB-2-Antikörpern unterworfen. Die immunpräzipitierten Proteine wurden mittels SDS/12% -Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und einem Immunoblotting mit anti-GRB-2-Antikörpern unterzogen. Gebundene Antikörper wurden mit dem [¹²&sup5;I]-Protein A sichtbar gemacht, und konnten sowohl in den Spuren, die anti-GRB-2-, als auch in jenen, die anti-ABL-immunpräzipitiertes Material enthielten, erfasst werden.
Metabolische Markierung von BCR-ABL-exprimierenden Zellen mit ³&sup5;S-Methionin und anschließender Immunopräzipitation mit anti-ABL- oder anti-GRB-2-Antikörpern zeigte, dass es bei 50% bis 90% der in der Zelle verfügbaren BCR- ABL-Kinase in Übereinstimmung mit den oben beschrieben Resultaten zu Komplexbildung mit GRB-2 kommt. Interessanterweise wurde keine Assoziierung von GRB-2 mit der oncogenen v-Abl-Kinase beobachtet. Diese Experimente weisen nach, dass das GRB-2-Adaptor-Protein mit beiden Formen der BCR- ABL-Tyrosin-Kinase einen stabilen Komplex bildet, hingegen nicht mit der v-Abl-Kinase, und dass die BCR-ABL/GRB-2-Komplexe nach der anschließenden in vitro-Phosphorylierung von BCR-ABL intakt bleiben.

6.2.2. IN VITRO BINDUNG VON BCR-ABL AN GRB-2

Um die molekulare Grundlage für die Assoziierung von BCR-ABL mit GRB-2 zu erforschen, wurde die cDNA-Sequenz von GRB-2 mit vollständiger Länge in pGEX-2T kloniert, um in Bakterien als ein Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Das GST-GRB-2-Protein wurde gereinigt und auf seine Fähigkeit getestet, in vitro an BCR-ABL zu binden. Insbesondere wurden mit ³&sup5;S-Methionin markierte Proteine aus Lysaten von Sf9-Insektenzellen, die mit P185-BCR-ABL-rekombinantem Baculovirus infiziert waren, mit einheitlichen Mengen von immobilisiertem alleinstehenden GST-, GST-GRB-2- mit vollständiger Länge, GST-Amino- Terminal-, GRB-2-SH3-Domänen-, GST-GRB-2-SH2-Domänen GST- Carboxy-Terminal-, GRB-2-SH3-Domänen- und anti-ABL-Antikörpern inkubiert, die an Protein-A-Sepharose-Kügelchen gebunden waren. Nach 90 Minuten Inkubation bei 4ºC wurden die Kügelchen viermal mit Inkubationspuffer und, um ungebundenes Material zu entfernen, zweimal mit RIPA-Puffer gespült. Die gebundenen Proteine wurden mittels SDS/7% -Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und mittels Fluorographie erfasst. Es stellte sich heraus, dass das in Baculovirusinfizierten Insektenzellen exprimierte P185-BCR-ABL an GRB- 2 band, das mit vollständiger Länge auf Glutathion- Sepharose-Kügelchen immobilisiert vorlag. Eine Bindung an alleinstehendes GST wurde nicht beobachtet. Der Komplex von BCR-ABL und GST-GRB-2 blieb nach Spülen mit Puffer intakt, der SDS- und Deoxycholat-Detergenzien enthielt.
Um festzustellen, welche GRB-2-Domäne(n) an BCR-ABL bindet(binden), wurden GST-Fusionsproteine präpariert, die die isolierten SH3- und SH2-Domänen des GRB-2 enthielten. BCR-ABL band an das SH2-Fusionsprotein von GST-GRB-2. GST- Fusionsproteine, die Amino- und Carboxy-terminale SH3-Domä- nen von GRB-2 enthielten, banden ebenfalls in vitro an das durch Baculovirus erzeugte BCR-ABL-Protein. Die Wechselwirkung von BCR-ABL mit den SH2- und SH3-Domänen von GRB-2 verhielt sich gegenüber Spülen mit einem Puffer, der SDS und Deoxycholat enthielt, widerstandsfähig. Eine Behandlung von BCR-ABL mit Kartoffelsäure-Phosphatase eliminierte zwar dessen Fähigkeit mit der SH2-Domäne von GRB-2 zu assoziieren vollständig, beeinträchtigte jedoch nicht dessen Bindungsverhalten an die SH3-Domänen von GRB-2.

7. BEISPIEL: FÜR SH2-VERMITTELTE BINDUNG VON GRB-2 AN BCR- ABL ERFORDERLICHE BCR-ABL-SE UENZEN

In dem im folgenden Abschnitt vorgestellten Arbeitsbeispiel werden Aminosäuresequenzen untersucht, die für BCR-ABL/GRB-2-Bindung mittels SH2-Domänen von GRB-2 erforderlich sind. Insbesondere wird nachgewiesen, dass für eine Bindung die Gegenwart von Tyr-phosphorylierten Aminosäurebausteinen erforderlich ist, und weiter wird gezeigt, dass eine Mutation des ersten Exon von BCR in der Lage ist, die SH2-vermittelte BCR/GR8-2-Bindung aufzuheben.

7.1. MATERIAL UND VERFAHREN

Das Material und die Verfahren, die in den in diesem Arbeitsbeispiel vorgestellten Versuchen verwendet werden, sind dieselben, wie sie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben wurden.

7.2. ERGEBNISSE

7.2.1 SH2-VERMITTELTE BINDUNG VON GRB-2 AN BCR-ABL ERFORDERT TYROSINE-PHOSPHORYLATION VON BCR-SEQUENZEN

Um festzustellen, welche Regionen in BCR-ABL an der GRB-2-Bindung beteiligt sind, wurden BCR- und ABL-Sequenzen gesondert in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen exprimiert und auf ihre Fähigkeit getestet, an GRB-2 mit vollständiger Länge sowie an die isolierten SH2- und SH3- Domänen von GRB-2 zu binden. Durch Baculovirus erzeugte cABL band in vitro an GRB-2 mit vollständiger Länge, nicht hingegen an die alleinstehende SH2-Domäne von GRB-2. Insbesondere im Falle von einzig mit cABL rekombinanten Baculoviren infizierten Sf9-Insektenzellen. Drei Tage nach der Infizierung wurden die Zellen mit ³&sup5;S-Methionin markiert. Die markierten Zellen wurden lysiert und die Lysat-Proteine wurden in Gegenwart von Protein-A-Sepharose Kügelchen mit GST alleinstehend, GST-GRB-2 mit vollständiger Länge, GST- GRB-2-Amino-SH3, GST-GRB-2-SH2, GST-GRB-2-carboxy-SH3, und den entsprechenden anti-ABL-Antikörpern inkubiert. Nach der Inkubation für 90 Minuten bei 4ºC wurden die Kügelchen viermal mit Inkubationspuffer und zweimal mit RIPA-Puffer gespült. Gebundene Proteine wurden mittels SDS/10%- Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und durch Fluorographie erfasst. In Insektenzellen hyperexprimierte cABL ist an Tyrosinresten phosphoryliert (Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). Das Unvermögen der SH2-Domäne von GRB-2 an das von Baculovirus erzeugte cABL-Protein zu binden, war daher nicht auf mangelnde Tyrosin-Phosphorylierung zurückzuführen.
Die Bindung von cABL an GRB-2 in vitro wird anscheinend ausschließlich über die Amino- und Carboxyterminal- SH3-Domänen von GRB-2 vermittelt. Die SH3-Domänen binden an spezifische Prolin-reiche Motive (Cicchetti et al., 1992, Science 257: 803-806; Ren et al., 1993, Science 259: 1157- 1161). Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass GRB2 über die direkte Wechselwirkung der SH3-Domänen von GRB-2 mit der Prolin-reichen Sequenz PPPVPPR, die in der Carboxy-terminalen Region von Sos1 vorhanden ist, an den Sosl-Guanin- Nucleotid-Austauscher bindet (Li et al., 1993, Nature 363: 85-87; Rozakis-Adcock et al., 1993, Nature 363: 83-85). Der Carboxy-Terminus von cABL enthält mehreren Prolin-reiche Abschnitte. Allerdings wurde keine PPPVPPR Sequenz in dem cABL-Protein gefunden. Das Binden von SH3-Domänen von GRB-2 an cABL in vitro in einem durch Deletion mutierten cABL-Protein, dem der größte Teil der cABL-Carboxy-terminalen Domäne fehlt, ist deutlich reduziert, jedoch nicht vollständig eliminiert. Diese Daten in Verbindung mit dem Fehlen von nachweisbarer Assoziierung zwischen normaler cABL und GRB-2 nach Immunopräzipitation aus Zell-Lysaten, wie nachstehend erörtert, geben Grund zur Annahme, dass die in vitro beobachtete cABL/GRB-2-Wechselwirkung nicht spezifisch ist und in vivo nicht auftreten kann. Allerdings ist es möglich, dass die Prolin-reiche Domäne in cABL Bindungsstellen für andere SH3-Domänen anbietet.
Eine ähnliche Analyse der Bindung von cBCR in vitro an isolierten GRB-2-Domänen oder solchen mit vollständiger Länge, erbrachte, dass lediglich die GRB-2 mit vollständiger Länge und in geringerem Maße die N-terminale SH3-Domäne von GRB-2 in vitro an cBCR band. Insbesondere wurden Sf9- Insektenzellen einzig mit cBCR-rekombinanten Baculoviren infiziert und wurden anschließend, wie vorstehend erörtert, hinsichtlich der cABL rekombinanten Baculoviren untersucht. Interessanterweise wurde dabei keinerlei Bindung von cBCR an die SH2-Domäne von GRB-2 festgestellt.
Das völlige Ausbleiben von in vitro Bindung der SH2- Domäne von GRB-2 an cABL und cBCR steht im Gegensatz zu der starken Bindung dieser Domäne an die chimäre BCR-ABL- Tyrosin-Kinase. Der Status der Phosphorylierung von cBCR- Sequenzen ist in dem cBCR-Protein mit vollständiger Länge gegenüber demjenigen in der BCR-ABL-Chimäre unterschiedlich. Das cBCR-Protein wird in sämtlichen untersuchten Zelltypen, selbst nach Hyperexpression in Insektenzellen, ausschließlich an Serin/Threonin-Resten phosphoryliert (Timmons et al., 1989, Oncopene 4: 559-567; Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171). Im Gegensatz hierzu phosphoryliert in der BCR-ABL Chimäre die aktivierte ABL-Kinase die ersten BCR-Exon-Sequenzen von Tyrosin (Liu et al., 1993, Oncogene 8: 101-109). Um zu überprüfen, ob Tyrosin-Phosphorylierung von BCR-Sequenzen eine Bindung an die isolierte SH2-Domäne von GRB-2 aufdecken kann, wurden Insektenzellen mit Baculoviren co-infiziert, die für die cBCR- und cABL- Proteine mit vollständiger Länge codieren. Insbesondere wurden Sf9-Insektenzellen mit cABL- und cBCR-rekombinanten Baculoviren co-infiziert und, wie vorstehend erläutert, auf cABL-rekombinante Baculoviren untersucht. Transphosphorylation von cBCR durch die cABL-Tyrosin-Kinase führte zu Bindung der SH2-Domäne von GRB-2 an cBCR. Western Blotting mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern erbrachte, dass cBCR in Sf9- Zellen, die mit cABL- und cBCR-Baculoviren co-infiziert waren, an Tyrosin phosphoryliert wurde. Ebenfalls wurde in vitro ein niedriger Level der Bindung von cBCR an die isolierten Amino- und Carboxy-terminalen SH3-Domänen von GRB-2 festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Bindung der SH2-Domäne von GRB-2 an BCR-Sequenzen Tyrosin-Phosphorylierung voraussetzt.

7.2.2. GRB-2 INTERAGIERT IN VIVO MIT BCR-ABL- JEDOCH NICHT MIT CABL- UND CBCR-SECUENZEN

Um zu untersuchen, ob die in vitro Bindung von GRB-2 an cABL und cBCR auch in vivo auftritt, wurden COS-Zellen mit Expressionskonstrukten der entsprechenden cDNAs transfiziert. Transfektion dieser cDNAs führt dazu, dass die Expression von cABL und cBCR auf das ca. 50- bis 200-fache der entsprechenden Level von endogenem Protein anwächst (Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). Ähnlich ließ sich nach Hyperexpression der BCR-Sequenzen, die in der P210-BCR-ABL-Chimäre in COS-Zellen zurückgehalten waren, keine Wechselwirkung von GRB-2 mit BCR-Sequenzen feststellen. Im Gegensatz hierzu wurden in demselben Experiment erhebliche Level von P185-BCR-ABL durch die anti-GRB-2-Antikörper ausgefällt.
Unter diese Bedingungen co-immunopräzipitierten keine akzeptablen Level von cABL mit GRB-2. Drei Tage nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und die Lysate wurden für 2 Stunden bei 4ºC mit normalen Kaninchenseren, anti- ABL-2/3-Antikörpern und anti-GRB-2-Antikörpern inkubiert. Die Immunopräzipitate wurden auf Protein-A-Sepharose-Kügelchen aufgefangen und sechs mal mit Inkubationspuffer gespült. Gebundene Proteine wurden mittels SDS/8%-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, auf Nitrocellulosefilter übertragen, und die Filter wurden mit monoklonalem anti- ABL-Antikörper der Maus inkubiert. Immunoreaktive Banden wurden mit dem Enhanced-Chemilumineszenz-Detektionsverfahren (ECL-) (Amersham) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurden COS-Zellen mit BCR-(Δ872-1271)-cDNA transfiziert, die in den pSRγ-Vektor kloniert war. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellen lysiert, und die Lysate wurden für 2 Stunden bei 4ºC mit Kontrollseren, anti-BCR-Antikörpern oder anti- GRB-2-Antikörpern inkubiert. Die Immunopräzipitate wurden mit Protein-A-Sepharose-Kügelchen aufgefangen, viermal mit Inkubationspuffer und zweimal mit 50 mN Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,0, gespült und dann in vitro einer Phosphorylierung in Gegenwart von γ-³²P-ATP und MnCl&sub2; unterzogen. Die Proteine wurden mittels SDS/8% -Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert.
Diese Daten stützen zusammen mit dem Fehlen von nachweisbaren endogenen cABL- und cBCR-Proteinen in anti-GRB-2- Immunopräzipitaten normaler Zellen, die Behauptung, dass in vivo keinerlei cABL/GRB-2- und cBCR/GRB-2-Komplexe nachzuweisen sind. Diese Ergebnisse beweisen, dass die BCR-ABL- Chimäre neuartige Eigenschaften von Proteinbindung vorweist, die sich von denjenigen ihrer BCR- und ABL- Proteinsequenz-Komponenten unterscheiden.

7.2.3. EINE PUNKTUELLE MUTATION IN DEM ERSTEN EXON VON BCR HEBT DIE BINDUNG DER SH2-DOMÄNE VON GRB-2 AN BCR AUF

Die Bindung von SH2-Domänen an spezifische Tyrosinphosphorylierte Proteine hängt von dem primären Sequenz-C- Terminal an das phosphorylierte Tyrosin ab (Fanti et al., 1992, Cell 69: 413-423; Kashishian et al., 1992, EMBO J.
11: 1373-1382; Sonyang et al., 1993, Cell 72: 767-778). Untersuchungen der Sequenzen, die die 11 potentiellen Tyrosin-Phosphorylierungstellen innerhalb des ersten Exons von BCR umgeben, ergaben, dass Tyrosin 177 innerhalb der Sequenz YVNV, die einer optimalen Bindungsstelle für die SH2-Domäne von GRB-2 entspricht, zu finden ist (Sonyang et al., 1993, Cell 72: 767-778; Skolnik et al., 1993, EMBO J. 12: 1929-1936). Sequenzen, die die anderen zehn Tyrosine in dem ersten Exon der BCR umgeben, stimmen nicht mit optimalen Bindungsstellen für die SH2-Domäne von GRB-2 oder für die anderen untersuchten SH2-Domänen überein (Sonyang et al., 1993, Cell 72: 767-778). Um festzustellen, ob Tyrosin 177 für die Bindung von BCR-ABL an die SH2-Domäne von GRB-2 erforderlich ist, wurde Tyrosin 177 in BCR-ABL durch stellenspezifische Mutagenese gegen Phenylalanin substituiert, das mutierte Protein in Insektenzellen exprimiert und auf Bindung an GRB-2 getestet. Ein Vergleich des Phosphopeptid- Abbildungsmuster der P185-(Y177F)-mutierten und der P185- Wild-Typ-Proteine nach in vitro Autophosphorylation deckte das Nichtvorhandensein von mindestens einem größeren Phosphopeptid in P185-(Y177F) auf. Insbesondere wurden COS-Zellen mit dem P185-Wild-Typ und P185-(Y177F) transfiziert, die in den pSRα-MSVtkneo-Vektor kloniert waren. Drei Tage nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und die Lysate mit anti-ABL-Antikörpern inkubiert. Die Immunopräzipitate wurden in vitro in Anwesenheit von γ-³²P-ATP und MnCl&sub2; einer Autophosphorylation unterzogen. Die Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, auf Nitrocellulose übertragen und einer Phosphopeptid-Kartierung unterworfen.
Untersuchungen der Bindung wiesen nach, dass das P185- BCR-ABL-(Y177F)-mutierte Protein, bei dem Tyrosin 177 durch ein Phenylalanin in dem ersten Exon von BCR ersetzt ist, im Gegensatz zu dem Wild-Typ-P185-BCR-ABL-Protein in vitro nicht mit der SH2-Domäne von GRB-2 in Wechselwirkung trat. Insbesondere wurden Sf9-Insektenzellen mit Wild-Typ- Baculovirus-DNA und Wild-Typ-P185-BCR-ABL-cDNAs, die mit dem pAcC12-Vektor kloniert waren, oder mit Wild-Typ- Baculovirus-DNA und P185-BCR-ABL-(Y177F)-cDNAs co-transfiziert, die in den pAcC12-Vektor kloniert waren. Sechs Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit ³&sup5;S-Methionin metabolisch markiert. Die Zellen wurden lysiert, und die Lysate mit GST-GRB-2-SH2- oder mit anti-ABL-pEx4-Antikörpern mit Protein-A-Sepharose-Kügelchen inkubiert. Die gebunden Proteine wurden mittels SDS/7% -Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Fluorographie analysiert.
Anschließend wurde die Fähigkeit der P185-BCR-ABL- (Y177F)-Mutante evaluiert, in vivo mit GRB-2 in Wechselwirkung zu treten. P185-(Y177F) interagierte nicht mit endogenem GRB-2, wenn es in COS-Zellen oder in Rat1-Fibroblasten, die das Mutationsprotein stabil exprimieren, hyperexprimiert wurde. In ähnlicher Weise war es BCR-ABL-Deletionsmutanten, denen Tyrosin 177 fehlt, nicht möglich, GRB-2 zu binden. Insbesondere wurden COS-Zellen mit P185- Wild-Typ- und P185-(Y177F)-cDNAs transfiziert, die in den pSRα-MSVtkneo-Vektor kloniert waren. Drei Tage nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Lysate mit gewöhnlichen Kaninchenseren (NRS), anti-ABL-2/3-Antikörpern oder anti-GRB-2-Antikörpern für 2 Stunden bei 4ºC inkubiert, Die Immunopräzipitate wurden auf Protein-A- Sepharose-Kügelchen aufgefangen und in vitro in Anwesenheit von [γ³²P]-ATP und MnCl&sub2; einer Phosphorylierung unterzogen. Die Proteine wurden mittels SDS-10% -Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert. Ferner wurden Lysate von nach G418 selektierten Rat1-Zellen, die P185- Wild-Typ und P185-(Y177F) exprimieren, für 2 Stunden bei 4ºC mit anti-GRB-2-Antikörpern, anti-ABL-2/3-Antikörpern oder gewöhnlichen Kaninchenseren inkubiert. Die Immunopräzipitate wurden auf Protein-A-Sepharose Kügelchen aufgefangen. Die gebundenen Proteine wurden mittels SDS-10%- Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und anschließend einem Immunoblotting mit monoklonalem anti-ABL-Antikörper der Maus unterzogen. Immunoreaktive Banden wurden mittels des ECL-Detektionsverfahrens (Amersham) sichtbar gemacht.
Diese Daten zeigen, dass eine Wechselwirkung zwischen BCR-ABL und GRB-2 in BCR-ABL durch das Binden der SH2-Domäne von GRB-2 an das phosphorylierte Tyrosin 177 in vivo vermittelt wird. Die SH3-Domänen von GRB-2 tragen offensichtlich nicht zu der in vivo Bindung zwischen GRB-2 mit vollständiger Länge und BCR-ABL bei.

8. BEISPIEL: BCR-ABL-PROTEINE, DIE SICH BEI GRB-2 BINDUNG FEHLERHAFT VERHALTEN, ZEIGEN REDUZIERTE TRANSFORMIERUNGSKAPAZITÄT

Die im folgenden Arbeitsbeispiel aufgeführten Daten weisen nach, dass das Transformationspotential der intrazellulären PTK von BCR-ABL von der Bindung dieser PTK an das GRB-2-Element der GRB-Sub-Familie der Adaptorfamilie von Proteinen abhängt. Das Ergebnis stellt den ersten Fall dar, bei dem die Bindung eines Adaptor-Proteins an eine derartige PTK als ein Schritt innerhalb eines Transformations/Oncogenese-Prozesses zu sehen ist.

8.1. MATERIAL UND VERFAHREN

8.1.1. TRANSFORMATIONSTESTS

Eine Infektion von Rat1-Fibroblasten wurde durchgeführt, wie bisher beschrieben (Lugo et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1263-1270). Die Titer lagen in der Größenordnung von > 10&sup5; infektiöse Teilchen pro ml, wie sich anhand der Häufigkeit von Gentransfer zu Fibroblasten bestimmen ließ. Die Bildung von Rat1-Kolonien in semi-festem Medium wurde gemessen, indem eine Schicht von 5 · 10&sup4; Zellen pro 6-cm²-Schale in 5 ml Iscoves eingebracht wurde, das mit 15% fetalem Kälberserum und 0,4% Noble-Agar ergänzt war (Lugo et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1263-1270). Durch Züchtung der infizierten Zellen über einen Zeitraum von 12- 15 Tagen in G518 (0,5 mg pro ml) wurden G418-resistente Populationen etabliert. Nach Selektion wurden Zellen aus G418-resistenten Kulturen in einer Dichte von 10&sup4; Zellen pro ml auf Agar ausgebreitet. Zwei Wochen nach dem Auftragen der Zellen wurde die Zahl der auf Agar entstandenen Kolonien erfasst.
Eine Infizierung und Etablierung von haematopoietischen Zellkulturen aus frisch isoliertem Mausknochenmark wurden durchgeführt, wie bereits beschrieben (McLaughlin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6558-6562). Dabei wurden kurz gesagt Knochenmarkselemente von 4-6 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen mit einer Dichte von 2 · 10&sup6; Zellen pro ml in der geeigneten retroviraler Mischung resuspendiert, ergänzt mit 4 ug Polybrene pro ml. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach der Infizierung wurden die Zellen gespült und in RPMI-1640-Medium auf eine Dichte von 10&sup6; Zellen pro ml resuspendiert, das mit 5% fetalem Kälberserum und 50uM β-Mercaptoethanol ergänzt war, sowie in einer Menge von 5 ml Zellsuspension pro 6-cm² Schale aufgetragen. Die Kulturen wurden bis zu 8 Wochen gehalten, und die Nährböden wurden einmal pro Woche aufgefrischt. Die Kulturen wurden für transformiert erachtet, sobald die Zelldichte der nicht-adhärenten haematopoietischen Zellen 10&sup6; Zellen pro ml übertraf.

8.1.2. SONSTIGE PROZEDUREN

Zu den Transformationstests, wie sie in Abschnitt 8.1.1 beschrieben sind, treten noch Techniken hinzu, wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben.

8.2. ERGEBNISSE

Um die biologische Relevanz von GRB-2 Bindung für BCR- ABL-induzierte Oncogenese zu bestimmen, wurde der Einfluss von mutierendem Tyrosin 177, das für die Assoziierung mit GRB-2 erforderlich ist, dahingehend untersucht, in wieweit BCR-ABL fähig ist Fibroblasten und haematopoietische Zellen zu transformieren. Helfer-freie retrovirale Mischungen vom Wild-Typ und mutierte BCR-ABL-Formen wurden verwendet, um Rat1-Fibroblasten und frisch isolierte Mäuseknochenmarkszellen zu infizieren. Sowohl für GRB-2 als auch für hSos-I ist deren Expression in diesen Zelltypen nachgewiesen (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442; Bowtell et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6511-6515; Chardin et al., 1993, Science 260: 1338-1343). Die Transformation von Rat1-Fibroblasten wurde anhand von Koloniebildung auf weichem Agar getestet (Lugo et al., 1989, Mal. Cell. Biol. 9: 1263-1270). Die haematopoietische Zelltransformation wurde getestet, indem infizierte Mäuseknochenmarkszellen unter Bedingungen gezüchtet wurden, die das Wachstum von Vorläufer-B-Lymphozyten fördern (McLaughlin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6558-6562). Im Gegensatz zu Wild-Typ-BCR-ABL transformierte das P185-(Y177F)-Protein haematopoietische Zellen nicht und zeigte eine reduzierte Kapazität Rat1-Zellen zu transformieren (siehe unten Tabelle 1). Diese Resultate stimmen mit der bisherigen Beobachtung überein, dass die P185-(Δ176-426)-Mutante, die Y177 deletiert, sowohl in Rat1-Fibroblasten als auch in haematopoietischen Zellen reduzierte Transformierungsaktivität zeigt (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792; Tabelle 1). P185-(Δ176-426) weist insbesondere nach G418- Selektion einen ausgeprägteren Defekt in der Transformation von Rat1-Fibroblasten vor als P185-(Y177F) auf (Tabelle 1) Für Sequenzen stromabwärts von Y177 in dem ersten Exon von BCR ist nachgewiesen, dass diese in einer von Phosphoserin/Phosphothreonin abhängigen Weise an SH2-Domänen binden (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792). Zwei (mit A und B bezeichnete) SH2-Bindungsstellen innerhalb dieser Region wurden identifiziert, und ein Entfernen dieser Stellen kann spezifische, für BCR-ABL-vermittelt Transformation von Fibroblasten wichtige Proteinwechselwirkungen aufheben. Sowohl P185-(Y177F) als auch P185-(Δ176-426) zeigten keinerlei Transformationsaktivität in haematopoietischen Zellen. Unterschiede in den Transformierungsaktivitäten der BCR- ABL-Proteine rührten nicht von unterschiedlichen Leveln der Protein-Expression her. Tabelle 1
Erläuterungen der hochgestellten Indizes:
a Bezeichnungen der verschiedenen Formen von P185-BCR-ABL. Die mutierten oder deletierten Aminosäuren sind in Klammern angegeben.
b Durchschnittliche Häufigkeit von Koloniebildung auf Agar, ermittelt anhand von zwei Schalen pro Test und vier bis fünf unabhängigen Tests pro Konstrukt.
c Die Zellen wurden 3 Tage nach Infektion mit Helfer-freien retroviralen Mischungen auf Agar aufgebracht.
d Die Zellen wurden, beginnend 3 Tage nach Infektion, mit Helfer-freien retroviralen Mischungen, 12 bis 15 Tage lang mit G418 (0,5 mg/ml) selektiert.
e Anzahl von Knochenmarkszellkulturen hoher Dichte, die gegenüber den insgesamt eingebrachten Kulturen gesteigertes transformiertes lymphoides Wachstum zeigten. Die Daten repräsentieren drei voneinander unabhängige Versuche. In jedem Experiment wurden Zellkulturen nach Infizierung mit der jeweiligen retroviralen Mischung errichtet.
Western-Blot-Analyse von Lysaten von Zellen, die die vielfältigen Formen von BCR-ABL exprimieren, ergaben nach Infizierung von Rat1-Fibroblasten mit den entsprechenden Retroviren vergleichbare gleichbleibende Level an Proteinen. Für die Western-Blot-Analysen wurden RAT1-Zellen mit Retroviren, die Wild-Typ- und mutante (Y177F)-Formen von P185-BCR-ABL codieren oder mit Vektorkontrolle infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellen lysiert und Western Blotting mit monoklonalem anti-ABL-Antikörper der Maus unterzogen. Immunoreaktive Banden wurden mit Hilfe des ECL- Detektionssystems (Amersham) sichtbar gemacht.

9. BEISPIEL: TRANSKRIPTION VON BCR-ABL-AKTIVITÄTEN AUS EINEM RAS-RESPONSIVEN ELEMENT-PROMOTER IN EINER VON RAS ABHÄNGIGEN WEISE

In dem in diesem Abschnitt dargestellten Arbeitsbeispiel wird nachgewiesen, das Bindung intrazellulärer PTK/GRB2 bei BCR-ABL dazu dient, den Ras-Signalisierungsweg zu aktivieren.

9.1. MATERIAL UND VERFAHREN

9.1.1. TRANSKRIPTIONS-AKTIVIERUNGSTEST

Es wurde eine Transkriptionale Aktivierung der Expression aus einem Ras-responsiven Element-(ets/AP-1)-Promoter wurde im Wesentlichen so durchgeführt, wie bisher beschrieben (Clark et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4887-4891; Hauser et al., 1993, Methods in Enzymology, im Druck). Kurz gesagt wurden NIH-3T3-Zellen mit 1 ug des Reporterplasmids pB4X-CAT-Chloramphenicol-Azetyltransferase (Wasylyk et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 2247-2250) zusammen mit 0,5 ug pSRαMSVTkneo, das die angegebenen BCR-ABL- Mutanten enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 ug pZIP H-Ras (17N) (Feig et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 3235-3243) transfiziert. Die Transfektionen wurden in doppelter Ausführung in 60 mm-Schalen durchgeführt, und die Zellen nach 48 Stunden geerntet. Anschließend an eine Lyse mittels Ausfrieren in 100 ul von 250 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,8) wurde das Zell-Debris durch Zentrifugieren entfernt und der Supernatant auf 62ºC erhitzt, um endogene Acyltransferasen zu denaturieren. Nach nochmaligem Zentrifugieren wurde ein 50 ul-Aliquat eines jeden Supernatants auf seine CAT-Aktivität getestet, indem er 45 Minuten lang mit 0,1 uCi ¹&sup4;C-Chloramphenicol (NEN) und 0,34 mM Azetyl-CoA in 250 mM Tris-HCl in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 140 ul inkubiert wurde. Die Reaktion wurde dann durch Extraktion mit 500 ul Ethylazetat terminiert, unter Vakuum verdampft, und die sich ergebenden Pellets wurden wieder aufgelöst und einer Dünnschichtchromatographie auf Silika- Gelplatten unterzogen, wobei 5%-Methanol/95%-Chloroform (v/v) als Lösungsmittel verwendet wurde. Die Testergebnisse wurden mittels eines AMBIS Beta-Scanners quantitativ erfasst,

9.1.2. VERSCHIEDENE TECHNIKEN

9.2. ERGEBNISSE

Ein Mechanismus, durch den die GRB-2-Bindung an BCR- ABL eine oncogene Transformation steigern kann, besteht in der direkten Stimulierung von Ras über den Sos-1-Guanin- Nucleotid-Austauschfaktor. Um zu festzustellen, ob die Wechselwirkung von BCR-ABL mit GRB-2 direkt zu dem Ras-Weg beiträgt, wurde ein Test der Aktivierung durch Transkription ausgeführt. Oncogenes Ras steigert die Transkriptionsrate aus Ras-responsiven Elementen (z. B. ets-1- und AP-1- DAN-Motive; Hauser et al., 1993, Methods in Enzymology, im Druck). Darüber hinaus können Oncogene mit vielfältigen Funktionen, zu denen Tyrosin-Proteinkinasen und Serin/Threoninkinasen gehören, eine Ttanskription aus Promotern aktivieren, die Ras-responsive Elemente aufweisen, wie beispielsweise das Motiv ets/AP-1 (Schweighoffer et al., 1992, Science 256: 825-827). Zwischen der Fähigkeit vielfältiger Oncogene, die Transkription aus einem Promoter, der ets/AP-1 enthält, zu aktivieren und deren Kapazität, Zellen zu transformieren, besteht eine Korrelation (Wasylyk et al., 1988, EMBO J. 7: 2475-2483). So können Transaktivierungstests die Erforschung auf dem Gebiet der Analyse der oncogenen Funktion von Zellwachstums und tumorerzeugenden Faktoren ergänzen.
Wild-Typ- und mutante Formen von BCR-ABL wurden hinsichtlich deren Fähigkeit verglichen, eine Transkription aus ets/AP-1 zu aktivieren. Ein CAT-Reporter unter der Kontrolle eines β-Globin-Promoters, der vier Tandern-Rasresponsive Elemente (pB4X-CAT) enthält. Es hat sich gezeigt, dass oncogenes Ras die Transkriptionsrate aus diesem Element bis zu 15-fach erhöht (Schweighoffer, Science 256: 825-827). Wie in Fig. 1 zu sehen, wird eine Wild-Typ- BCR-ABL-induzierte Aktivierung durch Co-Transfektion von Ras (17N)aufgehoben, einer dominanten inhibitorischen Mutante, von der nachgewiesen ist, das sie die Ras-Funktion neutralisiert (Feig et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 3235- 3243; Thomas et al., 1992, Cell 68: 1031-1040; Wood et al., 1992, Cell 68: 1041-1050), was bedeutet, dass BCR-ABL-induzierte Transkriptions-Aktivierung durch Ras vermittelt wird. Bezeichnenderweise hatten die BCR-ABL-Mutanten P185 (Y177F) und P185 (Δ176-426), die hinsichtlich GRB-2-Bindung defekt sind, wenn überhaupt, nur wenig Einfluss auf die transkriptionale Transaktivierung aus diesem Promoter. Der geringe Level an Transaktivierung, der mit den BCR-ABL-Mutanten erreicht wird, korreliert mit deren im Vergleich zu Wild-Typ-P185-BCR-ABL reduzierten Transformierungsaktivitäten (siehe oben Tabelle 1).
Ferner führt eine Infizierung von Rat1-Fibroblastzellen mit Wild-Typ-BCR-ABL-enthaltenden Retrovirus zu erhöhter Fraktionierung von Ras-GTP. Insbesondere wurden Rat1- Zellen mit Helfer-freien retroviralen Mischungen für P185- BCR-ABL-Wild-Typ oder Vektorkontrolle infiziert. Zwei Tage nach Infektion wurden die Zellen mit ³²P-Orthophosphat (0,5 mCi/ml) für 16 Stunden in phosphatfreiem Medium markiert. Die Zellen wurden lysiert und mit anti-Ras-monoklonalem Antikörper Ras-immunpräzipitiert. Guanin-Nucleotide, die an Ras gebunden waren, wurden dissoziiert und anschließend mittels Dünnschichtchromatographie auf PEI-Zelluloseplatten in 0,75 M KH&sub2; PO&sub4;, pH-Wert 3,5, aufgetrennt. Die quantitative Bestimmung der Menge von an Ras gebundener GDP und GTP mit einem AMBIS Beta-Scanner weist einen zwar mäßigen, jedoch reproduzierbaren Anstieg nach.

10. BEISPIEL: SIGNALISIERENDES INKOMPETENTES GRB2 FÜHRT ZU EINER RÜCKVERWANLUNG DES PHÄNOTYPS TRANSFORMIERTER ZELLEN

Das folgende Beispiel zeigt, dass eine unter Beteiligung von BCR/ABL und GRB2 stattfindende Blockierung des Signalübermittlungsweges einen transformierten Phänotyp in Zellen zurückwandeln kann. Gesteigerte Expression von signalisierenden inkompetenten GRB2-Mutanten kehrt BCR/ABL- induziertes transformiertes Wachstum in Rat1-Zellen um. Eine Blockierung des Signalisierungsweges inhibiert auch das Wachstum BCR/ABL-exprimierender Zellen, die aus einem Patienten mit chronisch-myelogener Leukämie (K562-Zellen) isolierte wurden, sowie transformierter Zellen, die auf den PDGF-Rezeptor angewiesen sind.

10.1. MATERIAL UND VERFAHREN

Mutante GRB2-Gene wurden konstruiert, die die SH3-Domäne entweder auf dem Amino-Terminus (N') oder dem Carboxy- Terminus (C') deletierten. GRB2 mit vollständiger Länge sowie gekürzte Formen wurden in die Bam-H1-Stelle eines modifizierten pCGN-Plasmid-Vektors (Tanaka et al., Cell 60: 375-386, 1990) inseriert, wie beschrieben in Pendergast et al., Cell 75: 175-185, 1993. Bei diesem Vektor ist das Hygromycin-Resistenz-Gen stromaufwärts des SV40-Ursprungs der Replikation inseriert. Um eine Unterscheidung des endogenen GRB2-Proteins von den transfizierten Konstrukten zu erleichtern, wurde eine Sequenz, die für das Hämagglutinin- Epitop des Influenza-Virus (Pati, U.K., Gene 114: 285-288, 1992) codiert, an dem N-Terminus der mutierten Proteine im Frame fusioniert. Die gleiche antigene Markierung wurde an das Gen von Wild-Typ-GRB2 fusioniert.
BCR/ABL-transformierte Rat1-Fibroblasten wurden wie in obigem Beispiel 8.1.1 beschrieben gezüchtet. GRB2-Konstrukte wurden mittels des standardisierten Calciumphosphat- Transfektionsprotokolls (Molecular Cloning Techniques, Laboratory Manual, 2. Aufl., Ed Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und Muller) in Rat1-BCR/ABL- Zell-Linien und die Glioma-Zell-Linie C6 der Ratte (ATCC CCL 107) transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Rat1-Zellen 24 Stunden gezüchtet und anschließend für 7-9 Tage den Pharmaka G418 + Hygromycin (Sigma) exponiert. Die mit zweifachem Pharmakon selektierte Massenpopulation von Zellen wurde auf weichem Agar aufgebracht, und die Level endogener BCR/ABL, GRB2 und transfizierter GRB2 mittels Western Blotting bestimmt. Ebenfalls wurden individuelle klonale Zell-Linien, die die verschiedenen transfizierten GRB2-Konstrukte exprimieren, etabliert. Im Falle von transfizierten C6-Zellen, wurden die Zellen, wie in Muller, supra, beschrieben, 10 Tage in Hygromycin-haltigen Medien selektiert. Anschließend an die pharmazeutische Selektion wurden die Zellen auf weichem Agarmedium aufgebracht, das 0,5% FCS und (1ng/ml) PDGF enthielt. Die Kolonien > 0,4 mm wurden am Tag 10 gezählt.
Die Expression der GRB2-Konstrukte wurde mittels Immunopräzipitation evaluiert, wie in Pendergast et al., Cell 75: 175-185, 1993 beschrieben. Kurz gesagt, es wurden die BCR/ABL-GRB2-exprimierenden Rat1-Zellen lysiert und mit anti-ABL-pEx4-Antikörpern immunopräzipitiert, und die Immunopräzipitate wurden einem in vitro-Autokinasetest unterzogen (Pendergast et al., supra). Die Proben wurden mit SDS- PAGE-Gel analysiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. In einem zweiten Experiment wurden Zellen in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 1% SDS, 1 mM PMSF lysiert, 15 ug Protein aus jeder der Proben wurde mittels SDS-PAGE (15%) abgesondert. Die Proteine wurden mittels Elektrophorese auf Nitrocellulosefilter übertragen und einem Immunoblotting mit monoklonalem Antikörper einer anti-GRB2-Maus (Transduction Laboratories) und einer anschließenden Inkubation mit an Meerrettichperoxidase (BioRad) konjugiertem anti- Maus-Mab der Ziege unterzogen. Proteine wurden durch das Enhanced-Chemilumineszenz-Detektionsverfahren (Amersham) sichtbar gemacht.
Tests auf weichem Agar wurden, wie bisher beschrieben (Lugo et al., Mol. Cell. Bio. 9,: 1263-1270, 1989), durchgeführt. Die Massenpopulationen von pharmazeutisch selektierten Zellen wurden abhängig von der Effizienz der Klonierung eines jeden Zelltyps mit Dichten im Bereich von 10³ bis 5 · 10&sup4; Zellen/6-cm²-Schale ausgebracht. Die Proben wurden in doppelter Ausführung auf ein Medium aufgebracht, das 20% fetales Kälberserum enthielt. Makroskopische Kolonien (> 0,4 mm) wurden nach 14 Tagen gezählt. Die Daten geben die durchschnittliche Anzahl von Kolonien wieder, die in 3 bis 5 voneinander unabhängigen Experimenten beobachtet wurden, die mit Massenpopulationen von transfizierten und pharmazeutisch selektierten Zellen durchgeführt wurden. Die Daten über das Wachstum von Rat1-BCR/ABL wurden gewonnen, indem drei voneinander unabhängige, mit den geeigneten Konstrukten transfizierte, klonale Rat1-BCR/ABL-Zell-Linien verwendet wurden, und dies für jede Zell-Linie in 2 bis 3 getrennten Versuchen wiederholt wurde. Die Daten geben also die durchschnittliche Zahl von Kolonien wieder, die in 7 voneinander unabhängigen Versuchen beobachtet wurden.
K562-(ATCC CRL 243)-Zellen wurden mittels Standardelektroporationsverfahren mit den GRB2-Konstrukten transfiziert. Anschließend an die Transfektion wurden die Zellen 18 bis 24 Stunden gezüchtet und dann 2 Tage Hygromycin (500 ug/ml) ausgesetzt. Nach pharmazeutischer Selektion wurde jeweils die Zahl der lebenden Zellen durch Zählen der Zellen, die das Färbemittel Trypan-Blau nicht annehmen, ermittelt. Einheitliche Zahlen von lebenden Zellen wurden auf weichem Agar ausgebracht.

10.2. ERGEBNISSE

10.2.1. EXPRESSION VON GRB2 IN RAT-1 ZELLEN

Eine Expression des N'GRB2-mutierten Proteins in Rat1- BCR/ABL-Zellen verursacht eine Rückwandlung in den normalen Phänotyp. Die Massenpopulation von Zellen, die mutiertes N'-GRB2 exprimierten, wuchs als monomolekulare Schicht auf flüssigem Nährmedium und zeigten bei Erreichen der Konfluenz Kontakthemmung. Bezeichnenderweise war bei Rat1- BCR/ABL-Zellen, die N'GRB2-Mutanten exprimierten, im Vergleich zu Zellen, die den leeren Vektor exprimieren, eine extreme Schwächung der Fähigkeit, auf weichem Agar Kolonien zu bilden, zu beobachten (siehe Tabelle 2). Die C'GRB2- Mutanten exprimierende Zellen exprimierende Zellen, wuchsen als monomolekulare Schicht auf flüssigem Nährmedium, stellten das Wachstum aber bei Erreichen der Konfluenz nicht ein. Das Wachstum von Rat1-BCR/ABL-Fibroblasten, die C'GRB2-Mutanten auf weichem Agar exprimierten, war ebenfalls unterdrückt, wenn auch in geringerem Maße, als im Falle der N'-GRB2-Mutante zu beobachten war. Da im Verhältnis zu Wild-Typ-GRB2-Protein sowohl in der N'- als auch in der C'-exprimierenden Zellpopulation vergleichbare Anteile von mutierten Proteinen vorhanden waren, lässt sich die größere Potenz der N'-Mutante, BCR/ABL-induzierte Transformation zu unterdrücken, wahrscheinlich nicht einfach auf unterschiedliche Level der zwei Mutanten zurückführen. Insbesondere wurden Rat1-Zellen, die p210-BCR-ABL allein exprimieren oder auch Wild-Typ-GRB-2 oder ein verkürztes GRB- 2 exprimieren, mit anti-ABL-Antikörper lysiert und immunopräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden in vitro einem Autokinasetest unterworfen, und die Proben mittels SDS-PAGE (8% Gel) analysiert. Im Vergleich zur Kontrolle, war in Zellen mit erhöhter GRB-2-Expression keine Veränderung der ABL-Kinaseaktivität zu beobachten. Ferner wurden Rat1-Zellen, die p210-BCR-ABL allein exprimieren oder auch Wild- Typ-GRB-2 oder ein verkürztes GRB-2 exprimieren, lysiert, und Proteine aus den klonierten Zell-Lysaten wurden mittels Elektrophorese auf Nitrocellulosefilter übertragen und anschließend einem Immunoblotting mit anti-GRB-2-Mab unterworfen. Sämtliche GRB-2-Transformanten exprimierten etwa die gleichen Level an GRB-2-Protein. Diese Unterschiede weisen eher darauf hin, dass die zwei SH3-Domänen SOS mit verschiedenen Affinitäten binden oder an verschiedene Substrate binden. So wirken durch SH3-Deletion mutierte GRB2- Proteine als dominant-negative Inhibitoren für BCR/ABL-induzierte Transformation, wenn sie in äquimolaren oder größeren Mengen als das endogene Wild-Typ-GRB2 in der Zelle vorhanden sind.
Im Gegensatz zu den N'- oder C'-GRB2-Mutanten verstärkte eine erhöhte Expression von Wild-Typ-GRB2 in Rat1- BCR/ABL-Fibroblasten anscheinend den transformierten Phänotyp. Die pharmazeutisch selektierte Massenpopulation von Zellen, die das transfizierte Wild-Typ-GRB2-Konstrukt exprimierten, zeigte im Vergleich zu den mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen übereinstimmend eine Erhöhung der Anzahl von Kolonien in weichem Agar um 25-30% (Tabelle 2). Diese Daten legen nahe, dass das GRB2-Protein möglicherweise ein limitierender Effektor für BCR/ABL-induzierte Transformation bei Rat1-Fibroblasten ist. Tabelle 2

10.2.2. EXPRESSION VON GRB2-MUTANTEN IN K562-ZELLEN

Die SH3-Mutanten von GRB2 inhibieren auch das Wachstum von menschlichen Leukämiezellen. Die GRB2-Konstrukte wurden in K562-Zellen eingeführt, einer p210-BCR/ABL-exprimierenden Zell-Linie, die von einem CML-Patienten in der Blastkrise stammte. Nach der Transfektion sowie 48 Stunden pharmazeutischer Selektion wurden die Level von endogenem BCR/ABL, GRB2 und transfiziertem GRB2 durch Western-Blot- Analyse ermittelt. Gleichzeitig wurden lebensfähige Zellen auf weichem Agar angesetzt. Im Vergleich zu scheintransfizierten Kontrollproben zeigten die angesetzten Kulturen mit K562 Zellen, die das N'GRB2- mutierte Protein exprimierten, eine 10-fach geringere Häufigkeit an weichen Agar- Kolonien (Tabelle 2). Analog zu den bei den Rat1-BCR/ABL- Fibroblasten festgestellten Beobachtungen, inhibierte die C'GRB2-Mutante ebenfalls Kolonie-Bildung von K562, jedoch in geringerem Maße als die N'-Mutante. Diese Daten lassen erkennen, dass GRB2-vermittelte Signalübermittlung eine unentbehrliche Rolle bei BCR/ABL-induzierten malignen Erkrankungen des Menschen spielt.

10.2.3. EXPRESSION VON GRB2 IN C6-GLIOMA-ZELLEN

Die GRB2-Konstrukte wurden auch in C6-Glioma-Zellen der Ratte eingeführt, die hinsichtlich deren Phänotyp für transformiertes Wachstum auf Aktivität des PDGF-Rezeptors angewiesen sind (Zhang et al., Neurol. Res. 14(5): 397-401, 1992). Die Wechselwirkung des PDGF-Rezeptors mit GRB2 ist erwiesen (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442). Wie Tabelle 2 zu entnehmen ist, inhibierte die Expression der signalisierenden inkompetenten GRB2-Mutante die Kolonie- Bildung deutlich. Diese Daten beweisen, dass Inhibierung der GRB2-Signalübermittlung dazu verwendet werden kann, um transformiertes Zellwachstum, das von der Aktivierung durch Rezeptor-Tyrosin-Kinase abhängt, zu inhibieren.

11. BEISPIEL: SIGNALISIERENDES INKOMPETENTES GRB2 VERHINDERT TUMORWACHSTUM IN EINEM TIER-MODELL

Dieses Beispiel zeigt, dass Zellen, die signalisierendes inkompetentes GRB2 exprimieren, nicht mehr in der Lage sind, Tumoren in Lebewesen zu bilden, was nahelegt, dass eine Blockierung des BCR/ABL Signalübertragungsweges für die Krebstherapie bei Säugern verwendet werden kann.

11.1. MATERIAL UND VERFAHREN

Rat1-Zellen, die GRB2 (vom Wild-Typ und -Mutanten) und BCR/ABL exprimieren, wurden, wie oben in Abschnitt 10.1 beschrieben, hergestellt. Nacktmäusen (4 Mäusen pro Gruppe) wurden Rat1-Zellen subcutan in die linke Flanke injiziert, die p210-BCR/ABL und entweder Wild-Typ-GRB2, N'-vekürztes GRB2 oder C'-verkürztes GRB2 co-exprimieren. Zellen, die p210-BCR/ABL allein exprimieren (2 · 10&sup6; Zellen in 100 ul) wurden subcutan in den rechten Hinterlauf einer jeden Maus injiziert, um als eine interne Kontrolle zu wirken. Die Mäuse wurden 3 Wochen nach Implantat geopfert und das Tumorvolumen gemessen.

11.2. ERGEBNISSE

Die in Tabelle 3 aufgeführten Ergebnisse weisen deutlich nach, dass die Expression von signalisierenden inkompetenten GRB2-Proteinen in vivo das Wachstum von Tumorzellen reduziert. TABELLE 3

12. BEISPIEL: AUSWIRKUNGEN VON SIGNALISIERENDEM INKOMPETENTEM GRB2 AUF RAS-AKTIVIERUNG

Dieses Beispiel weist nach, dass die hierin beschriebenen, signalisierenden inkompetenten GRB2-Moleküle BCR/ABL-induzierte Ras-Aktivierung proportional zu deren Potential, Transformation einzuschränken, inhibieren, was annehmen lässt, dass die Wechselwirkung zwischen GRB2 und abwärts-signalisierenden Komponenten, die zu einer Ras-Aktivierung führen, blockiert ist.

12.1. MATERIAL UND VERFAHREN

Die Transkriptions-Aktivierung einer Expression von einem Ras-responsiven Element-(ets/AP-1)-Promoter wurde, wie vorstehend in Abschnitt 9.1 beschrieben, durchgeführt. Die Transformation der Rat1-Zellen, Tests auf weichem Agar und Immunoblotting-Experimente wurden, wie in obigem Abschnitt 10.1 beschrieben, ausgeführt.

12.2. ERGEBNISSE

Um festzustellen, ob die wachstumshemmende Wirkung der GRB2-Mutanten auf deren Fähigkeit zurückzuführen ist, Ras- Aktivierung zu blockieren, wurden Lysate, die aus Rat1- BCR/ABL-Zell-Linien, die Wild-Typ- oder mutierte GRB2-Proteine hyperexprimieren, präpariert waren, hinsichtlich deren Fähigkeit, Ras zu aktivieren, evaluiert. Bei Durchführung eines Tests mit Ras-abhängiger Transkriptions-Aktivierung wurde beobachtet, dass Lysate aus N'-GRB2 exprimierenden Rat1-BCR/ABL-Zellen eine 10- bis 15-fach schwächere Ras-Aktivierungsaktivität als scheintransfizierte Kontrollproben zeigten (Fig. 2). Lysate aus C'-GRB2 exprimierenden Zell-Linien wiesen ebenfalls einen Rückgang ihrer Ras-Aktivierungsaktivität auf, wenn auch in geringerem Maße als die N'-Mutante. Die Differenz in der inhibitorischen Wirkung der N'- und C'-Mutanten steht in Einklang mit deren Potenz, den BCR/ABL-transformierten Phänotyp rückzuwandeln.
Falls die Funktion der GRB2-mutierten Proteine darin besteht, vor Ras liegende Zwischenschritte des Signalübermittlungsweges zu blockieren, dann ist zu erwarten, dass die Transformation durch Gene, die Ras-Aktivierung umgehen, nicht berührt wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die GRB2-Konstrukte in Rat1-Zellen transfiziert, die mit einer aktivierten Form von raftransformiert waren, einer Serin-Kinase, die ihre Mitose-auslösende Wirkung stromabwärts von ras auf demselben Signalweg hervorruft (Kolch et al., Nature 349: 426, 1991). Nach pharmazeutischer Selektion mit Hygromycin wurde die Massenpopulation von Zellen auf Agar angesetzt. Rat1/v-raf-Zellen, die N'- oder C'-GRB2-Mutanten exprimieren, verliehen der Anzahl von Kolonien in weichem Agar denselben Anstieg, wie die scheintransfizierten Kontroll-Zellen (Tabelle 4). Darüber hinaus wurde die Fähigkeit, auf weichem Agar zu wachsen im Falle von Zell-Linien nicht inhibiert, bei denen der exprimierte Überschuss von SH3-Mutanten mehr als das zweifache als der des endogenen Wild-Typ-GRB2-Proteins betrug. Diese Daten lassen darauf schließen, dass die GRB2-mutierten Proteine das BCR/ABL-Mitose-auslösende Signal durch Entkoppeln des Signalübermittlungsweges stromaufwärts von rafinhibieren. TABELLE 4

13. BEISPIEL; GRB2-MUTANTEN INHIBIEREN WACHSTUM DER MENSCHLICHEN Ph¹-POSITIVEN LEUKÄMIEZELL-LINIE K562. UND INDUZIEREN DEREN DIFFERENTIATION

In dem nachstehend aufgeführten Beispiel wird nachgewiesen, dass SH3-mutierte Grb2-Proteine nicht nur die Fähigkeit aufweisen, in haematopoietischen Zellen den BCR/ABL-induzierten oncogenen Phänotyp rückzuwandeln, sonder auch, dass derartige Mutanten in der Lage sind, das Auftreten von erythroider Spezialisierung von K562-Zellen zu ermöglichen.

13.1 MATERIAL UND VERFAHREN

Transformationstests. Weichagartests wurden, wie oben in Abschnitt 8.1.1 beschrieben, durchgeführt. Einheitliche Zahlen von lebensfähigen Zellen wurden auf weichem Agar mit Dichten im Bereich von 10³ bis 5 · 10&sup4; Zellen/6-cm²-Schale abhängig von der Klonierungseffizienz eines jeden Zelltyps verteilt. Die Proben wurden in doppelter Ausführung auf Nährmedium aufgebracht, das 20% fetales Kälberserum enthielt. Makroskopische Kolonien (> 0,4 mm) wurden nach 14 Tagen gezählt. Die Koloniezahlen wurden für eine Gesamtzahl von 10&sup4; Zellen angepasst.
Transkriptions-Aktivierungstest. Die Transkriptions- Aktivierung der Expression aus einem Ras-responsiven Element-(ets/AP-1)-Promoter wurde, wie bisher beschrieben, ausgeführt (Pendergast et al., 1993). Kurz gesagt, es wurden normale Rat1-Zellen und transformierte Rat1/BCR-ABL- Zellen, die die GRB2-Proteine exprimieren, mit 1 ug pB4x- CAT Reporterplasmid transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und auf ihre CAT- Aktivität, wie vorstehend in Abschnitt 9.1.1. beschrieben, getestet.
Bindungsversuche, in vitro-Autophosphorylation und Immunoblotting. Prozeduren für in vitro-Bindungstests, in vitro-Markierung mit [γ³²p]-ATP und Immunoblotting wurden, im Wesentlichen wie vorstehend in den Abschnitten 6.1.6 und 6.1.7 beschrieben, durchgeführt.
Hämoplobin-Protein-Erfassungen. Die Menge von Hämoglobin, das in Massenpopulationen von transfizierten K562-Zellen vorhanden war, wurde im Wesentlichen wie beschrieben erfasst (Feinstein, E. et al., 1992, Oncogene 7: 1853-1857). Kurz, es wurden aus jeder Zellpopulation Lysate hergestellt und die Gesamtmenge an Protein mittels des Bradford-Tests ermittelt. Für jede Probe wurden 20 ug des gesamten Zellproteins mit 1% Benzidinlösung in 90% Essigsäure und frisch zubereitetem Wasserstoffperoxid vermischt. Nach Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde 10% Essigsäure Lösung hinzugefügt, und die optische Dichte bei 515 nm ermittelt. Menschliches Hämoglobin wurde als Standard für den Vergleich herangezogen.
Tumorwachstumstest. Die tumorerzeugende Wirkung von Rat1/BCR-ABL Fibroblasten wurde im Wesentlichen wie beschrieben evaluiert (Lugo et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1263-1270). Kurz gesagt, es wurden 2 · 10&sup6; Zellen aus Massenpopulationen von Rat1/BCR-ABL-Fibroblasten mit dem Wild- Typ transfiziert, oder mutierte GRB2-Konstrukte in die linke hintere Flanke von Nacktmäusen inokuliert. Für eine interne Kontrolle wurde jede Maus zusätzlich mit Rat1/BCR- ABL-Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert waren, auf der rechten Hinterflanke inokuliert. Für jede Rat1/BCR- ABL-Zellpopulation wurden vier Mäuse evaluiert. Drei Wochen nach Inokulation wurden die Mäuse geopfert und die Größe der Tumoren auf den linken und rechten Flanken verglichen und als Feuchtgutmasse in Gramm registriert.

13.2 ERGEBNISSE

In den nachstehend beschriebenen Experimenten wurde evaluiert, ob die SH3-mutierten Proteine von GRB2 den BCR/ABL-induzierten oncogenen Phänotyp in haematopoietische Zellen möglicherweise rückwandeln können. Die GRB2-Konstrukte wurden in Ph¹-positive K562-Zellen eingeführt. Nach Transfektion und 48 Stunden Züchtung in Anwesenheit von Hygromycin wurden die Level von endogenen und transfizierten GRB2-Proteinen mittels Immunoblotting-Analyse erfasst. Gleichzeitig wurden die Zellen aus der flüssigen Kultur geerntet, und einheitliche Zahlen von lebensfähigen Zellen in weichem Agar angesetzt. In jedem der Versuche waren die Level der transfizierten GRB2-mutierten Proteine wenigstens fünfmal höher als diejenigen von endogenem GRB2. Kulturen, die mit K562-Zellen angesetzt waren, die daraufhin dN-GRB2- mutiertes Protein exprimierten, wiesen im Vergleich zu scheintransfizierten Kontrollproben 10-mal weniger Kolonien in weichem Agar auf (siehe oben, Tabelle 2). In Analogie zu den Beobachtungen im Falle der Rat1/BCR-ABL-Fibroblasten, ibhibierte die ΔC-GRB2-Mutante die K562-Koloniebildung ebenfalls, jedoch in geringerem Maße, als das ΔN-GRB2 (siehe oben, Tabelle 2). Diese Daten geben berechtigten Grund zur Annahme, dass BCR-ABL-induzierte Ras-Aktivierung, die durch GRB2 vermittelt ist, eine unentbehrliche Komponente für BCR-ABL-induzierte Krebserkrankungen bei Menschen darstellt.
Obwohl K562-Zell-Linien, die erhöhte Level von Wild- Typ-GRB2-Protein stabil exprimieren, in Kulturen gezüchtet werden können, war es bisher nicht möglich, klonale Zell- Linien zu errichten, die ΔN- oder ΔC-GRB2-Proteine exprimieren. K562-Zellen gewannen ihre Fähigkeit zu differenzieren und Hämoglobin zu synthetisieren zurück (Anderson L. C. et al., 1979, Int. J. Cancer 23: 143-147; Rowley, P. T. et al., 1981, Exp. Hematol. 9: 32-37; Feinstein, E. et al., 1992, Oncogene 7: 1853-1857). Bisherige Studien haben nachgewiesen, dass Medikamente, die Tyrosin-Kinase-Aktivität inhibieren, sich einsetzen lassen, um erythroide Differentiation von K562-Zellen zu ermöglichen (Fukazawa, H. et al., 1991, Biochem. Pharm, 42: 1661-1671; Anafi, M. et al., 1993, Blood 82: 3524-3529)
Um festzustellen, ob die Expression der GRB2-Mutanten einen ähnlichen Prozess der Differentiation ermöglicht, wurde ein Teil der transfizierten K562-Zellen, die in den weich-Agar-Tests verwendet wurden, lysiert und die Menge an Hämoglobin-Protein für jede der transfizierten Zellpopulationen ermittelt. Es wurde ein erheblicher Anstieg des Spiegel von Hämoglobin-Protein in Zellen beobachtet, die entweder die ΔN- oder ΔC-GRB2-Mutanten exprimieren. Im Gegensatz hierzu zeigten K562-Zellen, die erhöhte Level von Wild-Typ-GRB2-Protein exprimieren, im Vergleich zu scheintransfizierten Kontrollproben keinerlei Anstieg von Hämoglobin. D. h. die hierin verwendeten GRB2-Mutanten sind nicht nur in der Lage, den Phänotyp der BCR/ABL-Transformation rückzuwandeln, sondern auch erythroide Differenzierung in K562-Zellen zu ermöglichen. Diese Daten lassen annehmen, dass BCR-ABL haematopoietische Zellen teilweise durch Blockieren der normalen Differentiation auf eine von Ras abhängige Weise transformieren kann.

13. BEISPIEL: SCREENINGTEST FÜR DIE IDENTIFIZIERUNG VON VERBINDUNGEN, DIE PROTEIN/TYROSINE-KINASE-WECHSELWIRKUNGEN BLOCKIEREN

Das hierin vorgeführte Beispiel beschreibt ein Mittel, um für das Potential einer Prüfsubstanz abschätzen zu können, inwieweit diese die Wechselwirkung zwischen Bindungspartnerkomplexen inhibiert. Zu solchen Bindungspartnern können, beispielsweise Adaptorproteine und Moleküle zählen, die an derartige Adaptorproteine binden, wie z. B. aktivierte Tyrosin-Kinase-Moleküle und sonstige Proteine, wie beispielsweise das SHC-Protein. Die hierin identifizierten Verbindungen sind möglicherweise in der Lage, die Kontrolle des Wachstums der Zelle zu modulieren, und können ferner fähig sein, Oncogenese und zellproliferative Störungen zu steuern.
In dem speziellen, hierin beschriebenen Test, wird ein Adaptor-GST-Fusionsprotein, das in der Lage ist, an ein phosphoryliertes Tyrosin-Kinase-Protein zu binden, mit dem phosphorylierten Tyrosin-Kinase-Protein, das auf einer festen Phase immobilisiert wurde, in Anwesenheit einer Prüfsubstanz inkubiert. Wenn die Prüfsubstanz fähig ist, die Wechselwirkung zwischen dem Adaptor-Protein-GST-Fusionsprotein und dem Tyrosin-Kinase-Molekül zu inhibieren, verursacht sie im Verhältnis zu der Menge an Adaptor-GST-Fusionsprotein, das an das Tyrosin-Kinase-Molekül ohne die Anwesenheit des Prüfstoffs gebunden wird, einen nachweisbaren Rückgang des Adaptor-GST-Fusionsproteins, das an das irnobilisierte Tyrosin-Kinase-Molekül gebunden ist.
Dieses Beispiel wird im Einzelnen anhand des Screenens von Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen GRB-2 und EGF-R dargestellt. Dasselbe Prinzip lässt sich allerdings auf die Detektion von Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen beliebigen Tyrosin-Kinase-Protein- oder Tyrosin-phosphorylierten Substraten von Tyrosin-Kinasen (z. B. SHC, Phosphatase 1D) und beliebiges Adaptor-Protein anwenden, mit dem es interagiert.
Adaptor-GST-Fusionsprotein: Die hierin verwendeten Adaptor-GST-(Glutathion-S-Transferase)-Fusionsproteine stellten GRB-2-GST-Fusionsproteine dar, die durch Expression in E.coli hergestellt wurden, die mit GRB-2/pGEX-Konstrukten transformiert waren. Die GRB-2-Abschnitte dieser Fusionsproteine bestanden lediglich aus der SH2-Domäne des GRB-2-Proteins. Die transformierten Zellen werden in mit Ampicillin ergänzter Luria-Nährlösung (LB) gezüchtet. Nach Erreichen einer optischen Dichte (OD) von 0,3 bei 600 nm, werden die Zellen für 6 Stunden mit Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert, um das Fusionsprotein zu exprimieren.
Nach der Expressionsperiode von 6 Stunden werden die Zellen ausgefällt, mit 10.000 g für 10 Minuten bei 4ºC pelletiert, gespült und in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert. Anschließend werden die Zellen durch Ultraschall (6 Pulse, 5 Sekunden pro Puls) lysiert. Nicht lösliches Material wird durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 4ºC mit 10.000 g entfernt, und der Supernatant wird über eine Glutathion-Sepharose-Säule geleitet. Das gebundene GRB-2-GST-Fusionsprotein wird mit 5 mM reduziertem Glutathion aus der Säule eluiert, anschließend gegen PBS dialysiert.
Immobilisiertes Tyrosin-Kinase-Molekül: Das hierin verwendete Tyrosin-Kinase-Molekül stellt die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (EGF-R) dar. EGF-R wird aus Zellen isoliert, die EGF-R überexprimieren, wie z. B. die A431-(ATCC CRL 1551)-Zell-Linie. Die Zellen werden in HNTG-Puffer (20 mM Hepes/HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, 5% Glyzerin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mg/L Aprotonin, 1 mg/L Leupeptin, 10 mg/L Benzamidin) lysiert.
EGF-R-Protein wird aus den Zell-Lysaten durch Immobilisierung auf Mikrotitrationsplatten, wie nachstehend beschrieben, isoliert. EGF-R wird anschließend, wie weiter unten erläutert, in vitro phosphoryliert.
Das EGF-R-Molekül wird auf Mikrotitrationsplatten immobilisiert. Die Mikrotitrationsplatten werden präpariert, indem zunächst die Tüpfel der Platte, über Nacht bei 4ºC, mit einem anti-EGF-R-monoklonalen Antikörper, der gegen die extrazelluläre Domäne von EGFR (UBI, #05-101) gerichtet ist, beschichtet werden, und zwar in einer Konzentration von 0,5 ug (in PBS) pro Mikrotitertüpfel, bei einem Endvolumen von 150 ul pro Tüpfel.
Nach der über Nacht erfolgten Beschichtung wird die Beschichtungslösung von den Mikrotitrationstüpfeln entfernt, und für 30 Minuten bei Raumtemperatur durch einen Blocker-Puffer (5% Trockenmilchpulver in PBS) ersetzt, wonach der Blocker-Puffer entfernt wird, und die Tüpfel 4-mal mit TBST-Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,2, 0,1% Triton X-100) gespült werden.
Das Zell-Lysat aus EGF-R-exprimierenden Zellen wird jedem Tüpfel in 150 ul PBS hinzugefügt und 30 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundenes EGF-R wird durch 5-faches Spülen der Tüpfel mit TBST-Puffer entfernt. Etwa 50-100 ng EGF-R-Protein werden pro Tüpfel gebunden.
Es ist wichtig eine EGF-R-überexprimierende Zell-Linie zu verwenden, die eine hohe endogene Phosphatase-Aktivität aufweist, wie beispielsweise die Zell-Linie A431. Der Grund hierfür liegt darin, dass die Phosphatasen während der Lyse und Inkubation mit dem immobilisierten Antikörper Phosphat- Gruppen aus den EGF-R-Molekülen abspalten, und auf diese Weise endogene Adaptorproteine, wie z. B. GRB-Proteine, daran hindern, EGFR zu binden, was möglicherweise zu irreführenden Ergebnissen führen könnte. Außerdem könnten die Zellen vor der Lyse bereits verhungert sein, falls die verwendete Zell-Linie leicht verhungert.
Herstellung von autophosphoryliertem EGF-R: Die folgende in vitro-Kinase-Reaktion brachte autophosphoryliertes EGF-R hervor. Die Kinase-Reaktion wurde durch Hinzufügen von 15 ul ATP/Mn²&spplus;-Mischung (in 50 mM MnCl&sub2;, Endkonzentration von 10 pH ATP, für ein Gesamtvolumen von 150 ul in Gang gesetzt. Die Platte wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, der Supernatant wurde abgesaugt, und die Platten wurden anschließend Smal mit TBST gespült.
Testprozedur: Entweder 30 ng GRB-2-GST Fusionsproteine (d. h. EGF-R und GRB-2-Proteine im Verhältnis 1 : 1) oder 5 ng GRB-2-GST-Fusionsproteine (d. h. EGF-R:GRB-2-Proteine im Verhältnis 4 : 1) werden in Inkubationspuffer (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert 6,5) für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Anwesenheit einer in Dimethylsulfat gelösten Prüfsubstanz (DMSO) den phosphorylierten, mit EGF-R beschichteten Mikrotitrationstüpfeln zugeführt. Kontrolltüpfel werden in Abwesenheit der Prüfsubstanz mit GRB-2- GST-Fusionsproteinen inkubiert.
Nach Inkubation werden die Tüpfel gründlich mit TBST gespült. Vorzugsweise wird dann die Menge an GRB-2-GST-Fusionsprotein, das an das immobilisierte EGF-R gebunden hat, mittels eines gereinigten Kaninchen-Antiserums gegen den GST-Anteil des Fusionsproteins (AMRAD, New Victoria, Australia; Bestnr. 00001605) ermittelt. Die Inkubationen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Inkubation wird der Antikörper entfernt und die Tüpfel werden gründlich mit TBST gespült. Für die Visualisierung werden die Tüpfel als nächstes bei Raumtemperatur 30 Minuten mit einem Ziege-anti-Kaninchen-Peroxidase-Antikörper von TAGO inkubiert. Nach der Inkubation werden die Antikörper entfernt, die Tüpfel zunächst mit Leitungswasser und danach mit TBST gespült. Die Substratlösung ABTS (2,2'-Azinobis(3- Ethylbenzthiazolinsulfonsäure) /H&sub2;O&sub2; (1,2 ul H&sub2;O&sub2; zu 10 ml ABTS) wird auf die Tüpfel aufgetragen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5NH&sub2;SO&sub4; angehalten. Die optische Dichte bei 410 nm wird für jedes Tüpfel ermittelt. Durch Einsatz dieser Technik ist es möglich, sogar Mengen von nur 2 ng GRB-2-GST über dem Hintergrund zu erfassen.
Alternativ können, nach der Inkubation der Prüfsubstanz und des GRB-2-GST-Fusionsproteins in den EGF-R-Tüpfeln, biotinylierte monoklonale Antikörper, beispielsweise EL-6 oder EL-12, verwendet werden, um die Bindung von Fusionsprotein zu testen. Die Epitope, die durch derartige Antikörper erkannt werden, sind auf der SH2-Domäne von GRB- 2 kartiert, stören jedoch nicht die Bindung von GRB-2 an phosphoryliertes EGFR. Die Bindung dieser Antikörper wird anschließend mittels eines Streptavidin-biotinylierten Meerrettichperoxidase-Reaktanten erfasst.
Darüber hinaus kann, nach Inkubation der Prüfsubstanz und des GRB-2-GST-Fusionsproteins in den EGF-R-Tüpfel, die Bindung des Fusionsproteins an das imxnobilisierte EGFR mittels Inkubierung mit 1 mM 1-Chloro-2,4- Dinitrobenzol (CDNB) und 1,54 mg/ml reduziertem Glutathion in Inkubationspuffer getestet werden. Die OD (optische Dichte) wird anschließend bei 340 nm gemessen. Diese Reaktion verläuft bis zu einer OD von 1,0 linear, und lässt sich mit konkurrierenden GST-Inhibitoren anhalten, wie in Mannervik und Danielson beschrieben (Mannervik, B. und Danielson, U. H., 1988, CRC Critical Reviews in Biochemistry 23: 238).
Die speziellen Ausführungsbeispiele, die vorstehend hierin beschrieben wurden, sind lediglich als Beispiele aufgeführt, und die Erfindung wird ausschließlich im Sinne der beigefügten Ansprüche beschränkt.

Claims

1. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die auf die Fähigkeit getestet wird, eine zellproliferative Störung modulieren zu können, an der ein Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, wobei zu dem Verfahren die Schritte gehören:

(a) es wird wenigstens eine Verbindung einem Peptid, das einen funktionalen Abschnitt eines Elementes des Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes enthält, über eine ausreichend große Zeitspanne ausgesetzt, um die Bindung der Verbindung an den funktionalen Abschnitt des Elementes zu ermöglichen;

(b) nicht gebundene Verbindungen werden entfernt; und

(c) die Anwesenheit der Verbindung, die an den funktionalen Abschnitt des Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes gebunden ist, wird ermittelt, wodurch eine Verbindung identifiziert wird, die daraufhin getestet wird, ob sie in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren.

2. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplex beteiligt ist, zu modulieren, wobei es zu dem Verfahren gehört, dass die Verbindung einem Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex für eine ausreichende Zeitspanne ausgesetzt wird, um ein Aufbrechen des Komplexes sowie die Feststellung zu ermöglichen, dass der Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplex aufgebrochen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein Transmenbran- Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid eines Rezeptors ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das intrazelluläre, cytoplastische Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid vom Typ BCR/ABL ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein intrazelluläres Tyrosin-Nukleo-Proteinkinase-Polypeptid ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Adaptor-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein GRB-Polypeptid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das GRB-Polypeptid ein GRB-2-Polypeptid ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das GRB-Polypeptid ein GRB-1-, GRB-4-, GRB-7-, oder GRB-10-Polypeptid ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein BCR/ABL intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Typs BCR/ABL ist, und das Adaptor-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein GRB-2-Polypeptid ist, so dass der Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex ein BCR/ABL-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexes gehört, ein Peptid enthält, das wenigstens 1 phosphorylierten Tyrosin-Aminosäurerest aufweist.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer Phosphorylisierungsdomäne enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer SH2- Domäne enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer SH3- Domäne enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexes gehört, wenigstens 4 aufeinander folgende Aminosäurereste einer SH2-bindenden Domäne enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer SH3- bindenden Domäne enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der funktionale Abschnitt einer SH3-Bindungsdomäne wenigstens eine Länge von 4 Aminosäureresten aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der funktionale Abschnitt einer SH3-Bindendungsdomäne wenigstens 10 Aminosäurereste lang ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die identifizierte Verbindung ferner in der Lage ist, einen Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex aufzubrechen.

20. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Verbindung, die in der Lage ist, einen Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex aufzubrechen, weiter fähig ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die identifizierte Verbindung ferner in der Lage ist, einen BCR/ABL- Polypeptid/GRB-2-Polypeptid-Komplex aufzubrechen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Verbindung, die fähig ist, einen BCR/ABL/GRB-2-Polypeptid/GRB-2- Polypeptid-Komplex aufzubrechen, ferner in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein BCR/ABL- Polypeptid/GRB-2-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die zellproliferative Störung eine chronische myelogene Leukämie ist.

24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die zellproliferative Störung eine akute lymphozytische Leukämie ist.

25. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die zellproliferative Störung eine akute myelogene Leukämie ist.

26. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, um zu testen, ob diese in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinphosphatase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren, wobei zu dem Verfahren die Schritte gehören:

(a) wenigstens eine Verbindung wird einem Peptid, das einen funktionalen Abschnitt eines Elementes des Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes enthält, ausreichend lange ausgesetzt, um der Verbindung Zeit zu gewähren, an den funktionalen Abschnitt des Elementes zu binden;

(b) nicht gebundene Verbindungen werden entfernt; und

(c) die Anwesenheit der Verbindung, die an den funktionalen Abschnitt des Elementes des Tyrosin-Proteinphosphatase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes gebunden ist, wird ermittelt, wodurch eine Verbindung identifiziert wird, die daraufhin getestet wird, ob sie in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren.

27. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren, wobei zu dem Verfahren gehört, dass die Verbindung ausreichend lange einem Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplex ausgesetzt wird, um ein Aufbrechen des Komplexes, und eine Erkennung des Aufbrechens des Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes zu ermöglichen.

28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Tyrosin-Protein-Phosphatase-Polypeptid des Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Protein-Phosphatase-Polypeptid ist.

29. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Tyrosin-Protein-Phosphatase-Polypeptid des Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Protein- Phosphatase-Polypeptid ist.

30. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Adaptor-Polypeptid des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein GRB-Polypeptid ist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das GRB-Polypeptid ein GRB-2-Polypeptid ist.

32. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das GRB-Polypeptid ein GRB-1-, GRB-4-, GRB-7-, oder GRB-10-Polypeptid ist.

33. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplexes gehört, ein Peptid enthält, das wenigstens 1 phosphorylierten Aminosäurerest aufweist.

34. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer SH2-Domäne enthält.

35. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer SH3-Domäne enthält.

36. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplexes gehört, wenigstens 4 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer SH2-bindenden Domäne enthält.

37. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem das Peptid, zu dem ein funktionaler Abschnitt eines Elementes des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplexes gehört, einen funktionalen Abschnitt einer SH3-bindenden Domäne enthält.

38. Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der funktionale Abschnitt einer SH3-bindenden Domäne ein Länge von wenigstens 4 Aminosäureresten aufweist.

39. Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der funktionale Abschnitt einer SH3-bindenden Domäne wenigstens 10 Aminosäurereste lang ist.

40. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die darauf zu testen ist, ob diese in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Transmembran- Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren, wobei zu dem Verfahren die Schritte gehören:

(a) die Verbindung wird mit einer Zelle zusammengebracht, die in der Lage ist, einen Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex für eine ausreichende Zeitspanne zu bilden, um der Verbindung zu ermöglichen, an das Rezeptor-Tyrosin-Proteinlcinase-Polypeptid des Rezeptor- Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes zu binden;

(b) die Menge an Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/- Adaptor-Polypeptid-Komplexen, die in der Zelle des Schrittes (a) vorhanden ist, wird ermittelt;

(c) die Menge an Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/- Adaptor-Polypeptid-Komplexen, die in einer Zelle des Typs in Schritt (a) vorhanden ist, die nicht mit der Verbindung gebunden hat, wird ermittelt; und

(d) die in Schritt (b) ermittelte Menge an Rezeptor- Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexen wird mit der in Schritt (c) ermittelten Menge verglichen, so dass, falls die in Schritt (c) ermittelte Menge höher ist, als die in Schritt. (b) ermittelte Menge, eine Verbindung identifiziert ist, die daraufhin getestet ist, ob sie in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor- Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren.

41. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die auf eine Fähigkeit zu testen ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Transmembran-Rezeptor-Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren, wobei zu dem Verfahren die Schritte gehören:

(a) die Verbindung wird mit einer Zelle, die in der Lage ist, einen Rezeptor-Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex zu bilden, für eine ausreichende Zeitspanne zusammen gebracht, um der Verbindung zu ermöglichen, an das Rezeptor-Tyrosin-Protein-Phosphatase-Polypeptid des Rezeptor-Tyrosin-Proteinphosphatase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes zu binden;

(b) die Menge an Rezeptor-Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexen wird ermittelt, die in der Zelle von Schritt (a) vorhanden ist;

(c) die Menge an Rezeptor-Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexen, die in einer Zelle des Typs in Schritt (a) vorhanden ist, die nicht mit der Verbindung gebunden hat, wird ermittelt; und

(d) die in Schritt (b) ermittelte Menge an Rezeptor- Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid- Komplexen wird mit der Menge verglichen, die in Schritt (c) ermittelt wurde, so dass, falls die in Schritt (c) ermittelte Menge höher ist, als die in Schritt (b) festgestellte Menge, eine Verbindung identifiziert ist, die daraufhin getestet ist, ob sie in der Lage ist, eine zellproliferative Störung, an der ein Rezeptor-Tyrosin-Proteinphosphatase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, zu modulieren.

42. Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, bei dem das Adaptor-Polypeptid ein GRB-Polypeptid ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem das GRB-Polypeptid ein GRB-2-Polypeptid ist.

44. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem das GRB-Polypeptid ein GRB-1-, GRB-4-, GRB-7-, oder GRB-10-Polypeptid ist.

45. Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, wobei die Verbindung in ausreichender Menge Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexe aufbricht, wenn sie mit einer Zelle zusammengebracht wird, die in der Lage ist, Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexe zu bilden.

46. Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex in einem Säuger beteiligt ist, wobei die Verbindung in ausreichender Menge Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexe aufbricht.

47. Verwendung von Anspruch 45 oder 46, bei der das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein Transmembran- Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid ist.

48. Verwendung von Anspruch 45 oder 46, bei der das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid ist.

49. Verwendung von Anspruch 48, bei der das intrazelluläre cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid des Typs BCR/ABL ist.

50. Verwendung von Anspruch 45 oder 46, bei der das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypepticl-Komplexes ein intrazelluläres Tyrosin-Nukleo-Proteinkinase-Polypeptid ist.

51. Verwendung von Anspruch 45 oder 46, bei der der Adaptor des Polypeptids des Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein GRB-Polypeptid ist.

52. Verwendung von Anspruch 51, bei der das GRB-Polypeptid ein GRB-2-Polypeptid ist.

53. Verwendung von Anspruch 51, bei der das GRB-Polypeptid ein GRB-1-, GRB-4-, GRB-7-, oder GRB-10-Polypeptid ist.

54. Verwendung von Anspruch 45 oder 46, bei der das Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid des Typs BCR/ABL ist, und das Adaptor-Polypeptid des Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein GRB-2-Polypeptid ist, so dass der Tyrosin-Proteinkinase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex ein BCR/ABL- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex ist.

55. Verwendung von Anspruch 54, bei der die behandelte zellproliferative Störung ein chronische myelogene Leukämie ist.

56. Verwendung von Anspruch 54, bei der die behandelte zellproliferative Störung eine akute lymphozytische Leukämie ist.

57. Verwendung von Anspruch 54, bei der die behandelte zellproliferative Störung eine akute myelogene Leukämie ist.

58. Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex beteiligt ist, wobei die Verbindung in ausreichender Menge Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexe aufbricht, wenn sie mit einer Zelle zusammengebracht wird, die in der Lage ist, einen Tyrosin-Proteinphosphatase- Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex zu bilden.

59. Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer zellproliferative Störung, an der ein Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplex in einem Säuger beteiligt ist, wobei die Verbindung in ausreichender Menge Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexe aufbricht.

60. Verwendung von Anspruch 58 oder 59, bei der das Tyrosin-Protein-Phosphatase-F'olypeptid des Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypepticl/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Protein-Phosphatase-Polypeptid ist.

61. Verwendung von Anspruch 58 oder 59, bei der das Tyrosin-Protein-Phosphatase-Polypeptid des Tyrosin- Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein intrazelluläres cytoplastisches Tyrosin-Protein- Phosphatase-Polypeptid ist.

62. Verwendung Von Anspruch 58 oder 59, bei der das Adaptor-Polypeptid des Tyrosin-Proteinphosphatase-Polypeptid/Adaptor-Polypeptid-Komplexes ein GRB-Polypeptid ist.

63. Verwendung von Anspruch 62, bei der das GRB-Polypeptid ein GRS-2-Polypeptid ist.

64. Verwendung von Anspruch 58 oder 59, bei der das GRB-Polypeptid ein GRB-1-, GRB-4-, GRB-7-, oder GRS-10-Polypeptid ist.

65. Isolierter BCR/ABL-Polypeptid/GRB-2-Adaptor- Polypeptid-Komplex.

66. Test zum Identifizieren eines Stoffes, der die spezifische Wechselwirkung zwischen einem ersten Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid-Bindungspartnermolekül und einem zweiten Adaptor-Polypeptid-Bindungspartnermolekül inhibiert, wobei zu dem Test die Schritte gehören:

(a) ein Protein oder Peptid, das eine Aminosäurefolge aufweist, die einer Bindungsdomäne eines ersten Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid-Bindungspartnermoleküls entspricht, wird mit einem Protein oder Peptid, das eine Aminosäurefolge enthält, die einer Bindungsdomäne des zweiten Adaptor-Polypeptid-Bindungspartnermoleküls entspricht, zusammengebracht, und zwar unter Bedingungen und für eine ausreichende Zeitspanne, um in Anwesenheit einer Prüfsubstanz die Bindung des ersten Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptids und des zweiten Adaptor-Polypeptid-Bindungspartner und die Bildung eines Bindungspartnermolekülkomplexes zu ermöglichen; und

(b) die Komplexbildung wird durch die Fähigkeit des Prüfstoffes, nämlich die Wechselwirkung zwischen dem ersten Tyrosin-Protelnkinase-Polypeptid-Bindungspartner und dem zweiten Adaptor-Polypeptid-Bindungspartner zu inhibieren, anhand eines angezeigten Rückgangs der Komplexbildung im Vergleich zu der Menge von Komplexen, die ohne den Prüfstoff gebildet wurde, ermittelt.

67. Test nach Anspruch 66, bei dem die Bindungsdomäne des ersten Tyrosin-Proteinkinase-Polypeptid-Bindungspartnermoleküls eine SH2-Bindungsdomäne ist, und die Bindungsdomäne des zweiten Adaptor-Polypeptid-Bindungspartnermolekül eine SH2-Domäne ist.

68. Test nach Anspruch 66, bei dem der erste Tyrosin- Proteinkinase-Polypeptid-Bindungspartner ein aktiviertes Tyrosin-Kinase-Molekül ist.

69. Test gemäß Anspruch 68, bei dem das aktivierte Tyrosin-Kinase-Molekül ein aktiviertes BCR-ABL-Molekül ist und das Adaptor-Protein-Molekül ein GRS-2-Molekül ist.

70. Test gemäß Anspruch 66, bei dem das eine Bindungspartnermolekül des Komplexes immobilisiert ist, und das andere Bindungspartnermolekül mit einer signalerzeugenden Verbindung markiert ist.

71. Test gemäß Anspruch 70, bei dem das eine Bindungspartnermolekül des Komplexes vor Durchführung des Schrittes (a) immobilisiert wird, so dass das Zusammenbringen in Schritt (a) in einer fest-flüssigen Phase abläuft.