DE60123041T2

DE60123041T2 - Entzündungshemmende verbindungen und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60123041T2
Application number: DE60123041T
Authority: DE
Inventors: J. Michael Narberth MAY; Sankar Madison GHOSH
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2000-05-02
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2021-05-03
Also published as: EP1280820B1; US6864355B1; WO2001083547A2; US20110160119A1; AU6116401A; US20090286736A1; JP2012100663A; JP2003531918A; JP2003531636A; US20120101028A1; US8017726B2; JP2013056876A; EP1280820A2; WO2001083554A2; EP1282643B1; US20050143302A1; AR031696A1; EP1829888A1; WO2001083554A3; US8217138B2

Description

Unterstützung durch die US-Regierung
Diese Arbeit wurde mit einem Zuschuss des National Institute of Health (AI33443) unterstützt.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur selektiven Inhibierung der Cytokin-vermittelten NF-κB-Aktivierung durch Blockieren der Interaktion von NEMO mit IκB-Kinase-β (IKKβ) an der NEMO-Bindungsdomäne (NBD). Die Blockade der IKKβ-NEMO-Interaktion führt zur Inhibierung der IKKβ-Kinaseaktivierung und zur anschließenden verringerten Phosphorylierung von IκB. Die Phosphorylierung von IκB ist ein wesentlicher Schritt der Cytokin-vermittelten NF-κB-Aktivierung.
Hintergrund der Erfindung
NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, der extrazelluläre Signale vermittelt, die für die Induktion von an entzündungsfördernden Reaktionen beteiligten Genen verantwortlich sind (Baltimore et al., (1998) US-Patent Nr. 5,804,374). NF-κB ist im Cytoplasma der meisten nicht-stimulierten Zellen durch eine nicht-kovalente Interaktion mit einem von mehreren inhibierenden Proteinen verankert, die als IκBs bekannt sind (May & Ghosh, (1997) Semin. Cancer. Biol. 8, 63–73; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80–88; Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225–260). Zelluläre Stimuli, die mit entzündungsfördernden Reaktionen verbunden sind, wie TNFα, aktivieren Kinasen, die wiederum NF-κB durch Phosphorylierung von IκBs aktivieren. Die Kinasen, die IκBs phosphorylieren, werden als IκB-Kinasen (IKKs) bezeichnet.
Die Phosphorylierung zielt auf IκBs zur Ubiquinierung und Degradation ab. Die Degradation und anschließende Dissoziation von IκBs aus NF-κB zeigt das nukleäre Lokalisationssignal auf NF-κB, was zur nuklearen Translokation von aktivem NF-κB und damit zur Hochregulierung von Genen führt, die auf NF-κB ansprechen (May & Ghosh, (1997) Semin. Cancer. Biol. 8, 63–73; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80–88; Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225–260; Siebenlist et al., (1994) Annu. Rev. Cell Biol. 12, 405–455). Die Phosphorylierung von IκBs ist daher ein wesentilcher Schritt zur Regulierung von NF-κB-vermittelten, entzündungsfördernden Reaktionen.
Die Identifizierung und Charakterisierung von Kinasen, die IκBs phosphorylieren, führte zu einem besseren Verständnis der Signalwege, an denen die NF-κB-Aktivierung beteiligt ist. Bisher wurden mehrere verschiedene Subtypen von IKK identifiziert. IKKα wurde zunächst als eine IκB-Kinase identifiziert, die durch TNFα-Stimulierung in HeLa-Zellen induziert wird (DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548–554). Eine weitere IκB-Kinase, die homolog zu IKKα ist, wurde identifiziert, als IKKβ bezeichnet und als die wichtigste IκB-Kinase bestimmt, die nach einer TNFα-Stimulierung induziert wird (Takeda et al., (1999) Science 284, 313–316; Hu et al., (1999) Science 284, 316–320; Li et al., (1999) Science 284, 321–325; Pot et al., (2000) US-Patent Nr. 6,030,834; Woronicz & Goeddel (1999), US-Patent Nr. 5,939,302). IKKα und IKKβ haben eine Gesamthomologie von 52% und eine Homologie von 65% in der Kinasedomäne (Zandi et al., (1997) Cell 91, 243–252).
IκB-Proteinkinasen (IKKs) phosphorylieren IκBs an spezifischen Serinresten. Beispielsweise phosphorylieren sie spezifisch die Serine 32 und 36 von IκBα (Traenckner et al., (1995) EMBO J. 14, 2876–2883; DiDonato et al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 1295–1304). Die Phosphorylierung beider Stellen ist erforderlich, um wirksam auf IκBα zur Degradation zu zielen. Ferner erfolgt die Aktivierung von IKKα und IKKβ üblicherweise als Reaktion auf NF-κB-aktivierende Agenzien, und Mutanten von IKKα sowie IKKβ, die katalytisch inaktiv sind, können verwendet werden, um die NF-κB-Stimulierung durch Cytokine, wie TNFα und IL-1, zu blockieren (Régnier et al., (1997) Cell 90, 373–383; Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313). IκB-Proteinkinasen sind daher wesentlich für die Regulierung der NF-κB-Aktivierungsprozesse.
IKKα und IKKβ haben unterschiedliche Strukturmotive, einschließlich einer aminoterminalen Serin-Threonin-Kinasedomäne, die von einer Carboxyl-proximalen Helix-Schleife-Helix(H-L-H)-Domäne durch eine Leukin-Zipper-Domäne getrennt ist. Diese Strukturmerkmale unterscheiden sich von anderen Kinasen, und die nicht-katalytischen Domänen sind vermutlich an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt. Proteine, die an IKKs binden, können daher in der Lage sein, die Aktivität von NF-κB (Marcu et al., (1999) US-Patent Nr. 5,972,655) und potentiell solche stromabwärtigen Ereignisse wie die Induktion von NF-κB zu regulieren. Beispielsweise wurde NEMO (NF-κB-essentieller Modulator) als ein Protein identifiziert, das an IKKs bindet und die Kinaseaktivität erleichtert (Yamaoke et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 287–300; Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Haraj & Sun, (1999) J. Biol. Chem. 274, 22911–22914; Jin & Jeang, (1999) J. Biomed. Sci. 6, 115–120).
Eine Entzündung ist als die Reaktion von vaskularisiertem, lebendem Gewebe auf eine Verletzung definiert. Eine Entzündung ist an sich ein fundamentaler, stereotypisierter Komplex cytologischer und chemischer Reaktionen betroffener Blutgefäße und benachbarten Gewebes als Antwort auf eine Verletzung oder eine anormale Stimulation, die durch ein physikalisches, chemisches oder biologisches Agens verursacht ist. Eine Entzündung führt üblicherweise zur Ansammlung von Fluid und Blutzellen an der Verletzungsstelle und ist üblicherweise ein Heilungsprozess. Manchmal verursacht eine Entzündung jedoch Schaden, üblicherweise durch eine Dysfunktion des normalen Fortgangs der Entzündung. Entzündliche Erkrankungen sind solche, die zu einer Entzündung gehören, durch sie gekennzeichnet sind, sie verursachen, von ihr herrühren oder durch sie beeinflusst werden. Beispiele für entzündliche Erkrankungen oder Störungen umfassen ohne Einschränkung Asthma, Lungenentzündung, chronische Granulomatosen, wie Tuberkulose, Lepra, Sarkoidose und Silikose, Nephritis, Amyloidose, rheumatoide Arthritis, Spondylitis ankylosans, chronische Bronchitis, Skleroderma, Lupus, Polymyositis, Appendizitis, entzündliche Darmkrankheit, Geschwüre, Sjögren-Syndrom, Reiter-Syndrom, Psoriasis, Beckenentzündung, Orbitaentzündung, thrombotische Erkrankungen und unangemessene allergische Reaktionen auf Umweltreize, wie Giftefeu, Pollen, Insektenstiche und gewisse Lebensmittel, einschließlich atopischer Dermatitis und Kontaktdermatitis.
Entzündliche Erkrankungen stellen ein weltweites Problem dar. Studien des Krankheitsausmaßes bestätigten, daß Tuberkulose weltweit zu den 10 häufigsten Todesursachen zählt. Asthma betrifft 5% der Erwachsenenbevölkerung und 10–15% der Bevölkerung bei Kindern (Armetti und Nicosia (1999) Boll Chim. Farm. 138(11): 599). Asthma ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die mit einer weit verbreiteten, aber veränderlichen Einschränkung der Luftzufuhr verbunden ist.
Die Sepsis ist wiederum eine weitere Entzündungsstörung, die durch das Vorliegen verschiedener eiterbildender und anderer pathogener Mikroben oder ihrer Toxine im Blut oder Gewebe eines Subjektes verursacht wird. Die Sepsis ist durch eine systemische entzündliche Reaktion auf bakterielle Produkte während einer Infektion gekennzeichnet. Die Symptome einer Sepsis, wie Fieber, sind zumindest teilweise durch die entzündliche Reaktion des Körpers auf das infizierende Agens verursacht.
Daher besteht noch immer ein großer Bedarf an Verbindungen, die zur Behandlung entzündlicher Störungen brauchbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt entzündungshemmende Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und Verfahren zu deren Verwendung für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen bereit. Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Identifizierung der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) auf IκB-Kinase-α (IKKα) und auf IκB-Kinase-β (IKKβ).
Daher stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt entzündungshemmende Verbindungen bereit, die eine NEMO-Bindungsdomäne (NBD) aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung entzündungshemmende Verbindungen bereit, die Fusionen einer NEMO-Bindungsdomäne und mindestens eine Membrantranslokationsdomäne aufweisen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform erleichtert die Membrantranslokationsdomäne die Membrantranslokation der erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen in vivo. Die Membrantranslokationsdomäne kann beispielsweise die dritte Helix der Antennapedia-Homeodomäne oder das HIV-1 Tat-Protein sein. Bei einer Ausführungsform ist die NEMO-Bindungsdomäne ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr.: 2, 4,5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 dargestellten Sequenz.
Bei einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung entzündungshemmende Verbindungen bereit, die umfassen: (a) Peptide, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 enthalten oder daraus bestehen, und (b) Peptide, die einen konservativen Aminosäureaustausch der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID Nr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 enthalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen umfassen, z. B. pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten.
Gemäß einem wiederum weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer entzündlichen Störung, z. B. Asthma, Lungenentzündung oder Krebs, in einem Subjekt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer oder mehrerer erfindungsgemäßer entzündungshemmender Verbindungen an das Subjekt. Ohne sich auf einen Mechanismus beschränken zu wollen, wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen (direkt oder indirekt) dadurch wirken können, dass sie die Rekrutierung von Leukozyten in akute und chronische Entzündungsstellen blockieren, indem sie die Expression von E-Selektin auf Leukozyten herunterregulieren, oder indem sie die Differenzierung von Osteoklasten blockieren.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren der NF-κB-abhängigen Zielgenexpression, z. B. der E-Selektin-Expression, in einer Zelle bereit. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer entzündungshemmenden Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, um dadurch die NF-κB-abhängige Zielgenexpression in einer Zelle zu inhibieren.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Inhibieren der NF-κB-Induktion (z. B. der IKKα- und/oder IKKβ-abhängigen Induktion) in einer Zelle durch In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge einer entzündungshemmenden Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, wodurch die NF-κB-Induktion in einer Zelle inhibiert wird. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung nutzen solche Verfahren entzündungshemmende Verbindungen, die mindestens eine Membrantranslokationsdomäne aufweisen. Gemäß noch einer weiteren spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung umfassen die entzündungshemmenden Verbindungen, die bei diesen Verfahren eingesetzt werden, Aminosäuresequenzen mit den Sequenzen der SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 11, 12, 16, 17 oder 18.
Ein besonderer Vorteil der entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie zwar die NF-IκB-Induktion über IKK blockieren, die basale Aktivität von NF-κB aber nicht inhibieren.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen.
Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass NEMO mit dem COOH-Terminus von IKKβ interagiert. (A) GST alleine oder GST-NEMO wurden aus bakteriellen Lysaten unter Verwendung von Glutathion-Agarose präzipitiert, mit SDS-PAGE (10%) getrennt, und das Gel wurde mit Coomassie-Blau eingefärbt (linkes Bild). In anschließenden GST-Pulldown-Experimenten wurden gleiche Mengen GST oder GST-NEMO verwendet. Das im rechten Bild gezeigte Schema stellt die COOH- und NH2-terminalen Trunkationsmutanten von IKKβ dar, die zur Bestimmung der Region der NEMO-Interaktion verwendet werden. (B) IKKβ-Mutanten wurden kloniert, durch in vitro-Translation (Input; linke Tafel) exprimiert und für GST-Pulldown verwendet (rechtes Bild). (C) Wildtyp-IKKβ und IKKβ-(644-756) wurden in vitro translatiert (linkes Bild) und für eine GST-Pulldown-Analyse verwendet (linkes Bild). (D) HeLa-Zellen wurden vorübergehend entweder mit Vektor alleine oder mit steigenden Konzentrationen (0,25, 0,5, 1,0 μg/ml) des xpress-markierten IKKβ-(644-756)-Konstruktes zusammen mit dem pBIIX-Luciferase-Reporterplasmid transfiziert. Nach achtundvierzig Stunden wurden die Zellen entweder mit TNFα (10 ng/ml) oder mit IL-1β (10 ng/ml) vier Stunden behandelt, und anschließend wurde die NF-κB-Aktivität bestimmt. Eine Western Blot-Analyse von Portionen des Lysates unter Verwendung von anti-xpress (eingebettetes Bild) zeigt die steigenden Mengen an exprimiertem Protein.
2 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass die erste α-Helixregion von NEMO zur Bindung an IKKβ erforderlich ist. (A) Eine trunkierte Version von IKKβ, die nur aus dem COOH-Terminus von Rest V644 bis S756 besteht, wurde mit GST (GST-644-756) fusioniert und in Bakterien exprimiert. Nach Präzipitation mit Glutathionagarose wurden GST allein und GST-(644-756) mittels SDS-PAGE (10%) getrennt, und das Gel wurde mit Coomassie-Blau eingefärbt (linkes Bild). Für anschließende GST-Pulldown-Analysen wurden gleiche Mengen jedes Proteins verwendet. Verschiedene NH2- und COOH-terminale Trunkationen von NEMO wurden konstruiert, mit [³⁵S]-Methionin markiert und für in vitro-Pulldown verwendet (rechtes Bild).
Mutanten, die mit GST-(644-756) interagierten, sind mit (+) angegeben. Keine der Mutanten interagierte mit GST alleine. (B) Wildtyp-NEMO und eine Deletionsmutante, der die erste α-Helixregion fehlte (del.αH), wurden in vitro translatiert (linkes Bild: Input) und für GST-Pulldown mit den oben gezeigten Proteinen verwendet (A: links). (C) HeLa-Zellen wurden mit pBIIx-Luciferase zusammen mit pcDNA-3 (Vektor) oder steigenden Konzentrationen von del.αH (0,25, 0,5, 1,0 μg/ml) achtundvierzig Stunden transfiziert und dann vier Stunden mit TNFα (10 ng/ml) behandelt. Dann wurden die Zellen lysiert, und die NF-κB-Aktivität wurde mit einem Luciferase-Assay bestimmt.
3 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, daß die Interaktion mit NEMO und die funktionale Kinase-Aktivität eine IKKα-homologe Region des IKKβ-COOH-Terminus erfordert. (A) Trunkationsmutationen von IKKβ, denen nacheinander der äußerste COOH-Terminus (1-733), die Serin-freie Region (1-707), die Serin-reiche Domäne (1-662) und die α1-Region (1-644) fehlten, wurden exprimiert und mittels in vitro-Translation markiert sowie für GST-Pulldown mittels GST-NEMO verwendet (1A). Keine der Mutanten interagierte mit GST alleine. (B) Sequenz-Alignment der äußersten COOH-Termini von IKKβ und IKKα. Die α2- und die Glutamat-reichen Regionen sind eingezeichnet, und die sechs identischen Aminosäuren sind schraffiert dargestellt. (C) Wildtyp-IKKβ und die Trunkationsmutanten (1-733 und 1-744) wurden mit [³⁵S]-Methionin markiert (Input) und für eine in vitro-Pulldown-Analyse mit GST alleine oder mit GST-NEMO verwendet. (D) HeLa-Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit 1 μg/Vertiefung der angegebenen FLAG-markierten Konstrukte transfiziert, gefolgt von einer Immunpräzipitation unter Verwendung von Anti-FLAG. Die Immunpräzipitate wurden fünfzehn Minuten bei 30°C in Kinasepuffer inkubiert, der [³²P]-markiertes γATP enthielt, und dann mit Lysepuffer gewaschen, der 1% Triton-100 enthielt. Die resultierenden Komplexe wurden mittels SDS-PAGE (10%) getrennt und durch Autoradiographie visualisiert (oberes Bild). Das untere Bild zeigt einen Immun-Blot von identischen Proben, der in jeder Bahn äquivalente Mengen an transfiziertem Protein zeigt. (E) HeLa-Zellen wurden 48 Stunden mit 1 μg/ml der angegebenen Konstrukte oder mit einem leeren Vektor (pcDNA-3) zusammen mit pBIIx-Luciferase transfiziert. Die NF-κB-Aktivität wurde mittels Luciferase-Assay bestimmt. (F) Achtundvierzig Stunden mit FLAG-markierten Versionen von IKKβ (Wildtyp) oder IKKβ-(1-733) transfizierte HeLa-Zellen waren entweder unbehandelt (–) oder wurden sieben Minuten mit TNFα (10 ng/ml) behandelt (+). Nach Lyse und Immunpräzipitation mit Anti-FLAG wurde ein Immunkomplex- Kinase-Assay (obere Bilder) durchgeführt. Identische Proben wurden immunpräzipitiert und mit Anti-FLAG immungeblottet (untere Bilder).
4 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass sich bei der Assoziation von NEMO mit IKKβ und IKKα die NEMO-Bindungsdomäne (NBD) als sechs COOH-terminale Aminosäuren lang erweist. (A) COS-Zellen, die vorübergehend mit Vektor alleine, mit FLAG-markierter IKKα oder IKKβ (1 μg/Vertiefung) oder mit xpress-markiertem NEMO (1 μg/Vertiefung) bis zu einer Gesamt-DNA-Konzentration von 2 μg/Vertiefung transfiziert wurden, wie dargestellt. Nach Lyse wurden Immunpräzipitationen (IP) unter Verwendung von Anti-FLAG (M2) durchgeführt und der Inhalt der Lysates vor IP wurde mit Anti-xpress immungeblottet, um äquivalente Niveaus der NEMO-Expression in transfizierten Zellen sicher zu stellen. (B) Wildtyp-IKKα und IKKα-(1-737) wurden exprimiert und markiert (Input) sowie für GST-Pulldown unter Verwendung von GST oder GST-NEMO verwendet. (C) Eine Gesamtlängen-cDNA, die humane IKKi kodiert, wurde mittels RT-PCR aus HeLa-Zell-mRNA unter Verwendung des Expand^TM Long Template PCR Systems (Boehringer Mannheim), des Vorwärtsprimers (5'-CTAGTCGAATTCACCATGCAGAGCACAGCCAATTAC) (SEQ ID Nr.: 22) und des Rückwärtsprimers (3'-CTAGTCTCTAGATTAGACATCAGGAGGTGCTGG) (SEQ ID Nr. 23) erhalten und in die EcoRI- und XbaI-Stellen von pcDNA-3 kloniert. Eine GST-Pulldown-Analyse wurde unter Verwendung von [³⁵S]-Methionin-markierter IKKα, IKKβ and IKKi durchgeführt. (D) Eine Deletionsmutante von IKKβ, der die NBD fehlte (del.NBD), wurde mit [³⁵S]-Methionin markiert (Input) und für eine GST-Pulldown-Analyse verwendet. (E) Ein Fauchere-Pliska-Hydrophobizitätsplot des COOH-Terminus (N721-S756) von humaner IKKβ wurde mit der MacVector☐-Software (Version 6.5.3) erzeugt. Die NBD (L737-L742) ist eingerahmt. (F) COS-Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit insgesamt 2 μg DNA/Vertiefung von Vektor alleine, Vektor plus NEMO-FLAG oder NEMO-FLAG plus Xpress-markierten Versionen von IKKβ-(1-744) transfiziert, welche die angegebenen Punktmutationen innerhalb der NBD enthielten. Nach Lyse und Immunpräzipitation unter Verwendung von Anti-FLAG (M2) wurde eine Immunblot-Analyse mit Anti-FLAG oder mit Anti-Xpress durchgeführt. Die Menge an exprimiertem Protein im Lysat vor IP wurde durch Immunblotting mit Anti-Xpress bestimmt (unteres Bild). (G) HeLa-Zellen wurden achtundvierzig Stunden vorübergehend mit den angegebenen Konstrukten zusammen mit pBIIX-Luciferase transfiziert, und die NFκB-Aktivität im Lysat wurde mittels Luciferase-Assay bestimmt.
5 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass ein zellpermeables Peptid, das sich über die IKKβ-NBD erstreckt, die IKKβ/NEMO-Interaktion, die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung und die NF-κB-abhängige Genexpression inhibiert. (A) Eine GST-Pulldown-Analyse wurde unter Verwendung von mit GST-NEMO in vitro translatierter IKKβ (oberes Bild) oder mit GST-IKKβ-(644-756) in vitro translatiertem NEMO (unteres Bild) durchgeführt. Der Assay wurde in Abwesenheit (kein Peptid) oder in Gegenwart steigender Konzentrationen (125, 250, 500 oder 1000 μM) von Mutanten(MUT)- oder Wildtyp(WT)-NBD-Peptid durchgeführt. (B) HeLa-Zellen wurden mit beiden Peptiden (200 μM) jeweils über die angegebenen Zeiträume inkubiert. Nach der Lyse wurde der IKK-Komplex unter Verwendung von Anti-NEMO immunpräzipitiert und der resultierende Immunblot mit Anti-IKKβ sondiert. (C) HeLa-Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit pBIIX-Luciferase transfiziert, dann zwei Stunden in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart des Mutanten- oder des Wildtyp-NBD-Peptids (jeweils 100 bzw. 200 μM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen entweder mit TNFα (10 ng/ml) behandelt, wie gezeigt (linkes Bild), oder blieben weitere vier Stunden unbehandelt (rechtes Bild), wonach die NF-κB-Aktivierung mittels Luciferase-Assay bestimmt wurde. (D) HeLa-Zellen wurden drei Stunden mit steigenden Konzentrationen (50, 100 oder 200 μM) jedes Peptids inkubiert, gefolgt von einer fünzehnminütigen Behandlung mit TNFα (10 ng/ml), wie angegeben (+). Nach der Lyse wurden Kernextrakte hergestellt und 10 μg Protein aus jeder Probe für einen EMSA unter Verwendung einer spezifischen, [³²P]-markierten Sonde der κB-Stellen verwendet. (E) Primäre HUVEC wurden zwei Stunden mit Wildtyp-(links) oder Mutanten-(rechts)NBD-Peptiden vorinkubiert (100 μM) und dann weitere sechs Stunden mit TNFα (10 ng/ml) stimuliert. Die Kontrollzellen erhielten kein Peptid. Die Zellen wurden entweder mit Anti-E-Selektin (H4/18) oder mit einem nicht-bindenden Kontroll-Antikörper (K16/16) eingefärbt, und die Expression wurde mittels FACS (FACSort, Becton Dickinson) bestimmt. Die Profile zeigen eine E-Selektin-Färbung in Abwesenheit (schraffiert) und in Gegenwart (durchgezogene Linie) von TNFα, sowie die Antikörper-Färbung unter den gleichen Bedingungen (gestrichelte Linie: kein TNFα; gepunktete Linie: TNFα).
6 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass das Wildtyp-NBD-Peptid die NF-κB-induzierte Genexpression und eine experimentell induzierte Entzündung inhibiert. (A) Bei Mäusen, die mit einem Vehikel (VEH), mit Dexamethason (DEX) oder mit NBD-Peptiden topisch behandelt wurden, wurden PMA-induzierte Ohrenödeme induziert und wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. Die Daten sind als mittlere Unterschiede der Ohrendicke ± SD (* = p < 0,05, verglichen mit unbehandelter Kontrolle [–] und Vehikel [VEH]) dargestellt. (B) Die Wirkungen des NBD-Peptids im Vergleich zur Wirkung von Dexamethason (DEX) auf Zymosan(ZYM)-induzierte Peritonitis bei Mäusen wurden wiederum wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. Kontrollmäusen wurde Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert.
7 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, welche die dosisabhängige Inhibierung der Osteoklastendifferenzierung durch Wildtyp-, nicht aber durch Mutanten-NBD-Peptide zeigen. Die Daten sind als Mittelwertsbestimmung von Dreifachproben ± SD dargestellt.
8 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse von D738 innerhalb der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) von humaner IKKβ. (A) Der Asparaginsäurerest an Position 738 von IKKβ wurde mit Alanin, Asparagin oder mit Glutaminsäure mittels PCR-Mutagenese substituiert. (B) Die in A gezeigten IKKβ(D738)-Mutanten wurden durch in vitro-Transkription und -Translation mit ³⁵S-Methionin markiert und dann für eine GST-Pulldown-Analyse mit GST NEMO verwendet, wie dies zuvor beschrieben wurde. (C) Hela-Zellen wurden mit dem Fugene6-Transfektionsverfahren mit der NF-κB-abhängigen Reporterkonstrukt-pBIIx-Luciferase zusammen mit pcDNA-3, IKKβ oder den oben (A) beschriebenen D738-Mutanten vorübergehend transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde wie zuvor beschrieben bestimmt.
9 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse von W739 und W741 innerhalb der NBD von humaner IKKβ. (A) Die Tryptophanreste an den Positionen 739 und 741 von IKKβ wurden mittels PCR-Mutagenese mit Alanin, Phenylalanin, Tyrosin oder Arginin substituiert. (B) COS-Zellen wurden vorübergehend mit Vektor allein (pcDNA3.1-xpress), mit IKKβ, mit W739A, mit W739F oder mit W739Y zusammen mit FLAG-markiertem NEMO wie gezeigt transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen lysiert und Komplexe unter Verwendung von Anti-FLAG(M2)-gekoppelten Agaroseperlen immunpräzipitiert (IP). Vor der Immunpräzipitation wurde ein Teil jedes Lysates (5%) zur Analyse (vor IP) zurückbehalten. Die Proteine in den Proben wurden mit SDS-PAGE (10%) getrennt und mittels Immunblotting (IB) unter Verwendung von Antikörpern, die entweder FLAG (M2) oder Xpress erkennen, analysiert. Die oberen beiden Bilder zeigen Xpress-markierte IKKβ, und das untere Bild zeigt FLAG-markiertes NEMO. (C und D) COS-Zellen wurden vorübergehend mit den gezeigten Plasmiden transfiziert, gefolgt von einer Immunpräzipitation und einer Immunblot-Analyse, wie dies in B beschrieben ist. (C und D) Hela-Zellen wurden vorübergehend mit pBIIx-Luciferase zusammen mit den gezeigten Plasmiden transfiziert, und nach 48 Stunden wurde die Luciferaseaktivität in den Lysaten bestimmt.
10 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse von S740 innerhalb der NBD von humaner IKKβ. Der Serinrest in Position 740 von IKKβ wurde durch PCR-Mutagenese mit Alanin oder Glutaminsäure substituiert. (B) COS-Zellen wurden mit den gezeigten Plasmiden vorübergehend transfiziert, gefolgt von einer Immunpräzipitation und einer Immunblot-Analyse, wie dies in 2B beschrieben ist. (C) Hela-Zellen wurden 48 Stunden mit IKKβ-FLAG oder S740E-FLAG vorübergehend transfiziert und dann über die angegebenen Zeiträume mit TNFα (1 μg/ml) behandelt. Nach der Lyse wurden Komplexe unter Verwendung von Anti-FLAG(M2)-gekoppelten Agaroseperlen präzipitiert und ein Immunkomplex-Kinaseassay wurde unter Verwendung von GST-IκBα (1-90) als Substrat wie zuvor beschrieben durchgeführt.
11 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse der IKKα-NBD. (A) Jeder der Reste, welche die NBD von IKKα (L738 bis L743) umfassen, wurde durch PCR-Mutagenese mit Alanin substituiert. COS-Zellen wurden vorübergehend mit NEMO-FLAG zusammen mit Vektor alleine (pcDNA-3.1-xpress) oder mit Xpress-markierten Versionen von IKKα und den NBD-Mutanten wie gezeigt transfiziert. Eine Immunpräzipitation und Immunblotanalyse der IKKα-NEMO-Komplexe wurde wie in 2B beschrieben durchgeführt. (B) Hela-Zellen wurden vorübergehend mit pBIIx-Luciferase zusammen mit den gezeigten Plasmiden transfiziert, und nach 48 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität in den Lysaten bestimmt.
12 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, welches demonstriert, dass ein die IKKβ-NBD umfassendes Peptid die Interaktion von IKKα mit NEMO verhindert. (A) Sequenzen der NBD-Wildtyp- und der Scrambled-Kontroll-Peptide. Das Wildtyp-Peptid entspricht den Resten 734 bis 744 von IKKβ. (B) Eine GST-Pulldown-Analyse wurde mit GST-NEMO und mit in vitro transkribierter und translatierter IKKα (oberes Bild) und IKKβ (mittleres Bild) in Gegenwart oder Abwesenheit des Vehikels (2% DMSO), des Scrambled-, oder Wildtyp-NBD-Peptids (500 bzw. 1000 μM jedes Peptids) durchgeführt. Das untere Bild zeigt ein Coomassieblau-gefärbtes Gel, welches deutlich macht, dass keines der Peptide die Interaktion von GST-NEMO mit den Glutathionagaroseperlen beeinflusst, die zur Präzipitation verwendet wurden. (C) Eine densitometrische Analyse von Autoradiographiebanden, die nach GST-Pulldown von IKKα und IKKβ unter Verwendung von GST-NEMO in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Wildtyp-NBD-Peptids erhalten wurden. Das eingebettete Bild zeigt ein repräsentatives Experiment. Die Daten sind als Pixeldichte in Prozent der Kontrolle (kein Peptid) dargestellt und geben Mittelwerte ± SD an (n = 11). Die Analyse wurde mit der NIH-Image-Software durchgeführt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Allgemeine Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt entzündungshemmende Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und Verfahren zu deren Verwendung für die Behandlung von entzündlichen Störungen bereit. Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Identifizierung der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) auf IκB-Kinase-α (IKKα) und auf IκB-Kinase-β (IKKβ).
Ohne sich auf einen Mechanismus beschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung dadurch wirken, dass sie die Interaktion von NEMO mit einer IKK (z. B. IKKβ oder IKKα) an der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) blockieren, wodurch sie die Phosphorylierung, Degradation und anschließende Dissoziation der IκB von NF-κB inhibieren. Diese Inhibierung führt zur Blockierung der NF-κB-Aktivierung, die mit entzündungsfördernden Reaktionen verbunden ist.
Offenbart sind ferner Verfahren zum Screening und zur Identifizierung entzündungshemmender Verbindungen.
II. Definitionen
Sofern sie nicht anders definiert sind, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie sie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird, auf das sich diese Erfindung bezieht.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Bindung" auf das gegenseitige Anhaften von Molekülen, wie von Enzymen an Substraten, Antikörpern an Antigenen, DNA-Strängen an ihren komplementären Strängen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Eine Bindung erfolgt, weil die Form und chemische Beschaffenheit von Teilen der Moleküloberflächen zueinander „komplementär" sind. Eine übliche Metapher ist das „Schloss-Schlüssel"-Prinzip, mit dem beschrieben wird, wie die Enzyme mit ihrem Substrat zusammenpassen.
Der Begriff „Fusionspeptid" oder „Fusionspolypeptid" oder „Fusionsprotein" umfasst ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein, das durch Kombinieren zweier unterschiedlicher Aminosäuresequenzen erhalten wird. Typischerweise wird dabei eine Teilsequenz eines Peptids, Polypeptids oder Proteins mittels dem Fachmann bekannter Techniken mit einem anderen heterologen Peptid, Polypeptid oder Protein verknüpft.
Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei welcher der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind dem Fachmann bekannt, einschließlich basischer Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saurer Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladener polarer Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nichtpolarer Seitenketten (z. B. Alanin, Valein, Leucin, Isoleucin, Prolein, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigter Seitenketten (z. B. Threonin, Valein, Isoleucin) und aromatischer Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Nicht-einschränkende Beispiele für konservative Substitutionen, die in den entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können, umfassen die Substitution von D-Phenylalanin mit D-Tyrosin, D-Pyridylalanin oder D-Homophenylalanin, die Substitution von D-Leucin mit D-Valin oder einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette und/oder die Substitution von D-Valin mit D-Leucin oder einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Domäne" auf einen Teil eines Moleküls oder einer Struktur, das/die gemeinsame physikalisch-chemische Merkmale teilt, wie z. B. – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – hydrophobe, polare, globulare und helixförmige Domänen oder Eigenschaften. Spezifische Beispiele für Bindungsdomänen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, DNA-Bindungsdomänen und ATP-Bindungsdomänen.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Membrantranslokationsdomäne" auf ein Peptid, das in der Lage ist, durch die Membran einer Zelle zu dringen, und das zum Transport anhaftender Peptide in eine Zelle in vivo verwendet wird. Membrantranslokationsdomänen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die dritte Helix des Antennapedia-Homöodomänen-Proteins und das HIV-1-Protein Tat. Zusätzliche Membrantranslokationsdomänen sind dem Fachmann bekannt und umfassen diejenigen, die z. B. in Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444–10450, Lindgren et al., (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21, 99–103, Ho et al., Cancer Research 61, 474–477 (2001), US-Patent Nr. 5,888,762, US-Patent Nr. 6,015,787, US-Patent Nr. 5,846,743, US-Patent Nr. 5,747,641, US-Patent Nr. 5,804,604 und in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 98/52614, WO 00/29427 und WO 99/29721 beschrieben sind.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „IκB" (I Kappa B) auf eines von mehreren Mitgliedern einer Familie strukturverwandter inhibitorischer Proteine, die an der Regulierung der NF-κB-Induktion mitwirken.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „IκB-Kinase" oder „IκB-Proteinkinase" oder „IκB-Kinasekomplex" oder "IκB-Proteinkinase-Komplex" oder „IKK" auf eine Kinase, die IκBs phosphoryliert.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „IKKα" auf die α-Untereinheit eines IκB-Kinasekomplexes. So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „IKK" auf die β-Untereinheit eines IκB-Kinasekomplexes.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „NEMO" (NF-κB-essentieller Modulator), „IKKγ" oder „IKKAP" auf das Protein, das an IKKs bindet und die Kinaseaktivität erleichtert.
So wie er hier verwendet wird, umfaßt der Begriff „NEMO-Bindungsdomäne" oder „NBD" jede Domäne, die in der Lage ist, an NEMO in der Region zu binden, in der NEMO üblicherweise mit einer IKK (z. B. IKKα oder IKKβ) interagiert. Erfindungsgemäße NEMO-Bindungsdomänen sind die α2-Region (Reste 737–742) von Wildtyp-IKKβ oder die entsprechende, sechs Aminosäuren umfassende Sequenz von Wildtyp-IKKα (Reste 738–743), die kritisch für die Interaktion mit NEMO sind. Die Nukleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der Wildtyp-IKKβ-NBD sind in SEQ ID Nr.: 1 (GenBank-Zugangsnr. AR067807; Nukleotide 2203–2235) bzw. SEQ ID Nr. 2 vorgesehen.
Die Begriffe „Analog", „Derivat" und „Mimetikum" sollen, so wie sie hier verwendet werden, Moleküle umfassen, welche die chemische Struktur einer Peptidstruktur nachahmen und die Funktionsmerkmale der Peptidstruktur beibehalten. Ansätze zur Entwicklung von Peptidanaloga, -derivaten und -mimetika sind dem Fachmann bekannt, siehe beispielsweise Farmer, P. S. in Drug Design (E. J. Ariens, Hrsg.) Academic Press, New York, 1980, Nr. 10, S. 119–143; Ball. J. B. und Alewood, P. F. (1990) J. Mol. Recognition 3: 55; Morgan, B. A. und Gainor, J. A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243, und Freidinger, R. M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 270; siehe auch Sawyer, T. K. (1995) „Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M. D. und Amidon, G. L. (Hrsg.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport und Metabolism, Kapitel 17; Smith, A. B. 3rd, et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 11113–11123; Smith, A. B. 3rd, et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 9947–9962; und Hirschman, R., et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 12550–12568.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich ein „Derivat" einer Verbindung X (z. B. ein Peptid oder eine Aminosäure) auf eine Form von X, bei der eine oder mehrere Reaktionsgruppen der Verbindung mit einer Substituentengruppe derivatisiert wurden. Beispiele für Peptidderivate umfassen Peptide, bei denen eine Aminosäureseitenkette, die Peptidhauptkette oder der Amino- oder Carboxy-Terminus derivatisiert wurde (z. B. Peptidverbindungen mit methylierten Amidbindungen). Gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich ein „Analog" einer Verbindung X auf eine Verbindung, die chemische Strukturen von X behält, welche für die funktionelle Aktivität von X notwendig sind, die aber auch gewisse chemische Strukturen enthält, die sich von X unterscheiden. Ein Beispiel für ein Analog eines natürlich vorkommenden Peptids ist ein Peptid, das eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthält. Gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich ein „Mimetikum" einer Verbindung X auf eine Verbindung, bei der chemische Strukturen von X, die für die funktionale Aktivität notwendig sind, durch andere chemische Strukturen ersetzt wurden, welche die Konformation von X nachahmen. Beispiele für Peptidmimetika umfassen Peptidverbindungen, bei denen die Peptidhauptkette mit einem oder mehreren Benzodiazepinmolekülen substituiert ist (sieh z. B. James, G. L. et al. (1993) Science 260: 1937–1942).
Der Begriff Mimetikum und insbesondere Peptidmimetikum soll Isostere umfassen. In der vorliegenden Verwendung soll der Begriff „Isoster" eine chemische Struktur umfassen, die durch eine zweite chemische Struktur substitutiert werden kann, da die sterische Konformation der ersten Struktur zu einer Bindungsstelle passt, die spezifisch für die zweite Struktur ist. Insbesondere umfasst der Begriff Modifikationen der Peptid-Hauptkette (d. h. Amidbindungs-Mimetika), die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Solche Modifikationen umfassen Modifikationen von Amidstickstoff, α-Kohlenstoff, Amidcarbonyl, den vollständigen Austausch der Amidbindung, Erweiterungen, Deletionen oder Hauptkettenvernetzungen. Es sind mehrere Peptid-Hauptkettenmodifikationen bekannt, einschließlich ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CSNH₂], ψ[NHCO], ψ[COCH₂] und ψ[(E) oder (Z) CH=CH]. In der oben verwendeten Nomenklatur steht ψ für das Fehlen einer Amidbindung. Die Struktur, welche die Amidgruppe ersetzt, ist in Klammern angegeben.
Andere mögliche Modifikationen umfassen eine N-Alkyl-(oder -Aryl-)Substitution (ψ[CONR]) oder eine Hauptkettenvernetzung zur Konstruktion von Lactamen und anderer zyklischer Strukturen. Andere Derivate der erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen umfassen C-terminale Hydroxymethylderivate, O-modifizierte Derivate (z. B. C-terminaler Hydroxymethylbenzylether), N-terminal modifizierte Derivate mit substituierten Amiden, wie Alkylamide und Hydrazide, und entzündungshemmende Verbindungen, in denen ein C-terminaler Phenylalaninrest durch ein Phenethylamidanalog (z. B. Val-Phe-Phenethylamid als Analog des Tripeptids Val-Phe-Phe) ersetzt ist.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Wildtyp" auf den Genotyp und Phänotyp, der für die meisten Mitglieder einer natürlich vorkommenden Spezies charakteristisch ist, und im Gegensatz zum Genotyp und Phänotyp einer Mutante steht.
III. Spezifische Ausführungsformen
A. Entzündungshemmende Verbindungen
Die vorliegende Erfindung stellt entzündungshemmende Verbindungen bereit, die eine NEMO-Bindungsdomäne (NBD) aufweisen. Jedes Molekül mit einer Domäne, die in der Lage ist, an NEMO in der Region zu binden, in der NEMO üblicherweise mit einer IKK (z. B. IKKα oder IKKβ) interagiert, kann zur Herstellung der entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele für solche Moleküle umfassen Peptide, die Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration aufweisen; Derivate, Analoga und Mimetika von Peptidverbindungen; Antikörper (z. B. polyklonale, monoklonale, humanisierte, antiidiotypische, chimäre und einkettige Antikörper sowie Fab-, F(ab')₂-, Fab-Expressionsbibliothek-Fragmente und Epitopbindungsfragmente von Antikörpern); sowie kleine organische und anorganische Moleküle (z. B. Moleküle, die aus kombinatorischen und natürlichen Produktbibliotheken erhalten werden).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die entzündungshemmenden Verbindungen der Erfindung Fusionen einer NEMO-Bindungsdomäne und mindestens eine Membrantranslokationsdomäne, welche die Membrantranslokation der erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen in vivo erleichtert.
Entzündungshemmende Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ausgehend von der Wildtyp-Aminosäuresequenz der NBD von IKKα oder IKKβ (SEQ ID Nr. 2) entwickelt werden. Jedes Fragment der Wildtyp-Aminosäuresequenz der NBD von IKKα oder IKKβ, das zur Bindung von NEMO befähigt ist, kann zur Herstellung einer entzündungshemmenden Verbindung dieser Erfindung verwendet werden. Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen dieser Wildtypsequenzen (mit den hier beschriebenen Verfahren) können dazu verwendet werden, zusätzliche entzündungshemmende Verbindungen zu erzeugen. Peptide, die konservative Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 737, 740 und 742 des in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Peptids enthalten, sind besonders brauchbare erfindungsgemäße entzündungshemmende Verbindungen (Beispiele für konservative Substitutionen, die keinen merklichen Effekt auf die Fähigkeit der Peptide zur Bindung von NEMO haben, sind aus Tabelle 1 ersichtlich). Zudem können natürlich vorkommende Allelvarianten des IKKβ-Gens, welche die Fähigkeit zur Bindung von NEMO bewahren, zur Herstellung entzündungshemmender Verbindungen verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform umfassen die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung: (a) Peptide, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 enthalten oder daraus bestehen; (b) Peptide, die eine konservative Aminosäuresubstitution der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 enthalten; und (c) natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19.
Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, NEMO herunterzuregulieren. Die Herunterregulierung ist hier als Verringerung der Aktivität, Funktion oder Synthese von NEMO, seiner Liganden oder Aktivatoren definiert. Ferner ist sie so definiert, dass sie eine Zunahme der Degradation des NEMO-Gens, seines Proteinproduktes, seiner Liganden oder Aktivatoren umfasst. Die Herunterregulierung kann auf mehrere Weisen erreicht werden, z. B. durch Destabilisieren der Bindung von NEMO an eine IKK (z. B. IKKβ oder IKKα) oder durch Blockieren der Phosphorylierung von IκB und Bewirken der anschließenden Degradation dieses Proteins.
Die Phosphorylierung von IκB durch IKKβ führt zur Ubiquination und Degradation von IκB und zur anschließenden Dissoziation von IκB, was eine Kerntranslokation von NF-κB ermöglicht, die zur Hochregulierung von Genen führt, die kritisch für die entzündliche Reaktion sind. Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können daher zum Herunterregulieren der NF-κB-Funktion verwendet werden. Die Herunterregulierung von NF-κB kann auch durch die Verwendung von entzündungshemmenden Verbindungen erreicht werden, die polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Fragmente davon enthalten, welche gegen eine NBD oder gegen NEMO selbst gerichtet sind.
B. Screening-Assays
Zudem können Screening-Verfahren zum Identifizieren von entzündungshemmenden Verbindungen verwendet werden. Die entzündungshemmenden Verbindungen können die Funktion von IKKβ blockieren, deren Synthese verhindern oder deren biologische Stabilität verringern, indem sie an der NBD dieses Moleküls interagieren. Die biologische Stabilität ist ein Maß für die Zeit zwischen der Synthese des Moleküls und dessen Degradation. Beispielsweise kann die Stabilität eines Protein-, Peptid- oder Peptidmimetikum-Therapeutikums (Kauvar, Nature Biotech. (1996) 14, 709) durch Ändern seiner Sequenz dahingehend, dass es anfälliger für eine enzymatische Degradation wird, verkürzt werden.
Verbindungen, welche die IKKβ-Funktion deaktivieren oder als deren Antagonisten wirken, können gescreent werden. Diese Verbindungen können zur Modulierung pathologischer Zustände brauchbar sein, die mit Veränderungen der IKKβ- oder NF-κB-Proteinspiegel verbunden sind.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können bei Verfahren eingesetzt werden zum isolieren und Identifizieren von Bindungspartnern erfindungsgemäßer Peptide, z. B. Verbindungen, die mit IKKβ an der NBD dieses Moleküls interagieren oder mit NEMO interagieren und dadurch die NEMO-Interaktion mit IKKβ blockieren. Ein erfindungsgemäßes Peptid wird mit einem potentiellen Bindungspartner oder einem Extrakt oder einer Fraktion einer Zelle unter Bedingungen gemischt, welche die Assoziation potentieller Bindungspartner mit den erfindungsgemäßen Peptiden zulassen. Nach dem Mischen werden Peptide, Polypeptide, Proteine oder andere Moleküle, die mit einem erfindungsgemäßen Protein assoziiert sind, von dem Gemisch getrennt. Der an das erfindungsgemäße Peptid gebundene Bindungspartner kann dann entfernt und weiter analysiert werden. Zum Identifizieren und Isolieren eines Bindungspartners kann das gesamte Protein, z. B. das gesamte IKKβ-Peptid, verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Fragment des Proteins verwendet werden. Beispielsweise kann das Peptidfragment mit der NBD zum Blockieren der Interaktion von IKKβ mit NEMO verwendet werden.
Zum Erhalten eines Extraktes einer Zelle können verschiedene Verfahren angewendet werden. Die Zellen können mittels physikalischer oder chemischer Trennverfahren getrennt werden. Beispiele für physikalische Trennverfahren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Sonikation und mechanisches Scheren. Beispiele für chemische Lyseverfahren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Detergens-Lyse und die Enzym-Lyse. Der Fachmann kann Verfahren zur Herstellung von Zellextrakten ohne weiteres anpassen, um Extrakte zur Verwendung bei den vorliegenden Verfahren zu erhalten.
Sobald ein Extrakt einer Zelle hergestellt ist, wird der Extrakt mit IKKβ oder mit NEMO unter Bedingungen gemischt, unter denen eine Assoziation des Proteins mit dem Bindungspartner erfolgen kann. Es können verschiedene Bedingungen genutzt werden, wobei die bevorzugtesten Bedingungen diejenigen sind, die den im Cytoplasma einer menschlichen Zelle vorzufindenden Bedingungen am stärksten ähneln. Merkmale, wie Osmolarität, pH-Wert, Temperatur und Konzentration des verwendeten Zellextraktes, können variiert werden, um die Assoziation des Proteins mit dem Bindungspartner zu optimieren.
Nach dem Mischen unter den entsprechenden Bedingungen wird der gebundene Komplex von dem Gemisch getrennt. Zum Trennen des Gemisches können verschiedene Techniken genutzt werden. Beispielsweise können für ein erfindungsgemäßes Protein spezifische Antikörper zur Immunpräzipitation des Bindungspartner-Komplexes verwendet werden. Alternativ dazu können übliche chemische Trennverfahren, wie Chromatographie und Dichte-Sediment-Zentrifugation, eingesetzt werden.
Nach dem Entfernen nicht-assoziierter Zellbestandteile, die in dem Extrakt vorliegen, können die Bindungspartner mit herkömmlichen Verfahren von dem Komplex dissoziiert werden. Die Dissoziation kann beispielsweise durch Ändern der Salzkonzentration oder des pH-Wertes des Gemisches erreicht werden.
Um die Trennung assoziierter Bindungspartner-Paare von dem gemischten Extrakt zu unterstützen, kann das Protein an einen festen Träger immobilisiert werden. Beispielsweise kann das Protein an eine Nitrocellulosematrix oder an Acrylperlen gebunden werden. Die Bindung des Proteins an einen festen Träger unterstützt die Trennung der Peptid-Bindungspartner-Paare von anderen Bestandteilen, die in dem Extrakt vorliegen. Bei den identifizierten Bindungspartnern kann es sich entweder um ein einzelnes Protein oder um einen Komplex handeln, der aus zwei oder mehr Proteinen besteht. Alternativ dazu können Bindungspartner mit einem Far Western-Assay gemäß den Vorgehensweisen von Takayama et al., (1997) Methods Mol. Biol. 69, 171–184 oder Sauder et al., (1996) J. Gen. Virol. 77, 991–996, oder durch Verwendung von Epitop-markierten Proteinen oder GST-Fusionsproteinen identifiziert werden.
Alternativ dazu können die Nukleinsäuremoleküle, welche die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet werden. Das Hefe-Zwei-Hybrid-System wurde zur Identifizierung anderer Protein-Partnerpaare verwendet und kann ohne weiteres angepasst werden, um die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle einzusetzen (siehe beispielsweise das StratageneHybrizap^®-Zwei-Hybrid-System).
Verfahren zur Identifizierung von Agenzien, die mindestens eine Aktivität von NEMO oder IKKβ modulieren, können jedes Mittel zum Überwachen oder Detektieren der gewünschten Aktivität nutzen.
Gemäß einer Ausführungsform können die relativen Mengen eines erfindungsgemäßen Proteins zwischen einer Zellpopulation, die dem zu testenden Agens exponiert wurde, im Vergleich zu einer nicht-exponierten Kontroll-Zellpopulation getestet werden. Bei dieser Ausführungsform werden Sonden, wie spezifische Antikörper, zum Überwachen der unterschiedlichen Expression des Proteins in den verschiedenen Zellpopulationen verwendet. Zelllinien oder -populationen werden dem zu testenden Agens unter geeigneten Bedingungen und über einen geeigneten Zeitraum exponiert. Zelllysate können aus der exponierten Zelllinie oder -population und einer nicht-exponierten Kontroll-Zelllinie oder -population hergestellt werden. Die Zelllysate werden dann mit der Sonde analysiert.
Antikörpersonden werden durch Immunisierung geeigneter Wirtssäugetiere mit entsprechenden Immunisierungsprotokollen unter Verwendung der Peptide hergestellt. Peptide oder Proteine, welche die NBD aufweisen, haben eine ausreichende Länge oder werden nach Wunsch, wie dies zum Verbessern der Immunogenität erforderlich ist, an geeignete Träger konjugiert. Verfahren zur Herstellung immunogener Konjugate mit Trägern, wie BSA, KLH oder anderen Trägerproteinen, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Unter gewissen Umständen kann eine direkte Konjugation, z. B. unter Verwendung von Carbodiimid-Reagenzien, wirksam sein; in anderen Fällen können Bindungsreagenzien, wie sie von der Pierce Chemical Co. geliefert werden, erwünscht sein, um das Hapten zugänglich zu machen. Die Hapten-Peptide können entweder am Amino-Terminus oder am Carboxy-Terminus mit einem Cysteinrest erweitert oder beispielsweise mit Cysteinresten durchsetzt sein, um die Bindung an einen Träger zu erleichtern. Die Verabreichung der Immunogene wird allgemein mittels Injektion über einen geeigneten Zeitraum und unter Verwendung geeigneter Adjuvanzien durchgeführt, wie dies im Stand der Technik allgemein üblich ist. Während des Immunisierungsvorgangs werden Titer von Antikörpern entnommen, um die Eignung der Antikörperbildung zu bestimmen. Die auf diese Weise produzierten polyklonalen Antiseren können zwar für manche Anwendungen zufrieden stellend sein, doch für pharmazeutische Zusammensetzungen ist die Verwendung monoklonaler Präparate bevorzugt. Immortalisierte Zelllinien, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper ausscheiden, können mit dem Standardverfahren von Kohler & Milstein, (1992) Biotechnology 24, 524–526, oder mit Modifikationen, die eine Immortalisierung von Lymphozyten oder Milzzellen bewirken, hergestellt werden, wie dies allgemein bekannt ist. Die immortalisierten Zelllinien, welche die gewünschten Antikörper ausscheiden, werden mit einem Immunassay gescreent, bei dem das Antigen das Peptidhapten, Peptid oder Protein ist.
Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur, welche die gewünschten Antikörper ausscheidet, identifiziert ist, können die Zellen entweder in vitro oder durch Produktion in Aszitesflüssigkeit kultiviert werden. Die gewünschten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturüberstand oder aus dem Aszitesüberstand gewonnen werden. Fragmente der monoklonalen oder der polyklonalen Antiseren, die den immunologisch signifikanten Anteil enthalten, können ebenso als Antagonisten verwendet werden, wie die intakten Antikörper. Die Verwendung immunologisch reaktiver Fragmente, wie der Fab-, Fab'- oder F(ab')2-Fragmente, ist insbesondere in einem therapeutischen Zusammenhang oft bevorzugt, da diese Fragmente meist weniger immunogen sind als das gesamte Immunglobulin.
Die Antikörper oder Fragmente können mittels gängiger Technologie auch mit rekombinanten Mitteln produziert werden. Antikörperregionen, die spezifisch an die gewünschten Regionen des Proteins binden, können auch im Zusammenhang mit Chimären, die von mehreren Spezies stammen, produziert werden. Die Agenzien, die im obigen Verfahren getestet werden, können zufällig gewählt oder bewusst gewählt oder entwickelt sein. Gemäß der vorliegenden Verwendung gilt ein Agens als zufällig gewählt, wenn es zufällig gewählt wird, ohne die spezifischen Sequenzen zu berücksichtigen, die an der Assoziation eines erfindungsgemäßen Peptids alleine oder mit seinen assoziierten Substraten, Bindungspartnern usw. beteiligt sind. Ein Beispiel für zufällig gewählte Agenzien ist die Verwendung einer chemischen Bibliothek oder einer kombinatorischen Peptid-Bibliothek oder einer Kulturbrühe eines Organismus.
Gemäß der vorliegenden Verwendung gilt ein Agens als bewusst gewählt oder entwickelt, wenn es auf nicht-zufälliger Basis gewählt ist, wobei die Sequenz der Zielstelle und/oder deren Struktur im Zusammenhang mit der Wirkung des Agens berücksichtigt wird. Agenzien können bewusst gewählt oder bewusst entwickelt werden, indem die Peptidsequenzen genutzt werden, welche die NBD auf IKKβ oder die IKKβ-Bindungsdomäne auf NEMO umfassen. Beispielsweise kann ein bewusst gewähltes Peptid-Agens ein Peptid, dessen Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 identisch ist, oder ein Peptid mit konservativen Substitutionen davon sein.
Die erfindungsgemäßen Peptidverbindungen können mittels üblicher Peptidsyntheseverfahren in fester Phase (oder in flüssiger Phase) hergestellt werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Zusätzlich kann die DNA, welche diese Peptide kodiert, unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Oligonukleotidsynthese-Instrumentariums synthetisiert und mittels üblicher rekombinanter Produktionssysteme rekombinant produziert werden. Die Produktion mittels Festphasen-Peptidsynthese ist erforderlich, wenn Aminosäuren mit einbezogen werden sollen, die nicht genkodiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die das Peptid mit einer NBD und konservative Nukleotidsubstitutionen davon, vorzugsweise in isolierter Form, kodieren. Konservative Nukleotidsubstitutionen umfassen Nukleotidsubstitutionen, die keine Kodierung einer bestimmten Aminosäure bewirken, da die meisten Aminosäuren mehr als ein Codon aufweisen (siehe King & Stansfield (Herausgeber), A Dictionary of Genetics, Oxford University Press, 1997 auf Seite 19). Konservative Nukleotidsubstitutionen umfassen daher auch stille Mutationen und differentielle Codon-Nutzung. Beispielsweise umfasst die Erfindung das in SEQ ID Nr. 1 angegebene Nukleinsäuremolekül, welches das in SEQ ID Nr. 2 angegebene Peptid kodiert, und konservative Nukleotidsubstitutionen davon. Die Erfindung umfasst zudem Nukleinsäuren, welche die Peptide kodieren, die in SEQ ID Nr. 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 und 19 angegeben sind, und konservative Nukleotidsubstitutionen davon. Jede Nukleinsäure, welche die Peptide kodiert, die in SEQ ID Nr. 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 und 19 angegeben sind, fällt angesichts der möglichen mehrfachen Permutationen von Nukleotidsequenzen, welche diese Peptide kodieren, unter die Erfindung.
Spezifische Beispiele für unter diese Erfindung fallende Nukleinsäuren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die folgenden: (1) die Aminosäuren des Peptids der SEQ ID Nr. 2 können durch die Nukleinsäuresequenz TTAGATTGGTCTTGGTTA (SEQ ID Nr. 24) oder TTGGACTGGTCCTGGCTA (SEQ ID Nr. 25) kodiert sein, und (2) die Aminosäuren des Peptids der SEQ ID Nr. 15 können durch die Nukleinsäuresequenz TTAGATTGGTCTTATCTG (SEQ ID Nr. 26) oder CTTGACTGGTCATACTTA (SEQ ID Nr. 27) kodiert sein.
Gemäß der vorliegenden Verwendung gilt ein Nukleinsäuremolekül als „isoliert", wenn es im wesentlichen von kontaminierender Nukleinsäure getrennt ist, die andere Polypeptide aus der Quelle der Nukleinsäure kodiert. Modifikationen der Primärstruktur der Nukleinsäure selbst durch Deletion, Addition oder Änderung der während der Translation in die Proteinsequenz aufgenommenen Aminosäuren können durchgeführt werden, ohne die Aktivität des Peptids zu zerstören. Solche Substitutionen oder andere Änderungen ergeben ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, welche unter den vorgesehenen Umfang der vorliegenden Erfindung fällt.
C. Assays mit hohem Durchsatz
Einführung – Die Leistungsfähigkeit des Screenings mit hohem Durchsatz wird für die Suche nach neuen entzündungshemmenden Verbindungen genutzt, die zur Interaktion mit NEMO befähigt sind. Allgemeine Informationen zum Screening mit hohem Durchsatz finden sich beispielsweise in „Cost-Effective Strategies for Automated and Accelerated High-Throughput Screening", IBCS Biomedical Library Series, IBC United States Conferences, 1996; Devlin (Herausgeber), High Throughput Screening, Marcel Dekker 1998, und in US-Patent Nr. 5,763,263. Assays mit hohem Durchsatz nutzen eine oder mehrere verschiedene Assay-Techniken.
Immundiagnostik und Immunoassays – Hierbei handelt es sich um eine Gruppe von Techniken, die zur Bestimmung spezifischer biochemischer Substanzen, üblicherweise in niedrigen Konzentrationen in komplexen Gemischen, wie biologischen Fluiden, verwendet werden und von der Spezifität und hohen Affinität abhängen, die entsprechend hergestellte und gewählte Antikörper gegenüber ihren komplementären Antigenen zeigen. Eine zu bestimmende Substanz muss notwendigerweise antigen sein – entweder ein immunogenes Makromolekül oder ein haptenisches Kleinmolekül. Jeder Probe wird eine bekannte, begrenzte Menge eines spezifischen Antikörpers zugegeben, und der Anteil des Antigens, der sich mit diesem kombiniert – häufig als Verhältnis von gebunden:frei ausgedrückt – wird geschätzt, wobei als Indikator eine Form des Antigens verwendet wird, die mit einem Radioisotop (Radioimmunoassay), einem fluoreszierenden Molekül (Fluoroimmunoassay), einem stabilen freien Radikal (Spin-Immunoassay), einem Enzym (Enzym-Immunoassay) oder einer anderen, leicht unterscheidbaren Markierung markiert ist.
Antikörper können auf verschiedene Weisen markiert werden, einschließlich: Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Fluoreszenz-Immunoassay (FIA), Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA), und Markieren der Antikörper mit kolloidalen Goldpartikeln (Immunogold).
Übliche Assay-Formate umfassen den Sandwich-Assay, den kompetitiven oder Competition Assay, den Latex-Agglutinations-Assay, den homogenenen Assay, das Mikrotiterplattenformat und den Mikropartikel-basierten Assay.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) – ELISA ist eine immunchemische Technik, welche die Gefahren von Radiochemikalien und die Kosten von Fluoreszenzdetektionssystemen vermeidet. Stattdessen verwendet der Assay Enzyme als Indikatoren. ELISA ist eine Form von quantitativem Immunoassay, der auf der Verwendung von Antikörpern (oder Antigenen) beruht, die an eine unlösliche Trägeroberfläche gebunden sind, und der dann dazu verwendet wird, das relevante Antigen (oder den relevanten Antikörper) in der Testlösung „einzufangen". Der Antigen-Antikörper-Komplex wird dann durch Bestimmen der Aktivität eines entsprechenden Enzyms detektiert, das zuvor kovalent an das Antigen (oder den Antikörper) gebunden wurde.
Informationen zu ELISA-Techniken finden sich z. B. in Crowther, ELISA: Theory and Practice (Methods in Molecular Biology, Nr. 42), Humana Press, 1995; Challacombe & Kemeny, ELISA and Other Solid Phase Immunoassays: Theoretical and Practical Aspects, John Wiley, 1998; Kemeny, A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, 1991; Ishikawa, Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Nr. 27), Elsevier, 1991.
Kolorimetrische Assays für Enzyme – Unter Kolorimetrie ist jedes Verfahren zur quantitativen chemischen Analyse zu verstehen, bei dem die Konzentration oder Menge einer Verbindung durch Vergleichen der Farbe, welche durch die Reaktion eines Reagenzes mit Standard- und Testmengen der Verbindung erzeugt wurde, häufig unter Verwendung eines Kolorimeters bestimmt wird. Ein Kolorimeter ist eine Vorrichtung zur visuellen oder photoelektrischen Bestimmung der Farbintensität oder von Unterschieden der Farbintensität.
Übliche kolorimetrische Assays der Beta-Galactosidase-Enzymaktivität sind dem Fachmann hinlänglich bekannt (siehe z. B. Norton et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 281–290). Ein kolorimetrischer Assay kann mit Ganzzelllysaten unter Verwendung von O-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (ONPG, Sigma) als Substrat in einem üblichen kolorimetrischen Beta-Galactosidase-Assay durchgeführt werden (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). Automatisierte kolorimetrische Assays sind ebenfalls zur Detektion der Beta-Galactosidase-Aktivität verfügbar, wie dies im US-Patent Nr. 5,733,720 beschrieben ist.
Immunfluoreszenz-Assays – Die Immunfluoreszenz oder die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine Technik, bei der ein Antigen oder Antikörper durch Konjugation an einen fluoreszierenden Farbstoff fluoreszierend gemacht und dann mit dem komplementären Antikörper oder Antigen in einem Gewebeschnitt oder Abstrich reagieren gelassen wird. Die Lage des Antigens oder Antikörpers kann dann durch Beobachtung der Fluoreszenz mittels Mikroskopie unter Ultraviolett-Licht bestimmt werden.
Allgemeine Informationen zu Immunfluoreszenztechniken finden sich z. B. in Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy: A Practical Approach (The Practical Approach Series, Nr. 218) Oxford University Press; Beutner, (1983) Defined Immunofluorescence and Related Cytochemical Methods, New York Academy of Sciences; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. Detaillierte Erläuterungen von Immunfluoreszenztechniken, die bei der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, finden sich in den US-Patenten Nr. 5,912,176; 5,869,264; 5,866,319; und 5,861,259.
Biochips – Die erfindungsgemäßen Peptide können auf einem Array oder Mikroarray zum Screening mit hohem Durchsatz für Agenzien verwendet werden, die entweder mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Erfindung oder mit ihren entsprechenden Proteinen interagieren.
Ein „Array" oder „Mikroarray" bezieht sich allgemein auf ein Rastersystem, in dem jede Position oder Sondenzelle von definierten Nukleinsäurefragmenten, die auch als Oligonukleotide bekannt sind, besetzt ist. Die Arrays selbst werden gelegentlich als „Chips" oder „Biochips" bezeichnet, bei denen es sich um hochdichte Nukleinsäure- und Peptid-Mikroarrays handelt, die meist Tausende Sondenzellen in verschiedenen Rasterarten aufweisen.
Ein typischer molekularer Detektionschip umfasst ein Substrat, auf dem ein Array von Erkennungsstellen, Bindungsstellen oder Hybridisierungsstellen angeordnet ist. Jede Stelle weist einen entsprechenden molekularen Rezeptor auf, der an ein Molekül mit einer vorbestimmten Struktur bindet oder hybridisiert. Die festen Trägersubstrate, die zum Bilden der Oberfläche des Arrays oder Chips verwendet werden können, umfassen organische und anorganische Substrate, wie Glas, Polystyrole, Polyimide, Siliciumdioxid und Siliciumnitrid. Zum direkten Anhaften von Sonden an den Elektroden muss die Elektrodenoberfläche mit Materialien gefertigt sein, die in der Lage sind, Konjugate mit den Sonden zu bilden.
Sobald das Array hergestellt ist, wird eine Probenlösung auf den molekularen Detektionschip aufgebracht, und Moleküle in der Probe binden oder hybridisieren an eine oder mehrere Stellen. Die Stellen, an denen eine Bindung erfolgt, werden detektiert, und anschließend werden eine oder mehrere Strukturen innerhalb der Probe hergeleitet. Die Detektion markierter Chargen ist eine herkömmliche Detektionsstrategie und umfasst Radioisotop-, Fluoreszenz- und Biotin-Markierungen, wobei auch andere Möglichkeiten verfügbar sind, einschließlich elektronischer Signaltransduktion.
Die hier beschriebenen Verfahren finden besondere Verwendung, wenn ein hoher Proben-Durchsatz erforderlich ist. Insbesondere ist diese Erfindung nützlich für Liganden-Screening-Umgebungen und zur Bestimmung der Zusammensetzung komplexer Gemische.
Polypeptide sind ein beispielhaftes System für die Erforschung der Beziehung zwischen Struktur und Funktion in der Biologie. Wenn die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren zu einem polymeren Molekül kondensiert werden, bilden sie eine große Vielfalt von dreidimensionalen Konfigurationen, deren jede von einer bestimmten Aminosäuresequenz und und einem bestimmten Lösungsmittelzustand herrührt. Beispielsweise beträgt die Anzahl möglicher Polypeptidkonfigurationen unter Verwendung der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren für ein Polymer mit einer Länge von fünf Aminosäuren über drei Millionen. Typische Proteine sind mehr als einhundert Aminosäuren lang.
Bei typischen Anwendungen kontaktiert eine komplexe Lösung, die eine oder mehrere zu charakterisierende Substanzen enthält, ein Polymerarray, das Polypeptide umfasst. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch klassische Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, z. B. mit üblichen Verfahren in fester Phase. Die üblichen Verfahren umfassen die ausschließliche Synthese in fester Phase, Verfahren zur Synthese teilweise in fester Phase, die Fragmentkondensation, die klassische Lösungssynthese und die rekombinante DNA-Technologie (siehe Merrifield, (1963) Am. Chem. Soc. 85, 2149–2152).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die Polypeptide oder Proteine des Arrays an andere Co-Rezeptoren binden, um auf dem Array eine Heteroduplex zu bilden. Bei noch einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide oder Proteine des Arrays an Peptide oder kleine Moleküle binden.
D. Verwendungen für die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung
Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zum Modulieren einer Entzündung oder zur Behandlung oder Diagnose einer entzündlichen Störung in einem Subjekt verwendet werden. Die Verfahren umfassen die Verabreichung einer erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindung an ein Subjekt in einer zur Behandlung einer entzündlichen Störung wirksamen Menge.
Gemäß der vorliegenden Verwendung soll eine „entzündliche Störung" eine Erkrankung oder Störung umfassen, die durch eine Entzündung gekennzeichnet oder verursacht ist, von dieser herrührt oder durch diese beeinflusst wird. Eine entzündliche Störung kann durch biologische und pathologische Prozesse im Zusammenhang mit der NEMO- oder IKKβ-Funktion und -Aktivität und/oder mit NF-κB-vermittelten Prozessen verursacht oder mit diesen verbunden sein. Beispiele für entzündliche Erkrankungen oder Störungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, akute und chronische entzündliche Störungen, wie Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, psoriatische Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen (Morbus Crohn, ulzerative Colitis), Sepsis, Vaskulitis und Bursitis; Autoimmunerkrankungen, wie Lupus, Polymyalgie, Rheumatica, Skleroderma, Wegenersche Granulomatose, temporale Arteritis, Cryoglobulinämie und Multiple Sklerose; Transplantatabstoßung; Osteoporose; Krebs, einschließlich fester Tumore (z. B. Lunge, ZNS, Dickdarm, Niere und Bauchspeicheldrüse); Alzheimersche Krankheit; Atherosklerose; virale Infektionen (z. B. HIV oder Grippe); chronische virale Infektionen (z. B. Epstein-Barr, Cytomegalovirus, Herpes simplex-Virus), und Ataxia Telangiectasia.
Pathologische Prozesse beziehen sich auf eine Kategorie biologischer Prozesse, die einen schädigenden Effekt bewirken. Beispielsweise hängt die unregulierte Expression von NF-κB mit entzündungsfördernden Prozessen zusammen, die gewissen pathologischen Prozessen zugrunde liegen. Gemäß der vorliegenden Verwendung wird bei einer entzündungshemmenden Verbindung davon gesprochen, dass sie einen pathologischen Prozess moduliert, wenn die Verbindung den Grad oder die Schwere des Prozesses vermindert. Beispielsweise können durch Verabreichung entzündungshemmender Verbindungen, die in gewisser Weise die Expression oder zumindest eine Aktivität von NEMO oder IKKβ verringern, fördern oder modulieren, entzündungsfördernde Reaktionen verhindert oder pathologische Prozesse moduliert werden.
Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können daher zur Behandlung von Krankheiten mit einer NF-κB-Entzündungskomponente verwendet werden. Zu diesen Krankheiten zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Atherosklerose, Asthma (Ray & Cohn, (1999) J. Clin. Invest. 104, 985–993; Christman et al., (2000) Chest 117, 1482–1487) und die Alzheimersche Krankheit. Eine Übersicht über Erkrankungen mit einer NF-κB-Entzündungskomponente findet sich in Epstein, (1997) New Eng. J. Med. 336, 1066–1071; Lee et al., (1998) J. Clin. Pharmacol. 38, 981–993; Brand et al., (1997) Exp. Physiol. 82, 297–304.
Pathologische Prozesse, die mit einer entzündungsfördernden Reaktion verbunden sind, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen geeignet wären, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Asthma, Allergien, wie allergische Rhinitis, Utikaria, Anaphylaxe, Arzneimittel-Unverträglichkeit, Lebensmittel-Unverträglichkeit und dergleichen; kutane Entzündungen, wie Dermatitis, Ekzeme, Psoriasis, Kontaktdermatitis, Sonnenbrand, Alterung und dergleichen; Arthritis, wie Osteoarthritis, psoriatische Arthritis, Lupus, Spondylarthritis und dergleichen. Entzündungshemmende Verbindungen sind auch zur Behandlung einer chronischen obstruktiven Lungenkrankheit und einer chronischen entzündlichen Darmerkrankung geeignet. Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ferner dazu verwendet werden, Corticosteroide bei einer Anwendung zu ersetzen, bei der Corticosteroide verwendet werden, einschließlich der Immunsuppression bei Transplantaten und in der Krebstherapie.
So wie er hier verwendet wird, umfasst der Begriff „Subjekt" warmblütige Lebewesen, vorzugsweise Säugetiere, einschließlich Menschen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Subjekt ein Primat. Bei einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist der Primat ein Mensch.
Gemäß der vorliegenden Verwendung umfasst der Begriff „Verabreichung" an ein Subjekt die Ausgabe, Abgabe oder Anwendung einer entzündungshemmenden Verbindung, z. B. einer entzündungshemmenden Verbindung in einer pharmazeutischen Formulierung (wie hier beschrieben), an ein Subjekt über jeden geeigneten Abgabeweg der Verbindung an die gewünschte Stelle im Subjekt, einschließlich der Abgabe auf parenteralem oder oralem Wege, durch intramuskuläre Injektion, subkutane/intradermale Injektion, intravenöse Injektion, bukkale Verabreichung, transdermale Abgabe und Verabreichung auf rektalem Wege, über den Dickdarm, vaginal, intranasal oder über den Atemtrakt (z. B. durch Inhalation).
So wie er hier verwendet wird, umfasst der Begriff „wirksame Menge" eine Menge, die bei Dosierungen und über Zeiträume wirksam ist, die notwendig sind, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, z. B. zur Behandlung einer entzündlichen Störung in einem Subjekt ausreichen. Eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindung, wie sie hier definiert ist, kann abhängig von solchen Faktoren, wie Erkrankungszustand, Alter und Gewicht des Subjektes, sowie der Fähigkeit der Verbindung, eine gewünschte Reaktion im Subjekt hervorzurufen, variieren. Die Dosisregime können angepasst werden, um die optimale therapeutische Reaktion zu ergeben. Eine wirksame Menge ist auch eine, bei der die therapeutisch vorteilhaften Wirkungen gegenüber etwaigen toxischen oder schädigenden Wirkungen (z. B. Nebenwirkungen) der Verbindung überwiegen.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindung (d. h. eine wirksame Dosis) kann im Bereich von etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht, noch bevorzugter etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht und sogar noch bevorzugter etwa 1 bis 10 mg/kg, 2 bis 9 mg/kg, 3 bis 8 mg/kg, 4 bis 7 mg/kg oder 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht liegen. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass gewisse Faktoren die Dosis beeinflussen können, die zur Behandlung eines Subjektes erforderlich ist, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Schwere der Erkrankung oder Störung, früherer Behandlungen, der allgemeinen Gesundheit und/oder des Alters des Subjektes und anderer vorliegender Erkrankungen. Zudem kann die Behandlung eines Subjektes mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindung eine Einzelbehandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen umfassen. Bei einem Beispiel wird ein Subjekt mit einer erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindung im Bereich von etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht einmal pro Woche für etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise 2 bis 8 Wochen, noch bevorzugter etwa 3 bis 7 Wochen und sogar noch bevorzugter etwa 4, 5 oder 6 Wochen behandelt. Ebenso versteht sich, dass die wirksame Dosis einer erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindung, die zur Behandlung verwendet wird, im Laufe einer bestimmten Behandlung zu- oder abnehmen kann.
Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Kombination mit anderen Agenzien, die einen bestimmten pathologischen Prozess modulieren, bereitgestellt werden. Beispielsweise kann eine entzündungshemmende Verbindung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen bekannten entzündungshemmenden Agenzien verabreicht werden. Bekannte entzündungshemmende Agenzien, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, finden sich in Harrison's Principles of Internal Medicine, dreizehnte Auflage, Hrsg. T. R. Harrison et al. McGraw Hill N. Y., NY, und in The Physicians Desk Reference, 50. Auflage 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co., deren kompletter Inhalt hier ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen und die zusätzlichen entzündungshemmenden Agenzien können dem Subjekt in derselben pharmazeutischen Zusammensetzung oder in unterschiedlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen (gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeiten) verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Modulieren der Signaltransduktion unter Beteiligung von IκB in einer Zelle bereit. Die Verfahren umfassen die Modulation der IKKβ-Aktivität, z. B. durch Kontaktieren einer Zelle mit einer entzündungshemmenden Verbindung. Die entzündungshemmende Verbindung kann beispielsweise die Interaktion von NEMO mit IKKβ an der NBD und damit die IKKβ-Funktion inhibieren. Die Zelle kann in Kultur oder in situ, d. h. im natürlichen Wirt, vorliegen.
Für diagnostische Zwecke können die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen markiert werden, z. B. mit fluoreszierenden, radioaktiven, chemilumineszenten oder anderen einfach detektierbaren Molekülen. Die Markierung kann entweder direkt oder indirekt mit der entzündungshemmenden Verbindung konjugiert sein.
E. Pharmazeutische Präparate
Zur Erfindung gehören auch pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Pharmazeutisch verträgliche Träger können sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, einschließlich solcher, die aus Petroleum stammen, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft sind, wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen, sein. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können ebenfalls als flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen, verwendet werden. Geeignete pharmazeutische Träger sind in Gennaro et al., (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company beschrieben. Zusätzlich zum pharmakologisch aktiven Agens können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, die Exzipienten und Hilfsstoffe umfassen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparaten erleichtern, die pharmazeutisch zur Abgabe an den Wirkungsort verwendet werden können. Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form, z. B. als wasserlösliche Salze. Zudem können Suspensionen der aktiven Verbindungen als entsprechende ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden.
Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Träger umfassen fettige Öle, wie z. B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, z. B. Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol und Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten. Liposome können ebenfalls eingesetzt werden, um das Agens zur Abgabe in die Zelle einzukapseln.
Die pharmazeutische Formulierung zur systemischen Verabreichung gemäß der Erfindung kann zur enteralen, parenteralen oder topischen Verabreichung formuliert sein. Tatsächlich können alle drei Arten von Formulierungen gleichzeitig verwendet werden, um eine systemische Verabreichung des aktiven Bestandteils zu erreichen.
Geeignete Formulierungen zur oralen Verabreichung umfassen Hart- oder Weichgelatinekapseln, Pillen, Tabletten, einschließlich beschichteter Tabletten, Elixiere, Suspensionen, Sirupe oder Inhalationen und deren Formen zur kontrollierten Freisetzung.
Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen können auch in pharmazeutische Zusammensetzungen aufgenommen sein, welche die anhaltende Abgabe der entzündungshemmenden Verbindungen an ein Subjekt über einen Zeitraum von mindestens mehreren Wochen bis zu einem Monat oder mehr ermöglichen. Solche Formulierungen sind in den US-Patenten Nr. 5,968,895 und 6,180,608 B1 beschrieben.
Die entzündungshemmenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf parenteralem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, transdermalem oder bukkalem Wege verabreicht werden. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf oralem Wege durch Inhalation oder Lavage direkt in die Lungen erfolgen. Die verabreichte Dosis hängt von Alter, Gesundheit und Gewicht des Empfängers, der Art der eventuellen begleitenden Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkung ab.
Die bei den hier beschriebenen Behandlungsverfahren verwendeten, entzündungshemmenden Verbindungen können systemisch oder topisch verabreicht werden, was von solchen Überlegungen, wie dem zu behandelnden Zustand, dem Erfordernis einer ortsspezifischen Behandlung, der Menge des zu verabreichenden Wirkstoffs und ähnlichen Überlegungen, abhängt.
Eine topische Verabreichung kann angewendet werden, bei der jede übliche topische Formulierung, wie eine Lösung, eine Suspension, ein Gel, eine Creme oder Salbe und dergleichen, eingesetzt werden kann. Die Herstellung solcher topischen Formulierungen ist auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen hinreichend beschrieben, wie z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences. Zur topischen Anwendung können diese Verbindungen auch als Pulver oder Spray, insbesondere in Aerosol-Form, verabreicht werden. Der aktive Bestandteil kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die zur systemischen Verabreichung ausgelegt sind. Wenn ein Wirkstoff systemisch verabreicht werden soll, kann er bekanntlich als Pulver, Pille, Tablette oder dergleichen oder als Sirup oder Elixier zur oralen Verabreichung konfektioniert werden. Zur intravenösen, intraperitonealen oder intraläsionalen Verabreichung wird die Verbindung als Lösung oder Suspension hergestellt, die mittels Injektion verabreicht werden kann. In gewissen Fällen kann es nützlich sein, diese Verbindungen in Form eines Suppositoriums oder als Formulierung zur verzögerten Freisetzung zur Abgabe unter die Haut oder zur intramuskulären Injektion zu formulieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen mittels Inhalation verabreicht werden. Zur Inhalationstherapie kann die Verbindung in einer Lösung, die zur Verabreichung mittels druckbetriebener Inhalatoren (MDI) geeignet ist, oder in einer für einen Trockenpulver-Inhalator geeigneten Form vorliegen.
Eine wirksame Menge ist die Menge, welche die Aktivität eines Zielproteins moduliert oder dessen Spiegel verändert. Eine gegebene wirksame Menge variiert je nach Zustand und kann in manchen Fällen je nach Schwere des zu behandelnden Zustandes und Ansprechen des Patienten auf die Behandlung variieren. Daher wird eine gegebene wirksame Menge am besten zum jeweiligen Zeitpunkt und am jeweiligen Ort durch Routineversuche bestimmt. Es ist jedoch zu erwarten, dass bei der Behandlung eines Tumors gemäß der vorliegenden Erfindung eine Formulierung, die zwischen 0,001 und 5 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 0,01 bis 1 Prozent, enthält, üblicherweise eine therapeutisch wirksame Menge darstellt. Bei systemischer Verabreichung bewirkt eine Menge zwischen 0,01 und 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise jedoch von etwa 0,1 bis 10 mg pro kg, in den meisten Fällen ein therapeutisches Ergebnis.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können die Verbindungen dieser Erfindung alleine oder zusammen oder in Kombination mit anderen therapeutischen oder diagnostischen Agenzien verwendet werden. Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen können die Verbindungen dieser Erfindung gleichzeitig mit anderen Verbindungen, die nach allgemein akzeptierter medizinischer Praxis typischerweise für diese Zustände verschrieben werden, verabreicht werden. Die Verbindungen dieser Erfindung können in vivo, üblicherweise in Säugetieren, vorzugsweise beim Menschen, verwendet werden.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen mit chemischen Einheiten, einschließlich Proteinen, welche die Funktionen oder die Regulierung von Zielproteinen zum therapeutischen Nutzen verändern, gekoppelt sein. Diese Proteine können in Kombination andere Inhibitoren von Zytokinen und Wachstumsfaktoren enthalten, die einen zusätzlichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von entzündlichen Störungen bieten können. Zudem können die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen auch durch Phosphorylierung unter Verwendung der dem Fachmann hinlänglich bekannten Vernetzungsmittel an Biotinylat, Thioat, Acetylat oder Iodinat konjugiert werden.
F. Molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken
Gemäß der vorliegenden Erfindung können, wie oben beschrieben oder wie in den nachfolgenden Beispielen erörtert, herkömmliche molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken eingesetzt werden. Diese Techniken sind in der Literatur ausführlich erläutert, siehe beispielsweise Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Glover, (1985) DNA Cloning: A Practical Approach; Gait, (1984) Oligonucleotide Synthesis; Harlow & Lane, (1988) Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Roe et al., (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley; und Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing.
G. Antisense-RNA
Antisense-Moleküle sind RNA- oder einsträngige DNA-Moleküle mit Nukleotidsequenzen, die zu einer bestimmten mRNA komplementär sind. Wenn ein im Labor hergestelltes Antisense-Molekül in Zellen injiziert wird, welche die normale mRNA enthalten, die mit einem zu untersuchenden Gen transkribiert ist, kann das Antisense-Molekül ein Basenpaar mit der mRNA bilden, was die Translation der mRNA zu einem Protein verhindert. Die resultierende doppelsträngige RNA oder RNA/DNA wird von Enzymen verdaut, die spezifisch an solche Moleküle binden. Daher erfolgt eine Depletion der mRNA, welche die Translation des Genproduktes blockiert, so dass Antisense-Moleküle in der Medizin zum Blockieren der Produktion schädlicher Proteine Verwendung finden. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Antisense-RNA sind dem Durchschnittsfachmann hinlänglich bekannt (siehe beispielsweise Lichtenstein & Nellen (Herausgeber), Antisense Technology: A Practical Approach, Oxford University Press, 1997; Agrawal & Crooke, Antisense Research and Application (Handbook of Experimental Pharmacology, Nr. 131), Springer Verlag, 1998; Gibson, Antisense and Ribozyme Methodology: Laboratory Companion, Chapman & Hall, 1997; Mol & Van Der Krol, Antisense Nucleic Acids and Proteins, Marcel Dekker; Weiss, Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, 1997; Stanley et al., (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press; Stein & Krieg, (1998) Applied Antisense Oligonucleotide Technology).
Antisense-Moleküle und Ribozyme können mit jedem dem Fachmann bekannten Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuremolekülen hergestellt werden. Dazu zählen Techniken zur chemischen Synthese von Oligonukleotiden, wie die chemische Phosphoramidit-Synthese in fester Phase. Alternativ dazu können RNA-Moleküle durch Transkription von DNA-Sequenzen in vitro und in vivo erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in viele verschiedene Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotoren, wie T7 oder SP6, eingebracht werden. Alternativ dazu können diese cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingebracht werden.
RNA-Moleküle können modifiziert werden, um ihre intrazelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Addition von flankierenden Sequenzen an den 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorthioat oder 2'-O-Methyl, an Stelle von Phosphodiesterasebindungen innerhalb der Hauptkette des Moleküls. Dieses Konzept lässt sich durch Aufnahme unüblicher Basen, wie Inosin, Queosin und Wybutosin, sowie Acetyl-, Methyl-, Thio-, und ähnlich modifizierten Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die nicht ohne weiteres von endogenen Endonukleasen erkannt werden, erweitern.
H. Fusionsproteine
Ein Fusionsprotein ist ein Expressionsprodukt, das durch Fusion zweier Gene entsteht. Ein solches Protein kann z. B. in rekombinanten DNA-Expressionsstudien oder natürlicherweise in bestimmten viralen Onkogenen produziert werden, wobei das Onkogen mit gag fusioniert ist.
Die Produktion eines Fusionsproteins ergibt sich gelegentlich aus dem Erfordernis, ein kloniertes eukaryotisches Gen unter die Kontrolle eines bakteriellen Promotors zur Expression in einem bakteriellen System zu bringen. Sequenzen des bakteriellen Systems werden dann häufig mit dem eukaryotischen Protein verknüpft exprimiert. Fusionsproteine werden zur Analyse von Struktur, Reinheit, Funktion und Expression heterologer Genprodukte verwendet.
Ein fusioniertes Protein ist ein Hybridproteinmolekül, das produziert werden kann, wenn eine interessierende Nukleinsäure mittels rekombinanter DNA-Techniken in ein Empfängerplasmid eingesetzt wird und das Stopp-Codon für ein Plasmidgen verschiebt. Das fusionierte Protein beginnt am Aminoende mit einem Abschnitt der Plasmidproteinsequenz und endet mit dem interessierenden Protein.
Die Produktion von Fusionsproteinen ist dem Fachmann hinlänglich bekannt (siehe z. B. US-Patente Nr. 5,908,756; 5,907,085; 5,906,819; 5,905,146; 5,895,813; 5,891,643; 5,891,628; 5,891,432; 5,889,169; 5,889,150; 5,888,981; 5,888,773; 5,886,150; 5,886,149; 5,885,833; 5,885,803; 5,885,779; 5,885,580; 5,883,124; 5,882, 941; 5,882,894; 5,882,864; 5,879,917; 5,879,893; 5,876,972; 5,874,304; und 5,874,290). Eine allgemeine Übersicht über Aufbau, Eigenschaften, Anwendungen und Probleme im Zusammenhang mit spezifischen Arten von Fusionsmolekülen, die in der klinischen Medizin und in der Forschungsmedizin verwendet werden, findet sich z. B. in Chamow et al., (1999) Antibody Fusion Proteins, John Wiley.
I. Peptidmimetika
Diese Erfindung umfasst auch Peptidmimetika, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, z. B. Peptidmimetika, welche die dreidimensionale Struktur der NBD auf IKKβ nachahmen und die NEMO-Bindung an der NBD mittels Bindung an NEMO blockieren. Solche Peptidmimetika können merkliche Vorteile gegenüber natürlich vorkommenden Peptiden haben, wie z. B. wirtschaftlichere Produktion, größere chemische Stabilität, verbesserte pharmakologische Eigenschaften (Halbwertszeit, Absorption, Potenz und Wirksamkeit), eine veränderte Spezifität (z. B. ein breites Spekturm biologischer Aktivitäten), eine verringerte Antigenizität usw.
In einer Form sind Mimetika peptidhaltige Moleküle, die Elemente der Proteinsekundärstruktur nachahmen, siehe z. B. Johnson et al., (1993) Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., (Herausgeber) Chapman & Hall. Der zugrunde liegende Gedanke der Verwendung von Peptidmimetika ist, dass die Peptidhauptkette von Proteinen hauptsächlich dazu existiert, die Aminosäureseitenketten so auszurichten, dass molekulare Interaktionen erleichtert werden, wie die zwischen Antikörper und Antigen. Von einem Peptidmimetikum wird erwartet, dass es molekulare Interaktionen zulässt, die dem natürlichen Molekül entsprechen.
In einer anderen Form werden Peptidanaloga üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie als Nicht-Peptid-Wirkstoffe mit Eigenschaften analog zu denen des Modellpeptids verwendet. Diese Arten von Nicht-Peptid-Verbindungen werden auch als „Peptidmimetika" oder „Peptidomimetika" bezeichnet (Fauchere, (1986) Adv. Drug Res. 15, 29–69; Veber & Freidinger, (1985) Trends Neurosci. 8, 392–396; und Evans et al., (1987) J. Med. Chem. 30, 1229–1239) und üblicherweise mit Hilfe der computerisierten Molekularmodellierung entwickelt.
Peptidmimetika mit struktureller Ähnlichkeit zu therapeutisch nützlichen Peptiden können dazu verwendet werden, einen äquivalenten therapeutischen oder prophylaktischen Effekt zu erzeugen. Allgemein sind Peptidmimetika einem paradigmatischen Polypeptid (d. h. einem Polypeptid, das eine biochemische Eigenschaft oder pharmakologische Aktivität aufweist), wie der NBD, strukturell ähnlich, weisen jedoch eine oder mehrere Peptidbindungen auf, die gegebenenfalls durch eine Bindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO- besteht, mittels dem Fachmann bekannter Verfahren ersetzt werden, welche in den folgenden Druckschriften weiter beschrieben sind: Weinstein, (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Marcel Dekker; Morley, (1980) Trends Pharmacol. Sci. 1, 463–468 (allgemeine Übersicht); Hudson et al., (1979) Int. J. Pept. Protein Res. 14, 177–185 (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al., (1986) Life Sci. 38, 1243–1249 (-CH₂-S); Hann, (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 307–314 (-CH-CH-, cis und trans); Almquist et al., (1980) J. Med. Chem. 23, 1392–1398 (-COCH₂-); Jennings-White et al., (1982) Tetrahedron Lett. 23, 2533 (-COCH₂-); US-Patentanmeldung Nr. 4,424,207 (-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., (1983) Tetrahedron Lett. 24, 4401–4404 (-C(OH)CH₂-); und Hruby, (1982) Life Sci. 31, 189–199 (-CH₂-S-).
Die Markierung von Peptidmimetika beinhaltet üblicherweise die kovalente Bindung einer oder mehrerer Markierungen, direkt oder über einen Spacer (z. B. eine Amidgruppe) an (eine) unbeteiligte Position(en) auf dem Peptidmimetikum, die mittels quantitativer Struktur-Aktivitäts-Daten und/oder molekularer Modellierung vorhergesagt werden. Solche unbeteiligten Positionen sind allgemein Positionen, die keine direkten Kontakte mit den Makromolekülen bilden (z. B. keine Kontaktpunkte in NBD-NEMO-Komplexen sind), an die das Peptidmimetikum bindet, um die therapeutische Wirkung zu erzeugen. Eine Derivatisierung (z. B. Markierung) von Peptidmimetika sollte die gewünschte biologische oder pharmakologische Aktivität des Peptidmimetikums nicht wesentlich beeinflussen.
NBD-Peptidmimetika können durch Struktur-basierte Wirkstoffentwicklung mittels Ersetzen von Aminosäuren durch organische Einheiten konstruiert werden (siehe z. B. Hughes, (1980) Philos. Trans. R. Soc. Lond. 290, 387–394; Hodgson, (1991) Biotechnol. 9, 19–21; Suckling, (1991) Sci. Prog. 75, 323–359).
Die Verwendung von Peptidmimetika kann durch die Anwendung kombinatorischer Chemie zum Erzeugen von Wirkstoffbibliotheken verstärkt werden. Die Entwicklung von Peptidmimetika kann durch Identifizieren der Aminosäuremutationen, welche die Bindung einer NBD (z. B. der NBD auf IKKβ) an NEMO erhöhen oder vermindern, unterstützt werden, z. B. solcher Mutationen, wie sie in Tabelle 1 angegeben sind. Anwendbare Ansätze umfassen das Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren (siehe Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582) und die Verwendung des Phagen-Display-Verfahrens.
Mit dem Zwei-Hybrid-Verfahren werden Protein-Protein-Interaktionen in Hefe detektiert (Fields et al., (1989) Nature 340, 245–246). Das Phagen-Display-Verfahren detektiert die Interaktion zwischen einem immobilisierten Protein und einem Protein, das auf der Oberfläche von Phagen, wie Lambda und M13 exprimiert wird (Amberg et al., (1993) Strategies 6, 2–4; Hogrefe et al., (1993) Gene 128, 119–126). Diese Verfahren ermöglichen eine positive und negative Selektion für Protein-Protein-Interaktionen und die Identifizierung der Sequenzen, die diese Interaktionen bestimmen.
Allgemeine Informationen zu Peptidsynthese und Peptidmimetika finden sich beispielsweise in Jones, (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley; und Bodanszky et al., (1993) Peptide Chemistry: A Practical Textbook, 2. überarbeitete Auflage, Springer Verlag.
J. Transgene Tiere (nicht-menschlich)
Transgene Tiere sind genetisch modifizierte Tiere, in die rekombinantes, exogenes oder kloniertes Genmaterial experimentell transferiert wurde. Dieses Genmaterial wird häufig als Transgen bezeichnet. Die Nukleinsäuresequenz des Transgens kann entweder an einer Stelle eines Genoms eingebracht werden, an der diese bestimmte Nukleinsäure normalerweise nicht vorzufinden ist, oder an der normalen Stelle für das Transgen. Das Transgen kann aus Nukleinsäuresequenzen bestehen, die vom Genom derselben Spezies oder einer anderen Spezies als der Spezies des Zieltieres stammen.
Der Begriff „Keimzelllinien-transgenes Tier" bezieht sich auf ein transgenes Tier, bei dem die genetische Veränderung oder genetische Information in eine Keimlinienzelle eingebracht wurde, wodurch dem transgenen Tier die Fähigkeit verliehen wurde, die genetische Information an Nachkommen zu übertragen. Wenn diese Nachkommen diese Änderung oder genetische Information tatsächlich teilweise oder ganz aufweisen, sind auch sie transgene Tiere.
Die Änderung oder genetische Information kann der Tierspezies, zu welcher der Empfänger gehört, fremd sein, nur dem jeweiligen individuellen Empfänger fremd sein oder genetische Information sein, die der Empfänger bereits besitzt. Im letzteren Fall kann das geänderte oder eingebrachte Gen anders als das native Gen exprimiert werden.
Transgene Tiere können mit einer Reihe unterschiedlicher Verfahren hergestellt werden, einschließlich Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen und rekombinanter viraler und retroviraler Infektion (siehe z. B. US-Patent Nr. 4,736,866; US-Patent Nr. 5,602,307; Mullins et al., (1993) Hypertension 22, 630–633; Brenin et al., (1997) Surg. Oncol. 6, 99–110; Tuan, (1997) Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Nr. 62, Humana Press).
Eine Anzahl rekombinanter oder transgener Mäusen wurde produziert, einschließlich solcher, die eine aktivierte Onkogensequenz exprimieren (US-Patent Nr. 4,736,866), die das Simian SV40 T-Antigen exprimieren (US-Patent Nr. 5,728,915), denen die Expression des Interferon-Regulierungsfaktors 1 (IRF-1) fehlt (US-Patent Nr. 5,731,490), die eine dopaminerge Dysfunktion zeigen (US-Patent Nr. 5,723,719), mindestens ein an der Blutdrucksteuerung beteiligtes menschliches Gen exprimieren (US-Patent Nr. 5,731,489), eine größere Ähnlichkeit mit den bei natürlich auftretender Alzheimerscher Krankheit bestehenden Zuständen zeigen (US-Patent Nr. 5,720,936), eine verminderte Fähigkeit zur Vermittlung der Zelladhäsion aufweisen (US-Patent Nr. 5,602,307), ein Rinderwachstumshormongen besitzen (Clutter et al., (1996) Genetics 143, 1753–1760) oder in der Lage sind, eine vollständige menschliche Antikörperantwort zu erzeugen (Zou et al., (1993) Science 262, 1271–1274).
Obwohl Mäuse und Ratten für die meisten transgenen Experimente weiterhin die Tiere der Wahl sind, ist es in manchen Fällen bevorzugt oder auch notwendig, eine andere Tierspezies zu verwenden. Transgene Verfahren wurden erfolgreich bei verschiedenen anderen Tieren als Mäusen angewendet, einschließlich Schafen, Ziegen, Schweinen, Hunden, Katzen, Affen, Schimpansen, Hamstern, Kaninchen, Kühen und Meerschweinchen (siehe Kim et al., (1997) Mol. Reprod. Dev. 46, 515–526; Houdebine, (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35, 609–617; Petters, (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 643–645; Schnieke et al., (1997) Science 278, 2130–2133; Amoah, (1997) J. Animal Science 75, 578–585).
Das Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäurefragmenten in rekombinationsfähige Säugetierzellen kann mit jedem Verfahren erfolgen, das die Cotransformation mehrerer Nukleinsäuremoleküle begünstigt. Detaillierte Prozeduren zur Produktion transgener Tiere stehen dem Fachmann ohne weiteres zur Verfügung, einschließlich der Offenbarungen der US-Patente Nr. 5,489,743 und Nr. 5,602,307.
Diese Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als einschränkend auszulegen sind.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: IDENTIFIZIERUNG DER NEMO-BINDUNGSDOMÄNE AUF IKKB
Um die NEMO-Interaktionsdomäne von IKKβ zu identifizieren, führten wir in vitro-Pulldown-Assays (Zhong et al., (1997) Cell 89, 413–424) unter Verwendung einer bakteriell exprimierten Version von Gesamtlängen-NEMO durch, das an seinem NH2-Terminus mit Glutathion-S-transferase fusioniert war (GST-NEMO; 1A). Es wurden verschiedene Trunkationsmutanten konstruiert, denen verschiedene funktionelle Domänen von IKKβ (katalytische Domäne, Leukin-Zipper und Helix-Schleife-Helix; 1A) fehlten.
Jede Subklonierung und Mutagenese von Gesamtlängen-cDNA-Klonen von IKKα und IKKβ wurde mittels PCR unter Verwendung von klonierter Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Die Wildtyp- und die mutierte IKKβ-cDNA wurden in die KpnI- und NotI-Restriktionsstellen von pcDNA-3 oder pcDNA-3.1-xpress (Invitrogen) eingesetzt, und alle IKKα-cDNAs wurden in die EcoRI- und XhoI-Stellen derselben Vektoren eingesetzt. FLAG-markierte Versionen beider Kinasen wurden durch Subklonieren in pFLAG-CMV-2 (Sigma) konstruiert. Für GST-IKKβ (644-756) wurde das PCR-Fragment in die EcoRI- und XhoI-Stellen von pGEX-4T 1 (Pharmacia) eingesetzt.
Eine Gesamtlängen-cDNA, die den humanen NEMO kodiert, wurde mittels Reverser Transkriptase(RT)-PCR aus HeLa-Zell-mRNA unter Verwendung des Expand^TM Long Template PCR-Systems (Boehringer Mannheim) und des Primer-Paars (5'-ATAGACGAATTCAATAGGCACCTCTGGAAG) (SEQ ID Nr. 20) und (3'-TAGGACCTCGAGCTACTCAATGCACTCCATG) (SEQ ID Nr. 21) erhalten. Das resultierende PCR-Fragment wurde in die EcoRI- und XhoI-Stellen von pcDNA-3 oder pcDNA-s.1-xpress eingesetzt. Alle nachfolgenden NEMO-Mutanten wurden mittels PCR unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase konstruiert. GST-NEMO wurde durch Subklonieren der Gesamtlängen-cDNA in die EcoRI- und XhoI-Stellen von pGEX-4TI konstruiert.
Diese Mutanten wurden durch in vitro-Translation mit [³⁵S]-Methionin markiert (Input; 1B), entweder mit GST alleine oder mit GST-NEMO gemischt und unter Verwendung von Glutathionagarose präzipitiert. Es gab keine Interaktion der Mutanten mit GST alleine, während Wildtyp und alle drei NH2-terminalen Trunkationen von IKKβ (307-756, 458-756 und 486-756) mit GST-NEMO interagierten (1B (rechtes Bild). Dagegen präzipitierte keine der COOH-terminalen Trunkationsmutanten (1-456, 1-605 oder 1-644) mit GST-NEMO. Diese Ergebnisse zeigen, dass NEMO mit einer Region im COOH-Terminus von IKKβ interagiert, die distal zur Helix-Schleife-Helix(HLH)-Domäne liegt. Eine Mutante, die nur aus der Region von Aminosäure 644 (unmittelbar nach der HLH) bis zum COOH-Terminus (Rest 756) von IKKβ bestand, wurde als nächstes konstruiert. Wie in 1C gezeigt ist, präzipitierte diese Mutante nicht mit GST, interagierte aber mit GST-NEMO, was bestätigt, dass diese Region die Interaktion zwischen diesen beiden Molekülen vermittelt.
Die Wirkungen von IKKβ-(644-756) auf IL-1β- und TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung durch transiente Transfektion von HeLa-Zellen mit der Mutante zusammen mit einem NF-κB-abhängigen Reporter-Plasmid (pBIIX-Luciferase) wurden als nächstes untersucht (Kopp & Ghosh, (1994) Science 265, 956–959). Für Transfektionsstudien wurden Platten mit vierundzwanzig Vertiefungen (1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) oder mit sechs Vertiefungen (5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) mit HeLa- und COS-Zellen beimpft, die vierundzwanzig Stunden kultiviert wurden, bevor eine DNA-Transfektion mit Fugene6 (Roche) nach den Vorschriften des Herstellers erfolgte. Die Zellen in den Platten mit vierundzwanzig Vertiefungen bzw. sechs Vertiefungen erhielten jeweils insgesamt 1 μg bzw. 2 μg DNA. Nach achtundvierzig Stunden wurden die Zellen mit TNT (200 mM NaCl, 20 mM Tris-pH 8,0, 1% Triton-100) lysiert, und die Lysate wurden entweder zur Immunpräzipitation oder für einen Luciferase-Assay (Primage Luciferase Assay System) verwendet.
1D zeigt, dass IKKβ-(644-756) die von diesen Cytokinen induzierte NF-κB-Aktivierung in dosisabhängiger Weise inhibierte. Diese Ergebnisse zeigen, dass IKKβ-(644-756) dominant-negativ wirkt, indem es endogenes NEMO aus dem IκB-Kinase-Kernkomplex titriert. Ohne die Rekrutierung von Regulierungsproteinen durch NEMO wird IKKβ refraktorisch gegenüber IL-1β- und TNFα-induzierten Signalen, die sonst dessen Aktivierung bewirken sollten. Strukturell besteht NEMO aus extensiven α-Helixregionen, die zwei prominente Abschnitte von Coiled-Coil und ein Leukin-Zipper-Motiv sowie eine COOH-terminale Zink-Finger-Domäne enthalten (2A) (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297–300). Frühere Studien, mit denen versucht wurde, die Region von NEMO zu identifizieren, die für dessen Interaktion mit IKKβ erforderlich ist, lieferten widersprüchliche Ergebnisse (Harhaj et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 15297–15300). Um sich dieser Frage zuzuwenden, wurden GST-Pulldown-Assays unter Verwendung eines GST-Fusionsproteins von IKKβ-(644-756) (2A) und verschiedener [³⁵S]-Methionin-markierter Trunkationsmutanten von NEMO (2A) durchgeführt. 2A (rechtes Bild) fasst die Ergebnisse dieser Experimente zusammen, in denen gezeigt wurde, dass IKKβ-(644-756) mit NEMO-(1-196), -(1-302) und -(44-419) interagierte, aber nicht mit NEMO-(197-419) oder -(86-419). Identische Ergebnisse wurden aus Immunpräzipitationsstudien unter Verwendung eines Lysates von COS- oder HEK293-Zellen gewonnen, die mit FLAG-markierter IKKβ und den NEMO-Mutanten transient transfiziert waren (Daten nicht gezeigt).
Für alle Immunpräzipitationen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen kultivierte HeLa- oder COS-Zellen in 500 μl TNT lysiert. FLAG-markierte Proteine wurden aus dem Lysat transfizierter Zellen zwei Stunden bei 4°C mit 20 μl Anti-FLAG(M2)-konjugierter Agaroseperlen (Sigma) präzipitiert. Immunpräzipitationen von endogenem IKKβ oder NEMO wurden mit 1 μg spezifischer polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Santa Cruz) plus 20 μl Protein-A-Sepharose (Amersham-Pharmacia) durchgeführt. Für das Immunblotting wurden die Präzipitate dreimal mit TNT und zweimal mit PBS gewaschen und dann in SDS-Probenpuffer suspendiert. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE (10%) getrennt, auf PVDF-Membranen übertragen und mittels verstärkter Chemilumineszenz (Amersham-Pharmacia) visualisiert.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Interaktionsdomäne zwischen den Resten 44 und 86 liegt, einer Region, welche die erste α-Helix von NEMO enthält. Daher wurde eine Mutante hergestellt, in der eine α-Helix bis zur ersten Coiled-Coil-Domäne deletiert war (Reste T50-L93; del.αH). Diese Mutante zeigte keine Interaktion mit IKKβ-(644-756) (2B). Ferner zeigten Transfektionsstudien unter Verwendung von pBIIX-Luciferase, dass del.αH die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivität inhibierte (2C), was frühere Berichte bestätigt, wonach der COOH-Terminus von NEMO, der nicht mit IKKβ interagieren kann, ein dominant-negativer Inhibitor von NF-κB sei (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297–300).
Zusammen genommen zeigen die 1 und 2, dass die Interaktion zwischen IKKβ und NEMO über den COOH-Terminus von IKKβ und die erste α-Helixregion von NEMO erfolgt. Diese Erkenntnisse legen ein Modell nahe, bei dem der NH2-Terminus von NEMO dieses am IKK-Komplex verankert, wobei der Rest des Moleküls, der mehrere Protein:Protein-Interaktionsdomänen enthält, frei und zugänglich bleibt, um mit stromaufwärtigen Regulatoren der IKK-Funktion zu interagieren.
BEISPIEL 2: NEMO-REGULIERUNG DER IKKB-FUNKTION DURCH INTERAKTION AN DER NBD
Zur vollständigen Charakterisierung der NEMO-Interaktionsdomäne von IKKβ wurden weitere Trunkationsmutanten zwischen den Resten V644 und S756 (3A) konstruiert. Unmittelbar nach der HLH zeigt die Aminosäuresequenz bis zum Cystein in Position 662 eine 72%ige Übereinstimmung mit IKKα (in 3A mit α₁ bezeichnet). Daran anschließend ist die Region bis E707 eine Serin-reiche Domäne, von der früher berichtet wurde, dass sie ein Ziel für die Autophosphorylierung sei und eine Abwärtsregulierung der IKKβ-Aktivität nach Stimulierung durch entzündungsfördernde Cytokine bewirke (Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313). Die darauf folgende Sequenz enthält bis Position 733 keine Serinreste. Mutanten, denen nacheinander jede dieser Regionen fehlte, wurden mit [³⁵S]-Methionin markiert und in GST-Pulldown-Assays verwendet, wie dies oben beschrieben ist. 3A fasst die Ergebnisse dieser Experimente zusammen, wobei sich zeigt, dass keine der IKKβ-Mutanten mit GST-NEMO präzipitiert und ersichtlich ist, dass die Interaktionsdomäne im äußersten COOH-Terminus zwischen den Resten F734 und S756 liegt.
Ein Vergleich dieses kurzen Segmentes von IKKβ mit der entsprechenden Region von IKKα zeigt zwei auffällige Strukturmerkmale (3B). Erstens ist die Sequenz von F734 bis T744 bei IKKβ (α2 in 3B) mit der entsprechenden Sequenz von IKKα (L737 bis L742 von IKKβ und L738 bis L743 von IKKα) identisch. Zweitens geht die Sequenz von IKKβ über den COOH-terminalen Rest von IKKα (E745) um zwölf Aminosäuren hinaus, die eine stark saure Region umfassen, in der fünf der Reste Glutamate sind (3B). Die starke Ähnlichkeit zwischen der α2-Region von IKKβ und dem äußersten COOH-Terminus von IKKα zusammen mit früheren Berichten, wonach NEMO in vitro nicht mit IKKα interagiert (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297–300), führten zu der Hypothese, dass die NEMO-Interaktionsdomäne der Glutamat-reiche Abschnitt von IKKβ (E745 bis S756) sei.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Trunkationsmutante hergestellt, der diese Region fehlte (1-744; 3C), und deren Fähigkeit zur Interaktion mit GST-NEMO untersucht. Die Mutante assoziierte in gleichem Maße mit GST-NEMO wie Wildtyp-IKKβ (3C); diese Ergebnisse wurden durch Co-Immunpräzipitation von Epitop-markiertem NEMO und IKKβ-(1-744) aus dem Lysat von transient transfizierten COS-Zellen bestätigt. Diese Erkenntnisse zeigen, dass die NEMO-Interaktionsdomäne von IKKβ innerhalb der α2-Region des COOH-Terminus liegt.
Als nächstes wurden IKKβ-COOH-terminale Trunkationsmutanten zum Testen der Effekte der NEMO-Bindung auf die basale und induzierte Aktivität von IKKβ verwendet. 3D zeigt, dass die Trunation von IKKβ bei V644, bei welcher die Serin-reiche Region eliminiert war (siehe 3A), zu einem vollständigen Verlust der basalen Autophosphorylierung führte. Dagegen zeigte eine Mutante, welche die Serin-reiche Region (1-733) enthielt, deutlich höhere Autophosphorylierungsniveaus als Wildtyp-IKKβ (3D). Interessanterweise war das Autophosphorylierungsniveau von IKKβ-(1-744), welche die α2-NEMO-Bindungsregion enthielt, mit dem bei der Wildtyp-Kinase beobachteten identisch. Zum Testen der Wirkungen, welche diese Mutationen auf die basal Kinaseaktivität haben, wurden Mutanten in HeLa-Zellen transient transfiziert und die NF-κB-Aktivität mittels Luciferase-Assay bestimmt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse in 3D zeigen, dass IKKβ-(1-644) keine NF-κB-Aktivität induzierte, während IKKβ-(1-733) im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte Aktivierung bewirkte (3E). Ferner war die durch IKKβ-(1-744) induzierte NF-κB-Aktivität identisch mit der durch Wildtyp-IKKβ induzierten Aktivität.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die basale Autophosphorylierung und Kinaseaktivität von IKKβ von der Fähigkeit von NEMO zur Bindung an die Kinase abhängen. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtungen ist, dass NEMO eine Phosphatase zum IKK-Komplex rekrutiert, welche die IKKβ-Funktion durch Targeting der Serin-reichen Region des COOH-Terminus reguliert. Die Unfähigkeit zur Bindung von NEMO verhindert somit eine Phosphataserekrutierung und verursacht eine erhöhte Phosphorylierung innerhalb dieser Region.
Um den Effekt, den der Verlust der α2-Region auf die katalytische Aktivität von IKKβ hat, direkt zu untersuchen, wurde ein Immunkomplex-Kinase-Assay mit Lysat aus transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt (3F). Für die Immunkomplex-Kinase-Assays wurden Präzipitate mit TNT und dann mit Kinasepuffer gewaschen (20 mM HEPES pH 7,5, 20 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2 mM NaF, 2 mM β-Glycerophosphat, 1 mM DTT, 10 pM ATP). Dann wurden die Präzipitate fünfzehn Minuten bei 30°C in 20 μl Kinasepuffer inkubiert, der GST-IκBα-(1-90) und 10 μCi [³²P]-γ-markierte ATP (Amersham-Pharmacia) enthielt. Das Substrat wurde mit Glutathionagarose (Amersham-Pharmacia) präzipitiert und mittels SDS PAGE (10%) getrennt. Die Kinaseaktivität wurde mittels Autoradiographie bestimmt. Mit dem Kinasekomplex assoziierte, phosphorylierte Proteine, erschienen auf Autoradiographien, da der immunpräzipitierte Komplex vor der GST-Substrat-Präzipitation nicht entfernt worden war. Die Aktivität von IKKβ (Wildtyp) war in den unbehandelten Zellen niedrig, nach Behandlung mit TNFα jedoch deutlich erhöht. Entsprechend den in 3E angegebenen Daten war die basale Aktivität von IKKβ-(1-733) merklich höher als beim Wildtyp, wobei diese Aktivität jedoch durch Behandlung mit TNFα nicht weiter erhöht wurde (3F). Ferner war die basale und TNFα-induzierte katalytische Aktivität von IKKβ-(1-744) mit der Aktivität von IKKβ (WT) identisch. Neben phosphorylierten GST-IκBα-Proteinen wurden auch autophosphorylierte IKKβ-Proteine detektiert (3F, obere Banden). Nach TNFα-Behandlung wurden IKKβ (WT) und IKKβ-(1-744) rasch autophosphoryliert, während die bereits hohe basale Phosphorylierung von IKKβ-(1-733) nur geringfügig anstieg (3F). Eine frühere Studie zeigte, dass die Autophosphorylierung zum Herunterregulieren der TNFα-induzierten IKKβ-Aktivität führt, indem sie Strukturveränderungen innerhalb des Proteins verursacht (Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313).
Zusammen genommen zeigen diese Erkenntnisse (3D–F), dass IKKβ in Abwesenheit von NEMO autophoshoryliert, basal aktiv und gegenüber TNFα-induzierten Signalen refraktorisch wird, was zeigt, dass NEMO sowohl bei der Herunterregulierung als auch bei der Aktivierung der IKKβ-Aktivität eine grundlegende Rolle spielt.
Ein zusätzliches Band, das ein phosphoryliertes Protein darstellt, erschien nur in den Proben von TNFα-induzierter IKKβ (WT) und IKKβ-(1-744)-transfizierten Zellen (3F). Das Molekulargewicht dieses Proteins (49 kDa) weist stark darauf hin, dass es sich um endogenen NEMO handelt, der an den präzipitierten Komplex gebunden ist. Dies wird durch die Abwesenheit der Bande in beiden Präzipitaten (+/–TNFα) von IKKβ-(1-733)-transfizierten Zellen gestützt. Dieses Protein wurde als phosphorylierter NEMO identifiziert, indem der präzipitierte Komplex in SDS dissoziiert und [³²P]-markierter NEMO unter Verwendung von spezifischen Anti-NEMO-Antikörpern erneut immunpräzipitiert wurde. Die induzierte Phosphorylierung von NEMO kann daher eine weitere Ebene der Regulierung der Aktivität des IKK-Komplexes darstellen.
BEISPIEL 3: IDENTIFIKATION DER NBD AUF IKKA
Da die α2-Region von IKKβ dem COOH-Terminus von IKKα sehr ähnlich ist (3B), wurde die Fähigkeit von IKKα zur Interaktion mit NEMO getestet.
Immunpräzipitationen aus dem Lysat von COS-Zellen, die mit xpress-markiertem NEMO zusammen mit FLAG-markierten Versionen von IKKα oder IKKβ transient transfiziert waren, wurden unter Verwendung von Anti-FLAG wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. 4A zeigt, dass NEMO mit IKKβ ebenso gut interagierte wie mit IKKα. Es ist möglich, dass bei diesem Experiment die Interaktion mit IKKα nicht direkt ist, sondern stattdessen durch die Bildung eines Komplexes bedingt ist, der endogene IKKβ, FLAG-IKKα und xpress-NEMO enthält. Daher wurde ein GST-Pulldown-Assay unter Verwendung von GST-NEMO und [³⁵S]-Methionin-markierten Versionen von Wildtyp-IKKα oder einer trunkierten IKKα-Mutante, der die acht COOH-terminalen Aminosäuren fehlten (1-737: 4B), durchgeführt. In Übereinstimmung mit den oben dargelegten Erkenntnissen (4A), aber im Gegensatz zu früheren Berichten (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297–300) interagierte Wildtyp-IKKα mit NEMO in vitro, die trunkierte Mutante dagegen nicht (4B). Diese Ergebnisse zeigen nicht nur, dass IKKα mit NEMO interagiert, sondern auch, dass dies über die COOH-terminale Region erfolgt, welche die sechs Aminosäuren enthält, die IKKα und die α2-Region von IKKβ (3B) miteinander teilen. Gen-Targeting-Studien zeigten starke Unterschiede hinsichtlich der Aktivierung von IKKα und IKKβ duch TNFα (Woronicz et al., (1997) Science 278, 866–869; Zandi et al., (1997) Cell 91, 243–252; Mercurio et al., (1997) Science 278, 860–866; DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548–554; Régnier et al., (1997) Cell 90, 373–383).
Die vorliegenden Erkenntnisse zeigen, dass die Grundlage dieses Unterschiedes nicht durch eine differentielle Rekrutierung von NEMO bedingt ist (Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313; Takeda et al., (1999) Science 284, 313–316; Hu et al., (1999) Science 284, 316–20; Li et al., (1999) Science 284, 321–325; Li et al., (1999) J. Exp. Med. 189, 1839–1845; Li et al., (1999) Genes Dev. 13, 1322–1328; Tanaka et al., (1999) Immunity 10, 421–429). Stattdessen liegt der Unterschied höchstwahrscheinlich in der Fähigkeit jeder Kinase, die NEMO-assoziierten Signalisierungskomponenten in eine Aktivierungsantwort zu integrieren, vermutlich aufgrund von Unterschieden der inhärenten regulatorischen Merkmale der jeweiligen Kinasen.
Weitere Belege dafür, dass diese kurze COOH-terminale Sequenz die NEMO-Interaktionsdomäne der IKKs bildet, wurden erhalten, als wir die Fähigkeit der vor kurzem beschriebenen, IKK-verwandten Kinase IKKi (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362) zur Interaktion mit NEMO testeten. Ein Sequenzvergleich mit IKKα und IKKβ (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362; Woronicz et al., (1997) Science 278, 866–869; Zandi et al., (1997) Cell 91, 243–52; Mercurio et al., (1997) Science 278, 860–866; DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548–554; Régnier et al., (1997) Cell 90, 373–383) zeigt, dass IKKi nicht in ihrem COOH-Terminus die α2-Region aufweist (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362), und in Übereinstimmung damit, dass es sich hierbei um die NEMO-Bindungsdomäne handelt, stellten wir fest, dass IKKi in Pulldown-Assays nicht mit GST-NEMO interagiert (4C). Diese Erkenntnis zeigt, dass NEMO nicht für die funktionelle Aktivität von IKKi erforderlich ist, und dies wird durch die Unfähigkeit von IKKi zur Reaktion auf mittels TNFα oder IL-1β induzierte Signale gestützt (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362).
BEISPIEL 4: MUTATION VON AMINOSÄURERESTEN IN DER NBD
Nachdem festgestellt wurde, dass die α2-Region von IKKβ und die entsprechende Sequenz von sechs Aminosäuren von IKKα kritisch für die Interaktion mit NEMO sind [als NEMO-Bindungsdomäne (NBD) bezeichnet], wurde in IKKβ eine Deletionsmutante konstruiert, der die sechs Aminosäuren von L737 bis L742 fehlten (del.NBD). Diese Deletionsmutante assoziierte nicht mit GST NEMO (4D). Eine Untersuchung vorhergesagter struktureller und biochemischer Merkmale der NBD im Zusammenhang mit umgebenden Resten legt nahe, dass sie eine unflexible hydrophobe „Tasche" innerhalb einer hydrophilen Region des IKKβ-COOH-Terminus bildet (4E). Dies legt ein Modell nahe, in dem die NBD in die erste α-Helixregion von gebundenem NEMO (2) eingebettet wird, was ihre Exposition gegenüber einer wässrigen Umgebung verhindert, wodurch eine starke intermolekulare Interaktion aufrecht erhalten wird. Ob die Interaktion tatsächlich von dieser Hydrophobizität abhängt, bleibt noch zu ermitteln; wir stellten jedoch fest, dass eine Substitution von W739 oder W741 durch Alanin die Bindung von NEMO an IKKβ (4F) verhindert. Daher ist jeder dieser hydrophoben Tryptophanreste kritisch für das Bewahren einer funktionellen NBD. Zudem verhinderte eine Mutation von D738 zu Alanin auch eine NEMO-Interaktion, was darauf hinweist, dass ein negativ geladener Rest an dieser Position für die NBD-Funktion erforderlich ist. Im Gegensatz zu diesen Mutationen beeinflusste eine Substitution von L737, S740 oder L742 durch Alanin die NEMO-Bindung nicht. Zur Untersuchung der Wirkungen dieser Alanin-Substitutionen auf die IKKβ-Funktion wurden HeLa-Zellen mit jeder der Punktmutanten zusammen mit pBIIX-Luciferase-Reporter transfiziert. Im Einklang mit der Beobachtung, dass die Basalaktivität von IKKβ in Abwesenheit von gebundenem NEMO erhöht ist, aktivierten IKKβ-(1-733)-Mutanten (3E), die nicht an NEMO banden (D738A, W739A und W741A), NF-κB in größerem Maße als Wildtyp-IKKβ oder IKKβ-(1-744) (4G). Dagegen induzierten Mutanten, die Substitutionen enthielten, welche die NEMO-Assoziation nicht störten (L737A, S740A und L742A), NF-κB in gleichem Maße wie die Kontrollen. Diese Ergebnisse zeigen, dass NEMO eine kritische Rolle beim Herunterregulieren der intrinsischen IKKβ-Aktivität spielt.
Weitere Mutationen in der NBD wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zum Beeinflussen der NEMO-Bindung an IKKβ mit dem in Beispiel 3 erläuterten GST-Pulldown-Assay analysiert (siehe Tabelle 1). Tabelle 1 Charakterisierte NBD-Mutanten und ihre Fähigkeit zur Bindung an NEMO

* Der substitutierte Aminosäurerest ist fett gedruckt angegeben.

BEISPIEL 5: AGENZIEN, DIE MIT DER NBD INTERAGIEREN, UM DIE NEMO-BINDUNG ZU BLOCKIEREN
Die relativ geringe Größe der NBD macht sie zu einem attraktiven Ziel für die Entwicklung von Verbindungen, die auf eine Trennung des IKK-Kernkomplexes gerichtet sind. Die Relevanz dieses Ansatzes wurde untersucht, indem zellpermeable Peptide hergestellt wurden, welche sich über die IKKβ-NBD erstrecken, und ihre Fähigkeit, die IKKβ-NEMO-Interaktion zu stören, bestimmt wurde.
Die Sequenzen der beiden NBD-Peptide, die für diese Studie verwendet wurden, waren [DRQIKIWFQNRRMKWKK]TALDWSWLQTE (Wildtyp) (SEQ ID Nr. 18) und [DRQIKIWFQNRRMKWKK]TALDASALQTE (Mutante) (SEQ ID Nr. 19). Die Antennapedia-Homöodomäne-Sequenz (Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444–10450; US-Patent Nr. 5,888,762; US-Patent Nr. 6,015,787; US-Patent Nr. 6,080,724) ist in Klammern gesetzt, und die Positionen der Wto A-Mutationen sind unterstrichen. Beide Peptide wurden in DMSO bis zu einer Stammkonzentration von 20 mM gelöst. Bei allen Experimenten unterschieden sich die Kontrollen mit DMSO alleine nicht von Kontrollen ohne Peptid.
Das Wildtyp-NBD-Peptid bestand aus der Region von T735 bis E745 der IKKβ, die mit einer Sequenz fusioniert war, welche von der dritten Helix der Antennapedia-Homöodomäne stammte, die, wie gezeigt wurde, die Membrantranslokation vermittelt (Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444–10450). Die Mutante war identisch, mit der Ausnahme, dass die Tryptophanreste (W739 und W741) in der NBD zu Alanin mutiert waren. 5A zeigt, dass die NBD (WT), nicht aber die Mutante, dosisabhängig einen in vitro-Pulldown von [³⁵S]-markierter IKKβ durch GST-NEMO und von [³⁵S]-markiertem NEMO durch GST-IKKβ-(644-756) inhibierte. Zum Testen der Fähigkeit der NBD-Peptide, in Zellen einzudringen und die IKKβ-NEMO-Interaktion zu inhibieren, wurden HeLa-Zellen über unterschiedliche Zeiträume mit den Peptiden inkubiert und immunpräzipitierten den IKK-Komplex mittels Anti-NEMO. In Übereinstimmung mit den in vitro-Daten (5A) störte der Wildtyp, aber nicht die Mutante, die Bildung des endogenen IKK-Komplexes (5B).
BEISPIEL 6: AGENZIEN, WELCHE DIE NEMO-FUNKTION BLOCKIEREN
Anschließend wurden die Wirkungen der NBD-Peptide auf die signalinduzierte Aktivierung von NF-κB untersucht. Nach Transfektion der HeLa-Zellen mit dem pBIIX-Luciferase-Reporter wurden die Zellen mit Wildtyp- oder mit Mutanten-Peptiden vorinkubiert und mit TNFα behandelt, und die NF-κB-Aktivierung wurde mittels Luciferase-Reporter-Assay bestimmt. Wie in 5C (linkes Bild) gezeigt, inhibierte das Wildtyp-NBD-Peptid die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung, während die Mutante keine Wirkung zeigte. Interessanterweise wurde die basale NF-κB-Aktivität durch Behandlung mit dem Wildtyp-Peptid verstärkt (5C; rechtes Bild); diese Erkenntnis stimmt mit den Ergebnissen einer vorhergehenden Mutationsanalyse (3E–F und 4G) überein. Dies zeigt, dass das Entfernen von NEMO die basale, intrinsische Aktivität von IKK erhöht und gleichzeitig deren Ansprechen auf TNFα unterbindet. Ferner zeigte eine Analyse mittels elektrophoretischer Mobilitätsshift-Assays (EMSA) auch, dass nur das Wildtyp-NBD-Peptid die TNFα-induzierte Aktivierung und die Kerntranslokation von NF-κB inhibierte (5D). Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Abgabe eines intakten NBD-Peptids in Zellen die IKKβ-NEMO-Interaktion stört und verhindert, dass entzündungsfördernde Signale NF-κB inhibieren. Dagegen zeigt die Transduktion mit einem Peptid, das Mutationen an den Tryptophanresten aufweist, die zum Aufrechterhalten der NEMO-Interaktion kritisch sind, keine Wirkung.
BEISPIEL 7: AGENZIEN MIT DER FÄHIGKEIT ZUM HERUNTERREGULIEREN VON E-SELEKTIN
Zahlreiche Proteine, die an der Initiation und Aufrechterhaltung entzündlicher Reaktionen beteiligt sind, erfordern eine NF-κB-Aktivierung für die induzierte Expression ihrer Gene (Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225–260; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80–88). Ein solches Protein, E-Selektin, ist ein Leukozyten-Adhäsionsmolekül, das auf der luminalen Oberfläche vaskulärer Endothelzellen nach Aktivierung durch entzündungsfördernde Stimuli, wie IL-1 oder TNFα exprimiert wird (Pober et al., (1986) J. Immunol. 436, 1680–1687; Bevilacqua et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9238–9242; Collins et al., (1995) FASEB J. 9, 899–909). Die Expression von E-Selektin und anderen NF-κB-abhängigen Adhäsionsmolekülen ist für die Hemmung von Leukozyten und deren Rekrutierung an Orte akuter und chronischer Entzündung entscheidend. Zur Bestimmung des entzündungshemmenden Potentials des NBD-Peptids wurden primäre humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) mit den Wildtyp- und Mutanten-Peptiden behandelt, und die E-Selektin-Expression wurde mit TNFα induziert. Entsprechend den Wirkungen auf die basale NF-κB-Aktivierung (5C), induzierte das Wildtyp-NBD-Peptid eine E-Selektin-Expression geringen Ausmaßes (5E). Nach TNFα-Behandlung verringerte jedoch der Wildtyp, nicht aber die Mutante, die E-Selektin-Expression deutlich (5E).
Eine Inhibierung mittels Wildtyp-NBD-Peptid verringerte die Expression auf das Niveau, das durch das Peptid in Abwesenheit von TNFα induziert wird.
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung ist auf zwei Ebenen zu sehen. Erstens haben die Anmelder die strukturellen Anforderungen für die Bindung von NEMO an die IKKs identifiziert und festgestellt, dass die Bindung an IKKβ von drei Aminosäuren (D738, W739 und W741) innerhalb der NBD abhängt. Des weiteren wirkt NEMO nicht nur an der Aktivierung von IKKβ mit, sondern spielt auch eine kritische Rolle bei der Unterdrückung der intrinsischen, basalen Aktivität des IKK-Komplexes. Die zweite Ebene ihrer Bedeutung ist die offensichtliche klinische Verwendung für Wirkstoffe, die gegen die NBD gerichtet sind. Die Anmelder haben gezeigt, dass ein zellpermeables Peptid, das die NBD umfasst, nicht nur in der Lage ist, die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung zu inhibieren, sondern auch die Expression von E-Selektin, einem NF-κB-abhängigen Zielgen, in primären menschlichen Endothelzellen zu verringern. Die NBD ist nur sechs Aminosäuren lang, und es gehört daher zum Können eines Fachmanns, peptidmimetische Verbindungen zu schaffen, die den IKK-Kernkomplex trennen. Da das Trennen des Komplexes die basale Aktivität der IKK erhöhen soll, kann eine Behandlung mit einer gegen die NBD gerichteten Verbindung Probleme der Toxizität, z. B. durch Hepatozytenapoptose, vermeiden, die sich aus der Verabreichung von Wirkstoffen ergeben könnten, welche die Aktivität von NF-κB vollständig unterbinden. Somit ist die Identifizierung der NBD eine Möglichkeit zur Entwicklung neuer entzündungshemmender Wirkstoffe, die verhindern, dass Aktivierungssignale den IKK-Komplex erreichen, dabei jedoch ein niedriges NF-κB-Aktivitätsniveau beibehalten und mögliche toxische Nebenwirkungen vermeiden.
BEISPIEL 8: NBD-PEPTID-VERMITTELTE INHIBIERUNG ENTZÜNDLICHER REAKTIONEN IN VIVO
Das NBD-Peptid wurde auf seine Fähigkeit zur Inhibierung entzündlicher Reaktionen bei Tieren unter Verwendung zweier unterschiedlicher Modelle einer akuten Entzündung untersucht. Im ersten Modell wurde ein Ohrenödem in Mäusen mittels Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) induziert, und die Effekte einer topischen Verabreichung der NBD-Peptide wurden bestimmt. Ein Ohrenödem wurde mittels PMA in Replikatgruppen von alters- und geschlechtsmäßig zusammenpassenden Mäusen in zuvor beschriebener Weise induziert (Chang et al., (1987) Eur. J. Pharmacol. 142, 197–205). Je zwanzig μl NBD-Peptide (200 μg/Ohr), Dexamethason (40 μg/Ohr) oder Träger (DMSO:Ethanol; 25:75 V/V) wurden dreißig Minuten vor und dreißig Minuten nach Applikation von 20 μl in Ethanol gelöstem PMA (5 μg/Ohr) topisch auf das rechte Ohr aufgebracht. Die Ohrenschwellung wurde sechs Stunden nach PMA-Applikation mit einer Mikrometerschraube gemessen und als mittlerer Dickenunterschied zwischen dem behandelten (rechten) und dem unbehandelten (linken) Ohr ausgedrückt. Eine statistische Analyse der Daten wurde mit dem Student t-Test durchgeführt. Dabei wurde ein Wert von p < 0,05 für statistisch signifikant erachtet.
6A zeigt, dass das Wildtyp-Peptid die PMA-induzierte Ohrenverdickung merklich (77 ± 3% Inhibierung; p < 0,05), bis zu dem mit Dexamethason zu beobachtenden Niveau (82 ± 9% Inhibierung; p < 0,05), verringerte. Im Gegensatz dazu war der mit einer äquivalenten Dosis der Mutante beobachtete Effekt unbedeutend (p = 0,09). Keines der Peptide zeigte eine Wirkung, wenn es ohne PMA verabreicht wurde (nicht gezeigt).
In einem zweiten Modell wurde Peritonitis in Mäusen mittels intraperitonealer (i. p.) Injektion von Zymosan alleine oder in Kombination mit Dexamethason oder den NBD-Peptiden induziert. Für die Zymosan-induzierte Peritonitis wurde eine Messung an peritonealen Exsudaten und Ansammlungen entzündlicher Zellen von Replikatgruppen alters- und geschlechtsmäßig zusammenpassender Mäuse (C57BL/6NCR) in zuvor beschriebener Weise durchgeführt (Getting et al., (1998) Immunology 95, 625–630). Gruppen der Tiere wurden gleichzeitig ein ml Zymosan (1 mg/ml) und entweder Dexamethason (100 mg/ml) oder die NBD-Peptide (200 mg/ml) injiziert. Die Konzentration von NOX (Nitrat plus Nitrit), die in den entzündlichen Exsudaten vorhanden war, wurde mit einem kolorimetrischen Assay-Kit (Alexis Corporation) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Wie in 6B gezeigt ist, bewirkte die Zymosan-Injektion eine Akkumulierung von entzündlichen Exsudatfluiden und eine Migration von Polymorphonuklearzellen (PMN) in das Peritoneum dieser Tiere. Eine Behandlung der Mäuse mit Wildtyp-NBD-Peptid oder Dexamethason verringerte die Exsudatbildung und die PMN-Akkumulierung merklich, während die Mutante keine Wirkung zeigte.
Verschiedene in vivo-Studien zeigten eine Rolle von NO bei der Exsudatbildung und bei der Leukozytenmigration zu Entzündungsherden (Ialenti et al., (1992) Eur. J. Pharmacol. 211, 177–182; Ialenti et al., (1993) Br. J. Pharmacol. 110, 701–706; Iuvone et al., (1998) Br. J. Pharmacol. 123, 1325–1330). Daher wurden die Wirkungen der NBD-Peptide auf die NOX-Akkumulierung in den peritonealen Exsudaten von Zymosan-behandelten Mäusen untersucht.
6C (unteres Bild) zeigt, dass Dexamethason und Wildtyp-Peptid eine Verringerung von NOX um 86 ± 7% bzw. 66 ± 4% bewirkten, während die Mutante keine Wirkung zeigte. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die zeigten, dass die Verminderung der Exsudatbildung und der Zellakkumulierung eng mit der Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und mit der Verminderung der NO-Bildung zusammenhängt (D'Acquisto et al., (1999) Eur. J. Pharmacol. 369, 223–236; D'Acquisto et al., (1999) Naunyn-Schmeideberg's Arch. Pharmacol. 360, 670–675). Daher ist das Wildtyp-NBD-Peptid in experimentellen Tiermodellen ein wirksamer Entzündungshemmer.
BEISPIEL 9: INHIBIERUNG DER OSTEOKLASTENDIFFERENZIERUNG DURCH DAS NBD-PEPTID
Die Prozesse der Knochenmorphogenese und -wiederherstellung erfordern das Bewahren eines Gleichgewichtes zwischen der Synthese von Knochenmatrix durch Osteoblasten und der Resorption von Knochen durch Osteoklasten (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66–80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357). Die knochenresorbierenden Osteoklasten sind mehrkernige Riesenzellen, die sich aus Myeloidvorläufern und verschiedenen löslichen Faktoren, wie dem Kolonie-stimulierenden Faktor-1 (CSF-1), Interleukin-1 (IL-1), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), IL-6 und IL-11 (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66–80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357), differenzieren, welche die Osteoklastendifferenzierung in unterschiedlichen Stadien beeinflussen. Ein Faktor, der kritisch für die Osteoklastogenese ist, ist das kürzlich beschriebene Molekül mit der Bezeichnung RANKL (Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden), das auch als ODF (Osteoklastendifferenzierungsfaktor), OPGL (Osteoprotegerinligand) und TRANCE (durch die TNF-abhängige Aktivierung induziertes Zytokin) (Kong et al., (1999) Nature, 397, 315–323; Lacey et al., (1998) Cell 93, 165–176; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357; Wong et al., (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 715–724; Yasuda et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3597–3602). Der Rezeptor für RANKL ist ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie, die als RANK (Rezeptoraktivator von NF-κB) bezeichnet wird (Anderson et al., (1997) Nature 390, 175–179; Dougall et al., (1999) Genes Dev. 13, 2412–2424), und die Bindung von RANKL induziert die NF-κB-Aktivierung (Anderson et al., (1997) Nature 390, 175–179; Darnay et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 20551–20555; Darnay et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 7724–31; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357; Wong et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 28355–28359).
Darüber hinaus hängt die Osteoklastendifferenzierung von der NF-κB-Aktivierung ab, und Gen-Targeting-Studien haben gezeigt, dass reife Osteoklasten sich in Mäusen, denen die p50- und p52-NF-κB-Untereinheiten fehlen, nicht entwickeln (Franzoso et al., (1997) Genes Dev. 11, 3482–3496).
Die Osteoporose ist eine stark schwächende Erkrankung, die durch einen erheblichen Verlust an Knochenmasse gekennzeichnet ist, der durch eine Osteoklasten-abhängige Knochenresorption vermittelt wird (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66–80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357). Es ist daher möglich, dass eine selektive Inhibierung der NF-κB-Aktivierung in Osteoklasten-Vorläuferzellen die Osteoklastendifferenzierung verhindern und als Grundlage für therapeutisch wirksame Arzneimittel zur Behandlung von Osteoporose dienen würde. Daher wurde die Wirkung der NBD-Peptide auf die Osteoklastendifferenzierung unter Verwendung eines zuvor beschriebenen in vitro-Modells untersucht (Jimi et al., (1999) Exp. Cell Res. 247, 84–93). In Gewebekulturplatten mit 48 Vertiefungen plattierte Maus-Knochenmarkszellen wurden sechs Tage mit humanem Makrophagen-Koloniestimulierungsfaktor (M-CSF; 20 ng/ml) und mit humanem RANKL (100 ng/ml) in Abwesenheit oder Gegenwart verschiedener Konzentrationen (6,25, 12,5 und 25 mM) von Mutanten- oder Wildtyp-NBD-Peptid inkubiert. Dann wurden die Zellen fixiert und für den Osteoklasten-phänotypischen Marker, Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP), eingefärbt, und TRAP-positive, mehrkernige Zellen, die mehr als drei Nuklei enthielten, wurden als Osteoklasten gezählt. Dreifachproben wurden gezählt, und die Ergebnisse wurden als ± SD berechnet. Wie in 7 gezeigt, inhibierte zwar das Wildtyp-Peptid, nicht aber das Mutanten-Peptid, dosisabhängig die Osteoklastendifferenzierung.
Diese Daten zeigen, dass die Trennung des IKK-Kernkomplexes durch ein zellpermeables NBD-Peptid, das die NF-κB-Aktivierung inhibiert, die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung verhindert, was darauf hinweist, dass Wirkstoffe, welche spezifisch gegen die NBD gerichtet sind, zur Behandlung von Osteoporose wirksam sein werden. Als Erweiterung dieser in vitro-Studien können die gleichen Peptide hinsichtlich ihrer Effekte auf die Osteoporose in vivo analysiert werden. Dabei werden ovarektomierte Mäuse (Charles River Labs), die eine schwere Osteoporose aufweisen, werden mit den NBD-Peptiden behandelt und die Effekte auf die Knochendichte über einen Behandlungszeitraum bestimmt.
BEISPIEL 10: EFFEKT VON NBD-PEPTIDEN AUF ANDERE NF-KB-VERMITTELTE STÖRUNGEN
Zudem ist es auch möglich, die Effekte der NBD-Peptide auf Asthma zu untersuchen. Die NF-κB-Aktivierung in bronchiolaren Epithelzellen, T-Zellen und bronchiolaren Makrophagen wurde in den Atemwegen von Asthmapatienten und in Tiermodellen von Asthma beobachtet (Ray & Cohn, (1999) J. Clin. Invest. 104, 985–993; Christman et al., (2000) Chest 117, 1482–1487). Auch bewirken zahlreiche Agenzien, die Asthma induzieren, eine NF-κB-Aktivierung, und zahlreiche Gene, die an Asthma beteiligte Proteine kodieren (d. h. Leukozytenadhäsionsmoleküle, verschiedene Chemokine, induzierbare Stickoxid-Synthase), sind NF-κB-abhängig. Ein etabliertes Mausmodell für Asthma (Kleeberger et al., (1990) Am J. Physiol. 258, 313–320) kann zum Testen der Effekte einer Aerosol-Verabreichung der NBD-Peptide auf das Fortschreiten dieser mit Asthma assoziierten Zustände verwendet werden.
In gleicher Weise können auch die Effekte der NBD-Peptide auf einen septischen Schock bestimmt werden. Ein septischer Schock umfasst die Expression zahlreicher NF-κB-abhängiger Gene (d. h. TNF, IL-1), die durch bakterielle Endotoxine, wie Lipopolysaccharid (LPS), induziert werden.
LPS umfasst die Hauptbestandteile der Zellwände gram-negativer Bakterien, ist hoch immunogen und stimuliert die Produktion der endogenen Pyrogene IL-1 und TNF (Sell et al., (1996) Immunology, Immunopathology & Immunity, Appleton & Lange). Zum Testen der Effekte der NBD-Peptide auf einen septischen Schock werden Mäusen die NBD-Peptide und LPS injiziert, und das Überleben der Tiere wird bestimmt.
BEISPIEL 11: RELATIVE BEITRÄGE UND BEDEUTUNG JEDER AMINOSÄURE INNERHALB DER NBD FÜR DIE INTERAKTION MIT NEMO
Wie in den vorhergehenden Beispielen angegeben, besteht die NEMO-Bindungsdomäne (NBD) von IKKα und IKKβ aus sechs konservierten Aminosäuren (L737 bis L742 von IKKβ und L738 bis L743 von IKKα) im äußersten C-Terminus beider Kinasen. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um ein klareres Verständnis der relativen Beiträge und der Bedeutung jeder Aminosäure innerhalb der vorhergehenden NBDs für die Interaktion mit NEMO zu erhalten. Es wurde eine umfassende Mutationsanalyse der IKKβ-NBD durchgeführt, bei der jeder Rest durch verschiedene konservierte und nicht-konservierte Aminosäuren substituiert wurde.
Es wurde festgestellt, dass die Substitution des Leucinrestes (L737 oder L742) oder von Serin 740 die Assoziation von NEMO IKKβ nicht beeinflusste, was nahe legt, dass. keiner dieser Reste eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Interaktion spielt. Um festzustellen, ob Mehrfachmutationen dieser Aminosäuren die Bindung beeinflussen, wurden zwei Mutanten konstruiert, bei denen entweder L737 und S740 oder S740 und L742 (jeweils als LS bzw. SL bezeichnet) mit Alanin substituiert waren. Eine Analyse mittels GST-Pulldown und COS-Zelltransfektion/Immunpräzipitation/Immunblot zeigte, dass sowohl die LS- als auch die SL-Mutanten mit NEMO in gleichem Maße assoziieren wie die Wildtyp-IKKβ, was einen weiteren Beleg dafür liefert, dass diese Reste nicht merklich zur Interaktion beitragen. Ferner aktivieren sowohl LS als auch SL NF-κB sowie IKKβ, bestimmt durch die Aktivierung eines NF-κB-abhängigen Luciferase-Reporter-Konstruktes (pBIIx-Luciferase) in transienten Transfektionsassays. Eine doppelte Alaninmutante beider Leucinreste (LL) sowie eine dreifache Mutante (LSL) können dazu geeignet sein, die vorhergehenden Daten zur Bedeutung dieser Reste für die NEMO-Bindung zu bestätigen.
Im Gegensatz zum Ausbleiben von Effekten der oben beschriebenen Mutationen auf die NEMO-Bindung oder auf die NF-κB-Aktivierung verhinderte eine Alaninsubstitution des Asparaginsäurerestes innerhalb der NBD (D738) eine Assoziation von IKKβ mit NEMO. Ferner führte diese Substitution zu einem 2- bis 3-fachen Anstieg der basalen NF-κB-Aktivierungsfähigkeit von IKKβ.
Diese Ergebnisse zeigen eine Rolle der NEMO-Assoziation bei der Aufrechterhaltung der basalen Aktivität des IKK-Komplexes. Interessanterweise führte eine Behandlung von HeLa-Zellen mit dem zellpermeablen NBD-Peptid auch zu einem mäßigen Anstieg der basalen NF-κB-Aktivität, was die Vorstellung untermauert, dass ein Verlust der NEMO-Assoziation zu einer erhöhten basalen IKK-Aktivität führt.
Zur Untersuchung der Beschaffenheit des Restes an der Position 738 innerhalb der NBD wurde Asparaginsäure entweder mit Asparagin (D738N) oder mit Glutaminsäure (D738E; 8A) substituiert. Diese konservativen Substitutionen bewahren entweder die Form (N) oder Form und Ladung (E) des Restes an dieser Position. Wie in 8B gezeigt, beeinflusste keine dieser Substitutionen die Fähigkeit von IKKβ zur Assoziation mit NEMO, während eine Alaninsubstitution die Bindung verhinderte. Diese Daten zeigen, dass die Form (insbesondere das Vorliegen des zweiten Kohlenstoffs), und nicht die Ladung der Seitenkette der Aminosäure an dieser Position kritisch für die Interaktion zwischen IKKβ und NEMO ist. In Übereinstimmung mit den vorhergehenden Beobachtungen, die hier offenbart sind, beeinflusste keine der Mutationen die basale Aktivität von IKKβ, während eine Substitution mit Alanin einen Anstieg der Aktivität verursachte (8C).
Wie oben gezeigt wurde, sind beide Tryptophanreste innerhalb der NBD (W739 und W741) kritisch für die Aufrechterhaltung der Interaktion mit NEMO. Die Effekte konservativer Mutationen, welche die aromatische Struktur der Reste an diesen Positionen bewahren, wurde mittels Substitution von Tryptophan durch Phenylalanin (F) oder Tyrosin (Y) (9A) untersucht. Zusätzlich mutierten beide Tryptophane zu Arginin; hierbei handelt es sich um eine nicht-konservative Substitution, die nur eine einzige Basenänderung innerhalb des kodierenden Codons erfordert und die am häufigsten natürlich vorkommende Tryptophanmutation darstellt. Wie in 9B gezeigt, assoziierten sowohl W739F als auch W739Y-Mutanten mit NEMO in gleichem Maße wie IKKβ, während W739R nicht band (9C). Zusammen mit den Effekten der Alaninsubstitution (9B) deuten diese Erkenntnisse darauf hin, dass die aromatische Beschaffenheit des Restes an dieser Position für die Funktion der NBD kritisch ist. Entsprechend zu W739 wurde festgestellt, dass eine Substitution von W742 mit Phenylalanin (W742F) die Assoziation mit NEMO nicht beeinflusst, während die Mutation zu Arginin (W742R) eine Bindung verhinderte (9D). Im Gegensatz zu W739 verhinderte eine Substitution mit Tyrosin (W742Y) die Assoziation mit NEMO, was zeigt, dass das Vorliegen einer Hydroxyleinheit in der Aminosäureseitenkette an dieser Position ausreicht, um die Assoziation von NEMO zu verhindern. Diese Erkenntnis kann darauf hinweisen, dass die Phosphorylierung eines Restes innerhalb der NBD, auch wenn es sich um eine künstlich insertierte Aminosäure handelt, die Assoziation von IKKβ mit NEMO verhindert.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Modulation von NF-κB-Induktion in einer Zelle, umfassend In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Peptids oder einer Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend mindestens eine NEMO-Bindungsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 11, 12, 14, 16 oder 17, wobei die NF-κB-Induktion in einer Zelle moduliert wird, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO zu blockieren.
Verwendung einer wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Peptids oder einer Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend mindestens eine NEMO-Bindungsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 11, 12, 14, 16 oder 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation von NF-κB-Induktion in einer Zelle, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO zu blockieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei die IKK ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IKKα und IKKβ.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei das entzündungshemmende Peptid oder die Peptid-Mimetikumsverbindung weiterhin mindestens eine Membrantranslokationsdomäne umfasst.
Verwendung eines entzündungshemmenden Peptids oder einer Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend die NEMO-Bindungsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 11, 12, 14, 16 oder 17 in einer wirksamen Menge zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, welches an einer Entzündungskrankheit leidet, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO zu blockieren.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das entzündungshemmende Peptid oder die Peptid-Mimetikumsverbindung in der Lage ist, die Rekrutierung von Leukozyten in akute und chronische Entzündungsstellen zu inhibieren.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das entzündungshemmende Peptid oder die Peptid-Mimetikumsverbindung in der Lage ist, die Expression von E-Selektin auf Endothelzellen herunterzuregulieren.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das entzündungshemmende Peptid oder die Peptid-Mimetikumsverbindung in der Lage ist, die Differenzierung von Osteoklasten zu inhibieren.
In-vitro-Verfahren zur Modulation von NF-κB-abhängiger Zielgenexpression in einer Zelle umfassen In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Peptids oder einer Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend mindestens eine NEMO-Bindunsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 11, 12, 14, 16 oder 17, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO zu blockieren, wobei die NF-κB-abhängige Zielgenexpression in einer Zelle moduliert wird.
Verwendung einer wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Peptids oder einer Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend mindestens eine NEMO-Bindunsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 11, 12, 14, 16 oder 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation NF-κB-abhängigen Zielgenexpression in einer Zelle, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO zu blockieren.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Verwendung nach Anspruch 10, wobei die IKK IKKβ ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Verwendung nach Anspruch 10, wobei das NF-κB-abhängige Zielgen E-Selektin ist.
Entzündungshemmendes Peptid oder Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend eine NEMO-Bindunsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16 oder 17, fusioniert mit mindestens einer Membrantranslokationsdomäne, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO zu blockieren.
Entzündungshemmendes Peptid oder Peptid-Mimetikumsverbindung nach Anspruch 13, wobei die Membrantranslokationsdomäne in vivo die Membrantranslokation erleichtert.
Entzündungshemmendes Peptid oder Peptid-Mimetikumsverbindung nach Anspruch 13, wobei die Membrantranslokationsdomäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der dritten Helix der Antennapedia-Homöodomäne und HIV-1Tat-Protein.
Zusammensetzung, umfassend das entzündungshemmende Peptid oder die Peptid-Mimetikumsverbindung nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, weiterhin, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Isoliertes Peptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 17, 18 oder 19; und (b) einem isolierten Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 17, 18 oder 19, wobei das Peptid die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO blockiert und (c) ein isoliertes Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche einen konservativen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 umfasst, wobei das Peptid die Interaktion zwischen einer oder mehrerer IKKs und NEMO blockiert.
Isoliertes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Peptid bestehend aus der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 und (b) einem isolierten Peptid bestehend aus der Aminosäuresequenz, welche umfasst einen konservativen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19.
Isoliertes Peptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 und 19.
Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 19 bis 20.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, weiterhin, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem isolierten Nukleinsäuremolekül, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18 und 19 kodiert.
Verwendung einer wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Peptids oder einer Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend die NEMO-Bindungsdomäne, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 16 oder 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines NF-κB-vermittelten Zustands in einem Individuum, wobei die entzündungshemmende Verbindung in der Lage ist, die Interaktion zwischen einer IKK und NEMO zu blockieren.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der NF-κB-vermittelte Zustand eine Entzündungskrankheit, eine Autoimmunkrankheit, eine Transplantatabstoßung, Osteoporose, Krebs, Alzheimer'sche Krankheit, Arteriosklerose, eine virale Infektion oder Ataxia Telangiectasia ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Entzündungskrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asthma, Allergien, Uticaria, Anaphylaxie, kutane Entzündung, Sepsis, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, psoriatische Arthritis, entzündliche Darmkrankheit, chronisch-obstruktive Lungenkrankheit, Vaskulitis und Bursitis.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Entzündungskrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dermititis, Ekzema, Psoriasis, Osteoarthritis, psoriatische Arthritis, Lupus und Spondylarthritis.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das entzündungshemmende Peptid oder die Peptid-Mimetikumsverbindung mindestens eine Membrantranslokationsdomäne umfasst.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Membrantranslokationsdomäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der dritten Helix der Antennapedia-Homöodomäne und HIV-1Tat-Protein.
Entzündungshemmendes Peptid oder Peptid-Mimetikumsverbindung, umfassend die Aminosäuresequenz DRQIKIWFQNRRMKWKKTALDWSWLQTE.