ES2231494T3 - Compuestos antiinflamatorios y sus usos. - Google Patents

Compuestos antiinflamatorios y sus usos.

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ES2231494T3 ES01935035T ES01935035T ES2231494T3 ES 2231494 T3 ES2231494 T3 ES 2231494T3 ES 01935035 T ES01935035 T ES 01935035T ES 01935035 T ES01935035 T ES 01935035T ES 2231494 T3 ES2231494 T3 ES 2231494T3
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Abstract

Un compuesto antiinflamatorio que comprende la estructura: Xa-Xb, donde Xa es un dominio de translocación a través de la membrana que consta de 6 a 15 restos aminoacídicos y Xb es una secuencia de unión a NEMO que consta de la siguiente estructura: (Y)n-X1-X2-X3-X4-X5-X6-(A)m en la que cada uno de n y m es, independientemente, 0 ó 1; cada uno de A e Y comprende de 1 a 3 restos aminoacídicos; X1 es L, A, I o nor-leucina (Nle); X2 es D, E, N, Q, homoserina (Hser) o 2-cetopropilalanina (2-cetopropil-A); X3 es W, F, Y, 4-bifenil-alanina (Bpa), homofenilalanina (Hphe), 2- Naftilalanina (2-Nal), 1-Naftilalanina (1- Nal) o ciclohexil-alanina (Cha); X4 es S, A, E, L, T, nor-leucina (Nle) u homoserina (Hser); X5 es W, H, homofenilalanina (Hphe), 2-naftilalanina (2-Nal), 1- Naftilalanina (1-Nal), O-bencil serina (SeroBn) o 3-Piridilalanina (3-Pal); y X6 es L, A, I o nor-leucina (Nle), donde NEMO significa Modulador Esencial de NF-B.

Description

Compuestos antiinflamatorios y sus usos.
Campo de la invención
La invención se refiere a composiciones y métodos para la inhibición selectiva de la activación de NF-\kappaB mediada por citoquinas, por medio del bloqueo de la interacción de NEMO con la I\kappaB quinasa-\beta (IKK\beta) en el dominio de unión a NEMO (NBD). El bloqueo de la interacción IKK\beta-NEMO ocasiona la inhibición de la activación de la quinasa IKK\beta y la posterior reducción de la fosforilación de I\kappaB. La fosforilación de I\kappaB es una etapa integral en la activación de NF-\betaB mediada por citoquinas.
Antecedentes de la invención
NF-\kappaB es un factor de transcripción que media señales extracelulares responsables de la inducción de genes implicados en respuestas proinflamatorias (Baltimore et al., (1998), Patente de Estados Unidos Nº 5.804.374). NF-\kappaB está anclado en el citoplasma de la mayoría de las células no estimuladas por medio de una interacción no covalente con una de varias proteínas inhibidoras conocidas como I\kappaB (May & Ghosh, (1997) Semin. Cancer. Biol. 8, 63-73; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80-88; Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225-260). Los estímulos celulares asociados con respuestas proinflamatorias tales como TNF\alpha, activan a las quinasas que, a su vez, activan al NF-\kappaB por fosforilación de I\kappaB. Las quinasas que fosforilan las I\kappaB se denominan I\kappaB quinasas (IKK).
La fosforilación dirige a las I\kappaB a la ubiquitinación y degradación. La degradación y posterior disociación de las I\kappaB de NF-\kappaB revela la señal de localización nuclear en NF-\kappaB, produciéndose una translocación nuclear de NF-\kappaB activo, que conduce a la regulación positiva de genes que responden a NF-\kappaB (May & Ghosh, (1997) Semin. Cancer. Biol. 8, 63-73; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80-88; Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225-260; Siebenlist et al., (1994) Annu. Rev. Cell Biol. 12, 405-455). Por lo tanto, la fosforilación de I\kappaB es una etapa esencial en la regulación de respuestas proinflamatorias mediadas por NF-\kappaB.
La identificación y caracterización de quinasas que fosforilan I\kappaB ha conducido a una mejor comprensión de las rutas de señalización implicadas en la activación de NF-\kappaB. Hasta ahora se han identificado varios subtipos diferentes de IKK. IKK\alpha se identificó inicialmente como una I\kappaB quinasa inducida por estimulación por TNF\alpha en células HeLa (DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548-554). Se identificó otra I\kappaB quinasa homóloga a IKK\alpha, denominada IKK\beta y, según se determinó, era la I\kappaB quinasa mayor inducida después de la estimulación por TNF\alpha (Takeda et al., (1999) Science 284, 313-316; Hu et al., (1999), Science 284, 316-320; Li et al., (1999) Science 284, 321-325; Pot et al., (2000), Patente de Estados Unidos Nº 6.030.834; Woronicz & Goeddel (1999), Patente de Estados Unidos Nº 5.939.302). IKK\alpha e IKK\beta tienen una homología total del 52% y una homología del 65% en el dominio quinasa (Zandi et al., (1997), Cell 91, 243-252).
Las I\kappaB proteína quinasas (IKK) fosforilan las I\kappaB en restos específicos de serina. Por ejemplo, fosforilan específicamente las serinas 32 y 36 de I\kappaB\alpha (Traenckner et al., (1995) EMBO J. 14, 2876-2883; DiDonato et al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 1295-1304). Se requiere la fosforilación de los dos sitios para dirigir eficazmente la I\kappaB\alpha a la degradación. Además, la activación de IKK\alpha e IKK\beta normalmente responde a agentes activadores de NF-\kappa\beta, y pueden usarse IKK\alpha e IKK\beta mutantes, que son catalíticamente inactivas, para bloquear la estimulación de NF-\kappaB por citoquinas tales como TNF\alpha e IL-1 (Régnier et al., (1997) Cell 90, 373-383; Delhase et al., (1999) Science 284, 309-313). Por lo tanto, las I\kappaB proteína quinasas son esenciales en la regulación de procesos de activación de NF-\kappaB.
IKK\alpha e IKK\beta tienen motivos estructurales distintos, incluyendo un dominio quinasa de serina-treonina amino terminal separado de un dominio de hélice-bucle-hélice (H-L-H) próximo al extremo carboxilo por un dominio de cremallera de leucina. Estas características estructurales son distintas de otras quinasas, y se cree que los dominios no catalíticos están implicados en interacciones proteína-proteína. Por lo tanto, las proteínas que se unen a IKK pueden ser capaces de regular la actividad de NF-\kappaB (Marcu et al., (1999), Patente de Estados Unidos Nº 5.972.655) y potencialmente de regular acontecimientos posteriores tales como la inducción de NF-\kappaB. Por ejemplo, NEMO (modulador esencial de NF-\kappaB) es una proteína que, como se ha identificado, se une a las IKK y facilita la actividad quinasa (Yamaoke et al., (1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 287-300; Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526-1538; Haraj & Sun, (1999) J. Biol. Chem. 274, 22911-22914; Jin & Jeang, (1999) J. Biomed. Sci. 6, 115-120).
La inflamación se define como la reacción de un tejido vivo vascularizado a una lesión. Como tal, la inflamación es un complejo estereotipado fundamental de reacciones citológicas y químicas de los vasos sanguíneos afectados y tejidos adyacentes en respuesta a una lesión o estimulación anormal causada por un agente físico, químico o biológico. La inflamación normalmente conduce a la acumulación de fluido y células sanguíneas en el sitio de la lesión, y normalmente es un proceso de curación. Sin embargo, la inflamación algunas veces es perjudicial, normalmente debido a una disfunción del progreso normal de la inflamación. Las enfermedades inflamatorias son las que están relacionadas con, se caracterizan por, se producen o resultan de, o se ven afectadas por la inflamación. Los ejemplos de enfermedades o trastornos inflamatorios incluyen, sin limitación, asma, inflamación pulmonar, enfermedades granulomatosas crónicas tales como tuberculosis, lepra, sarcoidosis y silicosis, nefritis, amiloidosis, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, bronquitis crónica, esclerodermia, lupus, polimiositis, apendicitis, enfermedad inflamatoria del intestino, úlceras, síndrome de Sjorgen, síndrome de Reiter, psoriasis, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad inflamatoria orbital, enfermedad trombótica y respuestas alérgicas inapropiadas a estímulos ambientales tales como hiedra venenosa, polen, picaduras de insectos y ciertos alimentos, incluyendo dermatitis atópica y dermatitis de contacto.
Las enfermedades inflamatorias representan un problema mundial. Ciertos estudios de cargas de enfermedades han reafirmado que la tuberculosis se encuentra entre las 10 causas principales de muerte en el mundo. El asma afecta a 5% de la población de adultos y a 10-15% de la población de niños (Armetti y Nicosia (1999) Boll Chim. Farm. 138(11):599). El asma es una enfermedad inflamatoria crónica que está asociada con una obstrucción extendida pero variable del flujo de aire.
La sepsis es otro trastorno inflamatorio y se debe a la presencia de diversos microbios formadores de pus y otros microbios patógenos, o sus toxinas, en la sangre o tejidos de un sujeto. La sepsis se caracteriza por una respuesta inflamatoria sistémica a productos bacterianos durante la infección. Los síntomas de la sepsis, tales como fiebre, se producen al menos en parte por la respuesta inflamatoria del cuerpo al agente infeccioso.
Por consiguiente, existe una gran necesidad de compuestos útiles para tratar trastornos inflamatorios.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona compuestos antiinflamatorios, composiciones farmacéuticas de los mismos y métodos de uso de los mismos para tratar trastornos inflamatorios. La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación del dominio de unión a NEMO (NBD) en la I\kappaB quinasa-\alpha (IKK\alpha) y en la I\kappaB quinasa-\beta (IKK\beta).
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona compuestos antiinflamatorios que comprenden un dominio de unión a NEMO (NBD).
En una realización, la presente invención proporciona compuestos antiinflamatorios que comprenden fusiones de un dominio de unión a NEMO y al menos un dominio de translocación a través de la membrana. En una realización preferida, el dominio de translocación a través de la membrana facilita la translocación a través de la membrana de los compuestos antiinflamatorios de la invención in vivo. El dominio de translocación a través de la membrana puede ser, por ejemplo, la tercera hélice del homeodominio de antennapedia o la proteína Tat de VIH-1. En una realización, el dominio de unión a NEMO es un polipéptido que tiene la secuencia indicada en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19.
En otra realización, la presente invención proporciona compuestos antiinflamatorios que comprenden: (a) péptidos que incluyen, o constan de, la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19; (b) péptidos que incluyen una sustitución de aminoácidos conservativa de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19; y (c) variantes de secuencias de aminoácidos naturales de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19.
En otro aspecto, esta invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos antiinflamatorios de la invención, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la invención caracteriza un método para tratar un trastorno inflamatorio, por ejemplo, asma, inflamación pulmonar o cáncer, en un sujeto. El método incluye administrar el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos antiinflamatorios de la invención. Sin intención de limitarse por ningún mecanismo, se cree que los compuestos antiinflamatorios de la invención pueden actuar (directa o indirectamente) bloqueando el reclutamiento de leucocitos en sitios de inflamación aguda y crónica, por medio de la regulación negativa de la expresión de la E-selectina en leucocitos, o por medio del bloqueo de la diferenciación de osteoclastos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la expresión de un gen diana dependiente de NF-\kappaB, por ejemplo, la expresión de la E-selectina en una célula. El método incluye poner en contacto una célula con un compuesto antiinflamatorio de la presente invención, inhibiéndose de esta manera la expresión del gen diana dependiente de NF-\kappaB en la célula.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para inhibir la inducción de NF-\kappaB (por ejemplo, inducción dependiente de IKK\alpha y/o IKK\beta) en una célula poniendo en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto antiinflamatorio de la presente invención, inhibiéndose de esta manera la inducción NF-\kappaB en la célula. En una realización de esta invención, tales métodos utilizan compuestos antiinflamatorios que incluyen al menos un dominio de translocación a través de la membrana. En otra realización específica de esta invención, los compuestos antiinflamatorios utilizados en tales métodos incluyen secuencias de aminoácidos que comprenden las secuencias de las SEC ID Nº: 2, 4, 5, 6, 11, 12, 16, 17 y 18.
Una ventaja particular de los compuestos antiinflamatorios de la presente invención es que aunque bloquean la inducción de NF-\kappaB a través de IKK, no inhiben la actividad basal de NF-\kappaB.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes tras la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 representa resultados de experimentos que indican que NEMO interacciona con el extremo COOH de IKK\beta. (A) Se precipitaron GST sola o GST-NEMO a partir de lisados bacterianos usando glutatión-agarosa, se separaron por SDS-PAGE (10%) y el gel se tiñó con azul de Coomassie (panel de la izquierda). En experimentos GST-pull-down posteriores se usaron cantidades iguales de GST o GST-NEMO. El esquema representado en el panel de la derecha representa los mutantes de truncación COOH y NH2 terminales de IKK\beta usados para determinar la región de la interacción con NEMO. (B) Se clonaron mutantes de IKK\beta, se expresaron por traducción in vitro (entrada; panel de la izquierda) y se usaron para experimentos GST-pull-down (panel de la derecha). (C) Se tradujeron in vitro IKK\beta de tipo silvestre e IKK\beta-(644-756) (panel de la izquierda) y se usaron para análisis GST-pull-down (panel de la izquierda). (D) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa con el vector solo o con concentraciones crecientes (0,25, 0,5, 1,0 \mug/ml) de la construcción IKK\beta-(644-756) con una señal de xpress junto con el plásmido indicador pBIIX-luciferasa. Después de 48 horas, las células se trataron con TNF\alpha (10 ng/ml) o IL-1\beta (10 ng/ml) durante cuatro horas y después se midió la actividad de NF-\kappaB. El análisis de transferencia de Western de porciones del lisado usando anti-xpress (recuadro) demuestra los niveles crecientes de proteína expresada.
La Figura 2 representa los resultados de experimentos que indican que la primera región \alpha-helicoidal de NEMO se requiere para la unión a IKK\beta. (A) Una versión truncada de IKK\beta que constaba únicamente del extremo COOH-terminal desde el resto V644 a S756 se fusionó con GST (GST-644-756) y se expresó en bacterias. Después de la precipitación por glutatión agarosa, la GST sola y la GST-(644-756) se separaron por SDS-PAGE (10%) y el gel se tiñó con azul de Coomassie (panel de la izquierda). Para los posteriores análisis GST-pull-down se usaron cantidades iguales de cada proteína. Se construyeron diversas truncaciones NH2- y COOH-terminales de NEMO, se marcaron con [^{35}S]-metionina y se usaron para análisis pull-down in vitro (panel de la derecha). Los mutantes que interaccionaron con GST-(644-756) están indicados con un signo (+). Ninguno de los mutantes interaccionó con la GST sola. (B) Se tradujeron in vitro NEMO de tipo silvestre y un mutante de deleción que carecía de la primera región \alpha-helicoidal (del. \alphaH) (panel de la izquierda: entrada) y se usaron para el análisis GST-pull-down usando las proteínas mostradas anteriormente (A: izquierda). (C) Se transfectaron células HeLa con pBIIx-luciferasa junto con pcDNA-3 (vector) o concentraciones crecientes de del. \alphaH (0,25, 0,5, 1,0 \mug/ml) durante 48 horas y después se trataron durante cuatro horas con TNF\alpha (10 ng/ml). Las células después se lisaron y se midió la actividad de NF-\kappaB por medio del ensayo de luciferasa.
La Figura 3 representa resultados de experimentos que indican que la interacción con NEMO y la actividad quinasa funcional requieren una región homóloga a IKK\alpha del extremo COOH de IKK\beta. (A) Se expresaron mutaciones de truncación de IKK\beta omitiendo secuencialmente el extremo COOH terminal (1-733), la región sin serina (1-707), el dominio rico en serina (1-662) y la región \alpha1 (1-644), se marcaron por traducción in vitro y se usaron para análisis GST-pull-down por GST-NEMO (Figura 1A). Ninguno de los mutantes interaccionó con la GST sola. (B) Alineación de secuencias del extremo COOH-terminal de IKK\beta e IKK\alpha. Se indican las regiones \alpha2 y rica en glutamato y los seis aminoácidos idénticos están sombreados. (C) Se marcaron con [^{35}S]-metionina (entrada) la IKK\beta de tipo silvestre y los mutantes de truncación (1-733 y 1-744) y se usaron para análisis pull-down in vitro con GST sola o GST-NEMO. (D) Se transfectaron células HeLa durante 48 horas con 1 \mug/pocillo de las construcciones señalizadas con FLAG indicadas seguido de inmunoprecipitación usando anti-FLAG. Los inmunoprecipitados se incubaron en tampón quinasa que contenía \gammaATP marcado con [^{32}P] durante 15 minutos a 30ºC y después se lavaron con tampón de lisis que contenía Triton-100 al 1%. Los complejos resultantes se separaron por SDS-PAGE (10%) y se visualizaron por autorradiografía (panel superior). El panel inferior es una inmunotransferencia de muestras idénticas que muestran cantidades equivalentes de proteína transfectada en cada calle. (E) Se transfectaron células HeLa durante 48 horas con 1 \mug/ml de las construcciones indicadas o con el vector vacío (pcDNA-3) junto con pBIIx-luciferasa. La actividad de NF-\kappaB se determinó por ensayo de luciferasa. (F) Se dejaron células HeLa transfectadas durante 48 horas con versiones con señal FLAG de IKK\beta (tipo silvestre) o IKK\beta-(1-733) sin tratar (-) o se trataron durante varios minutos (+) con TNF\alpha (10 ng/ml). Después de la lisis e inmunoprecipitación usando anti-FLAG, se realizó un ensayo quinasa de complejos\kappa inmunes (paneles superiores). Se inmunoprecipitaron muestras idénticas y se sometieron a inmunotransferencia con anti-FLAG (paneles inferiores).
La Figura 4 representa resultados de experimentos que indican que la asociación de NEMO con IKK\beta e IKK\alpha revela que el dominio de unión a NEMO (NBD) tiene seis aminoácidos COOH-terminales. (A) Células COS transfectadas de forma transitoria con el vector solo, IKK\alpha o IKK\beta con señal FLAG (1 \mug/pocillo) o NEMO con señal xpress (1 \mug/pocillo) a una concentración total de ADN de 2 \mug/pocillo como se indica. Después de la lisis, se realizaron inmunoprecipitaciones (IP) usando anti-FLAG (M2) y el contenido de los precipitados se visualizó por inmunotransferencia (IB) con anti-FLAG (M2) o anti-xpress. Una porción del lisado pre-IP se sometió a inmunotransferencia con anti-xpress para asegurar niveles equivalentes de expresión de NEMO en las células transfectadas. (B) Se expresaron IKK\alpha de tipo silvestre e IKK\alpha-(1-737), se marcaron (entrada) y se usaron para un análisis GST-pull-down usando GST o GST-NEMO. (C) Se obtuvo ADNc de longitud completa que codificaba IKKi humana por RT-PCR a partir de ARNm de células HeLa usando el sistema Expand^{TM} Long Template PCR (Boehringer Mannheim), el cebador de avance (5'-CTAGTCGAATTCACCATGCAGAGCACAGCCAATTAC) (SEC ID Nº: 22) y el cebador inverso (3'-CTAGTCTCTAGATTAGACATCAGGAGGTGCTGG) (SEC ID Nº: 23) y se clonaron en los sitios EcoRI y Xbal de pcDNA-3. Se realizó un análisis GST-pull down usando IKK\alpha, IKK\beta e IKKi marcados con [^{35}S]-metionina. (D) Un mutante de deleción de IKK\beta que carecía del NBD (del.NBD) se marcó con [^{35}S]-metionina (entrada) y se usó para un análisis GST-pull-down. (E) Se generó un gráfico de hidrofobia Fauchere Pliska del extremo COOH (N721-S756) de IKK\beta humana usando el software MacVector™ (versión 6.5.3). El NBD (L737-L742) está en un recuadro. (F) Se transfectaron células COS durante 48 horas con un total de 2 \mug de ADN/pocillo de vector solo, vector más NEMO-FLAG o NEMO-FLAG más versiones con señal xpress de IKK\beta-(1-744) que contenía mutaciones puntuales dentro del NBD como se indica.
Después de la lisis e inmunoprecipitación usando anti-FLAG (M2), se realizó un análisis de inmunotransferencia con anti-FLAG o anti-xpress. El nivel de proteína expresada en el lisado pre-IP se determinó por inmunotransferencia con anti-xpress (panel inferior). (G) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa durante 48 horas con las construcciones indicadas junto con pBIIX-luciferasa y la actividad de NF-\kappaB en el lisado se midió por ensayo de luciferasa.
La Figura 5 representa resultados de experimentos que indican que un péptido al que son permeables las células que incluye el NBD de IKK\beta, inhibe la interacción IKK\beta/NEMO, la activación de NF-\kappaB inducida por TNF\alpha y la expresión génica dependiente de NF-\kappaB. (A) Se realizó un análisis GST-pull down usando GST-NEMO-IKK\beta traducida in vitro (panel superior) o GST-IKK\beta-(644-756)-NEMO traducida in vitro (panel inferior). El ensayo se realizó en ausencia (sin péptido) o en presencia de concentraciones crecientes (125, 250, 500 ó 1000 \muM) del péptido NBD mutante (MUT) o de tipo silvestre (WT). (B) Se incubaron células HeLa con péptido (200 \muM) durante los tiempos indicados. Después de la lisis, el complejo de IKK se inmunoprecipitó usando anti-NEMO y la inmunotransferencia resultante se sometió a un sondeo con anti-IKK\beta. (C) Se transfectaron células HeLa durante 48 horas con pBIIX-luciferasa y después se incubaron durante dos horas en ausencia (control) o en presencia del péptido NBD mutante o de tipo silvestre (100 y 200 \muM de cada uno). Posteriormente, las células se trataron con TNF\alpha (10 ng/ml) como se indica (panel de la izquierda) o se dejaron sin tratar (panel de la derecha) durante cuatro horas más, después de lo cual se midió la activación de NF-\kappaB por ensayo de luciferasa. (D) Las células HeLa se incubaron durante tres horas con concentraciones crecientes (50, 100 ó 200 \muM) de cada péptido, seguido de tratamiento durante 15 minutos con TNF\alpha (10 ng/ml) cuando se indica (+). Después de la lisis, se realizaron extractos nucleares y se usaron 10 \mug de proteína de cada muestra para EMSA usando una sonda de sitio \kappaB marcada con [^{32}P] específica. (E) Se preincubaron células HUVEC primarias durante dos horas con péptidos NBD de tipo silvestre (izquierda) o mutantes (derecha) (100 \muM) y después se estimularon con TNF\alpha (10 ng/ml) durante seis horas más. Las células de control no recibieron péptido. Las células se tiñeron con anti-E-selectina (H4/18) o con un anticuerpo de control sin unión (K16/16) y la expresión se midió por FACS (FACSort, Becton Dickinson). Los perfiles muestran la tinción con E-selectina en ausencia (sombreado) y presencia (línea continua) de TNF\alpha y tinción con anticuerpo de control en las mismas condiciones (línea de trazos, sin TNF\alpha; línea de puntos, TNF\alpha).
La Figura 6 representa los resultados de experimentos que indican que el péptido NBD de tipo silvestre inhibe la expresión génica inducida por NF-\kappaB y la inflamación inducida experimentalmente. (A) Se indujeron edemas de oreja por PMA en ratones tratados tópicamente con vehículo (VEH), dexametasona (DEX) o péptidos NBD y se midieron como se describe en el Ejemplo 8. Los datos se presentan como diferencias medias en el espesor de la oreja \pm SD (* = p < 0,05 en comparación con el control no tratado [-] y el vehículo [VEH]). (B) Los efectos del péptido NBD en comparación con el efecto de la dexametasona (DEX) sobre la peritonitis inducida por Zymosan (ZYM) en ratones se determinaron como se describe de nuevo en el Ejemplo 8. A los ratones de control se les inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS).
La Figura 7 representa los resultados de experimentos que indican la inhibición dependiente de la dosis de la diferenciación de osteoclastos por péptidos NBD de tipo silvestre pero no mutantes. Los datos se presentan como la determinación media de muestras por triplicado \pm SD.
La Figura 8 representa los resultados de un análisis mutacional de D738 dentro del dominio de unión a NEMO (NBD) de la IKK\beta humana. (A) El resto de ácido aspártico en la posición 738 de la IKK\beta se sustituyó por alanina, asparagina o ácido glutámico usando mutagénesis por PCR. (B) Los mutantes de IKK\beta (D738) mostrados en A se marcaron con ^{35}S-metionina por transcripción y traducción in vitro y después se usaron para el análisis GST-pull down usando GST-NEMO como se ha descrito previamente. (C) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa usando el método de transfección Fugene6 con la construcción indicadora dependiente de NF-\kappaB pBIIx-luciferasa junto pon pcDNA-3, IKK\beta o los mutantes D738 descritos anteriormente (A). Después de 48 horas, las células se lisaron y la actividad luciferasa se determinó como se ha descrito previamente.
La Figura 9 representa los resultados de un análisis mutacional de W739 y W741 dentro del NBD de la IKK\beta humana. (A) Los restos de triptófano en las posiciones 739 y 741 de IKK\beta se sustituyeron por alanina, fenilalanina, tirosina o arginina usando mutagénesis por PCR. (B) Se transfectaron transitoriamente células COS con el vector solo (pcDNA-3.1-xpress), IKK\beta, W739A, W739F o W739Y junto con NEMO señalizado con FLAG como se muestra. Después de 48 horas, las células se lisaron y los complejos se inmunoprecipitaron (IP) usando perlas de agarosa con anti-FLAG (M2) acoplado. Antes de la inmunoprecipitación, se retuvo una porción de cada lisado (5%) para el análisis (pre-IP). Las proteínas de las muestras se separaron por SDS-PAGE (10%) y se analizaron por inmunotransferencia (IB) usando anticuerpos que reconocían FLAG (M2) o xpress. Los dos paneles superiores muestran IKK\beta señalizado con xpress y los paneles inferiores muestran NEMO señalizado con FLAG. (C y D) Se transfectaron de forma transitoria células COS con los plásmidos mostrados seguido de inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia como se describe en B. (C y D) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa con pBIIx-luciferasa junto con los plásmidos mostrados y, después de 48 horas, se determinó la actividad luciferasa en los lisados.
La Figura 10 muestra los resultados de un análisis mutacional de S740 dentro del NBD de la IKK\beta humana. Los restos de serina en la posición 740 de IKK\beta se sustituyeron por alanina o ácido glutámico usando mutagénesis por PCR. (B) Se transfectaron de forma transitoria células COS con los plásmidos mostrados seguido de inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia como se describe en la Fig. 2B. (C) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa durante 48 horas con IKK\beta-FLAG o S740E-FLAG y después se trataron durante los periodos de tiempo mostrados con TNF\alpha (1 \mug/ml). Después de la lisis, los complejos se precipitaron usando perlas de agarosa con anti-FLAG (M2) acoplado y se realizó un ensayo quinasa de complejos inmunes usando GST-I\kappaB\alpha (1-90) como sustrato como se ha descrito previamente.
La Figura 11 representa los resultados de un análisis mutacional del NBD de la IKK\alpha. (A) Cada uno de los restos que constituyen el NBD de IKK\alpha (L738 a L743) se sustituyó por alanina por mutagénesis por PCR. Se transfectaron de forma transitoria células COS con NEMO-FLAG junto con el vector solo (pcDNA-3.1-xpress) o versiones señalizadas con xpress de IKK\alpha y los mutantes de NBD mostrados. La inmunoprecipitación y el análisis de inmunotransferencia de los complejos IKK\alpha-NEMO se realizaron como se describe en la Fig. 2B. (B) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa con pBIIx-luciferasa junto con los plásmidos mostrados y después de 48 horas se determinó la actividad luciferasa en los lisados.
La Figura 12 representa los resultados de un experimento que demuestra que un péptido que incluye el NBD de IKK\beta previene la interacción de IKK\alpha con NEMO. (A) Secuencias del péptido NBD de tipo silvestre y del péptido NBD de control manipulado. El péptido de tipo silvestre corresponde a los restos 734 a 744 de IKK\beta. (B) Se realizó un análisis GST-pull-down usando GST-NEMO e IKK\alpha (panel superior) e IKK\beta (panel medio) transcritas y traducidas in vitro en presencia o ausencia de vehículo (DMSO al 2%), o de péptido NBD manipulado o de tipo silvestre (500 y 1000 \muM de cada péptido). El panel inferior muestra un gel teñido con azul de coomassie que demuestra que ningún péptido afecta a la interacción de GST-NEMO con las perlas de glutatión-agarosa usadas para la precipitación. (C) Análisis densitométrico de bandas de autorradiografía obtenidas después del análisis GST-pull down de IKKa e IKKb usando GST-NEMO en presencia de una serie de concentraciones de péptido NBD de tipo silvestre. El recuadro muestra un experimento representativo. Los datos se presentan como densidad del píxel como un porcentaje del control (sin péptido) y representan medias \pm sd (n = 11). El análisis se realizó usando el software de imágenes NIH.
Descripción detallada de la invención I. Descripción general
La presente invención proporciona compuestos antiinflamatorios, composiciones farmacéuticas de los mismos y métodos de uso de los mismos para tratar trastornos inflamatorios. La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación del dominio de unión a NEMO (NBD) en la I\kappaB quinasa-\alpha (IKK\alpha) y en la I\kappaB quinasa-\beta (IKK\beta).
Sin intención de limitarse por ningún mecanismo, se cree que los compuestos antiinflamatorios de la presente invención actúan bloqueando la interacción de NEMO con una IKK (por ejemplo, IKK\beta o IKK\alpha) en el dominio de unión a NEMO (NBD), inhibiendo de esta manera la fosforilación, la degradación y la posterior disociación de I\kappaB de NF-\kappaB. Esta inhibición tiene como resultado el bloqueo de la activación de NF-\kappaB asociado con respuestas proinflamatorias.
II. Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente invención tienen los significados entendidos comúnmente por un especialista habitual en la técnica relacionada con esta invención.
Como se usa en este documento, el término "unión" se refiere a la adherencia de moléculas entre sí, tal como, pero sin limitación, enzimas a sustratos, anticuerpos a antígenos, y cadenas de ADN a sus cadenas complementarias. La unión se produce porque la forma y naturaleza química de partes de las superficies de las moléculas son "complementarias". Una metáfora común es el modelo de "llave y cerradura" usado para describir cómo se ajustan las enzimas alrededor de su sustrato.
La expresión "péptido de fusión", "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" incluye un péptido, polipéptido o proteína que se obtiene combinando dos secuencias de aminoácidos distintas. Típicamente, una secuencia parcial de un péptido, polipéptido o proteína se une a otro péptido, polipéptido o proteína heterólogos usando métodos conocidos en la técnica.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto aminoacídico se reemplaza por un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se conocen familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones \beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los ejemplos no limitantes de sustituciones conservativas que pueden realizarse en los compuestos antiinflamatorios de la presente invención incluyen la sustitución de D-fenilalanina por D-tirosina, D-piridilalanina o D-homofenilalanina, sustitución de D-leucina por D-valina u otro aminoácido natural o no natural que tenga una cadena lateral alifática y/o sustitución de D-valina por D-leucina u otro aminoácido natural o no natural que tenga una cadena lateral alifática.
Como se usa en este documento, el término "dominio" se refiere a una parte de una molécula o estructura que comparte características fisicoquímicas comunes tales como, pero sin limitación, dominios o propiedades hidrófobas, polares, globulares y helicoidales. Los ejemplos específicos de dominios de unión incluyen, pero sin limitación, dominios de unión al ADN y dominios de unión al ATP.
Como se usa en este documento, la expresión "dominio de translocación a través de la membrana" se refiere a un péptido capaz de atravesar la membrana de una célula y que se usa para transportar péptidos unidos al interior de una célula in vivo. Los dominios de translocación a través de la membrana incluyen, pero sin limitación, la tercera hélice de la proteína homeodominio de antennapedia y la proteína Tat de VIH-1. En la técnica se conocen otros dominios de translocación a través de la membrana e incluyen los descritos, por ejemplo, en Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450; Lindgren et al., (2000) Trends Pharmacol, Sci. 21, 99-103; Ho et al., Cáncer Research 61, 474-447 (2001); Patente de Estados Unidos Nº 5.888.762 ; Patente de Estados Unidos Nº 6.015.787; Patente de Estados Unidos Nº 5.846.743; Patente de Estados Unidos Nº 5.747.641; Patente de Estados Unidos Nº 5.804.604; y publicaciones de solicitudes PCT WO 98/52614; WO 00/29427 y WO 99/29721.
Como se usa en este documento, el término "I\kappaB" (I kappa B) se refiere a uno cualquiera de varios miembros de una familia de proteínas inhibidoras relacionadas estructuralmente que funcionan en la regulación de la inducción de NF-\kappaB.
Como se usa en este documento, la expresión "I\kappaB-quinasa", "I\kappaB proteína quinasa", "I\kappaB-complejo quinasa", "I\kappaB complejo proteína quinasa" o "IKK" se refiere a una quinasa que fosforila I\kappaB.
Como se usa en este documento, el término "IKK\alpha" se refiere a la subunidad \alpha de una I\kappaB complejo quinasa. Como se usa en este documento, el término "IKK\beta" se refiere a la subunidad \beta de una I\kappaB-complejo quinasa.
Como se usa en este documento, el término "NEMO" (modulador esencial de NF-\kappaB) "IKK\gamma" o "IKKAP" se refiere a la proteína que se une a IKK y facilita la actividad quinasa.
Como se usa en este documento, la expresión "dominio de unión a NEMO" o "NBD" incluye cualquier dominio capaz de unirse a NEMO en la región en la que NEMO normalmente interacciona con una IKK (por ejemplo, IKK\alpha o IKK\beta). Los dominios de unión a NEMO incluyen, por ejemplo, la región \alpha2 (restos 737-742) de la IKK\beta de tipo silvestre, o la secuencia correspondiente de 6 aminoácidos de IKK\alpha de tipo silvestre (restos 738-743) que son críticos para la interacción con NEMO. La secuencia de ácido nucleico y la correspondiente secuencia de aminoácidos del NBD de IKK\beta de tipo silvestre se proporcionan en la SEC ID Nº: 1 (Nº de acceso del GenBank AR067807; nucleótidos 2203-2235) y SEC ID Nº: 2, respectivamente.
Los términos "análogo", "derivado" y "mimético", como se usan en este documento, pretenden incluir moléculas que imitan la estructura química de una estructura peptídica y retienen las propiedades funcionales de la estructura peptídica. En la técnica se conocen estrategias para diseñar análogos, derivados y peptidomiméticos. Por ejemplo, véase Farmer, P.S. en Drug Design (E.J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. 10, p. 119-143; Ball. J.B. y Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3:55; Morgan, B.A. y Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243; y Freidinger. R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10:270. Véase también Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" en Taylor, M.D. y Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Capítulo 17; Smith, A.B. 3rd, et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11113-11123; Smith, A.B. 3rd et al. (1994) J Am. Chem. Soc. 116:9947-9962; y Hirschman, R., et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:12550-12568.
Como se usa en este documento, un "derivado" de un compuesto X (por ejemplo, un péptido o aminoácido) se refiere a una forma de X en la que uno o más grupos de reacción en el compuesto se han modificado con un grupo sustituyente. Los ejemplos de derivados peptídicos incluyen péptidos en los que se ha modificado una cadena lateral de aminoácido, el esqueleto peptídico, o el extremo amino o carboxi (por ejemplo, compuestos peptídicos con enlaces amida metilados). Como se usa en este documento, un "análogo" de un compuesto X se refiere a un compuesto que retiene estructuras químicas de X necesarias para la actividad funcional de X y que también contiene ciertas estructuras químicas que difieren de X. Un ejemplo de un análogo de un péptido natural es un péptido que incluye uno o más aminoácidos no naturales. Como se usa en este documento, un "mimético" de un compuesto X se refiere a un compuesto en el que ciertas estructuras químicas de X necesarias para la actividad funcional de X se han reemplazado por otras estructuras químicas que imitan la conformación de X. Los ejemplos de peptidomiméticos incluyen compuestos peptídicos en los que el esqueleto peptídico está sustituido con una o más moléculas de benzodiacepina (véase, por ejemplo, James, G.L. et al (1993) Science 260:1937-1942).
El término mimético y, en particular, peptidomimético pretende incluir isósteros. El término "isóstero", como se usa en este documento, pretende incluir una estructura química que puede sustituirse por una segunda estructura química porque la conformación estérica de la primera estructura se ajusta a un sitio de unión específico para la segunda estructura. El término incluye específicamente modificaciones de esqueletos peptídicos (es decir, miméticos de enlaces amida) bien conocidas para los especialistas en la técnica. Tales modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el carbono \alpha, amida carbonilo, el reemplazo completo del enlace amida, extensiones, deleciones o entrecruzamientos de esqueleto. Se conocen varias modificaciones del esqueleto peptídico, incluyendo \Psi[CH_{2}S], \Psi[CH_{2}NH], \Psi[CSNH_{2}], \Psi[NHCO], \Psi[COCH_{2}] y \Psi[(E) o (Z) CH=CH]. En la nomenclatura usada anteriormente, \Psi indica la ausencia de un enlace amida. La estructura que reemplaza el grupo amida se especifica dentro de los paréntesis.
Otras posibles modificaciones incluyen una sustitución N-alquilo (o arilo) (\Psi[CONR]), o entrecruzamientos de esqueleto para construir lactamas y otras estructuras cíclicas. Otros derivados de los compuestos antiinflamatorios de la invención incluyen derivados de hidroximetilo C-terminales, derivados O-modificados (por ejemplo, hidroximetil bencil éter C-terminal), derivados modificados N-terminalmente incluyendo amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas y compuestos antiinflamatorios en los que un resto de fenil alanina C-terminal se reemplaza por un análogo de fenetilamida (por ejemplo, Val-Phe-fenetilamida como un análogo del tripéptido Val-Phe-Phe).
Como se usa en este documento, la expresión "tipo silvestre" se refiere al genotipo y fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una especie natural y que contrasta con el fenotipo y genotipo de un mutante.
III. Realizaciones específicas A. Compuestos antiinflamatorios
Los compuestos antiinflamatorios de la invención comprenden fusiones de un dominio de unión a NEMO y al menos un dominio de translocación a través de la membrana que facilita la translocación a través de la membrana de los compuestos antiinflamatorios de la invención in vivo.
Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre del NBD de IKK\alpha o IKK\beta (SEC ID Nº: 2). Puede usarse cualquier fragmento de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre del NBD de IKK\alpha o IKK\beta capaz de unirse NEMO para preparar un compuesto antiinflamatorio de esta invención. Pueden usarse mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de estas secuencias de tipo silvestre (usando los métodos descritos en este documento) para generar compuestos antiinflamatorios adicionales. Son compuestos antiinflamatorios particularmente útiles de la invención péptidos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 737, 740 y 742 del péptido indicado en la SEC ID Nº: 2 (véanse los ejemplos de sustituciones conservativas que no tienen ningún efecto significativo sobre la capacidad de los péptidos para unirse a NEMO en la Tabla 1). Además, pueden usarse variantes alélicas naturales del gen IKK\beta que retienen la capacidad de unirse a NEMO para preparar compuestos antiinflamatorios.
En una realización, los compuestos antiinflamatorios de la presente invención comprenden: (a) péptidos que incluyen o constan de la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19; (b) péptidos que incluyen una sustitución de aminoácidos conservativa de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19; y (c) variantes de secuencia de aminoácidos naturales de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19.
Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención también pueden incluir receptores específicos de NEMO, tales como receptores de péptidos recombinados somáticamente, tales como anticuerpos específicos o receptores de antígenos de células T (véase Harlow & Lane, (1988) Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y otros agentes de unión intracelulares naturales identificados con ensayos tales como selecciones de uno, dos y tres híbridos, agentes de unión intracelular no naturales identificados en selecciones de bibliotecas químicas tales como las descritas más adelante.
Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden regular negativamente a NEMO. La regulación negativa se define en este documento como una reducción de la activación, función o síntesis de NEMO, sus ligandos o sus activadores. También se define para incluir un aumento en la degradación del gen de NEMO, su producto proteico, ligandos o activadores. La regulación negativa puede conseguirse de varias formas, por ejemplo, desestabilizando la unión de NEMO a una IKK (por ejemplo IKK\beta o IKK\alpha); o bloqueando la fosforilación de I\kappaB y originando la posterior degradación de esta proteína.
La fosforilación de I\kappaB por IKK\beta tiene como resultado la ubiquitinación y degradación de I\kappaB y la posterior disociación de I\kappaB, permitiendo la translocación nuclear de NF-\kappaB que conduce a una regulación positiva de genes críticos para la respuesta inflamatoria. Por lo tanto, los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden usarse para regular negativamente la función de NF-\kappaB. La regulación negativa de NF-\kappaB también puede realizarse por medio del uso de compuestos antiinflamatorios que comprenden anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos de los mismos dirigidos contra un NBD o el propio NEMO.
En una realización, la presente invención proporciona un compuesto antiinflamatorio de la fórmula
X_{a} - X_{b},
donde X_{a} es un dominio de translocación a través de la membrana que comprende de 6 a 15 restos aminoacídicos; y X_{b} es una secuencia de unión a NEMO. Opcionalmente, el compuesto puede incluir un grupo de modificación en el extremo N, el extremo C, o en ambos extremos.
X_{b} es una secuencia de unión a NEMO que comprende de 6 a 9 restos aminoacídicos. En una realización, X_{b} consta de la siguiente estructura:
(Y) _{n}-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-(A) _{m}
donde cada uno de n y m es, independientemente, 0 ó 1 y cada uno de A e Y comprende de 1 a aproximadamente 3 restos aminoacídicos. Cuando n es 1, Y es, preferiblemente, la secuencia TA. Cuando m es 1, A es preferiblemente la secuencia QTE. X_{1} es L, A, I o norleucina (Nle); X_{2} es D, E, N, Q u homoserina (Hser) o 2-cetopropilalanina (2-cetopropil-A); X_{3} es W, F, Y, 4-bifenilalanina (Bpa), homofenilalanina (Hphe), 2-naftilalanina (2-Nal), 1-naftilalanina (1-Nal) o ciclohexilalanina (Cha); X_{4} es S, A, E, L, T, norleucina (Nle) u homoserina (Hser); X_{5} es W, H, homofenilalanina (Hphe), 2-naftilalanina (2-Nal), 1-naftilalanina (1-Nal), O-bencil serina (SeroBn) o 3-piridilalanina (3-Pal); y X_{6} es L, A, I o norleucina (Nle).
Preferiblemente, X_{b} es una secuencia seleccionada entre TALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 28); LDWSWLQTE (SEC ID Nº: 29); TALDWSWL (SEC ID Nº: 30); ALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 31); LDWSWLQTE (SEC ID Nº: 32); LDWSWL (SEC ID Nº: 33); TALDWSWLQT (SEC ID Nº: 34); TALDWSWLQ (SEC ID Nº: 35); ALDWSWLQT (SEC ID Nº: 36); LDWSWLQ (SEC ID Nº: 37); LDWSWLQT (SEC ID Nº: 38); ADWSWL (SEC ID Nº: 39); LDWS
WA (SEC ID Nº: 40); ADWSWA (SEC ID Nº: 41); LDFSWL (SEC ID Nº: 42); LDYSWL (SEC ID Nº: 43); LDWAWL (SEC ID Nº: 44); LDWEWL (SEC ID Nº: 45); TAADWSWLQTE (SEC ID Nº: 46); ADWSWLQTE (SEC ID Nº: 47); TAADWSWL (SEC ID Nº: 48); AADWSWLQTE (SEC ID Nº: 49); ADWSWL (SEC ID Nº: 51); TAADWSWLQT (SEC ID Nº: 52); TAADWSWLQ (SEC ID Nº: 53); AADWSWLQT (SEC ID Nº: 54); ADWSWLQ (SEC ID Nº: 55); ADWSWLQT (SEC ID Nº: 56); ALDWSEAQTE (SEC ID Nº: 57); LDWSWAQTE (SEC ID Nº: 58); TALDWS
WA (SEC ID Nº: 59); LDWSWA (SEC ID Nº: 62); TALDWSWAQT (SEC ID Nº: 63); TALDWSWAQ (SEC ID Nº: 64); ALDWSWAQT (SEC ID Nº: 65); LDWSWAQ (SEC ID Nº: 66); LDWSWAQT (SEC ID Nº: 67); TAADWS
WAQTE (SEC ID Nº: 68); ADWSWAQTE (SEC ID Nº: 69); TAADWSWA (SEC ID Nº: 70); AADWSWAQTE (SEC ID Nº: 71); ADWSWAQTE (SEC ID Nº: 72); ADWSWA (SEC ID Nº: 73); TAADWSWAQT (SEC ID Nº: 74); TAADWSWAQ (SEC ID Nº: 75); AADWSWAQT (SEC ID Nº: 76); ADWSWAQ (SEC ID Nº: 77); ADWSWAQT (SEC ID Nº: 78); TALDFSWLQTE (SEC ID Nº: 79); LDFSWLQTE (SEC ID Nº: 80); TALDFSWL (SEC ID Nº: 81); ALDFSWLQTE (SEC ID Nº: 82); LDFSWLQTE (SEC ID Nº: 83); LDFSWL (SEC ID Nº: 84); TALDFSWLQT (SEC ID Nº: 85); TALDFSWLQ (SEC ID Nº: 86); ALDFSWLQT (SEC ID Nº: 87); LDFSWLQ (SEC ID Nº: 88); LDFSWLQT (SEC ID Nº: 89); TALDYSWLQTE (SEC ID Nº: 90); LDYSWLQTE (SEC ID Nº: 91); TALDYSWL (SEC ID Nº: 92); ALDYSWLQTE (SEC ID Nº: 93); LDYSWLQTE (SEC ID Nº: 94); LDYSWL (SEC ID Nº: 95); TALDYSWLQT (SEC ID Nº: 96); TALDYSWLQ (SEC ID Nº: 97); ALDYSWLQT (SEC ID Nº: 98); LDYSWLQ (SEC ID Nº: 99); LDYSWLQT (SEC ID Nº: 100); TALDWAWLQTE (SEC ID Nº: 101); LDWAWLQTE (SEC ID Nº: 102); TALDWAWL (SEC ID Nº: 103); ALDWAWLQTE (SEC ID Nº: 104); LDWAWLQTE (SEC ID Nº: 105); LDWAWL (SEC ID Nº: 106); TALDWAWLQT (SEC ID Nº: 107); TALDWAWLQ (SEC ID Nº: 108); ALDWAWLQT (SEC ID Nº: 109); LDWAWLQ (SEC ID Nº: 110); LDWAWLQT (SEC ID Nº: 111); TALDWEWLQTE (SEC ID Nº: 112); LDWEWLQTE (SEC ID Nº: 113); TALDWEWL (SEC ID Nº: 114); ALDWEWLQTE (SEC ID Nº: 115); LD
WEWLQTE (SEC ID Nº: 116); LDWEWL (SEC ID Nº: 117); TALDWEWLQT (SEC ID Nº: 118); TALDWEWLQ (SEC ID Nº: 119); ALDWEWLQT (SEC ID Nº: 120); LDWEWLQ (SEC ID Nº: 121); y LDWEWLQT (SEC ID Nº: 122).
X_{a} es un dominio de transducción a través de la membrana que consta de 6-15 restos aminoacídicos, preferiblemente 6-12 ó 6-10 restos aminoacídicos. Preferiblemente, X_{a} es un dominio de translocación a través de la membrana que comprende al menos cinco restos aminoacídicos básicos, preferiblemente al menos cinco restos seleccionados independientemente entre L-arginina, D-arginina, L-lisina y D-lisina. Los dominios de transducción a través de la membrana adecuados incluyen los descritos en este documento.
En una realización, X_{a} se selecciona entre las secuencias de aminoácidos RRMKWKK (SEC ID Nº: 123); YGRKK
RRQRRR (SEC ID Nº: 124); ygrkkrrqrrr (SEC ID Nº: 125); YARKARRQARR (SEC ID Nº: 126); yarkarrqarr (SEC ID Nº: 127); YARAARRAARR (SEC ID Nº: 128); yaraarraarr (SEC ID Nº: 129); rrmkwkk (SEC ID Nº: 130); (R)_{y} y (r)_{y}, donde Y es de 6 a 11. Las letras minúsculas indican restos D-aminoacídicos y las letras mayúsculas indican restos L-aminoacídicos.
Los ejemplos de péptidos X_{a}-X_{b} adecuados incluyen los que tienen las siguientes secuencias: RRMKWKKT
ALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 131); rrmkwkkTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 132); YGRKKRRQRRRTALDWSWL
QTE (SEC ID Nº: 133); ygrkkrrqrrrTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 134); rrrrrrrTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 135); RRRRRRRTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 136); YARKARRQARRTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 137); yar
karrqarrTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 138); YARAARRAARRTALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 139); yaraarraarr
TALDWSWLQTE (SEC ID Nº: 140); YGRKKRRQRRRLDWSWL (SEC ID Nº: 141); ygrkkrrqrrrLDWSWL (SEC ID Nº: 142); RRMKWKKLDWSWL (SEC ID Nº: 143); rrmkwkkLDWSWL (SEC ID Nº: 144); rrrrrrrLDWSWL (SEC ID Nº: 145); YARAARRAARRLDWSWL (SEC ID Nº: 146); yaraarraarrLDWSWL (SEC ID Nº: 147); y RRRRRRRLDWSWL (SEC ID Nº: 148).
Los compuestos antiinflamatorios de la invención opcionalmente pueden incluir grupos de modificación unidos al extremo C, el extremo N o ambos extremos. Por ejemplo, los grupos de modificación adecuados que pueden unirse al extremo C incluyen grupos amino sustituidos y no sustituidos, por ejemplo, -NH_{2}, NH(alquilo) y -N(alquilo)_{2}; y grupos alcoxi tales como grupos alcoxi C_{1}-C_{6} lineales, ramificados o cíclicos. Un grupo de modificación C-terminal preferido es el grupo -NH_{2}. Los grupos de modificación adecuados que pueden unirse al extremo N incluyen grupos acilo, tales como el grupo acetilo; y grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo C_{1}-C_{6}, más preferiblemente
metilo.
En los compuestos antiinflamatorios de la presente invención, el dominio de translocación a través de la membrana, X_{a}, puede estar presente en el extremo amino del compuesto y la secuencia de unión a NEMO, X_{b}, puede estar presente en el extremo carboxi del compuesto (X_{a}-X_{b}). Como alternativa, en los compuestos antiinflamatorios de la presente invención, el dominio de translocación a través de la membrana, X_{a}, puede estar presente en el extremo carboxilo del compuesto y la secuencia de unión a NEMO, X_{b}, puede estar presente en el extremo amino del compuesto
(X_{b}-X_{a}).
Los compuestos antiinflamatorios particulares de la invención incluyen los indicados a continuación:
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1 
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B. Ensayos de selección
La presente invención también describe métodos para seleccionar compuestos de acuerdo con la presente invención que desactivan o actúan como antagonistas de la función de IKK\beta. Tales compuestos pueden ser útiles en la modulación de estados patológicos asociados con alteraciones en los niveles de proteína IKK\beta o NF-\kappaB.
La presente invención también describe métodos para aislar e identificar moléculas de unión de proteínas de la invención, por ejemplo, compuestos que interaccionan con IKK\beta en el NBD de esta molécula, o que interaccionan con NEMO, bloqueando de esta manera la interacción de NEMO con IKK\beta. Una proteína de la invención se mezcla con una molécula de unión potencial o un extracto o fracción de una célula en condiciones que permitan la asociación de moléculas de unión potenciales con las proteínas de la invención. Después de la mezcla, los péptidos, polipéptidos, proteínas u otras moléculas que se han asociado con la proteína de la invención se separan de la mezcla. La molécula de unión unida a la proteína de la invención después puede retirarse y analizarse adicionalmente. Para identificar y aislar una molécula de unión, puede usarse la proteína entera, por ejemplo, el péptido IKK\beta entero. Como alternativa, puede usarse un fragmento de la proteína. Por ejemplo, puede usarse el fragmento peptídico que comprende NBD para bloquear la interacción de IKK\beta con NEMO.
Pueden usarse diversos métodos para obtener un extracto de una célula. Las células pueden romperse usando métodos de ruptura físicos o químicos. Los ejemplos de métodos de ruptura físicos incluyen, pero sin limitación, sonicación y cizallamiento mecánico. Los ejemplos de métodos de lisis química incluyen, pero sin limitación, lisis con detergentes y lisis con enzimas. Un especialista en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos para preparar extractos celulares con el fin de obtener extractos que puedan usarse en los presentes métodos.
Una vez preparado un extracto de una célula, el extracto se mezcla con IKK\beta o NEMO en condiciones en las que pueda producirse la asociación de la proteína con la molécula de unión. Pueden usarse diversas condiciones, siendo las más preferidas las condiciones que se parecen mucho a las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula humana. Las características tales como la osmolaridad, el pH, la temperatura y la concentración del extracto celular usado, pueden variarse para optimizar la asociación de la proteína con la molécula de unión.
Después de mezclarse en las condiciones apropiadas, el complejo unido se separa de la mezcla. Para separar la mezcla pueden usarse diversas técnicas. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos específicos para una proteína de la invención para inmunoprecipitar el complejo de molécula de unión. Como alternativa, pueden usarse técnicas de separación química convencionales tales como cromatografía y centrifugación de sedimentos por densidad.
Después de retirar los constituyentes celulares no asociados encontrados en el extracto, la molécula de unión puede disociarse del complejo usando métodos convencionales. Por ejemplo, la disociación puede realizarse alterando la concentración de sal o el pH de la mezcla.
Para ayudar a la separación de los pares de moléculas de unión asociados del extracto mixto, la proteína puede inmovilizarse en un soporte sólido. Por ejemplo, la proteína puede unirse a una matriz de nitrocelulosa o a perlas acrílicas. La unión de la proteína a un soporte sólido ayuda a separar los pares de péptido-molécula de unión de otros constituyentes encontrados en el extracto. Las moléculas de unión identificadas pueden ser una sola proteína o un complejo hecho de hasta dos o más proteínas. Como alternativa, pueden identificarse moléculas de unión usando un ensayo Far-Western de acuerdo con los procedimientos de Takayama et al., (1997) Methods Mol. Biol. 69, 171-184 o Sauder et al., (1996) J. Gen. Virol. 77, 991-996 o identificarse por medio del uso de proteínas señalizadas con epítopos o proteínas de fusión con GST.
Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de la invención pueden usarse en un sistema de dos híbridos de levadura. El sistema de dos híbridos de levadura se ha usado para identificar otros pares de moléculas de proteína y puede adaptarse fácilmente para emplear las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento (véase, por ejemplo, el sistema de dos híbridos Hybrizap® de Stratagene).
Se preparan sondas de anticuerpo inmunizando hospedadores mamíferos adecuados en protocolos de inmunización apropiados usando los péptidos. Los péptidos o proteínas que comprenden el NBD tienen una longitud suficiente o, si se desea, cuando es necesario para aumentar la inmunogenicidad, se conjugan con soportes adecuados. En la técnica son bien conocidos los métodos para preparar conjugados inmunogénicos con soportes tales como BSA, KLH u otras proteínas de soporte. En algunas circunstancias, puede ser eficaz la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, pueden ser deseables reactivos de unión tales como los suministrados por Pierce Chemical Co. para proporcionar accesibilidad al hapteno. Los péptidos haptenos pueden extenderse al extremo amino o carboxi con un resto de cisteína o intercalarse con restos de cisteína, por ejemplo, para facilitar la unión a un soporte. La administración de los inmunógenos se realiza generalmente por inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con el uso de adyuvantes adecuados, como se entiende generalmente en la técnica. Durante el programa de inmunización, se toman titulaciones de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación de los anticuerpos. Aunque los antisueros policlonales producidos de esta manera pueden ser satisfactorios para algunas aplicaciones, para composiciones farmacéuticas se prefiere el uso de preparaciones monoclonales. Pueden prepararse líneas de células inmortalizadas que secreten los anticuerpos monoclonales deseados usando el método convencional de Kohler & Milstein, (1992) Biotechnology 24, 524-526 o modificaciones que inmortalicen linfocitos o células de bazo, como se conoce generalmente. Las líneas de células inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se seleccionan por medio de un inmunoensayo en el que el antígeno es el hapteno peptídico, péptido o
proteína.
Una vez identificado el cultivo de células inmortalizadas apropiado que secreta el anticuerpo deseado, las células pueden cultivarse in vitro o por producción en fluido ascítico. Los anticuerpos monoclonales deseados pueden recuperarse del sobrenadante de cultivo o del sobrenadante del fluido ascítico. Los fragmentos de los antisueros monoclonales o policlonales que contienen la porción inmunológicamente significativa pueden usarse como antagonistas, así como los anticuerpos intactos. A menudo se prefiere el uso de fragmentos inmunológicamente reactivos, tales como los fragmentos Fab, Fab' o F(ab')2, especialmente en un contexto terapéutico, ya que estos fragmentos generalmente son menos inmunogénicos que la inmunoglobulina entera.
Los anticuerpos o fragmentos también pueden producirse usando la tecnología actual, por medios recombinantes. También pueden producirse regiones de anticuerpo que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína en el contexto de quimeras con múltiples orígenes de especie. Los agentes que se ensayan en el método anterior pueden seleccionarse aleatoriamente, seleccionarse racionalmente o diseñarse racionalmente. Como se usa en este documento, se dice que un agente se selecciona aleatoriamente cuando el agente se elige aleatoriamente sin considerar la secuencia específica implicada en la asociación de la proteína de la invención sola o con sus sustratos asociados, moléculas de unión, etc. Un ejemplo de un agente seleccionado aleatoriamente es el uso de una biblioteca química o de una biblioteca de péptidos combinatorios, o un caldo de cultivo de un organismo.
Como se usa en este documento, se dice que un agente se selecciona o se diseña racionalmente cuando el agente se elige en una base no aleatoria que tiene en cuenta la secuencia del sitio diana y/o su conformación en relación con la acción del agente. Los agentes pueden seleccionarse racionalmente o diseñarse racionalmente utilizando las secuencias de péptidos que comprenden el NBD de IKK\beta o el dominio de unión IKK\beta de NEMO. Por ejemplo, un agente peptídico seleccionado racionalmente puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o un péptido con sustituciones conservativas del mismo.
Los compuestos peptídicos de la invención pueden prepararse usando métodos de síntesis de péptidos en fase sólida convencionales (o en fase de solución) como es conocido en la técnica. Además, el ADN que codifica estos péptidos puede sintetizarse usando una instrumentación de síntesis de oligonucleótidos disponible en el mercado y producirse de manera recombinante usando sistemas de producción recombinantes convencionales. La producción usando síntesis de péptidos en fase sólida es necesaria si se van a incluir aminoácidos no codificados por genes.
C. Ensayos de alto rendimiento
Introducción - El poder de la selección de alto rendimiento se utiliza para buscar nuevos compuestos antiinflamatorios que sean capaces de interaccionar con NEMO. Como información general sobre la selección de alto rendimiento, véase, por ejemplo, Cost-Effective Strategies for Automated and Accelerated High-Throughput Screening, IBCS Biomedical Library Series, IBC United States Conferences, 1996; Devlin (Editor), High Throughput Screening, Marcel Dekker 1998; Patente de Estados Unidos Nº 5.763.263. Los ensayos de alto rendimiento utilizan una o más técnicas de ensayo diferentes.
Inmunodiagnóstico e Inmunoensayos - Son un grupo de técnicas usadas para medir sustancias bioquímicas específicas, comúnmente a bajas concentraciones en mezclas complejas tales como fluidos biológicos, que dependen de la especificidad y alta afinidad mostrada por anticuerpos preparados y seleccionados de manera adecuada por sus antígenos complementarios. La sustancia a medir necesariamente debe ser antigénica - una macromolécula inmunogénica o una molécula pequeña hapténica. A cada muestra se le añade una cantidad limitada conocida de anticuerpo específico y se estima la fracción de antígeno que se combina con el mismo, a menudo expresada como relación de anticuerpo unido:libre, usando como indicador una forma del antígeno marcado con el radioisótopo (radioinmunoensayo), molécula fluorescente (fluoroinmunoensayo), radical libre estable (inmunoensayo de spin), enzima (inmunoensayo enzimático) u otro marcador fácilmente distinguible.
Los anticuerpos pueden marcarse de diversas formas, incluyendo: ensayo de inmunoabsorbente con enzima unida (ELISA); radioinmunoensayo (RIA); inmunoensayo fluorescente (FIA); inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA); y marcaje del anticuerpo con partículas de oro coloidales (inmuno-oro).
Los formatos de ensayo comunes incluyen el ensayo de tipo sándwich, ensayo competitivo o de competición, ensayo de aglutinación de látex, ensayo homogéneo, formato en placas de microtitulación y el ensayo basado en micropartículas.
Ensayo de inmunoabsorbente con enzima unida (ELISA) - El ELISA es una técnica inmunoquímica que evita los riesgos de los agentes radioquímicos y el gasto de los sistemas de detección de fluorescencia. En su lugar, el ensayo usa enzimas como indicadores. El ELISA es una forma de inmunoensayo cuantitativo basada en el uso de anticuerpos (o antígenos) que se unen a la superficie de un soporte insoluble, que después se usa para "capturar" el antígeno (o anticuerpo) relevante en la solución de ensayo. El complejo de antígeno-anticuerpo después se detecta midiendo la actividad de una enzima apropiada que previamente se había unido covalentemente al antígeno (o anticuerpo).
Como información sobre técnicas ELISA, véase, por ejemplo, Crowther, ELISA: Theory and Practice (Methods in Molecular Biology, Vol. 42), Humana Press, 1995; Challacombe & Kemeny, ELISA and Other Solid Phase
Immunoassays: Theoretical and Practical Aspects, John Wiley, 1998; Kemeny, A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, 1991; Ishikawa, Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 27), Elsevier, 1991.
Ensayos Colorimétricos para Enzimas - La colorimetría es cualquier método de análisis químico cuantitativo en el que la concentración o cantidad de un compuesto se determina comparando el color producido por la reacción de un reactivo con cantidades convencionales y de ensayo del compuesto, a menudo usando un colorímetro. Un colorímetro es un dispositivo para medir la intensidad del color o las diferencias en la intensidad del color, visual o fotoeléctricamente.
Los ensayos colorimétricos convencionales de la actividad enzimática de la beta-galactosidasa son bien conocidos para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Norton et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 281-290). Puede realizarse un ensayo colorimétrico en lisados de células enteras usando O-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido (ONPG, Sigma) como sustrato en un ensayo colorimétrico convencional de \beta-galactosidasa (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). También se dispone de ensayos colorimétricos automáticos para la detección de la actividad beta-galactosidasa, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.733.720.
Ensayos de Inmunofluorescencia - La inmunofluorescencia o microscopía de inmunofluorescencia es una técnica en la que un antígeno o anticuerpo se vuelve fluorescente por conjugación con un colorante fluorescente y después se deja reaccionar con el anticuerpo o antígeno complementario en una sección tisular o en un frotis. Después puede determinarse la localización del antígeno o anticuerpo determinando la fluorescencia por microscopía con luz ultravioleta.
Como información general sobre técnicas inmunofluorescentes, véase, por ejemplo, Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy: A Practical Approach (The Practical Approach Series, Vol. 218) Oxford University Press; Beutner, (1983) Defined Immunofluorescence and Related Cytochemical Methods, New York Academy of Sciences; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. Como explicaciones detalladas de técnicas inmunofluorescentes aplicables a la presente invención véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.912.176; 5.869.264; 5.866.319; y 5.861.259.
Biochips - Los péptidos de la invención pueden usarse en una serie o microserie para la selección de alto rendimiento de agentes que interaccionan con los ácidos nucleicos de la invención o sus proteínas correspondientes.
Una "serie" o "microserie" generalmente se refiere a un sistema de rejilla que tiene cada posición o celda de prueba ocupada por un fragmento de un ácido nucleico definido también conocido como oligonucleótido. Las propias series algunas veces se denominan chips o "biochips", que son microseries de péptidos y ácidos nucleicos de alta densidad que a menudo tienen miles de celdas de prueba en una diversidad de estilos de rejilla.
Un chip de detección molecular típico incluye un sustrato en el que se dispone una serie de sitios de reconocimiento, sitios de unión o sitios de hibridación. Cada sitio tiene un receptor molecular respectivo que se une o hibrida con una molécula que tiene una estructura predeterminada. Los sustratos de soporte sólido que pueden usarse para formar la superficie de la serie o chip incluyen sustratos orgánicos e inorgánicos, tales como vidrio, poliestirenos, poliimidas, dióxido de silicio y nitruro de silicio. Para la unión directa de sondas a los electrodos, la superficie del electrodo debe fabricarse con materiales capaces de formar conjugados con las sondas.
Una vez fabricada la serie, se aplica una solución de muestra al chip de detección molecular y las moléculas presentes en la muestra se unen o hibridan con uno o más sitios. Los sitios en los que se produce la unión se detectan y posteriormente se deducen una o más estructuras moleculares dentro de la muestra. La detección de los lotes marcados es una estrategia de detección tradicional e incluye radioisótopos, marcadores fluorescentes y biotina, pero están disponibles otras opciones, incluyendo la transducción de señales electrónica.
Los polipéptidos son un sistema ilustrativo para explorar la relación entre la estructura y la función en biología. Cuando los veinte aminoácidos naturales se condensan en una molécula polimérica, forman una amplia diversidad de configuraciones tridimensionales, siendo resultantes cada una de una secuencia de aminoácidos particular y un estado del disolvente. Por ejemplo, el número de posibles configuraciones polipeptídicas usando los veinte aminoácidos naturales para un polímero de cinco aminoácidos de longitud es de más de tres millones. Las proteínas típicas tienen una longitud mayor de cien aminoácidos.
En aplicaciones típicas, una solución compleja que contiene una o más sustancias a caracterizar entra en contacto con una serie de polímeros que comprenden polipéptidos. Los polipéptidos de la invención pueden prepararse por métodos clásicos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando técnicas en fase sólida convencionales. Los métodos convencionales incluyen síntesis en fase sólida exclusiva, métodos de síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis en solución clásica y tecnología de ADN recombinante (véase Merrifield, (1963) Am. Chem. Soc. 85, 2149-2152).
En una realización preferida, los polipéptidos o proteínas de la serie pueden unirse a otros co-receptores para formar un heterodúplex en la serie. En otra realización, los polipéptidos o proteínas de la serie pueden unirse a péptidos o moléculas pequeñas.
D. Usos de los compuestos antiinflamatorios de la presente invención
Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden usarse para modular la inflamación y tratar o diagnosticar un trastorno inflamatorio en un sujeto. Los métodos incluyen administrar a un sujeto un compuesto antiinflamatorio de la invención en una cantidad eficaz para tratar el trastorno inflamatorio.
Como se usa en este documento, un "trastorno inflamatorio" pretende incluir una enfermedad o trastorno caracterizado por, producido por, debido a, o que se ve afectado por la inflamación. Un trastorno inflamatorio puede producirse o estar asociado con procesos biológicos y patológicos asociados con la función y actividad de NEMO o IKK\beta y/o con procesos mediados por NF-\kappaB. Los ejemplos de enfermedades o trastornos inflamatorios incluyen, pero sin limitación, trastornos inflamatorios agudos y crónicos tales como asma, psoriasis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriática, enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), sepsis, vasculitis y bursitis; enfermedades autoinmunes tales como lupus, polimialgia, reuma, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, arteritis temporal, crioglobulinemia y esclerosis múltiple; rechazo de trasplantes; osteoporosis; cáncer, incluyendo tumores sólidos (por ejemplo, de pulmón, SNC, colon, riñón y páncreas); enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis; infecciones virales (por ejemplo, VIH o influenza); infecciones virales crónicas (por ejemplo, Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes simple); y ataxia telangiectasia.
Los procesos patológicos se refieren a una categoría de procesos biológicos que producen un efecto perjudicial. Por ejemplo, la expresión no regulada de NF-\kappaB está asociada con procesos proinflamatorios subyacentes a ciertos procesos patológicos. Como se usa en este documento, se dice que un compuesto antiinflamatorio modula un proceso patológico cuando el compuesto reduce el grado o gravedad del proceso. Por ejemplo, pueden prevenirse respuestas proinflamatorias o pueden modularse procesos patológicos por medio de la administración de compuestos antiinflamatorios que reducen, promueven o modulan de alguna manera la expresión o al menos una actividad de NEMO o IKK\beta.
Por lo tanto, los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades con un componente inflamatorio de NF-\kappaB. Tales enfermedades incluyen, pero sin limitación, osteoporosis, artritis reumatoide, aterosclerosis, asma (Ray & Cohn, (1999) J. Clin. Invest. 104, 985-993; Christman et al., (2000) Chest 117, 1482-1487) y enfermedad de Alzheimer. Como revisión de enfermedades con un componente inflamatorio NF-\kappaB véase Epstein, (1997) New Eng. J. Med 336. 1066-1071; Lee et al., (1998) J. Clin. Pharmacol. 38, 981-993; Brand et al., (1997) Exp. Physiol. 82, 297-304.
Los procesos patológicos asociados con una respuesta proinflamatoria en los que serían útiles los compuestos antiinflamatorios de la invención para el tratamiento incluyen, pero sin limitación, asma, alergias tales como rinitis alérgica, urticaria, anafilaxis, sensibilidad a fármacos, sensibilidad a alimentos y similares; inflamación cutánea tal como dermatitis, eccema, psoriasis, dermatitis de contacto, quemaduras solares, envejecimiento y similares; artritis tal como osteoartritis, artritis psoriática, lupus, espondiloartritis y similares. Los compuestos antiinflamatorios también son útiles para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la enfermedad crónica inflamatoria del intestino. Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención además pueden usarse para reemplazar corticosteroides en cualquier aplicación en la que se usen los corticosteroides, incluyendo inmunosupresión en trasplantes y terapia del cáncer.
Como se usa en este documento, el término "sujeto" incluye animales de sangre caliente, preferiblemente mamíferos, incluyendo seres humanos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización incluso más preferida, el primate es un ser humano.
Como se usa en este documento, el término "administración" a un sujeto incluye la distribución, suministro o aplicación de un compuesto antiinflamatorio, por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio en una formulación farmacéutica (como se describe en este documento), a un sujeto por medio de cualquier vía adecuada de suministro del compuesto a la localización deseada en el sujeto, incluyendo el suministro por vía parenteral u oral, inyección intramuscular, inyección subcutánea/intradérmica, inyección intravenosa, administración bucal, suministro transdérmico y administración por vía rectal, colónica, vaginal, intranasal o a través del tracto respiratorio (por ejemplo, por inhalación).
Como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" incluye una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para conseguir el resultado deseado, por ejemplo, suficiente para tratar un trastorno inflamatorio en un sujeto. Una cantidad eficaz de un compuesto antiinflamatorio de la invención, como se define en este documento, puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad y el peso del sujeto, y la capacidad del compuesto de inducir una respuesta deseada en el sujeto. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial (por ejemplo, efectos secundarios) del compuesto se compensa por los efectos beneficiosos desde el punto de vista terapéutico.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antiinflamatorio de la invención (es decir, una dosificación eficaz) puede variar de aproximadamente 0,01 a 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 20 mg/kg de peso corporal, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, de 2 a 9 mg/kg, de 3 a 8 mg/kg, de 4 a 7 mg/kg, o de 5 a 6 mg/kg de peso corporal. El especialista en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir sobre la dosificación necesaria para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero sin limitación la gravedad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos previos, el estado de salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antiinflamatorio de la invención puede incluir un solo tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo, un sujeto se trata con un compuesto antiinflamatorio de la invención en el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal una vez por semana durante un periodo comprendido entre aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 y 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. También se apreciará que la dosificación eficaz de un compuesto antiinflamatorio de la invención usado para el tratamiento puede aumentar o reducirse a lo largo del transcurso de un tratamiento particular.
Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden proporcionarse solos o en combinación con otros agentes que modulan un proceso patológico particular. Por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio de la presente invención puede administrarse en combinación con otros agentes antiinflamatorios conocidos. Pueden encontrarse agentes antiinflamatorios conocidos que pueden usarse en los métodos de la invención en Harrison's Principles of Internal Medicine, Decimotercera Edición, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; y The Physicians Desk Reference 50ª Edición 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co., cuyo contenido completo se incorpora expresamente en este documento como referencia. Los compuestos antiinflamatorios de la invención y los agentes antiinflamatorios adicionales pueden administrarse al sujeto en las mismas composiciones farmacéuticas o en diferentes composiciones farmacéuticas (al mismo tiempo o en momentos diferentes).
La presente invención también proporciona métodos para modular la transducción de señales en la que esta implicada I\kappaB en una célula. Los métodos incluyen modular la actividad de IKK\beta, por ejemplo, poniendo en contacto una célula con un compuesto antiinflamatorio de la invención. El compuesto antiinflamatorio puede inhibir, por ejemplo, la interacción de NEMO con IKK\beta en el NBD, inhibiendo de esta manera la función de IKK\beta. La célula puede residir en cultivo o in situ, es decir, dentro del hospedador natural.
Para usos de diagnóstico, los compuestos antiinflamatorios de la invención pueden marcarse, tal como con moléculas fluorescentes, radiactivas, quimioluminiscentes u otras moléculas fácilmente detectables. El marcador puede conjugarse directa o indirectamente con el compuesto antiinflamatorio.
E. Preparaciones farmacéuticas
La invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos antiinflamatorios de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los procedentes del petróleo y los de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse como vehículos líquidos soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. En Gennaro et al., (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, se describen vehículos farmacéuticos adecuados. Además del agente farmacológicamente activo, las composiciones de la presente invención pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente para el suministro en el sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas de inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetil celulosa sódica, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. También pueden usarse liposomas para encapsular el agente para el suministro en la célula.
La formulación farmacéutica para administración sistémica de acuerdo con la invención puede formularse para administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, pueden usarse simultáneamente los tres tipos de formulaciones para conseguir la administración sistémica del ingrediente activo.
Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, píldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de los mismos.
Los compuestos antiinflamatorios de la invención también pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas que permitan la liberación sostenida de los compuestos antiinflamatorios a un sujeto durante un periodo de al menos varias semanas a un mes o más. Tales formulaciones se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.968.895 y 6.180.608 B1.
Los compuestos antiinflamatorios de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal. Como alternativa, o conjuntamente, la administración puede realizarse por vía oral o por inhalación o lavado, directamente en los pulmones. La dosificación administrada dependerá de la edad, estado de salud y peso del receptor, tipo de tratamiento conjunto, si lo hay, frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Los compuestos antiinflamatorios usados en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden administrarse sistémica o tópicamente, dependiendo de consideraciones tales como la afección a tratar, la necesidad de un tratamiento específico de sitio, la cantidad de fármaco a administrar y consideraciones similares.
Puede usarse la administración tópica. Puede emplearse cualquier formulación tópica común tal como una solución, suspensión, gel, pomada o ungüento y similares. La preparación de tales formulaciones tópicas está bien descrita en la técnica de las formulaciones farmacéuticas como se ejemplifica, por ejemplo, por Remington's Pharmaceutical Sciences. Para la aplicación tópica, estos compuestos también podrían administrarse como un polvo o pulverización, particularmente en forma de aerosol. El ingrediente activo puede administrarse en composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración sistémica. Como se sabe, si se va a administrar un fármaco sistémicamente, puede confeccionarse como un polvo, píldora, comprimido o similar, o como un jarabe o elixir para administración oral. Para la administración intravenosa, intraperitoneal o intralesional, el compuesto se preparará como una solución o suspensión que puede administrarse por inyección. En ciertos casos, puede ser útil formular estos compuestos en forma de supositorio o como una formulación de liberación prolongada para colocarse como un depósito debajo de la piel o para administrarse por inyección intramuscular. En una realización preferida, los compuestos antiinflamatorios de la invención pueden administrarse por inhalación. Para la terapia por inhalación, el compuesto puede estar en una solución útil para administración por inhaladores de dosificación medidos o en una forma adecuada para un inhalador de polvo seco.
Una cantidad eficaz es la cantidad que modulará la actividad o alterará el nivel de proteína diana. Una cantidad eficaz dada variará de un estado a otro y, en ciertos casos, puede variar con la gravedad del estado a tratar y la susceptibilidad del paciente al tratamiento. Por consiguiente, una cantidad eficaz dada se determinará de la mejor manera en el momento y en el sitio específico por medio de una experimentación rutinaria. Sin embargo, se prevé que en el tratamiento de un tumor de acuerdo con la presente invención, una formulación que contiene entre 0,001 y 5 por ciento en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 1 por ciento, normalmente constituirá una cantidad terapéuticamente eficaz. Cuando se administre sistémicamente, una cantidad comprendida entre 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal al día, pero preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg por kg, conseguirá un resultado terapéutico en la mayoría de los casos.
En la puesta en práctica de los métodos de esta invención, los compuestos de esta invención pueden usarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En ciertas realizaciones preferidas, los compuestos de esta invención pueden coadministrarse junto con otros compuestos recetados típicamente para estas afecciones de acuerdo con la práctica médica aceptada generalmente. Los compuestos de esta invención pueden utilizarse in vivo, normalmente en mamíferos, preferiblemente en seres humanos.
En otra realización, los compuestos antiinflamatorios de la invención pueden acoplarse a restos químicos, incluyendo proteínas que alteran las funciones o la regulación de proteínas diana para conseguir un efecto terapéutico beneficioso. Estas proteínas pueden incluir en combinación otros inhibidores de citoquinas y factores de crecimiento que pueden ofrecer un efecto beneficioso terapéutico adicional en el tratamiento de trastornos inflamatorios. Además, los compuestos antiinflamatorios de la invención también pueden conjugarse por medio de la fosforilación con biotinilato, tiolato, acetilato o yodinato usando cualquiera de los reactivos de entrecruzamiento bien conocidos en la técnica.
F. Biología molecular, microbiología y técnicas de ADN recombinante
De acuerdo con la presente invención, como se ha descrito anteriormente o como se describe en los Ejemplos presentados más adelante, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante. Tales técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Glover, (1985) DNA Cloning: A Practical Approach: Gait, (1984) Oligonucleotide Synthesis; Harlow & Lane, (1988), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Roe et al., (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley; y Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing.
G. ARN antisentido
Las moléculas antisentido son moléculas de ARN o ADN monocatenario con secuencias nucleotídicas complementarias a una ARNm específico. Cuando una molécula antisentido preparada en el laboratorio se inyecta en células que contienen el ARNm normal transcrito por un gen que se está estudiando, la molécula antisentido puede formar pares de bases con el ARNm, impidiendo la traducción del ARNm en proteínas. El ARN o ARN/ADN bicatenario resultante se digiere con enzimas que se unen específicamente a tales moléculas. Por lo tanto, se produce una reducción del ARNm bloqueándose la traducción del producto génico, por lo que las moléculas antisentido encuentran usos en medicina para bloquear la producción de proteínas perjudiciales. En la técnica son bien conocidos para los especialistas habituales en la técnica métodos para producir y utilizar ARN antisentido (véase, por ejemplo, Lichtenstein & Nellen (Editors), Antisense Technology: A Practical Approach, Oxford University Press, 1997; Agrawal & Crooke, Antisense Research and Application (Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 131), Springer Verlag, 1998; Gibson, Antisense and Ribozyme Methodology: Laboratory Companion, Chapman & Hall, 1997; Mol & Van Der Krol, Antisense Nucleic Acids and Proteins, Marcel Dekker; Weiss, Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA; Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, 1997; Stanley et al. (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press: Stein & Krieg, (1998), Applied Antisense Oligonucleotide Technology).
Las moléculas antisentido y las ribozimas pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ácido nucleico. Éstas incluyen técnicas para la síntesis química de oligonucleótidos tales como la síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Como alternativa, pueden generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN. Tales secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia diversidad de vectores con promotores de ARN polimerasa adecuados tales como T7 o SP6. Como alternativa, estas construcciones de ADNc que sintetizan ARN antisentido de manera constitutiva o inducible pueden introducirse en líneas celulares, células o tejidos. Las moléculas de ARN pueden modificarse para aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen, pero sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2'O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro del esqueleto de la molécula. Este concepto puede extenderse por la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como acetil-, metil-, tio- y formas modificadas de manera similar de adenina, citidina, guanina, timina y uridina, que no se reconocen fácilmente por endonucleasas endógenas.
H. Proteínas de fusión
Una proteína de fusión es un producto de expresión resultante de la fusión de dos genes. Tal proteína puede producirse, por ejemplo, en estudios de expresión de ADN recombinante o, de manera natural, en ciertos oncogenes virales en los que el oncogen está fusionado a gag.
La producción de una proteína de fusión algunas veces se debe a la necesidad de poner un gen eucariota clonado bajo el control de un promotor bacteriano para la expresión en un sistema bacteriano. Entonces, las secuencias del sistema bacteriano a menudo se expresan unidas a la proteína eucariota. Se usan proteínas de fusión para el análisis de la estructura, purificación, función y expresión de productos génicos heterólogos.
Una proteína fusionada es una molécula proteica híbrida que puede producirse cuando un ácido nucleico de interés se inserta por técnicas de ADN recombinante en un plásmido receptor y desplaza el codón stop del gen del plásmido. La proteína fusionada empieza en el extremo amino con una porción de la secuencia proteica del plásmido y termina con la proteína de interés.
La producción de proteínas de fusión es bien conocida para un especialista en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº: 5.908.756; 6.907.085; 5.906.819; 5.905.146; 5.895.813; 5.891.643; 5.891.628; 5.891.432; 5.889.169; 5.889.150; 5.888.981; 5.888.773; 5.886.150; 5.886.149; 5.885.833; 5.885.803; 5.885.779;
5.885.580; 5.883.124; 5.882.941; 5.882.894; 5.882.864; 5.879.917; 5.879.893; 5.876.972; 5.874.304; y 5.874.290). Como revisión general de las propiedades de construcción, aplicaciones y problemas asociados con los tipos específicos de moléculas de fusión usadas en medicina clínica y de investigación, véase, por ejemplo, Chamow et al., (1999) Antibody Fusion Proteins, John Wiley.
I. Peptidomiméticos
Pueden usarse peptidomiméticos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como el NBD, pero tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado entre el grupo compuesto por: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, CH_{2}-CH_{2}-, CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-, por métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en las siguientes referencias: Weinstein, (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino, Acids, Peptides and Proteins, Marcel Dekker; Morley, (1980) Trends Pharmacol. Sci. 1, 463-468 (revisión general); Hudson et al., (1979) Int. J. Pept. Protein Res. 14, 177-185 (-CH_{2}NH-, CH_{2}CH_{2}-); Spatola et al., (1986) Life Sci. 38, 1243-1249 (-CH_{2}-S); Hann, (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist et al., (1980) J. Med. Chem. 23, 1392-1398 (-COCH_{2}-); Jennings-White et al., (1982) Tetrahedron Lett. 23, 2533 (-COCH_{2}-); Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 4.424.207 (-CH(OH)CH_{2}-); Holladay et al., (1983) Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (-C(OH)CH_{2}-); y Hruby, (1982) Life Sci. 31, 189-199 (-CH_{2}-S-).
El marcaje de peptidomiméticos normalmente implica la unión covalente de uno o más marcadores, directamente o por medio de un espaciador (por ejemplo, un grupo amida), a posiciones que no interfieren del peptidomimético que se predicen por datos cuantitativos de estructura-actividad y/o modelado molecular. Tales posiciones que no interfieren generalmente son posiciones que no forman contactos directos con la(s) macromolécula(s) (por ejemplo, no son puntos de contacto en complejos NBD-NEMO) a las que se une el peptidomimético para producir el efecto terapéutico. La derivatización (por ejemplo, marcaje) de peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético. Los peptidomiméticos NBD pueden construirse por diseño de fármacos basado en la estructura por medio del reemplazo de aminoácidos por restos orgánicos (véase, por ejemplo, Hughes, (1980) Philos. Trans. R. Soc. Lond. 290, 387-394; Hodgson, (1991) Biotechnol., 9, 19-21; Suckling, (1991), Sci. Prog. 75, 323-359).
El uso de peptidomiméticos puede mejorarse por medio del uso de química combinatoria para crear bibliotecas de fármaco. El diseño de peptidomiméticos puede ayudarse por medio de la identificación de mutaciones de aminoácidos que aumentan o reducen la unión de un NBD (por ejemplo, el NBD en IKK\beta) a NEMO. Por ejemplo, mutaciones tales como las identificadas en la Tabla 1. Las estrategias que pueden usarse incluyen el método de dos híbridos de levadura (véase Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88, 9578-9582) y el uso del método de presentación de fagos. El método de dos híbridos detecta interacciones proteína-proteína en levaduras (Fields, et al., (1989) Nature 340, 245-246). El método de presentación de fagos detecta la interacción entre una proteína inmovilizada y una proteína que se expresa en la superficie de fagos tales como lambda y M13 (Amberg et al., (1993) Strategies 6, 2-4; Hogrefe et al., (1993) Gene 128, 119-126). Estos métodos permiten la selección positiva y negativa de interacciones proteína-proteína y la identificación de las secuencias que determinan estas interacciones.
Como información general sobre la síntesis de péptidos y peptidomiméticos véase, por ejemplo, Jones (1992), Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley; and Bodanszky et al., (1993) Peptide Chemistry: A Practical Textbook, 2ª Edición Revisada, Springer Verlag.
J. Animales transgénicos
Los animales transgénicos son animales no humanos modificados genéticamente a los que se ha transferido experimentalmente material genético recombinante, exógeno o clonado. Tal material genético a menudo se denomina transgen. La secuencia de ácido nucleico del transgen puede integrarse en un locus de un genoma en el que no se encuentra normalmente de otra manera esa secuencia de ácido nucleico particular o en el locus normal del transgen. El transgen puede constar de secuencias de ácido nucleico derivadas del genoma de la misma especie o de una especie diferente de la especie del animal diana.
La expresión "animal transgénico de línea de células germinales" se refiere a un animal transgénico en el que la alteración genética o la información genética se introdujo en una línea de células germinales, confiriendo de esta manera la capacidad del animal transgénico de transferir la información genética a la descendencia. Si tal descendencia posee realmente algunas o todas esas alteraciones o información genética, también son animales transgénicos.
La alteración o información genética puede ser ajena a la especie de animal a la que pertenece el receptor, ajena sólo al receptor individual particular, o puede ser una información genética que ya posee el receptor. En el último caso, el gen alterado o introducido puede expresarse de manera diferente que el gen nativo.
Los animales transgénicos pueden producirse por una diversidad de métodos diferentes incluyendo transfección, electroporación, microinyección, dirección de genes en células madre embrionarias e infección viral y retroviral recombinante (véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.736.866; la Patente de Estados Unidos Nº 5.602.307; Mullins et al., (1993) Hypertension 22, 630-633; Brenin et al., (1997) Surg. Oncol. 6, 99-110; Tuan (1997) Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Nº 62, Humana Press).
Se han producido varios ratones recombinantes o transgénicos, incluyendo los que expresan una secuencia de oncogen activada (Patente de Estados Unidos Nº 4.736.866); expresan el antígeno T de SV40 de simio (Patente de Estados Unidos Nº 5.728.915); carecen de la expresión del factor 1 regulador de interferón (IRF-1) (Patente de Estados Unidos Nº 5.731.490), presentan disfunción dopaminérgica (Patente de Estados Unidos Nº 5.723.719); expresan al menos un gen humano que participa en el control de la presión sanguínea (Patente de Estados Unidos Nº 5.731.489); presentan una mayor similitud con las condiciones que existen en la enfermedad de Alzheimer natural (Patente de Estados Unidos Nº 5.720.936); tienen una menor capacidad de mediar la adhesión celular (Patente de Estados Unidos Nº 5.602.307); poseen un gen de la hormona de crecimiento bovina (Clutter et al., (1996) Genetics 143, 1753-1760) o pueden generar una respuesta de anticuerpos completamente humana (Zou et al., (1993) Science 262, 1271-1274).
Aunque los ratones y las ratas siguen siendo los animales elegidos para la mayoría de la experimentación transgénica, en algunos casos es preferible o incluso necesario usar especies animales alternativas. Se han utilizado satisfactoriamente procedimientos transgénicos en una diversidad de animales no murinos, incluyendo ovejas, cabras, cerdos, perros, gatos, monos, chimpancés, hámsteres, conejos, vacas y cobayas (véase Kim et al., (1997) Mol. Reprod. Dev. 46, 515-526, Houdebine, (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35, 609-617; Fetters, (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 643-645; Schnieke et al., (1997) Science (278, 2130-2133; Amoah, (1997) J. Animal Science 75, 578-585).
El método para introducir fragmentos de ácido nucleico en células de mamífero competentes para la recombinación puede realizarse por cualquier método que favorezca la co-transformación de múltiples moléculas de ácido nucleico. Estarán disponibles para un especialista en la técnica procedimientos detallados para producir animales transgénicos, incluyendo los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.489.743 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.602.307.
Esta invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1 Identificación del dominio de unión a NEMO en IKKB
Para identificar el dominio de interacción con NEMO de IKK\beta realizamos ensayos pull-down in vitro (Zhong et al., (1997) Cell 89, 413-424) usando una versión expresada en bacterias de la proteína NEMO de longitud completa fusionada por su extremo NH_{2}-terminal a la glutatión S- transferasa (GST-NEMO; Figura 1A). Se construyeron diversos mutantes de truncación que carecían de diferentes dominios funcionales de IKK\beta (dominio catalítico, cremallera de leucina y hélice-bucle-hélice; Figura 1A).
Todas las subclonaciones y mutagénesis de clones de ADNc de longitud completa de IKK\alpha e IKK\beta se realizaron por PCR usando ADN-polimerasa de Pfu clonada (Stratagene). Los ADNc de IKK\beta de tipo silvestre y mutado se insertaron en los sitios de restricción KpnI y NotI de pcDNA-3 o pcDNA-3.1-xpress (Invitrogen) y todos los ADNc de IKK\alpha se insertaron en los sitios EcoRI y XhoI de los mismos vectores. Se construyeron versiones con señal FLAG de las dos quinasas por subclonación en pFLAG-CMV-2 (Sigma). En el caso de GST-IKK\beta-(644-756), el fragmento de PCR se insertó en los sitios EcoRI y XhoI de pGEX-4T1 (Pharmacia). Se obtuvo ADNc de longitud completa que codificaba la proteína NEMO humana por PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de ARNm de células HeLa usando el sistema de PCR Expand™ Long Template (Boehringer Mannheim) y el par de cebadores (5'-ATAGAC
GAATTCAATAGGCACCTCTGGAAG) (SEC ID Nº: 20) y (3'-TAGGACCTCGAGCTACTCAATGCACTCCATG) (SEC ID Nº: 21). El fragmento de PCR resultante se insertó en los sitios EcoRI y XhoI de pcDNA-3 o pcDNA-s.1-xpress. Todos los mutantes de NEMO posteriores se construyeron por PCR usando ADN polimerasa de Pfu. GST-NEMO se construyó por subclonación del ADNc de longitud completa en los sitios EcoRI y XhoI de pGEX-4T1.
Estos mutantes se marcaron por traducción in vitro con [^{35}S]-metionina (entrada; Figura 1B), junto con GST sola o GST-NEMO, y se precipitaron usando glutatión-agarosa. Ninguno de los mutantes interaccionó con la GST sola, mientras que el tipo silvestre y las tres truncaciones NH_{2}-terminales de IKK\beta (307-756, 458-756 y 486-756)
interaccionaron con GST-NEMO (Figura 1B (panel derecho)). Por el contrario, ninguno de los mutantes de truncación COOH-terminal (1-456, 1-605 ó 1-644) precipitó con GST-NEMO. Estos resultados demuestran que NEMO interacciona con una región del extremo COOH de IKK\beta distal al dominio hélice-bucle-hélice (HLH). A continuación se construyó un mutante que constaba únicamente de la región desde el aminoácido 644 (inmediatamente después de HLH) hasta el extremo COOH- (resto 756) de IKK\beta. Como se muestra en la Figura 1C, este mutante no precipitó con GST pero interaccionó con GST-NEMO, confirmando que esta región media la interacción entre estas dos moléculas.
A continuación se ensayaron los efectos de IKK\beta-(644-756) sobre la activación de NF-\kappaB inducida por IL-1\beta y TNF\alpha por células HeLa de transfección transitoria con el mutante junto con un plásmido indicador dependiente de NF-\kappaB (pBIIX-luciferasa) (Kopp & Ghosh, (1994) Science 265, 956-959). Para los estudios de transfección, se sembraron células HeLa y COS en placas de veinticuatro pocillos (1 x 10^{5} células/pocillo) o seis pocillos (5 x 10^{5} células/pocillo) y se cultivaron durante veinticuatro horas antes de la transfección del ADN con Fugene6 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células en bandejas de veinticuatro pocillos y de seis pocillos recibieron un total de 1 \mug o 2 \mug de ADN respectivamente. Después de cuarenta horas, las células se lisaron con TNT (NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, Triton-100 al 1%) y los lisados se usaron para inmunoprecipitación o ensayo de luciferasa (Primage Luciferase Assay System).
La Figura 1D demuestra que IKK\beta-(644-756) inhibía la activación de NF-\kappaB inducida por estas citoquinas de una manera dependiente de la dosis. Estos resultados indican que IKK\beta-(644-756) actúa como un dominante negativo retirando la proteína NEMO endógena del complejo I\kappaB-quinasa nuclear. Sin el reclutamiento de proteínas reguladoras por NEMO, IKK\beta se vuelve refractaria a las señales inducidas por IL-1\beta y TNF\alpha que de otra manera ocasionarían su activación. De manera estructural, NEMO consta de regiones \alpha-helicoidales extensivas que contienen dos tramos prominentes de motivos enrollado en espiral y cremallera de leucina, y un dominio de dedos de cinc COOH-terminal (Figura 2A) (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526-1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297-300). Los estudios previos que intentaban identificar la región de NEMO requerida para su interacción con IKK\beta han generado resultados conflictivos (Harhaj et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 15297-15300). Para solucionar esta cuestión, se realizaron ensayos de GST-pull-down usando una proteína de fusión con GST de IKK\beta-(644-756) (Figura 2A) y diversos mutantes de truncación marcados con [^{35}S]-metionina de NEMO (Figura 2A). La figura 2A (panel de la derecha) resume los resultados de estos experimentos en los que se demostró que IKK\beta-(644-756) interaccionaba con NEMO-(1-196), -(1-302) y -(44-419) pero no con NEMO-(197-419) o -(86-419). Se obtuvieron resultados idénticos a partir de estudios de inmunoprecipitación usando lisados de células COS o HEK293 transfectadas de manera transitoria con IKK\beta con señal FLAG y mutantes de NEMO (datos no mostrados).
Para todas las inmunoprecipitaciones, se lisaron células HeLa o COS cultivadas en bandejas de seis pocillos en 500 \mul de TNT. Las proteínas con señal FLAG se precipitaron del lisado de las células transfectadas durante dos horas a 4ºC usando 20 \mul de perlas de agarosa con anti-FLAG (M2) (Sigma) conjugado. Se realizaron inmunoprecipitaciones de IKK\beta o NEMO endógenas usando 1 \mug de anticuerpos policlonales de conejo específicos (Santa Cruz) más 20 \mul de Proteína-A sepharose (Amersham-Pharmacia). Para la inmunotransferencia, los precipitados se lavaron tres veces con TNT, dos veces con PBS y después se suspendieron en SDS-tampón de muestra. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE (10%), se transfirieron a membranas de PVDF y se visualizaron por medio de quimioluminiscencia potenciada (Amersham-Pharmacia).
Estos resultados establecen que el dominio de interacción está entre los restos 44 y 86, una región que incluye la primera \alpha-hélice de NEMO. Por lo tanto, se obtuvo un mutante en el que se delecionó la \alpha-hélice hasta el primer dominio enrollado en espiral (restos T50-L93; del. \alphaH). Este mutante no interaccionaba con IKK\beta-(644-756) (Figura 2B). Además, los estudios de transfección realizados usando pBIIX-luciferasa demostraron que del. \alphaH inhibía la actividad de NF-\kappaB inducida por TNF\alpha (Figura 2C), confirmando los informes previos de que el extremo COOH-terminal de NEMO que no podía interaccionar con IKK\beta es un inhibidor negativo dominante de NF-\kappaB (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526-1538; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297-300). Consideradas conjuntamente, las Figuras 1 y 2 demuestran que la interacción entre IKK\beta y NEMO se realiza a través del extremo COOH de IKK\beta y la primera región \alpha-helicoidal de NEMO. Estos hallazgos sugieren un modelo en el que el extremo NH_{2} de NEMO lo ancla al complejo de IKK dejando libre el resto de la molécula que contiene varios dominios de interacción proteína:proteína y accesible para la interacción con reguladores cadena arriba de la función de IKK.
Ejemplo 2 Regulación por NEMO de la función de IKKB por medio de la interacción en NBD
Para caracterizar completamente el dominio de interacción con NEMO de la IKK\beta, se construyeron más mutantes de truncación entre los restos V644 y S756 (Figura 3A). Inmediatamente después del tramo HLH, la secuencia de aminoácidos hasta la cisteína en la posición 662 presenta una identidad de 72% con IKK\alpha (denominada \alpha_{1} en la Figura 3A). Después de esto, la región hasta E707 es un dominio rico en serina previamente presentado como una diana para la autofosforilación y que funciona en la regulación negativa de la actividad de IKK\beta después de la estimulación por citoquinas proinflamatorias (Delhase et al., (1999) Science 284, 309-313). Las secuencias que consiguen esto no contienen ningún resto de serina hasta la posición 733. Los mutantes obtenidos omitiendo secuencialmente cada una de estas regiones se marcaron con [^{35}S]-metionina y se usaron en ensayos GST-pull-down como se ha descrito anteriormente. La Figura 3A resume los resultados de estos experimentos que demuestran que ninguno de los mutantes de IKK\beta precipitaba con GST-NEMO y que indican que el dominio de interacción reside en el extremo COOH terminal entre los restos F734 y S756.
La comparación de este segmento corto de IKK\beta con la región correspondiente de IKK\alpha revela dos características estructurales sorprendentes (Figura 3B). En primer lugar, la secuencia de F734 a T744 de IKK\beta (\alpha2 en la Figura 3B) es idéntica a la secuencia equivalente en IKK\alpha (L737 a L742 de IKK\beta y L738 a L743 de IKK\alpha). En segundo lugar, la secuencia de IKK\beta se extiende más allá del resto COOH-terminal de IKK\alpha (E745) para doce aminoácidos que constituyen una región muy ácida en la que cinco de los restos son glutamatos (Figura 3B). La notable semejanza entre la región \alpha2 de IKK\beta y el extremo COOH-terminal de IKK\alpha junto con informes previos de que NEMO no interacciona con IKK\alpha in vitro (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526-1538: Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297-300) condujo a la hipótesis de que el dominio de interacción con NEMO sería la porción rica en glutamato de IKK\beta (E745 a S756).
Para ensayar esta hipótesis, se realizó un mutante de truncación omitiendo esta región (1-744; Figura 3C) y se investigó su capacidad de interaccionar con GST-NEMO. El mutante se asoció con GST-NEMO en una medida igual que la IKK\beta de tipo silvestre (Figura 3C); estos resultados se han confirmado por co-inmunoprecipitación de NEMO marcada con epítopos e IKK\beta-(1-744) a partir del lisado de células COS transfectadas de manera transitoria. Estos hallazgos demuestran que el dominio de interacción con NEMO de IKK\beta está dentro de la región \alpha2 del extremo COOH.
A continuación se usaron mutantes de truncación COOH-terminal de IKK\beta para ensayar los efectos de la asociación con NEMO sobre la actividad basal e inducida de IKK\beta. La Figura 3B demuestra que la truncación de IKK\beta en V644, eliminando la región rica en serina (véase la Figura 3A), dio como resultado una perdida completa de autofosforilación basal. Por el contrario, un mutante que contenía la región rica en serina (1-733), presentó niveles significativamente mayores de autofosforilación que la IKK\beta de tipo silvestre (Figura 3D). Curiosamente, el nivel de autofosforilación de IKK\beta-(1-744) que contiene la región \alpha2 de unión a NEMO fue idéntico al observado con la quinasa de tipo silvestre. Para ensayar los efectos que tienen estas mutaciones sobre la actividad quinasa basal, se introdujeron mutantes por transfección transitoria en células HeLa y la actividad de NF-\kappaB se determinó por el ensayo de luciferasa descrito en el Ejemplo 1. Los resultados de la Figura 3D demuestran que IKK\beta-(1-644) no inducía la actividad de NF-\kappaB, mientras que IKK\beta-(1-733) aumentaba la activación en comparación con el tipo silvestre (Figura 3E). Además, la actividad de NF-\kappaB inducida por IKK\beta-(1-744) era idéntica a la inducida por la IKK\beta de tipo silvestre.
Estos resultados demuestran que la autofosforilación basal y la actividad quinasa de IKK\beta son dependientes de la capacidad de NEMO de asociarse con la quinasa. Una explicación de estas observaciones puede ser que NEMO asocia una fosfatasa al complejo de IKK que regula la función basal de IKK\beta dirigiéndose a la región rica en serina del extremo COOH-terminal. Por lo tanto, la incapacidad de unirse a NEMO impide el reclutamiento de la fosfatasa y produce una mayor fosforilación dentro de esta región.
Para ensayar directamente el efecto que tiene la pérdida de la región \alpha2 sobre la actividad catalítica de IKK\beta, se realiza un ensayo quinasa de complejos inmunes sobre el lisado de células HeLa transfectadas (Figura 3F). Para los ensayos de quinasas de complejos inmunes, los precipitados se lavaron con TNF y después con tampón quinasa (HEPES 20 mM, pH 7,5, MgCl_{2}20 mM, EDTA 1 mM, NaF 2 mM, \beta-glicerofosfato 2 mM, DTT 1 mM, ATP 10 \muM). Después, los precipitados se incubaron durante 15 minutos a 30ºC en 20 \mul de tampón quinasa que contenía GST-I\kappaB\alpha-(1-90) y 10 \muCi de ATP marcado con [^{32}P]-\gamma (Amersham-Pharmacia). El sustrato se precipitó usando glutatión-agarosa (Amersham-Pharmacia) y se separó por SDS-PAGE (10%). La actividad quinasa se determinó por autorradiografía. Las proteínas fosforiladas asociadas con el complejo quinasa aparecían en las autorradiografías porque el complejo inmunoprecipitado no se había retirado antes de la precipitación del GST-sustrato. La actividad de IKK\beta (tipo silvestre) fue baja en las células no tratadas, pero aumentó notablemente después del tratamiento con TNF\alpha. De acuerdo con los datos presentados en la Figura 3E, la actividad basal de IKK\beta-(1-733) fue significativamente mayor que la de tipo silvestre, sin embargo, esta actividad no mejoró adicionalmente por tratamiento con TNF\alpha (Figura 3F). Además, la actividad catalítica basal e inducida por TNF\alpha de IKK\beta-(1-744) fue idéntica a la actividad de IKK\beta (WT). Además de GST-I\kappa-B\alpha fosforilada, también se detectaron proteínas IKK\beta autofosforiladas (Figura 3F, bandas superiores). Después del tratamiento con TNF\alpha, IKK\beta (WT) e IKK\beta-(1-744) se autofosforilaron rápidamente, mientras que la fosforilación basal de IKK\beta- (1-733), que ya era alta, sólo aumento ligeramente (Figura 3F). Un estudio previo demostró que la autofosforilación sirve para regular negativamente la actividad de IKK\beta inducida por TNF\alpha produciendo cambios conformacionales dentro de la proteína (Delhase et al., (1999) Science 284, 309-313). Considerados conjuntamente, estos hallazgos (Figuras 3D-F) demuestran que en ausencia de NEMO, IKK\beta se autofosforila y se vuelve basalmente activa y refractaria a señales inducidas por TNF\alpha, lo cual indica que NEMO juega un papel fundamental en la regulación negativa así como en la activación de la actividad de IKK\beta.
Aparecía una banda adicional que representaba una proteína fosforilada únicamente en las muestras procedentes de células transfectadas con IKK\beta inducida por TNF\alpha (WT) e IKK\beta-(1-744) (Figura 3F). El peso molecular de esta proteína (49 kDa) sugiere firmemente que es NEMO endógena asociada con el complejo precipitado. Esto se confirma por la ausencia de la banda en cualquier precipitado (+/- TNF\alpha) de células transfectadas con IKK\beta-(1-733). Esta proteína se ha identificado como NEMO fosforilada por disociación del complejo precipitado en SDS y re-inmunoprecipitación de NEMO marcada con [^{32}P] usando anticuerpos anti-NEMO específicos. Por lo tanto, la fosforilación inducida de NEMO puede representar un nivel adicional de regulación de la actividad del complejo de IKK.
Ejemplo 3 Identificación del NBD en IKKA
Como la región \alpha2 de IKK\beta se parece mucho al extremo COOH de IKK\alpha (Figura 3B), se ensayó la capacidad de IKK\alpha de interaccionar con NEMO.
Se realizaron inmunoprecipitaciones del lisado de células COS transfectadas de forma transitoria con NEMO con señal xpress junto con versiones con señal FLAG de IKK\alpha o IKK\beta, usando anti-FLAG como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 4A demuestra que NEMO interaccionaba de la misma manera con IKK\beta y con IKK\alpha. Es posible que, en este experimento, la interacción con IKK\alpha no sea directa, sino debida a la formación de un complejo que contiene IKK\beta endógena, FLAG-IKK\alpha y xpress-NEMO. Por lo tanto, se realizaron ensayos GST-pull-down usando GST-NEMO y versiones marcadas con [^{35}S]-metionina de IKK\alpha de tipo silvestre o un mutante de IKK\alpha truncado que carecía de los ocho aminoácidos COOH-terminales (1-737; Figura 4B). De acuerdo con los hallazgos presentados anteriormente (Figura 4A), pero a diferencia de los informes previos (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526-1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297-300), la IKK\alpha de tipo silvestre interaccionaba con NEMO in vitro, mientras que el mutante truncado no lo hacía (Figura 4B). Estos resultados no sólo demuestran que IKK\alpha interacciona con NEMO, sino también demuestran que lo hace a través de la región COOH-terminal que contiene los seis aminoácidos compartidos entre IKK\alpha y la región \alpha2 de IKK\beta (Figura 3B). Ciertos estudios de dirección de genes han demostrado profundas diferencias en la activación de IKK\alpha e IKK\beta por TNF\alpha (Woronicz et al., (1997) Science 278, 866-869, Zandi et al., (1997) Cell 91, 243-252; Mercurio et al., (1997) Science 278, 860-866; DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548-554; Régnier et al., (1997) Cell 90, 373-383).
Los presentes hallazgos indican que la base de esta diferencia no se debe a un reclutamiento diferencial de NEMO (Delhase et al., (1999) Science 284; 309-313; Takeda et al., (1999) Science 284, 313-316, Hu et al., (1999) Science 284, 316-20; Li et al., (1999) Science 284, 321-325; Li et al., (1999) J. Exp. Med. 189, 1839-1845; Li et al., (1999) Genes Dev. 13, 1322-1328; Tanaka et al., (1999) Immunity 10, 421-429). En su lugar, lo más probable es que la diferencia se base en la capacidad de cada quinasa de integrar componentes de señalización asociados a NEMO en una respuesta de activación, presumiblemente por medio de diferencias en las características reguladoras intrínsecas de las quinasas individuales.
Se obtuvieron indicios adicionales de que esta corta secuencia de COOH-terminal constituye el dominio de interacción con NEMO de las IKK cuando se ensayó la capacidad de la quinasa relacionada con IKK descrita recientemente IKKi (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357-1362) de interaccionar con NEMO. La comparación de secuencias con IKK\alpha e IKK\beta (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357-1362; Woronicz et al., (1997) Science 278, 66-869; Zandi et al., (1997) Cell 91, 243-52; Mercurio et al., (1997) Science 278, 860-866 ; DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548-554 ; Regnier et al., (1997) Cell 90, 373-383) revela que IKKi no contiene la región \alpha2 en su extremo COOH (Shimada et al., (1999) Int. Immunol.11, 1357-1362), y se descubrió que IKKi no interacciona con GST-NEMO en ensayos pull-down (Figura 4C), lo cual es coherente con el hecho de que sea el dominio de unión de NEMO. Este hallazgo indica que NEMO no se requiere para la actividad funcional de IKKi y se confirma por la incapacidad de IKKi de responder a señales inducidas por TNF\alpha o IL-1\beta (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357-1362).
Ejemplo 4 Mutación de restos aminoacídicos en el NBD
Habiendo determinado que la región \alpha2 de IKK\beta y la secuencia de seis aminoácidos equivalente de IKK\alpha son críticas para la interacción con NEMO [denominándose dominio de unión a NEMO (NBD)], se construyó un mutante de deleción en IKK\beta que carecía de los seis aminoácidos de L737 a L742 (del.NBD). Este mutante de deleción no se asociaba con GST-NEMO (Figura 4D). El examen de las características bioquímicas y estructurales previstas del NBD en su contexto con los restos circundantes sugiere que constituye una "cavidad" hidrófoba inflexible dentro de una región hidrófila del extremo COOH de IKK\beta (Figura 4E). Esto sugiere un modelo en el que el NBD se entierra dentro de la primera región \alpha-helicoidal de NEMO unida (Figura 2) que impide su exposición a un medio acuoso, manteniéndose de esta manera una fuerte interacción intermolecular. Sigue sin determinarse si la interacción es realmente una función de esta hidrofobia, sin embargo, se descubrió que la sustitución de W739 o W741 por alanina impedía la asociación de NEMO con IKK\beta (Figura 4F). Por lo tanto, cada uno de estos restos hidrófobos de triptófano es crítico para mantener un NBD funcional. Además, la mutación de D738 a alanina también impidió la interacción con NEMO, indicando que se requiere un resto cargado negativamente en esta posición para la función de NBD. En contraste con estas mutaciones, la sustitución de L737, S740 o L742 con la alanina no afectaba a la unión a NEMO. Para ensayar los efectos de estas sustituciones de alanina sobre la función de IKK\beta, se cotransfectaron células HeLa con cada uno de los mutantes puntuales junto con el indicador pBIIX-luciferasa. De acuerdo con la observación de que la actividad basal de IKK\beta aumenta en ausencia de NEMO asociada, IKK\beta-(1-733) (Figura 3E), los mutantes que no se unían a NEMO (D738A, W739A y W741A) activaban NF-\kappaB en una mayor medida que la IKK\beta de tipo silvestre o IKK\beta-(1-744) (Figura 4G). Por el contrario, los mutantes que contenían sustituciones que no alteraban la asociación con NEMO ((L737A, S740A y L742A) inducían a la proteína NF-\kappaB al mismo nivel que los controles. Estos resultados indican que NEMO juega un papel crítico en la regulación negativa de la actividad intrínseca de IKK\beta.
Se analizaron mutaciones adicionales en NBD (véase la Tabla 1) para comprobar su capacidad de afectar a la unión de NEMO a IKK\beta usando el ensayo GST-pull-down explicado en el Ejemplo 3.
TABLA 1
2
Ejemplo 5 Agentes que interaccionan con NBD para bloquear la unión a NEMO
El tamaño relativamente pequeño del NBD hace que sea una diana atractiva para el desarrollo de compuestos destinados a romper el complejo de IKK nuclear. La importancia de esta estrategia se investigó diseñando péptidos a los que son permeables las células, que incluían el NBD de IKK\beta y determinando su capacidad de disociar la interacción IKK\beta-NEMO.
Las secuencias de los dos péptidos NBD usados en este estudio fueron [DRQIKIWFQNRRMKWKK]TALDWSW
LQTE (tipo silvestre) (SEC ID Nº: 18) y [DRQIKIWFQNRRMKWKK]TALDASALQTE (mutante) (SEC ID Nº: 19). La secuencia del homeodominio de antennapedia (Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450; Patente de Estados Unidos Nº 5.888.762; Patente de Estados Unidos Nº 6.015.787; Patente de Estados Unidos Nº 6.080.724) está entre paréntesis y las posiciones de las mutaciones Wto A están subrayadas. Los dos péptidos se disolvieron en DMSO hasta una concentración de solución madre de 20 mM. Para todos los experimentos, los controles con DMSO solo no fueron diferentes de los controles sin péptido.
El péptido NBD de tipo silvestre constaba de la región de T735 a E745 de IKK\beta fusionada con una secuencia procedente de la tercera hélice del homeodominio de antennapedia que, como se ha demostrado, media la translocación a través de la membrana (Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450). El mutante era idéntico con la excepción de que los restos de triptófano (W739 y W741) del NBD se habían mutado a alanina. La Figura 5A demuestra que el NBD (WT), pero no el mutante, inhibía de forma dependiente de la dosis la reducción in vitro de IKK\beta marcada con [^{35}S] por GST-NEMO y de NEMO marcada con [^{35}S] por GST-IKK\beta-(644-756). Para ensayar la capacidad de los péptidos NBD de entrar en las células e inhibir la interacción IKK\beta-NEMO, se incubaron células HeLa con los péptidos durante diferentes periodos de tiempo e inmunoprecipitaron el complejo de IKK usando anti-NEMO. De acuerdo con los datos in vitro (Figura 5A), el tipo silvestre, pero no el mutante, rompió la formación del complejo de IKK endógeno (Figura 5B).
Ejemplo 6 Agentes que bloquean la función de NEMO
A continuación se investigaron los efectos de los péptidos NBD sobre la activación de NF-\kappaB inducida por señales. Después de transfectar células HeLa con el indicador pBIIX-luciferasa, las células se preincubaron con péptidos de tipo silvestre o mutantes, se trataron con TNF\alpha y la activación de NF-\kappaB se midió por medio del ensayo indicador de luciferasa. Como se muestra en la Figura 5C (panel de la izquierda), el péptido NBD de tipo silvestre inhibía la activación de NF-\kappaB inducida por TNF\alpha mientras que el mutante no tenía ningún efecto. De manera interesante, la actividad basal de NF-\kappaB aumentó por tratamiento con el péptido de tipo silvestre (Figura 5C; panel de la derecha), un hallazgo que coincide con los resultados de análisis mutacionales previos (Figuras 3E-F y 4G). Esto indica que la eliminación de NEMO aumenta la actividad intrínseca basal de IKK, mientras que anula su respuesta al TNF\alpha. Un análisis adicional realizado usando ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) también demostró que sólo el péptido NBD de tipo silvestre inhibía la activación inducida por TNF\alpha y la translocación nuclear de NF-\kappaB (Figura 5D). Considerados conjuntamente, estos resultados demuestran que el suministro de un péptido NBD intacto a las células altera la interacción de IKK\beta-NEMO e impide que las señales proinflamatorias activen a la proteína NF-\kappaB. Por el contrario, la transducción con un péptido que contiene mutaciones en los restos de triptófano que son críticos para mantener la interacción con NEMO no tiene ningún efecto.
Ejemplo 7 Agentes capaces de regular negativamente la E-selectina
Muchas proteínas implicadas en el inicio y mantenimiento de respuestas inflamatorias requieren la activación de NF-\kappaB para la expresión inducida de sus genes (Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225-260; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80-88). Una de tales proteínas, la E-selectina, es una molécula de adhesión a los leucocitos expresada en la superficie luminal de células del endotelio vascular después de la activación por estímulos proinflamatorios tales como IL-1 o TNF\alpha (Pober et al., (1986) J. Immunol. 436, 1680-1687; Bevilacqua et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84, 9238-9242; Collins et al., (1995) FASEB J. 9, 899-909). La expresión de la E-selectina y otras moléculas de adhesión dependientes de NF-\kappaB es crucial para la deteción y reclutamiento de leucocitos en sitios de inflamación aguda y crónica. Para evaluar el potencial antiinflamatorio del péptido NBD, se pretrataron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) primarias con péptidos de tipo silvestre y mutante y se cuantificó la expresión de E-selectina inducida con TNF\alpha. De acuerdo con los efectos sobre la activación basal de NF-\kappaB (Figura 5C), el péptido NBD de tipo silvestre indujo un bajo nivel de expresión de E-selectina (Figura 5E). Sin embargo, después el tratamiento con TNF\alpha, el tipo silvestre pero no el mutante redujo significativamente la expresión de E-selectina (Figura 5E). La inhibición por el péptido NBD de tipo silvestre redujo la expresión al nivel inducido por el péptido en ausencia de TNF\alpha.
La importancia de la presente invención puede visualizarse en dos niveles. En primer lugar, los solicitantes han identificado los requisitos estructurales para la asociación de NEMO con las IKK y han descubierto que la asociación con IKK\beta depende de tres aminoácidos (D738, W739 y W741) dentro del NBD. Además, NEMO no sólo funciona en la activación de IKK\beta, sino que también tiene un papel crítico en la supresión de la actividad basal intrínseca del complejo de IKK. El segundo nivel de importancia es el uso clínico evidente de fármacos que se dirigen al NBD. Los solicitantes han demostrado que un péptido al que son permeables las células que incluye el NBD puede no sólo inhibir la activación de la proteína NF-\kappaB inducida por TNF\alpha, sino también reducir la expresión de la E-selectina, un gen diana dependiente de NF-\kappaB, en células endoteliales humanas primarias. El NBD tiene sólo seis aminoácidos de longitud y, por lo tanto, un especialista en la técnica puede diseñar compuestos peptidomiméticos que alteren el complejo de IKK nuclear. Como el efecto de la alteración del complejo es aumentar la actividad basal de la IKK, el tratamiento con un compuesto que se dirija a NBD puede evitar problemas de toxicidad, por ejemplo, debidos a apoptosis en hepatocitos, que podrían producirse por la administración de fármacos que anulan completamente la actividad de NF-\kappaB. Por lo tanto, la identificación del NBD es un medio para el desarrollo de nuevos fármacos antiinflamatorios que impidan que ciertas señales de activación alcancen el complejo de IKK, manteniendo al mismo tiempo un bajo nivel de actividad de NF-\kappaB y evitando efectos secundarios tóxicos potenciales.
Ejemplo 8 Inhibición mediada por el péptido NBD de respuestas inflamatorias in vivo
Se ensayó la capacidad del péptido NBD de inhibir respuestas inflamatorias en animales usando dos modelos distintos de inflamación aguda. En el primer modelo, se indujeron edemas de oreja en ratones usando forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) y se midieron los efectos de la administración tópica de los péptidos NBD. Se indujeron edemas de oreja usando PMA en grupos replicados de ratones de sexo y edad similares como se ha descrito previamente (Chang et al., (1987) Eur. J. Pharmacol. 142, 197-205). Se aplicaron tópicamente en la oreja derecha de los ratones 20 \mul de péptidos NBD (200 \mug/oreja), dexametasona (40 \mug/oreja) o vehículo (DMSO:Etanol; 25:75 v/v) treinta minutos antes y treinta minutos después de la aplicación de 20 \mul de PMA (5 \mug/oreja) disueltos en etanol. La hinchazón de la oreja se midió seis horas después de la aplicación de PMA usando un microcalibre y se expresó como la diferencia media en el espesor entre las orejas tratadas (derechas) y no tratadas (izquierdas). Se realizó un análisis estadístico de los datos usando el ensayo t de student. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
La Figura 6A demuestra que el péptido de tipo silvestre reducía significativamente (inhibición 77 \pm 3%; p < 0,05) el engrosamiento de la oreja inducido por PMA con respecto al nivel observado con dexametasona (82 \pm 9% de inhibición; p < 0,05). Por el contrario, el efecto observado con una dosis equivalente de mutante fue insignificante (p = 0,09). Ningún péptido tuvo ningún efecto cuando se administró en ausencia de PMA (no mostrado).
En un segundo modelo, se indujo peritonitis en ratones por inyección intraperitoneal (i.p.) de zymosan solo o en combinación con dexametasona o los péptidos NBD. En el caso de la peritonitis inducida por zymosan, se realizó la medición de exudados peritoneales y de colecciones de células inflamatorias de grupos replicados de ratones de sexo y edad similares (C57BL/6NCR) como se ha descrito previamente (Getting et al., (1998) Immunology 95, 625-630). A los grupos de animales se les inyectaron conjuntamente 1 ml de zymosan (1 mg/ml) y dexametasona (100 mg/ml) o los péptidos NBD (200 mg/ml). La concentración de NOX (nitrato más nitrito) presente en los exudados inflamatorios se midió usando un kit de ensayo colorimétrico (Alexis Corporation) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.
Como se muestra en la Figura 6B, la inyección de zymosan produjo una acumulación de fluidos inflamatorios exudados y la migración de células polimorfonucleares (PMN) al peritoneo de estos animales. El tratamiento de ratones con el péptido NBD de tipo silvestre o dexametasona redujo significativamente la formación de exudados y la acumulación de PMN, mientras que el mutante no tuvo ningún efecto.
Diversos estudios in vivo han demostrado un papel para el NO en la formación de exudados y la migración de leucocitos a sitios inflamatorios (Ialenti et al., (1992) Eur. J. Pharmacol, 211, 177-182, Ialenti et al., (1993) Br. J. Pharmacol. 110, 701-706; Iuvone et al., (1998) Br. J. Pharmacol. 123, 1325-1330). Por lo tanto, se investigaron los efectos de los péptidos NBD sobre la acumulación de NOX en los exudados peritoneales de ratones tratados con zymosan. La Figura 6C (panel inferior) demuestra que la dexametasona y el péptido de tipo silvestre reducían el NOX en 86 \pm 7% y 66 \pm 4% respectivamente, mientras que el mutante no tenía ningún efecto. Estos resultados son coherentes con los estudios previos que demuestran que la reducción de la formación del exudado y la acumulación de células se correlacionan con la inhibición de la activación de NF-\kappaB y la reducción de la formación de NO (D'Acquisto et al., (1999) Eur. J. Pharmacol. 369, 223-236; D'Acquisto et al., (1999) Naunyn-Schmeideberg Arch. Pharmacol. 360, 670-675). Por lo tanto, el péptido NBD de tipo silvestre es un inhibidor eficaz de la inflamación en modelos animales experimentales.
Ejemplo 9 Inhibición de la diferenciación de osteoclastos por el péptido NBD
El proceso de morfogénesis y remodelación ósea requiere el mantenimiento de un equilibrio entre la síntesis de matriz ósea por los osteoblastos y la resorción del hueso por los osteoclastos (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66-80; Suda et al., (1999) Endrocr. Rev. 20, 345-357). Los osteoclastos de resorción ósea son células gigantes multinucleadas que se diferencian de los precursores mieloides y diversos factores solubles incluyendo el factor 1 estimulador de colonias (CSF-1), la interleuquina-1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral-\alpha (TNF\alpha), IL-6 e IL-11 (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66-80; Suda et al, (1999) Endocr. Rev. 20, 345-357), que afectan a la diferenciación de los osteoclastos en distintas etapas. Un factor que es crítico para la osteoclastogénesis es la molécula descrita recientemente denominada RANKL (activador del receptor del ligando NF-\kappaB) que también se conoce como ODF (factor de diferenciación de osteoclastos), OPGL (ligando de osteoprotegerina) y TRANCE (citoquina inducida por activación relacionada con TNF) (Kong et al., (1999) Nature, 397, 315-323; Lacey et al., (1998) Cell 93, 165-176; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345-357; Wong et al., (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 715-724; Yasuda et al., (1998) Proc. atl. Acad. Sci. USA 95, 3597-3602). El receptor para RANKL es un miembro de la familia de receptores de TNF denominada RANK (activador del receptor de NK- \kappaB) (Anderson et al., (1997) Nature 390, 175-179; Dougall et al., (1999) Genes Dev. 13, 2412-2424) y la unión de RANKL induce la activación de NF-\kappaB (Anderson et al., (1997) Nature 390, 175-179; Darnay et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 20551-20555; Darnay et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 7724-31; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345-357; Wong et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 28355-28359). Además, la diferenciación de osteoclastos depende de la activación de NF-\kappaB y ciertos estudios de dirección génica han demostrado que no pueden desarrollarse osteoclastos maduros en ratones que carecen de las subunidades NF-\kappaB de p50 y p52 (Franzoso et al., (1997) Genes Dev. 11, 3482-3496).
La osteoporosis es una enfermedad gravemente debilitante caracterizada por una pérdida extensiva de masa ósea que está mediada por resorción ósea dependiente de osteoclastos (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66-80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345-357). Por lo tanto, es posible que la inhibición selectiva de la activación de NF-\kappaB en células precursoras de osteoclastos impida la diferenciación de los osteoclastos y proporcione la base de fármacos terapéuticamente eficaces para el tratamiento de la osteoporosis. Por lo tanto, el efecto de los péptidos NBD sobre la diferenciación de osteoclastos se ensayó usando un modelo in vitro descrito previamente (Jimi et al., (1999) Exp. Cell Res. 247, 84-93). Se incubaron células de médula ósea de ratón en bandejas de cultivo de tejidos de 48 pocillos con factor estimulador de colonias de macrófagos humano (M-CSF; 20 ng/ml) y RANKL humano (100 ng/ml) durante seis días en ausencia o presencia de diversas concentraciones (6,25, 12,5 y 25 mM) del péptido NBD mutante o de tipo silvestre. Las células después se fijaron y se tiñeron para el marcador fenotípico de osteoclastos fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y las células multinucleadas positivas para TRAP que contenían más de tres núcleos se contaron como osteoclastos. Se contaron muestras por triplicado y los resultados se calcularon como medias \pm SD. Como se muestra en Figura 7, el péptido de tipo silvestre pero no el péptido mutante inhibía la diferenciación de los osteoclastos de una manera dependiente de la dosis.
Estos datos demuestran que la alteración del complejo de IKK nuclear por un péptido NBD al que son permeables las células que inhibe la activación de NF- \kappaB impide la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL, indicando que los fármacos que se dirigen específicamente al NBD serán eficaces para el tratamiento de la osteoporosis. Como extensión de estos estudios in vitro, pueden analizarse los mismos péptidos con respecto a sus efectos sobre la osteoporosis in vivo. Se tratan ratones ovariectomizados (Charles River Labs) que presentan osteoporosis grave con los péptidos NBD y se determinan los efectos sobre la densidad ósea sobre un transcurso de tiempo de tratamien-
to.
Ejemplo 10 Efecto de los péptidos NBD sobre otros trastornos mediados por NF-KB
Además, también es posible examinar los efectos de los péptidos NBD sobre el asma. Se ha observado la activación de NF-\kappaB en células epiteliales bronquiolares, células T y macrófagos bronquiolares en las vías respiratorias de pacientes asmáticos y en modelos animales de asma (Ray & Cohn, (1999) J. Clin. Invest. 104, 985-993; Christman et al., (2000) Chest 117, 1482-1487). Además, muchos agentes que inducen el asma producen la activación de NF-\kappaB y muchos de los genes que codifican proteínas implicadas en el asma (es decir, moléculas de adhesión a leucocitos, diversas quimioquinas, óxido nítrico sintasa inducible) son dependientes de NF-\kappaB. Puede usarse un modelo de ratón establecido de asma (Kleeberger et al., (1990) Am. J. Physiol. 258, 313-320) para ensayar los efectos de la administración en aerosol de los péptidos NBD sobre la progresión de estas afecciones asociadas con el asma. De una manera similar, también pueden medirse los efectos de los péptidos NBD sobre el choque séptico. El choque séptico implica la expresión de muchos genes dependientes de NF-\kappaB (es decir, TNF, IL-1) que se inducen por endotoxinas bacterianas tales como lipopolisacárido (LPS). El LPS comprende los constituyentes principales de las paredes celulares de bacterias gram-negativas y es muy inmunogénico y estimula la producción de pirógenos endógenos IL-1 y TNF (Sell et al., (1996) Immunology, Immunopathology & Immunity, Appleton & Lange). Para ensayar los efectos de los péptidos NBD sobre el choque séptico, se inyectan péptidos NBD y LPS en ratones y se evalúa la supervivencia de los animales.
Ejemplo 11 Contribuciones relativas e importancia de cada aminoácido dentro del NBD para la interacción con NEMO
Como se ha indicado en los ejemplos anteriores, el dominio de unión a NEMO (NBD) de IKK\alpha e IKK\beta consta de seis aminoácidos conservados (L737 a L742 de IKK\beta y L738 a L743 de IKK\alpha) en el extremo C de las dos quinasas. Este experimento se realizó para obtener una comprensión más clara de las contribuciones relativas e importancia de cada aminoácido dentro de los NBD extraños a la interacción con NEMO. Se realizó un análisis mutacional extensivo del NBD de IKK\beta, en el que cada resto se sustituyó por diversos aminoácidos conservados y no conservados.
Se determinó que la sustitución de un resto de leucina (L737 o L742) o de la serina 740 no afectaba a la asociación de NEMO con IKK\beta, lo que sugería que ninguno de estos restos juega un papel crítico en el mantenimiento de la interacción. Para determinar si múltiples mutaciones de estos aminoácidos afectarán a la unión, se construyeron dos mutantes en los que L737 y S740 o S740 y L742 (denominados LS y SL respectivamente) se sustituyeron por alanina. El análisis GST-pull-down y el análisis de transfección de células COS-inmunoprecipitación-inmunotransferencia han revelado que tanto los mutantes LS como los mutantes SL se asocian con NEMO en la misma medida que la IKK\beta de tipo silvestre, proporcionando indicios adicionales de que estos restos no contribuyen significativamente a la interacción. Además, tanto LS como SL activan la proteína NF-\kappaB así como IKK\beta, cuando se mide por activación de una construcción indicadora de luciferasa dependiente de NF-\kappaB (pBIIx-luciferasa) en ensayos de transfección transitoria. Un doble mutante de alanina de los dos restos de leucina (LL), así como un mutante triple (LSL), pueden ser útiles para confirmar los datos anteriores con respecto a la importancia de estos restos para la unión a
NEMO.
En contraste con la falta de efectos de las mutaciones descritas anteriormente sobre la unión a NEMO o la activación de NF-\kappaB, la sustitución con alanina del resto de ácido aspártico dentro del NBD (D738) impidió la asociación de IKK\beta con NEMO. Además, esta sustitución condujo a un aumento de 2 a 3 veces en la capacidad basal de activacion de NF-\kappaB de IKK\beta. Estos resultados demuestran un papel para la asociación de NEMO en el mantenimiento de la actividad basal del complejo de IKK. De manera interesante, el tratamiento de células HeLa con el péptido NBD al que son permeables las células también condujo a un aumento modesto en la actividad basal de NF-\kappaB, confirmando adicionalmente el concepto de que la pérdida de asociación con NEMO conduce a un aumento de la actividad basal de IKK.
Para investigar la naturaleza del resto en la posición 738 dentro del NBD, el ácido aspártico se sustituyó por asparagina (D738N) o ácido glutámico (D738E, Figura 8A). Estas sustituciones conservativas mantienen la forma (N) o la forma y carga (E) del resto en esta posición. Como se muestra en la Figura 8B, ninguna sustitución afectaba a la capacidad de IKK\beta de asociarse con NEMO, mientras que la sustitución con alanina impedía la unión. Estos datos demuestran que es la forma (específicamente la presencia de un segundo carbono) y no la carga de la cadena lateral del aminoácido en esta posición la que es crítica para la interacción entre IKK\beta y NEMO. De acuerdo con las observaciones previas descritas en este documento, ninguna mutación afectaba la actividad basal de IKK\beta, mientras que la sustitución con alanina producía un aumento de actividad (Figura 8C).
Como se ha indicado anteriormente, los dos restos de triptófano dentro del NBD (W739 y W741) son críticos para mantener la interacción con NEMO. Los efectos de mutaciones conservativas que mantienen la estructura aromática de los restos en estas posiciones se investigaron sustituyendo triptófano por fenilalanina (F) o tirosina (Y) (Figura 9A). Además, los dos triptófanos se mutaron a arginina; requiriendo una sustitución no conservativa únicamente un solo cambio de base dentro del codón codificante que es la mutación de triptófano natural que se produce con más frecuencia. Como se muestra en la Figura 9B, tanto el mutante W739F como el mutante W739Y se asociaron con NEMO en la misma medida que IKK\beta, mientras que W739R no se unió (Figura 9C). Junto con los efectos de la sustitución de alanina (Figura 9B), estos hallazgos indican que la naturaleza aromática del resto en esta posición es crítica para la función del NBD. De forma similar a W739, se determinó que la sustitución W742 con fenilalanina (W742F) no afectaba a la asociación con NEMO, mientras que la mutación a arginina (W742R) impedía la unión (Figura 9D). A diferencia de lo que ocurría con W739, la sustitución con tirosina (W742Y) impedía la asociación con NEMO, demostrando que la presencia de un resto hidroxilo dentro de la cadena lateral aminoacídica en esta posición es suficiente para impedir la asociación de NEMO. Este hallazgo puede indicar que la fosforilación de un resto dentro del NBD, aunque es un aminoácido insertado artificialmente, impide la asociación de IKK\beta con
NEMO.
Ejemplo 12 Evaluación de compuestos antiinflamatorios en el modelo de ratón de lipopolisacárido letal
En este experimento, se evaluó la capacidad de compuestos antiinflamatorios de la invención de salvar ratones expuestos a una cantidad letal de lipopolisacárido (LPS). El LPS es un producto bacteriano que induce muchas de las respuestas que se observan en pacientes sépticos, incluyendo la muerte. En este modelo, se administró LPS de Salmonella typhimurium en suero tamponado con fosfato (PBS) a ratones C57BL/6 macho por inyección intravenosa a una dosis de 30 mg/kg (600 \mug/20 g de ratón). Como se estableció en experimentos de control, esta dosis era letal en el 100% de los ratones que la recibieron. Los ratones se trataron con el péptido de ensayo por inyección intravenosa (en dimetil sulfóxido al 1% en PBS) inmediatamente antes de la inyección de LPS y 24 horas después de la inyección de LPS. Los ratones se controlaron dos veces al día durante hasta 8 días después de recibir LPS y se registró la duración de la supervivencia y el número de ratones supervivientes.
Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 2 que muestra, para cada péptido y dosis, el número total de ratones que recibieron la dosificación y el número de ratones que sobrevivieron después de 5 días.
TABLA 2
3
Los resultados presentados en la Tabla 2 demuestran que los compuestos 2, 3 y 5-11 proporcionan una protección significativa frente a la exposición letal con LPS en este modelo cuando se administran a un dosis de 5 mg/kg i.v. El compuesto 10 también proporcionó una protección significativa a un dosis de 1 mg/kg i.v.
Ejemplo 13 Evaluación de péptidos en hepatitis inducida por concanavalina A
En este experimento, se evalúa la capacidad de compuestos antiinflamatorios de la invención de rescatar ratones con hepatitis inducida por concanavalina A.
La concanavalina A es una lectina, una clase de proteínas que se unen a carbohidratos. Cuando los carbohidratos forman parte de una proteína, la lectina se une a la proteína. Por medio de la unión a proteínas de la superficie celular, la concanavalina A estimula muchas células, incluyendo los linfocitos T. En relación con otros mediadores que se liberan por estimulación con concanavalina A, estos linfocitos T atacan a las células hepáticas que también tienen concanavalina A unida, originando la muerte de las células hepáticas. La implicación de los linfocitos T hace que este modelo sea similar a la hepatitis viral humana. Sin embargo, como parte de este modelo agudo, también hay una respuesta al TNF\alpha.
Cuarenta ratones C57BL/6 macho que pesaban entre 18 g y 22 g se dividieron en cinco grupos de tratamiento de ocho ratones cada uno como se muestra a continuación.
Grupo Tratamiento
1 Vehículo + vehículo
2 Concanavalina A + vehículo
3 Concanavalina A + 0,5 mg/kg de compuesto 10
4 Concanavalina A + 1 mg/kg de compuesto 10
5 Concanavalina A + 5 mg/kg de compuesto 10
Los ratones se pusieron en un recinto limitado y recibieron inyecciones intravenosas (i.v.) en la cola de un péptido de ensayo o vehículo en DMSO al 1% en PBS. Posteriormente, a los ratones se les inyectaron i.v. inmediatamente 15 mg/kg de concanavalina A disuelta en PBS estéril. El volumen de inyección fue de 5 ml/kg (100 \mul/20 g de ratón) con una concentración de concanavalina A de 3,0 mg/ml. La mañana siguiente (18-24 horas después), estos ratones se eutanizaron por inhalación de CO_{2} y se recogió sangre por punción cardíaca. Después, el suero se separó y se analizaron los niveles de AST y ALT.
Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 3. Los valores de ALT y AST se proporcionan como unidades Sigma-Frankel/ml, media \pmSEM.
TABLA 3
5
Los resultados anteriores indican que el compuesto 10 puede proteger contra la lesión hepática inducida por concanavalina A a una dosis de 5 mg/kg. La patología general confirmó esta conclusión, sugiriendo que el hígado se veía afectado por concanavalina A y que está lesión se prevenía por el compuesto 10 a una dosis de 5 mg/kg.

Claims (12)

1. Un compuesto antiinflamatorio que comprende la estructura:
X_{a}-X_{b},
donde X_{a} es un dominio de translocación a través de la membrana que consta de 6 a 15 restos aminoacídicos y X_{b} es una secuencia de unión a NEMO que consta de la siguiente estructura:
(Y) _{n}-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-(A) _{m}
en la que
cada uno de n y m
es, independientemente, 0 ó 1;
cada uno de A e Y
comprende de 1 a 3 restos aminoacídicos;
X_{1}
es L, A , I o nor-leucina (Nle);
X_{2}
es D, E, N, Q, homoserina (Hser) o 2-cetopropilalanina (2-cetopropil-A);
X_{3}
es W, F, Y, 4-bifenil-alanina (Bpa), homofenilalanina (Hphe), 2-Naftilalanina (2-Nal), 1-Naftilalanina (1-Nal) o ciclohexil-alanina (Cha);
X_{4}
es S, A, E, L, T, nor-leucina (Nle) u homoserina (Hser);
X_{5}
es W, H, homofenilalanina (Hphe), 2-naftilalanina (2-Nal), 1-Naftilalanina (1-Nal), O-bencil serina (SeroBn) o 3-Piridilalanina (3-Pal); y
X_{6}
es L, A, I o nor-leucina (Nle), donde NEMO significa Modulador Esencial de NF-\kappaB.
2. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, que comprende además un grupo de modificación.
3. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde n es 1 e Y es la secuencia TA.
4. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde m es 1 y A es la secuencia QTE.
5. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde X_{b} es una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por TALDWSWLQTE; LDWSWLQTE; TALDWSWL; ALDWSWLQTE; LDWSWL; TALDWSWLQT; TALDWSWLQ; ALDWSWLQT; LDWSWLQ; LDWSWLQT; ADWSWL; LDWSWA; ADWSWA, LDFSWL; LDY
SWL; LDWAWL; LDWEWL; TAADWSWLQTE; ADWSWLQTE; TAADWSWL; AADWSWLQTE; TAADWSWL
QT; TAADWSWLQ; AADWSWLQT; ADWSWLQ; ADWSWLQT; ALDWSWAQTE; LDWSWAQTE; TALDWS
WA; TALDWSWAQT; TALDWSWAQ; ALDWSWAQT; LDWSWAQ; LDWSWAQT; TAADWSWAQTE; ADWS
WAQTE; TAADWSWA; AADWSWAQTE; ADWSWAQTE; TAADWSWAQT; TAADWSWAQ; AADWSWAQT;
ADWSWAQ; ADWSWAQT; TALDFSWLQTE; LDFSWLQTE; TALDFSWL; ALDFSWLQTE; TALDFSWLQT;
TALDFSWLQ; ALDFSWLQT; LDFSWLQ; LDFSWLQT; TALDYSWLQTE; LDYSWLQTE, TALDYSWL; ALDY
SWLQTE; LDYSWLQTE; TALDYSWLQT; TALDYSWLQ; ALDYSWLQT; LDYSWLQ; LDYSWLQT; TALD
WAWLQTE; LDWAWLQTE; TALDWAWL; ALDWAWLQTE; LDWAWL; TALDWAWLQT; TALDWAWLQ; ALD
WAWLQT; LDWAWLQ; LDWAWLQT; TALDWEWLQTE; LDWEWLQTE; TALDWEWL; ALDEWEWLQTE;
LDWEWLQTE; TALDWEWLQT; TALDWEWLQ; ALDWEWLQT; LDWEWLQ; y LDWEWLQT.
6. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde X_{a} consta de 6 a 12 restos aminoacídicos.
7. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde X_{a} consta de 6 a 10 restos aminoacídicos.
8. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde X_{a} comprende al menos cinco restos aminoacídicos básicos.
9. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde X_{a} comprende al menos cinco restos aminoacídicos seleccionados independientemente entre L-arginina, D-arginina, L-lisina y D-lisina.
10. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, donde X_{a} se selecciona entre el grupo compuesto por RRMKWKK; YGRKKRRQRRR; ygrkkrrqrr; YARKARRQARR; yarkarrqarr; YARAARRAARR; yaraarraarr; rrmkw
kk; RRRRRR, RRRRRRR, RRRRRRRR, RRRRRRRRR, RRRRRRRRRR, RRRRRRRRRRR, rrrrrr, rrrrrrr, rrrrrrrr,
rrrrrrrrr, rrrrrrrrrr y rrrrrrrrrrr, donde una letra minúscula se refiere a un D-aminoácido.
11. El compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por: RRMKWKKTALDWSWLQTE; rrmkwkkTALDWSWLQTE; YGRKKRRQRRR
TALDWSWLQTE; ygrkkrrqrrrTALDWSWLQTE; rrrrrrrTALDWSWLQTE; RRRRRRRTALDWSWLQTE; YARK
ARRQARRTALDWSWLQTE; yarkarrqarrTALDWSWLQTE; YARAARRAARRTALDWSWLQTE; yaraarraarrTA
LDWSWLQTE; YGRKKRRQRRRLDWSWL; ygrkkrrqrrrLDWSWL; RRMKWKKLDWSWL; rrmkwkkLDWSWL; rrrrrrrLDWSWL; YARAARRAARRLDWSWL; yaraarraarrLDWSWL y RRRRRRRLDWSWL.
12. Un compuesto antiinflamatorio de la reivindicación 1, que tiene una estructura seleccionada entre el grupo compuesto por:
H-RRMKWKKTALDWSWLQTE-NH_{2};
H-YGRKKRRQRRRTALDWSWLQTE-NH_{2};
H-rrrrrrrTALDWSWLQTE-NH_{2};
H-YARKARRQARRTALDWSWLQTE-NH_{2};
H-YARAARRAARRTALDWSWLQTE-NH_{2};
H-RRMKWKKLDWSWL-NH_{2};
H-rrmkwkkLDWSWL-NH_{2};
H-rrrrrrrLDWSWL-NH_{2};
H-YARAARRAARRLDWSWL-NH_{2};
H-yaraarraarrLDWSWL-NH_{2}; y
H-YGRKKRRQRRRLDWSWL-NH_{2}.
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