DE60106423T2

DE60106423T2 - Entzündungshemmende verbindungen und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60106423T2
Application number: DE60106423T
Authority: DE
Inventors: J. Michael MAY; Sankar Ghosh; Mark A. Findeis; Kathryn Phillips
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2000-05-02
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2021-05-03
Also published as: EP1280820B1; US6864355B1; WO2001083547A2; DE60123041T2; US20110160119A1; AU6116401A; US20090286736A1; JP2012100663A; JP2003531918A; JP2003531636A; US20120101028A1; US8017726B2; JP2013056876A; EP1280820A2; WO2001083554A2; EP1282643B1; US20050143302A1; AR031696A1; EP1829888A1; WO2001083554A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur selektiven Inhibierung Cytokin-vermittelter NF-κB-Aktivierung durch Blockieren der Interaktion von NEMO mit IκB-Kinase-β (IKKβ) an der NEMO-Bindungsdomäne (NBD). Die Blockade der IKKβ-NEMO-Interaktion führt zur Inhibierung der IKKβ-Kinase-Aktivierung und einer anschließenden verringerten Phosphorylierung von IκB. Die Phosphorylierung von IκB ist ein wesentlicher Schritt der Cytokin-vermittelten NF-κB-Aktivierung.
Hintergrund der Erfindung
NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, der extrazelluläre Signale vermittelt, die für die Induktion an entzündungsfördernden Reaktionen beteiligter Gene verantwortlich sind (Baltimore et al., (1998) US-Patent Nr. 5,804,374). NF-κB ist im Cytoplasma der meisten nicht-stimulierten Zellen durch eine nicht-kovalente Interaktion mit einem von mehreren inhibitorischen Proteinen verankert, die als IκBs bekannt sind (May & Ghosh, (1997) Semin. Cancer. Biol. 8, 63–73; May & Ghosh,(1998) Immunol. Today 19, 80–88; Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225–260). Zellstimuli im Zusammenhang mit entzündungsfördernden Reaktionen, wie TNFα, aktivieren Kinasen, die wiederum NF-κB durch Phosphorylierung von IκBs aktivieren. Die Kinasen, die IκBs phosphorylieren, werden als IκB-Kinasen (IKK) bezeichnet.
Die Phosphorylierung ist auf IκBs zur Ubiquitinierung und Degradation gerichtet. Die Degradation und anschließende Dissoziation von IκBs aus NF-κB zeigt das nukleäre Lokalisierungssignal auf NF-κB, was eine nukleäre Translokation von aktivem NF-κB ergibt, die zu einer Hochregulierung von auf NF-κB ansprechenden Genen führt (May & Ghosh, (1997) Semin. Cancer. Biol. 8, 63–73; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80–88; Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225–260; Siebenlist et al., (1994) Annu. Rev. Cell Biol. 12, 405–455). Die Phosphorylierung von IκBs ist daher ein wesentlicher Schritt bei der Regulierung von NF-κB-vermittelten, entzündungsfördernden Reaktionen.
Die Identifikation und Charakterisierung von Kinasen, die IκBs phosphorylieren, führte zu einem besseren Verstehen der Signalwege, an denen die NF-κB-Aktivierung beteiligt ist. Bisher wurden einige verschiedene Subtypen von IKK identifiziert. IKKα wurde anfangs als eine IκB-Kinase identifiziert, die durch TNFα-Stimulation in HeLa-Zellen induziert wird (DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548–554). Eine andere IκB-Kinase, die homolog zu IKKα ist, wurde identifiziert, als IKKβ bezeichnet und als die Haupt-IκB-Kinase bestimmt, die infolge einer TNFα-Stimulation induziert wird (Takeda et al., (1999) Science 284, 313–316; Hu et al., (1999) Science 284, 316–320; Li et al., (1999) Science 284, 321–325; Pot et al., (2000) US-Patent Nr. 6,030,834; Woronicz & Goeddel (1999) US-Patent Nr. 5,939,302). IKKα und IKKβ haben eine Homologie von insgesamt 52% und eine Homologie in der Kinase-Domäne von 65% (Zandi et al., (1997) Cell 91, 243–252).
IκB-Proteinkinasen (IKKs) phosphorylieren IκBs an spezifischen Serinresten. Beispielsweise phosphorylieren sie spezifisch die Serine 32 und 36 von IκBα (Traenckner et al., (1995) EMBO J. 14, 2876–2883; DiDonato et al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 1295–1304). Eine Phosphorylierung beider Orte ist zum Targeting von IκBα zur Degradation erforderlich. Ferner kann mittels Aktivierung von IKKα und IKKβ, üblicherweise als Antwort auf NF-κB aktivierende Agenzien und Mutanten-IKKα und -IKKβ, die katalytisch inaktiv sind, die NF-κB-Stimulierung durch Cytokine, wie TNFα und IL-1, blockiert werden (Régnier et al., (1997) Cell 90, 373–383; Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313). IκB-Proteinkinasen sind daher wesentlich für die Regulierung von Prozessen zur NF-κB-Aktivierung.
IKKα und IKKβ weisen unterschiedliche Strukturmotive auf, einschließlich einer aminoterminalen Serin-Threonin-Kinasedomäne, die von einer carboxylproximalen Helix-Loop-Helix (H-L-H)-Domäne durch eine Leucin-Zipper-Domäne getrennt ist. Diese Strukturmerkmale unterscheiden sich von anderen Kinasen, und es wird davon ausgegangen, dass die nicht-katalytischen Domänen an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind. Proteine, die an IKKs binden, können daher in der Lage sein, die Aktivität von NF-κB zu regulieren (Marcu et al., (1999) US-Patent Nr. 5, 972,655) und möglicherweise auch stromabwärtige Ereignisse, wie die Induktion von NF-κB, zu regulieren. Beispielsweise ist NEMO (NF-κB-Essential Modulator) ein Protein, das als eines identifiziert wurde, welches an IKKs bindet und die Kinaseaktivität erleichtert (Yamaoke et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 287–300; Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Haraj & Sun, (1999) J. Biol. Chem. 274, 22911–22914; Jin & Jeang, (1999) J. Biomed. Sci. 6, 115–120).
Eine Entzündung ist als Reaktion von vaskularisiertem, lebendem Gewebe auf Verletzungen definiert. An sich ist eine Entzündung ein grundlegender, stereotypisierter Komplex cytologischer und chemischer Reaktionen betroffener Blutgefäße und benachbarten Gewebes als Antwort auf eine Verletzung oder eine abnormale Stimulation, die durch ein physikalisches, chemisches oder biologisches Agens verursacht ist. Eine Entzündung führt üblicherweise zur Akkumulation von Fluid und Blutzellen am Ort der Verletzung und ist üblicherweise ein Heilungsprozess. Manchmal verursacht eine Entzündung jedoch eine Schädigung, üblicherweise durch eine Dysfunktion des normalen Fortschreitens der Entzündung. Entzündliche Erkrankungen sind solche, die zu einer Entzündung gehören, durch diese gekennzeichnet sind, sie verursachen, durch sie entstehen oder von ihr beeinflusst werden. Zu Beispielen für entzündliche Erkrankungen oder Störungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Asthma, Lungenentzündung, chronische granulomatöse Erkrankungen, wie Tuberkulose, Lepra, Sarkoidose und Silikose, Nephritis, Amyloidose, rheumatoide Arthritis, ankylosierende Spondylitis, chronische Bronchitis, Sklerodermie, Lupus, Polymyositis, Blinddarmentzündung, entzündliche Darmerkrankungen, Geschwüre, das Sjogren-Syndrom, das Reiter-Syndrom, Psoriasis, Beckenentzündung, Entzündungen des Orbitalgewebes, Thrombose und unangemessene allergische Reaktionen auf Umweltreize, wie giftiger Efeu, Pollen, Insektenstiche und bestimmte Nahrungsmittel, einschließlich atopischer Dermatitis und Kontaktdermatitis.
Entzündliche Erkrankungen stellen ein weltweites Problem dar. Studien der Krankheitslast haben erneut bestätigt, dass Tuberkulose weltweit eine der 10 häufigsten Todesursachen ist. Unter Asthma leiden 5% der erwachsenen Bevölkerung und 10–15% der Kinder (Armetti und Nicosia (1999) Boll Chim. Farm. 138 (11): 599). Asthma ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die mit einer weit verbreiteten, aber veränderlichen Atemwegsobstruktion zusammen hängt.
Die Sepsis ist noch eine weitere entzündliche Störung und wird durch das Vorliegen verschiedener eiterbildender und anderer pathogener Mikroben oder deren Toxine im Blut oder Gewebe eines Lebewesens verursacht. Eine Sepsis ist durch eine systemische entzündliche Reaktion auf bakterielle Produkte während einer Infektion gekennzeichnet. Die Symptome einer Sepsis, wie z. B. Fieber, werden zumindest teilweise durch die entzündliche Reaktion des Körpers auf das Infektionsagens verursacht.
Daher besteht noch immer ein großer Bedarf an Verbindungen, die bei der Behandlung entzündlicher Störungen von Nutzen sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt entzündungshemmende Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und Verfahren zu deren Verwendung zur Behandlung entzündlicher Störungen bereit. Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Identifikation der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) auf IκB-Kinase-α (IKKα) und auf IκB-Kinase-β (IKKβ).
Daher stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt entzündungshemmende Verbindungen bereit, die eine NEMO-Bindungsdomäne (NBD) umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung entzündungshemmende Verbindungen bereit, die Fusionen einer NEMO-Bindungsdomäne und mindestens einer Membrantranslokationsdomäne aufweisen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform erleichtert die Membrantranslokationsdomäne die Membrantranslokation der entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung in vivo. Die Membrantranslokationsdomäne kann z. B. die dritte Helix der Antennapedia-Homeodomäne oder das HIV-1-Tat-Protein sein. Bei einer Ausführungsform ist die NEMO-Bindungsdomäne ein Polypeptid mit der unter folgender SEQ ID NO angegebenen Sequenz: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung entzündungshemmende Verbindungen bereit, mit: (a) Peptiden, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 enthalten oder aus dieser bestehen, (b) Peptiden, die eine konservative Aminosäuresubstitution der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 enthalten, und (c) natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz-Varianten der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen umfassen, z. B. pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten.
Nach einem weiteren Aspekt ist die Erfindung durch ein Verfahren zur Behandlung einer entzündlichen Störung, z. B. von Asthma, Lungenentzündung oder Krebs, bei einem Lebewesen gekennzeichnet. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer oder mehrerer entzündungshemmender Verbindungen gemäß der Erfindung an das Lebewesen. Ohne sich auf einen Mechanismus beschränken lassen zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen dadurch (direkt oder indirekt) wirken können, dass sie die Leukocyten-Rekrutierung an Orten akuter und chronischer Entzündung blockieren, indem sie die Expression von E-Selektin auf Leukocyten abwärts regulieren oder die Osteoklastendifferenzierung blockieren.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Expression eines NF-κB-abhängigen Zielgens, z. B. E-Selektin, in einer Zelle bereit. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer Zelle mit einer entzündungshemmenden Verbindung nach der vorliegenden Erfindung, wodurch die NF-κB-abhängige Zielgen-Expression in einer Zelle inhibiert wird.
Nach noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Inhibierung der NF-κB-Induktion (z. B. IKKα- und/oder IKKβ-abhängige Induktion) in einer Zelle bereit, bei denen eine Zelle mit einer wirksamen Menge einer entzündungshemmenden Verbindung nach der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht und dadurch die NF-κB-Induktion in einer Zelle inhibiert wird. Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung verwenden solche Verfahren entzündungshemmende Verbindungen, die mindestens eine Membrantranslokationsdomäne enthalten. Bei noch einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung umfassen die bei diesen Verfahren verwendeten, entzündungshemmenden Verbindungen Aminosäuresequenzen mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 11, 12, 16, 17 oder 18.
Ein besonderer Vorteil der entzündungshemmenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie zwar die NF-IκB-Induktion via IKK blockieren, die basale NF-κB-Aktivität jedoch nicht inhibieren.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen.
Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass NEMO mit dem COOH-Terminus von IKKβ interagiert. (A) GST alleine oder GST-NEMO wurden aus bakteriellen Lysaten unter Verwendung von Glutathion-Agarose präzipitiert, mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt, und das Gel wurde mit Coomassieblau (linkes Feld) gefärbt. GST oder GST-NEMO wurde in anschließenden GST-Pull-Down-Experimenten in gleichen Mengen verwendet. Das in der rechten Tafel gezeigte Schema stellt die COOH- und NH₂-terminalen Trunkationsmutanten von IKKβ dar, die verwendet wurden, um die Region der NEMO-Interaktion zu bestimmen. (B) IKKβ-Mutanten wurden kloniert, durch in vitro-Translation exprimiert (Input; linkes Feld) und für einen GST-Pull-Down verwendet (rechtes Feld). (C) Wildtyp-IKKβ und IKKβ-(644-756) wurden in vitro translatiert (linkes Feld) und für eine GST-Pull-Down-Analyse verwendet (linkes Feld). (D) HeLa-Zellen wurden vorübergehend entweder nur mit einem Vektor oder mit zunehmenden Konzentrationen (0,25, 0,5, 1,0 μg/ml) des Xpress-markierten IKKβ-(644-756)-Konstruktes zusammen mit dem pBIIX-Luciferase-Reporterplasmid transfiziert. Nach achtundvierzig Stunden wurden die Zellen vier Stunden mit TNFα (10 ng/ml) oder mit IL-1β (10 ng/ml) behandelt; dann wurde die NF-κB-Aktivität gemessen. Eine Western Blot-Analyse von Anteilen des Lysates mittels Anti-Xpress (Nebenbild) zeigt die steigenden Mengen an exprimiertem Protein.
2 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass die erste α-Helix-Region von NEMO zur Bindung an IKKβ erforderlich ist. (A) Eine trunkierte Version von IKKβ, die nur aus dem COOH-Terminus von den Resten V644 bis S756 besteht, wurde mit GST (GST-644756) fusioniert und in Bakterien exprimiert. Nach Präzipitation durch Glutathion-Agarose wurden GST alleine und GST-(644-756) mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und das Gel mit Coomassieblau eingefärbt (linkes Feld). Gleiche Mengen jedes Proteins wurden für anschließende GST-Pull-Down-Analysen verwendet. Es wurden verschiedene NH₂- und COOH-terminale Trunkationen von NEMO konstruiert, mit [³⁵S]-Methionin markiert und für einen in vitro-Pull-Down verwendet (rechtes Feld). Mutanten, die mit GST-(644-756) interagierten, sind mit (+) angegeben. Keine der Mutanten interagierte mit GST alleine. (B) Wildtyp-NEMO und eine Deletionsmutante, der die erste α-Helix-Region fehlte (del.αH) wurden in vitro translatiert (linkes Feld: Input) und für einen GST-Pull-Down unter Verwendung der oben gezeigten Proteine verwendet (A: links). (C) HeLa-Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit pBIIx-Luciferase, zusammen mit pcDNA-3 (Vektor) oder zunehmenden Konzentrationen an del.αH (0,25, 0,5, 1,0 μg/ml), transfiziert und dann vier Stunden mit TNFα (10 ng/ml) behandelt. Dann wurden die Zellen lysiert und die NF-κB-Aktivität durch einen Luciferase-Assay bestimmt.
3 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass eine Interaktion mit NEMO und eine funktionale Kinaseaktivität eine IKKα-homologe Region des IKKβ-COOH-Terminus erfordert. (A) Trunkationsmutationen von IKKβ, denen nacheinander der äusserste COOH-Terminus (1-733), die Serin-freie Region (1-707), die Serin-reiche Domäne (1-662) und die α1-Region (1-644) fehlte, wurden mittels in vitro-Translation exprimiert und markiert und für einen GST-Pull-Down durch GST-NEMO verwendet (1A). Keine der Mutanten interagierte mit GST alleine. (B) Sequence Alignment der äussersten COOH-Termini von IKKβ und IKKα. Die α2- und Glutamat-reichen Regionen sind eingezeichnet, und die sechs identischen Aminosäuren sind schraffiert dargestellt. (C) Wildtyp-IKKβ und die Trunkationsmutanten (1-733 und 1-744) wurden mit [³⁵S]-Methionin markiert (Input) und für einen in vitro-Pull-Down mit GST alleine oder mit GST-NEMO verwendet. (D) HeLa- Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit 1 μg/Vertiefung der angegebenen, FLAG-markierten Konstrukte transfiziert, gefolgt von einer Immunpräzipitation mit Anti-FLAG. Die Immunpräzipitate wurden fünfzehn Minuten bei 30°C in Kinasepuffer inkubiert, der [³²P]-markiertes γATP enthielt, und dann mit Lysepuffer gewaschen, der 1% Triton-100 enthielt. Die resultierenden Komplexe wurden mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht (oberes Feld). Das untere Feld ist ein Immunblot von identischen Proben, die in jeder Bahn äquivalente Mengen an transfiziertem Protein zeigen. (E) HeLa-Zellen wurden 48 Stunden mit 1μg/ml der angegebenen Konstrukte oder mit einem leeren Vektor (pcDNA-3) zusammen mit pBIIx-Luciferase transfiziert. Die NF-κB-Aktivität wurde durch einen Luciferase-Assay bestimmt. (F) HeLa-Zellen, die achtundvierzig Stunden mit FLAG-markierten Versionen von IKKβ (Wildtyp) oder IKKβ-(1-733) transfiziert worden waren, waren entweder unbehandelt (-) oder wurden sieben Minuten mit TNFα (10 ng/ml) behandelt (+). Nach Lyse und Immunpräzipitation mit Anti-FLAG wurde ein Immunkomplex-Kinase-Assay (oberes Feldn) durchgeführt. Identische Proben wurden immunpräzipitiert und mit Anti-FLAG immun-geblottet (unteres Feldn).
4 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass die Assoziierung von NEMO mit IKKβ und IKKα ergibt, dass die NEMO-Bindungsdomäne (NBD) aus sechs COOH-terminalen Aminosäuren besteht. (A) COS-Zellen wurden vorübergehend nur mit einem Vektor, mit FLAG-markiertem IKKα oder IKKβ (1 μg/Vertiefung) oder mit Xpress-markiertem NEMO (1 μg/Vertiefung) bis zu einer DNA-Gesamtkonzentration von 2 μg/Vertiefung wie angegeben transfiziert. Nach einer Lyse wurden Immunpräzipitationen (IP) mit Anti-FLAG (M2) durchgeführt und die Inhalte der Präzipitate mittels Immunblotting (IB) mit Anti-FLAG (M2) oder mit Anti-Xpress sichtbar gemacht. Ein Teil des pre-IP Lysates wurde mit Anti-Xpress immungeblottet, um gleiche Mengen an NEMO-Expression in transfizierten Zellen sicherzustellen. (B) Wildtyp-IKKα und IKKα-(1-737) wurden exprimiert und markiert (Input) und für einen GST-Pull-Down mit GST oder GST-NEMO verwendet. (C) Gesamtlängen-cDNA, die Human-IKKi codierte, wurde durch RT-PCR aus HeLa-Zellen-mRNA unter Verwendung des Expand^TM Long Template-PCR-Systems (Boehringer Mannheim), von Forward Primer (5'-CTAGTCGAATTCACCATGCAGAGCACAGCCAATTAC) (SEQ ID NO: 22) und Reverse Primer (3'-CTAGTCTCTAGATTAGACATCAGGAGGTGCTGG) (SEQ ID NO: 23) erhalten und in die EcoRI- und Xbal-Orte von pcDNA-3 kloniert. Eine GST-Pull-Down-Analyse wurde unter Verwendung von [³⁵S]-Methionin-markiertem IKKα, IKKβ und IKKi durchgeführt. (D) Eine Deletionsmutante von IKKβ, der die NBD fehlte (del.NBD) wurde mit [³⁵S]-Methionin markiert (Input) und für eine GST-Pull-Down- Analyse verwendet. (E) Ein Fauchere-Pliska-Hydrophobizitäts-Plot des COOH-Terminus (N721-S756) von Human-IKKβ wurde mit der Software MacVector^TM (Version 6.5.3) erzeugt. Die NBD (L737-L742) ist eingerahmt. (F) COS-Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit insgesamt 2μg DNA/Vertiefung von Vektor alleine, Vektor plus NEMO-FLAG oder NEMO-FLAG plus Xpress- markierten Versionen von IKKβ-(1-744) markiert, enthaltend Punktmutationen innerhalb der NBD, wie gezeigt. Nach Lyse und Immunpräzipitation mit Anti-FLAG (M2) wurde eine Immunblot-Analyse mit Anti-FLAG oder mit Anti-Xpress durchgeführt. Die Menge an exprimiertem Protein im pre-IP-Lysat wurde mittels Immunblotting mit Anti-Xpress bestimmt (unteres Feld). (G) HeLa-Zellen wurden vorübergehend achtundvierzig Stunden mit den angegebenen Konstrukten zusammen mit pBIIX-Luciferase transfiziert, und die NF-κB-Aktivität im Lysat wurde durch einen Luciferase-Assay bestimmt.
5 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass ein zellpermeables Peptid, das sich über die IKKβ-NBD erstreckt, die IKKβ/NEMO-Interaktion, die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung und die NF-κB-abhängige Genexpression inhibiert. (A) Es wurde eine GST-Pull-Down-Analyse durchgeführt, bei der entweder mit GST-NEMO in vitro translatierter IKKβ (oberes Feld) oder mit GST-IKKβ-(644-756) in vitro translatiertes NEMO verwendet wurde (unteres Feld). Der Assay wurde in Abwesenheit (kein Peptid) oder in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (125, 250, 500 oder 1000 μM) von Mutanten (MUT)- oder Wildtyp (WT)-NBD-Peptid durchgeführt. (B) HeLa-Zellen wurden über die angegebenen Zeiträume mit jedem Peptid (200 μM) inkubiert. Nach der Lyse wurde der IKK-Komplex mit Anti-NEMO immunpräzipitiert, und der resultierende Immunblot wurde mit Anti-IKKβ sondiert. (C) HeLa-Zellen wurden achtundvierzig Stunden mit pBIIX-Luciferase transfiziert und dann zwei Stunden in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von Mutanten- oder Wildtyp-NBD-Peptid Qeweils 100 und 200 μM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen weitere vier Stunden entweder mit TNFα (10 ng/ml) behandelt, wie gezeigt (linkes Feld), oder unbehandelt gelassen (rechtes Feld); danach wurde die NF-κB-Aktivierung mit einem Luciferase-Assay bestimmt. (D) HeLa-Zellen wurden drei Stunden mit zunehmenden Konzentrationen (50, 100 oder 200 μM) jedes Peptids inkubiert, gefolgt von einer fünfzehn-minütigen Behandlung mit TNFα (10 ng/ml), wie gezeigt (+). Nach einer Lyse wurden Kernextrakte hergestellt und 10 μg Protein von jeder Probe für einen EMSA unter Verwendung einer spezifischen [³²P]-markierten κB-Site Probe (Ortssonde) verwendet. (E) Primäre HUVEC wurden zwei Stunden mit Wildtyp- (links) oder Mutanten- (rechts) NBD-Peptiden (100μM) vorinkubiert und dann weitere sechs Stunden mit TNFα (10 ng/ml) stimuliert. Die Kontrollzellen erhielten kein Peptid. Die Zellen wurden mit Anti-E-Selektin (H4/18) oder mit einem nicht-bindenden Kontroll-Antikörper (K16/16) gefärbt, und die Expression wurde mittels FACS (FACSort, Becton Dickinson) bestimmt. Die Profile zeigen eine E-Selektin-Färbung in Abwesenheit (schraffiert) und in Gegenwart (durchgezogene Linie) von TNFα und die Färbung von Kontroll-Antikörpern unter denselben Bedingungen (gestrichelte Linie: kein TNFα; gepunktete Linie: TNFα).
6 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass das Wildtyp-NBD-Peptid eine NF-κB-induzierte Genexpression und eine experimentell induzierte Entzündung inhibiert. (A) Ein PMA-induziertes Ohrenödem in Mäusen, das entweder mit einem Vehikel (VEH), mit Dexamethason (DEX) oder mit NBD-Peptiden behandelt wurde, wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, induziert und gemessen. Die Daten sind als mittlere Unterschiede der Ohrendicke ± SD (* = p < 0,05 verglichen mit unbehandelter Kontrolle [–] und Vehikel [VEH]) dargestellt. (B) Die Effekte des NBD-Peptids im Vergleich zum Effekt von Dexamethason (DEX) auf Zymosan (ZYM)-induzierte Peritonitis in Mäusen wurden, wie wiederum in Beispiel 8 beschrieben, bestimmt. Kontrollmäusen wurde Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert.
7 stellt Ergebnisse von Experimenten dar, welche die dosisabhängige Inhibierung der Osteoklasten-Differenzierung durch Wildtyp-, aber nicht durch Mutanten-NBD-Peptide, zeigen. Die Daten sind als Mittelwert aus Dreifach-Proben ± SD dargestellt.
8 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse von D738 in der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) von Human-IKKβ. (A) Der Asparaginsäurerest in Position 738 von IKKβ wurde mittels PCR-Mutagenese mit Alanin-, Asparagin- oder Glutaminsäure substituiert. (B) Die unter A gezeigten IKKβ (D738)-Mutanten wurden durch in vitro-Transkription und -Translation mit ³⁵S-Methionin markiert und dann für eine GST-Pull-Down- Analyse verwendet, bei der GST NEMO wie zuvor beschrieben verwendet wurde. (C) HeLa-Zellen wurden vorübergehend transfiziert, wobei das Fugene6-Transfektionsverfahren mit dem NF-κB-abhängigen Reporter-Konstrukt pBIIx-Luciferase, zusammen mit pcDNA-3, IKKβ oder den oben beschriebenen D738-Mutanten (A), zur Anwendung kam. Nach 48 Stunden wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität, wie zuvor beschrieben, bestimmt.
9 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse von W739 und W741 in der NBD von Human-IKKβ. (A) Die Tryptophanreste in den Positionen 739 und 741 von IKKβ wurden mittels PCR-Mutagenese mit Alanin, Phenylalanin, Tyrosin oder Arginin substituiert. (B) COS-Zellen wurden vorübergehend entweder nur mit einem Vektor (pcDNA3.1-Xpress), mit IKKβ, W739A, W739F oder W739Y zusammen mit FLAG-markiertem NEMO wie gezeigt transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen lysiert und Komplexe unter Verwendung von Anti-FLAG (M2)-gekoppelten Agaroseperlen immunpräzipitiert (IP). Vor der Immunpräzipitation wurde ein Teil jedes Lysates (5%) zur Analyse zurückbehalten (pre-IP). Die Proteine in den Proben wurden mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und durch Immunblotting (IB) mit Antikörpern, die entweder FLAG (M2) oder Xpress erkennen, analysiert. Die beiden oberen Tafeln zeigen Xpress-markierten IKKβ, und das untere Feld zeigt FLAG-markiertes NEMO. (C und D) COS-Zellen wurden vorübergehend mit den gezeigten Plasmiden transfiziert, gefolgt von Immunpräzipitation und Immunblot-Analyse, wie dies unter B beschrieben ist. (C und D) HeLa-Zellen wurden vorübergehend mit pBIIx-Luciferase zusammen mit den gezeigten Plasmiden transfiziert, und nach 48 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität in Lysaten bestimmt.
10 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse von S740 in der NBD von Human-IKKβ. Die Serinreste in Position 740 von IKKβ wurden mittels PCR-Mutagenese mit Alanin- oder Glutaminsäure substituiert. (B) COS-Zellen wurden vorübergehend mit den gezeigten Plasmiden transfiziert, gefolgt von Immunpräzipitation und Immunblot-Analyse, wie in 2B beschrieben. (C) HeLa-Zellen wurden 48 Stunden vorübergehend mit IKKβ-FLAG oder S740E-FLAG transfiziert und dann über die angegebenen Zeiträume mit TNFα (1 μg/ml) behandelt. Nach einer Lyse wurden Komplexe mittels Anti-FLAG (M2)-gekoppelter Agaroseperlen präzipitiert und ein Immunkomplex-Kinase-Assay unter Verwendung von GST-IκBα (1-90) als Substrat wie zuvor beschrieben durchgeführt.
11 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse der IKKα-NBD. (A) Jeder der Reste, welche die NBD von IKKα (L738 bis L743) enthielten, wurde mittels PCR-Mutagenese mit Alanin substituiert. COS-Zellen wurden vorübergehend mit NEMO-FLAG, zusammen mit Vektor alleine (pcDNA-3.1-Xpress) oder mit Xpress-markierten Versionen von IKKα und den gezeigten NBD-Mutanten, transfiziert. Immunpräzipitation und Immunblot-Analyse der IKKα-NEMO-Komplexe wurden wie in 2B beschrieben durchgeführt. (B) HeLa-Zellen wurden vorübergehend mit pBIIx-Luciferase, zusammen mit den gezeigten Plasmiden, transfiziert, und nach 48 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität in Lysaten bestimmt.
12 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, welches demonstriert, dass ein die IKKβ-NBD umfassendes Peptid die Interaktion von IKKα mit NEMO verhindert. (A) Sequenzen des NBD-Wildtyps und gescrambelter (durchmischter) Kontrollpeptide. Das Wildtyp-Peptid entspricht den Resten 734 bis 744 von IKKβ. (B) Eine GST-Pull-Down-Analyse wurde mit GST-NEMO und in vitro-transkribiertem und -translatiertem IKKα (oberes Feld) und IKKβ (mittlere Tafel) in Gegenwart oder Abwesenheit eines Vehikels (2% DMSO), von durchmischtem Peptid oder von Wildtyp-NBD-Peptid (500 und 1000 μM von jedem Peptid) durchgeführt. Die unteres Feld zeigt ein mit Coomassieblau markiertes Gel, welches demonstriert, dass keines der Peptide die Interaktion von GST-NEMO mit den zur Präzipitation verwendeten Glutathion-Agaroseperlen beeinträchtigt. (C) Densitometrische Analyse von Autoradiograph-Banden, die nach einem GST-Pull-Down von IKKα und IKKβ mittels GST-NEMO in Gegenwart einer Reihe von Konzentrationen des Wildtyp-NBD-Peptids erhalten wurden. Das Nebenbild zeigt ein repräsentatives Experiment. Die Daten sind in Form der Pixeldichte als Prozentsatz der Kontrolle (kein Peptid) wiedergegeben und stellen Mittelwerte ± S.D. (n = 11) dar. Die Analyse wurde mit der NIH-Image-Software durchgeführt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Allgemeine Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt entzündungshemmende Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und Verfahren zu deren Verwendung zur Behandlung entzündlicher Störungen bereit. Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Identifikation der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) auf IκB-Kinase-α (IKKα) und auf IκB-Kinase-β (IKKβ).
Ohne sich auf einen Mechanismus beschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung durch Blockierung der Interaktion von NEMO mit einem IKK (z. B. IKKβ oder IKKα) in der NEMO-Bindungsdomäne (NBD) wirken, wodurch sie die Phosphorylierung, Degradation und anschließende Dissoziation von IκB aus NF-κB inhibieren. Diese Inhibierung führt zu einer Blockade der NF-κB-Aktivierung, die im Zusammenhang mit entzündungsfördernden Reaktionen steht.
II. Definitionen
Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie sie allgemein vom Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Der Begriff „Bindung" bezieht sich so, wie er hier verwendet wird, auf die Haftung von Molekülen aneinander, wie z. B., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, von Enzymen an Substraten, Antikörpern an Antigenen, DNA-Strängen an ihren komplementären Strängen. Eine Bindung erfolgt, weil die Form und chemische Beschaffenheit von Teilen der Moleküloberflächen zueinander „komplementär" sind. Eine übliche Metapher ist die von „Schlüssel und Schloss", mit der beschrieben wird, wie sich Enzyme um ihr Substrat herum anlagern.
Der Begriff „Fusionspeptid" oder „Fusionspolypeptid" oder „Fusionsprotein" umfasst ein Peptid, Polypeptid oder Protein, das durch Kombination zweier unterschiedlicher Aminosäuresequenzen erhalten wird. Typischerweise ist eine Teilsequenz eines Peptids, Polypeptids oder Proteins mit einem anderen heterologen Peptid, Polypeptid oder Protein mittels dem Fachmann bekannter Techniken verknüpft.
Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei welcher der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt ist. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind dem Fachmann bekannt, einschließlich basischer Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saurer Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladener polarer Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolarer Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigter Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischer Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Nicht einschränkende Beispiele für konservative Substitutionen, die bei den entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, umfassen die Substitution von D-Phenylalanin mit D-Tyrosin, D-Pyridylalanin oder D-Homophenylalanin, die Substitution von D-Leucin mit D-Valin oder einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette und/oder Substitution von D-Valin mit D-Leucin oder einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette.
Der Begriff „Domäne" bezieht sich so, wie er hier verwendet wird, auf einen Teil eines Moleküls oder einer Struktur, die gemeinsame physikalisch-chemische Merkmale teilen, wie z. B., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, hydrophobe, polare, globuläre und helixförmige Domänen oder Eigenschaften. Spezifische Beispiele für Bindungsdomänen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, DNA-Bindungsdomänen und ATP-Bindungsdomänen.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Membrantranslokationsdomäne" auf ein Peptid, das in der Lage ist, die Membran einer Zelle zu durchdringen, und das dazu verwendet wird, gebundene Peptide in vivo in eine Zelle zu transportieren. Membrantranslokationsdomänen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die dritte Helix des Antennapedia-Homeodomäne-Proteins und das HIV-1-Protein Tat. Zusätzliche Membrantranslokationsdomänen sind dem Fachmann bekannt und umfassen diejenigen, die z. B. in Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444–10450; Lindgren et al., (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21, 99–103; Ho et al., Cancer Research 61, 474–477 (2001); US-Patent Nr. 5,888,762; US-Patent Nr. 6,015,787; US-Patent Nr. 5,846,743; US-Patent Nr. 5,747,641; US-Patent Nr. 5,804,604 und in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 98/52614, WO 00/29427 und WO 99/29721 beschrieben sind.
Der Begriff „IκB" (I Kappa B) bezieht sich so, wie er hier verwendet wird, auf eines von mehreren Mitgliedern einer Familie strukturverwandter, inhibitorischer Proteine, die zur Regulierung der NF-κB-Induktion dienen.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „IκB-Kinase" oder „IκB-Proteinkinase" oder „IκB-Kinasekomplex" oder „IκB-Proteinkinasekomplex" oder „IKK" auf eine Kinase, die IκB phosphoryliert.
Der Begriff „IKKα" bezieht sich so, wie er hier verwendet wird, auf eine Untereinheit eines IκB-kinasekomplexes. So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „IKK" auf die β-Untereinheit eines IκB-Kinasekomplexes.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „NEMO" (NF-κB-Essential Modulator), „IKKγ" oder „IKKAP" auf das Protein, das IKK bindet und die Kinaseaktivität erleichtert.
Der Begriff „NEMO-Bindungsdomäne" oder „NBD" umfasst so, wie er hier verwendet wird, jede Domäne, die in der Lage ist, an NEMO in der Region zu binden, in der NEMO üblicherweise mit einem IKK interagiert (z. B. IKKα oder IKKβ). Zu NEMO-Bindungsdomänen zählen z. B. die α2-Region (Reste 737–742) von Wildtyp-IKKβ oder die entsprechenden sechs Aminosäuresequenzen von Wildtyp-IKKα (Reste 738–743), die für eine Interaktion mit NEMO kritisch sind. Die Nukleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der Wildtyp-IKKβ-NBD sind in SEQ ID NO: 1 (GenBank Zugangsnr. AR067807; Nukleotide 2203–2235) bzw. SEQ ID NO: 2 bereitgestellt.
Die Begriffe „Analog", „Derivat" und „Mimetikum" sollen so, wie sie hier verwendet werden, Moleküle enthalten, welche die chemische Struktur einer Peptidstruktur nachahmen und die Funktionseigenschaften der Peptidstruktur bewahren. Ansätze zur Entwicklung von Peptidanaloga, -derivaten und -mimetika sind dem Fachmann bekannt, siehe z. B. Farmer, P. S. in Drug Design (E. J. Ariens, Hrsg.) Academic Press, New York, 1980, Nr. 10, S. 119–143; Ball. J. B. und Alewood, P. F. (1990) J. Mol. Recognition 3: 55; Morgan, B. A. und Gainor, J. A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243; und Freidinger, R. M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 270; siehe auch Sawyer, T. K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M. D. und Amidon, G. L. (Hrsg.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Kapitel 17; Smith, A. B. 3rd, et al. (1995) J. Am.Chem. Soc. 117: 11113–11123; Smith, A. B. 3rd, et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 9947–9962; und Hirschman, R., et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 12550–12568.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich ein „Derivat" einer Verbindung X (z. B. ein Peptid oder eine Aminosäure) auf eine Form von X, in der eine oder mehrere Reaktionsgruppen der Verbindung mit einer Substituentengruppe derivatisiert wurden. Beispiele für Peptidderivate umfassen Peptide, bei denen eine Aminosäureseitenkette, die Peptid-Hauptkette oder der Amino- oder Carboxy-Terminus derivatisiert wurde (z. B. Peptidverbindungen mit methylierten Amidbindungen). Ein „Analog" einer Verbindung X bezieht sich, so wie es hier verwendet wird, auf eine Verbindung, die chemische Strukturen von X bewahrt, die für die funktionale Aktivität von X notwendig sind, die jedoch auch gewisse chemische Strukturen enthält, die sich von X unterscheiden. Ein Beispiel für ein Analog eines natürlich vorkommenden Peptids ist ein Peptid, das eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthält. So wie es hier verwendet wird, bezieht sich ein „Mimetikum" einer Verbindung X auf eine Verbindung, bei der chemische Strukturen von X, die für die funktionale Aktivität von X notwendig sind, durch andere chemische Strukturen ersetzt wurden, welche die Konformation von X nachahmen. Zu Beispielen für Peptidmimetika zählen Peptid-Verbindungen, bei denen die Peptid-Hauptkette mit einem oder mehreren Benzodiazepinmolekülen substituiert ist (siehe z. B. James, G. L. et al. (1993) Science 260:1937–1942).
Der Begriff Mimetikum und insbesondere Peptidmimetikum soll Isostere umfassen. Der Begriff „Isoster" soll so, wie er hier verwendet wird, eine chemische Struktur umfassen, die durch eine zweite chemische Struktur ersetzt werden kann, da die sterische Konformation der ersten Struktur zu einem für die zweite Struktur spezifischen Bindungsort passt. Der Begriff umfasst insbesondere Peptid-Hauptkettenmodifikationen (d. h. Amidbindungsmimetika), die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zu solchen Modifikationen zählen Modifikationen des Amidstickstoffs, des α-Kohlenstoffs, Amidcarbonyl, ein vollständiger Austausch der Amidbindung, Extensionen, Deletionen oder Hauptkettenvernetzungen. Es sind einige Peptid-Hauptkettenmodifikationen bekannt, einschließlich ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CSNH₂], ψ[NHCO], ψ[COCH₂] und ψ[(E) oder (Z) CH=CH]. In der oben verwendeten Nomenklatur steht ψ für das Fehlen einer Amidbindung. Die Struktur, welche die Amidgruppe ersetzt, ist in Klammern angegeben.
Andere mögliche Modifikationen umfassen eine N-Alkyl- (oder -Aryl)-Substitution (ψ[CONR]) oder eine Hauptkettenvernetzung, um Lactame und andere zyklische Strukturen zu konstruieren. Andere Derivate der entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung umfassen C-terminale Hydroxymethylderivate, O-modifizierte Derivate (z. B. C-terminaler Hydroxymethylbenzylether), N- terminal modifizierte Derivate, einschließlich substitutierter Amide, wie Alkylamide und Hydrazide, und entzündungshemmende Verbindungen, bei denen ein C-terminaler Phenylalaninrest durch ein Phenethylamidanalog ersetzt ist (z. B. Val-Phe-Phenethylamid als Analog des Tripeptids Val-Phe-Phe).
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Wildtyp" auf den Genotyp und Phänotyp, der für die meisten Mitglieder einer Spezies, die natürlich vorkommen und im Gegensatz zum Genotyp und Phänotyp einer Mutante stehen, charakteristisch ist.
III. Spezifische Ausführungsformen
A. Entzündungshemmende Verbindungen
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung umfassen Fusionen einer NEMO-Bindungsdomäne und mindestens eine Membrantranslokationsdomäne, welche die Membrantranslokation der erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Verbindungen in vivo erleichtert.
Entzündungshemmende Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können ausgehend von der Wildtyp-Aminosäuresequenz der NBD von IKKα oder IKKβ (SEQ ID NO: 2) entwickelt werden. Jedes Fragment der Wildtyp-Aminosäuresequenz der NBD von IKKα oder IKKβ, das in der Lage ist, NEMO zu binden, kann zur Herstellung einer entzündungshemmenden Verbindung nach dieser Erfindung verwendet werden. Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen dieser Wildtyp-Sequenzen (mit den hier beschriebenen Verfahren) können eingesetzt werden, um zusätzliche entzündungshemmende Verbindungen zu erzeugen. Peptide, die konservative Aminosäure-Substitutionen in den Positionen 737, 740 und 742 des unter SEQ ID NO: 2 angegebenen Peptids enthalten, sind besonders nützliche entzündungshemmende Verbindungen nach der Erfindung (in Tabelle 1 finden sich Beispiele für konservative Substitutionen, die keinen merklichen Effekt auf die Fähigkeit der Peptide zur Bindung von NEMO haben). Zusätzlich können natürlich auftretende Allelvarianten des IKKβ-Gens, welche die Fähigkeit zur Bindung von NEMO bewahren, zur Herstellung entzündungshemmender Verbindungen verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform umfassen die entzündungshemmenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung: (a) Peptide, welche die Aminosäuresequenz der folgenden SEQ ID NO enthalten oder aus dieser bestehen: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19; (b) Peptide, welche eine konservative Aminosäuresubstitution der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 enthalten; und (c) natürlich auftretende Aminosäuresequenzvarianten der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19.
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können auch NEMO-spezifische Rezeptoren, z. B. somatisch rekombinierte Peptidrezeptoren wie spezifische Antikörper oder T-Zell-Antigen-Rezeptoren (siehe Harlow & Lane, (1988) Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und andere natürliche intrazelluläre Bindungsagenzien aufweisen, die mit Assays, wie Ein-, Zwei- und Drei-Hybrid-Screens, identifiziert werden können, sowie nicht-natürliche intrazelluläre Bindungsagenzien, die in Screens von chemischen Bibliotheken wie nachfolgend beschrieben identifiziert werden.
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, NEMO abwärts zu regulieren. Die Abwärtsregulierung ist hier als Verminderung der Aktivierung, Funktion oder Synthese von NEMO, seiner Liganden oder seiner Aktivatoren definiert. Ferner ist sie so definiert, dass sie eine Erhöhung der Degradation des NEMO-Gens, seines Proteinproduktes, seiner Liganden oder seiner Aktivatoren umfasst. Eine Abwärtsregulierung kann auf zahlreiche Weisen erreicht werden, z. B. durch Destabilisieren der Bindung von NEMO an einen IKK (z. B. IKKβ oder IKKα) oder durch Blockieren der Phosphorylierung von IκB und Verursachen der anschließenden Degradation dieses Proteins.
Die Phosphorylierung von IκB durch IKKβ führt zur Ubiquitinierung und zum Abbau von IκB sowie zur anschließenden Dissoziation von IκB, was eine nukleäre Translokation von NF-κB ermöglicht, die zu einer Aufwärtsregulierung von Genen führt, die für die entzündliche Reaktion kritisch sind. Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können daher zur Abwärtsregulierung der NF-κB-Funktion verwendet werden. Die Abwärtsregulierung von NF-κB kann auch durch Verwendung entzündungshemmender Verbindungen erreicht werden, die polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Fragmente davon aufweisen, welche gegen eine NBD oder gegen NEMO selbst gerichtet sind.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine entzündungshemmende Verbindung der Formel Xa–Xb bereit,
worin X_a eine Membrantranslokationsdomäne mit 6 bis 15 Aminosäureresten und X_b eine NEMO-Bindungssequenz ist. Die Verbindung kann gegebenenfalls eine modifizierende Gruppe am N-Terminus, am C-Terminus oder an beiden aufweisen.
X_b ist eine NEMO-Bindungssequenz mit 6 bis 9 Aminosäureresten. Bei einer Ausführungsform besteht X_b aus der nachfolgenden Struktur: (Y)nX1-X2-X3-X4-X5-X6-(A)m, worin n und m unabhängig voneinander jeweils für 0 oder 1 stehen und A und Y jeweils 1 bis etwa 3 Aminosäurereste aufweisen. Wenn n gleich 1 ist, steht Y vorzugsweise für die Sequenz TA. Wenn m gleich 1 ist, steht A vorzugsweise für die Sequenz QTE. X₁ ist L, A, I oder Norleucin (Nle); X₂ ist D, E, N, Q, Homoserin (Hser) oder 2-Ketopropylalanin (2-Ketopropyl-A); X₃ ist W, F Y, 4-Biphenylalanin (Bpa), Homophenylalanin (Hphe), 2-Naphthylalanin (2-Nal), 1-Naphthylalanin (1-Nal) oder Cyclohexylalanin (Cha); X₄ ist S, A, E, L, T, Norleucin (Nle) oder Homoserin (Hser); X₅ ist W, N, Homophenylalanin (Hphe), 2-Naphthylalanin (2-Nal), 1-Naphthylalanin (1-Nal), O-Benzylserin (SeroBn) oder 3-Pyridylalanin (3-Pal), und X₆ ist L, A, I oder Norleucin (Nle).
Xb ist vorzugsweise eine Sequenz, die ausgewählt ist unter TALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 28), LDWSWLQTE (SEQ ID NO: 29), TALDWSWL (SEQ ID NO: 30); ALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 31), LDWSWLQTE (SEQ ID NO: 32), LDWSWL (SEQ ID NO: 33), TALDWSWLQT (SEQ ID NO: 34), TALDWSWLQ (SEQ ID NO: 35), ALDWSWLQT (SEQ ID NO: 36), LDWSWLQ (SEQ ID NO: 37), LDWSWLQT (SEQ ID NO: 38), ADWSWL (SEQ ID NO: 39), LDWSWA (SEQ ID NO: 40), ADWSWA (SEQ ID NO: 41), LDFSWL (SEQ ID NO: 42), LDYSWL (SEQ ID NO: 43), LDWAWL (SEQ ID NO: 44), LDWEWL (SEQ ID NO: 45), TAADWSWLQTE (SEQ ID NO: 46), ADWSWLQTE (SEQ ID NO: 47), TAADWSWL (SEQ ID NO: 48), AADWSWLQTE (SEQ ID NO: 49), ADWSWL (SEQ ID NO: 51), TAADWSWLQT (SEQ ID NO: 52), TAADWSWLQ (SEQ ID NO: 53), AADWSWLQT (SEQ ID NO: 54), ADWSWLQ (SEQ ID NO: 55), ADWSWLQT (SEQ ID NO: 56), ALDWSWAQTE (SEQ ID NO: 57), LDWSWAQTE (SEQ ID NO: 58), TALDWSWA (SEQ ID NO: 59), LDWSWA (SEQ ID NO: 62), TALDWSWAQT (SEQ ID NO: 63), TALDWSWAQ (SEQ ID NO: 64), ALDWSWAQT (SEQ ID NO: 65), LDWSWAQ (SEQ ID NO: 66), LDWSWAQT (SEQ ID NO: 67), TAADWSWAQTE (SEQ ID NO: 68), ADWSWAQTE (SEQ ID NO: 69), TAADWSWA (SEQ ID NO: 70), AADWSWAQTE (SEQ ID NO: 71), ADWSWAQTE (SEQ ID NO: 72), ADWSWA (SEQ ID NO: 73), TAADWSWAQT (SEQ ID NO: 74), TAADWSWAQ (SEQ ID NO: 75), AADWSWAQT (SEQ ID NO: 76), ADWSWAQ (SEQ ID NO: 77), ADWSWAQT (SEQ ID NO: 78), TALDFSWLQTE (SEQ ID NO: 79), LDFSWLQTE (SEQ ID NO: 80), TALDFSWL (SEQ ID NO: 81), ALDFSWLQTE (SEQ ID NO: 82), LDFSWLQTE (SEQ ID NO: 83), LDFSWL (SEQ ID NO: 84), TALDFSWLQT (SEQ ID NO: 85), TALDFSWLQ (SEQ ID NO: 86), ALDFSWLQT (SEQ ID NO: 87), LDFSWLQ (SEQ ID NO: 88), LDFSWLQT (SEQ ID NO: 89), TALDYSWLQTE (SEQ ID NO: 90), LDYSWLQTE (SEQ ID NO: 91), TALDYSWL (SEQ ID NO: 92), ALDYSWLQTE (SEQ ID NO: 93), LDYSWLQTE (SEQ ID NO: 94), LDYSWL (SEQ ID NO: 95), TALDYSWLQT (SEQ ID NO: 96), TALDYSWLQ (SEQ ID NO: 97), ALDYSWLQT (SEQ ID NO: 98), LDYSWLQ (SEQ ID NO: 99), LDYSWLQT (SEQ ID NO: 100), TALDWAWLQTE (SEQ ID NO: 101), LDWAWLQTE (SEQ ID NO: 102), TALDWAWL (SEQ ID NO: 103), ALDWAWLQTE (SEQ ID NO: 104), LDWAWLQTE (SEQ ID NO: 105), LDWAWL (SEQ ID NO: 106), TALDWAWLQT (SEQ ID NO: 107), TALDWAWLQ (SEQ ID NO: 108), ALDWAWLQT (SEQ ID NO: 109), LDWAWLQ (SEQ ID NO: 110), LDWAWLQT (SEQ ID NO: 111), TALDWEWLQTE (SEQ ID NO: 112), LDWEWLQTE (SEQ ID NO: 113), TALDWEWL (SEQ ID NO: 114), ALDWEWLQTE (SEQ ID NO: 115), LDWEWLQTE (SEQ ID NO: 116), LDWEWL (SEQ ID NO: 117), TALDWEWLQT (SEQ ID NO: 118), TALDWEWLQ (SEQ ID NO: 119), ALDWEWLQT (SEQ ID NO: 120), LDWEWLQ (SEQ ID NO: 121) und LDWEWLQT (SEQ ID NO: 122).
X_a ist eine Membrantransduktionsdomäne, bestehend aus 6–15 Aminosäureresten, vorzugsweise 6–12 oder 6–10 Aminosäureresten. Bevorzugt ist X_a eine Membrantranslokationsdomäne, die mindestens fünf basische Aminosäurereste, vorzugsweise fünf Reste, die unabhängig voneinander ausgewählt sind unter L-Arginin, D-Arginin, L-Lysin und D-Lysin, aufweist. Zu geeigneten Membrantranslokationsdomänen zählen die hier beschriebenen.
Bei einer Ausführungsform ist X_a ausgewählt unter den Aminosäuresequenzen RRMKWKK (SEQ ID NO: 123), YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 124), ygrkkrrgrrr (SEQ ID NO: 125), YARKARRQARR (SEQ ID NO: 126), yarkarrgarr (SEQ ID NO: 127), YARAARRAARR (SEQ ID NO: 128), yaraarraarr (SEQ ID NO: 129), rrmkwkk (SEQ ID NO 130), (R)_y und (r)_y, worin y 6 bis 11 ist. Die Kleinbuchstaben bezeichnen D-Aminosäurereste, und die Großbuchstaben stehen für L-Aminosäurereste.
Beispiele für geeignete Peptide X_a–X_b sind die mit folgenden Sequenzen:
RRMKWKKTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 131), rrmkwkkTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 132), YGRKKRRQRRRTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 133), ygrkkngrrrTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 134), rrrrrrrTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 135), RRRRRRRTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 136), YARKARRQARRTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 137), yarkarrgarrTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 138), YARAARRAARRTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 139), yaraarraarrTALDWSWLQTE (SEQ ID NO: 140), YGRKKRRQRRRLDWSWL (SEQ ID NO: 141), ygrkkrrgrrrLDWSWL (SEQ ID NO: 142), RRMKWKKLDWSWL (SEQ ID NO: 143), rrmkwkkLDWSWL (SEQ ID NO: 144), rrrrrrrLDWSWL (SEQ ID NO: 145), YARAARRAARRLDWSWL (SEQ ID NO: 146), yaraarraarrLDWSWL (SEQ ID NO: 147) und RRRRRRRLDWSWL (SEQ ID NO: 148).
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung können gegebenenfalls modifizierende Gruppen aufweisen, die an den C-Terminus, den N-Terminus oder an beide gebunden sind. Beispielsweise umfassen geeignete modifizierende Gruppen, die an den C-Terminus gebunden sein können, substituierte und unsubstituierte Aminogruppen, z. B. -NH₂-, -NH(Alkyl)- und -N(Alkyl)₂-Gruppen, und Alkoxygruppen, wie geradkettige, verzweigte oder zyklische C₁-C₆-Alkoxygruppen. Eine bevorzugte C-terminale modifizierende Gruppe ist die -NH₂-Gruppe. Geeignete modifizierende Gruppen, die an den N-Terminus gebunden sein können, sind Acylgruppen, wie die Acetylgruppe, und Alkylgruppen, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylgruppen, insbesondere Methyl.
In den entzündungshemmenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Membrantranslokationsdomäne X_a am Amino-Terminus der Verbindung und die NEMO-Bindungssequenz X_b am Carboxyl-Terminus der Verbindung vorhanden sein (X_a–X_b). Alternativ dazu kann bei den entzündungshemmenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung die Membrantranslokationsdomäne X_a am Carboxyl-Terminus der Verbindung und die NEMO-Bindungssequenz X_b am Amino-Terminus der Verbindung vorhanden sein (X_b–X_a)
Zu besonderen entzündungshemmenden Verbindungen gemäß der Erfindung zählen die nachfolgend aufgelisteten:
B. Screening-Assays
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Verfahren zum Screening bezüglich Verbindungen, welche die IKKβ-Funktion deaktivieren oder als deren Antagonisten wirken. Solche Verbindungen können für die Modulation pathologischer Zustände im Zusammenhang mit Veränderungen der IKKβ- oder NF-κB-Proteingehalte nützlich sein.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Verfahren zur Isolation und Identifikation von Bindungspartnern für erfindungsgemäße Proteine, beispielsweise Verbindungen, die mit IKKβ an der NBD dieses Moleküls interagieren oder mit NEMO interagieren und dadurch die NEMO-Interaktion mit IKKβ blockieren. Ein erfindungsgemäßes Protein wird unter Bedingungen, welche die Assoziierung potentieller Bindungspartner mit den erfindungsgemäßen Proteinen zulassen, mit einem potentiellen Bindungspartner oder einem Extrakt oder einer Fraktion einer Zelle vermischt. Nach dem Mischen werden Peptide, Polypeptide, Proteine oder andere Moleküle, die mit einem erfindungsgemäßen Protein assoziiert worden sind, von dem Gemisch abgetrennt. Der an das erfindungsgemäße Protein gebundene Bindungspartner kann dann entfernt und weiter analysiert werden. Zur Identifikation und Isolation eines Bindungspartners kann das gesamte Protein, z. B. das gesamte IKKβ-Peptid, verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Fragment des Proteins verwendet werden. Beispielsweise kann das Peptidfragment mit der NBD verwendet werden, um die Interaktion des IKKβ mit NEMO zu blockieren.
Verschiedene Verfahren können angewandt werden, um einen Extrakt einer Zelle zu erhalten. Zellen können mit physikalischen oder chemischen Aufschlussverfahren aufgeschlossen werden. Beispiele für physikalische Aufschlussverfahren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Beschallung und mechanisches Scheren. Zu Beispielen für chemische Lyseverfahren zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Detergenslyse und Enzymlyse. Der Fachmann kann Verfahren zur Herstellung von Zellextrakten ohne weiteres anpassen, um Extrakte zur Verwendung bei den vorliegenden Verfahren zu erhalten.
Sobald ein Extrakt einer Zelle hergestellt ist, wird der Extrakt entweder mit IKKβ oder mit NEMO unter Bedingungen vermischt, unter denen eine Assoziierung des Proteins mit dem Bindungspartner erfolgen kann. Es können verschiedene Bedingungen verwendet werden, wobei die bevorzugtesten Bedingungen solche sind, die den im Cytoplasma einer menschlichen Zelle vorzufindenden Bedingungen am ähnlichsten sind. Merkmale, wie Osmolalität, pH, Temperatur und die Konzentration des verwendeten Zellextraktes, können verändert werden, um die Assoziierung des Proteins mit dem Bindungspartner zu optimieren.
Nach dem Mischen unter geeigneten Bedingungen wird der gebundene Komplex von dem Gemisch abgetrennt. Zum Abtrennen des Gemisches können verschiedene Techniken eingesetzt werden. Beispielsweise können für ein erfindungsgemäßes Protein spezifische Antikörper zur Immunpräzipitation des Bindungspartnerkomplexes verwendet werden. Alternativ dazu können übliche chemische Abtrenntechniken, wie Chromatographie und Dichtegradientenzentrifugation, verwendet werden.
Nach dem Entfernen der nicht-assoziierten Zellbestandteile, die im Extrakt vorzufinden sind, kann der Bindungspartner mittels herkömmlicher Verfahren von dem Komplex dissoziiert werden. Eine Dissoziation kann beispielsweise durch Verändern der Salzkonzentration oder des pH-Wertes des Gemisches erreicht werden.
Zur Unterstützung der Trennung assoziierter Bindungspartner-Paare aus dem gemischten Extrakt kann das Protein auf einem festen Träger immobilisiert werden. Beispielsweise kann das Protein an eine Nitrocellulosematrix oder an Acrylperlen gebunden sein. Eine Bindung des Proteins an einen festen Träger unterstützt die Trennung der Peptid-Bindungspartner-Paare von anderen im Extrakt vorgefundenen Bestandteilen. Der identifizierte Bindungspartner kann ein einzelnes Protein oder ein aus zwei oder mehr Proteinen bestehender Komplex sein. Alternativ dazu können Bindungspartner mit einem Far-Western Assay gemäß den Prozeduren von Takayama et al., (1997) Methods Mol. Biol. 69, 171–184 oder Sauder et al., (1996) J. Gen. Virol. 77, 991–996, oder durch Verwendung von Epitopmarkierten Proteinen oder GST-Fusionsproteinen identifiziert werden.
Als Alternative können die Nukleinsäuremoleküle, welche die erfindungsgemäßen Peptide codieren, in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet werden. Das Hefe-Zwei-Hybrid-System wurde dazu verwendet, andere Proteinpartnerpaare zu identifizieren, und kann leicht angepasst werden, um die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle einzusetzen (siehe z. B. das StratageneHybrizap^® Zwei-Hybrid-System).
Antikörpersonden werden durch Immunisierung geeigneter Wirtssäuger in geeigneten Immunisierungsprotokollen mit den Peptiden hergestellt. Peptide oder Proteine, welche die NBD aufweisen, haben eine ausreichende Länge oder werden, falls erwünscht, mit geeigneten Trägern konjugiert, wie dies zur Verbesserung der Immunogenizität erforderlich ist. Verfahren zur Herstellung immunogener Konjugate mit Trägern, wie BSA, KLH, oder anderen Trägerproteinen sind dem Fachmann wohlbekannt. Unter manchen Umständen kann eine direkte Konjugation, z. B. mit Carbodiimid-Reagenzien, wirksam sein, in anderen Fällen können Verknüpfungsreagenzien, wie sie von Pierce Chemical Co. geliefert werden, erwünscht sein, um das Hapten zugänglich zu machen. Die Haptenpeptide können z. B. an ihrem Amino- oder Carboxy-Terminus mit einem Cysteinrest erweitert oder mit Cysteinresten durchsetzt sein, um die Verknüpfung mit einem Träger zu erleichtern. Die Verabreichung der Immunogenen wird allgemein durch Injektion über einen geeigneten Zeitraum und unter Verwendung geeigneter Adjuvanzien durchgeführt, wie dies dem Fachmann allgemein verständlich ist. Während des Immunisierungsvorgangs werden Antikörper-Titer genommen, um die Eignung der Antikörperbildung zu bestimmen. Während die auf diese Weise hergestellten polyklonalen Antiseren bei manchen Anwendungen zufriedenstellend sein können, ist für pharmazeutische Zusammensetzungen die Verwendung von monoklonalen Präparaten bevorzugt. Immortalisierte Zellinien, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper absondern, können mit dem Standardverfahren von Kohler & Milstein, (1992) Biotechnology 24, 524–526, oder durch Modifikationen, welche die Immortalisierung von Lymphocyten oder Milzzellen bewirken, wie allgemein bekannt ist, hergestellt werden. Die immortalisierten Zellinien, welche die gewünschten Antikörper sezernieren, werden durch einen Immunassay gescreent, bei dem das Antigen das Peptidhapten, Peptid oder Protein ist.
Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur, welche die gewünschten Antikörper sezerniert, identifiziert ist, können die Zellen entweder in vitro oder durch Herstellung in Ascitesflüssigkeit kultiviert werden. Die gewünschten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturüberstand oder aus dem Ascitesüberstand gewonnen werden. Fragmente der monoklonalen oder der polyklonalen Antiseren, welche den immunologisch signifikanten Abschnitt enthalten, können ebenso als Antagonisten verwendet werden, wie die intakten Antikörper. Die Verwendung immunologisch reaktiver Fragmente, wie der Fab-, Fab'- oder F(ab') 2-Fragmente ist oft vorzuziehen, insbesondere in einem therapeutischen Zusammenhang, da diese Fragmente im allgemeinen weniger immunogen sind als das gesamte Immunoglobulin.
Die Antikörper oder Fragmente können auch mit aktueller Technologie durch rekombinante Mittel hergestellt werden. Antikörperregionen, die spezifisch an die gewünschten Regionen des Proteins binden, können auch im Zusammenhang mit Chimären, die von mehreren Spezies stammen, hergestellt werden. Agenzien, die bei dem obigen Verfahren einem Assay unterzogen werden, können zufällig oder geziehlt ausgewählt oder entwickelt werden. So wie es hier verwendet wird, gilt ein Agens als zufällig ausgewählt, wenn das Agens zufällig ausgewählt wird, ohne die spezifischen Sequenzen zu berücksichtigen, die an der Assoziierung des erfindungsgemäßen Proteins alleine oder mit seinen assoziierten Substraten, Bindungspartnern, usw. beteiligt sind. Ein Beispiel für zufällig ausgewählte Agenzien ist die Verwendung einer chemischen Bibliothek oder einer kombinatorischen Peptidbibliothek oder einer Kulturbrühe eines Organismus.
So wie es hier verwendet wird, gilt ein Agens als gezielt ausgewählt oder gestaltet, wenn das Agens auf nicht-zufälliger Basis unter Berücksichtigung der Sequenz des Zielortes und/oder seiner Konformation im Zusammenhang mit der Wirkung des Agens ausgewählt wird. Agenzien können gezielt ausgewählt oder gezielt entwickelt werden, indem die Peptidsequenzen genutzt werden, welche die NBD auf IKKβ oder die IKK-Bindungsdomäne auf NEMO umfassen. Beispielsweise kann ein gezielt ausgewähltes Peptid-Agens ein Peptid, dessen Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 identisch ist, oder ein Peptid mit konservativen Substitutionen davon sein.
Die Peptidverbindungen nach der Erfindung können mit üblichen Peptidsyntheseverfahren in fester Phase (oder in flüssiger Phase) hergestellt werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Zusätzlich kann die DNA, welche diese Peptide codiert, mit kommerziell erhältlichen Oligonukleotid-Syntheseinstrumentarien synthetisiert und mit üblichen rekombinanten Herstellungssystemen rekombinant hergestellt werden. Die Herstellung durch Peptidsynthese in fester Phase ist erforderlich, wenn nicht-gencodierte Aminosäuren enthalten sein sollen.
C. Assays mit hohem Durchsatz
Einführung
Die Leistung des Screening mit hohem Durchsatz wird genutzt, um nach neuen entzündungshemmenden Verbindungen zu suchen, die in der Lage sind, mit NEMO zu interagieren. Allgemeine Informationen zum Screening mit hohem Durchsatz finden sich z. B. in Cost-Effective Strategies for Automated and Accelerated High-Throughput Screening, IBCS Biomedical Library Series, IBC United States Conferences, 1996; Devlin (Herausgeber), High Throughput Screening, Marcel Dekker 1998; US-Patent Nr. 5,763,263. Assays mit hohem Durchsatz nutzen eine oder mehrere unterschiedliche Assay-Techniken.
Immundiagnostik und Immunassays
Dabei handelt es sich um eine Gruppe von Techniken, die zur Bestimmung spezifischer biochemischer Substanzen, üblicherweise bei geringen Konzentrationen in Komplexgemischen, wie biologischen Fluiden, verwendet werden, die von der Spezifität und der hohen Affinität abhängen, welche entsprechend hergestellte und ausgewählte Antikörper gegenüber ihren komplementären Antigenen zeigen. Eine zu bestimmende Substanz muss zwingend antigen sein – entweder ein immunogenes Makromolekül oder ein haptisch kleines Molekül. Jeder Probe wird eine bekannte, begrenzte Menge spezifischer Antikörper zugegeben, und die Fraktion des mit diesem kombinierenden Antigen, oft als das Verhältnis von gebunden:frei ausgedrückt, wird geschätzt, wobei als Indikator eine Form des Antigens verwendet wird, die mit Radioisotopen (Radioimmunassay), fluoreszierenden Molekülen (Fluorimmunassay), stabilen freien Radikalen (Spin-Immunassay), Enzymen (Enzym-Immunassay) oder anderen leicht unterscheidbaren Markern markiert ist.
Antikörper können auf verschiedene Weisen markiert werden, einschließlich: Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Radioimmunassay (RIA), Fluoreszenz-Immunassay (FIA), Chemilumineszenz-Immunassay (CLIA) und Markierung der Antikörper mit kolloidalen Goldpartikeln (Immunogold).
Zu üblichen Assay-Formaten zählen der Sandwhich-Assay, der kompetitive Assay oder „Competition Assay", der Latex-Agglutinations-Assay, der homogene Assay, das Mikrotiterplatten-Format und der Assay auf Basis von Mikropartikeln.
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
ELISA ist eine immunochemische Technik, welche die Gefahren von Radiochemikalien und die Kosten von Fluoreszenzdetektionssystemen vermeidet. Stattdessen verwendet der Assay Enzyme als Indikatoren. ELISA ist eine Form eines quantitativen Immunassays, der auf der Verwendung von Antikörpern (oder Antigenen) beruht, die mit einer unlöslichen Trägeroberfläche verbunden sind, die dann dazu verwendet wird, das relevante Antigen (oder den relevanten Antikörper) in der Testlösung "einzufangen". Der Antigen-Antikörper-Komplex wird dann detektiert, indem die Aktivität eines entsprechenden Enzyms gemessen wird, das zuvor kovalent an das Antigen (oder den Antikörper) gebunden wurde.
Informationen zu ELISA-Techniken finden sich z. B. in Crowther, ELISA: Theory and Practice (Methods in Molecular Biologie, Nr. 42), Humana Press, 1995; Challacombe & Kemeny, ELISA and Other Solid Phase Immunoassays: Theoretical and Practical Aspects, John Wiley, 1998; Kemeny, A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, 1991; Ishikawa, Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Nr. 27), Elsevier, 1991.
Kolorimetrische Assays für Enzyme
Zur Kolorimetrie gehört jedes Verfahren zur quantitativen chemischen Analyse, bei dem die Konzentration oder die Menge einer Verbindung durch einen Vergleich der Farbe, welche durch die Reaktion eines Reagens sowohl mit Standard- als auch mit Testmengen der Verbindung erzeugt wird, häufig unter Verwendung eines Kolorimeters bestimmt wird. Ein Kolorimeter ist eine Vorrichtung zur Bestimmung der Farbintensität oder von Unterschieden der Farbintensität, sei es visuell oder photoelektrisch.
Übliche kolorimetrische Assays der enzymatischen Aktivität von Beta-Galactosidase sind dem Fachmann wohlbekannt (siehe z. B. Norton et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 281–290). Ein kolorimetrischer Assay kann mit Ganzzell-Lysaten unter Verwendung von O-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (ONPG, Sigma) als Substrat in einem üblichen kolorimetrischen Beta-Galactosidase-Assay durchgeführt werden (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). Automatisierte kolorimetrische Assays sind ebenfalls zur Detektion der Beta-Galactosidase-Aktivität verfügbar, z. B. wie in US-Patent Nr. 5,733,720 beschrieben.
Immunfluoreszenz Assays
Die Immunfluoreszenz oder die Immunfluoreszenzmikroskopie ist ein Verfahren, bei dem ein Antigen oder Antikörper durch Konjugation mit einem fluoreszierenden Farbstoff fluoreszierend gemacht und dann mit dem komplementären Antikörper oder Antigen in einem Gewebeschnitt oder -abstrich zur Reaktion gebracht wird. Die Lage des Antigens oder Antikörpers kann dann durch Beobachtung der Fluoreszenz mittels Mikroskopie unter UV-Licht bestimmt werden.
Allgemeine Informationen zu Immunfluoreszenz-Verfahren finden sich z. B. in Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy: A Practical Approach (The Practical Approach Series, Nr. 218) Oxford University Press; Beutner, (1983) Defined Immunofluorescence and Related Cytochemical Methods, New York Academy of Sciences; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. Detaillierte Erläuterungen von Immunfluoreszenzverfahren, die bei der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, finden sich in den US-Patenten Nr. 5,912,176, 5,869,264, 5,866,319 und 5,861,259.
Biochips – Die Peptide nach der Erfindung können auf einem Array oder Mikroarray zum Screening mit hohem Durchsatz für Agenzien verwendet werden, die entweder mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder mit deren entsprechenden Proteinen interagieren.
Ein „Array" oder „Mikroarray" bezieht sich allgemein auf ein Gittersystem, in dem jede Position oder Sondenzelle von einem definierten Nukleinsäurefragment eingenommen ist, die auch als Oligonukleotide bekannt sind. Die Arrays selbst werden gelegentlich als „Chips" oder „Biochips" bezeichnet, bei denen es sich um hochdichte Nukleinsäure- und Peptid-Mikroarrays handelt, die häufig Tausende von Sondenzellen in verschiedenen Gitterformen aufweisen.
Ein typischer Moleküldetektionschip umfasst ein Substrat, auf dem ein Array von Erkennungsorten, Bindungsorten oder Hybridisierungsorten angeordnet ist. Jeder Ort hat einen entsprechenden Molekülrezeptor, der an ein Molekül mit einer vorbestimmten Struktur gebunden oder mit diesem hybridisiert wird. Die festen Trägersubstrate, die verwendet werden können, um eine Oberfläche für den Array oder den Chip zu bilden, umfassen organische und anorganische Substrate, wie Glas, Polystyrene, Polyimide, Siliciumdioxid und Siliciumnitrid. Zur direkten Bindung von Sonden an die Elektroden muss die Elektrodenoberfläche mit Materialien hergestellt werden, die in der Lage sind, Konjugate mit den Sonden zu bilden.
Sobald der Array hergestellt ist, wird eine Probenlösung auf den Moleküldetektionschip aufgebracht und Moleküle in der Probe binden an oder hybridisieren mit einer oder mehreren Stellen. Die Stellen, an denen die Bindung erfolgt, werden detektiert, und anschließend wird/werden eine oder mehrere Molekülstrukturen in der Probe deduziert. Die Detektion markierter Chargen ist eine übliche Detektionsstrategie und umfasst Radioisotop-, Fluoreszenz- und Biotin-Markierungen, wobei aber auch andere Möglichkeiten verfügbar sind, einschließlich der elektronischen Signaltransduktion.
Polypeptide sind ein beispielhaftes System zum Erforschen der Beziehung zwischen Struktur und Funktion in der Biologie. Wenn die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren zu einem polymeren Molekül kondensiert werden, bilden sie eine breite Vielfalt dreidimensionaler Konfigurationen, die jeweils aus einer bestimmten Aminosäuresequenz und einem bestimmten Lösungsmittelzustand resultieren. Beispielsweise beträgt die Anzahl möglicher Polypeptid-Konfigurationen, welche die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren verwenden, bei einem fünf Aminosäuren langen Polymer über drei Millionen. Typische Proteine sind mehr als einhundert Aminosäuren lang.
Bei typischen Anwendungen kommt eine Komplexlösung, die eine oder mehrere zu charakterisierende Substanzen enthält, in Kontakt mit einem Polymer-Array, das Polypeptide umfasst. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren hergestellt werden, z. B. mittels üblicher Verfahren in fester Phase. Die Standardverfahren umfassen die ausschließliche Synthese in fester Phase, zum Teil in fester Phase durchgeführte Syntheseverfahren, Fragmentkondensation, klassische Lösungssynthese und rekombinante DNA-Technologie (siehe Merrifield, (1963) Am. Chem. Soc. 85, 2149–2152).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die Polypeptide oder Proteine des Arrays an andere Co-Rezeptoren binden, um eine Heteroduplex auf dem Array zu bilden. Bei noch einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide oder Proteine des Arrays an Peptide oder kleine Moleküle binden.
D. Verwendungen für die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, die Entzündung zu modulieren und eine entzündliche Störung in einem Lebewesen zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die Verfahren umfassen die Verabreichung einer entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung in einer Menge, die zur Behandlung einer entzündlichen Störung wirksam ist, an ein Lebewesen.
Eine „entzündliche Störung" soll hier eine Krankheit oder Störung umfassen, die durch eine Entzündung gekennzeichnet oder verursacht ist, von dieser herrührt oder durch diese beeinflusst wird. Eine entzündliche Störung kann durch biologische und pathologische Prozesse, die mit der NEMO- oder IKKβ-Funktion und -Aktivität und/oder mit NF-κB-vermittelten Prozessen zusammen hängen, verursacht sein oder mit diesen zusammen hängen. Zu Beispielen für entzündliche Erkrankungen oder Störungen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, akute und chronische entzündliche Störungen, wie Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, psoriatische Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen (Crohn'sche Erkrankung, Colitis ulcerosa), Sepsis, Vaskulitis und Bursitis; Autoimmunerkrankungen, wie Lupus, Polymyalgia rheumatica, Sklerodermis, Wegener'sche Granulomatose, temporale Arteritis, Cryoglobulinämie und multiple Sklerose; Transplantatabstoßung; Osteoporose; Krebs, einschließlich fester Tumore (z. B. Lunge, CNS, Darm, Niere, und Bauchspeicheldrüse); die Alzheimer'sche Krankheit; Atherosklerose; Virusinfektionen (z. B. HIV oder Grippe); chronische Virusinfektionen (z. B. Epstein-Barr, Cytomegalovirus, Herpes simplex-Virus) und Ataxia telangiectasia.
Pathologische Prozesse beziehen sich auf eine Kategorie biologischer Prozesse, die eine schädliche Wirkung erzeugen. Beispielsweise steht eine unregulierte Expression von NF-κB im Zusammenhang mit entzündungsfördernden Prozessen, die gewissen pathologischen Prozessen zugrunde liegen. Bei einer entzündungshemmenden Verbindung wird hier davon gesprochen, dass sie einen pathologischen Prozess moduliert, wenn die Verbindung den Grad oder die Schwere des Prozesses vermindert. Beispielsweise können durch die Verabreichung entzündungshemmender Verbindungen, welche die Expression oder zumindest eine Aktivität von NEMO oder von IKKβ, verringern, fördern oder auf irgendeine Weise modulieren, entzündungsfördernde Reaktionen verhindert oder pathologische Prozesse moduliert werden.
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können daher zur Behandlung von Erkrankungen mit einer NF-κB-Entzündungskomponente verwendet werden. Solche Erkrankungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Atherosklerose, Asthma (Ray & Cohn, (1999) J. Clin. Invest. 104, 985–993; Christman et al., (2000) Chest 117, 1482–1487) und die Alzheimer'sche Krankheit. Eine Übersicht über Erkrankungen mit einer NF-κB-Entzündungskomponente findet sich in Epstein, (1997) New Eng. J. Med.336, 1066–1071; Lee et al., (1998) J. Clin. Pharmacol.38, 981–993; Brand et al., (1997) Exp. Physiol.82, 297–304.
Pathologische Prozesse, die mit einer entzündungsfördernden Reaktion verbunden sind, bei der die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung für eine Behandlung brauchbar wären, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Asthma, Allergien, wie allergische Rhinitis, Uticaria, Anaphylaxe, Medikamentenunverträglichkeit, Nahrungsmittelunverträglichkeit und dergleichen; kutane Entzündungen, wie Dermatitis, Ekzeme, Psoriasis, Kontaktdermatitis, Sonnenbrand, Alterung und dergleichen; Arthritis, z. B. Osteoarthritis, psoriatische Arthritis, Lupus, Spondyloarthritis und dergleichen. Entzündungshemmende Verbindungen sind auch zur Behandlung einer Lungenerkrankung mit chronischer Obstruktion und chronischer entzündlicher Darmerkrankungen nützlich. Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können ferner dazu verwendet werden, Corticosteroide bei jeder Anwendung zu ersetzen, bei der Corticosteroide eingesetzt werden, einschließlich der Immunsuppression bei Transplantaten und der Krebstherapie.
Der Begriff „Lebewesen" umfasst so, wie er hier verwendet wird, Warmblüter, vorzugsweise Säuger, einschließlich Menschen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lebewesen ein Primat. Bei einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist der Primat ein Mensch.
Der Begriff „Verabreichung" an ein Lebewesen umfasst so, wie er hier verwendet wird, die Ausgabe, Zuführung oder Anwendung einer entzündungshemmenden Verbindung, z. B. einer entzündungshemmenden Verbindung in einer pharmazeutischen Formulierung (wie sie hier beschrieben ist) an ein Lebewesen über jeden geeigneten Abgabeweg der Verbindung an die gewünschte Stelle im Lebewesen, einschließlich der Abgabe auf parenteralem oder oralem Weg, durch intramuskuläre Injektion, subkutane/intradermale Injektion, intravenöse Injektion, bukkale Verabreichung, transdermale Abgabe und die rektale Verabreichung, die Verabreichung über den Darm, die vaginale oder die intranasale Verabreichung oder die Verabreichung über die Atemwege (z. B. durch Inhalation).
Der Begriff „wirksame Menge" umfasst so, wie er hier verwendet wird, eine Menge, die bei den notwendigen Dosierungen und über die notwendigen Zeiträume wirksam ist, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, z. B. ausreicht, um eine entzündliche Störung in einem Lebewesen zu behandeln. Eine wirksame Menge einer entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung kann so, wie sie hier definiert ist, abhängig von solchen Faktoren, wie dem Erkrankungszustand, Alter und Gewicht des Lebewesens, und der Fähigkeit der Verbindung, eine gewünschte Reaktion in dem Lebewesen hervorzurufen, variabel sein. Die Dosiserungsbereiche können angepasst werden, um die optimale therapeutische Reaktion zu ergeben. Eine wirksame Menge ist auch eine, bei der toxische oder schädliche Wirkungen (z. B. Nebenwirkungen) der Verbindung hinter den therapeutisch vorteilhaften Wirkungen zurückstehen.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung (d. h. eine wirksame Dosis) kann im Bereich von etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht, insbesondere etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht und noch bevorzugter etwa 1 bis 10 mg/kg, 2 bis 9 mg/kg, 3 bis 8 mg/kg, 4 bis 7 mg/kg oder 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht, liegen. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass gewisse Faktoren die zur wirksamen Behandlung eines Lebewesens erforderliche Dosis beeinflussen können, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, wie Schwere der Erkrankung oder Störung, Vorbehandlungen, allgemeiner Gesundheitszustand und/oder Alter des Lebewesens und andere vorliegende Erkrankungen. Darüber hinaus kann eine Behandlung eines Lebewesens mit einer therapeutisch wirksamen Menge der entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung eine Einzelbehandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen umfassen. In einem Beispiel wird ein Lebewesen mit einer entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung im Bereich von etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht einmal pro Woche über etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise 2 bis 8 Wochen, insbesondere etwa 3 bis 7 Wochen und noch bevorzugter etwa 4, 5 oder 6 Wochen, behandelt. Es versteht sich auch, dass die wirksame Dosis einer entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung, die zur Behandlung verwendet wird, im Laufe einer bestimmten Behandlung erhöht oder verringert werden kann.
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können alleine oder in Kombination mit anderen Agenzien, die einen bestimmten pathologischen Prozess modulieren, bereitgestellt werden. Beispielsweise kann eine entzündungshemmende Verbindung nach der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen bekannten entzündungshemmenden Agenzien verabreicht werden. Bekannte entzündungshemmende Agenzien, die bei den Verfahren nach der Erfindung verwendet werden können, sind zu finden in Harrison's Principles of Internal Medicine, dreizehnte Auflage, Hrsg. T. R. Harrison et al. McGraw Hill N. Y., NY; und in Physicians Desk Reference, 50. Auflage 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co., wobei hier ausdrücklich auf deren gesamten Inhalt Bezug genommen wird. Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung und die zusätzlichen entzündungshemmenden Agenzien können dem Lebewesen in ein- und derselben pharmazeutischen Zusammensetzung oder in verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen (gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeiten) verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Modulation der Signaltransduktion unter Beteiligung von IκB in einer Zelle bereit. Die Verfahren umfassen das Modulieren der IKKβ-Aktivität, z. B. durch Kontaktieren einer Zelle mit einer entzündungshemmenden Verbindung nach der Erfindung. Die entzündungshemmende Verbindung kann z. B. die Interaktion von NEMO mit IKKβ an der NBD inhibieren und damit die IKKβ-Funktion inhibieren. Die Zelle kann in Kultur oder in situ, d. h. im natürlichen Wirt, vorliegen.
Für diagnostische Verwendungen können die entzündungshemmenden Verbindungen gemäß der Erfindung markiert werden, z. B. mit fluoreszierenden, radioaktiven, chemilumineszenten oder anderen leicht detektierbaren Molekülen. Der Marker kann entweder direkt oder indirekt mit der entzündungshemmenden Verbindung konjugiert werden.
E. Pharmazeutische Präparate
Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger aufweisen. Pharmazeutisch verträgliche Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle, einschließlich solcher, die von Petroleum stammen, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft sind, wie z. B. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösung und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können ebenfalls als flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen, eingesetzt werden. Geeignete pharmazeutische Träger sind in Gennaro et al., (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, beschrieben. Zusätzlich zu dem pharmakologisch aktiven Agens können die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, die Exzipienten und Hilfsstoffe umfassen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparaten erleichtern, die pharmazeutisch zur Abgabe an den Wirkungsort verwendet werden können. Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form, zum Beispiel wasserlösliche Salze. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als entsprechende ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden.
Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle, z. B. Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, z. B. Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol und Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten. Liposome können auch dazu verwendet werden, das Agens zur Abgabe in die Zelle einzukapseln.
Die pharmazeutische Formulierung zur systemischen Verabreichung gemäß der Erfindung kann zur enteralen, parenteralen oder topischen Verabreichung formuliert werden. Tatsächlich können alle drei Arten von Formulierungen gleichzeitig verwendet werden, um die systemische Verabreichung des aktiven Bestandteils zu erreichen.
Geeignete Formulierungen zur oralen Verabreichung umfassen Hart- oder Weichgelatinekapseln, Pillen, Tabletten, einschließlich Filmtabletten, Elixire, Suspensionen, Sirupe oder Inhalationsmittel und deren Formen zur kontrollierten Freisetzung.
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung können auch in pharmazeutische Zusammensetzungen aufgenommen sein, welche die stetige Abgabe der entzündungshemmenden Verbindungen an ein Lebewesen über einen Zeitraum von wenigstens mehreren Wochen bis zu einem Monat oder mehr zulassen. Solche Formulierungen sind in den US-Patenten Nr. 5,968,895 und 6,180,608 B1 beschrieben.
Die entzündungshemmenden Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können auf parenteralem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, transdermalem oder bukkalem Wege verabreicht werden. Alternativ dazu oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf oralem Wege oder durch Inhalation oder Lavage direkt an die Lungen erfolgen. Die verabreichte Dosis hängt von Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Rezipienten, der Art der eventuellen gleichzeitigen Behandlung, der Behandlungshäufigkeit und der Art des gewünschten Effektes ab.
Die entzündungshemmenden Verbindungen, die bei den hier beschriebenen Behandlungsverfahren verwendet werden, können, abhängig von solchen Überlegungen, wie zu behandelnder Zustand, Bedarf einer ortsspezifischen Behandlung, zu verabreichende Wirkstoffmenge, und ähnlichen Überlegungen, systemisch oder topisch verabreicht werden.
Es kann die topische Verabreichung verwendet werden. Jede übliche topische Formulierung, wie eine Lösung, eine Suspension, ein Gel, eine Salbe oder Wundsalbe und dergleichen, kann eingesetzt werden. Die Herstellung solcher topischen Formulierungen ist auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen eingehend beschrieben, wofür z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences ein Beispiel ist. Zur topischen Anwendung können diese Verbindungen auch als Pulver oder Spray, insbesondere in Aerosolform, verabreicht werden. Der aktive Bestandteil kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die zur systemischen Verabreichung angepasst sind. Wie bekannt ist, kann ein Wirkstoff, wenn er systemisch verabreicht werden soll, als Pulver, Pille, Tablette oder dergleichen oder als Sirup oder Elixir zur oralen Verabreichung formuliert werden. Zur intravenösen, intraperitonealen oder intraläsionalen Verabreichung wird die Verbindung als Lösung oder Suspension hergestellt, die durch Injektion verabreicht werden kann. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, diese Verbindungen in Form eines Suppositoriums oder als Formulierung zur allmählichen Freisetzung zur Abgabe unter die Haut oder zur intramuskulären Injektion zu formulieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung durch Inhalation verabreicht werden. Zur Inhalationstherapie kann die Verbindung in einer Lösung vorliegen, die zur Verabreichung durch Dosisinhalatoren mit Maßangabe oder in einer für einen Trockenpulver-Inhalator geeigneten Form brauchbar sind.
Eine wirksame Menge ist die Menge, welche die Aktivität moduliert oder den Anteil eines Zielproteins verändert. Eine bestimmte wirksame Menge variiert je nach Zustand und kann in bestimmten Fällen je nach der Schwere des zu behandelnden Zustandes und dem Ansprechen des Patienten auf die Behandlung variieren. Daher wird eine bestimmte wirksame Menge am besten zur jeweiligen Zeit und am jeweiligen Ort durch Routineversuche bestimmt. Es ist jedoch bei der Behandlung eines Tumors gemäß der vorliegenden Erfindung zu erwarten, dass eine Formulierung, die 0,001 bis 5 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 0,01 bis 1 Prozent, enthält, üblicherweise eine therapeutisch wirksame Menge darstellt. Bei systemischer Verabreichung wird eine Menge im Bereich von 0,01 bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise aber von etwa 0,1 bis 10 mg pro kg, in den meisten Fällen ein therapeutisches Ergebnis bewirken.
Bei der Ausführung der Verfahren dieser Erfindung können die erfindungsgemäßen Verbindungen alleine oder zusammen oder in Kombination mit anderen therapeutischen oder diagnostischen Agenzien verwendet werden. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit anderen Verbindungen verabreicht werden, die bei diesen Zuständen nach allgemein akzeptierter medizinischer Praxis typischerweise verschrieben werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in vivo, üblicherweise in Säugern, vorzugsweise in Menschen, verwendet werden.
Bei noch einer anderen Ausführungsform können die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung mit chemischen Einheiten, einschließlich Proteinen, gekoppelt werden, welche die Funktionen oder die Regulierung von Zielproteinen für einen therapeutischen Nutzen verändern. Diese Proteine können in Kombination andere Inhibitoren von Cytokinen und Wachstumsfaktoren enthalten, die einen zusätzlichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von entzündlichen Störungen bieten können. Zusätzlich können die entzündungshemmenden Verbindungen nach der Erfindung auch durch Phosphorylierung mit einem der dem Fachmann wohlbekannten Vernetzungsmittel zu Biotinylat, Thioat, Acetylat oder Iodinat konjugiert werden.
F. Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinante DNA-Techniken
Gemäß der vorliegenden Erfindung, wie zuvor beschrieben oder in den nachfolgenden Beispielen erörtert, können die herkömmliche Molekularbiologie, die Mikrobiologie und rekombinante DNA-Techniken eingesetzt werden. Solche Techniken sind in der Literatur ausführlich erläutert, siehe z. B. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Glover, (1985) DNA Cloning: A Practical Approach; Gait, (1984) Oligonucleotide Synthesis; Harlow & Lane, (1988) Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Roe etal., (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley, und Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing.
G. Antisense-RNA
Antisense-Moleküle sind RNA- oder einsträngige DNA-Moleküle mit Nukleotidsequenzen, die zu einer angegebenen mRNA komplementär sind. Wenn ein im Labor hergestelltes Antisense-Molekül in Zellen injiziert wird, welche die normale mRNA enthalten, die von einem zu untersuchenden Gen transkribiert wird, kann das Antisense-Molekül ein Basispaar mit der mRNA bilden, was die Translation der mRNA zu einem Protein verhindert. Die resultierende doppelsträngige RNA oder RNA/DNA wird von Enzymen verdaut, die spezifisch an solche Moleküle binden. Daher erfolgt eine Depletion der mRNA, welche die Translation des Genproduktes blockiert, so dass Antisense-Moleküle in der Medizin Verwendung finden, um die Produktion schädlicher Proteine zu blockieren. Verfahren zur Herstellung und Nutzung von Antisense-RNA sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt (siehe z. B. Lichtenstein & Nellen (Herausgeber), Antisense Technology: A Practical Approach, Oxford University Press, 1997; Agrawal & Crooke, Antisense Research and Application (Handbook of Experimental Pharmacology, Nr. 131), Springer Verlag, 1998; Gibson, Antisense and Ribozyme Methodology: Laboratory Companion, Chapman & Hall, 1997; Mol & Van Der Krol, Antisense Nucleic Acids and Proteins, Marcel Dekker; Weiss, Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, 1997; Stanley of al., (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press; Stein & Krieg, (1998) Applied Antisense Oligonucleotide Technology).
Die erfindungsgemäßen Antisense-Moleküle und Ribozyme können nach jedem dem Fachmann bekannten Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuremolekülen hergestellt werden. Hierzu zählen Techniken zur chemischen Synthese von Oligonukleotiden, wie die chemische Phosphoramidit-Synthese in fester Phase. Alternativ dazu können RNA-Moleküle durch Transkription von DNA-Sequenzen in vitro und in vivo erzeugt werden. Diese DNA-Sequenzen können in eine breite Vielfalt von Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotern, wie T7 oder SP6, eingebracht werden.
Alternativ dazu können diese cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zellinien, Zellen oder Gewebe eingebracht werden. RNA-Moleküle können modifiziert werden, um die intrazelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Zugabe flankierender Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorthioat oder 2'-O-Methyl- an Stelle von Phosphodiesterasebindungen in der Hauptkette des Moleküls. Dieses Konzept kann durch die Aufnahme nicht-traditioneller Basen, wie Inosin, Queosin und Wybutosin, sowie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierten Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die nicht so leicht von endogenen Endonukleasen erkannt werden, erweitert werden.
H. Fusionsproteine
Ein Fusionsprotein ist ein Expressionsprodukt, das aus der Fusion zweier Gene resultiert. Ein solches Protein kann z. B. in Studien zur rekombinanten DNA-Expression oder natürlich in bestimmten viralen Onkogenen hergestellt werden, wobei das Onkogen mit gag fusioniert ist.
Die Produktion eines Fusionsprotein ergibt sich manchmal aus der Notwendigkeit, ein kloniertes eukaryontisches Gen der Kontrolle durch einen bakteriellen Promoter zur Expression in einem bakteriellen System zu unterziehen. Sequenzen des bakteriellen Systems werden dann häufig an das eukaryontische Protein gebunden exprimiert. Fusionsproteine werden zur Strukturanalyse, Reinigung, Funktion und Expression heterologer Genprodukte verwendet.
Ein fusioniertes Protein ist ein Hybrid-Proteinmolekül, das hergestellt werden kann, wenn eine interessierende Nukleinsäure durch rekombinante DNA-Techniken in ein Empfängerplasmid eingesetzt wird und das Stop-Codon für ein Plasmidgen verschiebt. Das fusionierte Protein beginnt am Aminoende mit einem Abschnitt der Plasmidproteinsequenz und endet mit dem interessierenden Protein.
Die Produktion von Fusionsproteinen ist dem Fachmann wohlbekannt (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,908,756; 5,907,085; 5,906,819; 5,905,146; 5,895,813; 5,891,643; 5,891,628; 5,891,432; 5,889,169; 5,889,150; 5,888,981; 5,888,773; 5,886,150; 5,886,149; 5,885,833; 5,885,803; 5,885,779; 5,885,580; 5,883,124; 5,882, 941; 5,882,894; 5,882,864; 5,879,917; 5,879,893; 5,876,972; 5,874,304 und 5,874,290). Eine allgemeine Übersicht über die Konstruktion, Eigenschaften, Anwendungen und Probleme im Zusammenhang mit spezifischen Typen von Fusionsmolekülen, die in der klinischen Medizin und in der Forschungsmedizin verwendet werden, findet sich z. B. in Chamow et al., (1999) Antibody Fusion Proteins, John Wiley.
I. Peptid-Mimetika
Peptid-Mimetika, die therapeutisch brauchbaren Peptiden strukturell ähnlich sind, können verwendet werden, um einen gleichwertigen therapeutischen oder prophylaktischen Effek zu erzeugen. Peptid- Mimetika ähneln strukturell einem Muster-Polypeptid (d. h. einem Polypeptid, das eine biochemische Eigenschaft oder pharmakologische Aktivität aufweist), wie z. B. der NBD, wobei bei diesen jedoch eine oder mehrere Peptidbindungen gegebenenfalls durch eine Bindung ersetzt ist/sind, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO-, mittels dem Fachmann bekannter Verfahren und wie in den folgenden Druckschriften näher beschrieben: Weinstein, (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Marcel Dekker; Morley, (1980) Trends Pharmacol. Sci. 1, 463–468 (allgemeine Übersicht); Hudson et al., (1979) Int. J. Pept. Protein Res. 14, 177–185 (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al., (1986) Life Sci. 38, 1243–1249 (-CH₂-S) ; Hann, (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 307–314 (-CH-CH-, cis und trans); Almquist et al., (1980) J. Med. Chem. 23, 1392–1398 (-COCH₂-); Jennings-White et al., (1982) Tetrahedron Lett. 23, 2533 (-COCH₂-); US-Patentanmeldung Nr. 4,424,207 (-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., (1983) Tetrahedron Lett. 24, 4401–4404 (-C(OH)CH₂-) und Hruby, (1982) Life Sci. 31, 189–199 (-CH₂-S-).
Die Markierung von Peptid-Mimetika beinhaltet üblicherweise eine kovalente Bindung eines oder mehrerer Marker, direkt oder durch einen Spacer (z. B. eine Amidgruppe), an (einer) nicht-störenden Positionen) auf dem Peptid-Mimetikum, die durch quantitative Struktur-Aktivitätsdaten und/oder Molekülmodellierung vorhergesagt wird (werden). Solche nicht-störenden Positionen sind meist Positionen, die keinen direkten Kontakt mit dem (den) Makromolekülen) ausbilden (z. B. keine Kontaktpunkte in NBD-NEMO-Komplexen sind), an welche(s) das Peptid-Mimetikum bindet, um die therapeutische Wirkung zu erzeugen. Eine Derivatisierung (z. B. Markierung) von Peptid-Mimetika sollte keinen wesentlichen Einfluss auf die gewünschte biologische oder pharmakologische Aktivität des Peptid-Mimetikums haben. NBD-Peptid-Mimetika können durch Struktur-basierte Wirkstoffentwicklung durch Ersetzen von Aminosäuren mit organischen Einheiten konstruiert werden (siehe z. B. Hughes, (1980) Philos. Trans. R. Soc. Lond. 290, 387–394; Hodgson, (1991) Biotechnol. 9, 19–21; Suckling, (1991) Sci. Prog. 75,323–359).
Die Verwendung von Peptid-Mimetika kann durch die Verwendung von kombinatorischer Chemie zur Erzeugung von Wirkstoffbibliotheken verbessert werden. Die Entwicklung der Peptid-Mimetika kann durch die Identifikation von Aminosäuremutationen unterstützt werden, welche die Bindung einer NBD (z. B. der NBD auf IKKβ) an NEMO erhöhen oder verringern. Beispiele sind die in Tabelle 1 angegebenen Mutationen. Vorgehensweisen, die angewandt werden können, umfassen das Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren (siehe Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582) und die Verwendung des Phagen-Anzeigeverfahrens.
Das Zwei-Hybrid-Verfahren detektiert Protein-Protein-Interaktionen in Hefe (Fields et al., (1989) Nature 340,245–246). Das Phagen-Anzeigeverfahren detektiert die Interaktion zwischen einem immobilisierten Protein und einem Protein, das auf der Oberfläche von Phagen, wie Lambda und M13, exprimiert wird (Amberg et al., (1993) Strategies 6, 2–4; Hogrefe et al., (1993) Gene 128,119–126). Diese Verfahren gestatten eine positive und negative Selektion bei Protein-Protein-Interaktionen und die Identifikation der Sequenzen, welche diese Interaktionen bestimmen.
Allgemeine Informationen zur Peptidsynthese und zu Peptid-Mimetika finden sich z. B. in Jones, (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley, und Bodanszky et al., (1993) Peptide Chemistry: A Practical Textbook, 2. überarbeitete Auflage, Springer Verlag.
J. Transgene Tiere
Transgene Tiere sind genetisch modifizierte Tiere, in die rekombinantes, exogenes oder kloniertes Genmaterial experimentell übertragen wurde. Dieses Genmaterial wird häufig als Transgen bezeichnet. Die Nukleinsäuresequenz des Transgens kann entweder an einer Stelle eines Genoms, an der diese bestimmte Nukleinsäuresequenz sonst normalerweise nicht zu finden ist, oder an der normalen Stelle für das Transgen integriert werden. Das Transgen kann aus Nukleinsäuresequenzen bestehen, die vom Genom derselben Spezies oder einer anderen Spezies als der des Zieltieres erhalten wurden.
Der Begriff „Keimzellinien-transgenes Tier" bezieht sich auf ein transgenes Tier, bei dem die genetische Veränderung oder genetische Information in eine Keimzelle eingebracht wurde, wodurch die Fähigkeit, die genetische Information auf Nachkommen zu übertragen, auf das transgene Tier übertragen wurde. Wenn diese Nachkommenh die Veränderung oder die genetische Information tatsächlich teilweise oder ganz aufweisen, dann sind auch sie transgene Tiere.
Die Veränderung oder die genetische Information kann der Tierspezies, welcher der Empfänger angehört, fremd sein, kann nur dem jeweiligen einzelnen Empfänger fremd sein, oder kann genetische Information sein, die der Empfänger bereits besitzt. Im letztgenannten Fall kann das veränderte oder eingebrachte Gen anders als das native Gen exprimiert werden.
Transgene Tiere können mittels mehrerer verschiedener Verfahren produziert werden, einschließlich Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Gen-Targeting in Embryonenstammzellen und rekombinanter viraler und retroviraler Infektion (siehe z. B. US-Patent Nr. 4,736,866; US-Patent Nr. 5,602,307; Mullins et al., (1993) Hypertension 22, 630–633; Brenin of al., (1997) Surg. Oncol. 6, 99-110; Tuan, (1997) Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Nr. 62, Humana Press).
Es wurde eine Anzahl rekombinanter oder transgener Mäuse produziert, einschließlich solcher, die eine aktivierte Onkogen-Sequenz exprimieren (US-Patent Nr. 4,736,866), das Affen-SV40-T-Antigen (US-Patent Nr. 5,728,915) exprimieren, den Interferonregulierungsfaktor 1 (IRF-1) nicht exprimieren (US-Patent Nr. 5,731,490), eine dopaminerge Dysfunktion zeigen (US-Patent Nr. 5,723,719), mindestens ein menschliches Gen exprimieren, das an der Steuerung des Blutdrucks beteiligt ist (US-Patent Nr. 5,731,489), größere Ähnlichkeit mit den Zuständen aufweisen, die bei einer natürlich auftretenden Alzheimer'schen Krankheit vorliegen (US-Patent Nr. 5,720,936), eine verringerte Fähigkeit zur Vermittlung der Zelladhäsion aufweisen (US-Patent Nr. 5,602,307), ein Rinderwachstumshormon-Gen besitzen (Clutter et al., (1996) Genetics 143, 1753–1760) oder in der Lage sind, eine vollständige menschliche Antikörperantwort zu erzeugen (Zou et al., (1993) Science 262, 1271–1274).
Während Mäuse und Ratten für die meisten transgenen Experimente die Tiere der Wahl sind, ist es in manchen Fällen vorzuziehen oder sogar notwendig, andere Tierspezies zu verwenden. Transgene Verfahren wurden erfolgreich bei verschiedenen nicht-murinen Tieren eingesetzt, einschließlich Schafen, Ziegen, Schweinen, Hunden, Katzen, Affen, Schimpansen, Hamstern, Kaninchen, Kühen und Meerschweinchen (siehe Kim et al., (1997) Mol. Reprod. Dev. 46, 515–526; Houdebine, (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35, 609–617; Petters, (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 643–645; Schnieke et al., (1997) Science 278, 2130–2133; Amoah, (1997) J. Animal Science 75, 578–585).
Das Verfahren der Einbringung von Nukleinsäurefragmenten in rekombinationsfähige Säugerzellen kann jedes Verfahren sein, welches die Co-Transformation mehrfacher Nukleinsäuremoleküle begünstigt. Detaillierte Prozeduren zur Produktion transgener Tiere stehen dem Fachmann ohne weiteres zur Verfügung, einschließlich der Offenbarungen in US-Patent Nr. 5,489,743 und US-Patent Nr. 5,602,307.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die nicht als einschränkend zu verstehen sind, weiter veranschaulicht.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: IDENTIFIKATION DER NEMO-BINDUNGSDOMÄNE AUF IKKB
Zur Identifikation der NEMO-Interaktionsdomäne von IKKβ führten wir in vitro-Pull-Down-Assays (Zhong et al., (1997) Cell 89, 413–424) mit einer bakteriell exprimierten Version von NEMO mit voller Länge, das an seinem NH₂-Terminus mit Glutathion-S-Transferase (GST NEMO; 1A) fusioniert war, durch. Es wurden verschiedene Trunkationsmutanten konstruiert, denen unterschiedliche funktionale Domänen von IKKβ fehlten (katalytische Domäne, Leucin-Zipper und Helix-Loop-Helix; 1A).
Jegliche Subklonierung und Mutagenese von Gesamtlängen-cDNA-Klonen von IKKα und IKKβ wurde mittels PCR unter Verwendung von klonierter Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Die Wildtyp- und Mutanten-IKKβ-cDNA wurden in die KpnI- und NotI-Restriktionsstellen von pcDNA-3 oder pcDNA-3.1-Xpress (Invitrogen) eingesetzt, und alle IKKα-cDNAs wurden in die EcoRI- und Xhol-Stellen derselben Vektoren eingesetzt. FLAG-markierte Versionen beider Kinasen wurden durch Subklonierung in pFLAG-CMV-2 (Sigma) konstruiert. Bei GST-IKKβ-(644-756) wurde das PCR-Fragment in die EcoRI- und Xhol-Stellen von pGEX-4T 1 (Pharmacia) eingesetzt. Gesamtlängen- cDNA, die Human-NEMO codierte, wurde durch Reverse Transkriptase (RT)-PCR aus HeLa-Zellen-mRNA mit dem Expand^TM Long Template PCR System (Boehringer Mannheim) und dem Primerpaar (5'-ATAGACGAATTCAATAGGCACCTCTGGAAG) (SEQ ID NO: 20) und (3'-TAGGACCTCGAGCTACTCAATGCACTCCATG) (SEQ ID NO: 21) erhalten. Das resultierende PCR-Fragment wurde in die EcoRI- und Mol-Stellen von pcDNA-3 oder pcDNA-s.1-xpress eingesetzt. Alle späteren NEMO-Mutanten wurden durch PCR mit Pfu-DNA-Polymerase konstruiert. GST-NEMO wurde durch Subklonieren der Gesamtlängen-cDNA in die EcoRI- und Xhol-Stellen von pGEX-4TI konstruiert.
Diese Mutanten wurden durch in vitro-Translation mit [³⁵S]-Methionine (Input; 1B) markiert, entweder mit GST alleine oder mit GST-NEMO vermischt und unter Verwendung von Glutathion-Agarose präzipitiert. Keine der Mutanten interagierte mit GST allein, während der Wildtyp und alle drei NH₂-terminalen Trunkationen von IKKβ (307–756,458–756 und 486–756) mit GST-NEMO interagierten (1B (rechtes Feld). Im Gegensatz dazu wurde keine der COOH-terminalen Trunkationsmutanten (1-456,1-605 oder 1-644) mit GST-NEMO präzipitiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass NEMO mit einer Region im COOH-Terminus von IKKβ interagiert, der distal zur Helix-Loop-Helix (HLH)-Domäne liegt. Als nächstes wurde eine Mutante konstruiert, die nur aus der Region von Aminosäure 644 (unmittelbar nach der HLH) bis zum COOH-Terminus (Rest 756) von IKKβ bestand. Wie in 1C gezeigt, präzipitierte diese Mutante nicht mit GST, interagierte jedoch mit GST-NEMO, was bestätigt, dass diese Region die Interaktion zwischen diesen beiden Molekülen vermittelt.
Als nächstes wurden die Auswirkungen von IKKβ-(644-756) auf die IL-1β- und TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung durch vorübergehende Transfektion von HeLa-Zellen mit der Mutante zusammen mit einem NF-κB-abhängigen Reporterplasmid (pBIIX-Luciferase) getestet (Kopp & Ghosh, (1994) Science 265, 956–959). Für Transfektionsstudien wurden HeLa- und COS-Zellen in Platten mit vierundzwanzig Vertiefungen (1 × 105 Zellen/Vertiefung) oder mit sechs Vertiefungen (5 × 105 Zellen/Vertiefung) eingeimpft und vor einer DNA-Transfektion mit Fugene6 (Roche) nach den Anweisungen des Herstellers vierundzwanzig Stunden kultiviert. Die Zellen in den Platten mit vierundzwanzig Vertiefungen und sechs Vertiefungen erhielten insgesamt 1 μg bzw. 2 μg DNA. Nach achtundvierzig Stunden wurden die Zellen mit TNT (200 mM NaCl, 20 mM Tris-pH 8,0, 1% Triton-100) lysiert, und das Lysat wurde entweder für einen Immunpräzipitations-Assay oder für einen Luciferase-Assay (Primage Luciferase Assay System) verwendet.
1D zeigt, dass IKKβ-(644-756) die NF-κB-Aktivierung inhibierte, die von diesen Cytokinen in dosisabhängiger Weise induziert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass IKKβ-(644-756) dominantnegativ wirkt, indem er endogenes NEMO aus dem IκB-Kinase-Kernkomplex heraustitriert. Ohne die Rekrutierung von regulierenden Proteinen durch NEMO wird IKKβ refraktorisch gegenüber IL-1β- und TNFα-induzierten Signalen, die sonst seine Aktivierung bewirken sollten. Strukturell besteht NEMO aus umfangreichen α-Helix-Regionen, die zwei auffällige Coiled-coil-Abschnitte und ein Leucin-Zipper-Motiv enthalten, und aus einer COOH-terminalen Zink-Finger-Domäne (2A) (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395,297–300). Frühere Studien, die versuchten, die Region von NEMO zu identifizieren, der für seine Interaktion mit IKKβ erforderlich ist, führten zu widersprüchlichen Ergebnissen (Harhaj et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 15297–15300). Zur Beschäftigung mit dieser Frage wurden GST-Pull-Down-Assays unter Verwendung eines GST-Fusionsproteins von IKKβ-(644-756) (2A) und verschiedener [³⁵S]-Methionin-markierter Trunkationsmutanten von NEMO (2A) durchgeführt. 2A (rechtes Feld) fasst die Ergebnisse dieser Experimente zusammen, bei denen gezeigt wurde, dass IKKβ-(644-756) mit NEMO-(1-196), -(1-302) und -(44-419) interagierte, aber nicht mit NEMO-(197-419) oder -(86-419). Identische Ergebnisse wurden aus Immunpäzipitationsstudien unter Verwendung eines Lysates von COS- oder HEK293-Zellen erhalten, die vorübergehend mit FLAG-markiertem IKKβ und den NEMO-Mutanten transfiziert wurden (Daten nicht gezeigt).
Bei allen Immunpräzipitationen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen gezüchtete HeLa- oder COS-Zellen in 500 μl TNT lysiert. FLAG-markierte Proteine wurden zwei Stunden bei 4°C aus dem Lysat von transfizierten Zellen präzipitiert, wobei 20 μl Anti-FLAG (M2)-konjugierter Agaroseperlen (Sigma) verwendet wurden. Immunpräzipitationen von endogenem IKKβ oder NEMO wurden unter Verwendung von 1 μg spezifischer polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Santa Cruz) plus 20 μl Protein-A-Sepharose (Amersham-Pharmacia) durchgeführt. Für einen Immunblotting-Vorgang wurden die Präzipitate dreimal mit TNT und zweimal mit PBS gewaschen und dann in SDS-Probepuffer suspendiert. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt, auf PVDF-Membranen übertragen und durch verstärkte Chemilumineszenz (Amersham-Pharmacia) sichtbar gemacht.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Interaktionsdomäne zwischen den Resten 44 und 86 liegt, einer Region, welche die erste α-Helix von NEMO enthält. Daher wurde eine Mutante hergestellt, in der eine α-Helix bis zur ersten Coiled-coil-Domäne deletiert wurde (Reste T50-L93; del.αH). Diese Mutante interagierte mit IKKβ-(644-756) (2B). Ferner zeigten Transfektionsstudien mit pBIIX-Luciferase, dass del.αH die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivität inhibierte (2C), was frühere Berichte bestätigt, dass der COOH-Terminus von NEMO, der nicht mit IKKβ interagieren kann, ein dominant-negativer Inhibitor von NF-κB ist (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Rothwart et al., (1998) Nature 395, 297–300). Zusammen genommen zeigen die 1 und 2, dass die Interaktion zwischen IKKβ und NEMO über den COOH-Terminus von IKKβ und die erste α-Helix-Region von NEMO erfolgt. Diese Erkenntnisse legen ein Modell nahe, in dem der NH₂-Terminus von NEMO dieses am IKK-Komplex verankert, wodurch der Rest des Moleküls, der mehrere Protein:Protein-Interaktionsdomänen enthält, frei und zugänglich für eine Interaktion mit stromaufwärtigen Regulatoren der IKK-Funktion bleibt.
BEISPIEL 2: NEMO-REGULIERUNG DER IKKB-FUNKTION DURCH INTERAKTION AN DER NBD
Zur vollständigen Charakterisierung der NEMO-Interaktionsdomäne von IKKβ wurden weitere Trunkationsmutanten zwischen den Resten V644 und S756 (3A) konstruiert. Unmittelbar nach der HLH zeigt die Aminosäuresequenz bis zum Cystein an Position 662 72% Übereinstimmung mit IKKα (in 3A mit α₁ bezeichnet). Daran anschließend ist die Region bis E707 eine Serin-reiche Domäne, von der früher berichtet wurde, sie sei ein Ziel für eine Autophosphorylierung und sie diene zur Abwärtsregulierung der IKKβ-Aktivität nach einer Stimulation durch entzündungsfördernde Cytokine (Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313). Die sich daran anschließende Sequenz enthält bis zur Position 733 keine Serinreste. Mutanten, denen nacheinander jede dieser Regionen fehlt, wurden mit [³⁵S]-Methionin markiert und in GST-Pull-Down-Assays wie zuvor beschrieben verwendet. 3A fasst die Ergebnisse dieser Experimente zusammen, die zeigen, dass keine der IKKβ-Mutanten mit GST-NEMO präzipitierte und dass die Interaktionsdomäne im äussersten COOH-Terminus zwischen den Resten F734 und S756 liegt.
Ein Vergleich dieses kurzen Segmentes von IKKβ mit der entsprechenden Region von IKKα ergibt zwei auffällige Strukturmerkmale (3B). Erstens ist die Sequenz von F734 bis T744 von IKKβ (α2 in 3B) mit der entsprechenden Sequenz in IKKα (L737 bis L742 von IKKβ und L738 bis L743 von IKKα) identisch. Zweitens erstreckt sich die Sequenz von IKKβ über den COOH-terminalen Rest von IKKα (E745) zwölf Aminosäuren weit hinaus, die eine äusserst saure Region umfassen, in der fünf der Reste Glutamate sind (3B). Die deutliche Ähnlichkeit zwischen der α2-Region von IKKβ und dem äussersten COOH-Terminus von IKKα führte zusammen mit früheren Berichten, dass NEMO mit IKKα nicht in vitro interagiert (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395,297–300) zu der Hypothese, dass die NEMO-Interaktionsdomäne der Glutamat-reiche Abschnitt von IKKβ (E745 bis S756) sei.
Um diese Hypothese zu prüfen, wurde eine Trunkationsmutante hergestellt, der diese Region fehlte (1-744; 3C), und ihre Fähigkeit zur Interaktion mit GST-NEMO untersucht. Die Mutante assoziierte sich in gleichem Maße mit GST-NEMO wie der Wildtyp-IKKβ (3C); diese Ergebnisse wurden durch Co-Immunpräzipitation von Epitop-markiertem NEMO und IKKβ-(1-744) aus dem Lysat von vorübergehend transfizierten COS-Zellen bestätigt. Diese Erkenntnisse zeigen, dass die NEMO-Interaktionsdomäne von IKKβ in der α2-Region des COOH-Terminus liegt.
Als nächstes wurden IKKβ-COOH-terminale Trunkationsmutanten verwendet, um die Auswirkungen der NEMO-Assoziierung auf die basale Aktivität und auf die induzierte Aktivität von IKKβ zu testen. 3D zeigt, dass eine Verkürzung von IKKβ bei V644, bei der die Serin-reiche Region entfernt wurde (siehe 3A), zu einem vollständigen Verlust der zugrunde liegenden Autophosphorylierung führte. Im Gegensatz dazu zeigte eine Mutante, welche die Serin-reiche Region (1-733) enthielt, ein deutlich höheres Maß an Autophosphorylierung als der Wildtyp-IKKβ (3 (3D). Interessanterweise war der Grad der Autophosphorylierung von IKKβ-(1-744), der die NEMO-bindende α2-Region enthielt, mit dem identisch, der bei der Wildtyp-Kinase beobachtet wurde. Um die Auswirkungen zu testen, welche diese Mutationen auf die basale Aktivität der Kinase haben, wurden Mutanten vorübergehend in HeLa-Zellen transfiziert, und die NF-κB-Aktivität wurde durch einen Luciferase-Assay, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse in 3D zeigen, dass IKKβ-(1-644) keine NF-κB-Aktivität induzierte, während IKKβ-(1-733) im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte Aktivierung verursachte (3E). Ferner war die durch IKKβ-(1-644) induzierte NF-κB-Aktivität mit der durch den Wildtyp-IKKβ induzierten identisch.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die zugrunde liegende Autophosphorylierung und Kinaseaktivität von IKKβ von der Fähigkeit von NEMO zur Assoziierung mit der Kinase abhängt. Eine Erklärung für diese Beobachtungen kann sein, dass NEMO eine Phosphatase zum IKK-Komplex rekrutiert, welche die IKKβ-Grundfunktion durch Targeting der Serin-reichen Region des COOH-Terminus reguliert. Eine Unfähigkeit zur Bindung von NEMO verhindert daher die Rekrutierung der Phosphatase und bewirkt in dieser Region eine erhöhte Phosphorylierung.
Zur direkten Untersuchung der Auswirkung, die der Verlust der α2-Region auf die katalytische Aktivität von IKKβ hat, wurde ein Immunkomplex-Kinase-Assay mit dem Lysat von transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt (3F). Für Immunkomplex-Kinase-Assays wurden Präzipitate mit TNT und dann mit Kinasepuffer gewaschen (20 mM HEPES pH 7.5, 20 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 2 mM NaF, 2 mM β-Glycerophosphat, 1 mM DTT, 10 μM ATP). Die Präzipitate wurden dann fünfzehn Minuten bei 30°C in 20 μl Kinasepuffer inkubiert, der GST-IκBα-(1-90) und 10 μCi [³²P]-γ-markiertes ATP (Amersham-Pharmacia) enthielt. Das Substrat wurde mit Glutathion-Agarose (Amersham-Pharmacia) präzipitiert und mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt. Die Kinaseaktivität wurde durch Autoradiographie bestimmt. Mit dem Kinasekomplex assoziierte phosphorylierte Proteine erschienen auf den Autoradiographien, da der immunpräzipitierte Komplex vor der GST-Substratpräzipitation nicht entfernt worden war. Die Aktivität von IKKβ (Wildtyp) war in unbehandelten Zellen niedrig, stieg jedoch nach Behandlung mit TNFα deutlich an. In Übereinstimmung mit den in 3E angegebenen Daten war die basale Aktivität von IKKβ-(1-733) deutlich höher als beim Wildtyp; diese Aktivität wurde durch die Behandlung mit TNFα jedoch nicht weiter verstärkt (3F). Ferner waren die basale Aktivität und die TNFα-induzierte katalytische Aktivität von IKKβ-(1-744) identisch mit der Aktivität von IKKβ (WT). Neben phosphorylierenden GST-IκBαs wurden auch autophosphorylierende IKKβ-Proteine detektiert (3F, obere Banden). Nach einer TNFα-Behandlung wurden IKKβ (WT) und IKKβ-(1-744) rasch autophosphoryliert, während die bereits hohe basale Phosphorylierung von IKKβ-(1-733) nur geringfügig verstärkt wurde (3F). Eine frühere Studie zeigte, dass die Autophosphorylierung zur Abwärtsregulierung der TNFα-induzierten IKKβ-Aktivität dient, indem es Konformationsänderungen innerhalb des Proteins verursacht (Delhase et al., (1999) Science 284,309-313). Zusammen genommen zeigen diese Erkenntnisse (3D–F), dass in Abwesenheit von NEMO IKKβ autophoshoryliert, basal aktiv und refraktorisch gegenüber TNFα-induzierten Signalen wird, die anzeigen, dass NEMO eine grundlegende Rolle bei der Abwärtsregulierung sowie bei der Aktivierung der IKKβ-Aktivität spielt.
Eine zusätzliche Bande, die ein phosphoryliertes Protein darstellt, erschien nur in den Proben von TNFα-induziertem IKKβ (WT) and in IKKβ-(1-744)-transfizierten Zellen (3F). Das Molekulargewicht dieses Proteins (49 kDa) weist deutlich darauf hin, dass es sich dabei um endogenes NEMO handelt, das mit dem präzipitierten Komplex assoziiert ist. Dies wird durch die Abwesenheit der Bande in beiden Präzipitaten (+/–TNFα) von mit IKKβ-(1-733)-transfizierten Zellen gestützt. Dieses Protein wurde als phosphoryliertes NEMO identifiziert, indem der präzipitierte Komplex in SDS dissoziiert und [³²P]-markiertes NEMO unter Verwendung spezifischer Anti-NEMO- Antikörper erneut immunpräzipitiert wurde. Eine induzierte Phosphorylierung von NEMO kann daher eine weitere Stufe der Regulierung der Aktivität des IKK-Komplexes darstellen.
BEISPIEL 3: IDENTIFIKATION DER NBD AUF IKKA
Da die α2-Region von IKKβ dem COOH-Terminus von IKKα sehr ähnlich ist (3B), wurde die Fähigkeit von IKKα zur Interaktion mit NEMO getestet.
Immunpräzipitationen aus dem Lysat von COS-Zellen, die vorübergehend mit xpress-markiertem NEMO zusammen mit FLAG-markierten Versionen von IKKα oder IKKβ transfiziert waren, wurden unter Verwendung von Anti-FLAG durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. 4A zeigt, dass NEMO mit IKKβ und IKKα gleich gut interagierte. Es ist möglich, dass die Interaktion mit IKKα in diesem Experiment nicht direkt ist, sondern stattdessen durch die Bildung eines Komplexes bedingt ist, der endogenes IKKβ, FLAG-IKKα und Xpress-NEMO enthält. Daher wurde ein GST-Pull-Down-Assay durchgeführt, bei dem GST-NEMO und [³⁵S]-Methionin-markierte Versionen von Wildtyp-IKKα oder eine trunkierte IKKα-Mutante, der die acht COOH-terminalen Aminosäuren fehlten (1-737: 4B), verwendet wurden. In Übereinstimmung mit den oben dargelegten Erkenntnissen (4A), aber im Gegensatz zu früheren Berichten (Mercurio et al., (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 1526–1538; Yamaoka et al., (1998) Cell 93, 1231–1240; Rothwarf et al., (1998) Nature 395, 297–300), interagiert Wildtyp-IKKα mit NEMO in vitro, während dies bei der trunkierten Mutante nicht der Fall war (4B). Diese Ergebnisse zeigen nicht nur, dass IKKα mit NEMO interagiert, sondern auch, dass dies über die COOH-terminate Region erfolgt, welche die sechs Aminosäuren enthält, die IKKα und der α2-Region von IKKβ gemeinsam sind (3B). Gen-Targeting-Studien zeigten deutliche Unterschiede in der Aktivierung von IKKα und IKKβ durch TNFα (Woronicz et al., (1997) Science 278, 866–869; Zandi et al., (1997) Cell 91, 243–252; Mercurio et al., (1997) Science 278, 860–866; DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548–554; Régnier et al., (1997) Cell 90, 373–383).
Die vorliegenden Erkenntnisse zeigen, dass die Grundlage dieses Unterschiedes nicht durch unterschiedliche Rekrutierung von NEMO bedingt ist (Delhase et al., (1999) Science 284, 309–313; Takeda et al., (1999) Science 284, 313–316; Hu et al., (1999) Science 284, 316–20; Li et al., (1999) Science 284, 321–325; Li et al., (1999) J. Exp. Med. 189, 1839–1845; Li et al., (1999) Genes Dev. 13, 1322–1328; Tanaka et al., (1999) Immunity 10, 421–429). Stattdessen liegt der Unterschied höchstwahrscheinlich in der Fähigkeit jeder Kinase, NEMO-assoziierte Signalkomponenten in eine Aktivierungsantwort zu integrieren, vermutlich durch Unterschiede hinsichtlich der inhärenten regulierenden Merkmale der jeweiligen Kinasen.
Weitere Indizien, dass diese kurze COOH-terminale Sequenz die NEMO-Interaktionsdomäne des IKK bildet, wurden erhalten, als wir die Fähigkeit der jüngst beschriebenen IKK-verwandten Kinase IKKi (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362) zur Interaktion mit NEMO testeten. Ein Sequenzvergleich mit IKKα und IKKβ (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362; Woronicz et al., (1997) Science 278, 866–869; Zandi et al., (1997) Cell 91, 243–52; Mercurio et al., (1997) Science 278, 860–866; DiDonato et al., (1997) Nature 388, 548–554; Régnier et al., (1997) Cell 90, 373–383) zeigte, dass IKKi nicht die α2-Region in seinem COOH-Terminus (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362) enthält, und in Übereinstimmung damit, dass dies die NEMO-Bindungsdomäne ist, wurde festgestellt, dass IKKi in Pull-Down-Assays nicht mit GST-NEMO interagiert (4C). Diese Erkenntnis zeigt, dass NEMO nicht nur für die funktionale Aktivität von IKKi erforderlich ist, und dies wird durch die Unfähigkeit von IKKi, auf Signale anzusprechen, die durch TNFα oder IL-1β induziert werden (Shimada et al., (1999) Int. Immunol. 11, 1357–1362), belegt.
BEISPIEL 4: MUTATION VON AMINOSÄURERESTEN IN DER NBD
Nachdem festgestellt wurde, dass die α2-Region von IKKβ und die entsprechenden sechs Aminosäuresequenzen von IKKα für die Interaktion mit NEMO [als NEMO-Bindungsdomäne (NBD) bezeichnet] kritisch sind, wurde eine Deletionsmutante in IKKβ konstruiert, der die sechs Aminosäuren von L737 bis L742 fehlten (del. NBD). Diese Deletionsmutante band nicht an GST-NEMO (4D). Eine Untersuchung der vorhergesagten strukturellen und biochemischen Merkmale der NBD im Zusammenhang mit umgebenden Resten deutet darauf hin, dass sie eine unflexible, hydrophobe „Tasche" innerhalb einer hydrophilen Region des IKKβ-COOH-Terminus bildet (4E). Dies legt ein Modell nahe, bei dem die NBD in die erste α-Helix-Region von gebundenem NEMO eingebettet wird (2), was verhindert, dass sie einer wässrigen Umgebung ausgesetzt ist, wodurch eine starke intermolekulare Interaktion bewahrt wird. Ob die Interaktion tatsächlich von dieser Hydrophobizität abhängt, bleibt noch festzustellen; wir fanden jedoch heraus, dass eine Substitution von W739 oder W741 mit Alanin die Assoziierung von NEMO mit IKKβ verhinderte (4F). Daher ist jeder dieser hydrophoben Tryptophanreste zur Bewahrung einer funktionalen NBD kritisch. Zusätzlich verhinderte eine Mutation von D738 zu Alanin ebenfalls die NEMO-Interaktion, was zeigt, dass ein negativ geladener Rest an dieser Position für die NBD-Funktion erforderlich ist. Im Gegensatz zu diesen Mutationen hatte eine Substitution von L737, S740 oder L742 mit Alanin keinen Einfluss auf die NEMO-Bindung. Um die Auswirkungen dieser Alanin-Substitutionen auf die IKKβ-Funktion zu testen, wurden HeLa-Zellen mit jeder der Punktmutanten, zusammen mit einem pBIIX-Luciferase-Reporter, co-transfiziert. In Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass die basale Aktivität von IKKβ in Abwesenheit von assoziiertem NEMO zunimmt, aktivierten Mutanten von IKKβ-(1-733) (3E), die nicht an NEMO banden (D738A, W739A und W741A) NF-κB in stärkerem Maße als Wildtyp-IKKβ oder IKKβ-(1-744) (4G). Im Gegensatz dazu induzierten Mutanten, die Substitutionen enthielten, welche die NEMO-Assoziierung nicht störten (L737A, S740A und L742A), NF-κB in gleichem Maße wie die Kontrollen. Diese Ergebnisse zeigen, dass NEMO eine kritische Rolle bei der Abwärtsregulierung der intrinsischen IKKβ-Aktivität spielt.
Weitere Mutationen der NBD wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die NEMO-Bindung an IKKβ zu beeinflussen, analysiert (siehe Tabelle 1), wobei der in Beispiel 3 erläuterte GST-Pull-Down-Assay verwendet wurde.
Tabelle 1
BEISPIEL 5: AGENZIEN, DIE MIT DER NBD INTERAGIEREN, UM DIE NEMO-BINDUNG ZU BLOCKIEREN
Die relativ geringe Größe der NBD macht sie zu einem attraktiven Ziel für die Entwicklung von Verbindungen, die darauf gerichtet sind, den IKK-Kernkomplex aufzuschließen. Die Relevanz dieses Vorgehens wurde untersucht, indem zellpermeable Peptide entwickelt wurden, welche die IKKβ-NBD umspannen, und ihre Fähigkeit, die IKKβ-NEMO-Interaktion zu dissoziieren, bestimmt wurde.
Die Sequenzen der beiden NBD-Peptide, die bei dieser Studie verwendet wurden, waren [DRQIKIWFQNRRMKWKK]TALDWSWLQTE (Wildtyp) (SEQ ID NO: 18) und [DRQIKIWFQNRRMKWKK]TALDASALQTE (Mutante) (SEQ ID NO: 19). Die Antennapedia-Homeodomäne-Sequenz (Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444–10450; US-Patent Nr. 5,888,762; US-Patent Nr. 6,015,787; US-Patent Nr. 6,080,724) ist in Klammern angegeben, und die Positionen der Wto A-Mutationen sind unterstrichen. Beide Peptide wurden in DMSO bis zu einer Stammkonzentration von 20 mM gelöst. Bei allen Experimenten unterschieden sich die Kontrollen mit DMSO alleine nicht von den Peptid-Kontrollen.
Das Wildtyp-NBD-Peptid bestand aus der Region von T735 bis E745 von IKKβ, die mit einer Sequenz fusioniert war, die von der dritten Helix der Antennapedia-Homeodomäne abgeleitet war, welche nachweislich die Membrantranslokation vermittelt (Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450). Die Mutante war identisch, wobei jedoch die Tryptophanreste (W739 und W741) in der NBD zu Alanin mutiert waren. 5A zeigt, dass die NBD (WT), aber nicht die Mutante, dosisabhängig einen in vitro-Pull-Down von [³⁵S]-markiertem IKKβ mittels GST-NEMO und von [³⁵S]-markiertem NEMO mittels GST- IKKβ-(644-756) inhibierte. Zur Untersuchung der Fähigkeit der NBD-Peptide, in Zellen einzudringen und die IKKβ-NEMO-Interaktion zu inhibieren, wurden HeLa-Zellen mit den Peptiden über unterschiedliche Zeiträume inkubiert, und der IKK-Komplex wurde mittels Anti-NEMO immunpräzipitiert. In Übereinstimmung mit den in vitro-Daten (5A) unterbrach der Wildtyp, aber nicht die Mutante, die Bildung des endogenen IKK-Komplexes (5B).
BEISPIEL 6: AGENZIEN, WELCHE DIE NEMO-FUNKTION BLOCKIEREN
Als nächstes wurden die Auswirkungen der NBD-Peptide auf die Signal-induzierte Aktivierung von NF-κB untersucht. Nach einer Transfektion der HeLa-Zellen mit dem pBIIX-Luciferase-Reporter wurden die Zellen mit Wildtyp- oder Mutanten-Peptiden vorinkubiert und mit TNFα behandelt, und die NF-κB-Aktivierung wurde durch den Luciferase-Reporter-Assay bestimmt. Wie in 5C (linkes Feld) gezeigt, inhibierte das Wildtyp-NBD-Peptid die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung, während die Mutante keine Wirkung zeigte. Interessanterweise wurde die basale NF-κB-Aktivität durch Behandlung mit dem Wildtyp-Peptid verstärkt (5C, rechtes Feld); diese Erkenntnis stimmt mit Ergebnissen einer früheren Mutationsanalyse (3E–F und 4G) überein. Dies zeigt, dass das Entfernen von NEMO die basale, intrinsische Aktivität von IKK erhöht, während es dessen Ansprechen auf TNFα ausschaltet. Eine weitere Analyse mit Electrophoretic-Mobility-Shift-Assays (EMSA) zeigte ebenfalls, dass nur das Wildtyp-NBD-Peptid die TNFα-induzierte Aktivierung und die Kerntranslokation von NF-κB inhibierte (5D). Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Abgabe eines intakten NBD-Peptides in Zellen die IKKβ-NEMO-Interaktion stört und verhindert, dass entzündungsfördernde Signale NF-κB aktivieren. Im Gegensatz dazu zeigt eine Transduktion mit einem Peptid, das Mutationen an den Tryptophanresten enthält, die für die Bewahrung der NEMO-Interaktion kritisch sind, keine Wirkung.
BEISPIEL 7: AGENZIEN, DIE ZUR ABWÄRTSREGULIERUNG VON E-SELEKTIN BEFÄHIGT SIND
Viele an der Einleitung und Bewahrung entzündlicher Reaktionen beteiligte Protein benötigen die NF-κB-Aktivierung zur induzierten Expression ihrer Gene (Ghosh et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 225–260; May & Ghosh, (1998) Immunol. Today 19, 80–88). Ein solches Protein, E-Selektin, ist ein Leukocyten-Adhäsionsmolekül, das auf der Lumenoberfläche vaskulärer Endothelzellen nach Aktivierung durch entzündungsfördernde Stimuli, wie IL-1 oder TNFα, exprimiert wird (Pober et al., (1986) J. Immunol. 436, 1680–1687; Bevilacqua et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9238-9242; Collins et al., (1995) FASEB J. 9, 899–909). Die Expression von E-Selektin und anderen NF-κB-abhängigen Adhäsionsmolekülen ist entscheidend für das Einfangen und die Leukocyten-Rekrutierung an den Orten von akuten und chronischen Entzündungen. Zur Beurteilung des entzündungshemmenden Potentials des NBD-Peptids wurden primäre humane Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC) mit den Wildtyp- und Mutanten-Peptiden vorbehandelt und die E-Selektin-Expression mit TNFα induziert. In Übereinstimmung mit den Auswirkungen auf die basale NF-κB-Aktivierung (5C) induzierte das Wildtyp-NBD-Peptid ein geringes Maß an Expression von E-Selektin (5E). Nach einer TNFα-Behandlung verringert der Wildtyp, aber nicht die Mutante, die Expression von E-Selektin deutlich (5E). Die Inhibition durch das Wildtyp-NBD-Peptid verringerte die Expression auf das Maß, das durch das Peptid in Abwesenheit von TNFα induziert wird.
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung kann auf zwei Ebenen betrachtet werden. Erstens wurden von den Anmeldern die strukturellen Erfordernisse für die Assoziierung von NEMO mit den IKKβs erkannt und festgestellt, dass die Assoziierung mit IKKβ von drei Aminosäuren (D738, W739 und W741) innerhalb der NBD abhängt. Ferner dient NEMO nicht nur zur Aktivierung von IKKβ, sondern spielt auch eine kritische Rolle bei der Unterdrückung der intrinsischen, basalen Aktivität des IKK-Komplexes. Die zweite Ebene von Bedeutung ist die offensichtliche klinische Verwendung für Wirkstoffe, welche die NBD anzielen. Die Anmelder zeigten, dass ein zellpermeables Peptid, welches die NBD umfasst, nicht nur die TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung inhibieren, sondern auch die Expression von E-Selektin, einem NF-κB-abhängigen Target-Gen, in primären humanen Endothelzellen verringern kann. Die NBD ist nur sechs Aminosäuren lang, und es gehört damit zum Können eines Fachmanns, peptidmimetische Verbindungen zu entwickeln, welche den IKK-Kernkomplex aufschließen. Da der Aufschluss des Komplexes eine Zunahme der basalen Aktivität des IKK bewirkt, können bei einer Behandlung mit einer NBD-Targeting-Verbindung toxizitätsbedingte Probleme, z. B. aufgrund einer Hepatocyten-Apoptose, die durch Verabreichung von Wirkstoffen entstehen, welche die Aktivität von NF-κB vollständig ausschalten, vermieden werden. Daher ist die Identifikation der NBD eine Möglichkeit zur Entwicklung neuer entzündungshemmender Wirkstoffe, die verhindern, dass Aktivierungssignale den IKK-Komplex erreichen, aber dennoch ein geringes Maß an NF-κB-Aktivität aufrecht erhalten und potentielle toxische Nebenwirkungen vermeiden.
BEISPIEL 8: NBD-PEPTID-VERMITTELTE INHIBIERUNG ENTZÜNDLICHER REAKTIONEN IN VIVO
Zunächst wurde die Fähigkeit des NBD-Peptids, entzündliche Reaktionen in Tieren zu inhibieren, untersucht, wobei zwei verschiedene Modelle einer akuten Entzündung verwendet wurden. Im ersten Modell wurde mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) ein Ohrenödem in Mäusen induziert, und die Effekte einer topischen Verabreichung der NBD-Peptide wurden bestimmt. Ein Ohrenödem wurde mit PMA in Replikatgruppen von Mäusen gleichen Alters und Geschlechts induziert, wie zuvor beschrieben (Chang et al., (1987) Eur. J. Pharmacol. 142, 197–205). Zwanzig μl NBD-Peptide (200 μg/Ohr), Dexamethason (40 μg/Ohr) oder Vehikel (DMSO: Ethanol; 25:75 v/v) wurden dreissig Minuten vor und dreissig Minuten nach Anwendung von 20 μl in Ethanol gelöstem PMA (5 μg/Ohr) topisch auf das rechte Ohr von Mäusen appliziert. Die Ohrenschwellung wurde sechs Stunden nach der PMA-Application mit einer Mikrolehre gemessen und als mittlere Differenz der Dicke zwischen dem behandelten (rechten) und dem unbehandelten (linken) Ohr ausgedrückt. Eine statistische Analyse der Daten wurde mit dem Studenten-t-Test durchgeführt. Dabei wurde ein Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet.
6A zeigt, dass das Wildtyp-Peptid die PMA-induzierte Ohr-Verdickung deutlich verringerte (77 ± 3% Inhibierung; p < 0,05), und zwar auf den mit Dexamethoson beobachteten Wert (82 ± 9% Inhibierung; p < 0,05). Im Gegensatz dazu war der mit einer äquivalenten Dosis der Mutante beobachtete Effekt unbedeutend (p = 0,09). Keines der Peptide zeigte eine Wirkung, wenn es in Abwesenheit von PMA verabreicht wurde (nicht gezeigt).
In einem zweiten Modell wurde in Mäusen durch intraperitoneale (i. p.) Injektion von Zymosan alleine oder in Kombination mit Dexamethason oder den NBD-Peptiden eine Peritonitis induziert. Bei der Zymosan-induzierten Peritonitis wurde eine Messung von Peritonealexsudaten und Entzündungszellkollektionen von Replikatgruppen von Mäusen gleichen Alters und Geschlechtes (C57BL/6NCR) wie zuvor beschrieben durchgeführt (Getting et al., (1998) Immunology 95, 625–630). Gruppen von Tieren wurden gleichzeitig ein ml Zymosan (1 mg/ml) und Dexamethason (100 mg/ml) oder die NBD-Peptide (200 mg/ml) injiziert. Die in den entzündlichen Exsudaten vorhandene Konzentration von NOX (Nitrat plus Nitrit) wurde mit einem kolorimetrischen Assay-Kit (Alexis Corporation) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Wie in 6B gezeigt, verursachte die Zymosan-Injektion eine Akkumulation von entzündlichen Exsudatfluiden und eine Migration polymorphonukleärer Zellen (PMN) in das Peritoneum dieser Tiere. Die Behandlung von Mäusen mit Wildtyp-NBD-Peptid oder Dexamethason verringerte deutlich die Exsudatbildung und die PMN-Akkumulation, während die Mutante keine Wirkung zeigte.
Verschiedene in vivo-Studien zeigten, dass NO eine Rolle bei der Exsudatbildung und bei der Leukocyten-Migration zu Entzündungsorten spielt (lalenti et al., (1992) Eur. J. Pharmacol. 211, 177-182; lalenti et al., (1993) Br. J. Pharmacol. 110, 701–706; luvone et al., (1998) Br. J. Pharmacol. 123, 1325–1330). Daher wurden die Auswirkungen der NBD-Peptide auf die NOX-Akkumulation in den Peritonealexsudaten von Zymosan-behandelten Mäusen untersucht. 6C (unteres Feld) zeigt, dass Dexamethason und Wildtyp-Peptid NOX um 86 ± 7% bzw. um 66 ± 4% verringerten, während die Mutante keine Wirkung zeigte. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die zeigen, dass die Verringerung der Exsudatbildung und der Zellakkumulation eng mit der Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und der Verringerung der NO-Bildung korrelieren (D'Acquisto et al., (1999) Eur. J. Pharmacol. 369, 223–236; D'Acquisto et al., (1999) Naunyn-Schmeideberg's Arch. Pharmacol. 360, 670–675). Das Wildtyp-NBD-Peptid ist daher ein wirksamer Inhibitor von Entzündungen in Tierversuchsmodellen.
BEISPIEL 9: INHIBIERUNG DER OSTEOKLASTEN-DIFFERENZIERUNG DURCH DAS NBD-PEPTID
Die Prozesse der Knochen-Morphogenese und -remodellierung erfordern das Beibehalten eines Gleichgewichtes zwischen der Synthese der Knochenmatrix durch Osteoblasten und der Knochenresorption durch Osteoklasten (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66–80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357). Knochen-resorbierende Osteoklasten sind mehrkernige Riesenzellen, die sich aus Myeloid-Präkursoren und verschiedenen löslichen Faktoren, wie Kolonie-stimulierendem Faktor-1 (CSF-1), InterLeucin-1 (IL-1), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), IL-6 und IL-11 differenzieren (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66–80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357), welche die Osteoklasten-Differenzierung in unterschiedlichen Phasen beeinflussen. Ein für die Osteoclastogenese kritischer Faktor ist das vor kurzem beschriebene, als RANKL (Rezeptor-Aktivator des NF-κB-Liganden) bezeichnete Molekül, das auch als ODF (Osteoklasten-Differenzierungsfaktor), OPGL (Osteoprotegerin-Ligand) und TRANCE (durch TNF-verwandtes, aktivierungsinduziertes Cytokin) bekannt ist (Kong et al., (1999) Nature, 397, 315–323; Lacey et al., (1998) Cell 93, 165–176; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357; Wong et al., (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 715–724; Yasuda et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3597–3602). Der Rezeptor für RANKL ist ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie mit der Bezeichnung RANK (Rezeptor-Aktivator von NF-κB) (Anderson et al., (1997) Nature 390, 175–179; Dougall et al., (1999) Genes Dev. 13, 2412–2424), und die Bindung von RANKL induziert eine NF-κB Aktivierung (Anderson et al., (1997) Nature 390, 175-179; Darnay et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 20551–20555; Darnay et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 7724–31; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345–357; Wong et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 28355-28359). Zudem hängt die Osteoklasten-Differenzierung von der NF-κB-Aktivierung ab, und Gene-Targeting-Studien haben gezeigt, dass reife Osteoklasten sich in Mäusen, denen die NF-κB-Untereinheiten p50 und p52 fehlen, nicht entwickeln (Franzoso et al., (1997) Genes Dev.11, 3482-3496).
Die Osteoporose ist eine zur schwerer Debilität führende Erkrankung, die durch einen weitgehenden Verlust an Knochenmasse gekennzeichnet ist, der durch Osteoklasten-abhängige Knochenresorption vermittelt wird (Suda et al., (1992) Endocr. Rev. 13, 66–80; Suda et al., (1999) Endocr. Rev. 20, 345-357). Es ist daher möglich, dass eine selektive Inhibierung der NF-κB-Aktivierung in Osteoklasten- Präkursorzellen eine Osteoklasten-Differenzierung verhindern und die Grundlage für therapeutisch wirksame Wirkstoffe zur Behandlung von Osteoporose liefern würde. Daher wurde der Effekt der NBD-Peptide auf die Osteoklasten-Differenzierung untersucht, wobei ein in vitro-Modell wie zuvor beschrieben verwendet wurde (Jimi et al., (1999) Exp. Cell Res. 247, 84–93). In Gewebekulturschalen mit 48 Vertiefungen plattierte Maus-Knochenmarkszellen wurden mit humanem Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF; 20 ng/ml) und Human-RANKL (100 ng/ml) sechs Tage in Abwesenheit oder in Gegenwart verschiedener Konzentrationen (6,25, 12,5 und 25 mM) einer Mutante oder eines Wildtyp-NBD-Peptids inkubier. Dann wurden die Zellen fixiert und auf den Osteoklasten-phänotypischen Marker Tartrat-resistente Säurephosphatase (TRAP) hin eingefärbt, und TRAP-positive, mehrkernige Zellen, die mehr als drei Kerne enthielten, wurden als Osteoklasten gezählt. Dreifach-Proben wurden gezählt, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD berechnet. Wie in 7 gezeigt, inhibierte das Wildtyp-Peptid, nicht aber das Mutanten-Peptid, dosisabhängig die Osteoklasten-Differenzierung.
Diese Daten zeigen, dass der Aufschluss des IKK-Kernkomplexes durch ein zellpermeables NBD-Peptid, das die NF-κB-Aktivierung inhibiert, eine RANKL-induzierte Osteoklasten-Differenzierung verhindert, was zeigt, dass Wirkstoffe, die spezifisch gegen NBD gerichtet sind, zur Behandlung von Osteoporose wirksam sind. Als Erweiterung dieser in vitro-Studien können dieselben Peptide hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Osteoporose in vivo analysiert werden. Ovarektomierte Mäuse (Charles River Labs), die eine schwere Osteoporose zeigen, werden mit den NBD-Peptiden behandelt, und die Auswirkungen auf die Knochendichte werden über einen Behandlungszeitraum bestimmt.
BEISPIEL 10: AUSWIRKUNG VON NBD-PEPTIDEN AUF ANDERE NF-κB-VERMITTELTE STÖRUNGEN
Zusätzlich ist es auch möglich, die Auswirkungen der NBD-Peptide auf Asthma zu untersuchen. Die NF-κB-Aktivierung in bronchiolaren Epithelzellen, T-Zellen und bronchiolaren Makrophagen wurde in den Atemwegen von Asthmapatienten und in Asthma-Tiermodellen untersucht (Ray & Cohn, (1999) J. Clin. Invest. 104, 985–993; Christman et al., (2000) Chest 117,1482–1487). Zudem verursachen viele Agenzien, die Asthma induzieren, eine NF-κB-Aktivierung, und viele der Gene, die an Asthma beteiligte Proteine codieren (d. h. Leukocytenadhäsionsmoleküle, verschiedene Chemokine, induzierbare Stickstoffoxid-Synthase) sind NF-κB-abhängig. Ein etabliertes Maus-Modell für Asthma (Kleeberger et al., (1990) Am J. Physiol. 258,313–320) kann dazu verwendet werden, die Effekte einer Aerosol-Verabreichung der NBD-Peptide auf das Fortschreiten dieser mit Asthma assoziierten Zustände zu untersuchen. In ähnlicher Weise können auch die Auswirkungen der NBD-Peptide auf einen septischen Schock bestimmt werden. An einem septischen Schock ist die Expression zahlreicher NF-κB-abhängiger Gene (d. h., TNF, IL-1) beteiligt, die durch bakterielle Endotoxine, wie Lipopolysaccharid (LPS), induziert werden. LPS umfasst die Hauptbestandteile der Zellwände von gram-negativen Bakterien, ist höchst immunogen und stimuliert die Produktion endogener Pyrogene IL-1 und TNF (Sell et al., (1996) Immunology, Immunopathology & Immunity, Appleton & Lange). Zur Untersuchung der Auswirkungen der NBD-Peptide auf septischen Schock werden Mäusen die NBD-Peptide und LPS injiziert und das Überleben der Tiere beurteilt.
BEISPIEL 11: RELATIVE BEITRÄGE UND BEDEUTUNG JEDER AMINOSÄURE INNERHALB DER NBD HINSICHTLICH DER INTERAKTION MIT NEMO
Wie in den vorangegangenen Beispielen gezeigt, besteht die NEMO-Bindungsdomäne (NBD) von IKKα und IKKβ aus sechs konservierten Aminosäuren (L737 bis L742 von IKKβ und L738 bis L743 von IKKα) im äussersten C-Terminus beider Kinasen. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um ein klareres Verständnis für die relativen Beiträge und die Bedeutung jeder Aminosäure innerhalb der vorstehenden NBD hinsichtlich der Interaktion mit NEMO zu erlangen. Es wurde eine umfassende Mutationsanalyse der IKKβ-NBD durchgeführt, bei der jeder Rest mit verschiedenen konservierten und nicht-konservierten Aminosäuren substituiert wurde.
Es wurde festgestellt, dass die Substitution eines Leucinrestes (L737 oder L742) oder von Serin 740 die Assoziierung von NEMO mit IKKβ nicht beeinträchtigte, was darauf hindeutet, dass keiner dieser Reste eine kritische Rolle bei der Bewahrung der Interaktion spielt. Um festzustellen, ob mehrfache Mutationen dieser Aminosäuren die Bindung beeinflussen, wurden zwei Mutanten konstruiert, bei denen entweder L737 und S740 oder S740 und L742 (nachfolgend LS bzw. SL genannt) mit Alanin substituiert waren. Eine GST-Pull-Down-Analyse und eine COS-Zellen-Transfektions-Immunpräzipitations-Immunblot-Analyse zeigten, dass sowohl LS- als auch SL-Mutanten in gleichem Maße wie Wildtyp-IKKβ an NEMO binden, was ein weiterer Beleg dafür ist, dass diese Reste nicht signifikant zur Interaktion beitragen. Ferner aktivieren sowohl LS als auch SL NF-κB sowie IKKβ, wenn sie mittels Aktivierung eines NF-κB-abhängigen Luciferase-Reporter-Konstruktes (pBIIx-Luciferase) in vorübergehenden Transfektionsassays bestimmt werden. Eine doppelte Alaninmutante beider Leucinreste (LL) sowie eine dreifache Mutante (LSL) können brauchbar sein, um die vorstehenden Daten hinsichtlich der Bedeutung dieser Reste für die NEMO-Bindung zu bestätigen.
Im Gegensatz zum Fehlen von Wirkungen der oben beschriebenen Mutationen auf die NEMO-Bindung oder die NF-κB-Aktivierung verhinderte die Alaninsubstitution des Asparaginsäurerestes innerhalb der NBD (D738) die Bindung von IKKβ an NEMO. Ferner führt diese Substitution zu einer 2- bis 3-fachen Zunahme der basalen NF-κB-Aktivierungsfähigkeit von IKKβ. Diese Ergebnisse zeigen eine Rolle bei der NEMO-Bindung in Form der Bewahrung der basalen Aktivität des IKK-Komplexes. Interessanterweise führte die Behandlung von HeLa-Zellen mit dem zellpermeablen NBD-Peptid auch zu einer moderaten Zunahme der basalen NF-κB-Aktivität, was den Gedanken, dass der Verlust der NEMO-Bindung zu einer erhöhten basalen IKK-Aktivität führt, weiter stützt.
Zur Untersuchung der Beschaffenheit des Restes an Position 738 innerhalb der NBD wurde Asparaginsäure entweder mit Asparagin- (D738N) oder mit Glutaminsäure (D738E, 8A) substituiert. Diese konservativen Substitutionen bewahren entweder die Form (N) oder die Form und Ladung (E) des Restes an dieser Position. Wie in 8B gezeigt, beeinflusste keine der Substitutionen die Fähigkeit von IKKβ zur Bindung an NEMO, während eine Alaninsubstitution die Bindung verhinderte. Diese Daten zeigen, dass die Form (insbesondere das Vorliegen des zweiten Kohlenstoffes), und nicht die Ladung der Seitenkette der Aminosäure an dieser Position kritisch für die Interaktion zwischen IKKβ und NEMO ist. In Übereinstimmung mit den vorhergehenden Beobachtungen, die hier beschrieben sind, beeinflusste keine der Mutationen die basale Aktivität von IKKβ, während die Substitution mit Alanin eine Zunahme der Aktivität verursachte (8C).
Wie oben gezeigt, sind beide Tryptophanreste innerhalb der NBD (W739 und W741) für die Bewahrung der Interaktion mit NEMO kritisch. Die Effekte konservativer Mutationen, welche die aromatische Struktur der Reste an diesen Positionen bewahren, wurde durch Substitution von Tryptophan mit Phenylalanin (F) oder mit Tyrosin (Y) untersucht (9A). Zusätzlich wurden beide Tryptophane zu Arginin mutiert, was eine nicht-konservative Substitution ist, die nur eine einzige Basenänderung innerhalb des Codierungscodons erfordert, wobei es sich um die häufigste natürlich auftretende Tryptophanmutation handelt. Wie in 9B gezeigt, banden beide Mutanten, W739F und W739Y, in gleichem Maße an NEMO wie IKKβ, während keine Bindung von W739R erfolgte (9C). Zusammen mit den Effekten der Alaninsubstitution (9B) zeigen diese Erkenntnisse, dass die aromatische Beschaffenheit des Restes an dieser Position für die Funktion der NBD kritisch ist. Ähnlich wie bei W739 wurde festgestellt, dass eine Substitution von W742 mit Phenylalanin (W742F) die Bindung an NEMO nicht beeinflusste, während eine Mutation zu Arginin (W742R) die Bindung verhinderte (9D). Im Gegensatz zu W739 verhinderte eine Substitution mit Tyrosin (W742Y) die Bindung an NEMO, was zeigt, dass das Vorliegen einer Hydroxyleinheit innerhalb der Aminosäure-Seitenkette an dieser Position ausreicht, um die NEMO-Bindung zu verhindern. Diese Erkenntnis kann darauf hindeuten, dass die Phosphorylierung eines Restes innerhalb der NBD, wenn auch mit einer künstlich eingesetzten Aminosäure, die Bindung von IKKβ an NEMO verhindert.
BEISPIEL 12: BEWERTUNG ENTZÜNDUNGSHEMMENDER VERBINDUNGEN IN EINEM LETHALEN LIPOPOLYSACCHARID-MAUSMODELL
Bei diesem Experiment wurde die Fähigkeit erfindungsgemäßer entzündungshemmender Verbindungen, Mäuse zu retten, die einer lethalen Menge an Lipopolysaccharid (LPS) ausgesetzt worden waren, bestimmt. LPS ist ein bakterielles Produkt, das einige der Antworten induziert, die bei septischen Patienten zu beobachten sind, einschließlich des Todes. In diesem Modell wurde männlichen C57BL/6-Mäusen Salmonella typhimurium-LPS in Phosphat-gepuffertem Serum (PBS) mittels intravenöser Injektion in einer Dosis von 30 mg/kg (600 μg/20 g Maus) verabreicht. Diese Dosis war, wie in Kontrollexperimenten festgestellt wurde, bei 100% der Mäuse, die sie erhielten, lethal. Mäuse wurden mit dem Testpeptid durch intravenöse Injektion (in 1 % Dimethylsulfoxid in PBS) unmittelbar vor der LPS-Injektion und 24 Stunden nach der LPS-Injektion behandelt. Die Mäuse wurden zweimal täglich bis zu 8 Tage nach der Gabe von LPS überprüft, und die Überlebensdauer und Anzahl der überlebenden Mause wurden aufgezeichnet.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 2 angegeben, die für jedes Peptid und jede Dosis die Gesamtzahl der Mäuse, die eine Dosis erhielten, und die Anzahl der nach 5 Tagen überlebenden Mäuse zeigt.
Tabelle 2
Die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen 2, 3 und 5–11 in diesem Modell signifikanten Schutz gegen einen lethalen Reiz mit LPS bieten, wenn sie in einer Dosis von 50 mg/kg i.v. verabreicht werden. Verbindung 10 bot auch bei einer Dosis von 1 mg/kg i.v. signifikanten Schutz.
BEISPIEL 13: BESTIMMUNG VON PEPTIDEN IN CONCANAVALIN A-INDUZIERTER HEPATITIS
In diesem Experiment wurde die Fähigkeit erfindungsgemäßer entzündungshemmender Verbindungen untersucht, Mäuse mit Concanavalin-induzierter Hepatitis zu retten.
Concanavalin A ist ein Lectin, eine Klasse von Proteinen, die an Kohlehydrate binden. Wenn Kohlehydrate Teil eines Proteins sind, bindet das Lectin an das Protein. Durch Bindung an Proteine auf der Zelloberfläche stimmuliert Concanavalin A zahlreiche Zellen, einschließlich T-Lymphocyten. Zusammen mit anderen Mediatoren, die durch Concanavalin A-Stimulation freigesetzt werden, greifen diese T-Lymphocyten Leberzellen an, an die ebenfalls Concanavalin A gebunden ist, was bewirkt, dass die Zellen sterben. Durch die Beteiligung von T-Lymphocyten ähnelt dieses Modell der menschlichen viralen Hepatitis. Zu diesem akuten Modell gehört jedoch auch eine TNFα-Antwort.
Vierzig männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht im Bereich von 18 g bis 22 g wurden in fünf Behandlungsgruppen zu je acht Mäusen, wie nachfolgend gezeigt, unterteilt.
Die Mäuse wurden in einem Restrainer platziert und ihnen wurde ein Testpeptid oder ein Vehikel in 1% DMSO in PBS intravenös (i.v.) in den Schwanz injiziert. Dann wurden den Mäusen sofort 15 mg/kg Concanavalin A, gelöst in sterilem PBS, i.v. injiziert. Das Injektionsvolumen betrug 5 ml/kg (100 μl/20 Maus) bei einer Concanavalin A-Konzentration von 3,0 mg/ml. Am nächsten Morgen (18–24 Stunden später) wurden diese Mäuse durch CO₂-Inhalation euthanasiert, und Blut wurde mittels Herzpunktion gesammelt. Dann wurde das Serum aufgetrennt und auf AST und ALT analysiert.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 3 gezeigt. Die ALT- und AST-Werte sind in Sigma-Frankel-Einheiten/ml als Mittelwert ± SEM angegeben.
Tabelle 3
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass Verbindung 10 in einer Dosis von 5 mg/kg vor einer Concanavalin A-induzierten Leberschädigung schützen kann. Die allgemeine Pathologie unterstützte diesen Rückschluss und deutet darauf hin, dass die Leber durch Concanavalin A geschädigt wurde und diese Schädigung durch Verbindung 10 in einer Dosis von 5 mg/kg verhindert wurde.

Claims

Entzündungshemmende Verbindung, umfassend die Struktur Xa–Xb worin X_a eine Membrantranslokationsdomäne, bestehend aus 6 bis 15 Aminosäureresten, ist und X_b eine NEMO-Bindesequenz ist, bestehend aus der nachfolgenden Struktur (Y)n-X1-X2-X3-X4-X5-X6-(A)m worin n und m unabhängig voneinander jeweils 0 oder 1 sind, A und Y jeweils 1 bis 3 Aminosäurereste umfassen, X₁ gleich L, A, I oder Norleucin (Nle) ist, X₂ gleich D, E, N, Q, Homoserin (Hser) oder 2-Ketopropylalanin (2-ketopropy-A) ist, X₃ gleich W, F, Y, 4-Biphenylalanin (Bpa), Homophenylalanin (Hphe), 2-Naphthylalanin (2-Nal), 1-Naphthylalanin (1-Nal) oder Cyclohexylalanin (Cha) ist, X₄ gleich S, A, E, L, T, Norleucin (Nle) oder Homoserin (Hser) ist, X₅ gleich W, N, Homophenylalanin (Hphe), 2-Naphthylalanin (2-Nal), 1-Naphthylalanin (1-Nal), O-Benzylserin (SeroBn) oder 3-Pyridylalanin (3-Pal) ist, und X₆ gleich L, A, I oder Norleucin (Nle) ist, wobei NEMO NF-κB Essentialmodulator bedeutet.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, weiter umfassend eine modifizierende Gruppe.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei n gleich 1 ist und Y die Sequenz TA ist.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei m gleich 1 ist und A die Sequenz QTE ist.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei X_b eine Sequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TALDWSWLQTE, LDWSWLQTE, TALDWSWL, ALDWSWLQTE, LDWAWL, TALDWSWLQT, TALDWSWLQ, ALDWSWLQT, LDWSWLQ, LDWSWLQT, ADWSWL, LDWSWA, ADWSWA, LDFSWL, LDYSWL, LDWAWL, LDWEWL, TAADWSWLQTE, ADWSWLQTE, TAADWSWL, AADWSWLQTE, TAADWSWLQT, TAADWSWLQ, AADWSWLQT, ADWSWLQ, ADWSWLQT, ALDWSWAQTE, LDWSWAQTE, TALDWSWA, TALDWSWAQT, TALDWSWAQ, ALDWSWAQT, LDWSWAQ, LDWSWAQT, TAADWSWAQTE, ADWSWAQTE, TAADWSWA, AADWSWAQTE, ADWSWAQTE, TAADWSWAQT, TAADWSWAQ, AADWSWAQT, ADWSWAQ, ADWSWAQT, TALDFSWLQTE, LDFSWLQTE, TALDFSWL, ALDFSWLQTE, TALDFSWLQT, TALDFSWLQ, ALDFSWLQT, LDFSWLQ, LDFSWLQT, TALDYSWLQTE, LDYSWLQTE, TALDYSWL, ALDYSWLQTE, LDYSWLQTE, TALDYSWLQT, TALDYSWLQ, ALDYSWLQT, LDYSWLQ, LDYSWLQT, TALDWAWLQTE, LDWAWLQTE, TALDWAWL, ALDWAWLQTE, LDWAWL, TALDWAWLQT, TALDWAWLQ, ALDWAWLQT, LDWAWLQ, LDWAWLQT, TALDWEWLQTE, LDWEWLQTE, TALDWEWL, ALDWEWLQTE, LDWEWLQTE, TALDWEWLQT, TALDWEWLQ, ALDWEWLQT, LDWEWLQ und LDWEWLQT.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei X_a aus 6 bis 12 Aminosäureresten besteht.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei X_a aus 6 bis 10 Aminosäureresten besteht.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei X_a mindestens fünf basische Aminosäurereste umfasst.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei X_a mindestens fünf Aminosäurereste umfasst, die unabhängig voneinander aus L-Arginin, D-Arginin, L-Lysin und D-Lysin ausgewählt sind.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, wobei X_a ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus RRMKWKK, YGRKKRRQRRR, ygrkkrrgrrr, YARKARRQARR, yarkarrgarr, YARAARRAARR, yaraarraarr, rrmkwkk, RRRRRR,RRRRRRR,RRRRRRRR,RRRRRRRRR,RRRRRRRRRR, RRRRRRRRRRR, rrrrrr, rrrrrrr, rrrrrrrr, rrrrrrrrr, rrrrrrrrrr und rrrrrrrrrrr, wobei ein Kleinbuchstabe eine D-Aminosäure bezeichnet.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus RRMKWKKTALDWSWLQTE, rrmkwkkTALDWSWLQTE, YGRKKRRQRRRTALDWSWLQTE, ygrkkrrgrrrTALDWSWLQTE, rrrrrrrTALDWSWLQTE, RRRRRRRTALDWSWLQTE, YARKARRQARRTALDWSWLQTE, yarkarrgarrTALDWSWLQTE, YARAARRAARRTALDWSWLQTE, yaraarraarrTALDWSWLQTE, YGRKKRRQRRRLDWSWL, ygrkkrrgrrrLDWSWL, RRMKWKKLDWSWL, rrmkwkkLDWSWL, rrrrrrrLDWSWL, YARAARRAARRLDWSWL, yaraarraarrLDWSWL und RRRRRRRLDWSWL.
Entzündungshemmende Verbindung nach Anspruch 1 mit einer Struktur, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus H-RRMKWKKTALDWSWLQTE-NH₂, H-YGRKKRRQRRRTALDWSWLQTE-NH₂, H-rrrrrrrTALDWSWLQTE-NH₂, H-YARKARRQARRTALDWSWLQTE-NH₂, H-YARAARRAARRTALDWSWLQTE-NH₂, H-RRMKWKKLDWSWL-NH₂, H-rrmkwkkLDWSWL-NH₂, H-rrrrrrrLDWSWL-NH₂, H-YARAARRAARRLDWSWL-NH₂, H-yaraarraarrLDWSWL-NH₂, H-YGRKKRRQRRRLDWSWL-NH₂.