CN113214356B - 十氟联苯环化修饰的nbd多肽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物，通过用十氟联苯对NBD多肽类似物进行环化修饰得到。结果表明该类NBD类似物比穿透素共价连接的NBD（Antp‑NBD）具有更高的细胞渗透性、更长的半衰期和更低的细胞毒性，同时能够抑制炎症因子的表达，可用于急性肺损伤等炎症疾病的治疗。

Description

十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及十氟联苯环化修饰的NEMO结合结构域肽及其制备方法和应用。

背景技术

NF-κB信号通路参与许多细胞过程，包括细胞存活、增殖和分化，并且这个途径的失调与多种炎症性疾病和某些癌症有关。NEMO调节亚基与催化亚基IKKα和IKKβ一起形成了IKK复合物。IKK对于激活经典NF-κB信号通路至关重要。所以抑制IKK复合物的形成或破坏NEMO/IKKα/β之间的相互作用已成为一种有前景的治疗手段。细胞在静息状态下，NF-κB以非活化的形式存在于细胞质中。多种免疫受体信号可激活经典的NF-κB信号通路，受抑制的NF-κB发生核易位，在核内与相关的靶基因序列结合并启动多种炎症因子基因的转录，诱导白介素(IL-1、IL-6和IL-8)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎性因子的表达。这些细胞因子又反过来进一步活化NF-κB，形成正反馈过程，导致炎症反应失调。因此NF-κB与炎症反应密切相关，在炎性疾病如类风湿性关节炎、胃炎和败血症中已经发现NF-κB的活化。在大多数炎性疾病中，NF-κB和促炎细胞因子表达增加导致免疫失调，因此普遍认为抑制NF-κB信号通路是治疗炎性疾病的主要途径。

已经通过蛋白质体外结合实验(Pull-down assay)研究了定点突变对IKKβ的影响以及各种长度的IKKβ衍生肽与NEMO的结合活性。研究证明NEMO与IKKβ的C末端区域(残基701-745)相互作用。在该区域内，结合NEMO的关键序列称为NBD，但其自身不具有细胞渗透性。NBD是一个以羧基结尾的11肽。其结构为：H-Thr-Ala-Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu-Gln-Thr-Glu-OH。已有研究将NBD与细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)连接促进细胞内递送。在小鼠和其他物种的炎症和退行性疾病模型中，CPPs-NBD具有一定的治疗效果。全身性给药CPPs-NBD可减轻杜氏肌营养不良症(DMD)鼠模型以及犬模型中巨噬细胞介导的肌肉坏死和变性；同样全身给药CPPs-NBD也可以改善IL-10缺陷型小鼠的慢性结肠炎，而不会影响NF-κB的基础活性；在关节炎的大鼠模型中，关节内注射CPPs-NBD可以缓解滑膜炎和关节炎，它还可以通过下调NF-κB、TNF-α和IL-1β来减轻炎症诱导的关节炎和破骨细胞的生成；通过局部给药，CPPs-NBD可预防LPS诱导的肺部炎症，还能改善急性呼吸窘迫综合症；同样局部给药CPPs-NBD还可以减少犬模型中弥漫性大B细胞淋巴瘤中恶性B细胞的增殖。

虽然CPPs-NBD具有强大的治疗功效，但要实现临床应用，则需要改善CPPs-NBD与NEMO的结合亲和力、代谢稳定性和细胞渗透性等问题。因此，找到比细胞穿膜肽递送时细胞渗透性更高、代谢稳定性和药效更好的类似物，对于日后研究NBD及其PPIs(蛋白质-蛋白质相互作用)的抗炎药物是非常有必要和有意义的。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物。

本发明还要解决的技术问题在于提供上述十氟联苯环化修饰的NBD多肽(NEMO结合结构域肽)类似物的制备方法和应用。

具体地，本发明提出了一种十氟联苯环化修饰的NBD多肽，通过用十氟联苯对NBD多肽类似物进行环化修饰得到，其中，所述NBD多肽类似物的序列为TALCWCWLQTE或CALDWSWLQTC。

在一种实施方式中，通过将NBD多肽的N端和C端的第一个氨基酸替换成天然的Cys，得到NBD多肽类似物，然后通过十氟联苯与该类似物的Cys的巯基进行芳基化反应形成首尾环化肽，即为十氟联苯环化修饰的NEMO结合结构域肽类似物。

在另外的一种实施方式中，通过将NBD多肽的第四位和第六位氨基酸替换成天然的Cys，得到NBD多肽类似物，然后通过十氟联苯与该类似物Cys的巯基进行芳基化反应形成环化肽，即为十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物。

本发明进一步提出了上述NBD多肽类似物的制备方法：首先采用Fmoc的多肽固相合成法合成NBD多肽类似物的序列，所述NBD多肽类似物的序列为TALCWCWLQTE或CALDWSWLQTC，然后向上述得到的NBD多肽类似物中加入环化剂和十氟联苯并用溶剂解，反应3-6h，油泵旋干溶剂，HPLC分离制备。

优选地，所述环化剂为Tris。

具体地，环化剂：十氟联苯：NBD多肽的类似物的摩尔比为25～40:2～5:1。优选地，环化剂：十氟联苯：NBD多肽的类似物的摩尔比为30:2:1，此时，十氟联苯和Tris的用量也均为过量。

优选地，所述溶剂为DMF。DMF的体积为加入后肽的浓度为1mM，旋干DMF时的温度为45℃。

HPLC的分离条件为：流动相为千分之一TFA的乙腈和水，从25％的乙腈浓度到85％的乙腈，时间为60min，制备柱子为C18色谱柱。

本发明进一步提出了上述十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物作为NEMO-IKKβ多肽抑制剂的应用。

本发明还提出了十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物在制备用于治疗或预防LPS诱导的急性肺损伤的药物上的应用。

具体地，所述十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物缓解LPS引起的过度水肿、出血导致的大面积肺泡壁厚度增加、肺泡塌陷和明显的炎性细胞浸润，同时降低肺部组织中IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达。

有益效果：本申请通过对NEMO结合结构域肽(后文简称NBD多肽)的类似物进行十氟联苯环化修饰得到修饰后的NBD类似物，结果表明该类NBD类似物比穿透素共价连接的NBD(Antp-NBD，即后文的NBD-1)具有更高的细胞渗透性、更长的半衰期和更低的细胞毒性，同时能够抑制炎症因子的表达，可用于急性肺损伤等炎症疾病的治疗。

附图说明

图1：(A)FITC标记的NBD、NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3在A549细胞中的细胞摄取(5μM，2h)，结果为平均值±SEM(n＝4)；(B)FITC标记的NBD、NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3在A549细胞中细胞摄取的活细胞共聚焦显微镜图像(5μM，2h)，比例尺＝20μm；

图2：(A)FITC标记的NBD、NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3在NIH3T3细胞中的细胞摄取(5μM，2h)，结果为平均值±SEM(n＝4)；(B)FITC标记的NBD、NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3在NIH3T3细胞中细胞摄取的活细胞共聚焦显微镜图像(5μM，2h)，比例尺＝20μm；

图3：(A)FITC标记的NBD、NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3在Raw264.7细胞中的细胞摄取(5μM，2h)，结果为平均值±SEM(n＝4)；(B)FITC标记的NBD、NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3在Raw264.7细胞中细胞摄取的活细胞共聚焦显微镜图像(5μM，2h)，比例尺＝20μm；

图4：NF-κB荧光素酶报告基因检测，在HEK293A细胞中以不同浓度的NBD-1、NBD-2、MutNBD-2、NBD-3和MutNBD-3对TNF-α诱导的NF-κB信号传导的抑制；

图5：不同浓度的NBD-1、NBD-2与MutNBD-2对炎症因子IL-1β(图A)、IL-6(图B)以及TNF-α(图C)mRNA水平的抑制；LPS(脂多糖)(1μg/mL)刺激细胞1h后，将细胞与浓度为10μM、25μM与50μM的NBD-1、NBD-2与MutNBD-2于37℃恒温培养箱内孵育48h，收集细胞，通过RT-qPCR测定炎症因子mRNA水平的表达，数据代表平均值±SEM(n＝3)；*表示LPS组与正常对照组相比；#表示加药组与LPS组相比，^*P/^#P<0.05；^**P/^##P<0.01；^***P/^###P<0.001；

图6：通过ELISA检测不同浓度的NBD-1、NBD-2与MutNBD-2对炎症因子IL-1β(图A)、IL-6(图B)以及TNF-α(图C)的抑制作用。LPS(1μg/mL)刺激细胞1h后，将细胞与浓度为10μM、25μM与50μM的NBD-1、NBD-2与MutNBD-2于37℃恒温培养箱内孵育48h，最后将培养基在4℃以1500g离心10min，收集上清，使用ELISA试剂盒进行测定；数据代表平均值±SEM(n＝3)；*表示LPS组与正常对照组相比；#表示加药组与LPS组相比；*P/#P<0.05；**P/##P<0.01；***P/###P<0.001；

图7：不同浓度的NBD-1与NBD-2对NF-κB信号通路p65蛋白磷酸化的抑制作用；LPS(1μg/mL)刺激Raw264.7细胞1h，用NBD-1(50μM)与NBD-2(25μM与50μM)与Raw264.7孵育2h，收集细胞，通过Western blotting分析细胞裂解物，数据代表平均值±SEM(n＝3)，*表示LPS组与正常对照组相比；^#表示加药组与LPS组相比；*P/^#P<0.05；**P/^##P<0.01；***P/^###P<0.001；

图8：刃天青检测不同浓度(10μM、25μM、50μM以及100μM)的NBD-1、NBD-2与MutNBD-2的细胞毒性(A)A549细胞系；(B)NIH3T3细胞系；(C)Raw264.7细胞系；数据代表平均值±SEM(n＝3)；

图9：ALI小鼠肺部组织病理变化；提前腹腔注射不同浓度的NBD-1、NBD-2与MutNBD-2 2h后，气管给药LPS 24h并取肺组织，将石蜡切片用于H&E染色(原始放大倍数×10)；(A)对照组：正常结构；(B)LPS组：肺泡壁增厚、出血、肺泡塌陷和明显的炎症细胞浸润；(C)0.25mg/kg NBD-1组；(D)0.1mg/kg NBD-2组；(E)0.25mg/kg NBD-2组；(F)0.5mg/kgNBD-2组；(G)0.5mg/kg MutNBD-2组；(H)肺损伤组织病理评分；数据表示为平均值±SEM(n＝每组6只小鼠)，*表示LPS组与正常对照组相比；^#表示加药组与LPS组相比，*P/^#P<0.05；**P/^##P<0.01；***P^/###P<0.001；

图10：NBD-1、NBD-2与MutNBD-2对ALI小鼠模型肺组织中炎症因子TNF-α(图A)、IL-6(图B)以及IL-1β(图C)表达的影响；将左肺与对应体积的PBS在冰上充分研磨，4℃下将匀浆5000g离心5min，取上清液使用ELISA试剂盒进行测定，NBD-1、NBD-2与MutNBD-2对MPO活性的影响(图D)，数据代表平均值±SEM(n＝3)；*表示LPS组与正常对照组相比；#表示加药组与LPS组相比，*P/^#P<0.05；**P/^##P<0.01；***P/^###P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中除非另有说明，所用试剂均为市售试剂。其中，人肺癌细胞A549，小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，模式细胞人胚胎肾细胞HEK293A均购自上海中科院细胞库。

实施例1 NBD多肽及其类似物的合成及修饰：

本申请使用十氟联苯(DFBP)修饰策略对PPIs抑制剂NBD进行了环化，并设计合成了一系列类似物。我们期望DFBP环化的NBD类似物具有优异的细胞摄取效率、代谢稳定性和对NEMO-IKKβ有效的抑制作用。

类似物的设计思路如下：首先，合成文献中报道的具有细胞渗透性的Antp-NBD(表示为NBD-1)作为阳性对照物。其次，将NBD序列中的D⁷³⁸和S⁷⁴⁰替换为两个Cys，并通过DFBP进行环化，合成具有稳定结构的NBD-2。W⁷³⁹和W⁷⁴¹是NBD的关键活性位点，利用Ala替代序列中的W⁷³⁹和W⁷⁴¹使其失去原有的活性，合成NBD-2的阴性对照肽MutNBD-2。此外，用两个Cys替代NBD肽N端的Thr和C末端的Glu，通过DFBP环化合成类似物NBD-3。同样将NBD-3序列中W⁷³⁹和W⁷⁴¹替换成Ala，合成NBD-3的阴性对照肽MutNBD-3。

基于以上NBD类似物，首先，我们探究了DFBP环化对NBD的结构、穿膜活性、内体逃逸以及代谢稳定性的影响，并试图阐述细胞摄取增强的原因。其次，在Raw264.7细胞以及ALI小鼠模型中深入探究NBD类似物的体内外抗炎活性，旨在探究基于DFBP环化后对NEMO-IKKβ的抑制活性。我们期望DFBP环化策略能有效解决PPIs多肽抑制剂细胞渗透性与代谢稳定性差的问题，并使其发挥一定的生物学活性，从而为PPIs抑制剂的设计提供一定的理论依据。

具体地，本申请研究了具有以下序列的NBD类似物，其中，Acp为六氨基己酸，为连接子：

表1序号和序列

其中，序列NBD-1中，RQIKIWFQNRRMKWKK为细胞穿膜肽(穿透素)的序列，GG为连接子，NBD-1即为细胞穿膜肽(穿透素)连接的NBD肽。本发明旨在合成十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物，环化后具有细胞渗透性相较连接有穿透素的NBD-1有提高，同时活性也有所提高，代谢稳定性有极大改善。

(一)NBD类似物多肽的合成

使用Fmoc固相多肽合成策略，合成如下NBD类似物多肽：

TALDWSWLQTE；

RQIKIWFQNRRMKWKKGGTALDWSWLQTE；

TALCWCWLQTE；

TAL CACALQTE；

CALDWSWLQTC；

CALDASALQTC。

合成步骤如下：

(1)Fmoc-Glu-2CTC-resin的合成，将2CTC树脂放入合成仪中，加入DCM溶胀，然后加入第一个氨基酸并搅拌5min，加入DIEA搅拌反应1h，加入甲醇搅拌反应30min，随后用DMF洗涤，最后用甲醇和DCM交替洗并收缩干燥，再测定取代值；

(2)将连接好第一个氨基酸的肽树脂按照Fmoc固相多肽合成策略从肽羧基端开始逐个合成。合成步骤为：1)接好第一个氨基酸的树脂放入合成仪中并用DCM溶胀，用含1.5％DBU和2％哌啶的DMF脱除氨基酸的氨基保护基团Fmoc，用DMF洗涤；2)将下一个氨基酸和缩合剂用DMF溶解并加入合成仪反应1h，DMF洗涤；3)重复步骤1)和2)的过程直到肽链合成完成，用1)的方法脱掉最后一个氨基酸的Fmoc保护基并收缩干燥。

(二)FITC-Acp-修饰的NBD类似物的合成

上述NBD类似物合成完成后，重复上述步骤，在NBD肽N端连接Acp，然后加入FITC荧光和DIEA过夜反应，DMF洗并收缩干燥。

肽裂解液为：TFA：EDT：TIS：水＝94％：2％：1％：2％，裂解3h，并用乙醚沉淀，离心干燥得到粗品。

(三)十氟联苯环化的NBD类似物的合成

将上述粗肽放入圆底烧瓶，加入Tris和十氟联苯并用DMF溶解，反应4h，旋干DMF，HPLC制备。其中，十氟联苯为摩尔数2倍过量，tris为摩尔数30倍过量，加入DMF使肽浓度为1mM。

多肽纯化：上述合成的多肽，用含千分之一TFA的乙腈和水作为流动相，梯度为乙腈25％到85％，时间60min，制备柱为C18色谱柱，220nm检测。收集样品冻干并质谱和色谱鉴定，结果如表2所示。NBD及其类似物采用Fmoc多肽固相合成法合成，使用RP-HPLC纯化多肽和纯度检测。纯度均为95.5％以上。

表2：NBD及类似物的保留时间、纯度和质谱鉴定结果

实施例2系列NBD多肽类似物的细胞渗透性。

24孔板以8×10⁴细胞/孔的密度接种，洗去培养基，将细胞与浓度为5μM的FITC标记肽(FITC-NBD、FITC-NBD-1、FITC-NBD-2、FITC-MutNBD-2、FITC-NBD-3、FITC-MutNBD-3)在新鲜培养基中于37℃恒温培养箱内孵育2h。吸去培养基用PBS洗，每孔加入500μL的胰蛋白酶消化细胞15min，在4℃冷冻离心机内1200rmp离心5min并用流式细胞仪检测细胞摄取的荧光强度。

A549、NIH3T3、Raw264.7和Hek293A以4×10⁴细胞/孔的密度接种，去除培养基。将细胞与浓度为5μM的FITC标记肽(FITC-NBD、FITC-NBD-1、FITC-NBD-2、FITC-MutNBD-2、FITC-NBD-3、FITC-MutNBD-3)在新鲜培养基中于37℃恒温培养箱内孵育2h。细胞核用Hoechst 33342染色10min，并用PBS洗。在激光共聚焦显微镜下(Zeiss 880)观察细胞内荧光并进行拍照。

通过流式细胞实验在A549、NIH3T3和Raw264.7细胞上评估NBD及其类似物的细胞摄取。所有类似物的细胞摄取结果如图1、2和3所示，实验结果显示十氟联苯环化修饰改善了NBD细胞不渗透性，在A549、NIH3T3和Raw264.7细胞上，十氟联苯环化的NBD-2类似物的细胞摄取是Antp-NBD(NBD-1)的3.5、2.8、1.4倍。而十氟联苯环化的NBD-3的细胞摄取与NBD-1相当。

实施例3 NBD及其类似物对NF-κB荧光素酶活性的影响。

在HEK293A细胞上瞬时转染NF-κB荧光素酶报告基因的质粒，并在37℃下培养过夜。除去旧的培养基，将不同终浓度的一系列NBD类似物加入细胞中并孵育2h。将5μL终浓度为5ng/mL的重组TNF-α添加至孔中，再孵育4h。除去培养基后，加入60μL裂解液(PBS稀释5倍)裂解细胞15min，吸取20μL孔裂解液于微孔板上，再在孔内加入60μL荧光底物后，立即在酶标仪下测定。TNF-α未刺激和刺激的细胞的荧光素酶活性分别记录为AU^-和AU⁺。与不同浓度的NBD类似物孵育后，TNF-α刺激细胞的荧光素酶活性记录为AUpep。NF-κB的抑制是通过荧光素酶活性诱导的百分比来计算的，基于以下公式：

TNF-α激活抑制率(％)＝(AUpep-AU^-)/(AU⁺-AU^-)×100％。

NBD及其类似物通过在HEK293A细胞上瞬时转染NF-κB荧光素酶报告基因的质粒后抑制荧光素酶表达的评估。所有类似物抑制荧光素酶表达的结果如图4所示。结果显示，NBD-1与NBD-2能够以剂量依赖的方式抑制HEK293A细胞中TNF-α刺激的萤光素酶的表达。较低浓度的NBD-2(50μM)能够产生比NBD-1(100μM)更强的生物学效应。NBD-3对于细胞内荧光素酶报告基因的表达没有明显的影响，即使在最大浓度(100μM)也只能抑制12％左右。同时，阴性对照MutNBD-2和MutNBD-3完全不影响NF-κB萤光素酶表达。因此NBD-2类似物可作为NEMO-IKKβ多肽抑制剂。

实施例4 NBD及其类似物的酶解稳定性。

将小鼠血清(285μL)和终浓度为10mM的一系列肽溶液(15μL)在1.5mL微量离心管中混匀，所得混合物在37℃水浴锅中孵育不同时间段(t＝0min、3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min和60min)，其中以孵育0min的混合物为阳性对照。然后，吸取40μL混合物于另一个1.5mL的微量离心管中，再加入40μL冰乙腈，并以13000rpm离心15min，取上清通过分析型HPLC进行分析并计算峰面积。

肽的剩余率＝样品组的峰面积/阳性对照组的峰面积×100％。

NBD及类似物NBD-2的酶解稳定性通过小鼠血清被评估。表3总结了NBD及NBD类似物的半衰期结果。结果显示十氟联苯环化修饰的类似物NBD-2的半衰期相比于NBD-1得到了延长。NBD-1和NBD-2的半衰期分别为10min和40min。这表明十氟联苯的环化修饰显著增加了药物的稳定性。

表3：NBD-1和NBD-2在血清中的稳定性

实施例5 NBD及其类似物对体外抗炎活性的影响。

将种有每孔2×10⁵个Raw264.7细胞的6孔板吸去旧的培养基，加入1mL不含血清的培养基，饥饿细胞过夜。在培养基中直接加入LPS(1μg/mL)刺激细胞1h。吸去旧的培养基，将细胞与不同浓度(10μM、25μM和50μM)的NBD-1、NBD-2和MutNBD-2(MutNBD-2作为阴性对照物)于37℃恒温培养箱内孵育48h。最后将培养基在4℃以1500g离心10min，收集上清，使用ELISA试剂盒进行测定。PBS洗，每孔加入500μL的胰蛋白酶消化细胞15min，在4℃冷冻离心机内1200rmp离心15min，收集细胞用于RT-qPCR的测定。

将种有每孔3×10⁵个Raw264.7细胞的6孔板吸去旧的培养基，加入1mL不含血清的培养基，饥饿细胞过夜。在培养基中加入LPS(1μg/mL)刺激细胞1h后，吸去旧的培养基，将细胞与NBD-1(50μM)与NBD-2(25μM和50μM)于37℃恒温培养箱内孵育2h。收集细胞，使用RIPA缓冲液并添加1mmol/L的PMSF和磷酸抑制剂在冰上裂解30min，从细胞裂解物中获得蛋白质。使用BCA蛋白质试剂盒检测蛋白质的浓度，通过10％SDS-PAGE分离蛋白质样品。将其转移至PVDF膜，将PVDF膜用5％(W/V)脱脂奶粉封闭1h后，与适当的一抗在4℃下孵育过夜。用1×TBST溶液洗去一抗，与适当的二抗在室温下孵育1h后，用1×TBST溶液洗膜，最后使用化学发光成像系统检测条带并计算灰度值。

NBD-1和类似物NBD-2的体外抗炎活性通过在LPS诱导的Raw264.7炎症模型细胞上评估。NBD-1和NBD-2的抗炎结果如图5和6所示。结果显示NBD-1和NBD-2都以剂量依赖性的方式显著降低了炎症因子的表达。但在相同的浓度下，NBD-2比NBD-1的抑制效果更显著，而MutNBD-2对于炎症因子的表达基本没有抑制作用。因此，我们证明NBD-2具有更强的抗炎活性。

通过Western blotting评估NBD-1和NBD-2抑制NF-κB通路中p65蛋白的磷酸化。NBD-1和NBD-2抑制NF-κB通路下游p65蛋白的磷酸化的结果如图7所示。实验结果显示LPS明显诱导了Raw264.7细胞中p65的磷酸化上调，而NBD-1与NBD-2都显著抑制LPS诱导的p65蛋白磷酸化，但在相同浓度(50μM)下，NBD-2比NBD-1的抑制作用更强，说明NBD-2比NBD-1更显著地抑制LPS诱导的p65蛋白的磷酸化。

实施例6 NBD及其类似物的细胞毒性检测。

将A549、NIH3T3或Raw264.7以每孔5000个细胞的密度接种到96孔板中，37℃恒温培养箱过夜。去除旧的培养基，将终浓度10μM、25μM、50μM和100μM系列肽溶液添加到孔中(将没有添加任何肽的细胞作为阳性对照，空白组只添加培养基)，孵育24h。然后向每个孔中加入10μL刃天青水溶液(刃天青2mg/mL)再孵育2h后，在酶标仪下(激发波长为560nm，发射波长为590nm)测定荧光值。

细胞存活率＝(样品组-空白组)/(阳性对照组-空白组)×100％。

NBD-1和NBD-2的细胞毒性通过刃天青实验评估。NBD-1和NBD-2的细胞毒性结果如图8。结果显示在高浓度下，NBD-2没有细胞毒性，而NBD-1有微弱的细胞毒性。

实施例7 NBD及其类似物的抗炎效果监测检测。

将C57BL/6小鼠随机分为五组(每组n＝6)，分别为LPS组、对照组(生理盐水)以及给药组。用戊巴比妥钠(剂量为70mg/kg)麻醉小鼠之后，进行腹腔以及气管内给药。实验组在腹腔内分别注射NBD-1(0.25mg/kg)、NBD-2(0.1mg/kg、0.25mg/kg和0.5mg/kg)以及MutNBD-2(0.5mg/kg)。2h后LPS组及给药组小鼠气管内注射LPS(0.5mg/kg)，其中对照组注射生理盐水。24h后断颈椎处死于冰上取肺组织，右肺组织用于组织病理学分析，左肺在液氮中速冻，用于ELISA和MPO活性的测定。

综合上述的体外抗炎实验的结果和体外血清稳定性的实验结果发现，NBD-2相比于NBD-1细胞活性提高了2倍，而且半衰期也延长了4倍。因此我们研究腹腔给药NBD-2在小鼠体内的抗炎活性，通过LPS诱导的急性肺损伤的小鼠模型鉴定它的抗炎作用。

组织切片结果显示腹腔给药NBD-2(0.1mg/kg、0.25mg/kg和0.5mg/kg)后可以在不同程度上缓解由LPS引起的过度水肿和出血导致的大面积肺泡壁厚度增加、肺泡塌陷和明显的炎性细胞浸润(图9)。而且随着给药浓度的增加，对LPS引起的病理变化治疗的作用更加明显。且在相同浓度(0.25mg/kg)下，NBD-2的抑制效果比NBD-1强。炎症因子检测结果显示NBD-2显著降低了肺部组织中IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达，且在相同的剂量(0.25mg/kg)下，NBD-2比NBD-1的抑制活性更强(图10)。髓过氧化物酶的检测结果显示NBD-2以剂量依赖性的方式降低MPO的活性。较低剂量(0.1mg/kg)的NBD-2与较高剂量的NBD-1(0.25mg/kg)可以产生相同的抑制效果(图10)。

综上所述，本发明提出的NBD肽类似物(特别是NBD-2)相比于NBD肽和Antp-NBD细胞渗透性和半衰期有极大的增加，同时，NBD肽类似物相比于Antp-NBD在细胞水平抑制活性有显著的改善，在细胞水平可以显著抑制LPS诱导的炎症因子的表达，在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中可以改善肺部的病理变化和抑制炎症因子的表达。

本发明提供了一种制备十氟联苯环化修饰的NEMO结合结构域肽类似物的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物及其制备方法和应用

<140> 2021106197085

<141> 2021-06-03

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> NBD(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Ala Leu Ala Thr Ser Thr Leu Gly Thr Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> NBD-1(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

Gly Gly Thr Ala Leu Asp Trp Ser Trp Leu Gln Thr Glu

20 25

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> NBD-2(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Ala Leu Cys Trp Cys Trp Leu Gln Thr Glu

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> MutNBD-2(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Ala Leu Cys Ala Cys Ala Leu Gln Thr Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> NBD-3(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Ala Leu Asp Trp Ser Trp Leu Gln Thr Cys

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> MutNBD-3(Artificial Sequence)

<400> 6

Cys Ala Leu Asp Ala Ser Ala Leu Gln Thr Cys

1 5 10

Claims (7)

1.一种十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物，其特征在于，通过用十氟联苯对NBD多肽类似物进行环化修饰得到，其中，所述十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物的氨基酸序列为TALCWCWLQTE；所述环化修饰为通过十氟联苯与所述NBD多肽类似物的Cys的巯基进行芳基化反应形成环化肽。

2.权利要求1所述的十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物的制备方法，其特征在于，首先采用Fmoc多肽固相合成法合成NBD多肽类似物TALCWCWLQTE，然后向上述得到的NBD多肽类似物中加入环化剂和十氟联苯并用溶剂溶解，反应3-6 h，油泵旋干溶剂，HPLC分离制备。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述环化剂为Tris。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，环化剂：十氟联苯：NBD多肽类似物的摩尔比为25~40: 2~5:1。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为DMF。

6.权利要求1所述的十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物在制备用于治疗或预防LPS诱导的急性肺损伤的药物上的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述十氟联苯环化修饰的NBD多肽类似物缓解LPS引起的肺组织的过度水肿、出血导致的大面积肺泡壁厚度增加、肺泡塌陷和明显的炎性细胞浸润，同时降低肺部组织中IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达。

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