KR101576904B1 - 파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명의 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 파골세포 분화 및 활성 억제능을 가지며 골 파괴와 관련된 골 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다. 본 발명의 펩타이드는 파골세포 분화와 관련된 TRAP 및 카텝신 K(cathepsin K)의 발현을 감소시키며 NF-κB 의 핵 내 이동을 억제하여 궁극적으로 파골세포의 분화를 억제한다. 본 발명은 상술한 펩타이드를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Description

파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Having Activities for Inhibiting Differentiation and Activity of Osteoclast and Uses Thereof}

본 발명은 파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날 까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다. 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.

골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)와 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다. 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다. 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다. 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데 특히 골다공증과 암세포의 골전이(bone metastasis)로 인한 뼈의 손상과 관련 된 질환이 대표적이다.

골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다. 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골손실(연간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(연간 0.5~1%) 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골 손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, 메토트렉사트(methotrexate), 사이클로스포린(cyclosporine), GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다.

위와 같은 골다공증 및 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상에는 포사맥스(Fosamax, 성분명: alendronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 이용되고 있다. 이들 비스포스포네이트 제제들은 대부분 뼈를 파괴하는 파골세포의 기능을 약화하고 사멸을 유도해 뼈의 손실을 느리게 하거나 멈추는 작용을 한다. 그러나 이들 약들은 새로운 골의 형성을 촉진시키는 작용은 가지고 있지 않으며, 최근 비스포스포네이트를 복용하는 환자에서 턱뼈의 괴사(osteonecrosis), 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다. 따라서 골 흡수를 억제하는 것보다 골의 형성을 촉진시키는 골다공증 예방 및 치료제의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 파골세포의 분화 및 활성을 억제하여 골 파괴에 의해 발생하는 다양한 골 질환에 대하여 우수한 예방 및 치료 효과를 갖는다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 파골세포의 분화 및 활성을 억제하여 골 파괴에 의해 발생하는 다양한 골 질환에 대하여 우수한 예방 및 치료 효과를 갖는다는 것을 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.

본 발명의 펩타이드는 파골세포의 분화 및 활성을 효과적으로 억제한다.

관절 내에서 골 파괴는 파골세포(osteoclast)가 활성화되면서 나타나는데 조혈모세포에서 분화한 골수성 전구세포(myeloid precursor)가 염증성 환경에서 파골세포로 분화된다. 류마티스관절 내에는 많은 염증성 사이토카인 및 케모카인이 존재하며 이들 물질에 의해 파골세포 분화에 필요한 여러 분자의 발현이 증가되어 파골세포 형성을 유도하게 된다. 류마티스관절염의 치료 목표는 골 파괴를 억제하여 관절 손상을 최소화하는 것이 중요하다고 인식되고 있다.

골수성 전구세포가 파골세포로 분화되는데 필수적인 물질로는 전구세포 표면에서 RANK(receptor activator of nuclear factorκB)이 유도되고 이에 대한 리간드인 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB ligand)을 제공하는 세포가 결합되는 소위 RANK-RANKL상호작용이 필수적이다. 이와 더불어 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)도 파골세포가 성숙하고 분화하는데 중요한 역할을 담당한다. 파골세포 분화의 주된 신호전달 경로로 RANK-RANKL 상호작용과 M-CSF가 필수적이지만, 전구세포 표면에 있는 여러 종류의 면역글로불린 유사 수용체(Ig-like receptor)를 통해 세포 내 신호전달 물질인 DAP12나 FcRγ에 연결되어 co-stimulatory signal을 제공한다. 가장 중심이 되는 신호전달 경로는 RANKL-RANK 상호결합이 이루어진 후 세포 내 신호전달 물질인 TRAF6(TNF-receptor-associated factor 6)을 통해 NF-kB 활성화를 거쳐 파골세포 형성에 필요한 유전자 전사를 증가시켜 이루어진다. 다음으로 M-CSF 역시 파골세포로 분화하는데 필수적인 물질로 알려져 있고, 수용체 타이로신 키나아제 수퍼패밀리에 속하는 cFMS와 같은 특이 수용체에 결합 후에 세포질 내 Src-PYK2 복합체를 구성하여 이를 통해 NF-κB와 같은 전사조절 물질을 유도하거나 인테그린 단백질을 통해 세포 내 신호전달 역할을 수행한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 파골세포 분화에 관련된 TRAP(tartrateresistant alkaline phosphatase) 및 카텝신 K(cathepsin K)의 발현을 감소시키며, NF-κB 의 핵 내 이동을 억제하여 결과적으로 파골세포의 분화 및 활성을 억제시킨다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 “안정성”은 “인 비보”안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 파골세포의 분화 및 활성을 억제하기 때문에 골 파괴와 관련된 골 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

본 발명의 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 파골 작용이 과도한 경우에 발생하는 모든 질환에 사용될 수 있으며, 예컨대 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성골질환 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1일 당 0.0001-200 ㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명의 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 파골세포 분화 및 활성 억제능을 가지며 골 파괴와 관련된 골 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

(ii) 본 발명의 펩타이드는 파골세포 분화와 관련된 TRAP 및 카텝신 K(cathepsin K)의 발현을 감소시키며 NF-κB 의 핵 내 이동을 억제하여 궁극적으로 파골세포의 분화를 억제한다.

(iii) 본 발명은 상술한 펩타이드를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 펩타이드 처리에 의한 파골세포 분화 시 발현되는 TRAP 단백질의 발현정도 변화를 TRAP 염색을 통해 확인한 결과이다.
a. 서열목록 제1서열의 펩타이드, b. 서열목록 제2서열의 펩타이드, c. 서열목록 제3서열의 펩타이드.
도 2는 본 발명의 펩타이드 처리에 의한 파골세포 분화 시 발현되는 TRAP 및 카텝신 K의 mRNA 레벨을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
a. 서열목록 제1서열의 펩타이드, b. 서열목록 제2서열의 펩타이드, c. 서열목록 제3서열의 펩타이드.
도 3은 본 발명의 펩타이드 처리에 의한 파골세포 분화 시 촉진되는 NF-κB의 핵 내 이동의 변화를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
a. 서열목록 제1서열의 펩타이드, b. 서열목록 제2서열의 펩타이드, c. 서열목록 제3서열의 펩타이드.
도 4는 본 발명의 펩타이드 처리에 의한 파골세포 분화 시 발현되는 TRAP의 발현 정도를 면역화학염색을 통해 확인한 결과이다.
a. 서열목록 제1서열의 펩타이드, b. 서열목록 제2서열의 펩타이드, c. 서열목록 제3서열의 펩타이드.
도 5는 본 발명의 펩타이드 처리에 의한 파골세포 분화 시 발현되는 카텝신 K의 발현 정도를 면역화학염색을 통해 확인한 결과이다.
a. 서열목록 제1서열의 펩타이드, b. 서열목록 제2서열의 펩타이드, c. 서열목록 제3서열의 펩타이드.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄(DCM) 용액을 넣고 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 DMF를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ㎖를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Arg(Pbf)-CTL Resin을 제조하였다.

새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Leu-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400mmole DIEA (N,N-Diisopropylethylamine) 를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Leu-Arg(Pbf)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다.

선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Val, Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(tBu) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt(Hydroxybenzotriazole)를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, 오산화인(Phosphorus pentoxide, P₂O₅) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[TFA(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Ser-Pro-Val-Glu-Phe-Leu-Arg 펩타이드 1(서열목록 제1서열)을 0.80 g 합성하였다(수율: 88.8%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 846.7(이론값 : 846.9)을 얻을 수 있었다. 위와 같은 방법으로 서열2 펩타이드(Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile-Ile-Arg-Thr)(서열목록 제2서열) 및 서열 3 펩타이드(Ala-Cys-Ile-His-Thr-Leu-Ser-Leu-Leu-Cys)(서열목록 제3서열)도 합성하였다(수율: 각각 86.4%, 83.2%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1086.3(이론값 : 1086.3) 및 1073.0(이론값: 1073.3)의 값을 각각 얻을 수 있었다.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
		분석치	이론치
서열 1	Ser-Pro-Val-Glu-Phe-Leu-Arg	846.7	846.9
서열 2	Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile-Ile-Arg-Thr	1086.3	1086.3
서열 3	Ala-Cys-Ile-His-Thr-Leu-Ser-Leu-Leu-Cys	1073.0	1073.3

실시예 1: TRAP 염색

파골세포 분화 시 발현되는 TRAP 단백질의 정도를 염색을 통해 확인하고 펩타이드 처리 시 감소되는 경향을 관찰하고자 하였다.

1x10⁴ 세포/웰로 48-웰 플레이트에 Raw264.7 대식세포를 시딩한 후 동시에 농도별로 펩타이드를 처리(펩타이드 단독 또는 50 ng/ml RANKL 동시 처리)하고, 5일간 배양하여 분화를 유도하였다. Sigma aldrich사의 acid phosphatase kit을 사용하여 TRAP 염색을 수행하였다. 고정 버퍼를 첨가 후 30초간 반응 시키고 증류수로 세척하였다. 염색용액을 웰당 200 μl 넣고 37℃ 30분간 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. 하루 건조한 후 현미경으로 관찰하였다.

RANKL 처리에 의해 파골세포 분화가 유도되어 TRAP 발현이 증가된 대조군에 비해, 서열 1 내지 3 펩타이드를 처리한 군에서는 TRAP 발현이 농도 의존적으로 감소된 것을 관찰할 수 있었다(도 1a-c).

실시예 2: TRAP 및 카텝신 K(cathepsin K)에 대한 RT-PCR

파골세포 분화 시 발현되는 TRAP 및 Cathepsin K의 mRNA level을 RT-PCR을 통해 확인하고 펩타이드 처리 시 감소되는 경향을 관찰하고자 한다.

1X10⁴ 세포/웰의 세포 밀도로 48-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 시딩하였다. 50 ng/ml RANKL과 펩타이드를 농도별(10, 50 μg/ml)로 처리하고 5일 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양 완료된 세포 회수 후 RNA extraction solution(Easy Blue, Intron) 처리하여 RNA를 준비한 후 RT premix(Intron)를 사용하여 cDNA 합성하였다. 각 표지 인자(카텝신 K, TRAP)에 대한 프라이머와 PCR premix(Intron)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 1% 아가로오스 겔에 PCR 결과물 5 μl씩을 로딩하여 전기영동한 후 Gel-Doc에서 밴드를 확인하였다. RANKL 처리에 의해 유도된 파골세포 분화 마커, TRAP 및 카텝신 K의 발현이 서열 1 내지 3 펩타이드 처리에 의해 감소된 것을 관찰하였다(도 2a-c).

실시예 3: 웨스턴 블롯으로 NF-κB의 위치 이동 분석

파골세포 분화 시 촉진되는 NF-κB 핵 내 이동을 확인하기 위해, 핵단백질을 분리하고 RANKL 처리에 의한 핵 내 NF-κB 레벨 증가를 관찰한 뒤 펩타이드 처리에 의한 감소 경향을 관찰하고자 하였다.

5x10⁵ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 마우스 대식세포주 Raw 264.7 대식세포를 시딩하였다. 하룻밤 동안 배양 후 무혈청 배지로 배지 교환하여 6시간 배양하였다. RANKL 50 ng/ml과 소재를 농도별로 처리하고 30분 동안 배양하였다. 처리 완료된 세포에서 핵 단백질을 추출하고 BCA 정량 후 샘플을 준비하여 SDS-PAGE에 전기영동하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼 한 후 5% 스킴 밀크를 사용하여 1시간 동안 블록킹 하였다. 1차 항체 항-NF-κB p65를 1:1,000로 블록킹 용액에 희석하여 냉장에서 하룻밤 동안 배양하였다. PBST로 15분간 3번 세척 후 2차 항체 항-rabbit IgG-HRP를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 15분간 3번 세척 후 ECL 용액으로 발색을 진행하였다.

RANKL 처리에 의해 유도된 NF-κB의 핵 내 이동이 서열 1 내지 3의 펩타이드 처리에 의해 감소되는 것을 관찰하였다(도 3a-c).

실시예 4: TRAP에 대한 면역화학염색

파골세포 분화 시 발현되는 마커인 TRAP의 발현 정도를 형광 염색을 통해 보다 명확하게 재확인하고 펩타이드 처리에 의한 발현 감소 경향을 관찰하고자 하였다.

2x10⁴ 세포/웰로 48-웰 플레이트에 Raw264.7 대식세포를 시딩하고 동시에 소재를 농도별로 처리하였다. 분화유도 5일 후, 세포에 4% 파라포름알데하이드를 넣고 20분 동안 상온에서 배양하여 고정시켰다. PBS로 3번 세척 후, 0.3% Triton X-100(in PBS)을 넣고 15분 동안 상온에서 배양하였다. 그 후 PBS로 3번 세척하였다. 2% BSA(in PBS)를 넣고 1시간 동안 상온에서 배양하여 블록킹시켰다. 1차 항체(TRAP)를 2% BSA에 1:100으로 희석 후 상온에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후, 텍사스 레드-융합 2차 항체를 2% BSA에 1:100으로 희석 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후, DAPI가 포함되어 있는 마운팅 용액으로 마운팅하고 다음날 형광현미경으로 관찰하였다.

RANKL 처리에 의해 파골세포 분화가 유도되어 TRAP 발현이 증가된 대조군에 비해 서열 1 내지 3 펩타이드를 처리한 군에서는 RAP 발현이 농도 의존적으로 감소된 것을 관찰하였다(도 4a-c).

실시예 5: 카텝신 K에 대한 면역화학염색

파골세포 분화 시 발현되는 마커인 카텝신 K의 발현 정도를 형광 염색을 통해 보다 명확하게 재확인하고 펩타이드 처리에 의한 발현 감소 경향을 관찰하였다.

2x10⁴ 세포/웰로 48-웰 플레이트에 Raw264.7 대식세포를 시딩하고 동시에 소재를 농도 별로 처리하였다. 분화유도 5일 후, 세포에 4% 파라포름알데히드를 넣고 20분 동안 상온에서 배양하여 고정시켰다. PBS로 3번 세척한 후, 0.3% Triton X-100(in PBS)을 넣고 15분 동안 상온에서 배양하고 PBS로 3번 세척하였다. 2% BSA(in PBS)를 넣고 1시간 동안 상온에서 배양하여 블록킹하였다. 1차 항체(카텝신 K)를 2% BSA에 1:100으로 희석 후 상온에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후, FITC-융합 2차 항체를 2% BSA에 1:100으로 희석 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후, DAPI가 포함되어 있는 마운팅 용액으로 마운팅하고 다음날 형광현미경으로 관찰하였다.

RANKL 처리에 의해 파골세포 분화가 유도되어 카텝신 K 발현이 증가된 대조군에 비해 서열 1 내지 3 펩타이드를 처리한 군에서는 카텝신 K 발현이 농도 의존적으로 감소되었다(도 5a-c).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CAREGEN Co,.LTD. <120> Peptides Having Activities for Inhibiting Differentiation and Activity of Osteoclast and Uses Thereof <130> PN140413 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Ser Pro Val Glu Phe Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Arg Thr 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 Ala Cys Ile His Thr Leu Ser Leu Leu Cys 1 5 10

Claims (6)

1. 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 TRAP(tartrateresistant alkaline phosphatase)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 카텝신 K(cathepsin K)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 NF-κB 의 핵 내 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 골 질환은 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성골질환인 것을 특징으로 하는 조성물.

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