WO2006135069A1 - 破骨細胞分化形成抑制剤、および骨代謝異常疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents

破骨細胞分化形成抑制剤、および骨代謝異常疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides new knowledge regarding the formation of osteoclasts involved in bone metabolism. Furthermore, the present invention is based on this new finding, a substance for inhibiting osteoclast differentiation (an inhibitor of osteoclast formation), and by inhibiting osteoclast differentiation by forming a bone.
  • the present invention relates to a method for controlling metabolism and a method for preventing or treating bone diseases caused by abnormal bone metabolism.
  • the present invention relates to a method for screening an ingredient that suppresses osteoclast differentiation and is effective as a preventive or therapeutic agent for bone diseases caused by abnormal bone metabolism.
  • Bone is a supporting tissue of a living body and a dynamic tissue in which bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts are constantly repeated. Normally, the balance between bone formation and bone resorption is maintained, but when the functional balance between osteoblasts and osteoclasts is abnormal, this dynamic equilibrium is broken, causing various bone diseases.
  • bone diseases include postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, osteoporosis due to steroid treatment, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, osteoarthritis of the hip, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, chronic renal failure Bone density decrease, bone marble disease and the like.
  • Osteoclasts are huge multinucleated cells responsible for bone resorption, which are separated from monocyte Z macrophage hematopoietic cells. In vivo, osteoclasts are classified as RANKL (Receptor a ctivator of NF— ⁇ B iigand), an osteoblastic force-induced osteoclast fraction stimulated by parathyroid hormone (PTH). 7) M—CSF (Macrtophage colony stimulating fa ctor) is promoted by secreting. Many molecules that play an important role in the osteoclast differentiation process and function have been identified (for example, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • c-Src a non-receptor tyrosine kinase of about 60 kDa
  • c-Src knockout mice differentiate osteoclasts but do not have bone resorbability
  • c-Src is considered to be a component responsible for osteoclast activation (acquisition of bone absorption). It is considered.
  • Osteoclasts from c-src knockout mice are TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) positive cells, but the morphology of the cells is abnormal.
  • Non-Patent Document 1 Johnson RS, et.al., Cell. 1992 Nov 13; 71 (4): 577-586
  • Non-Patent Document 2 Franzoso G, et.al, Genes Dev. 1997 Dec 15; 11 (24): 3482-3496
  • Non-Patent Document 3 Tondravi MM, et.al., Nature.1997 Mar 6; 386 (6620) : 81-84
  • Non-Patent Document 4 Soriano, P., Cell 64 693-702, 1991
  • osteoclasts have bone resorption activity and are essential for bone metabolism in vertebrates, and their formation and increased activity are caused by bone diseases such as osteoporosis and bone destruction associated with rheumatoid arthritis. It is known that it becomes a factor. Therefore, the development of drugs and methods that control osteoclast differentiation is considered to be useful as a solution for bone metabolic diseases, one of the social problems in an aging society. In that case, it is possible to develop a highly safe pharmaceutical by targeting the c-src gene or c-S rc (protein).
  • An object of the present invention is to provide a method and a substance (an osteoclast differentiation inhibitor) that inhibits osteoclast differentiation using c-Src as a target molecule. Another object of the present invention is to provide a method for controlling bone metabolism by inhibiting the formation of osteoclasts and a method for preventing or treating bone diseases caused by abnormal bone metabolism. Furthermore, the object of the present invention is to provide a method (screening method) for searching for a substance that can suppress the formation of osteoclast differentiation and can be an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for bone diseases caused by abnormal bone metabolism. It is to be. Another object of the present invention is to provide a substance that can be effectively used in a powerful screening method.
  • the c-src gene is an essential gene for osteoclast formation, and the mechanism is that c-Src (protein), which is the expression product of the c-src gene, is a specific site of the target protein in the cell. It is known that it is based on the binding of tyrosine residues in the phosphatase.
  • the present inventors have exhaustively searched for a protein that specifically binds to c-Src (c-Src-binding protein) in osteoclasts.
  • ADAP association of adhesion and aegranulation— Promoting adaptor protein
  • Strength S protein (3 ⁇ 4DO)
  • the present inventors have found that the binding site to C-Src on ADAP (in the case of mouse ADAPpl30, the tyrosine residue 807 site (Tyr807))
  • tyrosine residue 761 Identify the site (Tyr761), tyrosine residue 817 in the case of human ADAPpl30 (Tyr817), and tyrosine residue 771 in the case of human DAPpl20 (Tyr771)), and simultaneously inhibit ADAP expression (ADAP knock) Down cells), osteoclasts do not differentiate and multinucleated cells are formed, and therefore, by inhibiting the binding of c-
  • Osteoclast formation causes bone diseases such as osteoporosis and bone destruction associated with rheumatoid arthritis.
  • osteoclasts are specifically inhibited by binding to C-Src and ADAP (Tyr807 site for mouse ADAPpl30, Tyr761 for mouse ADAPpl20, Tyr817 site for human ADAP, Tyr771 for human ADAPpl20) It is considered that c-Src function expression is blocked in osteoporosis and osteoclast differentiation is suppressed, and as a result, bone metabolism can be controlled and bone diseases based on abnormal bone metabolism can be improved.
  • An osteoclast differentiation inhibitor containing as an active ingredient a substance that inhibits the binding between C-Src and ADAP (adhesion of degranulaton-promoting adaptor protein) in monocyte-derived macrophage-like cells.
  • An osteoclast differentiation inhibitor containing as an active ingredient a substance that inhibits the binding of ADAPpl30 to Tyr807 or mouse ADAPpl20 to Tyr761.
  • Osteoclasts whose active ingredient is a substance that inhibits the binding of human C-Src SH2 domain to Tyr817 of human ADAPp 130 or Tyr771 of human ADAPpl20 in monocyte-derived macrophage-like cells Differentiation formation inhibitor.
  • An osteoclast differentiation inhibitor comprising as an active ingredient DNA encoding the polypeptide described in any one of (a) to (c) below.
  • ( ⁇ -1) A binding inhibitor of ADAP and c-Src that also has a polypeptide power having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ -2 A binding inhibitor of ADAP and c-Src consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a cell membrane permeability sequence.
  • (II-3) The binding inhibitor according to (II-2), wherein the cell membrane permeability sequence is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • (IV-4) A binding inhibitor of ADAP and c-Src comprising a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • ADAP and c-Src binding inhibitor that also has the polypeptide ability described in (a) or (b) below:
  • (III-1) A method of suppressing osteoclast differentiation, which comprises inhibiting the binding of c-Src and ADAP (adhesion of degranulation-promoting adaptor protein) in monocyte-derived macrophage-like cells.
  • (III-2) Mouse c-Src SH2 domain in monocyte-derived macrophage-like cells and mouse ADAPpl30 807th tyrosine residue (Tyr807) or mouse ADAPpl20 761st tyrosine residue (Tyr761)
  • a method for inhibiting osteoclast differentiation which comprises inhibiting the binding of the osteoclast. Inhibiting the binding of mouse c-Src SH2 domain to Tyr807 of mouse ADAPpl30 or Tyr761 of mouse ADAPpl20 in monocyte-derived macrophage-like cells (III-2). Suppression method.
  • ( ⁇ -5) Suppresses phosphorylation of Tyr817 of human ADAPpl30 or Tyr771 of human ADAPpl20, and SH2 domain of human c-Src and Tyr8171 of human ADAPpl30 or Tyr771 of human ADAPpl20 in monocyte-derived macrophage-like cells
  • (IV-2) Human c-Src SH2 domain in human monocyte-derived macrophage-like cells and human ADAP pl30 817th tyrosine residue (Tyr817) or human ADAPpl20 771 tyrosine residue (Tyr771)
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolic disorders comprising as an active ingredient a substance that inhibits binding to the bone.
  • the aforementioned substance is a substance having an action of suppressing phosphorylation of Tyr817 of human ADAPpl30 or Tyr771 of human ADAPpl20. Is a therapeutic pharmaceutical composition.
  • the above-mentioned substance is an osteoclast component formation inhibitor described in any of (1-6) to (1-11) (IV-1) to (IV- 3.
  • (IV-5) Bone metabolic disorders are osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, lumbar spondylosis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, decreased bone density in chronic renal failure, bone marrow , Burkitt lymphoma, malignant lymphoma, familial bone paget disease, familial expansile osteolysis (FEO), or periodontal disease (IV-1) to (IV-4) A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of abnormal bone metabolism described in any of the above.
  • V-1 An effective amount of a substance that inhibits the binding of c-Src and ADAP (adhesion of degranulation-promoting adaptor protein) in monocyte-derived macrophage-like cells.
  • a method for preventing or treating a disease of abnormal bone metabolism comprising administering to a subject in a state.
  • V-2 Human c-Src SH2 domain and human ADAP in monocyte-derived macrophage-like cells
  • (V-3) The substance mentioned above is a substance having an action of suppressing phosphorylation of Tyr817 of human ADAP pl30 or Tyr771 of human ADAPpl20. Or treatment method.
  • (V-4) The substance is an osteoclast differentiation inhibitor described in any one of (1-6) to (1-11), (V-1) to (V- 3.
  • V-5 Osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, deformed lumbar spondylosis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, decreased bone density in chronic renal failure , Myeloma, Burkitt lymphoma, malignant lymphoma, familial osteopageet disease, familial expansile osteolysis (FEO), or periodontal disease (V-1) to (V- 4. The method for preventing or treating a bone metabolic disorder described in 4).
  • ADAP adheresion of degranulation—promoting adaptor protein
  • (VI-6) A method for searching for or obtaining an active ingredient of a pharmaceutical thread or composition for the prevention or treatment of a bone metabolic disorder, (VI-1) to (VI-5), which is described in any one of Screening method.
  • (VI-7) Bone metabolic disorder is osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, lumbar spondylosis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, decreased bone density in chronic renal failure, bone marrow
  • the screening method according to (VI-6) which is a tumor, Burkitt lymphoma, malignant lymphoma, familial bone paget disease, familial expansile osteolysis (FEO), or periodontal disease.
  • ADAP adheresion of degranulation—promoting adaptor protein
  • (VII-2) Screening method for c-SrcZADAP binding inhibitor having the following steps: (a ') Mouse C-Src SH2 domain and mouse ADAPpl30 807th tyrosine in the presence of the test substance Contacting the residue (Tyr807) or the 761 tyrosine residue (Tyr761) of mouse ADAPpl20, measuring the binding of Tyr761 in
  • (VII-4) Screening according to any one of (VII-1) to (VII-3), which is a method for searching for or obtaining an active ingredient of a pharmaceutical composition for prevention or treatment of diseases of abnormal bone metabolism. Method.
  • (VII-5) Osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, lumbar spondylosis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, decreased bone density in chronic renal failure, bone marrow
  • the "bond” in the present invention is not particularly limited in its aspect, but preferably includes “association”.
  • Tyr807 of mouse ADAPpl30 or Tyr761 of mouse ADAPpl20 means a tyrosine residue located at position 807 or 761 from the N-terminus of mouse ADAPpl30 (protein) or mouse ADAPpl20, respectively.
  • Tyr817 of human ADAPpl30 or Tyr771 of human ADAPpl20 means a tyrosine residue located at position 817 or 771 from the N-terminus of human ADAPpl30 (protein) or human ADAPpl20, respectively.
  • the action point that is, the target molecule
  • the action point is not limited to the strength of the substance's effects. It is desirable that the action is specific to the target disease, tissue or cell.
  • the osteoclast differentiation inhibitor and the pharmaceutical composition for preventing or treating abnormal bone metabolism comprising the same as the active ingredient provided by the present invention are considered to act specifically on osteoclasts. is expected. In other words, when c-src is knocked out, the effect on osteoclast formation and function is only seen, and no effect on osteoclasts is seen when knocking out other src families.
  • the mechanism of action of the pharmaceutical composition of the invention does not affect the development or maintenance of the individual, and is effective only on osteoclasts. is expected.
  • the osteoclast differentiation inhibitor provided by the present invention and the pharmaceutical composition comprising this as an active ingredient are mammals including humans. It is highly safe to use!
  • the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention comprises as an active ingredient a substance that inhibits the binding of c-3 ⁇ 4rc and ADAP ⁇ adhesion of degranulation—promoting adapter protein in monocyte-derived macrophage-like cells.
  • monocyte-derived macrophage-like cells may be macrophage-like cells derived from monocytes of vertebrates including humans or non-human mammals that can differentiate into osteoclasts.
  • cell lines include RAW264, RAW26 4.7, and RAW247 (Meiyanto E. et al, Biochem Biophys Res Commun., 282, p278-p283 (2001)).
  • Examples of “monocyte-derived macrophage-like cells” include bone marrow cells, spleen cells, or cells derived from inflammatory sites where osteoclast hyperplasia such as collagen arthritis and osteoarthritis occurs.
  • the "osteoclast” targeted by the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is a vertebrate osteoclast including mammals other than human or human. Osteoclasts formed from “monocyte-derived macrophage-like cells” in the above. Osteoclasts adhere to the surface of the bone and exhibit bone resorption ability by secreting acid, various proteases and the like with activity.
  • split formation to osteoclasts means that cells are differentiated and formed so as to exhibit the properties of osteoclasts, or morphological changes thereof. It is a concept including differentiation and formation so as to be activated through bone absorption.
  • “suppression” means 100% inhibition (inhibition) that "monocyte-derived macrophage-like cells” differentiate into “osteoclast", and 100% inhibition. However, it includes both cases where the “monocyte-derived macrophage-like cells” reduce the ability to form an osteoclast originally possessed by osteoclasts.
  • the distribution of osteoclasts can be measured by observing the formation of multinucleated cells that are characteristic of osteoclasts.
  • the tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining method which is a marker for osteoclasts, can be used, but the method is not limited thereto.
  • c-Src and ADAP in monocyte-derived macrophage-like cells
  • examples thereof include substances having an action of suppressing the binding of.
  • c-Src is a gene product of c-src, which was originally discovered as a homolog in the normal cell of the oncogene v-src of Rous sarcoma virus. This is a non-receptor tyrosine kinase of about 60 kDa, and 10 families (Src, Yes, Fgr, Yrk, Fyn, Lyn, Hck, Lck, Blk, Frk) have been reported to date (Sheila M ., et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 1997, 13: 513-609) o FIG. 1 shows a schematic diagram of the primary structure of these Src family proteins.
  • the amino acid sequence is conserved among each Src family, and there is a unique domain (SH4 domain), in which a fatty acid addition site necessary for binding to the cell membrane exists. This is followed by the SH3 domain that recognizes proline-rich sequences and binds to proteins, and the SH2 domain that recognizes phosphorylated tyrosine and binds to proteins, followed by the kinase domain responsible for kinase activity. (SH1 domain). There is a conserved tyrosine residue near the C-terminus that is responsible for proper regulation of Src family kinase activity.
  • This tyrosine residue is usually phosphated by a Csk family kinase, and the kinase domain of Src has an intramolecular association with the SH2 domain, resulting in a closed structure. This has an important role in negative regulation of Sre kinase activity.
  • the SH3 domain is known to bind to the linker region between the SH2 domain and the kinase domain. This also suppresses the kinase activity.
  • other molecules bind to the SH3 domain and SH2 domain of Src, or the C-terminal tyrosine residue is dephosphorylated by phosphatase, resulting in an open Src molecule. Is known to increase kinase activity.
  • c-Src is a protein that exists in all vertebrates including mammals including humans (for example, mouse, chicken, etc.), and the amino acid sequence and base sequence thereof are well known (human C-src gene: Anderson SK et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1122-112 9 (1985), and Tanaka A et al "Mol. Cell. Biol. 7: 1978-1983 (1987), mouse C-src gene: Martinez R et al., Science 237: 411-415 (1987), c-src gene derived from avian birds: Takeya. T and Hanafosa H, Cell 32: 881-890 (1983)).
  • C-Src of human origin And c-Src derived from mouse are both 536 amino acids and have SH2 domain in the region of amino acids 150-247.
  • the c-Src targeted by the present invention is c-Src derived from vertebrates including humans or non-human mammals, preferably human-derived C-Src, mouse-derived c-Src, chicken-derived C-Src can be illustrated.
  • ADAP is a protein expressed in T cells and bone marrow cells in all vertebrates including humans and mammals other than humans (eg, mice, chickens, etc.). ADAP was originally identified as a link between T cell receptor stimulation and the regulation of integrin binding activity, which controls T cell adhesion, and is responsible for integrin cluster formation and adhesion induced by T cell receptors. Known to regulate (Erik J. Peterson et al., Science 293: 2263-2265, 2001) o ADAP has many regions that are thought to mediate protein-protein interactions (eg, , See Figure 2), known to play an important role in the “inside-out” signal that enhances the intracellular adhesion of integrin ligands! /, (Griffit hs, EK, et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14, 317—322; Peterson, EL (2003) I mmmunol. Rev. 192, 113-121).
  • ADAP has two isoforms, ADAP having a molecular weight of approximately 130 kDa (referred to as “ADAPpl30”) and its splicing variant, ADAP having a molecular weight of approximately 120 kDa (referred to as “ADAPpl20”).
  • ADAPpl20 is highly expressed in the thymus and ADAPpl30 is highly expressed in mature T cells, tissue localization is observed, but both are expressed in osteoclasts. In addition, all are considered to have the same action and function (Veale M et al, J. Biol. Chem. 274: 28427-28435 (1999)).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the primary structure of mouse-derived ADAPpl30.
  • ADAP has a proline-rich region (Pro-rich), EVHl (Ena / VASP-homology) -binding domain (FPP PP), phosphothycin site (Tyrosine), and SH3-like domain from the N-terminal side.
  • the phosphotyrosine site (Tyrosine) binds to the SH2 domain of Fyn belonging to the Src family
  • the EVH1-binding domain (FPPPP) binds to the Ena / VASP (Drosophila enable / vasodilated phosphoprotein) family protein.
  • ADAPpl20 has a deletion of 46 amino acids located between the phosphotyrosine site (Tyrosine) of ADAPpl30 and the SH3-like domain. Have a structure.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of mouse AD APpl30
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of mouse ADAPpl20
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of human ADAPpl30
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of human ADAPpl20.
  • Figure 3 shows the alignment between the amino acid sequence of mouse ADAPpl30 and the amino acid sequence of human ADAPpl30 (640 amino acids match; identity: 77.2%).
  • Figure 4 shows the amino acid sequence of mouse ADAPpl20 and human ADA Ppl20. The alignment of the amino acid sequences of (640 amino acids match. Identity: 81.7%). As can be seen, the amino acid sequence of ADAP is relatively conserved among animal species.
  • the ADAP targeted by the present invention is not limited to the isoform (ADAPpl30, ADAPpl20). Further, the type of animal is not particularly limited as long as it is ADAP derived from mammals including humans and vertebrates. Typically, ADAP derived from the same animal is used corresponding to the c-Src derived animal used. Preferred are human-derived ADAP (ADAPpl30, ADAPpl20), mouse-derived ADAP (ADAPpl30, ADAPpl20), and chicken-derived ADAP (ADAPpl30, ADAPpl20).
  • C-Src and ADAP are c-Src SH2 domain and tyrosine residues in the C-terminal region of ADAP (Tyr807 for mouse ADAPpl30 and Tyr807 for mouse ADAPpl20). Tyr761, human ADAPpl30 binds via Tyr817, and human ADAPpl20 binds via Tyr771).
  • the active ingredient of the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention preferably (1) inhibition of binding between the SH2 domain of mouse C-Src and Tyr807 of mouse ADAPpl30 or Tyr761 of mouse ADAPpl20 And (2) human c-Src SH2 domain and human ADAPp. Furthermore, as shown in the experimental examples, c-Src and ADAP need to be cleaved at their tyrosine residues. Therefore, the active ingredient of the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention includes (3) a substance that suppresses phosphorylation of Tyr807 of mouse ADAPpl30 or Tyr761 of mouse ADAPpl20, and (4) Tyr817 of human ADAPpl30 or human AD.
  • ADAP A substance that selectively binds to the SH2 domain of c-Src involved and inhibits binding to ADAP.
  • a tyrosine residue in the C region of ADA P (Tyr807 for mouse ADAPpl30, Tyr761 for mouse ADAPpl20) A substance that selectively binds to c-Src by binding to Tyr817 in the case of human ADAPpl30 and Tyr771 in the case of human ADAPpl20), a tyrosine residue in the C region of ADAP (Tyr807 in the case of mouse ADAPpl30, Examples include substances that suppress phosphorylation of Tyr761 in the case of mouse ADAPpl20, Tyr817 in the case of human AD APpl30, Tyr771 in the case of human ADAPpl20, and substances that inhibit the kinase activity of c-Src.
  • antibodies against the SH2 domain of c-Src, tyrosine residues in the C region of ADAP (Tyr807 for mouse ADAPpl30, Tyr761 for mouse ADAPpl20, Tyr817 for human AD Apl30P)
  • human ADAPpl20 antibodies against the region containing Tyr771), peptides having the above-mentioned amino acid sequence containing the above tyrosine residue in the C region of ADAP, lipids containing inositol phospholipid, ADAP, etc. it can.
  • a tyrosine phosphorylation motif including the tyrosine residue in the C region of ADAP is used.
  • a peptide having an amino acid sequence (DGEIYDDIADGC: SEQ ID NO: 1) containing at least four amino acids at the front and rear as a center can be exemplified.
  • amino acid sequence is a sequence common to mouse and human ADAPpl30 and ADAPpl20 (mouse ADAPpl30: 803-814 region, mouse ADAPpl20: 757-768 region, human ADAPpl30: 813-824 region, Human ADAPpl20: equivalent to the region 767-778), a peptide with a strong amino acid sequence (polypeptide) is common to mouse and human ADAPpl30 and ADAPpl20, and c-Src and ADAP It can be used as a substance that suppresses binding.
  • Examples of the peptide (polypeptide) having a strong amino acid sequence include, for example, at least the region of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) in the amino acid sequence of mouse ADAPpl30 (SEQ ID NO: 5) (803 -814 region).
  • a polypeptide consisting of the 626-819 region of mouse ADAPpl30 (SEQ ID NO: 4) Can be mentioned.
  • these polypeptides have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and have an activity that inhibits the binding between ADAP and c-Src, one or more amino acids are deleted or substituted in other regions. Or it may be added.
  • a polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) for example, in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of mouse ADAPpl20, at least the region (757-768) of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) In the amino acid sequence of human ADAPpl30 (SEQ ID NO: 7), a polypeptide containing at least the region of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) (813-824 region), and the amino acid sequence of human ADAPpl20 (sequence) In No. 8), a polypeptide containing at least the region (767-778 region) of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) can be mentioned.
  • polypeptide corresponding to the polypeptide (SEQ ID NO: 4) having the 626-819 region of mouse ADAPpl30 is composed of the 636-839 region of human ADAPpl20 and the 624-773 region of mouse ADAPpl20. Mention may be made of polypeptides and polypeptides comprising the 644-783 region of human ADAPpl20.
  • polypeptides also have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and are deleted in one or more amino acids in other regions as long as they have the activity of inhibiting the binding between ADAP and c-Src. , May be substituted or added.
  • the peptide (polypeptide) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may further have a cell membrane permeability sequence.
  • the cell membrane permeable sequence is a protein that can permeate the cell membrane of eukaryotes and has Protein Trunsduction Domains (PTDs). These are amino acid sequences that have the function of incorporating large proteins of 120 kD or more into cells. For example, Drosophila Antennapedia transcription factor protein, HIV-1 Tat transcription factor protein, poiy-arginine, etc. are known (Jehangir S. 'et al., (2002) Current Opinion in Biotechnology. Vol.13, pp.52-56).
  • cell membrane-permeable sequence examples include the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the cell membrane-permeable active region of Tat protein of HIV-1 virus (Schwarze RS, et al., (1999) Science, Vol.285, ppl569-1572).
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of the above peptide (polypeptide) having the cell membrane permeable sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the substances that suppress the binding of c-Src and ADAP are those peptides.
  • (Polypeptide) It may be DNA encoding! / ⁇ .
  • the substance that suppresses the binding of c-Src and ADAP in monocyte-derived macrophage-like cells may include a substance that suppresses the expression or production of ADAP in such monocyte-derived macrophage-like cells. it can.
  • substances that suppress ADAP expression or production in monocyte-derived macrophage-like cells include ADAP gene transcription, RNA processing, transport, translation, and substances that suppress Z or stability. it can.
  • Specific examples of such substances include antisense molecules, ribozymes, and RNAi that can hybridize to the base sequence of a gene encoding ADAP and suppress its transcription, RNA processing, transport, translation, and Z or stability.
  • An effector can be exemplified.
  • the antisense molecule used in the present invention is designed to bind to the promoter of ADAP gene or other regulatory region, exon, intron or exon-intron boundary. Many effective antisense molecules are designed to hybridize with intron Z exon 'splice junctions. Therefore, the antisense molecule used in the present invention also has a nucleotide sequence substantially complementary to the region so that it hybridizes to a region within 50 to 200 bases of the intron Z exon 'splice junction of the ADAP gene. It is preferable to have something.
  • a ribozyme is an RNA or RNA protein complex that binds to a target gene (mRNA) in a site-specific manner and cleaves it, thereby inhibiting translation into a protein and expressing gene function. It is a substance that exerts its inhibitory function.
  • the ribozyme used in the present invention has a nucleotide sequence substantially complementary to the region so that it hybridizes with an arbitrary region of mRNA transcribed from the ADAP gene (DNA), and the target to which it is bound. It is designed to cleave the phosphate ester in the oligonucleotide region and inhibit translation into ADAP.
  • RNAi effector performs the function of RNAi (RNA interference) to hybridize to the DNA or mRNA of ADAP, specifically degrades ADAP mRNA, or ADAP residues. It specifically suppresses the expression of a gene.
  • RNAi effectors include siRNA (sma 11 interfering RNA), stRNA (small temporally regulated RNA), and shRNA (short hair pin RNA).
  • siRNA siRNA
  • stRNA small temporally regulated RNA
  • shRNA short hair pin RNA
  • siRNA used in the present invention “5′-AACCAACTTATGAGGAAAA-3 ′” (SEQ ID NO: 11) or “5′-AAGCATGCTGTGACGTTAA-3 ′” (SEQ ID NO: 12) can be preferably used.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • antibodies used in the present invention which are known in the art, can be prepared in accordance with this method. 0 [(For example, Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory manual Old Sp ring Harbor Laboratry, 1988; U.S. Pat. No. 4,196,265).
  • Examples of the antibody suitably used in the present invention include an anti-C-Src antibody, an anti-C-Src / SH2 domain antibody, and an anti-ADAP / SH3-like domain antibody.
  • the osteoclast differentiation method of the present invention can be carried out by inhibiting the binding of c-Src and ADAP (adhesion of degranulation-promoting adaptor protein) in monocyte-derived macrophage-like cells. it can.
  • the binding inhibition is not limited to directly inhibiting the binding between c-Src and AD AP, but also when inhibiting phosphate binding at the ADAP c-Src binding site, or the expression and production of ADAP. This also includes cases where c-Src binding to ADAP is hindered (hereinafter the same).
  • it can be carried out by using the osteoclast differentiation inhibitor described above for c-Src and ADAP, which has the action of inhibiting the binding between c-Src and ADAP.
  • a preferable osteoclast differentiation inhibitor is a substance that inhibits the binding of human-derived c-Src and human-derived ADAP.
  • human c-Src SH2 domain and human ADAPpl30 A substance that inhibits the binding of Tyr817 or human ADAPpl20 to Tyr771, and a substance that inhibits the phosphorylation of Tyr817 of human ADAPpl 30 or Tyr771 of human ADAPpl20.
  • Power Specific examples of the potent substance include a peptide (polypeptide) having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and an example thereof is a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3. it can.
  • the osteoclast differentiation inhibition method of the present invention includes both an in vitro osteoclast differentiation inhibition method and an in vivo osteoclast differentiation inhibition method. It is In the latter case, with respect to a subject with abnormal bone metabolism or its predecessor, osteoclast differentiation is suppressed to prevent the occurrence or progression of abnormal bone metabolic disease, or to improve or treat abnormal bone metastasis. It can also be used effectively as a method.
  • the subject include vertebrates including mammals other than humans. Specific examples of powerful mammals include mice, -birds, rats, wild birds, mussels, guinea pigs, dogs, monkeys, horses, horses, hidges, goats, and pigs without limitation.
  • osteoclast differentiation and increased activity contribute to diseases of abnormal bone metabolism such as osteoporosis. Therefore, the substance that inhibits the binding of c-Src and ADAP described above in I prevents or treats the onset of abnormal bone metabolism based on its action of suppressing osteoclast differentiation. Can be used effectively as a drug
  • Diseases of abnormal bone metabolism include osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, deformed lumbar spondylosis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, decreased bone density in chronic renal failure, myeloma, Burkitt's lymphoma, malignant lymphoma, familial osteopaget's disease, familial expansile osteolysis (FEO), or periodontal disease can be displayed.
  • FEO familial expansile osteolysis
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating a bone metabolic disorder of the present invention comprises a substance that inhibits the binding of c-Src and ADAP, that is, an osteoclast fraction inhibitor as described above for I as an active ingredient.
  • a preferable osteoclast differentiation inhibitor is a substance that inhibits the binding between human-derived c-Src and human-derived ADAP.
  • Inhibiting substances are included.
  • Specific examples of the potent substance include a peptide (polypeptide) having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and an example thereof is a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3. be able to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises an effective amount of an active ingredient (a substance that inhibits the binding between c-Src and ADAP), and a pharmaceutically acceptable carrier known per se, depending on the type. Additives may be included.
  • the pharmaceutical composition is administered in a desired manner, for example, oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, pulmonary administration, nasal administration, enteral administration, intraperitoneal administration, or coronary artery or coronary sinus administration.
  • solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, granules, and capsules; solutions, suspensions, emulsions, syrups, ribosomes It can be prepared, molded or prepared into liquid dosage forms such as preparations, injections, intravenous injections, drops, and elixirs; and external dosage forms such as patches, ointments, complaints, and sprays.
  • Carriers used in the preparation of these pharmaceutical compositions include excipients, diluents, binders, moisturizers, disintegrants that are commonly used depending on the dosage form of the formulation. Examples thereof include disintegration inhibitors, absorption accelerators, lubricants, solubilizers, buffers, emulsifiers, and suspending agents. Additives include stabilizers, preservatives, buffering agents, tonicity agents, chelating agents, pH adjusting agents, surfactants, coloring agents, flavoring agents, Examples include flavoring agents and sweetening agents.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the pharmaceutical composition and the dose thereof are not particularly limited, and may include a desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. It is appropriately selected from a wide range according to. Although the dose varies depending on the administration route, it can usually be administered in the range of 10 pg to 100 mgZkg body weight in terms of the amount of active ingredient per administration.
  • the method for preventing or treating bone metabolism disorder according to the present invention is described above with respect to a substance that inhibits the binding of c-Src and ADAP (adhesion of degranulation-promoting adaptor protein) in monocyte-derived macrophage-like fibroblasts, ie, I. It is carried out by administering an effective amount of an osteoclast fraction inhibitor to a subject in an abnormal state of bone metabolism or its previous state.
  • the preferred osteoclast differentiation inhibitor is a substance that inhibits the binding between human-derived c-Src and human-derived ADAP.
  • human C- Src SH2 domain and human Substances that inhibit the binding of ADAPpl30 to Tyr817 or human ADAPpl20 to Tyr771, and substances that inhibit the phosphorylation of Tyr817 of human ADAPpl30 or Tyr771 of human ADAPpl20 are included.
  • the potent substance include a peptide (polypeptide) having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and an example thereof is a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3. Can do.
  • the substance is effective in suppressing osteoclast differentiation and preventing the development or development of abnormal bone metabolic diseases, or improving the treatment of abnormal bone metabolic diseases, It can be used in the form of a pharmaceutical composition together with a pharmaceutically acceptable carrier or other additives.
  • the administration forms, administration routes, administration methods, and administration doses of these pharmaceutical compositions are as described above in III.
  • the target diseases of abnormal bone metabolism include osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, bone in chronic renal failure Examples include density reduction, myeloma, Burkitt lymphoma, malignant lymphoma, familial bone page et disease, familial expansile osteolysis (FEO), or periodontal disease.
  • vertebrates including mammals other than humans, as described in III (mouse, rabbits, rats, mice, guinea pigs, nu, monkeys, mice, horses, etc.). , Hidge, goat, pig, etc.).
  • the present invention provides a method of screening for a substance that suppresses osteoclast differentiation.
  • Substances searched and obtained by the method of the present invention can suppress the formation of osteoclast differentiation by having the action of inhibiting the binding between c-Src and ADAP. For this reason, it is expected that the substance can prevent or treat diseases of abnormal bone metabolism. Therefore, the method of the present invention can also be said to be a method for screening an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolic disorders.
  • the screening method of the present invention basically has the effect of inhibiting the binding between c-Src and ADAP. Specifically, the following method can be exemplified.
  • a screening method for an osteoclast differentiation inhibitor comprising the following steps:
  • Test substances include, but are not limited to, nucleic acids, peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, and the like. Specifically, screening is performed using these test substances or compositions containing them (for example, Cell extract, gene library expression product, etc.) can be contacted with the subject c-Src and ADAP.
  • test substance and c-Src and ADAP employed in the screening are not particularly limited, but it is usually preferable to carry out in an in vitro experimental system in a physiological environment or in a cell.
  • c-Src used in the present invention is not particularly limited, and cS rc derived from vertebrates including mammals other than humans (eg, mouse hens) in addition to those derived from humans is used. be able to.
  • c-Src may be a full-length protein, but may be a SH2 domain involved in binding to ADAP, or a partial fragment containing at least the SH2 domain. Preferably, it contains the SH2 domain of c-Src and has kinase activity.
  • ADAP origin of ADAP used in the present invention is not particularly limited.
  • Ability to use ADAP derived from vertebrates including mammals other than humans (eg, mouse hens, etc.), derived from the same animal as c-Src used together Is preferably used. Regardless of the isoform, either pl30 or pl20 isoforms may be used.
  • ADAP ADAPpl20, ADAPpl30
  • mouse ADAPpl3 In the case of 0, a partial fragment having a Tyr807 site involved in binding to c-Src, in the case of mouse ADAPpl20, a partial fragment having a Tyr761 site involved in binding to c-Src, and in the case of human ADAPpl30, c-Src In the case of human ADAPpl20, a partial fragment having a Tyr771 site involved in binding to c-Src can also be used. For this reason, the screening method (1) above can be described in more detail as (2) to (4) below.
  • a screening method for an osteoclast fraction inhibitor comprising the following steps:
  • (c ) A step of selecting a test substance that inhibits the above-mentioned binding as an osteoclast differentiation inhibitor [0115]
  • the measurement of the binding between C-Src and ADAP is evaluated by the presence of binding between c-Src and ADAP. How you can If so, there is no particular restriction! For example, after contacting c-Src (or SH2 domain of c-Src) and ADAP (or SH3-like domain of ADAP) in the presence of the test substance, the reaction solution (mixed solution) is subjected to electrophoresis.
  • a method for assessing the presence or absence of binding from the molecular weight, c-Src (or c2-Src SH2 domain) or ADAP (or ADAP SH3-like domain) antibody is used to assess the presence or absence of co-precipitation of other proteins And a method for measuring and evaluating the tyrosine kinase activity of c-Src.
  • Selection of anti-osteoclast differentiation inhibitor (candidate substance) by virtue of screening methods includes c-Src (including partial fragments such as SH2 domain of c-Src) and ADAP (ADAP SH3-like (Including partial fragments such as domains).
  • c-Src including a partial fragment such as the SH2 domain of c-Src
  • ADAP including the SH3-like domain partial fragment of ADAP
  • c-Src and ADA P do not bind at all, and when binding is reduced compared to control, the test substance used can be selected as a candidate for osteoclast differentiation inhibitor .
  • mouse ADAPpl30 Tyr807 mouse ADAPpl20 Tyr761, human ADAPpl30 Tyr817 or human ADAPpl20 Tyr771 is measured, for example, by immunoblotting using an anti-phosphotyrosine antibody. be able to.
  • the substance selected in the above screening has an action of suppressing osteoclast differentiation, and improves the pharmaceutical composition for preventing the onset and progression of abnormal bone metabolism or the abnormal bone metastasis. It can be used as an active ingredient of a therapeutic agent.
  • the diseases of bone metabolism are as follows: osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, arthritis, lumbar spondylosis, systemic lupus erythematosus, osteopenia in diabetes, decreased bone density in chronic kidney failure, myeloma , Burkitt lymphoma, malignant lymphoma, familial bone jet disease, familial expansile osteolysis (FEO), or periodontal disease.
  • the candidate substance selected by the above screening method can be further screened using a model non-human animal having a disease of abnormal bone metabolism.
  • Candidate substances to be selected by force are drug efficacy tests using non-human animals with pathological disorders and bone metabolism disorders, safety trials, and patients with bone metabolism disorders (humans) or their predecessors. By carrying out these tests, which can be used for clinical trials on patients (humans), it is possible to select and obtain more effective active ingredients of a pharmaceutical composition for preventing or treating abnormal bone metabolism.
  • the substance selected in this way is subjected to structural analysis as necessary, and then chemical synthesis, biological synthesis (including fermentation) or genetic engineering operation depending on the type of the substance.
  • the above screening method basically comprises searching for a substance having an action of inhibiting the binding between c-Src and ADAP. Therefore, the above screening method can be defined from a different angle as a method for screening a substance having an action of inhibiting the binding between c-Src and ADAP (c-SrcZA DAP binding inhibitor).
  • the c-SrcZADAP binding inhibitor obtained by this method can suppress the formation of osteoclast differentiation based on its action. Therefore, it is expected that the substance can prevent or treat diseases of abnormal bone metabolism. Therefore, the method of the present invention can also be said to be a method for screening an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating bone metabolic disorders.
  • association which is a preferred embodiment of “binding” between c-Src and ADAP in the present invention, will be described as an example, but the present invention is not limited thereto.
  • HEK293 cells Human embryonic kidney cell line (HEK293 cells) was prepared using Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen) supplemented with 10% FCS and antibiotics (penicillin 'streptomycin). Incubate under the conditions of ° C and 5% CO.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Macrophage cell line (RAW246 cells) uses EMEM (Nissui) supplemented with 10% FCS, non-essential amino acid solution (Gibco) and glutamate solution. Incubate at 37 ° C under 5% CO.
  • osteoclasts were isolated from mouse bone marrow cells by treatment with M-CSF.
  • Progenitor cells were generated. Specifically, mouse bone marrow cells from 6-week-old female ddY mice (CLEA Japan or Japan SLC) with bone marrow strength were treated with 10% heat-inactivated FCS, antibiotics, human M-CSF (RIKEN DNA Incubate overnight in a -MEM (Invitrogen) containing 1% culture supernatant of NIH3T3 / pCAhMCSF cells (MCSF-CM) stably expressing (Bank).
  • Non-adherent cells are collected and re-plated in ⁇ -MEM containing 10% FCS and 3% MCSF-CM. In this way, bone marrow macrophages (BMMs) are obtained as adherent cells. Re-plate it and induce it to become osteoclast by adding GST or RANKL using the conditions described in (2-1) above.
  • osteoclasts before fusion and multinucleated osteoclasts are obtained 48 hours and 96 hours after addition of RANKL, respectively.
  • TRAP staining described later can be used.
  • TRAP staining solution was mixed with 0.026M tartaric acid (in 0.1M tartaric acid, pH5.2) and 12.5mg / ml naphthol AS-BI phosphate (in 0.1M acetic acid, pH5.2) at a ratio of 24: 1.
  • FAST GARNET GBC (2-aminoazotoluene) in the solution and filter through a 0.8 m filter.
  • CDNA encoding full-length c-Src was prepared from mRNA of RAW264 cells obtained by reverse transcription PCR, and this was expressed using the expression vector pRc / CMV (Invitrogen) or retorvirus expression vector.
  • Kuta I pCX4 puro (Akagi, T., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1356 7-13572).
  • GST-U.SH3.SH2 expression vector and GST-U.SH3 expression vector c- Src SH3-SH2 domain (amino acids 1-262) or C- Src SH3 domain (amino acids 1- 149) is obtained in the same manner as described above, and is introduced into each of the fusion vectors (pGEX-3X GST: Amersham Biosciences), and the GST-U'SH3'SH2 expression vector and GST-U'SH3 Prepare an expression vector.
  • CDN A encoding full-length c-Src is prepared from mRNA of RAW264 cells obtained by reverse transcription PCR, and introduced into the expression vector pRc / CMV (Invitrogen). Then, using a mutation generation kit (Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE)), the 527th tyrosine residue was replaced with ferrolanine or the 295th lysine residue with methionine.
  • -Src catalytically active CA mutant (CA) (SrcY527F) expression vector or c-Src KD mutant (KD) (kinase-deficient, SrcK295M) expression vector is prepared.
  • CDNA encoding ADAP (pl30) was prepared from mRNA of RAW264 cells obtained by reverse transcription PCR and introduced into the expression vector pFLAG / CMV2 (EASTMAN KODAK COMPAN Y) or the retort virus expression vector pCX4-puro. Prepare.
  • the expression vector is the ADAP residue on the ADAP (pl30) expression vector prepared by the above method.
  • ADAP YF-mutant (Y615F) expression vector was obtained from the ADAP (pl30) expression vector prepared by the above method using a mutation generation kit (Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE)). The second tyrosine residue is replaced with ferrolanine And prepare by.
  • siADAP-1 5'- AACCTACCTACGAGGAGAA-3 '(200-218) (SEQ ID NO: 9) for siADAP-2 5 and AAGCCTGCTGCGATGTCAA— 3 ′ (1514-1532) (SEQ ID NO: 10)
  • the annealed oligonucleotide is introduced into the expression vector pSuper (01igo Engine) having a neomycin resistance gene (pSuper—siADAP-1 and pSuper—siADAP-2).
  • the target sequences for siADAP-1 and siADAP-2 were respectively 5'-AACC Crr: GAGG AA-3 '(si ADAP-1) (SEQ ID NO: 11), 5' -A Change to AGCATGCTGTGACGTTAA-3 '(siADAP-2) (SEQ ID NO: 12) (underlined part is the changed site).
  • HEK293 cells Gene transfer into HEK293 cells is performed using the polyethylenimine (PEI25) method according to the method described in the literature (Thomas, M., et al., (2002) Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 99, 14640-14645). Done using. Specifically, 3 ⁇ 10 5 HEK293 cells are seeded per 60 mm diameter culture dish and cultured in D-MEM containing FCS at 37 ° C, CO concentration 5%. The next day, cells are 50-90
  • Retor virus infection uses FuGENE 6 (Roche) to transfect HEK293 cells with pGL, pE-Eco (TaKaRa) and retroviral expression vectors. On the second day after transfer, the supernatant is collected and concentrated by centrifugation of the retrovirus at 8,000 xg for 16 hours. [0142] (7) ADAP-Knockdown RAW264
  • RAW264 cells are prepared using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) by transfection with pSuper-siADAP-1 and pSuper-siADAP-2 or an empty vector and isolating neomycin-resistant clones. Specifically, RAW264 cells are seeded in a 35mm diameter culture dish to 30-50% confluence, 37 ° C, CO concentration 5%, FCS containing E-
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM Na VO, 20 mM NaF, l% Triton X-100 )
  • Immunoprecipitation and Western blot are performed as described in the literature (Ishida, N., et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-41156).
  • the antibody-protein complex is precipitated using Protein G Sepharose or Protein A Sepharose conjugated with Rabbit IgG Fraction to Mouse IgG (MP Biomedicals).
  • the antibodies used for immunoprecipitation, western blotting, and immunostaining are as follows.
  • the protein is eluted in 100 ⁇ l of buffer H containing 500 mM NaCl.
  • the recovered protein is concentrated and separated on a 10% SDS polyacrylamide gel (1 mm thick and 6 cm long). Proteins are stained with Sypro Ruby (Molecular Probes) and visualized with UV illumination.
  • osteoclasts were treated with GST pull-down buffer (1% NP-40, 25 mM Hepes, 150 mM NaCl, ImM EDTA, lOmM MgCl, 10% glycerin, 2 mM NaVO
  • Immunostaining is performed according to the literature (Geng, L., et al, (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98, 11527-11532). Briefly, cells are fixed on a coverslip by treatment with PBS containing 2% paraformaldehyde (TAAB LABORATORIES) for 10 minutes and then permeabilized by treatment with PBS containing 0.1% TritonX-100 for 10 minutes. . After blocking with non-specific binding by treatment with 5% skim milk / 5% FCS / PBS for 30 minutes, the cells are incubated with anti-ADAP mAb for 30 minutes.
  • Cells on 12-well plates are stimulated with RANKL and incubated for 2 days to prepare osteoclast progenitors in the pre-fusion stage. Cover cells with mineral oil, 5% CO
  • osteoclast cell lysate that also induced GST-fused Src protein and RAW264 cell force.
  • GST-fused Src protein a mouse Src having SH3 and SH2 domains (GST-U'SH3'SH2) was used.
  • the cell lysate of osteoclasts was prepared by culturing RAW264 cells in the presence of RANKL for 4 days using a GST pull-down buffer (1% NP-40, 25 mM Hepes, 150 mM NaCl, ImM EDTA, lOmM MgCl, 10% glycerin, 2 mM
  • cProtein (GST-U ⁇ SH3 ⁇ SH2) and GST for control were expressed in E. coli and used according to standard methods using lutathione-Sepharose 4B (Amersham Biosciences). GST was prepared from the control vector pGEX-3X.
  • ADAP is the first protein that has been shown to interact with c-Src for the first time (see References 13-16 for other proteins).
  • ADAP was originally identified as an adapter 'protein that can bind to several proteins, including Fyn, and is known to play an “inside-out” signaling role under the activity of a T cell receptor. (Griffiths, EK, et al, (2002) Curr. Opin. Immunol. 14, 317-322; Peterson, EL (2003) Imm unol. Rev. 192, 113-121).
  • ADAP is required for association with c-Src via the SH2 domain, that is, for association of Src with the SH2 domain force ADAP.
  • RAW264 cells express two ADAP isoforms (pl20 and pl30) (Veale, M., et al., (1999)). J. Biol. Chem. 274, 28427-28435).
  • FIG. 2 shows a structural schematic diagram of mouse ADAP isoform pl30 (mouse ADAPpl30).
  • the amino acid sequence of mouse ADAPpl30 is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of mouse ADAPpl20 is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Mouse ADAPpl20 is a splicing variant in which the 46 amino acid residues located in the amino acid 627-672 region of mouse ADAPpl30 have been deleted.
  • ADAP derived from humans is known to have two isoforms (pl20 and pl30).
  • the amino acid sequence of human ADAPpl30 is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of human ADAPpl20 is shown in SEQ ID NO: 8.
  • FIG. 3 shows a comparison between the amino acid sequence of mouse ADAPpl30 and the amino acid sequence of human ADA Ppl30
  • FIG. 4 shows a comparison between the amino acid sequence of mouse ADAPpl20 and the amino acid sequence of human AD APpl20.
  • the mouse ADA Ppl30 and human ADAPpl30 are 77.2% identical in amino acid sequence, and mouse 0? 120 and human 0? 120 is 81.7% of the amino acid sequence.
  • ADAP may have a similar structure between animals in each isoform.
  • HEK293 cells were transfected with various mutants of Src and ADAP, immunoprecipitated with anti-FLAG antibody, and timestamped with anti-tyrosine phosphorylated antibody ( ⁇ -pTyr) (Fig. 6A, The third panel from the top).
  • ⁇ -pTyr anti-tyrosine phosphorylated antibody
  • WT wild type-cSrc
  • CA CA mutant
  • RAW264 cells were transfected with a retrovirus expressing the Src KD mutant (SrcKD) or the Src CA mutant (SrcCA).
  • Cell lysates prepared from these infected cells are immunoprecipitated with anti-tyrosine phosphate antibody ( ⁇ -pTyr) to give anti-ADAP antibody and Imnob.
  • Rotated top panel in Figure 6B.
  • whole cell lysates of the infected cells were Western blotted using anti-Src antibody (middle panel in FIG. 6B) or anti-ADAP antibody (lower panel in FIG. 6B).
  • ADAP isomers missing ADAP C-terminal region 615 or later
  • HEK cells were forced to express the CA isomer of Src (CA) (SrcY527F) and full-length ADAP (foil), ADAP, or ADAP with FLAG attached, respectively.
  • CA CA isomer of Src
  • Foil full-length ADAP
  • ADAP ADAP with FLAG attached
  • 1-326 1-614 were forcibly expressed, immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody, and blotted with an anti-tyrosine phosphate antibody ( ⁇ -pTyr) that recognizes tyrosine phosphate. As a result, it was confirmed that tyrosine phosphorylation was confirmed with full-length A DAP.
  • phosphate ⁇ site related to the association of ADAP with c-SRc is present at amino acid 615 and after, and the association between C-Src and ADAP involves the C-terminal region (amino acid 615- 819) was involved (Fig. 6C).
  • ADAP (Y687 / 791 / 807F: Tyr615 remains the same as the 687th, 791th, and 807th ones in which these four tyrosine residues (Tyr615, 687, 791 and 807) are each replaced with ferralanine.
  • HEK cells are combined with Src, empty vector (V), full-length ADAP (WT) with FLAG, or various YF substitutions (Y687 / 791 / 807F, Y615 / 791 / 807F, Y615 / 687 / 807F: Tyr791, Y615 / 687/79 IF) were forcibly expressed, respectively. Then, it was immunoprecipitated with anti-Src antibody and blotted with anti-FLAG antibody or anti-Src antibody. The results are shown in Figure 6D. As shown in Fig.
  • ADAP expression did not stimulate RANKL in both cells (RAW264 cells and bone marrow macrophages (BMMs)) !, It was also observed in cells (at 0 hours) and decreased when cells entered the multinucleated cell stage (upper panel in Figure 7A). ADAP isoform pl30 expression appeared to be more prominent! / In bone marrow macrophages (BMMs) than in RAW264 cells (FIG. 7A).
  • c-Src immunoprecipitation was observed in both RAW264 cells and osteoclast progenitor cells (bone marrow macrophages) prepared from bone marrow cells. This indicates that endogenous c-Src forms a complex with ADAP in differentiated cells (osteoclasts).
  • RAW264 cells in the prefusion stage were separated from the plate, suspended, and coated with a culture dish (Vn-coated plate) or poly-D-Lys (PDL) coated with vitronectin (Vn). It was laminated on the cultured dish (PDL coated plate) and left for 60 minutes.
  • ADAP was not completely phosphated in the suspension.
  • ADAP attached to the Vn-coated plate was observed to be phosphated.
  • ADAP attached to the PDL-coated plate did not phosphorylate, suggesting that ADAP phosphorylation is integrin-dependent. It was. From this result, ADAP appears to respond and function in the cell adhesion Z adhesion process.
  • Experimental Example 5 Inhibition of ADAP by siRNA damages the formation of multinucleated cells. Here we examined the function of ADAP in osteoclast progenitor cells.
  • RAW264 cells were transfected with an expression vector encoding siRNAs for ADAP, and ADAP knockdown cells were isolated (siADAP cl.l and siADAP cl.2).
  • RAW264 cell parent strain parent
  • RAW264 cell transfected with empty vector vector
  • a Anti-ADA Anti-ADA
  • Western blotting was performed using P antibody to confirm the suppression of ADAP expression in RAW264 cells (upper panel in FIG. 10A). In order to monitor the amount of expressed protein, Western blotting was similarly performed using an antibody against ⁇ -actin (anti- ⁇ -actin antibody) (FIG. 1, lower panel of OA).
  • ADAP plays an important role in the process of multinucleated cell formation, since ADAP expression is mainly detected in pre-fusion cells. This phenomenon was similar to that observed when c-src expression was suppressed using antisense src (the formation of functional multinucleated cells was significantly suppressed) (Kumagai, N. , et al, (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758-768).
  • This example demonstrates the importance of tyrosine phosphate-mediated signaling in osteoclast formation in vitro, and phosphorylation of cellular synthases in RAW264 cells. The profile of was examined.
  • RAW264 cell parent prepared by the method described in Experimental Example 5, RAW264 cells transfected with an empty vector, or ADAP knockdown cells (siAD APcl. L) And siADAP cl.2) were each immunoblotted with 4G10 phosphotyrosine antibody.
  • FIG. 12A As shown in Figure 12A, tyrosine phosphorylated protein that reacts with 4G 10 anti-phosphotyrosine antibody was detected in the 125-135 kDa range, and the intensity of the signal was determined by the parent strain of RAW264 cells or the empty vector transfer.
  • ADAP knockdown cells (siADA P cl. L and cl. 2) were weaker than ectans.
  • the tyrosine phosphorylated protein detected in the 125-135 kDa range was depleted by an antibody specific for Cas (Crk-associated substrate) (anti-Cas antibody).
  • ADAP plays an important role as a docking protein in the structure of the actin cytoskeleton that leads to cell migration (Chodniewicz, D., et al., (2004) Biochim. Biophys. Acta. 1692, 63-76).
  • Using lysate depleted of Cas significantly reduced the signal ( Figure 12B). This suggests that Cas is a tyrosine-phosphorylated protein in differentiated RAW264 cells.
  • Cas has been shown to be phosphorylated at tyrosin residues with the involvement of integrins.
  • Cas tyrosine phosphorylated was concentrated in the extension of migrating cell leaf-like pseudocells (Chodniewicz, D., et al, (20 04) Biochim. Biophys. Acta. 1692, 63-76).
  • formation of a complex of Cas and ADAP was suggested (Hamid, N., et al., (1999) Microb. Pathog. 27, 231-242; Deleuil, F., et al., (2003) Cell. Microbiol. 5, 53-64).
  • the phosphorylation of Cas in ADAP knockdown cells was significantly reduced, the extent of which was comparable to that seen in FIG. 12C.
  • DNA encoding the full-length protein of mouse ADAPpl30 was inserted into the Hindlll site of the pFLAG-CMV2 vector to construct a full-length ADAP expression vector.
  • This expression vector was cleaved with BamHI, and a fragment containing the C terminus was inserted into the BamHI site of the pFLAG-CMV2 vector to obtain an expression vector for the ADAP C-terminal region fragment (626-819).
  • HEK293 cells are strongly enriched with Src CA isomer (CA) (SrcY527F), full-length mouse A DAP pl30 (foil) with FLAG, mouse C-terminal fragment (626-819 region) with FLAG It was allowed to express.
  • the amount of C-terminal fragment of ADAP was set to 1: 3, 2: 3, and 4: 3, respectively, with respect to the full-length ADAP pl30 in terms of DNA / zg ratio.
  • each cell lysate was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody or an anti-Src antibody, and blotted with an anti-phosphatase or anti-FLAG antibody or an anti-Src antibody.
  • the region of twelve amino acid sequence (mouse ADAPpl30 region 803-814) centered on the tyrosine phosphorylation motif (corresponding to YDDI) containing Tyr807 of mouse ADAPpl30 that corresponds to the c-Src binding site (corresponding to YDDI) It was designed as an inhibitory active region (SEQ ID NO: 1).
  • a cell membrane permeation active region (YG RKKRRQRRR: 2) possessed by the Tat protein of HIV-1 virus was added to the N-terminal site of this region to obtain a TAT-ADAP polypeptide (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 1 A schematic diagram showing the structure of c-Src.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the amino acid sequence of isoform pl30 of mouse-derived ADAP with the amino acid sequence of isoform pl30 of human-derived ADAP.
  • FIG. 4 is a diagram comparing the amino acid sequence of isoform pl20 of mouse-derived ADAP with the amino acid sequence of human-derived ADAP isoform pl20.
  • FIG. 5 shows the results of performing a pull-down assay on GST-U-SH3-SH2 and identifying a protein that binds to GST-U-SH3-SH2.
  • Figure B shows the results of pull-down assay of ADAP bound to GST-fused Src domain (GST-U-SH3-SH2, GST-U-SH3) (Experiment 1).
  • FIG. 6 shows the result of identifying the c-Src-association site of ADAP in Experimental Example 2.
  • Figure A shows the phosphorylation-dependent association of AD AP to c-Src.
  • Figure B shows tyrosine phosphorylation of ADAP in RA W264 cells expressing Src variants.
  • Figure C shows that the C-terminal region of ADAP is involved in association with c-Src.
  • Figure D shows the results of identifying tyrosine residues in ADAP that are associated with c-Src association.
  • FIG. 7 shows ADAP expression profiles of RAW264 cells and osteoclasts.
  • Figure A shows ADAP expression levels in differentiated RAW264 cells.
  • Figure B shows the results of immunostaining for ADAP.
  • the thumbprints in the figure indicate the location of AD AP at the forefront of foliate or pseudopods.
  • the bar length is 20 ⁇ m.
  • FIG. 8 shows the association of ADAP and c-Src in RAW264 cells and bone marrow macrophage progenitor cells.
  • FIG. 9 shows ADAP adhesion-dependent tyrosine phosphates.
  • FIG. 10 shows ADAP expression in siRNA-treated cells.
  • Figure B shows the results of examining the effects of ADAP knockdown on multinucleated cell formation.
  • the length of the bar below the left panel is 50 ⁇ m G
  • FIG. 11 is a view showing a delay in migration of ADAP knockdown cells (siADAP cl.2).
  • FIG. 12 Fig. A tyrosine phosphorylated protein in RAW264 cells
  • Fig. B shows reduction in Cas
  • Fig. Shows Cas phosphorylation in ADAP knockdown cells
  • Fig. D shows Cas in Src knockdown cells. Each shows phosphorylation.
  • FIG. 13 shows the results of examining the inhibition of binding between c-SRC and ADAP in Example 7.
  • the figure on the left shows that tyrosine phosphorylation of A DAP pl30 (foll) by c-Src is suppressed depending on the expression level of the C-terminal region of ADAP (ADAP626-819 in the figure).
  • the right figure shows that the binding of c-Src and ADAP pl30 (foll) is inhibited depending on the expression level of ADAP C-terminal region (ADAP626-819 in the figure).
  • FIG. 14 shows the results of examining ADAP phosphorylation inhibition by Tat-ADAP polypeptide in Example 8.
  • the figure on the left shows the amino acid sequence of Tat-ADAP.
  • the figure on the right shows that tyrosine phosphorylation of ADAP pl30 (foll) by c-Src is suppressed depending on the amount of Ta-ADAP added.

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Abstract

　本発明は、骨代謝異常疾患の治療薬となり得る破骨細胞分化形成抑制剤を提供する。また当該破骨細胞分化形成抑制剤を探索するスクリーニング方法を提供する。本発明の破骨細胞分化形成抑制剤は、単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質を有効成分とする。また、本発明の破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法は、(a) 被験物質の存在下で、c-SrcとADAPとを接触させる工程、(b)c-SrcとADAPとの結合を測定する工程、および(c) c-SrcとADAPとの結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程から構成される。

Description

明 細 書
破骨細胞分化形成抑制剤、および骨代謝異常疾患の予防または治療剤 のスクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は、骨の代謝に関わる破骨細胞の分ィ匕形成に関して新たな知見を提供す るものである。さらに本発明は、この新たな知見に基づいて、破骨細胞の分化形成を 抑制するための物質 (破骨細胞分ィ匕形成抑制剤）、並びに破骨細胞の分化形成を 抑制することによって骨代謝を制御する方法、および骨代謝異常に起因する骨疾患 を予防または治療する方法に関する。
[0002] さらにまた本発明は、破骨細胞の分化形成を抑制し、骨代謝異常に起因する骨疾 患の予防または治療剤として有効な成分をスクリーニングする方法に関する。
背景技術
[0003] 骨は、生体の支持組織であると同時に、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨 吸収が絶えず繰り返されている動的組織である。通常は、骨形成と骨吸収のバランス が保たれているが、骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じると、この動的 平衡状態が破綻し、様々な骨疾患を引き起こす。骨疾患としては、例えば、閉経後骨 粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイド治療による骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形 関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少 症、慢性腎不全における骨密度低下、骨大理石病等を挙げることができる。これらの 骨疾患に罹患すると、その進行に伴って身体活動能力が低下し、ひいては腰痛-関 節痛等の痛みを伴い、 日常生活に支障をきたす場合も多い。近年、高齢ィ匕に伴って 骨粗鬆症等の骨疾患が注目されつつあり、 QOL (Quality of life)向上のためにも、患 者の症状に合わせた治療を行うベぐ多様な治療薬が求められている。
[0004] 破骨細胞は、単球 Zマクロファージ系の造血細胞より分ィ匕する、骨吸収を担う巨大 な多核細胞である。生体内において、破骨細胞の分ィ匕は、副甲状腺ホルモン (PTH) などの刺激を受けた骨芽細胞力 破骨細胞分ィ匕誘導因子である RANKL (Receptor a ctivator of NF— κ B iigand)を免 し、ま 7こ M— CSF (Macrtophage colony stimulating fa ctor)を分泌することによって促進される。従来より、破骨細胞の分化課程や機能にお いて重要な役割を果たす分子が多く同定されている (例えば、非特許文献 1〜3など
) o
[0005] 中でも、約 60kDaの非受容体型チロシンキナーゼである c-Srcについては、 1991年 にそのノックアウトマウスが作製され、破骨細胞機能不全によって大理石骨病を発症 することが報告されている（非特許文献 4)。 c-srcノックアウトマウスでは破骨細胞は分 化するものの、骨吸収能を有していないことから、 c-Srcは破骨細胞の活性化 (骨吸 収能の獲得)を担う成分であると考えられている。 c-srcノックアウトマウスの破骨細胞 は、顕微鏡観察によると TRAP (酒石酸耐性酸ホスファターゼ）陽性の細胞は存在す るが細胞の形態は異常である。また、骨表面に接着しているが、破状縁と封鎖層が 形成されず骨吸収ができない。このようなことから、 c-Srcは、破骨細胞分化の骨吸収 を行うための機能的な細胞骨格の形成に関わっていると推測される。しかし、その詳 細は不明な点が多い。
[0006] c-src遺伝子を欠失させた c-srcノックアウトマウスに見られる唯一の表現型は破骨 細胞の形成'機能不全であり、破骨細胞の分ィ匕にのみ影響が生じることから (非特許 文献 4)、 c-Srcの機能を阻害することによって生じる個体への影響は限定的であると 予想される。
[0007] このため、 c-src遺伝子やその発現産物である c-Src (タンパク質)を標的とした骨代 謝異常に起因する疾患 (骨代謝疾患)用の医薬品は、個体の発生や維持に影響す ることなく、破骨細胞に特異的に作用し、安全性の高い医薬品となりえるものと考えら れる。
[0008] 従来より骨代謝異常である骨粗鬆症の治療薬として汎用されて!ヽるビスホスフォネ 一ト等は基本的に細胞特異性がなぐまた現在試験段階にある抗体医薬 (RANK/RA NKLに対する抗体）は標的タンパク質が発現する細胞組織全てに作用するため、依 然として副作用と！ヽぅ問題を抱えて！/、る。
[0009] 従って、 C- src遺伝子や C- Src (タンパク質)を標的とした安全性の高!ヽ骨代謝疾患 用医薬品の開発が望まれるところである。
非特許文献 1 : Johnson RS, et.al., Cell.1992 Nov 13;71(4):577-586 非特許文献 2 : Franzoso G, et.al, Genes Dev. 1997 Dec 15;11(24):3482- 3496 非特許文献 3 : Tondravi MM, et.al., Nature.1997 Mar 6;386(6620):81- 84
非特許文献 4 : Soriano, P., Cell 64 693-702, 1991
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 前述するように、破骨細胞は骨吸収活性を有し、脊椎動物における骨代謝に必須 の細胞であり、その形成や活性の亢進は骨粗鬆症などの骨疾患、関節リューマチに 伴う骨破壊などの要因になることが知られている。このため、破骨細胞の分化形成を 制御する薬剤ならびに方法の開発は、高齢ィ匕社会における社会問題の一つである 骨代謝疾患の解決策として有用であると考える。またその場合に、 c-src遺伝子や c-S rc (タンパク質)を標的とすることによって安全性の高い医薬品の開発が可能となる。
[0011] 本発明の目的は、 c-Srcを標的分子として破骨細胞の分ィ匕形成を抑制する方法お よび抑制する物質 (破骨細胞分化形成抑制剤)を提供することである。また本発明の 目的は破骨細胞の分ィ匕形成を抑制することによって骨代謝を制御する方法、および 骨代謝異常に起因する骨疾患を予防または治療する方法を提供することである。さ らに本発明の目的は、破骨細胞の分化形成を抑制し、骨代謝異常に起因する骨疾 患の予防または治療剤の有効成分となりえる物質を探索する方法 (スクリーニング方 法)を提供することである。さらに本発明は、力かるスクリーニング方法に有効に利用 することのできる物質を提供することをも目的とする。
課題を解決するための手段
[0012] c-src遺伝子は破骨細胞の形成に必須な遺伝子であり、そのメカニズムは、 c-src遺 伝子の発現産物である c-Src (タンパク質）が細胞内において標的タンパク質の特定 部位のチロシン残基をリン酸ィ匕して結合することに基づくことが知られている。
[0013] そこで本発明者らは、破骨細胞内において c-Srcと特異的に結合するタンパク質 (c -Src結合タンパク質）を網羅的に探索していたところ、 ADAP (association of adhesion and aegranulation— promoting adaptor protein)力 S当亥タンノヽク質（¾DOことを見出し た。さらに本発明者らは、 ADAP上における C- Srcとの結合部位（マウス ADAPpl30の 場合はチロシン残基 807部位（Tyr807)、マウス ADAPpl20の場合はチロシン残基 761 部位（Tyr761)、ヒト ADAPpl30の場合はチロシン残基 817部位（Tyr817)、ヒト DAPpl2 0の場合はチロシン残基 771部位 (Tyr771) )を特定すると同時に、 ADAPの発現を阻 害した細胞 (ADAPノックダウン細胞)では、破骨細胞が分化せず多核細胞が形成さ れな 、ことから、 c-Srcとその結合タンパク質である ADAPとの結合を阻害することによ り破骨細胞の分ィ匕形成が抑制できることを確認した。
[0014] 破骨細胞の形成は、骨粗鬆症などの骨疾患や関節リューマチに伴う骨破壊などの 要因になる。 C- Srcと ADAP (マウス ADAPpl30の場合は Tyr807部位、マウス ADAPpl2 0の場合は Tyr761、ヒト ADAPの場合は Tyr817部位、ヒト ADAPpl20の場合は Tyr771) との結合を特異的に阻害すると、破骨細胞における c-Srcの機能発現が阻止されて 破骨細胞の分化形成が抑制され、その結果、骨代謝が制御でき、骨代謝異常に基 づく骨疾患を改善することが可能であると考えられる。
[0015] 本発明は力かる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有する ものである。
[0016] 1.破骨細朐分化形成 ¾制剤
(1-1)単球由来のマクロファージ様細胞における C- Srcと ADAP (adhesion of degranula tion-promoting adaptor protein)との結合を阻害する物質を有効成分とする破骨細 胞分化形成抑制剤。
[0017] (1-2)単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウス C- Srcの SH2ドメインとマウス
ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761との結合を阻害する物質を有 効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
[0018] (1-3)有効成分が、マウス ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761のリ ン酸化を抑制する作用を有する物質である (1-2)に記載する破骨細胞分化形成抑制 剤。
[0019] (1-4)単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒト C- Srcの SH2ドメインとヒト ADAPp 130の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771との結合を阻害する物質を有効成分とす る破骨細胞分化形成抑制剤。
[0020] (1-5)有効成分が、ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸 化を抑制する作用を有する物質である (4)に記載する破骨細胞分化形成抑制剤。 [0021] (I-6)ADAPと c-Srcの結合を阻害する活性を有する、配列番号 1に記載のアミノ酸 配列を有するポリペプチドを有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
[0022] (1-7)上記ポリペプチドが、さらに細胞膜透過性配列を有するものである（1-6)記載 の破骨細胞分化形成抑制剤。
[0023] (1-8)上記細胞膜透過性配列が配列番号 2に記載するアミノ酸配列である、 (1-7) 記載の破骨細胞分化形成抑制剤。
[0024] (1-9)配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする、 (I-
6)〜 (1-8)記載の破骨細胞分化形成抑制剤。
[0025] (1-10)下記 (a)または (b)に記載するポリペプチドを有効成分とする（1_6)記載の破 骨細胞分化形成抑制剤：
(a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド、
(b)上記アミノ酸配列（配列番号 4)の配列番号 1に記載するアミノ酸配列以外の領 域において、 1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有し、且つ ADAPと c-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド。
[0026] (1-11)下記（a)乃至（c)の!、ずれか 1に記載するポリペプチドをコードする DNAを 有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
[0027] (a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド、
(b)上記アミノ酸配列（配列番号 4)の配列番号 1に記載するアミノ酸配列以外の領 域において、 1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有し、且つ ADAPと c-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号 3に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
Figure imgf000006_0001
(Π-1)配列番号 1のアミノ酸配列を有するポリペプチド力もなる ADAPと c-Srcの結合 阻害剤。
[0029] (Π-2)配列番号 1のアミノ酸配列および細胞膜透過性配列からなる ADAPと c-Srcの 結合阻害剤。
[0030] (II-3)上記細胞膜透過性配列が配列番号 2に記載するアミノ酸配列である、 (II-2) 記載の結合阻害剤。 [0031] (Π-4)配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる ADAPと c-Src の結合阻害剤。
[0032] (II-5)下記（a)または (b)に記載するポリペプチド力もなる ADAPと c-Srcの結合阻害 剤：
(a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド、
(b)上記アミノ酸配列（配列番号 4)の配列番号 1に記載するアミノ酸配列以外の領 域において、 1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有し、且つ ADAPと c-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド。
[0033] III.破骨細朐分化形成の抑制方法
(III- 1)単球由来のマクロファージ様細胞における c-Srcと ADAP (adhesion of degranul ation-promoting adaptor protein)との結合を阻害することを特徴とする、破骨細胞の 分化形成抑制方法。
[0034] (III-2)単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウス c-Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の 807番目のチロシン残基（Tyr807)またはマウス ADAPpl20の 761番目の チロシン残基 (Tyr761)との結合を阻害することを特徴とする破骨細胞の分化形成の 抑制方法。 制して、単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウス c-Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761との結合を阻害する（III-2)に 記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。
[0036] (III-4)単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAP pl30の 817番目のチロシン残基 (Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン残 基 (Tyr771)との結合を阻害することを特徴とする破骨細胞の分ィ匕形成の抑制方法。
[0037] (ΠΙ-5)ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を抑制して 、単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771との結合を阻害する（ΠΙ-4)に記載する破骨細 胞の分化形成の抑制方法。
[0038] (III-6) (1-1)乃至 (1-11)のいずれかに記載する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤を用いて c-Srcと ADAPとの結合を阻害する、 (III-1)乃至 (ΠΙ-5)のいずれかに記載する破骨細 胞の分化形成抑制方法。
[0039] IV. #ィ弋謝 ¾^ 唐、のチ β方または'冶 ) ¾医. 糸且
(IV- 1)単球由来のマクロファージ様細胞における C- Srcと ADAP (adhesion of degranu lation-promoting adaptor protein)との結合を阻害する物質を有効成分とする、骨代 謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。
[0040] (IV-2)単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAP pl30の 817番目のチロシン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン 残基 (Tyr771)との結合を阻害する物質を有効成分とする、骨代謝異常疾患の予防 または治療用医薬組成物。
[0041] (IV-3)上記物質が、ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸 化を抑制する作用を有する物質である (IV-2)に記載する骨代謝異常疾患の予防ま たは治療用医薬組成物。
[0042] (IV-4)上記物質が、（1-6)乃至 (1-11)のいずれかに記載する破骨細胞分ィ匕形成抑 制剤である（IV-1)乃至 (IV-3)の 、ずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または 治療用医薬組成物。
[0043] (IV-5)骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、 変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全に おける骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページエツ ト病、家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis:FEO)、または、歯周疾患 である、 (IV-1)〜（IV-4)の ヽずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または治療 用医薬組成物。
[0044] V.骨代謝異常疾唐、の予防または '治療方法
(V- 1)単球由来のマクロファージ様細胞における c-Srcと ADAP (adhesion of degranul ation-promoting adaptor protein)との結合を阻害する物質を有効量、骨代謝異常疾 患を有する力またはその前状態にある被験者に投与することを含む、骨代謝異常疾 患の予防または治療方法。
[0045] (V-2)単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAP pl30の 817番目のチロシン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン 残基 (Tyr771)との結合を阻害する物質を有効量、骨代謝異常疾患を有するかまた はその前状態にある被験者に投与することを含む、骨代謝異常疾患の予防または治 療方法。
[0046] (V-3)上記物質が、ヒト ADAP pl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸 化を抑制する作用を有する物質である (V-2)に記載する骨代謝異常疾患の予防ま たは治療方法。
[0047] (V-4)上記物質が、（1-6)乃至 (1-11)の 、ずれかに記載する破骨細胞分化形成抑 制剤である、 (V-1)乃至 (V-3)の 、ずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または 治療用医薬組成物。
[0048] (V-5)骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変 形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全にお ける骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページエツト 病、家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis :FEO)、または、歯周疾患 である、 (V-1)〜 (V-4)の 、ずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または治療方 法。
[0049] VI. 骨細朐分化形成 ¾制剤のスクリーニング方法
(VI-1)下記の工程を有する、破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質の存在下で、 c-Src若しくはその SH2ドメインを含む断片と ADAP (adhesio n of degranulation— promoting adaptor protein)若しくはその c—Srcとの結合に関わる 断片とを接触させる工程、
(b) c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、およ び
(c) c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物質を 破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
[0050] (VI-2)下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a' )被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の 807番目 のチロシン残基（Tyr807)またはマウス ADAPpl20の 761番目のチロシン残基（Tyr761 )とを接触させる工程、
( ）マウス C- の Tyr761の結合を測定する工程、および
( ）上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程
[0051] (VI-3)下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1)被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の Tyr807ま たはマウス ADAPpl20の Tyr761とを接触させる工程、 る工程、および
(c)上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択するェ 程。
[0052] (VI-4)下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a")被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の 817番目のチロ シン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン残基（Tyr771)とを接触 させる工程、
(b)ヒト c- Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr817番目またはヒト ADAPpl20の Tyr7 71の結合を測定する工程、および
(c)上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
[0053] (VI-5)下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1，)被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771とを接触させる工程、
(2，）ヒト ADAPpl30の Tyr817番目またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を測定する 工程、および
(3')上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する 工程。
[0054] (VI-6)骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬糸且成物の有効成分の探索または 取得方法である (VI-1)〜 (VI-5)の 、ずれかに記載するスクリーニング方法。 [0055] (VI-7)骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、 変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全に おける骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページエツ ト病、家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis:FEO)、または、歯周疾患 である、 (VI-6)に記載するスクリーニング方法。
[0056] VII. C- SrcZADAP結合阻害剤のスクリーニング方法
(νπ-l)下記の工程を有する、 c-SrcZADAP結合阻害剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質の存在下で、 c-Src若しくはその SH2ドメインを含む断片と ADAP(adhesio n of degranulation— promoting adaptor protein)若しくはその c—Srcとの結合に関わる 断片とを接触させる工程、
(b) c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、およ び
(c) c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物質を 選択する工程。
[0057] (VII-2)下記の工程を有する、 c-SrcZADAP結合阻害剤のスクリーニング方法： (a')被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の 807番目 のチロシン残基（Tyr807)またはマウス ADAPpl20の 761番目のチロシン残基（Tyr761 )とを接触させる工程、 の Tyr761の結合を測定する工程、および
( ）上記結合を阻害する被験物質を c-Srcと ADAPとの結合を阻害する物質として選 択する工程。
[0058] (VII-3)下記の工程を有する、 c-SrcZADAP結合阻害剤のスクリーニング方法：
(a")被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の 817番目のチロ シン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン残基（Tyr771)とを接触 させる工程、 の結合を測定する工程、および (c")上記結合を阻害する被験物質を c-Srcと ADAPとの結合を阻害する物質として選 択する工程。
[0059] (VII-4)骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の探索また は取得方法である（VII-1)〜 (VII-3)の 、ずれかに記載するスクリーニング方法。
[0060] (VII-5)骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、 変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全に おける骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページエツ ト病、家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis:FEO)、または、歯周疾患 である、（VII- 4)に記載するスクリーニング方法。
[0061] なお、本発明でいう「結合」とは、その態様を特に制限するものではないが、好ましく は「会合」を挙げることができる。
[0062] また本明細書で、マウス ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761とは 、マウス ADAPpl30 (タンパク質）またはマウス ADAPpl20の N末端からそれぞれ 807番 目または 761番目に位置するチロシン残基を意味する。またヒト ADAPpl30の Tyr817 またはヒト ADAPpl20の Tyr771とは、ヒト ADAPpl30 (タンパク質）またはヒト ADAPpl20 の N末端からそれぞれ 817番目または 771番目に位置するチロシン残基を意味する。 発明の効果
[0063] 細胞の機能を制御する物質を探索あるいは開発し、医薬品としての可能性を探る 場合には、その物質の効果の強さだけではなぐその作用点、すなわち標的分子が 明確であり、その作用が目的とする病気、組織、細胞に特異的であることが望ましい。 本発明が提供する破骨細胞分化形成抑制剤およびこれを有効成分とする骨代謝異 常疾患の予防または治療用医薬組成物は、今までの知見から、破骨細胞に特異に 作用するものと予想される。すなわち、 c-srcをノックアウトした場合に破骨細胞の形成 、機能にのみその影響が見られること、他の srcファミリーをノックアウトしても破骨細胞 への影響は見られないこと等から、本発明の医薬組成物が有する作用機序 (c-Srcと ADAPとの結合を阻害する機序）は、個体の発生や維持には影響を及ぼさず、破骨 細胞にのみ効果を発揮するものと予想される。この点で本発明が提供する破骨細胞 分化形成抑制剤、およびこれを有効成分とする医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物 に対して安全性が高 、ものと!/、える。
発明を実施するための最良の形態
[0064] 1.破骨細朐分化形成 ¾制剤
本発明の破骨細胞分化形成抑制剤は、単球由来のマクロファージ様細胞における c— ¾rcと ADAP ^adhesion of degranulation— promoting adaptor protein;との結合を阻 する物質を有効成分とするものである。
[0065] ここで「単球由来のマクロファージ様細胞」としては、破骨細胞へと分化し得る、ヒト またはヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物の単球由来のマクロファージ様細胞であ ればよぐ特に限定されない。具体的には、例えば、株化細胞では RAW264、 RAW26 4.7、 RAW247 (Meiyanto E. et al, Biochem Biophys Res Commun., 282, p278- p283 (2001》などを挙げることができる。また生体に由来する「単球由来のマクロファージ様 細胞」としては、骨髄細胞、脾臓細胞、またはコラーゲン関節炎や変形性関節炎等の 破骨細胞形成過多が起きている炎症部位に由来する細胞等を挙げることができる。
[0066] 本発明の破骨細胞分化形成抑制剤が対象とする「破骨細胞」としては、ヒトまたはヒ ト以外の哺乳動物を含む脊椎動物の破骨細胞であれば特に限定されず、前記の「単 球由来のマクロファージ様細胞」から分ィ匕形成される破骨細胞を挙げることができる。 破骨細胞は、骨の表面に密着し、活性ィ匕に伴い酸や種々のプロテア一ゼ等を分泌 することにより骨吸収能を示す。
[0067] 本発明でいう破骨細胞への「分ィ匕形成」とは、細胞が形態的に破骨細胞の性質を 示すように分化形成されること、または、その形態学的な変化を経て活性化され骨吸 収作用を示すように分化形成されることを含む概念である。
[0068] なお、本発明で「抑制」とは、「単球由来のマクロファージ様細胞」が「破骨細胞」に 分化形成することを 100%抑制（阻止)する場合と、 100%阻止しなくても「単球由来 のマクロファージ様細胞」が本来有する破骨細胞への分ィ匕形成能を低減させる場合 の両方を含む。破骨細胞への分ィ匕は、破骨細胞の特徴である多核細胞の形成を観 察することにより測定することができる。破骨細胞への分ィ匕形成を測定する方法とし ては、破骨細胞のマーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ (TRAP)染色法を用 いることができるが、これに限定されない。 [0069] 力かる破骨細胞分ィ匕形成抑制作用を有する物質、すなわち本発明の破骨細胞分 化形成抑制剤の有効成分としては、単球由来のマクロファージ様細胞における c-Src と ADAPとの結合を抑制する作用を有する物質を挙げることができる。
[0070] ここで c-Srcは、当初ラウス肉腫ウィルスの癌遺伝子 v-srcの正常細胞内のホモログ として発見された c-srcの遺伝子産物である。これは約 60kDaの非受容体型チロシン キナーゼであり、現在までに 10個のファミリー（Src、 Yes、 Fgr、 Yrk、 Fyn、 Lyn、 Hck、 L ck、 Blk、 Frk)が報告されている（Sheila M., et al., Annu.Rev.Cell.Dev. Biol., 1997, 13 :513-609) o図 1に、これらの Srcファミリータンパク質の一次構造の模式図を示す。 N 末端領域には各々の Srcファミリ一間でアミノ酸配列が保存されて 、な 、ユニークドメ イン (SH4ドメイン)があり、この中には細胞膜との結合に必要な脂肪酸付加部位が存 在する。これに続いて、プロリンに富んだ配列を認識してタンパク質と結合する SH3ド メイン、リン酸ィ匕されたチロシンを認識してタンパク質と結合する SH2ドメインが存在し 、次いでキナーゼ活性を担うキナーゼドメイン (SH1ドメイン）がある。 C末端付近には 保存されたチロシン残基があり、 Srcファミリーキナーゼ活性の適正な調節を担ってい る。このチロシン残基は、通常 Cskファミリーのキナーゼによってリン酸ィ匕を受けており 、 Srcのキナーゼドメインは SH2ドメインと分子内結合し、閉じた構造をとる。このことが S reのキナーゼ活性の負の調節に重要な役割をもつ。また SH3ドメインは SH2ドメインと キナーゼドメインの間にあるリンカ一領域に結合することが知られている。これによつ てもキナーゼ活性が抑制される。また、逆に他の分子が Srcの SH3ドメイン、 SH2ドメイ ンに結合し、あるいはホスファターゼによって C末端のチロシン残基が脱リン酸ィ匕され ることで、 Src分子が開 、た構造をとることによってキナーゼ活性が上昇することが知 られている。
[0071] c-Srcは、ヒトを始めとする哺乳動物を含む脊椎動物全般にわたり（例えば、マウス、 ニヮトリなど)存在するタンパク質であり、そのアミノ酸配列および塩基配列は 、ずれ も公知である（ヒト由来 c- src遺伝子： Anderson SK et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1122-112 9 (1985)、および Tanaka A et al" Mol. Cell. Biol. 7: 1978-1983 (1987)、マウス由来 c- src遺伝子： Martinez R et al., Science 237: 411-415 (1987)、 -ヮトリ由来 c- src遺伝 子： Takeya. T and Hanafosa H, Cell 32:881-890 (1983) )。例えば、ヒト由来の c- Src およびマウス由来の c-Srcはいずれもアミノ酸 536個力 なるタンパク質であり、そのァ ミノ酸 150〜247の領域に SH2ドメインを有している。本発明が対象とする c-Srcは、ヒト またはヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物に由来する c-Srcであり、好ましくはヒト由 来の C- Src、マウス由来の c- Src、ニヮトリ由来の c-Srcを例示することができる。
[0072] ADAPは、ヒトを始め、ヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物全般 (例えば、マウス、二 ヮトリ等）にわたつて T細胞や骨髄細胞に発現しているタンパク質である。 ADAPは、 当初 T細胞受容体刺激と T細胞接着を支配するインテグリンの結合活性調節をつな ぐものとして同定されたタンパク質であり、 T細胞受容体によって誘導されるインテグリ ンのクラスター形成や接着を制御することが知られている（Erik J.Peterson et al., Scie nce 293:2263-2265,2001) o ADAPは、タンパク質間相互作用を仲介すると考えられる 多くの領域を有しており（例えば、図 2参照）、インテグリンのリガンドの細胞内接着を 増強する" inside-out"シグナルに重要な役割を担って!/、ることが知られて!/、る (Griffit hs, E. K. , et al., (2002) Curr. Opin. Immunol. 14, 317—322; Peterson, E.L. (2003) I mmmunol. Rev. 192, 113-121)。
[0073] ADAPは、約 130kDaの分子量を有する ADAP(「ADAPpl30」という）とそのスプライシ ング変異体である約 120kDaの分子量を有する ADAP(「ADAPpl20」という）の 2つのァ イソフォームを有する。 ADAPpl20は胸腺で高く発現し、 ADAPpl30は成熟 T細胞で 高く発現するなど、組織局在性が認められるものの、破骨細胞では両方がいずれも 発現している。なお、いずれも作用や機能は同じと考えられている (Veale M et al, J. Biol. Chem. 274:28427-28435 (1999) )。
[0074] 図 2にマウス由来の ADAPpl30の一次構造の模式図を示す。 ADAPは、 N末端側か ら、プロリンリッチ領域（Pro- rich)、 EVHl(Ena/VASP- homology)- bindingドメイン（FPP PP)、ホスフォチ口シン部位（Tyrosine)、及び SH3-likeドメインを有しており、ホスフォ チロシン部位（Tyrosine)では Srcファミリーに属する Fynの SH2ドメインと結合し、 EVH1 -bindingドメイン (FPPPP)では、 Ena/VASP (Drosophila enable/ vasodilated phosphopr otein)ファミリータンパク質と結合することが知られている（Emily K Griffiths et al., Cu rr Opin Immunol. 2002 Jun;14 (3) 317-322)。 ADAPpl20は、 ADAPpl30のホスフォ チロシン部位 (Tyrosine)と SH3-likeドメインとの間に位置する 46アミノ酸が欠失した構 造を有する。
[0075] 後述する配列表の配列番号 5にマウス AD APpl30のアミノ酸配列を、配列番号 6に マウス ADAPpl20のアミノ酸配列を示す。また、配列番号 7にヒト ADAPpl30のアミノ酸 配列を、配列番号 8にヒト ADAPpl20のアミノ酸配列を示す。図 3にマウス ADAPpl30 のアミノ酸配列とヒト ADAPpl30のアミノ酸配列の対比（alignment)を（640個のアミノ酸 がー致する。同一性： 77.2%)、また図 4にマウス ADAPpl20のアミノ酸配列とヒト ADA Ppl20のアミノ酸配列の対比（alignment)を（640個のアミノ酸が一致する。同一性： 81. 7%)を示す。これからわかるように、 ADAPのアミノ酸配列は動物種間で比較的保存 されている。
[0076] 本発明が対象とする ADAPは、ァイソフォーム（ADAPpl30、 ADAPpl20)の別を問わ ない。またヒトを始めとする哺乳動物や脊椎動物に由来する ADAPであれば、動物種 の別も特に制限されない。通常、使用される c-Srcの由来動物に対応して同じ動物に 由来する ADAPが使用される。好ましくはヒト由来の ADAP (ADAPpl30、 ADAPpl20) 、マウス由来の ADAP(ADAPpl30、 ADAPpl20)、二ヮトリ由来の ADAP (ADAPpl30、 ADAPpl20)である。
[0077] 後述する実験例に示すように、 C- Srcと ADAPとは、 c- Srcの SH2ドメインと ADAPの C 末端領域のチロシン残基（マウス ADAPpl30の場合は Tyr807、マウス ADAPpl20の場 合は Tyr761、ヒト ADAPpl30の場合は Tyr817、ヒト ADAPpl20の場合は Tyr771)を介し て結合する。
[0078] このため、本発明の破骨細胞分化形成抑制剤の有効成分として、好適には (1)マウ ス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761 との結合を抑制する作用を有する物質、および (2)ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPp 挙げることができる。さらに、実験例に示すように、 c-Srcと ADAPとが結合するにはそ のチロシン残基カ^ン酸化されることが必要である。このため、本発明の破骨細胞分 化形成抑制剤の有効成分は、（3)マウス ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20 の Tyr761のリン酸化を抑制する物質、および (4)ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト AD APpl20の Tyr771のリン酸化を抑制する物質であってもよい。 [0079] 単球由来のマクロファージ様細胞における c-Srcと ADAPとの結合を抑制する物質と しては、具体的には c-Srcと ADAPとの複合体形成を抑制する物質、 ADAPとの結合〖こ 関わる c-Srcの SH2ドメインに選択的に結合して ADAPとの結合を阻害する物質、 ADA Pの C領域にあるチロシン残基（マウス ADAPpl30の場合は Tyr807、マウス ADAPpl20 の場合は Tyr761、ヒト ADAPpl30の場合は Tyr817、ヒト ADAPpl20の場合は Tyr771) に選択的に結合して c-Srcとの結合を阻害する物質、 ADAPの C領域にあるチロシン 残基（マウス ADAPpl30の場合は Tyr807、マウス ADAPpl20の場合は Tyr761、ヒト AD APpl30の場合は Tyr817、ヒト ADAPpl20の場合は Tyr771)のリン酸化を抑制する物 質、 c-Srcのキナーゼ活性を抑制する物質などを挙げることができる。かかる物質とし て、より具体的には c-Srcの SH2ドメインに対する抗体、 ADAPの C領域にあるチロシン 残基（マウス ADAPpl30の場合は Tyr807、マウス ADAPpl20の場合は Tyr761、ヒト AD Apl30Pの場合は Tyr817、ヒト ADAPpl20の場合は Tyr771)を含む領域に対する抗体 、 ADAPの C領域にある上記チロシン残基を含むその近傍のアミノ酸配列を有するぺ プチド、イノシトールリン脂質を含む脂質類、 ADAPなどを挙げることができる。
[0080] ここで ADAPの C領域にある上記チロシン残基を含むその近傍のアミノ酸配列を有 するペプチドとしては、 ADAPの C領域にある当該チロシン残基を含むチロシンリン酸 化モチーフ（YDDI)を中心として少なくとも前後の 4つのアミノ酸を含むアミノ酸配列（ DGEIYDDIADGC：配列番号 1)を有するペプチドを例示することができる。当該アミノ 酸配列は、マウスおよびヒトの各 ADAPpl30および ADAPpl20に共通して存在する配 列であるため（マウス ADAPpl30 : 803- 814領域、マウス ADAPpl20 : 757- 768領域、ヒト ADAPpl30 : 813- 824領域、ヒト ADAPpl20 : 767- 778領域におのおの相当）、力かるァ ミノ酸配列を有するペプチド（ポリペプチド）は、マウスおよびヒトの各 ADAPpl30およ び ADAPpl20に対して共通して、 c-Srcと ADAPとの結合を抑制する物質として使用す ることがでさる。
[0081] なお力かるアミノ酸配列（配列番号 1)を有するペプチド (ポリペプチド）としては、例 えばマウス ADAPpl30のアミノ酸配列（配列番号 5)において、少なくとも当該アミノ酸 配列（配列番号 1)の領域 (803-814領域)を含むポリペプチドを挙げることができる。 具体的には、マウス ADAPpl30の 626-819領域からなるポリペプチド（配列番号 4)を 挙げることができる。なお、これらのポリペプチドは、配列番号 1で示すアミノ酸配列を 有し、かつ ADAPと c-Srcとの結合を阻害する活性を有する限り、他の領域において 1 または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されて 、てもよ 、。
[0082] 同様に、アミノ酸配列（配列番号 1)を有するペプチド (ポリペプチド）として、例えば マウス ADAPpl20のアミノ酸配列（配列番号 6)において、少なくとも当該アミノ酸配列 (配列番号 1)の領域（757-768領域）を含むポリペプチド、ヒト ADAPpl30のアミノ酸配 列（配列番号 7)において、少なくとも当該アミノ酸配列（配列番号 1)の領域 (813-824 領域）を含むポリペプチド、およびヒト ADAPpl20のアミノ酸配列（配列番号 8)におい て、少なくとも当該アミノ酸配列（配列番号 1)の領域 (767-778領域)を含むポリぺプ チドを挙げることができる。具体的には、マウス ADAPpl30の 626-819領域力 なるポ リペプチド（配列番号 4)に対応するポリペプチドとして、ヒト ADAPpl20の 636-839領 域からなるポリペプチド、マウス ADAPpl20の 624-773領域からなるポリペプチド、およ びヒト ADAPpl20の 644-783領域からなるポリペプチドを挙げることができる。
[0083] またこれらのポリペプチドも、配列番号 1で示すアミノ酸配列を有し、かつ ADAPと c- Srcとの結合を阻害する活性を有する限り、他の領域において 1または複数のアミノ酸 が欠失、置換または付加されていてもよい。
[0084] また配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するペプチド (ポリペプチド）は、さらに 細胞膜透過性配列を有するものであってもよい。ここで細胞膜透過性配列とは、真核 生物の細胞膜を透過できるタンパク質であり、 Protein Trunsduction Domains (PTDs) を有するものをいう。これらは 120kD以上の大型タンパク質をも細胞内に取り込ませる 機能を有するアミノ酸配列であり、例えば、 Drosophila Antennapedia transcription fac tor protein、 HIV— 1 Tat transcription factor protein、 poiy— arginineなど »知られてい る (Jehangir S.'et al., (2002)Current Opinion in Biotechnology.vol.13, pp.52— 56)。力 カゝる細胞膜透過性配列として、具体的には、 HIV-1ウィルスの Tatタンパク質の細胞 膜透過活性領域のアミノ酸配列（配列番号 2)を例示することができる（Schwarze R.S. , et al.,(1999) Science, Vol.285,ppl569-1572)。当該細胞膜透過性配列を有する上 記ペプチド (ポリペプチド）のアミノ酸配列を配列番号 3に示す。
[0085] なお、本発明にお!/、て c-Srcと ADAPとの結合を抑制する物質は、これらのペプチド (ポリペプチド）コードする DNAであってもよ!/ヽ。
[0086] また、単球由来のマクロファージ様細胞における ADAPの発現や産生を阻害するこ とによって、結果として c-Srcと ADAPとの結合を抑制することもできる。本発明でいう 単球由来のマクロファージ様細胞における c-Srcと ADAPとの結合を抑制する物質に は、かかる単球由来のマクロファージ様細胞における ADAPの発現や産生を抑制す る物質を含めることができる。
[0087] 例えば、単球由来のマクロファージ様細胞における ADAPの発現または産生を抑制 する物質としては、 ADAP遺伝子の転写、 RNAプロセッシング、輸送、翻訳、及び Z 又は安定性を抑制する物質を挙げることができる。こうした物質として具体的には、 A DAPをコードする遺伝子の塩基配列にハイブリダィズし、その転写、 RNAプロセッシン グ、輸送、翻訳、及び Z又は安定性を抑制し得るアンチセンス分子、リボザィム、及 び RNAiエフェクターを例示することができる。
[0088] 本発明で用いられるアンチセンス分子は、 ADAP遺伝子のプロモーターまたはその 他の制御領域、ェキソン、イントロンあるいはェキソン イントロン境界に結合するよう に設計される。多くの効果的なアンチセンス分子は、イントロン Zェキソン'スプライス 接合部とハイブリダィズし得るように設計されている。よって、本発明で用いるアンチ センス分子も、 ADAP遺伝子のイントロン Zェキソン'スプライス接合部の 50〜200塩基 内の領域にハイブリダィズするように、当該領域に対して実質的に相補的な塩基配 列を有するものであることが好まし 、。
[0089] リボザィムは、 RNAまたは RNA タンパク質複合体であり、対象の遺伝子（mRNA) に部位特異的に結合してそれを切断することで、タンパク質への翻訳を阻害し、遺伝 子機能の発現を抑制する機能を発揮する物質である。本発明で用いられるリボザィ ムは、 ADAP遺伝子 (DNA)カゝら転写された mRNAの任意領域とハイブリダィズするよう に当該領域に対して実質的に相補的な塩基配列を有し、そして結合した対象のオリ ゴヌクレオチド領域内のリン酸エステルを切断して ADAPへの翻訳を阻害するよう〖こ 設計される。
[0090] RNAiエフェクターは、 RNAi (RNA干渉）の機能を発揮することによって、 ADAPの DN Aもしくは mRNAにハイブリダィズし、 ADAPmRNAを特異的に分解し、または ADAP遺 伝子の発現を特異的に抑制するものである。 RNAiエフェクターとしては、 si RNA(sma 11 interfering RNA)、 stRNA (small temporally regulated RNA)及び shRNA (short hair pin RNA)等を挙げることができる。なお、 RNAiエフェクターを利用した RNAi技術並 びにその方法は、多比良和誠ら編,「RNAi実験プロトコール」,羊土社発行， 2003年等 に詳細に記載されており、その内容は援用により本発明の内容に組み込まれる。例 えば、本発明で用いられる siRNAとして、「5'- AACCAACTTATGAGGAAAA- 3'」 ( 配列番号 11)または「5'-AAGCATGCTGTGACGTTAA-3'」（配列番号 12)を好適に 使用することができる。
[0091] 抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、 好ましくはモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の 調製方法は、当業界で公知である、本発明で使用される抗体もこれに準じて調製す ること; 0できる ( [列 ば、 Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory manual,し old Sp ring Harbor Laboratry, 1988;米国特許第 4,196,265号など）。本発明で好適に用い られる抗体として、抗 C- Src抗体、抗 C- Src/SH2ドメイン抗体、抗 ADAP/SH3- likeドメイ ン抗体などを挙げることができる。
[0092] 11.破骨細朐分化形成の ¾制方法
本発明の破骨細胞の分ィ匕形成抑制方法は、単球由来のマクロファージ様細胞に おける c— Srcと ADAP (adhesion of degranulation— promoting adaptor protein)との結合 を阻害することによって実施することができる。なお、当該結合阻害には、 c-Srcと AD APの結合を直接阻害する場合に限らず、 ADAPの c-Srcとの結合部位のリン酸ィ匕を抑 制する場合や ADAPの発現や産生を阻害する場合など、結果として c-Srcと ADAPと の結合が妨げられる場合も含まれる（以下、同じ)。具体的には、 c-Srcと ADAPとの結 合を阻害する作用を有する Iで前述する破骨細胞分化形成抑制剤を c-Srcと ADAPに 対して用いることによって実施することができる。
[0093] 中でも好ましい破骨細胞分化形成抑制剤は、ヒト由来の c-Srcとヒト由来の ADAPと の結合を阻害する物質であり、力かるものにはヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30 の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771との結合を阻害する物質、およびヒト ADAPpl 30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を阻害する物質が含まれる。力 力る物質として、具体的には配列番号 1に記載するアミノ酸配列を有するペプチド (ポ リペプチド）を挙げることができ、その 1例として、配列番号 3に記載するアミノ酸配列 を有するペプチドを挙げることができる。
[0094] 本発明の破骨細胞の分ィ匕形成抑制方法には、 in vitroにおける破骨細胞の分ィ匕形 成抑制方法、および in vivoにおける破骨細胞の分化形成抑制方法の両方が含まれ る。後者の場合、骨代謝異常またはその前状態にある被験者について、破骨細胞の 分化形成を抑制して、骨代謝異常疾患の発生またはその進展を予防するか、骨代 謝異常疾患を改善若しくは治療する方法としても有効に使用することができる。なお 、被験者としては、ヒトゃヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物を挙げることができる。 力かる哺乳動物としては、具体的にマウス、 -ヮトリ、ラット、ノ、ムスター、モルモット、ィ ヌ、サル、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ブタなどを制限なく例示することができる。
[0095] 111. #ィ弋謝 ¾ 唐、のチ方または' 7合 ffl
前述するように、破骨細胞の分化形成や活性の亢進は、骨粗鬆症等の骨代謝異常 疾患の要因になることが知られている。よって、 Iで前述する c-Srcと ADAPとの結合を 阻害する物質は、破骨細胞の分化形成を抑制する作用を有することに基づいて、骨 代謝異常疾患の発症を予防し、また治療する薬物として有効に使用することができる
[0096] 骨代謝異常疾患としては、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変 形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全にお ける骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページエツト 病、家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis:FEO)、または歯周疾患を ί列示することができる。
[0097] 本発明の骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物は、 c-Srcと ADAPとの 結合を阻害する物質、すなわち Iで前述する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤を有効成分と して含む。本発明の有効成分として、好ましい破骨細胞分化形成抑制剤は、ヒト由来 の c-Srcとヒト由来の ADAPとの結合を阻害する物質であり、力かるものにはヒト c-Srcの 阻害する物質が含まれる。力る物質として、具体的には配列番号 1に記載するァミノ 酸配列を有するペプチド (ポリペプチド)を挙げることができ、その 1例として、配列番 号 3に記載するアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
[0098] 本発明の医薬組成物は、有効量の有効成分 (c-Srcと ADAPとの結合を阻害する物 質)とともに、その種類に応じて、自体公知の薬学的に許容される担体や添加剤を含 んでいてもよい。当該医薬組成物は、所望の投与方法、例えば経口投与、静脈内投 与、筋肉内投与、皮下投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、腹腔内投与、または 冠動脈もしくは冠状静脈洞投与などによって投与することができ、その投与経路に応 じて、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、及びカプセル剤などの固体投与形態;溶 液、懸濁剤、乳剤、シロップ、リボソーム製剤、注射剤、静注剤、点滴剤及びエリキシ ルなどの液剤投与形態;貼付剤、軟膏、クレーム及び噴霧剤などの外用投与形態に 、調合、成形乃至調製することができる。
[0099] これらの医薬組成物（医薬製剤)の調製に利用される担体としては、製剤の投与形 態に応じて通常使用される賦形剤、希釈剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、崩壊抑制剤 、吸収促進剤、滑沢剤、溶解補助剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤などが例示できる。ま た添加剤としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される安定化剤、保存剤、緩 衝剤、等張化剤、キレート剤、 pH調整剤、界面活性剤、着色剤、香料、風味剤、甘 味剤などが例示できる。
[0100] 上記医薬組成物中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限 定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件な どに応じて広範囲より適宜選択される。投与量は、投与経路によっても異なるが、通 常、 1回投与あたりの有効成分の量に換算して、 10pg〜100mgZkg体重の範囲で 投与することができる。
[0101] IV.骨代謝異常疾唐、の予防または '治療方法
本発明の骨代謝異常疾患の予防または治療方法は、単球由来のマクロファージ様 糸田胞における c—Srcと ADAP (adhesion of degranulation— promoting adaptor protein)と の結合を阻害する物質、すなわち Iで前述する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤を有効量、 骨代謝異常またはその前状態にある被験者に投与することによって実施される。 [0102] ここで好ましい破骨細胞分化形成抑制剤は、ヒト由来の c-Srcとヒト由来の ADAPとの 結合を阻害する物質であり、力かるものにはヒト C-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771との結合を阻害する物質、およびヒト ADAPpl3 0の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を阻害する物質が含まれる。力 力る物質として、具体的には配列番号 1に記載するアミノ酸配列を有するペプチド (ポ リペプチド）を挙げることができ、その 1例として、配列番号 3に記載するアミノ酸配列 を有するペプチドを挙げることができる。
[0103] 当該物質は、破骨細胞の分ィ匕形成を抑制して、骨代謝異常疾患の発生またはその 進展を予防するか、骨代謝異常疾患を改善'治療するために有効な量を、薬学的に 許容される担体もしくはその他の添加剤ととともに、医薬組成物の形態で使用するこ とができる。これら医薬組成物の投与形態、投与経路、投与方法並びに当該医薬組 成物の投与用量 (有効成分の投与量）は IIIに前述する通りである。
[0104] 対象とする骨代謝異常疾患は、 IIIに記載するように、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ 、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨 減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ 腫、家族性骨ページエツト病、家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis: FEO)、または歯周疾患を例示することができる。また、投与対象とする被験者として も、 IIIに記載する、ヒトゃヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物（マウス、 -ヮトリ、ラット 、ノ、ムスター、モルモット、ィヌ、サル、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ブタなど）を挙げること ができる。
[0105] V.スクリーニング方法
本発明は、破骨細胞の分化形成を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供 する。本発明の方法で探索取得される物質は、 c-Srcと ADAPとの結合を阻害する作 用を有することによって、破骨細胞の分化形成を抑制することができる。このため当 該物質によれば、骨代謝異常疾患を予防または治療することができると期待される。 従って、本発明の方法は、骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効 成分をスクリーニングする方法であるとも 、える。
[0106] 本発明のスクリーニング方法は、基本的には c-Srcと ADAPとの結合を阻害する作用 を有する物質を探索することからなるが、具体的には下記の方法を例示することがで きる。
( 1)下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質の存在下で、 C- Srcと ADAPとを接触させる工程、
(b) c-Srcと ADAPの結合を測定する工程、および
(c) C-Srcと ADAPとの結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選 択する工程。
[0107] 力かる工程により、 c-Srcと ADAPとの結合を阻害して破骨細胞の分ィ匕形成を抑制す る作用を有する物質を取得することができる。
[0108] 被験物質としては、制限はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、 または無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的には、これらの被験物質また はこれらを含む組成物 (例えば、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物等を含 む）を、対象の c-Srcおよび ADAPと接触させることにより行うことができる。
[0109] スクリーニングに際して採用される被験物質と c-Srcおよび ADAPとの接触条件は、 特に制限されないが、通常、生理的環境下における in vitro実験系、または細胞内で 行うことが好ましい。
[0110] 本発明において用いる c-Srcは、その由来を特に制限されず、ヒト由来のもののほか 、ヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物（例えば、マウスゃニヮトリなど）に由来する c-S rcを用いることができる。 c-Srcは全長のタンパク質であってもよいが、 ADAPとの結合 に関わる SH2ドメイン、または少なくとも SH2ドメインを含む部分断片であってもよい。 好ましくは、 c-Srcの SH2ドメインを含み、かつキナーゼ活性を有するものである。
[0111] 本発明において用いる ADAPも、その由来を特に制限されない。ヒト由来のもののほ か、ヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物（例えば、マウスゃニヮトリなど）に由来する A DAPを用いることができる力 一緒に使用する c-Srcと同一の動物に由来するものを 使用することが好ましい。ァイソフォームの別も問わず、 pl30も pl20のいずれのァイソ フォームを使用してもよい。 ADAP(ADAPpl20、 ADAPpl30)は全長のタンパク質であ つてもよいが、 c-Srcとの結合に関わる C末端に位置する SH3-likeドメイン、または少 なくとも SH3- likeドメインを含む部分断片であってもよ 、。また例えばマウス ADAPpl3 0の場合、 c-Srcとの結合に関わる Tyr807部位を有する部分断片、マウス ADAPpl20 の場合、 c-Srcとの結合に関わる Tyr761部位を有する部分断片、またヒト ADAPpl30 の場合、 c-Srcとの結合に関わる Tyr817部位を有する部分断片、ヒト ADAPpl20の場 合、 c-Srcとの結合に関わる Tyr771部位を有する部分断片を用いることもできる。 こ のため、上記（1)のスクリーニング方法は、より詳細には下記（2)〜 (4)のように記載 することができる。
[0112] (2)下記の工程を有する、破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質の存在下で、 c-Src若しくはその SH2ドメインを含む断片と ADAP若しくは その c-Srcとの結合に関わる断片とを接触させる工程、
(b)上記 c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、 および
(c)上記 c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物 質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
[0113] (3)下記の工程を有する、破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a')被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の Tyr807ま たはマウス ADAPpl20の Tyr761とを接触させる工程、 の Tyr761の結合を測定する工程、および
( ）上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程
[0114] (4)下記の工程を有する、破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a")被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒ ト ADAPpl20の Tyr771とを接触させる工程、 の結合を測定する工程、および
(c")上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程 [0115] C- Srcと ADAPとの結合の測定は、 c- Srcと ADAPとの結合の有無が評価できる方法 であれば特に制限されな!、。例えば、被験物質の存在下で c-Src (又は c-Srcの SH2ド メイン）と ADAP (又は ADAPの SH3-likeドメイン）とを接触させた後、その反応液 (混合 液)を電気泳動にかけて分子量から結合の有無を評価する方法、 c-Src (又は c-Src の SH2ドメイン）あるいは ADAP (又は ADAPの SH3- likeドメイン）の抗体を用いて他のタ ンパク質の共沈の有無を評価する方法、 c-Srcのチロシンキナーゼ活性を測定して評 価する方法を例示することができる。
[0116] 力かるスクリーニング方法による破骨細胞分ィ匕形成抑制剤 (候補物質)の選別は、 c -Src (c- Srcの SH2ドメインなどの部分断片を含む）と ADAP (ADAPの SH3- likeドメイン などの部分断片を含む）との結合の有無を評価することによって行うことができる。こ の場合、被験物質の非存在下で c-Src (c-Srcの SH2ドメインなどの部分断片を含む） と ADAP (ADAPの SH3-likeドメイン部分断片を含む）とを接触させて生じる c-Srcと AD APとの結合 (コントロール）と対比することによって評価することもできる。 c-Srcと ADA Pとが全く結合しない場合、およびコントロールに比して結合が低減した場合に、使用 された被験物質を、破骨細胞分化形成抑制剤の候補物質として選別することができ る。
[0117] なお、 c-Srcと ADAPとの結合の有無は、 ADAPの C末端領域のチロシン残基（マウス ADAPpl30の場合 Tyr807部位、マウス ADAPpl20の場合 Tyr761部位、ヒト ADAPpl30 の場合 Tyr817部位、ヒト ADAPpl20の場合 Tyr771部位）のリン酸化の有無を評価する こと〖こよっても行うことができる。この場合、下記の（5)または（6)の方法により、 ADAP の c-Srcとの結合部位におけるリン酸ィ匕の阻害活性を指標として破骨細胞分ィ匕形成 抑制剤の候補物質を探索することができる。
[0118] (5)下記の工程を有する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1)被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の Tyr807ま たはマウス ADAPpl20の Tyr761とを接触させる工程、 る工程、および
(3)上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択するェ 程。 [0119] (6)下記の工程を有する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1，）被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒ ト ADAPpl20の Tyr771とを接触させる工程、
(2')ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を測定するェ 程、および
(3')上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する 工程。
[0120] ここでマウス ADAPpl30の Tyr807、マウス ADAPpl20の Tyr761、ヒト ADAPpl30の Tyr 817またはヒト ADAPpl20の Tyr771におけるリン酸化の有無は、例えば抗リン酸化チロ シン抗体を用いたィムノブロッテイングによって測定することができる。
[0121] 上記スクリーニングで選別される物質は、破骨細胞の分化形成を抑制する作用を 有するものであり、骨代謝異常疾患の発症や進展を予防する医薬組成物または骨代 謝異常疾患を改善する治療薬の有効成分として使用することが可能である。
[0122] なお、骨代謝異常疾患としては、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節 炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不 全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨べ一 ジェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO)、または歯周 疾患を挙げることができる。
[0123] 上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに骨代謝異常疾患 を有するモデル非ヒト動物を用いてスクリーニングをかけることもできる。力べして選別 される候補物質は、さらに骨代謝異常疾患を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試 験、安全性試験、さらに骨代謝異常疾患を有する患者 (ヒト)もしくはその前状態にあ る患者 (ヒト)への臨床試験に供してもよぐこれらの試験を実施することによって、より 実用的な骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分を選別取得 することができる。
[0124] このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の 種類に応じて、化学的合成、生物学的合成 (発酵を含む)または遺伝子工学的操作 によって、工業的に製造することができ、破骨細胞分ィ匕形成抑制剤または骨代謝異 常疾患予防'治療用医薬組成物の調製に使用することができる。
[0125] 上記のスクリーニング方法は、前述するように、その基本は c-Srcと ADAPとの結合を 阻害する作用を有する物質を探索することからなる。従って、上記のスクリーニング方 法は、別の角度から、 c-Srcと ADAPとの結合を阻害する作用を有する物質 (c-SrcZA DAP結合阻害剤）をスクリーニングする方法と規定することができる。当該方法で得ら れる c-SrcZADAP結合阻害剤は、その作用に基づ ヽて破骨細胞の分化形成を抑制 することができる。このため当該物質によれば、骨代謝異常疾患を予防または治療す ることができると期待される。従って、本発明の方法もまた、骨代謝異常疾患の予防ま たは治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法であると 、える。
実施例
[0126] 以下、本発明をより詳細に示すために実験例を示す。ここでは、本発明でいう c-Src と ADAPとの「結合」の好適な態様である「会合」を例にして記載するが、これに制限さ れるものではない。
[0127] 下記の実験例において使用した材料と実験方法を説明する。
[0128] (1)細朐焙着
(1- 1)ヒト胚腎細胞株（HEK293細胞）は、 10%FCSおよび抗生物質 (ペニシリン 'スト レプトマイシン）を添カ卩したダルベッコの改変イーグル培地（DMEM) (Invitrogen)を用 いて、 37°C、 5%COの条件下で培養する。
2
[0129] (1-2)マウス単球.マクロファージ系細胞株（RAW246細胞）は、 10%FCS、非必須アミ ノ酸溶液 (Gibco)およびグルタミン酸溶液を添カ卩した EMEM (日水）を用いて、 37°C、 5 %COの条件下で培養する。
2
[0130] (2) in vitroでの破骨細胞形成
(2-1) RAW264細胞の分化誘導
in vitroで破骨細胞を形成するため、 RAW264細胞を 1.3 X 104 cells/cm2の密度に 調製し、これに GSTと RANKLを、それぞれ最終濃度が 250ng/mlおよび 500ng/mlとな るように添加する（ Ishida, N" et al, (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-41156.)。 72 時間培養後、培地を、 GSTまたは RANKLを含む新鮮な培地に交換し、さらに 24時間 培養を継続する（培養条件: 37°C、 CO濃度 5%)。なお、可溶性組み換え RANKL (Rec eptor activator of NF- κ B ligand)は、文献 (Meiyanto, E., et al., (2001) Biochem. Bi ophys. Res. Commun. 282, 278- 283)の記載に従って調製する。
[0131] (2-2)骨髄細胞から破骨細胞形成
文献 (Raab, M., et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 21170- 21179)に記載する方法に 従って、 M-CSFで処理することによって、マウス骨髄細胞から破骨細胞の前駆細胞を 生成した。具体的には、 6週齢の雌の ddYマウス（CLEA Japanあるいは Japan SLC)の 骨髄力も得られたマウス骨髄細胞を、 10%の熱不活性化 FCS、抗生物質、ヒト M-CSF ( RIKEN DNA Bank)を安定に発現する NIH3T3/pCAhMCSF細胞 (MCSF- CM)の 1% 培養上清を含む a -MEM (Invitrogen)中で一晩培養する。非接着性の細胞を回収し 、 10%の FCSおよび 3%の MCSF- CMを含む α - MEM中に再プレートする。こうすること で骨髄マクロファージ（BMMs)が接着細胞として得られる。これを再プレートして、上 記 (2-1)で説明した条件を使用して、 GSTまたは RANKLを添加して、破骨細胞になる ように誘導する。
[0132] (2-3)破骨細胞形成の上記の両システムにおいて、 RANKLを添加後、 48時間後お よび 96時間後に、それぞれ融合前の破骨細胞および多核の破骨細胞が得られる。 破骨細胞の数の計測には、後述する TRAP染色が使用できる。
[0133] (3) TRAP¾色
細胞を PBSで 3回洗浄後、メタノールで 30秒間固定し、乾燥させる。 TRAP染色液を 加え、 37°Cで 1時間インキュベートし、その後滅菌水で洗浄し、メタノールで 30秒間固 定し、乾燥させる。酒石酸耐性酸ホスファターゼ (TRAP)活性を有する赤く染色され た細胞 (TRAP陽性多核細胞）を計測する。なお、 TRAP染色液は、 0.026Mの酒石酸（ in 0.1M酒石酸、 pH5.2)と 12.5mg/ml naphthol AS- BI phosphate (in 0.1M酢酸、 pH5 .2)を、 24:1の割合で混ぜた液に、 FAST GARNET GBC (2-アミノアゾトルエン）をカロ え、 0.8 mフィルターで濾過して調製する。
[0134] (4)発現ベクターの調製
(4-1)全長 C- Src (野生型)発現ベクター
全長 c-Srcをコードする cDNAを、逆転写 PCRによって得られた RAW264細胞の mRN Aから調製し、これを発現ベクター pRc/CMV(Invitrogen)またはレトルウィルス発現べ クタ一 pCX4— puro ( Akagi, T.， et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1356 7-13572)に導入して調製する。
[0135] (4- 2) GST- U.SH3.SH2発現ベクターおよび GST- U.SH3発現ベクター c- Srcの SH3 - SH2ドメイン（アミノ酸 1-262)または C- Srcの SH3ドメイン（アミノ酸 1-149)をコードする c DNAを、上記と同様にして取得し、各々融合ベクター（pGEX-3X GST:Amersham Bi osciences)に導入して、 GST- U'SH3 'SH2発現ベクターおよび GST- U'SH3発現べク ターを調製する。
[0136] (4-3) c-Srcの CA変異体（CA)発現ベクターおよび c-Srcの KD変異体（KD)発現べ クタ一
逆転写 PCRによって得られた RAW264細胞の mRNAから全長 c-Srcをコードする cDN Aを調製し、これを発現ベクター pRc/CMV(Invitrogen)に導入する。次いで突然変異 生成キット〔Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE)〕を用いて 、 527番目のチロシン残基をフエ-ルァラニンに、または 295番目のリジン残基をメチ ォニンに置換して、それぞれ c-Srcの触媒活性な CA変異体 (CA) (SrcY527F)の発現 ベクター、または c-Srcの KD変異体（KD) (キナーゼ欠失体、 SrcK295M)の発現べク ターを調製する。
[0137] (4- 4)ADAP(pl30)発現ベクター
ADAP(pl30)をコードする cDNAを、逆転写 PCRによって得られた RAW264細胞の m RNAから調製し、これを発現ベクター pFLAG/CMV2 (EASTMAN KODAK COMPAN Y)またはレトルウィルス発現ベクター pCX4-puroに導入して調製する。
[0138] (4- 5)ADAPの C末端欠失変異体 (ADAP
1-326、 ADAP )発現べクタ一および部位
1-614
特異的変異体 (Y615F)発現ベクター ADAPの C末端欠失変異体 (ADAP
1-326、 ADAP
)発現べクタ一は、上記方法で調製した ADAP (pl30)発現ベクター上の ADAP遺
1-614
伝子を EcoRIで消化するか (ADAPのアミノ酸 1-326の切断）、あるいは Bglllで消化して (ADAPのアミノ酸 1-614の切断）、ベクターを再結合することによって調製する。 ADA Pの YF-変異体 (Y615F)発現ベクターは、上記方法で調製した ADAP (pl30)発現べ クタ一について、突然変異生成キット〔Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit ( STRATAGENE)〕を用いて、 615番目のチロシン残基をフエ-ルァラニンに置換するこ とによって調製する。
[0139] (4-6) ADAP発現抑制ベクター（pSuper- siADAP- 1および pSuper- siADAP- 2)
si RNAの発現用に、マウス ADAPに特異的な 2つの標的配列を選択する； siADAP- 1用に、 5'- AACCTACCTACGAGGAGAA- 3' (200〜218) (配列番号 9) siADAP— 2用に、 5し AAGCCTGCTGCGATGTCAA— 3' (1514〜1532) (配列番号 10 )
アニーリングされたオリゴヌクレオチドを、ネオマイシン耐性遺伝子を有する発現べ クタ一 pSuper(01igo Engine)に導入する（pSuper——siADAP— 1および pSuper— siADAP— 2)。
またはレトロウイルス発現ベクター pSINsi-hU6 (TaKaRa)に導入する。 silent- ADAPを コードするベクターを生成するために、 siADAP-1および siADAP-2に対する標的配列 をそれぞれ 5'-AACC Crr :GAGG AA-3' (si ADAP-1) (配列番号 11)、 5'-A AGCATGCTGTGACGTTAA-3'(siADAP-2) (配列番号 12)に変更する（下線部が 変更部位)。
[0140] (5) HEK293細胞への遣伝子導入
HEK293細胞への遺伝子導入は、文献 (Thomas, M., et al.， (2002) Proc. Natl. Aca d. Sci. U.S.A. 99, 14640- 14645)に記載する方法に従って、 polyethylenimine (PEI25) 法を使用して行った。具体的には、 60mm径の培養皿あたり 3 X 105個の HEK293細胞 を播種し、 37°C、 CO濃度 5%、 FCS入り D- MEMでー晚培養する。翌日、細胞が 50- 90
2
%コンフルェントであることを確認して実験に使用する。プラスミド DNA 7.5 μ gに、 5% のグルコース/ PBS 7.5 μ 1、及び 3.3mM PEI25/5%グルコース/ PBS 7.5 μ 1を加えて、 軽く混合して室温で 20分間静置する。これを前日より培養しておいた 60mm径の培養 皿中の細胞に添加し、 24-48時間後に細胞の溶解物を回収する。
[0141] (6)レトロウイルス感染
レトルウィルスの感染は、 FuGENE 6 (ロッシュ）を用いて、 HEK293細胞を、 pGL、 pE - Eco (TaKaRa)およびレトロウイルス発現ベクターと共にトランスフエクシヨンする。トラ ンスフエクシヨン後、 2日目に上清を回収して、レトロウイルスを 8,000 X gで 16時間遠 心分離することによって濃縮する。 [0142] (7) ADAP-ノックダウン RAW264細朐
RAW264細胞を Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を使用して、 pSuper- siADAP- 1およ び pSuper-siADAP-2あるいは空のベクターでトランスフエクシヨンし、ネオマイシンに 耐性なクローンを単離することによって調製する。具体的には、 35mm径の培養皿に R AW264細胞を 30- 50%コンフルェントになるように播き、 37°C、 CO濃度 5%、 FCS入り E-
2
MEMでー晚培養する。翌日、細胞が 60-90%コンフルェントであることを確認して、リ ポフエクシヨンを行う。
[0143] (8)細朐柚出液の調製
60mm径の培養皿に培養した細胞を PBSで 3回洗浄後、 Lysis buffer (50mM Tris- H Cl(pH7.4)、 150mM NaCl、 2mM EDTA、 2mM Na VO、 20mM NaF、 l%Triton X- 100)
3 4
を 200 /z l添カ卩し、細胞を搔き取る。 15,000rpmで 20分間遠心分離後、上清をエツペン ドルフチューブで回収し、細胞抽出液とする。
[0144] (9)免痔沈降、ウェスタンブロッテイング、
免疫沈殿とウェスタンブロットは、文献 (Ishida, N., et al.， (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-41156)の記載に従って行う。抗体とタンパク質との複合体は、マウス IgGに対 するゥサギ IgGフラクション（Rabbit IgG Fraction to Mouse IgG) (MP Biomedicals)を 結合した Protein G Sepharoseあるいは Protein A Sepharoseを用いて沈降させる。
[0145] (9-1)免疫沈降
1サンプルあたりゥサギ抗マウス IgG抗体 20ng、 Pro- Aビーズ 20 μ 1を加え、 Lysis buff erで最終 500 1に調整し、 4°Cで一晩回転しながらインキュベートする。これと併行し て、細胞抽出液 135 1に Lysis buffer 150 1を加え、更に抗 Src抗体 2 g、或いは抗 F LAG抗体 1 μ gをカ卩えて、 4°Cでー晚インキュベートする。反応後、先の Pro- Aビーズを Lysis bufferで 5回洗浄し、 2 Xサンプルバッファーをカ卩えて、 105°Cで 5分間インキュべ ートする。
[0146] (9-2)ウェスタンブロッテイング
免疫沈降を行ったサンプルは等量ずつ、また ADAPの発現量の確認には、各サン プル中のタンパク量が同一になるようにして、 SDS-PAGEにより分離し、水槽型ブロッ ティング装置を用いて、 PVDF膜にタンパク質を一晩かけて転写する。転写後、 PVDF 膜を PBSで洗浄し、 5% BSA/PBSで 1時間以上反応させる。 PBSで洗浄し、 PBSで 5分、 0.1% Tween-20/PBS (PBST)で 15分、 PBSで 5分間の順で、 PVDF膜を洗浄した後、 5 %スキムミルク/ PBSで 3000倍に希釈した二次抗体を室温で 1時間反応させる。 PBSで 5分、 PBSTで 15分、 PBSで 5分の順で、 PVDF膜を洗浄する。ウェスタンブロッテイング の検出は、 Amersham Biosciences社から購入したヒッジ抗-マウス HRP結合 IgGおよび ECL検出キットを用いて行う。
[0147] (9-3)免疫染色
35mm径のプレートにガラスプレートを敷き、 RAW264細胞から破骨細胞を誘導し、 細胞培養を行う。 PBSで 2回洗浄し、 4% p-formaldehyde/PBSで 15分間固定する。固 定後、 PBSで 2回洗浄し、 0.2% TritonX-100/PBSで 10分間ブロッキングを行う。 PBS で 2回洗浄し、 5%Milk/PBSで 1時間ブロッキングする。 PBSで 2回洗浄後、 1:25の抗 A DAP抗体（in 5% Milk/PBS)で 1時間処理する。次いで、 PBSで 3回洗浄し、 1:100の抗 マウス IgG conjugated FITC (in 5% Milk/PBS)で 1時間処理する。なお、ァクチンと共 染色する場合は、 1:2500の rhodamine phalloidin (in 5% Milk/PBS)を同時に加える。 処理後、 PBSで 3回洗浄し、マウント剤を用いてスライドガラスに乗せる。これをマ-ュ キュアでシールして、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡で観察する。
[0148] (9-4)なお、免疫沈降、ウェスタンブロッテイング、および免疫染色に使用する抗体 は、以下の通りである。
'マウス抗- Srcモノクローナル抗体（OP- 07) (CALBIOCHEM Oncogene Research Pr oducts) (単に「抗 -Src抗体」 t ヽぅ）
•マウス抗- β -ァクチンモノクローナル抗体 (AC-74) (Sigma) (単に「抗- β -ァクチン 抗体」という）
•マウス抗- FLAGモノクローナル抗体（Μ2) (Sigma) (単に「抗- FLAG抗体」という） 'マウス抗- ADAP抗体および抗- Cas抗体（BD Transduction Laboratories) •マウス抗-ホスフォチ口シン抗体（4G10) (Upstate Biotechnology) (単に「4G10」また は「α— pTyr」という）
( 10) GST融合 -Srcタンパク皙を用いたプルダウンアツセィ、および皙量分析 RAW264細胞の細胞溶解物は、 RANKLの存在下で 4日間 RAW264細胞を培養する ことによって調製する (破骨細胞への分化誘導)。 GSTを融合した c-Srcの SH3および Zまたは SH2ドメインを大腸菌中で発現して、定法に従って Glutathione- Sepharose 4 B (Amersham Biosciences)で精製する（GST融合 Srcタンパク質）。精製した GSTまた は GST融合 Srcタンパク質 g、および細胞抽出物から得られたタンパク質 (c- Src 会合タンパク質） 10mgを、 40°Cで 6時間培養する。バッファー H (50mMトリス- HC1 pH7 .4、 lOOmM NaCl、 5mM MgClおよび 10%のグリセリン）で 4回洗浄した後、結合タンパ
2
ク質を、 500mM NaClを含むバッファー H 100 μ 1中に溶出させる。 回収したタンパク 質を濃縮して、 10%の SDSポリアクリルアミドゲル（lmmの厚さ、および 6cm長さ）にかけ て分離する。タンパク質を Sypro Ruby (Molecular Probes)で染色して、 UV照明によつ て視覚化する。
[0149] 得られたタンパク質を、文献 (Kuwana, R., et al.， (2002) Microbiology 148, 3971-39 82)の記載に従って質量分析とデータ ·ベース探索を行った。小スケールのプルダウ ンアツセィのために、破骨細胞を、 GSTプルダウンバッファー（1% NP-40、 25mM Hepe s、 150mM NaCl、 ImM EDTA、 lOmM MgCl、 10%のグリセリン、 2mM NaVO
2 4、 lOmM N aFおよびプロチアーゼ阻害剤）にて溶解し、得られた溶解物を GST融合タンパク質と ともにインキュベーションするた。 会合したタンパク質は、 Glutathione- Sepharose4B で沈降させる。
[0150] (Π )免疫带光、顕微镱檢杳および画像解析
文献 (Geng, L., et al, (2001) Proc. Nat. Acad.Sci. U.S.A. 98, 11527- 11532)の記 載に準じて、免疫染色を行う。 簡単に説明すると、 細胞をカバーグラス上において、 2%のパラホルムアルデヒド（TAAB LABORATORIES)を含む PBSで 10分間処理して 固定し、 0.1%の TritonX-100を含む PBSで 10分間処理して透過する。 5%のスキムミルク /5%FCS/PBSで 30分間処理して、非特異性の結合をブロッキングした後、細胞を、抗 -ADAP mAbと 30分間インキュベーションする。その後、 Alexa Fluor 488標識ーャギ 抗マウス IgG (Molecular Probes)と 30分間インキュベーションする。カバースリップを、 ガラススライド上の PERMAFLUOR(Immunotech)に乗せる。蛍光の画像は、共焦点レ 一ザ一顕微鏡 LSM410 (Carl Zeiss)で取得し、 Adobe Photoshop 7.0 (アドビ 'システム ズ）で処理する。 [0151] ( 12) 日寺 ¾微鎗枪 法
12ゥエルのプレート上の細胞を、 RANKLで刺激して、 2日間インキュベートして、前 融合段階にある破骨細胞の前駆細胞を調製する。細胞を鉱油で覆って、 5%の CO大
2 気中で 37°Cに維持して、 Axiovert 200M (Carl Zeiss)を使用して観察する。位相差画 像は、 AxioVision3.1ソフトウェア（Carl Zeiss)を用いて 10-15時間に亘つて 5分毎に検 出する。泳動距離は、 Sction Image Software (Scion Corporation)を使用して、連続 のイメージ中の核の中心の転移をディジタルィ匕することにより計算する。
[0152] 実験例 1 c-Src会合タンパク質の同定
(1) c-Src会合タンパク質を探索するために、 GST融合 Srcタンパク質と RAW264細胞 力も分ィ匕誘導した破骨細胞の細胞溶解物を用いて、 in vitroプルダウンアツセィを行 つた。 GST融合 Srcタンパク質として、マウス Srcの SH3と SH2ドメインを有するもの（GST - U'SH3 'SH2)を用いた。なお、破骨細胞の細胞溶解物は、 RAW264細胞を RANKL の存在下で 4日間培養して調製した細胞抽出液を、 GSTプルダウンバッファー (1% NP -40、 25mM Hepes、 150mM NaCl、 ImM EDTA、 lOmM MgCl、 10%のグリセリン、 2mM
2
NaVO、 lOmM NaFおよびプロチアーゼ阻害剤)にて溶解して調製した。 GST融合 Sr
4
cタンパク質（GST-U · SH3 · SH2)およびコントロール用の GSTは大腸菌内で発現して 、定法に従つ飞 lutathione— Sepharose 4B(Amersham Biosciences)を用 ヽ飞； 製し て使用した。なお、 GSTはコントロールベクター pGEX-3Xから調製した。
[0153] 具体的には、まず、精製した GST-Srcタンパク質または GSTを 50 μ g、および破骨細 胞の細胞溶解物力も調製したタンパク質 10mgを、 40°Cで 6時間インキュベーションし た。 インキュベーション後、バッファー H(50mMトリス- HCl (pH7.4)、 lOOmM NaCl、 5m M MgClおよび 10%のグリセリン)で 4回洗浄した後、得られた会合タンパク質を、 500m
2
M NaClを含むバッファー H 100 1中に溶出させた。 回収した会合タンパク質を濃縮 して、 10%の SDSポリアクリルアミドゲル (厚さ lmm、長さ 6cm)にかけて電気泳動により分 離した。 SDSポリアクリルアミドゲルを Sypro Ruby (Molecular Probes)で染色して、分離 したタンパク質を UV照明によって視覚化した。 SDS-PAGE上の GST-Srcタンパク質（ GST-U-SH3 -SH2)に特有のバンドを同定し (図 5Aの右欄)、文献 (Kuwana, R., et al, (2002) Microbiology 148, 3971-3982)の記載に従って質量分析にかけて、データ' ベース探索を行った。
[0154] その結果、図 5Aの右欄に示すように、 10種類のタンパク質が c-Src会合タンパク質 として同定された。これら同定されたタンパク質のうち ADAPは、今回初めて c-Srcと相 互作用することが明らかになったタンパク質である（それ以外のタンパク質について は、文献 13-16参照のこと)。 ADAPは、当初、 Fynを含む幾つかのタンパク質と結合 することのできるアダプター 'タンパク質として同定されたものであり、 T細胞レセプタ 一の活性下で「inside-out」シグナリングの役目を果たすことが知られて 、る (Griffiths, E. K., et al, (2002) Curr. Opin. Immunol. 14, 317-322; Peterson, E. L. (2003) Imm unol. Rev. 192, 113-121)。
[0155] (2)上記で調製した破骨細胞（RAW246細胞）の細胞溶解物を、 GST、並びに GST 融合 Srcタンパク質〔マウス Srcの SH3と SH2ドメインを有するもの（GST- U · SH3 · SH2)と マウス Srcの SH3ドメインを有するもの（GST-U'SH3)〕とインキュベーションし、結合し たタンパク質を ADAPに対する抗体を用いたウェスタンブロッテイングに供した。結果 を図 5Bに示す。図 5Bに示すように、 Srcの SH3ドメインのみでは ADAPと会合しなかつ た力 SH2ドインを含む Srcは ADAPと会合した。このことから， ADAPは、 c- Srcとの SH2 ドメインを介して会合すること、すなわち Srcの SH2ドメイン力ADAPとの会合に必要で あることがわかった。また、バンドが二重であることから、 RAW264細胞は ADAPの 2つ のァイソフォーム（pl20と pl30)を発現していることが確認された（ Veale, M., et al., ( 1999) J. Biol. Chem. 274, 28427-28435)。
[0156] なお、マウスの ADAPのァイソフォーム pl30 (マウス ADAPpl30)の構造模式図を図 2 に示す。またマウス ADAPpl30のアミノ酸配列を配列番号 5に、マウス ADAPpl20のァ ミノ酸配列を配列番号 6に示す。マウス ADAPpl20は、マウス ADAPpl30のアミノ酸 627 -672領域に位置する 46アミノ酸残基が欠失したスプライシング変異体である。マウス と同様に、ヒトに由来する ADAPにも 2つのァイソフォーム（pl20と pl30)が存在してい ることが知られている。ヒト ADAPpl30のアミノ酸配列を配列番号 7に、ヒト ADAPpl20 のアミノ酸配列を配列番号 8に示す。また、マウス ADAPpl30のアミノ酸配列とヒト ADA Ppl30のアミノ酸配列を対比した図を図 3に、マウス ADAPpl20のアミノ酸配列とヒト AD APpl20のアミノ酸配列を対比した図を図 4に示す。これからわかるように、マウス ADA Ppl30とヒト ADAPpl30とはアミノ酸配列において 77.2%の割合で同一性であり、マウ ス 0 ？ 120とヒト 0 ？ 120とはァミノ酸配列にぉぃて81.7%の割合で同ーでぁる。 このように、 ADAPは各ァイソフォームとも動物間で類似した構造を有して ヽる。
[0157] 実,験例 2 ADAPの C- Src会合領城の同定 合部位の決定
(1)全長 c-Srcと ADAPpl30の in vivoにおける会合を確認するため、 HEK293細胞内 で、フラグをつけた ADAPと、野生型の cSrc (WT)、 cSrcの CA変異体（Srcの負の調節 部位に変異が与えられ、キナーゼ活性が恒常的に ONになっている変異体 ZSrcY52 7F) (CA)、あるいは cSrcの KD変異体 (Srcのリン酸基転移部位に変異が与えられ、 キナーゼ活性が恒常的に OFFになっている変異体 ZcSrcK295M) (KD)とを強制発 現させ、抗 Src抗体で免疫沈降し、抗 FLAG抗体 (M2)でゥ エスタンプロットした。結 果を図 6Aの上パネルに示す。図 6A (上パネル）に示すように、野生型の cSrc (WT)と c-Srcの CA変異体（CA)の両方力 ADAPと共沈殿したのに対し、 c-Srcの KD変異体（ KD)は共沈殿しな力つたことから、 ADAPとの会合には Srcのキナーゼ活性が必要で あることが示唆された。
[0158] また、 Srcと ADAPを強制発現させた際の ADAPのチロシンリン酸ィ匕状態を調べた。
具体的には HEK293細胞に Srcの各種変異体と ADAPをトランスフエクションした後、抗 FLAG抗体で免疫沈降し、抗チロシンリン酸化抗体（ α -pTyr)でゥヱスタンプロットし た（図 6A、上から 3番目のパネル)。その結果、 ADAPを単独で細胞に発現させた場 合および c-Srcの KD変異体とともに発現させた ADAPではチロシンリン酸ィ匕は認めら れな力つた力 野生型- cSrc (WT)または c-Srcの CA変異体 (CA)とともに発現させた ADAPではチロシンのリン酸化が確認された。
[0159] 以上の結果から、 ADAP上のチロシン残基のリン酸化が c-Srcとの会合に必須である こと、 c-Srcの SH2ドメインと ADAPのリン酸化されたチロシン残基とが会合すること、 A DAP上のチロシン残基のリン酸ィ匕は Srcのキナーゼ活性に依存していることが示唆さ れた。
[0160] (2) RAW264細胞を、 Srcの KD変異体（SrcKD)あるいは Srcの CA変異体（SrcCA)を 発現するレトロウイルスでトランスフエクシヨンした。この感染細胞から調製した細胞溶 解物を、抗チロシンリン酸ィ匕抗体（ α -pTyr)で免疫沈降して、抗 ADAP抗体とィムノブ ロッテイングした (図 6Bの上のパネル)。また、上記感染細胞の全細胞溶解物を、抗 Sr c抗体（図 6Bの中央のパネル）または抗 ADAP抗体（図 6Bの下のパネル）を用いてゥ エスタンブロットを行った。図 6Bに示すように、内在性 ADAPの Srcのキナーゼに依存 したリン酸化は、 RAW264細胞におけるレトロウイルスによる c-Srcの CA変異体あるい は KD変異体の発現によっても確認された（図 6B)。このことから、 c-Srcの SH2ドメイン とキナーゼ活性の両方力 ADAPとの会合に不可欠であることが分力つた。
[0161] (3) c-Srcとの会合に関わる ADAP上のチロシン残基の同定
C- Srcの SH2ドメインは pTyr- hydrophilic- hydrpphilic- lie/Proというアミノ酸モチーフ を好んで認識することが知られている。 ADAPのアミノ酸配列を調べたところ、 ADAP にはこれらの配列に近 、チロシン残基が 8つ存在して!/、た（図 6Cの上カラムの矢印） 。そこで、 ADAPの C領域を欠失させた変異体 (ADAP ： ADAPの C末端領域の 327
1-326
以降を欠如した異性体、 ADAP ： ADAPの C末端領域の 615以降を欠如した異性体
1-614
)を作成し、 C- Srcとの会合を確認した。
[0162] 具体的には、 HEK細胞に、 Srcの CA異性体 (CA) (SrcY527F)と、 FLAGを付けた全 長の ADAP (foil)、 ADAP 、または ADAP とをそれぞれ強制発現させた。そして
1-326 1-614
抗 Src抗体で免疫沈降させ、抗 FLAG抗体でブロッテイングした。その結果、全長の A DAPでは Srcとの相互作用が見られた力 ADAP および ADAP では Srcとの相互
1-614 1-326
作用は殆ど見られな力つた（図 6C中央カラム)。また、 HEK細胞に、 Srcの CA異性体（ CA) (SrcY527F)と、 FLAGを付けた全長の ADAP (foil)、 ADAP 、または ADAP
1-326 1-614 とをそれぞれ強制発現させ、抗 FLAG抗体で免疫沈降させて、チロシンリン酸ィ匕を認 識する抗チロシンリン酸ィ匕抗体（α -pTyr)でブロッテイングした。その結果、全長の A DAPではチロシンのリン酸化が確認できた力 ADAP ではリン酸化レベルは著しく
1-614
低下し、 ADAP ではリン酸ィ匕は確認できなカゝつた (結果示さず)。これらの結果から
1-326
、 ADAPの c-SRcとの会合に関係するリン酸ィ匕部位はアミノ酸 615番目以降に存在し、 C- Srcと ADAPとの会合には、 ADAPの 615番目以降の C末端領域 (アミノ酸 615- 819)が 関与していることが明らかになった（図 6C)。
[0163] (4)上記の知見に基づ!/、て、予測サーバー（NetPhos 2.0：デンマークの TechnicalU niversity)を使用して、 ADAPの C末端領域（アミノ酸 615-819)に位置するチロシンキ ナーゼによるリン酸ィ匕部位を推定した。その結果、 4つのチロシン残基 (Tyr615、 687、 791および 807)力 チロシンキナーゼによるリン酸ィ匕の推定部位であると推測された。 これらの中で、既に 615番目と 687番目のチロシン残基（Tyr 615、 Tyr687)は、それぞ れ ADAPおよび SLP-76の認識部位であることが報告されている（ Raab, M., et al.， (19 99) J. Biol. Chem. 274, 21170—21179)。
[0164] そこで、これらの 4つのチロシン残基（Tyr615、 687、 791および 807)を各々フエ-ル ァラニンに置換した ADAP(Y687/791/807F:Tyr615はそのまま、 687、 791及び 807番 目の Tyrを Pheに置換）（Y615/791/807F:Tyr687はそのまま、 615、 791及び 807番目 の Tyrを Pheに置換）（Y615/687/807F:Tyr791はそのまま、 615、 687及び 807番目の T yrを Pheに置換）（Y615/687/791F:Tyr807はそのまま、 615、 687及び 791番目の Tyrを Pheに置換)を用いて、それぞれ c-Srcとの会合活性を測定した。具体的には、 HEK細 胞に、 Srcと、空のベクター（V)、 FLAGを付けた全長の ADAP(WT)、または各種の YF 置換体 (Y687/791/807F、 Y615/791/807F, Y615/687/807F:Tyr791, Y615/687/79 IF)とをそれぞれ強制発現させた。そして抗 Src抗体で免疫沈降させ、抗 FLAG抗体 または抗 Src抗体を用いてブロッツティングした。結果を図 6Dに示す。図 6Dに示すよ うに全長 ADAPと Tyr807を有する YF変異体 (Y615/687/791F)にのみ、 Srcとの会合が 認められた。この結果から、 ADAPの SH3-likeドメインに続く C末端領域に存在する Ty r807が Srcとの会合に必要であることが分かった。
[0165] この結果はマウス ADAPpl30に関する結果である力 この結果から、ヒト ADAPpl30 については、マウス ADAPpl30の Tyr807に相当する Tyr817が、 Srcとの会合に必要で あると考えられる。また、マウス ADAPpl30のスプライシング変異体であるマウス ADAP pl20についても同様に、マウス ADAPpl30の Tyr807に相当する Tyr761が Srcとの会合 に必要であり、ヒト ADAPpl20についてもヒト ADAPpl30の Tyr817に相当する Tyr771が Srcとの会合に必要であると考えられる。
[0166] 実験例 3 ADAPの発現プロファイル、および破骨細胞の先駆細胞内での c-Srcと の会合
(1) RAW264細胞および骨髄細胞内での ADAPの発現プロファイルを検討した。な お、単核の前駆細胞は、 RANKL刺激によって RAW264細胞内で 24時間後に分ィ匕し、 また 48時間後に細胞融合をし始める（Kumagai, N., et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758-768; Ishida, N" et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-4 1156)。私たちは、既に c-srcが RANKL誘導可能な遺伝子で、両方の細胞（RAW264 細胞および骨髄マクロファージ）の中で 24時間後に c-Srcが検出可能になることを報 告している（Kumagai, N" et al" (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758- 768) o
[0167] このように RAW264細胞および骨髄マクロファージ（BMMs)は RANKL刺激によって 分化が促進されるため、これらの細胞を RANKL刺激した 24時間、 48時間、 72時間お よび 96時間目に細胞溶解物を調製し、 ADAPの発現量を、抗 ADAP抗体または抗 |8 ァクチン抗体を用いたウェスタンブロッテイングによって調べた。結果を図 7A上パネ ルに示す。 RANKL刺激後、 48時間目（前融合段階)および 96時間目（多核細胞）の 細胞（RAW264、 BMMs)を、 TRAP染色した結果を図 7A下パネルに示す。
[0168] この結果力 わ力るように、 c-Srcの発現とは対照的に、 ADAPの発現は、両方の細 胞（RAW264細胞および骨髄マクロファージ（BMMs) )ともに、 RANKL刺激しな!、細胞 (0時間のもの）でも認められ、また細胞が多核細胞段階に移行すると減少した (図 7A の上パネル)。 ADAPのァイソフォーム pl30の発現は、 RAW264細胞よりも、骨髄マク 口ファージ（BMMs)でより卓越して!/、るようであった (図 7A)。
[0169] (2) ADAPを発現しない HEK293細胞をネガティブコントロールとして使用した (図 7B の a、 a')。カバースリップの上で RANKL処理した後、 48時間（図 7Bの b、 b')、 96時間 (図 7Bの d、 d' )の RAW264細胞、および同様に RANKL処理した後、 48時間（図 7Bの c、 c，）の骨髄マクロファージ（BMM)細胞を、固定して、抗 ADAP mAbおよび Alexa488 -結合第 2抗体 (緑)で免疫染色した（図 7Bの上パネル)。 位相差画像を図 7Bの下パ ネルに示す。これからわかるように、多核細胞が、画像の中心（図 7Bの d、 d'の中の矢 )で観察された。また、図中の鏃印は、葉状仮足または偽足の最先端における ADAP の局在を示す。
[0170] これらの結果は、 ADAPが成熟した破骨細胞よりも単球細胞にぉ 、て、主な役目を 果たしていることを示唆している。実際、 ADAPを細胞中で免疫染色すると、多核細胞 では弱!、シグナルしか検出されな力つた力 単核球では明確なシグナルが検出され た (図 7B)。前融合段階の細胞では、 ADAPの強いシグナルは、特に葉様仮細胞の最 先端、および偽足の中に検出された (図 7B)。
[0171] (3)次 、で、分ィ匕細胞内で内在性の c-Srcが ADAPと会合することを確認した。具体 的には、骨髄細胞に由来する破骨細胞の前駆細胞 (骨髄マクロファージ)から調製さ れた溶解物（図 8、 BMMs-derivede pOC：右パネル）および RAW264細胞から調製さ れた溶解物（図 8、 RAW264 derivede pOC :右のパネル）から、抗 Src抗体またはコント ロールとして正常なマウス IgG (control IgG)を用いて免疫沈降（IP)を行った。 ウェス タンプロット (IB)を、抗 ADAP抗体（上パネル）および抗 Src抗体（下パネル）をそれぞれ 用いて行った。結果を図 8に示す。図 8に示すように、 RAW264細胞および骨髄細胞 から調製された破骨細胞の前駆細胞 (骨髄マクロファージ）の両方にお!、て、 c-Srcの 免疫沈降が認められた。このことから、分化細胞 (破骨細胞）内で内在性の c-Srcが A DAPと複合体を形成することがわ力る。
[0172] u 付羞に 存した AD APのリン酸化
上記の実験例からマウスの場合、 ADAPのチロシン残基（Tyr807)のリン酸化が c-Sr c (SH2ドメイン）との会合に不可欠であることがわかった。そこで、ここでは ADAPのリン 酸ィ匕が破骨細胞内でどのようにコントロールされているかを調べた。
[0173] 具体的には前融合段階にある RAW264細胞を、プレートから分離して懸濁し、ビトロ ネクチン (Vn)で被覆した培養皿 (Vn被覆プレート)または poly-D-Lys (PDL)で被覆し た培養皿 (PDL被覆プレート）の上に積層して、 60分間放置した。 RAW264細胞 (前融 合段階)の懸濁液、 Vn被覆プレートに積層したもの、 PDL被覆プレートに積層したも のからそれぞれ調製した細胞溶解物を、全てのチロシンをリン酸ィ匕したタンパク質に 対する抗体 (抗チ口シンリン酸ィ匕抗体： α -pTyr)を用いて免疫沈降して、抗 ADAP抗 体を用いてウェスタンブロッテイングを行った。結果を図 9に示す。
[0174] 図 9に示すように、懸濁液の中で ADAPは全くリン酸ィ匕されていな力つた。 Vn被覆プ レートに付着させた ADAPはリン酸ィ匕が認められた力 PDL被覆プレートに付着させ た ADAPはリン酸化しなかったことから、 ADAPのリン酸化がインテグリン依存性である ことが示唆された。この結果から、 ADAPは、細胞粘着 Z接着プロセスに応答し、かつ 機能するようである。 実験例 5 siRNAによる ADAPの抑制は多核細胞の形成 細朐游 を阳.害する ここでは破骨細胞の前駆細胞における ADAPの機能を検討した。
(1) RAW264細胞を ADAP用の siRNAsをコードする発現ベクターでトランスフエタトし 、 ADAPノックダウン細胞を単離した（siADAP cl.lおよび siADAP cl.2)。 RAW264細胞 の親株（parent)、空のベクター（vector)でトランスフエタトした RAW264細胞、または A
Figure imgf000042_0001
て、抗 ADA
P抗体を用いて、ウェスタンブロットを行って、 RAW264細胞内での ADAPの発現の抑 制を確認した（図 10Aの上パネル)。また、発現したタンパク質の量をモニターするた めに、 β - actinに対する抗体 (抗 βァクチン抗体）を用いて同様にウェスタンブロットを 行つた（図 1 OAの下パネル）。
[0176] (2)空のベクター (vector)でトランスフエタトした RAW264細胞、および ADAPノックダ
Figure imgf000042_0002
TRAP 染色を行った。図 10Bの左パネルに、空のベクター (vector)でトランスフエタトした RA W264細胞と ADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2)における代表的な TRAP染色所見 を示す。これら 3つの細胞につ!、て TRAP陽性を示す多核破骨細胞（MN細胞）の数 を数え、空のベクタートランスフエクタント（vector)から誘導された TRAP陽性破骨細 胞の数を 100%として、それと比較した（図 10Bの右パネル)。
[0177] その結果、 siRNAで処理した細胞では、わずかしか MN細胞が検出されず、 ADAPの 発現を抑制することによって MN細胞の形成が抑制されることが示唆された（図 10Bの 右パネル)。 ADAPの発現は主に前融合細胞で検出されることから、これらの結果は、 ADAPが多核細胞形成の過程に重要な役割を果たして 、ることを示して 、る。 この現 象は、アンチセンスの srcを使用して c-srcの発現を抑えた時に観察される現象によく 似ていた (機能的多核細胞の形成が有意に抑制された） (Kumagai, N., et al, (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758-768)。
[0178] (3)次!、で、 RAW264細胞の親株と ADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2細胞）を使 用して、ビデオ ·システムで、細胞遊走に対する影響を経時的に測定した。具体的に は、 RAW264細胞の親株（parent)あるいは ADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2細胞） を RANKLで刺激し、刺激から 48時間後に 5分ごと、細胞の画像を顕微鏡で経時的に 測定した。 50個の細胞の核の位置を各画像でラベルし、核中心の移動を画像中に連 続してディジタルィ匕した。 図 1 1に、この 50細胞全体の移動量を定量ィ匕してプロッティ ングした結果を示す。
[0179] RAW264細胞（parent)の親株の 60%以上は 20-40 μ m/hrの速度で遊走した。しかし 、 siADAP処理したノックダウン細胞（siADAP cl.2細胞）の 75%以上は、 20 /z m/h未満 の速度で遊走した。空のベクターによる感染細胞の遊走活性は、親細胞と同等であ つた。また、 siADAP処理した他のノックダウン細胞（siADAP cl. l細胞）についても、遊 走の遅延が認められた。 これらの結果は、前融合段階における破骨細胞の遊走活 性に、 ADAPが重要であることを示唆するものである。
[0180] 実験例 6 RAW264細胞の親株、および ADAPノックダウン細胞の、 Casのチロシン リン酸化
この実験例は、 in vitroでの破骨細胞形成におけるチロシンリン酸ィ匕を介したシグナ ルの重要性を理解するために、分ィ匕誘導 RAW264細胞における細胞タンパク質のチ 口シン残基リン酸化のプロファイルを検討した。
[0181] ( 1)実験例 5に記載する方法で調製した、 RAW264細胞の親株 (parent)、空のベタ ター（vector)でトランスフエタトした RAW264細胞、または ADAPノックダウン細胞（siAD APcl. lおよび siADAP cl.2)のそれぞれの細胞溶解物（いずれも前融合段階の細胞を 使用）を、 4G10 phosphotyrosine抗体でィムノブロットした。結果を図 12Aに示す。図 12Aに示すように、 4G 10抗 phosphotyrosine抗体と反応する、チロシンリン酸化タンパ ク質が、 125-135 kDaの範囲に検出され、そのシグナルの強度は、 RAW264細胞の親 株あるいは空のベクタートランスフエクタンスに比して、 ADAPノックダウン細胞 (siADA P cl. lおよび cl.2)は弱かった。
[0182] (2)上記の方法で調製した各細胞溶解物を抗チロシンリン酸化抗体（ ex pTyr)で免 疫沈降させ、抗 Cas抗体でィムノブロットした（図 12C)。
[0183] (3) src-ノックダウン細胞力も調製した細胞溶解物を、図 12Dの左のパネルに示す ように分析した。この細胞溶解物は抗チロシンリン酸ィ匕抗体（ ex pTyr)で処理した後、 抗 Cas抗体に対してィムノブロットした（図 12Dの右の上パネル)。また細胞溶解物（w hole cell lysate)を、抗 Src抗体（図 12D右の中央パネル）および抗 βァクチン抗体（ 図 12の右の下パネル）でィムノブロットした。
[0184] この結果からわかるように、 125-135 kDaの範囲に検出されたチロシンリン酸化タン パク質は、 Cas (Crk- associated substrate)に特異的な抗体（抗 Cas抗体）で消耗され ました。これは、 ADAPが、細胞遊走を導くァクチン細胞骨格の構成にドッキング蛋白 として重要な役割を果たすことを示唆している（Chodniewicz, D., et al., (2004) Biochi m. Biophys. Acta. 1692, 63-76)。 Casを消耗した溶解物を使用すると、シグナルは有 意に減少した（図 12B)。このことから、 Casが分化 RAW264細胞においてチロシン—リ ン酸化タンパク質であることを示唆している。 Casは、インテグリンの関与の下、チロシ ン残基でリン酸化されることが示された。また、チロシンがリン酸ィ匕された Casは、遊走 細胞の葉様仮細胞の伸長部に集中することが示された（Chodniewicz, D., et al, (20 04) Biochim. Biophys. Acta. 1692, 63-76)。 更に、 Casと ADAPの複合体の形成が示 唆された (Hamid, N., et al., (1999) Microb. Pathog. 27, 231-242; Deleuil, F.， et al., (2003) Cell. Microbiol. 5, 53-64)。実際に、 ADAPノックダウン細胞における Casの燐 酸化は、著しく減少し、その減少の程度は図 12Cで見られたものと比較可能であった 。これらの結果は、 ADAPが Casのリン酸化に重要であることを示している。
[0185] 更に、 Casのリン酸化は Srcノックダウン細胞の中で減少していることがわかった（図 1 2D)。 c-Srcは Casのリン酸化に関与しており、 c-Srcは前述するようにチロシンのリン 酸ィ匕を介して ADAPに結合するので、これらの結果は c-Srcが ADAPとの複合体の形 成を介して Casに対して影響することを示唆して 、る。
[0186] 実験例 7 c-Srcと ADAPの結合阻害
(1) ADAPの C末端領域発現ベクターの構築
pFLAG- CMV2ベクターの Hindlll部位にマウス ADAPpl30の全長タンパク質をコード する DNAを挿入し、全長 ADAP発現ベクターを構築した。この発現ベクターを BamHI により切断し、 C末端を含む断片を pFLAG- CMV2ベクターの BamHI部位に挿入する ことで、 ADAPの C末端領域断片 (626-819)の発現ベクターを得た。
[0187] (2) ADAPの C末端領域の細胞への導入
HEK293細胞に Srcの CA異性体（CA) (SrcY527F)と、 FLAGを付けた全長のマウス A DAP pl30 (foil)、 FLAGを付けたマウス ADAPpl30の C末端断片（626- 819領域）を強 制発現させた。 ADAPの C末端断片の量は、 DNA/z g比で、全長 ADAP pl30に対し、 それぞれ 1:3、 2:3、 4:3に設定した。その後、各々の細胞溶解液を抗 FLAG抗体あるい は抗 Src抗体で免疫沈降し、抗リン酸ィ匕チ口シン抗体あるいは抗 FLAG抗体、抗 Src抗 体でブロッテイングした。その結果、 ADAPの C末端領域の発現量依存的にリン酸化さ れる ADAPpl30 (foll)の量が減少した（図 13、左'上段）。また、 ADAPの C末端領域の 発現量依存的に c-Srcと ADAP pl30(foll)の結合が阻害された（図 13、右'上段)。以 上のことから、 ADAPの C末端領域力 ADAPp 130 (foil)と Srcとの結合を競合阻害する ことが示された。
[0188] 実験例 8 TAT-ADAPポリペプチドによる ADAPリン酸化の阻害
(1) TAT- ADAPポリペプチドの構築
c-Srcとの結合部位に当たるマウス ADAPpl30の Tyr807を含むチロシンリン酸化モ チーフ (YDDIに相当）を中心に、前後の 4アミノ酸を含む 12アミノ酸配列の領域 (マウ ス ADAPpl30の 803-814領域)を阻害活性領域として設計した (配列番号 1)。この領 域の N末端部位に HIV-1ウィルスの Tatタンパク質が有する細胞膜透過活性領域 (YG RKKRRQRRR:配列番号 2)を付加し、 TAT-ADAPポリペプチド（配列番号 3)とした。
[0189] (2) TAT-ADAPポリペプチドの細胞への導入
Srcの CA異性体（CA) (SrcY527F)と、 FLAGを付けた全長のマウス ADAP pi 30 (foil) を強制発現させた HEK293細胞の培地に TAT-ADAPポリペプチドを添カ卩し培養を行 なった。添カ卩する TAT-ADAPポリペプチドの量は、 1.25、 2.5、 5、 10 ( M)に設定した 。その後、各々の細胞溶解液を抗 FLAG抗体で免疫沈降し、抗リン酸ィ匕チ口シン抗体 、抗 FLAG抗体、抗 Src抗体でブロッテイングした。その結果、 TAT-ADAPポリペプチド の量依存的に、リン酸ィ匕される ADAP (foil)の量が減少した（図 14)。これまでの実験 により、 ADAPのリン酸ィ匕は Srcとの結合に必須であることが分力つている。従って、本 実験の結果は、 TAT-ADAPポリペプチド力AD AP (foil)のリン酸化を抑制して c-Srcと の結合を阻害することを示すものである。
図面の簡単な説明
[0190] [図 l]c- Srcの構造を示す模式図である。
[図 2]マウス ADAP(adnesion and degranulation— promoting adaptor proteinノのァイソ フォーム pl30の構造と、それと関連するタンパク質を示す模式図である
[図 3]マウス由来 ADAPのァイソフォーム pl30のアミノ酸配列とヒト由来 ADAPのァイソ フォーム pl30のアミノ酸配列とを対比した図である。
[図 4]マウス由来 ADAPのァイソフォーム pl20のアミノ酸配列とヒト由来 ADAPのァイソ フォーム pl20のアミノ酸配列とを対比した図である。
[図 5]図 Aは、 GST—U—SH3 -SH2についてプルダウンアツセィを行い、 GST— U— SH3 -S H2と結合するタンパク質を同定した結果を示す。図 Bは、 GST融合 Srcドメイン (GST- U-SH3 -SH2, GST-U-SH3)と結合した ADAPのプルダウンアツセィの結果を示す（実 験例 1)。
[図 6]実験例 2において ADAPの c-Src-会合部位を同定した結果を示す。図 Aは、 AD APの c-Srcに対するリン酸化依存性の会合を示す。図 Bは、 Src変異体を発現する RA W264細胞における ADAPのチロシンリン酸化を示す。図 Cは、 ADAPの C末端領域が c-Srcとの会合に関わっていることを示す。図 Dは c-Srcとの会合に関係する ADAP中 のチロシン残基を同定した結果を示す。
[図 7]RAW264細胞および破骨細胞の前記細胞における ADAPの発現プロファイルを 示す。図 Aは分化 RAW264細胞における ADAPの発現レベルを示す。図 Bは ADAPの 免疫染色の結果を示す。図中の鏃印は、葉状仮足または偽足の最先端における AD APの局在を示す。バー長さは 20 μ m。
[図 8]RAW264細胞および骨髄マクロファージ細胞の前駆細胞における、 ADAPと c-Sr cとの会合を示す。
[図 9]ADAPの付着依存のチロシンリン酸ィ匕を示す。
[図 10]図 Aは siRNA処理した細胞の ADAP発現を示す。図 Bは多核細胞形成に対す る ADAPのノックダウンの影響を調べた結果を示す。左パネル下のバーの長さは 50 μ mG
[図 11]ADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2)の遊走の遅延を示す図である。
[図 12]図 A RAW264細胞におけるチロシンが燐酸化されたタンパク質を、図 Bは Cas の減少を、図 ま ADAPノックダウン細胞における Casの燐酸化を、図 Dは Srcノックダ ゥン細胞の Casの燐酸化をそれぞれ示す。 [図 13]実施例 7において c-SRCと ADAPの結合阻害を調べた結果を示す図である。 図左は ADAPの C末端領域（図中： ADAP626- 819)の発現量依存的に、 c- Srcによる A DAP pl30(foll)のチロシンリン酸化が抑制されていることを示す。図右は ADAPの C末 端領域（図中： ADAP626-819)の発現量依存的に、 c-Srcと ADAP pl30(foll)の結合が 阻害されていることを示す。
[図 14]実施例 8において Tat-ADAPポリペプチドによる ADAPリン酸化の阻害を調べ た結果を示す図である。図左は Tat-ADAPのアミノ酸配列を示す図である。図右は Ta t-ADAPの添カ卩量依存的に、 c-Srcによる ADAP pl30(foll)のチロシンリン酸化が抑制 されていることを示す。

Claims

請求の範囲
[1] ADAP dhesion of degranulation— promoting adaptor protein;と c— Srcの結合を！ ¾_ する活性を有する、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成 分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
[2] 上記ポリペプチドが、さらに細胞膜透過性配列を有するものである請求項 1記載の 破骨細胞分化形成抑制剤。
[3] 上記細胞膜透過性配列が配列番号 2に記載するアミノ酸配列である、請求項 2記 載の破骨細胞分化形成抑制剤。
[4] 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする、請求項 1 記載の破骨細胞分化形成抑制剤。
[5] 下記 (a)または (b)に記載するポリペプチドを有効成分とする請求項 1記載の破骨 細胞分化形成抑制剤：
(a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド、
(b)上記アミノ酸配列（配列番号 4)の配列番号 1に記載するアミノ酸配列以外の領 域において、 1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有し、且つ ADAPと c-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド。
[6] 下記 (a)乃至 (c)の 、ずれか 1に記載するポリペプチドをコードする DNAを有効成 分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
(a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド、
(b)上記アミノ酸配列（配列番号 4)の配列番号 1に記載するアミノ酸配列以外の領 域において、 1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を 有し、且つ ADAPと c-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号 3に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
[7] 配列番号 1のアミノ酸配列を有するポリペプチド力 なる ADAPと c-Srcの結合阻害 剤。
[8] 単球由来のマクロファージ様細胞における c-Srcと ADAP (adhesion of degranulation
-promoting adaptor protein)との結合を阻害することを特徴とする、破骨細胞の分化 形成抑制方法。 [9] 単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウス c- Srcの SH2ドメインとマウス ADAP pl30の 807番目のチロシン残基（Tyr807)またはマウス ADAPpl20の 761番目のチロシ ン残基 (Tyr761)との結合を阻害することを特徴とする、請求項 8に記載する破骨細 胞の分化形成の抑制方法。
[10] マウス ADAPpl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761のリン酸化を抑制して 、単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAP pl30の Tyr807またはマウス ADAPpl20の Tyr761との結合を阻害する請求項 8に記載 する破骨細胞の分ィヒ形成の抑制方法。
[11] 単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の 817番目のチロシン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン残基（T yr771)との結合を阻害することを特徴とする、請求項 8に記載する破骨細胞の分ィ匕形 成の抑制方法。
[12] ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を抑制して、単球 由来のマクロファージ様細胞におけるヒト C- Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の Tyr81 7またはヒト ADAPpl20の Tyr771との結合を阻害する請求項 8に記載する破骨細胞の 分化形成の抑制方法。
[13] 請求項 1に記載する破骨細胞分ィヒ形成抑制剤を用いて c-Srcと ADAPとの結合を阻 害する、請求項 8に記載する破骨細胞の分化形成抑制方法。
[14] 下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質の存在下で、 c-Src若しくはその SH2ドメインを含む断片と ADAP(adhesio n of degranulation— promoting aaaptorprotein)若しくはその c— Srcとの結合に関わ o断 片とを接触させる工程、
(b)上記 c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、 および
(c)上記 c-Src若しくはその断片と ADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物 質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
[15] 下記の工程を有する、請求項 14に記載するスクリーニング方法：
(a')被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の 807番目 のチロシン残基（Tyr807)またはマウス ADAPpl20の 761番目のチロシン残基（Tyr761 )とを接触させる工程、
( ）
Figure imgf000050_0001
の Tyr761の結合を測定する工程、および
( ）上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程 下記の工程を有する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法： (1)被験物質の存在下で、マウス C- Srcの SH2ドメインとマウス ADAPpl30の 807番目の チロシン残基 (Tyr807)またはマウス ADAPpl20の 761番目のチロシン残基（Tyr761)と を接触させる工程、
Figure imgf000050_0002
る工程、および
(3)上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択するェ 程。
[17] 下記の工程を有する、請求項 14に記載するスクリーニング方法：
(a")被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の 817番目のチロ シン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン残基（Tyr771)とを接触 させる工程、 の結合を測定する工程、および
(c")上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程
[18] 下記の工程を有する破骨細胞分ィ匕形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1 ')被験物質の存在下で、ヒト c-Srcの SH2ドメインとヒト ADAPpl30の 817番目のチロ シン残基（Tyr817)またはヒト ADAPpl20の 771番目のチロシン残基（Tyr771)とを接触 させる工程、
(2')ヒト ADAPpl30の Tyr817またはヒト ADAPpl20の Tyr771のリン酸化を測定するェ 程、および (3')上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する 工程。
[19] 骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の探索または取得方 法である請求項 14、 16または 18に記載するスクリーニング方法。
[20] 骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性 腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における 骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページエツト病、 家族性拡張性骨溶解症 (familial expansile osteolysis:FEO)、または、歯周疾患であ る、請求項 19に記載するスクリーニング方法。
[21] ADAP dhesion of degranulation— promoting adaptor protein;と c— Srcの結合を！ ¾_ する活性を有する、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効量 、骨代謝異常疾患を有する力またはその前状態にある被験者に投与することを含む 、骨代謝異常疾患の予防または治療方法。
[22] ADAP dhesion of degranulation— promoting adaptor protein;と c— Srcの結合を！ ¾_ する活性を有する、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの、破骨 細胞分化形成抑制剤の調製のための使用。
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