DE60012718T2 - Prognose von ptp lar vermittelten krankheiten - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft unter anderem Verfahren zu Modulation der epithelialen Zellmigration und Verfahren, die verwendbar sind zur Identifikation der verschiedenen, für die Behandlung der mannigfaltigen Krankheiten und Funktionsstörungen zweckmäßigen Produkte.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die folgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung ist vorgesehen zur Unterstützung des Verständnisses der Erfindung, ist aber nicht zulässig als oder um den Stand der Technik der Erfindung zu beschreiben.
  • Die Cadherine stellen eine Familie von Transmembran-Rezeptoren dar, welche die homophile, Ca2+-abhängige Zell/Zell-Adhäsion vermitteln. In epithelialen Zellen werden die Vertreter dieser Familie, wie zum Beispiel die klassischen E-, N-, und P-Cadherine, vorzugsweise an Adherens Junctions (adhärente Verbindungen) angrenzender Zellen gefunden (Yap et al. (1997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 119–146.). β-Catenin und Plakoglobin (γ-Catenin) assoziieren direkt mit den hochkonservierten cytoplasmatischen Domänen der klassischen Cadherine in einer gegenseitig exklusiven Art und Weise (Ozawa et al. (1989) EMBO J. 8, 1711–1718; Hinck et. al (1994) J. Cell Biol. 125, 1327–1340).
  • Der Cadherin/Catenin-Komplex ist über α-Catenin entweder direkt (Rimm et. al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8813–8817) oder indirekt über die Actin-bindenden Proteine α-Actinin oder Vinculin (Knudsen et. al (1995) J. Cell Biol. 130, 67–77; Weiss et. al (1998) J. Cell Biol. 141, 755–64) mit dem Actinfilament-Netzwerk verbunden. Die Assoziation des Cadherin/Catenin-Komplexes mit dem Cytoskelett ist essentiell für eine enge Zell/Zell-Interaktion. Trotzdem müssen Cadherin/Catenin-vermittelte Zell/Zell-Kontakte hochdynamisch sein, da insbesondere während der Embryonalentwicklung oder der Wundheilung Adherens Junctions schnell getrennt und wieder verbunden werden müssen (Marrs et. al (1996) Int. Rev. Cytol. 165, 159–205).
  • Die Herunterregulation (Downregulation) von Cadherinen hat die Trennung benachbarter Zellen zur Folge, ein Phänomen, das während der Embryonalentwicklung an der epithelialmesenchymalen Transition (EMT) des sich bildenden Mesoderms beobachtet wird (Huber et al. (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8, 685–691) sowie in Tumorzellen, was deren Invasion und Ausbreitung im Körper erlaubt (Becker et. al (1994) Cancer Res. 54, 3845–3852). Während der epithelial-mesenchymalen Transition verlieren die Zellen transient ihre epithelialen Merkmale und nehmen eine fibroblastoide Morphologie an (Thiery et. al (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1, 91–113). Die entscheidende Bedeutung eines intakten Cadherin/Catenin-Komplexes wird durch die Beobachtung unterstrichen, dass die Herunterregulation jedweder seiner Komponenten den Verlust der tumorsuppressiven Aktivitäten der Adherens Junctions zur Folge hat und mit Tumorinvasion und mit Metastasenbildung korreliert (Birchmeier et. al (1995) Ciba F. Symp. 189, 124–141).
  • Außerdem scheint die Integrität der Adherens Junctions durch Tyrosin-Phosphorylierung dynamisch reguliert zu werden. Die Transfektion eines v-src Onkogens (Behrens et. al (1993) J. Cell Biol. 120, 757–766; Hamaguchi et. al (1993) EMBO J. 12, 307–314) oder die Behandlung mit Wachstumsfaktoren (Shibamoto et. al (1994) Cell Adhes. Commun. 1, 295–305; Fujii et. al (1996) Exp. Cell Res. 223, 50–62) verursacht eine unstabile Zell/Zell-Adhäsion. Die Migration von Zellen und die Inhibierung der Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTP) steigert diesen destabilisierenden Effekt (Volberg et. al (1992) EMBO J. 11, 1733–1742). Das Modell, in dem eine reversible Tyrosin-Phosphorylierung dazu dient, die Cadherin-vermittelte Zell/Zell-Adhäsion zu regulieren, wird weiterhin durch den Nachweis der Assoziation des Cadherin/Catenin-Komplexes mit den Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) EGF-Rezeptor und HER2/Neu (Hoschuetzky et. al (1994) J. Cell Biol. 127, 1375–1380; Ochiai et. al (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 205, 73–78) sowie mit den Transmembran PTPs μ, κ und λ (Brady-Kalnay et. al (1995) J. Cell Biol. 130, 977–986; Fuchs et. al (1996) J. Biol. Chem. 271, 16712–16719; Cheng et. al (1997) J. Biol. Chem. 272, 7264–7277) gestützt.
  • β-Catenin und Plakoglobin sind Säugetierhomologe des Drosophila Proteins Armadillo, dessen Funktion für die normale segmentale Musterbildung während der Entwicklung kritisch ist (Riggleman et. al (1989) Genes Dev. 3, 96–113). Die Gegenwart eines sich wiederholenden 42 Aminosäure-Sequenzmotivs definiert die Vertreter der "Armadillo-Familie" (Peifer et. al (1994) Cell 76, 789–791).
  • Die in den Drosophila und Xenopus Systemen erhaltenen Ergebnisse schlagen eine weitere Funktion für β-Catenin vor, unabhängig von der Cadherin-vermittelten Zelladhäsion. Diese involviert die Translokation von β-Catenin in den Zellkern, der seine Akkumulation im Cytoplasma vorausgeht. Folglich ist freies β-Catenin an der transkriptionellen Regulation spezifischer Gene beteiligt, die essentiell für die Embryonalentwicklung sind (Miller et. al (1996) Genes Dev. 10, 2527–2539). Die Signale, welche in einem freien Pool an β-Catenin resultieren, umfassen die Bindung von Wingless/Wnt an seinen Transmembran-Rezeptor Frizzled sowie die Inhibierung der Serin/Threonin-Kinase Zeste-white 3 (Shaggy) oder seines Wirbeltierhomologs Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3; Moon et. al (1997) Trends Genet. 13, 256–258).
  • Weitere Funktionen von β-Catenin und Plakoglobin werden durch ihre Assoziation mit dem Adenomatous Polyposis Coli (APC) Tumorsuppressorprotein angezeigt. Man nimmt an, dass dieses Protein als ein cytoplasmatischer Effektor von β-Catenin dient, der die Akkumulation des cytosolischen β-Catenins zusammen mit GSK3 (Bullions et. al (1996) Curr. Opin. Oncol. 10, 61–7) und Axin/Conduktin (Ikeda et. al (1998) EMBO J. 17, 1371–1384; Behrens et. al (1998) Science 280, 596–599; Sakanaka et. al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3020–3023) durch Induzieren der Ubiquitin-abhängigen Degradation von ß-Catenin (Aberle, et. al (1997) EMBO J. 16, 3797–3804) negativ reguliert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Während der epithelialen Migration akkumuliert β-Catenin im Cytosol in einer freien, unkomplexierten und Tyrosinphosphorylierten Form. Im Gegensatz dazu erhält β-Catenin in konfluenten Zellen die epitheliale Zelulintegrität als einen essentiellen Teil des Cadherin/Catenin-Tumorsuppressorsystems aufrecht. Somit reguliert die Tyrosin-Phosphorylierung die Funktion von β-Catenin als ein Signalmolekül während der epithelialen Zellmigration. PTP LAR ist ein Modulator der epithelialen Zellmigration. Folglich liegt eine Funktion seiner Phosphatase in der Regulation von Zell/Zell-Kontakten und der epithelialen Zellintegrität. Weiterhin hemmt die ectopische Expression von PTP LAR die Tumorbildung in Nacktmäusen. Ein Dysfunktion von PTP-LAR kann daher zu Tumorinvasion und Metastasenbildung führen. Der Patient ist ein Säugetier, und vorzugsweise ein Mensch.
  • Der Begriff "verhindern" bezeichnet die Verringerung der Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Organismus an einem anomalen Zustand erkrankt oder diesen entwickelt.
  • Der Begriff "behandeln" bezeichnet das Aufweisen eines therapeutischen Effekts und eine zumindest teilweise Linderung oder Aufhebung eines anomalen Zustandes in dem Organismus.
  • Der Begriff "therapeutischer Effekt" bezeichnet die Hemmung oder Inaktivierung von Faktoren, die den anomalen Zustand verursachen oder dazu beitragen. Ein therapeutischer Effekt lindert in gewissem Ausmaß eines oder mehr der Symptome des anomalen Zustandes. Mit Bezug auf die Behandlung anomaler Zustände kann sich ein therapeutischer Effekt auf eines oder mehr des Folgenden beziehen: (a) ein Anstieg der Proliferation, des Wachstums und/oder der Differenzierung von Zellen; (b) die Hemmung (d. h. Verlangsamen oder Stoppen) des Zelltods; (c) die Hemmung der Degenerierung; (d) die Linderung in einem gewissen Ausmaß von einem oder mehr der mit dem anomalen Zustand assoziierten Symptome; und (e) die Steigerung der Funktion der betroffenen Zellpopulation. Insbesondere umfasst ein therapeutischer Effekt die Verhinderung/Hemmung der epithelialen Zellmigration. Verbindungen, welche Effizienz gegenüber anomalen Zuständen zeigen, können wie hier beschrieben identifiziert werden.
  • Der Begriff "anomaler Zustand" bezieht sich auf eine Funktion in den Zellen oder Geweben eines Organismus, welche von deren normalen Funktionen in diesem Organismus abweicht. Ein anomaler Zustand kann beispielsweise die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung, das Zellüberleben oder die Zellmigration betreffen.
  • Anomale Zellproliferationszustände umfassen Krebs, Metastasen, fibrotiusche oder mesangiale Funktionsstörungen, anomale Angiogenese und Vasculogenese, Wundheilung, Psoriasis, Diabetes mellitus und Entzündung.
  • Anomale Differenzierungszustände umfassen, sind aber nicht beschränkt auf neurodegenerative Funktionsstörungen, langsame Wundheilungsraten und langsame Gewebetransplantations-Heilungsraten.
  • Anomale Zellüberlebenszustände betreffen Zustände, in denen die Stoffwechselwege des programmierten Zelltods (Apoptose) aktiviert oder abgeschaltet sind..
  • Anomale Zellmigrationszustände umfassen, sind aber nicht beschränkt auf aberrante Wundheilung, Krebs und Metastasenbildung.
  • Der Begriff "abberant" bezeichnet in Bezug auf diese Erfindung eine geringere oder höhere epitheliale Zellmigration verglichen mit normalen Zellen des selben Organismus oder eines unterschiedlichen Organismus. Alternativ kann es sich auf die Über- oder Unter-Tyrosin-Phosphorelierung von β-Catenin oder höhere oder geringere als die normalen Niveaus der β-Catenin-Pools beziehen. Diese Effekte können durch PTP LAR oder durch andere Verbindungen der Erfindung moduliert werden.
  • Der Begriff "verabreichen" bezeichnet ein Verfahren des Einbringens einer Substanz in Zellen oder Gewebe eines Organismus. Der anomale Zustand kann verhindert oder behandelt werden, wenn die Zellen oder die Gewebe des Organismus im Organismus oder außerhalb des Organismus existieren. Zellen, die außerhalb des Organismus existieren, können in Zellkulturschalen erhalten oder angezogen werden. Für Zellen, die im Organismus beherbergt werden, existieren im Stand der Technik viele Verfahren, um Substanzen zu verabreichen einschließlich (aber nicht beschränkt auf) orale, parenterale, dermale, Injektions- und Aerosol-Applikationen. Für Zellen außerhalb des Organismus existieren im Stand der Technik vielfältige Verfahren, um Substanzen zu verabreichen einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Zell-Mikroinjektionsverfahren, Transformationsverfahren und Carrier-Verfahren.
  • Der Patient ist vorzugsweise ein Säugetier einschließlich, aber nicht beschränkt auf Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen oder Ziege, bevorzugter ein Affe oder ein Menschenaffe und am meisten bevorzugt ein Mensch.
  • Der Begriff "PTP LAR" wie hier verwendet bezeichnet entweder die in 9 bereitgestellte Aminosäuresequenz oder Fragmente und Derivate davon, unter der Voraussetzung, dass die funktionelle Aktivität beibehalten wird. Bevorzugte funktionelle Aktivitäten von PTP LAR umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Fähigkeit zur Hemmung/Verhinderung der Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin, die Fähigkeit zur Verhinderung eines Anstiegs (oder einer Verminderung) der Pools an freiem β-Catenin und die Fähigkeit zur Hemmung/Verhinderung der epithelialen Zellmigration in vitro oder in vivo. Spezifische Fragmente einschließlich funktioneller Domänen, die im Rahmen der Erfindung vorgesehen sind, umfassen die hier in den Beispielen und in 11 beschriebenen. Zusätzlich können andere Modifikationen, Substitutionen und Delektionen vorgesehen sein, wie zum Beispiel diejenigen, welche eine funktionelle Aktivität nicht außer Kraft setzen. Diese werden genauer in der detaillierten Beschreibung der Erfindung diskutiert.
  • Weiter ist im Rahmen der Definition von "PTP LAR" hier ebenfalls eine Nukleinsäuresequenz beschrieben, welche PTP LAR kodiert (10). Ähnlich zu oben sind ebenfalls Fragmente eingeschlossen, welche funktionelle Domänen von PTP LAR kodieren, sowie Derivate der Nukleinsäure, welche PTP LAR oder funktionelle Fragmente davon kodiert, wie ebenfalls ausführlich in der detaillierten Beschreibung der Erfindung dargestellt.
  • Der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" oder "pharmazeutisch" wie hier verwendet betrifft Lösungen oder Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die therapeutische Komponente nicht davon abhalten, einen therapeutischen Effekt auszuüben, und die keine unannehmbaren nachteiligen Nebenwirkungen verursachen. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Reagenzien werden in The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD 1990 und FDA Inactive Inguredient Guide 1990, 1996 von der Division of Drug Information Resources veröffentlicht, bereitgestellt. Nicht akzeptable Nebenwirkungen variieren für verschiedene Erkrankungen. Allgemein werden je schwerer die Krankheit ist, umso toxischere Effekte toleriert. Nicht akzeptable Nebenwirkungen für verschiedene Erkrankungen sind im Stand der Technik bekannt.
  • Der Begriff "physiologisch akzeptabel" definiert einen Trägerstoff oder ein Verdünnungsmittel, das keine signifikante Irritation an einem Organismus verursacht und vorzugsweise die biologische Aktivität und die Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt.
  • Der Begriff "Trägerstoff" definiert eine chemische Verbindung, welche die Inkorporation einer Verbindung in Zellen oder Gewebe erleichtert. Beispielsweise ist Dimethylsulfoxid (DMSO) ein üblicherweise verwendeter Trägerstoff, da es die Aufnahme vieler organischer Verbindungen in die Zellen oder Gewebe eines Organismus erleichtert.
  • Der Begriff "Verdünnungsmittel" definiert chemische Verbindungen, die in Wasser (oder einem anderen Lösungsmittel) verdünnt die Verbindung von Interesse lösen sowie die biologisch aktive Form der Verbindung stabilisieren. Viele Salze, die in gepufferten Lösungen gelöst sind, werden als Verdünnungsmittel im Stand der Technik verwendet. Eine üblicherweise verwendete gepufferte Lösung ist phosphatgepufferte Saline, da sie die Salzkonzentrationen menschlichen Bluts nachahmt. Da Puffersalze den pH einer Lösung in geringen Konzentrationen kontrollieren können, modifiziert ein Verdünnungsmittel selten die biologische Aktivität einer Verbindung.
  • Der Begriff "Lösungsmittel" wie hier verwendet bezeichnet eine chemische Verbindung, welche die Solubilisierung von Verbindungen gemäß der Erfindung erleichtert. Beispiele für Lösungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf pharmazeutisch annehmbare Alkohole, wie zum Beispiel Ethanol und Benzylalkohol; Polyoxyhydrocarbyl-Verbindungen, wie zum Beipiel Poly(ethylenglykol); pharmazeutisch annehmbare Surfactants, wie zum Beispiel CREMOPHOR® EL; polyglycolisierte Lipide, wie zum Beispiel GELUCIRE® und LABRASOL®; und pharmazeutisch annehmbare Öle, wie zum Beispiel Miglyol 812.
  • Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Alkohol" wie hier verwendet bezeichnet Alkohole, die bei etwa Raumtemperatur (annähernd 20°C) Flüssigkeiten sind. Diese umfassen Propylenglycol, Ethanol, 2-(2-Ethoxyethoxy)ethanol (TRANSCUTOL®, Gattefosse, Westwood, NJ 07675), Benzylalkohol und Glyzerin.
  • Der Begriff "Polyoxyhydrocarbyl-Verbindung" wie hier verwendet bezeichnet ein wasserlösliches Kohlehydrat wie zum Beispiel Glucose, Sucrose, Maltotriose und dergleichen; wasserlösliche Kohlehydratderivate, wie zum Beispiel Gluconsäure und Mannitol und Oligosaccharide; sowie wasserlösliche Polymere, wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon, Poly(vinylalkohol), und insbesondere Polyether, wie zum Beispiel andere Polyoxyalkylene einschließlich Poly(ethylenglycol) oder andere wasserlösliche gemischte Oxyalkylen-Polymere sowie die polymere Form von Ethylenglycol. Obwohl Polyoxyhydrocarbyl-Verbindungen vorzugsweise mehr als ein Kohlenstoffatom, Sauerstoffatom und Wasserstoffatom enthalten, sind einige Moleküle, wie zum Beispiel Poly(ethylenimin) ebenfalls eingeschlossen.
  • Eine besonders bevorzugte Klasse solubilisierender Polyoxyhydrocarbyl-Verbindungen umfasst Poly(ethylenglycol) (PEG) und PEG-Derivate, wie zum Beispiel PEG-Monomethylether. Andere geeignete PEG-Derivate umfassen PEG-Silikon abgeleitete Ether. Viele dieser Polymere sind kommerziell in einer Vielzahl von Molekulargewichten verfügbar. Andere können einfach aus kommerziell verfügbaren Materialien hergestellt werden, wie etwa durch Kopplung eines Amino-PEG-Anteils an einen Haloalkyl-Silyl- oder Silan-Anteil.
  • Geeignete PEGs können in ihrem Molekulargewicht zwischen etwa 200 g/mol bis etwa 20.000 g/mol oder mehr, bevorzugter 200 g/mol bis 5.000 g/mol, noch bevorzugter 250 g/mol bis 1.000 g/mol und am meisten bevorzugt 250 g/mol bis 500 g/mol variieren. Die Wahl eines bestimmten Molekulargewichts kann abhängen von der Art der gewählten Verbindung und deren Molekulargewicht sowie Grad der Hydrophobizität sowie der bestimmten Anwendung, für welche die Formulierung verwendet wird.
  • Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Surfactant" wie hier verwendet bezeichnet eine Verbindung, welche die Verbindungen gemäß der Erfindung in wässrige Lösungen solubilisieren kann, falls notwendig. Vorzugsweise für parenterale Formulierungen ist der Surfactant ein nichtionischer Surfactant. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Surfactants umfassen POLYSORBAT 80 und andere Polyoxyethylen-Sorbitan-Fettsäureesther, Glycerin-Monooleat, Polyvinylalkohol, Ethylenoxid-Copolymere, wie zum Beispiel PLURONIC® (ein Polyether) und TETRONIC® (BASF), Polyol-Einheiten und Sorbitanesther. Vorzugsweise werden ethoxylierte Kastoröle, wie beispielsweise CREMOPHOR® EL, für die Formulierung einiger Verbindungen verwendet.
  • Der Begriff "ethoxyliertes Kastoröl" wie hier verwendet bezeichnet ein Kastoröl, das mit mindestens einer sauerstoffenthaltenden Einheit modifiziert wird. Insbesondere bezeichnet der Begriff ein Kastoröl, welches mindestens eine Ethoxyl-Einheit umfasst.
  • Weiterhin umfasst der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Surfactant" wie hier in Bezug auf orale Formulierungen verwendet pharmazeutisch annehmbare nicht-ionische Surfactants (zum Beispiel Polyoxyethylenpropylen-Glycol, wie beispielsweise POLORAMER® 68 (BASF Corp.) oder ein Mono-Fettsäureesther von Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monooleat (TWEEN© 80), Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monostearat (TWEEN® 60), Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monopalmitat (TWEEN® 40), Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monolaurat (TWEEN® 20) und ähnliches); Polyoxyethylen-Kastorölderivate (zum Beispiel Polyoxyethylenglycerol-Triricinoleat oder Polyoxyl-35-Kastoröl (CREMOPHOR® EL, BSF Corp.), Polyoxyethylenglycerol-Oxystearat (CREMOPHOR® RH 40 (Polyethylenglycol-40-hydrogeniertes-Kastoröl) oder CREMOPHOR® RH 60 (Polyethylenglycol-60-hydrogeniertes-Kastoröl, BASF Corp.) und ähnliches) oder ein pharmazeutisch annehmbarer anionischer Surfactant.
  • Der Begriff "polyglycolisierte Lipide" wie hier verwendet bezeichnet Gemische von Monoglyceriden, Diglyceriden oder Triglyceriden und Polyethylenglycol-Monoestern und – Diestern, welche durch die partielle Alkoholyse von Pflanzenölen unter Verwendung von PEG mit 200 g/mol bis 2.000 g/mol oder durch die Esterifizierung von Fettsäuren unter Verwendung von PEG mit 200 g/mol bis 2.000 g/mol und Glyzerinen hergestellt werden. Vorzugsweise umfassen diese GELUCIRE® 35/10, GELUCIRE® 44/14, GELUCIRE® 46/07, GELUCIRE® 50/13, GELUCIRE® 53/10 und LABRASOL®.
  • Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Öle" wie hier verwendet bezeichnet Öle, wie zum Beispiel Mineralöl oder Pflanzenöl (einschließlich Safflower-Öl, Erdnussöl, und Olivenöl) fraktioniertes Kokosnussöl, Propylenglycol-Monolaurat, gemischte Triglyceride mit Caprylsäure und Caprinsäure und ähnliches. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weisen Mineralöl, Pflanzenöl, fraktioniertes Kokosnussöl, gemischte Triglyceride mit Caprylsäure und Caprinsäure auf. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung weist Miglyol® 812 auf (verfügbar von Huls America, USA).
  • In bevorzugten Ausführungsformen von Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit oder Funktionsstörung wird PTP LAR als rekombinantes Protein, rekombinantes Gen oder als Teil einer rekombinanten Zelle bereitgestellt. Verfahren dazu sind dem Fachmann bekannt, und Beispiele werden weiterhin hier in der genauen Beschreibung der Erfindung diskutiert.
  • Der Begriff "rekombinant" wie hier verwendet bezeichnet die Manipulation von Genen, Proteinen und Zellen im Labor, welche im Stand der Technik Standard ist. Das erhaltene Gen, das Protein oder die Zelle kann identisch zu dem Gen, dem Protein oder der Zelle in ihrem natürlichen Wirt sein oder es kann in gewisser Weise modifiziert worden sein, zum Beispiel zur Erleichterung der Manipulation oder um es in einen geeigneten Vektor zu klonieren oder um eine einfachere Detektion zu erlauben oder um weniger einfach degradiert zu werden. Einige Aspekte der Erfindung umfassen rekombinante Fragmente von PTP LAR, die für Gentherapieanwendungen in vitro und in vivo manipuliert wurden.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen von Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit oder Funktionsstörung moduliert PTP LAR die epitheliale Zellmigration in vitro oder in vivo, und hemmt vorzugsweise die epitheliale Zellmigration in vivo oder in vitro. PTP LAR kann auch (oder anstelle) die Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin in vitro oder in vivo modulieren und hemmt vorzugsweise die Tyrosin-Phosphorylierung von ß-Catenin in vitro oder in vivo. Schließlich kann PTP LAR auch (oder anstelle) den freien Pool von β-Catenin in vitro oder in vivo modulieren und vermindert vorzugsweise das Niveau des freien Pools von β-Catenin in vitro oder in vivo.
  • Der Begriff "moduliert" bezeichnet die Fähigkeit von PTP LAR oder einer Verbindung, die epitheliale Zellmigration, die β-Catenin Tyrosin-Phosphorylierung oder die Niveaus freier β-Catenin Pools zu verändern. Ein Modulator hemmt vorzugsweise, obwohl es unter manchen Umständen vorteilhaft sein kann, diese Funktionen zu erhöhen.
  • Der Begriff "moduliert" bezieht sich auch auf die Erhöhung oder Verminderung der Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner gebildet wird. Ein Modulator erhöht vorzugsweise die Wahrscheinlichkeit, dass ein solcher Komplex zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner gebildet wird oder vermindert die Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner gebildet wird. Der Begriff "Komplex" bezeichnet einen Zusammenbau von zumindest zwei Molekülen, die aneinander gebunden sind.
  • Der Begriff "natürlicher Bindungspartner" bezeichnet Polypeptide, Lipide, kleine Moleküle oder Nukleinsäuren, die an PTP LAR binden. Eine Veränderung in der Interaktion zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner kann sich selbst als eine erhöhte oder verminderte Wahrscheinlichkeit manifestieren, dass die Interaktion gebildet wird oder eine erhöhte oder verminderte Konzentration des PTP LAR/natürlicher Bindungspartner-Komplex sowie Veränderungen in der Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin oder der Niveaus der freien Pools an β-Catenin.
  • In einem zweiten Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren für die Prognose einer Krankheit oder Funktionsstörung durch Detektion von PTP-LAR in einer Probe auf, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Nukleinsäure-Sonde, die unter Bedingungen eines Hybridisierungs-Assays an eine Nukleinsäure-Zielregion von PTP LAR hybridisiert, wobei die Probe eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die PTP LAR, Fragmente davon oder die Komplemente der besagten Sequenzen oder Fragmente kodiert; und (b) Detektieren der Gegenwart oder Menge des Sonde/Zielregion-Hybrids als eine Indikation für die Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt, die aus aberranter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht.
  • Ein alternatives Verfahren zur Prognose einer Krankheit oder Funktionsstörung durch Detektion von PTP LAR in einer Probe umfasst: (a) Vergleichen einer Nukleinsäure-Zielregion, welche die PTP LAR codiert, in einer Probe mit einer Kontroll-Nukleinsäure-Zielregion, welche die PTP LAR codiert; und (b) Detektieren von Unterschieden in der Sequenz oder der Menge zwischen der Zielregion und der Kontroll-Zielregion als eine Indikation der Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung. Vorzugsweise wird die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt, die aus abberanter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht.
  • Ein zusätzliches Verfahren zur Prognose einer Krankheit oder Funktionsstörung durch Detektion von PTP LAR in einer Probe umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der unter Bedingungen eines Hybridisierungs-Assays mit einer Aminosäure-Zielregion von PTP LAR hybridisiert; und (b) Detektieren der Gegenwart oder der Menge des Antikörper/Zielregion-Komplexes als eine Indikation der Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung. Vorzugsweise ist der Antikörper entweder ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper oder er stammt aus einer Hybridomazelllinie. Vorzugsweise wird die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt, die aus aberranter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht.
  • Der Begriff "prognostisch" wie hier verwendet bezeichnet zum Beispiel die Wahrscheinlichkeit einer Heilung oder die Wahrscheinlichkeit, für eine Behandlung empfänglich zu sein, oder die Wahrscheinlichkeit von Metastasen. Folglich betrifft er den Krankheitsverlauf und die Krankheitsheilung sowie das Ergebnis der Behandlung einer Krankheit.
  • Der Begriff "in Kontakt bringen" wie hier verwendet bezeichnet das Mischen einer Lösung, welche die Testverbindung umfasst, mit einem Flüssigmedium, das die Zellen oder die Proteine der jeweiligen Verfahren enthält. Die Lösung, welche die Verbindung umfasst, kann ferner eine weitere Komponente umfassen, wie etwa Dimethylsulfoxid (DMSO), das die Aufnahme der Testverbindung oder der Verbindungen in die Zellen der Verfahren erleichtert. Die Lösung, welche die Testverbindung umfasst, kann zum Medium, dass die Zellen enthält, durch Verwenden einer Abgabevorrichtung zugegeben werden, wie zum Beispiel einer auf Pipetten basierenden Vorrichtung oder einer auf Spritzen basierenden Vorrichtung.
  • Mit "Hybridisierungsassay-Bedingungen" werden Hybridisierungsassay-Bedingungen bezeichnet, die zumindest so stringent sind wie die folgenden: Hybridisierung in 50% Formamid, 5X SSC, 50 mM NaH2PO4, pH 6.8, 0.5% SDS, 0.1 mg/ml ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA und 5X Denhardt-Lösung bei 42°C über Nacht; Waschen mit 2X SSC, 0.1% SDS bei 45°C; und Waschen mit 0.2X SSC, 0.1% SDS bei 45°C. Bei einigen der stringentesten Hybridisierungsassay-Bedingungen kann der zweite Waschschritt mit 0.1X SSC bei einer Temperatur bis zu 70°C durchgeführt werden (Berger et. al (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques pg 421). Andere Applikationen können jedoch die Verwendung von Bedingungen erfordern, die zwischen diese Gruppen von Bedingungen fallen. Verfahren zur Bestimmung der Bedingungen, die zum Erhalt der gewünschten Hybridisierungen erforderlich sind, sind Fachleuten bekannt und basieren auf verschiedenen Faktoren einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Sequenzen, gegen die hybridisiert wird, und die zu untersuchenden Proben.
  • Mit "Nukleinsäure-Zielregion" wird ein Fragment des PTP LAR-Gens bezeichnet, das vorzugsweise einzigartig ist, sodass eine Sonde nur an das PTP LAR-Gen hybridisiert. Mit "einzigartig" ist gemeint, dass die Sequenz in keinem anderen bekannten Protein vorhanden ist. Techniken, dies zu bewerkstelligen, sind Fachleuten bekannt. Die "Kontroll-Nukleinsäure-Zielregion" bezeichnet die identische Region der Nukleinsäure im bekannten PTP LAR-Gen (10), verglichen mit der im PTP LAR-Gen in der Probe, welche getestet wird. Unter einigen Krankheitsbedingungen wird erwartet, dass die Sequenz des PTP LAR-Gens in der Probe verschieden von der Kontrollsequenz ist. Alternativ kann die Menge des PTP LAR-Gens in der Probe größer oder niedriger sein als die in einer normalen Probe aus Zellen oder Geweben gefundene.
  • Der Begriff "detektieren" wie hier verwendet umfasst ein beliebiges Verfahren, um ein Protein, einen Antikörper oder eine Nukleinsäure zu detektieren. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt, und viele werden hier diskutiert. Insbesondere umfassen diese Methoden wie zum Beispiel ELISA, PCR, radioaktive Markierungen etc.
  • In einem dritten Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von einer oder mehr Verbindungen auf, welche die epitheliale Zellmigration modulieren, das umfasst: (a) Inkontaktbringen von Tyrosin-phosphoryliertem β-Catenin mit einer oder mehr potentiellen Verbindungen; und (b) Überwachen einer Veränderung des Phosphorylierungsgrades von Tyrosin-phosphoriliertem β-Catenin, um eine oder mehr Verbindungen zu identifizieren, welche die epitheliale Zellmigration modulieren. In bevorzugten Ausführungsformen werden die eine oder mehr Verbindungen aus der Gruppe ausgewählt, die aus Indolinonen, Quinazolinen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
  • Ein alternatives Verfahren zur Identifikation von einer oder mehr Verbindungen, welche die Aktivität von PTP LAR modulieren, umfasst: (a) Inkontaktbringen von PTP LAR mit einer oder mehr potentiellen Verbindungen; (b) Messen der Aktivität von PTP LAR; und (c) Bestimmen, ob die eine oder mehr potentiellen Verbindungen die Aktivität von PTP LAR moduliert. Die gemessene Aktivität ist die Phosphotyrosin-Phosphotase LAR-Aktivität. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Zugabe eines natürlichen Bindungspartners zu Schritt (a). Vorzugsweise wird der natürliche Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt, die aus β-Catenin und Plakoglobin besteht, und die eine oder mehr Verbindungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Indolinonen, Quinazolinen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
  • Ein weiteres alternatives Verfahren zur Identifikation von einer oder mehr Verbindungen, welche die Aktivität von PTP LAR in Zellen modulieren, umfasst: (a) Exprimieren von PTP LAR in den Zellen; (b) Inkontaktbringen der Zellen mit einer oder mehr potentiellen Verbindungen; und (c) Überwachen einer Veränderung in der Zellmigration oder der Interaktion zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner, um eine oder mehr Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von PTP LAR modulieren. Vorzugsweise wird der natürliche Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt, die aus ß-Catenin und Plakoglobin besteht, und die eine oder mehr Verbindungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Indolinonen, Quinazolinen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
  • Der Begriff "Verbindung" bezeichnet vorzugsweise ein organisches Nichtpeptid-Molekül und bezieht sich am meisten bevorzugt auf ein synthetisches organisches Nichtpeptid-Molekül. Der Begriff "Nichtpeptid-Molekül" bezeichnet eine Verbindung, die kein Polymer aus Aminosäuren ist. Ein Nichtpeptid-Molekül enthält vorzugsweise keine chemischen Anteile, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysieren, zum Beispiel ein Peptidomimeticum. Beispiele für Verbindungen sind in der Beschreibung der Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise haben derartige Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als 3.000.
  • Der Begriff "exprimieren" wie hier verwendet bezeichnet vorzugsweise die Produktion von PTP LAR von einem Nukleinsäure-Vektor in einer Zelle. Der Nukleinsäure-Vektor wird mit Hilfe im Stand der Technik bekannter Verfahren in die Zellen transfiziert, wie hier beschrieben. "In höheren Konzentrationen" kann anzeigen, dass PTP LAR normalerweise überhaupt nicht exprimiert wird oder dass die Expression normal erfolgt, aber dass das Niveau höher ist. Expressionsniveaus (und Vergleiche) können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden (und Bespiele sind hier beschrieben). Eine höhere Expression ist vorzugsweise zweifach, noch bevorzugter fünffach oder mehr. Eine geringere Expression ist das Gegenteil.
  • Der Begriff "Nukleinsäure-Vektor" betrifft ein einzel- oder doppelsträngiges zirkuläres Nukleinsäuremolekül, das in Zellen transfiziert und innerhalb oder unabhängig von einem Zellgenom repliziert werden kann. Ein zirkuläres doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül kann geschnitten, und dadurch nach Behandlung mit Restriktionsenzymen linearisiert werden. Eine Auswahl an Nukleinsäurevektoren, Restriktionsenzymen und das Wissen der Nukleotidsequenzen, die durch Restriktionsenzyme geschnitten werden, sind für Fachleute leicht zugänglich. Ein Nukleinsäuremolekül, das einen chimären Rezeptor kodiert, kann in einen Vektor inseriert werden durch Schneiden des Vektors mit Restriktionsenzymen und Ligieren der beiden Stücke.
  • Der Begriff "transfizieren" definiert eine Reihe von Verfahren, um einen Nukleinsäurevektor oder andere Nukleinsäuremoleküle in eine Zelle zu inserieren. Diese Verfahren involvieren eine Vielzahl von Techniken, wie etwa die Behandlung der Zellen mit hohen Salzkonzentrationen, einem elektrischen Feld, Detergenz oder DMSO, um die äußere Membran oder Wand der Zellen permeabel für Nukleinsäuremoleküle von Interesse zu machen, oder die Verwendung von verschiedenen viralen Tansduktionsstrategien.
  • Der Begriff "überwachen" bezeichnet die Beobachtung des Effekts des Inkontaktbringens der Zellen mit Substanzen einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine oder mehr Verbindungen und PTP LAR. Der Effekt kann im Zellphänotyp oder der Migration manifestiert werden oder in der Interaktion zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner. Vorzugsweise ist der zu überwachende Effekt der Phosphorylierungsgrad von β-Catenin oder das Niveau der freien β-Catenin Pools.
  • Der Begriff "Effekt" beschreibt vorzugsweise eine Veränderung oder ein Fehlen einer Veränderung im Zellphänotyp. "Effekt" kann ferner eine Veränderung oder ein Fehlen einer Veränderung in der katalytischen Aktivität von PTP LAR beschreiben. "Effekt" kann ferner eine Veräderung oder ein Fehlen einer Veränderung in einer Interaktion zwischen PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner beschreiben, wie zum Beispiel β-Catenin oder Plakoglobin. Vorzugsweise beschreibt "Effekt" eine Veränderung oder ein Fehlen einer Veränderung in Phosphorylierungsgrad von β-Catenin, dem Niveau der freien β-Catenin Pools oder der epithelialen Zellmigration.
  • Der Begriff "Zellphänotyp" bezeichnet die äußere Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes oder die Funktion der Zelle oder des Gewebes. Beispiele für Zellphänotypen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Zellgröße (Reduktion oder Vergrößerung), Zellgestalt, Zellproliferation (erhöhte Zellzahlen), Zelldifferenzierung (Veränderungen im physiologischen Zustand), Cytotoxizität (Zelltod), Zellüberleben, Apoptose (programmierter Zelltod) oder die Verwendung eines metabolischen Nährstoffs (z. B. Glucoseaufnahme). Am meisten bevorzugt bezeichnet Zellphänotyp die Gegenwart oder das Fehlen der epithelialen Zellmigration – die Annahme der fibroblastoiden Gestalt. Veränderungen oder das Fehlen von Veränderungen im Zellphenotyp können durch im Stand der Technik bekannte Techniken einfach gemessen werden.
  • Der Begriff "katalytische Aktivität" in Zusammenhang mit der Erfindung definiert die Rate, mit der PTP LAR ein Substrat dephosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann zum Beispiel durch Bestimmen der Menge eines Substrats, das in ein dephosphoryliertes Produkt umgesetzt wird, als Funktion der Zeit gemessen werden. Die katalytische Aktivität kann mittels Verfahren der Erfindung durch Konstanthalten der Zeit und Bestimmen der Konzentration eines dephosphorylierten Substrates nach einer festgelegten Zeitspanne bestimmt werden. Die Dephosphorylierung eines Substrats erfolgt am aktiven Zentrum von PTP LAR. Das aktive Zentrum ist normalerweise eine Spalte, in der das Substrat an PTP LAR bindet und dephosphoryliert wird. Verfahren zur Bestimmung der Dephosphorylierung von β-Catenin werden hier beschrieben. Fachleute wären in der Lage, andere geeignete Verfahren vorzusehen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen modulieren und vorzugsweise inhibieren die eine oder mehr Verbindungen die epitheliale Zellmigration in vitro. Alternativ modulieren und vorzugsweise inhibieren die eine oder mehr Verbindungen die Tyrosin-Phosphorylierung (oder Dephosphorylierung) von β-Catenin in vitro. Alternativ modulieren und vorzugsweise vermindern die eine oder mehr Verbindungen die Niveaus der freien β-Catenin Pools in vitro. Schließlich werden in anderen bevorzugten Ausführungsformen die eine oder mehr Verbindungen aus der Gruppe ausgewählt, die aus Quinazolinen, Indolinonen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
  • Die Erfindung wurde hier in breiter und allgemeiner Form beschrieben. Jede engere Spezies und subgenerische Gruppierung, die unter die allgemeine Offenbarung fällt, bildet ebenfalls einen Teil der Erfindung. Dies umfasst die allgemeine Beschreibung der Erfindung unter einem Vorbehalt oder negativer Imitierung, einen beliebigen Gegenstand aus dem Oberbegriff zu entfernen, unabhängig davon, ob das entfernte Material hier spezifisch zitiert ist oder nicht.
  • Die oben beschriebene Zusammenfassung der Erfindung ist nicht einschränkend, und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung und aus den Ansprüchen ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A und 1B zeigen die Migration epithelialer NBT II Zellen unter verschiedenen Bedingungen. 1A zeigt einen in vitro Wund-Assay. 24 Stunden nach dem Ausplattieren wurde der konfluente Zellmonolayer wie in den Beispielen beschrieben abgekratzt. EGF (100 ng/ml) oder Ultroser G (2%) wurden hinzugegeben. Der Wundverschluss wurde mittels Fotografie dokumentiert. Der Kalibrierungsbalken zeigt 80 μm an.
  • 1B zeigt die Ergebnisse von Immunfluoreszenzstudien. 24 Stunden nach dem Ausplattieren wurde EGF (100 ng/ml) zu den subkonfluenten Zellen hinzugegeben. Sechs Stunden später wurden die Zellen für die weitere Immunmarkierung fixiert, und Bilder wurden mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen. Das obere Panel zeigt unbehandelte Kontrollen während das untere Panel Zellen zeigt, die mit EGF behandelt wurden. Die grüne Fluoreszenz zeigt die Gegenwart von E-Cadherin an, während die rote Fluoreszenz β-Catenin darstellt. Die Kontrollen, die ohne primären Antikörper inkubiert wurden, zeigten kein Fluoreszenzsignal. Der Kalibrierungsbalken zeigt 20 μm an.
  • 2 zeigt die Tyrosin-Phosphorylierung von ß-Catenin und Plakoglobin während der epithelialen Zellmigration. NBT II Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert. 24 Stunden später wurden Wachstumsfaktoren zugegeben, um die Migration zu induzieren. (EGF: 100 ng/ml; aFGF: 30 ng/ml einschließlich 50 μg/ml Heparin; Ultroser G: 2%). Neunzig Minuten vor der Lyse wurde Natrium-Orthovanadat (1 mM) hinzugegeben (rechts) oder nicht (links). Als Positivkontrolle wurden die Zellen 10 Minuten mit Pervanadat behandelt. Nach der Lyse wurde der Cadherin/Catenin-Komplex immunpräzipitiert, und die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE separiert. Tyrosin-Phosphorylierungsniveaus wurden mittels Western-Blotting mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (oben) analysiert. Die Membranen wurden mit spezifischen Antikörpern gegen E-Cadherin (Mitte) oder die Catenine (unten) erneut untersucht, um gleiche Mengen an präzipitierten Proteinen sicherzustellen. Hochgradig Tyrosin-phosphoryliertes β-Catenin (sowie nach Pervanadat-Behandlung) wurde im erneuten Blot (Reblot) nicht effizient immunmarkiert. Pfeile zeigen die Proteine von Interesse an. Molekulare Größenstandards in Kilodalton sind links gezeigt.
  • 3 zeigt, dass während der epithelialen Zellmigration der freie unkomplexierte Pool an β-Catenin erhöht ist und mit der erhöhten Tyrosin-Phosphorylierung korreliert. NBT II Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/m2 ausplattiert. 24 Stunden später wurde EGF (100 ng/ml) für die angegebenen Zeitintervalle zugegeben. Dreißig Minuten vor der Lyse wurde Natrium-Orthovanadat (1 mM) zugegeben. Anschließend wurden Affinitätspräzipitationen mit 5μg GST/E-Cadherin cytoplasmatischem Protein oder GST in einem dreifachen molaren Überschuss durchgeführt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, und die Niveaus an freiem unkomplexiertem β-Catenin wurden mittels Western-Blotting mit einem anti-β-Catenin-Antikörper (oben) analysiert. Western-Blotting mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper zeigt den Anstieg im Niveau der Tyrosin-Phosphorylierung in freiem unkomplexiertem β-Catenin (unten). Es ist zu beachten, dass im Vergleich zu 2 die Zellen nur 30 Minuten mit Natrium-Orthovanadat vorbehandelt wurden. Pfeile zeigen die Proteine von Interesse an. Molekulare Größenstandards in Kilodalton sind links gezeigt.
  • 4 zeigt, dass die Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes mit PTP LAR in NBT II Zellen colokalisieren. 24 Stunden nach dem Ausplattieren wurden die konfluenten Monolayer aus NBT II Zellen fixiert und für die indirekte Immunfluoreszenz weiterbehandelt. Die Zellen wurden mit Antikörpern entweder gegen β-Catenin, Plakoglobin oder E-Cadherin (grüne Fluoreszenz, oberes Panel) und gleichzeitig mit einem Antikörper gegen PTP LAR (rote Fluoreszenz, mittleres Panel) markiert, wie angegeben. Konfokale Laserfluoreszenzbilder zeigen die Colokalisation (gelbe Überlagerung, unteres Panel) von PTP LAR mit dem Cadherin/Catenin-Komplex an Adherens Junctions. Kontrollen ohne primären Antikörper zeigten kein Fluoreszenz-Signal. Der Kalibrierungsbalken zeigt 20 μm an.
  • Die 5A, 5B und 5C zeigen, dass die Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes mit PTP LAR assoziieren. Die 5A und 5B zeigen die Assoziation des Cadherin/Catenin-Komplexes mit PTP LAR in intakten Zellen. Humane epitheliale MCF7 Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert und 24 Stunden später wie angegeben mit EGF (100 ng/ml) stimuliert. Die Zellen wurden lysiert und mit Antikörpern gegen PTP LAR (monoklonaler Antikörper 11.1A, Kaninchen polyklonales Antiserum #320) oder Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes immunpräzipitiert wie angegeben. NIS bezeichnet die Nicht-Immun-Serumkontrolle. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western-Blotting mit Antikörpern gegen E-Cadherin (5A, oben), β-Catenin (5A, Mitte), Plakoglobin (5B, oben) oder PTP LAR (5A und 5B, unten; 5A, lange Expositionen sind ganz unten gezeigt) analysiert. Pfeile zeigen die Proteine von Interesse an. Molekulare Größenstandards in Kilodalton sind links angegeben.
  • 5C zeigt die in vitro Assoziation von β-Catenin und Plakoglobin mit PTP LAR. β-Catenin und Plakoglobin wurden transient in humanen embryonalen Nieren 293 Fibroblasten überexprimiert. Nach 24 Stunden Serummangel ("serum starvation") wurden die Zellen vor der Lyse 10 Minuten mit Pervanadat stimuliert. Gleiche Mengen der Lysate wurden mit dem GST-PTP LAR cytoplasmatischen Fusionsproteinen (GST-PTP LARi) oder einem dreifachen molaren Überschuss von GST inkubiert. Lysate der mit einem Kontrollvektor transfizierten 293 Zellen wurden mit dem GST-PTP LAR cytoplasmatischen Fusionsprotein (GST-PTP LARi) inkubiert. Die Komplexe wurden an Glutathion-Sepharose immobilisiert, und die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die gebundenen Proteine wurden mittels Western-Blotting mit einem anti-β-Catenin-Antikörper (links) oder einem Antikörper gegen Plakoglobin (rechts) analysiert. Pfeile bezeichnen die Proteine von Interesse. Molekulare Größenstandards in Kilodalton sind links angegeben.
  • 6 zeigt, dass β-Catenin in vitro ein Substrat von PTP LAR ist. β-Catenin wurde transient in humanen embryonalen Nieren 293 Fibroblasten überexprimiert. Nach 24 Stunden Serummangel wurden die Zellen vor der Lyse mit Pervanadat stimuliert. β-Catenin wurde anschließend mit einem anti-β-Catenin-Antikörper immunpräzipitiert, und die Präzipitate wurden für die angegebenen Zeitintervalle mit dem GST-PTP LAR cytoplasmatischen Fusionprotein (links), der Mutante GST-PTP LAR PTP D1 C1522S (Mitte) oder der Mutante GST-PTP LAR PTP D2 C1813S (rechts) inkubiert. Die Reaktionen wurden nach den angegebenen Zeitperioden gestoppt, und die Proteine wurden mittels SDS-PAGE separiert. Die Tyrosin-Phosphorylierungsniveaus von β-Catenin wurden mittels Western-Blotting mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (oben) analysiert. Western-Blotting mit einem anti-β-Catenin-Antikörper zeigte, dass gleiche Mengen an β-Catenin immunpräzipitiert wurden (unten). Pfeile bezeichnen die Proteine von Interesse.
  • Die 7A, 7B und 7C zeigen, dass die ectopische Überexpression von humaner PTP LAR die epitheliale Zellmigration und die Tumorbildung von Ratten NBT II Zellen in Nacktmäusen infibiert. Die 7A und 7B zeigen einen Streuungsassay von NBT II pLXSN und NBT II hPTP LAR Zellen. In 7A wurden NBT II Zellen, die mit dem leeren Vektor pLXSN (links) oder humaner PTP LAR (rechts) infiziert wurden, in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert und 24 Stunden später wie angegeben mit EGF (100 ng/ml) stimuliert. Nach 7 Stunden wurde die Migrationsmorphologie mittels Fotografie dokumentiert.
  • 7B zeigt eine Quantifizierung des Steuerungsassays (+/- Standardabweichung). Zu diesem Zweck wurden 100 Zellen pro Schale aus zufällig ausgewählten Mikroskopierfeldern ausgezählt; die Assays wurden dreifach durchgeführt. Eine Zelle wurde als eine migrierende Zelle beurteilt, wenn sie sich von einer kopfsteinpflaster-ähnlichen epithelialen Morphologie in einen migrierenden bibroplastoiden Phenotyp verändert hat.
  • 7C zeigt die Tumorbildung in Nacktmäusen durch NBT II pLXSN und NBT II hPTP LAR Zellen. NBT II Zellen, die mit dem leeren Vektor pLXSN (gefüllte Dreiecke) oder humanen PTP LAR (gefüllte Quadrate) infiziert waren, wurden subkutan in die Seitenregion ("flank region") von Swiss Nacktmäusen injiziert (2 × 106/50 μl). Die Tumorbildung wurde überwacht. Die Graphen zeigen das durchschnittliche Tumorvolumen von 3 Tumoren pro polyklonaler bzw. klonaler Zelllinie.
  • 8 zeigt, dass die ectopische Expression von humaner PTP LAR in NBT II Zellen die Phosphorylierung von Tyrosin-Resten in β-Catenin sowie den Anstieg des freien Pools von β-Catenin hemmt. NBT II Zellen, die mit dem leeren Vektor pLXSN (links) oder humaner PTP LAR (rechts) infiziert waren, wurden in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert und 24 Stunden später mit EGF (100 ng/ml) für die angegebenen Zeitintervalle stimuliert. Eine Vorbehandlung mit Natrium-Orthovanadat wurde weggelassen, um eine irreversible Hemmung der Protein-Tyrosin-Phosphataseaktivität zu vermeiden. Die Zellen wurden lysiert, und in vitro Assoziationen wurden mit 5 μg GST-E-Cadherin cytoplasmatischem Protein oder GST in einem dreifachen molaren Überschuss durchgeführt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE separiert, und die Niveaus an freiem unkomplexiertem β-Catenin wurden mittels Western-Blotting mit einem anti-β-Catenin-Antikörper (oben) analysiert. Western-Blotting mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper zeigt die erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung in freiem unkomplexiertem β-Catenin nur in der kontroll-infizierten NBT II Zelllinie (unten). Pfeile bezeichnen die Proteine von Interesse. Molekulare Größenstandards in Kilodalton sind links angegeben.
  • 9 zeigt die Aminosäuresequenz des PTP LAR Präproteins aus der EMBL Datenbank.
  • Die 10A, 10B und 10C zeigen die Nukleinsäuresequenz von PTP LAR aus der EMBL Datenbank.
  • Die 11A, 11B, 11C, 11D und 11E zeigen das Ergebnis einer Recherche in Pfam HMM mit der PTP LAR Aminosäuresequenz. Die Internetseite lautet: http://pfam.wustl.edu/cgi-bin/nph-hmmsearch. Die Phosphatase/Domänen waren "grün", was einen signifikanten E-Wert anzeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die durch den Cadherin/Catenin-Komplex vermittelte Zell/Zell-Adhäsion sowie die adhäsions-unabhängigen Funktionen von Cateninen wurden mit der Modulation multizellulärer Differenzierung, Proliferation und maligner Transformation epithelialer Zellen in Verbindung gebracht (Marrs et. al (1996) Int. Rev. Cyptol. 165, 159–205; Birchmeier et. al (1995) Ciba F. Symp. 189, 124–141; Huber et. al (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8, 685–691). Die Zellmigration ist ein essentieller Prozess während der Embryonalentwicklung und in der epithelialen Regeneration adulter Organismen, zum Beispiel in der Wundheilung, und erfordert eine präzise Kontrolle, die verändert wird oder verloren geht, wenn Tumorzellen invasiv und metastatisch werden. Als Teil der Erfindung wurden distinkte Mechanismen, welche die epitheliale Zellmigration regulieren, auf zellulärem und biochemischem Niveau definiert. Weiterhin wurde der Einfluss der Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin und deren Regulierung durch Tyrosin-Kinasen und die Protein-Tyrosin-Phosphatase LAR in motilen Zellen charakterisiert.
  • Es wurde gezeigt, dass Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise EGF, aFGF, oder der Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor, die Migration epithelialer Zellen induzieren (Manske et. al (1994) Int. Rev. Cytol. 155, 49–96). Eine Korrelation zwischen der Migration und der Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin wurde vorgeschlagen (Behrens et. al (1993) J. Cell Biol. 120, 757–766; Shibamoto et. al (1994) Cell Adhes. Commun. 1, 295-3), aber ihre Signifikanz blieb unklar. Eine Hemmung der Tyrosin-Kinase-Signalübertragung inhibiert die epitheliale Zellmigration von NBT II Zellen. RTKs wie der EGF-Rezeptor (Hoschuetzky et. al (1994) J. Cell Biol. 127, 1375–1380) oder cytoplasmatische Tyrosin-Kinasen wie Src sind in der Lage, die Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin zu vermitteln (Hamaguchi et al. (1993) EMBO J. 12, 307–314). In NBT II Zellen war eine dominant-negative c-Src Mutante in der Lage, die Migration zu hemmen (Rodier et. al (1995) J. Cell. Biol. 131, 761–773).
  • Die Erfindung bezieht sich unter anderem auf den Befund, dass nach Induktion der Migration der Pool an freiem unkomplexiertem β-Catenin erhöht ist, und dass dieser Anstieg mit einer gesteigerten β-Catenin Tyrosin-Phosphorylierung korreliert. Daher kann die Tyrosin-Phosphorylierung eine verminderte Interaktion von β-Catenin sowohl mit E-Cadherin als auch dem Aktin-Cytoskelet zur Folge haben. Da die Integrität des Cadherin/Catenin-Komplexes für eine starke Zell/Zell-Adhäsion essentiell ist, resultiert dies insgesamt in einer Verminderung der zellulären Kontakte. Interessanterweise wurde berichtet, dass ein Fusionsprotein aus E-Cadherin und α-Catenin die Interaktion von E-Cadherin mit dem Cytoskelett unabhängig von β-Catenin vermittelt. Diese Zellen waren jedoch nicht länger zur Migration in der Lage (Nagafuchi et. al (1994) J. Cell Biol. 127, 235–245). Daher kann die Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin zu einer Zerstörung des Kontakts zwischen E-Cadherin und dem Cytoskelett führen sowie zu einem erhöhten Pool an freiem β-Catenin. Dies legt eine Funktion für ß-Catenin unabhängig von der Cadherin-vermittelten Zelladhäsion nahe.
  • Es wurde gezeigt, dass neben ihrer Rolle an den Adherens Junctions eine Signalfunktion von β-Catenin oder seinem Drosophila Homolog Armadillo essentiell für die normale Embryonalentwicklung in Drosophila und Xenopus ist. Eine Interferenz mit der Signalfunktion von freiem unkomplexiertem β-Catenin hob eine normale Vertebraten-Entwicklung auf (Miller et. al (1996) Genes Dev. 10, 2527–2539). Nachfolgende Studien in Drosophila und Xenopus führten zur Entdeckung einer Signalkaskade, die den cytoplasmatischen Pool von β-Catenin reguliert.
  • Ohne ein Signal ist β-Catenin hauptsächlich an den Adherens Junctions lokalisiert, und jedwedes freie β-Catenin ist in einer ubiquitin-abhängigen Art und Weise nach unten reguliert (Aberle et. al (1997) EMBO J. 16, 3797–3804). Ein extrazelluläres Signal, wie etwa Wnt oder Wingless (Peifer et. al (1994) Development 120, 369–380; van Leeuwen et. al (1994) Nature 368, 342–344) führt über den Rezeptor Frizzled (Bhanot et. al (1996) Nature 382, 225–230) zu einer Hemmung der GSK3/Zeste White 3-Aktivität, und somit zu einer Stabilisierung von β-Catenin/Armadillo in seiner freien Form (Yost et. al (1996) Genes Dev. 10, 1443–1454; Papkoff et. al (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 2128–2134) durch Inhibierung der APC- und ubiquitin-abhängigen Degradation (Munemitsu et. al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 3046–3050; Aberle et. al (1997) EMBO J. 16, 3797–3804).
  • In der Erfindung hatte eine EGF-Behandlung einen erhöhten Pool an freiem β-Catenin im Cytoplasma und im Nukleus in migrierenden Zellen zur Folge, was einen weiteren Weg der Regulation des freien Pools an β-Catenin während der epithelialen Zellmigration neben der Wnt/Wingless-Signalkaskade nahe legt. Ferner kann die Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin freies β-Catenin stabilisieren, da die Tyrosin-phosphorylierte Form des homologen Plakoglobins nicht länger mit APC assoziiert ist (Shibata et. al (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 203, 519–522), und dadurch möglicherweise die APC-vermittelte Degradation verhindert. Zusätzlich wies der freie Pool an β-Catenin einen erhöhten Phosphotyrosin-Gehalt während der EGF-abhängigen epithelialen Zellmigration auf. Weiterhin hemmt EGF ebenso die GSK3-Aktivität (Eldar-Finkelman et. al (1995) J. Biol. Chem. 270, 987–990). Es wurde gezeigt, dass die Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin mit der Karzinomentstehung und Tumorinvasion korreliert (Sommers et. al (1994) Cancer Res. 54, 3544–3552). Nur freies ß-Catenin oder Plakoglobin ist zur Assoziation mit Vertretern der High-Mobility-Group- (HMG; Grosschedl et. al (1994) Trends Genet. 10, 94–100)-Familie von Transkriptionsfaktoren in der Lage, namentlich mit LEF1 und TCF3, TCF4 (Behrens et. al (1996) Nature 382, 638–642; Huber et. al (1996) Mech. Develop. 59, 3–10; Molenaar et. al (1996) Cell 86, 391–399; Korinek et. al (1997) Science 275, 1784–1787; Morin, et. al (1997) Science 275, 1787–1790). Jedoch unterscheiden sich β-Catenin und Plakoglobin in ihrer nuklearen Translokation und der Komplexbildung mit LEF1. Die LEF-abhängige Transaktivierung wird vorzugsweise durch β-Catenin angetrieben (Simcha et. al (1998) J. Cell Biol. 141, 1433–1448). Die Transkriptionsfaktoren LEF1 und TCF sind in der Lage, das dorsale Mesoderm zu induzieren, wenn sie zusammen mit β-Catenin in Xenopus-Embryos exprimiert werden (Huber et. al (1996) Mech. Develop. 59, 3–10; Behrens et. al (1996) Nature 382, 638–642; Molenaar et. al (1996) Cell 86, 391–399). Ergebnisse aus LEF1-defizienten und LEF1-transgenen Mäusen zeigen eine wichtige Rolle für diesen Transkriptionsfaktor während der EMT, da er normalerweise während der EMT und der induktiven Prozesse zwischen Mesenchym und Epithel nach oben reguliert ist (van Genderen et. al (1994) Genes Dev. 8, 2691–2703; Zhou et. al (1995) Genes Dev. 9, 570–583; Kratochwil et. al (1996) Genes Dev. 10, 1382–1394). Dies legt nahe, dass ein gemeinsames regulatorisches System existiert, das die Expression von Genen für die mesenchymalen und epithelialen Phänotypen während der Embryonalentwicklung sowie in der epithelialen Zellmigration koordiniert. Während der EMT oder der Zellmigration würde dieser gemeinsame Regulator die Expression epithelialer Gene abschalten, während er die Gene für den mesenchymalen Phänotyp anschaltet. Der β-Catenin/LEF1-Komplex kann diesen gemeinsamen Regulator darstellen, und Moleküle, welche den freien Pool von β-Catenin kontrollieren, können für die normale Entwicklung oder die Wundheilung essentiell sein.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass PTPs eine wichtige Rolle in der Regulation von Zell/Zell-Kontakten spielen, da die Behandlung mit Natrium-Orthovanadat, einem potenten Inhibitor der Phosphatase-Aktivität die normale Zellkontakt-Inhibition in epithelialen Zellen vermindert und zu einer erhöhten Tyrosin-Phosphorylierung an Adherens Junctions führt (Volberg et. al (1992) EMBO J. 11, 1733–1742). PTPs können daher als Steady-State Gleichgewichtsantagonisten von TKs für regulatorische Ereignisse an den Adherens Junctions fungieren. Konsistent mit diesen Befunden zeigen wir, dass die Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin in migrierenden epithelialen Zellen nach Vorbehandlung mit Natrium-Orthovanadat signifikant erhöht war.
  • Kürzlich wurde gezeigt, dass PTP LAR an fokalen Adhäsionen mit LIP-1 (LAR Interacting Protein-1) und dem multidomänen Protein Trio interagiert und colokalisiert. Keines dieser Proteine scheint jedoch ein Substrat für PTP LAR zu sein (Serra-Pages et. al (1995) EMBO J. 14, 2827–2838; Debant et. al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5466–547). Außerdem wurde berichtet, dass eine PTP LAR-ähnliche PTP mit dem Cadherin/Catenin-Komplex an Adherens Junctions von neurosekretorischen PC12 Zellen interagiert (Kypta et. al (1996) J. Cell Biol. 134, 1519–1529).
  • Wir zeigen hier die Colokalisation und Interaktion von PTP LAR mit dem Cadherin/Catenin-Komplex in epithelialen Zellen. Weiterhin zeigen wir, dass nur β-Catenin und Plakoglobin imstande sind, direkt mit PTP LAR zu assoziieren, und wir weisen nach, dass β-Catenin ein Substrat von PTP LAR ist. PTP LAR ist von besonderem Interesse, da es an Adherens Junctions und an fokalen Adhäsionen lokalisiert ist (dieser Bericht und Krypta et. al (1996) J. Cell Biol. 134, 1519–1529; Serra-Pages et. al (1995) EMBO J. 14, 2827–2838; Debant et. al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5466–5471), und folglich PTP LAR einen essentiellen Regulator der Disassemblierung und Reassemblierung von Zell/Zell- sowie Zell/EGM-Adhäsionen während der epithelialen Zellmigration darstellen könnte.
  • Wir zeigen, dass eine moderate ectopische Überexpression von PTP LAR die epitheliale Zellmigration signifikant hemmt. Eine ähnliche Situation wird in Drosophila gefunden, wo PTP LAR im Gegensatz zu Vertebraten beinahe ausschließlich in sich entwickelnden Neuronen exprimiert ist. In Fliegen, denen PTP LAR fehlt, umgehen die Motoraxone ihre normale Zielregion und dehnen sich stattdessen weiter aus, ohne zu stoppen (Krueger et. al (1996) Cell 84, 611–622). Es wurde gezeigt, dass PTP LAR, PTPμ, PTPk sowie PTP DEP-1 mit zunehmender Zellkonfluenz in erhöhten Proteinniveaus exprimiert werden (Fuchs et. al (1996) J. Biol. Chem. 271, 16712–17719; Longo et. al (1993) J.
  • Biol. Chem. 268, 26503–26511; Gebbink et. al (1995) J. Cell Biol. 131, 251–260; Östman et. al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9680–9684), und dabei zu der beobachteten erhöhten Phosphatase-Altivität in konfluenten Zellen beitragen (Mansbridge et. al (1992) J. Cell Physiol. 151, 433–442).
  • Der Anstieg in der Phosphatase-Aktivität in konfluenten Zellen legt eine Rolle für PTPs in der Regulation und Stabilisierung von Zell/Zell-Kontakten und der epithelialen Zellintegrität nahe. Im Gegensatz dazu sind die Zellen während der Wundheilung am Rand der Wunde in einem subkonfluenten Zustand, in dem die PTP-Aktivität reduziert ist. Dies könnte die Tyrosin-Kinase-Signalübertragung über Stimulation durch Wachstumsfaktoren, wie z. B. EGF, TGFa, KGF, begünstigen, was einen Anstieg in der Zellmigration und Proliferation zur Folge hat und folglich eine beschleunigte Wundheilung, da diese Wachstumsfaktoren während einer Wundsituation erhöht sind (Buckley et. al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; Rappolee et. al (1988) Science 241, 708–712; Werner et. al (1992) Proc. Natl. Sci. USA 89, 6896–6900).
  • Die Wichtigkeit von freiem und Tyrosin-phosphoryliertem ß-Catenin während der epithelialen Zellmigration wird durch unsere Beobachtungen unterstrichen, dass eine Interferenz mit diesem Parameter durch Überexprimieren von hPTP LAR die epitheliale Zellmotilität hemmt. Weiterhin hemmte die Expression von hPTP LAR in NBT II Zellen die Tumorbildung in Nacktmäusen, obwohl die Wachstumscharakteristika in vitro nicht verändert waren. Die ectopische Expression von hTPT LAR auf etwa das Zweifache des endogenen Niveaus war ausreichend, die beobachteten biologischen Effekte zu erzielen. Eine derartige moderate ectopische Expression von hPTP LAR scheint kritisch zu sein, da eine hohe Überexpression vollständig veränderte Wachstumscharakteristika und Apoptose der Zellen zur Folge hat (Weng et. al (1998) Curr. Biol. 8, 247–256). Die in diesem Bericht präsentierten Ergebnisse unterstützen stark eine wichtige Rolle für PTP LAR in der Regulation der Zell/Zell-Adhäsion und der epithelialen Zellmigration sowie der Tumorentstehung durch Kontrolle der freien Moleküls des Signalmoleküls β-Catenin.
  • Da Mutationen oder Deletionen sowohl in APC als auch β-Catenin, welche zu einem stabilisierten Pool an freiem β-Catenin führen, mit Tumorbildung korreliert wurden (Korinek et. al (1997) Science 275, 1784–178; Morin et. al (1997) Science 275, 1787–1790; Rubinfeld et. al (1997) Science 275, 1790–1792), kann der Verlust der PTP LAR Funktion ebenfalls zur Tumorentstehung und Metastasenbildung beitragen. Als potentielles Tumorsuppressor-Genprodukt könnte PTP LAR daher als prognostischer Marker für humanen Krebs dienen.
  • I. Die Nukleinsäuresequenz von PTP LAR
  • Eingeschlossen in die Verwendungsverfahren dieser Erfindung sind die funktionellen Äquivalente der hier beschriebenen isolierten Nukleinsäuremoleküle. Die Degeneriertheit des genetischen Codes erlaubt die Substitution bestimmter Codons durch andere Codons, welche dieselbe Aminosäure spezifizieren und daher dasselbe Protein ergeben würden. Die Nukleinsäuresequenz kann substantiell variieren, da mit Ausnahme von Methionin und Tryptophan die bekannten Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert werden können. Folglich könnten Teile oder das gesamte PTP LAR Gen synthetisiert werden, um eine Nukleinsäuresequenz zu ergeben, die sich von der in 10 gezeigten signifikant unterscheidet. Die kodierte Aminosäuresequenz davon würde jedoch bewahrt bleiben.
  • Zusätzlich kann die Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz umfassen, die aus der Addition, Deletion oder Substitution von zumindest einem Nukleotid am 5'-Ende und/oder 3'-Ende der in 10 gezeigten Nukleinsäure oder einem Derivat davon resultiert. Jedes Nukleotid oder Polynukleotid kann in dieser Hinsicht verwendet werden, vorausgesetzt dass seine Addition, Deletion oder Substitution die Aminosäuresequenz von PTP LAR, die von der Nukleotidsequenz kodiert wird, nicht verändert. Zum Beispiel sollen die Verfahren der Erfindung für ihre Verwendung jede Nukleinsäuresequenz einschließen, die aus der Addition von ATG als Initiationscodon am 5'-Ende der PTP LAR Nukleinsäuresequenz oder ihres Derivates oder aus der Addition von TTA, TAG oder TGA als Terminationscodon am 3'-Ende der PTP LAR Nukleotidsequenz oder ihres Derivats resultieren. Außerdem kann PTP LAR, sofern notwendig, Restrectionsendonuklease-Schnittstellen aufweisen, die an ihrem 5'-Ende und/oder 3'-Ende hinzugefügt wurden.
  • Derartige funktionelle Veränderungen einer gegebenen Nukleinsäuresequenz bieten die Möglichkeit, die Sekretion und/oder Prozessierung heterologer Proteine zu fördern, welche durch fremde Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die daran fusioniert sind. Alle Variationen der Nukleotidsequenz von PTP LAR und Fragmenten davon, die durch den genetischen Code ermöglicht werden, sind daher in dieser Erfindung eingeschlossen.
  • Weiterhin ist es möglich, Codons zu deletieren oder ein oder mehr Codons mit anderen Codons als degenerierten Codon zu substituieren, um ein strukturell modifiziertes Polypeptid zu erzeugen, das aber im wesentlichen die selbe Verwendbarkeit oder Aktivität wie das Polypeptid aufweist, das vom unmodifizierten Nukleinsäuremolekül erzeugt wurde. Wie im Stand der Technik anerkannt, sind die zwei Polypeptide funktionell äquivalent, wie es auch die zwei Nukleinsäuremoleküle sind, die zu deren Produktion führen, obwohl die Unterschiede zwischen den Nukleinsäuremolekülen nicht die Degeneriertheit des genetischen Codes betreffen. Diese Nukleinsäuren sollen ebenfalls in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden.
  • II. Nukleinsäure-Sonden, Verfahren und Kits zur Detektion von PTP LAR
  • Ein Fachmann kann einfach, basierend auf der hier offenbarten Sequenz unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren des Computer-Alignments und der Sequenzanalyse Sonden konzipieren (cf. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch, & Maniatis, eds., 1989). Die in den Verfahren der Erfindung verwendeten Hybridisierungssonden können durch Standard-Markierungstechniken markiert werden, wie etwa mit einer radioaktiven Markierung, Enzym-Markierung, Fluoreszenz-Markierung, Biotin/Avidin-Markierung, Chemilumineszenz und dergleichen. Nach der Hybridisierung können die Sonden unter Verwendung bekannter Verfahren visualisiert werden.
  • Die Nukleinsäure-Sonden, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, schließen RNA- sowie DNA-Sonden ein, wobei solche Sonden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden. Die Nukleinsäure-Sonde kann auf einem festen Träger immobilisiert werden. Beispiele für solche feste Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Kunststoffe, wie zum Beispiel Polycarbonat, komplexe Kohlehydrate, wie zum Beispiel Agarose und Sepharose, und Acrylharze, wie zum Beispiel Polyacrylamid und Latex-Kügelchen. Techniken für die Kopplung der Nukleinsäure-Proben an solche festen Träger sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die Untersuchungsproben, die für Verfahren mit Nukleinsäure-Sonden entsprechend der Erfindung geeignet sind, umfassen beispielsweise Zellen oder Nukleinsäureextrakte aus Zellen oder biologische Flüssigkeiten. Die in den oben beschriebenen Verfahren verwendeten Proben variieren basierend auf dem Assay-Format, der Detektionsmethode und der Art der Gewebe, Zellen oder Extrakte, die zu untersuchen sind. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäureextrakten aus Zellen sind im Stand der Technik bekannt und können einfach angepasst werden, um eine Probe zu erhalten, die mit der verwendeten Methode kompatibel ist.
  • Ein Verfahren zu Detektion der Präsenz von PTP LAR in einer Probe umfasst (a) Inkontaktbringen der Probe mit der oben beschriebenen Nukleinsäure-Sonde unter derartigen Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, und (b) Detektieren der Gegenwart der Sonde, die an das Nukleinsäuremolekül gebunden hat. Ein Fachmann würde die Nukleinsäure-Sonde entsprechend der im Stand der Technik bekannten Verfahren selektieren, wie oben beschrieben. Zu untersuchende Proben umfassen, sollten aber nicht beschränkt sein auf RNA-Proben aus humanem Gewebe.
  • Ein Kit zur Detektion der Präsenz von PTP LAR in einer Probe umfasst zumindest ein Behältnis, das darin die oben beschriebene Nukleinsäure-Sonde aufweist. Der Kit kann ferner weitere Behältnisse umfassen, die ein oder mehr des Folgenden aufweisen: Waschreagenzien und Reagenzien, die zur Detektion der Präsenz der gebundenen Nukleinsäure-Sonde imstande sind. Beispiele für Detektionsreagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf radioaktiv markierte Sonden, enzymatisch markierte Sonden (Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase) und affinitätsmarkierte Sonden (Biotin, Avidin oder Steptavidin).
  • Im Detail umfasst ein in Einzelteile zerlegter Kit einen beliebigen Kit, in dem die Reagenzien in separaten Behältnissen enthalten sind. Derartige Behältnisse umfassen kleine Glasbehältnisse, Kunststoffbehältnisse oder Streifen aus Kunststoff oder Papier. Solche Behältnisse erlauben den effizienten Transfer von Reagenzien von einem Kompartiment zu einem anderen Kompartiment, sodass die Proben und Reagenzien nicht kreuzkontaminiert werden, und die Agenzien oder Lösungen eines jeden Behältnisses in quantitativer Art und Weise aus einem Kompartiment in ein anderes hinzugegeben werden können. Derartige Behältnisse schließen ein Behältnis ein, das die Untersuchungsprobe aufnimmt, ein Behältnis, das die Sonde oder die im Essay verwendeten Primer enthält, Behältnisse, die Waschreagenzien (wie zum Beispiel Phosphat-gepufferte Saline, Tris-Puffer und dergleichen) enthalten, und Behältnisse, welche die Reagenzien enthalten, die zur Detektion der hybridisierten Sonde, des gebundenen Antikörpers, des amplifizierten Produkts oder dergleichen verwendet werden. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass Nukleinsäure-Sonden, die in der Erfindung beschrieben sind, einfach in eines der etablierten Kit-Formate aufgenommen werden können, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • III. DNA-Konstrukte, welche ein PTP LAR Nukleinsäuremolekül umfassen, und Zellen, welche diese Konstrukte enthalten
  • Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das 5' nach 3' umfasst: einen Promotor, der wirksam ist, um die Transkription in einer Wirtszelle zu initiieren, und die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle. Außerdem betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Vektor und ein oben beschriebenes Nukleinsäuremolekül umfasst. Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, das eine transkriptionelle Region aufweist, die in einer Zelle funktionell ist, eine Sequenz komplementär zu einer RNA-Sequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, welche dem oben beschriebenen Polypeptid entspricht, und eine transkriptionelle Terminationsregion, die in der Zelle funktionell ist. Die oben beschrieben Moleküle können isolierte und/oder gereinigte DNA-Moleküle sein.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Zelle oder einen Organismus, welcher die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle enthält, und dabei in der Lage ist, ein Polypeptid zu exprimieren. Ein Polypeptid kann aus Zellen gereinigt werden, die verändert wurden, um das Polypeptid zu exprimieren. Eine Zelle wird als "verändert, um ein gewünschtes Polypeptid zu expremieren" bezeichnet, wenn die Zelle durch genetischen Manipulation modifiziert wird, um ein Protein zu erzeugen, welches sie normalerweise nicht erzeugt, oder welches die Zelle normalerweise in geringerer Konzentration erzeugt. Ein Fachmann kann die Verfahren zum Einbringen und Exprimieren von entweder genomischen, cDNA oder synthetischen Sequenzen in entweder eukaryontische oder prokaryontische Zellen einfach adaptieren.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel DNA, wird als "imstande, ein Polypeptid zu exprimieren" bezeichnet, falls es Nukleotidsequenzen enthält, welche transkriptionelle und translationelle regulatorische Information enthalten, und solche Sequenzen "operativ verknüpft" mit Nukleotidsequenzen sind, die das Polypeptid kodieren. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, in der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, in derartiger Weise verbunden sind, dass die Expression der Gensequenz erlaubt wird. Die genaue Struktur der regulatorischen Regionen, die zur Expression der Gensequenz benötigt werden, kann von Organismus zu Organismus variieren, aber sollte im allgemeinen eine Promotorregion umfassen, die in Prokaryonten sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription steuert) sowie die DNA-Sequenzen enthält, die, wenn in RNA transkribiert, die Initiation der Peptidsynthese signalisieren. Derartige Regionen umfassen normalerweise diejenigen 5'-nichtkodierenden Sequenzen, die an der Initiation der Transkription und Translation beteiligt sind, wie etwa die TATA-Box, die Capping-Sequenz, die CAAT-Sequenz und dergleichen.
  • Zwei DNA-Sequenzen (wie z. B. die Sequenz einer Promotorregion und eine Sequenz, die PTP LAR kodiert) werden als operativ verknüpft bezeichnet, wenn die Art der Verknüpfung zwischen den zwei DNA-Sequenzen (1) nicht in der Einführung einer Frame-Shift Mutation resultiert, (2) nicht mit der Fähigkeit der Sequenz der Promotorregion interferiert, die Transkription einer Gensequenz zu steuern, welche eine Phosphatase der Erfindung kodiert, oder (3) nicht mit der Fähigkeit der Gensequenz von PTP LAR interferiert, durch die Sequenz der Promotorregion transkribiert zu werden. Folglich würde eine Promotorregion operativ verknüpft mit einer DNA-Sequenz sein, falls der Promotor in der Lage wäre, die Transkription dieser DNA-Sequenz zu bewirken. Folglich sind, um ein Gen zu exprimieren, welches die PTP LAR kodiert, transkriptionelle und translationelle Signale erforderlich, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
  • Die Erfindung umfasst die Expression von PTP LAR (oder einem funktionellen Derivat davon) sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen. Prokaryontische Wirte sind im allgemeinen sehr effizient und für die Herstellung rekombinanter Proteine geeignet, und sind daher ein bevorzugtes Expressionssystem für PTP LAR. Prokaryonten werden häufig durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert. Jedoch können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden, einschließlich anderer bakterieller Stämme.
  • In prokaryontischen Systemen können Plasmidvektoren verwendet werden, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, welche von einer Spezies stammen, die mit dem Wirt kompatibel ist. Beispiele für geeignete Plasmidvektoren können umfassen pBR322, pUC118, pUC119 und dergleichen; geeignete Phagen oder Bakteriophagen-Vektoren können umfassen γgt10, γgt11 und dergleichen; und geeignete virale Vektoren können umfassen pMAM-neo, pKRC und dergleichen. Vorzugsweise hat der selektierte Vektor der Erfindung die Kapazität, in der selektierten Wirtszelle zu replizieren.
  • Anerkannte prokaryontische Wirte umfassen Bakterien, wie etwa E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia und ähnliche. Unter derartigen Bedingungen wird das Polypeptid jedoch nicht glycosyliert. Der prokaryontische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
  • Um PTP LAR (oder ein funktionelles Derivat davon) in einer prokaryontischen Zelle zu exprimieren, ist es notwendig, die Sequenz, welche die Kinase der Erfindung kodiert, operativ mit einem funktionellen prokaryontischen Promotor zu verknüpfen. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder, bevorzugter, regulierbar (d.h. induzierbar oder dereprimierbar) sein. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen den int-Promotor des Bakteriophagen λ, den bla-Promotor der β-Lactamase-Gensequenz von pPR322 und den cat-Promotor der Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gensequenz von pBR322 und ähnliche. Beispiele für induzierbare prokaryontische Promotoren umfassen die major right und major 1eft-Promotoren des Bakteriophagen λ (PL und PR), die trp, recA, λacZ, λacI und gal-Promotoren von E. coli, die α-Amylase (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162, 176–182, 1985) und ς-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman et al., Gene Sequence 32, 11–20, 1984), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY, 1982), und Streptomyces-Promotoren (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203, 468–478, 1986). Übersichten über prokaryontische Promotoren finden sich bei Glick (Ind. Microbiot. 1, 277–282, 1987), Cenatiempo (Biochimie 68, 505–516, 1986), und Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18, 415–442, 1984).
  • Eine einwandfreie Expression in einer prokaryontischen Zelle erfordert ferner die Gegenwart einer Ribosomenbindungsstelle oberhalb ("upstream") der die Gensequenz kodierenden Sequenz. Solche Ribosomenbindungsstellen werden zum Beispiel von Gold et. al (Ann. Rev. Microbiol. 35, 265–404, 1981) offenbart. Die Auswahl von Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren, Transformationsmethoden und dergleichen sind vom Typ der Wirtszelle abhängig, die zur Expression des Gens verwendet wird. Wie hier verwendet, können die Begriffe "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" untereinander austauschbar verwendet werden, und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Abkömmlinge. Somit umfassen die Begriffe "Transformanten" oder "transfomierte Zellen" die primären Zellen und die davon abgeleiteten Kulturen ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Ferner ist es selbstverständlich, dass nicht alle Abkömmlinge auf Grund gewollter oder zufälliger Mutationen genau identisch in ihrem DNA-Gehalt sein können. Die mutierten Abkömmlinge weisen jedoch, wie definiert, dieselbe Funktionalität auf wie die ursprünglich transformierte Zelle.
  • Wirtszellen, die in den Expressionssystemen der Erfindung verwendet werden können, sind nicht strikt begrenzt, vorausgesetzt dass sie für die Verwendung in der Expression des interessierenden Kinase-Polypeptids geeignet sind. Geeignete Wirte umfassen häufig eukaryontische Zellen. Bevorzugte eukaryontische Wirte umfassen beispielsweise Hefe, Pilze, Insektenzellen, Säugetierzellen entweder in vivo oder in Gewebekultur. Säugetierzellen, die als Wirte zweckmäßig sind, umfassen HeLa Zellen, aus Fibroblasten abgeleitete Zellen, wie z. B. VERO oder CHO-K1, oder aus Lymphoiden abgeleitete Zellen und ihre Derivate. Bevorzugte Säugetier- Wirtszellen umfassen SP2/0 und J558L sowie Neuroblastoma-Zelllinien, wie z. B IMR 332, welche bessere Kapazitäten für die korrekte posttranslationale Prozessierung bereitstellen können.
  • Zusätzlich sind Pflanzenzellen ebenfalls als Wirt verwendbar, und Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, sind verfügbar, wie z. B. der Cauliflower Mosaic Virus 35S und 19S- und der Nopalinesynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Ein weiterer bevorzugter Wirt ist ein Insektenzelle, z. B. die Drosophila-Larve. Bei Verwendung von Insektenzellen als Wirt kann der Drosophila Alkoholdehydrogenase-Promotor verwendet werden (Rubin, Science 240, 1453–1459, 1988). Alternativ können Bacuolvirus-Vektoren manipuliert werden, um große Mengen von PTP LAR in Insektenzellen zu expremieren (Jasny, Science 238, 1653, 1987; Miller et al., In : Genetic Engineering, Vol. 8, Plenum, Setlow et al., eds., pp. 277–297, 1986).
  • Jedes einer Reihe von Hefe Expressionssystemen kann verwendet werden, welches Promotor- und Terminationselemente aus aktiv exprimierten Sequenzen verwendet, welche für glykolytische Enzyme kodieren, die in großer Menge erzeugt werden, wenn Hefe in glucose-reichen Medien angezogen wird. Bekannte glycolytische Gensequenzen können ferner sehr effiziente transkriptionelle Kontrollsignale bereitstellen. Hefe bietet dahingehend wesentliche Vorteile, da auch posttranslationale Modifikationen durchgeführt werden können. Eine Reihe rekombinanter DNA-Strategien existiert, die starke Promotorsequenzen und hohe Plasmidkopienzahlen verwenden, die für die Produktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Leader-Sequenzen in klonierten Säugetier-Genen und sekretiert Peptide, welche Leader-Sequenzen beinhalten (d. h. Propeptide). Mehrere mögliche Vektorsysteme sind für die Expression von Kinasen entsprechend der Erfindung in einem Säugetier-Wirt verfügbar.
  • Abhängig von der Art des Wirts können eine Vielzahl transkriptioneller und translationeller regulatorischer Sequenzen verwendet werden. Die transkriptionellen und translationellen regulatorischen Signale können aus viralen Quellen stammen, wie z. B. Adenovirus, boviner Papillomavirus, Cytomegalovirus, Simianvirus oder ähnliche, in denen die regulatorischen Signale mit einer bestimmten Gensequenz assoziiert sind, welche ein hohes Expressionsniveau aufweist. Alternativ können Promotoren von Säugetier-Expressionsprodukten verwendet werden, wie z. B. Actin, Kollagen, Myosin und ähnliche. Regulatorische Transkriptionsinitiationssignale können ausgewählt werden, die eine Repression oder Aktivierung erlauben, sodass die Expression der Gensequenzen moduliert werden kann. Von Interesse sind regulatorische Signale, die temperatursensitiv sind, sodass durch Variation der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder die einer chemischen Regulation (wie z. B. durch Metabolite) unterworfen sind.
  • Die Expression von PTP LAR in eukaryontischen Wirten erfordert die Verwendung eukaryontischer regulatorischer Regionen. Solche Regionen umfassen im allgemeinen eine Promotorregion, die ausreichend ist, die Initiation der RNA-Synthese zu steuern. Bevorzugte eukaryontische Promotoren umfassen z. B. den Promotor der Maus Metallothionein I-Gensequenz (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 273–288, 1982), den TK-Promotor des Herpesvirus (McKnight, Cell 31, 355–365, 1982), den SV40 early-Promotor (Benoist et al., Nature (London) 290, 304–31, 1981) und den Promotor der Hefe gal4-Gensequenz (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6971–6975, 1982; Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5951–5955, 1984).
  • Die Translation eukaryontischer mRNA wird an dem Codon initiiert, welches das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grund ist es bevorzugt sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen einem eukaryontischen Promotor und einer DNA-Sequenz, welche PTP LAR (oder ein funktionelles Derivat davon) kodiert, keine intervenierenden Codons enthält, welche imstande sind, ein Methionin zu kodieren (i. e. AUG). Das Vorhandensein derartiger Codons hat entweder die Bildung eines Fusionsproteins zur Folge (falls das AUG Codon im selben Leserahmen ist als die PTP LAR kodierende Sequenz) oder einer Frame-Shift Mutation (falls das AUG Codon nicht im selben Leserahmen ist als die PTP LAR kodierende Sequenz).
  • Ein Nukleinsäuremolekül, das PTP LAR und einen operativ verknüpften Promotor kodiert, kann in eine prokaryontische oder eukaryontische Empfängerzelle entweder als ein nicht replizierendes DNA- oder RNA-Molekül eingebracht werden, welches entweder ein lineares Molekül oder vorzugsweise ein kovalent geschlossenes zirkuläres Molekül sein kann. Da derartige Moleküle zur autonomen Replikation nicht in der Lage sind, kann die Expression des Gens durch eine transiente Expression der eingebrachten Sequenz erfolgen. Alternativ kann eine permanente Expression durch die Integration der eingebrachten DNA-Sequenz in das Chromosom des Wirts erfolgen.
  • Es kann ein Vektor verwendet werden, der zur Integration der gewünschten Gensequenzen in das Chromosom der Wirtszelle imstande ist. Die Zellen, welche die eingebrachte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können durch zusätzliches Einbringen von ein oder mehr Markern selektiert werden, welche die Selektion der Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann für eine Prototrophie eines auxotrophen Wirts, Resistenz gegenüber Biociden, z. B. Antibiotika oder Schwermetalle, wie etwa Kupfer, und dergleichen sorgen. Die Gensequenz für den selektierbaren Marker kann entweder direkt mit der zu exprimierenden DNA-Gensequenz verknüpft sein oder in dieselbe Zelle durch Cotransfektion eingebracht werden. Zusätzliche Elemente können ebenfalls für die optimale Synthese von mRNA erforderlich sein. Diese Elemente können Prozessierungssignale (Splice-Signale) sowie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale umfassen. cDNA Expressionsvektoren, welche derartige Elemente enthalten, umfassen die von Okayama (Mol. Cell. Biol. 3, 280-, 1983) beschriebenen.
  • Das eingebrachte Nukleinsäuremolekül kann in ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut werden, der zur autonomen Replikation im aufnehmenden Wirt imstande ist. Ein beliebiger einer Vielzahl von Vektoren kann zu diesem Zweck verwendet werden. Wichtige Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors umfassen: die Einfachheit, mit der Empfängerzellen, welche den Vektor enthalten, erkannt und aus den Empfängerzellen, die den Vektor nicht enthalten, selektiert werden können; die Anzahl an Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es wünschenswert ist, in der Lage zu sein, mit dem Vektor zwischen Wirtszellen aus unterschiedlichen Spezies zu "pendeln" ("shuttle").
  • Bevorzugte prokaryontische Vektoren schließen Plasmide ein, wie zum Beispiel diejenigen, zur Replikation in E. coli imstande sind (wie z. B. pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, πVX; "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, supra). Bacillus Plasmide umfassen pC194, pC221, pT127 und dergleichen (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, pp. 307–329, 1982). Geeignete Streptomyces Plasmide umfassen p1J101 (Kendall et al., J. Bacteriol 169, 4177–4183, 1987) und Streptomyces Bacteriophagen, z. B. ΦC31 (Chater et al., In: Sikth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary, pp. 45–54, 1986). Übersichten über Pseudomonas Plasmide finden sich bei John et. al (Rev. Infect. Dis. 8, 693–704, 1986) und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33, 729–742, 1978).
  • Bevorzugte eukaryontische Plasmide umfassen beispielsweise BPV, Vaccinia, SV40, 2-micron circle und dergleichen oder ihre Derivate. Derartige Plasmide sind im Stand der Technik bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19, 265–274, 1982; Broach, In: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 445–470, 1981; Broach, Cell 28, 203–204, 1982; Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10, 39–48, 1980; Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563–608, 1980.
  • Sobald der Vektor oder das Nukleinsäuremolekül, welches das Konstrukt (die Konstrukte) enthält, für die Expression vorbereitet wurde, kann das DNA-Konstrukt (die DNA-Konstrukte) durch eine Vielzahl geeigneter Mittel in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden, so z. B. Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Particle Gun-Technologie, Calciumphosphat-Präzipitation, direkte Mikroinjektion und ähnliches. Nach dem Einbringen des Vektors werden die Empfängerzellen in einem Selektivmedium angezogen, das auf Wachstum der Vektorenthaltenden Zellen selektiert. Die Expression des klonierten Gens (der klonierten Gene) hat die Produktion einer Kinase der Erfindung oder von Fragmenten davon zur Folge. Dies kann in den transformierten Zellen als solche stattfinden oder nachfolgend an die Induktion der Differenzierung dieser Zellen (z. B. durch Verabreichen von Bromdeoxyuracil an Neuroblastomazellen oder ähnliches). Eine Vielzahl von Inkubationsbedingungen kann verwendet werden, um das Peptid der Erfindung zu erzeugen. Die am meisten bevorzugten Bedingungen sind diejenigen, welche physiologische Bedingungen nachahmen.
  • IV. Das PTP LAR Protein
  • Eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren kann verwendet werden, um das PTP LAR Polypeptid zu erhalten. Das Polypeptid kann aus Geweben oder Zellen gereinigt werden, die natürlicherweise die Polypeptide erzeugen. Alternativ könnten die oben beschriebenen isolierten Nukleinsäurefragmente verwendet werden, um PTP LAR in einem beliebigen Organismus zu expremieren. Die Proben der Erfindung umfassen Zellen, Proteinextrakte oder Membranextrakte von Zellen oder biologische Flüssigkeiten. Die Proben variieren abhängig vom Assay-Format, der Detektionsmethode und der Art der Gewebe, Zellen oder Extrakte, die als Probe verwendet werden.
  • Jeder eukaryontische Organismus kann als Quelle für das PTP LAR Polypeptid verwendet werden, solange der Ursprungsorganismus natürlicherweise derartige Polypeptide enthält. Wie hier verwendet, bezieht sich "Ursprungsorganismus" auf den originalen Organismus, aus dem die Aminosäuresequenz der Untereinheit stammt, unabhängig vom Organismus, in dem die Untereinheit exprimiert wird, und aus dem sie letztendlich isoliert wird.
  • Der Fachmann kann einfach bekannten Verfahren zur Isolation von Proteinen folgen, um die Polypeptide frei von natürlichen Kontaminanten zu erhalten. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Größenausschlusschromatographie, HPLC, Ionenaustauschchromatographie und Immunaffinitätschromatographie.
  • V. Antikörper, Hybridomazelllinien, Verwendungsverfahren und Kits zur Detektion von PTP LAR
  • Die Erfindung betrifft einen Antikörper, der Bindungsaffinität für PTP LAR aufweist, oder Verfahren zur Verwendung dieser Antikörper. Das Polypeptid kann die in 9 dargestellte Aminosäuresequenz aufweisen oder ein funktionelles Derivat davon sein oder zumindest 9 aufeinanderfolgende Aminosäuren davon darstellen (vorzugsweise zumindest 20, 30, 35 oder 40 oder mehr aufeinanderfolgende Aminsäuren davon).
  • Die Erfindung betrifft ferner einen Antikörper, der eine spezifische Bindungsaffinität gegenüber PTP LAR aufweist, oder Verwendungen davon. Ein derartiger Antikörper kann isoliert werden, indem seine Bindungsaffinität gegenüber PTP LAR mit seiner Bindungsaffinität gegenüber anderen Polypeptiden verglichen wird. Diejenigen Antikörper, welche selektiv an PTP LAR binden, würden für eine Verwendung in Verfahren ausgewählt werden, welche eine Unterscheidung zwischen PTP LAR und anderen Polypeptiden bedürfen. Derartige Verfahren könnten umfassen, sollten aber nicht beschränkt sein auf die Analyse veränderter PTP LAR Expression in Geweben, welche andere Polypeptide enthalten.
  • PTP LAR kann verwendet werden, um Antikörper oder Hybridomazelllinien zu erzeugen. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein derartiges Peptid wie hier beschrieben generiert und als ein Immunogen verwendet werden könnte, falls ein Antikörper gewünscht wird. Die Antikörper der Erfindung umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente dieser Antikörper und humanisierte Formen. Humanisierte Formen der Antikörper der Erfindung können unter Verwendung einer der im Stand der Technik bekannten Verfahren generiert werden, wie zum Beispiel Chimärenbildung oder CDR Grafting.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine Hybridomazelllinie, welche den oben beschriebenen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon erzeugt. Eine Hybridomazelllinie ist eine immortalisierte Zelllinie, die zur Sekretion eines spezifischen monoklonalen Antikörpers in der Lage ist.
  • Im allgemeinen sind Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper und Hybridomazelllinien im Stand der Technik bekannt (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984; St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35, 1–21, 1980). Jedes Tier (Maus, Kaninchen und ähnliches), von dem bekannt ist, dass es Antikörper produziert, kann mit dem selektierten Polypeptid immunisiert werden. Verfahren zur Immunisierung sind im Stand der Technik bekannt. Derartige Verfahren umfassen die subkutane oder intraperitoneale Injektion des Polypeptids. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Menge des zur Immunisierung verwendeten Polypeptids abhängig vom Tier, das immunisiert wird, der Antigenizität des Polypeptids und der Injektionsstelle variiert.
  • Das Polypeptid kann modifiziert werden oder in einem Adjuvans verabreicht werden, um die Antigenizität des Peptids zu erhöhen. Verfahren zur Erhöhung der Antigenizität eines Polypeptids sind im Stand der Technik bekannt. Derartige Verfahren umfassen die Kopplung des Antigens mit einem heterologen Protein (wie z. B. Globulin oder β-Galactosidase) oder durch die Einbeziehung eines Adjuvans während der Immunisierung.
  • Für monoklonale Antikörper werden Milzzellen aus den immunisierten Tieren entfernt und mit Myelomzellen fusioniert, wie z. B. SP/0-Ag14 Myelomzellen, und es wird ermöglicht, dass diese zu den monoklonalen Antikörpern produzierenden Hybridomazellen werden. Ein beliebiges aus der Reihe von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, kann verwendet werden, um die Hybridomazelle zu identifizieren, die einen Antikörper mit den gewünschten Charakteristika produziert. Diese umfassen das Screening der Hybridomazellen mit einem ELISA-Assay, einer Western Blot-Analyse oder einem Radioimmunoassay (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175, 109–124, 1988). Hybridomazellen, welche die gewünschten Antikörper sekretieren, werden kloniert, und die Klasse und Subklasse werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren bestimmt (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", supra, 1984).
  • Für polyklonale Antikörper wird das antikörperenthaltende Antiserum aus dem immunisierten Tier isoliert und unter Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren auf das Vorhandensein von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität gescreent. Die oben beschriebenen Antikörper können detektierbar markiert sein. Die Antikörper können detektierbar markiert sein durch die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (wie z. B. Biotin, Avidin und ähnliches), enzymatischen Markierungen (wie z. B. Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase und ähnliches), fluoreszierenden Markierungen (wie z. B. FITC oder Rhodamin und dergleichen), paramagnetischen Atome und ähnlichem. Verfahren zum Erhalt derartiger Markierungen sind im Stand der Technik bekannt, siehe beispielsweise Stemberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18, 315, 1970; Bayer et al., Meth. Enzym. 62, 308-, 1979; Engval et al., Immunol. 109, 129-, 1972; Goding, J. Immunol. Meth. 13, 215-, 1976. Die markierten Antikörper der Erfindung können für in vitro, in vivo und in situ-Assays verwendet werden, um Zellen oder Gewebe zu identifizieren, die ein spezifisches Peptid exprimieren.
  • Die oben beschriebene Antikörper können ferner auf einem festen Trägermaterial immobilisiert werden. Beispiele derartiger fester Trägermaterialien umfassen Kunststoffe, wie zum Beispiel Polycarbonat, komplexe Kohlenhydrate, wie zum Beispiel Agarose und Sepharose, Acrylharze, wie zum Beispiel Polyacrylamid und Latexkügelchen. Techniken für die Kopplung, von Antikörpern an solche festen Trägermaterialien sind im Stand der Technik bekannt (Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10, 1986; Jacoby et al., Meth. Enzym. 34, Academic Press, N.Y., 1974). Die immobilisierten Antikörper der Erfindung können für in vitro, in vivo und in situ-Assays sowie in der Immunchromatographie verwendet werden.
  • Weiterhin kann der Fachmann die gegenwärtig verfügbaren Verfahren sowie die Techniken, Methoden und Kits, die hier im Zusammenhang mit Antikörpern offenbart sind, leicht adaptieren, um Peptide zu erzeugen, die zur Bindung einer spezifischen Peptidsequenz in der Lage sind, um rational konzipierte Antipeptid-Peptide zu generieren (Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", In Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp. 289–307, 1992; Kaspczak et al., Biochemistry 28, 9230–9238, 1989).
  • Antipeptid-Peptide können durch Ersetzen der basischen Aminosäurereste, die in den Peptidsequenzen der Kinasen der Erfindung gefunden werden, durch saure Reste generiert werden, während die hydrophoben und ungeladenen polaren Gruppen erhalten werden. Zum Beispiel werden Lysin, Arginin und/oder Histidin-Reste mit Aspartat oder Glutamat ersetzt, und Glutamat-Reste werden durch Lysin, Arginin oder Histidin ersetzt.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion von PTP LAR in einer Probe, das umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem oben beschriebenen Antikörper unter derartigen Bedingungen, dass Immunkomplexe gebildet werden, und (b) Detektieren der Präsenz des Antikörpers, der an das Polypeptid gebunden hat. In Detail umfassen die Verfahren das Inkubieren einer Untersuchungsprobe mit einem oder mehr Antikörpern der Erfindung und das Untersuchen, ob der Antikörper an die Untersuchungsprobe bindet. Veränderte Niveaus einer PTP LAR der Erfindung in einer Probe verglichen mit normalen Niveaus kann eine Krankheit oder die Prognose einer Krankheit anzeigen.
  • Die Bedingungen zur Inkubation eines Antikörpers mit einer Untersuchungsprobe variieren. Die Inkubationsbedingungen hängen vom Format ab, das im Assay verwendet wird, von den verwendeten Detektionsverfahren und vom Typ und der Art des Antikörpers, der im Assay verwendet wird. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes der allgemein verfügbaren immunologischen Assay-Formate (wie z. B. Radioimmunoassays, Enzym-gekoppelte Immunoabsorbent-Assays, Diffusions-basierter Ouchterlony oder Rocket Immunofluoreszenzassays) einfach adaptiert werden kann, um die Antikörper der Erfindung zu verwenden. Beispiele für solche Assays können gefunden werden in Chard ("An Introduction to Radioimmunassay and Related Techniques" Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1986), Bullock et. al ("Techniques in Immunocytochemistry," Academic Press, Orlando, FL Vol. 1, 1982; Vol. 2, 1983; Vol. 3, 1985), und Tijssen ("Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1985).
  • Die Untersuchungsproben der Erfindung für immunologische Assays umfassen Zellen, Protein- oder Membranextrakte aus Zellen oder biologische Flüssigkeiten, wie etwa Blut, Serum, Plasma oder Urin. Die in dem oben beschriebenen Verfahren verwendeten Untersuchungsproben variieren abhängig vom Assay-Format, der Art des Nachweisverfahren und der Gewebe, Zellen oder Extrakte, die als zu untersuchende Probe verwendet werden. Verfahren zur Herstellung von Proteinextrakten oder Membranextrakten aus Zellen sind im Stand der Technik bekannt und können einfach adaptiert werden, um eine Probe zu erhalten, die im verwendeten System analysierbar ist.
  • Ein Kit enthält alle notwendigen Reagenzien, um die oben beschriebenen Nachweisverfahren durchzuführen. Der Kit kann umfassen: (i) eine erstes Behältnis, das einen oben beschriebenen Antikörper enthält, und (ii) ein zweites Behältnis, das ein Konjugat enthält, welches einen Bindungspartner des Antikörpers und eine Markierung umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit zusätzlich ein oder mehr weitere Behältnisse, die eines oder mehr des Folgenden umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die zur Detektion der Gegenwart des gebundenen Antikörpers imstande sind.
  • Beispiele für Detektionsreagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf markierte sekundäre Antikörper oder als Alternative, falls der primäre Antikörper markiert ist, die chromophoren, enzymatischen oder Antikörper-bindenden Reagenzien, die zur Reaktion mit dem Antikörper imstande sind. Der Kit aus Einzelteilen kann wie oben für Nukleinsäure-Sonden Kits beschrieben zusammengesetzt sein. Ein Fachmann wird sofort erkennen, dass die in der Erfindung beschriebenen Antikörper einfach in eines der etablierten Kit-Formate, die im Stand der Technik bekannt sind, eingebracht werden können.
  • VI. Isolierung von Verbindungen, die mit PTP LAR interagieren
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion einer Verbindung, die zur Bindung an PTP LAR imstande ist, das die Inkubation der Verbindung mit PTP LAR und die Detektion der Präsenz der an PTP LAR gebundenen Verbindung umfasst. Die Verbindung kann in einer komplexen Mischung vorhanden sein, zum Beispiel Serum, Körperflüssigkeit oder Zellextrakte.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion eines Agonisten oder Antagonisten der PTP LAR-Aktivität oder der Aktivität eines PTP LAR-Bindungspartners, das die Inkubation der Zellen, die PTP LAR erzeugen, in der Gegenwart einer Verbindung und die Detektion von Veränderungen im Niveau der PTP LAR-Aktivität oder der Aktivität eines PTP LAR- Bindungspartners umfasst. Die so identifizierten Verbindungen würden eine Veränderung in der Aktivität erzeugen, welche die Gegenwart der Verbindung anzeigt. Die Verbindung kann in einer komplexen Mischung vorliegen, zum Beispiel Serum, Körperflüssigkeit oder Zellextrakte. Sobald die Verbindung identifiziert ist, kann sie unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert werden.
  • Im Bestreben, neue Behandlungen für Krankheiten zu Entdecken, haben biomedizinische Forscher und Chemiker Moleküle konzipiert, synthetisiert und getestet, welche die Funktion vieler Proteine hemmen. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, welche die Funktion von Proteinen moduliert. Beispiele für Moleküle, von denen eine Hemmung der Funktion von Proteinen berichtet wurde, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf bis-monozyklische, bizyklische oder heterozyklische Aryl-Verbindungen (PCT WO 92/20642 , veröffentlicht am 26. November 1992 von Maguire et. al), Vinylen-azaindol-Duerivate (PCT WO 94/14808 , veröffentlicht am 7. Juli 1994 von Ballinuari et. al), 1-Cyclopropyl-4-pyridyl-quinolone (U.S. Patent Nr. 5,330,992 ), Styryl-Verbindungen (U.S. Patent Nr. 5,217,999 ), Styrylsubstituierte Pyridyl-Verbindungen (U.S. Patent Nr. 5,302,606 ), bestimmte Quinazolin-Derivate (EP Anmeldung Nr. 0 566 266 A1 ), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427 , veröffentlicht am 17. Februar 1994 von Denny et. al), trizyklische Polyhydroxyl-Verbindungen (PCT WO 92/21660 , veröffentlicht am 10. Dezember 1992 von Dow), und Benzylphosphonsäure-Verbindungen (PCT WO 91/15495 , veröffentlicht am 17. Oktober 1991 von Dow et. al).
  • Verbindungen, welche Zellmembranen überqueren können und gegenüber Säurehydrolyse resistent sind, sind als Therapeutika potentiell von Vorteil, da sie nach oraler Verabreichung an Patienten in hohem Maße bioverfügbar werden können. Viele dieser Proteininhibitoren hemmen die Funktion von Proteinen jedoch nur schwach. Zusätzlich hemmen viele eine Vielzahl von Proteinen und verursachen als Therapeutika für Krankheiten multiple Nebenwirkungen.
  • Einige Indolinon-Verbindungen bilden jedoch Klassen von säureresistenten und membranpermeablen organischen Molekülen. WO 96/22976 (veröffentlicht am 01. August 1996 von Ballinari et. al) beschreibt wasserlösliche Indolinon-Verbindungen, die Tetralin, Naphtalin, Quinolin und Indol-Substituenten enthalten, die an den Oxindol-Ring fusioniert sind. Diese bizyklischen Substituenten sind wiederum mit polaren Einheiten substituiert, welche hydroxylierte Alkyl-, Phosphat- und Ether-Einheiten einschließen. Die U.S. Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/702,232 , eingereicht am 23. August 1996 mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" von Tang et al. (Lyon & Lyon Aktenzeichen 221/187) und 08/485,323 , eingereicht am 07. Juni 1995 mit dem Titel "Benzylidene-Z-Indoline Compounds for the Treatment of Disease" von Tang et. al (Lyon & Lyon Aktenzeichen 223/298) und die Internationale Patentanmeldung WO 96/22976 , veröffentlicht am 01. August 1996 von Ballinari et. al beschreiben chemische Indolinon-Bibliotheken aus Indolinol-Verbindungen, die andere bizyklische Einheiten sowie monozyklische Einheiten enthalten, die mit dem Oxindol-Ring fusioniert sind. Die Anmeldungen 08/702,232 , eingereicht am 23. August 1996 mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" von Tang et. al (Lyon & Lyon Aktenzeichen 221/187), 08/485,323 , eingereicht am 07. Juni 1995 mit dem Titel "Benzylidene-Z-Indoline Compounds for the Treatment of Disease" by Tang et. al (Lyon & Lyon Aktenzeichen 223/298), und WO 96/22976 , veröffentlicht am 01. August 1996 von Ballinari et. al lehren Verfahren zur Indolinon-Synthese, Verfahren zur Untersuchung der biologischen Aktivität von Indolinon-Verbindungen in Zellen und Inhibierungsmuster von Indolinon-Derivaten.
  • Andere Beispiele von Substanzen, die zur Modulation der Proteinaktivität imstande sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tyrphostine, Quinazoline, Quinoxoline und Quinoline. Die Quinazoline, Tyrphostine, Quinoline und Quinoxoline umfassen mit Bezug auf das oben Gesagte bekannte Verbindungen, wie etwa die in der Literatur beschriebenen. Repräsentative Publikationen, die Quinazoline beschreiben, umfassen zum Beispiel Barker et al., EPO Publikation Nr. 0 520 722 A1 ; Jones et al., U.S. Patent No. 4,447,608 ; Kabbe et al., U.S. Patent No. 4,757,072 ; Kaul and Vougioukas, U.S. Patent No. 5,316,553 ; Kreighbaum and Comer, U.S. Patent No. 4,343,940 ; Pegg and Wardleworth, EPO Publikation Nr. 0 562 734 A1 ; Barker et al., Proc. of Am. Assoc. for Cancer Research 32, 327 (1991); Bertino, J.R., Cancer Research 3, 293–304 (1979); Bertino, J.R., Cancer Research 9(2 part 1), 293–304 (1979); Curtin et al., Br. J. Cancer 53, 361–368 (1986); Fernandes et aL., Cancer Research 43, 1117–1123 (1983); Ferris et al., J. Org Chem. 44(2), 173–178; Fry et al., Science 265, 1093–1095 (1994); Jackman et al., Cancer Research 51, 5579–5586 (1981); Jones et aL., J. Med. Chem. 29(6), 1114–1118; Lee and Skibo, Biochemistry 26(23), 7355–7362 (1987); Lemus et al., J. Org. Chem. 54, 3511–3518 (1989); Ley and Seng, Synthesis 1975, 415–522 (1975); Maxwell et al., Magnetic Resonance in Medicine 17, 189–196 (1991); Mini et al., Cancer Resarch 45, 325–330 (1985); Phillips and Castle, J. Heterocyclic Chem. 17(19), 1489–1596 (1980); Reece et al., Cancer Research 47(11), 2996–2999 (1977); Sculier et al., Cancer Immunol. and Immunother. 23, A65 (1986); Sikora et al., Cancer Letters 23, 289–295 (1984); und Sikora et al., Analytical Biochem. 172, 344–355 (1988).
  • Quinoxalin wird beschrieben in Kaul and Vougioukas, U.S. Patent No. 5,316,553 .
  • Quinoline werden beschrieben in Dolle et al., J. Med. Chem. 37, 2627–2629 (1994); MaGuire, J. Med. Chem. 37, 2129–2131 (1994); Burke et al., J. Med. Chem. 36, 425–432 (1993); und Burke et. al Bioorganic Med. Chem. Letters 2, 1771–1774 (1992).
  • Tyrphostine werden beschrieben in Allen et al., Clin. Exp. Immunol. 91, 141–156 (1993); Anafi et al., Blouod 82(12), 3524–3529 (1993); Baker et al., J. Cell Sci. 102, 543–555 (1992); Bilder et al., Amer. Physiol. Soc. pp. 6363–6143, C721–C730 (1991); Brunton et al., Proceedings of Amer. Assoc. Cancer Rsch. 33, 558 (1992); Bryckaert et al., Experimental Cell Research 199, 255–261 (1992); Dong et al., J. Leukocyte Biology 53, 53–60 (1993); Dong et al., J. Immunol. 151(5), 2717–2724 (1993); Gazit et al., J. Med. Chem. 32, 2344–2352 (1989); Gazit et al., J. Med. Chem. 36, 3556–3564 (1993); Kaur et al., Anti-Cancer Drugs 5, 213–222 (1994); Kaur et al., King et al., Biochem. J. 275, 413–418 (1991); Kuo et al., Cancer Letters 74, 197–202 (1993); Levitzki, A., The FASEB J. 6, 3275–3282 (1992); Lyall et al., J. Biol. Chem. 264, 14503–14509 (1989); Peterson et al., The Prostate 22, 335–345 (1993); Pillemer et al., Int. J. Cancer 50, 80–85 (1992); Posner et al., Molecular Pharmacology 45, 673–683 (1993); Rendu et al., Biol. Pharmacology 44(5), 881–888 (1992); Sauro and Thomas, Life Sciences 53, 371–376 (1993); Sauro and Thomas, J. Pharm. and Experimental Therapeutics 267(3), 119–125 (1993); Wolbring et al., J. Biol. Chem. 269(36), 22470–22472 (1994); und Yoneda et al., Cancer Research 51, 4430–4435 (1991).
  • Andere Verbindungen, die als Modulatoren verwendet werden könnten, umfassen Oxindolinone, wie zum Beispiel die in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/702,232 , eingereicht am 23. August 1996 beschriebenen.
  • BEISPIELE
  • Die nachfolgenden Beispiele sind nicht einschränkend und lediglich repräsentativ für die verschiedenen Aspekte und Merkmale der Erfindung. Die nachfolgenden Beispiele zeigen die Rolle von PTP LAR in der epithelialen Zellmigration und in der Tumorhemmung.
  • Allgemeine Materialien und Methoden
  • Klonierung von α-Catenin, β-Catenin und Plakoglobin (γ-Catenin) – Humanes α-Catenin (Hinterlegungsnummer D14705), β-Catenin (Z19054) und Plakoglobin (M23410) wurden aus cDNA amplifiziert, die aus MCF7 Zellen mittels PCR erzeugt wurde. Die PCR-Produkte wurden in einen eukaryontischen Expressionsvektor unter die Kontrolle des CMV-Promotors kloniert und mittels Sequenzanalyse bestätigt.
  • Zelllinien und Zellkultur – Alle Zelllinien wurden von der American Tissue Cultur Collection bezogen. NBT II Zellen (CRL-1655) wurden in MFM angezogen, das mit 1% nichtessentiellen Aminosäuren, Earle's Balanced Salt, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 10% FCS (Sigma) supplementiert war. MCF7 Zellen (HTB22) wurden in RPMI-Medium angezogen, das mit 2 mM Glutamin und 10% FCS supplementiert war, und humane embryonale 293 Nierenzellen (CRL 1573) in Dulbecco's Modifided Eagle's Medium, das mit 1 mg/mL Glucose, 2 mM Glutamin und 10% FCS supplementiert war. FCS wurde routinemäßig hitzeinaktiviert. Alle Medien und Supplemente wurden von Gibco BRL bezogen.
  • Migrationsassays – Für in vitro Wund-Assays wurden NBT II Zellen in einer Dichte von 7 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde der konfluente Monolayer mit einer Pipettenspitze abgekratzt, um einen zellfreien Bereich zu erzeugen, Wachstumsfaktoren wurden hinzugegeben und der Wundverschluss wurde mittels Fotographie dokumentiert. Für Streuungsassays wurden die Zellen in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert. Wachstumsfaktoren wurden nach 24 Stunden zugegeben, und die Morphologie der Zellen und die Dispersion von kleinen Kolonien wurden durch Fotographie dokumentiert. Die Quantifizierung der Migration wurde durch Zählen einzelner Zellen mit fibroblastoider Migrationsmorphologie verglichen mit Zellen in Gruppen mit epithelialer Morphologie in verschiedenen, zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern durchgeführt. 1000 Zellen pro Schale wurden ausgezählt. Alle Migrationsassays wurden dreifach durchgeführt. Tysosin-Kinasen (TK), mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPK) oder Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) wurden durch Genistein (250 μM; Biomol) inhibiert, das eine Stunde vor Zugabe der Wachstumsfaktoren hinzugefügt wurde. Als Kontrolle wurde das Lösungsmittel DMSO verwendet. Die DNA-Synthese wurde durch den spezifischen Inhibitor der DNA-Polymerase α-Aphidicolin (1.5 μM, Serva) eine Stunde vor Zugabe der Wachstumsfaktoren gehemmt.
  • Tumorbildung in Nacktmäusen – NBT II Zellen wurden in einer Zelldichte von 2 × 106/50 μL in MEM resuspendiert und subkutan in die Seitenregionen von Swiss Nacktmäusen (IGR Villejuif, Paris, Frankreich) injiziert. Die Tumorbildung wurde durch Messen der Breite (W) und der Länge (L) der Tumoren mit W < L überwacht. Das Tumorvolumen wurde entsprechend der Formel (W2 × L × π/6) bestimmt. Die Assays wurden zumindest dreifach durchgeführt.
  • Generierung von rekombinanten Retroviren und Retrovirusvermittelter Gentransfer – Die vollständige (full-length) PTP LAR (H. Saito, Harvard Medical School, Boston, USA) wurde in den Vektor pLXSN subkloniert (Miller, et. al (1989) BioTechniques 7). Stabile NBT II Zelllinien wurden mittels retroviralem Gentransfer erzeugt wie beschrieben (Pear et. al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8392–8396). Polyklonale und klonale Zelllinien wurden in Medium selektiert, das 0.5 mg/ml G418 (Gibco BRL, FRG) enthält. Die ectopische Expression wurde mit Hilfe von Immunpräzipition und Western Blot-Analyse bestätigt.
  • Transiente Expression, Zelllyse und Immunpräzipitation – Die transiente Transfektion von humanen 293 embryonalen Nierenzellen wurde wie beschrieben durchgeführt (Chen et. al (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 2745–2752). Für biochemische Analysen wurden NBT II Zellen in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 am Tag vor der Lyse ausplattiert. Wenn angegeben, wurden die Zellen vor der Lyse mit Na-Orthovanadat (1 mM) für die angegebene Zeitdauer vorbehandelt. Nach Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Zellen in eiskaltem Lyse-Puffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glyzerin, 20 mM Pyrophosphat, 1% Triton X-100, 100 mM NaFl, 2 mM Phenylymethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Aprotinin, 20 μg/ml Leupeptin, 0.7 μg/ml Pestatin, 0.2 mM Ammoniummolybdat, 2 mM Na-Orthovanadat) lysiert und durch Zentrifugation bei 12.500 × g und 4°C für 10 min vorgeklärt. Die Proteinkonzentrationen der Überstände wurden angeglichen. HNTG-Puffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM Pyrophosphat, 10 mM NaFl, 0.2 mM Ammoniummolybdat, 10% Glyzerin, 0.1% Triton X-100, 2 mM Na-Orthovanadat) wurde in einem 1 : 1 Verhältnis hinzugefügt, und die Immunpräzipitationen wurden für zwei Stunden bei 4°C durchgeführt. Protein A- oder Protein G-Sepharose wurde für weitere zwei Stunden hinzugegeben. Die Präzipitate wurden dreimal mit HNTG-Puffer gewaschen, und die Kügelchen wurden in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Für die anschließende Western Blot-Analyse wurden die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell) transferiert und mit dem entsprechenden Antikörper inkubiert. Die Proteine wurden mit Hilfe des ECL-Systems (Amersham) visualisiert. Vor einer erneuten Untersuchung ("reprobing") wurden die Blots durch Inkubation für eine Stunde in 68 mM Tris-HCL, pH 6.8, 2% SDS und 0.1% β-Mercaptoethanol bei 50°C entfärbt ("stripped").
  • In vitro Bindungsassays – Das Plasmid, welches das GST-hPTP LARi Fusionsprotein kodiert, wurde durch PCR-Amplifikation der cDNA-Sequenz zwischen den Aminosäuren 1259–1881 der humanen PTP LAR konstruiert und in den geeigneten pGEX Vektor (Pharmacia Biotech) kloniert. In vitro Mutagenese (Kunkel et. al (1987) Methods Enzymol. 154, 367–382) des originalen Vektors pSP65-LAR ergab eine PTP LAR entweder mit inaktivierter PTP Domäne 1, PTP LAR D1 C1522S oder inaktivierter PTP Domäne 2, PTP LAR D2 C1813S, welche mittels PCR zwischen den Aminosäuren 1259–1881 der humanen PTP LAR amplifiziert und in den pGEX-Vektor subkloniert wurden. Die Integrität der subklonierten PCR-Produkte wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. GST-Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert und wie beschrieben gereinigt (Smith et. al (1988) Gene 67, 31–40). 3μg GST-hPTP LARi Fusionsprotein oder ein dreifacher molarer Überschuss an GST wurden bei 4°C mit gleichen Mengen an Zelllysaten inkubiert, an Glutathion-Sepharose (Sigma, FRG) immobilisiert und dreimal mit HNTG gewaschen. Gebundene Proteine wurden mittels SDS-PAGE für Western-Blotting aufgetrennt.
  • Affinitätspräzipitation – Das Plasmid, das für das GST-E-Cadherin cytoplasmatische Fusionsproteinen kodiert, wurde durch PCR-Amplifikation der cDNA-Sequenz zwischen den Aminosäuren 734 und 884 von E-Cadherin der Maus (Nagafuchi et. al (1987) Nature 329, 341–343) konstruiert und in den geeigneten pGEX-Vektor kloniert. Für die Affinitätspräzipitation wurden gleiche Konzentrationen der vorgeklärten NBT II Zelllysate mit 5μg des gereinigten GST-E-Cadherin cytoplasmatischen Fusionsproteins oder einem dreifachen molaren Überschuss an GST inkubiert und an Glutathion-Sepharose immobilisert. Die erhaltenen Komplexe wurden dreimal mit HNTG gewaschen, und die gebundenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE für Western-Blotting aufgetrennt.
  • Antiseren – Ein monoklonaler Antikörper gegen Phosphotyrosin (4G10) wurde von UBI erhalten. α-Catenin, β-Catenin, Plakoglobin und E-Cadherin Antikörper wurden von Transduction Laboratories erhalten. Ein zweiter Antikörper gegen E-Cadherin wurde gegen ein GST-Fusionsprotein erzeugt, welches die Aminosäuren 834–913 des humanen E-Cadherins enthält. Der monoklonale Antikörper 11.1A (M. Streuli, Dana Faber Cancer Institute, Boston, USA) erkennt die extrazelluläre Domäne der humanen PTP LAR (Streuli et. al (1992) EMBO J. 11, 897–907). Das Kaninchen Antiserum #320 (Y. Schlessinger, New York University Medical Center, New York, USA) ist gegen ein Peptid gerichtet, das dem C-Terminus von PTP LAR (Aminosäuren 1868–1881) entspricht.
  • In vitro Dephosphorylierungsassay – ß-Catenin wurde transient in humanen 293 embryonalen Nierenzellen überexprimiert. Die Zellen wurden einem Serummangel unterzogen, 10 min mit Pervanadat (0.3 μM H2O2/0.1 mM Na-Orthnovanadat) behandelt und lysiert. Immunpräzipitationen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme dass HNTG ohne Pyrophosphat, Amoniummolybdat und Na-Orthovanadat verwendet wurde. Die PTP-Aktivität gegen Tyrosinphosphoryliertes β-Catenin wurde in 200 μl Reaktionen bei 25°C untersucht, welche 25 mM HEPES, pH 7.5, 5 mM EDAT, 10 mM DTT, und 1 mg/ml BSA mit 200 ng GST-hPTP LAR cytoplasmatischem Fusionsprotein, GST-hPTP LAR D1 C1522S oder GST-hPTP LAR D2 C1813S enthielten. Die Reaktionen wurden durch Waschen mit HNTG gestoppt und anschließend durch SDS-PAGE aufgetrennt. Der Tyrosin-Phosphorylierungsstatus wurde mittels Western-Blotting unter Verwendung eines anti-Phosphotyrosin-Antikörpers analysiert.
  • Immunfluoreszenz – NB II Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 oder 7 × 104 Zellen/cm2 ausplattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen mit 2% Paraformaldehyd in phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7.4, 125 mM Sucrose) fixiert. Die Autofluoreszenz wurde mit PBS-Glycin (100 mM Glycin, 0.1% Borhydrat in PGS) gequencht, und die Zellen wurden mit 0.5% Saponin in PGS (5 min) permeabilisiert. Die nicht-spezifische Antikörperbindung wurde eine Stunde mit phosphat-gepufferter Gelatine (PBG : PBS, 0.5% Rinderserumalbumin, 0.045% Kaltwasserfischgelatine, 5% Eselserum) geblockt. Die Inkubation mit dem primären Antikörper wurde nach Verdünnung in PBG bei Raumtemperatur für zwei Stunden durchgeführt. Nach drei Waschschritten in PBG wurde die Bindung des primären Antikörpers mit einem Isotypspezifischen sekundären Antikörper, entweder FITC(DTAF)- oder Cy3-konjugiert (Jackson Laboratories, USA), detektiert. Für Experimente mit einer zweifachen Markierung wurde die Markierung des Antikörpers konsekutiv durchgeführt. Deckgläser wurden unter Permafluor Mounting Medium (Immunotech, Frankreich) montiert und entweder mit einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop (Leica, FGR) oder einem konfokalen CLSM Laser-Mikroskop (Leica, FRG) betrachtet. Die Kontrollen wurden in einem identischen Aufbau untersucht.
  • BEISPIEL 1
  • Relokalisierung des Cadherin/Catenin-Komplexes nach Induktion der epitelialen Zellmigration
  • Die Migration epithelialer Zellen in Gewebekultur stellt in vielerlei Hinsicht ein Modellsystem für die epithelialmesenchymale Transition dar (Manske et. al (1994) Int. Rev. Cyptol. 155, 49–9). Die Ratten Blasenkarzinomzelllinie NBT II (Toyoshima et al., J. Nat. Cancer Inst. 47, 979–985) wurde verwendet, da bestimmte Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) die Migration dieser Zellen induzieren (Valles et. al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1124–1128; Tchao, R. (1982) Cell Motil. 4,333–341; Tucker et. al (1990) Cancer Res. 50, 129–137).
  • Die Ergebnisse eines in vitro Wund-Assays sind in 1A für EGF und den kommerziellen Serumersatz Ultroser G dargestellt. Um die Proliferation als Ursache des Wundverschlusses auszuschließen, wurde Aphidicolin verwendet, um die DNA-Synthese zu hemmen; es beeinträchtigte die Migration nicht. Im Gegensatz dazu hob die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3A) durch ly295002, der Tyrosinkinasen (TK) durch Genistein oder der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) durch PD98059 die Zellmigration vollständig auf. Die Proteinkonzentrationen der Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes blieben während der Migration unverändert, und selbst die Überexpression von E-Cadherin konnte die Zerstörung intrazellulärer Kontakte nicht verhindern (Boyer et. al (1992) Exp. Cell Res. 201, 347–357).
  • Die Lokalisierung der Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes während der EMT war jedoch verändert. E-Cadherin (grüne Fluoreszenz)und β-Catenin (rote Fluoreszenz) waren entlang der gesamten Zell/Zell-Kontaktregion angrenzender, subkonfluent ausplattierter Zellen lokalisiert (1B, oberes Panel). Die Fluoreszenz an kontaktfreien Membranstellen war nur schwach oder fehlte vollständig. Eine schwache β-Catenin-Färbung wurde im Nukleus von Kontrollzellen detektiert, höchstwahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass die konfluenten Zellen ihre Adherens Junctions nicht vollständig ausbildeten. Nach Induktion der Migration durch EGF, breiten sich E-Cadherin und β-Catenin jedoch wieder über die ganze Zelloberfläche und im Cytoplasma aus. Interessanterweise war die erhöhte nukleare Lokalisation von ß-Catenin ebenfalls während der epithelialen Zellmigration detektierbar.
  • BEISPIEL 2
  • Tyrosin-Phosphorylierung des Cadherin/Catenin-Komplexes
  • Die Spezifität von Tyrosin-Kinasen für den Cadherin/Catenin-Komplex wurde untersucht. Eine transiente Cotransfektion von TKs mit den Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplex zeigte, dass nur TKs, die eine Rolle in der epithelialen Zellmigration spielen, wie zum Beispiel EGFR, c-Src oder FGFR2, in der Lage sind, β-Catenin und Plakoglobin zu phosphorylieren. α-Catenin und E-Cadherin waren jedoch keine Substrate für diese TKs. Diese Beobachtungen konnten in nicht transfizierten NBT II Zellen bestätigt werden, die zur Migration stimuliert wurden. Nach Zelllyse wurden alle Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes mit spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Diese Technik ermöglicht die Präzipitation der Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes unabhängig von ihrer Lokalisation und ihren Bindungspartnern, und daher auch von E-Cadheringebundenem α-Catenin. Die Tyrosin-Phosphorylierungsniveaus wurden mittels Western-Blotting mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (2, oben), gefolgt von der Detektion von E- Cadherin (2, Mitte) oder den Cateninen (2, unten) durch spezifische Antiköper analysiert.
  • Die Tyrosin-Phosphorylierung von ß-Catenin und Plakoglobin, nicht aber von α-Catenin und E-Cadherin war bereits 30 min nach Induktion der Migration detektierbar. Die Phosphorylierung war transient, dauerte etwa 9 Stunden und war nach 24 Stunden nicht länger detektierbar. Für die Immunpräzipitation war eine Vorbehandlung der Zellen mit 1 mM Na-Orthovanadat notwendig, ein spezifischer Inhibitor der PTPs, um Tyrosin-Phosphorylierung zu detektieren. Dies indiziert, dass der Phosphorylierungszustand von ß-Catenin und Plakoglobin durch TKs und PTPs strikt reguliert war. Die Korrelation der ephithelialen Zellkoloniedispersion mit der Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin konnte ebenfalls in HT29- und HaCaT-Zellen nachgewiesen werden, was einen gemeinsamen regulatorischen Mechanismus während der Induktion der Zellmigration nahelegt.
  • BEISPIEL 3
  • Erhöhter freier Pool an β-Catenin während der epithelialen Zellmigration
  • β-Catenin aus EGF-behandelten Zellen wurde mit einem GST-Fusionsprotein affinitätspräzipitiert, das die gesamte cytoplasmatische Domäne von E-Cadherin umfasst. Die Niveaus an freiem unkomplexiertem β-Catenin (3, oben) sowie dessen Phosphotyrosin-Gehalt (3, unten) wurde durch Immunblotting analysiert. Wie oben gezeigt, erlaubt diese Strategie im Gegensatz zur Immunpräzipitation die spezifische und selektive Präzipitation des freien, nicht E-Kadheringebundenen Pools an ß-Catenin (Papkoff et. al (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 2128–2134).
  • Die Induktion der Migration durch EGF korrelierte mit einem Anstieg des freien Pools an ß-Catenin, das einen signifikant höheren Phophotyrosin-Gehalt aufwies als das β-Catenin, das durch Immunpräzipitation erhalten wurde (vergleiche die 2 und 3). Der freie Pool an β-Catenin in nicht-stimulierten Kontrollzellen blieb unbeeinflusst. Während Erhöhungen an freiem Tyrosin-phosphoryliertem β-Catenin selbst ohne Zugabe von Na-Orthovanadat detektiert wurden (siehe 8), verbesserte dessen Zugabe die Detektion. Diese Befunde zeigen, dass die Phosphorylierung durch TKs zu einem Anstieg des freien, unkomplexierten Pools an ß-Catenin während der epithelialen Zellmigration führt.
  • BEISPIEL 4
  • Colocalization des Cadherin/Catenin-Komplexes mit PTP LAR
  • Eine Vorbehandlung mit Na-Orthovanadat führte zu einer erhöhten Tyrosin-Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin in migrierenden NBT II Zellen. PTPs können daher als Steady-State Gleichgewichtsantagonisten von TKs für regulatorische Ereignisse an Adherens Junctions fungieren. Wie in 4 gezeigt, colokalizierte PTP LAR (rote Fluoreszenz) mit dem Cadherin/Catenin-Komplex (grüne Fluoreszenz), wie durch das gelbe Fluoreszenzsignal an den Adherens Junctions von epithelialen Zellen gezeigt. PTP LAR wurde an die fokalen Adhäsionen epithelialer MCF7 Zellen lokalisiert (Serra-Pages et. al (1995) EMBO J. 14, 2827–2838). In NBT II Zellen wurde PTP LAR vorzugsweise an Adherens Junctions detektiert und mit geringerer Signalintensität an fokalen Adhäsionen. Da motile Zellen ihre Adherens Junctions und fokalen Adhäsionen schnell trennen und wieder verbinden müssen, unterstützt die Lokalisation von PTP LAR ihre potenzielle regulatorische Funktion während der epitherialen Zellmigration.
  • BEISPIEL 5
  • Assoziation von β-Catenin und Plakoglobin mit PTP LAR
  • Um die potenzielle Assoziation von PTP LAR mit dem Cadherin/Catenin-Komplex in intakten Zellen zu untersuchen, wurden subkonfluente humane MCF7 Zellen mit EGF stimuliert, lysiert und mit Antikörpern entweder gegen PTP LAR oder den Cadherin/Catenin-Komplex immunpräzipitiert. Eine Western Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern gegen β-Catenin und E-Cadherin (5A) oder Plakoglobin und E-Cadherin (5B) detektierten diese Proteine in anti-humanen PTP LAR Immunpräzipitaten mit dem monoklonalen Antikörper 11.1A gegen die extrazelluläre Domäne von humaner PTP LAR und umgekehrt. Interessanterweise war die Assoziation konstitutiv und unabhängig von EGF-Stimulation. Kein spezifisches Signal der Komponenten des Cadherin/Catenin-Komplexes wurde mit dem polyklonalen Antiserum #320 aus Kaninchen gegen PTP LAR erhalten, was nahelegt, dass das antigene Epitop in diesem Komplex nicht zugänglich war. Um zu untersuchen, welche Komponente des Cadherin/Catenin-Komplexes die Interaktion mit PTP LAR vermittelte, wurde ein GST-Fusionsprotein, das die gesamte cytoplasmatische Domäne von PTP LAR enthält (GST-PTP LARi) für die Affinitätsreinigung der einzelnen Komponenten des Cadherin/Catenin-Komlexes verwendet und transient in humanen 293 embryonalen Nierenfibroblasten überexprimiert, welche vor der Lyse mit dem Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor Pervanadat behandelt wurden.
  • Es wurde gefunden, dass β-Catenin (5C, links) und Plakoglobin (5C, rechts) unter diesen Bedingungen spezifisch mit der cytoplasmatischen Domäne von PTP LAR assoziieren. E-Cadherin und α-Catenin interagierten unter den gleichen experimentellen Bedingungen nicht direkt mit PTP LAR (Ergebnisse nicht gezeigt). Der Phosphorylierungszustand von β-Catenin oder Plakoglobin, die beide nach Behandlung mit Pervanadat Tyrosin-phosphoryliert waren, beeinflusste ihre Assoziation mit den GST-PTP LAR cytoplasmatischen Fusionsprotein nicht. Diese Interaktion erforderte die vollständige cytoplasmatische Domäne von PTP LAR, da Deletionsmutanten von PTP LAR β-Catenin oder Plakoglobin nicht effizient gebunden haben.
  • BEISPIEL 6
  • β-Catenin ist ein Substrat von PTP LAR in vitro
  • Die Assoziation von β-Catenin und Plakoglobin mit PTP LAR veranlasste die Untersuchung, ob diese Proteine tatsächliche Substrate für PTP LAR darstellen könnten. GST-Fusionsproteine von PTP LAR, die entweder die gesamte cytoplasmatische Domäne (GST-PTP LAR cytopl.) oder Mutanten von PRP LAR mit katalytisch inaktivierter PTP Domäne 1 (GST-PTP LAR PTP D1 C1522S) oder inaktivierter PTP Domäne 2 (GST-PTP LAR PTP D2 C1813S) umfassen, wurden mit Tyrosin-phosphoryliertem β-Catenin aus transient überexprimierenden, Pervanadatbehandelten humanen 293 Zellen inkubiert. Nach verschiedenen Zeitintervallen wurden die Reaktionen gestoppt und mit einem anti-Phosphotyrosin-spezifischen Antikörper analysiert.
  • Es wurde eine signifikante Reduktion im Tyrosin-Phosphorylierungssignal innerhalb der ersten fünf Minuten nach Inkubation von ß-Catenin mit GST-PTP LAR cytoplasmatisch oder GST-PTP LAR PTP D2 C1813S (6, oben links und rechts) erhalten. Keine Veränderung im Phosphorylierungsgrad wurde nach Inkubation mit GST-PTP LAR PTP D1 C1522S beobachtet ( 6, oben, Mitte), was die Ergebnisse der enzymatischen Aktivitätsmessungen für die GST-Fusionproteine unter Verwendung von pNPP als Substrat bestätigt (Ergebnisse nicht gezeigt). Diese Ergebnisse sind mit früheren Befunden konsistent, dass die erste PTP Domäne von PTP LAR für die katalytische Aktivität essentiell ist, währende die zweite katalytisch inaktiv ist (Streuli, et. al (1990) EMBO J. 9). Die Blots wurden mit einem anti-β-Catenin-spezifischen Antikörper erneut untersucht ("reprobed"), um zu bestätigen, dass die gleichen Proteinmengen im Assay verwendet wurden (6, unten). Somit ist β-Catenin ein Substrat für PTP LAR.
  • BEISPIEL 7
  • PTP LAR hemmt die eptheliale Zellmigration und die Tumorbildung in Nacktmäusen
  • Als nächstes untersuchten wir, ob PTP LAR eine direkte regulatorische Funktion während der epithelialen Zellmigration besitzt. Dazu exprimierten wir humane PTP LAR ectopisch in NBT II Zellen in Konzentrationen, die vergleichbar mit dem endogenen Protein waren, wobei polyklonale sowie klonale Zelllinien mit etwa der zweifachen PTP LAR Expression relativ zu den parentalen Zellen erhalten wurden. Mit diesen Zelllinien führten wir Streuungsassays durch, um die Migration nach EGF-Behandlung zu quantifizieren. Diese moderate ectopische Expression von hPTP LAR in NBT II Zellen inhibierte die EMT und die Motilität (7A) signifikant auf etwa 40% der mit der Vektorkontrolle infizierten Zelllinien (NBT II pLXSN, 7B) ohne die Kinetiken des Beginns der Migration zu beeinflussen. Keine Unterschiede in der Aktivierung und Autophosphorylierung des EGF-Rezeptors und dessen Assoziation mit dem Adapterprotein Shc wurden detektiert, was nahelegt, dass ectopische hPTP LAR nicht durch Inaktivierung des EGF-Rezeptors funktioniert. Weiterhin wurden "Downstream-Ereignisse" der EGF-Signalübertragung wie DNA-Synthese und Proliferationsrate dieser NBT II-hPTP LAR Zelllinien durch die ectopische Expression von hPTP LAR nicht beeinflusst.
  • Die epitheliale Zellmigration in vitro ähnelt einem vereinfachten Modellsystem für die Tumorentstehung und Metastasenbildung in vivo. Daher wurde die Korrelation der ectopischen Expression von hPTP LAR mit einer verminderten Kapazität dieser Zellen untersucht, Tumoren in vivo in Nacktmäusen auszubilden. NBT II-hPTP LAR Zellen wurden subkutan in die Seitenregion von Swiss Nacktmäusen injiziert. Interessanterweise zeigten diese Zellen verglichen mit NBT II pLXSN Zellen ein signifikant vermindertes Tumorwachstum ( 7C). Die Fähigkeit zur Tumorbildung von polyklonalen und klonalen Zelllinien unterschied sich nicht. Die parentalen NBT II Zellen bildeten in gleichem Maße Tumoren aus wie die mit der Vektorkontrolle infizierten Zelllinien, was ein klonales Artefakt ausschließt. Diese Daten legen in starken Maße nahe, dass PTP LAR als negativer Regulator der epitelialen Zellmigration und der Tumorbildung dient.
  • BEISPIEL 8: PTP LAR inhibiert die Tyrosin-Phosphorylierung und den Anstieg des freien Pools an β-Catenin β-Catenin wurde in Kontroll- und in hPTP LAR-exprimierenden NBT II Zellen unter Verwendung eines GST-E-Cadherin cytoplasmatischen Fusionsprotein affinitätspräzipitiert. Die Zellen wurden nicht mit dem PTP-Inhibitor Na-Orthovanadat behandelt, um die Funktion von PTP LAR nicht zu maskieren. Nichtsdestotrotz wurde ein Anstieg des Pools an freiem, unkomplexiertem und tyrosin-phodphoryliertem β-Catenin in Vektor-infizierten Kontrollzellen detektiert, was zeigt, dass ein Anstieg an freiem Tyrosin-phosphoriliertem β-Catenin auch in Zellen ohne Vorbehandlung mit Na-Orthovanadat erfolgt (8, links). In NBT II-hPTP LAR-expremierenden Zellen wurde jedoch weder eine Tyrosin-Phosphorylierung noch ein Anstieg des Pools an freiem β-Catenin detektiert (8, rechts). Da β-Catenin in vitro ein Substrat von PTP LAR ist, und die ectopische Expression von humaner PTP LAR in NBT II Zellen nicht mit der EGF Rezeptor-vermittelten Signalübertragung interferiert, fungiert PTP LAR als spezifischer negativer Regulator der β-Catenin Tyrosin-Phosphorylierung, die einen Anstieg an freiem β-Catenin verhindert, und dabei die epitheliale Zellmigration inhibiert.
  • Ein Fachmann würde sofort erkennen, dass die Erfindung zur Ausführung der einzelnen Objekte und zur Erreichung der erwähnten Ziele und Vorteile sowie derjenigen, die darin inhärent enthalten sind, angepasst ist. Die molekularen Komplexe und die Methoden, die Verfahren, Moleküle und spezifischen Verbindungen, die hier als derzeit repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen beschrieben sind, sind beispielhaft und sollen nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung verstanden werden. Dem Fachmann können Veränderungen darin und andere Verwendungen in den Sinn kommen, die im Rahmen der Erfindung, die durch den Umfang der Ansprüche definiert ist, eingeschlossen sind.
  • Für den Fachmann ist es leicht ersichtlich, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen an der hier offenbarten Erfindung durchgeführt werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
  • Alle Patente und Publikationen, die in der Spezifikation erwähnt sind, sind Indikativ für das Niveau der Fachleute, welche die Erfindung betrifft.
  • Die hier illustrativ dargestellte Erfindung kann bei Fehlen eines beliebigen Elements oder von Elementen, einer Beschränkung oder von Beschränkungen, die hier nicht spezifisch offenbart ist, in geeigneter Weise ausgeführt werden. Daher kann zum Beispiel in jedem Fall jeder der Begriffe "umfassen", "im wesentlichen bestehen aus" und "bestehen aus" durch jeweils jeden der beiden anderen Begriffe ersetzt werden. Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden beschreibend und nicht als Einschränkung verwendet, und es besteht nicht die Absicht, dass bei Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke beliebige Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon ausgeschlossen werden, sondern es wird erkannt, dass verschiedene Modifikationen im Rahmen des Schutzbereichs der beanspruchten Erfindung möglich sind.
  • Zusätzlich werden Fachleute erkennen, wenn Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Form von Markush-Gruppen beschrieben sind, dass die Erfindung dadurch in Form eines beliebigen einzelnen Vertreters oder einer Subgruppe von Vertretern der Markush-Gruppe beschrieben wird. Falls zum Beispiel X beschrieben wird als ausgewählt aus der Gruppe, die aus Brom, Chlor und Iod besteht, sind Ansprüche mit X als Brom und Ansprüche mit X als Brom und Chlor vollständig beschrieben.
  • Weitere Ausführungsformen finden sich in den nachfolgenden Ansprüchen.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Prognose einer Krankheit oder Funktionsstörung durch Detektion von PTP LAR in einer Probe, wobei die Probe aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Zellen, Nukleinsäureextrakten von Zellen und biologischen Flüssigkeiten besteht, wobei die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus aberranter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht, und wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde, die unter Bedingungen eines Hybridisierungsassays mit einer Nukleinsäurezielregion von PTP LAR hybridisiert, wobei die Sonde die Nukleinsäuresequenz umfasst, welche PTP LAR, Fragmente davon oder die Komplemente dieser Sequenzen oder Fragmente kodiert; und (b) Detektieren der Gegenwart oder der Menge des Sonde/Targetregion-Hybrids als Indikation der Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung.
  2. Verfahren zur Prognose einer Krankheit oder Funktionsstörung durch Detektion von PTP LAR in einer Probe, wobei die Probe aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Zellen, Nukleinsäureextrakten von Zellen und biologischen Flüssigkeiten besteht, wobei die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus aberranter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht, und wobei das Verfahren umfasst: (a) Vergleichen einer Nukleinsäurezielregion, welche die PTP LAR kodiert, in einer Probe mit einer Kontroll-Nukleinsäurezielregion, welche die PTP LAR kodiert; und (b) Detektieren von Unterschieden in der Sequenz oder der Menge zwischen der Zielregion und der Kontroll-Zielregion als Indikation der Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung.
  3. Verfahren zur Detektion von PTP LAR in einer Probe als ein prognostisches Hilfsmittel für eine Krankheit oder Funktionsstörung, wobei die Probe aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Zellen, Proteinen oder Membranextrakten von Zellen und biologischen Flüssigkeiten besteht wobei die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus aberranter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht, und wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der unter Bedingungen eines Hybridisierungsassays mit einer Aminosäurezielregion von PTP LAR hybridisiert; und (b) Detektieren der Gegenwart oder der Menge des Antikörper/Targetregion-Komplexes als Indikation der Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus polyklonalen und monoklonalen Antikörpern besteht.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Antikörper aus einer Hybridomazelle ist.
  6. Verfahren zur Prognose einer Krankheit oder Funktionsstörung durch Detektion von PTP LAR in einer Probe, wobei die Probe aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Zellen, Proteinen oder Membranextrakten von Zellen und biologischen Flüssigkeiten besteht wobei die Krankheit oder Funktionsstörung aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus aberranter Wundheilung, Krebs und Metastasen besteht, und wobei das Verfahren das Detektieren der Gegenwart oder Menge von PTP LAR als Indikation der Prognose der Krankheit oder Funktionsstörung umfasst.
  7. Verfahren zur Identifikation einer oder mehr Verbindungen, welche die epitheliale Zellmigration modulieren, das umfasst: (a) Inkontaktbringen von Tyrosin-phosphoryliertem β-Catenin mit einer oder mehr potentiellen Verbindungen; und (b) Überwachen einer Veränderung des Phosphorylierungsgrads von Tyrosin-phosphoryliertem β-Catenin, um eine oder mehr Verbindungen zu identifizieren, welche die epitheliale Zellmigration modulieren.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die eine oder mehr Verbindungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Indolinonen, Quinazolinen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
  9. Verfahren zur Identifikation von einer oder mehr Verbindungen, welche die Aktivität von PTP LAR modulieren, das umfasst: (a) Inkontaktbringen von PTP LAR mit einer oder mehr potentiellen Verbindungen; (b) Messen der Aktivität von PTP LAR; und (c) Vergleichen der Aktivität von PTP LAR mit der Aktivität von PTP LAR, die nicht mit einer oder mehr potentieller Verbindungen in Kontakt gebracht wurde, um zu bestimmen, ob die Verbindung ein Agonist oder Antagonist von PTP LAR ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Aktivität die Phosphotyrosin-Phosphataseaktivität ist.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 9, das ferner die Zugabe eines natürlichen Bindungspartners zu Schritt (a) umfasst.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der natürliche Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus β-Catenin und Plakoglobin besteht.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die eine oder mehr Verbindungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Indolinonen, Quinazolinen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
  14. Verfahren zur Identifikation von einer oder mehr Verbindungen, welche die Aktivität von PTP LAR in Zellen modulieren, das umfasst: (a) Exprimieren der PTP LAR Aktivität in den Zellen; (b) Inkontaktbringen der Zellen mit einer oder mehr potentiellen Verbindungen; und (c) Überwachen einer Veränderung in der Zellmigration oder der Interaktion der PTP LAR und einem natürlichen Bindungspartner, um eine oder mehr Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von PTP LAR modulieren.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der natürliche Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus β-Catenin und Plakoglobin besteht.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die eine oder mehr Verbindungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Indolinonen, Quinazolinen, Quinoxalinen und Tyrphostinen besteht.
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