JP2002541214A - Ptp lar関連疾病の治療のための物および方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は,種々の上皮細胞移動疾病および疾患の治療に有用な,およびこれらの疾病および疾患の治療に有用な種々の産物の同定に有用な方法に関する。特に,PTP LARを用いる治療方法,ならびにPTP LAR活性を調節する化合物を同定する方法が開示される。
Description
【0001】発明の分野 本発明は,とりわけ,種々の上皮細胞移動関連疾病および疾患の治療に有用な
方法および産物,およびこれらの疾病および疾患の治療に有用な種々の産物の同
定に有用な方法に関する。
方法および産物,およびこれらの疾病および疾患の治療に有用な種々の産物の同
定に有用な方法に関する。
【0002】発明の背景 以下の発明の背景の記載は,本発明の理解を助けるために提供され,本発明に
対する先行技術であるかまたはそれを記載すると認めるものではない。
対する先行技術であるかまたはそれを記載すると認めるものではない。
【0003】 カドヘリンは,同種親和性のCa2+依存性細胞−細胞接着を媒介する膜貫通レ
セプターのファミリーである。上皮細胞においては,このファミリーのメンバー
,例えば,伝統的なE−,N−,およびP−カドヘリンは主として隣接する細胞
のアドヘレンスジャンクションに見いだされる(Yap,et al.(199
7)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.13,119−146.
)。β−カテニンおよびプラコグロビン(γ−カテニン)は,伝統的カドヘリン
の高度に保存された細胞質ドメインに互いに独占的様式で直接会合している(O
zawa,et al.(1989)EMBO J.8,1711−1718;
Hinck,efcal.(1994)J.Cell Biol.125,13
27−1340)。
セプターのファミリーである。上皮細胞においては,このファミリーのメンバー
,例えば,伝統的なE−,N−,およびP−カドヘリンは主として隣接する細胞
のアドヘレンスジャンクションに見いだされる(Yap,et al.(199
7)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.13,119−146.
)。β−カテニンおよびプラコグロビン(γ−カテニン)は,伝統的カドヘリン
の高度に保存された細胞質ドメインに互いに独占的様式で直接会合している(O
zawa,et al.(1989)EMBO J.8,1711−1718;
Hinck,efcal.(1994)J.Cell Biol.125,13
27−1340)。
【0004】 カドヘリン/カテニン−複合体は,α−カテニンを介して,直接(Rimm,
et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
2,8813−8817)またはアクチン結合蛋白質であるα−アクチニンまた
はビンクリンを介して間接的に(Knudsen,et al.(1995).
7.Cell Biol.130,67−77;Weiss,et al.(1
998)J.Cell Biol.141,755−64),アクチンフィラメ
ントネットワークに結合している。カドヘリン/カテニン−複合体と細胞骨格と
の会合は,密接な細胞−細胞相互作用に必須である。いずれにしても,カドヘリ
ン/カテニン媒介性細胞−細胞接触は,特に胚発生または創傷治癒の間にはアド
ヘレンスジャンクションが迅速に分解され再構築されなければならないため,高
度に動的でなければならない(Marrs,et al.(1996)Int.
Rev.Cytol.165,159−205)。
et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
2,8813−8817)またはアクチン結合蛋白質であるα−アクチニンまた
はビンクリンを介して間接的に(Knudsen,et al.(1995).
7.Cell Biol.130,67−77;Weiss,et al.(1
998)J.Cell Biol.141,755−64),アクチンフィラメ
ントネットワークに結合している。カドヘリン/カテニン−複合体と細胞骨格と
の会合は,密接な細胞−細胞相互作用に必須である。いずれにしても,カドヘリ
ン/カテニン媒介性細胞−細胞接触は,特に胚発生または創傷治癒の間にはアド
ヘレンスジャンクションが迅速に分解され再構築されなければならないため,高
度に動的でなければならない(Marrs,et al.(1996)Int.
Rev.Cytol.165,159−205)。
【0005】 カドヘリンのダウンレギュレーションにより近接する細胞が分離し,この現象
は中胚葉を形成する上皮−間葉遷移(EMT)における胚発生の間に観察される
(Huber,et al.(1996)Curr.Opin.Cell Bi
ol.8,685−691)。また,これは腫瘍細胞においても観察され,これ
らが身体全体に侵襲し広まることを可能とする(Becker,et al.(
1994)Cancer Res.54,3845−3852)。上皮−間葉遷
移の間,細胞は過渡的にその上皮特性を失い,繊維芽細胞状形態を獲得する(T
hiery,et al.(1985)Annu.Rev.Cell Biol
.1,91−113)。無傷のカドヘリン/カテニン複合体の重要性は,そのい
ずれかの成分のダウンレギュレーションによりアドヘレンスジャンクションの腫
瘍抑制作用が喪失し,これが腫瘍の侵襲および転移と相関しているという観察に
より強調される(Birchmeier,et al.(1995)Ciba
F.Symp.189,124−141)。
は中胚葉を形成する上皮−間葉遷移(EMT)における胚発生の間に観察される
(Huber,et al.(1996)Curr.Opin.Cell Bi
ol.8,685−691)。また,これは腫瘍細胞においても観察され,これ
らが身体全体に侵襲し広まることを可能とする(Becker,et al.(
1994)Cancer Res.54,3845−3852)。上皮−間葉遷
移の間,細胞は過渡的にその上皮特性を失い,繊維芽細胞状形態を獲得する(T
hiery,et al.(1985)Annu.Rev.Cell Biol
.1,91−113)。無傷のカドヘリン/カテニン複合体の重要性は,そのい
ずれかの成分のダウンレギュレーションによりアドヘレンスジャンクションの腫
瘍抑制作用が喪失し,これが腫瘍の侵襲および転移と相関しているという観察に
より強調される(Birchmeier,et al.(1995)Ciba
F.Symp.189,124−141)。
【0006】 さらに,アドヘレンスジャンクションの一体性は,チロシンリン酸化により動
的に制御されているようである。v−srcオンコジンのトランスフェクション
(Behrens,et al.(1993)J.Cell Biol.120
,757−766;Hamaguchi,et al.(1993)EMBO
J.12,307−314),または成長因子による処理(Shibamoto
,et al.(1994)Cell Adhes.Commun.1,295
−305;Fujii,et al.(1996)Exp.Cell Res.
223,50−62)は,不安定な細胞−細胞接着を引き起こす。細胞の移動お
よび蛋白質チロシンホスファターゼ(PTP)の阻害は,この不安定化効果を促
進する(Volberg,et al.(1992)EMBO J.11,17
33−1742)。可逆的チロシンリン酸化がカドヘリン−媒介性細胞−細胞接
着を制御するよう働くというモデルは,カドヘリン/カテニン−複合体が,レセ
プターチロシンキナーゼ(RTK)であるEGFレセプターおよびHER2/N
eu(Hoschuetzky,et al.(1994)J.Cell Bi
ol.127,1375−1380;Ochiai,et al.(1994)
Blochem.Biophys.Res.Comm.205,73−78),
ならびに膜貫通PTPのμ,κ,およびλ(Brady−Kalnay,et
al.(1995)J.Cell Biol.130,977−986;Fuc
hs,et al.(1996)J.Biol.Chem.271,16712
−17719;Cheng,et al.(1997)J.Biol.Chem
.272,7264−7277)と会合していることによりさらに支持される。
的に制御されているようである。v−srcオンコジンのトランスフェクション
(Behrens,et al.(1993)J.Cell Biol.120
,757−766;Hamaguchi,et al.(1993)EMBO
J.12,307−314),または成長因子による処理(Shibamoto
,et al.(1994)Cell Adhes.Commun.1,295
−305;Fujii,et al.(1996)Exp.Cell Res.
223,50−62)は,不安定な細胞−細胞接着を引き起こす。細胞の移動お
よび蛋白質チロシンホスファターゼ(PTP)の阻害は,この不安定化効果を促
進する(Volberg,et al.(1992)EMBO J.11,17
33−1742)。可逆的チロシンリン酸化がカドヘリン−媒介性細胞−細胞接
着を制御するよう働くというモデルは,カドヘリン/カテニン−複合体が,レセ
プターチロシンキナーゼ(RTK)であるEGFレセプターおよびHER2/N
eu(Hoschuetzky,et al.(1994)J.Cell Bi
ol.127,1375−1380;Ochiai,et al.(1994)
Blochem.Biophys.Res.Comm.205,73−78),
ならびに膜貫通PTPのμ,κ,およびλ(Brady−Kalnay,et
al.(1995)J.Cell Biol.130,977−986;Fuc
hs,et al.(1996)J.Biol.Chem.271,16712
−17719;Cheng,et al.(1997)J.Biol.Chem
.272,7264−7277)と会合していることによりさらに支持される。
【0007】 β−カテニンおよびプラコグロビンは,ショウジョウバエの蛋白質Armad
illoの哺乳動物相同体であり,その機能は発生の間の正常な体節パターン形
成に必須である(Riggleman,et al.(1989)Genes
Dev.3,96−113)。反復42アミノ酸配列モチーフの存在が,"ar
madilloファミリー"のメンバーを規定する(Peifer,et al
.(1994)Cell 76,789−791)。
illoの哺乳動物相同体であり,その機能は発生の間の正常な体節パターン形
成に必須である(Riggleman,et al.(1989)Genes
Dev.3,96−113)。反復42アミノ酸配列モチーフの存在が,"ar
madilloファミリー"のメンバーを規定する(Peifer,et al
.(1994)Cell 76,789−791)。
【0008】 ショウジョウバエおよびアフリカツメガエル系において得られたデータは,カ
ドヘリン−媒介性細胞接着に依存しない,β−カテニンの別の機能を示唆する。
これには,β−カテニンが細胞質中に蓄積した後,核に移動することが含まれる
。すなわち,フリーのβ−カテニンは,胚発生に必須の特定の遺伝子の転写的制
御に関与している(Miller,et al.(1996)Genes De
v.10,2527−2539)。β−カテニンのフリープールにおいて生ずる
シグナルには,Wingless/Wntのその膜貫通レセプター(Frizz
led)への結合,およびセリン/トレオニンキナーゼ(Zeste−whit
e3)(Shaggy)またはその脊椎動物相同体であるグリコゲンシンターゼ
キナーゼ3(GSK3;Moon,et al.(1997)Trends G
enet.13,256−258)の阻害が含まれる。
ドヘリン−媒介性細胞接着に依存しない,β−カテニンの別の機能を示唆する。
これには,β−カテニンが細胞質中に蓄積した後,核に移動することが含まれる
。すなわち,フリーのβ−カテニンは,胚発生に必須の特定の遺伝子の転写的制
御に関与している(Miller,et al.(1996)Genes De
v.10,2527−2539)。β−カテニンのフリープールにおいて生ずる
シグナルには,Wingless/Wntのその膜貫通レセプター(Frizz
led)への結合,およびセリン/トレオニンキナーゼ(Zeste−whit
e3)(Shaggy)またはその脊椎動物相同体であるグリコゲンシンターゼ
キナーゼ3(GSK3;Moon,et al.(1997)Trends G
enet.13,256−258)の阻害が含まれる。
【0009】 β−カテニンおよびプラコグロビンのさらに別の機能は,これらが腺腫様ポリ
ープ細胞(APC)腫瘍抑制剤蛋白質と会合することにより示される。この蛋白
質は,β−カテニンの細胞質エフェクターとして作用して,サイトゾルβ−カテ
ニンのGSK3と協調した蓄積を(Bullions,et al.(1996
)Curr.Opin.Oncol.10,61−7),およびアキシン/コン
ダクチン(Ikeda,et al.(1998)Embo J.17,137
1−1384;Behrens,et al.(1998)Science28
0,596−599;Sakanaka,et al.(1998)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 95,3020−3023)を,β−カ
テニンのユビキチン−依存性分解を誘導することにより負に制御すると考えられ
ている(Aberle,et al.(1997)EMBO J.16,379
7−3804)。
ープ細胞(APC)腫瘍抑制剤蛋白質と会合することにより示される。この蛋白
質は,β−カテニンの細胞質エフェクターとして作用して,サイトゾルβ−カテ
ニンのGSK3と協調した蓄積を(Bullions,et al.(1996
)Curr.Opin.Oncol.10,61−7),およびアキシン/コン
ダクチン(Ikeda,et al.(1998)Embo J.17,137
1−1384;Behrens,et al.(1998)Science28
0,596−599;Sakanaka,et al.(1998)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 95,3020−3023)を,β−カ
テニンのユビキチン−依存性分解を誘導することにより負に制御すると考えられ
ている(Aberle,et al.(1997)EMBO J.16,379
7−3804)。
【0010】発明の概要 上皮移動の間,β−カテニンは,フリーの,複合体を形成していない状態で,
チロシンリン酸化形態で,サイトゾル中に蓄積する。これに対し,コンフルエン
ト細胞においては,β−カテニンは,カドヘリン/カテニン腫瘍抑制システムの
必須の部分として,上皮細胞の一体性を維持する。すなわち,チロシンリン酸化
は,β−カテニンの,上皮細胞移動の間のシグナリング分子としての機能を制御
する。PTP LARは,上皮細胞移動の調節剤である。すなわち,そのホスフ
ァターゼの1つの機能は,細胞−細胞−接触および上皮細胞一体性の制御におけ
るものである。さらに,PTP LARの異所性発現は,ヌードマウスにおいて
腫瘍形成を阻害する。したがって,PTP LARの機能喪失は,腫瘍侵襲およ
び転移につながるかもしれない。
チロシンリン酸化形態で,サイトゾル中に蓄積する。これに対し,コンフルエン
ト細胞においては,β−カテニンは,カドヘリン/カテニン腫瘍抑制システムの
必須の部分として,上皮細胞の一体性を維持する。すなわち,チロシンリン酸化
は,β−カテニンの,上皮細胞移動の間のシグナリング分子としての機能を制御
する。PTP LARは,上皮細胞移動の調節剤である。すなわち,そのホスフ
ァターゼの1つの機能は,細胞−細胞−接触および上皮細胞一体性の制御におけ
るものである。さらに,PTP LARの異所性発現は,ヌードマウスにおいて
腫瘍形成を阻害する。したがって,PTP LARの機能喪失は,腫瘍侵襲およ
び転移につながるかもしれない。
【0011】 第1の観点においては,本発明は,疾病または疾患を予防または治療する方法
を特徴とし,該方法は,そのような治療を必要とする患者にPTP LARを含
む薬学的に許容しうる組成物を投与することを含む。好ましい態様においては,
疾病または疾患は,上皮細胞移動,β−カテニンのチロシンリン酸化の増加,お
よび/またはフリーのβ−カテニンのプールのレベルの増加により特徴づけられ
る。別の好ましい態様においては,疾病または疾患は,癌,転移,および異常な
創傷治癒からなる群より選択される。しかし,異常な上皮細胞移動を原因として
含む他の疾病もまた,本発明の方法により治療することが意図される。別の好ま
しい態様においては,患者は哺乳動物であり,好ましくはヒトである。
を特徴とし,該方法は,そのような治療を必要とする患者にPTP LARを含
む薬学的に許容しうる組成物を投与することを含む。好ましい態様においては,
疾病または疾患は,上皮細胞移動,β−カテニンのチロシンリン酸化の増加,お
よび/またはフリーのβ−カテニンのプールのレベルの増加により特徴づけられ
る。別の好ましい態様においては,疾病または疾患は,癌,転移,および異常な
創傷治癒からなる群より選択される。しかし,異常な上皮細胞移動を原因として
含む他の疾病もまた,本発明の方法により治療することが意図される。別の好ま
しい態様においては,患者は哺乳動物であり,好ましくはヒトである。
【0012】 "予防する"との用語は,生物が異常な状態に罹患するか発達させる可能性を減
少させることを表す。
少させることを表す。
【0013】 "治療する"との用語は,生物において治療効果を有し,異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【0014】 "治療効果"との用語は,異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する因子
の阻害または活性化を表す。治療効果は,異常な状態の1またはそれ以上の症状
をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して,治療効果は,以下の1または
それ以上を表すことができる:(a)細胞の増殖,成長,および/または分化の
増加;(b)細胞死の阻害(すなわち,遅延または停止);(c)変性の阻害;
(d)異常な状態に伴う1またはそれ以上の症状のある程度の緩和;および(e
)影響を受けた細胞の集団の機能の増強。特に,治療効果は,上皮細胞移動の予
防/阻害を含む。異常な状態に対して有効性を示す化合物は,本明細書に記載さ
れるようにして同定することができる。
の阻害または活性化を表す。治療効果は,異常な状態の1またはそれ以上の症状
をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して,治療効果は,以下の1または
それ以上を表すことができる:(a)細胞の増殖,成長,および/または分化の
増加;(b)細胞死の阻害(すなわち,遅延または停止);(c)変性の阻害;
(d)異常な状態に伴う1またはそれ以上の症状のある程度の緩和;および(e
)影響を受けた細胞の集団の機能の増強。特に,治療効果は,上皮細胞移動の予
防/阻害を含む。異常な状態に対して有効性を示す化合物は,本明細書に記載さ
れるようにして同定することができる。
【0015】 "異常な状態"との用語は,生物の細胞または組織における,その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は,例えば細胞増殖,細胞分化
,細胞生存または細胞移動に関連しうる。
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は,例えば細胞増殖,細胞分化
,細胞生存または細胞移動に関連しうる。
【0016】 異常な細胞増殖状態には,癌,転移,繊維性およびメサンギウム疾患,異常な
新脈管形成および脈管形成,創傷治癒,乾癬,真性糖尿病,および炎症が含まれ
る。
新脈管形成および脈管形成,創傷治癒,乾癬,真性糖尿病,および炎症が含まれ
る。
【0017】 異常な分化状態には,限定されないが,神経変性性疾患,遅い創傷治癒速度,
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【0018】 異常な細胞生存状態は,プログラムされた細胞死(アポトーシス)経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。
化されているかまたは排除されている状態に関連する。
【0019】 異常な細胞移動状態には,限定されないが,異常な創傷治癒,癌および転移が
含まれる。
含まれる。
【0020】 本発明に関連して,"異常な"との用語は,同じ生物または異なる生物からの正
常細胞と比較して,より低いかまたはより高い上皮細胞移動を表す。あるいは,
β−カテニンの過剰なまたは過小なチロシンリン酸化,または正常レベルより高
いかまたは低いβ−カテニンプールを表すことができる。これらの影響は,PT
P LARにより,または本発明の他の化合物により調節することができる。
常細胞と比較して,より低いかまたはより高い上皮細胞移動を表す。あるいは,
β−カテニンの過剰なまたは過小なチロシンリン酸化,または正常レベルより高
いかまたは低いβ−カテニンプールを表すことができる。これらの影響は,PT
P LARにより,または本発明の他の化合物により調節することができる。
【0021】 "投与する"との用語は,化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は,生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合,予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は,細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は,当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し,例えば,限定され
ないが,経口,非経口,経皮,注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については,当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し,例え
ば,限定されないが,細胞マイクロインジェクション手法,トランスフォーメー
ション手法,および担体手法が含まれる。
に関連する。異常な状態は,生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合,予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は,細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は,当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し,例えば,限定され
ないが,経口,非経口,経皮,注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については,当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し,例え
ば,限定されないが,細胞マイクロインジェクション手法,トランスフォーメー
ション手法,および担体手法が含まれる。
【0022】 患者は,好ましくは哺乳動物であり,限定されないが,マウス,ラット,ウサ
ギ,モルモットまたはヤギであり,より好ましくは,有尾または無尾サルであり
,最も好ましくはヒトである。
ギ,モルモットまたはヤギであり,より好ましくは,有尾または無尾サルであり
,最も好ましくはヒトである。
【0023】 本明細書において用いる場合,"PTP LAR"との用語は,図9に示される
アミノ酸配列,およびその機能的活性が維持されているそのフラグメントおよび
誘導体のいずれかを表す。PTP LARの好ましい機能的活性は,限定されな
いが,β−カテニンのチロシンリン酸化を阻害/妨害する能力,β−カテニンフ
リープールの増加を妨害する(または低下させる)能力,およびインビトロでま
たはインビボで上皮細胞移動を阻害/妨害する能力である。本発明に含まれるこ
とが企図される,機能ドメインを含む特定のフラグメントには,本明細書の実施
例および図11に記載されるものが含まれる。さらに,機能的活性を排除しない
他の修飾,置換および欠失も企図される。これらは,本明細書の発明の詳細な説
明においてさらに詳細に記載される。
アミノ酸配列,およびその機能的活性が維持されているそのフラグメントおよび
誘導体のいずれかを表す。PTP LARの好ましい機能的活性は,限定されな
いが,β−カテニンのチロシンリン酸化を阻害/妨害する能力,β−カテニンフ
リープールの増加を妨害する(または低下させる)能力,およびインビトロでま
たはインビボで上皮細胞移動を阻害/妨害する能力である。本発明に含まれるこ
とが企図される,機能ドメインを含む特定のフラグメントには,本明細書の実施
例および図11に記載されるものが含まれる。さらに,機能的活性を排除しない
他の修飾,置換および欠失も企図される。これらは,本明細書の発明の詳細な説
明においてさらに詳細に記載される。
【0024】 "PTP LAR"の定義に加えて,本明細書にはPTP LARをコードする
核酸配列が記載される(図10)。上述と同様に,PTP LARの機能的ドメ
インをコードするフラグメントもまた含まれ,PTP LARまたはその機能的
フラグメントをコードする核酸の誘導体も含まれる。これらは,本明細書の発明
の詳細な説明においてさらに詳細に記載される。
核酸配列が記載される(図10)。上述と同様に,PTP LARの機能的ドメ
インをコードするフラグメントもまた含まれ,PTP LARまたはその機能的
フラグメントをコードする核酸の誘導体も含まれる。これらは,本明細書の発明
の詳細な説明においてさらに詳細に記載される。
【0025】 本明細書において用いる場合,"薬学的に許容しうる"または"薬学的"との用語
は,治療化合物が治療効果を発揮することを妨害せず,許容しえない有害な副作
用を引き起こさない,医薬組成物の溶液または化合物を表す。薬学的に許容しう
る試薬の例は,The United Skates Pharmacopei
a The National Formulary, United Sta
tes Pharmacopeial Convention,Inc.,Ro
ckville,MD 1990 and FDA Inactive Ing
redient Guide 1990,1996(the Division
of Drug Information Resources)(図面を含
め,本明細書の一部としてここに引用する)に記載されている。許容しえない副
作用は疾病により様々である。一般に,疾病がより重篤になればなるほど,耐え
られる毒性効果が高くなる。種々の疾病についての許容しえない副作用は当該技
術分野において知られている。
は,治療化合物が治療効果を発揮することを妨害せず,許容しえない有害な副作
用を引き起こさない,医薬組成物の溶液または化合物を表す。薬学的に許容しう
る試薬の例は,The United Skates Pharmacopei
a The National Formulary, United Sta
tes Pharmacopeial Convention,Inc.,Ro
ckville,MD 1990 and FDA Inactive Ing
redient Guide 1990,1996(the Division
of Drug Information Resources)(図面を含
め,本明細書の一部としてここに引用する)に記載されている。許容しえない副
作用は疾病により様々である。一般に,疾病がより重篤になればなるほど,耐え
られる毒性効果が高くなる。種々の疾病についての許容しえない副作用は当該技
術分野において知られている。
【0026】 "生理学的に許容しうる"との用語は,生物に有意な刺激を引き起こさず,好ま
しくは化合物の生物学的活性および特性を排除しない担体または希釈剤を規定す
る。
しくは化合物の生物学的活性および特性を排除しない担体または希釈剤を規定す
る。
【0027】 "担体"との用語は,化合物の細胞または組織への取り込みを容易にする化学化
合物を規定する。例えば,ジメチルスルホキシド(DMSO)は,多くの有機化
合物を生物の細胞または組織に取り込ませることを容易にするため,慣用的に用
いられている担体である。
合物を規定する。例えば,ジメチルスルホキシド(DMSO)は,多くの有機化
合物を生物の細胞または組織に取り込ませることを容易にするため,慣用的に用
いられている担体である。
【0028】 "希釈剤"との用語は,目的とする化合物を溶解し,ならびに化合物の生物学的
に活性な形を安定化させる,水中(または他の溶媒)に希釈された化学化合物を
規定する。当該技術分野においては,緩衝化溶液中に溶解された塩が希釈剤とし
て用いられる。1つの慣用的に用いられている緩衝化溶液は,リン酸緩衝化食塩
水である。これは,これがヒトの血液の塩条件を模倣するためである。緩衝化塩
は,低濃度で溶液のpHを調節しうるため,緩衝化希釈剤は化合物の生物学的活
性をほとんど変更させない。
に活性な形を安定化させる,水中(または他の溶媒)に希釈された化学化合物を
規定する。当該技術分野においては,緩衝化溶液中に溶解された塩が希釈剤とし
て用いられる。1つの慣用的に用いられている緩衝化溶液は,リン酸緩衝化食塩
水である。これは,これがヒトの血液の塩条件を模倣するためである。緩衝化塩
は,低濃度で溶液のpHを調節しうるため,緩衝化希釈剤は化合物の生物学的活
性をほとんど変更させない。
【0029】 本明細書において用いる場合,"溶媒"との用語は,本発明の化合物の溶解性を
促進する化学化合物を表す。溶媒の例には,限定されないが,薬学的に許容しう
るアルコール,例えばエタノールおよびベンジルアルコール;ポリオキシヒドロ
カルビル化合物,例えばポリ(エチレングリコール);薬学的に許容しうる界面
活性剤,例えばCREMOPHOR(登録商標)EL;ポリグリコール化脂質,
例えばGELUCIRE(登録商標)およびLABRASOL(登録商標);お
よび薬学的に許容しうる油,例えばMiglyol812が含まれる。
促進する化学化合物を表す。溶媒の例には,限定されないが,薬学的に許容しう
るアルコール,例えばエタノールおよびベンジルアルコール;ポリオキシヒドロ
カルビル化合物,例えばポリ(エチレングリコール);薬学的に許容しうる界面
活性剤,例えばCREMOPHOR(登録商標)EL;ポリグリコール化脂質,
例えばGELUCIRE(登録商標)およびLABRASOL(登録商標);お
よび薬学的に許容しうる油,例えばMiglyol812が含まれる。
【0030】 本明細書において用いる場合,"薬学的に許容しうるアルコール"との用語は,
ほぼ室温(約20℃)で液体であるアルコールを表す。これには,ポリプロピレ
ングリコール,エタノール,2−(2−エトキシエトキシ)エタノール(TRA
NSCUTOL(登録商標),Gattefosse,Westwood,NJ
07675),ベンジルアルコール,およびグリセロールが含まれる。
ほぼ室温(約20℃)で液体であるアルコールを表す。これには,ポリプロピレ
ングリコール,エタノール,2−(2−エトキシエトキシ)エタノール(TRA
NSCUTOL(登録商標),Gattefosse,Westwood,NJ
07675),ベンジルアルコール,およびグリセロールが含まれる。
【0031】 本明細書において用いる場合,"ポリオキシヒドロカルビル化合物"との用語は
,水溶性炭水化物,例えばグルコース,ショ糖,マルトトリオース等;水溶性炭
水化物誘導体,例えばグルコン酸およびマンニトール,およびオリゴ糖;および
水溶性ポリマー,例えばポリビニルピロリドン,ポリ(ビニルアルコール),お
よび特にポリエーテル類,例えばポリ(エチレングリコール)または他の水溶性
混合オキシアルキレンポリマーを含む他のポリオキシアルキレン,および高分子
型エチレングリコールを表す。ポリオキシヒドロカルビル化合物は好ましくは2
以上の炭素,酸素および水素原子を含むが,ある分子,例えばポリ(エチレンイ
ミン)もまた含まれる。
,水溶性炭水化物,例えばグルコース,ショ糖,マルトトリオース等;水溶性炭
水化物誘導体,例えばグルコン酸およびマンニトール,およびオリゴ糖;および
水溶性ポリマー,例えばポリビニルピロリドン,ポリ(ビニルアルコール),お
よび特にポリエーテル類,例えばポリ(エチレングリコール)または他の水溶性
混合オキシアルキレンポリマーを含む他のポリオキシアルキレン,および高分子
型エチレングリコールを表す。ポリオキシヒドロカルビル化合物は好ましくは2
以上の炭素,酸素および水素原子を含むが,ある分子,例えばポリ(エチレンイ
ミン)もまた含まれる。
【0032】 可溶化ポリオキシヒドロカルビル成分の特に好ましい群は,ポリ(エチレング
リコール)(PEG)およびPEG誘導体,例えばPEGモノメチルエーテルが
含まれる。他の適当なPEG誘導体には,PEG−シリコン誘導化エーテルが含
まれる。これらのポリマーの多くは,種々の分子量のものが市販されている。他
のものは,アミノ−PEG成分をハロアルキルシリルまたはシラン成分とカップ
リングさせる等により,市販の材料から慣用的に製造することができる。
リコール)(PEG)およびPEG誘導体,例えばPEGモノメチルエーテルが
含まれる。他の適当なPEG誘導体には,PEG−シリコン誘導化エーテルが含
まれる。これらのポリマーの多くは,種々の分子量のものが市販されている。他
のものは,アミノ−PEG成分をハロアルキルシリルまたはシラン成分とカップ
リングさせる等により,市販の材料から慣用的に製造することができる。
【0033】 適当なPEGは,約200g/mol−約20,000g/molまたはそれ
以上の種々の分子量のものでありうる。より好ましくは,200g/mol−5
,000g/mol,さらにより好ましくは,250g/mol−1,000g
/mol,最も好ましくは,250g/mol−500g/molである。特定
の分子量の選択は,選択される特定の化合物,およびその分子量および疎水性の
程度,ならびにその処方を用いる特定の用途に依存するであろう。
以上の種々の分子量のものでありうる。より好ましくは,200g/mol−5
,000g/mol,さらにより好ましくは,250g/mol−1,000g
/mol,最も好ましくは,250g/mol−500g/molである。特定
の分子量の選択は,選択される特定の化合物,およびその分子量および疎水性の
程度,ならびにその処方を用いる特定の用途に依存するであろう。
【0034】 本明細書において用いる場合,"薬学的に許容しうる界面活性剤"との用語は,
必要な場合に本発明の化合物を水性溶液中に溶解させることができる化合物を表
す。好ましくは,非経口処方のためには,界面活性剤は非イオン性界面活性剤で
ある。薬学的に許容しうる界面活性剤の例には,POLYSORBATE80お
よび他のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル,モノオレイン酸グリセ
リル,ポリビニルアルコール,エチレンオキシドコポリマー,例えばPLURO
NIC(登録商標)(ポリエーテル)およびTETRONIC(登録商標)(B
ASF),ポリオール成分,およびソルビタンエステルが含まれる。好ましくは
,エトキシル化ひまし油,例えばCREMOPHOR(登録商標)ELがある種
の化合物の処方用に用いられる。
必要な場合に本発明の化合物を水性溶液中に溶解させることができる化合物を表
す。好ましくは,非経口処方のためには,界面活性剤は非イオン性界面活性剤で
ある。薬学的に許容しうる界面活性剤の例には,POLYSORBATE80お
よび他のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル,モノオレイン酸グリセ
リル,ポリビニルアルコール,エチレンオキシドコポリマー,例えばPLURO
NIC(登録商標)(ポリエーテル)およびTETRONIC(登録商標)(B
ASF),ポリオール成分,およびソルビタンエステルが含まれる。好ましくは
,エトキシル化ひまし油,例えばCREMOPHOR(登録商標)ELがある種
の化合物の処方用に用いられる。
【0035】 本明細書において用いる場合,"エトキシル化ひまし油"との用語は,少なくと
も1つの酸素含有成分で修飾したひまし油を表す。特に,この用語は,少なくと
も1つのエトキシル成分を含むひまし油を表す。
も1つの酸素含有成分で修飾したひまし油を表す。特に,この用語は,少なくと
も1つのエトキシル成分を含むひまし油を表す。
【0036】 さらに,本明細書において経口処方に関して用いる場合,"薬学的に許容しう
る界面活性剤"との用語は,薬学的に許容しうる非イオン性界面活性剤(例えば
,ポリオキシエチレンプロピレングリコール,例えばPOLOXAMER(登録
商標)68(BASF Corp.)またはポリオキシエチレン(20)ソルビ
タンモノオレイン酸(TWEEN(登録商標)80),ポリオキシエチレン(2
0)ソルビタンモノステアリン酸(TWEEN(登録商標)60),ポリオキシ
エチレン(20)ソルビタンモノパルミチン酸(TWEEN(登録商標)40)
,ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウリル酸(TWEEN(登録商
標)20)等)のモノ脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンひまし油誘導体(例
えば,ポリオキシエチレングリセロール−トリリシノレートまたはポリオキシ3
5ひまし油(CREMOPHOR(登録商標)EL,BASF Corp.),
ポリオキシエチレングリセロールオキシステアリン酸(CREMOPHOR(登
録商標)RH40(ポリエチレングリコール40水素化ひまし油)またはCRE
MOPHOR(登録商標)RH60(ポリエチレングリコール60水素化ひまし
油),BASF Corp.)等);または薬学的に許容しうるアニオン性界面
活性剤を含む。
る界面活性剤"との用語は,薬学的に許容しうる非イオン性界面活性剤(例えば
,ポリオキシエチレンプロピレングリコール,例えばPOLOXAMER(登録
商標)68(BASF Corp.)またはポリオキシエチレン(20)ソルビ
タンモノオレイン酸(TWEEN(登録商標)80),ポリオキシエチレン(2
0)ソルビタンモノステアリン酸(TWEEN(登録商標)60),ポリオキシ
エチレン(20)ソルビタンモノパルミチン酸(TWEEN(登録商標)40)
,ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウリル酸(TWEEN(登録商
標)20)等)のモノ脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンひまし油誘導体(例
えば,ポリオキシエチレングリセロール−トリリシノレートまたはポリオキシ3
5ひまし油(CREMOPHOR(登録商標)EL,BASF Corp.),
ポリオキシエチレングリセロールオキシステアリン酸(CREMOPHOR(登
録商標)RH40(ポリエチレングリコール40水素化ひまし油)またはCRE
MOPHOR(登録商標)RH60(ポリエチレングリコール60水素化ひまし
油),BASF Corp.)等);または薬学的に許容しうるアニオン性界面
活性剤を含む。
【0037】 本明細書において用いる場合,"ポリグリコール化脂質"との用語は,植物油を
200g/mol−2,000g/molのPEGを用いて部分的にアルコール
分解するか,またはPEG200g/mol−2,000g/molおよびグリ
セロールを用いて脂肪酸をエステル化することにより形成される,モノグリセリ
ド,ジグリセリド,またはトリグリセリドおよびポリエチレングリコールモノエ
ステルおよびジエステルの混合物を表す。好ましくは,これらには,GELUC
IRE(登録商標)35/10,GELUCIRE(登録商標)44/14,G
ELUCIRE(登録商標)46/07,GELUCIRE(登録商標)50/
13,GELUCIRE(登録商標)53/10,およびLABRASOL(登
録商標)が含まれる。
200g/mol−2,000g/molのPEGを用いて部分的にアルコール
分解するか,またはPEG200g/mol−2,000g/molおよびグリ
セロールを用いて脂肪酸をエステル化することにより形成される,モノグリセリ
ド,ジグリセリド,またはトリグリセリドおよびポリエチレングリコールモノエ
ステルおよびジエステルの混合物を表す。好ましくは,これらには,GELUC
IRE(登録商標)35/10,GELUCIRE(登録商標)44/14,G
ELUCIRE(登録商標)46/07,GELUCIRE(登録商標)50/
13,GELUCIRE(登録商標)53/10,およびLABRASOL(登
録商標)が含まれる。
【0038】 本明細書において用いる場合,"薬学的に許容しうる油"との用語は,鉱物油ま
たは植物油(紅花油,ピーナッツ油,およびオリーブ油を含む),分画ヤシ油,
プロピレングリコールモノラウリル酸,カプリン酸の混合トリグリセリドおよび
カプリン酸等を含む)を表す。本発明の好ましい態様は,鉱物油,植物油,分画
ヤシ油,カプリン酸の混合トリグリセリドおよびカプリン酸を特徴とする。本発
明の非常に好ましい態様は,Miglyol(登録商標)812(HulsAm
erica,USAから入手可能)を特徴とする。
たは植物油(紅花油,ピーナッツ油,およびオリーブ油を含む),分画ヤシ油,
プロピレングリコールモノラウリル酸,カプリン酸の混合トリグリセリドおよび
カプリン酸等を含む)を表す。本発明の好ましい態様は,鉱物油,植物油,分画
ヤシ油,カプリン酸の混合トリグリセリドおよびカプリン酸を特徴とする。本発
明の非常に好ましい態様は,Miglyol(登録商標)812(HulsAm
erica,USAから入手可能)を特徴とする。
【0039】 疾病または疾患を治療または要望する方法の好ましい態様においては,PTP LARは組換え蛋白質,組換え遺伝子,または組換え細胞の一部として提供さ
れる。これを行う方法は,当業者にはよく知られており,その例は,本明細書の
発明の詳細な説明においてさらに議論される。
れる。これを行う方法は,当業者にはよく知られており,その例は,本明細書の
発明の詳細な説明においてさらに議論される。
【0040】 本明細書において用いる場合,"組換え"との用語は,当該技術分野において標
準的な実験室において遺伝子,蛋白質,および細胞を操作することを表す。得ら
れる遺伝子,蛋白質,または細胞は,その自然の宿主における遺伝子,蛋白質,
または細胞と同一であってもよく,操作の簡単のためにある方法で修飾されてい
てもよく,または適当なベクター中に置かれていてもよく,またはより簡単に検
出しうるようにされていてもよく,または容易に分解しうるようにされていても
よい。本発明のある観点は,インビトロおよびインビボで遺伝子治療の用途のた
めに操作されたPTP LARの組換えフラグメントを含む。
準的な実験室において遺伝子,蛋白質,および細胞を操作することを表す。得ら
れる遺伝子,蛋白質,または細胞は,その自然の宿主における遺伝子,蛋白質,
または細胞と同一であってもよく,操作の簡単のためにある方法で修飾されてい
てもよく,または適当なベクター中に置かれていてもよく,またはより簡単に検
出しうるようにされていてもよく,または容易に分解しうるようにされていても
よい。本発明のある観点は,インビトロおよびインビボで遺伝子治療の用途のた
めに操作されたPTP LARの組換えフラグメントを含む。
【0041】 疾病または疾患を治療または予防する方法の別の好ましい態様においては,P
TP LARは,上皮細胞移動をインビトロでまたはインビボで調節し,好まし
くは上皮細胞移動をインビボでまたはインビトロで阻害する。PTP LARは
また(あるいはその代わりに),β−カテニンのチロシンリン酸化をインビトロ
でまたはインビボで調節し,好ましくはβ−カテニンのチロシンリン酸化をイン
ビトロでまたはインビボで阻害する。最後に,PTP LARはまた(あるいは
その代わりに),β−カテニンのフリープールをインビトロでまたはインビボで
調節し,好ましくは,β−カテニンのフリープールのレベルをインビトロでまた
はインビボで低下させる。
TP LARは,上皮細胞移動をインビトロでまたはインビボで調節し,好まし
くは上皮細胞移動をインビボでまたはインビトロで阻害する。PTP LARは
また(あるいはその代わりに),β−カテニンのチロシンリン酸化をインビトロ
でまたはインビボで調節し,好ましくはβ−カテニンのチロシンリン酸化をイン
ビトロでまたはインビボで阻害する。最後に,PTP LARはまた(あるいは
その代わりに),β−カテニンのフリープールをインビトロでまたはインビボで
調節し,好ましくは,β−カテニンのフリープールのレベルをインビトロでまた
はインビボで低下させる。
【0042】 "調節する"との用語は,PTP LARまたは化合物が,上皮細胞移動,β−
カテニンのチロシンリン酸化,またはβ−カテニンフリープールのレベルを変更
する能力を表す。調節剤は,好ましくはこれらの機能を阻害するが,ある状況に
おいてはこれらの機能を増加させることが好ましいかもしれない。
カテニンのチロシンリン酸化,またはβ−カテニンフリープールのレベルを変更
する能力を表す。調節剤は,好ましくはこれらの機能を阻害するが,ある状況に
おいてはこれらの機能を増加させることが好ましいかもしれない。
【0043】 "調節する"との用語はまた,PTP LARと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を増加または減少させることを表す。調節剤は,好まし
くは,PTP LARと天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成
される確率を増加させ,またはPTP LARと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を減少させる。"複合体"との用語は,互いに結合した少
なくとも2つの分子の組み合わせを表す。
複合体が形成される確率を増加または減少させることを表す。調節剤は,好まし
くは,PTP LARと天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成
される確率を増加させ,またはPTP LARと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を減少させる。"複合体"との用語は,互いに結合した少
なくとも2つの分子の組み合わせを表す。
【0044】 "天然の結合パートナー"との用語は,PTP LARに結合するポリペプチド
,脂質,小分子,または核酸を表す。PTP LARと天然の結合パートナーと
の間の相互作用の変化は,相互作用が形成される確率の増加または減少,または
PTP LAR/天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少,ならび
にβ−カテニンのチロシンリン酸化,またはβ−カテニンのフリープールのレベ
ルの変化として現れることができる。
,脂質,小分子,または核酸を表す。PTP LARと天然の結合パートナーと
の間の相互作用の変化は,相互作用が形成される確率の増加または減少,または
PTP LAR/天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少,ならび
にβ−カテニンのチロシンリン酸化,またはβ−カテニンのフリープールのレベ
ルの変化として現れることができる。
【0045】 第2の観点においては,本発明は,試料中でPTP LARを疾病または疾患
の予知の道具として検出する方法を特徴とする。該方法は,(a)試料を,ハイ
ブリダイゼーションアッセイ条件下でPTP LARの核酸標的領域とハイブリ
ダイズする核酸プローブと接触させ,ここでプローブはPTP LARをコード
する核酸配列,そのフラグメント,または前記配列およびフラグメントの相補体
を含み;そして(b)プローブ:標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病ま
たは疾患の予知の指標として検出することを含む。好ましい態様においては,疾
病または疾患は,異常な創傷治癒,癌,および転移からなる群より選択される。
の予知の道具として検出する方法を特徴とする。該方法は,(a)試料を,ハイ
ブリダイゼーションアッセイ条件下でPTP LARの核酸標的領域とハイブリ
ダイズする核酸プローブと接触させ,ここでプローブはPTP LARをコード
する核酸配列,そのフラグメント,または前記配列およびフラグメントの相補体
を含み;そして(b)プローブ:標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病ま
たは疾患の予知の指標として検出することを含む。好ましい態様においては,疾
病または疾患は,異常な創傷治癒,癌,および転移からなる群より選択される。
【0046】 試料中のPTP LARを疾病または疾患の予知の道具として検出する別の方
法は,(a)試料中のPTP LARをコードする核酸標的領域をPTP LA
Rをコードする対照核酸標的領域と比較し;そして(b)前記標的領域と前記対
照標的領域との間の配列または量の相違を,前記疾病または疾患の前記予知の指
標として検出することを含む。好ましくは,疾病または疾患は,異常な創傷治癒
,癌,および転移からなる群より選択される。
法は,(a)試料中のPTP LARをコードする核酸標的領域をPTP LA
Rをコードする対照核酸標的領域と比較し;そして(b)前記標的領域と前記対
照標的領域との間の配列または量の相違を,前記疾病または疾患の前記予知の指
標として検出することを含む。好ましくは,疾病または疾患は,異常な創傷治癒
,癌,および転移からなる群より選択される。
【0047】 試料中のPTP LARを疾病または疾患の予知の道具として検出する別の方
法は,(a)試料をPTP LARとハイブリダイズする抗体と接触させ;そし
て(b)抗体:PTP LAR複合体の存在または量を疾病または疾患の予知の
指標として検出することを含む。好ましくは,抗体は,ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であり,あるいは,抗体はハイブリドーマ由来である。好
ましくは,疾病または疾患は,異常な創傷治癒,癌,および転移からなる群より
選択される。
法は,(a)試料をPTP LARとハイブリダイズする抗体と接触させ;そし
て(b)抗体:PTP LAR複合体の存在または量を疾病または疾患の予知の
指標として検出することを含む。好ましくは,抗体は,ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であり,あるいは,抗体はハイブリドーマ由来である。好
ましくは,疾病または疾患は,異常な創傷治癒,癌,および転移からなる群より
選択される。
【0048】 本明細書において用いる場合,"予知"との用語は,例えば,治癒の見込み,治
療に反応する見込み,または転移の見込みを表す。すなわち,これは,疾病の進
行,および疾病の治癒,および疾病治療の結果に関連する。
療に反応する見込み,または転移の見込みを表す。すなわち,これは,疾病の進
行,および疾病の治癒,および疾病治療の結果に関連する。
【0049】 本明細書において用いられる場合,"接触させる"との用語は,試験化合物を含
む溶液をこの方法の細胞または蛋白質を浸す液体培地と混合することを表す。化
合物を含む溶液はまた,試験化合物または化合物のこの方法の細胞内への取り込
みを容易にする他の成分,例えばジメチルスルホキシド(DMSO)を含んでい
てもよい。本発明の化合物を含む溶液は,輸送装置,例えばピペットに基づく装
置またはシリンジに基づく装置を用いることにより,細胞を浸す培地に加えるこ
とができる。
む溶液をこの方法の細胞または蛋白質を浸す液体培地と混合することを表す。化
合物を含む溶液はまた,試験化合物または化合物のこの方法の細胞内への取り込
みを容易にする他の成分,例えばジメチルスルホキシド(DMSO)を含んでい
てもよい。本発明の化合物を含む溶液は,輸送装置,例えばピペットに基づく装
置またはシリンジに基づく装置を用いることにより,細胞を浸す培地に加えるこ
とができる。
【0050】 ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは,少なくとも以下の程度のストリン
ジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する:50%ホルムアミ
ド,5XSSC,50mM NaH2PO4,pH6.8,0.5%SDS,0.
1mg/mL超音波処理サケ精子DNA,および5Xデンハルト溶液中で42℃
で一夜ハイブリダイゼーション,2XSSC,0.1%SDSで45℃で洗浄;
および0.2XSSC,0.1%SDSで45℃で洗浄。最もストリンジェント
なハイブリダイゼーションアッセイ条件のいくつかにおいては,第2の洗浄は,
0.1XSSCを用いて70℃までの温度で行うことができる(Berger
et al.(1987)Guide to Molecular Cloni
ng Techniques,pg 421,(図面および表を含め,本明細書
の一部としてここに引用する)。しかし,他の用途は,これらの条件の組の間の
条件を使用とすることを必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーショ
ンを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく知られており,い
くつかの因子,例えば,限定されないが,ハイブリダイズすべき配列および試験
すべき試料に基づく。
ジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する:50%ホルムアミ
ド,5XSSC,50mM NaH2PO4,pH6.8,0.5%SDS,0.
1mg/mL超音波処理サケ精子DNA,および5Xデンハルト溶液中で42℃
で一夜ハイブリダイゼーション,2XSSC,0.1%SDSで45℃で洗浄;
および0.2XSSC,0.1%SDSで45℃で洗浄。最もストリンジェント
なハイブリダイゼーションアッセイ条件のいくつかにおいては,第2の洗浄は,
0.1XSSCを用いて70℃までの温度で行うことができる(Berger
et al.(1987)Guide to Molecular Cloni
ng Techniques,pg 421,(図面および表を含め,本明細書
の一部としてここに引用する)。しかし,他の用途は,これらの条件の組の間の
条件を使用とすることを必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーショ
ンを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく知られており,い
くつかの因子,例えば,限定されないが,ハイブリダイズすべき配列および試験
すべき試料に基づく。
【0051】 "核酸標的領域"とは,PTP LAR遺伝子のフラグメントを表し,好ましく
は,プローブがPTP LAR遺伝子のみにハイブリダイズするようにユニーク
である。ユニークとは,配列が他の既知の蛋白質のいずれにも存在しないことを
意味する。これを行う手法は当業者にはよく知られている。"対照"核酸標的領域
とは,試験している試料中のPTP LAR遺伝子中のものと比較した,既知の
PTP LAR遺伝子中の核酸の同一の領域を表す(図10)。ある疾病状態に
おいては,試料からのPTP LAR遺伝子の配列が対照配列とは異なることが
予測される。あるいは,試料中のPTP LAR遺伝子の量が,細胞または組織
の正常な試料において見いだされるより多いかまたは少ないかもしれない。
は,プローブがPTP LAR遺伝子のみにハイブリダイズするようにユニーク
である。ユニークとは,配列が他の既知の蛋白質のいずれにも存在しないことを
意味する。これを行う手法は当業者にはよく知られている。"対照"核酸標的領域
とは,試験している試料中のPTP LAR遺伝子中のものと比較した,既知の
PTP LAR遺伝子中の核酸の同一の領域を表す(図10)。ある疾病状態に
おいては,試料からのPTP LAR遺伝子の配列が対照配列とは異なることが
予測される。あるいは,試料中のPTP LAR遺伝子の量が,細胞または組織
の正常な試料において見いだされるより多いかまたは少ないかもしれない。
【0052】 本明細書において用いる場合,"検出する"との用語は,蛋白質,抗体,または
核酸を検出する任意の方法を含む。このような方法は当該技術分野においてよく
知られており,多くが本明細書において議論される。特に,これらには,ELI
SA,PCR,放射性標識等の方法が含まれる。
核酸を検出する任意の方法を含む。このような方法は当該技術分野においてよく
知られており,多くが本明細書において議論される。特に,これらには,ELI
SA,PCR,放射性標識等の方法が含まれる。
【0053】 第3の観点においては,本発明は,上皮細胞移動を調節する1またはそれ以上
の化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は,(a)チロシンリン酸化β−
カテニンを1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ;(b)前記チロ
シンリン酸化β−カテニンのリン酸化レベルの変化をモニターして,前記上皮細
胞移動を調節する前記1またはそれ以上の化合物を同定する,の各工程を含む。
好ましい態様においては,1またはそれ以上の化合物は,インドリノン,キナゾ
リン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される。
の化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は,(a)チロシンリン酸化β−
カテニンを1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ;(b)前記チロ
シンリン酸化β−カテニンのリン酸化レベルの変化をモニターして,前記上皮細
胞移動を調節する前記1またはそれ以上の化合物を同定する,の各工程を含む。
好ましい態様においては,1またはそれ以上の化合物は,インドリノン,キナゾ
リン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される。
【0054】 PTP LAR活性を調節する1またはそれ以上の化合物を同定する別の方法
は,(a)PTP LARを1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ
;(b)PTP LARの活性を測定し;そして(c)1またはそれ以上の可能
性のある化合物が前記PTP LARの活性を調節するか否かを判定する,こと
を含む。好ましい態様においては,活性はホスホチロシンホスファターゼ活性で
ある。別の好ましい態様においては,該方法はさらに,天然の結合パートナーを
工程(a)に加えることを含む。好ましくは,天然の結合パートナーは,β−カ
テニンおよびプラコグロビンからなる群より選択され,1またはそれ以上の化合
物は,インドリノン,キナゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる
群より選択される。
は,(a)PTP LARを1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ
;(b)PTP LARの活性を測定し;そして(c)1またはそれ以上の可能
性のある化合物が前記PTP LARの活性を調節するか否かを判定する,こと
を含む。好ましい態様においては,活性はホスホチロシンホスファターゼ活性で
ある。別の好ましい態様においては,該方法はさらに,天然の結合パートナーを
工程(a)に加えることを含む。好ましくは,天然の結合パートナーは,β−カ
テニンおよびプラコグロビンからなる群より選択され,1またはそれ以上の化合
物は,インドリノン,キナゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる
群より選択される。
【0055】 細胞においてPTP LAR活性を調節する1またはそれ以上の化合物を同定
するまた別の方法は,(a)PTP LARを前記細胞中で発現させ;(b)前
記細胞を1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ;そして(c)細胞
移動または前記PTP LARと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化
をモニターして,前記PTP LAR活性を調節する前記1またはそれ以上の化
合物を同定する,ことを含む。好ましくは,天然の結合パートナーは,β−カテ
ニン,およびプラコグロビンからなる群より選択され,1またはそれ以上の化合
物は,インドリノン,キナゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる
群より選択される。
するまた別の方法は,(a)PTP LARを前記細胞中で発現させ;(b)前
記細胞を1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ;そして(c)細胞
移動または前記PTP LARと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化
をモニターして,前記PTP LAR活性を調節する前記1またはそれ以上の化
合物を同定する,ことを含む。好ましくは,天然の結合パートナーは,β−カテ
ニン,およびプラコグロビンからなる群より選択され,1またはそれ以上の化合
物は,インドリノン,キナゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる
群より選択される。
【0056】 "化合物"との用語は,好ましくは,非ペプチド有機分子を表し,最も好ましく
は,非ペプチド合成有機分子を表す。"非ペプチド分子"との用語は,アミノ酸の
ポリマーではない化合物を表す。非ペプチド分子は,好ましくは,生理学的条件
で加水分解する化学成分,例えばペプチド模倣体を含まない。化合物の例は,本
明細書の発明の説明中に含まれる。好ましくは,そのような分子は,3,000
未満の分子量を有する。
は,非ペプチド合成有機分子を表す。"非ペプチド分子"との用語は,アミノ酸の
ポリマーではない化合物を表す。非ペプチド分子は,好ましくは,生理学的条件
で加水分解する化学成分,例えばペプチド模倣体を含まない。化合物の例は,本
明細書の発明の説明中に含まれる。好ましくは,そのような分子は,3,000
未満の分子量を有する。
【0057】 本明細書において用いる場合,"発現する"との用語は,好ましくは,細胞内に
おける核酸ベクターからのPTP LARの生成を表す。本明細書に記載される
ような,当該技術分野においてよく知られる技術を用いて核酸ベクターを細胞に
トランスフェクトする。"より高いレベルで"とは,PTP LARが通常は全く
発現されないか,または通常はその発現が起こるがそのレベルがより高いことを
示すことができる。発現のレベル(および比較)は,当該技術分野においてよく
知られる方法により決定することができる(および本明細書において例が記載さ
れる)。より高い発現は,好ましくは2倍,より好ましくは5倍またはそれ以上
である。より低い発現はその逆である。
おける核酸ベクターからのPTP LARの生成を表す。本明細書に記載される
ような,当該技術分野においてよく知られる技術を用いて核酸ベクターを細胞に
トランスフェクトする。"より高いレベルで"とは,PTP LARが通常は全く
発現されないか,または通常はその発現が起こるがそのレベルがより高いことを
示すことができる。発現のレベル(および比較)は,当該技術分野においてよく
知られる方法により決定することができる(および本明細書において例が記載さ
れる)。より高い発現は,好ましくは2倍,より好ましくは5倍またはそれ以上
である。より低い発現はその逆である。
【0058】 "核酸ベクター"との用語は,細胞にトランスフェクトすることができ,細胞ゲ
ノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を
表す。環状二本鎖核酸分子は,制限酵素で処理することにより切断し,直鎖状に
することができる。核酸ベクターの分類,制限酵素,および制限酵素により切断
されるヌクレオチド配列の知識は,当業者には容易に入手可能である。キメラレ
セプターをコードする核酸分子は,ベクターを制限酵素で切断し,2つの断片を
一緒にライゲーションすることにより,ベクター中に挿入することができる。
ノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を
表す。環状二本鎖核酸分子は,制限酵素で処理することにより切断し,直鎖状に
することができる。核酸ベクターの分類,制限酵素,および制限酵素により切断
されるヌクレオチド配列の知識は,当業者には容易に入手可能である。キメラレ
セプターをコードする核酸分子は,ベクターを制限酵素で切断し,2つの断片を
一緒にライゲーションすることにより,ベクター中に挿入することができる。
【0059】 "トランスフェクトする"との用語は,核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞
中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には,種々の手法が含まれ,
例えば,細胞を高濃度の塩,電界,界面活性剤,またはDMSOで処理すること
により,細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること,また
は種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には,種々の手法が含まれ,
例えば,細胞を高濃度の塩,電界,界面活性剤,またはDMSOで処理すること
により,細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること,また
は種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【0060】 "モニターする"との用語は,細胞を,物質,例えば,限定されないが,1また
はそれ以上の化合物およびPTP LARと接触させる影響を観察することを表
す。影響は,細胞表現型または移動,またはPTP LARと天然の結合パート
ナーとの間の相互作用として現れることができる。より好ましくは,モニターす
べき影響は,β−カテニンのリン酸化レベルまたはフリーのβ−カテニンプール
のレベルである。"影響"との用語は,好ましくは,細胞表現型の変化または無変
化を記述する。"影響"はまた,PTP LARの触媒活性の変化または無変化を
記述する。"影響"はまた,PTP LARと天然の結合パートナー,例えばβ−
カテニンまたはプラコグロビンとの相互作用の変化または無変化を記述すること
ができる。より好ましくは,"影響"は,β−カテニンのリン酸化レベル,フリー
のβ−カテニンプールのレベル,または上皮細胞移動の変化または無変化を記述
する。
はそれ以上の化合物およびPTP LARと接触させる影響を観察することを表
す。影響は,細胞表現型または移動,またはPTP LARと天然の結合パート
ナーとの間の相互作用として現れることができる。より好ましくは,モニターす
べき影響は,β−カテニンのリン酸化レベルまたはフリーのβ−カテニンプール
のレベルである。"影響"との用語は,好ましくは,細胞表現型の変化または無変
化を記述する。"影響"はまた,PTP LARの触媒活性の変化または無変化を
記述する。"影響"はまた,PTP LARと天然の結合パートナー,例えばβ−
カテニンまたはプラコグロビンとの相互作用の変化または無変化を記述すること
ができる。より好ましくは,"影響"は,β−カテニンのリン酸化レベル,フリー
のβ−カテニンプールのレベル,または上皮細胞移動の変化または無変化を記述
する。
【0061】 "細胞表現型"との用語は,細胞または組織の外見,または細胞または組織の機
能を表す。細胞表現型の例には,限定されないが,細胞サイズ(縮小または拡大
),細胞形状,細胞増殖(細胞の数の増加),細胞分化(生理学的状態の変化)
,細胞毒性(細胞死),細胞生存,アポトーシス(プログラムされた細胞死),
または代謝栄養の利用(例えばグルコース取り込み)が含まれる。最も好ましく
は,細胞表現型とは,上皮細胞移動(繊維芽細胞の形状を帯びる)の存在または
非存在を表す。細胞表現型の変化または無変化は,当該技術分野において知られ
る手法により容易に測定することができる。
能を表す。細胞表現型の例には,限定されないが,細胞サイズ(縮小または拡大
),細胞形状,細胞増殖(細胞の数の増加),細胞分化(生理学的状態の変化)
,細胞毒性(細胞死),細胞生存,アポトーシス(プログラムされた細胞死),
または代謝栄養の利用(例えばグルコース取り込み)が含まれる。最も好ましく
は,細胞表現型とは,上皮細胞移動(繊維芽細胞の形状を帯びる)の存在または
非存在を表す。細胞表現型の変化または無変化は,当該技術分野において知られ
る手法により容易に測定することができる。
【0062】 "触媒活性"との用語は,本発明の文脈においては,PTP LARが基質を脱
リン酸化する速度を規定する。触媒活性は,例えば脱リン酸化生成物に変換され
た基質の量を時間の関数として決定することにより測定することができる。触媒
活性は,時間を一定にし,一定時間後の脱リン酸化された基質の濃度を決定する
ことによって,本発明の方法により測定することができる。基質の脱リン酸化は
,PTP LARの活性部位において生ずる。活性部位は,通常は基質がPTP
LARに結合し,脱リン酸化される腔である。β−カテニンの脱リン酸化を測
定する方法は本明細書において記載される。当業者は,他の適当な方法を想像す
ることができるであろう。
リン酸化する速度を規定する。触媒活性は,例えば脱リン酸化生成物に変換され
た基質の量を時間の関数として決定することにより測定することができる。触媒
活性は,時間を一定にし,一定時間後の脱リン酸化された基質の濃度を決定する
ことによって,本発明の方法により測定することができる。基質の脱リン酸化は
,PTP LARの活性部位において生ずる。活性部位は,通常は基質がPTP
LARに結合し,脱リン酸化される腔である。β−カテニンの脱リン酸化を測
定する方法は本明細書において記載される。当業者は,他の適当な方法を想像す
ることができるであろう。
【0063】 最後の観点においては,本発明は,上皮細胞移動により特徴づけられる疾病ま
たは疾患を治療する方法を特徴とする。該方法は,そのような治療を必要とする
患者に薬学的に許容しうる組成物中の1またはそれ以上の化合物を投与すること
を含み,ここで,前記1またはそれ以上の化合物は,上述の方法により同定され
る。好ましくは,疾病または疾患は,癌,転移,および異常な創傷治癒からなる
群より選択される。最も好ましくは,患者は哺乳動物であり,哺乳動物はヒトで
ある。
たは疾患を治療する方法を特徴とする。該方法は,そのような治療を必要とする
患者に薬学的に許容しうる組成物中の1またはそれ以上の化合物を投与すること
を含み,ここで,前記1またはそれ以上の化合物は,上述の方法により同定され
る。好ましくは,疾病または疾患は,癌,転移,および異常な創傷治癒からなる
群より選択される。最も好ましくは,患者は哺乳動物であり,哺乳動物はヒトで
ある。
【0064】 本発明はまた,上皮細胞移動により特徴づけられる疾病または疾患を治療する
別の方法を含む。該方法は,そのような治療を必要とする患者に,薬学的に許容
しうる組成物中の1またはそれ以上の化合物を投与し,ここで,1またはそれ以
上の化合物は上皮細胞移動を調節する。好ましくは,疾病または疾患は,癌,転
移,および異常な創傷治癒からなる群より選択され,患者は哺乳動物であり,好
ましくは,ヒトである。
別の方法を含む。該方法は,そのような治療を必要とする患者に,薬学的に許容
しうる組成物中の1またはそれ以上の化合物を投与し,ここで,1またはそれ以
上の化合物は上皮細胞移動を調節する。好ましくは,疾病または疾患は,癌,転
移,および異常な創傷治癒からなる群より選択され,患者は哺乳動物であり,好
ましくは,ヒトである。
【0065】 好ましい態様においては,1またはそれ以上の化合物はインビトロで上皮細胞
移動を調節し,好ましくは阻害する。あるいは,1またはそれ以上の化合物は,
インビトロでβ−カテニンのチロシンリン酸化を調節し,好ましくは阻害する(
または脱リン酸化する)。あるいは,1またはそれ以上の化合物は,インビトロ
でβ−カテニンフリープールのレベルを調節し,好ましくは低下させる。最後に
,別の好ましい態様においては,1またはそれ以上の化合物は,キナゾリン,イ
ンドリノン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される。
移動を調節し,好ましくは阻害する。あるいは,1またはそれ以上の化合物は,
インビトロでβ−カテニンのチロシンリン酸化を調節し,好ましくは阻害する(
または脱リン酸化する)。あるいは,1またはそれ以上の化合物は,インビトロ
でβ−カテニンフリープールのレベルを調節し,好ましくは低下させる。最後に
,別の好ましい態様においては,1またはそれ以上の化合物は,キナゾリン,イ
ンドリノン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される。
【0066】 本明細書においては,発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには,除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず,属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには,除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず,属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
【0067】 上述の発明の概要は限定的なものではなく,本発明の他の特徴および利点は,
以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【0068】図面の簡単な説明 図1Aおよび1Bは,種々の条件下における上皮NBTII細胞の移動を示す
。図1Aは,インビトロ創傷アッセイを示す。播種の24時間後,コンフルエン
ト細胞単層を実施例に記載されるように掻き取った。EGF(100ng/mL
)またはUltroserG(2%)を加えた。創傷閉合は,写真により記録し
た。目盛バーは80μmを表す。
。図1Aは,インビトロ創傷アッセイを示す。播種の24時間後,コンフルエン
ト細胞単層を実施例に記載されるように掻き取った。EGF(100ng/mL
)またはUltroserG(2%)を加えた。創傷閉合は,写真により記録し
た。目盛バーは80μmを表す。
【0069】 図1Bは,免疫蛍光研究の結果を表す。播種の24時間後,EGF(100n
g/mL)をサブコンフルエント細胞に加えた。6時間後,細胞を次の免疫標識
用に固定し,慣用の蛍光顕微鏡により画像を記録した。上パネルは,未処理対照
を示し,下パネルはEGPで処理した細胞を示す。緑色蛍光は,E−カドヘリン
の存在を示し,赤色蛍光はβ−カテニンを示す。一次抗体なしでインキュベート
した対照は,蛍光シグナルについてネガティブのままであった。目盛バーは20
μmを表す。
g/mL)をサブコンフルエント細胞に加えた。6時間後,細胞を次の免疫標識
用に固定し,慣用の蛍光顕微鏡により画像を記録した。上パネルは,未処理対照
を示し,下パネルはEGPで処理した細胞を示す。緑色蛍光は,E−カドヘリン
の存在を示し,赤色蛍光はβ−カテニンを示す。一次抗体なしでインキュベート
した対照は,蛍光シグナルについてネガティブのままであった。目盛バーは20
μmを表す。
【0070】 図2は,上皮細胞移動の間のβ−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリ
ン酸化を示す。NBTII細胞を1x104細胞/cm2の密度で播種した。24
時間後,成長因子を加えて移動を誘導した(EGF:100ng/mL;aFG
F:30ng/mL,50μg/mLヘパリンを含む;UltroserG;2
%)。溶解の90分前に,Na−オルトバナジン酸(1mM)を加えた(右)ま
たは加えなかった(左)。陽性対照として,細胞を過バナジン酸で10分間処理
した。溶解した後,カドヘリン/カテニン複合体を免疫沈澱させ,沈殿物をSD
S−PAGEにより分離した。チロシンリン酸化レベルは,抗ホスホチロシン抗
体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した(上)。E−カドヘリン(
中)またはカテニン(下)に対する特異的抗体を用いて膜を再探索して,沈澱し
た蛋白質が等量であることを確実にした。高度にチロシンリン酸化されたβ−カ
テニン(以後過バナジン酸処理と称する)は,再ブロッティングにおいては効率
的に免疫修飾されなかった。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準はキロ
ダルトンで表され,左側に示される。
ン酸化を示す。NBTII細胞を1x104細胞/cm2の密度で播種した。24
時間後,成長因子を加えて移動を誘導した(EGF:100ng/mL;aFG
F:30ng/mL,50μg/mLヘパリンを含む;UltroserG;2
%)。溶解の90分前に,Na−オルトバナジン酸(1mM)を加えた(右)ま
たは加えなかった(左)。陽性対照として,細胞を過バナジン酸で10分間処理
した。溶解した後,カドヘリン/カテニン複合体を免疫沈澱させ,沈殿物をSD
S−PAGEにより分離した。チロシンリン酸化レベルは,抗ホスホチロシン抗
体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した(上)。E−カドヘリン(
中)またはカテニン(下)に対する特異的抗体を用いて膜を再探索して,沈澱し
た蛋白質が等量であることを確実にした。高度にチロシンリン酸化されたβ−カ
テニン(以後過バナジン酸処理と称する)は,再ブロッティングにおいては効率
的に免疫修飾されなかった。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準はキロ
ダルトンで表され,左側に示される。
【0071】 図3は,上皮細胞移動の間,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニン
のプールが増加し,チロシンリン酸化の促進と相関することを示す。NBTII
細胞は,1x104細胞/cm2の密度で播種した。24時間後,EGF(100
ng/mL)を示された時間間隔で加えた。溶解の30分前に,Na−オルトバ
ナジン酸(1mM)を加えた。次に,5μgのGST/E−カドヘリン細胞質蛋
白質または3倍モル過剰のGSTを用いてアフィニティー沈澱を行った。蛋白質
はSDS−PAGEにより分離し,フリーの,複合体を形成していないβ−カテ
ニンのレベルを,抗−β−カテニン抗体を用いるウエスタンブロッティングによ
り分析した(上)。抗−ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティング
は,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンのチロシンリン酸化のレベ
ルの増加を示す(下)。図2と比較すると,細胞をNa−オルトバナジン酸で3
0分間のみ前処理したことに注意すべきである。矢印は,目的とする蛋白質を示
す。分子量標準はキロダルトンで表され,左側に示される。
のプールが増加し,チロシンリン酸化の促進と相関することを示す。NBTII
細胞は,1x104細胞/cm2の密度で播種した。24時間後,EGF(100
ng/mL)を示された時間間隔で加えた。溶解の30分前に,Na−オルトバ
ナジン酸(1mM)を加えた。次に,5μgのGST/E−カドヘリン細胞質蛋
白質または3倍モル過剰のGSTを用いてアフィニティー沈澱を行った。蛋白質
はSDS−PAGEにより分離し,フリーの,複合体を形成していないβ−カテ
ニンのレベルを,抗−β−カテニン抗体を用いるウエスタンブロッティングによ
り分析した(上)。抗−ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティング
は,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンのチロシンリン酸化のレベ
ルの増加を示す(下)。図2と比較すると,細胞をNa−オルトバナジン酸で3
0分間のみ前処理したことに注意すべきである。矢印は,目的とする蛋白質を示
す。分子量標準はキロダルトンで表され,左側に示される。
【0072】 図4は,カドヘリン/カテニン複合体のメンバーがNBTII細胞においてP
TP LARと共局在することを示す。播種の24時間後,NBTII細胞のコ
ンフルエント単層を固定し,間接免疫蛍光用に処理した。細胞は,示されるよう
に,β−カテニン,プラコグロビンまたはE−カドヘリンのいずれかに対する抗
体で標識し(緑色蛍光,上パネル),同時にPTP LARに対する抗体で標識
した(赤色蛍光,中パネル)。レーザー共焦点蛍光イメージは,PTP LAR
とカドヘリン/カテニン複合体がアドヘレンスジャンクションにおいて共局在す
ることを示す(黄色の重ね合わせ,下パネル)。一次抗体なしの対照は,蛍光シ
グナルがネガティブのままであった。目盛バーは20pmを示す。
TP LARと共局在することを示す。播種の24時間後,NBTII細胞のコ
ンフルエント単層を固定し,間接免疫蛍光用に処理した。細胞は,示されるよう
に,β−カテニン,プラコグロビンまたはE−カドヘリンのいずれかに対する抗
体で標識し(緑色蛍光,上パネル),同時にPTP LARに対する抗体で標識
した(赤色蛍光,中パネル)。レーザー共焦点蛍光イメージは,PTP LAR
とカドヘリン/カテニン複合体がアドヘレンスジャンクションにおいて共局在す
ることを示す(黄色の重ね合わせ,下パネル)。一次抗体なしの対照は,蛍光シ
グナルがネガティブのままであった。目盛バーは20pmを示す。
【0073】 図5A,5B,および5Cは,カドヘリン/カテニン−複合体のメンバーがP
TP LARと会合することを示す。図5Aおよび5Bは,無傷の細胞における
カドヘリン/カテニン−複合体とPTP LARとの会合を示す。ヒト上皮MC
F7細胞を1x104細胞/cm2で播種し,24時間後にEGF(100ng/
mL)で示されるように刺激した。細胞を溶解し,PTP LARに対する抗体
(モノクローナル抗体11.1A,ウサギポリクローナル抗血清#320),ま
たは示されるカドヘリン/カテニン−複合体のメンバーで免疫沈澱させた。NI
Sは非免疫血清対照を示す。蛋白質をSDS−PAGEにより分離し,E−カド
ヘリンに対する抗体(図5A,上),β−カテニン(図5A,中),プラコグロ
ビン(図5B,上)またはPTP LAR(図5Aおよび5B,下;図5A,長
時間露光が最下部に示される)を用いてウエスタンブロッティングにより分析し
た。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準はキロダルトンで表され,左側
に示される。
TP LARと会合することを示す。図5Aおよび5Bは,無傷の細胞における
カドヘリン/カテニン−複合体とPTP LARとの会合を示す。ヒト上皮MC
F7細胞を1x104細胞/cm2で播種し,24時間後にEGF(100ng/
mL)で示されるように刺激した。細胞を溶解し,PTP LARに対する抗体
(モノクローナル抗体11.1A,ウサギポリクローナル抗血清#320),ま
たは示されるカドヘリン/カテニン−複合体のメンバーで免疫沈澱させた。NI
Sは非免疫血清対照を示す。蛋白質をSDS−PAGEにより分離し,E−カド
ヘリンに対する抗体(図5A,上),β−カテニン(図5A,中),プラコグロ
ビン(図5B,上)またはPTP LAR(図5Aおよび5B,下;図5A,長
時間露光が最下部に示される)を用いてウエスタンブロッティングにより分析し
た。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準はキロダルトンで表され,左側
に示される。
【0074】 図5Cは,β−カテニンおよびプラコグロビンとPTP LARとのインビト
ロ会合を示す。β−カテニンおよびプラコグロビンを,ヒト胚性腎臓293繊維
芽細胞中で過渡的に過剰発現させた。24時間の血清飢餓の後,細胞を溶解する
前に過バナジン酸で10分間刺激した。等量の溶解物を,GST−PTP LA
R細胞質融合蛋白質(GST−PTP LARi)または3倍モル過剰のGST
とともにインキュベートした。対照ベクターでトランスフェクトした293細胞
の溶解物をGST−PTP LAR細胞質融合蛋白質(GST−PTP LAR
i)とともにインキュベートした。複合体をグルタチオン−セファロース上に固
定化し,沈殿物をSDS−PAGEにより分離した。結合した蛋白質は,抗β−
カテニン抗体(左)またはプラコグロビンに対する抗体(右)を用いてウエスタ
ンブロッティングにより分析した。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準
はキロダルトンで表され,左側に示される。
ロ会合を示す。β−カテニンおよびプラコグロビンを,ヒト胚性腎臓293繊維
芽細胞中で過渡的に過剰発現させた。24時間の血清飢餓の後,細胞を溶解する
前に過バナジン酸で10分間刺激した。等量の溶解物を,GST−PTP LA
R細胞質融合蛋白質(GST−PTP LARi)または3倍モル過剰のGST
とともにインキュベートした。対照ベクターでトランスフェクトした293細胞
の溶解物をGST−PTP LAR細胞質融合蛋白質(GST−PTP LAR
i)とともにインキュベートした。複合体をグルタチオン−セファロース上に固
定化し,沈殿物をSDS−PAGEにより分離した。結合した蛋白質は,抗β−
カテニン抗体(左)またはプラコグロビンに対する抗体(右)を用いてウエスタ
ンブロッティングにより分析した。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準
はキロダルトンで表され,左側に示される。
【0075】 図6は,β−カテニンがインビトロでPTP LARの基質であることを示す
。β−カテニンをヒト胚性腎臓293繊維芽細胞において過渡的に過剰発現させ
た。血清飢餓の24時間後,細胞を溶解する前に過バナジン酸で刺激し,次にβ
−カテニンを抗β−カテニン抗体を用いて免疫沈澱させ,沈殿物を指示された時
間間隔でGST−PTP LAR細胞質融合蛋白質(左),GST−PTP L
AR PTP D1Cl522S−変異体(中)またはGST−PTP LAR
PTP D2C1813S−変異体(右)とともにインキュベートした。指示
された時間の後に反応を終了し,蛋白質をSDS−PAGEにより分離した。β
−カテニンのチロシンリン酸化レベルは,抗ホスホチロシン抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した(上)。抗β−カテニン抗体を用いるウエス
タンブロッティングは,等量のβ−カテニンが免疫沈澱したことを示した(下)
。矢印は目的とする蛋白質を示す。
。β−カテニンをヒト胚性腎臓293繊維芽細胞において過渡的に過剰発現させ
た。血清飢餓の24時間後,細胞を溶解する前に過バナジン酸で刺激し,次にβ
−カテニンを抗β−カテニン抗体を用いて免疫沈澱させ,沈殿物を指示された時
間間隔でGST−PTP LAR細胞質融合蛋白質(左),GST−PTP L
AR PTP D1Cl522S−変異体(中)またはGST−PTP LAR
PTP D2C1813S−変異体(右)とともにインキュベートした。指示
された時間の後に反応を終了し,蛋白質をSDS−PAGEにより分離した。β
−カテニンのチロシンリン酸化レベルは,抗ホスホチロシン抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した(上)。抗β−カテニン抗体を用いるウエス
タンブロッティングは,等量のβ−カテニンが免疫沈澱したことを示した(下)
。矢印は目的とする蛋白質を示す。
【0076】 図7A,7B,および7Cは,ヒトPTP LARの異所性過剰発現が上皮細
胞移動およびラットNBTII細胞のヌードマウス中における腫瘍形成を阻害す
ることを示す。図7Aおよび7Bは,NBTII pLXSNおよびNBTII
hPTP LAR細胞のスキャッタアッセイを示す。図7Aにおいては,空ベ
クターpLXSN(左)またはヒトPTP LAR(右)で感染したNBTII
細胞を1x104細胞/cm2で播種し,24時間後に示されるようにEGF(1
00ng/mL)で刺激した。7時間後,移動形態を写真により記録した。
胞移動およびラットNBTII細胞のヌードマウス中における腫瘍形成を阻害す
ることを示す。図7Aおよび7Bは,NBTII pLXSNおよびNBTII
hPTP LAR細胞のスキャッタアッセイを示す。図7Aにおいては,空ベ
クターpLXSN(左)またはヒトPTP LAR(右)で感染したNBTII
細胞を1x104細胞/cm2で播種し,24時間後に示されるようにEGF(1
00ng/mL)で刺激した。7時間後,移動形態を写真により記録した。
【0077】 図7Bは,スキャッターアッセイの定量を示す(+/−標準偏差)。この目的
のために,ランダムに選択した顕微鏡視野中から1枚あたり1000個の細胞を
計数した。アッセイは三重に行った。細胞は,丸石様の上皮の形態から移動して
つつある繊維芽細胞状の表現型に変化したときに,移動している細胞であると判
定した。
のために,ランダムに選択した顕微鏡視野中から1枚あたり1000個の細胞を
計数した。アッセイは三重に行った。細胞は,丸石様の上皮の形態から移動して
つつある繊維芽細胞状の表現型に変化したときに,移動している細胞であると判
定した。
【0078】 図7Cは,NBTII pLXSNおよびNBTII nPTP LAR細胞
による,ヌードマウスにおける腫瘍形成を示す。空ベクターpLXSN(黒三角
)またはヒトPTP LAR(黒四角)で感染させたNETII細胞を,スイス
ヌードマウスの横腹領域の皮下に注射した(2x106/50μl)。腫瘍形成
をモニターした。グラフは,それぞれポリクローンのおよびクローン化した細胞
株あたり3個の平均腫瘍体積を示す。
による,ヌードマウスにおける腫瘍形成を示す。空ベクターpLXSN(黒三角
)またはヒトPTP LAR(黒四角)で感染させたNETII細胞を,スイス
ヌードマウスの横腹領域の皮下に注射した(2x106/50μl)。腫瘍形成
をモニターした。グラフは,それぞれポリクローンのおよびクローン化した細胞
株あたり3個の平均腫瘍体積を示す。
【0079】 図8は,NBTII細胞におけるヒトPTP LARの異所性発現がβ−カテ
ニンのチロシン残基のリン酸化を阻害し,β−カテニンのフリープールを増加さ
せることを示す。空ベクターpLXSN(左)またはヒトPTP LAR(右)
で感染したNBTII細胞を,1x104細胞/cm2で播種し,24時間後,E
GF(100ng/mL)で示された時間感覚で刺激した。蛋白質チロシンホス
ファターゼ活性の不可逆的阻害を回避するために,Na−オルトバナジン酸前処
理は省略した。細胞を溶解し,5μgのGST−E−カドヘリン細胞質蛋白質ま
たは3倍モル過剰のGSTを用いてインビトロ会合を行った。蛋白質をSDS−
PAGEにより分離し,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンのレベ
ルを,抗−β−カテニン抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した
(上)。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングは,対照感染
NBTII細胞株において,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンの
チロシンリン酸化のみが増加したことを示す(下)。矢印は目的とする蛋白質を
示す。分子量標準はキロダルトンで表され,左側に示される。
ニンのチロシン残基のリン酸化を阻害し,β−カテニンのフリープールを増加さ
せることを示す。空ベクターpLXSN(左)またはヒトPTP LAR(右)
で感染したNBTII細胞を,1x104細胞/cm2で播種し,24時間後,E
GF(100ng/mL)で示された時間感覚で刺激した。蛋白質チロシンホス
ファターゼ活性の不可逆的阻害を回避するために,Na−オルトバナジン酸前処
理は省略した。細胞を溶解し,5μgのGST−E−カドヘリン細胞質蛋白質ま
たは3倍モル過剰のGSTを用いてインビトロ会合を行った。蛋白質をSDS−
PAGEにより分離し,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンのレベ
ルを,抗−β−カテニン抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した
(上)。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングは,対照感染
NBTII細胞株において,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンの
チロシンリン酸化のみが増加したことを示す(下)。矢印は目的とする蛋白質を
示す。分子量標準はキロダルトンで表され,左側に示される。
【0080】 図9は,EMBLデータベースから抽出したPTP LARプレ蛋白質のアミ
ノ酸配列を示す。
ノ酸配列を示す。
【0081】 図10A,10Bおよび10Cは,EMBLデータベースから抽出したPTP LARの核酸配列を示す。
【0082】 図11A,11B,11C,11D,および11Eは,PTP LARのアミ
ノ酸配列を用いたPfam HMMの検索から得られた出力を示す。サイトはh
ttp://pfam.wustl.edu/cgi−bin/nph−hmm
searchである。ホスファターゼドメインは"緑色"であり,有意なE−値を
示す。
ノ酸配列を用いたPfam HMMの検索から得られた出力を示す。サイトはh
ttp://pfam.wustl.edu/cgi−bin/nph−hmm
searchである。ホスファターゼドメインは"緑色"であり,有意なE−値を
示す。
【0083】好ましい態様の詳細な説明 カドヘリン/カテニン−複合体媒介性細胞−細胞接着ならびにカテニンの接着
−非依存性機能は上皮細胞の多細胞分化の調節,増殖,および悪性トランスフォ
ーメーションに関与することが示唆されている(Marrs,et al.(1
996)Int.Rev.Cytol.165,159−205;Birchm
eier,et a1.(1995)Ciba F.Symp.189,124
−141;Huber, et al.(1996)Curr.Opin.Ce
ll Biol.8,685−691)。細胞移動は,胚発生および成人生物に
おける上皮再生,例えば創傷治癒の間の必須のプロセスであり,精密な制御を必
要とする。これは,腫瘍細胞が侵襲性および転移性になると変化または喪失する
。本発明の一部として,上皮細胞移動を制御する明確なメカニズムが細胞および
生化学レベルで定義された。さらに,チロシンキナーゼによるβ−カテニンのチ
ロシンリン酸化の影響,および蛋白質チロシンホスファターゼLARによるその
制御が,運動性細胞において特性決定された。
−非依存性機能は上皮細胞の多細胞分化の調節,増殖,および悪性トランスフォ
ーメーションに関与することが示唆されている(Marrs,et al.(1
996)Int.Rev.Cytol.165,159−205;Birchm
eier,et a1.(1995)Ciba F.Symp.189,124
−141;Huber, et al.(1996)Curr.Opin.Ce
ll Biol.8,685−691)。細胞移動は,胚発生および成人生物に
おける上皮再生,例えば創傷治癒の間の必須のプロセスであり,精密な制御を必
要とする。これは,腫瘍細胞が侵襲性および転移性になると変化または喪失する
。本発明の一部として,上皮細胞移動を制御する明確なメカニズムが細胞および
生化学レベルで定義された。さらに,チロシンキナーゼによるβ−カテニンのチ
ロシンリン酸化の影響,および蛋白質チロシンホスファターゼLARによるその
制御が,運動性細胞において特性決定された。
【0084】 成長因子,例えばEGF,aFGFまたは肝細胞成長因子/スキャッター因子
は,上皮細胞の移動を誘導することが示されている(Manske,et al
.(1994)Int.Rev.Cytol.155,49−96)。移動とβ
−カテニンのチロシンリン酸化との間の相関が示唆されているが(Behren
s et al.(1993)J.Cell Biol.120,757−76
6;Shibamoto, et al.(1994)Cell Adhes.
Commun.1,295−3),その有意性はまだ明らかではない。チロシン
キナーゼシグナリングの阻害は,NETII細胞の上皮細胞移動を阻害する。E
GFレセプター(Hoschuetzky, et al.(1994)J.C
ell Biol.3.27,1375−1380)または細胞質チロシンキナ
ーゼ(例えばSrc)等のRTKは,β−カテニンのチロシンリン酸化を媒介す
ることができる(Hamaguchi, et al.(1993)EMBO
J.12,307−314)。NBTII細胞においては,優性ネガティブc−
Src変異体は移動を阻害することができる(Rodier,et al.(1
995)J.Cell.Biol.131,761−773)。
は,上皮細胞の移動を誘導することが示されている(Manske,et al
.(1994)Int.Rev.Cytol.155,49−96)。移動とβ
−カテニンのチロシンリン酸化との間の相関が示唆されているが(Behren
s et al.(1993)J.Cell Biol.120,757−76
6;Shibamoto, et al.(1994)Cell Adhes.
Commun.1,295−3),その有意性はまだ明らかではない。チロシン
キナーゼシグナリングの阻害は,NETII細胞の上皮細胞移動を阻害する。E
GFレセプター(Hoschuetzky, et al.(1994)J.C
ell Biol.3.27,1375−1380)または細胞質チロシンキナ
ーゼ(例えばSrc)等のRTKは,β−カテニンのチロシンリン酸化を媒介す
ることができる(Hamaguchi, et al.(1993)EMBO
J.12,307−314)。NBTII細胞においては,優性ネガティブc−
Src変異体は移動を阻害することができる(Rodier,et al.(1
995)J.Cell.Biol.131,761−773)。
【0085】 本発明は,とりわけ,移動を誘導した後,フリーの,複合体を形成していない
β−カテニンのプールが増加し,この増加がβ−カテニンチロシンリン酸化の促
進と相関しているという知見に関する。したがって,チロシンリン酸化は,β−
カテニンと,E−カドヘリンおよびアクチン−細胞骨格の両方との相互作用を低
下させるかもしれない。強い細胞−細胞接着にはカドヘリン/カテニン−複合体
の完全性が必須であるため,細胞間接触が全体的に減少する。興味深いことに,
E−カドヘリンとβ−カテニンとの融合蛋白質は,β−カテニンに非依存的にE
−カドヘリンと細胞骨格との相互作用を媒介することが報告されている。しかし
,これらの細胞はもはや移動することができない(Nagafuchi, et
al.(1994)J.Cell Biol.127,235−245)。す
なわち,β−カテニンのチロシンリン酸化は,E−カドヘリンと細胞骨格との間
の接触の破壊,およびフリーのβ−カテニンのプールの増加につながるかもしれ
ない。このことは,カドヘリン媒介性細胞接着に依存しないβ−カテニンの機能
を示唆する。
β−カテニンのプールが増加し,この増加がβ−カテニンチロシンリン酸化の促
進と相関しているという知見に関する。したがって,チロシンリン酸化は,β−
カテニンと,E−カドヘリンおよびアクチン−細胞骨格の両方との相互作用を低
下させるかもしれない。強い細胞−細胞接着にはカドヘリン/カテニン−複合体
の完全性が必須であるため,細胞間接触が全体的に減少する。興味深いことに,
E−カドヘリンとβ−カテニンとの融合蛋白質は,β−カテニンに非依存的にE
−カドヘリンと細胞骨格との相互作用を媒介することが報告されている。しかし
,これらの細胞はもはや移動することができない(Nagafuchi, et
al.(1994)J.Cell Biol.127,235−245)。す
なわち,β−カテニンのチロシンリン酸化は,E−カドヘリンと細胞骨格との間
の接触の破壊,およびフリーのβ−カテニンのプールの増加につながるかもしれ
ない。このことは,カドヘリン媒介性細胞接着に依存しないβ−カテニンの機能
を示唆する。
【0086】 アドヘレンスジャンクションにおけるこれらの役割の他に,β−カテニンまた
はそのショウジョウバエ相同体であるArmadilloのシグナリング機能は
,ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおいて正常な胚発生に必須であ
ることが示されている。フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンのシグ
ナリング機能の妨害は,脊椎動物の正常な発生を破壊した(Miller, e
t al.(1996)Genes Dev.10,2527−2539)。そ
の後のショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおける研究は,β−カテニ
ンの細胞質プールを制御するシグナリングカスケードの発見につながった。
はそのショウジョウバエ相同体であるArmadilloのシグナリング機能は
,ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおいて正常な胚発生に必須であ
ることが示されている。フリーの,複合体を形成していないβ−カテニンのシグ
ナリング機能の妨害は,脊椎動物の正常な発生を破壊した(Miller, e
t al.(1996)Genes Dev.10,2527−2539)。そ
の後のショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおける研究は,β−カテニ
ンの細胞質プールを制御するシグナリングカスケードの発見につながった。
【0087】 シグナルがないとき,β−カテニンは主としてアドヘレンスジャンクションに
局在し,フリーのβ−カテニンはユビキチン依存的様式でダウンレギュレートさ
れる(Aberle, et al.(1997)EMBO J.16/379
7−3804)。細胞外シグナル,例えばWntまたはWingless(Pe
ifer,et al.(1994)Development 120,369
−380;vanLeeuwen, et al.(1994)Nature
368,342−344)は,レセプターFrizzled(Bhanot,e
t al.(1996)Nature 382.225−230)を介してGS
K3/ZesteWhite3活性を阻害し,したがってβ−カテニン/Arm
adilloをそのフリーの形で安定化させる(Yost, et al.(1
996)Genes Dev.10,1443−1454;Papkoff e
t al.(1996)Mol.Cell.Biol.16,2128−213
4)。これは,APC依存性およびユビキチン依存性分解(Munemitsu
, et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
92,3046−3050;Aberle,et al.(1997)EMB
O J.16,3797−3804)を阻害することによる。
局在し,フリーのβ−カテニンはユビキチン依存的様式でダウンレギュレートさ
れる(Aberle, et al.(1997)EMBO J.16/379
7−3804)。細胞外シグナル,例えばWntまたはWingless(Pe
ifer,et al.(1994)Development 120,369
−380;vanLeeuwen, et al.(1994)Nature
368,342−344)は,レセプターFrizzled(Bhanot,e
t al.(1996)Nature 382.225−230)を介してGS
K3/ZesteWhite3活性を阻害し,したがってβ−カテニン/Arm
adilloをそのフリーの形で安定化させる(Yost, et al.(1
996)Genes Dev.10,1443−1454;Papkoff e
t al.(1996)Mol.Cell.Biol.16,2128−213
4)。これは,APC依存性およびユビキチン依存性分解(Munemitsu
, et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
92,3046−3050;Aberle,et al.(1997)EMB
O J.16,3797−3804)を阻害することによる。
【0088】 本発明においては,EGF処理により移動している細胞中の細胞質および核に
おけるフリーのβ−カテニンのプールが増加する。このことは,上皮細胞移動の
間のβ−カテニンのフリープールを制御する,Wnfc/Winglessシグ
ナリングとは別の経路を示唆する。β−カテニンのチロシンリン酸化はまたフリ
ーのβ−カテニンを安定化させるかもしれない。これは,相同のプラコグロビン
のチロシンリン酸化型はもはやAPCと会合せず(Shibata, et a
l.(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.203
,519−522),このことによりおそらくはAPC媒介性分解を妨害してい
るためである。さらに,EGF依存性上皮細胞移動の間,β−カテニンのフリー
プールは増加したホスホチロシン含量を有する。さらに,EGFはまたGSK3
活性を阻害する(Eldar−Finkelman, et al.(1995
)J.Biol.Chem.270,987−990)。β−カテニンのチロシ
ンリン酸化は,癌腫形成および腫瘍侵襲と相関することが示されている(Som
mers,et al.(1994)Cancer Res.54,3544−
3552).フリーのβ−カテニンまたはプラコグロビンのみが,高移動性群の
メンバー(HMG;Grosschedl,et al.(1994)Tren
ds Genet.10,94−100),転写因子のファミリー,すなわち,
LEF1およびTCF3,TCF4(Behrens, et al.(199
6)Nature 382,638−642;Huber, et al.(1
996)Mech.Develop..59,3−10;Molenaar,
et al.(1996)Cell 86,391−399;Korinek,
et al.(1997)Science 275,1784−1787;M
orin, et al.(1997)Science 275,1787−1
790)と会合することができる。しかし,β−カテニンおよびプラコグロビン
は,その核トランスローケーションおよびLEF1との複合体形成において異な
る。LEF1依存性トランスアクチベーションは,β−カテニンにより優先的に
推進される(Simcha, et al.(1998)J.Cell Bio
l.141,1433−1448)。転写因子LEF1およびTCFは,アフリ
カツメガエル胚中でβ−カテニンとともに発現されたとき,背面中胚葉を誘導す
ることができる(Huber, et al.(1996)Mech.Deve
lop.,59,3−10;Behrens, et al.(1996)Na
ture 382,638−642;Molenaar. et al.(19
96)Cell 86,391−399)。LEFl−欠損およびLEFl−ト
ランスジェニックマウスからのデータは,EMTの間のこの転写因子の重要性を
示す。この転写因子は,通常はEMTの間および間葉と上皮との間の誘導的プロ
セスの間,アップレギュレートされるためである(vanGenderen,
et al.(1994)Genes Dev.Q,2691−2703;Zh
ou, et al.(1995)Genes Dev.9,570−583;
Kratochwil, et al.(1996)Genes Dev.10
,1382−1394)。このことは,胚発生ならびに上皮細胞移動の間の間葉
および上皮表現型の遺伝子の発現を調和させる一般的な制御システムが存在する
ことを示唆する。EMTまたは細胞移動の間,この共通のレギュレータは,上皮
遺伝子の発現をスイッチオフし,間葉表現型の遺伝子をスイッチオンするのであ
ろう。β−カテニン/LEFl−複合体は,この共通のレギュレータであるかも
しれず,β−カテニンのフリープールを制御する分子は,適切な発生または創傷
治癒に必須であるかもしれない。
おけるフリーのβ−カテニンのプールが増加する。このことは,上皮細胞移動の
間のβ−カテニンのフリープールを制御する,Wnfc/Winglessシグ
ナリングとは別の経路を示唆する。β−カテニンのチロシンリン酸化はまたフリ
ーのβ−カテニンを安定化させるかもしれない。これは,相同のプラコグロビン
のチロシンリン酸化型はもはやAPCと会合せず(Shibata, et a
l.(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.203
,519−522),このことによりおそらくはAPC媒介性分解を妨害してい
るためである。さらに,EGF依存性上皮細胞移動の間,β−カテニンのフリー
プールは増加したホスホチロシン含量を有する。さらに,EGFはまたGSK3
活性を阻害する(Eldar−Finkelman, et al.(1995
)J.Biol.Chem.270,987−990)。β−カテニンのチロシ
ンリン酸化は,癌腫形成および腫瘍侵襲と相関することが示されている(Som
mers,et al.(1994)Cancer Res.54,3544−
3552).フリーのβ−カテニンまたはプラコグロビンのみが,高移動性群の
メンバー(HMG;Grosschedl,et al.(1994)Tren
ds Genet.10,94−100),転写因子のファミリー,すなわち,
LEF1およびTCF3,TCF4(Behrens, et al.(199
6)Nature 382,638−642;Huber, et al.(1
996)Mech.Develop..59,3−10;Molenaar,
et al.(1996)Cell 86,391−399;Korinek,
et al.(1997)Science 275,1784−1787;M
orin, et al.(1997)Science 275,1787−1
790)と会合することができる。しかし,β−カテニンおよびプラコグロビン
は,その核トランスローケーションおよびLEF1との複合体形成において異な
る。LEF1依存性トランスアクチベーションは,β−カテニンにより優先的に
推進される(Simcha, et al.(1998)J.Cell Bio
l.141,1433−1448)。転写因子LEF1およびTCFは,アフリ
カツメガエル胚中でβ−カテニンとともに発現されたとき,背面中胚葉を誘導す
ることができる(Huber, et al.(1996)Mech.Deve
lop.,59,3−10;Behrens, et al.(1996)Na
ture 382,638−642;Molenaar. et al.(19
96)Cell 86,391−399)。LEFl−欠損およびLEFl−ト
ランスジェニックマウスからのデータは,EMTの間のこの転写因子の重要性を
示す。この転写因子は,通常はEMTの間および間葉と上皮との間の誘導的プロ
セスの間,アップレギュレートされるためである(vanGenderen,
et al.(1994)Genes Dev.Q,2691−2703;Zh
ou, et al.(1995)Genes Dev.9,570−583;
Kratochwil, et al.(1996)Genes Dev.10
,1382−1394)。このことは,胚発生ならびに上皮細胞移動の間の間葉
および上皮表現型の遺伝子の発現を調和させる一般的な制御システムが存在する
ことを示唆する。EMTまたは細胞移動の間,この共通のレギュレータは,上皮
遺伝子の発現をスイッチオフし,間葉表現型の遺伝子をスイッチオンするのであ
ろう。β−カテニン/LEFl−複合体は,この共通のレギュレータであるかも
しれず,β−カテニンのフリープールを制御する分子は,適切な発生または創傷
治癒に必須であるかもしれない。
【0089】 PTPは,Na−オルトバナジン酸(ホスファターゼ活性の強力な阻害剤)で
処理すると,上皮細胞における正常細胞接触阻害が減少し,アドヘレンスジャン
クションにおけるチロシンリン酸化が増加するため,細胞−細胞接触の制御に重
要な役割を果たすことが提唱されている(Volberg, et al.(1
992)EMBO J.11,1733−1742)。したがって,PTPは,
アドヘレンスジャンクションにおける制御事象においてTKの定常状態平衡アン
タゴニストとして作用するのかもしれない。これらの知見と一致して,我々は,
Na−オルトバナジン酸で前処理した後に,上皮細胞の移動におけるβ−カテニ
ンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化が顕著に増加することを示す。
処理すると,上皮細胞における正常細胞接触阻害が減少し,アドヘレンスジャン
クションにおけるチロシンリン酸化が増加するため,細胞−細胞接触の制御に重
要な役割を果たすことが提唱されている(Volberg, et al.(1
992)EMBO J.11,1733−1742)。したがって,PTPは,
アドヘレンスジャンクションにおける制御事象においてTKの定常状態平衡アン
タゴニストとして作用するのかもしれない。これらの知見と一致して,我々は,
Na−オルトバナジン酸で前処理した後に,上皮細胞の移動におけるβ−カテニ
ンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化が顕著に増加することを示す。
【0090】 最近,PTP LARは,LIP−1(LAR相互作用蛋白質−1)および多
ドメイン蛋白質Trioとの局所性接着と相互作用し共局在することが示された
。しかし,これらの蛋白質のいずれも,PTP LARの基質ではなさそうであ
る(Serra−Pages, et al.(1995)EMBO J.14
,2827−2838;Debant, et al.(1996)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 93,5466−547)。さらに,P
TP LAR様PTPは,神経分泌PC12細胞のアドヘレンスジャンクション
においてカドヘリン/カテニン−複合体と相互作用することが報告されている(
Kypta,et al.(1996)J.Cell Biol.134,15
19−1529)。
ドメイン蛋白質Trioとの局所性接着と相互作用し共局在することが示された
。しかし,これらの蛋白質のいずれも,PTP LARの基質ではなさそうであ
る(Serra−Pages, et al.(1995)EMBO J.14
,2827−2838;Debant, et al.(1996)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 93,5466−547)。さらに,P
TP LAR様PTPは,神経分泌PC12細胞のアドヘレンスジャンクション
においてカドヘリン/カテニン−複合体と相互作用することが報告されている(
Kypta,et al.(1996)J.Cell Biol.134,15
19−1529)。
【0091】 我々は,本発明において,上皮細胞におけるPTP LARとカドヘリン/カ
テニン−複合体との共局在および相互作用を示す。さらに,β−カテニンおよび
プラコグロビンのみがPTP LARと直接会合することができることを示し,
β−カテニンがPTP LARの基質であることの証拠を提示する。PTP L
ARは,アドヘレンスジャンクションおよびフォーカルコンタクトに局在し(こ
の報告およびKypta, et al.(1996)J.Cell Biol
.134,1519−1529;Serra−Pages, et al.(1
995)EMBO J.14,2827−2838;Debant, et a
l.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,54
66−5471),したがってPTP LARは,上皮細胞移動の間の細胞−細
胞−接着ならびに細胞−EGM−接着の分解および再構築の必須のレギュレータ
でありうるため,特に興味深い。
テニン−複合体との共局在および相互作用を示す。さらに,β−カテニンおよび
プラコグロビンのみがPTP LARと直接会合することができることを示し,
β−カテニンがPTP LARの基質であることの証拠を提示する。PTP L
ARは,アドヘレンスジャンクションおよびフォーカルコンタクトに局在し(こ
の報告およびKypta, et al.(1996)J.Cell Biol
.134,1519−1529;Serra−Pages, et al.(1
995)EMBO J.14,2827−2838;Debant, et a
l.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,54
66−5471),したがってPTP LARは,上皮細胞移動の間の細胞−細
胞−接着ならびに細胞−EGM−接着の分解および再構築の必須のレギュレータ
でありうるため,特に興味深い。
【0092】 我々は,PTP LARの適度の異所性過剰発現が上皮細胞移動を有意に阻害
することを示す。ショウジョウバエにおいても類似の状況が見いだされており,
この場合には,脊椎動物とは異なり,PTP LARはほとんど発生しつつある
ニューロンにおいてのみ発現される。PTP LARを欠失したハエにおいては
,運動軸索はその正常な標的領域をバイバスし,停止することなく伸び続ける(
Krueger,et al.(1996)Cell 84,611−622)
。PTP LAR,PTPμ,PTPκ,ならびにPTP DEP−1は,上昇
した蛋白質レベルで発現され,細胞コンフルエンスが増加し(Fuchs, e
t al.(1996)J.Biol.Chem.271,16712−177
19;Longo et al.(1993)J.Biol.Chem.268
,26503−26511;Gebbink, et al.(1995)J.
Cell Biol.131,251−260;Ostman, et al.
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9680
−9684),このことによりコンフルエント細胞におけるホスファターゼ活性
の観察される増加に寄与することが見いだされている(Mansbridge,
et al.(1992)J.Cell Physiol.151,433−
442)。
することを示す。ショウジョウバエにおいても類似の状況が見いだされており,
この場合には,脊椎動物とは異なり,PTP LARはほとんど発生しつつある
ニューロンにおいてのみ発現される。PTP LARを欠失したハエにおいては
,運動軸索はその正常な標的領域をバイバスし,停止することなく伸び続ける(
Krueger,et al.(1996)Cell 84,611−622)
。PTP LAR,PTPμ,PTPκ,ならびにPTP DEP−1は,上昇
した蛋白質レベルで発現され,細胞コンフルエンスが増加し(Fuchs, e
t al.(1996)J.Biol.Chem.271,16712−177
19;Longo et al.(1993)J.Biol.Chem.268
,26503−26511;Gebbink, et al.(1995)J.
Cell Biol.131,251−260;Ostman, et al.
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9680
−9684),このことによりコンフルエント細胞におけるホスファターゼ活性
の観察される増加に寄与することが見いだされている(Mansbridge,
et al.(1992)J.Cell Physiol.151,433−
442)。
【0093】 コンフルエント細胞におけるホスファターゼ活性の増加は,細胞−細胞−接着
および上皮細胞の一体性の制御および安定化におけるPTPの役割を示唆する。
これに対し,創傷治癒の間,創傷末端の細胞はサブコンフルエント状態であり,
ここでは,PTPの作用は減少する。これは,成長因子,例えばEGF,TGF
α,およびKGFによる刺激を介するチロシンキナーゼシグナリングに有利であ
り,このため細胞移動および増殖が増加し,したがって,これらの成長因子が創
傷状態の間増加するため,創傷治癒が加速される(Buckley, et a
l.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82;Ra
ppolee, et al.(1988)Science 241,708−
712;Werner, et al.(1992)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 89,6896−6900)。
および上皮細胞の一体性の制御および安定化におけるPTPの役割を示唆する。
これに対し,創傷治癒の間,創傷末端の細胞はサブコンフルエント状態であり,
ここでは,PTPの作用は減少する。これは,成長因子,例えばEGF,TGF
α,およびKGFによる刺激を介するチロシンキナーゼシグナリングに有利であ
り,このため細胞移動および増殖が増加し,したがって,これらの成長因子が創
傷状態の間増加するため,創傷治癒が加速される(Buckley, et a
l.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82;Ra
ppolee, et al.(1988)Science 241,708−
712;Werner, et al.(1992)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 89,6896−6900)。
【0094】 上皮細胞移動の間フリーおよびチロシンリン酸化されたβ−カテニンの重要性
は,hPTP LARの過剰発現によりこのパラメータに干渉すると上皮細胞の
運動性が阻害されるという我々の観察により強調される。さらに,NETII細
胞におけるhPTP LARの発現は,ヌードマウスにおいて腫瘍形成を阻害し
たが,これらの細胞のインビトロでの成長特性は変化していなかった。hPTP
LARの内因性レベルの約2倍の異所性発現が,観察された生物学的効果に十
分であった。高い過剰発現により細胞の成長特性およびアポトーシスが完全に変
更されるため,そのようなhPTP LARの適度な異所性発現は重要である(
Weng, et al.(1998)Curr.Blol.8,247−25
6)。この報告に示されるデータは,細胞−細胞接着および上皮細胞移動,なら
びにシグナリングβ−カテニンのフリープールを制御することによる腫瘍原性の
制御におけるPTP LARの重要な役割を強く支持する。
は,hPTP LARの過剰発現によりこのパラメータに干渉すると上皮細胞の
運動性が阻害されるという我々の観察により強調される。さらに,NETII細
胞におけるhPTP LARの発現は,ヌードマウスにおいて腫瘍形成を阻害し
たが,これらの細胞のインビトロでの成長特性は変化していなかった。hPTP
LARの内因性レベルの約2倍の異所性発現が,観察された生物学的効果に十
分であった。高い過剰発現により細胞の成長特性およびアポトーシスが完全に変
更されるため,そのようなhPTP LARの適度な異所性発現は重要である(
Weng, et al.(1998)Curr.Blol.8,247−25
6)。この報告に示されるデータは,細胞−細胞接着および上皮細胞移動,なら
びにシグナリングβ−カテニンのフリープールを制御することによる腫瘍原性の
制御におけるPTP LARの重要な役割を強く支持する。
【0095】 APCまたはβ−カテニンのいずれかにおける変異または欠失は,フリーのβ
−カテニンの安定化されたプールにつながるため,腫瘍形成と関連づけられてい
る(Korinek,et al.(1997)Science 275,17
84−178;Morin,et al.(1997)Science 275
,1787−1790;Rubinfeld,et al.(1997)Sci
ence 275,1790−1792)。PTP LAR機能の喪失はまた,
腫瘍形成および転移に寄与するかもしれない。したがって,PTP LARは,
可能性のある腫瘍抑制遺伝子産物として,ヒト癌の予知マーカーとして働くこと
ができる。
−カテニンの安定化されたプールにつながるため,腫瘍形成と関連づけられてい
る(Korinek,et al.(1997)Science 275,17
84−178;Morin,et al.(1997)Science 275
,1787−1790;Rubinfeld,et al.(1997)Sci
ence 275,1790−1792)。PTP LAR機能の喪失はまた,
腫瘍形成および転移に寄与するかもしれない。したがって,PTP LARは,
可能性のある腫瘍抑制遺伝子産物として,ヒト癌の予知マーカーとして働くこと
ができる。
【0096】1.PTP LARの核酸配列 本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に
含まれる。遺伝コードの縮重のため,あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え,同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は,
メチオニンおよびトリプトファンを除き,2以上のコドンによりコードされるこ
とができるため,核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち,PTP LA
R遺伝子の一部または全部を合成して,図10に示される核酸配列と有意に異な
る核酸配列を得ることができる。しかし,これによりコードされるアミノ酸配列
は保存される。
含まれる。遺伝コードの縮重のため,あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え,同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は,
メチオニンおよびトリプトファンを除き,2以上のコドンによりコードされるこ
とができるため,核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち,PTP LA
R遺伝子の一部または全部を合成して,図10に示される核酸配列と有意に異な
る核酸配列を得ることができる。しかし,これによりコードされるアミノ酸配列
は保存される。
【0097】 さらに,核酸配列は,図10に示される核酸の式の5’−末端および/または
3’−末端で少なくとも1つのヌクレオチドを付加,欠失または置換することに
より得られるヌクレオチド配列またはその誘導体を含んでいてもよい。その付加
,欠失または置換が,ヌクレオチド配列によりコードされるPTP LARのア
ミノ酸配列を変更しない限り,任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこ
のように用いることができる。例えば,本発明の方法は,PTP LARの核酸
配列またはその誘導体の5’−末端に開始コドンとしてATGを付加することに
より,またはPTP LARのヌクレオチド配列またはその誘導体の3’−末端
に終止コドンとしてTTA,TAGまたはTGAを付加することにより得られる
任意の核酸配列を使用することを含むことを意図する。さらに,PTP LAR
は,必要に応じて,これらの5’−末端および/または3’−末端に付加された
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。
3’−末端で少なくとも1つのヌクレオチドを付加,欠失または置換することに
より得られるヌクレオチド配列またはその誘導体を含んでいてもよい。その付加
,欠失または置換が,ヌクレオチド配列によりコードされるPTP LARのア
ミノ酸配列を変更しない限り,任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこ
のように用いることができる。例えば,本発明の方法は,PTP LARの核酸
配列またはその誘導体の5’−末端に開始コドンとしてATGを付加することに
より,またはPTP LARのヌクレオチド配列またはその誘導体の3’−末端
に終止コドンとしてTTA,TAGまたはTGAを付加することにより得られる
任意の核酸配列を使用することを含むことを意図する。さらに,PTP LAR
は,必要に応じて,これらの5’−末端および/または3’−末端に付加された
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。
【0098】 所定の核酸配列のそのような機能的変更により,これに融合した外来核酸配列
によりコードされる異種蛋白質の分泌および/またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって,遺伝コードにより許容されるPTP LARお
よびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
によりコードされる異種蛋白質の分泌および/またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって,遺伝コードにより許容されるPTP LARお
よびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
【0099】 さらに,コドンを削除するかまたは1またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して,構造的に改変されているが,未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように,2つの
ポリペプチドは機能的に同等であり,これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても,これらの製造を生じさせる2つの核酸分子
も機能的に同等である。これらの核酸もまた,本発明の方法において用いること
が意図される。
外のコドンと置換して,構造的に改変されているが,未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように,2つの
ポリペプチドは機能的に同等であり,これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても,これらの製造を生じさせる2つの核酸分子
も機能的に同等である。これらの核酸もまた,本発明の方法において用いること
が意図される。
【0100】II.PTPLAPの検出のための核酸プローブ,方法,およびキット 当業者は,本明細書に開示される配列に基づいて,当該技術分野において知ら
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを容易に設計することができる("Molecular Cloning:
A Laboratory Manual",1989,上掲)。本発明の方法
において用いられるハイブリダイゼーションプローブは,標準的標識技術,例え
ば放射性標識,酵素標識,蛍光標識,ビオチン−アビジン標識,化学発光等を用
いる技術により,標識することができる。ハイブリダイゼーション後,プローブ
は既知の方法を用いて可視化することができる。
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを容易に設計することができる("Molecular Cloning:
A Laboratory Manual",1989,上掲)。本発明の方法
において用いられるハイブリダイゼーションプローブは,標準的標識技術,例え
ば放射性標識,酵素標識,蛍光標識,ビオチン−アビジン標識,化学発光等を用
いる技術により,標識することができる。ハイブリダイゼーション後,プローブ
は既知の方法を用いて可視化することができる。
【0101】 本発明において用いるべき核酸プローブには,RNAならびにDNAプローブ
が含まれ,そのようなプローブは,当該技術分野において知られる技術を用いて
生成される。核酸プローブは,固体支持体上に固定化してもよい。そのような固
体支持体の例としては,限定されないが,プラスチック,例えばポリカーボネー
ト,複合炭水化物,例えばアガロースおよびセファロース,およびアクリル樹脂
,例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブ
をそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られて
いる。
が含まれ,そのようなプローブは,当該技術分野において知られる技術を用いて
生成される。核酸プローブは,固体支持体上に固定化してもよい。そのような固
体支持体の例としては,限定されないが,プラスチック,例えばポリカーボネー
ト,複合炭水化物,例えばアガロースおよびセファロース,およびアクリル樹脂
,例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブ
をそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られて
いる。
【0102】 本発明の核酸探索方法に適した試験試料には,例えば,細胞または細胞の核酸
抽出物,または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は,アッセ
イフォーマット,検出方法,およびアッセイすべき組織,細胞,または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており,用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
抽出物,または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は,アッセ
イフォーマット,検出方法,およびアッセイすべき組織,細胞,または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており,用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【0103】 試料中のPTP LARの存在を検出する1つの方法は,(a)前記試料をハ
イブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ,
そして(b)前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する,ことを含
む。当業者は,当該技術分野において知られる技術にしたがって,上述のように
核酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には,限定されないが,ヒト
組織のRNA試料が含まれる。
イブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ,
そして(b)前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する,ことを含
む。当業者は,当該技術分野において知られる技術にしたがって,上述のように
核酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には,限定されないが,ヒト
組織のRNA試料が含まれる。
【0104】 試料中のPTP LARの存在を検出するためのキットは,その中に上述の核
酸プローブが置かれている少なくとも1つの容器手段を含む。キットはさらに,
以下の1またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい:洗浄試薬および結
合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては
,限定されないが,放射性標識プローブ,酵素標識プローブ(西洋ワサビペルオ
キシダーゼ,アルカリホスファターゼ),および親和性標識プローブ(ビオチン
,アビジン,またはストレプトアビジン)が挙げられる。
酸プローブが置かれている少なくとも1つの容器手段を含む。キットはさらに,
以下の1またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい:洗浄試薬および結
合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては
,限定されないが,放射性標識プローブ,酵素標識プローブ(西洋ワサビペルオ
キシダーゼ,アルカリホスファターゼ),および親和性標識プローブ(ビオチン
,アビジン,またはストレプトアビジン)が挙げられる。
【0105】 詳細には,コンパートメント化されたキットには,試薬が別々の容器に入れら
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には,小ガラス容器,プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は,試料および試薬が互いに夾雑しないように,かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で1つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように,1つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には,試験試料を入れる容器
,アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器,洗浄試薬
(例えばリン酸緩衝化食塩水,Tris緩衝液等)を含有する容器,およびハイ
ブリダイズしたプローブ,結合した抗体,増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は,本発明において記載される核酸プ
ローブを,当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
1つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には,小ガラス容器,プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は,試料および試薬が互いに夾雑しないように,かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で1つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように,1つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には,試験試料を入れる容器
,アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器,洗浄試薬
(例えばリン酸緩衝化食塩水,Tris緩衝液等)を含有する容器,およびハイ
ブリダイズしたプローブ,結合した抗体,増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は,本発明において記載される核酸プ
ローブを,当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
1つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【0106】III.PTP LAR核酸分子を含むDNA構築物およびこれらの構築物を含 む細胞 本発明はまた,宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を5’から3’方向に含む組換えDNA分子に関する。さらに
,本発明は,ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えDNA分子に関する。
本発明はまた,細胞において機能的な転写領域,上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするRNA配列に相補的な配列,および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は,単離されたおよ
び/または精製されたDNA分子でありうる。
び上述の核酸分子を5’から3’方向に含む組換えDNA分子に関する。さらに
,本発明は,ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えDNA分子に関する。
本発明はまた,細胞において機能的な転写領域,上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするRNA配列に相補的な配列,および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は,単離されたおよ
び/または精製されたDNA分子でありうる。
【0107】 本発明はまた,上述の核酸分子を含み,したがってポリペプチドを発現しうる
細胞または生物に関する。ポリペプチドは,そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が,細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合,細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は,ゲノム,cDNA,または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
細胞または生物に関する。ポリペプチドは,そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が,細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合,細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は,ゲノム,cDNA,または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
【0108】 核酸分子,例えばDNAは,これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み,かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合,ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは,制御DNA配列および発現が求められているDN
A配列が,遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが,これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては,プ
ロモーター領域は,プロモーター(RNA転写の開始を指示する)ならびにRN
Aに転写されたときに合成の開始を合図するであろうDNA配列の両方を含む。
そのような領域は,通常は転写および翻訳の開始に関与する5’−非コーディン
グ配列,例えばTATAボックス,キャッピング配列,CAAT配列等を含むで
あろう。
ド配列を含み,かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合,ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは,制御DNA配列および発現が求められているDN
A配列が,遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが,これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては,プ
ロモーター領域は,プロモーター(RNA転写の開始を指示する)ならびにRN
Aに転写されたときに合成の開始を合図するであろうDNA配列の両方を含む。
そのような領域は,通常は転写および翻訳の開始に関与する5’−非コーディン
グ配列,例えばTATAボックス,キャッピング配列,CAAT配列等を含むで
あろう。
【0109】 2つのDNA配列(例えば,プロモーター領域配列およびPTP LARをコ
ードする配列)は,2つのDNA配列の連結の性質が,(1)フレームシフト変
異を導入しない,(2)プロモーター領域配列が本発明のホスファターゼをコー
ドする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない,または(3)PTP L
ARの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨害しない場
合,動作可能なように連結されていると言われる。すなわち,プロモーター領域
は,プロモーターがそのDNA配列の転写を行うことができる場合,DNA配列
に動作可能なように連結されているであろう。すなわち,PTP LARをコー
ドする遺伝子を発現させるためには,適当な宿主により認識される転写および翻
訳シグナルが必要である。
ードする配列)は,2つのDNA配列の連結の性質が,(1)フレームシフト変
異を導入しない,(2)プロモーター領域配列が本発明のホスファターゼをコー
ドする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない,または(3)PTP L
ARの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨害しない場
合,動作可能なように連結されていると言われる。すなわち,プロモーター領域
は,プロモーターがそのDNA配列の転写を行うことができる場合,DNA配列
に動作可能なように連結されているであろう。すなわち,PTP LARをコー
ドする遺伝子を発現させるためには,適当な宿主により認識される転写および翻
訳シグナルが必要である。
【0110】 本発明は,本発明のPTP LAR(またはその機能的誘導体)をコードする
遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含
する。原核生物宿主は,一般に,組換え蛋白質の製造において非常に有効であり
かつ便利であり,したがって,PTP LARのための1つの好ましい発現シス
テムである。原核生物は,しばしばE.coliの種々の株により代表される。
しかし,他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含
する。原核生物宿主は,一般に,組換え蛋白質の製造において非常に有効であり
かつ便利であり,したがって,PTP LARのための1つの好ましい発現シス
テムである。原核生物は,しばしばE.coliの種々の株により代表される。
しかし,他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【0111】 原核生物系においては,宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には,pBR322,pUC118,pUC119等が含まれ,適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には,λgtl0,λgt11等
が含まれ,適当なウイルスベクターの例には,pMAM−neo,pKRC等が
含まれる。好ましくは,本発明の選択されたベクターは,選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には,pBR322,pUC118,pUC119等が含まれ,適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には,λgtl0,λgt11等
が含まれ,適当なウイルスベクターの例には,pMAM−neo,pKRC等が
含まれる。好ましくは,本発明の選択されたベクターは,選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【0112】 認められている原核生物宿主には,細菌,例えばE.coli,Bacill
us,Streptomyces,Pseudomonas,Salmonel
la,Serratia等が含まれる。しかし,そのような条件下においては,
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
us,Streptomyces,Pseudomonas,Salmonel
la,Serratia等が含まれる。しかし,そのような条件下においては,
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【0113】 PTP LAR(またはその機能的誘導体)を原核生物細胞において発現させ
るためには,本発明のキナーゼをコードする配列が,機能的原核生物プロモータ
ーと動作可能なように連結されていることが必要である。そのようなプロモータ
ーは,構成的であってもよく,より好ましくは制御可能(すなわち,誘導可能ま
たは抑制解除可能)である。構成的プロモーターの例には,バクテリオファージ
λのintプロモーター,pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のbla
プロモーター,およびpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子配列のcatプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プ
ロモーターの例には,バクテリオファージλの主要右および左プロモーター(P L およびPR),E.coliのtrp,recA,lacZ,lacI,および
galプロモーター,α−アミラーゼ(Ulmanen et al.,J.B
acteriol.162:176−182,1985)およびB.subti
lisのσ−28−特異的プロモーター(Oilman et al..Gen
e Seqeucne 32:11−20,1984),Bacillusのバ
クテリオファージのプロモーター(Gryczan,The Molecula
r Biology of the Bacilli,Academic Pr
ess,Inc.,NY,1982),およびStreptomycesプロモ
ーター(Ward et al.,Mol.Gen.Genet.203:46
8−478,1986)が含まれる。原核生物プロモーターは,Glick(I
nd.Microbiot.1:277−282,1987),Cenatie
mpo(Biochimie 68:505−516,1986),およびGo
ttesman(Ann.Rev.Genet.18:415−442,198
4)により概説されている。
るためには,本発明のキナーゼをコードする配列が,機能的原核生物プロモータ
ーと動作可能なように連結されていることが必要である。そのようなプロモータ
ーは,構成的であってもよく,より好ましくは制御可能(すなわち,誘導可能ま
たは抑制解除可能)である。構成的プロモーターの例には,バクテリオファージ
λのintプロモーター,pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のbla
プロモーター,およびpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子配列のcatプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プ
ロモーターの例には,バクテリオファージλの主要右および左プロモーター(P L およびPR),E.coliのtrp,recA,lacZ,lacI,および
galプロモーター,α−アミラーゼ(Ulmanen et al.,J.B
acteriol.162:176−182,1985)およびB.subti
lisのσ−28−特異的プロモーター(Oilman et al..Gen
e Seqeucne 32:11−20,1984),Bacillusのバ
クテリオファージのプロモーター(Gryczan,The Molecula
r Biology of the Bacilli,Academic Pr
ess,Inc.,NY,1982),およびStreptomycesプロモ
ーター(Ward et al.,Mol.Gen.Genet.203:46
8−478,1986)が含まれる。原核生物プロモーターは,Glick(I
nd.Microbiot.1:277−282,1987),Cenatie
mpo(Biochimie 68:505−516,1986),およびGo
ttesman(Ann.Rev.Genet.18:415−442,198
4)により概説されている。
【0114】 原核生物細胞における適切な発現には,遺伝子コーディング配列の上流にリボ
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は,例えば
,Gold et al.(Ann.Rev.Microbiol.35:36
5−404,1981)に記載されている。制御配列,発現ベクター,トランス
フォーメーション方法等の選択は,遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合,"細胞","細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ,そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち,"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は,継代の数にかかわらず,初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また,意図的なまたは偶然の変異のために,すべての子孫がDNA含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし,定義される
ように,変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は,例えば
,Gold et al.(Ann.Rev.Microbiol.35:36
5−404,1981)に記載されている。制御配列,発現ベクター,トランス
フォーメーション方法等の選択は,遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合,"細胞","細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ,そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち,"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は,継代の数にかかわらず,初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また,意図的なまたは偶然の変異のために,すべての子孫がDNA含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし,定義される
ように,変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【0115】 本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は,目的とするキ
ナーゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り,特に限定されな
い。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物
宿主には,例えば,酵母,真菌,昆虫細胞,哺乳動物細胞(インビボまたは組織
培養のいずれか)が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には,H
eLa細胞,繊維芽細胞由来の細胞,例えばVEROまたはCHO−K1,また
はリンパ球由来の細胞,およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿
主細胞には,SP2/0およびJ558L,ならびに神経芽細胞腫細胞株,例え
ばIMR332が含まれ,これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能
力を提供することができる。
ナーゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り,特に限定されな
い。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物
宿主には,例えば,酵母,真菌,昆虫細胞,哺乳動物細胞(インビボまたは組織
培養のいずれか)が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には,H
eLa細胞,繊維芽細胞由来の細胞,例えばVEROまたはCHO−K1,また
はリンパ球由来の細胞,およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿
主細胞には,SP2/0およびJ558L,ならびに神経芽細胞腫細胞株,例え
ばIMR332が含まれ,これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能
力を提供することができる。
【0116】 さらに,植物細胞もまた宿主として利用可能であり,植物細胞と適合しうる制
御配列,例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sおよび19S,およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞,例えば,Drosophila larva
eである。昆虫細胞を宿主として用いる場合,Drosophilaアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる(Rubin,Scien
ce 240:1453−1459,1988)。あるいは,バキュロウイルス
ベクターを,昆虫細胞においてPTP LARを大量に発現するよう遺伝子工学
処理することができる(Jasny,Science 238:1653,19
87;Miller et al.,Genetic Engineering
,Vol.8,Plenum,Setlow et al.,eds.,pp.
277−297,1986)。
御配列,例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sおよび19S,およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞,例えば,Drosophila larva
eである。昆虫細胞を宿主として用いる場合,Drosophilaアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる(Rubin,Scien
ce 240:1453−1459,1988)。あるいは,バキュロウイルス
ベクターを,昆虫細胞においてPTP LARを大量に発現するよう遺伝子工学
処理することができる(Jasny,Science 238:1653,19
87;Miller et al.,Genetic Engineering
,Vol.8,Plenum,Setlow et al.,eds.,pp.
277−297,1986)。
【0117】 酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた,非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は,翻訳後修飾を行うこともできる点において,実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えD
NA戦略が存在し,これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
,リーダー配列を有するペプチド(すなわちプレペプチド)を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のキナーゼの発現にはいくつかの可能なベクター系が利用
可能である。
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた,非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は,翻訳後修飾を行うこともできる点において,実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えD
NA戦略が存在し,これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
,リーダー配列を有するペプチド(すなわちプレペプチド)を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のキナーゼの発現にはいくつかの可能なベクター系が利用
可能である。
【0118】 宿主の性質に応じて,広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは,制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源,例えばアデノウイルス,ウシパ
ピローマウイルス,サイトメガロウイルス,サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは,哺乳動物発現産物,例えばアクチン,コラーゲン,ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは,遺伝
子配列の発現を調節することができるように,抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは,温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか,化学物質(例え
ば代謝産物)制御を行うことができる制御シグナルである。
きる。転写および翻訳制御シグナルは,制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源,例えばアデノウイルス,ウシパ
ピローマウイルス,サイトメガロウイルス,サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは,哺乳動物発現産物,例えばアクチン,コラーゲン,ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは,遺伝
子配列の発現を調節することができるように,抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは,温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか,化学物質(例え
ば代謝産物)制御を行うことができる制御シグナルである。
【0119】 PTP LARの真核生物宿主における発現には,真核生物制御領域を使用す
ることが必要である。そのような領域は,一般に,RNA合成の開始を指示する
のに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには,例え
ば,マウスメタロチオネインI遺伝子配列のプロモーター(Hamer et
al.,J.Mol.Appl.Gen.1:273−288,1982);ヘ
ルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight,Cell 31:35
5−365,1982);SV40初期プロモーター(Benoist et
al.,Nature(London)290:304−31,1981);お
よび酵母gal4遺伝子配列プロモーター(Johnston et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:6971−6975
,1982;Silver et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.(USA)81:5951−5955,1984)が含まれる。
ることが必要である。そのような領域は,一般に,RNA合成の開始を指示する
のに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには,例え
ば,マウスメタロチオネインI遺伝子配列のプロモーター(Hamer et
al.,J.Mol.Appl.Gen.1:273−288,1982);ヘ
ルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight,Cell 31:35
5−365,1982);SV40初期プロモーター(Benoist et
al.,Nature(London)290:304−31,1981);お
よび酵母gal4遺伝子配列プロモーター(Johnston et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:6971−6975
,1982;Silver et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.(USA)81:5951−5955,1984)が含まれる。
【0120】 真核生物mRNAの翻訳は,最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため,真核生物プロモーターと,PTP LAR(またはその
機能的誘導体)をコードするDNA配列との間の連結には,メチオニンをコード
しうる介在コドン(すなわちAUG)が含まれないことを確実にすることが好ま
しい。そのようなコドンの存在は,融合蛋白質(AUGコドンがPTP LAR
のコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合)またはフレームシ
フト変異(AUGコドンがPTP LARのコーディング配列と同じリーディン
グフレームにない場合)の形成のいずれかをもたらす。
れる。この理由のため,真核生物プロモーターと,PTP LAR(またはその
機能的誘導体)をコードするDNA配列との間の連結には,メチオニンをコード
しうる介在コドン(すなわちAUG)が含まれないことを確実にすることが好ま
しい。そのようなコドンの存在は,融合蛋白質(AUGコドンがPTP LAR
のコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合)またはフレームシ
フト変異(AUGコドンがPTP LARのコーディング配列と同じリーディン
グフレームにない場合)の形成のいずれかをもたらす。
【0121】 PTP LARをコードする核酸分子および動作可能なように連結されたプロ
モーターは,レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に,非複製DN
AまたはRNA分子のいずれかとして導入することができ,これは,直線状分子
またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自己複製
することができず,遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生ずる。
あるいは,導入されたDNA配列が宿主染色体中にインテグレートされることに
より永久発現が得られる。
モーターは,レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に,非複製DN
AまたはRNA分子のいずれかとして導入することができ,これは,直線状分子
またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自己複製
することができず,遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生ずる。
あるいは,導入されたDNA配列が宿主染色体中にインテグレートされることに
より永久発現が得られる。
【0122】 所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたDNAをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は,発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする1またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは,栄養
要求性宿主に対する栄養,殺生物剤耐性(例えば抗生物質,または重金属,例え
ば銅)等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は,発現させるべき
DNA遺伝子配列に直接連結してもよく,または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。mRNAの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には,スプライシングシグナル,ならびに転写プロモーター,
エンハンサー,および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだc
DNA発現ベクターには,Okayama(Mol.Cell.Biol.3:
280−289,1983)により記載されるものが含まれる。
ることができる。導入されたDNAをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は,発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする1またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは,栄養
要求性宿主に対する栄養,殺生物剤耐性(例えば抗生物質,または重金属,例え
ば銅)等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は,発現させるべき
DNA遺伝子配列に直接連結してもよく,または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。mRNAの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には,スプライシングシグナル,ならびに転写プロモーター,
エンハンサー,および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだc
DNA発現ベクターには,Okayama(Mol.Cell.Biol.3:
280−289,1983)により記載されるものが含まれる。
【0123】 導入された核酸分子は,レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には,ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性;特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数;およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には,ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性;特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数;およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【0124】 好ましい原核生物ベクターには,E.coli中で複製しうるプラスミド(例
えば,,pBR322,ColEl,pSC101,pACYC184,ΣVX
;"Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual",1989,上掲)などのプラスミドが含まれる。.Bacillus
プラスミドには,pC194,pC221,pT127等が含まれる(Gryc
zan,The Molecular Biology of the Bac
illi,Academic Press,NY,pp.307−329,19
82)。適当なStreptomycesプラスミドには,p1J101(Ke
ndall et al.,J.Bacteriol.169:4177−41
83,1987),およびStreptomycesバクテリオファージ,例え
ばIC31(Chater et al.,Sixth Internatio
nal Symposiumon Actinomyc et ales Bi
ology,Akademiai Kaido,Budapest,Hunga
ry,pp.45−54,1986)が含まれる。Pseudomonasプラ
スミドはJohn et al.(Rev.Infect.Dis.8:693
−704,1986),およびIzaki(Jpn.J.Bacteriol.
33:729−742,1978)により概説されている。
えば,,pBR322,ColEl,pSC101,pACYC184,ΣVX
;"Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual",1989,上掲)などのプラスミドが含まれる。.Bacillus
プラスミドには,pC194,pC221,pT127等が含まれる(Gryc
zan,The Molecular Biology of the Bac
illi,Academic Press,NY,pp.307−329,19
82)。適当なStreptomycesプラスミドには,p1J101(Ke
ndall et al.,J.Bacteriol.169:4177−41
83,1987),およびStreptomycesバクテリオファージ,例え
ばIC31(Chater et al.,Sixth Internatio
nal Symposiumon Actinomyc et ales Bi
ology,Akademiai Kaido,Budapest,Hunga
ry,pp.45−54,1986)が含まれる。Pseudomonasプラ
スミドはJohn et al.(Rev.Infect.Dis.8:693
−704,1986),およびIzaki(Jpn.J.Bacteriol.
33:729−742,1978)により概説されている。
【0125】 好ましい真核生物プラスミドには,例えば,BPV,ワクチニア,SV40,
2−ミクロンサークル等,またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている(Botstein et al
.,Miami Wntr.Symp.19:265−274,1982;Br
oach,"The Molecular Biology of the Y
east Saccharomyces:Life Cycle and In
heritance",Cold Spring Harbor Labora
tory,Cold Spring Harbor,NY,p.445−470
,1981;Broach,Cell 28:203−204,1982;Bo
llon et al.,J.Clin.Hematol.Oncol.10:
39−48,1980;Maniatis,Cell Biology:A C
omprehensive Treatise,Vol.3,Gene Seq
uence Expression,Academic Press,NY,p
p.563−608,1980)。
2−ミクロンサークル等,またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている(Botstein et al
.,Miami Wntr.Symp.19:265−274,1982;Br
oach,"The Molecular Biology of the Y
east Saccharomyces:Life Cycle and In
heritance",Cold Spring Harbor Labora
tory,Cold Spring Harbor,NY,p.445−470
,1981;Broach,Cell 28:203−204,1982;Bo
llon et al.,J.Clin.Hematol.Oncol.10:
39−48,1980;Maniatis,Cell Biology:A C
omprehensive Treatise,Vol.3,Gene Seq
uence Expression,Academic Press,NY,p
p.563−608,1980)。
【0126】 構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後,DNA構築
物は,種々の適当な手段,すなわち,トランスフォーメーション,トランスフェ
クション,コンジュゲーション,プロトプラスト融合,エレクトロポレーション
,粒子銃技術,リン酸カルシウム沈澱,直接マイクロインジェクション等により
,適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後,レシピエ
ント細胞を,ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により,本発明のキナーゼまたはそのフラグメント
が産生される。これは,トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか,また
はこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる(例えば,ブロモデオキシ
ウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより)。本発明のペプチドを形成す
るために,種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい
条件は,生理学的条件を模倣した条件である。
物は,種々の適当な手段,すなわち,トランスフォーメーション,トランスフェ
クション,コンジュゲーション,プロトプラスト融合,エレクトロポレーション
,粒子銃技術,リン酸カルシウム沈澱,直接マイクロインジェクション等により
,適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後,レシピエ
ント細胞を,ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により,本発明のキナーゼまたはそのフラグメント
が産生される。これは,トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか,また
はこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる(例えば,ブロモデオキシ
ウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより)。本発明のペプチドを形成す
るために,種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい
条件は,生理学的条件を模倣した条件である。
【0127】IV.PTP LAR蛋白質 当該技術分野において知られる種々の方法論を用いて,PTP LARポリペ
プチドを得ることができる。ポリペプチドは,天然にポリペプチドを産生する組
織または細胞から精製することができる。あるいは,上述の単離された核酸フラ
グメントを用いてPTP LARを任意の生物中で発現させることができる。本
発明の試料には,細胞,蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物,または生物学的液
体が含まれる。試料は,アッセイフォーマット,検出方法,および試料として用
いられる組織,細胞または抽出物の性質に基づいて様々であろう。
プチドを得ることができる。ポリペプチドは,天然にポリペプチドを産生する組
織または細胞から精製することができる。あるいは,上述の単離された核酸フラ
グメントを用いてPTP LARを任意の生物中で発現させることができる。本
発明の試料には,細胞,蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物,または生物学的液
体が含まれる。試料は,アッセイフォーマット,検出方法,および試料として用
いられる組織,細胞または抽出物の性質に基づいて様々であろう。
【0128】 起源生物が天然にそのようなポリペプチドを含む限り,任意の真核生物をPT
P LARポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用
いる場合,"起源生物"とは,その生物においてサブユニットが発現されているか
,および最終的にそれから単離されたかにかかわらず,サブユニットのアミノ酸
配列が由来する元の生物を意味する。
P LARポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用
いる場合,"起源生物"とは,その生物においてサブユニットが発現されているか
,および最終的にそれから単離されたかにかかわらず,サブユニットのアミノ酸
配列が由来する元の生物を意味する。
【0129】 当業者は,天然の夾雑物を含まないポリペプチドを得るために,蛋白質を単離
する既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには,限定されないが,
サイズ排除クロマトグラフィー,HPLC,イオン交換クロマトグラフィー,お
よび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
する既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには,限定されないが,
サイズ排除クロマトグラフィー,HPLC,イオン交換クロマトグラフィー,お
よび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【0130】V.PTP LAR検出のための抗体,ハイブリドーマ,使用方法およびキット 本発明は,PTP LARに対する結合親和性を有する抗体またはこれらの抗
体を用いる方法に関する。ポリペプチドは,図9に記載されるアミノ酸配列,ま
たはその機能的誘導体,またはその少なくとも9個の連続するアミノ酸(好まし
くは,その少なくとも20,30,35,または40個の連続するアミノ酸)を
有することができる。
体を用いる方法に関する。ポリペプチドは,図9に記載されるアミノ酸配列,ま
たはその機能的誘導体,またはその少なくとも9個の連続するアミノ酸(好まし
くは,その少なくとも20,30,35,または40個の連続するアミノ酸)を
有することができる。
【0131】 本発明はまた,PTP LARに対する特異的結合親和性を有する抗体および
その使用に関する。そのような抗体は,PTP LARに対するその結合親和性
を他のポリペプチドに対するその結合親和性と比較することにより単離すること
ができる。PTP LARに選択的に結合する抗体は,PTP LARと他のポ
リペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択される
であろう。そのような方法には,限定されないが,他のポリペプチドを含む組織
における変更されたPTP LAR発現の分析が含まれる。
その使用に関する。そのような抗体は,PTP LARに対するその結合親和性
を他のポリペプチドに対するその結合親和性と比較することにより単離すること
ができる。PTP LARに選択的に結合する抗体は,PTP LARと他のポ
リペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択される
であろう。そのような方法には,限定されないが,他のポリペプチドを含む組織
における変更されたPTP LAR発現の分析が含まれる。
【0132】 PTP LARは,抗体またはハイブリドーマを生成するために用いることが
できる。当業者は,抗体が望まれる場合,そのようなペプチドを本明細書に記載
されるように生成し,免疫原として用いることができることを認識するであろう
。本発明の抗体には,モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体,ならびに
これらの抗体のフラグメント,およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒト
化型は,キメラ化またはCDRグラフティング等の当該技術分野において知られ
る手法の1つを用いて生成することができる。
できる。当業者は,抗体が望まれる場合,そのようなペプチドを本明細書に記載
されるように生成し,免疫原として用いることができることを認識するであろう
。本発明の抗体には,モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体,ならびに
これらの抗体のフラグメント,およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒト
化型は,キメラ化またはCDRグラフティング等の当該技術分野において知られ
る手法の1つを用いて生成することができる。
【0133】 本発明はまた,上述のモノクローナル抗体,またはその結合フラグメントを産
生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは,特定のモノクローナル抗体
を分泌することができる不死化細胞株である。
生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは,特定のモノクローナル抗体
を分泌することができる不死化細胞株である。
【0134】 一般に,モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている(Campbell,"Monolonal A
ntibody Technology:Laboratory Techni
ques in Biochemistry and Molecular B
iology",Elsevier Science Publishers,
Amsterdam,The Netherlands,1984;St.Gr
oth et al.,J.Immunol.Methods 35:1−21
,1980)。抗体を生成することが知られている任意の動物(マウス,ウサギ
等)を,選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には,ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は,免疫に用いるポリペプチドの量は,免疫
する動物,ポリペプチドの抗原性,および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
分野においてよく知られている(Campbell,"Monolonal A
ntibody Technology:Laboratory Techni
ques in Biochemistry and Molecular B
iology",Elsevier Science Publishers,
Amsterdam,The Netherlands,1984;St.Gr
oth et al.,J.Immunol.Methods 35:1−21
,1980)。抗体を生成することが知られている任意の動物(マウス,ウサギ
等)を,選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には,ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は,免疫に用いるポリペプチドの量は,免疫
する動物,ポリペプチドの抗原性,および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【0135】 ポリペプチドは,ペプチドの抗原性を増加させるために,修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には,抗原を異種蛋
白質(例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ)とカップリングさせるか
,または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には,抗原を異種蛋
白質(例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ)とカップリングさせるか
,または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【0136】 モノクローナル抗体のためには,免疫した動物から脾臓細胞を切除し,ミエロ
ーマ細胞,例えばSP2/0−Agl4ミエローマ細胞と融合させ,モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて,所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには,ハイブリドーマをELISA
アッセイ,ウエスタンブロット分析,またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる(Lutz et al.,Exp.CellR
es.175:109−124,1988)。所望の抗体を分泌するハイブリド
ーマをクローニングし,当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよ
びサブクラスを決定する(Campbell,"Monoclonal Ant
ibody Technology:Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Bio
logy",上掲,1984)。
ーマ細胞,例えばSP2/0−Agl4ミエローマ細胞と融合させ,モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて,所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには,ハイブリドーマをELISA
アッセイ,ウエスタンブロット分析,またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる(Lutz et al.,Exp.CellR
es.175:109−124,1988)。所望の抗体を分泌するハイブリド
ーマをクローニングし,当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよ
びサブクラスを決定する(Campbell,"Monoclonal Ant
ibody Technology:Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Bio
logy",上掲,1984)。
【0137】 ポリクローナル抗体については,免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し,上述の方法の1つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は,検出可能なように標識することができる。抗体
は,放射性同位体,アフィニティー標識(例えばビオチン,アビジン等),酵素
標識(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ,アルカリホスファターゼ等),蛍光
標識(例えばFITCまたはローダミン等),常磁性原子等を用いて,検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば,Stemberger et al.,J.H
istochem.Cytochem.18:315,1970;Bayer
et al.Meth.Enzym.62:308−,1979;Engval
et al.,Immunol.109:129−,1972;Goding
,J.Immunol.Meth.13:215−,1976を参照。本発明の
標識された抗体は,インビトロ,インビボ,およびインシトゥーアッセイに用い
て,特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
離し,上述の方法の1つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は,検出可能なように標識することができる。抗体
は,放射性同位体,アフィニティー標識(例えばビオチン,アビジン等),酵素
標識(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ,アルカリホスファターゼ等),蛍光
標識(例えばFITCまたはローダミン等),常磁性原子等を用いて,検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば,Stemberger et al.,J.H
istochem.Cytochem.18:315,1970;Bayer
et al.Meth.Enzym.62:308−,1979;Engval
et al.,Immunol.109:129−,1972;Goding
,J.Immunol.Meth.13:215−,1976を参照。本発明の
標識された抗体は,インビトロ,インビボ,およびインシトゥーアッセイに用い
て,特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【0138】 上述の抗体は,固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には,プラスチック,例えばポリカーボネート,複合炭水化物,例えばアガロー
スおよびセファロース,アクリル樹脂,例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている(Weir et al.,"Han
dbook of Experimental Immunology"4th
Ed.,Blackwell Scientific Publication
s,Oxford,England,Chapter 10,1986;Jac
oby et al.,Meth.Enzym.34,Academic Pr
ess,N.Y.,1974)。本発明の固定化された抗体は,インビトロ,イ
ンビボ,およびインシトゥーアッセイに,ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
には,プラスチック,例えばポリカーボネート,複合炭水化物,例えばアガロー
スおよびセファロース,アクリル樹脂,例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている(Weir et al.,"Han
dbook of Experimental Immunology"4th
Ed.,Blackwell Scientific Publication
s,Oxford,England,Chapter 10,1986;Jac
oby et al.,Meth.Enzym.34,Academic Pr
ess,N.Y.,1974)。本発明の固定化された抗体は,インビトロ,イ
ンビボ,およびインシトゥーアッセイに,ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【0139】 さらに,当業者は,合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
,現在利用可能な方法,並びに抗体に関して本明細書に記載される技術,方法お
よびキットを容易に適合させて,特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる(Hurby et al.,"Applicati
on of Synthetic Peptides:Antisense P
eptides",In Synthetic Peptides,A Use
r’s Guide,W.H.Freeman,NY,pp.289−307,
1992;Kaspczak et al.,Biochemistry 28
:9230−9238,1989)。
,現在利用可能な方法,並びに抗体に関して本明細書に記載される技術,方法お
よびキットを容易に適合させて,特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる(Hurby et al.,"Applicati
on of Synthetic Peptides:Antisense P
eptides",In Synthetic Peptides,A Use
r’s Guide,W.H.Freeman,NY,pp.289−307,
1992;Kaspczak et al.,Biochemistry 28
:9230−9238,1989)。
【0140】 抗ペプチドペプチドは,本発明のキナーゼのペプチド配列中に見いだされる塩
基性アミノ酸残基を,疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で置き
換えることにより生成することができる。例えば,リジン,アルギニン,および
/またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え,およ
びグルタミン酸残基をリジン,アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
基性アミノ酸残基を,疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で置き
換えることにより生成することができる。例えば,リジン,アルギニン,および
/またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え,およ
びグルタミン酸残基をリジン,アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
【0141】 本発明はまた,試料中でPTP LARを検出する方法を包含する。該方法は
,(a)試料を,免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ,
そして(b)ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する,ことを含む。
詳細には,該方法は,試験試料を1またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベ
ートし,抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で
本発明のPTP LARのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは
疾病または疾病の予後を示すかもしれない。
,(a)試料を,免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ,
そして(b)ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する,ことを含む。
詳細には,該方法は,試験試料を1またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベ
ートし,抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で
本発明のPTP LARのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは
疾病または疾病の予後を示すかもしれない。
【0142】 抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は,アッセイにおいて用いられるフォーマット,用いられる検出方法,およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は,慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット(例えばラジオイムノア
ッセイ,酵素結合イムノソルベントアッセイ,拡散に基づくオクタロニー,また
はロケット免疫蛍光アッセイ)の任意のものを,本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は,Chard("An Introduction to Radioimm
unoassy and Related Techniques",Else
vier Science Publishers,Amsterdam,Th
e Netherlands,1986),Bullock et al.("
Techniques in Immunocytochemistry",A
cademic Press,Orlando,FLVol.1,1982;V
ol.2,1983;Vol.3,1985),Tijssen("Pract
ice and Theory of Enzyme Immunoassys
:Laboratory Techniques in Biochemist
ry and Molecular Biology",Elsevier S
cience Publishers,Amsterdam,The Neth
erlands,1985)に見いだすことができる。
条件は,アッセイにおいて用いられるフォーマット,用いられる検出方法,およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は,慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット(例えばラジオイムノア
ッセイ,酵素結合イムノソルベントアッセイ,拡散に基づくオクタロニー,また
はロケット免疫蛍光アッセイ)の任意のものを,本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は,Chard("An Introduction to Radioimm
unoassy and Related Techniques",Else
vier Science Publishers,Amsterdam,Th
e Netherlands,1986),Bullock et al.("
Techniques in Immunocytochemistry",A
cademic Press,Orlando,FLVol.1,1982;V
ol.2,1983;Vol.3,1985),Tijssen("Pract
ice and Theory of Enzyme Immunoassys
:Laboratory Techniques in Biochemist
ry and Molecular Biology",Elsevier S
cience Publishers,Amsterdam,The Neth
erlands,1985)に見いだすことができる。
【0143】 本発明の免疫学的アッセイ試験試料には,細胞,蛋白質または細胞の膜抽出物
,または体液,例えば血液,血清,血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は,アッセイフォーマット,検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織,細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており,用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
,または体液,例えば血液,血清,血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は,アッセイフォーマット,検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織,細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており,用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【0144】 キットは,先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは,(i)上述の抗体を含む第1の容器手段,および(ii)抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第2の容器手段を含むことができ
る。好ましくは,キットは使用の指針も含む。別の好ましい態様においては,キ
ットは以下の1またはそれ以上を含む1またはそれ以上の他の容器をさらに含む
:洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
キットは,(i)上述の抗体を含む第1の容器手段,および(ii)抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第2の容器手段を含むことができ
る。好ましくは,キットは使用の指針も含む。別の好ましい態様においては,キ
ットは以下の1またはそれ以上を含む1またはそれ以上の他の容器をさらに含む
:洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
【0145】 検出試薬の例には,限定されないが,標識第2抗体が含まれ,あるいは,一次
抗体が標識されている場合には,標識された抗体と反応しうる発色団,酵素,ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は,本発明に記載される抗体を,
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの1つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
抗体が標識されている場合には,標識された抗体と反応しうる発色団,酵素,ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は,本発明に記載される抗体を,
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの1つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【0146】VI.PTP LARと相互作用する化合物の単離 本発明はまた,PTP LARに結合しうる化合物を検出する方法に関する。
該方法は,化合物をPTP LARとともにインキュベートし,PTP LAR
に結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は,複雑な混合物,例え
ば,血清,体液,または細胞抽出物中に存在していてもよい。
該方法は,化合物をPTP LARとともにインキュベートし,PTP LAR
に結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は,複雑な混合物,例え
ば,血清,体液,または細胞抽出物中に存在していてもよい。
【0147】 本発明はまた,PTP LAR活性またはPTP LAR結合パートナー活性
のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は,PTP
LARを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし,PTP LAR
活性またはPTP LAR結合パートナー活性のレベルの変化を検出することを
含む。このようにして同定される化合物は,化合物の存在を示す活性の変化を生
ずるであろう。化合物は,複雑な混合物,例えば,血清,体液,または細胞抽出
物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば,当該技術分野にお
いてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は,PTP
LARを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし,PTP LAR
活性またはPTP LAR結合パートナー活性のレベルの変化を検出することを
含む。このようにして同定される化合物は,化合物の存在を示す活性の変化を生
ずるであろう。化合物は,複雑な混合物,例えば,血清,体液,または細胞抽出
物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば,当該技術分野にお
いてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【0148】 本発明はまた,哺乳動物においてPTP LAR関連活性をアゴナイズ(促進
)するかまたはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は,前記哺乳動物に
PTP LARに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまた
はアンタゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。PTP LAR
関連機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量のアゴニストまた
はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む,哺乳動物においてPTP
LAR活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾病を治療する方法もま
た,本発明に包含される。
)するかまたはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は,前記哺乳動物に
PTP LARに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまた
はアンタゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。PTP LAR
関連機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量のアゴニストまた
はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む,哺乳動物においてPTP
LAR活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾病を治療する方法もま
た,本発明に包含される。
【0149】 疾病の新規な治療を発見することをめざして,生物医学研究者および化学者は
,蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し,合成し,試験してきた。いく
つかの小さい有機分子は蛋白質キナーゼの機能を調節する化合物の一群を形成す
る。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては,
限定されないが,ビス単環式,二環式または複素環式アリール化合物(PCT
WO92/20642,1992年11月26日公開,Maguire et
al.),ビニレン−アザインドール誘導体(PCT WO94/14808,
1994年7月7日公開,Ballinari et al.),1−シクロプ
ロピル−4−ピリジル−キノロン類(米国特許5,330,992),スチリル
化合物(米国特許5,217,999),スチリル置換ピリジル化合物(米国特
許5,302,606),ある種のキナゾリン誘導体(欧州特許出願05662
66A1),セレオインドール類およびセレニド類(PCT WO94/034
27,1994年2月17日公開,Denny et al.),三環式ポリヒ
ドロキシ化合物(PCT WO92/21660,1992年12月10日公開
,Dow),およびベンジルホスホン酸化合物(PCT WO91/15495
,1991年10月17日公開,Dow et al)が挙げられる。
,蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し,合成し,試験してきた。いく
つかの小さい有機分子は蛋白質キナーゼの機能を調節する化合物の一群を形成す
る。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては,
限定されないが,ビス単環式,二環式または複素環式アリール化合物(PCT
WO92/20642,1992年11月26日公開,Maguire et
al.),ビニレン−アザインドール誘導体(PCT WO94/14808,
1994年7月7日公開,Ballinari et al.),1−シクロプ
ロピル−4−ピリジル−キノロン類(米国特許5,330,992),スチリル
化合物(米国特許5,217,999),スチリル置換ピリジル化合物(米国特
許5,302,606),ある種のキナゾリン誘導体(欧州特許出願05662
66A1),セレオインドール類およびセレニド類(PCT WO94/034
27,1994年2月17日公開,Denny et al.),三環式ポリヒ
ドロキシ化合物(PCT WO92/21660,1992年12月10日公開
,Dow),およびベンジルホスホン酸化合物(PCT WO91/15495
,1991年10月17日公開,Dow et al)が挙げられる。
【0150】 細胞膜を横切ることができ,酸加水分解に耐性の化合物は,患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため,治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし,これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは,蛋白質キナー
ゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに,多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し
,したがって,疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
れた後に高度に生物利用性となることができるため,治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし,これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは,蛋白質キナー
ゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに,多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し
,したがって,疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【0151】 しかし,ある種のインドリノン化合物は,酸耐性であり膜透過性である有機分
子の一群を形成する。WO96/22976(1996年8月1日公開,Bal
linari et al.)は,オキシインドール環に融合したテトラリン,
ナフタレン,キノリン,およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は,さらに,ヒドロキシル化アルキル,
リン酸,およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Indolin
one Combinatorial Libraries and Rela
ted Products and Methods for the Tre
atment of Deseases"と題するTang et al.の米
国特許出願08/702,232(1996年8月23日出願;Lyon&Ly
on Docket No.221/187)および"Benzylidene
−Z−Indoline Compounds for the Treatm
ent of Deseases"と題するTang et alの米国特許出
願08/485,323(1995年6月7日出願;Lyon&Lyon Do
cket No.223/298)および国際特許出願WO96/40116(
1996年12月19日公開,Tang,et al.)およびWO96/22
976(1996年8月1日公開,Ballinari et al)(これら
はすべて,図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
)は,オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有す
るインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Indol
inone Combinatorial Libraries and Re
lated Products and Methods for the T
reatment of Deseases"と題するTang et al.
の出願08/702,232(1996年8月23日出願;Lyon&Lyon
Docket No.221/187),"Benzylidene−Z−I
ndoline Compounds for the Treatment
of Deseases"と題するTang et al.の08/485,3
23(1995年6月7日出願;Lyon&Lyon Docket No.2
23/298),およびWO96/22976(1996年8月1日公開,Ba
llinari et al.)は,インドリノンの合成方法,細胞におけるイ
ンドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻
害パターンを教示する。
子の一群を形成する。WO96/22976(1996年8月1日公開,Bal
linari et al.)は,オキシインドール環に融合したテトラリン,
ナフタレン,キノリン,およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は,さらに,ヒドロキシル化アルキル,
リン酸,およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Indolin
one Combinatorial Libraries and Rela
ted Products and Methods for the Tre
atment of Deseases"と題するTang et al.の米
国特許出願08/702,232(1996年8月23日出願;Lyon&Ly
on Docket No.221/187)および"Benzylidene
−Z−Indoline Compounds for the Treatm
ent of Deseases"と題するTang et alの米国特許出
願08/485,323(1995年6月7日出願;Lyon&Lyon Do
cket No.223/298)および国際特許出願WO96/40116(
1996年12月19日公開,Tang,et al.)およびWO96/22
976(1996年8月1日公開,Ballinari et al)(これら
はすべて,図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
)は,オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有す
るインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Indol
inone Combinatorial Libraries and Re
lated Products and Methods for the T
reatment of Deseases"と題するTang et al.
の出願08/702,232(1996年8月23日出願;Lyon&Lyon
Docket No.221/187),"Benzylidene−Z−I
ndoline Compounds for the Treatment
of Deseases"と題するTang et al.の08/485,3
23(1995年6月7日出願;Lyon&Lyon Docket No.2
23/298),およびWO96/22976(1996年8月1日公開,Ba
llinari et al.)は,インドリノンの合成方法,細胞におけるイ
ンドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻
害パターンを教示する。
【0152】 キナーゼ活性を調節することができる物質の他の例には,限定されないが,チ
ロホスチン,キナゾリン,キノキソリン,およびキノリンが含まれる。上述のキ
ナゾリン,チロホスチン,キノリン,およびキノキソリンには,よく知られる化
合物,例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば,キナゾリン類を記載
する代表的刊行物には,Barker et al.,欧州特許公開05207
22Al;Jones et al.,米国特許.4,447,608;Kab
be et al.,米国特許.4,757,072;Kaul and Vo
ugioukas,米国特許.5,316,553;Kreighbaum a
nd Comer,米国特許.4,343,940;Pegg and War
dleworth,欧州特許公開0562734A1;Barker et a
l.,(1991)Proc.of Am.Assoc.for Cancer
Research 32,327;Bertino,J.R.,(1979)
Cancer Research 3,293−304;Bertino,J.
R.,(1979)Cancer Research 9(2 part1),
293−304;Curtin et al.,(1986)Br.J.Can
cer 53,361−368;Fernandes et al.,(198
3)Cancer Research 43,1117−1123;Ferri
s et al.J.Org.Chem.44(2),173−178;Fry
et al.,(1994)Science265,1093−1095;Ja
ckmanet al.,(1981)Cancer Research 51
,5579−5586;Jones et al.J.Med.Chem.29
(6),1114−1118;Lee and Skibo,(1987)Bi
ochemistry 26(23),7355−7362;Lemus et
al.,(1989)J.Org.Chem.54,3511−3518;L
ey and Seng,(1975)Synthesis 1975,415
−522;Maxwell et al.,(1991)Magnetic R
esonance in Medicine 17,189−196;Mini
et al.,(1985)Cancer Research 45,325
−330;Phillips and Castle,J.(1980)Het
erocyclic Chem.17(19),1489−1596;Reec
e et al.,(1977)Cancer Research 47(11
):2996−2999;Sculler et al.,(1986)Can
cer Immunol.and Immunother.23,ASS;Si
kora et al.,(1984)Cancer Letters 23,
289−295;Sikora et al.,(1988)Analytic
al Biochem.172,344−355(これらすべては,図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する)が含まれる。
ロホスチン,キナゾリン,キノキソリン,およびキノリンが含まれる。上述のキ
ナゾリン,チロホスチン,キノリン,およびキノキソリンには,よく知られる化
合物,例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば,キナゾリン類を記載
する代表的刊行物には,Barker et al.,欧州特許公開05207
22Al;Jones et al.,米国特許.4,447,608;Kab
be et al.,米国特許.4,757,072;Kaul and Vo
ugioukas,米国特許.5,316,553;Kreighbaum a
nd Comer,米国特許.4,343,940;Pegg and War
dleworth,欧州特許公開0562734A1;Barker et a
l.,(1991)Proc.of Am.Assoc.for Cancer
Research 32,327;Bertino,J.R.,(1979)
Cancer Research 3,293−304;Bertino,J.
R.,(1979)Cancer Research 9(2 part1),
293−304;Curtin et al.,(1986)Br.J.Can
cer 53,361−368;Fernandes et al.,(198
3)Cancer Research 43,1117−1123;Ferri
s et al.J.Org.Chem.44(2),173−178;Fry
et al.,(1994)Science265,1093−1095;Ja
ckmanet al.,(1981)Cancer Research 51
,5579−5586;Jones et al.J.Med.Chem.29
(6),1114−1118;Lee and Skibo,(1987)Bi
ochemistry 26(23),7355−7362;Lemus et
al.,(1989)J.Org.Chem.54,3511−3518;L
ey and Seng,(1975)Synthesis 1975,415
−522;Maxwell et al.,(1991)Magnetic R
esonance in Medicine 17,189−196;Mini
et al.,(1985)Cancer Research 45,325
−330;Phillips and Castle,J.(1980)Het
erocyclic Chem.17(19),1489−1596;Reec
e et al.,(1977)Cancer Research 47(11
):2996−2999;Sculler et al.,(1986)Can
cer Immunol.and Immunother.23,ASS;Si
kora et al.,(1984)Cancer Letters 23,
289−295;Sikora et al.,(1988)Analytic
al Biochem.172,344−355(これらすべては,図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する)が含まれる。
【0153】 キノキサリン類は,Kaul and Vougioukas,米国特許5,
316,553,(図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
)に記載される。
316,553,(図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
)に記載される。
【0154】 キノリン類は,Dolle et al.,(1994)J.Med.Che
m.37,2627−2629;MaGuire,J.(1994)Med.C
hem.37,2129−2131;Burke et al.,(1993)
J.Med.Chem.36,425−432,−およびBurke et a
l.(1992)Bio Organic Med.Chem.Letters
2,1771−1774(これらすべては,図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する)に記載される。
m.37,2627−2629;MaGuire,J.(1994)Med.C
hem.37,2129−2131;Burke et al.,(1993)
J.Med.Chem.36,425−432,−およびBurke et a
l.(1992)Bio Organic Med.Chem.Letters
2,1771−1774(これらすべては,図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する)に記載される。
【0155】 チロホスチン類は,Alien et al.,(1993)Clin.Ex
p.Immunol.91,141−156;Anafi et al..(1
993)Blood 82:12,3524−3529;Baker et a
l.,(1992)J.Cell.Sci.102,543−555;Bild
er et al.,(1991)Amer.Physiol.Soc.pp.
6363−6143−.C721−C730;Bruntonet al.,(
1992)Proceedings of Amer.Assoc.Cance
r Rsch.33,558;Bryckaert et al.,(1992
)Exp.Cell Research 199,255−261;Dong
et al.,(1993)J.Leukocyte Biology 53,
53−60;Dong et al.,(1993)J.Immunol.15
1(5),2717−2724;Gazit et al..(1989)J.
Med.Chem.32,2344−2352;Gazit et al.,(
1993)J.Med.Chem.36,3556−3564;Kaur et
al.,(1994)Anti−Cancer Drugs 5,213−2
22;King et al.,(1991)Biochem.J.275,4
13−418;Kuo et al.,(1993)Cancer Lette
rs 74,197−202;Levitzki,A.,(1992)The
FASEB J.6,3275−3282;Lyall et al..(19
89)J.Biol.Chem.264,14503−14509;Peter
son et al.,(1993)The Prostate 22,335
−345;Pillemeret al.,(1992)Int.J.Canc
er 50,80−85;Posner et al.,(1993)Mole
cular Pharmacology 45,673−683;Rendu
et al.,(1992)Biol.Pharmacology 44(5)
,881−888;Sauro and Thomas,(1993)Life
Sciences 53,371−376;Sauro and Thoma
s,(1993)J.Pharm.and Experimental The
rapeutics 267(3),119−1125;Wolbring e
t al.,(1994)J.Biol.Chem.269(36),2247
0−22472;およびYoneda et al.,(1991)Cance
r Research51,4430−4435;(これらはすべて,図面を含
めその全体を本明細書の一部としてここに引用する)に記載される。
p.Immunol.91,141−156;Anafi et al..(1
993)Blood 82:12,3524−3529;Baker et a
l.,(1992)J.Cell.Sci.102,543−555;Bild
er et al.,(1991)Amer.Physiol.Soc.pp.
6363−6143−.C721−C730;Bruntonet al.,(
1992)Proceedings of Amer.Assoc.Cance
r Rsch.33,558;Bryckaert et al.,(1992
)Exp.Cell Research 199,255−261;Dong
et al.,(1993)J.Leukocyte Biology 53,
53−60;Dong et al.,(1993)J.Immunol.15
1(5),2717−2724;Gazit et al..(1989)J.
Med.Chem.32,2344−2352;Gazit et al.,(
1993)J.Med.Chem.36,3556−3564;Kaur et
al.,(1994)Anti−Cancer Drugs 5,213−2
22;King et al.,(1991)Biochem.J.275,4
13−418;Kuo et al.,(1993)Cancer Lette
rs 74,197−202;Levitzki,A.,(1992)The
FASEB J.6,3275−3282;Lyall et al..(19
89)J.Biol.Chem.264,14503−14509;Peter
son et al.,(1993)The Prostate 22,335
−345;Pillemeret al.,(1992)Int.J.Canc
er 50,80−85;Posner et al.,(1993)Mole
cular Pharmacology 45,673−683;Rendu
et al.,(1992)Biol.Pharmacology 44(5)
,881−888;Sauro and Thomas,(1993)Life
Sciences 53,371−376;Sauro and Thoma
s,(1993)J.Pharm.and Experimental The
rapeutics 267(3),119−1125;Wolbring e
t al.,(1994)J.Biol.Chem.269(36),2247
0−22472;およびYoneda et al.,(1991)Cance
r Research51,4430−4435;(これらはすべて,図面を含
めその全体を本明細書の一部としてここに引用する)に記載される。
【0156】 調節剤として用いることができる他の化合物には,オキシインドリノン,例え
ば,米国特許出願08/702,232(1996年8月23日出願,図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する)に記載されるものが含まれる。
ば,米国特許出願08/702,232(1996年8月23日出願,図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する)に記載されるものが含まれる。
【0157】VII.遺伝子治療 PTP LARまたはその遺伝子配列は,遺伝子治療においても有用である(
総説としてMiller,Nature 357:455−460,1992)
。Millerは,進歩により,ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治
療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な
科学はMulligan(Science 260:926−931,1993
)に記載されている。
総説としてMiller,Nature 357:455−460,1992)
。Millerは,進歩により,ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治
療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な
科学はMulligan(Science 260:926−931,1993
)に記載されている。
【0158】 1つの好ましい態様においては,PTP LARのコーディング配列を含む発
現ベクターを細胞に挿入し,細胞をインビトロで成長させ,次にこれを大量に患
者に注入する。別の好ましい態様においては,選択されたプロモーター(例えば
,強いプロモーター)を含むDNAセグメントを,本発明のキナーゼをコードす
る内因性遺伝子を含む細胞中に,プロモーターセグメントが内因性キナーゼ遺伝
子の発現を増強する様式で移送する(例えば,プロモーターセグメントをこれが
内因性キナーゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送する)。
現ベクターを細胞に挿入し,細胞をインビトロで成長させ,次にこれを大量に患
者に注入する。別の好ましい態様においては,選択されたプロモーター(例えば
,強いプロモーター)を含むDNAセグメントを,本発明のキナーゼをコードす
る内因性遺伝子を含む細胞中に,プロモーターセグメントが内因性キナーゼ遺伝
子の発現を増強する様式で移送する(例えば,プロモーターセグメントをこれが
内因性キナーゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送する)。
【0159】 遺伝子治療は,腫瘍を標的とするキナーゼcDNAを含むアデノウイルスの使
用を含むことができる。全身キナーゼは,遺伝子工学処理した細胞の移植,PT
P LARをコードするウイルスの注入,または裸のPTP LARDNAの適
当な組織への注入により増加する。
用を含むことができる。全身キナーゼは,遺伝子工学処理した細胞の移植,PT
P LARをコードするウイルスの注入,または裸のPTP LARDNAの適
当な組織への注入により増加する。
【0160】 そのような複合体の活性を調節するために,標的細胞集団を,蛋白質複合体の
1またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば,標的細胞中における複合体成分の活性(例えば上皮細胞移動)を
減少させるか阻害することにより,そのような状態を減少させ,阻害し,または
逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持し
ているが上皮細胞移動またはPTP LARの他の機能を調節するよう機能する
ことができない成分の欠失またはミスセンス変異体もまた有用である。
1またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば,標的細胞中における複合体成分の活性(例えば上皮細胞移動)を
減少させるか阻害することにより,そのような状態を減少させ,阻害し,または
逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持し
ているが上皮細胞移動またはPTP LARの他の機能を調節するよう機能する
ことができない成分の欠失またはミスセンス変異体もまた有用である。
【0161】 蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持しているが,シグナル伝達
において機能することができない成分の欠失またはミスセンス変異体を用いて,
異常な,有害なシグナル伝達事象を阻害することができる。
において機能することができない成分の欠失またはミスセンス変異体を用いて,
異常な,有害なシグナル伝達事象を阻害することができる。
【0162】 ウイルス,例えばレトロウイルス,ワクチニアウイルス,アデノウイルス,ア
デノ随伴ウイルス,ヘルペスウイルス,いくつかのRNAウイルス,またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて,本発明の組換えキナーゼ
をコードするヌクレオチド配列(例えばcDNA)を標的細胞集団(例えば腫瘍
細胞)に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて,コーディ
ング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる(Maniat
is et al.,Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,N.Y.,1989;Ausubel et al.,Curre
nt Protocols in Molecular Biology,Gr
eene Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.,1989)。あるいは,蛋白質配列を
コードする組換え核酸分子を裸のDNAとしてまたは再構築系,例えば標的細胞
への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる(例
えば,Felgner et al.,Nature 337:387−8,1
989)。ヒト遺伝子治療において用いるための,プラスミドDNAを細胞内に
直接輸送するいくつかの他の方法が存在し,これはプラスミドDNAを蛋白質に
複合体化させることによりDNAを細胞上のレセプターにターゲティングするこ
とを含む(Miller,上掲)。
デノ随伴ウイルス,ヘルペスウイルス,いくつかのRNAウイルス,またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて,本発明の組換えキナーゼ
をコードするヌクレオチド配列(例えばcDNA)を標的細胞集団(例えば腫瘍
細胞)に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて,コーディ
ング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる(Maniat
is et al.,Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,N.Y.,1989;Ausubel et al.,Curre
nt Protocols in Molecular Biology,Gr
eene Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.,1989)。あるいは,蛋白質配列を
コードする組換え核酸分子を裸のDNAとしてまたは再構築系,例えば標的細胞
への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる(例
えば,Felgner et al.,Nature 337:387−8,1
989)。ヒト遺伝子治療において用いるための,プラスミドDNAを細胞内に
直接輸送するいくつかの他の方法が存在し,これはプラスミドDNAを蛋白質に
複合体化させることによりDNAを細胞上のレセプターにターゲティングするこ
とを含む(Miller,上掲)。
【0163】 最も簡単な形においては,遺伝子輸送は,単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のDNAを注入することにより行うことができる(C
apecchi,Cell 22:479−88,1980)。組換え遺伝子は
,いったん細胞内に導入されると,転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ,遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
DNAを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には,DNA
をCaPO4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション(Chen et al.,Mol.Cell Biol.7:2
745−52,1987);細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション(Chu et al.,Nucleic Acids Re
s.15:1311−26,1987);DNAを親油性ベヒクル中に封入し,
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン/リポソーム融合(Felgner
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:74
13−7417,1987);および小さい発射体に結合させたDNAを用いる
粒子衝撃(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
87:9568−9572,1990)が含まれる。DNAを細胞内に導入する
他の方法は,DNAを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
により細胞の核内に最小量のDNAを注入することにより行うことができる(C
apecchi,Cell 22:479−88,1980)。組換え遺伝子は
,いったん細胞内に導入されると,転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ,遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
DNAを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には,DNA
をCaPO4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション(Chen et al.,Mol.Cell Biol.7:2
745−52,1987);細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション(Chu et al.,Nucleic Acids Re
s.15:1311−26,1987);DNAを親油性ベヒクル中に封入し,
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン/リポソーム融合(Felgner
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:74
13−7417,1987);および小さい発射体に結合させたDNAを用いる
粒子衝撃(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
87:9568−9572,1990)が含まれる。DNAを細胞内に導入する
他の方法は,DNAを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【0164】 また,アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ,DNAの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをDNA複合体を
含む溶液と混合するか,または組換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改
良する蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにDN
Aを結合させる(Curiel et al.,Am.J.Respir.Ce
ll.Mol.Biol.6:247−52,1992)。
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをDNA複合体を
含む溶液と混合するか,または組換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改
良する蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにDN
Aを結合させる(Curiel et al.,Am.J.Respir.Ce
ll.Mol.Biol.6:247−52,1992)。
【0165】 本明細書において用いる場合,"遺伝子輸送"とは,外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は,一般に,遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には,蛋白質,ポリペプチド,
アンチセンスDNAまたはRNA,または酵素的に活性なRNAが含まれる。遺
伝子輸送は,培養細胞中で,または動物への直接投与により行うことができる。
一般に,遺伝子輸送には,核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ,核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ,核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに,発現には,核酸が細胞の核に移動し,転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
入する工程を意味する。遺伝子輸送は,一般に,遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には,蛋白質,ポリペプチド,
アンチセンスDNAまたはRNA,または酵素的に活性なRNAが含まれる。遺
伝子輸送は,培養細胞中で,または動物への直接投与により行うことができる。
一般に,遺伝子輸送には,核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ,核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ,核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに,発現には,核酸が細胞の核に移動し,転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【0166】 本明細書において用いる場合,"遺伝子治療"とは,遺伝子輸送の1つの形であ
り,本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ,特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は,細胞でエクスビボで行い,次に患者に移植することにより,ま
たは,核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより,行うこと
ができる。
り,本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ,特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は,細胞でエクスビボで行い,次に患者に移植することにより,ま
たは,核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより,行うこと
ができる。
【0167】 別の好ましい態様においては,PTP LARをコードする核酸配列を有する
ベクターが提供され,ここで,核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。
組織特異的遺伝子発現を行う方法は,国際公開WO93/09236(1992
年11月3日出願,1993年5月13日公開)に記載される。
ベクターが提供され,ここで,核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。
組織特異的遺伝子発現を行う方法は,国際公開WO93/09236(1992
年11月3日出願,1993年5月13日公開)に記載される。
【0168】 上述したすべてのベクターにおいて,本発明のさらに別の観点は,ベクターに
含まれる核酸配列が,核酸の配列の一部または全てについて,上で定義したよう
な付加,欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
含まれる核酸配列が,核酸の配列の一部または全てについて,上で定義したよう
な付加,欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【0169】 別の好ましい態様においては,遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合,"遺伝子置換"とは,インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し,このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
いて用いる場合,"遺伝子置換"とは,インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し,このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【0170】VIII.物質の投与 患者に投与すべき化合物の投与量を決定する方法,および化合物を生物に投与
するモードは,米国特許08/702,282(1996年8月23日出願)お
よび国際公開WO96/22976(1996年8月1日公開)に記載されてお
り,これらの両方とも,図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用
する。当業者は,そのような記載が本発明に適用可能であり,これに容易に適合
しうることを理解するであろう。
するモードは,米国特許08/702,282(1996年8月23日出願)お
よび国際公開WO96/22976(1996年8月1日公開)に記載されてお
り,これらの両方とも,図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用
する。当業者は,そのような記載が本発明に適用可能であり,これに容易に適合
しうることを理解するであろう。
【0171】 適切な投与量は,種々の因子,例えば,治療している疾病のタイプ,用いられ
る特定の組成物,および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は,最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば,動物モデルにおいて,最初は細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたIC50を考慮した循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて,ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
る特定の組成物,および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は,最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば,動物モデルにおいて,最初は細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたIC50を考慮した循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて,ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
【0172】 薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿,腫瘍,および主要な臓器におけ
る生物学的分布を決定して,疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば,薬剤で処
置した動物の血漿についてHPLC分析を行い,X線,CATスキャン,および
MRI等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが,不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は,化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては,優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
る生物学的分布を決定して,疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば,薬剤で処
置した動物の血漿についてHPLC分析を行い,X線,CATスキャン,および
MRI等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが,不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は,化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては,優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
【0173】 毒性研究は,血液細胞組成物を測定することにより実施することもできる。例
えば,以下のようにして,適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができ
る1)化合物をマウスに投与し(未処置対照マウスも用いなければならない);
2)各処置群の1匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し;そして
3)試料を,赤血球および白血球数,血液細胞組成物,およびリンパ球対多形核
細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は
,毒性が存在するか否かを示す。
えば,以下のようにして,適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができ
る1)化合物をマウスに投与し(未処置対照マウスも用いなければならない);
2)各処置群の1匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し;そして
3)試料を,赤血球および白血球数,血液細胞組成物,およびリンパ球対多形核
細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は
,毒性が存在するか否かを示す。
【0174】 各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより(好ましくは,the A
merican Veterinary Medical Associati
on guidelines Report of the American
Veterinary Medical Assoc.Panel on E
uthanasia,Journal of American Veteri
nary Medical Assoc./202:229−249,1993
にしたがって),さらなる研究を実施することができる。次に,各処置群の代表
的動物を,肉眼剖検により転移の直接証拠,異常な不健康,または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し,組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物,および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に,有害な影響が大きければ大きいほど
,化合物はより好ましくない。
merican Veterinary Medical Associati
on guidelines Report of the American
Veterinary Medical Assoc.Panel on E
uthanasia,Journal of American Veteri
nary Medical Assoc./202:229−249,1993
にしたがって),さらなる研究を実施することができる。次に,各処置群の代表
的動物を,肉眼剖検により転移の直接証拠,異常な不健康,または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し,組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物,および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に,有害な影響が大きければ大きいほど
,化合物はより好ましくない。
【0175】 癌の治療においては,疎水性薬剤の予測される1日用量は1−500mg/d
ay,好ましくは,1−250mg/day,最も好ましくは,1−50mg/
dayの範囲である。薬剤は,活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持する
のに十分であるかぎり,より少ない頻度で投与することができる。
ay,好ましくは,1−250mg/day,最も好ましくは,1−50mg/
dayの範囲である。薬剤は,活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持する
のに十分であるかぎり,より少ない頻度で投与することができる。
【0176】 血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に,化合物が強力であ
ればあるほど,有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
ればあるほど,有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【0177】 本発明に関連する他の方法は,本明細書において開示される実施例に記載され
る。
る。
【0178】実施例 以下の実施例は限定的なものではなく,単に本発明の種々の観点および特徴の
代表例にすぎない。以下の実施例は,上皮細胞移動および腫瘍阻害におけるPT
P LARの役割を示す。
代表例にすぎない。以下の実施例は,上皮細胞移動および腫瘍阻害におけるPT
P LARの役割を示す。
【0179】一般的材料および方法 α−カテニン,β−カテニン,およびプラコグロビン(γ−カテニン)のクロー ニング ヒトα−カテニン(受託番号D14705),β−カテニン(Z19054)
,およびプラコグロビン(M23410)は,MCF7細胞から生成したcDN
AからPCRにより増幅した。PCR産物をCMVプロモーターの制御下の真核
生物発現ベクター中にクローニングし,配列分析により確認した。
,およびプラコグロビン(M23410)は,MCF7細胞から生成したcDN
AからPCRにより増幅した。PCR産物をCMVプロモーターの制御下の真核
生物発現ベクター中にクローニングし,配列分析により確認した。
【0180】細胞株および細胞培養 すべての細胞株は,the American Tissue Cultur
e Collectionから入手した。NETII細胞(CRL−1655)
は,1%非必須アミノ酸,イーグル平衡塩,2mMグルタミン,1mMピルビン
酸ナトリウムおよび10%FCS(Sigma)を補充したMFM中で成長させ
た。MCF7細胞(HTB22)は,2mMグルタミンおおび10%FCSを補
充したRPMI培地で成長させ,ヒト胚性293腎細胞(CRL1573)は,
1mg/mLグルコース,2mMグルタミンおよび10%FCSを補充したダル
ベッコ改変イーグル培地で成長させた。FCSは日常的に熱不活性化した。すべ
ての培地および補充物は,GibcoBRLから入手した。
e Collectionから入手した。NETII細胞(CRL−1655)
は,1%非必須アミノ酸,イーグル平衡塩,2mMグルタミン,1mMピルビン
酸ナトリウムおよび10%FCS(Sigma)を補充したMFM中で成長させ
た。MCF7細胞(HTB22)は,2mMグルタミンおおび10%FCSを補
充したRPMI培地で成長させ,ヒト胚性293腎細胞(CRL1573)は,
1mg/mLグルコース,2mMグルタミンおよび10%FCSを補充したダル
ベッコ改変イーグル培地で成長させた。FCSは日常的に熱不活性化した。すべ
ての培地および補充物は,GibcoBRLから入手した。
【0181】移動アッセイ インビトロ創傷アッセイのためには,NETII細胞を7x104細胞/cm2 の密度で播種した。24時間後,ピペットチップでコンフルエント単層を掻き取
って無細胞領域を作成し,成長因子を加え,創傷閉合を写真で記録した。スキャ
ッターアッセイのためには,細胞を1x104細胞/cm2の細胞密度で播種した
。24時間後に成長因子を加え,細胞の形態および小さいコロニーの分散を写真
で記録した。移動の定量化は,異なる,ランダムに選択した顕微鏡視野において
,繊維芽細胞状移動形態を有する単一の細胞を,上皮形態を有する細胞群と比較
することにより行った。皿1枚あたり1000個の細胞を計数した。すべての移
動アッセイは三重に行った。チロシンキナーゼ(TK),有糸分裂促進物質活性
化蛋白質キナーゼ(MAPK)またはホスファチジルイノシトール−3−キナー
ゼ(P13K)は,成長因子を加える1時間前に加えたゲニステイン(250μ
M;Biomol)により阻害した。対照として,溶媒DMSOを用いた。DN
A合成は,成長因子を加える1時間前に,DNAポリメラーゼの特異的阻害剤で
あるアフィジコリン(1.5μM;Serva)により阻害した。
って無細胞領域を作成し,成長因子を加え,創傷閉合を写真で記録した。スキャ
ッターアッセイのためには,細胞を1x104細胞/cm2の細胞密度で播種した
。24時間後に成長因子を加え,細胞の形態および小さいコロニーの分散を写真
で記録した。移動の定量化は,異なる,ランダムに選択した顕微鏡視野において
,繊維芽細胞状移動形態を有する単一の細胞を,上皮形態を有する細胞群と比較
することにより行った。皿1枚あたり1000個の細胞を計数した。すべての移
動アッセイは三重に行った。チロシンキナーゼ(TK),有糸分裂促進物質活性
化蛋白質キナーゼ(MAPK)またはホスファチジルイノシトール−3−キナー
ゼ(P13K)は,成長因子を加える1時間前に加えたゲニステイン(250μ
M;Biomol)により阻害した。対照として,溶媒DMSOを用いた。DN
A合成は,成長因子を加える1時間前に,DNAポリメラーゼの特異的阻害剤で
あるアフィジコリン(1.5μM;Serva)により阻害した。
【0182】ヌードマウスにおける腫瘍形成 NETII細胞は,2x106/50μLの細胞密度でMEMに懸濁し,スイ
スヌードマウス(IGR Villejuif,Paris,France)の
横腹領域の皮下に注入した。腫瘍形成は,腫瘍の幅(W)および長さ(L)(W
<L)を測定することによりモニターした。腫瘍体積は,式(W2xLxπ/6
)にしたがって計算した。アッセイは少なくとも三重に行った。
スヌードマウス(IGR Villejuif,Paris,France)の
横腹領域の皮下に注入した。腫瘍形成は,腫瘍の幅(W)および長さ(L)(W
<L)を測定することによりモニターした。腫瘍体積は,式(W2xLxπ/6
)にしたがって計算した。アッセイは少なくとも三重に行った。
【0183】組換えレトロウイルスの生成およびレトロウイルス媒介性遺伝子輸送 全長PTP LAR(H.Saito,Harvard Medical S
chool,Boston,USA)を,pLXSNベクター(Miller,
et al.(1989)Bio Techniques 7,(図面および
表を含め,その全体を本明細書の一部としてここに引用する)中にサブクローニ
ングした。安定なNETII細胞株は,記載されるように(Pear, et
al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,8
392−8396(図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに
引用する)),レトロウイルス遺伝子輸送により生成した。ポリクローンおよび
クローン細胞株は,0.5mg/mLG418(GibcoBRL,FRG)を
含有する培地中で選択した。異所性発現は,免疫沈澱およびウエスタンブロット
分析により確認した。
chool,Boston,USA)を,pLXSNベクター(Miller,
et al.(1989)Bio Techniques 7,(図面および
表を含め,その全体を本明細書の一部としてここに引用する)中にサブクローニ
ングした。安定なNETII細胞株は,記載されるように(Pear, et
al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,8
392−8396(図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに
引用する)),レトロウイルス遺伝子輸送により生成した。ポリクローンおよび
クローン細胞株は,0.5mg/mLG418(GibcoBRL,FRG)を
含有する培地中で選択した。異所性発現は,免疫沈澱およびウエスタンブロット
分析により確認した。
【0184】過渡的発現,細胞溶解および免疫沈澱 ヒト293胚性腎細胞の過渡的トランスフェクションは,記載されるようにし
て行った(Chen, et al.(1987)Mol.Cell.Biol
.7,2745−2752,(図面および表を含め,その全体を本明細書の一部
としてここに引用する))。生化学的分析のためには,NBTII細胞は,1x
104細胞/cm2の密度で溶解の前日に播種した。示される場合には,細胞を溶
解する前に指示された時間Na−オルトバナジン酸(1mM)で前処理した。氷
冷PBSで洗浄した後,細胞を氷冷溶解緩衝液(50mMHEPES,pH7.
5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%グリセロール,20mM
ピロリン酸,1%TritonX−100,100mM NaFl,2mMフッ
化フェニルメチルスルホニル,20μg/mLアプロチニン,20μg/mLロ
イペプチン,0.7μ/mLペプスタチン,0.2mMモリブデン酸アンモニウ
ム,2mM Na−オルトバナジン酸)中で溶解させ,12,500xgで10
分間,4℃で遠心分離することによりあらかじめ透明にした。上清の蛋白質濃度
が同じになるように調節した。HNTG緩衝液(20mMHEPES,pH7.
5,150mM NaCl,10mMピロリン酸,10mM NaFl,0.2
mMモリブデン酸アンモニウム,10%グリセロール,0.1%TritonX
−100,2mM Na−オルトバナジン酸)を1:1比で加え,免疫沈澱を4
℃で2時間行った。プロテインAまたはプロテインG−セファロースを加え,さ
らに2時間おいた。沈殿物をHNTG緩衝液で3回洗浄し,ビーズをSDS−試
料緩衝液に再懸濁した。続くウエスタンブロット分析のためには,SDS−PA
GEにより分離した蛋白質をニトロセルロース(Schleicher and
Schuell)に移し,それぞれの抗体とともにインキュベートした。蛋白
質はECLシステム(Amersham)により可視化した。再探索する前に,
68mMTris−HCl,pH6.8,2%SDS,および0.1%β−メル
カプトエタノール中で50℃で1時間インキュベートすることにより,ブロット
をはがした。
て行った(Chen, et al.(1987)Mol.Cell.Biol
.7,2745−2752,(図面および表を含め,その全体を本明細書の一部
としてここに引用する))。生化学的分析のためには,NBTII細胞は,1x
104細胞/cm2の密度で溶解の前日に播種した。示される場合には,細胞を溶
解する前に指示された時間Na−オルトバナジン酸(1mM)で前処理した。氷
冷PBSで洗浄した後,細胞を氷冷溶解緩衝液(50mMHEPES,pH7.
5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%グリセロール,20mM
ピロリン酸,1%TritonX−100,100mM NaFl,2mMフッ
化フェニルメチルスルホニル,20μg/mLアプロチニン,20μg/mLロ
イペプチン,0.7μ/mLペプスタチン,0.2mMモリブデン酸アンモニウ
ム,2mM Na−オルトバナジン酸)中で溶解させ,12,500xgで10
分間,4℃で遠心分離することによりあらかじめ透明にした。上清の蛋白質濃度
が同じになるように調節した。HNTG緩衝液(20mMHEPES,pH7.
5,150mM NaCl,10mMピロリン酸,10mM NaFl,0.2
mMモリブデン酸アンモニウム,10%グリセロール,0.1%TritonX
−100,2mM Na−オルトバナジン酸)を1:1比で加え,免疫沈澱を4
℃で2時間行った。プロテインAまたはプロテインG−セファロースを加え,さ
らに2時間おいた。沈殿物をHNTG緩衝液で3回洗浄し,ビーズをSDS−試
料緩衝液に再懸濁した。続くウエスタンブロット分析のためには,SDS−PA
GEにより分離した蛋白質をニトロセルロース(Schleicher and
Schuell)に移し,それぞれの抗体とともにインキュベートした。蛋白
質はECLシステム(Amersham)により可視化した。再探索する前に,
68mMTris−HCl,pH6.8,2%SDS,および0.1%β−メル
カプトエタノール中で50℃で1時間インキュベートすることにより,ブロット
をはがした。
【0185】インビトロ結合アッセイ GST−hPTP LARi−融合蛋白質をコードするプラスミドは,ヒトP
TP LARのアミノ酸1259−1881の間のcDNA配列をPCR増幅し
,適当なpGEXベクター(Pharmacia Biotech)中にクロー
ニングすることにより構築した。元のベクターpSP65−LARのインビトロ
突然変異(Kunkel, et al.(1987)Methods Enz
yme1.154,367−382(図面および表を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する))により,不活性化PTPドメイン1,PTP L
AR D1C1522S,または不活性化PTPドメイン2,PTP LAR
D2C1813Sを有するPTP LARを得た。これもまたヒトPTP LA
Rのアミノ酸1259−1881の間をPCR増幅し,pGEXベクターにサブ
クローニングした。サブクローニングされたPCR産物の完全性は,配列分析に
より確認した。GST−融合蛋白質をE.coilで発現させ,記載されるよう
に精製した(Smith,et al.(1988)Gene 67,31−4
0(図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する))。
3μgのGST−hPTP LARi−融合蛋白質,または3倍モル過剰のGS
Tを,等量の細胞溶解物と4℃でインキュベートし,グルタチオン−セファロー
ス(Sigma,FRG)に固定化し,HNTGで3回洗浄した。ウエスタンブ
ロッティングのために,結合した蛋白質をSDS−PAGEにより分離した。
TP LARのアミノ酸1259−1881の間のcDNA配列をPCR増幅し
,適当なpGEXベクター(Pharmacia Biotech)中にクロー
ニングすることにより構築した。元のベクターpSP65−LARのインビトロ
突然変異(Kunkel, et al.(1987)Methods Enz
yme1.154,367−382(図面および表を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する))により,不活性化PTPドメイン1,PTP L
AR D1C1522S,または不活性化PTPドメイン2,PTP LAR
D2C1813Sを有するPTP LARを得た。これもまたヒトPTP LA
Rのアミノ酸1259−1881の間をPCR増幅し,pGEXベクターにサブ
クローニングした。サブクローニングされたPCR産物の完全性は,配列分析に
より確認した。GST−融合蛋白質をE.coilで発現させ,記載されるよう
に精製した(Smith,et al.(1988)Gene 67,31−4
0(図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する))。
3μgのGST−hPTP LARi−融合蛋白質,または3倍モル過剰のGS
Tを,等量の細胞溶解物と4℃でインキュベートし,グルタチオン−セファロー
ス(Sigma,FRG)に固定化し,HNTGで3回洗浄した。ウエスタンブ
ロッティングのために,結合した蛋白質をSDS−PAGEにより分離した。
【0186】アフィニティー精製 GST−E−カドヘリン細胞質−融合蛋白質をコードするプラスミドは,ネズ
ミE−カドヘリン(Nagafuchi,et al.(1987)Natur
e 329,341−343,(図面および表を含めその全体を本明細書の一部
としてここに引用する))のアミノ酸734−884の間のcDNA配列をPC
Rにより増幅し,適当なpGEXベクター中にクローニングすることにより構築
した。アフィニティー精製のためには,等濃度のあらかじめ透明にしたNETI
I細胞溶解物を,5μgの精製GST−Eカドヘリン細胞質−融合蛋白質または
3倍モル過剰のGSTとともにインキュベートし,グルタチオンセファロースに
固定化した。得られた複合体をHNTGで3回洗浄し,結合した蛋白質をSDS
−PAGEにより分離し,ウエスタンブロッティングを行った。
ミE−カドヘリン(Nagafuchi,et al.(1987)Natur
e 329,341−343,(図面および表を含めその全体を本明細書の一部
としてここに引用する))のアミノ酸734−884の間のcDNA配列をPC
Rにより増幅し,適当なpGEXベクター中にクローニングすることにより構築
した。アフィニティー精製のためには,等濃度のあらかじめ透明にしたNETI
I細胞溶解物を,5μgの精製GST−Eカドヘリン細胞質−融合蛋白質または
3倍モル過剰のGSTとともにインキュベートし,グルタチオンセファロースに
固定化した。得られた複合体をHNTGで3回洗浄し,結合した蛋白質をSDS
−PAGEにより分離し,ウエスタンブロッティングを行った。
【0187】抗血清 ホスホチロシン(4G10)に対するモノクローナル抗体はUBIから入手し
た。α−カテニン,β−カテニン,プラコグロビンおよびE−カドヘリン抗体は
,Transduction Laboratoriesから入手した。E−カ
ドヘリンに対する第2抗体は,ヒトE−カドヘリンのアミノ酸834−913を
含むGST−融合蛋白質に対して生成した。モノクローナル抗体11.1A(M
.Streuli,Dana Farber Cancer Institut
e,Boston,USA)は,ヒトPTP LAR(Streuli, et
al.(1992)EMBO J.11,897−907)の細胞外ドメイン
を認識する。ウサギ抗血清#320(Y.Schlessinger,New
York University Medical Center,New Y
ork,USA)はPTP LARのC末端(アミノ酸1868−1881)に
対応するペプチドに対するものである。
た。α−カテニン,β−カテニン,プラコグロビンおよびE−カドヘリン抗体は
,Transduction Laboratoriesから入手した。E−カ
ドヘリンに対する第2抗体は,ヒトE−カドヘリンのアミノ酸834−913を
含むGST−融合蛋白質に対して生成した。モノクローナル抗体11.1A(M
.Streuli,Dana Farber Cancer Institut
e,Boston,USA)は,ヒトPTP LAR(Streuli, et
al.(1992)EMBO J.11,897−907)の細胞外ドメイン
を認識する。ウサギ抗血清#320(Y.Schlessinger,New
York University Medical Center,New Y
ork,USA)はPTP LARのC末端(アミノ酸1868−1881)に
対応するペプチドに対するものである。
【0188】インビトロ脱リン酸化アッセイ ヒト293胚性腎細胞においてβ−カテニンを過渡的に過剰発現させた。細胞
を血清飢餓とし,過バナジン酸(0.3μMH2O2/0.1mM Na−オルト
バナジン酸)で10分間処理し,溶解した。免疫沈澱は上述したように行い,た
だし,ピロリン酸,モリブデン酸アンモニウム,およびNa−オルトバナジン酸
を含まないHNTGを用いた。チロシンリン酸化β−カテニンに対するPTP活
性は,25mM HEPES,pH7.5,5mM EDTA,10mM DT
T,および1mg/mL BSAを含む200μL反応液中で,200ngのG
ST−hPTP LAR細胞質,GST−hPTP LARD1C1522S,
またはGST−hPTP LARD2C1813Sを加えて,25℃でアッセイ
した。HNTGで洗浄することにより反応を停止し,次にSDS−PAGEで分
離した。チロシンのリン酸化状態は,抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタン
ブロッティングにより分析した。
を血清飢餓とし,過バナジン酸(0.3μMH2O2/0.1mM Na−オルト
バナジン酸)で10分間処理し,溶解した。免疫沈澱は上述したように行い,た
だし,ピロリン酸,モリブデン酸アンモニウム,およびNa−オルトバナジン酸
を含まないHNTGを用いた。チロシンリン酸化β−カテニンに対するPTP活
性は,25mM HEPES,pH7.5,5mM EDTA,10mM DT
T,および1mg/mL BSAを含む200μL反応液中で,200ngのG
ST−hPTP LAR細胞質,GST−hPTP LARD1C1522S,
またはGST−hPTP LARD2C1813Sを加えて,25℃でアッセイ
した。HNTGで洗浄することにより反応を停止し,次にSDS−PAGEで分
離した。チロシンのリン酸化状態は,抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタン
ブロッティングにより分析した。
【0189】免疫蛍光 NBII細胞を1x104細胞/cm2または7x104細胞/cm2の密度で播
種した。24時間後,細胞をリン酸緩衝化食塩水(PBS,pH7.4,125
mMショ糖)中2%パラホルムアルデヒドで固定した。自己蛍光は,PBSグリ
シン(100mMグリシン,0.1%PGS中ホウ水素)を用いて消光し,細胞
をPBS中0.5%サポニンで透過性にした(5分間)。非特異的抗体結合は,
リン酸緩衝化ゼラチン(PBG:PBS,0.5%ウシ血清アルブミン,0.0
45%冷水魚ゼラチン,5%ロバ血清)で1時間ブロッキングした。PBG中で
希釈した後,一次抗体インキュベーションを室温で2時間行った。PBG中で3
回洗浄した後,一次抗体結合をFITC(DTAF)またはCy3(Jacks
on Laboratories,USA)にコンジュゲートしたアイソタイプ
特異的二次抗体で検出した。二重標識実験のためには,連続して抗体修飾を行っ
た。カバースリップをPermafluorモニタリング媒体(Immunof
cech,France)下でマウントし,慣用の蛍光顕微鏡(Leica,F
RG)またはCLSMレーザー共焦点顕微鏡(Leica,FRG)のいずれか
で観察した。対照は,同一の設定で記録した。
種した。24時間後,細胞をリン酸緩衝化食塩水(PBS,pH7.4,125
mMショ糖)中2%パラホルムアルデヒドで固定した。自己蛍光は,PBSグリ
シン(100mMグリシン,0.1%PGS中ホウ水素)を用いて消光し,細胞
をPBS中0.5%サポニンで透過性にした(5分間)。非特異的抗体結合は,
リン酸緩衝化ゼラチン(PBG:PBS,0.5%ウシ血清アルブミン,0.0
45%冷水魚ゼラチン,5%ロバ血清)で1時間ブロッキングした。PBG中で
希釈した後,一次抗体インキュベーションを室温で2時間行った。PBG中で3
回洗浄した後,一次抗体結合をFITC(DTAF)またはCy3(Jacks
on Laboratories,USA)にコンジュゲートしたアイソタイプ
特異的二次抗体で検出した。二重標識実験のためには,連続して抗体修飾を行っ
た。カバースリップをPermafluorモニタリング媒体(Immunof
cech,France)下でマウントし,慣用の蛍光顕微鏡(Leica,F
RG)またはCLSMレーザー共焦点顕微鏡(Leica,FRG)のいずれか
で観察した。対照は,同一の設定で記録した。
【0190】実施例1:上皮細胞移動の誘導によるカドヘリン/カテニン−複合体の再局在化 組織培養における上皮細胞の移動は,多くの観点において上皮−間葉遷移のモ
デル系である(Manske, et al.(1994)Int.Rev.C
ytol.155,49−9)。ラット膀胱癌腫細胞株NETII(Toyos
hima, et al.(1971)J.Nat.Cancer Inst.
47,979−985)を用いた。これは,細胞外マトリックス(ECM)のあ
る種の成長因子および成分がこれらの細胞の移動を誘導するためである(Val
les, et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 87,1124−1128;Tchao,R.(1982)Cell
Motil.4,333−341;Tucker, et al.(1990)
Cancer Res.50,129−137)。
デル系である(Manske, et al.(1994)Int.Rev.C
ytol.155,49−9)。ラット膀胱癌腫細胞株NETII(Toyos
hima, et al.(1971)J.Nat.Cancer Inst.
47,979−985)を用いた。これは,細胞外マトリックス(ECM)のあ
る種の成長因子および成分がこれらの細胞の移動を誘導するためである(Val
les, et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 87,1124−1128;Tchao,R.(1982)Cell
Motil.4,333−341;Tucker, et al.(1990)
Cancer Res.50,129−137)。
【0191】 EGFおよび市販の血清基質UltroserGについてのインビトロ創傷ア
ッセイの結果が図1Aに示される。創傷閉合の原因としての増殖を妨げるため,
アフィジコリンを加えてDNA合成を阻害した。これは,移動を妨害しなかった
。これに対し,ly295002によるホスファチジルイノシトール−3−キナ
ーゼ(P13K)の阻害,ゲニステインによるチロシンキナーゼ(tk)の阻害
,またはPD98059による有糸分裂促進物質活性化蛋白質キナーゼ(MAP
K)の阻害は,細胞移動を完全に排除した。カドヘリン/カテニン−複合体の成
分の蛋白質レベルは,移動の間変化せず,さらに,E−カドヘリンの過剰発現は
,細胞間接触の破壊を防止することができなかった(Boyer, et al
.(1992)Exp.Cell Res.201,347−357)。
ッセイの結果が図1Aに示される。創傷閉合の原因としての増殖を妨げるため,
アフィジコリンを加えてDNA合成を阻害した。これは,移動を妨害しなかった
。これに対し,ly295002によるホスファチジルイノシトール−3−キナ
ーゼ(P13K)の阻害,ゲニステインによるチロシンキナーゼ(tk)の阻害
,またはPD98059による有糸分裂促進物質活性化蛋白質キナーゼ(MAP
K)の阻害は,細胞移動を完全に排除した。カドヘリン/カテニン−複合体の成
分の蛋白質レベルは,移動の間変化せず,さらに,E−カドヘリンの過剰発現は
,細胞間接触の破壊を防止することができなかった(Boyer, et al
.(1992)Exp.Cell Res.201,347−357)。
【0192】 しかし,EMTの間のカドヘリン/カテニン−複合体のメンバーの局在は変化
していた。E−カドヘリン(緑色蛍光)およびβ−カテニン(赤色蛍光)は,隣
接する,サブコンフルエントに播種された細胞の細胞−細胞接触領域全体にわた
り局在していた(図1B上パネル)。無接触の膜部分の蛍光は弱いかまたは存在
しなかった。いくつかの弱いβ−カテニン染色が対照細胞の核において検出され
た。これはおそらく,これらのサブコンフルエント細胞がその接着接合部を完全
に確立しなかったためであろう。しかし,EGFにより移動を誘導すると,E−
カドヘリンおよびβ−カテニンは細胞表面全体および細胞質内に再分布した。興
味深いことに,上皮細胞移動の間に,β−カテニンの核局在の増加を検出するこ
とができた。
していた。E−カドヘリン(緑色蛍光)およびβ−カテニン(赤色蛍光)は,隣
接する,サブコンフルエントに播種された細胞の細胞−細胞接触領域全体にわた
り局在していた(図1B上パネル)。無接触の膜部分の蛍光は弱いかまたは存在
しなかった。いくつかの弱いβ−カテニン染色が対照細胞の核において検出され
た。これはおそらく,これらのサブコンフルエント細胞がその接着接合部を完全
に確立しなかったためであろう。しかし,EGFにより移動を誘導すると,E−
カドヘリンおよびβ−カテニンは細胞表面全体および細胞質内に再分布した。興
味深いことに,上皮細胞移動の間に,β−カテニンの核局在の増加を検出するこ
とができた。
【0193】実施例2:カドヘリン/カテニン−複合体のチロシンリン酸化 チロシンキナーゼのカドヘリン/カテニン−複合体に対する特異性を調べた。
TKとカドヘリン/カテニン−複合体のメンバーとの過渡的なコトランスフェク
ションは,EGFR,c−Src,またはFGFR2等の上皮細胞移動において
役割を果たすTKのみが,β−カテニンおよびプラコグロビンをリン酸化しうる
ことを示した。しかし,α−カテニンおよびE−カドヘリンは,これらのTKの
基質ではなかった。これらの知見は,トランスフェクトしていないNBTII細
胞が移動するよう促進されたことにより確認することができた。細胞溶解後,カ
ドヘリン/カテニン複合体のすべてのメンバーを特異的抗体で免疫沈澱した。こ
の手法は,カドヘリン/カテニン複合体のメンバーを局在および結合パートナー
にかかわらず沈澱させ,したがって,E−カドヘリン結合β−カテニンも沈澱す
る。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによりチロシンリ
ン酸化レベルを分析し(図2,上),次にE−カドヘリン(図2,中)またはカ
テニン(図2,下)を特異的抗体で検出した。
TKとカドヘリン/カテニン−複合体のメンバーとの過渡的なコトランスフェク
ションは,EGFR,c−Src,またはFGFR2等の上皮細胞移動において
役割を果たすTKのみが,β−カテニンおよびプラコグロビンをリン酸化しうる
ことを示した。しかし,α−カテニンおよびE−カドヘリンは,これらのTKの
基質ではなかった。これらの知見は,トランスフェクトしていないNBTII細
胞が移動するよう促進されたことにより確認することができた。細胞溶解後,カ
ドヘリン/カテニン複合体のすべてのメンバーを特異的抗体で免疫沈澱した。こ
の手法は,カドヘリン/カテニン複合体のメンバーを局在および結合パートナー
にかかわらず沈澱させ,したがって,E−カドヘリン結合β−カテニンも沈澱す
る。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによりチロシンリ
ン酸化レベルを分析し(図2,上),次にE−カドヘリン(図2,中)またはカ
テニン(図2,下)を特異的抗体で検出した。
【0194】 移動の誘導から30分後,β−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン
酸化は既に検出可能であったが,α−カテニンおよびE−カドヘリンでは検出さ
れなかった。リン酸化は過渡的であり,約9時間持続し,24時間後にはもはや
検出できなかった。免疫沈澱については,チロシンリン酸化を検出するために,
細胞を1mM Na−オルトバナジン酸(PTPの特異的阻害剤)で前処理する
ことが必要であった。このことは,β−カテニンおよびプラコグロビンのリン酸
化状態が,TKおよびPTPにより厳重に制御されたことを示す。上皮細胞コロ
ニー分散とβ−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化との相関はま
た,HT29−およびHaCaT−細胞においても示されており,細胞移動の誘
導の間の共通する制御メカニズムを示唆する。
酸化は既に検出可能であったが,α−カテニンおよびE−カドヘリンでは検出さ
れなかった。リン酸化は過渡的であり,約9時間持続し,24時間後にはもはや
検出できなかった。免疫沈澱については,チロシンリン酸化を検出するために,
細胞を1mM Na−オルトバナジン酸(PTPの特異的阻害剤)で前処理する
ことが必要であった。このことは,β−カテニンおよびプラコグロビンのリン酸
化状態が,TKおよびPTPにより厳重に制御されたことを示す。上皮細胞コロ
ニー分散とβ−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化との相関はま
た,HT29−およびHaCaT−細胞においても示されており,細胞移動の誘
導の間の共通する制御メカニズムを示唆する。
【0195】実施例3:上皮細胞移動の間のβ−カテニンのフリープールの増加 EGF処理細胞からのβ−カテニンを,E−カドヘリンの全細胞質ドメインを
含むGST融合蛋白質でアフィニティー沈澱させた。フリーの,複合体を形成し
ていないβ−カテニンのレベル(図3,上),ならびにそのホスホチロシン含有
量(図3,下)を,免疫ブロッティングにより分析した。先に示されるように,
この戦略は,免疫沈澱とは異なり,β−カテニンのフリーの,E−カドヘリンに
結合していないプールの特異的かつ選択的沈澱を可能とする(Papkoff,
et al.(1996)Mol.Cell.Biol.16,2128−2
134(図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する)
)。
含むGST融合蛋白質でアフィニティー沈澱させた。フリーの,複合体を形成し
ていないβ−カテニンのレベル(図3,上),ならびにそのホスホチロシン含有
量(図3,下)を,免疫ブロッティングにより分析した。先に示されるように,
この戦略は,免疫沈澱とは異なり,β−カテニンのフリーの,E−カドヘリンに
結合していないプールの特異的かつ選択的沈澱を可能とする(Papkoff,
et al.(1996)Mol.Cell.Biol.16,2128−2
134(図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する)
)。
【0196】 EGFによる移動の誘導はβ−カテニンのフリープールの増加と相関しており
,これは免疫沈澱で得られたβ−カテニンより有意に高いホスホチロシン含有量
を有していた(図2および3を比較)。非刺激対照細胞におけるβ−カテニンの
フリープールは影響を受けなかった。フリーの,チロシンリン酸化β−カテニン
の増加は,Na−オルトバナジン酸を加えない場合にも検出されたが(図8を参
照),これを加えると検出が改良された。これらの知見は,上皮細胞移動の間に
,TKによるリン酸化により,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニン
のプールが増加することを示す。
,これは免疫沈澱で得られたβ−カテニンより有意に高いホスホチロシン含有量
を有していた(図2および3を比較)。非刺激対照細胞におけるβ−カテニンの
フリープールは影響を受けなかった。フリーの,チロシンリン酸化β−カテニン
の増加は,Na−オルトバナジン酸を加えない場合にも検出されたが(図8を参
照),これを加えると検出が改良された。これらの知見は,上皮細胞移動の間に
,TKによるリン酸化により,フリーの,複合体を形成していないβ−カテニン
のプールが増加することを示す。
【0197】実施例4:カドヘリン/カテニン−複合体とPTP LARの共局在 Na−オルトバナジン酸で前処理することにより,移動しているNBTII細
胞において,β−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化が増加した
。したがって,PTPは,アドヘレンスジャンクションにおける制御事象におい
て,TKの定常状態平衡アンタゴニストとして作用するのかもしれない。図4に
示されるように,PTP LAR(赤色蛍光)とカドヘリン/カテニン複合体(
緑色蛍光)は,黄色蛍光シグナルに示されるように,上皮細胞のアドヘレンスジ
ャンクションにおいて共局在した。PTP LARは,上皮MCF7細胞のフォ
ーカルコンタクトに局在することが示されている(Serra−Pages,
et al.(1995)EMBO J.14,2827−2838)。NBT
II細胞においては,PTP LARは主としてアドヘレンスジャンクションに
おいて検出され,フォーカルコンタクトにおいてはシグナル強度はより低かった
。運動性細胞はアドヘレンスジャンクションおよびフォーカルコンタクトを迅速
に分解および再構築しなければならないため,PTP LARの局在化は,上皮
細胞移動の間のその制御機能の可能性を支持する。
胞において,β−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化が増加した
。したがって,PTPは,アドヘレンスジャンクションにおける制御事象におい
て,TKの定常状態平衡アンタゴニストとして作用するのかもしれない。図4に
示されるように,PTP LAR(赤色蛍光)とカドヘリン/カテニン複合体(
緑色蛍光)は,黄色蛍光シグナルに示されるように,上皮細胞のアドヘレンスジ
ャンクションにおいて共局在した。PTP LARは,上皮MCF7細胞のフォ
ーカルコンタクトに局在することが示されている(Serra−Pages,
et al.(1995)EMBO J.14,2827−2838)。NBT
II細胞においては,PTP LARは主としてアドヘレンスジャンクションに
おいて検出され,フォーカルコンタクトにおいてはシグナル強度はより低かった
。運動性細胞はアドヘレンスジャンクションおよびフォーカルコンタクトを迅速
に分解および再構築しなければならないため,PTP LARの局在化は,上皮
細胞移動の間のその制御機能の可能性を支持する。
【0198】実施例5:β−カテニンおよびプラコグロビンのPTP LARとの会合 無傷の細胞におけるPTP LARとカドヘリン/カテニン−複合体との会合
の可能性を調べるために,EGFで刺激したサブコンフルエントのヒトMCF7
細胞を溶解し,PTP LARまたはカドヘリン/カテニン−複合体のいずれか
に対する抗体で免疫沈澱した。β−カテニンおよびE−カドヘリン(図5A)ま
たはプラコグロビンおよびE−カドヘリン(図5B)に対する特異的抗体を用い
たウエスタンブロッティング分析においては,抗ヒトPTP LAR免疫沈澱物
において,ヒトPTP LARの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体1
1.1Aによりこれらの蛋白質が検出され,その逆も検出された。興味深いこと
に,会合は構成的でありEGF刺激に非依存性であった。PTP LARに対す
るウサギポリクローナル抗血清#320によってはカドヘリン/カテニン−複合
体のメンバーの特異的シグナルは得られなかった。このことは,抗原性エピトー
プが複合体中においてアクセス可能ではないことを示唆する。カドヘリン/カテ
ニン−複合体のいずれの成分がPTP LARとの相互作用を媒介するかを調べ
るため,PTP LARの全細胞質ドメインを含むGST融合蛋白質(GST−
PTP LARi)を用いて,溶解前にチロシンホスファターゼ阻害剤である過
バナジン酸で処理したヒト293胚性腎繊維芽細胞において過渡的に過剰発現さ
れたカドヘリン/カテニン−複合体の別々の成分をアフィニティー精製した。
の可能性を調べるために,EGFで刺激したサブコンフルエントのヒトMCF7
細胞を溶解し,PTP LARまたはカドヘリン/カテニン−複合体のいずれか
に対する抗体で免疫沈澱した。β−カテニンおよびE−カドヘリン(図5A)ま
たはプラコグロビンおよびE−カドヘリン(図5B)に対する特異的抗体を用い
たウエスタンブロッティング分析においては,抗ヒトPTP LAR免疫沈澱物
において,ヒトPTP LARの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体1
1.1Aによりこれらの蛋白質が検出され,その逆も検出された。興味深いこと
に,会合は構成的でありEGF刺激に非依存性であった。PTP LARに対す
るウサギポリクローナル抗血清#320によってはカドヘリン/カテニン−複合
体のメンバーの特異的シグナルは得られなかった。このことは,抗原性エピトー
プが複合体中においてアクセス可能ではないことを示唆する。カドヘリン/カテ
ニン−複合体のいずれの成分がPTP LARとの相互作用を媒介するかを調べ
るため,PTP LARの全細胞質ドメインを含むGST融合蛋白質(GST−
PTP LARi)を用いて,溶解前にチロシンホスファターゼ阻害剤である過
バナジン酸で処理したヒト293胚性腎繊維芽細胞において過渡的に過剰発現さ
れたカドヘリン/カテニン−複合体の別々の成分をアフィニティー精製した。
【0199】 β−カテニン(図5C,左)およびプラコグロビン(図5C,右)はこれらの
条件下で,PTP LARの細胞質ドメインと特異的に会合することが見いださ
れた。E−カドヘリンおよびα−カテニンは同じ実験条件下でPTP LARと
直接相互作用しなかった(データ示さず)。過バナジン酸で処理した後のβ−カ
テニンまたはプラコグロビンのリン酸化状態(いずれもチロシンリン酸化である
)は,これらのGST−PTP LAR細胞質融合蛋白質との会合に影響を及ぼ
さなかった。この相互作用には,PTP LARの完全な細胞質ドメインが必要
であった。これは,PTP LARの欠失変異体はβ−カテニンまたはプラコグ
ロビンに効率的に結合しなかったためである。
条件下で,PTP LARの細胞質ドメインと特異的に会合することが見いださ
れた。E−カドヘリンおよびα−カテニンは同じ実験条件下でPTP LARと
直接相互作用しなかった(データ示さず)。過バナジン酸で処理した後のβ−カ
テニンまたはプラコグロビンのリン酸化状態(いずれもチロシンリン酸化である
)は,これらのGST−PTP LAR細胞質融合蛋白質との会合に影響を及ぼ
さなかった。この相互作用には,PTP LARの完全な細胞質ドメインが必要
であった。これは,PTP LARの欠失変異体はβ−カテニンまたはプラコグ
ロビンに効率的に結合しなかったためである。
【0200】実施例6:β−カテニンはインビトロでPTP LARの基質である β−カテニンおよびプラコグロビンとPTP LARとが会合するため,これ
らの蛋白質がPTP LARの実際の基質であるか否かを調べた。細胞質ドメイ
ン全体(GST−PTP LARcytopl)または触媒的に不活性化された
PTPドメイン1(GST−PTP LAR PTP D1C1522S)また
は不活性化PTPドメイン2(GST−PTP LAR PTP D2C181
3S)を有するPTP LARの変異体のいずれかを含むPTP LARのGS
T融合蛋白質を,過渡的に過剰発現する過バナジン酸処理ヒト293細胞からの
チロシンリン酸化β−カテニンとともにインキュベートした。異なる時間間隔の
後に,反応を終了させ,抗ホスホチロシン特異的抗体を用いて分析した。
らの蛋白質がPTP LARの実際の基質であるか否かを調べた。細胞質ドメイ
ン全体(GST−PTP LARcytopl)または触媒的に不活性化された
PTPドメイン1(GST−PTP LAR PTP D1C1522S)また
は不活性化PTPドメイン2(GST−PTP LAR PTP D2C181
3S)を有するPTP LARの変異体のいずれかを含むPTP LARのGS
T融合蛋白質を,過渡的に過剰発現する過バナジン酸処理ヒト293細胞からの
チロシンリン酸化β−カテニンとともにインキュベートした。異なる時間間隔の
後に,反応を終了させ,抗ホスホチロシン特異的抗体を用いて分析した。
【0201】 β−カテニンをGST−PTP LAR細胞質またはGST−PTP LAR
PTPD2C1813Sとともにインキュベートすると,最初の5分間のうちに
チロシンリン酸化シグナルの有意な低下が見られた(図6,上,左および右)。
GST−PTP LARPTPD1C1522S(図6,上,中)とともにイン
キュベートした後にはリン酸化レベルには変化が観察されず,pNPPを基質と
して用いたGST融合蛋白質の酵素活性の測定の結果(データ示さず)が確認さ
れた。これらのデータは,PTP LARの第1のPTPドメインは触媒活性に
必須であるが,第2のドメインは触媒的に不活性であるという先の知見と一致す
る(Streuli, et al.(1990)EMBO J.9)。抗β−
カテニン特異的抗体でブロットを再探索して,アッセイにおいて等量の蛋白質が
用いられたことを確認した(図6,下)。すなわち,β−カテニンはPTP L
ARの基質である。
PTPD2C1813Sとともにインキュベートすると,最初の5分間のうちに
チロシンリン酸化シグナルの有意な低下が見られた(図6,上,左および右)。
GST−PTP LARPTPD1C1522S(図6,上,中)とともにイン
キュベートした後にはリン酸化レベルには変化が観察されず,pNPPを基質と
して用いたGST融合蛋白質の酵素活性の測定の結果(データ示さず)が確認さ
れた。これらのデータは,PTP LARの第1のPTPドメインは触媒活性に
必須であるが,第2のドメインは触媒的に不活性であるという先の知見と一致す
る(Streuli, et al.(1990)EMBO J.9)。抗β−
カテニン特異的抗体でブロットを再探索して,アッセイにおいて等量の蛋白質が
用いられたことを確認した(図6,下)。すなわち,β−カテニンはPTP L
ARの基質である。
【0202】実施例7:PTP LARはヌードマウスにおいて上皮細胞移動および腫瘍形成 を阻害する 次に我々は,PTP LARが上皮細胞移動の間に直接の制御機能を有するか
否かを調べた。したがって我々は,NBTII細胞においてヒトPTP LAR
を内因性蛋白質と匹敵するレベルで異所的に発現させ,このことにより親細胞と
比較して約2倍のPTP LAR発現を有するポリクローンならびにクローン化
細胞株を得た。これらの細胞株を用いて,スキャッターアッセイを行って,EG
F処理後の移動を定量した。hPTP LARのNBTII細胞におけるこの適
度な異所性発現は,移動の開始の動力学には影響を与えずに,EMTおよび移動
性(図7A)を有意に,ベクター対照感染細胞株(NBTII pLXSN,図
7B)の約40%に阻害した。EGFレセプターの活性化および自己リン酸化お
よびそのアダプター蛋白質Shcとの会合には相違が検出されず,このことは,
異所性hPTP LARはEGF−レセプターを不活性化することにより機能す
るのではないことを示唆する。さらに,これらのNBTII−hPTP LAR
細胞株のEGFシグナリングの下流の事象,例えばDNA合成および増殖速度は
,hPTP LARの異所性発現により影響を受けなかった。
否かを調べた。したがって我々は,NBTII細胞においてヒトPTP LAR
を内因性蛋白質と匹敵するレベルで異所的に発現させ,このことにより親細胞と
比較して約2倍のPTP LAR発現を有するポリクローンならびにクローン化
細胞株を得た。これらの細胞株を用いて,スキャッターアッセイを行って,EG
F処理後の移動を定量した。hPTP LARのNBTII細胞におけるこの適
度な異所性発現は,移動の開始の動力学には影響を与えずに,EMTおよび移動
性(図7A)を有意に,ベクター対照感染細胞株(NBTII pLXSN,図
7B)の約40%に阻害した。EGFレセプターの活性化および自己リン酸化お
よびそのアダプター蛋白質Shcとの会合には相違が検出されず,このことは,
異所性hPTP LARはEGF−レセプターを不活性化することにより機能す
るのではないことを示唆する。さらに,これらのNBTII−hPTP LAR
細胞株のEGFシグナリングの下流の事象,例えばDNA合成および増殖速度は
,hPTP LARの異所性発現により影響を受けなかった。
【0203】 インビトロの上皮細胞移動は,インビボでの腫瘍形成および転移の簡単なモデ
ルシステムに似ている。したがって,hPTP LARの異常な発現と,これら
の細胞がヌードマウスにおいてインビボで腫瘍を形成する能力の低下との相関関
係を試験した。NETIIhPTP LAR細胞をスイスヌードマウスの横腹領
域の皮下に注入した。興味深いことに,これらの細胞はNBTII pLXSN
細胞と比較して,有意に減少した腫瘍成長を示した(図7C)。ポリクローナル
およびクローナル細胞株において腫瘍を形成する能力は相違しなかった。親NB
TII細胞は,ベクター対照感染細胞株と同じ程度に腫瘍を形成し,これはクロ
ーニングアルチファクトを除外する。これらのデータは,PTP LARが上皮
細胞移動および腫瘍形成の負のレギュレータとして作用することを強く示唆する
。
ルシステムに似ている。したがって,hPTP LARの異常な発現と,これら
の細胞がヌードマウスにおいてインビボで腫瘍を形成する能力の低下との相関関
係を試験した。NETIIhPTP LAR細胞をスイスヌードマウスの横腹領
域の皮下に注入した。興味深いことに,これらの細胞はNBTII pLXSN
細胞と比較して,有意に減少した腫瘍成長を示した(図7C)。ポリクローナル
およびクローナル細胞株において腫瘍を形成する能力は相違しなかった。親NB
TII細胞は,ベクター対照感染細胞株と同じ程度に腫瘍を形成し,これはクロ
ーニングアルチファクトを除外する。これらのデータは,PTP LARが上皮
細胞移動および腫瘍形成の負のレギュレータとして作用することを強く示唆する
。
【0204】実施例8:PTP LARはチロシンリン酸化を阻害し,β−カテニンのフリー プールを増加させる β−カテニンは,GST−E−カドヘリン細胞質融合蛋白質を用いて対照およ
びhPTP LAR−発現NETII細胞においてアフィニティー沈澱した。P
TP LARの機能を覆わないように,細胞はPTPの阻害剤であるNa−オル
トバナジン酸で処理しなかった。いずれにしても,ベクター感染対照細胞におい
てフリーの,複合体を形成していないβ−カテニンおよびβ−カテニンのチロシ
ンリン酸化プールの増加が検出され,このことは,フリーの,チロシンリン酸化
β−カテニンの増加がN−オルトバナジン酸前処理(図8,左)を行っていない
細胞においても生じることを示した。しかし,NETII−hPTP LAR−
発現細胞においては,チロシンリン酸化の増加も,β−カテニンのフリープール
の増加も検出できなかった(図8,右)。β−カテニンはインビトロでPTP
LARの基質であり,NETII細胞におけるヒトPTP LARの異所性発現
はEGFレセプター媒介性シグナリングを妨害しないため,PTP LARは,
β−カテニンのチロシンリン酸化の特異的な負のレギュレータとして機能して,
フリーのβ−カテニンの増加を防止し,このことにより上皮細胞移動を阻害する
。
びhPTP LAR−発現NETII細胞においてアフィニティー沈澱した。P
TP LARの機能を覆わないように,細胞はPTPの阻害剤であるNa−オル
トバナジン酸で処理しなかった。いずれにしても,ベクター感染対照細胞におい
てフリーの,複合体を形成していないβ−カテニンおよびβ−カテニンのチロシ
ンリン酸化プールの増加が検出され,このことは,フリーの,チロシンリン酸化
β−カテニンの増加がN−オルトバナジン酸前処理(図8,左)を行っていない
細胞においても生じることを示した。しかし,NETII−hPTP LAR−
発現細胞においては,チロシンリン酸化の増加も,β−カテニンのフリープール
の増加も検出できなかった(図8,右)。β−カテニンはインビトロでPTP
LARの基質であり,NETII細胞におけるヒトPTP LARの異所性発現
はEGFレセプター媒介性シグナリングを妨害しないため,PTP LARは,
β−カテニンのチロシンリン酸化の特異的な負のレギュレータとして機能して,
フリーのβ−カテニンの増加を防止し,このことにより上皮細胞移動を阻害する
。
【0205】 当業者は,本発明が,その目的を実施し,記載される結果および利点,ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法,手順,処理,分子,特定の
化合物は,現在のところ好ましい態様の代表的なものであり,例示的なものであ
って,本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は,特許請
求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途
をなすであろう。
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法,手順,処理,分子,特定の
化合物は,現在のところ好ましい態様の代表的なものであり,例示的なものであ
って,本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は,特許請
求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途
をなすであろう。
【0206】 当業者は,本発明の範囲および精神から逸脱することなく,本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
【0207】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は,本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。
術分野の技術者のレベルを示す。
【0208】 本明細書に例示的に記載されている発明は,本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち,例
えば,本明細書における各例において,"・・・を含む","・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は,他の2つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は,説明の用語として用い
るものであり,限定ではない。そのような用語および表現の使用においては,示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち,例
えば,本明細書における各例において,"・・・を含む","・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は,他の2つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は,説明の用語として用い
るものであり,限定ではない。そのような用語および表現の使用においては,示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
【0209】 特に,本明細書に記載されるある処方は処方に添加された賦形剤により同定さ
れるが,本発明はこれらの賦形剤の組み合わせにより形成される最終処方をもカ
バーすることを意味する。特に,本発明は,添加された賦形剤の1つないしすべ
てが処方の間に反応し,最終処方中にもはや存在しないかまたは変化した形で存
在する処方を含む。
れるが,本発明はこれらの賦形剤の組み合わせにより形成される最終処方をもカ
バーすることを意味する。特に,本発明は,添加された賦形剤の1つないしすべ
てが処方の間に反応し,最終処方中にもはや存在しないかまたは変化した形で存
在する処方を含む。
【0210】 さらに,発明の特徴および観点がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合,当業者は,本発明が,マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば,Xが,臭素,塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合,Xが臭素である特許請求の範囲およびXが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
る場合,当業者は,本発明が,マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば,Xが,臭素,塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合,Xが臭素である特許請求の範囲およびXが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【0211】 他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
【図1】 図1は,種々の条件下における上皮NBTII細胞の移動を示す
。
。
【図2】 図2は,上皮細胞移動の間のβ−カテニンおよびプラコグロビン
のチロシンリン酸化を示す。
のチロシンリン酸化を示す。
【図3】 図3は,上皮細胞移動の間,フリーの,複合体を形成していない
β−カテニンのプールが増加し,チロシンリン酸化の促進と相関することを示す
。
β−カテニンのプールが増加し,チロシンリン酸化の促進と相関することを示す
。
【図4】 図4は,カドヘリン/カテニン複合体のメンバーがNBTII細
胞においてPTP LARと共局在することを示す。
胞においてPTP LARと共局在することを示す。
【図5】 図5は,カドヘリン/カテニン−複合体のメンバーがPTP L
ARと会合することを示す。
ARと会合することを示す。
【図6】 図6は,β−カテニンがインビトロでPTP LARの基質であ
ることを示す。
ることを示す。
【図7】 図7は,ヒトPTP LARの異所性過剰発現が上皮細胞移動お
よびラットNBTII細胞のヌードマウス中における腫瘍形成を阻害することを
示す。
よびラットNBTII細胞のヌードマウス中における腫瘍形成を阻害することを
示す。
【図8】 図8は,NBTII細胞におけるヒトPTP LARの異所性発
現がβ−カテニンのチロシン残基のリン酸化を阻害し,β−カテニンのフリープ
ールを増加させることを示す。
現がβ−カテニンのチロシン残基のリン酸化を阻害し,β−カテニンのフリープ
ールを増加させることを示す。
【図9】 図9は,EMBLデータベースから抽出したPTP LARプレ
蛋白質のアミノ酸配列を示す。
蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図10】 図10は,EMBLデータベースから抽出したPTP LAR
の核酸配列を示す。
の核酸配列を示す。
【図11】 図11は,PTP LARのアミノ酸配列を用いたPfam
HMMの検索から得られた出力を示す。
HMMの検索から得られた出力を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成13年10月30日(2001.10.30)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 PTP LAR関連疾病の治療のための物および方法
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 45/00 A61K 48/00 48/00 A61P 3/10 A61P 3/10 9/00 9/00 13/12 13/12 17/02 17/02 17/06 17/06 25/28 25/28 29/00 29/00 35/00 35/00 35/04 35/04 43/00 111 43/00 111 C12Q 1/02 C12Q 1/02 1/42 1/42 1/68 A 1/68 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/50 Z 33/50 33/53 D 33/53 M 33/566 33/566 33/577 B 33/577 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ミュラー,トーマス アメリカ合衆国 94080 カリフォルニア 州 エス サンフランシスコ,イースト グランド アベニュー 230,スージェ ン・インコーポレーテッド内 Fターム(参考) 2G045 AA25 AA40 CA25 CA26 CB03 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FA16 FB01 FB02 FB03 FB07 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ08 QQ33 QQ42 QQ52 QR08 QR13 QR33 QR42 QR55 QR57 QR59 QR62 QR74 QR80 QR82 QS05 QS15 QS25 QS26 QS34 QS36 QX02 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA62 MA13 MA17 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA152 ZA362 ZA512 ZA812 ZA892 ZB262 ZC352 ZC412 4C086 BC13 BC46 BC52 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA15 ZA21 ZA36 ZA59 ZA81 ZB11 ZB26 ZC35 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA59 NA14 ZA15 ZA36 ZA81 ZA89 ZB11 ZB26 ZC41
Claims (51)
- 【請求項1】 疾病または疾患を治療する方法であって,そのような治療
を必要とする患者にPTP LARを含む薬学的に許容しうる組成物を投与する
ことを含む方法。 - 【請求項2】 前記疾病または疾患が,上皮細胞移動により特徴づけられ
る,請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 前記疾病または疾患が,β−カテニンのチロシンリン酸化
の増加により特徴づけられる,請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 前記疾病または疾患が,フリーのβ−カテニンのプールの
レベルの増加により特徴づけられる,請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 前記疾病または疾患が,癌,転移,および異常な創傷治癒
からなる群より選択される,請求項1記載の方法。 - 【請求項6】 前記患者が哺乳動物である,請求項1記載の方法。
- 【請求項7】 前記哺乳動物がヒトである,請求項6記載の方法。
- 【請求項8】 前記PTP LARが組換え蛋白質として提供される,請
求項1記載の方法。 - 【請求項9】 前記PTP LARが組換え遺伝子として提供される,請
求項1記載の方法。 - 【請求項10】 前記PTP LARが組換え細胞として提供される,請
求項1記載の方法。 - 【請求項11】 前記PTP LARが,上皮細胞移動をインビトロでま
たはインビボで調節する,請求項1記載の方法。 - 【請求項12】 前記PTP LARが上皮細胞移動をインビトロでまた
はインビボで阻害する,請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 前記PTP LARが,β−カテニンのチロシンリン酸
化をインビトロでまたはインビボで調節する,請求項1記載の方法。 - 【請求項14】 前記PTP LARが,β−カテニンのチロシンリン酸
化をインビトロでまたはインビボで阻害する,請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 前記PTP LARが,β−カテニンのフリープールを
インビトロでまたはインビボで調節する,請求項1記載の方法。 - 【請求項16】 前記PTP LARが,β−カテニンのフリープールの
レベルをインビトロでまたはインビボで低下させる,請求項15記載の方法。 - 【請求項17】 試料中のPTP LARを疾病または疾患の予知の道具
として検出する方法であって, (a)前記試料を,ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でPTP LARの
核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ,前記プローブは,
前記PTP LARをコードする核酸配列,そのフラグメント,または前記配列
またはフラグメントの相補体を含み;そして (b)プローブ−標的領域ハイブリッドの存在または量を前記疾病または疾患の
前記予知の指標として検出する, の各工程を含む方法。 - 【請求項18】 前記疾病または疾患が,異常な創傷治癒,癌,および転
移からなる群より選択される,請求項17記載の方法。 - 【請求項19】 試料中のPTP LARを,疾病または疾患の予知の道
具として検出する方法であって,(a)試料中の前記PTP LARをコードす
る核酸標的領域を前記PTP LARをコードする対照核酸標的領域と比較し;
そして(b)前記標的領域と前記対照標的領域との間の配列または量の相違を前
記疾病または疾患の前記予知の指標として検出する,の各工程を含む方法。 - 【請求項20】 前記疾病または疾患が,異常な創傷治癒,癌,および転
移からなる群より選択される,請求項19記載の方法。 - 【請求項21】 試料中のPTP LARを疾病または疾患の予知の道具
として検出する方法であって, (a)前記試料を,ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でPTP LARの
アミノ酸標的領域にハイブリダイズする抗体と接触させ,そして (b)抗体:標的領域複合体の存在または量を前記疾病または疾患の前記予知の
指標として検出する, の各工程を含む方法。 - 【請求項22】 前記抗体が,ポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体からなる群より選択される,請求項21記載の方法。 - 【請求項23】 前記抗体がハイブリドーマから得られる,請求項21記
載の方法。 - 【請求項24】 前記疾病または疾患が,異常な創傷治癒,癌,および転
移からなる群より選択される,請求項21記載の方法。 - 【請求項25】 試料中のPTP LARを疾病または疾患の予知の道具
として検出する方法であって,PTP LARの存在または量を前記疾病または
疾患の前記予知の指標として検出することを特徴とする方法。 - 【請求項26】 前記疾病または疾患が,異常な創傷治癒,癌,および転
移からなる群より選択される,請求項25記載の方法。 - 【請求項27】 上皮細胞移動を調節する1またはそれ以上の化合物を同
定する方法であって, (a)チロシンリン酸化β−カテニンを1またはそれ以上の可能性のある化合物
と接触させ; (b)前記チロシンリン酸化β−カテニンのリン酸化レベルの変化をモニターし
て,前記上皮細胞移動を調節する前記1またはそれ以上の化合物を同定する, の各工程を含む方法。 - 【請求項28】 前記1またはそれ以上の化合物が,インドリノン,キナ
ゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される,請求項
27記載の方法。 - 【請求項29】 PTP LAR活性を調節する1またはそれ以上の化合
物を同定する方法であって, (a)PTP LARを1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ; (b)前記PTP LARの活性を測定し;そして (c)前記1またはそれ以上の可能性のある化合物が前記PTP LARの活性
を調節するか否かを判定する, の各工程を含む方法。 - 【請求項30】 前記活性がホスホチロシンホスファターゼ活性である,
請求項29記載の方法。 - 【請求項31】 天然の結合パートナーを工程(a)に加えることをさら
に含む,請求項29記載の方法。 - 【請求項32】 前記天然の結合パートナーが,β−カテニンおよびプラ
コグロビンからなる群より選択される,請求項31記載の方法。 - 【請求項33】 前記1またはそれ以上の化合物が,インドリノン,キナ
ゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される,請求項
29記載の方法。 - 【請求項34】 細胞においてPTP LAR活性を調節する1またはそ
れ以上の化合物を同定する方法であって: (a)PTP LARを前記細胞中で発現させ; (b)前記細胞を1またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ;そして (c)細胞移動または前記PTP LARと天然の結合パートナーとの間の相互
作用の変化をモニターして,前記PTP LAR活性を調節する前記1またはそ
れ以上の化合物を同定する, の各工程を含む方法。 - 【請求項35】 前記天然の結合パートナーが,β−カテニン,およびプ
ラコグロビンからなる群より選択される,請求項34記載の方法。 - 【請求項36】 前記1またはそれ以上の化合物が,インドリノン,キナ
ゾリン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される,請求項
34記載の方法。 - 【請求項37】 上皮細胞移動により特徴づけられる疾病または疾患を治
療する方法であって,そのような治療を必要とする患者に,薬学的に許容しうる
組成物中の1またはそれ以上の化合物を投与することを含み,ここで,前記1ま
たはそれ以上の化合物は,請求項27−36のいずれかに記載の方法により同定
されることを特徴とする方法。 - 【請求項38】 前記疾病または疾患が,癌,転移,および異常な創傷治
癒からなる群より選択される,請求項37記載の方法。 - 【請求項39】 前記患者が哺乳動物である,請求項37記載の方法。
- 【請求項40】 前記哺乳動物がヒトである,請求項39記載の方法。
- 【請求項41】 上皮細胞移動により特徴づけられる疾病または疾患を治
療する方法であって,そのような治療を必要とする患者に,薬学的に許容しうる
組成物中の1またはそれ以上の化合物を投与することを含み,ここで,前記1ま
たはそれ以上の化合物は前記上皮細胞移動を調節することを特徴とする方法。 - 【請求項42】 前記疾病または疾患が,癌,転移,および異常な創傷治
癒からなる群より選択される,請求項41記載の方法。 - 【請求項43】 前記患者が哺乳動物である,請求項41記載の方法。
- 【請求項44】 前記哺乳動物がヒトである,請求項43記載の方法。
- 【請求項45】 前記1またはそれ以上の化合物が前記上皮細胞移動をイ
ンビトロで調節する,請求項41記載の方法。 - 【請求項46】 前記1またはそれ以上の化合物が前記上皮細胞移動をイ
ンビトロで阻害する,請求項45記載の方法。 - 【請求項47】 前記1またはそれ以上の化合物が,β−カテニンのチロ
シンリン酸化をインビトロで調節する,請求項41記載の方法。 - 【請求項48】 前記1またはそれ以上の化合物が,β−カテニンのチロ
シンリン酸化を阻害する,請求項47記載の方法。 - 【請求項49】 前記1またはそれ以上の化合物が,インビトロでβ−カ
テニンフリープールのレベルを調節する,請求項41記載の方法。 - 【請求項50】 前記1またはそれ以上の化合物がインビトロでβ−カテ
ニンフリープールのレベルを低下させる,請求項49記載の方法。 - 【請求項51】 前記1またはそれ以上の化合物が,キナゾリン,インド
リノン,キノキサリン,およびチロホスチンからなる群より選択される,請求項
41記載の方法。
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