JP2002541214A - Ｐｔｐ ｌａｒ関連疾病の治療のための物および方法 - Google Patents

Ｐｔｐ ｌａｒ関連疾病の治療のための物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は，種々の上皮細胞移動疾病および疾患の治療に有用な，およびこれらの疾病および疾患の治療に有用な種々の産物の同定に有用な方法に関する。特に，ＰＴＰ ＬＡＲを用いる治療方法，ならびにＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する化合物を同定する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は，とりわけ，種々の上皮細胞移動関連疾病および疾患の治療に有用な
方法および産物，およびこれらの疾病および疾患の治療に有用な種々の産物の同
定に有用な方法に関する。
【０００２】発明の背景 以下の発明の背景の記載は，本発明の理解を助けるために提供され，本発明に
対する先行技術であるかまたはそれを記載すると認めるものではない。
【０００３】 カドヘリンは，同種親和性のＣａ2+依存性細胞−細胞接着を媒介する膜貫通レ
セプターのファミリーである。上皮細胞においては，このファミリーのメンバー
，例えば，伝統的なＥ−，Ｎ−，およびＰ−カドヘリンは主として隣接する細胞
のアドヘレンスジャンクションに見いだされる（Ｙａｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３，１１９−１４６．
）。β−カテニンおよびプラコグロビン（γ−カテニン）は，伝統的カドヘリン
の高度に保存された細胞質ドメインに互いに独占的様式で直接会合している（Ｏ
ｚａｗａ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８，１７１１−１７１８；
Ｈｉｎｃｋ，ｅｆｃａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２５，１３
２７−１３４０）。
【０００４】 カドヘリン／カテニン−複合体は，α−カテニンを介して，直接（Ｒｉｍｍ，
ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
２，８８１３−８８１７）またはアクチン結合蛋白質であるα−アクチニンまた
はビンクリンを介して間接的に（Ｋｎｕｄｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）．
７．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０，６７−７７；Ｗｅｉｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１
９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４１，７５５−６４），アクチンフィラメ
ントネットワークに結合している。カドヘリン／カテニン−複合体と細胞骨格と
の会合は，密接な細胞−細胞相互作用に必須である。いずれにしても，カドヘリ
ン／カテニン媒介性細胞−細胞接触は，特に胚発生または創傷治癒の間にはアド
ヘレンスジャンクションが迅速に分解され再構築されなければならないため，高
度に動的でなければならない（Ｍａｒｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．
Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５，１５９−２０５）。
【０００５】 カドヘリンのダウンレギュレーションにより近接する細胞が分離し，この現象
は中胚葉を形成する上皮−間葉遷移（ＥＭＴ）における胚発生の間に観察される
（Ｈｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．８，６８５−６９１）。また，これは腫瘍細胞においても観察され，これ
らが身体全体に侵襲し広まることを可能とする（Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（
１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，３８４５−３８５２）。上皮−間葉遷
移の間，細胞は過渡的にその上皮特性を失い，繊維芽細胞状形態を獲得する（Ｔ
ｈｉｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１，９１−１１３）。無傷のカドヘリン／カテニン複合体の重要性は，そのい
ずれかの成分のダウンレギュレーションによりアドヘレンスジャンクションの腫
瘍抑制作用が喪失し，これが腫瘍の侵襲および転移と相関しているという観察に
より強調される（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｂａ
Ｆ．Ｓｙｍｐ．１８９，１２４−１４１）。
【０００６】 さらに，アドヘレンスジャンクションの一体性は，チロシンリン酸化により動
的に制御されているようである。ｖ−ｓｒｃオンコジンのトランスフェクション
（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２０
，７５７−７６６；Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ
Ｊ．１２，３０７−３１４），または成長因子による処理（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ
，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１，２９５
−３０５；Ｆｕｊｉｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．
２２３，５０−６２）は，不安定な細胞−細胞接着を引き起こす。細胞の移動お
よび蛋白質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の阻害は，この不安定化効果を促
進する（Ｖｏｌｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１，１７
３３−１７４２）。可逆的チロシンリン酸化がカドヘリン−媒介性細胞−細胞接
着を制御するよう働くというモデルは，カドヘリン／カテニン−複合体が，レセ
プターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＥＧＦレセプターおよびＨＥＲ２／Ｎ
ｅｕ（Ｈｏｓｃｈｕｅｔｚｋｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．１２７，１３７５−１３８０；Ｏｃｈｉａｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）
Ｂｌｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０５，７３−７８），
ならびに膜貫通ＰＴＰのμ，κ，およびλ（Ｂｒａｄｙ−Ｋａｌｎａｙ，ｅｔ
ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０，９７７−９８６；Ｆｕｃ
ｈｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１６７１２
−１７７１９；Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７２，７２６４−７２７７）と会合していることによりさらに支持される。
【０００７】 β−カテニンおよびプラコグロビンは，ショウジョウバエの蛋白質Ａｒｍａｄ
ｉｌｌｏの哺乳動物相同体であり，その機能は発生の間の正常な体節パターン形
成に必須である（Ｒｉｇｇｌｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．３，９６−１１３）。反復４２アミノ酸配列モチーフの存在が，"ａｒ
ｍａｄｉｌｌｏファミリー"のメンバーを規定する（Ｐｅｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ
．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６，７８９−７９１）。
【０００８】 ショウジョウバエおよびアフリカツメガエル系において得られたデータは，カ
ドヘリン−媒介性細胞接着に依存しない，β−カテニンの別の機能を示唆する。
これには，β−カテニンが細胞質中に蓄積した後，核に移動することが含まれる
。すなわち，フリーのβ−カテニンは，胚発生に必須の特定の遺伝子の転写的制
御に関与している（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖ．１０，２５２７−２５３９）。β−カテニンのフリープールにおいて生ずる
シグナルには，Ｗｉｎｇｌｅｓｓ／Ｗｎｔのその膜貫通レセプター（Ｆｒｉｚｚ
ｌｅｄ）への結合，およびセリン／トレオニンキナーゼ（Ｚｅｓｔｅ−ｗｈｉｔ
ｅ３）（Ｓｈａｇｇｙ）またはその脊椎動物相同体であるグリコゲンシンターゼ
キナーゼ３（ＧＳＫ３；Ｍｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇ
ｅｎｅｔ．１３，２５６−２５８）の阻害が含まれる。
【０００９】 β−カテニンおよびプラコグロビンのさらに別の機能は，これらが腺腫様ポリ
ープ細胞（ＡＰＣ）腫瘍抑制剤蛋白質と会合することにより示される。この蛋白
質は，β−カテニンの細胞質エフェクターとして作用して，サイトゾルβ−カテ
ニンのＧＳＫ３と協調した蓄積を（Ｂｕｌｌｉｏｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６
）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０，６１−７），およびアキシン／コン
ダクチン（Ｉｋｅｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ．１７，１３７
１−１３８４；Ｂｅｈｒｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８
０，５９６−５９９；Ｓａｋａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，３０２０−３０２３）を，β−カ
テニンのユビキチン−依存性分解を誘導することにより負に制御すると考えられ
ている（Ａｂｅｒｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，３７９
７−３８０４）。
【００１０】発明の概要 上皮移動の間，β−カテニンは，フリーの，複合体を形成していない状態で，
チロシンリン酸化形態で，サイトゾル中に蓄積する。これに対し，コンフルエン
ト細胞においては，β−カテニンは，カドヘリン／カテニン腫瘍抑制システムの
必須の部分として，上皮細胞の一体性を維持する。すなわち，チロシンリン酸化
は，β−カテニンの，上皮細胞移動の間のシグナリング分子としての機能を制御
する。ＰＴＰ ＬＡＲは，上皮細胞移動の調節剤である。すなわち，そのホスフ
ァターゼの１つの機能は，細胞−細胞−接触および上皮細胞一体性の制御におけ
るものである。さらに，ＰＴＰ ＬＡＲの異所性発現は，ヌードマウスにおいて
腫瘍形成を阻害する。したがって，ＰＴＰ ＬＡＲの機能喪失は，腫瘍侵襲およ
び転移につながるかもしれない。
【００１１】 第１の観点においては，本発明は，疾病または疾患を予防または治療する方法
を特徴とし，該方法は，そのような治療を必要とする患者にＰＴＰ ＬＡＲを含
む薬学的に許容しうる組成物を投与することを含む。好ましい態様においては，
疾病または疾患は，上皮細胞移動，β−カテニンのチロシンリン酸化の増加，お
よび／またはフリーのβ−カテニンのプールのレベルの増加により特徴づけられ
る。別の好ましい態様においては，疾病または疾患は，癌，転移，および異常な
創傷治癒からなる群より選択される。しかし，異常な上皮細胞移動を原因として
含む他の疾病もまた，本発明の方法により治療することが意図される。別の好ま
しい態様においては，患者は哺乳動物であり，好ましくはヒトである。
【００１２】 "予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するか発達させる可能性を減
少させることを表す。
【００１３】 "治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【００１４】 "治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する因子
の阻害または活性化を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状
をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１または
それ以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の
増加；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；
（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ
）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。特に，治療効果は，上皮細胞移動の予
防／阻害を含む。異常な状態に対して有効性を示す化合物は，本明細書に記載さ
れるようにして同定することができる。
【００１５】 "異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，例えば細胞増殖，細胞分化
，細胞生存または細胞移動に関連しうる。
【００１６】 異常な細胞増殖状態には，癌，転移，繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
【００１７】 異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【００１８】 異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。
【００１９】 異常な細胞移動状態には，限定されないが，異常な創傷治癒，癌および転移が
含まれる。
【００２０】 本発明に関連して，"異常な"との用語は，同じ生物または異なる生物からの正
常細胞と比較して，より低いかまたはより高い上皮細胞移動を表す。あるいは，
β−カテニンの過剰なまたは過小なチロシンリン酸化，または正常レベルより高
いかまたは低いβ−カテニンプールを表すことができる。これらの影響は，ＰＴ
Ｐ ＬＡＲにより，または本発明の他の化合物により調節することができる。
【００２１】 "投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【００２２】 患者は，好ましくは哺乳動物であり，限定されないが，マウス，ラット，ウサ
ギ，モルモットまたはヤギであり，より好ましくは，有尾または無尾サルであり
，最も好ましくはヒトである。
【００２３】 本明細書において用いる場合，"ＰＴＰ ＬＡＲ"との用語は，図９に示される
アミノ酸配列，およびその機能的活性が維持されているそのフラグメントおよび
誘導体のいずれかを表す。ＰＴＰ ＬＡＲの好ましい機能的活性は，限定されな
いが，β−カテニンのチロシンリン酸化を阻害／妨害する能力，β−カテニンフ
リープールの増加を妨害する（または低下させる）能力，およびインビトロでま
たはインビボで上皮細胞移動を阻害／妨害する能力である。本発明に含まれるこ
とが企図される，機能ドメインを含む特定のフラグメントには，本明細書の実施
例および図１１に記載されるものが含まれる。さらに，機能的活性を排除しない
他の修飾，置換および欠失も企図される。これらは，本明細書の発明の詳細な説
明においてさらに詳細に記載される。
【００２４】 "ＰＴＰ ＬＡＲ"の定義に加えて，本明細書にはＰＴＰ ＬＡＲをコードする
核酸配列が記載される（図１０）。上述と同様に，ＰＴＰ ＬＡＲの機能的ドメ
インをコードするフラグメントもまた含まれ，ＰＴＰ ＬＡＲまたはその機能的
フラグメントをコードする核酸の誘導体も含まれる。これらは，本明細書の発明
の詳細な説明においてさらに詳細に記載される。
【００２５】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる"または"薬学的"との用語
は，治療化合物が治療効果を発揮することを妨害せず，許容しえない有害な副作
用を引き起こさない，医薬組成物の溶液または化合物を表す。薬学的に許容しう
る試薬の例は，Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｋａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉ
ａ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ １９９０ ａｎｄ ＦＤＡ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇ
ｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ １９９０，１９９６（ｔｈｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）（図面を含
め，本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。許容しえない副
作用は疾病により様々である。一般に，疾病がより重篤になればなるほど，耐え
られる毒性効果が高くなる。種々の疾病についての許容しえない副作用は当該技
術分野において知られている。
【００２６】 "生理学的に許容しうる"との用語は，生物に有意な刺激を引き起こさず，好ま
しくは化合物の生物学的活性および特性を排除しない担体または希釈剤を規定す
る。
【００２７】 "担体"との用語は，化合物の細胞または組織への取り込みを容易にする化学化
合物を規定する。例えば，ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は，多くの有機化
合物を生物の細胞または組織に取り込ませることを容易にするため，慣用的に用
いられている担体である。
【００２８】 "希釈剤"との用語は，目的とする化合物を溶解し，ならびに化合物の生物学的
に活性な形を安定化させる，水中（または他の溶媒）に希釈された化学化合物を
規定する。当該技術分野においては，緩衝化溶液中に溶解された塩が希釈剤とし
て用いられる。１つの慣用的に用いられている緩衝化溶液は，リン酸緩衝化食塩
水である。これは，これがヒトの血液の塩条件を模倣するためである。緩衝化塩
は，低濃度で溶液のｐＨを調節しうるため，緩衝化希釈剤は化合物の生物学的活
性をほとんど変更させない。
【００２９】 本明細書において用いる場合，"溶媒"との用語は，本発明の化合物の溶解性を
促進する化学化合物を表す。溶媒の例には，限定されないが，薬学的に許容しう
るアルコール，例えばエタノールおよびベンジルアルコール；ポリオキシヒドロ
カルビル化合物，例えばポリ（エチレングリコール）；薬学的に許容しうる界面
活性剤，例えばＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ；ポリグリコール化脂質，
例えばＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）およびＬＡＢＲＡＳＯＬ（登録商標）；お
よび薬学的に許容しうる油，例えばＭｉｇｌｙｏｌ８１２が含まれる。
【００３０】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうるアルコール"との用語は，
ほぼ室温（約２０℃）で液体であるアルコールを表す。これには，ポリプロピレ
ングリコール，エタノール，２−（２−エトキシエトキシ）エタノール（ＴＲＡ
ＮＳＣＵＴＯＬ（登録商標），Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＮＪ
０７６７５），ベンジルアルコール，およびグリセロールが含まれる。
【００３１】 本明細書において用いる場合，"ポリオキシヒドロカルビル化合物"との用語は
，水溶性炭水化物，例えばグルコース，ショ糖，マルトトリオース等；水溶性炭
水化物誘導体，例えばグルコン酸およびマンニトール，およびオリゴ糖；および
水溶性ポリマー，例えばポリビニルピロリドン，ポリ（ビニルアルコール），お
よび特にポリエーテル類，例えばポリ（エチレングリコール）または他の水溶性
混合オキシアルキレンポリマーを含む他のポリオキシアルキレン，および高分子
型エチレングリコールを表す。ポリオキシヒドロカルビル化合物は好ましくは２
以上の炭素，酸素および水素原子を含むが，ある分子，例えばポリ（エチレンイ
ミン）もまた含まれる。
【００３２】 可溶化ポリオキシヒドロカルビル成分の特に好ましい群は，ポリ（エチレング
リコール）（ＰＥＧ）およびＰＥＧ誘導体，例えばＰＥＧモノメチルエーテルが
含まれる。他の適当なＰＥＧ誘導体には，ＰＥＧ−シリコン誘導化エーテルが含
まれる。これらのポリマーの多くは，種々の分子量のものが市販されている。他
のものは，アミノ−ＰＥＧ成分をハロアルキルシリルまたはシラン成分とカップ
リングさせる等により，市販の材料から慣用的に製造することができる。
【００３３】 適当なＰＥＧは，約２００ｇ／ｍｏｌ−約２０，０００ｇ／ｍｏｌまたはそれ
以上の種々の分子量のものでありうる。より好ましくは，２００ｇ／ｍｏｌ−５
，０００ｇ／ｍｏｌ，さらにより好ましくは，２５０ｇ／ｍｏｌ−１，０００ｇ
／ｍｏｌ，最も好ましくは，２５０ｇ／ｍｏｌ−５００ｇ／ｍｏｌである。特定
の分子量の選択は，選択される特定の化合物，およびその分子量および疎水性の
程度，ならびにその処方を用いる特定の用途に依存するであろう。
【００３４】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる界面活性剤"との用語は，
必要な場合に本発明の化合物を水性溶液中に溶解させることができる化合物を表
す。好ましくは，非経口処方のためには，界面活性剤は非イオン性界面活性剤で
ある。薬学的に許容しうる界面活性剤の例には，ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ８０お
よび他のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル，モノオレイン酸グリセ
リル，ポリビニルアルコール，エチレンオキシドコポリマー，例えばＰＬＵＲＯ
ＮＩＣ（登録商標）（ポリエーテル）およびＴＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）（Ｂ
ＡＳＦ），ポリオール成分，およびソルビタンエステルが含まれる。好ましくは
，エトキシル化ひまし油，例えばＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬがある種
の化合物の処方用に用いられる。
【００３５】 本明細書において用いる場合，"エトキシル化ひまし油"との用語は，少なくと
も１つの酸素含有成分で修飾したひまし油を表す。特に，この用語は，少なくと
も１つのエトキシル成分を含むひまし油を表す。
【００３６】 さらに，本明細書において経口処方に関して用いる場合，"薬学的に許容しう
る界面活性剤"との用語は，薬学的に許容しうる非イオン性界面活性剤（例えば
，ポリオキシエチレンプロピレングリコール，例えばＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録
商標）６８（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）またはポリオキシエチレン（２０）ソルビ
タンモノオレイン酸（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０），ポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノステアリン酸（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０），ポリオキシ
エチレン（２０）ソルビタンモノパルミチン酸（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）
，ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリル酸（ＴＷＥＥＮ（登録商
標）２０）等）のモノ脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンひまし油誘導体（例
えば，ポリオキシエチレングリセロール−トリリシノレートまたはポリオキシ３
５ひまし油（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ，ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．），
ポリオキシエチレングリセロールオキシステアリン酸（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登
録商標）ＲＨ４０（ポリエチレングリコール４０水素化ひまし油）またはＣＲＥ
ＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ６０（ポリエチレングリコール６０水素化ひまし
油），ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）等）；または薬学的に許容しうるアニオン性界面
活性剤を含む。
【００３７】 本明細書において用いる場合，"ポリグリコール化脂質"との用語は，植物油を
２００ｇ／ｍｏｌ−２，０００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧを用いて部分的にアルコール
分解するか，またはＰＥＧ２００ｇ／ｍｏｌ−２，０００ｇ／ｍｏｌおよびグリ
セロールを用いて脂肪酸をエステル化することにより形成される，モノグリセリ
ド，ジグリセリド，またはトリグリセリドおよびポリエチレングリコールモノエ
ステルおよびジエステルの混合物を表す。好ましくは，これらには，ＧＥＬＵＣ
ＩＲＥ（登録商標）３５／１０，ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）４４／１４，Ｇ
ＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）４６／０７，ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）５０／
１３，ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）５３／１０，およびＬＡＢＲＡＳＯＬ（登
録商標）が含まれる。
【００３８】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる油"との用語は，鉱物油ま
たは植物油（紅花油，ピーナッツ油，およびオリーブ油を含む），分画ヤシ油，
プロピレングリコールモノラウリル酸，カプリン酸の混合トリグリセリドおよび
カプリン酸等を含む）を表す。本発明の好ましい態様は，鉱物油，植物油，分画
ヤシ油，カプリン酸の混合トリグリセリドおよびカプリン酸を特徴とする。本発
明の非常に好ましい態様は，Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２（ＨｕｌｓＡｍ
ｅｒｉｃａ，ＵＳＡから入手可能）を特徴とする。
【００３９】 疾病または疾患を治療または要望する方法の好ましい態様においては，ＰＴＰ ＬＡＲは組換え蛋白質，組換え遺伝子，または組換え細胞の一部として提供さ
れる。これを行う方法は，当業者にはよく知られており，その例は，本明細書の
発明の詳細な説明においてさらに議論される。
【００４０】 本明細書において用いる場合，"組換え"との用語は，当該技術分野において標
準的な実験室において遺伝子，蛋白質，および細胞を操作することを表す。得ら
れる遺伝子，蛋白質，または細胞は，その自然の宿主における遺伝子，蛋白質，
または細胞と同一であってもよく，操作の簡単のためにある方法で修飾されてい
てもよく，または適当なベクター中に置かれていてもよく，またはより簡単に検
出しうるようにされていてもよく，または容易に分解しうるようにされていても
よい。本発明のある観点は，インビトロおよびインビボで遺伝子治療の用途のた
めに操作されたＰＴＰ ＬＡＲの組換えフラグメントを含む。
【００４１】 疾病または疾患を治療または予防する方法の別の好ましい態様においては，Ｐ
ＴＰ ＬＡＲは，上皮細胞移動をインビトロでまたはインビボで調節し，好まし
くは上皮細胞移動をインビボでまたはインビトロで阻害する。ＰＴＰ ＬＡＲは
また（あるいはその代わりに），β−カテニンのチロシンリン酸化をインビトロ
でまたはインビボで調節し，好ましくはβ−カテニンのチロシンリン酸化をイン
ビトロでまたはインビボで阻害する。最後に，ＰＴＰ ＬＡＲはまた（あるいは
その代わりに），β−カテニンのフリープールをインビトロでまたはインビボで
調節し，好ましくは，β−カテニンのフリープールのレベルをインビトロでまた
はインビボで低下させる。
【００４２】 "調節する"との用語は，ＰＴＰ ＬＡＲまたは化合物が，上皮細胞移動，β−
カテニンのチロシンリン酸化，またはβ−カテニンフリープールのレベルを変更
する能力を表す。調節剤は，好ましくはこれらの機能を阻害するが，ある状況に
おいてはこれらの機能を増加させることが好ましいかもしれない。
【００４３】 "調節する"との用語はまた，ＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を増加または減少させることを表す。調節剤は，好まし
くは，ＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成
される確率を増加させ，またはＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を減少させる。"複合体"との用語は，互いに結合した少
なくとも２つの分子の組み合わせを表す。
【００４４】 "天然の結合パートナー"との用語は，ＰＴＰ ＬＡＲに結合するポリペプチド
，脂質，小分子，または核酸を表す。ＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナーと
の間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少，または
ＰＴＰ ＬＡＲ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少，ならび
にβ−カテニンのチロシンリン酸化，またはβ−カテニンのフリープールのレベ
ルの変化として現れることができる。
【００４５】 第２の観点においては，本発明は，試料中でＰＴＰ ＬＡＲを疾病または疾患
の予知の道具として検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試料を，ハイ
ブリダイゼーションアッセイ条件下でＰＴＰ ＬＡＲの核酸標的領域とハイブリ
ダイズする核酸プローブと接触させ，ここでプローブはＰＴＰ ＬＡＲをコード
する核酸配列，そのフラグメント，または前記配列およびフラグメントの相補体
を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病ま
たは疾患の予知の指標として検出することを含む。好ましい態様においては，疾
病または疾患は，異常な創傷治癒，癌，および転移からなる群より選択される。
【００４６】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲを疾病または疾患の予知の道具として検出する別の方
法は，（ａ）試料中のＰＴＰ ＬＡＲをコードする核酸標的領域をＰＴＰ ＬＡ
Ｒをコードする対照核酸標的領域と比較し；そして（ｂ）前記標的領域と前記対
照標的領域との間の配列または量の相違を，前記疾病または疾患の前記予知の指
標として検出することを含む。好ましくは，疾病または疾患は，異常な創傷治癒
，癌，および転移からなる群より選択される。
【００４７】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲを疾病または疾患の予知の道具として検出する別の方
法は，（ａ）試料をＰＴＰ ＬＡＲとハイブリダイズする抗体と接触させ；そし
て（ｂ）抗体：ＰＴＰ ＬＡＲ複合体の存在または量を疾病または疾患の予知の
指標として検出することを含む。好ましくは，抗体は，ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であり，あるいは，抗体はハイブリドーマ由来である。好
ましくは，疾病または疾患は，異常な創傷治癒，癌，および転移からなる群より
選択される。
【００４８】 本明細書において用いる場合，"予知"との用語は，例えば，治癒の見込み，治
療に反応する見込み，または転移の見込みを表す。すなわち，これは，疾病の進
行，および疾病の治癒，および疾病治療の結果に関連する。
【００４９】 本明細書において用いられる場合，"接触させる"との用語は，試験化合物を含
む溶液をこの方法の細胞または蛋白質を浸す液体培地と混合することを表す。化
合物を含む溶液はまた，試験化合物または化合物のこの方法の細胞内への取り込
みを容易にする他の成分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでい
てもよい。本発明の化合物を含む溶液は，輸送装置，例えばピペットに基づく装
置またはシリンジに基づく装置を用いることにより，細胞を浸す培地に加えるこ
とができる。
【００５０】 ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以下の程度のストリン
ジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する：５０％ホルムアミ
ド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０．５％ＳＤＳ，０．
１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃
で一夜ハイブリダイゼーション，２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃で洗浄；
および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃で洗浄。最もストリンジェント
なハイブリダイゼーションアッセイ条件のいくつかにおいては，第２の洗浄は，
０．１ＸＳＳＣを用いて７０℃までの温度で行うことができる（Ｂｅｒｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｇ ４２１，（図面および表を含め，本明細書
の一部としてここに引用する）。しかし，他の用途は，これらの条件の組の間の
条件を使用とすることを必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーショ
ンを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく知られており，い
くつかの因子，例えば，限定されないが，ハイブリダイズすべき配列および試験
すべき試料に基づく。
【００５１】 "核酸標的領域"とは，ＰＴＰ ＬＡＲ遺伝子のフラグメントを表し，好ましく
は，プローブがＰＴＰ ＬＡＲ遺伝子のみにハイブリダイズするようにユニーク
である。ユニークとは，配列が他の既知の蛋白質のいずれにも存在しないことを
意味する。これを行う手法は当業者にはよく知られている。"対照"核酸標的領域
とは，試験している試料中のＰＴＰ ＬＡＲ遺伝子中のものと比較した，既知の
ＰＴＰ ＬＡＲ遺伝子中の核酸の同一の領域を表す（図１０）。ある疾病状態に
おいては，試料からのＰＴＰ ＬＡＲ遺伝子の配列が対照配列とは異なることが
予測される。あるいは，試料中のＰＴＰ ＬＡＲ遺伝子の量が，細胞または組織
の正常な試料において見いだされるより多いかまたは少ないかもしれない。
【００５２】 本明細書において用いる場合，"検出する"との用語は，蛋白質，抗体，または
核酸を検出する任意の方法を含む。このような方法は当該技術分野においてよく
知られており，多くが本明細書において議論される。特に，これらには，ＥＬＩ
ＳＡ，ＰＣＲ，放射性標識等の方法が含まれる。
【００５３】 第３の観点においては，本発明は，上皮細胞移動を調節する１またはそれ以上
の化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）チロシンリン酸化β−
カテニンを１またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ；（ｂ）前記チロ
シンリン酸化β−カテニンのリン酸化レベルの変化をモニターして，前記上皮細
胞移動を調節する前記１またはそれ以上の化合物を同定する，の各工程を含む。
好ましい態様においては，１またはそれ以上の化合物は，インドリノン，キナゾ
リン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる群より選択される。
【００５４】 ＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する１またはそれ以上の化合物を同定する別の方法
は，（ａ）ＰＴＰ ＬＡＲを１またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ
；（ｂ）ＰＴＰ ＬＡＲの活性を測定し；そして（ｃ）１またはそれ以上の可能
性のある化合物が前記ＰＴＰ ＬＡＲの活性を調節するか否かを判定する，こと
を含む。好ましい態様においては，活性はホスホチロシンホスファターゼ活性で
ある。別の好ましい態様においては，該方法はさらに，天然の結合パートナーを
工程（ａ）に加えることを含む。好ましくは，天然の結合パートナーは，β−カ
テニンおよびプラコグロビンからなる群より選択され，１またはそれ以上の化合
物は，インドリノン，キナゾリン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる
群より選択される。
【００５５】 細胞においてＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する１またはそれ以上の化合物を同定
するまた別の方法は，（ａ）ＰＴＰ ＬＡＲを前記細胞中で発現させ；（ｂ）前
記細胞を１またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ；そして（ｃ）細胞
移動または前記ＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化
をモニターして，前記ＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する前記１またはそれ以上の化
合物を同定する，ことを含む。好ましくは，天然の結合パートナーは，β−カテ
ニン，およびプラコグロビンからなる群より選択され，１またはそれ以上の化合
物は，インドリノン，キナゾリン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる
群より選択される。
【００５６】 "化合物"との用語は，好ましくは，非ペプチド有機分子を表し，最も好ましく
は，非ペプチド合成有機分子を表す。"非ペプチド分子"との用語は，アミノ酸の
ポリマーではない化合物を表す。非ペプチド分子は，好ましくは，生理学的条件
で加水分解する化学成分，例えばペプチド模倣体を含まない。化合物の例は，本
明細書の発明の説明中に含まれる。好ましくは，そのような分子は，３，０００
未満の分子量を有する。
【００５７】 本明細書において用いる場合，"発現する"との用語は，好ましくは，細胞内に
おける核酸ベクターからのＰＴＰ ＬＡＲの生成を表す。本明細書に記載される
ような，当該技術分野においてよく知られる技術を用いて核酸ベクターを細胞に
トランスフェクトする。"より高いレベルで"とは，ＰＴＰ ＬＡＲが通常は全く
発現されないか，または通常はその発現が起こるがそのレベルがより高いことを
示すことができる。発現のレベル（および比較）は，当該技術分野においてよく
知られる方法により決定することができる（および本明細書において例が記載さ
れる）。より高い発現は，好ましくは２倍，より好ましくは５倍またはそれ以上
である。より低い発現はその逆である。
【００５８】 "核酸ベクター"との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲ
ノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を
表す。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，直鎖状に
することができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素により切断
されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。キメラレ
セプターをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断片を
一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる。
【００５９】 "トランスフェクトする"との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞
中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含まれ，
例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理すること
により，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること，また
は種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００６０】 "モニターする"との用語は，細胞を，物質，例えば，限定されないが，１また
はそれ以上の化合物およびＰＴＰ ＬＡＲと接触させる影響を観察することを表
す。影響は，細胞表現型または移動，またはＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パート
ナーとの間の相互作用として現れることができる。より好ましくは，モニターす
べき影響は，β−カテニンのリン酸化レベルまたはフリーのβ−カテニンプール
のレベルである。"影響"との用語は，好ましくは，細胞表現型の変化または無変
化を記述する。"影響"はまた，ＰＴＰ ＬＡＲの触媒活性の変化または無変化を
記述する。"影響"はまた，ＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナー，例えばβ−
カテニンまたはプラコグロビンとの相互作用の変化または無変化を記述すること
ができる。より好ましくは，"影響"は，β−カテニンのリン酸化レベル，フリー
のβ−カテニンプールのレベル，または上皮細胞移動の変化または無変化を記述
する。
【００６１】 "細胞表現型"との用語は，細胞または組織の外見，または細胞または組織の機
能を表す。細胞表現型の例には，限定されないが，細胞サイズ（縮小または拡大
），細胞形状，細胞増殖（細胞の数の増加），細胞分化（生理学的状態の変化）
，細胞毒性（細胞死），細胞生存，アポトーシス（プログラムされた細胞死），
または代謝栄養の利用（例えばグルコース取り込み）が含まれる。最も好ましく
は，細胞表現型とは，上皮細胞移動（繊維芽細胞の形状を帯びる）の存在または
非存在を表す。細胞表現型の変化または無変化は，当該技術分野において知られ
る手法により容易に測定することができる。
【００６２】 "触媒活性"との用語は，本発明の文脈においては，ＰＴＰ ＬＡＲが基質を脱
リン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば脱リン酸化生成物に変換され
た基質の量を時間の関数として決定することにより測定することができる。触媒
活性は，時間を一定にし，一定時間後の脱リン酸化された基質の濃度を決定する
ことによって，本発明の方法により測定することができる。基質の脱リン酸化は
，ＰＴＰ ＬＡＲの活性部位において生ずる。活性部位は，通常は基質がＰＴＰ
ＬＡＲに結合し，脱リン酸化される腔である。β−カテニンの脱リン酸化を測
定する方法は本明細書において記載される。当業者は，他の適当な方法を想像す
ることができるであろう。
【００６３】 最後の観点においては，本発明は，上皮細胞移動により特徴づけられる疾病ま
たは疾患を治療する方法を特徴とする。該方法は，そのような治療を必要とする
患者に薬学的に許容しうる組成物中の１またはそれ以上の化合物を投与すること
を含み，ここで，前記１またはそれ以上の化合物は，上述の方法により同定され
る。好ましくは，疾病または疾患は，癌，転移，および異常な創傷治癒からなる
群より選択される。最も好ましくは，患者は哺乳動物であり，哺乳動物はヒトで
ある。
【００６４】 本発明はまた，上皮細胞移動により特徴づけられる疾病または疾患を治療する
別の方法を含む。該方法は，そのような治療を必要とする患者に，薬学的に許容
しうる組成物中の１またはそれ以上の化合物を投与し，ここで，１またはそれ以
上の化合物は上皮細胞移動を調節する。好ましくは，疾病または疾患は，癌，転
移，および異常な創傷治癒からなる群より選択され，患者は哺乳動物であり，好
ましくは，ヒトである。
【００６５】 好ましい態様においては，１またはそれ以上の化合物はインビトロで上皮細胞
移動を調節し，好ましくは阻害する。あるいは，１またはそれ以上の化合物は，
インビトロでβ−カテニンのチロシンリン酸化を調節し，好ましくは阻害する（
または脱リン酸化する）。あるいは，１またはそれ以上の化合物は，インビトロ
でβ−カテニンフリープールのレベルを調節し，好ましくは低下させる。最後に
，別の好ましい態様においては，１またはそれ以上の化合物は，キナゾリン，イ
ンドリノン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる群より選択される。
【００６６】 本明細書においては，発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
【００６７】 上述の発明の概要は限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点は，
以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００６８】図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは，種々の条件下における上皮ＮＢＴＩＩ細胞の移動を示す
。図１Ａは，インビトロ創傷アッセイを示す。播種の２４時間後，コンフルエン
ト細胞単層を実施例に記載されるように掻き取った。ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ
）またはＵｌｔｒｏｓｅｒＧ（２％）を加えた。創傷閉合は，写真により記録し
た。目盛バーは８０μｍを表す。
【００６９】 図１Ｂは，免疫蛍光研究の結果を表す。播種の２４時間後，ＥＧＦ（１００ｎ
ｇ／ｍＬ）をサブコンフルエント細胞に加えた。６時間後，細胞を次の免疫標識
用に固定し，慣用の蛍光顕微鏡により画像を記録した。上パネルは，未処理対照
を示し，下パネルはＥＧＰで処理した細胞を示す。緑色蛍光は，Ｅ−カドヘリン
の存在を示し，赤色蛍光はβ−カテニンを示す。一次抗体なしでインキュベート
した対照は，蛍光シグナルについてネガティブのままであった。目盛バーは２０
μｍを表す。
【００７０】 図２は，上皮細胞移動の間のβ−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリ
ン酸化を示す。ＮＢＴＩＩ細胞を１ｘ１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種した。２４
時間後，成長因子を加えて移動を誘導した（ＥＧＦ：１００ｎｇ／ｍＬ；ａＦＧ
Ｆ：３０ｎｇ／ｍＬ，５０μｇ／ｍＬヘパリンを含む；ＵｌｔｒｏｓｅｒＧ；２
％）。溶解の９０分前に，Ｎａ−オルトバナジン酸（１ｍＭ）を加えた（右）ま
たは加えなかった（左）。陽性対照として，細胞を過バナジン酸で１０分間処理
した。溶解した後，カドヘリン／カテニン複合体を免疫沈澱させ，沈殿物をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分離した。チロシンリン酸化レベルは，抗ホスホチロシン抗
体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した（上）。Ｅ−カドヘリン（
中）またはカテニン（下）に対する特異的抗体を用いて膜を再探索して，沈澱し
た蛋白質が等量であることを確実にした。高度にチロシンリン酸化されたβ−カ
テニン（以後過バナジン酸処理と称する）は，再ブロッティングにおいては効率
的に免疫修飾されなかった。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準はキロ
ダルトンで表され，左側に示される。
【００７１】 図３は，上皮細胞移動の間，フリーの，複合体を形成していないβ−カテニン
のプールが増加し，チロシンリン酸化の促進と相関することを示す。ＮＢＴＩＩ
細胞は，１ｘ１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種した。２４時間後，ＥＧＦ（１００
ｎｇ／ｍＬ）を示された時間間隔で加えた。溶解の３０分前に，Ｎａ−オルトバ
ナジン酸（１ｍＭ）を加えた。次に，５μｇのＧＳＴ／Ｅ−カドヘリン細胞質蛋
白質または３倍モル過剰のＧＳＴを用いてアフィニティー沈澱を行った。蛋白質
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し，フリーの，複合体を形成していないβ−カテ
ニンのレベルを，抗−β−カテニン抗体を用いるウエスタンブロッティングによ
り分析した（上）。抗−ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティング
は，フリーの，複合体を形成していないβ−カテニンのチロシンリン酸化のレベ
ルの増加を示す（下）。図２と比較すると，細胞をＮａ−オルトバナジン酸で３
０分間のみ前処理したことに注意すべきである。矢印は，目的とする蛋白質を示
す。分子量標準はキロダルトンで表され，左側に示される。
【００７２】 図４は，カドヘリン／カテニン複合体のメンバーがＮＢＴＩＩ細胞においてＰ
ＴＰ ＬＡＲと共局在することを示す。播種の２４時間後，ＮＢＴＩＩ細胞のコ
ンフルエント単層を固定し，間接免疫蛍光用に処理した。細胞は，示されるよう
に，β−カテニン，プラコグロビンまたはＥ−カドヘリンのいずれかに対する抗
体で標識し（緑色蛍光，上パネル），同時にＰＴＰ ＬＡＲに対する抗体で標識
した（赤色蛍光，中パネル）。レーザー共焦点蛍光イメージは，ＰＴＰ ＬＡＲ
とカドヘリン／カテニン複合体がアドヘレンスジャンクションにおいて共局在す
ることを示す（黄色の重ね合わせ，下パネル）。一次抗体なしの対照は，蛍光シ
グナルがネガティブのままであった。目盛バーは２０ｐｍを示す。
【００７３】 図５Ａ，５Ｂ，および５Ｃは，カドヘリン／カテニン−複合体のメンバーがＰ
ＴＰ ＬＡＲと会合することを示す。図５Ａおよび５Ｂは，無傷の細胞における
カドヘリン／カテニン−複合体とＰＴＰ ＬＡＲとの会合を示す。ヒト上皮ＭＣ
Ｆ７細胞を１ｘ１０4細胞／ｃｍ2で播種し，２４時間後にＥＧＦ（１００ｎｇ／
ｍＬ）で示されるように刺激した。細胞を溶解し，ＰＴＰ ＬＡＲに対する抗体
（モノクローナル抗体１１．１Ａ，ウサギポリクローナル抗血清＃３２０），ま
たは示されるカドヘリン／カテニン−複合体のメンバーで免疫沈澱させた。ＮＩ
Ｓは非免疫血清対照を示す。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し，Ｅ−カド
ヘリンに対する抗体（図５Ａ，上），β−カテニン（図５Ａ，中），プラコグロ
ビン（図５Ｂ，上）またはＰＴＰ ＬＡＲ（図５Ａおよび５Ｂ，下；図５Ａ，長
時間露光が最下部に示される）を用いてウエスタンブロッティングにより分析し
た。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準はキロダルトンで表され，左側
に示される。
【００７４】 図５Ｃは，β−カテニンおよびプラコグロビンとＰＴＰ ＬＡＲとのインビト
ロ会合を示す。β−カテニンおよびプラコグロビンを，ヒト胚性腎臓２９３繊維
芽細胞中で過渡的に過剰発現させた。２４時間の血清飢餓の後，細胞を溶解する
前に過バナジン酸で１０分間刺激した。等量の溶解物を，ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡ
Ｒ細胞質融合蛋白質（ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲｉ）または３倍モル過剰のＧＳＴ
とともにインキュベートした。対照ベクターでトランスフェクトした２９３細胞
の溶解物をＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ細胞質融合蛋白質（ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ
ｉ）とともにインキュベートした。複合体をグルタチオン−セファロース上に固
定化し，沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。結合した蛋白質は，抗β−
カテニン抗体（左）またはプラコグロビンに対する抗体（右）を用いてウエスタ
ンブロッティングにより分析した。矢印は目的とする蛋白質を示す。分子量標準
はキロダルトンで表され，左側に示される。
【００７５】 図６は，β−カテニンがインビトロでＰＴＰ ＬＡＲの基質であることを示す
。β−カテニンをヒト胚性腎臓２９３繊維芽細胞において過渡的に過剰発現させ
た。血清飢餓の２４時間後，細胞を溶解する前に過バナジン酸で刺激し，次にβ
−カテニンを抗β−カテニン抗体を用いて免疫沈澱させ，沈殿物を指示された時
間間隔でＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ細胞質融合蛋白質（左），ＧＳＴ−ＰＴＰ Ｌ
ＡＲ ＰＴＰ Ｄ1Ｃｌ５２２Ｓ−変異体（中）またはＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ
ＰＴＰ Ｄ2Ｃ１８１３Ｓ−変異体（右）とともにインキュベートした。指示
された時間の後に反応を終了し，蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。β
−カテニンのチロシンリン酸化レベルは，抗ホスホチロシン抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した（上）。抗β−カテニン抗体を用いるウエス
タンブロッティングは，等量のβ−カテニンが免疫沈澱したことを示した（下）
。矢印は目的とする蛋白質を示す。
【００７６】 図７Ａ，７Ｂ，および７Ｃは，ヒトＰＴＰ ＬＡＲの異所性過剰発現が上皮細
胞移動およびラットＮＢＴＩＩ細胞のヌードマウス中における腫瘍形成を阻害す
ることを示す。図７Ａおよび７Ｂは，ＮＢＴＩＩ ｐＬＸＳＮおよびＮＢＴＩＩ
ｈＰＴＰ ＬＡＲ細胞のスキャッタアッセイを示す。図７Ａにおいては，空ベ
クターｐＬＸＳＮ（左）またはヒトＰＴＰ ＬＡＲ（右）で感染したＮＢＴＩＩ
細胞を１ｘ１０4細胞／ｃｍ2で播種し，２４時間後に示されるようにＥＧＦ（１
００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。７時間後，移動形態を写真により記録した。
【００７７】 図７Ｂは，スキャッターアッセイの定量を示す（＋／−標準偏差）。この目的
のために，ランダムに選択した顕微鏡視野中から１枚あたり１０００個の細胞を
計数した。アッセイは三重に行った。細胞は，丸石様の上皮の形態から移動して
つつある繊維芽細胞状の表現型に変化したときに，移動している細胞であると判
定した。
【００７８】 図７Ｃは，ＮＢＴＩＩ ｐＬＸＳＮおよびＮＢＴＩＩ ｎＰＴＰ ＬＡＲ細胞
による，ヌードマウスにおける腫瘍形成を示す。空ベクターｐＬＸＳＮ（黒三角
）またはヒトＰＴＰ ＬＡＲ（黒四角）で感染させたＮＥＴＩＩ細胞を，スイス
ヌードマウスの横腹領域の皮下に注射した（２ｘ１０6／５０μｌ）。腫瘍形成
をモニターした。グラフは，それぞれポリクローンのおよびクローン化した細胞
株あたり３個の平均腫瘍体積を示す。
【００７９】 図８は，ＮＢＴＩＩ細胞におけるヒトＰＴＰ ＬＡＲの異所性発現がβ−カテ
ニンのチロシン残基のリン酸化を阻害し，β−カテニンのフリープールを増加さ
せることを示す。空ベクターｐＬＸＳＮ（左）またはヒトＰＴＰ ＬＡＲ（右）
で感染したＮＢＴＩＩ細胞を，１ｘ１０4細胞／ｃｍ2で播種し，２４時間後，Ｅ
ＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で示された時間感覚で刺激した。蛋白質チロシンホス
ファターゼ活性の不可逆的阻害を回避するために，Ｎａ−オルトバナジン酸前処
理は省略した。細胞を溶解し，５μｇのＧＳＴ−Ｅ−カドヘリン細胞質蛋白質ま
たは３倍モル過剰のＧＳＴを用いてインビトロ会合を行った。蛋白質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離し，フリーの，複合体を形成していないβ−カテニンのレベ
ルを，抗−β−カテニン抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した
（上）。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングは，対照感染
ＮＢＴＩＩ細胞株において，フリーの，複合体を形成していないβ−カテニンの
チロシンリン酸化のみが増加したことを示す（下）。矢印は目的とする蛋白質を
示す。分子量標準はキロダルトンで表され，左側に示される。
【００８０】 図９は，ＥＭＢＬデータベースから抽出したＰＴＰ ＬＡＲプレ蛋白質のアミ
ノ酸配列を示す。
【００８１】 図１０Ａ，１０Ｂおよび１０Ｃは，ＥＭＢＬデータベースから抽出したＰＴＰ ＬＡＲの核酸配列を示す。
【００８２】 図１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃ，１１Ｄ，および１１Ｅは，ＰＴＰ ＬＡＲのアミ
ノ酸配列を用いたＰｆａｍ ＨＭＭの検索から得られた出力を示す。サイトはｈ
ｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｈ−ｈｍｍ
ｓｅａｒｃｈである。ホスファターゼドメインは"緑色"であり，有意なＥ−値を
示す。
【００８３】好ましい態様の詳細な説明 カドヘリン／カテニン−複合体媒介性細胞−細胞接着ならびにカテニンの接着
−非依存性機能は上皮細胞の多細胞分化の調節，増殖，および悪性トランスフォ
ーメーションに関与することが示唆されている（Ｍａｒｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１
９９６）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５，１５９−２０５；Ｂｉｒｃｈｍ
ｅｉｅｒ，ｅｔ ａ１．（１９９５）Ｃｉｂａ Ｆ．Ｓｙｍｐ．１８９，１２４
−１４１；Ｈｕｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．８，６８５−６９１）。細胞移動は，胚発生および成人生物に
おける上皮再生，例えば創傷治癒の間の必須のプロセスであり，精密な制御を必
要とする。これは，腫瘍細胞が侵襲性および転移性になると変化または喪失する
。本発明の一部として，上皮細胞移動を制御する明確なメカニズムが細胞および
生化学レベルで定義された。さらに，チロシンキナーゼによるβ−カテニンのチ
ロシンリン酸化の影響，および蛋白質チロシンホスファターゼＬＡＲによるその
制御が，運動性細胞において特性決定された。
【００８４】 成長因子，例えばＥＧＦ，ａＦＧＦまたは肝細胞成長因子／スキャッター因子
は，上皮細胞の移動を誘導することが示されている（Ｍａｎｓｋｅ，ｅｔ ａｌ
．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１５５，４９−９６）。移動とβ
−カテニンのチロシンリン酸化との間の相関が示唆されているが（Ｂｅｈｒｅｎ
ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２０，７５７−７６
６；Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．１，２９５−３），その有意性はまだ明らかではない。チロシン
キナーゼシグナリングの阻害は，ＮＥＴＩＩ細胞の上皮細胞移動を阻害する。Ｅ
ＧＦレセプター（Ｈｏｓｃｈｕｅｔｚｋｙ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３．２７，１３７５−１３８０）または細胞質チロシンキナ
ーゼ（例えばＳｒｃ）等のＲＴＫは，β−カテニンのチロシンリン酸化を媒介す
ることができる（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ
Ｊ．１２，３０７−３１４）。ＮＢＴＩＩ細胞においては，優性ネガティブｃ−
Ｓｒｃ変異体は移動を阻害することができる（Ｒｏｄｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１
９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３１，７６１−７７３）。
【００８５】 本発明は，とりわけ，移動を誘導した後，フリーの，複合体を形成していない
β−カテニンのプールが増加し，この増加がβ−カテニンチロシンリン酸化の促
進と相関しているという知見に関する。したがって，チロシンリン酸化は，β−
カテニンと，Ｅ−カドヘリンおよびアクチン−細胞骨格の両方との相互作用を低
下させるかもしれない。強い細胞−細胞接着にはカドヘリン／カテニン−複合体
の完全性が必須であるため，細胞間接触が全体的に減少する。興味深いことに，
Ｅ−カドヘリンとβ−カテニンとの融合蛋白質は，β−カテニンに非依存的にＥ
−カドヘリンと細胞骨格との相互作用を媒介することが報告されている。しかし
，これらの細胞はもはや移動することができない（Ｎａｇａｆｕｃｈｉ， ｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７，２３５−２４５）。す
なわち，β−カテニンのチロシンリン酸化は，Ｅ−カドヘリンと細胞骨格との間
の接触の破壊，およびフリーのβ−カテニンのプールの増加につながるかもしれ
ない。このことは，カドヘリン媒介性細胞接着に依存しないβ−カテニンの機能
を示唆する。
【００８６】 アドヘレンスジャンクションにおけるこれらの役割の他に，β−カテニンまた
はそのショウジョウバエ相同体であるＡｒｍａｄｉｌｌｏのシグナリング機能は
，ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおいて正常な胚発生に必須であ
ることが示されている。フリーの，複合体を形成していないβ−カテニンのシグ
ナリング機能の妨害は，脊椎動物の正常な発生を破壊した（Ｍｉｌｌｅｒ， ｅ
ｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０，２５２７−２５３９）。そ
の後のショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおける研究は，β−カテニ
ンの細胞質プールを制御するシグナリングカスケードの発見につながった。
【００８７】 シグナルがないとき，β−カテニンは主としてアドヘレンスジャンクションに
局在し，フリーのβ−カテニンはユビキチン依存的様式でダウンレギュレートさ
れる（Ａｂｅｒｌｅ， ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６／３７９
７−３８０４）。細胞外シグナル，例えばＷｎｔまたはＷｉｎｇｌｅｓｓ（Ｐｅ
ｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０，３６９
−３８０；ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ
３６８，３４２−３４４）は，レセプターＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｂｈａｎｏｔ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８２．２２５−２３０）を介してＧＳ
Ｋ３／ＺｅｓｔｅＷｈｉｔｅ３活性を阻害し，したがってβ−カテニン／Ａｒｍ
ａｄｉｌｌｏをそのフリーの形で安定化させる（Ｙｏｓｔ， ｅｔ ａｌ．（１
９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０，１４４３−１４５４；Ｐａｐｋｏｆｆ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，２１２８−２１３
４）。これは，ＡＰＣ依存性およびユビキチン依存性分解（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ
， ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２，３０４６−３０５０；Ａｂｅｒｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．１６，３７９７−３８０４）を阻害することによる。
【００８８】 本発明においては，ＥＧＦ処理により移動している細胞中の細胞質および核に
おけるフリーのβ−カテニンのプールが増加する。このことは，上皮細胞移動の
間のβ−カテニンのフリープールを制御する，Ｗｎｆｃ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグ
ナリングとは別の経路を示唆する。β−カテニンのチロシンリン酸化はまたフリ
ーのβ−カテニンを安定化させるかもしれない。これは，相同のプラコグロビン
のチロシンリン酸化型はもはやＡＰＣと会合せず（Ｓｈｉｂａｔａ， ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０３
，５１９−５２２），このことによりおそらくはＡＰＣ媒介性分解を妨害してい
るためである。さらに，ＥＧＦ依存性上皮細胞移動の間，β−カテニンのフリー
プールは増加したホスホチロシン含量を有する。さらに，ＥＧＦはまたＧＳＫ３
活性を阻害する（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ， ｅｔ ａｌ．（１９９５
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９８７−９９０）。β−カテニンのチロシ
ンリン酸化は，癌腫形成および腫瘍侵襲と相関することが示されている（Ｓｏｍ
ｍｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，３５４４−
３５５２）．フリーのβ−カテニンまたはプラコグロビンのみが，高移動性群の
メンバー（ＨＭＧ；Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０，９４−１００），転写因子のファミリー，すなわち，
ＬＥＦ１およびＴＣＦ３，ＴＣＦ４（Ｂｅｈｒｅｎｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６３８−６４２；Ｈｕｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１
９９６）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．．５９，３−１０；Ｍｏｌｅｎａａｒ，
ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６，３９１−３９９；Ｋｏｒｉｎｅｋ，
ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１７８４−１７８７；Ｍ
ｏｒｉｎ， ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１７８７−１
７９０）と会合することができる。しかし，β−カテニンおよびプラコグロビン
は，その核トランスローケーションおよびＬＥＦ１との複合体形成において異な
る。ＬＥＦ１依存性トランスアクチベーションは，β−カテニンにより優先的に
推進される（Ｓｉｍｃｈａ， ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１４１，１４３３−１４４８）。転写因子ＬＥＦ１およびＴＣＦは，アフリ
カツメガエル胚中でβ−カテニンとともに発現されたとき，背面中胚葉を誘導す
ることができる（Ｈｕｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖｅ
ｌｏｐ．，５９，３−１０；Ｂｅｈｒｅｎｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３８２，６３８−６４２；Ｍｏｌｅｎａａｒ． ｅｔ ａｌ．（１９
９６）Ｃｅｌｌ ８６，３９１−３９９）。ＬＥＦｌ−欠損およびＬＥＦｌ−ト
ランスジェニックマウスからのデータは，ＥＭＴの間のこの転写因子の重要性を
示す。この転写因子は，通常はＥＭＴの間および間葉と上皮との間の誘導的プロ
セスの間，アップレギュレートされるためである（ｖａｎＧｅｎｄｅｒｅｎ，
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．Ｑ，２６９１−２７０３；Ｚｈ
ｏｕ， ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９，５７０−５８３；
Ｋｒａｔｏｃｈｗｉｌ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０
，１３８２−１３９４）。このことは，胚発生ならびに上皮細胞移動の間の間葉
および上皮表現型の遺伝子の発現を調和させる一般的な制御システムが存在する
ことを示唆する。ＥＭＴまたは細胞移動の間，この共通のレギュレータは，上皮
遺伝子の発現をスイッチオフし，間葉表現型の遺伝子をスイッチオンするのであ
ろう。β−カテニン／ＬＥＦｌ−複合体は，この共通のレギュレータであるかも
しれず，β−カテニンのフリープールを制御する分子は，適切な発生または創傷
治癒に必須であるかもしれない。
【００８９】 ＰＴＰは，Ｎａ−オルトバナジン酸（ホスファターゼ活性の強力な阻害剤）で
処理すると，上皮細胞における正常細胞接触阻害が減少し，アドヘレンスジャン
クションにおけるチロシンリン酸化が増加するため，細胞−細胞接触の制御に重
要な役割を果たすことが提唱されている（Ｖｏｌｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．（１
９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１，１７３３−１７４２）。したがって，ＰＴＰは，
アドヘレンスジャンクションにおける制御事象においてＴＫの定常状態平衡アン
タゴニストとして作用するのかもしれない。これらの知見と一致して，我々は，
Ｎａ−オルトバナジン酸で前処理した後に，上皮細胞の移動におけるβ−カテニ
ンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化が顕著に増加することを示す。
【００９０】 最近，ＰＴＰ ＬＡＲは，ＬＩＰ−１（ＬＡＲ相互作用蛋白質−１）および多
ドメイン蛋白質Ｔｒｉｏとの局所性接着と相互作用し共局在することが示された
。しかし，これらの蛋白質のいずれも，ＰＴＰ ＬＡＲの基質ではなさそうであ
る（Ｓｅｒｒａ−Ｐａｇｅｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４
，２８２７−２８３８；Ｄｅｂａｎｔ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，５４６６−５４７）。さらに，Ｐ
ＴＰ ＬＡＲ様ＰＴＰは，神経分泌ＰＣ１２細胞のアドヘレンスジャンクション
においてカドヘリン／カテニン−複合体と相互作用することが報告されている（
Ｋｙｐｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３４，１５
１９−１５２９）。
【００９１】 我々は，本発明において，上皮細胞におけるＰＴＰ ＬＡＲとカドヘリン／カ
テニン−複合体との共局在および相互作用を示す。さらに，β−カテニンおよび
プラコグロビンのみがＰＴＰ ＬＡＲと直接会合することができることを示し，
β−カテニンがＰＴＰ ＬＡＲの基質であることの証拠を提示する。ＰＴＰ Ｌ
ＡＲは，アドヘレンスジャンクションおよびフォーカルコンタクトに局在し（こ
の報告およびＫｙｐｔａ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１３４，１５１９−１５２９；Ｓｅｒｒａ−Ｐａｇｅｓ， ｅｔ ａｌ．（１
９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４，２８２７−２８３８；Ｄｅｂａｎｔ， ｅｔ ａ
ｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，５４
６６−５４７１），したがってＰＴＰ ＬＡＲは，上皮細胞移動の間の細胞−細
胞−接着ならびに細胞−ＥＧＭ−接着の分解および再構築の必須のレギュレータ
でありうるため，特に興味深い。
【００９２】 我々は，ＰＴＰ ＬＡＲの適度の異所性過剰発現が上皮細胞移動を有意に阻害
することを示す。ショウジョウバエにおいても類似の状況が見いだされており，
この場合には，脊椎動物とは異なり，ＰＴＰ ＬＡＲはほとんど発生しつつある
ニューロンにおいてのみ発現される。ＰＴＰ ＬＡＲを欠失したハエにおいては
，運動軸索はその正常な標的領域をバイバスし，停止することなく伸び続ける（
Ｋｒｕｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４，６１１−６２２）
。ＰＴＰ ＬＡＲ，ＰＴＰμ，ＰＴＰκ，ならびにＰＴＰ ＤＥＰ−１は，上昇
した蛋白質レベルで発現され，細胞コンフルエンスが増加し（Ｆｕｃｈｓ， ｅ
ｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１６７１２−１７７
１９；Ｌｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８
，２６５０３−２６５１１；Ｇｅｂｂｉｎｋ， ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３１，２５１−２６０；Ｏｓｔｍａｎ， ｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９６８０
−９６８４），このことによりコンフルエント細胞におけるホスファターゼ活性
の観察される増加に寄与することが見いだされている（Ｍａｎｓｂｒｉｄｇｅ，
ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５１，４３３−
４４２）。
【００９３】 コンフルエント細胞におけるホスファターゼ活性の増加は，細胞−細胞−接着
および上皮細胞の一体性の制御および安定化におけるＰＴＰの役割を示唆する。
これに対し，創傷治癒の間，創傷末端の細胞はサブコンフルエント状態であり，
ここでは，ＰＴＰの作用は減少する。これは，成長因子，例えばＥＧＦ，ＴＧＦ
α，およびＫＧＦによる刺激を介するチロシンキナーゼシグナリングに有利であ
り，このため細胞移動および増殖が増加し，したがって，これらの成長因子が創
傷状態の間増加するため，創傷治癒が加速される（Ｂｕｃｋｌｅｙ， ｅｔ ａ
ｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２；Ｒａ
ｐｐｏｌｅｅ， ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，７０８−
７１２；Ｗｅｒｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，６８９６−６９００）。
【００９４】 上皮細胞移動の間フリーおよびチロシンリン酸化されたβ−カテニンの重要性
は，ｈＰＴＰ ＬＡＲの過剰発現によりこのパラメータに干渉すると上皮細胞の
運動性が阻害されるという我々の観察により強調される。さらに，ＮＥＴＩＩ細
胞におけるｈＰＴＰ ＬＡＲの発現は，ヌードマウスにおいて腫瘍形成を阻害し
たが，これらの細胞のインビトロでの成長特性は変化していなかった。ｈＰＴＰ
ＬＡＲの内因性レベルの約２倍の異所性発現が，観察された生物学的効果に十
分であった。高い過剰発現により細胞の成長特性およびアポトーシスが完全に変
更されるため，そのようなｈＰＴＰ ＬＡＲの適度な異所性発現は重要である（
Ｗｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｌｏｌ．８，２４７−２５
６）。この報告に示されるデータは，細胞−細胞接着および上皮細胞移動，なら
びにシグナリングβ−カテニンのフリープールを制御することによる腫瘍原性の
制御におけるＰＴＰ ＬＡＲの重要な役割を強く支持する。
【００９５】 ＡＰＣまたはβ−カテニンのいずれかにおける変異または欠失は，フリーのβ
−カテニンの安定化されたプールにつながるため，腫瘍形成と関連づけられてい
る（Ｋｏｒｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１７
８４−１７８；Ｍｏｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５
，１７８７−１７９０；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７５，１７９０−１７９２）。ＰＴＰ ＬＡＲ機能の喪失はまた，
腫瘍形成および転移に寄与するかもしれない。したがって，ＰＴＰ ＬＡＲは，
可能性のある腫瘍抑制遺伝子産物として，ヒト癌の予知マーカーとして働くこと
ができる。
【００９６】１．ＰＴＰ ＬＡＲの核酸配列 本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードされるこ
とができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，ＰＴＰ ＬＡ
Ｒ遺伝子の一部または全部を合成して，図１０に示される核酸配列と有意に異な
る核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコードされるアミノ酸配列
は保存される。
【００９７】 さらに，核酸配列は，図１０に示される核酸の式の５’−末端および／または
３’−末端で少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することに
より得られるヌクレオチド配列またはその誘導体を含んでいてもよい。その付加
，欠失または置換が，ヌクレオチド配列によりコードされるＰＴＰ ＬＡＲのア
ミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこ
のように用いることができる。例えば，本発明の方法は，ＰＴＰ ＬＡＲの核酸
配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することに
より，またはＰＴＰ ＬＡＲのヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端
に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる
任意の核酸配列を使用することを含むことを意図する。さらに，ＰＴＰ ＬＡＲ
は，必要に応じて，これらの５’−末端および／または３’−末端に付加された
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。
【００９８】 所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容されるＰＴＰ ＬＡＲお
よびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
【００９９】 さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。これらの核酸もまた，本発明の方法において用いること
が意図される。
【０１００】ＩＩ．ＰＴＰＬＡＰの検出のための核酸プローブ，方法，およびキット 当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知ら
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを容易に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明の方法
において用いられるハイブリダイゼーションプローブは，標準的標識技術，例え
ば放射性標識，酵素標識，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用
いる技術により，標識することができる。ハイブリダイゼーション後，プローブ
は既知の方法を用いて可視化することができる。
【０１０１】 本発明において用いるべき核酸プローブには，ＲＮＡならびにＤＮＡプローブ
が含まれ，そのようなプローブは，当該技術分野において知られる技術を用いて
生成される。核酸プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固
体支持体の例としては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネー
ト，複合炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂
，例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブ
をそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られて
いる。
【０１０２】 本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１０３】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲの存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハ
イブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，
そして（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含
む。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように
核酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト
組織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１０４】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲの存在を検出するためのキットは，その中に上述の核
酸プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，
以下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結
合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては
，限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオ
キシダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン
，アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。
【０１０５】 詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れら
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１０６】ＩＩＩ．ＰＴＰ ＬＡＲ核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含 む細胞 本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０１０７】 本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
【０１０８】 核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
【０１０９】 ２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列およびＰＴＰ ＬＡＲをコ
ードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレームシフト変
異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のホスファターゼをコー
ドする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）ＰＴＰ Ｌ
ＡＲの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨害しない場
合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち，プロモーター領域
は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合，ＤＮＡ配列
に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，ＰＴＰ ＬＡＲをコー
ドする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主により認識される転写および翻
訳シグナルが必要である。
【０１１０】 本発明は，本発明のＰＴＰ ＬＡＲ（またはその機能的誘導体）をコードする
遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含
する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効であり
かつ便利であり，したがって，ＰＴＰ ＬＡＲのための１つの好ましい発現シス
テムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表される。
しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【０１１１】 原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【０１１２】 認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０１１３】 ＰＴＰ ＬＡＲ（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において発現させ
るためには，本発明のキナーゼをコードする配列が，機能的原核生物プロモータ
ーと動作可能なように連結されていることが必要である。そのようなプロモータ
ーは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，誘導可能ま
たは抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バクテリオファージ
λのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａ
プロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プ
ロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（Ｐ L およびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，および
ｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｏｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．．Ｇｅｎ
ｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌｌｕｓのバ
クテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモ
ーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６
８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉ
ｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅｎａｔｉｅ
ｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６），およびＧｏ
ｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８
４）により概説されている。
【０１１４】 原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボ
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０１１５】 本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするキ
ナーゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されな
い。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物
宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織
培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，Ｈ
ｅＬａ細胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１，また
はリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿
主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株，例え
ばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能
力を提供することができる。
【０１１６】 さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルス
ベクターを，昆虫細胞においてＰＴＰ ＬＡＲを大量に発現するよう遺伝子工学
処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，１９
８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．
２７７−２９７，１９８６）。
【０１１７】 酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のキナーゼの発現にはいくつかの可能なベクター系が利用
可能である。
【０１１８】 宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０１１９】 ＰＴＰ ＬＡＲの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域を使用す
ることが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指示する
のに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには，例え
ば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘ
ルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３５
５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１）；お
よび酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５
，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０１２０】 真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，ＰＴＰ ＬＡＲ（またはその
機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンをコード
しうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすることが好ま
しい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンがＰＴＰ ＬＡＲ
のコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）またはフレームシ
フト変異（ＡＵＧコドンがＰＴＰ ＬＡＲのコーディング配列と同じリーディン
グフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす。
【０１２１】 ＰＴＰ ＬＡＲをコードする核酸分子および動作可能なように連結されたプロ
モーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複製ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線状分子
またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自己複製
することができず，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生ずる。
あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートされることに
より永久発現が得られる。
【０１２２】 所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０１２３】 導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０１２４】 好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例
えば，，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ
；"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。．Ｂａｃｉｌｌｕｓ
プラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９
８２）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅ
ｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１
８３，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例え
ばＩＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ ｅｔ ａｌｅｓ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａ
ｒｙ，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラ
スミドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３
−７０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
３３：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０１２５】 好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０１２６】 構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のキナーゼまたはそのフラグメント
が産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，また
はこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオキシ
ウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを形成す
るために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい
条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０１２７】ＩＶ．ＰＴＰ ＬＡＲ蛋白質 当該技術分野において知られる種々の方法論を用いて，ＰＴＰ ＬＡＲポリペ
プチドを得ることができる。ポリペプチドは，天然にポリペプチドを産生する組
織または細胞から精製することができる。あるいは，上述の単離された核酸フラ
グメントを用いてＰＴＰ ＬＡＲを任意の生物中で発現させることができる。本
発明の試料には，細胞，蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物，または生物学的液
体が含まれる。試料は，アッセイフォーマット，検出方法，および試料として用
いられる組織，細胞または抽出物の性質に基づいて様々であろう。
【０１２８】 起源生物が天然にそのようなポリペプチドを含む限り，任意の真核生物をＰＴ
Ｐ ＬＡＲポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用
いる場合，"起源生物"とは，その生物においてサブユニットが発現されているか
，および最終的にそれから単離されたかにかかわらず，サブユニットのアミノ酸
配列が由来する元の生物を意味する。
【０１２９】 当業者は，天然の夾雑物を含まないポリペプチドを得るために，蛋白質を単離
する既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには，限定されないが，
サイズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，お
よび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【０１３０】Ｖ．ＰＴＰ ＬＡＲ検出のための抗体，ハイブリドーマ，使用方法およびキット 本発明は，ＰＴＰ ＬＡＲに対する結合親和性を有する抗体またはこれらの抗
体を用いる方法に関する。ポリペプチドは，図９に記載されるアミノ酸配列，ま
たはその機能的誘導体，またはその少なくとも９個の連続するアミノ酸（好まし
くは，その少なくとも２０，３０，３５，または４０個の連続するアミノ酸）を
有することができる。
【０１３１】 本発明はまた，ＰＴＰ ＬＡＲに対する特異的結合親和性を有する抗体および
その使用に関する。そのような抗体は，ＰＴＰ ＬＡＲに対するその結合親和性
を他のポリペプチドに対するその結合親和性と比較することにより単離すること
ができる。ＰＴＰ ＬＡＲに選択的に結合する抗体は，ＰＴＰ ＬＡＲと他のポ
リペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択される
であろう。そのような方法には，限定されないが，他のポリペプチドを含む組織
における変更されたＰＴＰ ＬＡＲ発現の分析が含まれる。
【０１３２】 ＰＴＰ ＬＡＲは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用いることが
できる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書に記載
されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するであろう
。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，ならびに
これらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒト
化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において知られ
る手法の１つを用いて生成することができる。
【０１３３】 本発明はまた，上述のモノクローナル抗体，またはその結合フラグメントを産
生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体
を分泌することができる不死化細胞株である。
【０１３４】 一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【０１３５】 ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０１３６】 モノクローナル抗体のためには，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエロ
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲ
ｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリド
ーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよ
びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０１３７】 ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８−，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９−，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５−，１９７６を参照。本発明の
標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用い
て，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【０１３８】 上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【０１３９】 さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０１４０】 抗ペプチドペプチドは，本発明のキナーゼのペプチド配列中に見いだされる塩
基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で置き
換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，および
／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え，およ
びグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
【０１４１】 本発明はまた，試料中でＰＴＰ ＬＡＲを検出する方法を包含する。該方法は
，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ，
そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含む。
詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベ
ートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で
本発明のＰＴＰ ＬＡＲのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは
疾病または疾病の予後を示すかもしれない。
【０１４２】 抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０１４３】 本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１４４】 キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。好ましくは，キットは使用の指針も含む。別の好ましい態様においては，キ
ットは以下の１またはそれ以上を含む１またはそれ以上の他の容器をさらに含む
：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
【０１４５】 検出試薬の例には，限定されないが，標識第２抗体が含まれ，あるいは，一次
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０１４６】ＶＩ．ＰＴＰ ＬＡＲと相互作用する化合物の単離 本発明はまた，ＰＴＰ ＬＡＲに結合しうる化合物を検出する方法に関する。
該方法は，化合物をＰＴＰ ＬＡＲとともにインキュベートし，ＰＴＰ ＬＡＲ
に結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は，複雑な混合物，例え
ば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。
【０１４７】 本発明はまた，ＰＴＰ ＬＡＲ活性またはＰＴＰ ＬＡＲ結合パートナー活性
のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は，ＰＴＰ
ＬＡＲを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし，ＰＴＰ ＬＡＲ
活性またはＰＴＰ ＬＡＲ結合パートナー活性のレベルの変化を検出することを
含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示す活性の変化を生
ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出
物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，当該技術分野にお
いてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【０１４８】 本発明はまた，哺乳動物においてＰＴＰ ＬＡＲ関連活性をアゴナイズ（促進
）するかまたはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は，前記哺乳動物に
ＰＴＰ ＬＡＲに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまた
はアンタゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。ＰＴＰ ＬＡＲ
関連機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量のアゴニストまた
はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物においてＰＴＰ
ＬＡＲ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾病を治療する方法もま
た，本発明に包含される。
【０１４９】 疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は
，蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。いく
つかの小さい有機分子は蛋白質キナーゼの機能を調節する化合物の一群を形成す
る。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては，
限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（ＰＣＴ
ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ
ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８，
１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．），１−シクロプ
ロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），スチリル
化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特
許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２
６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４
２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．），三環式ポリヒ
ドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２年１２月１０日公開
，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５
，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙げられる。
【０１５０】 細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは，蛋白質キナー
ゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し
，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【０１５１】 しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙ
ｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７）および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ
−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許出
願０８／４８５，３２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏ
ｃｋｅｔ Ｎｏ．２２３／２９８）および国際特許出願ＷＯ９６／４０１１６（
１９９６年１２月１９日公開，Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）およびＷＯ９６／２２
９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ）（これら
はすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有す
るインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Ｉｎｄｏｌ
ｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅ
ｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．
の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ
Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７），"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉ
ｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の０８／４８５，３
２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２
２３／２９８），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａ
ｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細胞におけるイ
ンドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻
害パターンを教示する。
【０１５２】 キナーゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されないが，チ
ロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上述のキ
ナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知られる化
合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類を記載
する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５２０７
２２Ａｌ；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；Ｋａｂ
ｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏ
ｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許．５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ ａ
ｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許．４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａｒ
ｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．
Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１），
２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８
３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒｙ
ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊａ
ｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１
，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９
（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅｔ
ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；Ｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１５
−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒ
ｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２５
−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅｔ
ｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅｃ
ｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（１１
）：２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，ＡＳＳ；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０１５３】 キノキサリン類は，Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，
３１６，５５３，（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）に記載される。
【０１５４】 キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，−およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載される。
【０１５５】 チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３−．Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（
１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２
）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，
５３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
１（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（
１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２
２２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４
１３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ
ＦＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９
８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５
−３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ
ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５）
，８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａ
ｓ，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７
０−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含
めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０１５６】 調節剤として用いることができる他の化合物には，オキシインドリノン，例え
ば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
【０１５７】ＶＩＩ．遺伝子治療 ＰＴＰ ＬＡＲまたはその遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用である（
総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９２）
。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治
療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な
科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９９３
）に記載されている。
【０１５８】 １つの好ましい態様においては，ＰＴＰ ＬＡＲのコーディング配列を含む発
現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患
者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例えば
，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のキナーゼをコードす
る内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性キナーゼ遺伝
子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーターセグメントをこれが
内因性キナーゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送する）。
【０１５９】 遺伝子治療は，腫瘍を標的とするキナーゼｃＤＮＡを含むアデノウイルスの使
用を含むことができる。全身キナーゼは，遺伝子工学処理した細胞の移植，ＰＴ
Ｐ ＬＡＲをコードするウイルスの注入，または裸のＰＴＰ ＬＡＲＤＮＡの適
当な組織への注入により増加する。
【０１６０】 そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性（例えば上皮細胞移動）を
減少させるか阻害することにより，そのような状態を減少させ，阻害し，または
逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持し
ているが上皮細胞移動またはＰＴＰ ＬＡＲの他の機能を調節するよう機能する
ことができない成分の欠失またはミスセンス変異体もまた有用である。
【０１６１】 蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持しているが，シグナル伝達
において機能することができない成分の欠失またはミスセンス変異体を用いて，
異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害することができる。
【０１６２】 ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，ア
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えキナーゼ
をコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば腫瘍
細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コーディ
ング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒ
ｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質配列を
コードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的細胞
への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる（例
えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８，１
９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞内に
直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白質に
複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングするこ
とを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０１６３】 最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【０１６４】 また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または組換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改
良する蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにＤＮ
Ａを結合させる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０１６５】 本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【０１６６】 本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であ
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
【０１６７】 別の好ましい態様においては，ＰＴＰ ＬＡＲをコードする核酸配列を有する
ベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。
組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２
年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０１６８】 上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０１６９】 別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【０１７０】ＶＩＩＩ．物質の投与 患者に投与すべき化合物の投与量を決定する方法，および化合物を生物に投与
するモードは，米国特許０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）お
よび国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）に記載されてお
り，これらの両方とも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用
する。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，これに容易に適合
しうることを理解するであろう。
【０１７１】 適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療している疾病のタイプ，用いられ
る特定の組成物，および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は，最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，最初は細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮した循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
【０１７２】 薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器におけ
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
【０１７３】 毒性研究は，血液細胞組成物を測定することにより実施することもできる。例
えば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができ
る１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；
２）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして
３）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核
細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は
，毒性が存在するか否かを示す。
【０１７４】 各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
【０１７５】 癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／ｄ
ａｙ，好ましくは，１−２５０ｍｇ／ｄａｙ，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／
ｄａｙの範囲である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持する
のに十分であるかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０１７６】 血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であ
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０１７７】 本発明に関連する他の方法は，本明細書において開示される実施例に記載され
る。
【０１７８】実施例 以下の実施例は限定的なものではなく，単に本発明の種々の観点および特徴の
代表例にすぎない。以下の実施例は，上皮細胞移動および腫瘍阻害におけるＰＴ
Ｐ ＬＡＲの役割を示す。
【０１７９】一般的材料および方法 α−カテニン，β−カテニン，およびプラコグロビン（γ−カテニン）のクロー ニング ヒトα−カテニン（受託番号Ｄ１４７０５），β−カテニン（Ｚ１９０５４）
，およびプラコグロビン（Ｍ２３４１０）は，ＭＣＦ７細胞から生成したｃＤＮ
ＡからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーターの制御下の真核
生物発現ベクター中にクローニングし，配列分析により確認した。
【０１８０】細胞株および細胞培養 すべての細胞株は，ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ＮＥＴＩＩ細胞（ＣＲＬ−１６５５）
は，１％非必須アミノ酸，イーグル平衡塩，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン
酸ナトリウムおよび１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＭＦＭ中で成長させ
た。ＭＣＦ７細胞（ＨＴＢ２２）は，２ｍＭグルタミンおおび１０％ＦＣＳを補
充したＲＰＭＩ培地で成長させ，ヒト胚性２９３腎細胞（ＣＲＬ１５７３）は，
１ｍｇ／ｍＬグルコース，２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＣＳを補充したダル
ベッコ改変イーグル培地で成長させた。ＦＣＳは日常的に熱不活性化した。すべ
ての培地および補充物は，ＧｉｂｃｏＢＲＬから入手した。
【０１８１】移動アッセイ インビトロ創傷アッセイのためには，ＮＥＴＩＩ細胞を７ｘ１０4細胞／ｃｍ2 の密度で播種した。２４時間後，ピペットチップでコンフルエント単層を掻き取
って無細胞領域を作成し，成長因子を加え，創傷閉合を写真で記録した。スキャ
ッターアッセイのためには，細胞を１ｘ１０4細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種した
。２４時間後に成長因子を加え，細胞の形態および小さいコロニーの分散を写真
で記録した。移動の定量化は，異なる，ランダムに選択した顕微鏡視野において
，繊維芽細胞状移動形態を有する単一の細胞を，上皮形態を有する細胞群と比較
することにより行った。皿１枚あたり１０００個の細胞を計数した。すべての移
動アッセイは三重に行った。チロシンキナーゼ（ＴＫ），有糸分裂促進物質活性
化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）またはホスファチジルイノシトール−３−キナー
ゼ（Ｐ１３Ｋ）は，成長因子を加える１時間前に加えたゲニステイン（２５０μ
Ｍ；Ｂｉｏｍｏｌ）により阻害した。対照として，溶媒ＤＭＳＯを用いた。ＤＮ
Ａ合成は，成長因子を加える１時間前に，ＤＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤で
あるアフィジコリン（１．５μＭ；Ｓｅｒｖａ）により阻害した。
【０１８２】ヌードマウスにおける腫瘍形成 ＮＥＴＩＩ細胞は，２ｘ１０6／５０μＬの細胞密度でＭＥＭに懸濁し，スイ
スヌードマウス（ＩＧＲ Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の
横腹領域の皮下に注入した。腫瘍形成は，腫瘍の幅（Ｗ）および長さ（Ｌ）（Ｗ
＜Ｌ）を測定することによりモニターした。腫瘍体積は，式（Ｗ2ｘＬｘπ／６
）にしたがって計算した。アッセイは少なくとも三重に行った。
【０１８３】組換えレトロウイルスの生成およびレトロウイルス媒介性遺伝子輸送 全長ＰＴＰ ＬＡＲ（Ｈ．Ｓａｉｔｏ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓ
ｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）を，ｐＬＸＳＮベクター（Ｍｉｌｌｅｒ，
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７，（図面および
表を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）中にサブクローニ
ングした。安定なＮＥＴＩＩ細胞株は，記載されるように（Ｐｅａｒ， ｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，８
３９２−８３９６（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに
引用する）），レトロウイルス遺伝子輸送により生成した。ポリクローンおよび
クローン細胞株は，０．５ｍｇ／ｍＬＧ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＦＲＧ）を
含有する培地中で選択した。異所性発現は，免疫沈澱およびウエスタンブロット
分析により確認した。
【０１８４】過渡的発現，細胞溶解および免疫沈澱 ヒト２９３胚性腎細胞の過渡的トランスフェクションは，記載されるようにし
て行った（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．７，２７４５−２７５２，（図面および表を含め，その全体を本明細書の一部
としてここに引用する））。生化学的分析のためには，ＮＢＴＩＩ細胞は，１ｘ
１０4細胞／ｃｍ2の密度で溶解の前日に播種した。示される場合には，細胞を溶
解する前に指示された時間Ｎａ−オルトバナジン酸（１ｍＭ）で前処理した。氷
冷ＰＢＳで洗浄した後，細胞を氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．
５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，２０ｍＭ
ピロリン酸，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１００ｍＭ ＮａＦｌ，２ｍＭフッ
化フェニルメチルスルホニル，２０μｇ／ｍＬアプロチニン，２０μｇ／ｍＬロ
イペプチン，０．７μ／ｍＬペプスタチン，０．２ｍＭモリブデン酸アンモニウ
ム，２ｍＭ Ｎａ−オルトバナジン酸）中で溶解させ，１２，５００ｘｇで１０
分間，４℃で遠心分離することによりあらかじめ透明にした。上清の蛋白質濃度
が同じになるように調節した。ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．
５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭピロリン酸，１０ｍＭ ＮａＦｌ，０．２
ｍＭモリブデン酸アンモニウム，１０％グリセロール，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００，２ｍＭ Ｎａ−オルトバナジン酸）を１：１比で加え，免疫沈澱を４
℃で２時間行った。プロテインＡまたはプロテインＧ−セファロースを加え，さ
らに２時間おいた。沈殿物をＨＮＴＧ緩衝液で３回洗浄し，ビーズをＳＤＳ−試
料緩衝液に再懸濁した。続くウエスタンブロット分析のためには，ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分離した蛋白質をニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し，それぞれの抗体とともにインキュベートした。蛋白
質はＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により可視化した。再探索する前に，
６８ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，および０．１％β−メル
カプトエタノール中で５０℃で１時間インキュベートすることにより，ブロット
をはがした。
【０１８５】インビトロ結合アッセイ ＧＳＴ−ｈＰＴＰ ＬＡＲｉ−融合蛋白質をコードするプラスミドは，ヒトＰ
ＴＰ ＬＡＲのアミノ酸１２５９−１８８１の間のｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し
，適当なｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中にクロー
ニングすることにより構築した。元のベクターｐＳＰ６５−ＬＡＲのインビトロ
突然変異（Ｋｕｎｋｅｌ， ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｅ１．１５４，３６７−３８２（図面および表を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する））により，不活性化ＰＴＰドメイン１，ＰＴＰ Ｌ
ＡＲ Ｄ1Ｃ１５２２Ｓ，または不活性化ＰＴＰドメイン２，ＰＴＰ ＬＡＲ
Ｄ2Ｃ１８１３Ｓを有するＰＴＰ ＬＡＲを得た。これもまたヒトＰＴＰ ＬＡ
Ｒのアミノ酸１２５９−１８８１の間をＰＣＲ増幅し，ｐＧＥＸベクターにサブ
クローニングした。サブクローニングされたＰＣＲ産物の完全性は，配列分析に
より確認した。ＧＳＴ−融合蛋白質をＥ．ｃｏｉｌで発現させ，記載されるよう
に精製した（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７，３１−４
０（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
３μｇのＧＳＴ−ｈＰＴＰ ＬＡＲｉ−融合蛋白質，または３倍モル過剰のＧＳ
Ｔを，等量の細胞溶解物と４℃でインキュベートし，グルタチオン−セファロー
ス（Ｓｉｇｍａ，ＦＲＧ）に固定化し，ＨＮＴＧで３回洗浄した。ウエスタンブ
ロッティングのために，結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【０１８６】アフィニティー精製 ＧＳＴ−Ｅ−カドヘリン細胞質−融合蛋白質をコードするプラスミドは，ネズ
ミＥ−カドヘリン（Ｎａｇａｆｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２９，３４１−３４３，（図面および表を含めその全体を本明細書の一部
としてここに引用する））のアミノ酸７３４−８８４の間のｃＤＮＡ配列をＰＣ
Ｒにより増幅し，適当なｐＧＥＸベクター中にクローニングすることにより構築
した。アフィニティー精製のためには，等濃度のあらかじめ透明にしたＮＥＴＩ
Ｉ細胞溶解物を，５μｇの精製ＧＳＴ−Ｅカドヘリン細胞質−融合蛋白質または
３倍モル過剰のＧＳＴとともにインキュベートし，グルタチオンセファロースに
固定化した。得られた複合体をＨＮＴＧで３回洗浄し，結合した蛋白質をＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分離し，ウエスタンブロッティングを行った。
【０１８７】抗血清 ホスホチロシン（４Ｇ１０）に対するモノクローナル抗体はＵＢＩから入手し
た。α−カテニン，β−カテニン，プラコグロビンおよびＥ−カドヘリン抗体は
，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｅ−カ
ドヘリンに対する第２抗体は，ヒトＥ−カドヘリンのアミノ酸８３４−９１３を
含むＧＳＴ−融合蛋白質に対して生成した。モノクローナル抗体１１．１Ａ（Ｍ
．Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）は，ヒトＰＴＰ ＬＡＲ（Ｓｔｒｅｕｌｉ， ｅｔ
ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１，８９７−９０７）の細胞外ドメイン
を認識する。ウサギ抗血清＃３２０（Ｙ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，ＵＳＡ）はＰＴＰ ＬＡＲのＣ末端（アミノ酸１８６８−１８８１）に
対応するペプチドに対するものである。
【０１８８】インビトロ脱リン酸化アッセイ ヒト２９３胚性腎細胞においてβ−カテニンを過渡的に過剰発現させた。細胞
を血清飢餓とし，過バナジン酸（０．３μＭＨ2Ｏ2／０．１ｍＭ Ｎａ−オルト
バナジン酸）で１０分間処理し，溶解した。免疫沈澱は上述したように行い，た
だし，ピロリン酸，モリブデン酸アンモニウム，およびＮａ−オルトバナジン酸
を含まないＨＮＴＧを用いた。チロシンリン酸化β−カテニンに対するＰＴＰ活
性は，２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ，および１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む２００μＬ反応液中で，２００ｎｇのＧ
ＳＴ−ｈＰＴＰ ＬＡＲ細胞質，ＧＳＴ−ｈＰＴＰ ＬＡＲＤ1Ｃ１５２２Ｓ，
またはＧＳＴ−ｈＰＴＰ ＬＡＲＤ2Ｃ１８１３Ｓを加えて，２５℃でアッセイ
した。ＨＮＴＧで洗浄することにより反応を停止し，次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離した。チロシンのリン酸化状態は，抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタン
ブロッティングにより分析した。
【０１８９】免疫蛍光 ＮＢＩＩ細胞を１ｘ１０4細胞／ｃｍ2または７ｘ１０4細胞／ｃｍ2の密度で播
種した。２４時間後，細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４，１２５
ｍＭショ糖）中２％パラホルムアルデヒドで固定した。自己蛍光は，ＰＢＳグリ
シン（１００ｍＭグリシン，０．１％ＰＧＳ中ホウ水素）を用いて消光し，細胞
をＰＢＳ中０．５％サポニンで透過性にした（５分間）。非特異的抗体結合は，
リン酸緩衝化ゼラチン（ＰＢＧ：ＰＢＳ，０．５％ウシ血清アルブミン，０．０
４５％冷水魚ゼラチン，５％ロバ血清）で１時間ブロッキングした。ＰＢＧ中で
希釈した後，一次抗体インキュベーションを室温で２時間行った。ＰＢＧ中で３
回洗浄した後，一次抗体結合をＦＩＴＣ（ＤＴＡＦ）またはＣｙ３（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）にコンジュゲートしたアイソタイプ
特異的二次抗体で検出した。二重標識実験のためには，連続して抗体修飾を行っ
た。カバースリップをＰｅｒｍａｆｌｕｏｒモニタリング媒体（Ｉｍｍｕｎｏｆ
ｃｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）下でマウントし，慣用の蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｆ
ＲＧ）またはＣＬＳＭレーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，ＦＲＧ）のいずれか
で観察した。対照は，同一の設定で記録した。
【０１９０】実施例１：上皮細胞移動の誘導によるカドヘリン／カテニン−複合体の再局在化 組織培養における上皮細胞の移動は，多くの観点において上皮−間葉遷移のモ
デル系である（Ｍａｎｓｋｅ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃ
ｙｔｏｌ．１５５，４９−９）。ラット膀胱癌腫細胞株ＮＥＴＩＩ（Ｔｏｙｏｓ
ｈｉｍａ， ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．
４７，９７９−９８５）を用いた。これは，細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のあ
る種の成長因子および成分がこれらの細胞の移動を誘導するためである（Ｖａｌ
ｌｅｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８７，１１２４−１１２８；Ｔｃｈａｏ，Ｒ．（１９８２）Ｃｅｌｌ
Ｍｏｔｉｌ．４，３３３−３４１；Ｔｕｃｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，１２９−１３７）。
【０１９１】 ＥＧＦおよび市販の血清基質ＵｌｔｒｏｓｅｒＧについてのインビトロ創傷ア
ッセイの結果が図１Ａに示される。創傷閉合の原因としての増殖を妨げるため，
アフィジコリンを加えてＤＮＡ合成を阻害した。これは，移動を妨害しなかった
。これに対し，ｌｙ２９５００２によるホスファチジルイノシトール−３−キナ
ーゼ（Ｐ１３Ｋ）の阻害，ゲニステインによるチロシンキナーゼ（ｔｋ）の阻害
，またはＰＤ９８０５９による有糸分裂促進物質活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰ
Ｋ）の阻害は，細胞移動を完全に排除した。カドヘリン／カテニン−複合体の成
分の蛋白質レベルは，移動の間変化せず，さらに，Ｅ−カドヘリンの過剰発現は
，細胞間接触の破壊を防止することができなかった（Ｂｏｙｅｒ， ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１，３４７−３５７）。
【０１９２】 しかし，ＥＭＴの間のカドヘリン／カテニン−複合体のメンバーの局在は変化
していた。Ｅ−カドヘリン（緑色蛍光）およびβ−カテニン（赤色蛍光）は，隣
接する，サブコンフルエントに播種された細胞の細胞−細胞接触領域全体にわた
り局在していた（図１Ｂ上パネル）。無接触の膜部分の蛍光は弱いかまたは存在
しなかった。いくつかの弱いβ−カテニン染色が対照細胞の核において検出され
た。これはおそらく，これらのサブコンフルエント細胞がその接着接合部を完全
に確立しなかったためであろう。しかし，ＥＧＦにより移動を誘導すると，Ｅ−
カドヘリンおよびβ−カテニンは細胞表面全体および細胞質内に再分布した。興
味深いことに，上皮細胞移動の間に，β−カテニンの核局在の増加を検出するこ
とができた。
【０１９３】実施例２：カドヘリン／カテニン−複合体のチロシンリン酸化 チロシンキナーゼのカドヘリン／カテニン−複合体に対する特異性を調べた。
ＴＫとカドヘリン／カテニン−複合体のメンバーとの過渡的なコトランスフェク
ションは，ＥＧＦＲ，ｃ−Ｓｒｃ，またはＦＧＦＲ２等の上皮細胞移動において
役割を果たすＴＫのみが，β−カテニンおよびプラコグロビンをリン酸化しうる
ことを示した。しかし，α−カテニンおよびＥ−カドヘリンは，これらのＴＫの
基質ではなかった。これらの知見は，トランスフェクトしていないＮＢＴＩＩ細
胞が移動するよう促進されたことにより確認することができた。細胞溶解後，カ
ドヘリン／カテニン複合体のすべてのメンバーを特異的抗体で免疫沈澱した。こ
の手法は，カドヘリン／カテニン複合体のメンバーを局在および結合パートナー
にかかわらず沈澱させ，したがって，Ｅ−カドヘリン結合β−カテニンも沈澱す
る。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによりチロシンリ
ン酸化レベルを分析し（図２，上），次にＥ−カドヘリン（図２，中）またはカ
テニン（図２，下）を特異的抗体で検出した。
【０１９４】 移動の誘導から３０分後，β−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン
酸化は既に検出可能であったが，α−カテニンおよびＥ−カドヘリンでは検出さ
れなかった。リン酸化は過渡的であり，約９時間持続し，２４時間後にはもはや
検出できなかった。免疫沈澱については，チロシンリン酸化を検出するために，
細胞を１ｍＭ Ｎａ−オルトバナジン酸（ＰＴＰの特異的阻害剤）で前処理する
ことが必要であった。このことは，β−カテニンおよびプラコグロビンのリン酸
化状態が，ＴＫおよびＰＴＰにより厳重に制御されたことを示す。上皮細胞コロ
ニー分散とβ−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化との相関はま
た，ＨＴ２９−およびＨａＣａＴ−細胞においても示されており，細胞移動の誘
導の間の共通する制御メカニズムを示唆する。
【０１９５】実施例３：上皮細胞移動の間のβ−カテニンのフリープールの増加 ＥＧＦ処理細胞からのβ−カテニンを，Ｅ−カドヘリンの全細胞質ドメインを
含むＧＳＴ融合蛋白質でアフィニティー沈澱させた。フリーの，複合体を形成し
ていないβ−カテニンのレベル（図３，上），ならびにそのホスホチロシン含有
量（図３，下）を，免疫ブロッティングにより分析した。先に示されるように，
この戦略は，免疫沈澱とは異なり，β−カテニンのフリーの，Ｅ−カドヘリンに
結合していないプールの特異的かつ選択的沈澱を可能とする（Ｐａｐｋｏｆｆ，
ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，２１２８−２
１３４（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
）。
【０１９６】 ＥＧＦによる移動の誘導はβ−カテニンのフリープールの増加と相関しており
，これは免疫沈澱で得られたβ−カテニンより有意に高いホスホチロシン含有量
を有していた（図２および３を比較）。非刺激対照細胞におけるβ−カテニンの
フリープールは影響を受けなかった。フリーの，チロシンリン酸化β−カテニン
の増加は，Ｎａ−オルトバナジン酸を加えない場合にも検出されたが（図８を参
照），これを加えると検出が改良された。これらの知見は，上皮細胞移動の間に
，ＴＫによるリン酸化により，フリーの，複合体を形成していないβ−カテニン
のプールが増加することを示す。
【０１９７】実施例４：カドヘリン／カテニン−複合体とＰＴＰ ＬＡＲの共局在 Ｎａ−オルトバナジン酸で前処理することにより，移動しているＮＢＴＩＩ細
胞において，β−カテニンおよびプラコグロビンのチロシンリン酸化が増加した
。したがって，ＰＴＰは，アドヘレンスジャンクションにおける制御事象におい
て，ＴＫの定常状態平衡アンタゴニストとして作用するのかもしれない。図４に
示されるように，ＰＴＰ ＬＡＲ（赤色蛍光）とカドヘリン／カテニン複合体（
緑色蛍光）は，黄色蛍光シグナルに示されるように，上皮細胞のアドヘレンスジ
ャンクションにおいて共局在した。ＰＴＰ ＬＡＲは，上皮ＭＣＦ７細胞のフォ
ーカルコンタクトに局在することが示されている（Ｓｅｒｒａ−Ｐａｇｅｓ，
ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４，２８２７−２８３８）。ＮＢＴ
ＩＩ細胞においては，ＰＴＰ ＬＡＲは主としてアドヘレンスジャンクションに
おいて検出され，フォーカルコンタクトにおいてはシグナル強度はより低かった
。運動性細胞はアドヘレンスジャンクションおよびフォーカルコンタクトを迅速
に分解および再構築しなければならないため，ＰＴＰ ＬＡＲの局在化は，上皮
細胞移動の間のその制御機能の可能性を支持する。
【０１９８】実施例５：β−カテニンおよびプラコグロビンのＰＴＰ ＬＡＲとの会合 無傷の細胞におけるＰＴＰ ＬＡＲとカドヘリン／カテニン−複合体との会合
の可能性を調べるために，ＥＧＦで刺激したサブコンフルエントのヒトＭＣＦ７
細胞を溶解し，ＰＴＰ ＬＡＲまたはカドヘリン／カテニン−複合体のいずれか
に対する抗体で免疫沈澱した。β−カテニンおよびＥ−カドヘリン（図５Ａ）ま
たはプラコグロビンおよびＥ−カドヘリン（図５Ｂ）に対する特異的抗体を用い
たウエスタンブロッティング分析においては，抗ヒトＰＴＰ ＬＡＲ免疫沈澱物
において，ヒトＰＴＰ ＬＡＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体１
１．１Ａによりこれらの蛋白質が検出され，その逆も検出された。興味深いこと
に，会合は構成的でありＥＧＦ刺激に非依存性であった。ＰＴＰ ＬＡＲに対す
るウサギポリクローナル抗血清＃３２０によってはカドヘリン／カテニン−複合
体のメンバーの特異的シグナルは得られなかった。このことは，抗原性エピトー
プが複合体中においてアクセス可能ではないことを示唆する。カドヘリン／カテ
ニン−複合体のいずれの成分がＰＴＰ ＬＡＲとの相互作用を媒介するかを調べ
るため，ＰＴＰ ＬＡＲの全細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−
ＰＴＰ ＬＡＲｉ）を用いて，溶解前にチロシンホスファターゼ阻害剤である過
バナジン酸で処理したヒト２９３胚性腎繊維芽細胞において過渡的に過剰発現さ
れたカドヘリン／カテニン−複合体の別々の成分をアフィニティー精製した。
【０１９９】 β−カテニン（図５Ｃ，左）およびプラコグロビン（図５Ｃ，右）はこれらの
条件下で，ＰＴＰ ＬＡＲの細胞質ドメインと特異的に会合することが見いださ
れた。Ｅ−カドヘリンおよびα−カテニンは同じ実験条件下でＰＴＰ ＬＡＲと
直接相互作用しなかった（データ示さず）。過バナジン酸で処理した後のβ−カ
テニンまたはプラコグロビンのリン酸化状態（いずれもチロシンリン酸化である
）は，これらのＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ細胞質融合蛋白質との会合に影響を及ぼ
さなかった。この相互作用には，ＰＴＰ ＬＡＲの完全な細胞質ドメインが必要
であった。これは，ＰＴＰ ＬＡＲの欠失変異体はβ−カテニンまたはプラコグ
ロビンに効率的に結合しなかったためである。
【０２００】実施例６：β−カテニンはインビトロでＰＴＰ ＬＡＲの基質である β−カテニンおよびプラコグロビンとＰＴＰ ＬＡＲとが会合するため，これ
らの蛋白質がＰＴＰ ＬＡＲの実際の基質であるか否かを調べた。細胞質ドメイ
ン全体（ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲｃｙｔｏｐｌ）または触媒的に不活性化された
ＰＴＰドメイン１（ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ ＰＴＰ Ｄ1Ｃ１５２２Ｓ）また
は不活性化ＰＴＰドメイン２（ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ ＰＴＰ Ｄ2Ｃ１８１
３Ｓ）を有するＰＴＰ ＬＡＲの変異体のいずれかを含むＰＴＰ ＬＡＲのＧＳ
Ｔ融合蛋白質を，過渡的に過剰発現する過バナジン酸処理ヒト２９３細胞からの
チロシンリン酸化β−カテニンとともにインキュベートした。異なる時間間隔の
後に，反応を終了させ，抗ホスホチロシン特異的抗体を用いて分析した。
【０２０１】 β−カテニンをＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ細胞質またはＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲ
ＰＴＰＤ2Ｃ１８１３Ｓとともにインキュベートすると，最初の５分間のうちに
チロシンリン酸化シグナルの有意な低下が見られた（図６，上，左および右）。
ＧＳＴ−ＰＴＰ ＬＡＲＰＴＰＤ1Ｃ１５２２Ｓ（図６，上，中）とともにイン
キュベートした後にはリン酸化レベルには変化が観察されず，ｐＮＰＰを基質と
して用いたＧＳＴ融合蛋白質の酵素活性の測定の結果（データ示さず）が確認さ
れた。これらのデータは，ＰＴＰ ＬＡＲの第１のＰＴＰドメインは触媒活性に
必須であるが，第２のドメインは触媒的に不活性であるという先の知見と一致す
る（Ｓｔｒｅｕｌｉ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９）。抗β−
カテニン特異的抗体でブロットを再探索して，アッセイにおいて等量の蛋白質が
用いられたことを確認した（図６，下）。すなわち，β−カテニンはＰＴＰ Ｌ
ＡＲの基質である。
【０２０２】実施例７：ＰＴＰ ＬＡＲはヌードマウスにおいて上皮細胞移動および腫瘍形成 を阻害する 次に我々は，ＰＴＰ ＬＡＲが上皮細胞移動の間に直接の制御機能を有するか
否かを調べた。したがって我々は，ＮＢＴＩＩ細胞においてヒトＰＴＰ ＬＡＲ
を内因性蛋白質と匹敵するレベルで異所的に発現させ，このことにより親細胞と
比較して約２倍のＰＴＰ ＬＡＲ発現を有するポリクローンならびにクローン化
細胞株を得た。これらの細胞株を用いて，スキャッターアッセイを行って，ＥＧ
Ｆ処理後の移動を定量した。ｈＰＴＰ ＬＡＲのＮＢＴＩＩ細胞におけるこの適
度な異所性発現は，移動の開始の動力学には影響を与えずに，ＥＭＴおよび移動
性（図７Ａ）を有意に，ベクター対照感染細胞株（ＮＢＴＩＩ ｐＬＸＳＮ，図
７Ｂ）の約４０％に阻害した。ＥＧＦレセプターの活性化および自己リン酸化お
よびそのアダプター蛋白質Ｓｈｃとの会合には相違が検出されず，このことは，
異所性ｈＰＴＰ ＬＡＲはＥＧＦ−レセプターを不活性化することにより機能す
るのではないことを示唆する。さらに，これらのＮＢＴＩＩ−ｈＰＴＰ ＬＡＲ
細胞株のＥＧＦシグナリングの下流の事象，例えばＤＮＡ合成および増殖速度は
，ｈＰＴＰ ＬＡＲの異所性発現により影響を受けなかった。
【０２０３】 インビトロの上皮細胞移動は，インビボでの腫瘍形成および転移の簡単なモデ
ルシステムに似ている。したがって，ｈＰＴＰ ＬＡＲの異常な発現と，これら
の細胞がヌードマウスにおいてインビボで腫瘍を形成する能力の低下との相関関
係を試験した。ＮＥＴＩＩｈＰＴＰ ＬＡＲ細胞をスイスヌードマウスの横腹領
域の皮下に注入した。興味深いことに，これらの細胞はＮＢＴＩＩ ｐＬＸＳＮ
細胞と比較して，有意に減少した腫瘍成長を示した（図７Ｃ）。ポリクローナル
およびクローナル細胞株において腫瘍を形成する能力は相違しなかった。親ＮＢ
ＴＩＩ細胞は，ベクター対照感染細胞株と同じ程度に腫瘍を形成し，これはクロ
ーニングアルチファクトを除外する。これらのデータは，ＰＴＰ ＬＡＲが上皮
細胞移動および腫瘍形成の負のレギュレータとして作用することを強く示唆する
。
【０２０４】実施例８：ＰＴＰ ＬＡＲはチロシンリン酸化を阻害し，β−カテニンのフリー プールを増加させる β−カテニンは，ＧＳＴ−Ｅ−カドヘリン細胞質融合蛋白質を用いて対照およ
びｈＰＴＰ ＬＡＲ−発現ＮＥＴＩＩ細胞においてアフィニティー沈澱した。Ｐ
ＴＰ ＬＡＲの機能を覆わないように，細胞はＰＴＰの阻害剤であるＮａ−オル
トバナジン酸で処理しなかった。いずれにしても，ベクター感染対照細胞におい
てフリーの，複合体を形成していないβ−カテニンおよびβ−カテニンのチロシ
ンリン酸化プールの増加が検出され，このことは，フリーの，チロシンリン酸化
β−カテニンの増加がＮ−オルトバナジン酸前処理（図８，左）を行っていない
細胞においても生じることを示した。しかし，ＮＥＴＩＩ−ｈＰＴＰ ＬＡＲ−
発現細胞においては，チロシンリン酸化の増加も，β−カテニンのフリープール
の増加も検出できなかった（図８，右）。β−カテニンはインビトロでＰＴＰ
ＬＡＲの基質であり，ＮＥＴＩＩ細胞におけるヒトＰＴＰ ＬＡＲの異所性発現
はＥＧＦレセプター媒介性シグナリングを妨害しないため，ＰＴＰ ＬＡＲは，
β−カテニンのチロシンリン酸化の特異的な負のレギュレータとして機能して，
フリーのβ−カテニンの増加を防止し，このことにより上皮細胞移動を阻害する
。
【０２０５】 当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請
求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途
をなすであろう。
【０２０６】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
【０２０７】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。
【０２０８】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
【０２０９】 特に，本明細書に記載されるある処方は処方に添加された賦形剤により同定さ
れるが，本発明はこれらの賦形剤の組み合わせにより形成される最終処方をもカ
バーすることを意味する。特に，本発明は，添加された賦形剤の１つないしすべ
てが処方の間に反応し，最終処方中にもはや存在しないかまたは変化した形で存
在する処方を含む。
【０２１０】 さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０２１１】 他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，種々の条件下における上皮ＮＢＴＩＩ細胞の移動を示す
。
【図２】 図２は，上皮細胞移動の間のβ−カテニンおよびプラコグロビン
のチロシンリン酸化を示す。
【図３】 図３は，上皮細胞移動の間，フリーの，複合体を形成していない
β−カテニンのプールが増加し，チロシンリン酸化の促進と相関することを示す
。
【図４】 図４は，カドヘリン／カテニン複合体のメンバーがＮＢＴＩＩ細
胞においてＰＴＰ ＬＡＲと共局在することを示す。
【図５】 図５は，カドヘリン／カテニン−複合体のメンバーがＰＴＰ Ｌ
ＡＲと会合することを示す。
【図６】 図６は，β−カテニンがインビトロでＰＴＰ ＬＡＲの基質であ
ることを示す。
【図７】 図７は，ヒトＰＴＰ ＬＡＲの異所性過剰発現が上皮細胞移動お
よびラットＮＢＴＩＩ細胞のヌードマウス中における腫瘍形成を阻害することを
示す。
【図８】 図８は，ＮＢＴＩＩ細胞におけるヒトＰＴＰ ＬＡＲの異所性発
現がβ−カテニンのチロシン残基のリン酸化を阻害し，β−カテニンのフリープ
ールを増加させることを示す。
【図９】 図９は，ＥＭＢＬデータベースから抽出したＰＴＰ ＬＡＲプレ
蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図１０】 図１０は，ＥＭＢＬデータベースから抽出したＰＴＰ ＬＡＲ
の核酸配列を示す。
【図１１】 図１１は，ＰＴＰ ＬＡＲのアミノ酸配列を用いたＰｆａｍ
ＨＭＭの検索から得られた出力を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１０月３０日（２００１．１０．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 ＰＴＰ ＬＡＲ関連疾病の治療のための物および方法
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/00 9/00 13/12 13/12 17/02 17/02 17/06 17/06 25/28 25/28 29/00 29/00 35/00 35/00 35/04 35/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/42 1/42 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミュラー，トーマス アメリカ合衆国 94080 カリフォルニア 州 エス サンフランシスコ，イースト グランド アベニュー 230，スージェ ン・インコーポレーテッド内 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CA25 CA26 CB03 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FA16 FB01 FB02 FB03 FB07 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ08 QQ33 QQ42 QQ52 QR08 QR13 QR33 QR42 QR55 QR57 QR59 QR62 QR74 QR80 QR82 QS05 QS15 QS25 QS26 QS34 QS36 QX02 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA62 MA13 MA17 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA152 ZA362 ZA512 ZA812 ZA892 ZB262 ZC352 ZC412 4C086 BC13 BC46 BC52 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA15 ZA21 ZA36 ZA59 ZA81 ZB11 ZB26 ZC35 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA59 NA14 ZA15 ZA36 ZA81 ZA89 ZB11 ZB26 ZC41

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 疾病または疾患を治療する方法であって，そのような治療
    を必要とする患者にＰＴＰ ＬＡＲを含む薬学的に許容しうる組成物を投与する
    ことを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記疾病または疾患が，上皮細胞移動により特徴づけられ
    る，請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記疾病または疾患が，β−カテニンのチロシンリン酸化
    の増加により特徴づけられる，請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記疾病または疾患が，フリーのβ−カテニンのプールの
    レベルの増加により特徴づけられる，請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記疾病または疾患が，癌，転移，および異常な創傷治癒
    からなる群より選択される，請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記患者が哺乳動物である，請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記哺乳動物がヒトである，請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが組換え蛋白質として提供される，請
    求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが組換え遺伝子として提供される，請
    求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが組換え細胞として提供される，請
    求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが，上皮細胞移動をインビトロでま
    たはインビボで調節する，請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが上皮細胞移動をインビトロでまた
    はインビボで阻害する，請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが，β−カテニンのチロシンリン酸
    化をインビトロでまたはインビボで調節する，請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが，β−カテニンのチロシンリン酸
    化をインビトロでまたはインビボで阻害する，請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが，β−カテニンのフリープールを
    インビトロでまたはインビボで調節する，請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ＰＴＰ ＬＡＲが，β−カテニンのフリープールの
    レベルをインビトロでまたはインビボで低下させる，請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲを疾病または疾患の予知の道具
    として検出する方法であって， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＰＴＰ ＬＡＲの
    核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，
    前記ＰＴＰ ＬＡＲをコードする核酸配列，そのフラグメント，または前記配列
    またはフラグメントの相補体を含み；そして （ｂ）プローブ−標的領域ハイブリッドの存在または量を前記疾病または疾患の
    前記予知の指標として検出する， の各工程を含む方法。
  18. 【請求項１８】 前記疾病または疾患が，異常な創傷治癒，癌，および転
    移からなる群より選択される，請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲを，疾病または疾患の予知の道
    具として検出する方法であって，（ａ）試料中の前記ＰＴＰ ＬＡＲをコードす
    る核酸標的領域を前記ＰＴＰ ＬＡＲをコードする対照核酸標的領域と比較し；
    そして（ｂ）前記標的領域と前記対照標的領域との間の配列または量の相違を前
    記疾病または疾患の前記予知の指標として検出する，の各工程を含む方法。
  20. 【請求項２０】 前記疾病または疾患が，異常な創傷治癒，癌，および転
    移からなる群より選択される，請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲを疾病または疾患の予知の道具
    として検出する方法であって， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＰＴＰ ＬＡＲの
    アミノ酸標的領域にハイブリダイズする抗体と接触させ，そして （ｂ）抗体：標的領域複合体の存在または量を前記疾病または疾患の前記予知の
    指標として検出する， の各工程を含む方法。
  22. 【請求項２２】 前記抗体が，ポリクローナル抗体およびモノクローナル
    抗体からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記抗体がハイブリドーマから得られる，請求項２１記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記疾病または疾患が，異常な創傷治癒，癌，および転
    移からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 試料中のＰＴＰ ＬＡＲを疾病または疾患の予知の道具
    として検出する方法であって，ＰＴＰ ＬＡＲの存在または量を前記疾病または
    疾患の前記予知の指標として検出することを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 前記疾病または疾患が，異常な創傷治癒，癌，および転
    移からなる群より選択される，請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 上皮細胞移動を調節する１またはそれ以上の化合物を同
    定する方法であって， （ａ）チロシンリン酸化β−カテニンを１またはそれ以上の可能性のある化合物
    と接触させ； （ｂ）前記チロシンリン酸化β−カテニンのリン酸化レベルの変化をモニターし
    て，前記上皮細胞移動を調節する前記１またはそれ以上の化合物を同定する， の各工程を含む方法。
  28. 【請求項２８】 前記１またはそれ以上の化合物が，インドリノン，キナ
    ゾリン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる群より選択される，請求項
    ２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する１またはそれ以上の化合
    物を同定する方法であって， （ａ）ＰＴＰ ＬＡＲを１またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ； （ｂ）前記ＰＴＰ ＬＡＲの活性を測定し；そして （ｃ）前記１またはそれ以上の可能性のある化合物が前記ＰＴＰ ＬＡＲの活性
    を調節するか否かを判定する， の各工程を含む方法。
  30. 【請求項３０】 前記活性がホスホチロシンホスファターゼ活性である，
    請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 天然の結合パートナーを工程（ａ）に加えることをさら
    に含む，請求項２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記天然の結合パートナーが，β−カテニンおよびプラ
    コグロビンからなる群より選択される，請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記１またはそれ以上の化合物が，インドリノン，キナ
    ゾリン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる群より選択される，請求項
    ２９記載の方法。
  34. 【請求項３４】 細胞においてＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する１またはそ
    れ以上の化合物を同定する方法であって： （ａ）ＰＴＰ ＬＡＲを前記細胞中で発現させ； （ｂ）前記細胞を１またはそれ以上の可能性のある化合物と接触させ；そして （ｃ）細胞移動または前記ＰＴＰ ＬＡＲと天然の結合パートナーとの間の相互
    作用の変化をモニターして，前記ＰＴＰ ＬＡＲ活性を調節する前記１またはそ
    れ以上の化合物を同定する， の各工程を含む方法。
  35. 【請求項３５】 前記天然の結合パートナーが，β−カテニン，およびプ
    ラコグロビンからなる群より選択される，請求項３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記１またはそれ以上の化合物が，インドリノン，キナ
    ゾリン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる群より選択される，請求項
    ３４記載の方法。
  37. 【請求項３７】 上皮細胞移動により特徴づけられる疾病または疾患を治
    療する方法であって，そのような治療を必要とする患者に，薬学的に許容しうる
    組成物中の１またはそれ以上の化合物を投与することを含み，ここで，前記１ま
    たはそれ以上の化合物は，請求項２７−３６のいずれかに記載の方法により同定
    されることを特徴とする方法。
  38. 【請求項３８】 前記疾病または疾患が，癌，転移，および異常な創傷治
    癒からなる群より選択される，請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記患者が哺乳動物である，請求項３７記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記哺乳動物がヒトである，請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 上皮細胞移動により特徴づけられる疾病または疾患を治
    療する方法であって，そのような治療を必要とする患者に，薬学的に許容しうる
    組成物中の１またはそれ以上の化合物を投与することを含み，ここで，前記１ま
    たはそれ以上の化合物は前記上皮細胞移動を調節することを特徴とする方法。
  42. 【請求項４２】 前記疾病または疾患が，癌，転移，および異常な創傷治
    癒からなる群より選択される，請求項４１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記患者が哺乳動物である，請求項４１記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記哺乳動物がヒトである，請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記１またはそれ以上の化合物が前記上皮細胞移動をイ
    ンビトロで調節する，請求項４１記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記１またはそれ以上の化合物が前記上皮細胞移動をイ
    ンビトロで阻害する，請求項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記１またはそれ以上の化合物が，β−カテニンのチロ
    シンリン酸化をインビトロで調節する，請求項４１記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記１またはそれ以上の化合物が，β−カテニンのチロ
    シンリン酸化を阻害する，請求項４７記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記１またはそれ以上の化合物が，インビトロでβ−カ
    テニンフリープールのレベルを調節する，請求項４１記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記１またはそれ以上の化合物がインビトロでβ−カテ
    ニンフリープールのレベルを低下させる，請求項４９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記１またはそれ以上の化合物が，キナゾリン，インド
    リノン，キノキサリン，およびチロホスチンからなる群より選択される，請求項
    ４１記載の方法。
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