JP2003517836A - 哺乳動物蛋白質ホスファターゼ - Google Patents

哺乳動物蛋白質ホスファターゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は，ホスファターゼポリペプチド，ホスファターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。バイオインフォマティクス戦略を用いることにより，ＭＡＰキナーゼホスファターゼＰＴＰおよびＳＴＰの哺乳動物メンバーが同定され，その蛋白質構造が推定された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は，米国特許仮出願６０／１７３，２５５，６０／１７８，０７８，６
０／１７９，３０１，６０／１７５，７６６，（およびＳｕｇｅｎの書類番号"
Ｃｅｌ＿１６"で表される仮出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願は
すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】発明の分野 本発明は，ホスファターゼポリペプチド，ホスファターゼポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の
診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
【０００３】発明の背景 以下の発明の背景の記載は本発明の理解を助けるために提供され，本発明に対
する先行技術であるかまたはそれを記述すると認めるものではない。
【０００４】 細胞シグナル伝達は，各種の細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリ
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニ
ズムの一つは蛋白質キナーゼによる蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成
熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる
。真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼは，セリン，トレオニ
ンおよびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナ
ーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン
酸化に特異的なものの２グループに大別される。
【０００５】 所定の基質のリン酸化状態はまた，蛋白質ホスファターゼ，すなわち，蛋白質
キナーゼにより所定の基質に加えられたリン酸基の除去を担う一群の蛋白質によ
っても制御される。蛋白質ホスファターゼもまた，セリン／トレオニン，または
チロシンのいずれかに特異的であるとして分類することができる。このファミリ
ーのいくつかのメンバーは，チロシンのみを脱リン酸化することができ，"蛋白
質チロシンホスファターゼ"（"ＰＴＰ"）として知られており，他のものはチロ
シンならびにセリンおよびトレオニンを脱リン酸化することができ，"二重特異
性ホスファターゼ"（"ＤＳＰ"）と称され；第３のファミリーはセリンまたはト
レオニンのみをリン酸化する（"ＳＴＰ"）。これらは，Ｆａｕｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９６ Ｎｏｖ ２１（１１
）：４１３−７）およびＭａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．
１９９８ Ｆｅｂ ２８；８（１）：２−１１）に記載される。これらの蛋白質
は，共通の触媒コア構造を含む２５０−３００アミノ酸ドメインを共有する。関
連するホスファターゼは，チロシンホスファターゼ，二重特異性ホスファターゼ
，およびミオチューブラリン様（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｌｉｋｅ）ホスフ
ァターゼ（（Ｆａｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，；およびＭａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．，上掲）の別個のサブファミリーに分類される。
【０００６】 ホスファターゼは，上流のレギュレータと相互作用すると考えられている種々
の非触媒ドメインを有する。例としては，ＳＨ３含有蛋白質との相互作用のため
のプロリンリッチドメイン，またはＲａｃ，Ｒｈｏ，およびＲａｂ等の小さいＧ
蛋白質との相互作用のための特異的ドメインが含まれる。これらの相互作用は，
種々の細胞表面レセプターの活性化等の外部刺激，例えば，チロシンキナーゼ，
サイトカインレセプター，ＴＮＦレセプター，Ｆａｓ，Ｔ細胞レセプター，ＣＤ
２８，またはＣＤ４０に応答した独特の生化学的経路の間をクロストークするた
めのメカニズムを提供するかもしれない。
【０００７】 ホスファターゼは，種々の細胞応答，例えば，成長因子，サイトカインおよび
ホルモンに対する応答，酸化−，ＵＶ−，または照射−関連ストレス経路，炎症
性シグナル（例えばＴＮＦα），アポトーシス刺激（例えばＦａｓ），Ｔおよび
Ｂ細胞共刺激，細胞骨格構造の制御，および細胞トランスフォーメーション等の
制御において関与することが示唆されている（ＴＨＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＨＯ
ＳＰＨＡＴＡＳＥ ＦＡＣＴＢＯＯＫ，Ｔｏｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照）。
【０００８】 したがって，その不適切な活性が癌または他の疾患につながりうる追加のホス
ファターゼを同定し，これらの疾患の適切な治療をも同定することが必要とされ
ている。
【０００９】発明の概要 本発明にしたがうホスファターゼの特徴を記載するために，以下の略号を用い
る： ＤｓＰＴＰ 二重特異性蛋白質ホスファターゼ ＤＵＳ 二重特異性ホスファターゼ ＭＫＰ ＭＡＰキナーゼホスファターゼ ＭＴＭ 筋細管ミオパシー（ミオチューブラリン）ホスファターゼ ＰＴＰ 蛋白質チロシンホスファターゼ ＰＴＥＮ ホスファターゼおよびテンシンホモログ
【００１０】 "モチーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより
，我々は，ホスファターゼファミリーのある種の追加の哺乳動物メンバーを同定
し，これは本明細書に記載される。本発明は，１２個のホスファターゼの部分配
列または完全配列，ならびにこれらの分類，予測されたまたは推定された蛋白質
構造，およびこれらの蛋白質の生物学的および治療上の関連性を解明する戦略を
提供する。これらの新規蛋白質には，以下のものが含まれる：８つのＭＡＰキナ
ーゼホスファターゼ酵素（"ＭＫＰ"），これはＤＳＰファミリーのメンバーであ
る；ＳＴＰファミリーからの２つのホスファターゼ；およびＰＴＰファミリーか
らの２つのホスファターゼ。新規な蛋白質を確立されたファミリーに属するとし
て分類することは，各蛋白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの推定にお
けるのみならず，これらの蛋白質の制御，基質，およびシグナリング経路におい
ても，非常に正確であることが証明された。
【００１１】 本発明の１つの観点は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番
号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号
２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸
配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチ
ドをコードする，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴と
する。
【００１２】 核酸に関して"単離された"とは，互いに結合した１０個（好ましくは２１個，
より好ましくは３９個，最も好ましくは７５個）またはそれ以上のヌクレオチド
のポリマーを意味し，天然起源から単離された，またはセンス鎖または相補的な
アンチセンス鎖として合成されるＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本発明のある
態様においては，より長い核酸が好ましく，例えば，３００，６００，９００，
１２００，１５００，またはそれ以上のヌクレオチドのもの，および／または配
列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配
列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列
番号１２に記載される配列からなる群より選択される配列と，少なくとも５０％
，６０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％または９９％の同一性を有
するものが好ましい。
【００１３】 本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見
いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていること
を表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環
境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド
鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド物
質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離され
た染色体とは区別されることを意味する。
【００１４】 核酸に関連して，"濃縮された"との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡ
は，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵ
Ｃ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種
のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる事象，例えばウイルス感
染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語は，人が所望の
核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
【００１５】 ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利であ
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくと
も１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的
に企図される。
【００１６】 "ホスファターゼポリペプチド"とは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号
１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２
０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載さ
れるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
中の，３２個（好ましくは４０，より好ましくは４５，最も好ましくは５５個）
またはそれ以上の連続するアミノ酸を意味する。ある観点においては，１００，
２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６００，７００，８００，
９００個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドが好ましい。ホスファターゼ
ポリペプチドは，ポリペプチドの機能的活性が保持される限り，全長核酸配列ま
たは全長核酸配列の任意の部分（例えば，本明細書において定義される"フラグ
メント"），例えば，触媒ドメイン（本明細書において定義される）またはその
一部によりコードされることができる。遺伝コードの縮重のため，多数の異なる
核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうることは当該技術分野においてよく知
られている。同じく，アミノ酸の保存的変更を行って，元の機能を保持している
蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも，当該技術分野においてよ
く知られている。そのような置換には，アミノ酸を類似の物理化学的特性を有す
る残基で置き換えること，例えば，１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ
またはＡｌａ）を別のもので，または塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ，酸性残基
ＧｌｕおよびＡｓｐ，アミド残基ＧｌｎおよびＡｓｎ，ヒドロキシル残基Ｓｅｒ
およびＴｙｒ，または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間で置き換えることが含
まれる。蛋白質全体にあったとしてもわずかの影響しか与えないアミノ酸の交換
を作成することに関するさらなる情報は，Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１９９０，２４７，１３０６−１３１０に見いだすことができる（図面
および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。すべての場
合において，すべての順列がこの開示によりカバーされることが意図される。
【００１７】 本発明のホスファターゼペプチドのアミノ酸配列は，配列番号１３，配列番号
１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１
９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番
号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列，また
は対応する全長アミノ酸配列，またはそのフラグメントを有する配列に実質的に
類似するであろう。
【００１８】 配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，
配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配
列番号２３，および配列番号２４に記載される配列からなる群より選択される配
列と実質的に類似する配列は，好ましくは配列と少なくとも９０％の同一性（よ
り好ましくは少なくとも９５％，最も好ましくは９９−１００％）を有するであ
ろう。
【００１９】 "同一性"とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。同
一性は，同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列のドメイン中の残
基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ
酸の付加または欠失により生じたアラインメント中の空間である。すなわち，完
全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に
保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するで
あろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するための
いくつかのコンピュータプログラム，例えば，Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴまたは
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３
−４１０），およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）
（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９
５−１９７）が利用可能であることを認識するであろう。好ましくは，これらの
プログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者は，これらの設定を変更するこ
とが必要であるか否かを認識しており，どのようにして変更するかがわかる。
【００２０】 "類似性"は，同一の残基の数と保存的に置換された残基の数（Ｂｏｗｉｅ，ｅ
ｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２４７，１３０６−１３１０を参照（図
面および表を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）との合計
を残基とギャップの総数で割り，１００を乗ずることにより測定することができ
る。
【００２１】 好ましい態様においては，本発明は，以下のヌクレオチド配列を含むホスファ
ターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮されたまたは精製された核
酸分子を特徴とする： （ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）（ａ）のヌクレオチド分子に高度にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし，かつ天然に生ずるホスファターゼポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
選択されるアミノ酸配列であって，ただしＮ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末
端触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領
域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメインの
全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードする；および （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２２】 "相補体"との用語は，互いに多くの望ましい相互作用を形成しうる２つのヌク
レオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することが
できるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素
結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第
１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的
である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２３】 所望の特異性および選択性に応じて，種々の低いまたは高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業
者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
は，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのよう
な条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有す
る核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は
，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸の
ハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００
個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブ
リダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個
のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００２４】 ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以
下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する
：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０
．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハ
ルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗
浄。いくつかの最もストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件に
おいては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣで７０℃までの温度で行うことがで
きる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｇ４２１（図面および表を
含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。しかし，他の用途は，
これらの条件の組の間に入る条件の使用を必要とするかもしれない。所望のハイ
ブリダイゼーションを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく
知られており，いくつかの因子，例えば，限定されないが，ハイブリダイズすべ
き配列および試験すべき試料に基づく。低いストリンジェンシーの洗浄条件は，
しばしば洗浄工程の間により低い温度，例えば，６５℃，６０℃，５５℃，５０
℃，または４２℃を用いる。
【００２５】 "ドメイン"との用語は，特定の機能を含むポリペプチドの領域を表す。例えば
，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されない
が，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細
胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の
機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残部と別々に発現させて
それ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するために
は無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域と
も称され，これもまたドメインと関連する。
【００２６】 "Ｎ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの開始メチオニンと触媒
的ドメインとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列
を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを
行い，触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる
。Ｎ末端ドメインは，その長さに応じて，ホスファターゼ機能において制御的役
割を果たすかまたは果たさない。"触媒ドメイン"とは，典型的には２５−３００
アミノ酸の長さであり，高エネルギーリン酸ドナー分子，例えばＡＴＰまたはＧ
ＴＰから，それ自身（自己リン酸化）または他の蛋白質（外因性リン酸化）への
リン酸転移反応を担う蛋白質ホスファターゼの領域を表す。蛋白質ホスファター
ゼの触媒ドメインは高度に保存されたアミノ酸残基を含む１２個のサブドメイン
から構成され，正しいポリペプチドのフォールディングおよび触媒を担う。触媒
ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してをスミス・ウォー
ターマンアライメントさせた後に同定することができる。
【００２７】 本明細書において用いられる場合，"触媒活性"との用語は，ホスファターゼ触
媒ドメインが基質をリン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，リン酸
化された生成物に変換される基質の量を時間の関数として決定することにより測
定することができる。触媒活性は，時間を一定にして定められた時間の後にリン
酸化された基質の濃度を決定することにより，本発明の方法により測定すること
ができる。基質のリン酸化は，蛋白質ホスファターゼの活性部位において生ずる
。活性部位は，通常は，基質が蛋白質ホスファターゼに結合し，リン酸化される
空洞である。
【００２８】 本明細書において用いられる場合，"基質"との用語は，本発明のホスファター
ゼによりリン酸化される分子を表す。ホスファターゼは，セリン／トレオニンま
たはチロシンアミノ酸で基質をリン酸化する。分子は別の蛋白質またはポリペプ
チドであってもよい。
【００２９】 "Ｃ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの触媒ドメインまたは最
後の（Ｃ末端に最も近い位置の）機能的ドメインとカルボキシ末端アミノ酸残基
との間に位置する領域を表す。"機能的"ドメインとは，他の蛋白質に対するアミ
ノ酸配列ホモロジーから，または特定の構造的コンフォメーションを与えるであ
ろうアミノ酸配列の存在（例えばＮ末端ドメイン）により，制御的または触媒的
役割を果たすであろう，ポリペプチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメイン
は，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンア
ラインメントを用いて，触媒ドメインまたは任意の機能的なＣ末端の触媒外ドメ
インのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。その長さおよび
アミノ酸組成に依存して，Ｃ末端ドメインは，ホスファターゼ機能において制御
的機能を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。本発明のいくつかのホ
スファターゼについては，Ｃ末端ドメインはまた触媒ドメインを含むかもしれな
い（上述）。
【００３０】 本明細書において用いる場合，"Ｃ末端テール"との用語は，ホモロジーにより
，その最も近いホモログのＣ末端アミノ酸を越えて伸長または突出している蛋白
質ホスファターゼのＣ末端ドメインを表す。Ｃ末端テールは，蛋白質配列を非重
複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用
いることにより，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相
同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。Ｃ末端テー
ルは，その長さに依存して，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすか
もしれないし果たさないかもしれない。
【００３１】 本明細書において用いる場合，"コイルドコイル構造領域"との用語は，コンピ
ュータアルゴリズム，例えばＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９６）Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：５１３−５２５）により推定してコイルド
コイル構造をとる可能性が高いポリペプチド配列を表す。コイルドコイルは，平
行な２または３個の両親媒性α−ヘリックスから形成される。コイルドコイルは
，他のポリペプチドのコイルドコイルドメインと結合してホモ二量体またはヘテ
ロ二量体を生ずることができる（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２：１１６２−１１６４）。
【００３２】 本明細書において用いる場合，"プロリンリッチ領域"との用語は，蛋白質ホス
ファターゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見い
だされるこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。
プロリンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，
標準的なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥ
ｄｉｔＳｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質
と蛋白質との相互作用に関与することが示されている。
【００３３】 本明細書において用いる場合，"スペーサー領域"との用語は，予測される機能
的ドメインの間に位置する蛋白質ホスファターゼの領域を表す。スペーサー領域
は，データベース中の任意のアミノ酸配列に対する検出可能なホモロジーを有し
ない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミスウォータ
ーマンアラインメントを用いて，これを挟む機能的ドメインのＣおよびＮ末端境
界を規定することにより同定することができる。スペーサー領域は，蛋白質ホス
ファターゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果たさないかもしれな
い。
【００３４】 本明細書において用いる場合，"挿入物"との用語は，密接なホモログ中にはな
い蛋白質ホスファターゼの一部を表す。挿入物は，エクソンの選択的スプライシ
ングの産物であるかもしれないしそうではないかもしれない。挿入物は，蛋白質
配列の非重複蛋白質データベースに対するスミス−ウォーターマン配列アライン
メントを用いて，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相
同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。挿入物は，
蛋白質−蛋白質相互作用のための新規な伝達手段を提示することにより，または
そのような相互作用を妨害することにより，機能的役割を果たすかもしれない。
【００３５】 "シグナル伝達経路"との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播し，細
胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激するこ
とができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的には
レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよ
び非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを
含むポリペプチド，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）
およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリ
ンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅ，ホスホジエ
ステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋
結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ
，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
【００３６】 別の好ましい態様においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドをコー
ドし，宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーター
をさらに含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする
。本発明はまた，組換え核酸を特徴とし，これは好ましくは細胞または生物内に
ある。組換え核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列
番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配
列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択される配
列，またはその機能的誘導体，および宿主細胞において転写を開始させるのに有
効なベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は
，細胞において機能的な転写開始領域，ホスファターゼポリペプチドをコードす
るＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞において機能的な転写終止領域を含んで
いてもよい。特定のベクターおよび宿主細胞の組み合わせは本明細書において議
論される。
【００３７】 "ベクター"との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲノム
中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す
。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直
鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素によ
り切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。ホ
スファターゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断
片を一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる
。
【００３８】 "トランスフェクトする"との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞
性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含
まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理す
ることにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること
，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００３９】 本明細書において用いる場合，"プロモーター"との用語は，遺伝子配列の発現
に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々
の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロ
モーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのよう
な領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例
えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００４０】 好ましい態様においては，単離された核酸は，配列番号１，配列番号２，配列
番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列
番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列か
らなる群より選択される核酸配列を含むか，本質的にそれからなるか，それから
なり，かつ，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列
番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番
号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる
群より選択されるアミノ酸配列，その機能的誘導体，または配列番号１３，配列
番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番
号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配
列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも３５
，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００，または３００個の連続する
アミノ酸をコードする。核酸は，ｃＤＮＡクローニングにより，またはサブトラ
クティブハイブリダイゼーションにより，天然の起源から単離することができる
。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましくはヒト，好ましくは血液，
精液または組織であり，核酸はトリエステル法によりまたは自動化ＤＮＡ合成機
を用いることにより合成してもよい。
【００４１】 "哺乳動物"とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，
およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾
サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
【００４２】 さらに別の好ましい態様においては，核酸は，例えば，追加のポリペプチドの
同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを
設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプ
ローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の
領域である。
【００４３】 "保存された核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする２つま
たはそれ以上の核酸に存在する領域を意味し，特定の核酸配列は低いストリンジ
ェンシー条件下でこの領域にハイブリダイズすることができる。ホスファターゼ
ポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー
条件の例は，Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：３９９−
４０７（１９８７）およびＷａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５
２：４１５−４２３（１９８７）（図面および表を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領域は，２０ヌクレ
オチド中５個以下で異なり，より好ましくは２０ヌクレオチド中２個，最も好ま
しくは２０ヌクレオチド中１個が異なる。
【００４４】 "独特の核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸中に存
在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない
配列を意味する。そのような領域は，好ましくは配列番号１３，配列番号１４，
配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配
列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される全長アミノ酸配列に記載さ
れる３２個（好ましくは４０個，より好ましくは４５個，最も好ましくは５５個
）またはそれ以上の連続するアミノ酸をコードする。特に，独特の核酸領域は，
好ましくは哺乳動物起源のものである。
【００４５】 本発明の別の観点は，試料において，配列番号１３，配列番号１４，配列番号
１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２
０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載さ
れるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファター
ゼポリペプチドをコードする核酸を検出するための核酸プローブを特徴とする。
核酸プローブは，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号
５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番
号１１，および配列番号１２，またはその機能的誘導体に記載される配列からな
る群より選択される配列にハイブリダイズするであろうヌクレオチド塩基配列を
含む。
【００４６】 好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号１３，配列番号１４，配
列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列
番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に
記載されるアミノ酸配列またはその機能的誘導体からなる群より選択される全長
配列の，少なくとも１２，３２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００
，２５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードする核酸にハイブ
リダイズする。
【００４７】 プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下
で試料を核酸プローブと接触させ，ホスファターゼＲＮＡに結合したプローブの
存在または量を検出することにより，試料中のホスファターゼＲＮＡの存在また
は量を検出することが含まれる。プローブとホスファターゼポリペプチドをコー
ドする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを，検出された核酸の
配列の同定において用いることができる（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ
ｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，
１９９２（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブが置かれ
ている容器手段を含むように構築することができる。
【００４８】 別の観点においては，本発明は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５
，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，
配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される
アミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポ
リペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞または組織を記述する。その
ような細胞においては，核酸は遺伝的制御要素の制御下にあってもよく，または
外来性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。"外来性"と
は，通常はホスファターゼポリペプチドのコーディング配列とインビボで転写的
にカップリングしていないプロモーターを意味する。
【００４９】 ポリペプチドは，好ましくは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，
配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配
列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるア
ミノ酸配列からなる群より選択される全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白
質のフラグメントである。"フラグメント"とは，ホスファターゼポリペプチド中
に存在するアミノ酸配列を意味する。好ましくは，そのような配列は，配列番号
１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１
８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３
，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される全長
配列の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個
の連続するアミノ酸を含む。
【００５０】 別の観点においては，本発明は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５
，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，
配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される
アミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する，単離された，濃
縮されたまたは精製されたホスファターゼポリペプチドを特徴とする。
【００５１】 ポリペプチドに関して"単離された"とは，互いに結合した６個（好ましくは１
２個，より好ましくは１８個，最も好ましくは２５，３２，４０，または５０個
）またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味し，天然起源から単離されたポリ
ペプチドまたは合成されたポリペプチドが含まれる。ある種の観点においては，
より長いポリペプチド，例えば，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，
配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配
列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるア
ミノ酸配列からなる群より選択される全長配列の，１００，２００，３００，４
００，４５０，５００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ
以上の連続するアミノ酸を含むものが好ましい。
【００５２】 本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見
いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生
ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列
は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。こ
の用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものでは
なく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なく
とも約９０−９５％純粋）ことを意味する。
【００５３】 ポリペプチドに関して使用する場合，"濃縮された"との用語は，特定のアミノ
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割
合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の
量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加
により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。
しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するもので
はなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する
ことに注意すべきである。本明細書において"有意"にとの用語は，増加のレベル
がそのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のア
ミノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍
，またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ
酸配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，
例えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ
１９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所
望のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００５４】 ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましく
は２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物
質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９
５％，または９９％純粋である。
【００５５】 好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号１３，配
列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列
番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および
配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される全長アミノ酸
配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。好ましくは，ホスファタ
ーゼポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１
６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１
，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列
，またはその機能的誘導体からなる群より選択される全長配列の，少なくとも３
２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸を
含む。
【００５６】 好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドは， （ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
選択されるアミノ酸配列；および （ｂ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
選択されるアミノ酸配列であって，ただし，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｎ末端ドメイ
ン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ
領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメイン
の１またはそれ以上が欠失している配列； を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】 ポリペプチドは，当該技術分野においてよく知られる方法により，天然の起源
から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましく
はヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。
【００５８】 ある態様においては，本発明は，（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列
番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番
号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記
載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する組換えホ
スファターゼポリペプチドを含む。"組換えホスファターゼポリペプチド"とは，
その存在位置（例えば，天然に見いだされる物とは異なる細胞または組織に存在
），純度または構造において天然に生ずるポリペプチドと区別されるように，組
換えＤＮＡ技術により製造されるポリペプチドを意味する。一般に，そのような
組換えポリペプチドは，天然に通常観察される量とは異なる量で細胞中に存在す
るであろう。
【００５９】 宿主細胞中で発現させるべきポリペプチドは，異種蛋白質からの領域を含む融
合蛋白質であってもよい。そのような領域を含むことにより，例えば，分泌させ
，安定性を改良し，またはポリペプチドの精製を容易にすることができる。例え
ば，適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター中に組み込むこと
ができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を，ポリペプチドが
シグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるように，ポリヌクレオチド
配列にインフレームで融合させることができる。意図する宿主細胞において機能
的であるシグナルペプチドは，ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましく
は，シグナル配列はポリペプチドが細胞から分泌される際にポリペプチドから切
断される。すなわち，ホスファターゼポリペプチドのＮ末端が運搬ペプチドに融
合されている好ましい融合蛋白質を作成することができる。
【００６０】 １つの態様においては，ポリペプチドは，ポリペプチドの精製を容易にするた
めに用いられる異種領域を含む融合蛋白質を含む。そのような機能のために用い
られる入手可能なペプチドの多くは，融合蛋白質が結合パートナーに選択的に結
合することを可能とする。好ましい結合パートナーには，プロテインＡのＩｇＧ
結合ドメインの１またはそれ以上が含まれ，融合蛋白質は，ＩｇＧ結合セファロ
ース等のアフィニティークロマトグラフィーにより容易に均一にまで精製される
。あるいは，多くのベクターは，標的蛋白質のＮ末端またはＣ末端で発現される
ことができるヒスチジン残基のストレッチを有するという利点を有しており，し
たがって，金属キレート化クロマトグラフィーにより目的とする蛋白質を回収す
ることができる。蛋白質加水分解酵素，例えばエンテロホスファターゼ，ファク
ターＸプロコラゲナーゼまたはトロンビンの認識部位をコードするヌクレオチド
配列をホスファターゼポリペプチドの配列のすぐ上流に配置すると，融合蛋白質
を切断して成熟ホスファターゼポリペプチドを得ることができる。融合蛋白質結
合パートナーのさらなる例には，限定されないが，酵母Ｉ−因子，ｓｆ９昆虫細
胞におけるミツバチメラチンリーダー，６−Ｈｉｓタグ，チオレドキシンタグ，
ヘマグルチニンタグ，ＧＳＴタグ，およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる
。当業者には理解されるように，ペプチドを認識しこれに結合する結合パートナ
ーは，任意のイオン，分子または化合物であることができ，例えば金属イオン（
例えば金属アフィニティーカラム），抗体，またはそのフラグメント，およびペ
プチドに結合する任意の蛋白質またはペプチド，例えばＦＬＡＧタグが含まれる
。
【００６１】 別の観点においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドまたはホスファ
ターゼポリペプチドドメインまたはフラグメントに対して特異的結合親和性を有
する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を特徴とし
，ここで，ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列
番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番
号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ
酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択される。"特
異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチドに結
合するより高い親和性をもって標的ホスファターゼポリペプチドに結合すること
を意味する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領
域を含むポリペプチドである。"特異的結合親和性"との用語は，特定の条件下で
，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもってホスファターゼポリペプ
チドに結合する抗体を記述する。抗体を用いて，ホスファターゼポリペプチドの
内因性起源を同定して，細胞サイクル制御をモニターすることができ，または，
ホスファターゼポリペプチドの細胞中の免疫局在化に用いることができる。
【００６２】 "ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
【００６３】 "モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であ
る。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意
の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法
により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方
は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
【００６４】 "抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
【００６５】 本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体
または抗体フラグメントは，試料をホスファターゼ−抗体免疫複合体の形成に適
した条件下で抗体で探索し，ホスファターゼポリペプチドに結合した抗体の存在
および／または量を検出することにより，試料中のホスファターゼポリペプチド
の存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのよう
な方法を実施するための診断キットは，ホスファターゼに特異的な抗体または抗
体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュ
ゲートを含むように構築することができる。
【００６６】 本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体
または抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精
製することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真
核生物の両方において，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。
ポリペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
【００６７】 本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体
は，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ホスファター
ゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，
試料中のホスファターゼポリペプチドの存在および／または量を検出するための
方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キット
は，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射
性同位体）を含む第２の容器を含むように構築することができる。診断キットは
また，ＦＤＡに認可された使用の通知およびその指針を含んでいてもよい。
【００６８】 別の観点においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドまたはホスファ
ターゼポリペプチドドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生する
ハイブリドーマを特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号
１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１
９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番
号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有す
る群から選択される。"ハイブリドーマ"とは，抗体，例えば本発明のホスファタ
ーゼに対する抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態様において
は，ホスファターゼに対する抗体は，本発明のホスファターゼポリペプチドに特
異的に結合することができるアミノ酸の配列を含む。
【００６９】 別の観点においては，本発明はまた，上述したいずれかの核酸分子によりコー
ドされるポリペプチドに結合する抗体，および負対照抗体を含むキットに関する
。
【００７０】 "負対照抗体"との用語は，特異的結合親和性を有する抗体と類似の起源に由来
するが，本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示さない抗体を表す。
【００７１】 別の観点においては，本発明は，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５
，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，
配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載される
アミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択される
ホスファターゼポリペプチドに結合することができるホスファターゼポリペプチ
ド結合剤を特徴とする。結合剤は，好ましくは，本発明のホスファターゼポリペ
プチド上に存在するエピトープを認識する精製された抗体である。他の結合剤に
は，ホスファターゼポリペプチドに結合する分子およびホスファターゼポリペプ
チドに結合する類似の分子が含まれる。そのような結合剤は，ホスファターゼ結
合パートナー活性を測定するアッセイを用いて同定することができる。
【００７２】 本発明はまた，本発明のホスファターゼポリペプチドまたは同等の配列を含む
ヒト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野にお
いて日常的かつ標準的な技術，例えば本発明のホスファターゼの同定のために本
明細書において記載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブ
ロット分析，インシトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，
ヒト細胞において新規ポリペプチドを同定することを含む。
【００７３】 別の観点においては，本発明は，ホスファターゼ活性を調節する物質を同定す
る方法を特徴とする。該方法は，（ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号
１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２
０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載さ
れるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択さ
れるホスファターゼポリペプチドを試験物質と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチ
ドの活性を測定し；そして（ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節する
か否かを判定する，の各工程を含む。
【００７４】 "調節する"との用語は，化合物が本発明のホスファターゼの機能を変化させる
能力を表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度
に依存して本発明のホスファターゼの活性を活性化するかまたは阻害する。
【００７５】 "調節する"との用語はまた，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を増加または減少させることにより，本発明のホスファ
ターゼの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼと
天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，
より好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度に依存してホスファ
ターゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減
少させ，最も好ましくは，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に複合
体が形成される確率を減少させる。
【００７６】 "活性化する"との用語は，ホスファターゼの細胞活性を増加させることを表す
。阻害するとの用語は，ホスファターゼの細胞活性を減少させることを表す。ホ
スファターゼ活性は，好ましくは，天然の結合パートナーとの相互作用である。
【００７７】 "複合体"との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シ
グナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を
含む。
【００７８】 "天然の結合パートナー"との用語は，細胞中でホスファターゼに結合するポリ
ペプチド，脂質，小分子，または核酸を表す。ホスファターゼと天然の結合パー
トナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少
，またはホスファターゼ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少
として現れることができる。
【００７９】 本明細書において用いる場合，"接触させる"との用語は，試験化合物を含む溶
液を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物
を含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の
成分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合
物を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基
づく装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
【００８０】 別の観点においては，本発明は，細胞においてホスファターゼ活性を調節する
物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞においてホスファター
ゼポリペプチドを発現させ，ここで前記ポリペプチドは，配列番号１３，配列番
号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号
１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列
番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有
する群から選択され；（ｂ）試験物質を前記細胞に加え；そして（ｃ）細胞表現
型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化をモ
ニターする，の各工程を含む。
【００８１】 本明細書において用いる場合，"発現"との用語は，細胞中でホスファターゼ遺
伝子を含む核酸ベクターから本発明のホスファターゼが産生されることを表す。
本明細書に記載されるように，核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知ら
れる手法を用いて細胞中にトランスフェクトする。
【００８２】 本発明の別の観点は，本発明のホスファターゼポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法に関する。該方法は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接
触させ，化合物がホスファターゼポリペプチドに結合するか否かを判定すること
を含む。結合は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが
，ゲルシフトアッセイ，ウエスタンブロット，放射性標識競合アッセイ，ファー
ジに基づく発現クローニング，クロマトグラフィーによる共分画，共沈澱，架橋
，相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析，サウスウエスタン分析，ＥＬＩＳ
Ａ等により判定することができる。このようなアッセイは，例えば，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９
９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体を本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されている。スクリーニングすべき化合物には，限定
されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源の化合物が含まれる。
【００８３】 本発明の方法はまた，標識，例えば放射性標識（例えば125Ｉ，35Ｓ，32Ｐ，3 3 Ｐ，3Ｈ），蛍光標識，化学発光標識，酵素標識および免疫学的標識に結合した
化合物を包含する。そのような試験において用いるホスファターゼポリペプチド
は，溶液中で遊離であってもよく，固体支持体に結合していてもよく，細胞表面
上に存在してもよく，細胞内に存在してもよく，または細胞の一部に付随してい
てもよい。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物との間
の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物によ
り引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成
の減少を調べることができる。
【００８４】 他のアッセイを用いて，酵素活性を調べることができる。これには，限定され
ないが，測光法，放射線法，ＨＰＬＣ，電気化学的方法等が含まれ，これは，例
えば，Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，ｅｄｓ．Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ，１９９
２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（その全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載されている。
【００８５】 本発明の別の観点は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接触させ，化合
物がホスファターゼポリペプチドの活性を調節するか否かを判定することを含む
，ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する（すなわち，増加または減少さ
せる）化合物を同定する方法に関する。これらの化合物はまた，"蛋白質ホスフ
ァターゼの調節剤"と称される。試験化合物の存在下における活性を，試験化合
物の非存在下における活性に対して測定する。試験化合物を含む試料の活性が試
験化合物を含まない試料の活性より高い場合，その化合物は活性を増加させたの
であろう。同様に，試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の
活性より低い場合，その化合物は活性を阻害したのであろう。
【００８６】 本発明は，種々の薬剤スクリーニング手法のいずれかにおいてホスファターゼ
ポリペプチドを用いて化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリ
ーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または
化学的起源のものが含まれる。そのような試験において用いるホスファターゼポ
リペプチドは，任意の形状であることができ，好ましくは，溶液中で遊離してい
るか，固体支持体に結合しているか，細胞表面上に存在するか，または細胞内に
存在する。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物の間の
複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により
引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の
減少を調べることができる。
【００８７】 本発明のホスファターゼポリペプチドの活性は，例えば，化学的に合成された
ペプチドリガンドに結合するかまたはそれにより活性化される能力を調べること
により決定することができる。あるいは，ホスファターゼポリペプチドの活性は
，カルシウム等の金属イオン，ホルモン，ケモカイン，神経ペプチド，神経伝達
物質，ヌクレオチド，脂質，臭気物質，および光子に結合する能力を調べること
によりアッセイすることができる。すなわち，ホスファターゼポリペプチドの活
性の調節剤は，ホスファターゼの機能，例えばホスファターゼの結合特性または
シグナル伝達等の活性または膜局在を変化させるであろう。
【００８８】 本発明の方法の種々の態様においては，アッセイは，酵母成長アッセイ，エク
オリンアッセイ，ルシフェラーゼアッセイ，有糸分裂促進アッセイ，ＭＡＰホス
ファターゼ活性アッセイ，ならびに当該技術分野において一般に知られている結
合または機能に基づくホスファターゼ活性の他のアッセイの形をとることができ
る。これらの態様のいくつかにおいては，本発明は，レセプターおよび非レセプ
ター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホス
ファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含有するポリペプチド，ホ
スホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン
結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（
ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅｓ，ホスホジエステラーゼ，ホスホ
リパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭ
Ｐ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，
ヌクレオチド交換因子，および転写因子の任意のものを含む。本発明にしたがう
ホスファターゼの生物学的活性には，限定されないが，天然のまたは合成のリガ
ンドの結合，ならびに当該技術分野において知られるホスファターゼの機能的活
性のいずれかが含まれる。ホスファターゼ活性の非限定的例には，ホスファター
ゼ結合相互作用および／またはシグナル伝達に及ぼす影響を含む種々の形の貫膜
シグナリングが含まれる。
【００８９】 本発明の調節剤は，種々の化学構造を示し，これは一般に，天然のホスファタ
ーゼリガンドの模倣体，およびホスファターゼのペプチドおよび非ペプチドアロ
ステリックエフェクターに分類することができる。本発明は適切な調節剤の起源
を限定するものではなく，これは，天然起源，例えば植物，動物または無機抽出
物，または非天然起源，例えば小分子ライブラリ（コンビナトリアル化学方法に
より構築したライブラリを含む）およびペプチドライブラリから得ることができ
る。
【００９０】 ホスファターゼをコードするｃＤＮＡを薬剤発見において用いることはよく知
られている。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において１日に数千種
類の未知の化合物を試験することができるアッセイが詳細に提供されている。文
献は，薬剤発見のためにＨＴＳ結合アッセイにおいて放射性標識リガンドを使用
する例を多数記載している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４を参照；総説につ
いては，Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。結合アッセイＨＴＳのためには，組
換えレセプターが好ましい。これは特異性がより高く（より高い相対純度），大
量のレセプター材料を生成する能力を提供し，広範な種類のフォーマットで用い
ることができるためである（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，１９９２，１０，９７３−９８０を参照；その全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する）。
【００９１】 組換えレセプターの機能的発現には種々の異種システムが利用可能であり，当
業者にはよく知られている。そのようなシステムには，細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒ
ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８），酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅ
ｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４
），何種類かの昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙ
ｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８），両生類細胞（Ｊａｙａｗ
ｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）およびいくつかの哺
乳動物細胞株（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ等；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３を
参照）が含まれる。これらの例は他の可能な細胞発現システム，例えば線虫から
得られる細胞株を使用することを排除するものではない（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／
３７１７７）。
【００９２】 発現されたホスファターゼを，その規定されたリガンド（この場合にはこれを
活性化する対応するペプチド）とともにＨＴＳ結合アッセイにおいて用いること
ができる。同定されたペプチドは，適当な放射性同位体，例えば，限定されない
が，125Ｉ，3Ｈ，35Ｓまたは32Ｐで，当業者によく知られる方法により標識する
。あるいは，ペプチドは，適当な蛍光誘導体を用いてよく知られる方法により標
識してもよい（Ｂａｉｎｄｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，
１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙ Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換え蛋白質を発現する細
胞株から作成した膜調節物において，レセプターに特異的に結合する放射活性リ
ガンドは，いくつかの標準的な方法の１つ，例えば，レセプター−リガンド複合
体を濾過して結合したリガンドを未結合リガンドから分離する方法において，Ｈ
ＴＳアッセイにより検出することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ
．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４．；Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５
５）。別の方法としては，シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはその
ような分離を必要としないフラッシュプレート（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ）フォー
マットが挙げられる（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１；Ｂｏｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−
２９２．）。蛍光リガンドの結合は，例えば，蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）
，結合したリガンドの直接分光蛍光分析，または蛍光分極等の種々の方法により
検出することができる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄ
ａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
【００９３】 ホスファターゼおよび異種ホスファターゼポリペプチドの機能的発現に必要な
天然の結合パートナーは，宿主細胞の天然の構成物であってもよく，またはよく
知られる組換え技術により導入してもよい。ホスファターゼポリペプチドは無傷
であってもよく，キメラであってもよい。ホスファターゼ活性化により他の天然
蛋白質が刺激または阻害され，これらの事象を測定可能な応答に連結させること
ができる。
【００９４】 そのような生物学的応答の例には，限定されないが，以下のものが含まれる：
特別に遺伝子工学処理した酵母細胞において制限栄養の非存在下で生存する能力
（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７
，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定される細胞内Ｃａ2+濃度の変化
（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ
．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光の変化を用いてリガンド誘
導性の膜電位または細胞内ｐＨの変化をモニターすることもできる。このような
目的のためにＨＴＳのための自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄ
ｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１
９９６，１，７５−８０）。共通のセカンドを測定するためのアッセイもまた利
用可能であるが，これらは一般的にはＨＴＳには好ましくない。
【００９５】 本発明は，ホスファターゼポリペプチドに結合するリガンドの阻害剤をスクリ
ーニングし同定する多数のアッセイを企図する。１つの例においては，ホスファ
ターゼポリペプチドを固定化し，候補調節剤，例えば阻害剤化合物の存在下およ
び非存在下において，結合パートナーとの相互作用を評価することができる。別
の例においては，ホスファターゼポリペプチドとその結合パートナーとの間の相
互作用は，溶液アッセイにおいて，候補阻害剤化合物の存在下および非存在下の
両方で評価することができる。いずれのアッセイにおいても，阻害剤はホスファ
ターゼポリペプチドとその天然の結合パートナーとの間の結合を減少させる化合
物として同定される。別の企図されるアッセイには，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／
２０６５２（１９９５年８月３日公開；図面および表を含め本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されるような，トランスフォームしたまたはトランス
フェクトした宿主細胞におけるポジティブシグナルの検出により蛋白質／蛋白質
相互作用の阻害剤を同定する，ジハイブリッドアッセイの変種が含まれる。
【００９６】 本発明により企図される調節剤の候補には，潜在的活性化剤または潜在的阻害
剤のいずれかのライブラリから選択される化合物が含まれる。小分子調節剤の同
定に用いられる多くの多様なライブラリが存在し，これには，例えば，（１）化
学ライブラリ，（２）天然産物ライブラリ，および（３）ランダムペプチド，オ
リゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリが
含まれる。化学ライブラリはランダムな化学構造から構成され，その一部は既知
の化合物の類似体または他の薬剤発見スクリーニングにおいて"ヒット"または"
リード"として同定された化合物の類似体であるが，別のものは天然産物から誘
導され，さらに別のものは，無指向性有機合成化学から生ずる。天然産物ライブ
ラリは，（１）土壌，植物または海洋生物からの培養液の発酵および抽出，また
は（２）植物または海洋生物の抽出，によりスクリーニング用の混合物を作成す
るために用いられる，微生物，動物，植物，または海洋生物の収集物である。天
然産物ライブラリには，ポリケタイド，非リボソームペプチド，およびそれらの
変種（天然に生じない）が含まれる。総説については，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２
：６３−６８（１９９８）を参照。コンビナトリアルライブラリは，混合物とし
ての多数のペプチド，オリゴヌクレオチド，または有機化合物から構成される。
これらのライブラリは，伝統的自動化合成法，ＰＣＲ，クローニング，または私
有の合成法により比較的容易に製造することができる。特に興味深いものは非ペ
プチドコンビナトリアルライブラリである。さらに興味深い他のライブラリには
，ペプチド，蛋白質，ペプチド模倣物，多重平行合成収集物，リコンビナトリア
ル，およびポリペプチドライブラリが含まれる。コンビナトリアルケミストリお
よびこれから作成されるライブラリの総説については，Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照。本
明細書に記載される，種々のライブラリを用いる調節剤の同定により，候補物質
である"ヒット"（または"リード"）を改変して，"ヒット"が活性を調節する能力
を最適化することができる。
【００９７】 本発明により企図される他の候補阻害剤を設計することができ，これには溶解
性型の結合パートナー，ならびにキメラ，または融合蛋白質等の結合パートナー
が含まれる。本明細書において用いる場合，"結合パートナー"は，上述したよう
な天然の結合パートナーならびにキメラポリペプチド，天然のリガンド以外のペ
プチド調節剤，抗体，抗体フラグメント，および同定されたホスファターゼ遺伝
子の発現産物に免疫特異的な抗体ドメインを含む改変型化合物を広く包含する。
【００９８】 ホスファターゼポリペプチドの特異的ペプチドリガンドを同定するために他の
アッセイを用いることができ，これには，試験リガンドの標的蛋白質への直接結
合の測定により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイ，ならびにイオンスプ
レー質量分析計／ＨＰＬＣ方法を用いてアフィニティー限外濾過により標的蛋白
質のリガンドを同定するアッセイ，または他の物理学的および分析的方法が含ま
れる。あるいは，そのような結合相互作用は，Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９），およびＦｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１
９９４）（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載される酵母ツ
ーハイブリッド系を用いて間接的に評価することができる。ツーハイブリッド系
は２つの蛋白質またはポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝子アッ
セイである。これを用いて，目的とする既知の蛋白質または線引きされたドメイ
ンまたは相互作用に重要な残基に結合する蛋白質を同定することができる。この
方法論の変形が，ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のクローニング，蛋白質
に結合するペプチドの同定，および薬剤のスクリーニング用に開発されている。
ツーハイブリッド系は，１対の相互作用する蛋白質が転写活性化ドメインをレポ
ーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインの近く
に配置させる能力を利用しており，一般に酵母において行われる。アッセイにお
いては，（１）第１の蛋白質に融合されたＤＮＡ結合ドメイン，および（２）第
２の蛋白質に融合された活性化ドメイン，をコードする２つのハイブリッド遺伝
子を構築することが必要である。ＤＮＡ結合ドメインは，第１のハイブリッド蛋
白質をレポーター遺伝子のＵＡＳにターゲティングする。しかし，ほとんどの蛋
白質は活性化ドメインを有していないため，このＤＮＡ結合ハイブリッド蛋白質
はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブ
リッド蛋白質は，ＵＡＳに結合しないため，それ自身ではレポーター遺伝子の発
現を活性化しない。しかし，両方のハイブリッド蛋白質が存在する場合には，第
１の蛋白質と第２の蛋白質との非共有結合的相互作用が活性化ドメインをＵＡＳ
につなぎ，レポーター遺伝子の転写を活性化させる。例えば，第１の蛋白質が，
他の蛋白質または核酸と相互作用することが知られているホスファターゼ遺伝子
産物，またはそのフラグメントである場合，このアッセイを用いて結合相互作用
に干渉する薬剤を検出することができる。異なる試験薬剤を系に添加してレポー
ター遺伝子の発現をモニターする。阻害剤が存在すると，レポーターシグナルが
発生しない。
【００９９】 ホスファターゼポリペプチド遺伝子産物の機能が未知であり，遺伝子産物に結
合するリガンドが知られていない場合においても，酵母ツーハイブリッドアッセ
イを用いて遺伝子産物に結合する蛋白質を同定することができる。ホスファター
ゼポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する蛋白質を同定するアッセイに
おいては，ホスファターゼポリペプチド（またはフラグメント）およびＵＡＳ結
合ドメイン（すなわち，第１の蛋白質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチ
ドを用いることができる。さらに，それぞれが活性化ドメインに融合された異な
る第２の蛋白質をコードする多数のハイブリッド遺伝子を製造し，アッセイにお
いてスクリーニングすることができる。典型的には，第２の蛋白質は総ｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡ融合ライブラリの１またはそれ以上のメンバーによりコード
され，ここで，それぞれの第２の蛋白質のコーディング領域は活性化ドメインに
融合されている。この系は広範な種類の蛋白質に適用することができ，第２の結
合蛋白質の同一性または機能を知ることすら必要ではない。この系は非常に感度
が高く，他の方法では明らかにされない相互作用を検出することができる。過渡
的相互作用であっても，転写を誘発して安定なｍＲＮＡを生成し，これは繰り返
し翻訳されてレポーター蛋白質を生成することができる。
【０１００】 他のアッセイを用いて，標的蛋白質に結合する薬剤を検索してもよい。試験リ
ガンドの標的蛋白質への直接結合を同定する１つのそのようなスクリーニング方
法が，米国特許５，５８５，２７７（本明細書の一部としてここに引用する）に
議論されている。この方法は，蛋白質は一般に折り畳まれた状態と折り畳まれて
いない状態の混合物として存在し，２つの状態の間で継続的に交替しているとい
う原理に基づく。試験リガンドが折り畳まれた形の標的蛋白質に結合する場合（
すなわち，試験リガンドが標的蛋白質のリガンドである場合），リガンドに結合
した標的蛋白質分子は折り畳まれた状態のままである。すなわち，折り畳まれた
標的蛋白質は，標的蛋白質に結合する試験リガンドの存在下で，リガンドの非存
在下におけるよりも多く存在する。リガンドの標的蛋白質への結合は，折り畳ま
れた状態と折り畳まれていない状態の標的蛋白質とを区別する任意の方法により
検出することができる。このアッセイを行うためには，標的蛋白質の機能がわか
っている必要はない。この方法により事実上すべての薬剤，例えば，限定されな
いが，金属，ポリペプチド，蛋白質，脂質，多糖類，ポリヌクレオチドおよび小
有機分子を試験リガンドとして評価することができる。
【０１０１】 標的蛋白質のリガンドを同定する別の方法は，Ｗｉｅｂｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ
．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）（本明細書
の一部としてここに引用する）に記載されている。この手法は，１回に溶液相中
の２０−３０種類の薬剤のコンビナトリアルライブラリを標的蛋白質に対する結
合についてスクリーニングする。簡単な膜洗浄により標的蛋白質に結合する薬剤
を他のライブラリ成分から分離する。次にフィルター上に保持された特定の選択
された分子を標的蛋白質から遊離させ，ＨＰＬＣおよび気体補助エレクトロスプ
レー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析する。この方法は，標的蛋
白質に対して最も高い親和性を有するライブラリ成分を選択し，特に小分子ライ
ブラリについて有用である。
【０１０２】 本発明の好ましい態様においては，ホスファターゼ活性を調節する化合物をス
クリーニングする方法は，試験化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ
，化合物とホスファターゼポリペプチドとの間の複合体の存在についてアッセイ
することを含む。そのようなアッセイにおいては，典型的にはリガンドを標識す
る。適当にインキュベートした後，遊離のリガンドを結合した形のリガンドから
分離する。遊離のまたは複合体を形成していない標識の量は，特定の化合物がホ
スファターゼポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０１０３】 本発明の別の態様においては，ホスファターゼポリペプチドに対して適切な結
合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを用いる。簡単には
，多数の様々な小ペプチド試験化合物を固体支持体上で合成する。ペプチド試験
化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ，洗浄する。次に，結合したホ
スファターゼポリペプチドを当該技術分野においてよく知られる方法により検出
する。精製した本発明のポリペプチドを，上述した薬剤スクリーニング手法にお
いて用いるために，直接プレート上にコーティングすることもできる。さらに，
非中和抗体を用いて蛋白質を捕獲し，これを固体支持体上に固定化することがで
きる。
【０１０４】 本発明の別の態様は，本発明のポリペプチドに結合しうる中和抗体がポリペプ
チドに対する結合について試験化合物と特異的に競合する，競合スクリーニング
アッセイを用いることを含む。このようにして，抗体を用いて，ホスファターゼ
ポリペプチドと１またはそれ以上の抗原性決定基を共有するペプチドの存在を検
出することができる。放射性標識した競合結合実験は，Ａ．Ｈ．Ｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ，１９９７，ｖｏｌ．４１，ｎｏ．１０．ｐｐ．２１２７−２１３１に
記載されており，この開示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０１０５】 別の観点においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配
列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列
番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および
配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるホスファター
ゼの活性を調節する物質を投与することにより疾病を治療する方法を提供する。
好ましくは疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニュ
ーロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，
これらの疾病には，組織，または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系
疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，
認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，
不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症
，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，ア
ルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；
ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または
細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例
えば糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，
例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患
，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性
；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤
疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，
鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１０６】 好ましい態様においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号１３
，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，
配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，お
よび配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸
配列を有するホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を投与すること
により，疾病または疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは，疾
病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾
病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病
には，組織，または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状
態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低
血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分
裂病；躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハ
ンチントン病，またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー
病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，
ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物によ
り引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば，糖尿病
および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再
灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテロー
ム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性
疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多
発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自
己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１０７】 本発明はまた，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列
番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番
号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記
載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファ
ターゼポリペプチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾
患を治療または予防する方法を特徴とする。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連
疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾
患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織，または
造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛
，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血
圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ病，せん
妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病またはツレ
ット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発
性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイ
ルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルス
または非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこれらに関
連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝
固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例え
ば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢
性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，
乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれ
る。
【０１０８】 本発明はまた，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配列
番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番
号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記
載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポ
リペプチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療
または予防する方法を特徴とする。好ましくは，疾病は，免疫関連疾病および疾
患，心臓血管疾病，および癌からなる群より選択される。最も好ましくは，免疫
関連疾病および疾患は，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤
疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，
鼻炎，自己免疫，および臓器移植からなる群より選択される。
【０１０９】 ホスファターゼ関連疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題
とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のイン
ビトロアッセイにおいて陽性の結果を示す（そのようなアッセイの例は，本明細
書において提供され参照される。望ましい活性についてスクリーニングすること
ができる物質の例は，以下に提供され参照される。ホスファターゼの活性を調節
する物質は，好ましくは，限定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチドお
よび以下に参照される方法およびスクリーニングにより決定されるような蛋白質
ホスファターゼの阻害剤を含む。
【０１１０】 "予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能
性を減少させることを表す。
【０１１１】 "治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１１２】 "治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ
）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影
響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は
，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【０１１３】 "異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。
【０１１４】 異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
【０１１５】 異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１１６】 異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファタ
ーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機
能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１１７】 シグナル伝達プロセスにおけるホスファターゼの機能に関連して，"異常な"と
の用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が
野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，
天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋
白質ホスファターゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，
または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを表す。
【０１１８】 "投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【０１１９】 異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０１２０】 別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中に
おいてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（
ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号１３，配列番
号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号
１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列
番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有
するホスファターゼポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プロ
ーブと接触させ，ここで，前記プローブは，ポリペプチド，そのフラグメントを
コードする核酸配列，および配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（
ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出す
る， の各工程を含む。
【０１２１】 本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，動
脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的
ストレス関連神経変性性疾患，および癌からなる群より選択される。
【０１２２】 ホスファターゼ"標的領域"とは，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列
番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列
番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より
選択されるヌクレオチド塩基配列，または核酸プローブが特異的にハイブリダイ
ズするであろう対応する全長配列，その機能的誘導体，またはそのフラグメント
である。特異的なハイブリダイゼーションとは，他の核酸の存在下において，プ
ローブが本発明のホスファターゼの標的領域にのみ検出可能なようにハイブリダ
イズすることを示す。予測標的領域は，当該技術分野においてよく知られる，デ
ータベース中の最も近い関連配列のアラインメントおよび比較からなる方法によ
り同定することができる。
【０１２３】 好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号１３，配列番号１４，配
列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列
番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に
記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列またはそれらの機能
的誘導体からなる群より選択される配列の，少なくとも６，１２，７５，９０，
１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連続するア
ミノ酸をコードするホスファターゼ標的領域にハイブリダイズする。ハイブリダ
イゼーション条件は，他の核酸分子の存在下でホスファターゼ遺伝子とのみハイ
ブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダ
イズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に
１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
そのような条件は上で定義される。
【０１２４】 試料中のホスファターゼ遺伝子の検出により診断することができる疾病には，
ホスファターゼ核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅
されている疾病が含まれる。"増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でホスフ
ァターゼＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。正常細胞にお
いては，ホスファターゼは典型的には１コピーの遺伝子として見いだされる。選
択された疾病においては，ホスファターゼ遺伝子の染色体位置が増幅されて，遺
伝子の多数のコピーまたは増幅が生ずる。遺伝子増幅は，そのようなホスファタ
ーゼＲＮＡを増幅させることができ，またはホスファターゼＲＮＡはホスファタ
ーゼＤＮＡの増幅なしに増幅することができる。
【０１２５】 ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてホスファターゼＲＮＡが検出可
能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ホスファターゼ
ＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，ホスファターゼ
の発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと
比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い，ホスファターゼＲＮＡ
の検出である。
【０１２６】 試料中のホスファターゼ核酸の検出により診断することができる疾病には，好
ましくは癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，
細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用い
られる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細
胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法
は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るた
めに容易に適合させることができる。
【０１２７】 別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中の
ホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試
料中のホスファターゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を，ホスファター
ゼポリペプチド，またはその１またはそれ以上フラグメントをコードする対照核
酸標的領域と比較し，ここで，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号１３，
配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配
列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，およ
び配列番号２４に記載される配列，またはその１またはそれ以上フラグメントか
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有しており；そして（ｂ）標的領域と対
照標的領域との間の配列または量の相違を疾病または疾患の指標として検出する
ことを含む。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病
，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。
より詳細には，これらの疾病には，組織，または造血細胞起源の癌；中枢神経ま
たは末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障
害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的
疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞お
よび運動異常症，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾
病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮
性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体ま
たは真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；
代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，
心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されな
い細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症
，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病
，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテロー
ム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１２８】 本明細書において用いる場合，"比較する"との用語は，試料から単離された核
酸標的領域と対照核酸標的領域との間の不一致を同定することを表す。不一致は
，ヌクレオチド配列における，例えば挿入，欠失，または点突然変異であっても
よく，または所定のヌクレオチド配列の量におけるものであってもよい。配列に
おけるこれらの不一致を判定する方法は当業者にはよく知られている。"対照"核
酸標的領域とは，正常細胞，例えば，先に記載したような疾病を有しない細胞に
おいて見いだされる配列または配列の量を表す。
【０１２９】使用方法 ヒト蛋白質ホスファターゼの部分アミノ酸配列は，配列番号１，配列番号２，
配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される核
酸配列によりコードされる。
【０１３０】 これらの配列は，推定される蛋白質ホスファターゼのそれぞれの全長クローン
を見いだすために用いられる。これらのクローンは，コードされる蛋白質ホスフ
ァターゼの触媒活性を阻害し，以下の疾病の治療に潜在的有用性を有する小分子
化合物のスクリーニングに有用であろう：組織または血液の癌，例えば，乳，結
腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌；中枢神経または末
梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注
意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，
例えば不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動
異常症，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば
アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症
；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌また
は細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，
例えば糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，
例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，
アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；
炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病
，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎
，自己免疫，および臓器移植拒絶。
【０１３１】 上述した本発明の概要は限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点
は，以下の本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１３２】図面の簡単な説明 図１Ａ−Ｈは，ヒト蛋白質ホスファターゼのヌクレオチド配列を示す（配列番
号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番
号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，および配列番号
１２）。
【０１３３】 図２Ａ−２Ｃは，配列番号１−配列番号１２によりコードされるヒト蛋白質ホ
スファターゼのアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号１３，配列番号１４
，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，
配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２
４）。いくつかの配列はコーディング領域中で推定終止コドンをコードしており
，これは’ｘ’で示される。
【０１３４】発明の詳細な説明 本発明は，新規なポリペプチド，これらのポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列の単離および特徴付け，種々のポリペプチド関連疾病および状態，例え
ば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するのに用いることができる種々の
産物およびアッセイ方法に関する。ポリペプチド，好ましくはホスファターゼ，
およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は，本明細書に記載される配列
が与えられれば，よく知られる標準的な合成手法を用いて製造することができる
。以下の表１−８を参照すると，本発明の遺伝子をより理解することができる。
本発明はさらに，多数の異なる態様，例えば以下に記載される態様を提供する。
【０１３５】核酸 マップされた遺伝子の染色体の位置と癌における関与が示唆されているアンプ
リコンとの関連づけは，文献検索（ＰｕｂＭｅｄｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ），ＯＭＩ
Ｍ検索（ＯｎｌｉｎｅＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｉｎＭａｎ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａ
ｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）およびＫｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．により維持
されている癌アンプリコンの包括的データベース（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａ
ｌ．，ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉ
ｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ １５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／−ｌｅｌｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）に基づく。
マップされた遺伝子の多くについて，Ｋｎｕｕｔｉｌａからの細胞遺伝学的領域
が示されており，続いて，増幅が報告されている事例の数および調べた事例の総
数が示されている。すなわち，以下のＳＧＰ００６については，登録物"膀胱癌
腫（１２ｑ２１−ｑ２４，１／１６）"とは，染色体位置の１２ｑ２１−ｑ２４
が非小細胞肺癌に関連づけられており，これは，ＳＧＰ００６の位置を包含し，
調べた１６例の試料中の１例で増幅が認められたことを意味する。
【０１３６】 一塩基多型については，ＮＣＢＩで維持されているｄｂＳＮＰ（一塩基多型の
データベース）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）においてＳＮＰが記録されている場合に，受託
番号（例えば，ＳＧＫ１８７についてはｓｓ１５８１６２４）が与えられる。Ｓ
ＮＰについての受託番号を用いて，このサイトから完全ＳＮＰ含有配列を引き出
すことができる。ｄｂＳＮＰ受託番号を有しない候補ＳＮＰｓは，本明細書の配
列のｃＤＮＡおよびゲノムデータベースに対するＢｌａｓｔｎ出力を調べること
により同定した。これは，例えば，表７および８に示され，実施例１において記
載される。
【０１３７】核酸プローブ，ホスファターゼを検出するための方法およびキット 本発明はさらに，核酸プローブおよびその用途を提供する。本発明の核酸プロ
ーブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染色体またはｃ
ＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得ることができる。染色
体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野において認識されている方
法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，第２版．Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９を参照）。
【０１３８】 別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端，およ
びＣ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化
学合成を行うことができる。合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にした
がって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当
な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ること
ができる。
【０１３９】 当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知ら
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いて，そのようなプ
ローブを容易に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハ
イブリダイゼーションプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素
標識，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標
識することができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用い
て可視化することができる。
【０１４０】 本発明の核酸プローブはＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含み，そのようなプ
ローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸
プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例とし
ては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物
，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアク
リルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体
支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【０１４１】 本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１４２】 試料中で本発明の核酸の存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハイ
ブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そ
して（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む
。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核
酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組
織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１４３】 試料中で本発明の核酸の存在を検出するためのキットは，その中に上述の核酸
プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以
下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合
した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，
限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，
アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。好ましくは，キットはさ
らに使用の指針を含む。
【０１４４】 詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れら
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１４５】本発明にしたがうポリペプチドの分類 本発明の多数の蛋白質ホスファターゼについて，これが属する蛋白質クラスお
よびファミリーの分類，非触媒的蛋白質モチーフの概要，ならびに染色体位置が
提供される。この情報は，各蛋白質についての機能，制御および／または治療的
有用性を決定するのに有用である。染色体領域の増幅を種々の癌と関連づけるこ
とができる。本明細書において議論されるアンプリコンについては，情報源はＫ
ｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ（Ｋｎｕｕｔｉｌａ Ｓ，Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔ
Ａ−Ｍ，Ａｕｔｉｏ Ｋ，Ｔａｒｋｋａｎｅｎ Ｍ，Ｗｏｌｆ Ｍ，Ｍｏｎｎｉ
Ｏ，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ Ｊ，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ ＭＬ，Ｔａｐｐｅｒ
Ｊ，Ｐｅｒｅ Ｈ，Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ Ｗ，Ｈｅｍｍｅｒ Ｓ，Ｗａｓｅｎｉｕ
ｓ Ｖ−Ｍ，Ｖｉｄｇｒｅｎ Ｖ＆Ｚｈｕ Ｙ：ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅ
ｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５２：１１０７−
１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／〜ｌｇ
ｌ＿ｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）であった。
【０１４６】 ホスファターゼ分類および蛋白質ドメインは，しばしば，経路，細胞での役割
，または上流または下流の制御のメカニズムを反映する。また，疾病関連性遺伝
子は，しばしば関連する遺伝子のファミリーにおいて生ずる。例えば，ホスファ
ターゼファミリーの１つのメンバーがオンコジンまたは腫瘍サプレッサーとして
機能する場合，または，免疫，神経，心臓血管，または代謝性疾患において破壊
されていることが見いだされている場合，他のファミリーメンバーはしばしば関
連する役割を果たすであろう。
【０１４７】 染色体位置は，腫瘍アンプリコンまたは腫瘍サプレッサー遺伝子座についての
候補標的を同定することができる。有力な腫瘍アンプリコンの概要は文献から入
手可能であり，隣接する領域に位置するホスファターゼ遺伝子の増幅されたコピ
ーを含むことを実験的に確認すべき腫瘍タイプを同定することができる。
【０１４８】 本発明のポリペプチドのより詳細な特性決定，例えば潜在的な生物学的および
臨床的意味は，例えば実施例２および３に提供される。
【０１４９】ホスファターゼ活性を示すポリペプチドの分類 本明細書に記載されるポリペプチドは，以下のグループのいずれかに属するこ
とができる：（１）蛋白質ホスファターゼの二重特異性グループ（ＤＳＰ）；（
２）セリン−トレオニンホスファターゼ（ＳＴＰ）；または（３）蛋白質チロシ
ンホスファターゼ（ＰＴＰ）。この分類は，少なくとも部分的には，このクラス
のホスファターゼの触媒ドメインを構築している保存されたコアアミノ酸配列モ
チーフによる。
【０１５０】ＤＳＰグループ 二重特異性クラスのホスファターゼの触媒ドメインの独特の特徴的モチーフは
これらの酵素がホスホセリン／ホスホトレオニン，ならびにホスホチロシン残基
を脱リン酸化する能力を担う。蛋白質ホスファターゼの二重特異性グループには
，ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）のファミリーメンバーが含まれる。
ＭＫＰファミリーの構造的および機能的特徴は以下に記載される。
【０１５１】ＭＫＰファミリー 本明細書に記載される新規ＭＫＰ様ホスファターゼは，ＳＧＰ００６（配列番
号１），ＳＧＰ００２（配列番号２），ＳＧＰ００１（配列番号３），ＳＧＰ０
１８（配列番号４），ＳＧＰ００３（配列番号５），ＳＧＰ０１４（配列番号６
），ＳＧＰ０６０（配列番号７），およびＳＧＰ００８（配列番号８）を含み，
これらは例えば表１−６および実施例２により詳細に開示される。
【０１５２】 二重特異性ホスファターゼファミリーには，約２０個の既知のヒトメンバーが
含まれる（一覧については，ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇ．ｄｅ／ｓｍａｒｔ／ｇｅｔ＿ｍｅｍｂｅｒｓ．ｐｌ？ＷＨＡＴ＝ｓｐ
ｅｃｉｅｓ＆ＮＡＭＥ＝ＤＳＰｃ＆ＷＨＩＣＨ＝Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓを参
照）。二重特異性ホスファターゼのＭＰＫファミリーのよく知られるメンバーに
は以下のものが含まれる：ＤＵＳ１（ＭＰＫ−１，ＣＬ１００，ＰＴＰＮ−１０
，ｅｒｐ，ＶＨ１または３ＣＨ１３４としても知られる），ＤＵＳ３（ＶＨＲと
しても知られる），ＤＵＳ４（ＨＶＨ２，ＴＹＰ１，ＭＫＰ２またはＶＨ２とし
ても知られる），ＤＵＳ５（ＨＶＨ３，Ｂ２３，ＶＨ３としても知られる），Ｄ
ＵＳ６（ＰＹＳＴ１，ＭＫＰ３，ｒＶＨ６としても知られる），ＤＵＳ７（ＰＹ
ＳＴ２としても知られる），ＣＤＫＮ３（ＣＤＫＮ３，ＫＡＰ，ＣＩＰ２または
ＣＤＩ１としても知られる），ＶＨ５およびＳＴＹＸ。
【０１５３】 ほとんどのＭＫＰホスファターゼは，脱リン酸化反応により，ＭＡＰＫ経路に
関与するキナーゼを不活性化することができる。ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キ
ナーゼ），ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ／ストレス活性化蛋白
質キナーゼ）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は，細胞外リガンドに応答して，
細胞分裂，分化またはアポトーシスを担うシグナル伝達事象を媒介する（Ｃｏｂ
ｂＭＨ，Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；７１（３−
４）：４７９−５００）。完全なＭＡＰキナーゼ酵素活性には，選択的上流二重
特異性キナーゼによる，ＭＡＰキナーゼの活性ループに存在するトレオニンおよ
びチロシン残基の同時リン酸化が必要である。ＭＫＰファミリー二重特異性ホス
ファターゼは，これらのトレオニンおよびチロシン残基を脱リン酸化することに
よりＭＡＰキナーゼの活性を媒介する。このメカニズムは，ＭＡＰキナーゼ経路
の負のフィードバック制御を提供する。ＭＫＰは，細胞トランスフォーメーショ
ンに関与するＭＡＰキナーゼカスケードを弱体化させることにより，ヒト癌にお
いて重要な役割を果たすかもしれない。
【０１５４】 多数のＭＡＰキナーゼ，ならびにＭＫＰが存在するが，中心となる疑問は，Ｍ
ＫＰによるキナーゼ基質認識において選択性が存在するか否かである。そのよう
な特異性が存在するという証拠は，ＤＵＳ−６（ＭＫＰ３）およびＶＨ５により
提供される。これらは，それぞれＥＲＫまたはＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８Ｍ
ＡＰキナーゼに対して高度に選択的なホスファターゼであることが示されている
（Ｍｕｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｎｏｖ１
；２７１（４４）：２７２０５−８．）。別のレベルの基質特異性は，ＤＵＳ−
６（ＭＫＰ３）により示されるように，細胞内コンパートメント化により生ずる
。これは，核ではなく細胞質においてのみ見いだされる（Ｇｒｏｏｍ，Ｌ．Ａ．
ｅｔ ａｌ（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３６２１−３６３２）。さらに，
特異性は，発現の組織特異性のレベルからも生じうる（例えば，Ｍｕｄａ，Ｍ．
ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５１４１−５１５１
）。
【０１５５】 ＭＡＰキナーゼ対応物の多数のメンバーが酵母（例えばＹＶＨ１），Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓ（例えばＹ０４２），ショウジョウバエ（例えばｐｕｃｋｃｅｒｅｄ
），植物（例えばＤｓＰＴＰｌ）および哺乳動物に存在するように，ＭＫＰは，
系統発生的分布において普遍的であるようである。多様な種から単離されたＭＫ
Ｐの主要な作用モードは，ＭＡＰＫを脱リン酸化し，このことによりＭＡＰＫシ
グナル伝達経路に負のフィードバックを提供することである。ＭＫＰは，低酸素
条件下でＭＫＰ−１遺伝子発現が誘導されることから示唆されるように，病態生
理学的低酸素の間に重要な役割を果たしているかもしれない（Ｌａｄｅｒｒｏｕ
ｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２８９０−１
２８９７）。腫瘍の低酸素は，悪性発達の間の脈管形成の開始に直接連鎖してい
る（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：３５３−３
６４およびＭａｚｕｒｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５６：３４３６−３４４０）。低酸素状態の間に多くの遺伝子が誘導される
ことが見いだされている：例えば熱ショック転写因子−１（ＨＳＦ−１）（Ｂｅ
ｎｊａｍｉｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８７：６２６３−６２６７），ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ（Ａｕ
ｓｓｅｒｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１４：５０３２−５０４２，およびＭｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２３４３５−２３４３９），および低酸素誘導可能
因子−１（ＨＩＦ−１）（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：６０９−６１６）。ＭＫＰ−１の転写産物および
蛋白質は，初期癌腫，ならびに乳および前立腺癌腫の多くの段階でアップレギュ
レートされることが示されている（Ｌｅａｖ，Ｉ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：３６１−３７０）。前立腺腫瘍細胞株におけるＭＫＰ
−１の過剰発現は，Ｆａｓリガンド誘導性アポトーシスに対する耐性を付与し（
Ｓｒｉｋａｎｔｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１９９：１６９−１７８），ＭＫＰ−１がアポトーシスの阻害に寄与し
，アンドロゲン非依存性増殖をもたらすことが示唆されている。ＭＫＰ−１はま
た，抗新生物剤，例えばシスプラチンおよびカンプトテシンにより引き起こされ
るアポトーシスの誘導を阻害することができる（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，
Ｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：５１４２−５１５２；
Ｃｏｓｔａ Ｐｅｒｅｉｒａ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ ８２：１８２７−１８３４）。低酸素状態はＪＮＫ経路の活性化を
介してアポトーシスを誘発し（Ｉｐ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０５−２１９に概説），ＭＡＰＫホ
スファターゼはこの経路に負のフィードバックを与えることが知られているため
，ＭＫＰ−１はアポトーシスを妨害することにより腫瘍成長を支持することが予
測される。ＭＫＰ−１の過剰発現はコトランスフェクションした腫瘍細胞におい
てＳＡＰＫ／ＪＮＫの低酸素誘導性活性を妨害する（Ｌａｄｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ
．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２８９０−１２８９７
）。
【０１５６】 ＭＡＰＫホスファターゼによるＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２の脱リン酸化およ
び続く不活性化は，アンジオスタチンによる脈管形成性血管内皮細胞増殖の抑制
を担うかもしれない（Ｒｅｄｌｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖａ
ｓｃ．Ｒｅｓ ３６：２８−３４）。
【０１５７】 本発明に示される新規ＭＰＫファミリーホスファターゼは，その主要な機能と
してＭＡＰＫシグナル伝達の負のフィードバック制御を有するようであるホスフ
ァターゼの，大きくなりつつあるリストに寄与する。既知のＭＰＫの間では基質
認識のレベルでの作用メカニズムにおける選択性，細胞内局在および組織分布が
知られているため，本明細書に記載される新規ＭＰＫは，同様の選択性を示すか
もしれない。新規ＭＰＫはまた，ＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路を遮断することにより，
病因的低酸素症，例えば脈管形成腫瘍において生ずるようなものにおいて，アポ
トーシスの抑制において役割を果たすかもしれない。抗アポトーシス性ＭＫＰを
標的とする特異的ホスファターゼ阻害剤の開発は，癌治療の方法として価値を有
するであろう。
【０１５８】ＰＴＰグループ 本発明には，２つのＰＴＰ様配列が存在する：ＳＧＰ０１２（配列番号１１）
およびＳＧＰ０２４（配列番号１２）であり，これらは例えば表１−６および実
施例２により詳細に開示される。
【０１５９】 ＳＧＰ０１２は，ネズミＯＳＴ−ＰＴＰ（ＰＴＰ−ＥＳＰとも称される）と密
接に関連する。骨精巣ＰＴＰ（ＯＳＴ−ＰＴＰ）は，１０個のフィブロネクチン
タイプＩＩＩ反復，潜在的膜スパニング領域および２つのタンデム触媒ドメイン
からなる細胞内ドメインを有する予測レセプター蛋白質チロシンホスファターゼ
である。発現パターンは非常に限定的であり，主として骨および精巣において検
出可能である（Ｍａｕｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１９９６２６
９：３０６５９−６７）。ＯＳＴ−ＰＴＰのリガンドは知られていないが，細胞
外ドメインの構造は，細胞−細胞相互作用が関与しているかもしれないことを示
唆する。重要なことには，ヒトオルトログはまだクローニングされていない。
【０１６０】 骨の沈着と吸収のバランスは，２つの細胞タイプ，すなわち，骨芽細胞と破骨
細胞との相対的な活性により制御される。骨代謝におけるホスファターゼの潜在
的役割は，不完全にしか理解されていない。しかし，骨芽細胞の培養物において
は，オルトバナジン酸でＰＴＰ活性を阻害するとマトリックス形成が促進される
（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １８８−１２３：２８５
８−６７）。さらに，過剰な吸収を伴う骨疾病を治療するために臨床的に使用さ
れているビスホスホネートは，骨芽細胞の培養物に，骨芽細胞分化，アルカリホ
スファターゼ活性，タイプＩコラーゲン分泌，および鉱化作用等の骨沈着の増加
と一致するある範囲の変化を引き起こす（Ｒｅｉｎｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００ ６０：６００１−００７）。これらの
化合物の分子標的は依然として不明であるが，ＯＳＴ−ＰＴＰ活性の阻害は，骨
芽細胞培養において観察される骨形成活性の増加を担うようである。したがって
，ＯＳＴ−ＰＴＰ活性を標的とすることは，骨粗鬆症，治癒しない骨折，および
骨代謝の他の疾患の治療を提供することができる。
【０１６１】 ＳＧＰ０２４はＰＴＰ−デルタに関連する部分ＰＴＰＴ触媒ドメインを示す。
【０１６２】ＳＴＰグループ 本発明には，２つのＳＴＰ蛋白質が存在する：ＳＧＰ０３９（配列番号９）お
よびＳＧＰ０４０（配列番号１０）であり，これらは例えば表１−６および実施
例２いより詳細に開示される。
【０１６３】 セリン−トレオニンホスファターゼは，ＰＰ１，ＰＰ２Ａ，ＰＰ２Ｂ，および
ＰＰ２Ｃで表される４つの主要なクラスに分けることができる。ＰＰ２ａは多制
御サブユニットに付随して見いだされ，その不活性化はウイルス成分，例えばス
モールＴ抗原によるトランスフォーメーションにつながりうる。制御サブユニッ
トの１つにおける変異は結腸直腸癌に関連づけられており，腫瘍サプレッサーと
しての役割と一致する（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ ２０００ ４７：
２６８−７１）。最近，ＰＰ２ａはＴリンパ球の活性化における関与が示唆され
ている（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００ １３：３１
３−２２）。ＰＰ１は，種々の細胞機能，例えば低酸素症に対する応答，アポト
ーシスおよび細胞質分裂における関与が示唆されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０００ ９７：１２０９１−９６，Ａｙｌｉｏｎ ｅｔ
ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２０００ １９２２３７−４６，Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００ ６８：１３５０−５８）。最後に，糖尿
病ラットにおける研究は，対照と比較して低下したＰＰ１活性および上昇したＰ
Ｐ２Ａ活性を示す（Ｂｅｇｕｍ ａｎｄ Ｒａｇｏｌｉａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ １９９８ ４７：５４−６２）。セリン／トレオニンホスファターゼの活性
に及ぼす制御サブユニットの多様性のため，新規メンバーの生物学的機能は予測
することが困難である。しかし，研究から，種々の疾病，例えば腫瘍発生，炎症
性疾病および代謝性疾病における改良の可能性が示唆される。
【０１６４】本発明にしたがう治療方法： 診断： 本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中のポリペプチドを検出す
る方法を提供する。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ
条件下で，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番
号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号
２２，配列番号２３，および配列番号２４からなる群より選択されるポリペプチ
ドの核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブ
は，ポリペプチドをコードする核酸配列，そのフラグメント，および配列の相補
体およびフラグメントを含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの
存在または量を疾病の指標として検出する，の各工程を含む。
【０１６５】 本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，ア
テローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎
不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性疾患，例えば糖尿病，生殖疾
患，例えば不妊症，および癌からなる群より選択される。
【０１６６】 ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の存在下においてその遺伝子と
のみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハ
イブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防
止する。そのような条件は上で定義される。
【０１６７】 試料中の遺伝子の検出により診断することができる疾病には，核酸（ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"
増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加して
いることを意味する。
【０１６８】 ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてＲＮＡが検出可能なように存在
することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためで
ある。他の正常細胞においては，発現の基底レベルが存在し，したがってこれら
の場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれよ
り多い検出である。
【０１６９】 試料中の核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは，癌が
含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細
胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は
，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出
物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術
分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に
適合させることができる。
【０１７０】抗体，ハイブリドーマ，ホスファターゼの検出のための使用方法およびキット 本発明は，本発明のホスファターゼに対して結合親和性を有する抗体に関する
。ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６
，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，
配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列，
またはその機能的誘導体，またはその少なくとも９個の連続するアミノ酸（好ま
しくは，その少なくとも２０，３０，３５，または４０個の連続するアミノ酸）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することができる。
【０１７１】 本発明はまた，本発明のホスファターゼに対して特異的結合親和性を有する抗
体に関する。そのような抗体は，本発明のホスファターゼに対するその結合親和
性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単離することが
できる。本発明のホスファターゼに選択的に結合する抗体を，本発明のホスファ
ターゼと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるた
めに選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他のポリペ
プチドを含む組織におけるホスファターゼ発現の変化の分析が含まれる。
【０１７２】 本発明のホスファターゼは，種々の手順および方法，例えば抗体の生成，医薬
組成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができ
る。
【０１７３】 本発明のホスファターゼは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用い
ることができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細
書に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識する
であろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，
ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗
体のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野におい
て知られる手法の１つを用いて生成することができる。
【０１７４】 本発明はまた，上述のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを産生
するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を
分泌することができる不死化細胞株である。
【０１７５】 一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【０１７６】 ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０１７７】 モノクローナル抗体については，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエロ
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリ
ドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスお
よびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０１７８】 ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８−，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９−，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５−，１９７６を参照。本発明の
標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用い
て，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【０１７９】 上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【０１８０】 さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０１８１】 抗ペプチドペプチドは，本発明のホスファターゼのペプチド配列中に見いださ
れる塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基
で置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，
および／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え
，およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える
。
【０１８２】 本発明はまた，試料中においてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を
包含する。該方法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述
の抗体と接触させ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出
する，ことを含む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明
の抗体とインキュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイするこ
とを含む。試料中で本発明のホスファターゼのレベルが正常なレベルと比較して
変化していることは疾病を示すかもしれない。
【０１８３】 抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０１８４】 本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１８５】 キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１ま
たはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検
出しうる試薬。
【０１８６】 検出試薬の例には，限定されないが，標識二次抗体が含まれ，あるいは，一次
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０１８７】ホスファターゼと相互作用する化合物の単離 本発明はまた，本発明の蛋白質ホスファターゼに結合しうる化合物を検出する
方法に関する。該方法は，化合物を本発明のホスファターゼとともにインキュベ
ートし，ホスファターゼに結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物
は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していても
よい。
【０１８８】 本発明はまた，ホスファターゼの活性またはホスファターゼの結合パートナー
の活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は，
本発明のホスファターゼを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし，
ホスファターゼ活性またはホスファターゼ結合パートナーの活性のレベルの変化
を検出することを含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示
す活性の変化を生ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液
，または細胞抽出物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，
当該技術分野においてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【０１８９】ポリペプチド活性の調節： 本発明はさらに，治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，配
列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列
番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，からな
る群より選択されるポリペプチド，その機能的誘導体，およびそのフラグメント
の活性を調節する物質を投与することにより，疾病または異常な状態を治療する
方法を提供する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬
化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的スト
レス関連神経変性性疾患，代謝性および生殖疾患，および癌からなる群より選択
される。
【０１９０】 疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾
患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のアッセイにおいて陽性の
結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されない
が，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質ホスファターゼの阻害剤を含
む。
【０１９１】 "予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能
性を減少させることを表す。
【０１９２】 "治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１９３】 "治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ
）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影
響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は
，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【０１９４】 "異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。異常な状態にはまた，変則的な細胞サイクル進行，す
なわち有糸分裂および減数分裂を通る正常な細胞サイクル進行が変則的であるこ
とが含まれる。
【０１９５】 異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
【０１９６】 異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１９７】 異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファタ
ーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機
能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１９８】 シグナル伝達プロセスにおけるホスファターゼポリペプチドの機能に関連して
，"異常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，そ
の触媒活性が野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異
しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異してい
るか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されな
いか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを
表す。
【０１９９】 "投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【０２００】 異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０２０１】ホスファターゼ関連活性の促進またはアンタゴナイズ 本発明はまた，哺乳動物において本発明の標的および天然の結合パートナーに
関連する活性をアゴナイズ（促進）するかまたはアンタゴナイズする方法を含む
。該方法は，前記哺乳動物に，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配
列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列
番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，その機能的誘導体，お
よびそのフラグメントに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズ
ムまたはアンタゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。本発明は
また，ホスファターゼに関連する機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするの
に十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む
，哺乳動物において，上述のポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニス
トを用いて疾病を治療する方法を含む。
【０２０２】 治療を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定の疾病状態との関連性を評価
することができる。本発明の１つの態様にしたがえば，マイクロアレイ発現分析
を実施して，本発明にしたがう種々のホスファターゼ遺伝子の発現プロファイル
を確立し，このことにより，その発現がある種の疾病状態と相関する遺伝子を同
定することができる。
【０２０３】 種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されているため，そのよ
うな治療は，広範な範囲の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管
疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビ
ウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病お
よび過誤腫について実施することができる。特に重要なものは，種々のタイプの
癌の治療である。したがって，本発明は，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部
癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫
瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌等の病理を治療する方
法を提供する。
【０２０４】 例えば，種々の組織起源のＲＮＡ試料から作成したｃＤＮＡをナイロン膜にス
ポットし，目的とするホスファターゼ遺伝子に由来する放射性標識プローブでハ
イブリダイズさせた。実施例３および表５を参照すると，用いたホスファターゼ
遺伝子配列には，以下のものが含まれる：配列番号４，配列番号５および配列番
号７。下記の表５の記載において議論されているように，正常組織，腫瘍組織，
種々の細胞株，およびＰ５３野生型および変異型からの試料を用いて，発現アレ
イを作成した。実施例３に示されるように，種々の組織起源および細胞株におけ
る試験したホスファターゼ遺伝子の相対的遺伝子発現レベルは，ハイブリダイズ
したシグナルのＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染色を測定することにより定量した
。表に記録される数値の読みは，バックグラウンド計数を引いた後，ｄｓｃＤＮ
Ａまたは変性プローブからのハイブリダイゼーション結果に対して標準化した。
【０２０５】 表５の意味のある発現レベルは，本明細書に提供される対応する核酸およびア
ミノ酸配列の情報とともに，種々の組織起源における目的とするホスファターゼ
遺伝子の発現プロファイルを構成する。そのような発現プロファイルデータは，
本発明にしたがう治療計画に対する指針を与える。例えば，表５の試料，"Ｍ１
４"細胞株（悪性黒色腫）を参照すると，配列番号４の発現のレベルはゼロであ
る。配列番号７の発現のレベル（５８）は下限に近い。しかし，配列番号５の発
現のレベル（２，５２８）は，有意により高い。そのような横の比較により，配
列番号５によりコードされるホスファターゼ遺伝子が黒色腫に関与するであろう
ことが明らかとなる。すなわち，この遺伝子の機能活性を操作することは，悪性
黒色腫の癌性の状態に影響を与えるかもしれない。例えば，配列番号５（ＳＧＰ
００３）は，配列番号１７（ＭＫＰファミリーに属する蛋白質，表１に示される
）をコードする。したがって，悪性黒色腫に関連する癌状態を治療する方法は，
例えば，この癌に罹患した患者に，配列番号１７により表される蛋白質のホスフ
ァターゼの活性を調節することができる薬剤を投与することでありうる。したが
って，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される治療方法に特異
性および有効性を付与する。
【０２０６】 実施例３に記載される方法と類似の方法において生成された発現データに基づ
いて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができることが理解され
るであろう。これらの方法は上述の議論に基づいて当業者には明らかであり，し
たがって，本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および相関分析か
ら導かれる推論を用いて，本発明にしたがう治療方法または投与計画を具体化す
ることができる。例えば，正常組織および疾病組織の試料の対を用いて発現アレ
イを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどのホスファター
ゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このことにより，本
発明にしたがう治療方法の標的を形成するであろう。すなわち，インビボまたは
インビトロのいずれかでこれらの活性を制御することができる調節剤または薬剤
を同定することができ，所定の疾病状態の治療において用いることができる。
【０２０７】 本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，本明細書に開示され
るホスファターゼ遺伝子配列から誘導されるヌクレオチドプローブ，例えば本明
細書に記載されるものを用いて，試料中においてホスファターゼを検出する方法
が提供される。種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されている
ため，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，
パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症
候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過
誤腫について，そのような診断の尺度を用いることができる。特に重要なものは
，種々のタイプの癌の診断である。本発明の診断方法を用いて，乳癌，尿生殖器
癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細
胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌
について試験することができる。
【０２０８】 同様の特徴において，正確な診断を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定
の疾病状態との関連性の程度を判定することは有用である。そのような判定は，
本発明の１つの態様にしたがってマイクロアレイ発現分析を実施することにより
行うことができる。その発現がある種の疾病状態と関連するホスファターゼ遺伝
子は，上述した方法により同定することができる。
【０２０９】 マイクロアレイデータから得られたデータはまた，特定の病因に罹患している
かもしれない患者を診断するのに用いることができる。したがって，本発明にし
たがって黒色腫に関連する癌状態を診断する方法は，試験試料（患者から集める
ことができる）を配列番号１７により表される蛋白質をコードする核酸配列とハ
イブリダイズすることができるヌクレオチドプローブと接触させ；次に，ハイブ
リダイズしたプローブ：標的の対の存在を検出し，神経芽細胞腫に関連する癌状
態の指標としてそのようなハイブリダイゼーションのレベルを定量することであ
る。すなわち，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される診断方
法に特異性および有効性を付与する。
【０２１０】 上述したように，本明細書に記載される方法と類似の方法において生成された
発現データに基づいて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができ
る。これらも必然的に本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および
相関分析から導かれる推論を用いて，本発明にしたがう診断方法を具体化するこ
とができる。注目すべき１つのシナリオは，正常組織と疾病組織の試料の対を用
いて発現アレイを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどの
ホスファターゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このこ
とにより，上述の診断方法において用いられる診断マーカーとして働くことがで
きる。
【０２１１】 本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，試料中でホスファタ
ーゼを検出する別の方法が提供される。該方法は，本発明に開示されるホスファ
ターゼ遺伝子，例えば図２に挙げられるアミノ酸配列をコードする遺伝子の核酸
標的領域を制御領域と比較し；そして次に，標的領域と制御領域との間の配列ま
たは量の相違を，疾病または疾患の指標として検出することを含む。この方法は
また，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，
パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症
候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過
誤腫の診断に用いることができる。特に重要なものは種々のタイプの癌の診断で
ある。上述の診断方法において述べたように，この特定の方法を同様に用いて，
乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小
細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，
および甲状腺癌について試験することができる。
【０２１２】 標的領域は，ホスファターゼ遺伝子中の目的とする任意の特定の領域であるこ
とができ，例えば，上流の制御領域が含まれる。ホスファターゼのファミリーに
おいては，上流の制御領域の配列の変動はしばしば機能的な関連性を有しており
，そのいくつかは，ある種の疾病状態を引き起こすのに重要であるかもしれない
。ある種のホスファターゼ遺伝子における標的領域の量の変化，例えば，レセプ
ター結合部位等の制御領域のコピー数の変化もまた，機能的分化のメカニズムを
表し，したがって，ある種の疾病状態と関連しているであろう。したがって，標
的領域の配列および量を対照領域と比較してそのような相違を検出することは，
疾病状態の検出に有効につながるであろう。
【０２１３】 本発明の１つの態様においては，マイクロアレイ実験を用いて，疾病状態と１
組のホスファターゼ遺伝子の間の標的領域の変動との間の潜在的な関連性を同定
することができる。例えば，目的とするホスファターゼ遺伝子の，それぞれ所定
の標的領域および対照領域に対応する核酸プローブを作成することができる。正
常組織および疾病組織からの試料を用いて，上でおよび実施例３で議論されるよ
うに，マイクロアレイを作成することができる。このように作成されたアレイに
これらのプローブをハイブリダイズさせることにより，目的とする領域の正常お
よび疾病状態における比較プロファイルが得られ，標的領域と対照領域との，問
題とする疾病に特徴的な相違の定義を導くことができる。次に，そのような定義
は，本発明にしたがう副次的に言及される診断方法において用いられるような，
疾病状態の指標として働くことができる。多くの同等または類似の方法を用いて
，この方法にしたがう診断を実施することができることが理解されるであろう。
これらは，本明細書に提供される実施例に基づいて当業者には明らかであり，し
たがって，本発明の範囲内に含まれる。
【０２１４】 疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は
，蛋白質ホスファターゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた
。いくつかの小さい有機分子は蛋白質ホスファターゼの機能を調節する化合物の
一群を形成する。蛋白質ホスファターゼの機能を阻害することが報告されている
分子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリー
ル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａ
ｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ
９４／１４８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ
．），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，
９９２），スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリ
ジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州
特許出願０５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ
ＷＯ９４／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ
．），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２
年１２月１０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ Ｗ
Ｏ９１／１５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙
げられる。
【０２１５】 細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質ホスファターゼ阻害剤の多くは，蛋白質
ホスファターゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質ホス
ファターゼを阻害し，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こ
すであろう。
【０２１６】 しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄ
ｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許５，８８０，１
４１（米国特許出願０８／４８５，３２３），国際公開ＷＯ９６／４０１１６，
（１９９６年１２月 １９日公開，Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．）および国際公開Ｗ
Ｏ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａ
ｌ）（これらはすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環
式成分を有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。
"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ
ｅｔ ａｌ．の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願），"Ｂ
ｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．の米国特許５，８８０，１４１（米国特許出願０８／４８５，３２３
，１９９５年６月７日出願），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１
日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細
胞におけるインドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノ
ン誘導体の阻害パターンを教示する。
【０２１７】 ホスファターゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されない
が，チロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上
述のキナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知ら
れる化合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類
を記載する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５
２０７２２Ａ１；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；
Ｋａｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ
Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ
ａｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａ
ｒｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９
）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ
．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１）
，２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９
８３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒ
ｙｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊ
ａｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５
１，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２
９（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；
Ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１
５−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎ
ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２
５−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅ
ｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅ
ｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１
），２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，Ａ６５；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０２１８】 キノキサリン類は，Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，
３１６，５５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に記載される。
【０２１９】 キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）に記載される。
【０２２０】 チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３：Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（１
９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）
Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，５
３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１
（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（１
９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２２
２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４１
３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ Ｆ
ＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５−
３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５），
８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ
，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７０
−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２２１】 調節剤として用いることができる他の化合物には，オキシインドリノン，例え
ば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
【０２２２】組換えＤＮＡ技術 ホスファターゼ核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞： 本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０２２３】 本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
【０２２４】 核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
【０２２５】 所望の場合には，本発明のホスファターゼをコードする配列の３’側の非コー
ディング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止
制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。す
なわち，本発明のホスファターゼをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している
３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発
現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞
において機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０２２６】 ２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列および本発明のホスファタ
ーゼをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレーム
シフト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のホスファター
ゼをコードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）本
発明のホスファターゼの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されるこ
とを妨害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち，
プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる
場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本発
明のホスファターゼをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主によ
り認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【０２２７】 本発明は，本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）をコードする
遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含
する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効であり
かつ便利であり，したがって，本発明のホスファターゼのための１つの好ましい
発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表
される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【０２２８】 原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【０２２９】 認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０２３０】 本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において
発現させるためには，本発明のホスファターゼをコードする配列が，機能的原核
生物プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのよ
うなプロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわ
ち，誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バク
テリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝
子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可
能な原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プ
ロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌ
ａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）および
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．２０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，
Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），
Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６
），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−
４４２，１９８４）により概説されている。
【０２３１】 原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボ
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０２３２】 本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするホ
スファターゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定
されない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真
核生物宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまた
は組織培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞に
は，ＨｅＬａ細胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１
，またはリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳
動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株
，例えばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐ
れた能力を提供することができる。
【０２３３】 さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，ショウジョウバエアルコールデヒ
ドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルスベク
ターを，昆虫細胞において本発明のホスファターゼを大量に発現するよう遺伝子
工学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，
１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ
ｐ．２７７−２９７，１９８６）。
【０２３４】 酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のホスファターゼの発現にはいくつかの可能なベクター系
が利用可能である。
【０２３５】 宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０２３６】 本発明のホスファターゼの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域
を使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を
指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターに
は，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８
２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３
１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８
１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−
６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０２３７】 真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のホスファターゼ（ま
たはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニン
をコードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にするこ
とが好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明
のホスファターゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）
またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のホスファターゼのコーディ
ング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす
。
【０２３８】 本発明のホスファターゼをコードする核酸分子および動作可能なように連結さ
れたプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非
複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直
線状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は
自己複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現
により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレー
トされることにより永久発現が得られる。
【０２３９】 所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０２４０】 導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０２４１】 好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例
えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ；
"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラ
スミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃｚａ
ｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌ
ｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２
）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄ
ａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３
，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばΦ
Ｃ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ ｅｔ ａｌｅｓ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ
，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミ
ドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７
０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３
：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０２４２】 好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０２４３】 構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のホスファターゼまたはそのフラグ
メントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか
，またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデ
オキシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを
形成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好
ましい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０２４４】トランスジェニック動物： 本発明に関連するトランスジェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能
である。ＤＮＡを受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させる
か，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞
分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。
本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス
，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２４５】 胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
【０２４６】 齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
【０２４７】 一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウス
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０）。
【０２４８】 胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウ
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０２４９】 ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクロ
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０２５０】 ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
【０２５１】 すなわち，本発明は，本発明のキナーゼをコードするトランスジンまたはキナ
ーゼの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒト哺乳動物を
提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，キナーゼの導入
の効果を研究するため，またはキナーゼの発現を制御（すなわち，追加の遺伝子
，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビボ試験
系として特に有用である。
【０２５２】 "トランスジェニック動物"とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトキナーゼをコードすることができる。動物における自然の発現は，レセ
プターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与
えることにより減少させることができる。
【０２５３】遺伝子治療 本発明のホスファターゼまたはその遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用
である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１
９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト
遺伝子治療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の
基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，
１９９３）に記載されている。
【０２５４】 １つの好ましい態様においては，ホスファターゼのコーディング配列を含む発
現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患
者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例えば
，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のホスファターゼをコ
ードする内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性ホスフ
ァターゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーターセグメ
ントをこれが内因性ホスファターゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送す
る）。
【０２５５】 遺伝子治療は，腫瘍を標的とするホスファターゼｃＤＮＡを含むアデノウイル
スの使用を含むことができる。全身ホスファターゼは，遺伝子工学処理した細胞
の移植，ホスファターゼをコードするウイルスの注入，または裸のホスファター
ゼＤＮＡの適当な組織への注入により増加する。
【０２５６】 そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害するこ
とにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害
し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能
力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失
またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害する
ことができる。
【０２５７】 ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，ア
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えホスファ
ターゼをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例え
ば腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コ
ーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質
配列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標
的細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができ
る（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−
８，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細
胞内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋
白質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティング
することを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０２５８】 最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【０２５９】 また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結
合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みお
よび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅ
ｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２６０】 本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【０２６１】 本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であ
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
【０２６２】 別の好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸
配列を有するベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ
発現される。組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３
６（１９９２年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２６３】 上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２６４】 別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【０２６５】医薬処方および投与経路 本明細書に記載される化合物は，それ自体で，または医薬組成物中でヒト患者
に投与することができる。医薬組成物では，組み合わせ療法におけるように，化
合物が他の活性成分と混合されているか，または適当な担体または賦形剤と混合
されている。本発明の化合物の処方および投与の手法は"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見いだすことができる。
【０２６６】投与経路： 投与の適当な経路には，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸投与；非経口
輸送，例えば筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内注入，ならびに鞘内，直接心室内，
腹膜内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
【０２６７】 あるいは，化合物を全身ではなく局所的に投与してもよく，これには，例えば
，化合物を，しばしばデポ製剤または徐放製剤として直接固体腫瘍に注射するこ
とが含まれる。
【０２６８】 さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，
例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソ
ームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０２６９】組成物／処方： 本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，限
定されないが，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封
入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
【０２７０】 すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬
剤として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補
助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方
法で製剤することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０２７１】 注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶
液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することが
できる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる
。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０２７２】 経口投与のためには，化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許
容しうる担体と混合することにより化合物を容易に処方することができる。その
ような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤
，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として
処方することを可能とする。適当な担体には，特に，ラクトース，ショ糖，マン
ニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン
，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラ
ガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カル
ボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビ
ニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナト
リウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０２７３】 糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加し
てもよい。
【０２７４】 経口で使用することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフ
ィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑
剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成
分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよ
びステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含
むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン
，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁するこ
とができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そ
のような投与に適当な用量で調製すべきである。
【０２７５】 口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形に
することができる。
【０２７６】 吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，噴射剤，例えば
，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフル
オロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまた
はネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧された
エアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブに
より調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するための
ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトー
スまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
【０２７７】 化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方する
ことができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは
添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性ま
たは水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることがで
き，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０２７８】 非経口投与用の薬剤処方は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。さ
らに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することが
できる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸
エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含
む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビト
ール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいても
よい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該
化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０２７９】 あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば
発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０２８０】 化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤
を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０２８１】 上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。
そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によ
るか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，例えば，化合
物は，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁
液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として
，処方することができる。
【０２８２】 本発明の化合物のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界面活性
剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系であってもよい。共溶媒
系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコ
ール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である
。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液
中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，
それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶
解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，
共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面
活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコ
ールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニ
ルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖ま
たは多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０２８３】 あるいは，疎水的医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソーム
および乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知
られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用
いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続放
出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用い
て輸送することができる。種々の持続放出材料が当業者にはよく知られている。
持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間
，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さ
らに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０２８４】 医薬組成物はまた，適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいて
もよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウ
ム，リン酸カルシウム，種々の糖，澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，および
ポリエチレングリコール等の高分子が含まれる。
【０２８５】 本発明のチロシンまたはセリン／トレオニンホスファターゼ調節化合物の多く
は，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供される。薬学的に適合
性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石
酸，リンゴ酸，クエン酸等を用いて形成することができる。塩は，水性または他
のプロトン性溶媒において，対応する遊離塩基の形よりもより溶解性である傾向
にある。
【０２８６】適切な投与計画： 本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図され
る目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には
，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療
している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。本発明の化
合物の治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，
十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２８７】 患者に投与すべき化合物の投与量および生物に化合物を投与するモードを決定
する方法は，米国特許出願０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）
および国際出願ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）（この両方に
ついて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に開示されている。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易
に適合させることができることを理解するであろう。
【０２８８】 適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療する疾病のタイプ，用いられる特
定の組成物および患者のサイズおよび生理学的状態に依存する。本明細書に記載
される化合物についての治療上有効量は，最初は培養細胞および動物モデルから
見積もることができる。例えば，容量は，動物モデルにおいて，培養細胞アッセ
イにおいて決定されたＩＣ50を最初に考慮した循環濃度範囲を達成する用量を処
方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおける有用な用量を
より正確に決定することができる。
【０２８９】 本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な用量は
，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにお
いて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちチロシンまたはセリン／ト
レオニンホスファターゼ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を
含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。そのような情
報は，ヒトまたは他の被験体における有用な用量のさらに正確な決定のために用
いることができる。
【０２９０】 本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験
動物における標準的な薬理学的方法，例えばＬＤ50（集団の５０％に致死的な用
量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することにより，
決定することができる。毒性と治療上有効性の用量の比は治療指数であり，ＬＤ 50 とＥＤ50の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好まし
い。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにお
いて用いるための投与量の範囲を定式化するために用いることができる。このよ
うな化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ50を含み毒性がほとんどまたは全くな
い循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路に
より，この範囲内で様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，
個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇ
ｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａ
ｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０２９１】 毒性研究は，血液細胞組成を測定することにより実施することもできる。例え
ば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる
１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２
）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３
）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細
胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，
毒性が存在するか否かを示す。
【０２９２】 各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
【０２９３】 癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／日
，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲
である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であ
るかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０２９４】 血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であ
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０２９５】 薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器におけ
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
【０２９６】 投与量および間隔は，個々に，活性成分がホスファターゼ調節効果を維持する
のに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節する
ことができる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例
えば，限定されないが，本明細書に記載されるアッセイを用いて，ホスファター
ゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。
ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するで
あろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決
定することができる。
【０２９７】 投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−
９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の
時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである
。
【０２９８】 局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度
とは関係ないであろう。
【０２９９】 投与される特定の組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛
の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０３００】包装： 組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を
含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。
パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むこ
とができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されてい
てもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または
販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添
付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用のポリヌクレオチ
ドの形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例
えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか
，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処
方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置さ
れ，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すことができる。ラベ
ル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，
糖尿病等の治療が挙げられる。
【０３０１】機能的誘導体 本発明はまた，本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体を提供する。
"機能的誘導体"は，本発明のポリペプチドまたは核酸の"化学的誘導体"，"フラ
グメント"または"変種"を意味し，これらの用語は以下に定義される。機能的誘
導体は，蛋白質の機能の少なくとも一部，例えば蛋白質に特異的な抗体との反応
性，非触媒ドメインにより媒介される酵素活性または結合活性を保持しており，
これにより本発明にしたがう有用性を有する。遺伝コードの縮重のため，多くの
異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができることは当該技術分
野においてよく知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変更して，元の機能
性的を保持する蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも当該技術分
野においてよく知られている。いずれの場合においても，すべての順列が本明細
書の開示によりカバーされることが意図される。
【０３０２】 本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすること
ができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子
の一部または全部を合成して，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号
４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号
１０，配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列からなる群より選択
される核酸配列と有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによ
りコードされるアミノ酸配列は保存される。
【０３０３】 さらに，核酸配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配
列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，
配列番号１１，および配列番号１２に記載される配列，またはその誘導体．から
なる群より選択される核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３
’−末端で少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することによ
り得られるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が
，ヌクレオチド配列によりコードされる，配列番号１３，配列番号１４，配列番
号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号
２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載
される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドをこのように用いることができる。例えば，
本発明は，本発明の核酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとして
ＡＴＧを付加することにより，または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導
体の３’−末端に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加すること
により得られる任意の核酸配列を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分
子は，必要に応じて，これらの５’−末端および／または３’−末端に付加され
た制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。
【０３０４】 所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明のホスファ
ターゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発
明に含まれる。
【０３０５】 さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
【０３０６】 複合体の"化学的誘導体"は，通常は蛋白質の一部ではない追加の化学的成分を
含む。蛋白質またはペプチドの共有結合修飾は，本発明の範囲内に含まれる。そ
のような修飾は，以下に記載するように，ペプチドの標的アミノ酸残基を選択さ
れた側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導化剤と反応させることにより，分
子中に導入することができる。
【０３０７】 システイン残基は，最も一般的にはアルファ−ハロアセテート（および対応す
るアミン），例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて，カルボ
キシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基は，ブ
ロモトリフルオロアセトン，クロロアセチルホスフェート，Ｎ−アルキルマレイ
ミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド，メチル２−ピリジルジスルフィ
ド，ｐ−クロロ水銀ベンゾエート，２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール，ま
たはクロロ７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させるこ
とにより誘導化する。
【０３０８】 ヒスチジン残基は，ｐＨ５．５−７．０でジエチルプロカーボネートと反応さ
せることにより誘導化することができる。これは，この薬剤がヒスチジンの側鎖
に比較的特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である
。反応は，好ましくは，０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行う。
【０３０９】 リジンおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応さ
せる。これらの薬剤による誘導化は，リジン残基の電荷を逆転させる効果を有す
る。１級アミン含有残基を誘導化するための他の適当な試薬には，イミドエステ
ル，例えば，メチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリド
キサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ
ウレア；２，４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼに触媒されるグリ
オキシレートとの反応が含まれる。
【０３１０】 アルギニン残基は慣用的な試薬の１つまたはいくつかと反応させることにより
修飾する。これには，例えば，フェニルグリオキサール，２，３−ブタンジオン
，１，２−シクロヘキサンジオン，およびニンヒドリンがある。アルギニン残基
の誘導化には，グアニジン官能基の高いｐＫａのため，反応をアルカリ条件中で
行うことが必要である。さらに，これらの試薬はリジンの基ならびにアルギニン
アルファアミノ基とも反応することができる。
【０３１１】 チロシン残基は，芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反
応させることにより光学的標識を導入するための修飾のよく知られる標的である
。最も一般的には，Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用い
て，それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
【０３１２】 カルボキシル側鎖（アスパラギン酸およびグルタミン酸）は，カルボジイミド
（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’），例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４
，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドと反応させることにより，選択的に修
飾する。さらに，アスパラギン酸およびグルタミン酸残基は，アンモニウムイオ
ンと反応させることにより，アスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
【０３１３】 グルタミンおよびアスパラギン残基は，しばしば脱アミド化して，対応するグ
ルタミン酸およびアスパラギン酸残基に変換する。あるいは，これらの残基をよ
り穏和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形も本発明の範
囲内である。
【０３１４】 二官能性薬剤による誘導化は，例えば，蛋白質の成分ペプチドを互いに，また
は複合体中の他の蛋白質と，または水不溶性支持体マトリクスと，または他の高
分子担体と架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋薬剤としては，例え
ば，１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデヒ
ド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば，４−アジドサリチル酸の
エステル，ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含む），および二官能
性マレイミド，例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。
メチル−３−［ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導化
薬剤により，光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体が得られる。
あるいは，反応性の水不溶性マトリクス，例えば臭化シアン活性化炭水化物およ
び米国特許３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４
，２４７，６４２；４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載され
る反応性基質を蛋白質固定化のために用いることができる。
【０３１５】 他の修飾としては，プロリンおよびリジンのヒドロキシル化，セリンまたはト
レオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化，リジン，アルギニン，およびヒスチ
ジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
ｐｐ．７９−８６（１９８３）），Ｎ末端アミンのアセチル化，および場合によ
りＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０３１６】 そのような誘導化された成分は，安定性，溶解性，吸収，生物学的半減期等を
改良することができる。あるいは，これらの成分は，蛋白質複合体の望ましくな
い副作用を排除するかまたは緩和することができる。そのような効果を媒介しう
る成分は，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。
【０３１７】 "フラグメント"との用語は，これが由来する全長ポリペプチドより短い長さを
有する蛋白質または複合体のアミノ酸配列に由来するポリペプチドを示すものと
して用いられる。そのようなフラグメントは，例えば，全長蛋白質の蛋白質分解
性切断により製造することができる。好ましくは，フラグメントは，蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配
列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸を除去する
ことにより，組換えにより得る。蛋白質のフラグメントは，本明細書に記載され
るように，シグナル伝達を調節するように作用する物質のスクリーニングに有用
である。そのようなフラグメントは，天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的
部分を保持しているであろうことが理解される。そのような保持される特徴の例
としては，触媒的活性；基質特異性；無傷の細胞中における他の分子との相互作
用；制御機能；または天然の複合体またはそのエピトープに対する抗体との結合
が挙げられる。
【０３１８】 本発明の範囲内に入ることが意図される別の機能的誘導体は，天然のポリペプ
チドに対して，１またはそれ以上のアミノ酸を欠失しているか，追加のまたは置
換されたアミノ酸を含む"変種"ポリペプチドである。変種は，蛋白質のＤＮＡコ
ーディング配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中
の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸のためのコドン
を付加，除去，および／または改変することにより，天然に生ずる複合体成分か
ら誘導することができる。追加，置換および／または追加アミノ酸を有するその
ような変種は，上述するように，天然の蛋白質の１またはそれ以上の特徴的部分
を保持していることが理解される。
【０３１９】 アミノ酸残基が除去，挿入および／または置換されている蛋白質の機能的誘導
体は，当業者によく知られる標準的な手法を用いて製造することができる。例え
ば，機能的誘導体の改変された成分は，改変されたコード配列を生成するように
，ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを修飾する部位特異的突然変異手法（Ａｄ
ｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＤＮＡ ２：１８３に例示されている）
を用いて，その後上述したような手法を用いてこの組換えＤＮＡを原核生物また
は真核生物宿主細胞中で発現させることにより，製造することができる。あるい
は，アミノ酸が削除，挿入および／または置換されている蛋白質は，当該技術分
野においてよく知られる方法を用いて，直接化学合成により便利に製造すること
ができる。蛋白質の機能的誘導体は，典型的には天然の蛋白質と同じ質の生物学
的活性を示す。
【０３２０】 本発明はまた，核酸配列が天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的部分を含
む本発明にしたがうホスファターゼをコードするか否かを検出する方法を提供す
る。記載されるように，そのような保存された特徴の例には以下のものが含まれ
る：触媒活性；基質特異性；無傷の細胞における他の分子との相互作用；制御機
能；または天然の複合体に特異的な抗体またはそのエピトープとの結合。したが
って，本発明は，所定の核酸分子によりコードされるポリペプチドホスファター
ゼの１またはそれ以上の特徴，特に，触媒ドメインの存在を分析するアッセイを
提供する。
【０３２１】 この目的のため，適当なアッセイは，ホスファターゼ蛋白質を精製し定量する
ことから開始することができる。次に，例えば，一連の希釈を行い，加水分解し
うる基質，および任意にポリペプチドの触媒活性を増加させることができる還元
剤を含む緩衝液（例えばＡＢＴ緩衝液）中でインキュベートすることにより，蛋
白質をアッセイすることができる。好ましくは，基質はｐ−ニトロフェニルホス
フェート（ｐＮＰＰ）であり，還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり，
ｍＭ濃度はそれぞれ４Ｘおよび１Ｘであうｒ。インキュベーションは，活性によ
り，室温で約２分間から一夜でありうる。反応を停止するためには，ＮａＯＨを
加え，これは約１００μｌの１０ＮＮａＯＨでありうる。懸濁液を遠心分離し，
上清をＯＤ４１０ｎＭで分析して，蛋白質ホスファターゼが触媒特性を示すか否
かを判定することができる。
【０３２２】表およびその記載 表１は，各遺伝子の名前，各遺伝子の分類，配列中のオープンリーディングフ
レームの位置，および対応するペプチドの長さを表す。データは，左から右に，
以下のものを表す："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"
，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"ＮＡ長さ"，"ＯＲＦ開
始"，"ＯＲＦ終了"，"ＯＲＦ長さ"，および"ＡＡ長さ"。"遺伝子名"は，ホスフ
ァターゼまたはホスファターゼ様酵素をコードする配列に与えられた名前を表す
。各遺伝子は，"ＳＧＰ"名称およびその後の番号により表される。ＳＧＰ名は，
通常は，１つの連続配列（"コンティグ"）に構築された多数の重複配列を表す。
"ＩＤ＃ｎａ"および"ＩＤ＃ａａ"は，本明細書において各核酸およびアミノ酸配
列に与えられた同定番号を表す。"ＦＬ／Ｃａｔ"は，遺伝子の長さを表し，ＦＬ
は全長を，"Ｃａｔ"は触媒ドメインのみが示されていることを表す。このカラム
中の"Ｐａｒｔｉａｌ"とは，配列が部分的蛋白質ホスファターゼ触媒ドメインを
コードすることを示す。"スーパーファミリー"とは，遺伝子が二重特異性ホスフ
ァターゼ，蛋白質チロシンホスファターゼまたはセリントレオニンホスファター
ゼであるかを識別する。"グループ"および"ファミリー"は，配列ホモロジーによ
り定義され，先に確立されている系統発生分析に基づく蛋白質ホスファターゼの
分類を表す（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏ
ｏｋ，Ｎｉｃｋ Ｔｏｎｋｓ，Ｓｈｉｒｉｓｈ Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｈａｒ
ｒｙ Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ，２０００）。"ＮＡ
長さ"は，対応する核酸配列の長さをヌクレオチドで表す。"ＯＲＦ開始"は，オ
ープンリーディングフレームの開始ヌクレオチドを表す。"ＯＲＦ終了"は，オー
プンリーディングフレームの終止コドンを除く最後のヌクレオチドを表す。"Ｏ
ＲＦ長さ"は，オープンリーディングフレームの長さをヌクレオチドで表す。"Ａ
Ａ長さ"は，対応する核酸配列においてコードされるペプチドの長さをアミノ酸
で表す。
【０３２３】 表１−オープンリーディングフレーム
【表１】
【０３２４】 表２は，本明細書に記載される遺伝子の以下の特徴を示す：染色体位置，一塩
基多型（ＳＮＰｓ），ｄｂＥＳＴにおける表示，および反復領域。示されるデー
タは，左から右に，以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃
ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"
染色体"，"ＳＮＰｓ"，"ｄｂＥＳＴ＿ヒット"，および"反復"。最初の７つのカ
ラム（すなわち，"遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，
"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"）の内容は，表１について上
述したとおりである。"染色体"は，遺伝子の細胞遺伝学的位置を表す。"ＳＮＰ
ｓ"カラムの情報は，候補一塩基多型（ＳＮＰｓ）の核酸位置および縮重性を示
す。"ｄｂＥＳＴヒット"は，対応する遺伝子に対して少なくとも１００ｂｐの１
００％同一性を含む，ＥＳＴの公共のデータベース（ｄｂＥＳＴ，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔ
ｍｌ）中の登録物の受託番号を示す。これらのＥＳＴはｄｂＥＳＴのｂｌａｓｔ
ｎにより同定した。"反復"は，複雑性が低く，いくつかの別々の遺伝子中に存在
する約２０ｂｐの長さの短い配列の位置に関する情報を含む。これらの反復は，
ＮＣＢＩ（ｎｒｎａ）の非重複核酸データベースに対するＤＮＡ配列のｂｌａｓ
ｔｎにより同定した。この反復カラムに含まれるためには，配列は典型的にはそ
の長さにわたり１００％同一性を有し，典型的には少なくとも５つの異なる遺伝
子中に存在する。
【０３２５】 表２−ＣＨＲ，ＳＮＰｓ，ｄｂＥＳＴ，反復
【表２】
【０３２６】 表３は，ホスファターゼ触媒ドメインの程度および境界を示す。カラムの表題
は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃ
ａｔ"，"ドメイン""Ｐｈｏｓ開始""Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始""プロフ
ァイル終了"。カラム"遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＰＬ／Ｃａｔ
"の内容は表１について上述したとおりである。"Ｐｈｏｓ開始"，"Ｐｈｏｓ終了
"，"プロファイル開始"および"プロファイル終了"は，隠れマルコフモデルを用
いて得た，触媒範囲の境界を規定するデータを表す（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．
ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。蛋白質全体中の触媒ドメインの
境界は，"Ｐｈｏｓ開始"および"Ｐｈｏｓ終了"のカラムで示される。３つのプロ
ファイルを用いた。１つは１７３アミノ酸の長さの二重特異性ホスファターゼ（
ＤＳＰ）について；１つは３０１アミノ酸の長さのＳＴＰについて；１つは２６
４アミノ酸の長さＰＴＰについてである。（用いたプロファイルはｈｔｔｐ：／
／ｐｆａｄ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／に示される）。プロファイルが全長触媒ドメ
インを認識する蛋白質は，"プロファイル開始"が１であり，プロファイル終了は
３つのファミリーについて以下のとおりである：ＤＳＰは１７３，ＳＴＰは３０
１，ＰＴＰは２６４。部分的触媒ドメインを有する遺伝子は，プロファイル開始
が１より大きく（ホスファターゼドメインの開始が欠失していることを示す），
および／または"プロファイル終了が"２６１より小さい（ホスファターゼドメイ
ンのＣ末端が欠失していることを示す）。各配列は完全触媒ドメインを包含する
が，ただし，ＳＧＰ０２４は，ＰＴＰプロファイルのアミノ酸２０５−２６４で
ある部分触媒ドメインを有する。
【０３２７】 表３−ホスファターゼドメイン
【表３】
【０３２８】 表４は，非重複蛋白質配列のＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ
）に対するアミノ酸配列のスミス・ウォーターマン類似性検索（マトリックス：
Ｐａｍｌ００；ギャップオープン／イクステンションペナルティー１２／２）の
結果を示す。カラム標題は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"
ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリ
ー"，"Ｐスコア"，"ａａ長さ"，"ａａＩＤマッチ"，"％同一性"，"％類似性"，"
ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"，"説明"，"クエリー開始"，"クエリー終了"，"標的開
始"，および"標的終了"。次のカラム："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ
"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"ファミリー"の内容は表１について上述したとおりである
。"Ｐスコア"はスミス・ウォーターマン確率スコアを表す。この数値はアライン
メントが偶然により生ずるおよその確率を表す。すなわち，非常に低い数値，例
えば２．１０Ｅ−６４は，クエリーとデータベース標的との間に非常に顕著なマ
ッチがあることを示す。"ａａ長さ"は，蛋白質の長さをアミノ酸で表す。"ａａ
ＩＤマッチ"は，アラインメント中で同一であるアミノ酸の数を示す。"％同一性
"は，アラインメントした領域にわたって同一であるヌクレオチドのパーセント
を示す。"％類似性"は，アラインメント全体にわたって類似するアミノ酸のパー
セントを示す。"ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"は，非重複蛋白質のＮＣＢＩデータベ
ース中で最も類似する蛋白質の受託番号を示す。"説明"は，非重複蛋白質ＮＣＢ
Ｉデータベース中で最も類似する蛋白質の名前を含む。"クエリー開始"はホスフ
ァターゼ（"クエリー"）中のアラインメントが開始するアミノ酸番号を表す。"
クエリー終了"はホスファターゼ（"クエリー"）中のアラインメントが終了する
アミノ酸番号を表す。"標的開始"はＮＲＡＡからのスミス・ウォーターマンヒッ
ト（"標的"）中のアラインメントが開始するアミノ酸番号を表す。"標的終了"は
ＮＲＡＡからのスミス・ウォーターマンヒット（"標的"）中のアラインメントが
終了するアミノ酸番号を表す。ＳＧＰ００６については３つの登録物が存在し，
ＳＧＰ０１４については２つの登録物が存在することに注意されたい。これらの
追加の列は異なるデータベース"標的"を用いるアラインメントの異なる領域を記
述する（詳細については以下を参照）。
【０３２９】 表４−スミス・ウォーターマン
【表４】
【０３３０】 表５は，４９９の組織および細胞株に由来するｃＤＮＡのマイクロアレイを用
いて，本発明に開示される選択されたホスファターゼの遺伝子発現を分析した結
果を示す。ｃＤＮＡをナイロン上にスポットし，以下の材料および方法に記載さ
れるように，標識ホスファターゼ遺伝子で探索した。ホスファターゼプローブは
，ゲノムのエクソンからＰＣＲクローニングした。データは，左から右に，以下
のものを表す："ＩＤ"：試料の番号；"試料名"；"Ｔ／Ｎ"，腫瘍または正常組織
；"タイプ"，元の組織；"組織／細胞株"，試料が組織に由来するか培養細胞株に
由来するか；"注"：試料についての追加の情報；"処理"：組織または細胞株の化
学的または物理学的処理；"ｐ５３"は，起源試料におけるｐ５３遺伝子の状態，
変異型または野生型を示す。続くカラムにおいて，各遺伝子について，そのＳＧ
Ｐ番号および配列番号を参照して，標準化した発現値が示されている。表５に示
される遺伝子は以下のとおりである：ＳＧＰ００３，ＳＧＰ０６０，およびＳＧ
Ｐ０１８。探索された組織アレイを含むブロットの画像も含まれる。
【０３３１】 表５−組織アレイ
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【０３３２】 表６の"多組織ブロット"は，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓ
ｕｅ ＢｌｏｔをＳＧＰ００２およびＳＧＰ０１２に由来する放射性標識プロー
ブで探索した結果を含む。表には，ブロット上の組織および各組織における相対
的遺伝子発現について得られた値が示される。
【０３３３】 表６−多組織ブロット
【表１２】
【０３３４】実施例 以下の実施例は限定ではなく，本発明の種々の観点および特徴の代表的なもの
にすぎない。以下の実施例は，本発明のセリン／トレオニンホスファターゼの単
離および特徴付けを示す。
【０３３５】実施例１：ゲノムＤＮＡからの蛋白質ホスファターゼ遺伝子の同定および特徴付 け 材料および方法 新規ホスファターゼは，Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム配列データベースから，およ
び公共のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｊｅｃｔ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から，隠れマル
コフモデル（ＨＭＭＲ）を用いて同定した。ゲノムデータベース登録物は，６つ
のオープンリーディングフレームに翻訳し，ＨＭＭＲ２．１のフィールドプログ
ラム可能アレイ（ＦＰＧＡ）加速版を有するＴｉｍｅｌｏｇｉｃ Ｄｅｃｙｐｈ
ｅｒボックスを用いて，モデルに対してこれらを検索した。ＨＭＭＲプロファイ
ルに対してアラインメントした，予測された蛋白質配列をコードするＤＮＡ配列
を，元のゲノムデータベースから抽出した。次に，核酸配列をＰａｎｇｅａ Ｃ
ｌｕｓｔｅｒｉｎｇツールを用いてクラスター化し，反復登録物を排除した。次
に推定蛋白質ホスファターゼ配列を一連のクエリーおよびフィルターを通して順
番に走らせて，新規蛋白質ホスファターゼ配列を同定した。特に，ＨＭＭＲで同
定された配列は，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸを用いて，既知のヒト蛋白質
ホスファターゼおよびすべてのその後の新規蛋白質ホスファターゼ配列をそれが
同定されるにつれて含有するヌクレオチドおよびアミノ酸レポジトリに対して検
索した。出力はスプレッドシートで表示して，手動検査で既知の遺伝子を排除す
ることを容易にした。２つのモデル，すなわち，"完全"モデルおよび"部分"また
はスミス・ウォーターマンモデルを開発した。部分モデルを用いて準触媒的ホス
ファターゼドメインを同定し，完全モデルを用いて完全触媒ドメインを同定した
。次に選択したヒットをＢＬＡＳＴＮを用いて公共ｎｒｎａおよびＥＳＴデータ
ベースに対してクエリーを行い，これらが実際にユニークであることを確認した
。場合によっては，新規遺伝子は，先に同定されている齧歯類または脊椎動物蛋
白質ホスファターゼのオルトログであると判定された。
【０３３６】 仮出願に置いて出願された配列の多くは，全コーディング配列を含んでいなか
った。部分ＤＮＡ配列の延長による全長オープンリーディングフレームの包含は
，いくつかの方法により行った。表７に示されるｃＤＮＡデータベースを繰り返
しｂｌａｓｔｎ検索して，ゲノム配列を延長したｃＤＮＡを見いだした。"Ｌｉ
ｆｅＳｅｑＧｏｌｄ"データベースはＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／）から入手した。ＮＣＢＩデ
ータベースはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手した。すべてのｂｌａｓｔｎ検索は，ヌクレオチド
ミスマッチについてのペナルティー３，およびヌクレオチドマッチのリウォード
１を用いて行った。ギャップ付きｂｌａｓｔアルゴリズムは以下に記載されてい
る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅ
ｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ
，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ
Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９９７），"Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【０３３７】 部分ＤＮＡ配列の伸長による全長オープンリーディングフレームの包含はま
た，ゲノムデータベースの検索の繰り返しにより行った。第１の方法は，スミス
−ウォーターマンアルゴリズムを用いて，最も近い蛋白質ホモログまたはオルト
ログを部分配列に対して蛋白質−蛋白質検索を行った。標的データベースは，Ｇ
ｅｎｅｓｃａｎおよびヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）ならびにＣｅｌｅｒａ
から得られた全ヒトゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
からなる。検索したゲノムデータベースの完全なセットは以下の表８に示される
。潜在的な延長をコードするゲノム配列は，ＮＣＢＩ非重複データベースに対す
るｂｌａｓｔｘ分析を行ってヒットの新規性を確認することによりさらに評価し
た。延長するゲノム配列は，ＤＮＡＳｔａｒのＳｅｑｍａｎプログラムを用いて
潜在的イントロンを削除した後にｃＤＮＡ配列中に組み込んだ。スミス−ウォー
ターマン検索について用いたデフォルトのパラメータは以下のとおりである。マ
トリクス：ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップオープニングペナルティー：１２；ギャ
ップ延長ペナルティー：２．Ｇｅｎｅｓｃａｎ予測は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログ
ラムを，Ｃｈｒｉｓ Ｂｕｒｇｅ ａｎｄ Ｓａｍ Ｋａｒｌｉｎ（"Ｐｒｅｄ
ｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉ
ｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ"，ＪＭＢ（１９９７）２６８（１）
：７８−９４）に詳細が記載されるように用いて行った。ゲノムＤＮＡからのＯ
ＲＦの予測は，標準的な６フレーム翻訳を用いて行った。
【０３３８】 ゲノム配列からＤＮＡ伸長を規定する別の方法は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラ
ムを用いてゲノムデータベースを繰り返し検索してエクソンスプライシングを予
測した。次にこれらの予測された遺伝子を，関連するホスファターゼに対するホ
モロジーに基づいてこれらが部分遺伝子の"本物の"延長であるかを見ることによ
り評価した。
【０３３９】 別の方法は，Ｇｅｎｅｗｉｓｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇ
ｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２／）を使用して，最も近いオ
ルトログ／ホモログに対するホモロジーに基づいて潜在的ＯＲＦを予測すること
を含む。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，２つの入力，すなわち相同の蛋白質と目的とする
遺伝子を含むゲノムＤＮＡを必要とする。ゲノムＤＮＡはＣｅｌｅｒａおよびヒ
トゲノムプロジェクトのデータベースのｂｌａｓｔｎ検索により同定した。オル
トログは，ＮＣＢＩ非重複蛋白質データベース（ＮＲＡＡ）をｂｌａｓｔｐ検索
することにより同定した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，蛋白質配列をゲノムＤＮＡ配列
と比較し，イントロンおよびフレームシフトエラーを得ることができる。
【０３４０】 表７−ｃＤＮＡに基づく配列延長に用いたデータベース
【表１３】
【０３４１】 表８−ゲノムに基づく配列延長に用いたデータベース
【表１４】
【０３４２】結果 仮出願において遺伝子を延長するのに用いた配列情報源を以下に示す。Ｇｅｎ
ｅｗｉｓｅを用いて延長した遺伝子については，蛋白質オルトログおよびゲノム
ＤＮＡの受託番号が記載されている（Ｇｅｎｅｗｉｓｅはゲノム配列から標的遺
伝子のコーディング配列を組み立てるためにオルトログを用いる）。オルトログ
のアミノ酸配列は，蛋白質のＮＣＢＩ非重複データベースから得た（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉ
ｎ．ｈｔｍｌ）。ゲノムＤＮＡは２つの起源，すなわち，ＣｅｌｅｒａおよびＮ
ＣＢＩ−ＮＲＮＡからのものであり，これは以下に示される。ｃＤＮＡ起源もま
た以下に示される。略号：ＨＧＰ：ヒトゲノムプロジェクト；ＮＣＢＩ，Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ．
【０３４３】ＳＧＰ００６（配列番号１） Ｎ末端領域（１−３３５）は，Ｃｅｌｅｒａコンティグ３００８２５９０３を
用いるＧｅｎｅｗｉｓｅ予測，および蛋白質ホモログｇｉ｜７２４２９５１，ｇ
ｉ｜８９２３４８３およびｇｉ｜６７１４６４１から導かれた。Ｃｅｌｅｒａコ
ンティグ３００８２５９０３のＧｅｎｓｃａｎ予測も用いた。配列を延長するた
めに用いたＮＣＢＩ ＥＳＴは以下のとおりである：ＢＥ７９３０９２．１，ｇ
ｉ｜９１２７４４６，ｇｉ｜５９２７３６４，ｇｉ｜８１４８５６９，ｇｉ｜９
０９６６１０，ｇｉ｜０２１４２９０，ｇｉ｜５９２７３６５，ｇｉ｜４５３３
１０１，ｇｉ｜ｌ９４８７４８，ｇｉ｜２０１０５８２，ｇｉ｜３０５７１，ｇ
ｉ｜２４３３２２５，ｇｉ｜８１５２９１５。Ｉｎｃｙｔｅ配列３３９２６６．
１はエクソン７（ＧＦＳＶＳＴＡＧＲＭＨＩＦＫＰＶＳＶＱＡＭＷ）を欠失して
いる。公共の配列ｇｉ｜７２４２９５１（ＫＩＡＡ１２９８）はエクソン１１を
欠失しており，エクソン１０の最初の近くから始まる。エクソン１１の欠失によ
りフレームシフトが生じ，したがって，ＫＩＡＡ１２９８は別のＮ末端予測ペプ
チドを有し，エクソン１０は異なるフレームである。ＳＧＰ００６は，ＳＧＰ０
０６のＣ末端の７１５アミノ酸（アミノ酸３３５−１０４９）にわたり，ＫＩＡ
Ａ１２９８と同一である。
【０３４４】 ＳＧＰ００６（配列番号１）は６３７４ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置３４で開始し，位置３１８３で終了し，３１５０ヌ
クレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１０４９アミノ酸の長さであ
る。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下
のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホス
ファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置１２ｑ２１．３−ｑ２２
にマップされる。この染色体位置の増幅は以下のヒト疾病と関連づけられている
：膀胱癌腫（１２ｑ２１−ｑ２４，１／１６）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ
．）。この遺伝子は次の位置に一塩基多型候補を含む：６２２２＝Ｒ（ｃｃａａ
ａｃａｔａａｇｔｇｇｃａｃａｒ）ｄｂＳＮＰ｜ｒｓ８８１１７９＿ａｌｌｅｌ
ｅ。この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりで
ある：ＢＥ７９３０９２．１，ＡＩ６５１２１３．１，ＢＥ２５６９７８．１。
この遺伝子は以下のヌクレオチド位置において反復配列を有する：Ａｌｕ５７５
０−６０１０；５７５０−５７７０。
【０３４５】ＳＧＰ００２（配列番号２） ＳＧＰ００２核酸配列は，ＣｅｌｅｒａゲノムＤＮＡ７０００００１６５９２
５９６を用いるＧｅｎｅｗｉｓｅアルゴリズムの実行および蛋白質ホモログｇｉ
＿６６７９１５６から導かれた。同様のＧｅｎｓｃａｎ予測により，Ｎ末端延長
が得られ，ＨＧＰコンティグｇｉ｜７６５８２９７との比較により予測中のフレ
ームシフトを補正した。近いホモログは同じ長さである。ＮＣＢＩ ＥＳＴｇｉ
｜７９５０６９９およびｇｉ｜７６０９８３はそれぞれ５’および３’ＵＴＲ中
に延長される。ゲノム配列を用いてこれらのＥＳＴの配列エラーを補正した。Ｎ
ＣＢＩ ＥＳＴｇｉ｜０７１７９５８はスプライシング変種をコードする。Ｉｎ
ｃｙｔｅ ＥＳＴ１０２６６５９．２はホスファターゼドメインの一部を含むエ
クソンを欠失している選択的スプライシング型をコードする。Ｉｎｃｙｔｅ Ｅ
ＳＴ１０２６６５９．７は，追加の１７２ヌクレオチドの５’ＵＴＲを遺伝子に
付加する。Ｉｎｃｙｔｅおよび公共のＥＳＴは，多くの組織，最も一般的には，
消化系，神経系，呼吸系，および雄および雌生殖器における発現を示す。
【０３４６】 ＳＧＰ００２（配列番号２）は２７３２ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置５３８で開始し，位置２５３５で終了し，１９９８
ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は６６５アミノ酸の長さであ
る。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下
のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホス
ファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置１２ｐ１１．１−ｐ１２
．１にマップされる。この染色体位置は，以下のヒト疾病と関連づけられている
：精巣癌（１２ｐ１１．２−ｐ１２．１，１０／１１）；非小細胞肺癌（１２ｐ
１１．２−ｐ１２，４／５０），および乳癌腫（１２ｐ１１−ｐｔｅｒ，２／３
６）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．）。この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥ
ＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：ＢＥ８９７７９５。この遺伝子は
以下のヌクレオチド位置において反復配列を有する：２６１０−２６３１。
【０３４７】ＳＧＰ００１（配列番号３） ｇｅｎｓｃａｎおよびＣｅｌｅｒａコンティグ５００００１２１６４５０５，
および蛋白質ホモログｇｉ＿６７１４６４１およびｇｉ＿７２４２９５１を用い
るｇｅｎｅｗｉｓｅを用いる。いくつかの公共およびＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴを用
いて遺伝子を延長し，ゲノムデータを用いてＥＳＴ配列エラーを補正した。これ
らには以下のものが含まれる：Ｉｎｃｙｔｅ配列：２１０３４３．１，２１０３
４３．２，６３７３３１ＣＢ１；およびＮＣＢＩ ＥＳＴｓ：ｇｉ｜３８９４５
０２，ｇｉ｜００１７２，ｇｉ｜ｌｌｌ００１７２，ｇｉ｜４１３７３７０，ｇ
ｉ｜６５０５０７１，ｇｉ｜６８８５１７１，ｇｉ｜１１２３２６２，およびｇ
ｉ｜６５９０４１２。
【０３４８】 ＳＧＰ００１（配列番号３）は２２６０ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置７０９で開始し，位置２２０５で終了し，１４９７
ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は４９８アミノ酸の長さであ
る。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下
のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホス
ファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置Ｘｐ１１．１−１１．３
にマップされる。この染色体位置は以下のヒト疾病と関連づけられている：前立
腺癌（Ｘｐｌｌ−ｑｌ３，１／９）および小細胞肺癌（Ｘｐ１１．２，１／１３
）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．）。この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥＳ
Ｔ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：ＡＩ２７２２３１，ＢＦ２０６５８
６。この遺伝子は以下のヌクレオチド位置において反復配列を有する：５７９−
５９８。
【０３４９】ＳＧＰ０１８（配列番号４） ＳＧＰ０１８の配列は，Ｃｅｌｅｒａコンティグ６８００００１７７０６８５
９から，ｇｉ＿７３０５０１１およびｇｉ＿７７０５９５９とのＧｅｎｓｃａｎ
およびｇｅｎｅｗｉｓｅを用いて予測される。ｇｅｎｅｗｉｓｅ予測は推定ホス
ファターゼのほとんどをカバーする。Ｇｅｎｓｃａｎ予測はｇｅｎｅｗｉｓｅ予
測と重複してこれを延長し，ｇｅｎｓｃａｎのほとんど全ては，Ｉｎｃｙｔｅお
よびｄｂＥＳＴからのＥＳＴによりカバーされた。すべての場合において，ＥＳ
Ｔは最初にゲノム（Ｃｅｌｅｒａ／ＨＧＰ）配列と整列させることにより補正し
た。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測されるスプライシング変種は，配列ＳＥＦＬＤＥ
ＡＬＬＴＹＲをＹＣＨＹＩＩＦＳＣＶＦＩＳで置き換える（ヌクレオチド配列は
ＡＣＴＧＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴ
ＣからＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＡＣＡ
Ｇに変化）。ＥＳＴ起源：Ｉｎｃｙｔｅ配列：９８１７１２．１，９８１７１２
．３，９８１７１２．２，３６４５７５．１，０６１６８８．１，１４４６０８
．１，７６６８６４８Ｈ１，７４７３６０３ＣＢ１，７４７３６０４ＣＢ１。公
共ＥＳＴは以下のものを含む：ｇｉ｜６８８０１９７，ｇｉ｜６８８０１９１，
ｇｉ｜６８８０１４１，ｇｉ｜５４４１２０４，ｇｉ｜５４４１１４９，ｇｉ｜
１２４２１７４，ｇｉ｜ｌ０９８４３５７。Ｇｅｎｓｃａｎはまた，ＶＨＬＬか
らＣ末端までの配列が以下の配列に置き換えられている選択的Ｃ末端を予測する
： ＡＮＧＮＳＶＲＳＴＳＲＦＳＳＳＳＴＲＥＧＲＥＭＨＫＦＳＲＳＴＹＮＥＴＳＳ
ＳＲＥＥＳＰＥＰＹＦＦＲＲＴＰＥＳＳＥＲＥＥＳＰＥＰＱＲＰＷＡＲＳＲＤＷ
ＥＤＶＥＥＳＳＫＳＤＦＳＥＦＧＡＫＲＫＦＴＱＳＦＭＲＳＥＥＥＧＥＫＥＲＴ
ＥＮＲＥＥＧＲＦＡＳＧＲＲＳＱＹＲＲＳＮＤＲＥＥＥＥＭＤＤＥＡＩＩＡＡＷ
ＲＲＲＱＥＥＴＲＴＫＬＱＫＲＲＥＤ
【０３５０】 ５４４−６１２からのｃＤＮＡ配列はいずれのＥＳＴにもカバーされていない
。したがって，上流および下流の配列は異なる遺伝子であるかもしれず，位置６
１３における開始は，後のＭＬＥＳＡＥで開始するペプチドを与える。これは，
最も近いマウスホモログ，ＰＴＰ１３と良いホモロジーおよび同じＮ末端長さを
有する蛋白質を与える。ｉｎｃｙｔｅＥＳＴ０６１６８８．１および７６６８６
４８Ｈ１の比較により見いだされる潜在的な選択的スプライシング形は，Ｎ末端
を欠失し，その代わりに配列ＭＴＰＥＫで開始する蛋白質の形を予測する。
【０３５１】 ＳＧＰ０１８（配列番号４）は４３６１ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置２０８で開始し，位置３６０９で終了し，３４０２
ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１１３３アミノ酸の長さで
ある。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以
下のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホ
スファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子の染色体位置はマップされていない
。この遺伝子は次の位置に一塩基多型候補を含む：２９２９＝Ｍ（ａｇａａｇａ
ｔｇｔｃｔｇａｇｔａｃｍ）ｄｂＳＮＰ｜ｓｓ１７６５９４１；１１６１＝Ｓ（
ｃａｔｃｔａｃｃｃｃａａｔｇａｓ）ｄｂＳＮＰ｜ｓｓｌ７６５９４０。この遺
伝子の公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：ＢＦ
１１４８８１。この遺伝子は以下のヌクレオチド位置において反復配列を有する
：１６０３−１６２７。
【０３５２】ＳＧＰ００３（配列番号５） ＳＧＰ００３配列は，Ｃｅｌｅｒａコンティグ１７３００００１９６１３５１
９およびＮＣＢＩホモログテンプレートｇｉ＿７７０５９５９を用いるＧｅｎｅ
ｗｉｓｅから誘導し，ゲノムウォーキングにより終止コドンまで延長した。ｃＤ
ＮＡテンプレートは，４つのＥＳＴクローン，筋肉から２つ，骨および副甲状腺
から各１つを用いて構築した。ＨＧＰコンティグｇｉ｜１０１７８２６６を用い
て配列中のフレームシフトを補正し，ゲノムを最初の終止コドンまで５’ウォー
キングすることにより配列をさらに延長した。ＳＧＰ００３は，開始コドンの前
にヌクレオチド３からヌクレオチド２３９まで延びる２３５ヌクレオチドオープ
ンリーディングフレームを有し，これは以下に大文字で示される： ｃａＡＧＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＡ
ＡＧＣＡＧＡＴＧＴＣＡＴＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣ
ＡＣＧＣＡＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＣＴＡＡＡＡＡＴ
ＡＧＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＣＧ
ＧＣＴＧＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＡＣＧ
ＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧ
ＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＡａｔｇ このオープンリーディングフレームは以下のペプチド配列をコードする： ＱＧＦＱＶＡＬＥＮＨＦＡＳＲＣＨＲＳＰＬＲＬＤＧＴＱＧＱＲＨＲＳＤＰＫＮ
ＲＰＬＬＰＶＧＶＡＧＲＡＡＡＴＣＰＴＤＱＮＬＰＴＲＰＧＰＧＴＰＳＣＲＫＥ
ＲＫＳＬＧＳＫ 位置２４０の開始コドンは，開始メチオニンに関するコザック規則に合致してお
り，−３位にＡを有する。
【０３５３】 ＳＧＰ００３（配列番号５）は１２６２ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置２４０で開始し，位置９０２で終了し，６６３ヌク
レオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２２０アミノ酸の長さである。
この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下のよ
うに分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホスファ
ターゼ，ＤＳＰ，ＭＥＴ。この遺伝子は染色体位置ＣＨＲ１０にマップされる。
この遺伝子は以下のヌクレオチド位置において反復配列を有する：３１１−３３
４。
【０３５４】ＳＧＰ０１４（配列番号６） ＳＧＰ０１４の配列は，Ｃｅｌｅｒａコンティグ９２０００００５０３３０３
１から，蛋白質ホモログテンプレートｇｉ＿７２９３５３２，ｇｉ＿７７０５９
５９およびｇｉ＿９５０２０７４を用いるｇｅｎｓｃａｎおよびｇｅｎｅｗｉｓ
ｅを用いて構築した。予測されたｇｅｎｅｗｉｓｅ／ｇｅｎｓｃａｎ蛋白質をｄ
ｂＥＳＴからのいくつかのＥＳＴ（ＡＡ７２３２７１，ＡＷ４４４８９０．１，
ＡＡ４３５５１３．１）との重複により延長し，公共の配列ｇｉ｜７７０５９５
９で確認した。全長推定ペプチドは５４９アミノ酸であり，全長ＤＳＰドメイン
は３７−１８１および３６８−５４１である。以下のＮＣＢＩ ＥＳＴはこの遺
伝子に由来する：ｇｉ｜１１１０５８５７，ｇｉ｜１９９８３３４，ｇｉ｜１４
２３３４０，ｇｉ｜２１８６４８１，ｇｉ｜６９８６６５２，ｇｉ｜ｌＯ３７２
５３３，ｇｉ｜２１８６３０５，ｇｉ｜４８２５８８０，ｇｉ｜２７４０９０８
，ｇｉ｜３２１３９５３，ｇｉ｜２４３６３５０，ｇｉ｜２１４０４２７，ｇｉ
｜２８３３９１９，ｇｉ｜５７６８１５４，ｇｉ｜１ｌ３４００９，ｇｉ｜２０
４６５８０，ｇｉ｜４８２２４１１，ｇｉ｜１１１５２９２７。以下のＩｎｃｙ
ｔｅ配列はこの遺伝子に由来する：１２８０７７．１，１３８４２５５．１，８
００９８３８Ｈ１，３０４４２１ＣＢ１。選択的スプライシングは非常に一般的
である。個々のエクソンは以下のとおりである：エクソンの末端の挿入アミノ酸
は，少なくとも全長形においてはエクソンを横断する残基である。
【０３５５】 エクソン１：ＭＡＥＴＳＬＰＥＬＧＧＥＤＫＡＴＰＣＰＳＩＬＥＬＥＥＬＬＲ
ＡＧＫＳＳＣＳＲＶＤＥＶＷＰＮＬＦＩＧＤ（Ａ） エクソン２：ＡＴＡＮＮＲＦＥＬＷＫＬＧＩＴＨＶＬＮＡＡＨＫＧＬＹＣＱＧＧ
ＰＤＦＹＧＳＳＶＳＹＬＧＶＰＡＨＤＬＰＤＦＤＩＳＡＹＦＳＳＡＡＤＦＩＨＲ
ＡＬＮＴＰＧ（Ａ） エクソン３：ＫＶＬＶＨＣＷＧＶＳＲＳＡＴＬＶＬＡＹＬＭＬＨＱＲＬＳＬＲＱ
ＡＶＩＴＶＲＱＨＲＷＶＦＰＮＲＧＦＬＨＱＬＣＲＬＤ（Ｈ） エクソン４：ＷＳＬＬＰＡＭＧＬＣＨＦＡＴＬＡＬＩＬＬＶＬＬＥＡＬＡＱＡＤ
ＴＱＫＭＶＥＡＱＲＧＶＧＰＲＡＣＹＳＩＷＬＬＬＡＰＴＰＰＬＳＨＣＬＱＳＰ
Ｑ エクソン５：ＫＱＨＱＶＣＧＤＲＲＬＫＡＳＳＴＮＣＰＳＥＫＣＴＡＷＡＲＹＳ
ＨＲＷ エクソン６：ＡＨＩＬＶＰＬＫＩＱＬＲＲＶＰＤＳＦＳＱＱＭＰＥＴＳＹＬＴＲ
ＶＧＰＤＩＱＣＷＰＥＳＷ（Ｇ） エクソン７：ＭＤＳＬＱＫＱＤＬＲＲＰＫＩＨＧＡＶＱＡＳＰＹＱＰＰＴＬＡＳ
ＬＱＲＬＬＷＶＲＱＡＡＴＬＮＨＩＤＥＶＷＰＳＬＦＬＧＤ（Ａ） エクソン８：ＹＡＡＲＤＫＳＫＬＩＱＬＧＩＴＨＶＶＮＡＡＡＧＫＦＱＶＤＴＧ
ＡＫＦＹＲＧＭＳＬＥＹＹＧＩＥＡＤＤＮＰＦＦＤＬＳＶＹＦＬＰＶＡＲＹＩＲ
ＡＡＬＳＶＰＱ（Ｅ） エクソン９：ＤＧＨＧＣＬＦＦＰＫＧＷＶＶＱＧＱＶＡＤＡＫＬＶＬＰＴＧＲＶ
ＬＶＨＣＡＭＧＶＳＲＳＡＴＬＶＬＡＦＬＭＩＣＥＮＭＴＬＶＥＡＩＱＴＶＱＡ
ＨＲＮＩＣＰＮＳＧＦＬＲＱＬＱＶＬＤＮＲＬＧＲＥＴＧＲＦ
【０３５６】 ＤＳＰドメイン１はエクソン１の後半分からエクソン３に達し，ドメイン２は
エクソン７の末端近くからエクソン９のほぼ末端に達する。ＥＳＴにより示され
る選択的スプライシング：エクソン９の開始点（ＥＤＧ−ＬＰＴ）は，ｇｉ｜６
９８６６５２，ｇｉ｜２１８６３０５において欠失しており，ｇｉ＿１０３７２
５３３はエクソン８の末端およびエクソン９の開始点（ＫＦＱ−ＬＰＴ），を欠
失しており，ｇｉ｜１１１０５８５７はエクソン２，３，４，６，およびエクソ
ン９の開始点（ＥＤＧ−ＧＲＶ）を欠失している。これはエクソン１と５の間に
フレームシフトを有し，これはシークエンスエラーであろう。ｇｉ＿２１８６４
８１はエクソン２，３，６を欠失している。ｇｉ｜２７４０９０８，ｇｉ｜２４
３６３５０，ｇｉ｜２１４０４２７，ｇｉ｜２８３３９１９は，エクソン９の末
端近くのコンセンサスに対してフレームシフトを有し，これはＮＳＧＦの後の配
列をＳＧＳＳＲＦＷＴＴＤＷＧＧＲＲＧＧＳＤＬＡＧＳＱＤＰで置き換える。こ
の変化により，ホスファターゼドメインの末端が破壊され，これはデータベース
中のいずれとも類似していない。これは個体間のゲノム多型または反復配列エラ
ーのためであろう。あるいは，ある形の遺伝子制御のためであるかもしれない。
これらのＥＳＴは，精巣（２，同じライブラリ），前立腺および心臓に由来して
おり，したがって，ライブラリのアルチファクトではない。８００９８３８Ｈ１
はＹＬＧ−ＳＳＡからのエクソン２中に内部欠失を有する。３０４４２１ＣＢ１
は，エクソン２−６を欠失しており，エクソン１と７の間にフレームシフトを有
し，エクソン９の開始点を欠失している。１２８０７７．１はエクソン２，３，
６およびエクソン９の開始点を欠失している。
【０３５７】 ＳＧＰ０１４（配列番号６）は１９１７ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置３１で開始し，位置１６８０で終了し，１６５０ヌ
クレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は５４９アミノ酸の長さである
。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下の
ように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホスフ
ァターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置１０ｑ２１．３にマップさ
れる。この染色体位置は以下のヒト疾病と関連づけられている：頭頚部扁平上皮
癌（１０ｑ２１−ｑ２２，２／３０）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．）。こ
の遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：
ＡＡ７２３２７１，ＡＷ４４４８９０．１，ＡＡ４３５５１３．１。
【０３５８】ＳＧＰ０６０（配列番号７） ＳＧＰ０６０の配列は，Ｃｅｌｅｒａコンティグ６５１４０３５＿１および蛋
白質ホモログＮＰ＿０５７４４８を用いるＧｅｎｅｗｉｓｅから導かれる。配列
を延長するために用いたＮＣＢＩ ＥＳＴには，ＢＦ２０７２３２，ＢＦ３１４
８１８，ＡＷ９５３２１６．１が含まれる。
【０３５９】 ＳＧＰ０６０（配列番号７）は６３６ヌクレオチドの長さである。オープンリ
ーディングフレームは位置１で開始し，位置６３６で終了し，６３６ヌクレオチ
ドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２１１アミノ酸の長さである。この配
列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下のように分
類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホスファターゼ
，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置８ｐ１１．１−ｑ１１．１セントロ
メアにマップされる。この染色体位置は，以下の疾病と関連づけられている：乳
癌腫（８ｐ１１−ｐ１２，８／５３）；非小細胞肺癌（１８ｐ１１．２，２／５
０）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．）。この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥ
ＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：ＢＦ２０７２３２，ＢＦ３１４８
１８，ＡＷ９５３２１６．１。
【０３６０】ＳＧＰ００８（配列番号８） Ｃｅｌｅｒａコンティグ７８０００００６０９１４１５について，ホモログｇ
ｉ｜９９１０４３２，ｇｉ｜７２９４４６６およびｇｉ｜７２９８９８８を用い
てＧｅｎｓｃａｎおよびｇｅｎｅｗｉｓｅを行った。公共ＥＳＴｇｉ｜７２８０
５５４，ｇｉ｜６９２５６７７およびｇｉ｜６１４２１４０，およびＩｎｃｙｔ
ｅ配列７４７５５７６ＣＢ１を用いてこれらを確認し，延長した。予測ｃＤＮＡ
は，Ｃｅｌｅｒａコンティグおよび現在のＨＧＰコンティグからの配列を用いて
補正した。非ヒトＥＳＴおよび公共の蛋白質配列との比較から，アミノ酸位置９
５（ＭＧＮＧ）において蛋白質の内部の開始が存在することが示される。
【０３６１】 ＳＧＰ００８（配列番号８）は１３２６ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置１で開始し，位置９９０で終了し，９９０ヌクレオ
チドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３２９アミノ酸の長さである。この
配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下のように
分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重ホスファター
ゼ，ＤＳＰ，ＳＴＹＸ。この遺伝子は染色体位置２０ｑｌ１．２にマップされる
。この遺伝子は次の位置に一塩基多型候補を含む：８７１＝Ｓ（ｃａｇｃａｇｃ
ｃｔｃｃｇａｇｇｇａａｃｃｓ）ｄｂＳＮＰ｜ｓｓ１３８９４１９。この遺伝子
の公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：ＡＷ４０
６６２０．１，ＢＦ３７７３６４．１，ＡＷ５９３２９６．１。この遺伝子は以
下のヌクレオチド位置において反復配列を有する：１２５１−１２７０。
【０３６２】ＳＧＰ０３９（配列番号９） ＳＧＰ０３９は，Ｃｅｌｅｒａ配列１７００００３０２７９７５６，およびＩ
ｎｃｙｔｅ配列２７２６１６．１および７４７６９０８ＣＢ１ｋら導かれる。
【０３６３】 ＳＧＰ０３９（配列番号９）は１０８３ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置１で開始し，位置１０８３で終了し，１０８３ヌク
レオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３６０アミノ酸の長さである。
この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これは以下のよ
うに分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セリンホスフ
ァターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子の染色体位置はマップされていない。
この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである
：ＢＥ１４７１３９。
【０３６４】ＳＧＰ０４０（配列番号１０） ＳＧＰ０４０の配列は，Ｃｅｌｅｒａ配列１７００００９１６０９０３９およ
びピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼの公共の配列ＮＭ０１８４４４．
１から導かれる。
【０３６５】 ＳＧＰ０４０，ＰＤＰ（配列番号１０）は１７２５ヌクレオチドの長さである
。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１７２５で終了し，１
７２５ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は５７４アミノ酸の長
さである。この配列は全長である（開始メチオニンから終止コドンまで）。これ
は以下のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セ
リンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置８ｑ２１．３
にマップされる。この染色体位置は以下のヒト疾病と関連づけられている：被膜
細胞リンパ腫（１８ｑ２１−ｑ２３；５／５０）（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａ
ｌ．）。この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとお
りである：ＡＶ７０６５３３．１，ＡＶ７０５５７１．１，ＡＶ７１０８０１．
１。
【０３６６】ＳＧＰ０１２（配列番号１１） ＳＧＰ０１２の配列は，ゲノムＤＮＡ入力としてＣｅｌｅｒａ配列９４０００
００２１２０４５３；１４２００００１６３６７２２５；１４２００００１６０
０６７５３を用い，蛋白質ホモログとしてＮＰ＿０３１９８１（ネズミＰＴＰ−
ＥＳＴ）を用いるＧｅｎｅｗｉｓｅから導かれる。この配列と重複するＩｎｃｙ
ｔｅ ＥＳＴＳには，１００５３０３．１および７１０９６５１＿３が含まれる
。この配列と重複する公共ＥＳＴには，ＡＬ０４２５３２．１，ＡＩ３８１５７
１，およびＡＷ８７２６７７が含まれる。
【０３６７】 ＳＧＰ０１２ＰＴＰ−ＥＳＰ（配列番号１１）は４７１９ヌクレオチドの長さ
である。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置４７１９で終了
し，４７１９ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。この遺伝子のゲノム配列は
かなり質が低い。すなわち，まだ組み立てられておらず，明らかな配列の誤りを
有する。したがって，核酸および蛋白質配列は部分的であり，配列中に"Ｘ"で示
されるギャップを有する。予測蛋白質は１５７３アミノ酸の長さである。この配
列は触媒ドメインを含む。これは以下のように分類される（スーパーファミリー
／グループ／ファミリー）：チロシンホスファターゼ，ＲＰＴＰ，ＰＴＰｄ。こ
の遺伝子の染色体位置はマップされていない。この遺伝子の公共ドメイン（ｄｂ
ＥＳＴ）におけるＥＳＴは以下のとおりである：ＡＬ０４２５３２．１，ＡＩ３
８１５７１，ＡＷ８７２６７７。この遺伝子は以下のヌクレオチド位置において
反復配列を有する：１３０５−１３２４。
【０３６８】ＳＧＰ０２４（配列番号１２） ＳＧＰ０２４は，は，ゲノム起源としてＣｅｌｅｒａＤＮＡ配列１４２０００
０１６２２６６９２，蛋白質ホモログとしてＮＰ＿００２８３０．１（ヒトＰＴ
Ｐデルタ）を用いるＧｅｎｅｗｉｓｅから導かれる。
【０３６９】 ＳＧＰ０２４（配列番号１２）は３５４ヌクレオチドの長さである。オープン
リーディングフレームは位置１で開始し，位置３５７で終了し，３５７ヌクレオ
チドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１１８アミノ酸の長さである。この
配列は部分的触媒ドメインである。これは以下のように分類される（スーパーフ
ァミリー／グループ／ファミリー）：チロシンホスファターゼ，レセプターＰＴ
Ｐ，ＰＴＰデルタサブファミリー。
【０３７０】実施例２：予測蛋白質 ＳＧＰ００６，ＫＩＡＡ１２９８（配列番号１）は配列番号１３の１０４９ア
ミノ酸の長さの蛋白質をコードする。これはＭＫＰとして分類される。この蛋白
質中のホスファターゼドメインはＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼの隠れマルコフ
プロファイルとプロファイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする（
全長触媒ドメイン）。コードされる蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸３０８
からアミノ酸４４６である。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこ
の蛋白質配列でスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下のとおりである
。ＳＧＰ００６のＣ末端（アミノ酸位置３２２−１０４９）はＫＩＡＡ１２９８
蛋白質［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］と１００％同一である。出力の概要は以下
のとおりである：Ｐ値＝０；同一のアミノ酸の数＝７１５；パーセント同一性＝
１００％；パーセント類似性＝１００％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受
託番号はＢＡＡ９２５３６．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前
または説明および種は以下のとおりである：ＫＩＡＡ１２９８蛋白質［Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓ］。ＫＩＡＡ１２９８とのこの蛋白質のＮ末端側の領域は新規
である。アミノ酸１２０−４７７について，アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共デ
ータベースをスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下のとおりである：
Ｐ値＝１．５０Ｅ−９９；同一のアミノ酸の数＝２４８；パーセント同一性＝４
６％；パーセント類似性＝５９％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号
はＢＡＡ８９５３４．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または
説明および種は以下のとおりである：ＭＡＰキナーゼホスファターゼ［Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ］。ＳＧＰ００６のＮ末端配列のアミ
ノ酸１−２６３もまた新規であり，アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベー
スをこの蛋白質配列でスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下のとおり
である：Ｐ値＝６．８０Ｅ−５８；同一のアミノ酸の数＝１１９；パーセント同
一性＝４１％；パーセント類似性＝５９％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の
受託番号はＮＰ−０６０３２７．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の
名前または説明および種は以下のとおりである：仮定蛋白質ＦＬＪ２０５１５［
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３７１】 ＳＧＰ００２（配列番号２）は，配列番号１４の６６５アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＭＫＰとして分類される。この蛋白質中のホスファター
ゼドメインは，ＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼドメインの隠れマルコフとプロフ
ァイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする（全長触媒ドメイン）。
コードされる蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸１５８からアミノ酸２９７で
ある。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス
・ウォーターマン検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐ値＝１．１０Ｅ−
１５７；同一のアミノ酸の数＝３０４；パーセント同一性＝４６％；パーセント
類似性＝６０％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿００４４
１１．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は
以下のとおりである：二重特異性ホスファターゼ８［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
］。この蛋白質はローダネース様ドメインを含む（アミノ酸１１−１３１）。ロ
ーダネースドメインはチオ硫酸：シアニドサルファトランスフェラーゼ（ＥＣ２
．８．１．１）活性と関連づけられている。このドメインの存在は，ＳＧＰ００
２が細胞の酸化還元環境に応答して制御されていることを示すかもしれない（Ｎ
ａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
２０００ Ａｐｒ；３２（４）：４６５−７３；Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ ａｓ ａ
ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｏｘｉｄａｓｅ）。
【０３７２】 ＳＧＰ００１（配列番号３）は，配列番号１５の４９８アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＭＫＰとして分類される。この蛋白質中のホスファター
ゼドメインはＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼドメインの隠れマルコフプロファイ
ルとプロファイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする。コードされ
る蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸３０７からアミノ酸４４１である。アミ
ノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス・ウォータ
ーマン検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐスコア＝８．３０Ｅ−１３３
；同一のアミノ酸の数＝２５０；パーセント同一性＝４７％；パーセント類似性
＝６０％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＢＡＡ８９５３４．１
である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は以下のと
おりである：ＭＫＰ［Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ］。
【０３７３】 ＳＧＰ０１８（配列番号４）は，配列番号１６の１１３３アミノ酸の長さの蛋
白質をコードする。これはＭＫＰとして分類される。この蛋白質中のホスファタ
ーゼドメインはＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼドメインの隠れマルコフプロファ
イルとプロファイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする。コードさ
れる蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸１８５からアミノ酸３３０である。ア
ミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス・ウォー
ターマン検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐ値＝２．２０Ｅ−２７；同
一のアミノ酸の数＝７９；パーセント同一性＝４５％；パーセント類似性＝６３
％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号は０５７４４．１である；ＮＲ
ＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は以下のとおりである：
蛋白質ホスファターゼＬＯＣ５１２０７［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３７４】 ＳＧＰ００３（配列番号５）は，配列番号１７の２２０アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＭＫＰと分類される。この蛋白質中のホスファターゼド
メインはＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼドメインの隠れマルコフプロファイルと
プロファイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする。コードされる蛋
白質中の触媒領域の位置はアミノ酸５４からアミノ酸１９９である。アミノ酸配
列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス・ウォーターマン
検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐ値＝３．４０Ｅ−５４；同一のアミ
ノ酸の数＝９１；パーセント同一性＝４９％；パーセント類似性＝６８％；ＮＲ
ＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿０５７４４８．１である；ＮＲ
ＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は以下のとおりである：
蛋白質ホスファターゼＬＯＣ５１２０７［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３７５】 ＳＧＰ０１４（配列番号６）は，配列番号１８の５４９アミノ酸の長さの，２
つのホスファターゼドメインを有する蛋白質をコードする。この蛋白質中のいず
れのドメインもＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼプロファイルの隠れマルコフプロ
ファイルと位置１からプロファイル位置１７３でマッチする（全長）。両方のＤ
ＳＰドメインは類似しており，ｇｉ｜７７０５９５９（ヒト；この遺伝子の一部
），およびマウスからのＤＳＰ１３と最もよくヒットする。コードされる蛋白質
の触媒領域の位置は，Ｎ末端ドメインについてはアミノ酸３７からアミノ酸１８
１であり，Ｃ末端ドメインについては３６８から５２０である。
【０３７６】 アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス・ウ
ォーターマン検索を行った結果は以下のとおりである：アミノ酸３２４−５４９
について，Ｐ値＝７．５０Ｅ−１２２；同一のアミノ酸の数＝１９８；パーセン
ト同一性＝８８％；パーセント類似性＝８８％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録
物の受託番号はＮＰ＿０５７４４８．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白
質の名前または説明および種は以下のとおりである：蛋白質ホスファターゼＬＯ
Ｃ５１２０７［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。アミノ酸１−１９８については，
アミノ酸配列の公共データベースをスミス・ウォーターマン検索した結果は以下
のとおりである：Ｐ値＝８．２０Ｅ−３６；同一のアミノ酸の数＝７５；パーセ
ント同一性＝４５％；パーセント類似性＝６５％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登
録物の受託番号はＮＰ＿００４０８１．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋
白質の名前または説明および種は以下のとおりである：二重特異性ホスファター
ゼ３［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３７７】 ＳＧＰ０６０（配列番号７）は，配列番号１９の２１１アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＭＫＰと分類される。この蛋白質中のホスファターゼド
メインは，ＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼの隠れマルコフプロファイルとプロフ
ァイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする（全長）。コードされる
蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸６１からアミノ酸２０４である。アミノ酸
配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス・ウォーターマ
ン検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐ値＝１．１０Ｅ−４８；同一のア
ミノ酸の数＝８６；パーセント同一性＝５３％；パーセント類似性＝７２％；Ｎ
ＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿０５７４４８．１である；Ｎ
ＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は以下のとおりである
：蛋白質ホスファターゼＬＯＣ５１２０７［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３７８】 ＳＧＰ００８（配列番号８）は，配列番号２０の３２９アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＭＫＰ．／ＳＴＹＸと分類される。この蛋白質中のホス
ファターゼドメインはＭＫＰ／ＤＳＰホスファターゼドメインの隠れマルコフプ
ロファイルとプロファイル位置１からプロファイル位置１７３でマッチする。コ
ードされる蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸９８からアミノ酸２３５である
。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列でスミス・ウ
ォーターマン検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐ値＝４．４０Ｅ−１７
２；同一のアミノ酸の数＝２６０；パーセント同一性＝９２％；パーセント類似
性＝９２％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＣＡＣ１０００８．
１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は以下の
とおりである：新規蛋白質［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３７９】 ＳＧＰ０３９（配列番号９）は，配列番号２１の３６０アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＰＰ２Ｃと分類される。この蛋白質のホスファターゼド
メインは隠れマルコフプロファイルとプロファイル位置１からプロファイル位置
３０１までマッチする（全長触媒）。コードされる蛋白質中の触媒領域の位置は
アミノ酸９１からアミノ酸３４４である。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共デー
タベースをこの蛋白質配列でスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下の
とおりである：Ｐ値＝１．００Ｅ−１０６；同一のアミノ酸の数＝１６４；パー
セント同一性＝９８％；パーセント類似性＝９９％；ＮＲＡＡ中の最も類似する
登録物の受託番号はＡＡＤ１７２３５．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋
白質の名前または説明および種は以下のとおりである：ＰＰ２Ｃ［Ｍｕｓ ｍｕ
ｓｃｕｌｕｓ］。
【０３８０】 ＳＧＰ０４０，ＰＤＰ（配列番号１０）は，配列番号２２の５７４アミノ酸の
長さの蛋白質をコードする。これはＰＰ２Ｃと分類される。この蛋白質中のホス
ファターゼドメインは隠れマルコフプロファイルと位置１から位置３０１でマッ
チする。コードされる蛋白質中の触媒領域の位置はアミノ酸２０９からアミノ酸
４９７である。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベースをこの蛋白質配列
でスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下のとおりである：Ｐ値＝０；
同一のアミノ酸の数＝５７４；パーセント同一性＝１００％；パーセント類似性
＝１００％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託番号はＮＰ＿０６０９１４
．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は以下
のとおりである：ピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼ［Ｈｏｍｏ ｓａ
ｐｉｅｎｓ］。
【０３８１】 ＳＧＰ０１２ＰＴＰ−ＥＳＰ（配列番号１１）は，配列番号２３の１５７３ア
ミノ酸の長さの蛋白質をコードする。これは以下のように分類される：ＰＴＰ，
デルタホスファターゼ様。この蛋白質中のホスファターゼドメインは，隠れマル
コフプロファイルとＰＴＰホスファターゼのプロファイル位置１からプロファイ
ル位置２６４でマッチする（全長触媒）。コードされる蛋白質中の触媒領域の位
置はアミノ酸１０１０から１２５９である。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共デ
ータベースをこの蛋白質配列でスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下
のとおりである：Ｐ値＝０；同一のアミノ酸の数＝１０５３；パーセント同一性
＝６０％；パーセント類似性＝７０％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受託
番号はＮＰ＿０３１９８１．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前
または説明および種は以下のとおりである：胚性幹細胞ホスファターゼ［Ｍｕｓ
ｍｕｓｃｕｌｕｓ］。この蛋白質は５個のフィブロネクチンドメインを含む：
アミノ酸位置３５−１２０；１２８−２０８；３９０−４７１；４８４−５５８
；６６８−７４８。配列のギャップは"ＸＸＸ"により表される。
【０３８２】 ＳＧＰ０２４（配列番号１２）は配列番号２４の１１８アミノ酸の長さの蛋白
質をコードする。これはＰＴＰと分類され，ＰＴＰデルタと関連する。この蛋白
質中のホスファターゼドメインは，隠れマルコフプロファイルとＰＴＰのプロフ
ァイル位置２０５からプロファイル位置２６４でマッチする（これはＣ末端領域
を表す部分触媒ドメインである）。コードされる蛋白質中の触媒領域の位置はア
ミノ酸３からアミノ酸５８である。アミノ酸配列（ＮＲＡＡ）の公共データベー
スをこの蛋白質配列でスミス・ウォーターマン検索を行った結果は以下のとおり
である：Ｐ値＝５．９０Ｅ−５４；同一のアミノ酸の数＝９０；パーセント同一
性＝７６％；パーセント類似性＝８２％；ＮＲＡＡ中の最も類似する登録物の受
託番号はＣＡＡ３８０６８．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前
または説明および種は以下のとおりである：蛋白質チロシンホスファターゼデル
タ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］。
【０３８３】実施例３．新規哺乳動物蛋白質ホスファターゼの発現分析 選択された遺伝子についての遺伝子発現パターンを，以下の２つの手法を用い
て研究した：１）Ｓｕｇｅｎで開発した組織マイクロアレイ，４９９の組織を含
み，標識遺伝子で探索する；および２）Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの市販の組織アレ
イ，標識遺伝子で探索する。
【０３８４】１）組織アレイ 種々の起源に由来する"ｃＤＮＡライブラリ"をナイロン膜上に固定化し，目的
とする遺伝子に由来する３２Ｐ標識ｃＤＮＡフラグメントで探索した。ＲＮＡの
起源は表３に示される：１）Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗ
ａｒｄ，ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈａｉｎ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ３
．ｈｔｍｌ）：２）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）：３）ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／：ＡＴＣＣ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃａｔａ
ｌｏｇｓ．ｈｔｍｌから注文可能）により用いられた哺乳動物細胞株；４）Ｐａ
ｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｉｃ．ｃｏｍ／ｃｏ
ｍｐａｎｙ／ｓｕｂｓｉｄｉａｒｉｅｓ／ｐａｉ．ｈｔｍｌ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ｃＤＮＡアレイを調製するプロトコルは以下に詳
細に記載される。いくつかの細胞株を化合物で処理して，それが遺伝子発現にお
よぼす影響を評価した。８種類の処理を用いた：１）対照，２）低血清，３）２
００μＭミモシン，４）３ｍＭＨＵ，５）２μＭＡＵＲ２阻害剤，６）１０μＭ
シスプラチン，７）４００ｎｇ／ｍｌノコダゾール−２４時間，および８）４０
０ｎｇ／ｍｌノコダゾール−４８時間。処理した細胞株は細胞株名およびその次
の１−８の番号で示される。
【０３８５】 ４５０以上の組織または細胞株起源に由来する"ｃＤＮＡライブラリ"をナイロ
ン膜に固定化し，目的とする遺伝子に由来する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメン
トで探索した。ｃＤＮＡを作成するためには，総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを逆転写
反応においてテンプレートとして用いて，両端に特定の配列でタグ付けされた一
本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を生成した。特定の配列（ＣＤＳ：ＡＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ30ＶＮ（Ｖ＝Ａ，Ｇ，ＣＮ＝Ａ，Ｇ
，Ｃ，Ｔ））を含むオリゴｄＴプライマーは，ｍＲＮＡの３’末端のポリＡトラ
ックにアニーリングし，リバーストランスクリプターゼ（ＭＭＬＶ Ｒｎａｓｅ
Ｈ-）はＲＮＡ鎖の末端に到達するまでアンチセンス鎖を転写し，ここで追加の
Ｃ残基を付加する。３つのＧで終わるプライマー（ＳＭＩＩ：ＡＡＧＣＡＧＴＧ
ＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧまたはＭＬ２Ｇ：ＡＡＧＴＧＧ
ＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧ）を加えると，これは付加
されたＣにアニーリングし，ＭＭＬＶはプライマー配列の残りをテンプレートと
して認識して転写を続ける。その結果，合成されたｃＤＮＡは５’末端および３
’末端の両方に特定の配列タグを含む。５’末端および３’末端を同じ配列（Ｃ
ＤＳおよびＳＭＩＩ）でタグ付けした場合，これは"対称"と称される。５’末端
を３’末端とは異なる配列（ＣＤＳおよびＭＬ２Ｇ）でタグ付けした場合，これ
は"非対称"と称される。次に，付加された配列タグにアニーリングする３’ＰＣ
ＲおよびＭＬ２プライマー（３’ＰＣＲ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧ
ＣＡＧＡＧＴおよびＭＬ２：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴ
）を用いて，ＰＣＲ増幅により二本鎖"ｃＤＮＡライブラリ"を生成する。
【０３８６】 増幅させた"ｃＤＮＡライブラリ"を３８４ピンレプリケータを用いて手動でナ
イロン膜上に配列させた。ＤＮＡをアルカリ処理により変性させ，中和し，ＵＶ
光で架橋させた。アレイをＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でプレ
ハイブリダイズさせ，目的とする遺伝子に対応するｃＤＮＡフラグメントのラン
ダムヘキサマープライミングにより生成した32Ｐ標識プローブを用いてハイブリ
ダイズさせた。洗浄した後，ブロットをホスファーイメージングカセットに露光
し，シグナルの強度を定量した。アレイ上のＤＮＡの量もまた，非変性または変
性アレイをそれぞれＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＩまたはＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
ＩＩで２分間処理することにより定量した（１：１００，０００，５０ｍＭＴ
ｒｉｓ，ｐＨ８．０中）。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で洗浄した後，ホス
ファーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で蛍光放出を検
出し定量した。整列させたＤＮＡの量を用いてハイブリダイゼーションシグナル
を標準化し，補正値を表５に示す。
【０３８７】統計学的方法： ３種類のホスファターゼについてのこの組織アレイのデータを，異なる組織タ
イプにわたって，レンジ規格化を用いて統計学的分析用に規格化した。規格化は
，測定値を一般的スケールに変換する。我々は各変数の最も小さい値を各値から
引いてそのレンジで割るレンジ標準化を用いた。新たなスケールは０で始まり，
１．０で終わる。標準化したデータについて以下の統計学的方法を実行した：記
述的統計の生成，グラフによる可視化，階層的およびｋ平均クラスター分析（１
０，７，および５クラスター），および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いる群間の
比較。特定の組織タイプについて正常および腫瘍組織の両方のデータが存在する
場合，２つの群を差異について直接比較した。すべての統計学的分析は，対称お
よび非対称組織アレイ実験室方法について別々に行った。これは，過去のデータ
を用いた経験から，遺伝子発現は用いた方法に依存することがわかっているため
である。すべての統計学的分析はＳＹＳＴＡＴ９．０１（著作権１９９９，ＳＰ
ＳＳ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０３８８】結果の概要 表９−正常ヒト組織と癌細胞株，および正常組織と腫瘍試料との間の平均発現の
相違
【表１５】 対照：［ｎ＝４１（組織），６６（細胞株），４（正常細胞株），６２（腫瘍細
胞株），４０（正常組織），および１（腫瘍組織）］ 非対称：［ｎ＝１１２（組織），２６２（細胞株），４３（正常細胞株），２１
９（腫瘍細胞株），４９（正常組織），および６３（腫瘍組織）］
【０３８９】考察 １．ＳＧＰ００３（配列番号５） この遺伝子は，対称および非対称方法のいずれにおいても，組織試料（細胞株
試料と比較して）および正常試料（腫瘍試料と比較して）において一貫してより
高く発現されていることが観察された。対称方法において非対称方法におけるよ
りさらに大きい相違が認められた（表９）。しかし，不適切な試料サイズおよび
データの大きな変動のため，対称方法においては，この相違は統計学的に有意で
あるとは考えられなかった。一方，非対称方法における組織と細胞株試料との間
の２．３３倍の相違は，ｐ＜０．０５で統計学的に有意であった。このホスファ
ターゼは腫瘍試料において正常試料よりも高く発現されるため，これは腫瘍抑制
に役割を果たすかもしれない。この遺伝子の最も高いレベルの発現は，正常試料
，特に脳，胎児脳，胎児腎臓，および腺からの組織，例えば下垂体および副腎か
ら得られた試料において観察される。いくつかの腫瘍試料（リンパ芽球腫，神経
芽細胞腫，黒色腫，肺，結腸，乳，および腎臓腫瘍）において比較的高いレベル
の発現が認められた。選択されたクラスターおよびこのホスファターゼの発現レ
ベルにしたがうそのランキングは以下に示される：
【０３９０】 （対照データ） 最高平均発現によるクラスターランキング： ・クラスター１（単集合）．正常群：心臓試料（組織）。 ・クラスター２（単集合）．正常群：脊髄（組織）。 ・クラスター３（８メンバー）．正常群のみ：結腸（胃組織），結腸（小腸組織
），乳上皮細胞（細胞株），脾臓（ヘム組織），リンパ節（ヘム組織），胎児肺
（組織），胎児脳（神経組織），および前立腺（組織）。
【０３９１】 （非対称データ） 最高平均発現によるクラスターランキング： ・クラスター１（単集合）．正常群：副腎（組織）。 ・クラスター２（３メンバー）．正常群：胸腺（ヘム組織）。腫瘍群：肺癌腫（
細胞株），および神経試料（組織）。 ・クラスター３（１４メンバー）．正常群：甲状腺（組織），リンパ節（ヘム組
織），および心臓動脈内皮細胞（細胞株）；および腫瘍群：肺（組織），悪性黒
色腫，肺に転移（細胞株），乳（細胞株），未知（細胞株），乳（細胞株），Ｈ
ＮＳ（組織），内皮（細胞株），内皮（細胞株），前立腺（組織），腎臓（組織
），および腎臓腺癌（細胞株）。
【０３９２】２．ＳＧＰ０６０（配列番号７） 非対称方法における最高の発現は腫瘍試料であった。これらは異なる腫瘍タイ
プを表すが，種々の肺癌試料において一貫して非常に高い発現が認められた。こ
の遺伝子は肺癌において重要なオンコジンであるかもしれない。正常組織におい
ては，脳組織試料および胎児腎臓において最も高く発現されている。選択された
クラスターおよびこのホスファターゼの発現レベルにしたがうそのランキングは
以下に示される： 最高平均発現によるランキングクラスター（非対称データ）： ・クラスター１（２メンバー）．腫瘍群のみ：肺（組織）および肺癌腫（細胞株
）。 ・クラスター２（３メンバー）．腫瘍群：肺（組織）および卵巣腺癌（細胞株）
；および正常群：前立腺（組織）。 ・クラスター３（３メンバー）．腫瘍群のみ：肺（組織），神経芽細胞腫 （組織），および結腸癌腫（細胞株）。 ・クラスター４（８メンバー）．腫瘍群：ＭＧ（組織），ｓｍｃ（細胞株）， 神経膠芽細胞腫（細胞株），肺大細胞癌腫（細胞株），内皮（組織）， 原発性腎臓細胞癌腫（細胞株），および肺（組織）；および正常群：脳（組織）
。 ・クラスター５（１０メンバー）．腫瘍群：肺（組織），肺への悪性黒色腫転移
（細胞株），結腸腺癌（細胞株），腎臓（細胞株），未知試料（ＭＫポリＡ＋）
，乳（細胞株），腎臓原発性明細胞癌腫転移（細胞株），卵巣（組織），および
神経芽細胞腫（ケラチノサイト細胞株）；および正常群：胎児腎臓（組織）。
【０３９３】３．ＳＧＰ０１８（配列番号４） 非対称方法にしたがえば，この遺伝子は腫瘍試料でより高く発現されており（
正常試料と比較して），このパターンは，組織の間および細胞株試料のプールの
間で一致しており，統計学的に有意であった（表９）。この遺伝子は広範な範囲
の腫瘍タイプにわたり非常に高く発現しており，神経膠芽細胞腫および卵巣癌に
おいて特に重要でありうる。ＫＡＰと同様に，このホスファターゼは，マーカー
としておよび治療において優れた標的であるかもしれない。最高平均発現による
ランキングクラスター（非対称データ）： ・クラスター１（単集合）．腫瘍群：神経（組織）。 ・クラスター２（３メンバー）．腫瘍群のみ：ＨＮＳ（組織），腎臓腺癌（細胞
株），および卵巣（細胞株）。 ・クラスター３（５メンバー）．腫瘍群のみ：悪性黒色腫，肺への転移（細胞株
），結腸（細胞株，３ｍＭＨＵで処理），卵巣（細胞株，１０μＭシスプラチン
で処理），神経（細胞株，１０μＭシスプラチンで処理），およびＰＭＬ末梢血
，前骨髄球白血病（細胞株）。 ・クラスター４（１１メンバー）．腫瘍群：結腸（細胞株，１０μＭシスプラチ
ンで処理），乳（細胞株），内皮細胞（細胞株，低酸素症についてＨｅＬａ２５
ＸＤＥＦ−ＭＥＳで処理，４時間），未知試料（未知），子宮頚部（細胞株，４
００ｎｇ／ｍｌのｎｏｃｏで４８時間処理），腎臓（組織），肺（組織），肺（
組織），内皮細胞（細胞株），および肺（組織）；および正常群：ＨＵＶＥＣ（
細胞株，１０ｍｎＰＤＧＦ刺激で処理）。 ・クラスター５（２７メンバー）．腫瘍群：腎臓癌腫（細胞株），肺（組織），
神経（細胞株，１０μＭシスプラチンで処理），肺（組織），骨（細胞株），乳
（細胞株），肺（組織），肺（細胞株，３ｍＭＨＵで処理），神経（細胞株，４
００ｎｇ／ｍｌのｎｏｃｏで２４時間処理），内皮細胞（細胞株，低酸素症につ
いてＨｅＬａ２５ＸＤＥＦ−ＭＥＳで処理，０時間），卵巣（細胞株，２μＭＡ
ＵＲ２阻害剤で処理），乳（細胞株，正常／１０％ＦＢＳで処理），乳（細胞株
，２μＭＡＵＲ２阻害剤で処理），乳（細胞株，２００μＭミモシンで処理），
骨（細胞株，低血清／０．１％ＦＢＳで処理），結腸（細胞株，１０μＭシスプ
ラチンで処理），子宮頚部（細胞株，低血清／０．１％ＦＢＳで処理），内皮細
胞（細胞株），腎臓（組織），膵臓（組織），および腎臓（細胞株）；正常群：
内皮細胞（細胞株，ＨＵＶＥＣＶＥＧＦ＋５４１６で処理，２４時間），肺（組
織），内皮細胞（細胞株，ＨＵＶＥＣ未刺激／対照），および胃（結腸組織）。
【０３９４】２）多数組織発現ブロット（ＭＴＥ） ＭＴＥ（多数組織発現）ブロットは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した（表６を参照）。これらのブロットは，正常ヒト
組織およびヒト細胞株に由来する８４個の整列したｃＤＮＡ試料および対照を含
んでいた。発現ブロットを０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含むＥｘｐ
ｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）で６５℃で２時間プレハイブリダイズさせた。放射性ＤＮＡプロ
ーブは，ランダムプライミングＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて調製し
た。精製したＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）をキットのプロトコルを用いて
２５０μＣｉの３２Ｐ標識ｄＣＴＰで４５分間標識した。スピンカラム（Ｐｒｏ
ｂｅＱｕａｎｔＧ５０マイクロカラム，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
，Ｉｎｃ．）を用いて取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。３分間煮沸
することにより変性させた後，プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に加
え，ブロットを６５℃で２０時間ハイブリダイズさせた。次にブロットを１５ｍ
ＭＮａＣｌ，１．５ｍＭクエン酸ナトリウム，０．１％ラウリル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を含む溶液で６５℃で４回各１５分間洗浄し，ホスファーイメージャ
ースクリーンに露光して定量した。
【０３９５】結果 ＳＧＰ０１２（配列番号１１，配列番号２３をコード）は，以下の組織で最も
高く発現されている：精巣；小脳，右；結腸，下向；小脳，左；リンパ節；バー
キットリンパ腫；ダウジ；および乳腺。この発現のパターンは，ＳＧＰ０１２が
中枢神経系（小脳発現），免疫系疾病（リンパ節，バーキットリンパ腫，および
ダウジはすべて免疫系組織である），または乳癌（組織乳における発現から）の
疾病において役割を果たすかもしれないことを示唆する。
【０３９６】 ＳＧＰ００２（配列番号２，配列番号１４をコード）は，以下の組織で最も高
く発現されている：副腎；胎盤；前立腺；唾液腺；乳腺；下垂体。前立腺および
乳における発現は，このホスファターゼがこれらの組織の癌において役割を果た
すことを示すかもしれない。副腎における発現は，副腎により制御される代謝性
プロセス，例えばストレス応答において役割を果たすことを示すかもしれない。
【０３９７】実施例４：哺乳動物蛋白質ホスファターゼの染色体位置 いくつかの情報源を用いて，本発明の遺伝子のそれぞれの染色体上の位置に関
する情報を得た。最初に，核酸配列の受託番号を用いてＵｎｉｇｅｎｅデータベ
ースを検索した。Ｕｎｉｇｅｎｅサーチエンジンを含むサイトは，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／Ｈｓ．Ｈｏｍ
ｅ．ｈｔｍｌである。Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中のマップ位置の情報は，い
くつかの情報源，例えば，ｔｈｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈ
ｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ
．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ），Ｔ
ｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ．ｉｎｆｏｂｉ
ｏｇｅｎ．ｆｒ／ｇｄｂ／ｓｉｍｐｌｅＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ），およびｔｈ
ｅ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｙｓｉｃａｌ
ｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８０００／ｃ
ｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｓｔｓ＿ｉｎｆｏ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ｒｅｌｅ
ａｓｅ）から得た。ＵｎｉｇｅｎｅがＥＳＴをマップしなかった場合には，既に
マップされている配列を含むデータベース，例えばｄｂｓｔｓおよびｈｔｇｓ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ
ａｓｔｄａｔａｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）に対して目的とする遺伝子についての核
酸をクエリーとして用いた。核酸配列はＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗ
ｂｌａｓｔ）でＢＬＡＳＴ−２を用いて検索し，これを用いてｄｂｓｔｓまたは
ｈｔｇｓのいずれかにクエリーを行った。これらの方法のいずれかにより細胞遺
伝学的領域を同定した後，ＯＭＩＭを細胞遺伝学的位置で検索することにより，
疾病との関連を確立する。ＯＭＩＭは，疾病により系統づけられた細胞遺伝学的
マップ位置の検索可能なカタログを維持する。また，細胞遺伝学的領域について
の入手可能な文献の徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ
）を用いて行う。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体異常と
の関連についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐ
ａｔｈｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことができる。
結果は上述の核酸の節で議論される。
【０３９８】実施例５：一塩基多型（ＳＮＰｓ）候補 材料および方法 ヒトＤＮＡにおける最も一般的な変種は一塩基多型（ＳＮＰｓ）であり，これ
は，約１００−３００塩基に１回生ずる。ＳＮＰｓは大規模の関連遺伝学研究を
容易にすると予測されているため，最近，ＳＮＰの発見および検出に多大な興味
がもたれている。本明細書に記載される遺伝子の候補ＳＮＰｓは，核酸配列を公
共のデータベースに記録されているＳＮＰｓを含む配列に対してｂｌａｓｔｎ検
索することにより同定した（ｄｂＳＮＰ，ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐｂｌａｓｔｐｒｅｔｔｙ．ｈ
ｔｍｌ）。ＳＮＰ含有配列についてｄｂＳＮＰ受託番号が与えられている。ＳＮ
Ｐｓはまた，発現遺伝子（ｄｂＥＳＴ，ＮＲＮＡ）およびゲノム配列（すなわち
ＮＲＮＡ）のいくつかのデータベースを一塩基対ミスマッチについて比較するこ
とにより同定した。結果は，表２の"ＳＮＰｓ"のカラムに示される。これらは候
補ＳＮＰｓである。ヒト集団におけるこれらの実際の頻度は決定していない。以
下のコードはそれぞれのＤＮＡ配列を表す標準である： Ｇ＝グアノシン Ａ＝アデノシン Ｔ＝チミジン Ｃ＝シチジン Ｒ＝ＧまたはＡ，（プリン） Ｙ＝ＣまたはＴ，（ピリミジン） Ｋ＝ＧまたはＴ，（ケト） Ｗ＝ＡまたはＴ，（弱）（２つの水素結合） Ｓ＝ＣまたはＧ，（強）（３つの水素結合） Ｍ＝ＡまたはＣ，（アミノ） Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ（すなわち，Ａ以外） Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ（すなわち，Ｃ以外） Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ（すなわち，Ｇ以外） Ｖ＝Ａ，ＣまたはＧ（すなわち，Ｔ以外） Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ，（任意） Ｘ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ 相補的ＤＮＡ鎖
【表１６】
【０３９９】 例えば，２つのバージョンの遺伝子が存在し，一方は所定の位置に"Ｃ"を有し
，他方は同じ位置に"Ｔ”を有する場合，その位置はＹと表され，これはＣまた
はＴを意味する。表１においては，ＳＧＰ００２についてＳＮＰのカラムには"
１１６５＝Ｒ"と記載されており，これは，位置１１６５において多型が存在す
ることを意味する。この位置は，場合によりＧを，場合によりＡを含む（ＲはＡ
またはＧを表す）。ＳＮＰｓは，遺伝子に付随する遺伝性の特徴を同定するため
に重要であろう。
【０４００】結果 ＳＧＰ００６は位置６２２２に一塩基多型を有する：６２２２＝Ｒ（ｃｃａａ
ａｃａｔａａｇｔｇｇｃａｃａｒ）。ｄｂＳＮＰ受託番号はｒｓ８８１１７９で
ある。このＳＮＰは３’非翻訳領域に生ずる。
【０４０１】 ＳＧＰ０１８は位置１１６１に一塩基多型を有する；１１６１＝Ｓ（ｃａｔｃ
ｔａｃｃｃｃａａｔｇａｓ）。ｄｂＳＮＰ受託番号はｓｓ１７６５９４０である
。このＳＮＰによりペプチド配列が変化する：アミノ酸番号１８３は，ヌクレオ
チド５４９＝Ｇのときグルタミン酸であることができ；またはアミノ酸１８３は
ヌクレオチド５４９＝Ｃであるときアスパラギン酸であることができる。いずれ
のアミノ酸も酸性であるためこの変化はかなり保存的であるが，酵素の生物学を
変更する可能性がある。第２のＳＮＰはサイレントである：２９２９＝Ｍ（ａｇ
ａａｇａｔｇｔｃｔｇａｇｔａｃｍ），ｄｂＳＮＰ｜ｓｓ１７６５９４１。この
位置がＣまたはＡのいずれであっても，アミノ酸位置９７７はグリシンである。
【０４０２】 ＳＧＰ００８は位置８７１に一塩基多型を有する：８７１＝Ｓ（ｃａｇｃａｇ
ｃｃｔｃｃｇａｇｇｇａａｃｃｓ）。このＳＮＰのｄｂＳＮＰにおける受託番号
はｓｓ１３８９４１９である。これは非サイレント変化であり，位置２９１は，
ヌクレオチド８７１＝Ｇのときバリンであり，ヌクレオチド８７１＝Ｃのときロ
イシンである。この変化は酵素の生物学を変更する可能性がある。
【０４０３】実施例６：哺乳動物蛋白質ホスファターゼをコードするｃＤＮＡの単離 材料および方法 新規クローンの同定 総ＲＮＡは，原発性腫瘍，正常および腫瘍細胞株，正常ヒト組織，およびソー
トしたヒト造血細胞細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｐ．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１６２，１５６（１９８７））のグアニジン塩／フェノール抽出プロトコル
を用いて単離する。これらのＲＮＡを用いて，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｆ
ＯＣＵＳ １１，６６）を用いて，製造元により推奨される条件で一本鎖ｃＤＮ
Ａを生成する。典型的な反応においては，６０μｌの反応容量中で１０μｇの総
ＲＮＡおよび１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）12-18を用いる。生成物をＲＮａｓｅ
Ｈで処理し，Ｈ2Ｏで１００μｌに希釈する。続くＰＣＲ増幅のためには，１−
４μｌのこのｓｓｃＤＮＡを各反応において用いる。
【０４０４】 縮重オリゴヌクレオチドは，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４
８ＤＮＡ合成機で確立されたホスホルアミダイト化学を用いて合成し，エタノー
ルで沈澱させ，精製せずにＰＣＲ用に用いる。これらのプライマーは，いくつか
の蛋白質ホスファターゼの触媒ドメイン中の保存モチーフのセンスおよびアンチ
センス鎖に由来する。縮重ヌクレオチド残基の表示は以下のとおりである：Ｎ＝
Ａ，Ｃ，Ｇ，またはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ
，Ｇではない；Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ，Ｃではない；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＷ＝
ＡまたはＴ。
【０４０５】 ＰＣＲ反応は，多数の一本鎖ｃＤＮＡに適用される縮重プライマーを用いて行
う。プライマーをそれぞれ最終濃度５μＭで，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ
８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，各２００μＭデオキシヌ
クレオシド三リン酸，０．００１％ゼラチン，１．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ），および１−４μ
ｇのｃＤＮＡを含む混合物に加える。９５℃で３分間変性させた後，サイクルの
条件は，９４℃で３０秒間，５０℃で１分間，および７２℃で１分４５秒間を３
５サイクルである。３００−３５０ｂｐの間に移動したＰＣＲフラグメントをＧ
ｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて２％アガロースゲルから単離
し，製造元のプロトコルにしたがってｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｃｏｒｐ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）中にＴ−Ａクローニングする。
【０４０６】 Ｑｉａｇｅｎカラムを用いるミニプラスミドＤＮＡ調製用にコロニーを選択し
，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットおよびＡｍｐｌｉＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプ
ラスミドＤＮＡを配列決定する。配列決定反応生成物はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３
７７ ＤＮＡシークエンサーにかけ，ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズム（
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３−１０）を用いて分析する。
【０４０７】 追加のＰＣＲ戦略を用いて，正確なまたはほぼ正確なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて種々のＰＣＲフラグメントまたはＥＳＴを接続する。ＰＣＲ条件
は上述したとおりであるが，ただし，アニーリング温度は，式：Ｔｍ＝４（Ｇ＋
Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）を用いて各オリゴ対について計算する。
【０４０８】ｃＤＮＡクローンの単離： ヒトｃＤＮＡライブラリをホスファターゼ関連遺伝子に対応するＰＣＲまたは
ＥＳＴフラグメントで探索する。プローブをランダムプライミングにより32Ｐで
標識し，ライブラリスクリーニングの標準的手法にしたがって，２ｘ１０6ｃｐ
ｍ／ｍＬで用いる。プレハイブリダイゼーション（３時間）およびハイブリダイ
ゼーション（一夜）は，５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液，２．５％硫酸デキス
トラン，５０ｍＭＮａ2ＰＯ4／ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．０，５０％ホルムアミド
，１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で行う。ストリンジェントな
洗浄は，６５℃で，０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で行う。ＤＮＡ配列
決定は，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットを用い，Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用
いて両方の鎖について行う。配列決定反応生成物をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７
ＤＮＡシークエンサーにかける。
【０４０９】実施例７：蛋白質ホスファターゼ遺伝子発現 発現ベクターの構築 ヒトｃＤＮＡのいくつかから発現構築物を作成する：ａ）ｐＣＤＮＡ発現ベク
ター中の完全長クローン；ｂ）ＧＳＴ発現カセットのＣ末端に融合させた新規ホ
スファターゼの触媒ドメインを含むＧＳＴ融合構築物；およびｃ）ｐＣＤＮＡベ
クター中に挿入されたホスファターゼドメイン中の予測触媒部位にＣｙｓからＳ
ｅｒ（ＣからＳ）変異を含む完全長クローン。
【０４１０】 ホスファターゼの"ＣからＳ"変異体は優性負の構築物として機能するかもしれ
ず，これらの新規ホスファターゼの機能を解明するために用いられる。
【０４１１】実施例８：蛋白質ホスファターゼに対する特異的免疫試薬の作成 材料および方法 単離されたホスファターゼポリペプチドに対応するＫＬＨ−またはＭＡＰ−コ
ンジュゲート化合成ペプチドに対する特異的免疫試薬をウサギで生成させる。Ｃ
末端ペプチドをグルタルアルデヒドでＫＬＨとコンジュゲートさせ，遊離Ｃ末端
を残す。内部ペプチドは，ブロックされたＮ末端を用いてＭＡＰ−コンジュゲー
トさせる。追加の免疫試薬はまた，細菌で発現させた各新規ＰＴＰまたはＳＴＰ
の細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質でウサギを免疫することにより生成す
ることができる。内因性起源について試験する前に，最初に，種々の免疫血清を
，組換え蛋白質に対する反応性および選択性について試験する。
【０４１２】ウエスタンブロット ＳＤＳ ＰＡＧＥ上の蛋白質をイモビロン膜に移す。洗浄緩衝液はＰＢＳＴ（
標準的リン酸緩衝化食塩水，ｐＨ７．４＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で
ある。ブロッキングおよび抗体インキュベーション緩衝液はＰＢＳＴ＋５％ミル
クである。抗体希釈は１：１０００から１：２０００の範囲である。
【０４１３】実施例９：蛋白質ホスファターゼの組換え発現および生物学的アッセイ 材料および方法 哺乳動物細胞におけるホスファターゼの過渡的発現 ＳＴＥ２０関連ホスファターゼ構築物を含むｐｃＤＮＡ発現プラスミド（１０
μｇＤＮＡ／１００ｍｍプレート）をリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と
ともに２９３細胞中に導入する。７２時間後，細胞を０．５ｍＬの可溶化緩衝液
（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロ
ール，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＥＧＴ
Ａ，２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル，１μｇ／ｍＬアプロチニン）中に
回収する。試料アリコートを６％アクリルアミド／０．５％ビスアクリルアミド
ゲルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し，電気泳動
的にニトロセルロースに移す。非特異的結合は，ブロットをＢｌｏｔｔｏ（５％
ｗ／ｖ無脂乾燥ミルクおよび０．２％ｖ／ｖ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉ
ｇｍａ）を含有するリン酸緩衝化食塩水）中でプレインキュベートすることによ
りブロックし，種々の抗ペプチドまたは抗ＧＳＴ融合蛋白質特異的抗血清を用い
て組換え蛋白質を検出した。
【０４１４】インビトロホスファターゼアッセイ ホスファターゼ発現構築物でトランスフェクトした３日後，１０ｃｍプレート
の２９３細胞をＰＢＳで洗浄し，氷上でホスファターゼ阻害剤を含む２ｍＬのＰ
ＢＳＴＤＳで可溶化する（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．２５，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５％デオキシコール酸，０．１
％ＳＤＳ，０．２％アジ化ナトリウム，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，４
ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム，１％アプロチニン，５μｇ／ｍＬロイペプチ
ン）。細胞断片を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分間，４℃）により除去し，
溶解物をプロテインＡセファロースの１：１スラリー５０μｌとともにそれぞれ
１時間２回インキュベートすることにより前精製する。０．５ｍＬの精製上清を
，１０μｌのプロテインＡ精製ホスファターゼ特異的抗血清（ＧＳＴ融合蛋白質
または抗ペプチド抗血清から生成）プラス５０μｌのプロテインＡ−セファロー
スの１：１スラリーで，４℃で２時間インキュベートする。次にビーズをＰＢＳ
ＴＤＳ中で２回，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール）中で２回洗浄
する。
【０４１５】 セファロースビーズ上の免疫精製ホスファターゼを２０μｌのＨＮＴＧ＋３０
ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ ＭｎＣｌ2，および２０μＣｉ［α32Ｐ］ＡＴＰ（
３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）中に再懸濁する。ホスファターゼ反応は室温で３０分
間実施し，５０ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＨＮＴＧを加えることにより停止させ
る。試料をＨＮＴＧ中で６回洗浄し，ＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸し，６％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーにより分析する。リン酸化
アミノ酸の分析は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した32Ｐ−標識バンドの標
準的２Ｄ法により行う。細菌で発現させたホスファターゼのＧＳＴ融合構築物に
ついても同様のアッセイを行う。
【０４１６】実施例１０：サザンブロッティングによる遺伝子増幅の証明 材料および方法 ナイロン膜はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入する。変性溶
液は，０．４ＭＮａＯＨおよび０．６Ｍ ＮａＣｌを含む。中和溶液は，０．５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５および１．５ＭＮａＣｌを含む。ハイブリダイ
ゼーション溶液は，５０％ホルムアミド，６ＸＳＳＰＥ，２．５Ｘデンハルト溶
液，０．２ｍｇ／ｍＬ変性サケＤＮＡ，０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ，および
０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む。制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍから購入する。放射性標識プローブは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの
Ｐｒｉｍｅ−ｉｔＩＩキットを用いて調製する。プローブテンプレートに用いる
ベータアクチンＤＮＡフラグメントはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入する。
【０４１７】 種々の腫瘍細胞株（例えば，ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，Ｃａｌｕ−６
，Ａ５４９，ＨＣＴ−１５，ＨＴ−２９，Ｃｏｌｏ２０５，ＬＳ−１８０，ＤＬ
Ｄ−１，ＨＣＴ−１１６，ＰＣ３，ＣＡＰＡＮ−２，ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，Ｐ
ＡＮＣ−１，ＡｓＰｃ−１，ＢｘＰＣ−３，ＯＶＣＡＲ−３，ＳＫＯＶ３，ＳＷ
６２６およびＰＡ−１），および２つの正常細胞株から，ゲノムＤＮＡを単離す
る。
【０４１８】 各ゲノムＤＮＡ試料の１０μｇのアリコートをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し，
別の１０μｇの試料をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化する。制限酵素消化したＤ
ＮＡ試料を０．７％アガロースゲルに負荷し，電気泳動分離した後，標準的方法
によりＤＮＡをナイロン膜にキャピラリー移動させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）。
【０４１９】実施例１１：ファージディスプレイによる蛋白質−蛋白質相互作用の検出 材料および方法 ファージディスプレイは，所望のおとりに対する親和性に基づいて分子相互作
用を単離する方法を提供する。ファージ被覆蛋白質への融合としてクローニング
されたｃＤＮＡフラグメントは，ファージの表面にディスプレイされる。おとり
と相互作用するファージをアフィニティー精製により濃縮し，個々のクローンか
らの挿入ＤＮＡを分析する。
【０４２０】Ｔ７ファージディスプレイライブラリ すべてのライブラリは，Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−ｌｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ
）中で，製造元の指針にしたがって構築する。
【０４２１】おとりの提示 おとりとして用いるべき蛋白質ドメインは，ＧＳＴへのＣ末端融合体として作
成し，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。ペプチドは化学的に合成し，長鎖スペーサー
ビオチン試薬を用いてＮ末端でビオチン化する。
【０４２２】選択 ＰａｎＭｉｘおよびＥ．ｃｏｌｉ阻害剤カクテル（ＳｉｇｍａＰ−８４６５）
を補充した，新たに調製したライブラリ（１０10−１０12ｐｆｕ）のアリコート
を，固定化したおとりとともに室温で１−２時間インキュベートする。未結合フ
ァージを洗浄緩衝液でよく洗浄する（少なくとも４回）。３−４ラウンドの選択
の後，結合したファージを１００μｌの１％ＳＤＳ中に溶出し，アガロースプレ
ートに播種して，単一プラークを得る。
【０４２３】挿入ＤＮＡの同定 個別のプラークを２５μｌの１０ｍＭＥＤＴＡ中に取り出し，７０℃で１０分
間加熱することによりファージを破壊する。２μｌの破壊ファージを５０μｌの
ＰＣＲ反応混合物に加える。３５ラウンドの熱サイクル（９４℃，５０秒間；５
０℃，１分間；７２℃，１分間）により挿入ＤＮＡを増幅する。
【０４２４】緩衝液の組成 １０ｘＰａｎＭｉｘ ５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １０％無脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ） １０ｍＭＥＧＴＡ ２５０ｍＭＮａＦ ２５０μｇ／ｍＬヘパリン（ｓｉｇｍａ） ２５０μｇ／ｍＬ，剪断し，沸騰させたサケ精子ＤＮＡ（ｓｉｇｍａ） ０．０５％アジ化ナトリウム ＰＢＳ中で調製する。
【０４２５】洗浄緩衝液 ＰＢＳ，以下のもので補充： ０．５％ＮＰ−４０ ２５μｇ／ｍＬヘパリン ＰＣＲ反応混合物 １．０ｍＬ １０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，１５ｍＭＭｇを
含む） 各０．２ｍＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ保存液） ０．１ｍＬ Ｔ７ＵＰプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴ
ＡＴＴＣＣＡＧＴＣ ０．１ｍＬ Ｔ７ＤＮプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧ
ＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧ ０．２ｍＬ ２５ｍＭＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４，ＥＤＴＡ補償用 蒸留水で１０ｍＬとする 反応液５０μｌあたり１ユニットのＴａｑポリメラーゼを加える ライブラリ：Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−Ｈ４４１
【０４２６】化合物の評価 所定の任意の一連の化合物について，生物学的活性のスペクトルを観察するこ
とができることが理解されるであろう。１つの好ましい態様においては，本発明
は，細胞シグナル伝達に関連する蛋白質酵素，好ましくは蛋白質ホスファターゼ
，最も好ましくは蛋白質チロシンホスファターゼを調節する能力を示す化合物に
関する。以下に記載されるアッセイを用いて，最適な程度の所望の活性を示す化
合物を選択する。
【０４２７】 本明細書において用いる場合，"最適な程度の所望の活性"との語句は，疾患に
罹患している動物またはヒト患者に治療上有効量の本発明の化合物を可能な最低
の投与量で与えるような，細胞シグナル伝達を媒介し特定の疾患と関連する蛋白
質酵素に対する最高の治療指数（上で定義）を表す。
【０４２８】阻害的活性を決定するためのアッセイ 当該技術分野において知られる種々の方法を用いて，本発明の化合物による蛋
白質酵素，特に蛋白質ホスファターゼの活性の阻害を同定，評価またはアッセイ
することができる。例えば，限定されないが，ホスファターゼに関しては，その
ようなアッセイは，培養標的細胞を化合物に暴露し，（ａ）細胞溶解物を生化学
的に分析して，リン酸化された蛋白質のレベルおよび／または種類を評価する；
または（ｂ）試験物質に暴露されていない対照細胞と比較して，処理細胞におけ
る発現型のまたは機能的変化を評点することを含む。
【０４２９】 シグナル伝達レセプターの天然のリガンドの模倣体を同定または評価する際に
は，細胞を本発明の化合物に暴露し，天然のリガンドにのみ暴露された正対照，
および化合物にも天然のリガンドにも暴露されていない負対照と比較する。天然
のリガンドの非存在下で基底レベルでリン酸化されることが知られているレセプ
ター，例えばインスリンレセプターについては，アッセイはリガンドの非存在下
で行うことができる。リガンド誘導性シグナル伝達の阻害剤または促進剤を同定
または評価する際には，細胞を天然のリガンドの存在下で本発明の化合物に暴露
し，本発明の化合物に暴露されていない対照と比較する。
【０４３０】 以下に記載されるアッセイは，本発明の化合物がホスファターゼ活性を阻害す
る能力を評価する一次スクリーニングとして用いることができる。また，アッセ
イを用いて，ある範囲の濃度，例えば１００μＭ−１ｐＭの範囲を試験し，リン
酸化またはシグナル伝達の量が対照と比較して５０％減少するか増加する濃度（
ＩＣ50）を計算することにより，化合物の相対的効力を評価することができる。
【０４３１】生化学的アッセイ １つの態様においては，シグナル伝達の間にチロシン残基においてリン酸化ま
たは脱リン酸化される基質分子を有する標的細胞を本発明の化合物および放射性
標識したリン酸に暴露し，その後，これを溶解して目的とする基質を含む細胞内
容物を放出させる。基質は，ドデシルリン酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）技術を一次元または二次元で用いて細胞溶解物の
蛋白質成分を分離し，Ｘ線フィルムに暴露してリン酸化された蛋白質の存在を検
出することにより分析することができる。放射性標識を用いない同様の手法にお
いては，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した蛋白質成分をニトロセルロース膜に移
し，抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）抗体を用いてｐＴｙｒの存在を検出する。
あるいは，細胞溶解物を固体支持体に結合した基質特異的結合抗体とともにイン
キュベートすることにより目的とする基質を最初に単離し，次に非結合細胞成分
を洗い流し，抗ｐＴｙｒ抗体により固体支持体上のｐＴｙｒの存在または非存在
を評価することが好ましい。この好ましい方法は，自動化ロボットシステムによ
りマイクロタイタープレートフォーマットで容易に行うことができ，このことに
より，大量の試料を適当な短い時間枠で試験することができる。
【０４３２】 抗ｐＴｙｒ抗体は，放射性物質で標識することにより検出することができ，こ
れはオートラジオグラフィーによるその検出を容易にする。あるいは，抗ｐＴｙ
ｒ抗体を酵素，例えば西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化させ，次
にその酵素の適当な基質を加えることにより検出する。基質の選択は当業者には
明らかである。さらに別の方法は，ｐＴｙｒ抗体を認識する二次抗体と反応させ
ることにより抗ｐＴｙｒ抗体を検出することを含む。この二次抗体は，放射性物
質または先に記載した酵素で標識する。当該技術分野において知られる，抗体を
検出する他の任意の方法を用いることができる。
【０４３３】 上述の方法はまた，シグナル伝達基質分子を含む細胞溶解物およびホスファタ
ーゼが本発明の化合物およびキナーゼと混合されている無細胞系において用いる
こともできる。基質は，アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加えてキナーゼ反応を
開始することによりリン酸化される。化合物の活性を評価するためには，反応混
合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法により分析することができ，またはこれを固体支持
体に結合した基質−特異的結合抗体に加えて，分離されたまたは捕捉された基質
について上述した検出方法を実施して，ｐＴｙｒの存在または非存在を評価する
ことができる。結果を化合物を加えない反応混合物から得られた結果と比較する
。無細胞系には，天然のリガンドまたはその種類についての知識は必要ではない
。例えば，Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ．ａｌ，（米国特許５，１５５，０３１）は，基
質としてインスリンレセプターを，標的細胞としてラット脂肪細胞を用いて，過
バナジン酸がＰＴＰ活性を阻害する能力を示すことを記載する。Ｂｕｒｋｅ ｅ
ｔ．ａｌ．（１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
，２０４：１２９−１３４）は，自己リン酸化インスリンレセプターおよび組換
えＰＴＰ１Ｂを用いてホスホチロシル模倣体の阻害的活性を評価することを記載
する。
【０４３４】 基質蛋白質のリン酸化または脱リン酸化を測定することに加えて，第２のメッ
センジャーの産生の活性化または調節，細胞のイオンレベルの変化，シグナリン
グ分子の会合，解離または移動，遺伝子または特異的遺伝子の転写または翻訳の
誘導をモニターすることができる。これらの生化学的アッセイは，これらの目的
のために開発された慣用の手法を用いて行うことができる。
【０４３５】生物学的アッセイ 本発明の化合物がシグナル伝達を制御するＰＴＰの活性を調節する能力はまた
，リガンド結合に関連する形態学的または機能的変化を評点することにより測定
することができる。当該技術分野において知られる任意の定性的または定量的手
法を適用して，シグナリング経路においてホスファターゼの制御下にある細胞プ
ロセスを観察および測定することができる。そのような細胞プロセスには，限定
されないが，同化および異化プロセス，細胞増殖，細胞分化，細胞接着，細胞移
動および細胞死が含まれる。
【０４３６】 バナジン酸のホスファターゼ阻害剤としての種々の生物学的効果を研究するた
めに用いられてきた手法を，本発明の化合物について用いるために適合させるこ
とができる。例えば，バナジン酸は，ラット脂肪細胞においてグルコースおよび
グルコース類似体のインスリン感受性促進性輸送システムを活性化することが示
されている（Ｄｕｂｙａｋ ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２５６：５３０６−５３１２）。本発明の化合物の活性は，化合物に暴露し
たラット脂肪細胞におけるグルコース類似体，例えば２−デオキシ−3Ｈ−グル
コースの輸送の速度の増加を測定することにより評価することができる。バナジ
ン酸はまた，インスリンがラット脂肪細胞におけるグルコース酸化に及ぼす影響
を模倣する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８
４：５５６−５５８）。本発明の化合物は，14Ｃ−グルコースの14ＣＯ2への変
換を測定することにより，グルコース酸化の刺激について試験することができる
。さらに，ナトリウムオルトバナジン酸がエリスロポエチン媒介性細胞増殖に及
ぼす影響は，ＤＮＡ合成の間のトリチル化チミジンの取り込みにより評価して，
ＤＮＡ含量に基づく細胞サイクル分析により評価されている（Ｓｐｉｖａｋ ｅ
ｔ．ａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：５００−５０４）。
同様に，細胞増殖において役割を果たすホスファターゼに対する本発明の化合物
の活性は，細胞サイクル分析により評価することができる。
【０４３７】 本発明の化合物の活性はまた，シグナル伝達の機能不全により引き起こされる
かこれに関連する疾患の実験モデルを用いて動物において評価することができる
。例えば，本発明の化合物の活性は，非肥満性糖尿病マウス（Ｌｕｎｄ ｅｔ．
ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：７２７−７２９），ＢＢＷｉｓｔａ
ｒラットおよびストレプトゾトシン誘導性糖尿病ラット（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ
．ａｌ．，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９７：３７２−３７６）
において，インスリンレセプターシグナル伝達に及ぼす化合物の影響について試
験することができる。ホスファターゼはシグナル伝達の機能不全において重要な
役割を果たし，細胞トランスフォーメーションにつながりうるため，化合物の活
性は，動物発癌性実験において評価することもできる。例えば，オカダイン酸（
ホスファターゼ阻害剤）は，マウス皮膚において腫瘍形成を促進することが示さ
れている（Ｓｕｇａｎｕｍａ ｅｔ．ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：１７６８−１７７１）。
【０４３８】 これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて，ヒト
において用いるためのある範囲の投与量を処方することができる。本発明の化合
物の投与量は，毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内でなければなら
ない。投与量は，用いられる投与量の形態および投与経路に依存して，この範囲
内で様々でありうる。
【０４３９】ホスホチロシン酵素結合イムノソルベントアッセイ このアッセイを用いて，本発明の化合物がインスリンレセプター（ＩＲ）上の
ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）残基の脱リン酸化を阻害する能力を試験することが
できる。当業者は，異なる標的細胞および結合抗体を用いることにより，他の基
質分子，例えば血小板由来成長因子レセプターをこのアッセイにおいて用いるこ
とができることを認識するであろう。アッセイにおいて異なる基質分子を用いる
ことにより，異なる蛋白質チロシン酵素に対する本発明の化合物の活性を評価す
ることができる。ＩＲの場合，内因性キナーゼ活性はインスリン結合がない場合
であっても低いレベルで活性がある。したがって，ＩＲのリン酸化を刺激するた
めにはインスリンは必要ではない。すなわち，化合物に暴露した後，細胞溶解物
を調製し，抗インスリンレセプター抗体で被覆したマイクロタイタープレートに
加えることができる。抗ｐＴｙｒ抗体および酵素結合二次抗体を用いて捕捉され
たインスリンレセプターのリン酸化のレベルを検出する。
【０４４０】化合物−ＰＴＰのＩＣ５０を決定するためのアッセイ方法 本発明の種々の化合物の活性のレベルおよび１またはそれ以上のＰＴＰに及ぼ
す影響を決定するためには，以下のインビトロアッセイ方法が好ましい。当該技
術分野においてよく知られる手法を用いて，任意のＰＴＰについて同様のアッセ
イを設計することができる。
【０４４１】 本明細書に記載される触媒的アッセイは，９６−ウエルフォーマットで行う。
一般的方法は，最初に，広範囲の緩衝液ｐＨにわたってイオン強度の変動を最少
にした３成分緩衝液系を用いて，ＰＴＰの最適ｐＨを決定する。次に，各特異的
基質−ＰＴＰ系についてミカエリス−メンテン定数，すなわちＫｍを決定する。
次にこのＫｍ値を化合物スクリーニングの基質反応濃度として用いる。最後に，
試験ＰＴＰを種々の濃度の化合物に１５分間暴露し，基質と１０分間反応させる
。結果はパーセント阻害対化合物濃度としてプロットし，プロットの内挿からＩ
Ｃ50を求める。
【０４４２】 以下の材料および試薬を用いた。 １．特に示さない限り，アッセイ緩衝液をすべてのアッセイ溶液の溶媒とし
て用いた。 成分 濃度 アセテート（Ｆｉｓｈｅｒ １００ｍＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ３８，５００） ビス−ｔｒｉｓ（ＳｉｇｍａＢ−７５３５） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｆｉｓｈｅｒ ５０ｍＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１５２−５） グリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ １０％（ｖ／ｖ） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ２２９−１） ＊ＤＴＴ使用直前に１ｍＭを加える ２．９６ウエルイージーウォッシュプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３６９） ３．ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ ７３８−３７９） ４．フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ Ｆ−２９９９） ５．０．２２μねじ蓋濾過システム５００ｍｌ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳＣＧＰＵ
０５ＲＥ） ６．１０Ｎ ＮａＯＨ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＳ２５５−１
） ７．１０Ｎ ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１４４−５００
） ８．化合物は，ＤＭＳＯ（ＳｉｇｍａＤ−５８７９）に５または１０ｍＭ濃度で
溶解し，小さいアリコートで−２０℃で保存した。
【０４４３】方法 すべてのアッセイは，ｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として用いて行う。用いた
各ＰＴＰについて最適ｐＨを決定する。
【０４４４】ＰＴＰアッセイ ＰＴＰａｓｅ活性は，適当な濃度のｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として含む１
００μｌの反応混合物中で２５℃でアッセイする。反応は，ＰＴＰを加えること
により開始し，１０分後に５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えることにより停止す
る。基質の非酵素的加水分解は，酵素を加えない対照を測定することにより補正
する。生成したｐ−ニトロフェノールの量は，４１０ｎｍの吸収から決定する。
速度論的パラメータＫｍを決定するためには，種々の基質濃度で初速度を測定し
，データをミカエリス等式 速度＝（Ｖｍａｘ×［Ｓ］）／（Ｋｍ＋［Ｓ］） ［Ｓ］＝基質反応濃度 に適合させる。
【０４４５】阻害実験 化合物がＰＴＰに及ぼす影響は，２５℃でｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として
用いて評価する。ＰＴＰを種々の濃度の化合物とともに１５分間プレインキュベ
ートする。次に基質を固定濃度（通常は先に計算されたＫｍと等しい）で加える
。１０分後，ＮａＯＨを加えて反応を停止する。ｐＮＰＰの加水分解は，Ｂｉｏ
ｔｅｋ Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ２００マイクロプレートスキャニング分光光度計
で４１０ｎｍで追跡する。パーセント阻害は，以下のように計算する： パーセント阻害＝［（対照シグナル−化合物シグナル）／対照シグナル］ｘ
１００％ 次に，パーセント阻害対化合物濃度のプロットを内挿することによりＩＣ５０を
決定する。
【０４４６】 細菌ＧＳＴ−ＰＴＰ融合蛋白質発現のために設計したプラスミドは，ＰＣＲ生
成ヒトＰＴＰフラグメントをｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）中に挿入することにより作成する。次に，これらの構築物のいくつかを
用いて，Ｓｆ−９昆虫細胞における発現用にホスファターゼをｐＦａｓｔＢａｃ
−１中にサブクローニングする。ＰＴＰ遺伝子の最初の増幅に用いたオリゴヌク
レオチドは以下に示される。ｃＤＮＡｓは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したＲＮ
Ａで，Ｇｉｌｂｏ ＢＲＬ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプレ増幅システムを用いて
調製する。
【０４４７】結論 当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明
の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して
種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
【０４４８】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。
【０４４９】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発
明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更およ
び変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される
本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０４５０】 さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０４５１】 遺伝コードの縮重の観点から，核酸の他の組み合わせもまた本明細書のペプチ
ドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つ
の核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸
について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは
平均で３100，すなわち５ｘ１０47種類の核酸配列によりコードされるであろう
。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第１
の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核酸
配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチド
および蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒトに
おいて好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように，
本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更し
ない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのようなポ
リペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選択
することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，ア
ミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を与
えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする対
応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与え
ずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合蛋
白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプチ
ドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。ポ
リペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の実
験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意な
活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸および
／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
【０４５２】 本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に
含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成
する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，
属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一
般的記載が含まれる。
【０４５３】 他の態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，ヒト蛋白質ホスファターゼのヌクレオチド配列を示す。
【図２】 図２は，配列番号１−配列番号１２によりコードされるヒト蛋白
質ホスファターゼのアミノ酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/02 Ａ６１Ｐ 9/12 ４Ｈ０４５ 9/12 15/08 15/08 21/04 21/04 25/00 25/00 25/06 25/06 25/16 25/16 25/18 25/18 25/28 25/28 27/02 27/02 29/00 29/00 31/04 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 35/00 35/00 37/00 37/00 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/16 Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/42 9/16 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／１７８，０７８ (32)優先日 平成12年１月25日(2000．1．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７９，３０１ (32)優先日 平成12年１月31日(2000．1．31) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 プラウマン，グレゴリー・ディー アメリカ合衆国 94070 カリフォルニア 州 サン カルロス，ワインディング ウ ェイ 35 (72)発明者 マルティネス，リカルド アメリカ合衆国 94404 カリフォルニア 州 フォスター シティ，カルティエ レ ーン 984 (72)発明者 ホワイト，デイビッド アメリカ合衆国 94002 カリフォルニア 州 ベルモント，バークレイ ウェイ 2623 (72)発明者 マニング，ジェラルド アメリカ合衆国 94025 カリフォルニア 州 メンロ パーク，４，フレモント ス トリート 844 (72)発明者 シュダーサナム，スーチャ アメリカ合衆国 94904 カリフォルニア 州 グリーンブレー，コルテ パテンシオ 20 (72)発明者 ヒル，ロナルド・ジェイ アメリカ合衆国 94010 カリフォルニア 州 バーリンゲイム，オーク グローブ アベニュー 532 (72)発明者 フラナガン，ピーター アメリカ合衆国 94114 カリフォルニア 州 サン フランシスコ，ハートフォード ３，225 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 BA43 CA01 CA04 CA07 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 HA03 HA11 HA17 4B050 CC01 CC03 CC05 DD11 FF14 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ01 QQ05 QQ13 QQ33 QQ44 QQ52 QR08 QR13 QR33 QR42 QR55 QR57 QR59 QR62 QR74 QR80 QR82 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA25 CA31 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA012 ZA022 ZA082 ZA152 ZA162 ZA182 ZA202 ZA332 ZA362 ZA422 ZA432 ZA812 ZA942 ZB072 ZB082 ZB262 ZB322 ZB332 ZB352 ZC192 ZC212 ZC352 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃
    縮された，または精製された核酸分子であって，前記核酸分子は， （ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
    ７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
    ，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
    選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズ
    し，かつ天然に生ずるホスファターゼポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
    ７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
    ，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
    選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが，ただし，前記ポ
    リペプチドは，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ド
    メイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域および
    Ｃ末端テールの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しており；または （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である， のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
  2. 【請求項２】 宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまた
    はプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記核酸分子が，哺乳動物から単離された，濃縮された，ま
    たは精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記哺乳動物がヒトである，請求項３記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 試料中のホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の検
    出に用いられ，前記ホスファターゼポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１
    ４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９
    ，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号
    ２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する
    ホスファターゼポリペプチドからなる群より選択される，請求項１記載の核酸プ
    ローブ。
  6. 【請求項６】 配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６
    ，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，
    配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列か
    らなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコ
    ードする請求項１記載の核酸分子を含む組換え細胞。
  7. 【請求項７】 単離された，濃縮された，または精製されたホスファターゼ
    ポリペプチドであって， （ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
    ７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
    ，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
    選択されるアミノ酸配列；または （ｂ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
    ７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
    ，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
    選択されるアミノ酸配列であって，ただし，ポリペプチドは，Ｎ末端ドメイン，
    Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域
    ，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選
    択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失している， を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
  8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが，哺乳動物から単離され，精製され，ま
    たは濃縮されたものである，請求項７記載のホスファターゼポリペプチド。
  9. 【請求項９】 前記哺乳動物がヒトである，請求項８記載のホスファターゼ
    ポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 ホスファターゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドのド
    メインに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントであって
    ，前記ポリペプチドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号
    １６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２
    １，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配
    列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチド
    であることを特徴とする抗体または抗体フラグメント。
  11. 【請求項１１】 配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１
    ６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１
    ，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドに
    対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。
  12. 【請求項１２】 請求項７または８記載のポリペプチドに結合する抗体およ
    び負対照抗体を含むキット。
  13. 【請求項１３】 ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定
    する方法であって， （ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
    ７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
    ，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
    選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドを試験物質と接触
    させ； （ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして （ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する， の各工程を含む方法。
  14. 【請求項１４】 細胞においてホスファターゼポリペプチドの活性を調節す
    る物質を同定する方法であって， （ａ）配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１
    ７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２
    ，配列番号２３，および配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より
    選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドを発現させ； （ｂ）前記細胞に試験物質を加え；そして （ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互
    作用の変化をモニターする， の各工程を含む方法。
  15. 【請求項１５】 治療を必要とする患者に，配列番号１３，配列番号１４，
    配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配
    列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および配列番号２４
    に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホス
    ファターゼの活性を調節する物質を投与することにより疾病または疾患を治療す
    る方法。
  16. 【請求項１６】 前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心
    臓血管疾病，脳または神経関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択され
    る，請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記疾病または疾患が，組織の癌；造血性起源の癌；中枢
    神経系の疾病；末梢神経系の疾病；アルツハイマー病；パーキンソン病；多発性
    硬化症；筋萎縮性側索硬化症；ウイルス感染；プリオンにより引き起こされる感
    染；細菌により引き起こされる感染；真菌により引き起こされる感染；眼性疾病
    ，代謝性疾患，および糖尿病からなる群より選択される，請求項１５記載の方法
    。
  18. 【請求項１８】 前記疾病または疾患が，片頭痛；痛み；性的機能不全；気
    分障害；注意障害；認識障害；低血圧；高血圧；精神病性疾患；神経学的疾患；
    運動異常症；代謝性疾患；および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求
    項１５記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記物質がインビトロでホスファターゼ活性を調節する，
    請求項１５記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記物質がホスファターゼ阻害剤である，請求項１９記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 疾病または疾患の診断道具として試料中においてホスファ
    ターゼポリペプチドを検出する方法であって， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で配列番号１３，配
    列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列
    番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，および
    配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列
    を有するホスファターゼポリペプチドの核酸標的領域とハイブリダイズする核酸
    プローブと接触させ，前記プローブは，前記ポリペプチド，そのフラグメント，
    または前記配列およびフラグメントの相補体をコードする核酸配列を含み；そし
    て （ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を前記疾病の指標として
    検出する， の各工程を含む方法。
  22. 【請求項２２】 前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心
    臓血管疾病，脳または神経関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択され
    る，請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記疾病または疾患が，組織の癌；造血性起源の癌；中枢
    神経系の疾病；末梢神経系の疾病；アルツハイマー病；パーキンソン病；多発性
    硬化症；筋萎縮性側索硬化症；ウイルス感染；プリオンにより引き起こされる感
    染；細菌により引き起こされる感染；真菌により引き起こされる感染；および眼
    性疾病からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記疾病または疾患が，片頭痛，痛み；性的機能不全；気
    分障害；注意障害；認識障害；低血圧；高血圧；精神病性疾患；神経学的疾患；
    運動異常症；代謝性疾患；および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求
    項２１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 疾病または疾患の診断道具として試料中のホスファターゼ
    ポリペプチドを検出する方法であって， （ａ）試料中の，前記ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を
    ，前記ホスファターゼポリペプチドまたはその１またはそれ以上のフラグメント
    をコードする対照核酸標的領域と比較し，ここで，前記ホスファターゼポリペプ
    チドは，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号
    １７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２
    ２，配列番号２３，および配列番号２４，に記載されるアミノ酸配列からなる群
    より選択されるアミノ酸配列またはその１またはそれ以上のフラグメントを有し
    ており；そして （ｂ）前記標的領域と前記対照標的領域との間の配列または量の差異を前記疾病
    または疾患の指標として検出する， の各工程を含む方法。
  26. 【請求項２６】 前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心
    臓血管疾病，脳または神経関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択され
    る，請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記疾病または疾患が，組織の癌；造血性起源の癌；中枢
    神経系の疾病；末梢神経系の疾病；アルツハイマー病；パーキンソン病；多発性
    硬化症；筋萎縮性側索硬化症；ウイルス感染；プリオンにより引き起こされる感
    染；細菌により引き起こされる感染；真菌により引き起こされる感染；および眼
    性疾病からなる群より選択される，請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記疾病または疾患が，片頭痛，痛み；性的機能不全；気
    分障害；注意障害；認識障害；低血圧；高血圧；精神病性疾患；神経学的疾患；
    運動異常症；代謝性疾患；および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求
    項２５記載の方法。
  29. 【請求項２９】 配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列
    番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配
    列番号１１，および配列番号１２からなる群より選択される，哺乳動物ホスファ
    ターゼまたはそのフラグメントをコードする核酸。
JP2001546892A 1999-12-21 2000-12-21 哺乳動物蛋白質ホスファターゼ Withdrawn JP2003517836A (ja)

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