JP2003510010A - Ｐｙｋ２結合蛋白質 - Google Patents

Ｐｙｋ２結合蛋白質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は，新規なＰｙｋ２結合蛋白質，新規なＰｙｋ２結合蛋白質をコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のＰｙｋ２結合蛋白質関連および蛋白質キナーゼ関連疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。バイオインフォマティクス戦略を用いることにより，Ｐｙｋ２結合蛋白質ファミリーの２つの哺乳動物のメンバーが同定され，その蛋白質構造が推定された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は，"ＰＹＫ２ ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ"と題する米国特許出願０８／３５７，６４２（Ｌｅｖ ａｎｄ Ｓｃ
ｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２０９／０
７０，１９９４年１２月１５日出願）；"ＰＹＫ２ ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ"と題する米国特許出願０８／４６０，６２
６（Ｌｅｖ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃ
ｋｅｔ Ｎｏ．２１１／１２１，１９９５年６月２日出願）；および"ＰＹＫ２
ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ"と題する米国
特許出願０８／９８７，６８９（Ｌｅｖ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，
Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２３０／１１０，１９９７年１２月
１９日出願）に関連し，これらはすべて，図面または表を含めその全体を本明細
書の一部としてここに引用する。
【０００２】 発明の分野 本発明は，新規な蛋白質チロシンキナーゼ結合ポリペプチド，そのようなポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のキナーゼ関連疾病およ
び状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
【０００３】 発明の背景 以下の発明の背景の記載は，本発明の理解を助けるために提供され，本発明に
対する従来技術であるかまたは従来技術を記載すると認めるものではない。
【０００４】 蛋白質キナーゼは，真核生物蛋白質の最も大きなファミリーの１つであり，数
百のメンバーが知られている。これらの蛋白質は，共通の触媒的コア構造を含む
１２個の別個のサブドメインに分割することができる２５０−３００アミノ酸ド
メインを共有する。蛋白質キナーゼの触媒的ドメイン中の配列の多重アライメン
トおよび続く節減（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ）分析により，関連するキナーゼをサブ
ファミリーの別個の枝に分けることができる。サブファミリーには，チロシンキ
ナーゼ，二重特異性キナーゼ，およびセリン／トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ’ｓ
）が含まれる。蛋白質チロシンキナーゼは，さらに，細胞外リガンド結合ドメイ
ンおよび貫膜ドメインを有するか有しないかにより，レセプタークラスおよび非
レセプタークラスに分けることができる（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，１９９５
．Ｔｈｅ Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔｕｒｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ ８９：１０５−１
２３）。
【０００５】 触媒的キナーゼドメインにおける配列類似性および共通の構造的モチーフの存
在に基づいて，多数の非レセプターチロシンキナーゼのファミリーが定義されて
いる（Ｎｅｅｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ １
：１４７−１６９）。非レセプターチロシンキナーゼは，原形質膜にリクルート
されることができ，ここで固有の蛋白質チロシンキナーゼ活性を有しない細胞表
面レセプターの細胞性シグナリングを媒介する。例えば，蛋白質チロシンキナー
ゼのＳｒｃファミリーのメンバーは，成長因子レセプターおよびＧ蛋白質結合レ
セプター，ならびに多くの他の細胞外刺激剤の刺激に応答して活性化される（Ｔ
ｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．
Ｂｉｏｌ．１３：５１３−６０９）。一方，フォーカス接着キナーゼ（ＦＡＫ）
は，インテグリン媒介性シグナリングにおいて中心的役割を果たす（Ｓｃｌａｅ
ｐｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：
１５１−１５７）。
【０００６】 ＦＡＫおよびＰｙｋ２（プロリンリッチチロシンキナーゼ２，またＲＡＦＴＫ
，ＣＡＫβおよびＣＡＤＴＫとしても知られる）は，ＰＴＫの１つのファミリー
を構成する（Ｓｃｌａｅｐｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：１５１−１５７）。Ｐｙｋ２およびＦＡＫは，約４５％
のアミノ酸同一性および類似のドメイン構造（すなわち，独特のＮ末端，中心に
位置する蛋白質チロシンキナーゼドメイン，およびＣ末端の２つのプロリンリッ
チ領域）を示す。しかし，Ｐｙｋ２はフォーカス接点には局在せず，細胞の核周
囲領域に濃縮されている。
【０００７】 Ｐｙｋ２は，細胞内カルシウム濃度を上昇させる種々の細胞外シグナルにより
活性化される（Ｌｅｖ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７３
７−４５）。さらに，ホルボルエステルまたはＧ蛋白質結合レセプターのアゴニ
ストで処理すると，Ｐｙｋ２のチロシンリン酸化が生ずる（Ｄｉｋｉｃ，ｅｔ
ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８３：５４７−５５０；Ｌｅｖ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７３７−４５；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，
１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４３４１−８）。Ｐｙｋ２は，
ＦＡＫと同様に，インテグリンレセプターの活性化により制御することができる
（Ａｓｔｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：
１９７１９−２４；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．．１９９６．Ｂｌｏｏｄ ８８：４１７
−２８）。
【０００８】 Ｐｙｋ２の主要な自己リン酸化部位であるチロシン４０２は，ＳｒｃのＳＨ２
ドメインのドッキング部位として機能する。Ｐｙｋ２は，Ｓｒｃとともに，ヘテ
ロ３量体Ｇ蛋白質結合レセプターとＭＡＰキナーゼシグナリング経路との間の連
結として機能する（Ｄｉｋｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８
３：５４７−５５０）。
【０００９】 発明の概要 本発明は，とりわけ，Ｐｙｋ２に特異的に結合する，Ｐａｐ（Ｐｙｋ２Ｃ末端
付随蛋白質）と名付けられた新規蛋白質のクローニングおよび特性決定に関する
。好ましい態様においては，本明細書において，蛋白質構造および部分または完
全配列，ならびにＰａｐ蛋白質の分類，推定または演繹された蛋白質構造，およ
び発現のパターンの評価が記載される。
【００１０】 インビトロおよびインビボの両方でＰａｐとＰｙｋ２との間の会合が示された
。Ｐｙｋ２の活性化により，Ｐａｐがチロシンリン酸化される。内因性Ｐａｐも
また，ホルボルエステル刺激に応答してチロシン残基でリン酸化される。
【００１１】 Ｐａｐは，インビボでＡｒｆ ＧＡＰ蛋白質として機能する。Ａｒｆ ＧＡＰ
蛋白質は，小胞体，ゴルジ装置，および原形質膜の間の小胞輸送に関与する。Ｐ
ａｐは，原形質膜，細胞質およびゴルジコンパートメントに局在する。Ｐａｐは
，ゴルジ膜にリクルートされたとき，Ａｒｆ媒介性小胞発芽を制御することがで
きる。これは，Ｐａｐが蛋白質チロシンキナーゼＰｙｋ２およびＳｒｃの基質お
よび下流標的として機能するためである。すなわち，これらの２つの蛋白質キナ
ーゼは，小胞輸送のある局面の制御に関与しているのかもしれない。
【００１２】 すなわち，本発明の第１の観点は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする，
単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする。好ましくは，
ポリペプチドは，ＰａｐαおよびＰａｐβからなる群より選択される。
【００１３】 核酸に関して，"単離された"とは，互いに結合した６個またはそれ以上（好ま
しくは２１，より好ましくは３９，最も好ましくは７５）のヌクレオチドのポリ
マーを意味し，天然起源から単離されたまたは合成されたＤＮＡおよびＲＮＡが
含まれる。本発明のある態様においては，より長い核酸，例えば，３００，６０
０，９００またはそれ以上のヌクレオチド，および／または配列番号３または配
列番号４に示される配列と少なくとも５０％，６０％，７５％，９０％，９５％
，または９９％の同一性を有する核酸が好ましい。
【００１４】 本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見
いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていること
を表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環
境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド
鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド物
質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離され
た染色体とは区別されることを意味する。
【００１５】 核酸に関連して，"濃縮された"との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡ
は，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵ
Ｃ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種
のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる事象，例えばウイルス感
染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語は，人が所望の
核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
【００１６】 ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利であ
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくと
も１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的
に企図される。
【００１７】 "Ｐｙｋ２結合ポリペプチド"とは，配列番号１または２に記載されるアミノ酸
配列の３３個またはそれ以上（好ましくは４０，より好ましくは４５，最も好ま
しくは５５個）の連続するアミノ酸，または本明細書に記載されるその機能的誘
導体を意味する。ある観点においては，１００，２００，３００またはそれ以上
のアミノ酸のポリペプチドが好ましい。Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，全長核酸
配列，またはポリペプチドの機能的活性が保持される限り全長核酸配列の任意の
部分によりコードされることができる。遺伝コードの縮重のため，多数の異なる
核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうることは，当該技術分野においてよく
知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変化させて元の機能性を保持する蛋
白質またはポリペプチドを得ることができることも，当該技術分野においてよく
知られている。いずれの場合にも，すべての順列がこの開示によりカバーされる
ことが意図される。本明細書に記載される，ＰａｐαおよびＰａｐβを同定する
ために用いた方法を用いて，他のＰｙｋ２結合ポリペプチドを同定することがで
きる。
【００１８】 アミノ酸配列は，配列番号１または配列番号２に示される配列またはそのフラ
グメントと実質的に類似するであろう。配列番号１または配列番号２の配列と実
質的に類似する配列は，好ましくは，スミス−ウォーターマン蛋白質−蛋白質検
索を用いて，配列番号１または配列番号２の配列と少なくとも９０％（より好ま
しくは少なくとも９５％，最も好ましくは９８−１００％）の同一性を有するで
あろう。
【００１９】 "同一性"とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。一
般に，同一性は，同一の残基の数を残基とギャップの合計数で割り，１００を乗
ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ酸の付加または欠失により生
ずる，アライメント中の空間である。すなわち，完全に同一の配列の２つのコピ
ーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に保存され，欠失，付加または
置換を含む配列は，より低い程度の同一性を有するであろう。当業者は，配列の
同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラムが利用可能であるこ
とを認識するであろう。
【００２０】 好ましい態様においては，本発明は，単離された，濃縮された，または精製さ
れた，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核酸分子を特徴とする。該核酸分
子は，（ａ）配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；（
ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし
，かつ天然に生ずるＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードする；（ｄ）配列番号１
または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
が，ただし，Ｎ末端，コイルドコイル，ＰＨ，Ａｒｆ ＧＡＰ，アンキリン，プ
ロリンリッチ，ＳＨ３，およびＣ末端ドメインからなる群より選択される，全部
ではないが１またはそれ以上のドメインを欠失している，；または（ｅ）（ｄ）
のヌクレオチド配列の相補体である，ヌクレオチド配列を含む。
【００２１】 "相補体"との用語は，互いに多くの望ましい相互作用を形成しうる２つのヌク
レオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することが
できるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素
結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第
１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的
である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２２】 "ドメイン"との用語は，特定の機能を含むポリペプチドの領域を表す。例えば
，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されない
が，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細
胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の
機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残りと別々に発現させて
それ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するために
は無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域と
も称され，これもまたドメインと関連する。
【００２３】 "Ｎ末端ドメイン"との用語は，蛋白質キナーゼの開始メチオニンと触媒的ドメ
インとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重
複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアライメントを行い，触
媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末端
ドメインは，その長さに応じて，キナーゼ機能において制御的役割を果たすかま
たは果たさない。Ｎ末端ドメインが制御的役割を果たすことが知られている蛋白
質キナーゼの例はＰＡＫ６５であり，これはＣｄｃ４２およびｒａｃ結合に用い
られるＣＲＩＢモチーフを含む（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９
９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９０７１−２９０７４）。
【００２４】 本明細書において用いる場合，"コイルドコイルドメイン"との用語は，コンピ
ュータアルゴリズム，例えばＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９６）Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：５１３−５２５）により推定してコイルド
コイル構造をとる可能性が高いポリペプチド配列を表す。コイルドコイルは，平
行な２または３個の両親媒性α−ヘリックスから形成される。コイルドコイルは
，他のポリペプチドのコイルドコイルドメインと結合してホモ二量体またはヘテ
ロ二量体を生ずることができる（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２：１１６２−１１６４）。コイルドコイル依存性オリゴマー化は，蛋白
質機能，例えばセリン／トレオニンキナーゼの触媒活性に必要であることが示さ
れている（Ｒｏｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２：５８３８−５８４５）。
【００２５】 本明細書において用いる場合，"プロリンリッチ領域"との用語は，蛋白質キナ
ーゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見いだされ
るこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。プロリ
ンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，標準的
なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥｄｉｔ
Ｓｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質と蛋白
質との相互作用に関与することが示されている。これらの相互作用の中で，本発
明に最も関連性が深いものは，ある種の蛋白質キナーゼ（例えばヒトＰＡＫ１）
およびアダプター分子ＮｃｋのＳＨ３ドメイン（Ｇａｌｉｓｔｅｏ，Ｍ．Ｌ．ｅ
ｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０９９７−２１０
００）に見いだされる"ＰｘｘＰ"プロリンリッチモチーフを含む。"ＰｘｘＰ"プ
ロリンリッチモチーフが関与する他の制御相互作用には，ＷＷドメインがある（
Ｓｕｄｏｌ，Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．６
５：１１３−１３２）。
【００２６】 "Ｃ末端ドメイン"との用語は，一般に，最後の（Ｃ末端に最も近い位置にある
）機能ドメインの後に位置し，Ｐｋｙ２結合蛋白質のカルボキシ末端アミノ酸残
基を含む領域を表す。"機能"ドメインとは，他の蛋白質とのアミノ酸配列ホモロ
ジーから推定して，または特定の構造的コンフォメーションを生じさせることが
できるアミノ酸配列が存在することにより（例えばＮ末端ドメイン），制御的ま
たは触媒的役割を果たしうるポリペプチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメ
インは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマ
ンアライメントを用いて，最もＣ末端の機能ドメインのＣ末端境界を規定するこ
とにより同定することができる。Ｃ末端ドメインは，その長さおよびアミノ酸組
成に応じて，Ｐｋｙ２結合蛋白質の機能において制御的役割を果たすかまたは果
たさないであろう。
【００２７】 "シグナル伝達経路"との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播し，細
胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激するこ
とができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的には
レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，レセプターおよび非レ
セプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメイン，ホスホ
チロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合
（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ
３ドメイン含有蛋白質），ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
【００２８】 所望の特異性および選択性に応じて，種々の低いまたは高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業
者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
は，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのよう
は条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有す
る核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００２９】 ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以
下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する
：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０
．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハ
ルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗
浄。
【００３０】 別の好ましい態様においては，本発明は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコード
し，かつ宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモータ
ーをさらに含む，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴と
する。好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥから
なる群より選択される。本発明はまた，組換え核酸，好ましくは細胞または生物
中の組換え核酸を特徴とする。組換え核酸は，配列番号３または配列番号４に記
載される配列，またはそれらの機能的誘導体，および宿主細胞において転写を開
始するのに有効なベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは，
組換え核酸は，細胞中で機能的な転写開始領域，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコ
ードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および細胞中で機能的な転写終止領域を含
むことができる。好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰ
ａｐＥからなる群より選択される。
【００３１】 "ベクター"との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲノム
中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す
。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直
鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素によ
り切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。Ｐ
ｙｋ２結合蛋白質をコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つ
の断片を一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することがで
きる。
【００３２】 "トランスフェクトする"との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞
性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含
まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理す
ることにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること
，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００３３】 本明細書において用いる場合，"プロモーター"との用語は，遺伝子配列の発現
に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々
の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロ
モーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮ
Ａに転写されたときに，合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのよ
うな領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，
例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００３４】 好ましい態様においては，単離された核酸は，配列番号３または配列番号４に
記載される核酸配列を含むか，本質的にそれからなるか，それからなるか，また
は配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的誘導体，または
配列番号１の少なくとも３５，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００
，または３００個の連続するアミノ酸，または配列番号２の少なくとも１０，１
５，２０，３０，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００，または３０
０個の連続するアミノ酸をコードする。Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，配列番号
１の少なくとも３５，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００，または
３００個の連続するアミノ酸または配列番号２の少なくとも１０，１５，２０，
３０，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００，または３００個の連続
するアミノ酸を含むか，本質的にそれからなるか，それからなる。核酸は，ｃＤ
ＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより天然の
起源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ま
しくはヒト，血液，精液，または組織であり，核酸はトリエステル法によりまた
は自動化ＤＮＡ合成機を用いて合成してもよい。
【００３５】 "哺乳動物"とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，
およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾
サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
【００３６】 さらに別の好ましい態様においては，核酸は，例えば，追加のポリペプチドの
同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを
設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプ
ローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の
領域である。
【００３７】 "保存された核酸領域"とは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする２つまた
はそれ以上の核酸上に存在する領域を意味し，この領域に特定の核酸配列が低い
ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる。Ｐｙｋ２結合ポ
リペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー条
件の例は，Ａｂｅ，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９：１３３６１
−１３３６８，１９９２）（図面または表を含め，その全体を本明細書の一部と
してここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領域は２０ヌクレオチド
中５ヌクレオチド以下で異なる。
【００３８】 "独特の核酸領域"とは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核酸中に存在
し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない配
列を意味する。そのような領域は，好ましくは配列番号１または２に記載される
アミノ酸配列の３３個またはそれ以上（好ましくは４０，より好ましくは４５，
最も好ましくは５５個）の連続するアミノ酸をコードする。特に，独特の核酸領
域は，好ましくは哺乳動物起源のものである。
【００３９】 本発明の第２の観点は，試料中でＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核酸
を検出するための核酸プローブを特徴とする。好ましくは，ポリペプチドは，Ｐ
ａｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される。好ましい態様においては，核
酸プローブは，配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列によりコ
ードされる蛋白質のフラグメントであるＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードする
。核酸プローブは，配列番号３または配列番号４に記載される配列またはその機
能的誘導体にハイブリダイズするであろうヌクレオチド塩基配列を含む。
【００４０】 別の好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号３に記載される全長
配列の少なくとも３５，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０
，３００または３５０個の連続するアミノ酸，配列番号４に記載される全長配列
の少なくとも１２，３２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５
０，３００または３５０個の連続するアミノ酸，またはそれらの機能的誘導体を
コードする核酸にハイブリダイズする。
【００４１】 プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下
で試料を核酸プローブと接触させ，ポリペプチドのＲＮＡに結合したプローブの
存在または量を検出することにより，試料中のＰｙｋ２結合ポリペプチドＲＮＡ
の存在または量を検出することが含まれる。プローブとＰｙｋ２結合ポリペプチ
ドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを，検出され
た核酸の配列の同定において用いることができる（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．
２７５，１９９２（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに
引用する）。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブ
が置かれている容器手段を含むように構築することができる。
【００４２】 第３の観点においては，本発明は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核
酸分子を含む組換え細胞または組織を記載する。好ましくは，ポリペプチドは，
ＰａｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される。そのような細胞においては
，核酸は遺伝的制御要素の制御下にあってもよく，または外来性プロモーターを
含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。"外来性"とは，通常はＰｙｋ２結
合ポリペプチドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングしていな
いプロモーターを意味する。
【００４３】 ポリペプチドは，好ましくは配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ
酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。"フラグメント"とは，
Ｐｙｋ２結合ポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を意味する。好ましくは，
そのような配列は，配列番号１に記載される配列の少なくとも３５，４５，５０
，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸，または配列番号
２に記載される配列の少なくとも１０，１５，２０，３０，４５，５０，６０，
１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸を含む。
【００４４】 第４の観点においては，本発明は，単離された，濃縮された，または精製され
たＰｙｋ２結合ポリペプチドを特徴とする。好ましくは，ポリペプチドは，Ｐａ
ｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される。
【００４５】 ポリペプチドに関して"単離された"とは，互いに結合した６個またはそれ以上
（好ましくは１２，より好ましくは１８，最も好ましくは２５，３２，４０，ま
たは５０個）のアミノ酸のポリマーを意味し，天然の起源から単離されたまたは
合成されたポリペプチドを含む。ある観点においては，より長いポリペプチド，
例えば，配列番号１または配列番号２に記載される配列の１００，２００，３０
０，４００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を有するポリペプチドが好まし
い。
【００４６】 本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見
いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生
ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列
は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。こ
の用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものでは
なく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なく
とも約９０−９５％純粋）ことを意味する。
【００４７】 ポリペプチドに関して使用する場合，"濃縮された"との用語は，特定のアミノ
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割
合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の
量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加
により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。
しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するもので
はなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する
ことに注意すべきである。本明細書において有意にとの用語は，増加のレベルが
そのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミ
ノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，
またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸
配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例
えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１
９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望
のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００４８】 ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましく
は２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物
質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９
５％，または９９％純粋である。
【００４９】 好ましい態様においては，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，配列番号１または配
列番号２に記載されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントで
ある。好ましくは，ポリペプチドは，配列番号１に記載される配列の少なくとも
３５，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸
，または配列番号２に記載される配列の少なくとも１０，１５，２５，３５，４
５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸，または
それらの機能的誘導体を含む。
【００５０】 好ましい態様においては，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，（ａ）配列番号１ま
たは配列番号２に記載されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１または配列番号２
に記載されるアミノ酸配列であって，ただし，Ｎ末端，コイルドコイル，ＰＨ，
Ａｒｆ ＧＡＰ，アンキリン，プロリンリッチ，ＳＨ３，およびＣ末端ドメイン
からなる群より選択される，全部ではないが１またはそれ以上のドメインを欠失
している，を有するアミノ酸配列を含む。
【００５１】 ポリペプチドは，当該技術分野においてよく知られる方法により，天然の起源
から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましく
はヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。
【００５２】 ある態様においては，本発明は，組換えＰｙｋ２結合ポリペプチドを含む。好
ましくは，ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される
。"組換えＰｙｋ２結合ポリペプチド"とは，その存在位置（例えば，天然に見い
だされる物とは異なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に
生ずるポリペプチドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポ
リペプチドを意味する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常
観察される量とは異なる量で細胞中に存在するであろう。
【００５３】 第５の観点においては，本発明は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドに対して特異的
結合親和性を有する抗体（例えば，モノクローナルまたはポリクローナル抗体）
を特徴とする。好ましくは，ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥ，または
ポリペプチドのドメインまたはフラグメントからなる群より選択される。抗体は
，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの内因性起源を同定するために，細胞サイクル制御
をモニターするために，およびＰｙｋ２結合ポリペプチドを中心体に免疫局在化
させるために用いることができる。
【００５４】 "特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチド
に結合するより高い親和性をもって標的Ｐｙｋ２結合ポリペプチドに結合するこ
とを意味する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる
領域を含むポリペプチドである。"特異的結合親和性"との用語は，特定の条件下
で，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもってＰｙｋ２結合ポリペプ
チドに結合する抗体を記述する。
【００５５】 "ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
【００５６】 "モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であ
る。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意
の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法
により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５，および米国特許．４，３７６，１１０（これらの両
方は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））
。
【００５７】 "抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，抗体の物理的にポリペプチド標的に結合する部分である。
【００５８】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体ま
たは抗体フラグメントは，試料をＰｙｋ２結合ポリペプチド−抗体免疫複合体の
形成に適した条件下で抗体で探索し，ポリペプチドに結合した抗体の存在および
／または量を検出することにより，試料中のポリペプチドの存在および／または
量を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するため
の診断キットは，ポリペプチドに特異的な抗体または抗体フラグメント，ならび
に抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュゲートを含むように構築
することができる。
【００５９】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体ま
たは抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精製
することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真核
生物の両方において，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポ
リペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
【００６０】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体は
，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ポリペプチドに
結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中のポリペプ
チドの存在および／または量を検出するための方法において用いることができる
。そのような方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器および
抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射性同位体）を含む第２の容器を含
むように構築することができる。診断キットはまた，ＦＤＡに認可された使用の
通知およびその指針を含んでいてもよい。
【００６１】 第６の観点においては，本発明は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドに対して特異的
結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とする。好ましくは，
ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される。"ハイブ
リドーマ"とは，抗体（例えば本発明のポリペプチドに対する抗体）を分泌しう
る不死化細胞株を意味する。好ましい態様においては，ポリペプチドに対する抗
体は，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに特異的に結合することができるアミ
ノ酸の配列を含む。
【００６２】 第７の観点においては，本発明は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドに結合すること
ができる薬剤を特徴とする。好ましくは，ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａ
ｐＥからなる群より選択される。結合薬剤は，好ましくは，本発明のＰｙｋ２結
合ポリペプチド上に存在するエピトープを認識する精製された抗体である。他の
結合薬剤には，そのようなポリペプチドに結合する分子およびＰｙｋ２結合ポリ
ペプチドに結合する類似の分子が含まれる。そのような結合薬剤は，キナーゼ結
合パートナー活性を測定するアッセイ，例えばＰＤＧＦＲ活性を測定するアッセ
イを用いて同定することができる。試験すべき結合薬剤には，インドリノン，キ
ナゾリン，キノキサリン，キノリン，およびチロホスチンが含まれ，その例およ
び製造方法は，本明細書の第ＶＩＩ節に記載される。
【００６３】 本発明はまた，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドまたは同等の配列を含むヒ
ト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野におい
て日常的かつ標準的な技術，例えば本発明のポリペプチドの同定のために本明細
書において記載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブロッ
ト分析，インシトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト
細胞において新規ポリペプチドを同定することを含む。さらに，インビトロでＳ
ＯＳリクルートメントシステムを用いて，他のＰｙｋ２結合ポリペプチドを同定
することができる。
【００６４】 第８の観点においては，本発明は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチド活性を調節する
物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）Ｐｙｋ２結合ポリペプチド
を試験物質と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）
前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを決定する，ことを含む。
好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥからなる群
より選択される。
【００６５】 試験すべき物質には，インドリノン，キナゾリン，キノキサリン，キノリン，
およびチロホスチンが含まれ，その例および製造方法は以下の第ＶＩＩ節に記載
される。
【００６６】 "調節する"との用語は，物質が本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドの機能を変
化させる能力を表す。調節剤は，好ましくは本発明のポリペプチドの活性を活性
化し，またはより好ましくは阻害する。
【００６７】 "活性化する"との用語は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの細胞活性を増加させる
ことを表す。"阻害する"との用語は，ポリペプチドの細胞活性を減少させること
を表す。
【００６８】 "調節する"との用語はまた，ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間に複
合体が形成される可能性を増加または減少させることにより，本発明のポリペプ
チドの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ポリペプチドと天然
の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される可能性を増加させ，最
も好ましくは，ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成され
る可能性を減少させる。
【００６９】 "複合体"との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シ
グナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を
含む。例えば，蛋白質チロシンレセプター蛋白質キナーゼ，ＧＲＢ２，ＳＯＳ，
ＲＡＦ，およびＲＡＳは，有糸分裂促進性リガンドに応答して集合してシグナル
伝達複合体を形成する。
【００７０】 "天然の結合パートナー"との用語は，細胞中でＰｙｋ２結合ポリペプチドに結
合するポリペプチド，脂質，小分子，または核酸を表す。Ｐｙｋ２結合ポリペプ
チドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される
確率の増加または減少，またはポリペプチド／天然の結合パートナー複合体の濃
度の増加または減少として現れることができる。好ましくは，天然の結合パート
ナーは，Ｐｙｋ２およびＳｒｃからなる群より選択され，最も好ましくはＰｙｋ
２である。
【００７１】 本明細書において用いる場合，"接触する"との用語は，試験化合物を含む溶液
を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物を
含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の成
分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合物
を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基づ
く装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
【００７２】 第９の観点においては，本発明は，細胞においてＰｙｋ２結合ポリペプチド活
性を調節する物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）Ｐｙｋ２結合
ポリペプチドを細胞中で発現させ；（ｂ）前記細胞を試験物質と接触させ；そし
て（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相
互作用の変化をモニターする，ことを含む。好ましくは，ポリペプチドは，Ｐａ
ｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される。好ましくは，天然の結合パート
ナーは，Ｐｙｋ２およびＳｒｃからなる群より選択される。最も好ましくは，天
然の結合パートナーはＰｙｋ２である。
【００７３】 試験すべき物質には，インドリノン，キナゾリン，キノキサリン，キノリン，
およびチロホスチンが含まれ，その例および製造方法は以下の第ＶＩＩ節に記載
される。
【００７４】 本明細書において用いる場合，"発現"との用語は，細胞中でそのようなポリペ
プチド遺伝子を含む核酸ベクターから本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドが産生
されることを表す。本明細書に記載されるように，核酸ベクターを，当該技術分
野においてよく知られる手法を用いて細胞中にトランスフェクトする。
【００７５】 第１０の観点においては，本発明は，治療を必要とする患者にＰｙｋ２結合ポ
リペプチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病を治療する方法を
提供する。好ましくは，ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥからなる群よ
り選択される。
【００７６】 キナーゼ関連疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする
疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロ
アッセイにおいて陽性の結果を示す。望ましい活性についてスクリーニングする
ことができる物質の例は以下の第ＶＩＩ節において提供および参照され，インド
リノン，キナゾリン，キノキサリン，キノリン，およびチロホスチンが含まれる
。Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの活性を調節する物質には，好ましくは，限定され
ないが，抗体，アンチセンスオリゴヌクレオチド，および以下の第ＶＩＩ節およ
び実施例の節において参照される方法およびスクリーニングにより決定されるＰ
ｙｋ２結合ポリペプチドの阻害剤が含まれる。好ましい態様においては，物質は
，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドおよびそのフラグメントの発現を阻害するためのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドである。好ましくは，ポリペプチドは，ＰａｐΔ
およびＰａｐＥからなる群より選択される。好ましくは，ＰａｐΔおよびＰａｐ
Ｅのアンチセンスオリゴヌクレオチドは，ホスホロチオエートとして合成される
。
【００７７】 "予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するか発達させる可能性を減
少させることを表す。
【００７８】 "治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【００７９】 "治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ
）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影
響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は
，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【００８０】 "異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。異常な状態には，癌，心臓血管，神経変性，および免
疫疾患が含まれる。
【００８１】 異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症，ならび
に本発明の癌が含まれる。異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾
患，遅い創傷治癒速度，および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【００８２】 異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くのキナーゼ関連状態
がアポトーシス経路に関連している。
【００８３】 シグナル伝達プロセスにおけるＰｙｋ２結合ポリペプチドの機能に関連して，
"異常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その
活性が野生型ポリペプチド活性より低いかまたは高いように変異しているか，天
然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の結合
分子または蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，または天然の結
合パートナーともはや相互作用しない，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドを表す。
【００８４】 "投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【００８５】 異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾猿または無尾猿であり，最も好ましくはヒトである。
【００８６】 本発明の第１１の観点は，疾病または疾患の診断道具として，試料中において
Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核酸を検出するための方法を特徴とする
。前記方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＰｙｋ
２結合ポリペプチドの核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブと接触さ
せ，該プローブは，結合ポリペプチドをコードする核酸配列，そのフラグメント
，およびその配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）疾病または
疾患の指標として，プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を検出する
，の工程を含む。好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，ＰａｐΔおよびＰ
ａｐＥからなる群より選択される。
【００８７】 本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，癌，心臓血管，神経変
性および免疫疾患からなる群より選択される。
【００８８】 核酸の"標的領域"は，核酸プローブが特異的にハイブリダイズするであろう，
配列番号３または配列番号４に記載される全長ヌクレオチド塩基配列，その機能
的誘導体，またはそのフラグメントである。特異的ハイブリダイゼーションは，
プローブが，他の核酸の存在下で，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドの標的領
域にのみ検出可能なようにハイブリダイズすることを示す。推定標的領域は，当
該技術分野においてよく知られる，データベース中の最も密接に関連する配列と
のアライメントおよび比較からなる方法により同定することができる。
【００８９】 好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号１または配列番号２に記
載される配列の少なくとも６，１２，３２，５０，７５，９０，１０５，１２０
，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸，または
その機能的誘導体をコードする核酸標的領域にハイブリダイズする。ハイブリダ
イゼーション条件は，他の核酸分子が存在したとしても，ハイブリダイゼーショ
ンがＰｙｋ２結合ポリペプチド遺伝子とのみ生ずるような条件であるべきである
。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸
配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続
するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼ
ーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
【００９０】 試料中のＰｙｋ２結合ポリペプチド遺伝子の検出により診断することができる
疾病には，Ｐｙｋ２結合ポリペプチド核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正
常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"増幅"とは，正常細胞と比較
して，細胞中でポリペプチドＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味
する。正常細胞においては，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは典型的には１コピーの
遺伝子として見いだされる。選択された疾病においては，ポリペプチド遺伝子の
染色体位置が増幅されて，遺伝子の多数のコピーまたは増幅が生ずる。遺伝子増
幅は，そのようなポリペプチドＲＮＡを増幅させることができ，またはそのよう
なポリペプチドＲＮＡはポリペプチドのＤＮＡ増幅なしに増幅することができる
。
【００９１】 ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてポリペプチドＲＮＡが検出可能
なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，Ｐｙｋ２結合ポリ
ペプチドＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，そのよ
うなポリペプチドの発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増
幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多いポリペ
プチドＲＮＡの検出である。
【００９２】 試料中のＰｙｋ２結合ポリペプチド核酸の検出により診断することができる疾
病には，好ましくは，癌，心臓血管，神経変性および免疫疾患が含まれる。本発
明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物
，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォ
ーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出物の性質により
様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術分野においてよ
く知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に適合させること
ができる。
【００９３】 本発明の最後の観点は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの発現を阻害するためのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを特徴とする。好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペ
プチドは，ＰａｐΔおよびＰａｐＥからなる群より選択される。好ましい態様に
おいては，オリゴヌクレオチドは，配列番号１または配列番号２に記載されるア
ミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントをコードする配列の相補体
である。好ましくは，アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートと
して合成される。
【００９４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは，好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチド
の発現を特異的に阻害するよう設計する。好ましくは，これは本発明のＰｙｋ２
結合ポリペプチドに独特の配列（１またはそれ以上）を同定することにより行う
。好ましくは，これらの配列は，試料または患者中に存在する他の非Ｐｙｋ２結
合ポリペプチド中には存在しない。そのような配列を同定する方法は当該技術分
野においてよく知られており，したがって簡単にしか記載しない。好ましくは，
アンチセンスオリゴヌクレオチドは１０−１００ヌクレオチド，より好ましくは
１５−３０ヌクレオチド，最も好ましくは１８−２５ヌクレオチドの長さである
。
【００９５】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，好ましくは正常および腫瘍細胞
におけるＰｙｋ２結合蛋白質の発現をインビボで阻害するために用いられる。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは，単独で用いても組み合わせて用いてもよい。
好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの発現は有意に減少し，より好ましくは
検出限界以下に減少する。好ましい態様においては，本発明のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いる治療は，成長を阻害しおよび／または細胞においてアポ
トーシスを誘導する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた，ヌードマウス中
のヒト腫瘍細胞異種移植片におけるＰｙｋ２結合蛋白質の発現を阻害するために
用いることができる。好ましい態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドが過剰発現されているかまたは異常に発現され
ている種々のヒト疾病および疾患の治療に用いられる。
【００９６】 追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび有効な組み合わせは，当該技術
分野においてよく知られる方法により同定することができる。簡単には，Ｐｙｋ
２結合ポリペプチドを過剰発現している細胞または組織をアンチセンスオリゴヌ
クレオチドと接触させ（単独でまたは組み合わせで），ポリペプチドのＲＮＡ，
および／またはポリペプチドそのものの発現を，本明細書に記載される方法によ
り決定することができる。好ましくは，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドに対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いる治療は，そのようなポリペプチドＲＮＡお
よび／またはポリペプチドの発現の減少を引き起こし，より好ましくは発現は有
意に減少し（１−２倍），最も好ましくは発現は検出できないレベルまで減少す
る。
【００９７】 上述の本発明の概要は，限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点
は，以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００９８】 図面の簡単な説明 図１ａおよび１ｂは，Ｐａｐアイソフォームのアミノ酸配列および一次構造を
示す。図１ａは，Ｐａｐアイソフォームの一次構造の概略図を示す。図１ｂは，
ＰａｐΔ（ヒト；配列番号１）およびＰａｐＥ（ネズミ；配列番号２）のアミノ
酸配列を１文字コードで示す。番号はアミノ酸残基の位置を表す。推定コイルド
コイル領域（ＣｏｉｌＳｃａｎプログラム，ＧＣＧパッケージ）は，角丸四角形
で囲まれている。ＰＨドメインは二重下線が施されている。Ａｒｆ ＧＡＰドメ
インはボックスで囲まれている。アンキリンホモロジー領域は波線下線が施され
ている。プロリンリッチ領域は実線下線が施されている。ＳＨ３ドメインもまた
ボックスで囲まれている。
【００９９】 図２は，ジンクフィンガーモチーフＣＸＸＣＸ16ＣＸＸＣ（式中，Ｘは任意の
アミノ酸である）（それぞれ，残基１−１１９，配列番号５；残基５−１２２，
配列番号６；および残基２４３−３８１，配列番号７）を含むＡｒｆ１ ＧＡＰ
，ＧＣＳ１，およびネズミＰａｐ領域の多重配列アライメントを示す。同一の残
基は枠で囲まれ，陰がつけられている。ジンクフィンガーモチーフの４つの保存
システインの位置は点で示されている。
【０１００】 図３は，種々のヒト組織におけるＰａｐ ｍＲＮＡの発現のノザンブロット分
析を示す。キロベース（Ｋｂ）のサイズマーカーが図の右側に示されている。Ｈ
，心臓；Ｂ，脳；Ｐｌ，胎盤；Ｌｕ，胚；Ｌｉ，肝臓；Ｓ，脾臓；Ｋ，腎臓；Ｐ
ａ，膵臓。
【０１０１】 図４ａ，４ｂ，４ｃおよび４ｄは，培養細胞および脳組織におけるＰｙｋ２と
Ｐａｐの間のインビトロでの相互作用を示す。図４ａは，Ｐｙｋ２またはＰＫＭ
の発現ベクターまたはベクター単独でトランスフェクトした２９３細胞からの溶
解物のウエスタンブロットを示す。溶解物は，直ちに（総溶解物）または抗Ｐｙ
ｋ２抗体で免疫沈澱させた後（ＩＰ）にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，ニトロセルロ
ースフィルターに移し，Ｐａｐのプロリンリッチ領域およびＳＨ３ドメインを含
むＧＳＴ融合蛋白質（３μｇ／ｍＬ）および抗ＧＳＴモノクローナル抗体（１：
１０００）（上パネル）でブロットした。次に，同じフィルターを抗Ｐｙｋ２抗
体で再探索した（下パネル）。矢印はＰｙｋ２／ＰＫＭを示す。標準蛋白質マー
カーの位置（ｋＤａ）が右側に示されている。
【０１０２】 図４ｂは，Ｐｙｋ２−ＨＡとＰａｐＥ，ＰＫＭ−ＨＡとＰａｐＥ，ＰａｐＥの
み，またはＰｙｋ２−ＨＡのみの発現ベクターでトランスフェクトした２９３細
胞からの溶解物のウエスタンブロットを示す。溶解物は，抗ＨＡ，抗Ｐａｐまた
は抗Ｐｙｋ２抗体で免疫沈澱した（ＩＰ）。免疫沈殿物を抗ＨＡまたは抗Ｐａｐ
抗体でイムノブロッティング（ＩＢ）に供した。矢印は，Ｐｙｋ２／ＰＫＭおよ
びＰａｐＥを示す。標準蛋白質マーカーの位置（ｋＤａ）が右側に示されている
。
【０１０３】 図４ｃは，成人マウス脳ホモジネートのウエスタンブロットを示す。ホモジネ
ートは，抗Ｐｙｋ２抗体で免疫沈澱させ（ＩＰ），抗Ｐａｐ抗体（右上パネル）
または抗Ｐｙｋ２抗体（右下パネル）でイムノブロッティング（ＩＢ）を行った
。ＰａｐＥウイルスに感染したＰＣ１２細胞の溶解物を抗Ｐｙｋ２抗体で免疫沈
澱させ，次に抗Ｐａｐ（左上パネル）または抗Ｐｙｋ２（左下パネル）抗体でイ
ムノブロッティング（ＩＢ）を行った。矢印は，ＰａｐΔ，ＰａｐＥおよびＰＹ
Ｋ２を示す。標準蛋白質マーカーの位置（ｋＤａ）が右側に示されている。
【０１０４】 図４ｄは，ＳｒｃまたはＰａｐΔとＳｒｃの発現ベクターでトランスフェクト
した２９３細胞からの溶解物のウエスタンブロットを示す。溶解物は前免疫（Ｐ
Ｉ）または抗Ｐａｐ抗体（ＰＡＰ）のいずれかで免疫沈澱した（ＩＰ）。
【０１０５】 免疫沈澱物を抗Ｓｒｃ抗体でイムノブロッティング（ＩＢ）を行った。矢印は
ＳｒｃおよびＩｇＧ重鎖を示す。標準蛋白質マーカー（ｋＤａ）の位置が右側に
示されている。
【０１０６】 図５ａ，５ｂおよび５ｃは，Ｐｙｋ２およびＳｒｃキナーゼによるＰａｐのチ
ロシンリン酸化を示す。図５ａは，Ｈ2Ｏ2とＮａ3ＶＯ4（１ｍＭ）の混合物で２
０分間，またはＰＭＡ（２μＭ）で１０分間，３７℃で刺激したＰＣ１２細胞の
ウエスタンブロットを示す。Ｐａｐは，非刺激（−）または刺激（＋）細胞から
免疫沈澱させ，抗ｐＹ抗体でイムノブロット（ＩＢ）し（上パネル），および抗
Ｐａｐ抗体で再探索した（下パネル）。矢印はＰａｐΔを示す。標準蛋白質マー
カー（ｋＤａ）の位置が右側に示されている。抗Ｐａｐ抗体は，内因性ＰａｐΔ
（１１２ｋＤａ）とは別に，見かけ分子量１４０ｋＤａのバンドを沈澱させ（下
パネル），これはＰＣ１２細胞で発現されている追加の特性決定されていないＰ
ＡＰアイソフォームであるかもしれない。
【０１０７】 図５ｂは，ＰａｐＥとＰｙｋ２−ＨＡ，ＰａｐＥとＰＫＭ−ＨＡ，またはＰａ
ｐＥ単独の発現ベクターでトランスフェクトした２９３細胞からの溶解物のウエ
スタンブロットを示す。溶解物は，抗Ｐａｐ抗体で免疫沈澱させ，抗ｐＹ抗体で
イムノブロッティングを行った。同じフィルターを抗Ｐａｐおよび抗ＨＡ抗体で
再探索した。矢印はＰｙｋ２／ＰＫＭおよびＰａｐＥを示す。標準蛋白質マーカ
ー（ｋＤａ）の位置が右側に示されている。
【０１０８】 図５ｃは，ＰａｐΔとＳｒｃ，またはＰａｐΔとＳｒｃ（−）（Ｓｒｃのキナ
ーゼネガティブ変異体）の発現ベクターでトランスフェクトした２９３細胞から
の溶解物のウエスタンブロットを示す。溶解物は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，
抗ｐＹ抗体でイムノブロットして，抗Ｐａｐまたは抗Ｓｒｃ抗体で再探索するか
，または抗Ｐａｐ抗体で免疫沈澱させ，抗ｐＹ抗体および抗Ｐａｐ抗体でイムノ
ブロッティングした。矢印はＰａｐΔおよびＳｒｃを示す。標準蛋白質マーカー
（ｋＤａ）の位置が右側に示されている。
【０１０９】 図６ａ，６ｂ，６ｃおよび６ｄは，ＰａｐがＰｙｋ２によりチロシンリン酸化
されるがＦＡＫによってはリン酸化されないことを示す。ヒト２９３細胞を０．
１，１，または１０μｇの，ＰａｐＥとＰｙｋ２，またはＰａｐＥとＦＡＫの発
現ベクターでトランスフェクトした。これらの細胞からの溶解物を直ちに（総溶
解物），または抗Ｐａｐ抗体で免疫沈澱（ＩＰ）した後に，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
離した。
【０１１０】 図６は，抗ＰＹＫまたは抗ＦＡＫ抗体でのイムノブロッティングの結果を示す
。図６ｂおよび６ｄは，抗ｐＹ抗体でのイムノブロッティングの結果を示す。図
６ｃは，ＰＡＰ抗体でのイムノブロッティングの結果を示す。総細胞溶解物中で
検出されたチロシンリン酸化１１２ｋＤａ蛋白質（図６ｄ）は，同じフィルター
を抗Ｐｙｋ２または抗ＦＡＫ抗体で再探索することにより決定したところ（示さ
ず），Ｐｙｋ２およびＦＡＫに対応する。矢印は，Ｐｙｋ２／ＦＡＫおよびＰａ
ｐＥを示す。標準蛋白質マーカー（ｋＤａ）の位置が右側に示されている。
【０１１１】 図７ａおよび７ｂは，組換えＰａｐがインビトロでＡｒｆ ＧＡＰ活性を有す
ることを示す。図７ａは，ミリストイル化Ａｒｆ１（白丸），ミリストイル化Ａ
ｒｆ５（黒丸），ミリストイル化Ａｒｆ６（四角）および未修飾Ａｒｌ２（三角
）での１ラウンドのＧＴＰ加水分解のグラフである。加水分解は，ＰｔｄＩｎｓ
（４，５）Ｐ2の供給源としての粗ホスホイノシチド（１ｍｇ／ｍＬ）および示
された濃度の組換えＰａｐの存在下で測定した。ＧＡＰ活性は，４分間で加水分
解されたＧＴＰの，最初に結合したＧＴＰに対するパーセンテージで表されてい
る。図７ｂは，非ミリストイル化Ａｒｆ１の１ラウンドのＧＴＰ加水分解のグラ
フである。加水分解は，１．５ｎＭの組換えＰａｐおよび以下に示されるリン脂
質の存在下で測定した：なし（リン脂質を加えず）；ＰＩＰ2（９０μＭホスフ
ァチジルイノシトール４，５−ビホスフェート）；ＰＡ（７５０μＭホスファチ
ジン酸）；ＰＩ（７２０μＭホスファチジルイノシトール），ＰＳ（７２０μＭ
ホスファチジルセリン）；ＰＣ（７２０μＭホスファチジルコリン）。誤差バー
はＳＤ値を示す。
【０１１２】 図８は，ＰａｐΔ，繊維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ１，貫膜蛋白質
），またはＧｒｂ２（サイトゾル蛋白質）を過剰発現している亜細胞分画した２
９３細胞のイムノブロットを示す。総（Ｔ），可溶性（Ｓ），および粒子（Ｐ）
画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，抗Ｐａｐ，抗ＦＧＦＲ１，または抗Ｇｒｂ２
抗体でイムノブロットした。
【０１１３】 図９は，ＰａｐΔ−ｍｙｃの発現ベクターで過渡的にトランスフェクトしたＨ
ｅｌａ細胞の免疫蛍光染色を示す。４８時間後，細胞を固定し，透過性にし，抗
ｍｙｃ抗体で標識し，フルオレセイン結合抗ｍｙｃ抗体で染色し，次に共焦点顕
微鏡で調べた。矢印は原形質膜突出部におけるＰａｐΔの局在を示す。
【０１１４】 図１０は，ＰａｐΔ−ｍｙｃおよびＰｙｋ２−ＨＡ発現ベクターで過渡的にト
ランスフェクトしたＨｅＬａおよびＣＯＳ−７細胞の免疫蛍光染色を示す。４８
時間後，細胞を固定し，透過性にし，抗ＨＡモノクローナル抗体および抗Ｐａｐ
ポリクローナル抗体で二重標識した。フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ抗体お
よびローダミン結合抗ウサギＩｇＧ抗体で染色した後，細胞を共焦点顕微鏡で調
べた。画像を重ね合わせ（立体写真），重複する局在の領域を検出した。矢印は
原形質膜に共局在するＰａｐおよびＰｙｋ２の領域を示す。
【０１１５】 図１１は，ＰａｐΔ−ｍｙｃの発現ベクターで過渡的にトランスフェクトした
ＣＯＳ−７細胞を示す。４８時間後，細胞を固定し，透過性にし，抗ｍｙｃ，抗
マンノシダーゼＩＩまたは抗Ｅ−ＣＯＰ抗体で標識した。次に細胞をフルオレセ
イン結合抗マウスＩｇＧ抗体およびローダミン結合抗ウサギＩｇＧ抗体で染色し
，共焦点顕微鏡により調べた。画像を重ね合わせて（立体写真），重複する局在
の領域を検出した。矢印は核周囲領域におけるＰａｐおよびマンノシダーゼＩＩ
またはＥ−ＣＯＰの共局在の領域を示す。
【０１１６】 図１２ａ，１２ｂ，１２ｃおよび１２ｄは，Ｐａｐによるポストゴルジ小胞の
生成の阻害を示す。図１２ａは，ＶＳＶ−Ｇ蛋白質の放出パーセントのグラフで
ある。ゴルジ画分および［35Ｓ］標識シアル化ＶＳＶ−Ｇ蛋白質，肝臓サイトゾ
ル蛋白質およびＡＴＰを含むアッセイ混合物を，指示された濃度の組換えＰａｐ
とともに，３７℃で１時間インキュベートした。氷上で冷却することにより反応
を停止した。残留するゴルジ膜を除去した後に上清に回収された放射活性を，ゴ
ルジ中の初期放射活性のパーセンテージとして表す（ＶＳＶ−Ｇの放出，％）。
アッセイ混合物を組換えＰａｐ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）とともに（黒丸），また
はなしで（白丸）３７℃で１時間インキュベートした。図１２ｂ，１２ｃ，およ
び１２ｄは，肝臓サイトゾルの存在下における総放射活性のパーセントのグラフ
である。ＡＴＰ（１ｍＭ）あり（図１２ｂ）またはなし（図１２ｃ），ＧＭＰ−
ＰＮＰ（１００μＭ）あり（図１２ｄ）。インキュベーション後，混合物を氷上
で冷却し，放出された小胞をショ糖密度勾配により分離した。勾配画分，ローデ
ィングゾーン（Ｓ），および再懸濁ペレット（Ｐ）中の放射活性分布を，勾配に
回収された総ＶＳＶ−Ｇ放射活性のパーセンテージとして表す。被覆されていな
い小胞（画分２−５）は被覆されている小胞（画分５−１１）よりゆっくり沈降
した。
【０１１７】 図１３は，Ｐａｐの過剰発現による２９３細胞におけるＳＥＡＰ分泌の阻害の
グラフを示す。２９３細胞は，ＳＥＡＰの発現ベクターでトランスフェクトする
か，またはＳＥＡＰの発現ベクターと，ＰａｐまたはＰｙｋ２の発現ベクターを
，またはその両方でコトランスフェクトした。アッセイの間にブレフェルジンＡ
（５μｇ／ｍＬ）を培地に加えた。培地に放出されたＳＥＡＰの量を総ＳＥＡＰ
のパーセンテージで表す。すべての実験は三重に三回行った。誤差バーはＳＤ値
を表す。
【０１１８】 図１４は，Ｐａｐ（配列番号３）の核酸配列を示す。
【０１１９】 図１５は，Ｐａｐ（配列番号４）の核酸配列を示す。
【０１２０】 発明の詳細な説明 本発明は，とりわけ，Ｐｙｋ２に特異的に結合する新規蛋白質（Ｐａｐ（Ｐｙ
ｋ２Ｃ末端付随蛋白質）と称される）のクローニングおよび特性決定に関する。
Ｐａｐは，コイルドコイルモチーフを有するＮ末端α−ヘリックス領域，ＰＨ（
プレクストリンホモロジー）ドメイン，ジンクフィンガー含有Ａｒｆ ＧＡＰド
メイン，アンキリンホモロジー領域，プロリンリッチ領域およびＳＨ３ドメイン
から構成される。ＰａｐおよびＰｙｋ２は，インビトロおよびインビボの両方で
会合する。内因性Ｐａｐは，ホルボルエステル刺激に応答してチロシン残基でリ
ン酸化される。また，Ｐｙｋ２の活性化により，Ｐａｐがチロシンリン酸化され
る。密接に関連するキナーゼであるＦＡＫは，Ｐａｐをリン酸化しない。
【０１２１】 免疫蛍光分析は，Ｐａｐが原形質膜，細胞質，およびゴルジコンパートメント
に存在することを明らかにした。組換えＰａｐを加えると，インビトロでＡｒｆ
のＧＴＰ加水分解が強く活性化され，ポストゴルジ小胞のＡｒｆ依存性生成が阻
害される。さらに，２９３細胞におけるＰａｐの過剰発現は，マーカー蛋白質（
ＳＥＡＰ）の構成的分泌をダウンレギュレートする。
【０１２２】 １つの理論に限定されることを望むものではないが，本発明者らの現在の仮説
は，ＰａｐがインビボでＡｒｆ ＧＡＰ蛋白質として機能し，Ｐａｐのゴルジ膜
へのリクルートメントがＡｒｆ媒介性小胞発芽を制御するというものである。Ｐ
ａｐはまた，蛋白質チロシンキナーゼＰｙｋ２およびＳｒｃの基質および下流標
的として機能する。すなわち，現在好ましい仮説は，ＰＹＫ２およびＳｒｃは，
これらとＰａｐとの相互作用を介して，小胞輸送のある局面の制御に関与してい
るというものである。
【０１２３】 Ｐａｐは，酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて全長Ｐｙｋ２をおと
りとして用いて単離された。特異的プローブを用いるノザンブロット分析は，Ｐ
ａｐ ｍＲＮＡが脳，腎臓，および心臓において最も多量に存在し，胎盤，肺お
よび肝臓においてより低い発現が検出されることを示す。
【０１２４】 Ｐａｐのアミノ末端は，ミオシンおよびキネシンのα−ヘリックス配列と弱い
ホモロジーを示す。これは推定コイルドコイル構造，続いて典型的なＰＨドメイ
ンを含む。ＰＨドメインは，膜ターゲティングシグナルとして機能し，多くのＰ
Ｈドメインがホスホイノシチドに特異的に結合する。免疫蛍光実験は，Ｐａｐ分
子の集団が原形質膜に局在することを示す（図８−１１）。さらに，ＰａｐのＰ
Ｈドメインは温度感受性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｄｃ２５−２を補完し（
Ａｒｏｎｈｅｉｍ，１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２５：３３７３−３３７４；Ａｒｏｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：３０９４−３１０２），酵母が非許容温度で
成長することを可能とする。このことは，ＰａｐのＰＨドメインが細胞膜にター
ゲティングされることを示す。本発明らは，現在のところ，ＰＨドメインはおそ
らく蛋白質の細胞膜へのターゲティングに関与していると考えている。
【０１２５】 本発明は，２つのＰａｐアイソフォームであるＰａｐΔおよびＰａｐＥのクロ
ーニングおよび特性決定を含む。これらは，蛋白質のプロリンリッチ領域からの
４５アミノ酸の欠失およびＮ末端からの１７２アミノ酸の欠失において異なる。
Ｐａｐ特異的抗体を用いて，いくつかの免疫反応性種が同定され，このことは，
選択的スプライシングによりＰａｐの追加のアイソフォームが生成しているかも
しれないことを示唆する。これらはすべて，本発明に包含されることを意図する
ものである。
【０１２６】 ＰａｐのＳＨ３ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質は，インビトロでＰｙｋ２に
結合し，このことは，Ｐｙｋ２とＰａｐとの間の相互作用がＰａｐのＳＨ３ドメ
インがＰｙｋ２のＣ末端のプロリンリッチ領域に結合することを介していること
を示唆する。ＰａｐΔのプロリンリッチ領域は，４つのＳＨ３ドメインの推定結
合部位を含む。プロリンリッチ領域の１つがスプライスアウトされて，ＰａｐＥ
アイソフォームが生成する。別のプロリンリッチ領域は，ＳｒｃのＳＨ３ドメイ
ンの標準結合部位とほぼ同一であり，このことは，Ｓｒｃとの複合体の形成が，
おそらくはＳｒｃのＳＨ３ドメインがＰａｐのプロリンリッチ配列に結合するこ
とにより媒介されていることを示唆する。
【０１２７】 Ｐｙｋ２はインビトロおよびインビボの両方で，Ｐａｐと安定な複合体を形成
する。これらの蛋白質はいずれも原形質膜中に局在する（図８−１１）。さらに
，内因性Ｐａｐは，インビボで，異なる細胞タイプにおいてよく知られるＰｙｋ
２活性化剤であるＰＭＡによる刺激に応答してチロシンリン酸化される。２９３
細胞においては，ＰａｐはＰｙｋ２またはＳｒｃによりチロシンリン酸化される
。Ｐｙｋ２または他の蛋白質チロシンキナーゼによるＰａｐのチロシンリン酸化
により，シグナリング蛋白質のＳＨ２ドメインのための結合部位が生成するであ
ろう（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ．４：２５−３０）。例えば，Ｔｙｒ４７０は，ＳＨ２ドメイン
ｐ８５（ＰＩ−３キナーゼの制御サブユニット）のためのコンセンサス結合部位
（ＰＸＸＭ）中に位置する。
【０１２８】 Ｐａｐ中におけるＡｒｆ ＧＡＰドメインの存在は，ＰａｐがＡｒｆ蛋白質に
対して固有のＧＡＰ活性を有するかもしれないことを示す。ＰａｐのＰＨドメイ
ン，Ａｒｆ ＧＡＰドメイン，およびアンキリンホモロジー領域から構成される
組換え蛋白質は，Ａｒｆ１およびＡｒｆ５に対して強いＧＡＰ活性を示し，Ａｒ
ｆ６に対してより弱い活性を示した（図７）。ＧＡＰ活性は，アッセイ混合物中
のＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2の存在に厳密に依存した。ＰＨドメインを欠失し
た切断型蛋白質は，検出しうるＧＡＰ活性を有さず，このことはＰＨドメインが
Ｐａｐの膜会合を媒介し，このことによりＡｒｆ ＧＡＰ活性をＰｔｄＩｎｓ（
４，５）Ｐ2−依存性で刺激するかもしれないことを示唆する。
【０１２９】 Ａｒｆ１は，ゴルジ複合体等の異なる細胞内コンパートメントにおける小胞輸
送の制御に関与することが示唆されている。ゴルジ複合体の完全性および被覆蛋
白質のリクルートメントは，Ａｒｆ１活性化に依存性である。細胞中のＡｒｆ１
ＧＡＰの過剰発現は，ゴルジ膜に付随するＡｒｆ−ＧＴＰの枯渇のため，ゴル
ジ複合体の崩壊を引き起こす（Ａｏｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＥＭＢＯ Ｊ
．１６：７３０５−１６）。
【０１３０】 免疫蛍光局在実験は，Ｐａｐがゴルジコンパートメント中に局在することを示
す。Ｐａｐの過剰発現は，ゴルジ複合体の完全性に影響を及ぼさない（図１１Ｃ
）。しかし，ポストゴルジ小胞放出は組換えＰａｐ蛋白質および加水分解可能な
ヌクレオチドの存在下で阻害される。すなわち，阻害は，ゴルジ膜に付随する内
因性Ａｒｆ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性の増強のためである（図１２）。このこと
は，ゴルジ膜中の内因性Ａｒｆｌ蛋白質がＰａｐのＡｒｆ ＧＡＰ活性に応答す
ることを示唆する。
【０１３１】 Ｐａｐ蛋白質の２９３細胞における過剰発現は，ＳＥＡＰの構成的分泌の部分
的阻害を引き起こし，このことは，Ｐａｐがこれらの細胞においても類似のＡｒ
ｆ ＧＡＰ活性を示すかもしれないことを示唆する。しかし，ＳＥＡＰ分泌のＰ
ａｐ媒介性減少は，Ｐｙｋ２の発現により影響を受けない。この結果は，Ｐｙｋ
２およびＰａｐの細胞分布と一致する。ＰａｐおよびＰｙｋ２は原形質膜中に共
局在するが，Ｐａｐと異なり，Ｐｙｋ２はゴルジコンパートメント中では見いだ
されない。したがって，Ｐｙｋ２とＰａｐとの相互作用は原形質膜に限定されて
いるようである。Ｐａｐはゴルジ複合体中で他のチロシンキナーゼと相互作用す
るかもしれない。
【０１３２】 Ｉ．本発明の核酸および蛋白質 ＰＹＫ２をおとりとして用いるＳＯＳリクルートメントシステムにより同定さ
れたネズミ核酸配列は，推定分子量８８ｋＤａの，７８３アミノ酸のオープンリ
ーディングフレームを明らかにした。ネズミＰｙｋ２付随蛋白質はＰａｐＥと称
される。
【０１３３】 ネズミ配列でデータベースを探索することにより，５７１１塩基を含むヒト相
同体が同定された。ヒト類似体は，ネズミ配列と９５％の配列同一性を示し，１
００６アミノ酸を含み，推定分子量は１１２ｋＤａである。ヒト類似体ＰａｐΔ
，は，ネズミ類似体ＰａｐＥより大きい，これは，おそらくは選択的スプライシ
ングにより生成した追加の配列を含むためである。ＰａｐΔは，プロリンリッチ
ドメイン中に追加の４５アミノ酸，およびＮ末端ドメイン中に追加の１７２アミ
ノ酸を有する（図１）。
【０１３４】 ネズミおよびヒト配列の一次構造の分析は，Ｐａｐがいくつかの先に記載され
た配列モチーフから構成されるマルチドメイン蛋白質であることを示す。Ｐａｐ
のＮ末端は独特のアミノ酸配列を含み，この後にプレクストリンホモロジー（Ｐ
Ｈ）ドメイン，Ａｒｆ ＧＡＰドメイン，３つのアンキリン反復，プロリンリッ
チ領域，およびＳＨ３ドメインが存在する（図１）。
【０１３５】 Ｐａｐのアミノ末端は，ミオシンおよびキネシンのα−ヘリックス配列と弱い
ホモロジーを示す。これは，推定コイルドコイル構造および続く典型的なＰＨド
メインを含む。ＰａｐのＡｒｆ ＧＡＰドメインは，典型的なＣＸＸＣＸ16ＣＸ
ＸＣジンクフィンガー配列を含み，これはＡｒｆ１ ＧＡＰおよびＧＣＳ１蛋白
質のジンクフィンガー含有ドメインと高い配列同一性を有する（図２）。Ｐａｐ
のプロリンリッチ配列は，いくつかのＳＨ３ドメインのコンセンサス結合部位（
ＰＸＸＰ）を含み，これには，４つのタイプＩＩ ＳＨ３ドメイン結合部位（Ｐ
ＸＸＰＸＲ）が含まれる（Ｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６６：１２４１−１２４７）。ＰａｐΔのこの領域から４５アミノ酸がスプ
ライスアウトされてＰａｐＥが生ずる。
【０１３６】 Ｐａｐは，酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいてＳｒｃをおとりとし
て用いて最近クローニングされた蛋白質であるＡＳＡＰ１と密接に関連する（Ｂ
ｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｒｃ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，印刷中）。Ｐ
ａｐおよびＡＳＡＰ１の両方とも独特のアミノ末端配列を含み，この後に，ＰＨ
ドメイン，Ａｒｆ ＧＡＰドメイン，３つのアンキリン反復，プロリンリッチ配
列およびＳＨ３ドメインが存在する。しかし，ＰａｐおよびＡＳＡＰ１は異なる
組織発現パターンを示し，異なるプロリンリッチ配列を含む。このことは，互い
に異なるＳＨ３またはＷＷドメインを含有するシグナリング分子と相互作用する
ことを示唆する。ＰａｐおよびＡＳＡＰ１は，全体で６８％の同一性を有し；Ｐ
ＨおよびＡｒｆ ＧＡＰドメインは６９％同一であり，一方ＳＨ３ドメインは７
５％同一である。
【０１３７】 ＩＩ．小胞輸送 Ｓｒｃファミリーのキナーゼは，血小板の被覆膜領域と会合していることが見
いだされている（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｂｌｏｏｄ ８
９：２３８４−９３）。ＰＣ１２細胞においてＳｒｃはシナプス小胞とともに精
製される（Ｌｉｎｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１１７：１０７７−８４）。Ｓｒｃは膜輸送に関与するいくつかの蛋白質，
例えばニューロンシナプス小胞付随蛋白質であるシナプシンＩ，シナプトフィシ
ンおよびシナプトギリンと会合しこれをリン酸化する（Ｂａｒｎｅｋｏｗ，ｅｔ
ａｌ．，１９９０．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１０１９−２４；Ｐｏｓｔｅｒ−
Ｂａｒｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９５：４６７３−７；Ｊａｎｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８５１−７）。
【０１３８】 小胞の輸送は異なる制御蛋白質により制御されている。これには，Ｒａｓ−様
ＧＴＰａｓｅ（Ｒｏｔｈｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｎａｔｕｒｅ ３５
５：４０９−４１５），ヘテロ三量体Ｇ−蛋白質（Ｂｏｍｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．
，１９９２．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．３：１３１７−１３２８；Ｄｏｎａ
ｌｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．６：５２７−３２），ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）転移蛋白質（Ｂ
ｏｍｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．３：１３
１７−１３２８；Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５２７−３２；Ｏｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．
，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ ３７７），ＰＩ−３キナーゼ（ＤｅＣａｍｉｌｌｉ
，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１５３３−９），ホスホ
リパーゼＤ（ＰＬＤ；Ｅｘｔｏｎ，１９９７．Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２：１５５７９−８２），Ｃａ2+流入（Ｇｏｄａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：５１３−８），ならびに蛋白質
キナーゼＣ（ＰＫＣ）（Ｂｕｃｃｉｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３５２３−３３；Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９
６．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３５：３５５−７０）が含まれる。ヘテロ三量
体Ｇ−蛋白質は，小胞形成を制御する小さいＧＴＰ結合蛋白質であるＡＲＰ（Ａ
ＤＰ−リボシル化因子）の活性を制御することによりゴルジ装置を通る小胞輸送
を制御しうる（Ｂｏｍｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．３：１３１７−１３２８）。
【０１３９】 Ａｒｆは最初に，インビトロアッセイにおいてＧsΔのコレラ毒素依存性ＡＤ
Ｐリボシル化に必要なサイトゾル補因子として単離された（Ｋａｈｎ，ｅｔａ．
１．，１９８６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：７９０６−７９１１）。こ
の性質，および酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけ
る致死的二重ａｒｆ１−ａｒｆ２欠失を救済する能力により，Ａｒｆは構造的に
類似するＡｒｆ−様蛋白質から区別される（Ａｒｌｓ；Ｋａｈｎ，ｅｔ ａｌ．
，１９９１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２６０６−２６１４）。
【０１４０】 ６個のＡｒｆファミリーのメンバーがこれまでに同定されている。最も特性決
定されている哺乳動物ＡｒｆであるＡｒｆ１は，被覆蛋白質のゴルジ装置の膜へ
のリクルートメントにおいて，直接またはＰＬＤの活性化を介して機能する（Ｄ
ｏｎａｌｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．６：５２７−３２；Ｓａｂａｔｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｂ
ｉｏｃｅｌｌ ２０：２８７−３００）。真菌代謝産物であるブレフェルジンＡ
によるゴルジ複合体の破壊は，Ａｒｆ１におけるＧＤＰからＧＴＰへの交換の阻
害によるものであることが示されている（Ｈｅｌｍｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９２
．Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３５２−４）。Ａｒｆ１はまた，ＥＲからゴルジへの
輸送，エンドソーム機能，およびシナプス小胞形成に関与することが示唆されて
いる（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５２７−３２；Ｆａｕｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９
８．Ｃｅｌｌ ９３：４２３−３２）。最近の実験は，Ａｒｆ１が原形質膜にお
いてＧ−蛋白質結合レセプターと物理的に会合しており，ＰＬＤの活性化を促進
するという証拠を提供している（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．
Ｎａｔｕｒｅ３９２：４１１−４）。Ａｒｆ６は，原形質膜に局在し（Ｃａｖｅ
ｎａｇｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１７
６７−７４），ここでアクチン細胞骨格の組立およびエンドサイトーシスの両方
を調節するようである（Ｄ’Ｓｏｕｚａ−Ｓｃｈｏｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９
９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１１７５−８；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：４９−６１）。
【０１４１】 Ａｒｆは，膜へのＧＴＰ依存性結合および固有のＧＴＰａｓｅ活性がない点に
おいて，他の小さいＧＴＰａｓｅとは区別される。したがって，ＧＴＰａｓｅサ
イクルの完成には，グアニン−ヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）およびＧＴＰａ
ｓｅ−活性化蛋白質（ＧＡＰ）との相互作用を必要とする。３つのＡｒｆ ＧＥ
Ｐが特性決定されている（Ｃｈａｒｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕ
ｒｅ３８４：４８１−４；Ｋｌａｒｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８５９−６２；Ｍｅａｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．，１
９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１７４５−８
）。
【０１４２】 酵母（Ｐｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１００７４−７），ウシ脳（Ｒａｎｄａｚｚｏ，ｅｔ
ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０７５８−６３）およ
びラット肝臓（Ｍａｋｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：５２３２−７；Ｒａｎｄａｚｚｏ，１９９７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ
．３２４：４１３−９）からいくつかのＡｒｆ ＧＡＰ活性が検出されている。
酸性脂質およびＰｔｄＩｎｓ（４，Ｐ）Ｐ2は，ある種のＡｒｆ ＧＡＰによる
ＧＴＰ加水分解の刺激に必要な補因子であることが見いだされている（Ｋａｈｎ
，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ．Ｃｅｌｌｉｇｎａ
ｌ．１４：２０９−１４；Ｒａｎｄａｚｚｏ，１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７２：７６８８−９２）。
【０１４３】 最近同定されたＡｒｆ１−ＧＡＰ蛋白質は，Ａｒｆ ＧＡＰドメインと称され
る約１２０アミノ酸のジンクフィンガー配列を含む（Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ，ｅｔ
ａｌ．，１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１９９９−２００２）。Ａｒｆ
１ ＧＡＰのこの部分はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの"ジンクフィンガー"蛋白質
のファミリーと高度の類似性を示す。これらの１つであるＧＣＳ１は，静止段階
から細胞増殖への転移を媒介し（Ｉｒｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１３：３８１２−３８２１），インビトロおよびインビボで酵母Ａ
ｒｆ ＧＡＰとして機能することが示されている（Ｐｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１
９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１００７４−
７）。
【０１４４】 ＩＩＩ．新規Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの臨床応用 Ｐａｐポリペプチドは，蛋白質チロシンキナーゼＰｙｋ２およびＳｒｃの標的
として機能し，したがって，シグナル伝達経路において役割をはたす。さらに，
Ｐａｐポリペプチドはインビボで，ゴルジ膜にリクルートされたときＡｒｆ媒介
性小胞発芽を制御するようにＡｒｆ ＧＡＰ蛋白質として機能する。したがって
，過剰発現および／または変異事象によるＰａｐポリペプチドの制御解除は，小
胞輸送またはシグナル伝達を調節することを通して，癌，心臓血管，神経変性，
および／または免疫疾患において役割を果たすであろう。
【０１４５】 Ｐａｐポリペプチドのインビトロ使用には，これらの遺伝子中の変異が癌また
は他の状態に罹患する素因がより高いことに関連することが見いだされれば，診
断試薬としての使用が含まれる。そのような有用性は，ｐ５３，ＢＲＣＡ１等の
遺伝子および網膜芽細胞腫において価値を有することが証明されている（Ｆｅａ
ｒｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１０４３−１０４９
およびＰｏｎｄｅｒ，Ｂ．同，１０５０−１０５３）。さらに，これらは，シグ
ナル伝達経路および小胞輸送に関与する生化学的経路を解明するための研究試薬
として用いることができる。
【０１４６】 ＩＶ．Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの検出のための核酸プローブ，方法，およびキ
ット 本発明の核酸プローブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適
当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得る
ことができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野におい
て認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ"，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８
９を参照）。
【０１４７】 別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端および
Ｃ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学
合成を行うことができる。合成された核酸プローブは，ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にした
がって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当
な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ること
ができる。
【０１４８】 当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知ら
れるコンピュータアライメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロー
ブを用意に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハイブ
リダイゼーションプローブは，標準的標識技術，例えば放射性標識，酵素標識，
蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識する
ことができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可視
化することができる。
【０１４９】 本発明の核酸プローブは，ＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含みそのようなプ
ローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸
プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例とし
ては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物
，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアク
リルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体
支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【０１５０】 本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１５１】 試料中で本発明の核酸の存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハイ
ブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そ
して（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む
。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核
酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組
織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１５２】 試料中で本発明の核酸の存在を検出するためのキットは，その中に上述の核酸
プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以
下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合
した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，
限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，
アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。好ましくは，キットはさ
らに使用の指針を含む。
【０１５３】 コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れられている任
意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラスチック容器
またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容器は，試料
および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液を定量的様
式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えることができるよ
うに，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有効に移すこ
とができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器，アッセイ
において用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬（例えばリ
ン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイブリダイズ
したプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられる試薬を含
有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プローブを，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１５４】 Ｖ．Ｐｙｋ２結合蛋白質の核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を
含む細胞 本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０１５５】 本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
【０１５６】 核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
【０１５７】 所望の場合には，本発明のキナーゼをコードする配列の３’側の非コーディン
グ領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止制御配
列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。すなわち
，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接して
いる３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる
。発現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主
細胞において機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０１５８】 ２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列および本発明のＰｙｋ２結
合蛋白質をコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレ
ームシフト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のＰｙｋ２
結合ポリペプチドをコードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，
または（３）本発明のポリペプチドの遺伝子配列がプロモーター領域配列により
転写されることを妨害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる
。すなわち，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行う
ことができる場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。す
なわち，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させるた
めには，適当な宿主により認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【０１５９】 本発明は，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチド（またはその機能的誘導体）を
コードする遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させる
ことを包含する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に
有効でありかつ便利であり，したがって，本発明のポリペプチドのための１つの
好ましい発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株に
より代表される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができ
る。
【０１６０】 原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【０１６１】 認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０１６２】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチド（またはその機能的誘導体）を原核生物細
胞において発現させるためには，本発明のポリペプチドをコードする配列が，機
能的原核生物プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である
。そのようなプロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能
（すなわち，誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例に
は，バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる
。誘導可能な原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右お
よび左プロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａ
ｃＺ，ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５
）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｏｉｌｍａｎ
ｅｔ ａｌ．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４）
，Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ
ｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモー
ターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９
８７），Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，
１９８６），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：
４１５−４４２，１９８４）により概説されている。
【０１６３】 原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボ
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０１６４】 本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするＰ
ｙｋ２結合ポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定さ
れない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核
生物宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは
組織培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には
，ＨｅＬａ細胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１，
またはリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動
物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株，
例えばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれ
た能力を提供することができる。
【０１６５】 さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルス
ベクターを，昆虫細胞において本発明のキナーゼを大量に発現するよう遺伝子工
学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，１
９８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ
．２７７−２９７，１９８６）。
【０１６６】 酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドの発現にはいくつかの可能な
ベクター系が利用可能である。
【０１６７】 宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０１６８】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドの真核生物宿主における発現には，真核生
物制御領域を使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合
成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロ
モーターには，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（
Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８
８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃ
ｅｌｌ ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅ
ｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３
１，１９８１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：
６９７１−６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が
含まれる。
【０１６９】 真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のポリペプチド（また
はその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンを
コードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすること
が好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明の
ポリペプチドのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）また
はフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のポリペプチドのコーディング配
列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす。
【０１７０】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核酸分子および動作可能なよ
うに連結されたプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細
胞中に，非複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，
これは，直線状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのよ
うな分子は自己複製することができず，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的
発現により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグ
レートされることにより永久発現が得られる。
【０１７１】 所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０１７２】 導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０１７３】 好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例
えば，，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ
；"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。．Ｂａｃｉｌｌｕｓ
プラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９
８２）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅ
ｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１
８３，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例え
ばＩＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ
，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミ
ドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７
０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３
：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０１７４】 好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０１７５】 構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドまたは
そのフラグメントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのま
ま起こるか，またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば
，ブロモデオキシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明の
ペプチドを形成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができ
る。最も好ましい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０１７６】 ＶＩ．Ｐｙｋ２結合ポリペプチド検出のための抗体，ハイブリドーマ，使用方法
およびキット 本発明は，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに対する結合親和性を有する抗
体に関する。ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２に記載されるアミノ酸配
列，またはその機能的誘導体，またはその少なくとも９個の連続するアミノ酸（
好ましくは，その少なくとも２０，３０，３５，または４０個の連続するアミノ
酸）を有することができる。
【０１７７】 本発明はまた，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに対する特異的結合親和性
を有する抗体に関する。そのような抗体は，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチド
に対するその結合親和性を他のポリペプチドに対するその結合親和性と比較する
ことにより単離することができる。本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗
体は，本発明のポリペプチドと他のポリペプチドとを区別することを必要とする
方法において用いるために選択されるであろう。そのような方法には，限定され
ないが，他のポリペプチドを含む組織における変更されたＰｙｋ２結合ポリペプ
チド発現の分析が含まれる。
【０１７８】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドは，種々の手順および方法，例えば抗体の
生成，医薬組成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いる
ことができる。
【０１７９】 本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドは，抗体またはハイブリドーマを生成する
ために用いることができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチ
ドを本明細書に記載されるように生成し，免疫原として用いることができること
を認識するであろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクロー
ナル抗体，ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。
本発明の抗体のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術
分野において知られる手法の１つを用いて生成することができる。
【０１８０】 本発明はまた，上述のモノクローナル抗体，またはその結合フラグメントを産
生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体
を分泌することができる不死化細胞株である。
【０１８１】 一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【０１８２】 ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０１８３】 モノクローナル抗体のためには，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエロ
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲ
ｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリド
ーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよ
びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０１８４】 ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８−３１９，１９７９；Ｅｎｇ
ｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９−１３５，１９７２；
Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５−２２６，１９７
６を参照。本発明の標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシト
ゥーアッセイに用いて，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定するこ
とができる。
【０１８５】 上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【０１８６】 さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０１８７】 抗ペプチドペプチドは，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドのペプチド配列中
に見いだされる塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しなが
ら酸性残基で置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，ア
ルギニン，および／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸
で置き換え，およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで
置き換える。本発明はまた，試料中でＰｙｋ２結合ポリペプチドを検出する方法
を包含する。該方法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上
述の抗体と接触させ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検
出する，ことを含む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発
明の抗体とインキュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイする
ことを含む。試料中で本発明のポリペプチドのレベルが正常なレベルと比較して
変化していることは疾病を示すかもしれない。
【０１８８】 抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０１８９】 本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１９０】 キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。好ましくは，キットは使用の指針も含む。別の好ましい態様においては，キ
ットは以下の１またはそれ以上を含む１またはそれ以上の他の容器をさらに含む
：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
【０１９１】 検出試薬の例には，限定されないが，標識第２抗体が含まれ，あるいは，一次
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０１９２】 ＶＩＩ．Ｐｙｋ２結合ポリペプチドと相互作用する化合物の単離 本発明はまた，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドに結合しうる化合物を検出
する方法に関する。該方法は，化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュ
ベートし，ポリペプチドに結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物
は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していても
よい。
【０１９３】 本発明はまた，Ｐｙｋ２結合ポリペプチド活性の，またはそのようなＰｙｋ２
結合ポリペプチド結合パートナーの活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検
出する方法に関する。該方法は，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドを産生する
細胞を化合物の存在下でインキュベートし，Ｐｙｋ２結合ポリペプチド活性また
はＰｙｋ２結合ポリペプチド結合パートナーの活性のレベルの変化を検出するこ
とを含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示す活性の変化
を生ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞
抽出物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，当該技術分野
においてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【０１９４】 本発明はまた，哺乳動物においてキナーゼ関連活性をアゴナイズ（促進）する
かまたはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は，前記哺乳動物に本発明
のキナーゼに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまたはア
ンタゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。Ｐｙｋ２結合ポリペ
プチド関連機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量のアゴニス
トまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物においてＰ
ｙｋ２結合ポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾病を
治療する方法もまた，本発明に包含される。
【０１９５】 疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は
，蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。いく
つかの小さい有機分子は蛋白質キナーゼの機能を調節する化合物の一群を形成す
る。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては，
限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（ＰＣＴ
ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ
ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８，
１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．），１−シクロプ
ロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），スチリル
化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特
許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２
６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４
２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．），三環式ポリヒ
ドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２年１２月１０日公開
，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５
，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙げられる。
【０１９６】 細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは，蛋白質キナー
ゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し
，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【０１９７】 しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙ
ｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７）および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ
−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許出
願０８／４８５，３２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏ
ｃｋｅｔ Ｎｏ．２２３／２９８）および国際特許出願ＷＯ９６／４０１１６（
１９９６年１２月１９日公開，Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）およびＷＯ９６／２２
９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ）（これら
はすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有す
るインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Ｉｎｄｏｌ
ｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅ
ｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．
の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ
Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７），"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉ
ｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の０８／４８５，３
２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２
２３／２９８），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａ
ｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細胞におけるイ
ンドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻
害パターンを教示する。さらなる情報は，"３−Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ−２−Ｉ
ｎｄｏｌｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米国特許．５
，７９２，７８３（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２３／３０１
，１９９６年６月５日出願）（これもまた，図面および表を含めその全体を本明
細書の一部としてここに引用する）に見いだすことができる。
【０１９８】 キナーゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されないが，チ
ロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上述のキ
ナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知られる化
合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類を記載
する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５２０７
２２Ａｌ；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；Ｋａｂ
ｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏ
ｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許．５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ ａ
ｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許．４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａｒ
ｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．
Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１），
２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８
３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒｙ
ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊａ
ｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１
，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９
（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅｔ
ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；Ｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１５
−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒ
ｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２５
−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅｔ
ｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅｃ
ｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１）
−．２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，ＡＳＳ；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０１９９】 キノキサリン類は，Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，
３１６，５５３，（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）に記載される。
【０２００】 キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，−およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載される。
【０２０１】 チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３−．Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（
１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２
）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，
５３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
１（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（
１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２
２２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４
１３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ
ＦＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９
８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５
−３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ
ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５）
，８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａ
ｓ，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７
０−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含
めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２０２】 ＶＩＩＩ．トランスジェニック動物 本発明に関連するトランスジェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能
である。ＤＮＡを雄前核と雌前核の融合前に受精可能卵の前核に注入するか，ま
たはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞分裂を
開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。本発明
の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス，特に
レトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２０３】 胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
【０２０４】 齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
【０２０５】 一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウス
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０）。
【０２０６】 胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウ
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂ
ｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０２０７】 ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクロ
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０２０８】 ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
【０２０９】 すなわち，本発明は，本発明のＰｙｋ２結合ポリペプチドをコードするトラン
スジンまたはポリペプチドの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニッ
クの非ヒト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動
物は，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドの導入の効果を研究するため，またはＰｙｋ２
結合ポリペプチドの発現を制御（すなわち，追加の遺伝子，アンチセンス核酸，
またはリボザイムの導入により）するためのインビボ試験系として特に有用であ
る。
【０２１０】 "トランスジェニック動物"とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトＮＥＫキナーゼをコードしていてもよい。動物における自然の発現は，
レセプターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ
を与えることにより減少させることができる。
【０２１１】 ＩＸ．遺伝子治療 Ｐｙｋ２結合蛋白質またはその遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用であ
る（総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９
２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝
子治療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本
的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９
９３）に記載されている。
【０２１２】 １つの好ましい態様においては，Ｐｙｋ２結合蛋白質のコーディング配列を含
む発現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量
に患者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例
えば，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のＰｙｋ２結合ポ
リペプチドをコードする内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメント
が内因性ポリペプチド遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモ
ーターセグメントをこれが内因性Ｐｙｋ２結合ポリペプチド遺伝子に直接連結す
るように細胞内に移送する）。
【０２１３】 遺伝子治療は，腫瘍を標的とするＰｙｋ２結合ポリペプチドｃＤＮＡを含むア
デノウイルスの使用を含むことができる。全身Ｐｙｋ２結合ポリペプチドは，遺
伝子工学処理した細胞の移植，そのようなポリペプチドをコードするウイルスの
注入，または裸のＰｙｋ２結合ポリペプチドＤＮＡの適当な組織への注入により
増加する。
【０２１４】 そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害するこ
とにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害
し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能
力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失
またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害する
ことができる。
【０２１５】 ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，ア
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えＰｙｋ２
結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞
集団（例えば腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を
用いて，コーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができ
る（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるい
は，蛋白質配列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系
，例えば標的細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いる
ことができる（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７
：３８７−８，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミド
ＤＮＡを細胞内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミド
ＤＮＡを蛋白質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにター
ゲティングすることを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０２１６】 最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【０２１７】 また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または組換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改
良する蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにＤＮ
Ａを結合させる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２１８】 本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【０２１９】 本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であ
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
【０２２０】 別の好ましい態様においては，Ｐｙｋ２結合ポリペプチドをコードする核酸配
列を有するベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発
現される。組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９−２３
６（１９９２年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２２１】 上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２２２】 別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【０２２３】 Ｘ．医薬製剤および投与経路 本明細書に記載される物質は，そのままヒトの患者に投与するか，または組み
合わせ治療において，これを他の活性成分とともに適当な担体または賦形剤と混
合した医薬組成物中で投与することができる。本明細書に記載される物質の製剤
および投与の技術は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍｃｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔ
ｏｎ，ＰＡ）の最新版に見いだされる。
【０２２４】 ａ．投与経路 適当な投与経路は，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸管投与，あるいは
筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内等の非経口輸送，ならびに髄内，直接心室内，腹
腔内，鼻腔内，または眼内の注射を含む。
【０２２５】 あるいは，化合物は，全身的方法ではなく局所に，例えば化合物を固体腫瘍内
へ直接に，しばしばデポ剤または持効性の製剤中で，注射することにより投与し
てもよい。さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムに
おいて，例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい
。リポソームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０２２６】 ｂ．組成物／製剤 本発明の医薬組成物は，当該技術分野において知られる方法，例えば慣用の混
合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾
燥により製造することができる。
【０２２７】 すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性物質を薬剤
として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補助
剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法
で製剤することができる。適切な製剤は，選択される投与経路に依存する。
【０２２８】 注射用には，本発明の薬剤は水溶性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル
溶液，または生理的塩類緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で製剤すること
ができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が製剤に用いられ
る。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０２２９】 経口投与のためには，活性物質を当該技術分野においてよく知られる薬学的に
許容しうる担体と混合することにより物質を容易に製剤することができる。その
ような担体は，物質を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，丸薬，糖
衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として製剤するこ
とを可能とする。適当な担体には，ラクトース，ショ糖，マンニトール，または
ソルビトールを含む糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，
およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，
メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量
剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン
，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊
剤を加えてもよい。
【０２３０】 糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性成分の用量の異なる組合せ
を特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加する
ことができる。
【０２３１】 経口投与することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフィ
ットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロールやソルビトール等の可塑剤
から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分
を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよび
ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含む
ことができる。軟カプセルにおいては，活性物質は脂肪油，流動パラフィン，ま
たは液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁することが
できる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての製剤は，そのよ
うな投与に適当な用量で調製すべきである。
【０２３２】 口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形に
することができる。
【０２３３】 吸入による投与用には，本発明に従って用いられる物質は，噴射剤，例えば，
ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオ
ロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまたは
ネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエ
アーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブによ
り調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼ
ラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトース
またはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう製剤することができる。
【０２３４】 物質は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤するこ
とができる。注射用の製剤は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは添
加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性また
は水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることができ
，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０２３５】 非経口投与用の薬剤組成物は，水溶性の形態の活性物質の水性溶液を含む。さ
らに，活性成分の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することがで
きる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸エ
チルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含む
。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトー
ル，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよ
い。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該化
合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０２３６】 あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば
発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０２３７】 物質はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を
用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に製剤することができる。
【０２３８】 上述した製剤に加えて，物質はまたデポ製剤として製剤することができる。そ
のような長時間作用性の製剤は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）による
か，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，物質は，適当な
高分子性または疎水性物質と共に（例えば薬理学的に許容される油剤による乳濁
液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として
，製剤することができる。
【０２３９】 疎水性物質のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界面活性剤，
水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系はＶＰＤ共
溶媒系であってもよい。
【０２４０】 ＶＰＤは，３％ｗ／ｖベンジルアルコール，８％ｗ／ｖ非極性界面活性剤ポリ
ソルベート８０，および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００を純粋エタ
ノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤ
を５％デキストロースの水溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系
は疎水性物質をよく溶解し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来
，そのような共溶媒系の比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく
相当変化させることができる。さらに，共溶媒成分の同一性も変化させることが
できる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに
用いることができ，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他
の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピローリドンをポリエチレングリコー
ルの代わりに用いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わり
に用いることができる。
【０２４１】 あるいは，疎水的医薬物質のための他の輸送系を用いてもよい。リポソームお
よび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知ら
れている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用い
ることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，物質は，持続放出系
，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリクスを用いて輸送
することができる。種々の持続放出材料が確立されており，当業者にはよく知ら
れている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を
越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に
応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０２４２】 医薬組成物はまた，適当な固体またはゲル相担体または賦形剤を含んでいても
よい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム
，リン酸カルシウム，種々の糖および澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，およ
びポリエチレングリコール等のポリマーが含まれる。
【０２４３】 ＰＴＫ調節物質の多くは，薬学的に適合性のカウンターイオンとして提供する
ことができる。薬学的に適合性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩
酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石酸，マレイン酸，コハク酸等を用いて形成すること
ができる。塩は，対応する遊離塩基の形である水性または他のプロトン性溶媒に
比べてより溶解性が高い傾向にある。
【０２４４】 ｃ．有効用量 本発明において用いるのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図する目
的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より詳細には，治療上
有効量とは，疾病の症状を予防，緩和，または改善するか，または治療中の患者
の生存を延長するのに有効な物質の量を意味する。治療上有効量の決定は，特に
本明細書において提供された詳細な開示を考慮すれば，十分に当業者の能力の範
囲内である。
【０２４５】 本発明の方法において用いられる任意の物質について，治療上有効な用量は，
最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにおい
て，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわち蛋白質Ｐｙｋ２結合ポリペプ
チド活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を
達成するような用量を処方することができる。そのような情報は，ヒトにおける
有用な用量のさらに正確な決定のために用いることができる。
【０２４６】 本明細書に記載される物質の毒性および治療上有効性は，培養細胞または実験
動物における標準的な薬学的方法，例えば，ＬＤ50（集団の５０％に致死的な用
量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための
方法により決定することができる。毒性と治療的効果との間の用量の比は治療指
数であり，これはＬＤ50とＥＤ50との間の比率として表すことができる。高い治
療指数を示す物質が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得
られるデータは，ヒトにおいて用いるための投与量の範囲を定式化するために用
いることができる。そのような物質の投与量は，好ましくは，ＥＤ50を含み毒性
がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態
および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。正確な製剤，投与
経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することがで
きる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１
，ｐ．１を参照）。
【０２４７】 投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果またはＰｙｋ２結
合ポリペプチド調節効果を維持するのに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃
度（ＭＥＣ）を与えるよう調節することができる。ＭＥＣは，各化合物について
異なるが，インビトロのデータ，例えば，本明細書に記載されるアッセイを用い
てＰｙｋ２結合ポリペプチドの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度か
ら見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性お
よび投与経路に依存するであろう。しかし，ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッ
セイを用いて血漿濃度を決定することができる。
【０２４８】 投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。物質は，１０−９
０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の時
間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。
【０２４９】 局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度
とは関係ないであろう。
【０２５０】 投与される組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛の激し
さ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０２５１】 ｄ．包装 組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を
含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。
パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むこ
とができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されてい
てもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，用途，または
販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に関連した注意書が添
付されていてもよく，その注意書は当該組成物の形状について，あるいはヒトま
たは獣医学的投与についての当該機関による承認を反映するものである。かかる
注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベル
によるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した製剤
学的担体中で製剤された，本発明の化合物を含む組成物もまた調製され，適当な
容器内に配置され，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すこと
ができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の
阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
【０２５２】 ＸＩ．機能的誘導体 また，本明細書においては，本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体
が提供される。"機能的誘導体"とは，本発明のポリペプチドまたは核酸の"化学
的誘導体，"フラグメント"または"変種"を意味し，これらの用語は以下に定義さ
れる。機能的誘導体は，蛋白質の機能，例えば蛋白質に特異的な抗体との反応性
，酵素的活性または非触媒的ドメインにより媒介される結合活性の少なくとも一
部を保持しており，本発明にしたがう有用性を可能とする。遺伝コードの縮重の
ため，多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうることは，当該技
術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変化させて，元
の蛋白質の機能性を保持する蛋白質またはポリペプチドを得ることができること
も，当該技術分野においてよく知られている。いずれの場合にも，すべての順列
が本明細書の開示によりカバーされることが意図される。
【０２５３】 本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすること
ができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，Ｐｙｋ２結合ポ
リペプチド遺伝子の一部または全部を合成して，配列番号３または配列番号４に
示される核酸配列と有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これに
よりコードされるアミノ酸配列は保存される。
【０２５４】 さらに，核酸配列は，配列番号３または配列番号４に示される核酸の式の５’
−末端および／または３’−末端で少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失
または置換することにより得られるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。その
付加，欠失または置換が，ヌクレオチド配列によりコードされる配列番号１また
は配列番号２のアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリ
ヌクレオチドをこのように用いることができる。例えば，本発明は，本発明の核
酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加すること
により，または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端に終止
コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる任意の
核酸配列を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，
これらの５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を有することができる。
【０２５５】 所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明のＰｙｋ２
結合ポリペプチド遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての
変種は本発明に含まれる。
【０２５６】 さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
【０２５７】 複合体の"化学的誘導体"は，通常は蛋白質の一部ではない追加の化学的成分を
含む。蛋白質またはペプチドの共有結合修飾は，本発明の範囲内に含まれる。そ
のような修飾は，以下に記載するように，ペプチドの標的アミノ酸残基を選択さ
れた側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導化剤と反応させることにより，分
子中に導入することができる。
【０２５８】 システイン残基は，最も一般的には，アルファ−ハロアセテート（および対応
するアミン），例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて，カル
ボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はま
た，ブロモトリフルオロアセトン，リン酸クロロアセチル，Ｎ−アルキルマレイ
ミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド，メチル２−ピリジルジスルフィ
ド，ｐ−クロロ−水銀ベンゾエート，２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール，
またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応に
より誘導化される。
【０２５９】 ヒスチジン残基は，ｐＨ５．５−７．０においてジエチルプロカーボネートと
反応させることにより誘導化される。これは，この薬剤がヒスチジル側鎖に比較
的特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である。反応
は，好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム，ｐＨ６．０中で行う。
【０２６０】 リジンおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応さ
せる。これらの薬剤による誘導化は，リジン残基の電荷を逆転させる効果を有す
る。１級アミン含有残基を誘導化するための他の適当な試薬には，イミドエステ
ル，例えば，メチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリド
キサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ
ウレア；２，４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼに触媒されるグリ
オキシレートとの反応が含まれる。
【０２６１】 アルギニン残基は，１または数個の慣用の試薬，例えばフェニルグリオキサー
ル，２，３−ブタンジオン，１，２−シクロヘキサンジオン，およびニンヒドリ
ンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導化には，反応がアルカリ条
件下で行われることが必要である。これは，グアニジン官能基のｐＫaが高いた
めである。さらに，これらの試薬は，リジンの基ならびにアルギニンのαアミノ
基とも反応しうる。
【０２６２】 チロシン残基は，芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反
応によりスペクトル標識を導入する修飾のよく知られた標的である。最も一般的
には，それぞれＮ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて，
Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。
【０２６３】 カルボキシル側基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は，カルボジイミド
（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’），例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４
，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。
さらに，アンモニウムイオンとの反応により，アスパラギン酸およびグルタミン
酸残基は，アルパラギンおよびグルタミン残基に変換される。
【０２６４】 グルタミンおよびアスパラギン残基は，しばしば脱アミノ化して，対応するグ
ルタミン酸およびアスパラギン酸残基とする。あるいは，これらの残基を弱酸条
件下で脱アミノ化する。これらの残基のいずれの形も本発明の範囲内である。
【０２６５】 二官能性薬剤による誘導化は，例えば，蛋白質の成分ペプチドを互いに，また
は複合体中の他の蛋白質と，または水不溶性支持体マトリクスと，または他の高
分子担体と架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋薬剤としては，例え
ば，１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデヒ
ド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば，４−アジドサリチル酸の
エステル，ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含む），および二官能
性マレイミド，例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。
メチル−３−［ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導化
薬剤により，光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体が得られる。
あるいは，反応性の水不溶性マトリクス，例えば臭化シアン活性化炭水化物およ
び米国特許３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４
，２４７，６４２；４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載され
る反応性基質を蛋白質固定化のために用いることができる。
【０２６６】 他の修飾としては，プロリンおよびリジンのヒドロキシル化，セリンまたはト
レオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化，リジン，アルギニン，およびヒスチ
ジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
ｐｐ．７９−８６（１９８３）），Ｎ−末端アミンのアセチル化，および場合に
よりＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０２６７】 そのような誘導化された成分は，安定性，溶解性，吸収，生物学的半減期等を
改良することができる。あるいは，これらの成分は，蛋白質複合体の望ましくな
い副作用を排除するかまたは緩和することができる。そのような効果を媒介しう
る成分は，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。
【０２６８】 "フラグメント"との用語は，これが由来する全長ポリペプチドより短い長さを
有する蛋白質または複合体のアミノ酸配列に由来するポリペプチドを示すものと
して用いられる。そのようなフラグメントは，例えば，全長蛋白質の蛋白質分解
性切断により製造することができる。好ましくは，フラグメントは，蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を適当に改変して，Ｃ−末端，Ｎ−末端，および／または天
然配列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸を除去
することにより，組換えにより得る。蛋白質のフラグメントは，本明細書に記載
されるように，シグナル伝達を調節するように作用する物質のスクリーニングに
有用である。そのようなフラグメントは，天然の複合体の１またはそれ以上の特
徴的部分を保持しているであろうことが理解される。そのような保持される特徴
の例としては，触媒的活性；基質特異性；無傷の細胞中における他の分子との相
互作用；制御機能；または天然の複合体またはそのエピトープに対する抗体との
結合が挙げられる。
【０２６９】 本発明の範囲内に入ることが意図される別の機能的誘導体は，天然のポリペプ
チドに対して，１またはそれ以上のアミノ酸を欠失しているか，追加のまたは置
換されたアミノ酸を含む"変種"ポリペプチドである。変種は，蛋白質のＤＮＡコ
ーディング配列を適当に改変して，Ｃ−末端，Ｎ−末端，および／または天然配
列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸のためのコ
ドンを付加，除去，および／または改変することにより，天然に生ずる複合体成
分から誘導することができる。追加，置換および／または追加アミノ酸を有する
そのような変種は，上述するように，天然の蛋白質の１またはそれ以上の特徴的
部分を保持していることが理解される。
【０２７０】 アミノ酸残基が除去，挿入および／または置換されている蛋白質の機能的誘導
体は，当業者によく知られる標準的な手法を用いて製造することができる。例え
ば，機能的誘導体の改変された成分は，改変されたコード配列を生成するように
，ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを修飾する部位特異的突然変異手法（Ａｄ
ｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＤＮＡ２：１８３に例示されている）を
用いて，その後上述したような手法を用いてこの組換えＤＮＡを原核生物または
真核生物宿主細胞中で発現させることにより，製造することができる。あるいは
，アミノ酸が削除，挿入および／または置換されている蛋白質は，当該技術分野
においてよく知られる方法を用いて，直接化学合成により便利に製造することが
できる。蛋白質の機能的誘導体は，典型的には天然の蛋白質と同じ質の生物学的
活性を示す。
【０２７１】 ショウジョウバエ網膜変性Ｂ（ｒｄｇＢ）蛋白質に関連するＰＹＫ２の標的の新
規ファミリーの同定 蛋白質チロシンキナーゼＰＹＫ２は，Ｇ−蛋白質結合レセプター，細胞内カル
シウム，およびストレスシグナルにより活性化されるシグナリング経路に関与す
ることが示唆されている。本明細書においては，Ｎｉｒ（ＰＹＫ２Ｎ末端ドメイ
ン相互作用レセプター）と称されるＰＹＫ２−結合蛋白質の新規ファミリーの分
子クローニングおよび特徴付けが記載される。３つのＮｉｒ蛋白質（Ｎｉｒｌ，
Ｎｉｒ２，およびＮｉｒ３）は，カルボキシ末端に位置する保存された配列モチ
ーフを介してＰＹＫ２のアミノ末端ドメインに結合する。Ｎｉｒの一次構造は，
６個の推定貫膜ドメイン，ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）転移蛋白質に相
同性の領域および酸性ドメインを明らかにする。Ｎｉｒ蛋白質は，ショウジョウ
バエの網膜変性Ｂ蛋白質（ｒｄｇＢ）（ハエにおいて視覚伝達経路に関与するこ
とが示唆されている蛋白質）のヒト相同体である。本発明らは，Ｎｉｒがインビ
ボでＰＩ転移活性を示すカルシウム結合蛋白質であることを示している。細胞内
カルシウムを上昇させる薬剤またはホルボルエステルによるＰＹＫ２の活性化は
，Ｎｉｒのチロシンリン酸化を誘導する。さらに，ＰＹＫ２およびＮｉｒは，脳
および網膜のいくつかの領域において類似する発現パターンを示す。さらに，Ｐ
ＹＫ２−Ｎｉｒ複合体は，培養細胞または脳組織から調製した溶解物中で検出さ
れる。最後に，Ｎｉｒ１をコードする遺伝子は，ヒト染色体１７ｐ１３．１の，
いくつかのヒト網膜疾病の原因である座に近い位置にある。本発明らは，Ｎｉｒ
およびｒｄｇＢ蛋白質が，Ｇ−蛋白質結合レセプターの下流のカルシウムおよび
ホスホイノシチド代謝の制御において役割を果たす進化的に保存されたＰＹＫ２
−結合蛋白質の新規ファミリーであることを提唱する。
【０２７２】 実施例 以下の実施例は限定ではなく，本発明の種々の観点および特徴の代表的なもの
にすぎない。実施例は，本発明のＰＹＫ２結合蛋白質の単離および特徴付けを示
す。
【０２７３】 実験方法 Ｓｏｓリクルートメントシステム 蛋白質−蛋白質相互作用を検出するためのＳｏｓリクルートメントシステムは
Ａｒｏｎｈｅｉｍ（１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２５：３３７３−３３７４；Ａｒｏｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：３０９４−３１０２）に記載されており，温
度感受性のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｄｃ２５−
２株，ｐＡＤＮＳ−ｈ５’Ｓｏｓ構築物，およびＳｒｃミリスチル化シグナルに
融合させたラット下垂体ｃＤＮＡのガラクトース誘導可能発現ライブラリの使用
を含む。
【０２７４】 全長Ｐｙｋ２を，ｐＡＤＮＳ発現ベクター中にｈ５’Ｓｏｓとインフレームで
サブクローニングした。ｐＡＤＮＳ−ｈ５’ＳＯＳ−Ｐｙｋ２でトランスフェク
トしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｄｃ２５−２の溶解物を，抗Ｐｙｋ２抗体
で免疫沈澱させ，次に抗Ｐｙｋ２または抗Ｓｏｓ抗体でブロッティングして，ｈ
５’Ｓｏｓ−Ｐｙｋ２融合蛋白質の発現を確認した。
【０２７５】 ライブラリプラスミドおよびｈ５’Ｓｏｓ−Ｐｙｋ２"おとり"を含有する約４
ｘ１０5個のｃｄｃ２５−２トランスフォーマントを室温で成長させ，ガラクト
ースプレート上にレプリカし，３７℃でインキュベートした。３７℃でガラクト
ース依存性成長を示すクローンからライブラリプラスミド（ｐＹＥＳ２発現ベク
ター）を単離し，ｈ５’Ｓｏｓ−Ｐｙｋ２，または関連性のないおとり（ｈ５’
ＳＯＳ−ＦＡＫ）のいずれかを発現するｐＡＤＮＳベクターまたはｈ５’Ｓｏｓ
単独でｃｄｃ２５−２細胞を再トランスフォームした。ｈ５’Ｓｏｓ−Ｐｙｋ２
の存在下でのみｃｄｃ２５−２表現型を抑制したクローンをポジティブであると
考え，さらに分析した。慣用的な酵母操作プロトコルを用いた。酵母トランスフ
ェクションおよび培地組成およびレプリカプレーティングは，先に記載されるよ
うに実施した（Ｇｉｅｔｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｙｅａｓｔ １１：３５
５−６０；Ａｒｏｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１７：３０９４−３１０２）。
【０２７６】 ノザンブロット分析 ヒトの多数の組織のノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を，製造元の指針に
したがって，高ストリンジェンシー条件下で，32Ｐで標識したＰａｐαのアミノ
酸２８１−６９１に対応するｃＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせ，オー
トラジオグラフィーを行った。
【０２７７】 プラスミド，サブクローニング，Ｐａｐ ｃＤＮＡの単離および配列分析 ラット下垂体ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングにおいて得られたクローン
は，Ｐａｐ蛋白質のＣ末端領域およびＰａｐ遺伝子の３’末端を含んでいた。遺
伝子の５’末端を同定するために，マウス脳ラムダｃＤＮＡライブラリ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）を，Ｐａｐ Ｃ末端（６３９塩基対）に対応する32Ｐ−標識プ
ローブで，標準的な方法にしたがってスクリーニングした。ポジティブクローン
をプラーク精製した。切り出したｃＤＮＡは，自動化シークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて，内部および外部プライマーから両方
の方向で配列決定した。ジェネティクスコンピュータグループ（ＧＣＧ）配列分
析ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ）を用いて，ＤＮＡおよびアミノ酸配列を分析した。プレクストリンホモ
ロジー（ＰＨ）ドメインは，ＰＨドメインデータベースとの比較により同定した
。
【０２７８】 哺乳動物での発現のためには，ＰａｐαおよびＰａｐβをコードするｃＤＮＡ
をｐＲＫ５発現ベクター（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１２：５８２４−３３）中にサブクローニングした。ｍｙｃ−タグを
ＰａｐαのＣ末端にインフレームで融合させた。また，ＦＡＫ，ＨＡ−タグ付き
Ｐｙｋ２，およびＨＡ−タグ付きＰＫＭを含有するｐＲＫ５ベクターも用いた（
Ｌｅｖ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７３７−４５）。Ｐ
ａｐβを安定に発現するＰＣ１２細胞を作成するために，ＰａｐβのｃＤＮＡを
ＰＣＲを用いてｐＬＸＳＮレトロウイルス中にサブクローニングした。
【０２７９】 ＧＳＴ−ＰＡＰ融合蛋白質を作成するために，プロリンリッチ領域およびＳＨ
３ドメインをコードするＰａｐのＣ末端部分をＰＣＲで増幅し，ｐＧＥＸ−２Ｔ
ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）中にＧＳＴとイン
フレームでサブクローニングした。構築物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
中で発現させ，グルタチオン−セファロースビーズを用いてアフィニティークロ
マトグラフィーにより精製した（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｇｅｎ
ｅ ６７：３１−４０）。
【０２８０】 Ａｒｆ ＧＡＰアッセイにおいて用いるべき構築物を作成するために，ＰＨド
メイン，Ａｒｆ ＧＡＰドメイン，およびアンキリンホモロジー領域を含むＰａ
ｐβの領域（アミノ酸１１１−５２２）をＰＣＲにより増幅し，細菌性発現ベク
ターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にＨｉｓ−タグ配列とインフレー
ムでサブクローニングした。蛋白質産物を細菌中で発現させ，ＨｉｌｏａｄＱお
よびニッケルキレートカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．
）で順にクロマトグラフィーを行うことにより精製した。
【０２８１】 細胞株，過渡的および安定トランスフェクション ヒト腎臓（２９３），サル腎臓（ＣＯＳ−７），およびヒト上皮（ＨｅＬａ）
細胞は，１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．
）を補充したＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で成長させた。ラット褐色細胞腫（
ＰＣ１２）細胞は，１０％ウシ胎児血清および１０％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中
で成長させた。ＰＣ１２細胞は血清を含まない成長培地中で２４時間飢餓状態と
した後，ＰＭＡ（２ｐＭ）で１０分間，またはＨ2Ｏ2とＮａＶＯ３（１ｍＭ）と
の混合物で２０分間刺激した。コンフルエントに近い２９３細胞を，６ウエルプ
レートのウエルあたり１ｐｇのＤＮＡで，カルシウム沈澱法を用いて（Ｃｈｅｎ
，ｅｔａｌ，１９８７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２），
または記載されるようにトランスフェクトした。Ｐａｐβを発現する安定にトラ
ンスフェクトされたＰＣ１２細胞は，ＰＬＸＳＮレトロウイルス発現ベクターを
用いることにより作成した（Ｈａｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３９６６−３９７３）。Ｐａｐβの発現レベルは選
択後にＰＣ１２細胞溶解物をイムノブロッティングすることにより決定した。
【０２８２】 抗体，免疫沈澱およびイムノブロッティング Ｐａｐに対する抗体は，アミノ酸６１２−６２３（Ｐａｐβ）に対応するＫＬ
Ｈ結合合成ペプチドまたはＧＳＴ−ＰＡＰ融合蛋白質（上を参照）で免役したウ
サギで生成させた。ＦＡＫに対する抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｐｙｋ２に対する抗体は先に記載されている（
Ｄｉｋｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８３：５４７−５５０
）。抗Ｐｙｋ２抗体はＰｙｋ２およびＰＫＭを認識するが，ＦＡＫまたはＰａｐ
を認識しなかった。ポリクローナル抗ホスホチロシン抗体は先に記載されている
（Ｂａｔｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４
：５１９２−２０１）。抗マンノシダーゼＩＩおよび抗β−ＣＯＰポリクローナ
ル抗体は，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから提供された。ウサ
ギポリクローナル抗Ｓｏｓ，抗Ｓｒｃ抗体，抗ＨＡタグ，抗ｍｙｃタグ，および
抗ＧＳＴモノクローナル抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｉｎｃ．から入手した。
【０２８３】 免疫沈澱およびイムノブロッティング分析のためには，細胞を氷冷リン酸緩衝
液化食塩水で洗浄し，５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，
１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム，４０ｍＭ β−グリセロホスフェート，１
０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍＬロイペプチ
ン，１０μｇ／ｍＬアプロチニン（溶解緩衝液）中で溶解させた。細胞抽出物は
，遠心分離によりあらかじめ清浄にし，ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷したか（総溶解
物），またはプロテインＡ−セファロースビーズに架橋した抗体とともに転頭機
中で４℃で３時間または一夜インキュベートした。免疫複合体は，溶解緩衝液中
で洗浄し，記載されるように分析した（Ｇａｌｉｓｔｅｏ，ｅｔ ａｌ．，１９
９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０９９７−１０００）。
【０２８４】 ファーウエスタンブロットのためには，トランスフェクトした２９３細胞から
の総細胞溶解物および免疫沈澱物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，慣用の技術を用
いてニトロセルロースに移した。フィルターは，５％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液
で４℃で一夜ブロッキングし，ＧＳＴ−ＰＡＰ融合蛋白質（３μｇ／ｍＬ）およ
び抗ＧＳＴモノクローナル抗体（１：１０００）の混合物とともに４℃で一夜イ
ンキュベートした。次にフィルターを通常のイムノブロットと同様に処理した。
【０２８５】 マウス脳ホモジネート（２０％ｗ／ｖ）は，殺したマウスから迅速に脳を切除
し，組織を氷冷リン酸緩衝化食塩水に一時的に浸漬し，次にテフロン（登録商標
）−ガラスホモジナイザーを用いて氷冷溶解緩衝液で組織をホモジナイズ（１０
ストローク）することにより調製した。次に抽出物を卓上遠心分離で４℃で１０
分間，最大速度で遠心分離し，次に４℃で１時間再遠心分離した（１００，００
０ｘｇ）。上清を免疫沈澱およびイムノブロッティングに用いた。
【０２８６】 Ａｒｆ ＧＡＰアッセイ Ａｒｆ ＧＡＰ活性は，組換えＡｒｆにおける１ラウンドのＧＴＰ加水分解を
測定するインビトロアッセイを用いて決定した（Ｒａｎｄａｚｚｏ，ｅｔ ａｌ
．，１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０７５８−６３）。ウシ肝
臓からの粗ホスホイノシチド，ホスファチジルイノシトール（ＰＩ），ウシ脳か
らのホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート（ＰＩＰ2），ホスフ
ァチジルコリン（ＰＣ），ホスファチジルセリン（ＰＳ），およびレクチンから
調製したホスファチジン酸（ＰＡ）はＳｉｇｍａから入手した。リン脂質は０．
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化し，混合ミセルとしてアッセイに加え
た。
【０２８７】 ミリストイル化Ａｒｆ１，非ミリストイル化Ａｒｆ１，Ａｒｌ２およびミリス
トイル化Ａｒｆ５は，記載されるように調製した（Ｒａｎｄａｚｚｏ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１９：３６２−３６９；
Ｒａｎｄａｚｚｏ，１９９７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３２４：４１３−９）。Ｐ
ａｐのＡｒｆアイソフォーム特異性を比較するために，すべてのＡｒｔはミリス
トイル化形で使用した。Ａｒｆ６のｃＤＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＢＬ２（ＤＥ３）株で発現させ，記載されるように精製した（Ｂｒｏｗｎ，
ｅｔ ａｌ．Ｓｒｃ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）。細胞溶解物におけるＡ
ｒｆ ＧＡＰ活性を判定するために，２９３細胞抽出物を上述のように調製した
。
【０２８８】 免疫蛍光分析および亜細胞分画 ＨｅＬａまたはＣＯＳ−７細胞をコーティングしていないカバースリップ上で
成長させ，カルシウム沈澱法を用いてトランスフェクトし，ＰＢＳ中で２回洗浄
し（３７℃），２％ホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し，Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００（０．２％）を含むＰＢＳ中で２０分間透過性化し，ＰＢＳで洗浄し
た。カバースリップをＢＳＡ（５％）を含むＴＢＳ緩衝液中で希釈した一次抗体
または前免疫血清とともに１時間インキュベートし，ＰＢＳ中で洗浄し，二次抗
体とともに１時間インキュベートし，ＰＢＳ中で洗浄し，ｆｌｕｏｒｏｓｔａｂ
（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｉｎｃ．）でマウントし，共焦点
顕微鏡（Ｓａｒａｓｔｒｏ−２０００）で調べた。二重標識免疫蛍光実験のため
には，一次抗体（ウサギ）および二次抗体（抗ウサギ）とのインキュベーション
の後に第２の組の一次抗体（ネズミ）および二次抗体（抗マウス）とともにイン
キュベーションした。対照実験においては，第２の組からの一次抗体は用いなか
った。亜細胞分画のためには，Ｐａｐαを過剰発現する２９３細胞を，界面活性
剤を含まない溶解緩衝液中で凍結および融解を３回繰り返すことにより溶解させ
た。総溶解物（Ｔ）を１６，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離することによ
り，可溶性（Ｓ）および粒子（Ｐ）画分に分離した。
【０２８９】 ポストゴルジ小胞のインビトロ生成 ゴルジ画分は，ＶＳＶ感染ＭＤＣＫ細胞，およびラット肝臓サイトゾルから分
画されたサイトゾル蛋白質から単離した（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６
．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６９５２−６１）。ゴルジ画分は，溶解
する前に細胞を２０℃で２時間インキュベーションした間にトランスゴルジネッ
トワーク（ＴＧＮ）中に蓄積された35Ｓ−標識化シアル化ＶＳＶ−Ｇ蛋白質を含
有していた。小胞生成は，３７℃で６０分間のインキュベーションの間に進行し
，ＡＴＰ（１ｍＭ）またはほとんど加水分解されないＧＴＰ類似体であるグアニ
リルイミドジホスフェート（ＧＭＰ−ＰＮＰ）（１００（μＭ））のいずれかに
より支持された。反応は，氷上で冷却することにより停止させた。ゴルジ膜を１
０，０００ｘｇで１０分間の沈降により除去した。標識されたウイルス糖蛋白質
の放出は，上清中に現れたゴルジ画分中に最初に存在した総標識蛋白質のパーセ
ンテージとして測定した。場合によっては，冷却した反応液を，放出された小胞
を分離しうるショ糖密度勾配遠心分離により分析した（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ
．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６９５２−６１）。
【０２９０】 分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ ６ウエルプレート中で成長させたヒト２９３細胞を，カルシウム沈澱法を用い
て，ｐＣＤＮＡ．３ＳＥＡＰおよびｐＲＫ５に基づく構築物（１：１００）でコ
トランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後，培地を交換した。
４時間後，培養上清を除去し，細胞を１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１ｍＭ
ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍＬロイペプチン，１０μｇ／ｍＬアプロチニンを補充
した氷冷成長培地中で溶解させた。培養上清および細胞溶解物中のＳＥＡＰ活性
を，ＳＥＡＰレポータージーンアッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）を用いて測定した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在は，細胞溶解物
中のＳＥＡＰ活性に影響を与えなかった（示さず）。分泌は，培養上清および細
胞溶解物中のＳＥＡＰ活性の合計に対する培養上清中のＳＥＡＰ活性の比率で表
した。すべての実験は三重に三回行った。ｐＲＫ５に基づく構築物の発現は，イ
ムノブロットにより確認した。
【０２９１】 実施例１：ＳＯＳリクルートメントシステムを用いるＰＹＫ２付随蛋白質の単離 Ｓｏｓリクルートメントシステム（ＳＲＳ）（細胞質ツーハイブリッドスクリ
ーニングとしても知られる）は，酵母における蛋白質−蛋白質相互作用の検出を
可能とする遺伝子的方法である（Ａｒｏｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：３０９４−３１０２）。Ｐｙｋ２結合蛋白
質を同定するために，ＳＲＳを用いて，Ｐｙｋ２をおとりとしてラット下垂体ｃ
ＤＮＡライブラリをスクリーニングした。４ｘ１０5個のトランスフォーマント
をスクリーニングした後，Ｐｙｋ２と特異的に相互作用するが，異種のおとり（
ＦＡＫ）とは相互作用しない１つのクローンを単離した。このクローン（６３９
塩基）を用いて，マウス脳ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより
，２つの新たなクローンを単離した。
【０２９２】 ＰａｐαおよびＰａｐβ ｃＤＮＡは，２９３細胞中で過渡的に発現させた。
ポリクローナルウサギ抗Ｐａｐ抗体を用いる免疫沈澱，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
オートラジオグラフィーにより，適当な分子量を有する蛋白質が検出された。
【０２９３】 Ｐａｐの組織発現パターンを，特異的Ｐａｐプローブを用いて種々のヒト組織
のノザンブロット分析により決定した（図３）。約５．７ｋｂのＰａｐ転写産物
は，主として脳，腎臓および心臓，ならびに胎盤，肺および膵臓で検出された。
【０２９４】 実施例２：ＰＹＫ２とＰＡＰとのインビトロおよびインビボでの会合 ＰａｐとＰｙｋ２との間の会合をファーウエスタンブロット分析により確認し
た。Ｐａｐのプロリンリッチ領域およびＳＨ３ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質
をＰｙｋ２への直接結合のプローブとして用いた。Ｐａｐのこの領域は，Ｐｙｋ
２およびキナーゼ−ネガティブＰｙｋ２変異体−ＰＫＭに特異的に結合する（図
４ａ）。
【０２９５】 次に，Ｐｙｋ２−ＨＡとＰａｐβ，およびＰＫＭ−ＨＡとＰａｐβの発現ベク
ターで別々に２９３細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞
を溶解し，抗Ｐａｐおよび抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈澱およびイムノブロッティ
ングを行った。Ｐａｐβは，Ｐｙｋ２とおよびＰＫＭと複合体を形成し，このこ
とは，これらの２つの蛋白質の会合はＰｙｋ２のキナーゼ活性に非依存的である
ことを示す（図４ｂ）。
【０２９６】 Ｐｙｋ２とＰａｐとの間の会合は，マウス脳から調製した溶解物およびＰａｐ
βウイルスに感染したＰＣ１２細胞から調製した溶解物においても検出された（
図４ｃ）。脳溶解物においては，抗Ｐｙｋ２抗体は，ＳＤＳ中で見かけ分子量１
１２ｋＤａに移動した蛋白質を免疫沈澱させ，これは抗Ｐａｐ抗体により特異的
に認識された（図４ｃ，右上パネル）。同様に，Ｐａｐβウイルスに感染したＰ
Ｃ１２細胞において，抗Ｐｙｋ２抗体は外来的に発現させたネズミ９０ｋＤａ型
のＰａｐβおよびラットＰａｐα由来の内因性１１２ｋＤａ型の両方を免疫沈澱
させた（図４ｃ，左上パネル）。
【０２９７】 ＰａｐαおよびＰａｐβのプロリンリッチ領域は，ＳｒｃのＳＨ３ドメインの
コンセンサス結合部位に密接に類似するＰＰＬＰＰＲＮＶＧＫ配列を含む（Ｒｉ
ｃｋｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９２：１０９０９−１３）。ヒト２９３細胞をＳｒｃおよびＰａｐα
の発現ベクターでトランスフェクトし，トランスフェクトした細胞からの溶解物
を抗Ｐａｐ抗体で免疫沈澱させ，次に抗Ｓｒｃ抗体でイムノブロッティングを行
った。これらの細胞からの溶解物において，ＰａｐαとＳｒｃとの間に安定な複
合体の形成が認められた（図４ｄ）。
【０２９８】 実施例３：ＰＹＫ２またはＳＲＣキナーゼによるＰＡＰのチロシンリン酸化 ホルボルエステル（ＰＭＡ）および過バナデート（ＮａＶＯ3）は両方とも，
ＰＣ１２および他の細胞タイプにおいてＰｙｋ２のチロシンリン酸化を刺激する
（Ｄｉｋｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８３：５４７−５５
０；Ｌｅｖ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７３７−４５）
。過バナデートまたはＰＭＡで刺激したまたは刺激していないＰＣ１２細胞を溶
解させ，抗Ｐａｐ抗体で免疫沈澱させ，次にホスホチロシンに対する抗体でイム
ノブロッティングを行った。ＰＭＡ処理およびバナジン酸処理の両方がＰａｐα
のチロシンリン酸化を誘導する（図５ａ）。
【０２９９】 ＰＹＫ２によるＰａｐリン酸化を調べるため，２９３細胞をＰｙｋ２−ＨＡと
Ｐａｐβ，またはＰＫＭ−ＨＡとＰａｐβの発現ベクターでコトランスフェクト
した。細胞溶解物は，抗Ｐａｐ抗体で免疫沈澱させ，Ｐａｐβのチロシン残基で
のリン酸化を，抗ホスホチロシン抗体を用いるイムノブロッティングにより測定
した（図５ｂ）。ＰａｐβおよびＰｙｋ２を共発現する細胞から調製された溶解
物のＰａｐβ免疫沈澱物の分析は，２つの蛋白質が複合体を形成し，チロシンリ
ン酸化されていることを示した。これに対し，Ｐａｐβ単独を発現する細胞また
はＰａｐβおよびＰｙｋ２−ＰＫＭのキナーゼネガティブ変異体を共発現する細
胞においてＰａｐβはチロシンリン酸化されなかった。（図５ｂ）。
【０３００】 Ｐｙｋ２とＰａｐの相互作用の特異性を調べるために，２９３細胞をＰａｐβ
とＰｙｋ２，またはＰａｐβとＦＡＫでコトランスフェクトした。ＰａｐβはＰ
ｙｋ２発現細胞においてチロシンリン酸化されるが，ＦＡＫ発現細胞においては
リン酸化されない（図６）。ＰＡＫの非常に多い過剰発現の後，痕跡量のＦＡＫ
がＰＡＰβ免疫沈澱物中で見いだされた。しかし，ＰＡＰβのチロシンリン酸化
は検出されなかった。これらを合わせると，これらの実験は，ＰａｐβはＰｙｋ
２によりチロシンリン酸化されるが，密接に関連するキナーゼＦＡＫによっては
リン酸化されないことを示す。
【０３０１】 ＰａｐがＳｒｃによってもリン酸化されるか否かを判定するために，Ｐａｐα
およびＳｒｃでコトランスフェクトした２９３細胞からの溶解物をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分離し，抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットを行った。同じフィルタ
ーを抗Ｓｒｃおよび抗ＰＡＰ抗体で再探索した。ＳｒｃおよびＰａｐαは，２９
３細胞中で共発現したとき，チロシンリン酸化される（図５ｃ）。Ｐａｐαおよ
びＳｒｃのキナーゼネガティブ変異体の発現ベクターでコトランスフェクトした
２９３細胞からの溶解物においては，Ｐａｐαのチロシンリン酸化は検出されな
かった（図５ｃ，右パネル）。
【０３０２】 実施例４：ＰＡＰ蛋白質はインビトロでＡＲＦ ＧＡＰ活性を示す Ｐａｐアミノ酸配列（図２）中のＡｒｆ ＧＡＰドメインの存在は，Ｐａｐが
ＡｒｆによるＧＴＰ加水分解を活性化するかもしれないことを示す。ＰＨドメイ
ン，Ａｒｆ ＧＡＰドメイン，およびアンキリンホモロジー領域（アミノ酸１１
１−５２２）を含むＰａｐの一部を細菌で発現させ，基質としてＡｒｆ１，Ａｒ
ｆ５，Ａｒｆ６およびＡｒｌ２を用いて，インビトロでＡｒｆ ＧＡＰ活性につ
いて試験した（Ｒａｎｄａｚｚｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６９：１０７５８−６３）。主としてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2を
含む粗ホスホイノシチドの存在下で，組換えＰａｐは，Ａｒｆ１およびＡｒｆ５
に対してＧＡＰ活性を，Ａｒｆ６に対してより弱い活性を示し，Ａｒｌ２に対し
て活性を示さなかった（図７ａ）。ＧＡＰ活性は，ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2
の存在下でのみ検出され，ホスファチジン酸（ＰＡ），ホスファチジルイノシト
ール（ＰＩ），ホスファチジルセリン（ＰＳ），またはホスファチジルコリン（
ＰＣ）の存在下では検出されなかった（図７ｂ）。ｍｙｃ−タグ付きＰａｐαで
トランスフェクトした２９３細胞から調製した溶解物はＡｒｆ１に対して，ベク
ター単独でトランスフェクトした細胞から調製した溶解物の約１００倍高いＡｒ
ｆ ＧＡＰ活性を有していた（示さず）。
【０３０３】 実施例５：ＰＡＰの細胞内局在 Ｐａｐの細胞内局在は，免疫蛍光顕微鏡を用いて測定した。透過性にし，蛍光
標識したｍｙｃ−タグ付きＰａｐαを過剰発現するＨｅＬａ細胞を調べると，Ｐ
ａｐαが細胞質および細胞の端の膜突起物に局在していることが示された（図９
）。透過性にした，ＰａｐαおよびＰｙｋ２−ＨＡを過剰発現するＨｅＬａまた
はＣＯＳ−７細胞を抗Ｐａｐおよび抗ＨＡ抗体による二重標識免疫蛍光顕微鏡を
用いてそれぞれ調べると，両方の細胞株においてＰｙｋ２およびＰａｐαが原形
質膜中および膜突起物中に局在していることが示された（図１０）。これらの結
果は，ある量の過剰発現ＰＡＰα蛋白質が常に粒子画分に伴うことを示す亜細胞
分画実験（図８）と一致する。
【０３０４】 Ｐａｐの細胞質局在は，既知のマーカー蛋白質を認識する抗体を用いる二重標
識免疫蛍光顕微鏡分析を行うことによりさらに分析した。これらの実験において
は，Ｐａｐα−ｍｙｃを過剰発現しているＣＯＳ−７細胞を透過性にし，抗ｍｙ
ｃ抗体および特定の細胞内コンパートメントを認識する抗体で標識した。これら
の実験は，Ｐａｐα分子の集団がβ−ＣｏｐおよびマンノシダーゼＩＩ（ゴルジ
コンパートメントの２つの特異的マーカー）と共局在することを示した（図１１
）。Ｐａｐαの過剰発現は，ゴルジコンパートメントの完全性に影響を与えなか
った。これに対し，Ａｒｆ１−ＧＡＰの過剰発現は，ゴルジ複合体と小胞体（Ｅ
Ｒ）との融合を引き起こす（Ａｏｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＥＭＢＯ Ｊ．
１６：７３０５−１６）。
【０３０５】 実施例６：ＰＡＰレベルの促進はＰＯＳＴ−ゴルジ小胞の生成を阻害し，構成的
分泌を減少させる トランスゴルジ網（ＴＧＮ）からの小胞出芽におけるＡｒｆ１−ＧＴＰの役割
はよく確立されている（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５２７−３２；Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６９５２−６１）。本明
細書に記載される免疫蛍光局在実験は，ＰＡＰ作用の１つの可能性のある部位が
，ゴルジコンパートメント中であることを示唆する。Ｐａｐのゴルジコンパート
メントへのリクルートメントは，ＴＧＮに伴うＡｒｆ１−ＧＴＰのプールを減少
させることにより，小胞出芽を阻害するかもしれない。
【０３０６】 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に感染したＭＤＣＫ細胞から調製された，単
離されたゴルジ画分からのポストゴルジ小胞の生成のためのインビトロ系（Ｓｉ
ｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６９５
２−６１）を用いて，この仮説を試験した。この系においては，小胞生成はサイ
トゾルで温度依存的に生じ，ヌクレオチド三リン酸の供給源を必要とする。ＡＴ
Ｐの存在下で，放出された小胞は直径５０−８０ｎｍであり，被覆構造を欠失し
ている（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：１６９５２−６１）。ＡＴＰをほとんど加水分解されないＧＴＰ類似体であ
るグアニリル−イミドジホスフェート（ＧＭＰ−ＰＮＰ）で置き換えると，被覆
を除くためにはＡｒｆに結合したＧＴＰの加水分解が必要であるため，放出され
るポストゴルジ小胞は非クラスリンＣＯＰ−１被覆で被覆されたままである（Ｓ
ｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６９
５２−６１）。
【０３０７】 ＡＴＰの存在下で，組換えＰａｐは濃度依存的様式で小胞の生成を阻害する（
図１２ａおよび１２ｂ）。反応混合物からヌクレオチドを除去すると，小胞は生
成されなかった（図１２Ｃ）。ＧＭＰ−ＰＮＰをＡＴＰの代わりに用いると，Ｐ
ａｐは被覆された小胞の生成に影響を与えなかった（図１２Ｄ）。ＰＡＰは加水
分解可能なヌクレオチドの存在下においてのみ小胞放出を阻害することができる
ことは，これがＡｒｆのＴＧＮ膜との安定な会合を妨ぐＡｒｆ ＧＡＰとして作
用することを示す。
【０３０８】 インビボでの分泌に及ぼすＰａｐ過剰発現の影響を，ＳＥＡＰアッセイを用い
て試験した。トランスフェクトされた細胞中で発現されたとき，胎盤アルカリホ
スファターゼ（ＳＥＡＰ）の切断型は，構成的分泌を評価するマーカーとして作
用する（Ｇｏｒｒ，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３５７５−３
５８０）。この蛋白質はゴルジ装置中でＮ−グリコシル化され，ここから原形質
膜に輸送されて，培養液中に放出される。
【０３０９】 過渡的にトランスフェクトされた２９３細胞において合成された総ＳＥＡＰの
約８０％が，４時間後に培地中に放出された（図１３）。予測されたように，ブ
レフェルジンＡ処理は分泌を完全に遮断し，このことは，このプロセスがＡｒｆ
−ＧＴＰを必要とすることを示す。しかし，ＰａｐをＳＥＡＰとともに２９３細
胞コトランスフェクトすると，ＳＥＡＰ分泌の小さいが再現性のある減少が検出
された（図１３）。Ｐｙｋ２とのコトランスフェクションは，ＳＥＡＰ分泌にも
ＳＥＡＰ分泌のＰａｐ媒介性阻害にも影響を及ぼさなかった。
【０３１０】 当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請
求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途
をなすであろう。
【０３１１】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
【０３１２】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。
【０３１３】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
【０３１４】 さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０３１５】 最後に，本明細書においては，発明を広くかつ一般的に記載している。一般的
開示に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部
を形成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわ
らず，属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発
明の一般的記載が含まれる。
【０３１６】 他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，Ｐａｐアイソフォームのアミノ酸配列および一次構造を
示す。
【図２】 図２は，Ａｒｆ１ ＧＡＰ，ＧＣＳ１，およびネズミＰａｐ領域
の多重配列アライメントを示す。
【図３】 図３は，種々のヒト組織におけるＰａｐ ｍＲＮＡの発現のノザ
ンブロット分析を示す。
【図４】 図４は，培養細胞および脳組織におけるＰｙｋ２とＰａｐの間の
インビトロでの相互作用を示す。
【図５】 図５は，Ｐｙｋ２およびＳｒｃキナーゼによるＰａｐのチロシン
リン酸化を示す。
【図６】 図６は，抗ＰＹＫまたは抗ＦＡＫ抗体でのイムノブロッティング
の結果を示す。
【図７】 図７は，組換えＰａｐがインビトロでＡｒｆ ＧＡＰ活性を有す
ることを示す。
【図８】 図８は，ＰａｐΔ，繊維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ１
，貫膜蛋白質），またはＧｒｂ２（サイトゾル蛋白質）を過剰発現している亜細
胞分画した２９３細胞のイムノブロットを示す。
【図９】 図９は，ＰａｐΔ−ｍｙｃの発現ベクターで過渡的にトランスフ
ェクトしたＨｅｌａ細胞の免疫蛍光染色を示す。
【図１０】 図１０は，ＰａｐΔ−ｍｙｃおよびＰｙｋ２−ＨＡ発現ベクタ
ーで過渡的にトランスフェクトしたＨｅＬａおよびＣＯＳ−７細胞の免疫蛍光染
色を示す。
【図１１】 図１１は，ＰａｐΔ−ｍｙｃの発現ベクターで過渡的にトラン
スフェクトしたＣＯＳ−７細胞を示す。
【図１２】 図１２は，Ｐａｐによるポストゴルジ小胞の生成の阻害を示す
。
【図１３】 図１３は，Ｐａｐの過剰発現による２９３細胞におけるＳＥＡ
Ｐ分泌の阻害のグラフを示す。
【図１４】 図１４は，Ｐａｐ（配列番号３）の核酸配列を示す。
【図１５】 図１５は，Ｐａｐ（配列番号４）の核酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 13/12 ４Ｃ０８４ 13/12 17/02 ４Ｃ０８６ 17/02 17/06 ４Ｈ０４５ 17/06 19/04 19/04 25/00 25/00 29/00 29/00 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ｂ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュレジンガー，ジョーゼフ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10011， ニューヨーク，ワシントン・スクエアー・ ウエスト 37 (72)発明者 アンドリーヴ，ジュリアン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10016， ニューヨーク，ファースト・アベニュー 564，アパートメント 14ディー Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB01 BB07 CB01 DA13 DA36 FA16 FB02 FB03 FB12 4B024 AA01 AA11 BA31 BA41 BA80 CA04 CA09 DA03 DA06 EA04 GA03 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QR32 QR55 QR77 QR80 QS24 QS28 QS34 4B065 AA26X AA91X AA91Y AA92X AA93X AB01 AB05 AC14 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C057 BB02 DD02 MM01 MM09 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 NA14 ZA01 ZA36 ZA81 ZA89 ZB07 ZB11 ZB26 ZC20 ZC35 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA36 ZA81 ZA89 ZB07 ZB11 ZB26 ZC20 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA30 BA18 BA19 BA20 BA21 CA40 DA76 DA86 EA22 EA23 EA28 EA50 FA74 【要約の続き】

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｐｙｋ２結合蛋白質をコードする，単離された，濃縮された
    または精製された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記Ｐｙｋ２結合蛋白質がＰａｐαおよびＰａｐβからなる
    群より選択される，請求項１記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記核酸分子が，以下のヌクレオチド配列： （ａ）配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプ
    チドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズ
    し，かつ天然に生ずるＰｙｋ２結合蛋白質をコードする； （ｄ）配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプ
    チドをコードするが，ただし，Ｎ末端，コイルドコイル，ＰＨ，Ａｒｆ ＧＡＰ
    ，アンキリン，プロリンリッチ，ＳＨ３，およびＣ末端ドメインからなる群より
    選択される全部ではないが１またはそれ以上のドメインを欠失している；または
    （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である である，請求項１記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまた
    はプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記核酸分子が，哺乳動物から単離された，濃縮された，ま
    たは精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記哺乳動物がヒトである，請求項５記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 試料中においてＰｙｋ２結合蛋白質をコードする核酸を検出
    するための核酸プローブ。
  8. 【請求項８】 前記蛋白質が，ＰａｐαおよびＰａｐβからなる群より選択
    される，請求項７記載のプローブ。
  9. 【請求項９】 前記蛋白質が，配列番号１または配列番号２に記載されるア
    ミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである，請求項７記載のプ
    ローブ。
  10. 【請求項１０】 Ｐｙｋ２結合蛋白質をコードする核酸分子を含む組換え細
    胞。
  11. 【請求項１１】 前記蛋白質が，ＰａｐαおよびＰａｐβからなる群より選
    択される，請求項１０記載の細胞。
  12. 【請求項１２】 前記蛋白質が，配列番号１または配列番号２に記載される
    アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである，請求項１０記載
    の細胞。
  13. 【請求項１３】 単離された，濃縮された，または精製されたＰｙｋ２結合
    蛋白質。
  14. 【請求項１４】 前記蛋白質が，ＰａｐαおよびＰａｐβからなる群より選
    択される，請求項１３記載の蛋白質。
  15. 【請求項１５】 前記蛋白質が，配列番号１または配列番号２に記載される
    アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである，請求項１３記載
    の蛋白質。
  16. 【請求項１６】 前記蛋白質が， （ａ）配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列；または （ｂ）配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列であって，ただし
    ，Ｎ末端，触媒，Ｃ末端，コイルドコイル，ＰＨ，Ａｒｆ ＧＡＰ，アンキリン
    反復，プロリンリッチ，およびＳＨ３ドメインからなる群より選択されるドメイ
    ンの全部ではないが１またはそれ以上を欠失している； を有するアミノ酸配列を含む，請求項１３記載の蛋白質。
  17. 【請求項１７】 前記蛋白質が，哺乳動物から単離され，精製され，または
    濃縮されたものである，請求項１３記載のＰｙｋ２結合蛋白質。
  18. 【請求項１８】 前記哺乳動物がヒトである，請求項１７記載のＰｙｋ２結
    合蛋白質。
  19. 【請求項１９】 Ｐｙｋ２結合蛋白質または前記蛋白質のドメインに対して
    特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメント。
  20. 【請求項２０】 前記蛋白質が，ＰａｐαおよびＰａｐβからなる群より選
    択される，請求項１９記載の抗体または抗体フラグメント。
  21. 【請求項２１】 Ｐｙｋ２結合蛋白質に対して特異的結合親和性を有する抗
    体を産生するハイブリドーマ。
  22. 【請求項２２】 前記蛋白質がＰａｐαおよびＰａｐβからなる群より選択
    される，請求項２１記載のハイブリドーマ。
  23. 【請求項２３】 Ｐｙｋ２結合蛋白質活性を調節する物質を同定する方法で
    あって： （ａ）Ｐｙｋ２結合蛋白質を試験物質と接触させ； （ｂ）前記蛋白質の活性を測定し；そして （ｃ）前記物質が前記蛋白質の活性を調節するか否かを決定する の各工程を含む方法。
  24. 【請求項２４】 天然の結合パートナーを工程（ａ）に加えることをさらに
    含む，請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記天然の結合パートナーが，Ｐｙｋ２およびＳｒｃから
    なる群より選択される，請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 細胞においてＰｙｋ２結合蛋白質活性を調節する物質を同
    定する方法であって： （ａ）Ｐｙｋ２結合蛋白質を細胞中で発現させ； （ｂ）試験物質を前記細胞に提供し；そして （ｃ）細胞表現型または前記蛋白質と天然の結合パートナーとの間の相互作用の
    変化をモニターして，細胞においてＰｙｋ２結合パートナー活性を調節する前記
    物質を同定する の各工程を含む方法。
  27. 【請求項２７】 前記天然の結合パートナーが，Ｐｙｋ２およびＳｒｃから
    なる群より選択される，請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 治療を必要とする患者にＰｙｋ２結合蛋白質の活性を調節
    する物質を投与することにより疾病または疾患を治療する方法。
  29. 【請求項２９】 前記疾病または疾患が，癌，心臓血管，神経変性，および
    免疫疾患からなる群より選択される，請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記物質がインビトロでＰｙｋ２結合蛋白質活性を調節す
    る，請求項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記物質がＰｙｋ２結合蛋白質活性を阻害する，請求項２
    ８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記物質が，Ｐｙｋ２結合蛋白質の発現を阻害するアンチ
    センスオリゴヌクレオチドである，請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 疾病または疾患の診断道具として試料中でＰｙｋ２結合蛋
    白質をコードする核酸を検出する方法であって： （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で前記蛋白質の核酸
    標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，前記
    蛋白質をコードする核酸配列，そのフラグメント，および前記配列およびフラグ
    メントの相補体を含み；そして （ｂ）前記疾病の指標としてプローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を
    検出する の各工程を含む方法。
  34. 【請求項３４】 前記疾病が，癌，心臓血管，神経変性，および免疫疾患か
    らなる群より選択される，請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 Ｐｙｋ２結合蛋白質の発現を阻害するアンチセンスオリゴ
    ヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】 前記オリゴヌクレオチドが，配列番号１または配列番号２
    に記載されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントをコードす
    る配列の相補体である，請求項３５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
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