JP2003507016A - 新規な蛋白質ホスファターゼおよびホスファターゼ関連疾患の診断および治療 - Google Patents
新規な蛋白質ホスファターゼおよびホスファターゼ関連疾患の診断および治療Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は，ポリペプチド，そのようなポリペプチドをコードする核酸，そのような核酸を含む細胞，組織および動物，ポリペプチドに対する抗体，ポリペプチドを用いるアッセイ，および上述のすべてに関連する方法に関する。好ましくは，本発明のポリペプチドはホスファターゼである。本明細書においては，"モチーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより，ホスファターゼファミリーの追加の哺乳動物メンバーが示される。これらのホスファターゼには，ＭＫＰ−様蛋白質，ＣＤＣ１４様蛋白質，ＰＴＥＮ様蛋白質，およびミオチューブラリン（ＭＴＭ）様蛋白質が含まれる。確立されたファミリーの新規なメンバーとしての蛋白質の分類は，各蛋白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの推定におけるのみならず，その制御，基質，およびシグナリング経路においても，非常に正確であることが証明された。
Description
【０００１】
本出願は，米国特許出願６０／１４９，００５（１９９９年８月１３日出願）
に基づく優先権を主張しており，図面を含めこの出願の全内容を本明細書の一部
としてここに引用する。
に基づく優先権を主張しており，図面を含めこの出願の全内容を本明細書の一部
としてここに引用する。
【０００２】発明の分野
本発明は，ポリペプチドに関する。特に，本発明は，ホスファターゼポリペプ
チド，ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，種々のホスファターゼ関連
疾病および状態，例えば細胞増殖疾患の診断および治療に有用な化合物を同定す
るために用いることができる種々の産物およびアッセイ方法に関する。
チド，ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，種々のホスファターゼ関連
疾病および状態，例えば細胞増殖疾患の診断および治療に有用な化合物を同定す
るために用いることができる種々の産物およびアッセイ方法に関する。
【０００３】発明の背景
以下の記載は本発明の理解を助けるために提供され，本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。
であると認めるものではない。
【０００４】
細胞シグナル伝達は，各種の細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリ
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニ
ズムの一つは蛋白質キナーゼによる蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成
熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる
。真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼはセリン，スレオニン
およびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナー
ゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン酸
化に特異的なものの２グループに大別される。所定の基質のリン酸化状態はまた
，蛋白質ホスファターゼ，すなわち，蛋白質キナーゼにより所定の基質に加えら
れたリン酸基の除去を担う一群の蛋白質によっても制御される。蛋白質ホスファ
ターゼもまた，セリン／トレオニン，またはチロシンのいずれかに特異的である
として分類することができる。したがって，蛋白質ホスファターゼは，ヒドロキ
シル含有アミノ酸であるセリン，トレオニンまたはチロシンのリン酸化により修
飾された蛋白質の脱リン酸化を触媒する酵素の大きなファミリーである。このフ
ァミリーのいくつかのメンバーは，チロシンのみを脱リン酸化することができ（
蛋白質チロシンホスファターゼ），他のものはチロシンならびにセリンおよびト
レオニンを脱リン酸化することができる（二重特異性ホスファターゼ）。これら
の蛋白質は，共通の触媒コア構造を含む２５０−３００アミノ酸ドメインを共有
する。関連するホスファターゼは，チロシンホスファターゼ，二重特異性ホスフ
ァターゼ，およびミオチューブラリン様（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｌｉｋｅ
）ホスファターゼ（Ｆａｕｍａｎ ＥＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９６ Ｎｏｖ；２１（１１）：４１３−７；Ｍａｒｔｅ
ｌｌ ＫＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ．１９９８ Ｆｅｂ ２８；８
（１）：２−１１）の別個のサブファミリーに分類される。
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニ
ズムの一つは蛋白質キナーゼによる蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成
熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる
。真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼはセリン，スレオニン
およびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナー
ゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン酸
化に特異的なものの２グループに大別される。所定の基質のリン酸化状態はまた
，蛋白質ホスファターゼ，すなわち，蛋白質キナーゼにより所定の基質に加えら
れたリン酸基の除去を担う一群の蛋白質によっても制御される。蛋白質ホスファ
ターゼもまた，セリン／トレオニン，またはチロシンのいずれかに特異的である
として分類することができる。したがって，蛋白質ホスファターゼは，ヒドロキ
シル含有アミノ酸であるセリン，トレオニンまたはチロシンのリン酸化により修
飾された蛋白質の脱リン酸化を触媒する酵素の大きなファミリーである。このフ
ァミリーのいくつかのメンバーは，チロシンのみを脱リン酸化することができ（
蛋白質チロシンホスファターゼ），他のものはチロシンならびにセリンおよびト
レオニンを脱リン酸化することができる（二重特異性ホスファターゼ）。これら
の蛋白質は，共通の触媒コア構造を含む２５０−３００アミノ酸ドメインを共有
する。関連するホスファターゼは，チロシンホスファターゼ，二重特異性ホスフ
ァターゼ，およびミオチューブラリン様（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｌｉｋｅ
）ホスファターゼ（Ｆａｕｍａｎ ＥＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９６ Ｎｏｖ；２１（１１）：４１３−７；Ｍａｒｔｅ
ｌｌ ＫＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ．１９９８ Ｆｅｂ ２８；８
（１）：２−１１）の別個のサブファミリーに分類される。
【０００５】
"モチーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより
，我々は，ホスファターゼファミリーの追加の哺乳動物メンバーを同定した。本
明細書においては，２０個の新規ホスファターゼの部分配列または完全配列，こ
れらの分類，推定されたまたは演繹された蛋白質構造，およびこれらの生物学的
および治療上の関連性を解明する戦略が開示される。これらの本発明の蛋白質に
は，１５個のＭＫＰ様蛋白質，２個のＣＤＣ１４様蛋白質，および２個のミオチ
ューブラリン（ＭＴＭ）様蛋白質が含まれる。ＰＴＥＮ様蛋白質もまた記載され
る。新規な蛋白質の，確立されたファミリーの新規なメンバーとしての分類は，
各蛋白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの推定におけるのみならず，そ
の制御，基質，およびシグナリング経路においても，非常に正確であることが証
明された。
，我々は，ホスファターゼファミリーの追加の哺乳動物メンバーを同定した。本
明細書においては，２０個の新規ホスファターゼの部分配列または完全配列，こ
れらの分類，推定されたまたは演繹された蛋白質構造，およびこれらの生物学的
および治療上の関連性を解明する戦略が開示される。これらの本発明の蛋白質に
は，１５個のＭＫＰ様蛋白質，２個のＣＤＣ１４様蛋白質，および２個のミオチ
ューブラリン（ＭＴＭ）様蛋白質が含まれる。ＰＴＥＮ様蛋白質もまた記載され
る。新規な蛋白質の，確立されたファミリーの新規なメンバーとしての分類は，
各蛋白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの推定におけるのみならず，そ
の制御，基質，およびシグナリング経路においても，非常に正確であることが証
明された。
【０００６】
ホスファターゼは，種々の細胞プロセスの制御における関与が示唆されている
。これには，例えば，成長因子，サイトカインおよびホルモンに対する応答，酸
化的，紫外線，または照射に関連するストレス経路，炎症シグナル（すなわちＴ
ＮＦ），アポトーシス刺激（すなわちＦａｓ），ＴおよびＢ細胞共刺激，細胞骨
格構造の制御，および細胞トランスフォーメーションが含まれる（Ｔｈｅ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，Ｎｉｃｋ Ｔｏｎ
ｋｓ，Ｓｈｉｒｉｓｈ Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｈａｒｒｙ Ｃｈａｒｂｏｎｎ
ｅａｕ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ，２０００を参照）。
。これには，例えば，成長因子，サイトカインおよびホルモンに対する応答，酸
化的，紫外線，または照射に関連するストレス経路，炎症シグナル（すなわちＴ
ＮＦ），アポトーシス刺激（すなわちＦａｓ），ＴおよびＢ細胞共刺激，細胞骨
格構造の制御，および細胞トランスフォーメーションが含まれる（Ｔｈｅ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，Ｎｉｃｋ Ｔｏｎ
ｋｓ，Ｓｈｉｒｉｓｈ Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｈａｒｒｙ Ｃｈａｒｂｏｎｎ
ｅａｕ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ，２０００を参照）。
【０００７】
ホスファターゼはまた，上流のレギュレータと相互作用すると考えられている
種々の非触媒ドメインを有する。例としては，ＳＨ３含有蛋白質との相互作用の
ためのプロリンリッチドメイン，またはＲａｃ，Ｒｈｏ，およびＲａｂ等の小さ
いＧ蛋白質との相互作用のための特異的ドメインが含まれる。これらの相互作用
は，種々の細胞表面レセプターの活性化等の外部刺激，例えば，チロシンキナー
ゼ，サイトカインレセプター，ＴＮＦレセプター，Ｆａｓ，Ｔ細胞レセプター，
ＣＤ２８，またはＣＤ４０に応答した独特の生化学的経路の間をクロストークす
るためのメカニズムを提供するかもしれない。
種々の非触媒ドメインを有する。例としては，ＳＨ３含有蛋白質との相互作用の
ためのプロリンリッチドメイン，またはＲａｃ，Ｒｈｏ，およびＲａｂ等の小さ
いＧ蛋白質との相互作用のための特異的ドメインが含まれる。これらの相互作用
は，種々の細胞表面レセプターの活性化等の外部刺激，例えば，チロシンキナー
ゼ，サイトカインレセプター，ＴＮＦレセプター，Ｆａｓ，Ｔ細胞レセプター，
ＣＤ２８，またはＣＤ４０に応答した独特の生化学的経路の間をクロストークす
るためのメカニズムを提供するかもしれない。
【０００８】発明の概要
本発明は，ポリペプチド，そのようなポリペプチドをコードする核酸，そのよ
うな核酸を含む細胞，組織および動物，ポリペプチドに対する抗体，ポリペプチ
ドを用いるアッセイ，および上述のすべてに関連する方法に関する。好ましくは
，本発明のポリペプチドはホスファターゼである。本明細書においては，"モチ
ーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより，ホス
ファターゼファミリーの追加の哺乳動物メンバーが示される。これらのホスファ
ターゼには，ＭＫＰ−様蛋白質，ＣＤＣ１４様蛋白質，ＰＴＥＮ様蛋白質，およ
びミオチューブラリン（ＭＴＭ）様蛋白質が含まれる。確立されたファミリーの
新規なメンバーとしての蛋白質の分類は，各蛋白質の残りの非触媒部分に存在す
るモチーフの推定におけるのみならず，その制御，基質，およびシグナリング経
路においても，非常に正確であることが証明された。
うな核酸を含む細胞，組織および動物，ポリペプチドに対する抗体，ポリペプチ
ドを用いるアッセイ，および上述のすべてに関連する方法に関する。好ましくは
，本発明のポリペプチドはホスファターゼである。本明細書においては，"モチ
ーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより，ホス
ファターゼファミリーの追加の哺乳動物メンバーが示される。これらのホスファ
ターゼには，ＭＫＰ−様蛋白質，ＣＤＣ１４様蛋白質，ＰＴＥＮ様蛋白質，およ
びミオチューブラリン（ＭＴＭ）様蛋白質が含まれる。確立されたファミリーの
新規なメンバーとしての蛋白質の分類は，各蛋白質の残りの非触媒部分に存在す
るモチーフの推定におけるのみならず，その制御，基質，およびシグナリング経
路においても，非常に正確であることが証明された。
【０００９】
本発明の１つの観点は，ポリペプチド，好ましくはホスファターゼをコードす
る，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴とする。好まし
い態様においては，本発明は，ホスファターゼをコードする単離された，濃縮さ
れたまたは精製された核酸分子であって，以下のヌクレオチド配列を含む核酸分
子を含む： （ａ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列
番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番
号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号
３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に記載さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）高度にストリンジェントな条件下で（ｂ）の分子にハイブリダイズし，か
つ天然に生ずるポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載される全長アミノ酸配列であっ
て，ただし，いずれかの図のそれぞれのドメイン境界に記載される番号付けされ
たアミノ酸残基の連続する組の，全部ではないが少なくとも１またはそれ以上を
欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｆ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列； （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｈ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載される全長アミノ酸配列であっ
て，ただし，Ｎ−末端ドメイン，ホスファターゼドメインおよびＣ−末端ドメイ
ンからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失
しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｊ）配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番
号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号
２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３
１，配列番号３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番号３９に記載され
るヌクレオチド配列を有する；または （ｋ）（ｊ）に記載されるヌクレオチド配列の相補体である。好ましくは，核酸
は哺乳動物から，最も好ましくはヒトから単離された，精製されたまたは濃縮さ
れたものである。
る，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴とする。好まし
い態様においては，本発明は，ホスファターゼをコードする単離された，濃縮さ
れたまたは精製された核酸分子であって，以下のヌクレオチド配列を含む核酸分
子を含む： （ａ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列
番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番
号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号
３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に記載さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）高度にストリンジェントな条件下で（ｂ）の分子にハイブリダイズし，か
つ天然に生ずるポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載される全長アミノ酸配列であっ
て，ただし，いずれかの図のそれぞれのドメイン境界に記載される番号付けされ
たアミノ酸残基の連続する組の，全部ではないが少なくとも１またはそれ以上を
欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｆ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列； （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｈ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載される全長アミノ酸配列であっ
て，ただし，Ｎ−末端ドメイン，ホスファターゼドメインおよびＣ−末端ドメイ
ンからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失
しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｊ）配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番
号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号
２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３
１，配列番号３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番号３９に記載され
るヌクレオチド配列を有する；または （ｋ）（ｊ）に記載されるヌクレオチド配列の相補体である。好ましくは，核酸
は哺乳動物から，最も好ましくはヒトから単離された，精製されたまたは濃縮さ
れたものである。
【００１０】
本発明の別の観点にしたがえば，本発明にしたがうアミノ酸配列，例えば本明
細書に含まれる教示を考慮して，添付図面に同定されるようなアミノ酸配列を有
するホスファターゼの活性を調節する薬剤を患者に投与することにより，疾病ま
たは疾患を治療する方法が提供される。種々のホスファターゼファミリーには広
範な機能が含まれるため，そのような治療は広範な範囲の疾病，例えば癌，病態
生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン病
，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バーニヤン
ゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫において実施することができる。特に重
要なものは，実施例３に例示される種々のタイプの癌である。本発明の方法は，
乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞
肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，直腸結腸癌，および
甲状腺癌において用いることができる。
細書に含まれる教示を考慮して，添付図面に同定されるようなアミノ酸配列を有
するホスファターゼの活性を調節する薬剤を患者に投与することにより，疾病ま
たは疾患を治療する方法が提供される。種々のホスファターゼファミリーには広
範な機能が含まれるため，そのような治療は広範な範囲の疾病，例えば癌，病態
生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン病
，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バーニヤン
ゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫において実施することができる。特に重
要なものは，実施例３に例示される種々のタイプの癌である。本発明の方法は，
乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞
肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，直腸結腸癌，および
甲状腺癌において用いることができる。
【００１１】
治療を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定の疾病状態との関連性を評価
することができる。本発明の１つの態様にしたがえば，マイクロアレイ発現分析
を行って，本発明にしたがう種々のホスファターゼ遺伝子の発現プロファイルを
確立し，このことによりその発現がある種の疾病状態と相関している遺伝子を同
定することができる。
することができる。本発明の１つの態様にしたがえば，マイクロアレイ発現分析
を行って，本発明にしたがう種々のホスファターゼ遺伝子の発現プロファイルを
確立し，このことによりその発現がある種の疾病状態と相関している遺伝子を同
定することができる。
【００１２】
実施例３に記載される方法と類似の方法を用いて生成した発現データに基づい
て，多くの方法の比較および相関分析を実施しうることが理解されるであろう。
これは，上述の議論に基づいて当業者に明らかであり，したがって，本発明の範
囲内である。これらの比較および相関分析から導かれる推論は，本発明にしたが
う治療方法の実証に同様に用いることができる。注目すべき１つのシナリオは，
正常組織と疾病組織の試料の対を用いて発現アレイを作成したとき，生成するデ
ータはある種の疾病状態においていずれのホスファターゼ遺伝子が異なるように
発現されているかを特異的に示し，このことにより，本発明にしたがう治療方法
の標的を形成するであろう。すなわち，インビボまたはインビトロのいずれかで
その活性を制御しうる調節剤または薬剤を同定し，所定の疾病状態の治療におい
て用いることができる。
て，多くの方法の比較および相関分析を実施しうることが理解されるであろう。
これは，上述の議論に基づいて当業者に明らかであり，したがって，本発明の範
囲内である。これらの比較および相関分析から導かれる推論は，本発明にしたが
う治療方法の実証に同様に用いることができる。注目すべき１つのシナリオは，
正常組織と疾病組織の試料の対を用いて発現アレイを作成したとき，生成するデ
ータはある種の疾病状態においていずれのホスファターゼ遺伝子が異なるように
発現されているかを特異的に示し，このことにより，本発明にしたがう治療方法
の標的を形成するであろう。すなわち，インビボまたはインビトロのいずれかで
その活性を制御しうる調節剤または薬剤を同定し，所定の疾病状態の治療におい
て用いることができる。
【００１３】
本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，本発明において開示
されるホスファターゼ遺伝子配列から導かれるヌクレオチドプローブ，例えば本
明細書に開示されるプローブを用いて，試料中においてホスファターゼを検出す
る方法が提供される。種々のホスファターゼファミリーには広範な機能が含まれ
るため，そのような診断測定は，広範な範囲の疾病，例えば癌，病態生理学的低
酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン病，外胚葉性
形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バーニヤンゾナナ症候
群，精神分裂病および過誤腫において用いることができる。特に重要なものは，
種々のタイプの癌の診断である。本発明の診断方法を用いて，乳癌，尿生殖器癌
，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，
膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，直腸結腸癌，および甲状腺癌の試験を
行うことができる。
されるホスファターゼ遺伝子配列から導かれるヌクレオチドプローブ，例えば本
明細書に開示されるプローブを用いて，試料中においてホスファターゼを検出す
る方法が提供される。種々のホスファターゼファミリーには広範な機能が含まれ
るため，そのような診断測定は，広範な範囲の疾病，例えば癌，病態生理学的低
酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン病，外胚葉性
形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バーニヤンゾナナ症候
群，精神分裂病および過誤腫において用いることができる。特に重要なものは，
種々のタイプの癌の診断である。本発明の診断方法を用いて，乳癌，尿生殖器癌
，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，
膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，直腸結腸癌，および甲状腺癌の試験を
行うことができる。
【００１４】
上述の治療方法と同様に，正確な診断を行うためには，特定の疾病状態に対す
るホスファターゼ遺伝子の関連性のレベルを判定することが有用である。そのよ
うな判定は，本発明の１つの態様にしたがってマイクロアレイ発現分析を実施す
ることにより行うことができる。本明細書に記載される方法により，その発現が
ある種の疾病状態と相関しているホスファターゼ遺伝子を同定することができる
。
るホスファターゼ遺伝子の関連性のレベルを判定することが有用である。そのよ
うな判定は，本発明の１つの態様にしたがってマイクロアレイ発現分析を実施す
ることにより行うことができる。本明細書に記載される方法により，その発現が
ある種の疾病状態と相関しているホスファターゼ遺伝子を同定することができる
。
【００１５】
本明細書に記載される方法と類似の方法を用いて生成した発現データに基づい
て，多くの方法の比較および相関分析を実施することができる。これらもまた必
然的に本発明の範囲内である。これらの比較および相関分析から導かれる推論は
，本発明にしたがう診断方法の実証に同様に用いることができる。注目すべき１
つのシナリオは，正常組織と疾病組織の試料の対を用いて発現アレイを作成した
とき，生成するデータはある種の疾病状態においていずれのホスファターゼ遺伝
子が異なるように発現されているかを特異的に示し，このことにより，上述の診
断方法において診断マーカーとして働くことができる。
て，多くの方法の比較および相関分析を実施することができる。これらもまた必
然的に本発明の範囲内である。これらの比較および相関分析から導かれる推論は
，本発明にしたがう診断方法の実証に同様に用いることができる。注目すべき１
つのシナリオは，正常組織と疾病組織の試料の対を用いて発現アレイを作成した
とき，生成するデータはある種の疾病状態においていずれのホスファターゼ遺伝
子が異なるように発現されているかを特異的に示し，このことにより，上述の診
断方法において診断マーカーとして働くことができる。
【００１６】
本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，本発明に開示される
ホスファターゼ遺伝子，例えば図２に挙げられるアミノ酸配列をコードする遺伝
子の核酸標的領域を調節領域と比較し；次に疾病または疾患の指標として標的領
域と調節領域との間の配列または量の相違を検出することにより，試料中におい
てホスファターゼを検出する方法が提供される。この方法はまた，広範な範囲の
疾病，例えば癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴ
ル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッ
ド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫の診断において用
いることができる。特に重要なものは，種々のタイプの癌の診断である。上述し
た診断方法と同様に，この特別の方法もまた，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭
頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍
，胃癌，神経膠芽細胞腫，直腸結腸癌，および甲状腺癌の診断において用いるこ
とができる。
ホスファターゼ遺伝子，例えば図２に挙げられるアミノ酸配列をコードする遺伝
子の核酸標的領域を調節領域と比較し；次に疾病または疾患の指標として標的領
域と調節領域との間の配列または量の相違を検出することにより，試料中におい
てホスファターゼを検出する方法が提供される。この方法はまた，広範な範囲の
疾病，例えば癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴ
ル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッ
ド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫の診断において用
いることができる。特に重要なものは，種々のタイプの癌の診断である。上述し
た診断方法と同様に，この特別の方法もまた，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭
頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍
，胃癌，神経膠芽細胞腫，直腸結腸癌，および甲状腺癌の診断において用いるこ
とができる。
【００１７】
標的領域は，ホスファターゼ遺伝子中の目的とする任意の特定の領域，例えば
上流の制御領域でありうる。ホスファターゼのファミリーにおける上流の制御領
域の配列の変種は，しばしば機能的暗示を有しており，そのうちのあるものはあ
る種の疾病状態をもたらすのに重要でありうる。標的領域の量の変化，例えば，
ある種のホスファターゼ遺伝子中の制御領域（例えばレセプター結合部位）のコ
ピー数の変化はまた，機能的相違のメカニズムを表し，したがって，ある種の疾
病状態と関連づけることができる。したがって，調節領域と比較した標的領域の
配列および量におけるそのような相違の検出は，疾病状態の検出に効果的につな
がるであろう。
上流の制御領域でありうる。ホスファターゼのファミリーにおける上流の制御領
域の配列の変種は，しばしば機能的暗示を有しており，そのうちのあるものはあ
る種の疾病状態をもたらすのに重要でありうる。標的領域の量の変化，例えば，
ある種のホスファターゼ遺伝子中の制御領域（例えばレセプター結合部位）のコ
ピー数の変化はまた，機能的相違のメカニズムを表し，したがって，ある種の疾
病状態と関連づけることができる。したがって，調節領域と比較した標的領域の
配列および量におけるそのような相違の検出は，疾病状態の検出に効果的につな
がるであろう。
【００１８】
本発明の１つの態様においては，マイクロアレイ実験を用いて，疾病状態と，
１組のホスファターゼ遺伝子間の標的領域の変動との間の潜在的関連性を同定す
る。例えば，目的とするホスファターゼ遺伝子の，それぞれ所定の標的領域およ
び調節領域に対応する核酸プローブを作成する。上述および実施例３に記載のよ
うに正常組織および疾病組織からの試料を用いてマイクロアレイを作成する。こ
れらのプローブをこのように作成されたアレイにハイブリダイゼーションさせる
ことにより，正常および疾病状態における目的とする領域の比較プロファイルが
得られ，したがって，問題となっている疾病に特徴的な，標的領域と調節領域と
の相違の定義が導かれる。一方，そのような定義は，本発明にしたがう２番目に
述べた診断方法において用いる場合に，疾病状態の指標として働くであろう。多
くの同等または類似の方法を用いて，本発明にしたがう診断を実施することがで
き，これは当業者には本明細書に記載される例に基づいて明らかであることが理
解されるであろう。したがって，これらも本明細書の範囲内に含まれる。以下の
説明により本発明をさらに明らかにする。
１組のホスファターゼ遺伝子間の標的領域の変動との間の潜在的関連性を同定す
る。例えば，目的とするホスファターゼ遺伝子の，それぞれ所定の標的領域およ
び調節領域に対応する核酸プローブを作成する。上述および実施例３に記載のよ
うに正常組織および疾病組織からの試料を用いてマイクロアレイを作成する。こ
れらのプローブをこのように作成されたアレイにハイブリダイゼーションさせる
ことにより，正常および疾病状態における目的とする領域の比較プロファイルが
得られ，したがって，問題となっている疾病に特徴的な，標的領域と調節領域と
の相違の定義が導かれる。一方，そのような定義は，本発明にしたがう２番目に
述べた診断方法において用いる場合に，疾病状態の指標として働くであろう。多
くの同等または類似の方法を用いて，本発明にしたがう診断を実施することがで
き，これは当業者には本明細書に記載される例に基づいて明らかであることが理
解されるであろう。したがって，これらも本明細書の範囲内に含まれる。以下の
説明により本発明をさらに明らかにする。
【００１９】
核酸に関連して"単離された"とは，例えば，天然の起源から単離されたかまた
は合成された，互いに結合した１４，１７，２１，３５，５０，７５，１００個
またはそれ以上のヌクレオチドのポリマーを意味し，ＤＮＡおよびＲＮＡを含む
。本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見
いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていること
を表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環
境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド
配列であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド
物質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離さ
れた染色体とは区別されることを意味する。
は合成された，互いに結合した１４，１７，２１，３５，５０，７５，１００個
またはそれ以上のヌクレオチドのポリマーを意味し，ＤＮＡおよびＲＮＡを含む
。本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見
いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていること
を表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環
境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド
配列であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド
物質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離さ
れた染色体とは区別されることを意味する。
【００２０】
核酸に関連して，"濃縮された"との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡ
は，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵ
Ｃ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種
のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる濃縮事象からの配列，例
えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語
は，人が所望の核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡ
は，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵ
Ｃ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種
のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる濃縮事象からの配列，例
えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語
は，人が所望の核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
【００２１】
ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利であ
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
好ましくは天然のメッセンジャーのおよそ１００倍以上の精製，より好ましくは
１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくとも１桁，好ましくは２または３
桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に企図される。この用語はまた
，ホスファターゼをコードするかもしれないが，クローンのライブラリ中の他の
クローンから単離されていない，既に存在するクローンを区別するためにも選択
される。すなわち，この用語は，他の非ホスファターゼクローンから単離された
，ホスファターゼをコードするクローンをカバーする。
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
好ましくは天然のメッセンジャーのおよそ１００倍以上の精製，より好ましくは
１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくとも１桁，好ましくは２または３
桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に企図される。この用語はまた
，ホスファターゼをコードするかもしれないが，クローンのライブラリ中の他の
クローンから単離されていない，既に存在するクローンを区別するためにも選択
される。すなわち，この用語は，他の非ホスファターゼクローンから単離された
，ホスファターゼをコードするクローンをカバーする。
【００２２】
上述のいずれかの配列または上述のいずれかの配列の機能的誘導体（以下に定
義）にハイブリダイズする核酸もまた，本発明の一部として企図される。核酸は
，天然の起源からｃＤＮＡクローニング，濃縮ハイブリダイゼーションおよび／
またはサブトラクティブハイブリダイゼーション手法により単離することができ
る。天然の起源は，哺乳動物（ヒト）血液，精液，または組織であることができ
，核酸は，トリエステル法または他の方法で，または自動化ＤＮＡ合成器を用い
て合成することができる。
義）にハイブリダイズする核酸もまた，本発明の一部として企図される。核酸は
，天然の起源からｃＤＮＡクローニング，濃縮ハイブリダイゼーションおよび／
またはサブトラクティブハイブリダイゼーション手法により単離することができ
る。天然の起源は，哺乳動物（ヒト）血液，精液，または組織であることができ
，核酸は，トリエステル法または他の方法で，または自動化ＤＮＡ合成器を用い
て合成することができる。
【００２３】
"ハイブリダイズする"との用語は，核酸配列を，溶液中でまたは固体支持体，
例えばセルロースまたはニトロセルロース上でＤＮＡまたはＲＮＡ分子と相互作
用させる方法を表す。核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡ分子に高い親和性をもって
結合する場合，これはＤＮＡまたはＲＮＡ分子に"ハイブリダイズする"といわれ
る。探索する配列とその標的との間の相互作用の強さは，ハイブリダイゼーショ
ン条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所
望の特異性および選択性によって，種々の低いまたは高いストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション条件を用いることができる（例えば，Ｂｅｒｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ
１５２（１９８７），を参照（その全体を図面を含め本明細書の一部としてこ
こに引用する））。ストリンジェンシーは，塩濃度または変性剤の濃度を変化さ
せることにより調節することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ条件とは，少なくとも以下の程度にストリンジェントなハイブリダ
イゼーションアッセイ条件を意味する：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０
ｍＭＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理
サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼ
ーション；２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄。よりストリンジェントな条件は，０．１
ＸＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳおよび５５℃での２回目の洗浄を含む。
例えばセルロースまたはニトロセルロース上でＤＮＡまたはＲＮＡ分子と相互作
用させる方法を表す。核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡ分子に高い親和性をもって
結合する場合，これはＤＮＡまたはＲＮＡ分子に"ハイブリダイズする"といわれ
る。探索する配列とその標的との間の相互作用の強さは，ハイブリダイゼーショ
ン条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所
望の特異性および選択性によって，種々の低いまたは高いストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション条件を用いることができる（例えば，Ｂｅｒｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ
１５２（１９８７），を参照（その全体を図面を含め本明細書の一部としてこ
こに引用する））。ストリンジェンシーは，塩濃度または変性剤の濃度を変化さ
せることにより調節することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ条件とは，少なくとも以下の程度にストリンジェントなハイブリダ
イゼーションアッセイ条件を意味する：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０
ｍＭＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理
サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼ
ーション；２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄。よりストリンジェントな条件は，０．１
ＸＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳおよび５５℃での２回目の洗浄を含む。
【００２４】
当業者は，いかにしてそのような条件を変更して特異性および選択性を変化さ
せることができるかを認識するであろう。高いストリンジェンシーのハイブリダ
イゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。
好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２
個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
せることができるかを認識するであろう。高いストリンジェンシーのハイブリダ
イゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。
好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２
個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００２５】
さらに別の好ましい態様においては，核酸は，単離された，保存されたまたは
独特の領域であり，例えば，追加のポリペプチドの同定およびクローニングを容
易にするためのハイブリダイゼーションプローブを設計するのに，または追加の
ポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプローブを設計するのに
有用なものである。
独特の領域であり，例えば，追加のポリペプチドの同定およびクローニングを容
易にするためのハイブリダイゼーションプローブを設計するのに，または追加の
ポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプローブを設計するのに
有用なものである。
【００２６】
"保存された核酸領域"とは，ポリペプチド，好ましくはホスファターゼポリペ
プチドをコードする２つまたはそれ以上の核酸上に存在する領域を意味し，特定
の核酸配列がこの領域に低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするこ
とができる。ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに
適した低ストリンジェンシー条件の例は，Ａｂｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．１９：１３３６１（１９９２）；およびＢｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
，上掲（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に提供される。好ましくは，保存領域は，連続する２０ヌクレオチド中５個以下
で異なる。
プチドをコードする２つまたはそれ以上の核酸上に存在する領域を意味し，特定
の核酸配列がこの領域に低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするこ
とができる。ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに
適した低ストリンジェンシー条件の例は，Ａｂｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．１９：１３３６１（１９９２）；およびＢｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
，上掲（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に提供される。好ましくは，保存領域は，連続する２０ヌクレオチド中５個以下
で異なる。
【００２７】
"独特の核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸中に存
在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない
配列を意味する。このような領域は，好ましくは，ホスファターゼポリペプチド
をコードする全長核酸中に存在する１４，１７，２１，３５，５０，７５，１０
０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。特に，独特の核酸領域は，
好ましくはヒト起源の物である。独特の核酸領域は，目的とする全長配列を既知
の配列とアラインメントさせることにより同定することができる。２つの配列は
それぞれ，互いに同一である多くの連続するヌクレオチドを有するであろう。独
特の核酸領域は，これらの連続するヌクレオチドおよび目的とする全長配列から
の１またはそれ以上の追加の連続するヌクレオチドを含むであろう。
在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない
配列を意味する。このような領域は，好ましくは，ホスファターゼポリペプチド
をコードする全長核酸中に存在する１４，１７，２１，３５，５０，７５，１０
０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。特に，独特の核酸領域は，
好ましくはヒト起源の物である。独特の核酸領域は，目的とする全長配列を既知
の配列とアラインメントさせることにより同定することができる。２つの配列は
それぞれ，互いに同一である多くの連続するヌクレオチドを有するであろう。独
特の核酸領域は，これらの連続するヌクレオチドおよび目的とする全長配列から
の１またはそれ以上の追加の連続するヌクレオチドを含むであろう。
【００２８】
本発明はまた，試料中においてホスファターゼポリペプチドをコードする核酸
を検出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは，例えば，配列番
号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列
番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番
号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号
３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番号３９に記載される少なくとも
１４，１７，２１，３５，５０，７５，１００またはそれ以上の連続するヌクレ
オチド，またはその相補体または機能的誘導体の配列に特異的にハイブリダイズ
するであろう核酸を含む。プローブは，好ましくは少なくとも１４，１７，２１
，３５，５０，７５，１００またはそれ以上の塩基の長さであり，ホスファター
ゼをコードする核酸の独特の領域に特異的にハイブリダイズするよう選択される
。
を検出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは，例えば，配列番
号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列
番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番
号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号
３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番号３９に記載される少なくとも
１４，１７，２１，３５，５０，７５，１００またはそれ以上の連続するヌクレ
オチド，またはその相補体または機能的誘導体の配列に特異的にハイブリダイズ
するであろう核酸を含む。プローブは，好ましくは少なくとも１４，１７，２１
，３５，５０，７５，１００またはそれ以上の塩基の長さであり，ホスファター
ゼをコードする核酸の独特の領域に特異的にハイブリダイズするよう選択される
。
【００２９】
好ましい態様においては，核酸プローブは，いずれかの図に記載される番号付
けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする。上述するよう
に，所望の特異性および選択性によって種々の低いまたは高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件下においては，高度に相補的な核酸配列のみが
ハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを阻
止する。
けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする。上述するよう
に，所望の特異性および選択性によって種々の低いまたは高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件下においては，高度に相補的な核酸配列のみが
ハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを阻
止する。
【００３０】
プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生じるような条件下
で試料を核酸プローブと接触させ，ホスファターゼＲＮＡに結合したプローブの
存在または量を検出することにより試料中におけるホスファターゼＲＮＡの存在
または量を検出することが含まれる。プローブとホスファターゼポリペプチドを
コードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスは，検出された核
酸の配列の同定において用いることができる（例えば，Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
ｐ．２７５ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋ
ａ，ｅｄ．，１９９２）（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引
用する））。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブ
が置かれた容器手段を含むよう構築することができる。
で試料を核酸プローブと接触させ，ホスファターゼＲＮＡに結合したプローブの
存在または量を検出することにより試料中におけるホスファターゼＲＮＡの存在
または量を検出することが含まれる。プローブとホスファターゼポリペプチドを
コードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスは，検出された核
酸の配列の同定において用いることができる（例えば，Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
ｐ．２７５ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋ
ａ，ｅｄ．，１９９２）（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引
用する））。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブ
が置かれた容器手段を含むよう構築することができる。
【００３１】
本発明はまた組換え核酸，好ましくは細胞または生物中の組換え核酸を特徴と
する。組換え核酸は，記載されるホスファターゼのいずれか，またはその機能的
誘導体をコードする配列，および宿主細胞において転写を開始させるのに有効な
ベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は，細
胞において機能的な転写開始領域，ホスファターゼポリペプチドをコードするＲ
ＮＡ配列に相補的な配列，および細胞において機能的な転写終止領域を含むこと
ができる。
する。組換え核酸は，記載されるホスファターゼのいずれか，またはその機能的
誘導体をコードする配列，および宿主細胞において転写を開始させるのに有効な
ベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は，細
胞において機能的な転写開始領域，ホスファターゼポリペプチドをコードするＲ
ＮＡ配列に相補的な配列，および細胞において機能的な転写終止領域を含むこと
ができる。
【００３２】
本発明の別の観点は，単離された，濃縮されたまたは精製されたポリペプチド
を特徴とする。好ましくは，単離された，濃縮されたまたは精製されたポリペプ
チドは，ホスファターゼポリペプチドである。本発明のポリペプチドは， （ａ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列
番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番
号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号
３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に記載さ
れるアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列であって，
ただしいずれかの図に記載されるそれぞれのドメイン境界の，全部ではないが１
またはそれ以上を欠失したアミノ酸配列； （ｃ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列； （ｄ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２または配列番号３４，配
列番号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列であっ
て，ただし，以下のドメイン：Ｎ−末端ドメイン，Ｃ−末端ドメインまたはホス
ファターゼドメインの，全部ではないが少なくとも１つを欠失しているアミノ酸
配列 を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは，ホスファターゼは，哺乳動物から，
最も好ましくはヒトから単離された，精製されたまたは濃縮されたものである。
を特徴とする。好ましくは，単離された，濃縮されたまたは精製されたポリペプ
チドは，ホスファターゼポリペプチドである。本発明のポリペプチドは， （ａ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列
番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番
号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号
３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に記載さ
れるアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列であって，
ただしいずれかの図に記載されるそれぞれのドメイン境界の，全部ではないが１
またはそれ以上を欠失したアミノ酸配列； （ｃ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列； （ｄ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２または配列番号３４，配
列番号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列であっ
て，ただし，以下のドメイン：Ｎ−末端ドメイン，Ｃ−末端ドメインまたはホス
ファターゼドメインの，全部ではないが少なくとも１つを欠失しているアミノ酸
配列 を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは，ホスファターゼは，哺乳動物から，
最も好ましくはヒトから単離された，精製されたまたは濃縮されたものである。
【００３３】
"ホスファターゼポリペプチド"とは，配列番号２，配列番号４，配列番号６，
配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列
番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番
号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号
３８または配列番号４０に示される配列またはそのフラグメントと実質的に類似
するアミノ酸配列を意味する。実質的に類似する配列は，好ましくは，配列番号
２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列
番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番
号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号
３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０の配列に対して，少なく
とも９０％の同一性（より好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは９
９−１００％）を有する。
配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列
番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番
号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号
３８または配列番号４０に示される配列またはそのフラグメントと実質的に類似
するアミノ酸配列を意味する。実質的に類似する配列は，好ましくは，配列番号
２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列
番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番
号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号
３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０の配列に対して，少なく
とも９０％の同一性（より好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは９
９−１００％）を有する。
【００３４】
"同一性"とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。同
一性は，２つの配列の間で同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列
のドメイン中の残基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。すなわ
ち，完全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い
程度に保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有
するであろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定する
ためのいくつかのコンピュータプログラム，例えばＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴま
たはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３−４１０），およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能
であることを認識するであろう。
一性は，２つの配列の間で同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列
のドメイン中の残基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。すなわ
ち，完全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い
程度に保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有
するであろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定する
ためのいくつかのコンピュータプログラム，例えばＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴま
たはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３−４１０），およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能
であることを認識するであろう。
【００３５】
ポリペプチドに関して"単離された"とは，互いに結合した６，１２，１８，２
４，３０，３６，５０，７５，１００個またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを
意味し，天然の起源から単離されたまたは合成されたポリペプチドを含む。本発
明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見いださ
れない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生ずる配
列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列は，無
細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。この用語
は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく，
配列が天然にこれに付随する物質を本質的に含まない（少なくとも約９０−９５
％純粋）ことを意味する。
４，３０，３６，５０，７５，１００個またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを
意味し，天然の起源から単離されたまたは合成されたポリペプチドを含む。本発
明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見いださ
れない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生ずる配
列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列は，無
細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。この用語
は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく，
配列が天然にこれに付随する物質を本質的に含まない（少なくとも約９０−９５
％純粋）ことを意味する。
【００３６】
ポリペプチドに関して使用する場合，"濃縮された"との用語は，特定のアミノ
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在するアミノ酸全体の有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の量
の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加に
より，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。し
かし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するものでは
なく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味するこ
とに注意すべきである。本明細書において有意にとの用語は，増加のレベルがそ
のような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミノ
酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸配
列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例え
ば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１９
によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望の
アミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在するアミノ酸全体の有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の量
の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加に
より，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。し
かし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するものでは
なく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味するこ
とに注意すべきである。本明細書において有意にとの用語は，増加のレベルがそ
のような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミノ
酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸配
列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例え
ば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１９
によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望の
アミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００３７】
ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで））。少なくとも１桁の精製，好まし
くは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。
物質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，
９５％，または９９％純粋である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで））。少なくとも１桁の精製，好まし
くは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。
物質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，
９５％，または９９％純粋である。
【００３８】
別の観点においては，本発明は，単離された，濃縮された，または精製された
ポリペプチドフラグメント，好ましくはホスファターゼポリペプチドフラグメン
トを特徴とする。"ホスファターゼポリペプチドフラグメント"とは，配列番号２
，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番
号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号
２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３
４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に示される全長ホスファタ
ーゼアミノ酸配列より短いアミノ酸配列を意味する。フラグメントの例には，ホ
スファターゼドメイン，ホスファターゼ変異体およびホスファターゼ特異的エピ
トープまたは組換えホスファターゼポリペプチドが含まれる。
ポリペプチドフラグメント，好ましくはホスファターゼポリペプチドフラグメン
トを特徴とする。"ホスファターゼポリペプチドフラグメント"とは，配列番号２
，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番
号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号
２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３
４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に示される全長ホスファタ
ーゼアミノ酸配列より短いアミノ酸配列を意味する。フラグメントの例には，ホ
スファターゼドメイン，ホスファターゼ変異体およびホスファターゼ特異的エピ
トープまたは組換えホスファターゼポリペプチドが含まれる。
【００３９】
"ドメイン"とは，１またはそれ以上の既知の蛋白質に対してホモロジーを有し
，配列がある種の共通の機能，相互作用または活性を予言する，ポリペプチドの
部分を意味する。本発明のポリペプチドドメインには，Ｃ−末端ドメイン，Ｎ−
末端ドメインおよびホスファターゼドメイン（本明細書においてはあるいは触媒
ドメインとして与えられる）が含まれる。
，配列がある種の共通の機能，相互作用または活性を予言する，ポリペプチドの
部分を意味する。本発明のポリペプチドドメインには，Ｃ−末端ドメイン，Ｎ−
末端ドメインおよびホスファターゼドメイン（本明細書においてはあるいは触媒
ドメインとして与えられる）が含まれる。
【００４０】
"ホスファターゼドメイン"との用語は，リン酸化された蛋白質からのリン酸の
除去を担う蛋白質ホスファターゼの領域を表す。
除去を担う蛋白質ホスファターゼの領域を表す。
【００４１】
"Ｎ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの開始メチオニン，また
はＮ−末端ドメインが部分的である場合には最初のアミノ酸と触媒的ドメインと
の間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白
質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行い，触媒的
ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末端ドメ
インは，その長さに応じて，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすか
または果たさない。
はＮ−末端ドメインが部分的である場合には最初のアミノ酸と触媒的ドメインと
の間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白
質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行い，触媒的
ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末端ドメ
インは，その長さに応じて，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすか
または果たさない。
【００４２】
Ｃ末端ドメインとは，ホスファターゼの触媒ドメインとカルボキシ末端アミノ
酸残基との間に位置する領域を表す。Ｃ末端ドメインは，非重複蛋白質データベ
ースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンアラインメントを用いて，触
媒ドメインのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｃ末端ド
メインは，ホスファターゼ機能において制御的機能を果たすかもしれないし果た
さないかもしれない。本発明においては，Ｎ−末端またはＣ−末端ドメインのい
ずれかが，追加の蛋白質機能を担う，同定されていないドメインを包含していて
もよい。
酸残基との間に位置する領域を表す。Ｃ末端ドメインは，非重複蛋白質データベ
ースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンアラインメントを用いて，触
媒ドメインのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｃ末端ド
メインは，ホスファターゼ機能において制御的機能を果たすかもしれないし果た
さないかもしれない。本発明においては，Ｎ−末端またはＣ−末端ドメインのい
ずれかが，追加の蛋白質機能を担う，同定されていないドメインを包含していて
もよい。
【００４３】
"ホスファターゼ変異体"とは，１またはそれ以上のアミノ酸が変更，付加およ
び／または欠失されている点において天然の配列とは異なるホスファターゼポリ
ペプチドを意味する。アミノ酸の変更は保存的でも非保存的でもよい。"保存的"
とは，アミノ酸が類似の特性，例えば電荷，疎水性，構造を有するアミノ酸で置
換されていることを意味する。ポリペプチドとの用語により包含されるものの例
としては，限定されないが，以下のものが含まれる：（１）非ホスファターゼポ
リペプチド配列，例えばヘマグルチニン（ＨＡ）のポリペプチド配列に融合され
たホスファターゼポリペプチド配列の一部を含むキメラ蛋白質，（２）特定のド
メイン，例えば触媒ドメインを欠失したホスファターゼ蛋白質，および（３）点
突然変異を有するホスファターゼ蛋白質。ホスファターゼ変異体は，いくつかの
有用な機能，例えば天然の結合パートナーへの結合，触媒活性，またはホスファ
ターゼ特異的抗体（下で定義する）に結合する能力等を保持しているであろう。
び／または欠失されている点において天然の配列とは異なるホスファターゼポリ
ペプチドを意味する。アミノ酸の変更は保存的でも非保存的でもよい。"保存的"
とは，アミノ酸が類似の特性，例えば電荷，疎水性，構造を有するアミノ酸で置
換されていることを意味する。ポリペプチドとの用語により包含されるものの例
としては，限定されないが，以下のものが含まれる：（１）非ホスファターゼポ
リペプチド配列，例えばヘマグルチニン（ＨＡ）のポリペプチド配列に融合され
たホスファターゼポリペプチド配列の一部を含むキメラ蛋白質，（２）特定のド
メイン，例えば触媒ドメインを欠失したホスファターゼ蛋白質，および（３）点
突然変異を有するホスファターゼ蛋白質。ホスファターゼ変異体は，いくつかの
有用な機能，例えば天然の結合パートナーへの結合，触媒活性，またはホスファ
ターゼ特異的抗体（下で定義する）に結合する能力等を保持しているであろう。
【００４４】
"ホスファターゼ特異的エピトープ"とは，抗原性がありかつホスファターゼに
独特のアミノ酸の配列を意味する。ホスファターゼ特異的エピトープを用いて，
ホスファターゼ特異的抗体を生成することができ，これは以下にさらに詳細に説
明する。
独特のアミノ酸の配列を意味する。ホスファターゼ特異的エピトープを用いて，
ホスファターゼ特異的抗体を生成することができ，これは以下にさらに詳細に説
明する。
【００４５】
"組換えホスファターゼポリペプチド"とは，天然に生ずるポリペプチドとはそ
の存在場所（例えば天然に見いだされるものとは異なる細胞または組織中に存在
する），純度または構造において区別されるように，組換えＤＮＡ手法により生
成されたポリペプチドを含むことを意味する。一般に，そのような組換えポリペ
プチドは，天然で通常見いだされる量とは異なる量で細胞中に存在する。
の存在場所（例えば天然に見いだされるものとは異なる細胞または組織中に存在
する），純度または構造において区別されるように，組換えＤＮＡ手法により生
成されたポリペプチドを含むことを意味する。一般に，そのような組換えポリペ
プチドは，天然で通常見いだされる量とは異なる量で細胞中に存在する。
【００４６】
本発明のさらに別の観点は，ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに
対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体）を特徴とし，ポリペプチドは好ましくはホスファターゼである
。"特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチド
に結合するより高い親和性をもってホスファターゼポリペプチドに結合すること
を意味する。本発明の抗体は，ホスファターゼまたはそのフラグメントに対して
特異的結合親和性を有し，ここで，前記ホスファターゼまたはそのフラグメント
は，いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少
なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する。
対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体）を特徴とし，ポリペプチドは好ましくはホスファターゼである
。"特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチド
に結合するより高い親和性をもってホスファターゼポリペプチドに結合すること
を意味する。本発明の抗体は，ホスファターゼまたはそのフラグメントに対して
特異的結合親和性を有し，ここで，前記ホスファターゼまたはそのフラグメント
は，いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少
なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する。
【００４７】
ホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体は，免疫
複合体が形成されるような条件下で試料を抗体と接触させ，そしてホスファター
ゼポリペプチドにコンジュゲートした抗体の存在および／または量を検出するこ
とにより，試料中におけるホスファターゼポリペプチドの存在および／または量
を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための
診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーと放射性同位
体等の標識とのコンジュゲートを有する第２の容器を含むよう構築することがで
きる。診断キットはまたＦＤＡに認可された使用の通知書およびその指針を含ん
でいてもよい。
複合体が形成されるような条件下で試料を抗体と接触させ，そしてホスファター
ゼポリペプチドにコンジュゲートした抗体の存在および／または量を検出するこ
とにより，試料中におけるホスファターゼポリペプチドの存在および／または量
を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための
診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーと放射性同位
体等の標識とのコンジュゲートを有する第２の容器を含むよう構築することがで
きる。診断キットはまたＦＤＡに認可された使用の通知書およびその指針を含ん
でいてもよい。
【００４８】
別の観点においては，本発明は，本発明のポリペプチドに対して特異的結合親
和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とする。"ハイブリドーマ"と
は，抗体，例えばホスファターゼ抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好
ましい態様においては，ホスファターゼ抗体は，本発明のホスファターゼ分子に
特異的に結合しうるアミノ酸の配列を含む。
和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とする。"ハイブリドーマ"と
は，抗体，例えばホスファターゼ抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好
ましい態様においては，ホスファターゼ抗体は，本発明のホスファターゼ分子に
特異的に結合しうるアミノ酸の配列を含む。
【００４９】
別の態様においては，本発明は，ポリペプチド，好ましくはホスファターゼポ
リペプチドをコードする精製された核酸を含む組換え細胞または組織を包含する
。本発明の組換え細胞は核酸分子を含み，ここで，前記核酸分子はいずれかの図
に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記
載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼまたはその機能的同等物をコード
する。そのような細胞においては，核酸はその遺伝的制御要素の制御下にあって
もよく，または外来性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよ
い。"外来性"とは，天然の状態ではホスファターゼポリペプチドのコーディング
配列と通常は転写的にカップリングしていないプロモーターを意味する。
リペプチドをコードする精製された核酸を含む組換え細胞または組織を包含する
。本発明の組換え細胞は核酸分子を含み，ここで，前記核酸分子はいずれかの図
に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記
載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼまたはその機能的同等物をコード
する。そのような細胞においては，核酸はその遺伝的制御要素の制御下にあって
もよく，または外来性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよ
い。"外来性"とは，天然の状態ではホスファターゼポリペプチドのコーディング
配列と通常は転写的にカップリングしていないプロモーターを意味する。
【００５０】
本発明は，ポリペプチドまたは関連する配列を含むヒト細胞を同定する方法を
特徴とする。該方法は，当該技術分野において日常的であり標準的である手法，
例えばホスファターゼを同定するために本明細書において記載される手法（例え
ば，クローニング，サザンまたはノザンブロット分析，インシトゥーハイブリダ
イゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト細胞においてポリペプチドを同定
することを含む。
特徴とする。該方法は，当該技術分野において日常的であり標準的である手法，
例えばホスファターゼを同定するために本明細書において記載される手法（例え
ば，クローニング，サザンまたはノザンブロット分析，インシトゥーハイブリダ
イゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト細胞においてポリペプチドを同定
することを含む。
【００５１】
本発明はまた，ポリペプチドの天然の結合パートナーについて細胞をスクリー
ニングする方法を特徴とする。"天然の結合パートナー"とは，ポリペプチド，好
ましくはホスファターゼと相互作用する蛋白質を意味する。結合パートナーには
，リガンド，アゴニスト，アンタゴニストおよび下流シグナリング分子，例えば
アダプター蛋白質が含まれ，当該技術分野においてよく知られる手法，例えば共
免疫沈澱によりまたは例えばツーハイブリッドスクリーニング等を用いて同定す
ることができる（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，米国特許５，２８３，１７
３（１９９４年２月１日発行），本明細書の一部としてここに引用する）。本発
明はまた，上述の方法により同定された，精製された，単離されたまたは濃縮さ
れた形のポリペプチドを特徴とする。
ニングする方法を特徴とする。"天然の結合パートナー"とは，ポリペプチド，好
ましくはホスファターゼと相互作用する蛋白質を意味する。結合パートナーには
，リガンド，アゴニスト，アンタゴニストおよび下流シグナリング分子，例えば
アダプター蛋白質が含まれ，当該技術分野においてよく知られる手法，例えば共
免疫沈澱によりまたは例えばツーハイブリッドスクリーニング等を用いて同定す
ることができる（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，米国特許５，２８３，１７
３（１９９４年２月１日発行），本明細書の一部としてここに引用する）。本発
明はまた，上述の方法により同定された，精製された，単離されたまたは濃縮さ
れた形のポリペプチドを特徴とする。
【００５２】
別の観点においては，本発明は，ポリペプチド，好ましくはホスファターゼの
活性を調節する物質を同定するアッセイを提供する。該アッセイは， （ａ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの少な
くとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのホスファターゼ
を接触させ； （ｂ）ホスファターゼの活性を測定し；そして （ｃ）試験物質がホスファターゼの活性を調節するか否かを判定する， の各工程を含む。
活性を調節する物質を同定するアッセイを提供する。該アッセイは， （ａ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの少な
くとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのホスファターゼ
を接触させ； （ｂ）ホスファターゼの活性を測定し；そして （ｃ）試験物質がホスファターゼの活性を調節するか否かを判定する， の各工程を含む。
【００５３】
そのようなアッセイは，インビトロまたはインビボで実施することができ，現
存するアッセイ，例えばＷＯ９６／４０２７６（１９９６年１２月１９日公開）
およびＷＯ９６／１４４３３（１９９６年５月１７日公開）（いずれも図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるアッセイを改変すること
により得ることができる。この他，標準基質に対するホスファターゼ活性を試験
することも可能である。このようにして同定された物質は，ホスファターゼ活性
のエンハンサーまたは阻害剤であるかもしれず，ペプチド，天然産物（例えば真
菌株から単離される産物）または小分子量の化学化合物でありうる。好ましい物
質は，５，０００より小さい，より好ましくは１，０００より小さい，最も好ま
しくは５００より小さい分子量の化合物である。本発明により企図されるアッセ
イおよび物質は以下にさらに詳細に説明する。
存するアッセイ，例えばＷＯ９６／４０２７６（１９９６年１２月１９日公開）
およびＷＯ９６／１４４３３（１９９６年５月１７日公開）（いずれも図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるアッセイを改変すること
により得ることができる。この他，標準基質に対するホスファターゼ活性を試験
することも可能である。このようにして同定された物質は，ホスファターゼ活性
のエンハンサーまたは阻害剤であるかもしれず，ペプチド，天然産物（例えば真
菌株から単離される産物）または小分子量の化学化合物でありうる。好ましい物
質は，５，０００より小さい，より好ましくは１，０００より小さい，最も好ま
しくは５００より小さい分子量の化合物である。本発明により企図されるアッセ
イおよび物質は以下にさらに詳細に説明する。
【００５４】
本発明の別の観点は，細胞内でホスファターゼ活性を調節する物質を同定する
方法である。該方法は， （ａ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの少な
くとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのホスファターゼ
を発現させ； （ｂ）試験物質を細胞に加え；そして （ｃ）（ｉ）細胞表現型の変化，または （ｉｉ）ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用 をモニターする の各工程を含む。例えば，マウスの皮下異種移植モデルを用いて，細胞増殖疾患
，例えば白血病またはリンパ腫の治療としてホスファターゼ活性の阻害剤を試験
することができる。
方法である。該方法は， （ａ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの少な
くとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのホスファターゼ
を発現させ； （ｂ）試験物質を細胞に加え；そして （ｃ）（ｉ）細胞表現型の変化，または （ｉｉ）ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用 をモニターする の各工程を含む。例えば，マウスの皮下異種移植モデルを用いて，細胞増殖疾患
，例えば白血病またはリンパ腫の治療としてホスファターゼ活性の阻害剤を試験
することができる。
【００５５】
本発明の別の観点においては，疾病または疾患を治療する方法が提供される。
該方法は，そのような治療を必要とする患者にポリペプチド，好ましくはいずれ
かの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの少なくとも１つに
記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼの活性を調節する物質を投与す
ることを含む。疾病または疾患は，癌，心不全において見られるような病態生理
学的低酸素症，および血管疾患であることができ，例えばアテローム性動脈硬化
症，狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候
群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候
群，バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および過誤腫であり
うる。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，
滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，直腸結
腸癌および甲状腺癌でありうる。ホスファターゼ活性を刺激することができ，こ
の方法はインビトロで活性を調節することができる。
該方法は，そのような治療を必要とする患者にポリペプチド，好ましくはいずれ
かの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの少なくとも１つに
記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼの活性を調節する物質を投与す
ることを含む。疾病または疾患は，癌，心不全において見られるような病態生理
学的低酸素症，および血管疾患であることができ，例えばアテローム性動脈硬化
症，狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候
群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候
群，バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および過誤腫であり
うる。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，
滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，直腸結
腸癌および甲状腺癌でありうる。ホスファターゼ活性を刺激することができ，こ
の方法はインビトロで活性を調節することができる。
【００５６】
本発明のさらに別の観点においては，疾病または疾患の診断道具として，試料
中においてポリペプチド，好ましくはホスファターゼを検出する方法が提供され
る。該方法は， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でいずれかの図に記
載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする
核酸プローブと接触させ；そして （ｂ）疾病の指標としてプローブ：標的領域の存在または量を検出する の各工程を含む。疾病または疾患は癌，心不全において見られる病態生理学的低
酸素症，および血管疾患であることができ，例えば，アテローム性動脈硬化症，
狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，
コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，
バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および過誤腫でありうる
。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜
肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，直腸結腸癌
および甲状腺癌でありうる。
中においてポリペプチド，好ましくはホスファターゼを検出する方法が提供され
る。該方法は， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でいずれかの図に記
載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする
核酸プローブと接触させ；そして （ｂ）疾病の指標としてプローブ：標的領域の存在または量を検出する の各工程を含む。疾病または疾患は癌，心不全において見られる病態生理学的低
酸素症，および血管疾患であることができ，例えば，アテローム性動脈硬化症，
狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，
コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，
バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および過誤腫でありうる
。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜
肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，直腸結腸癌
および甲状腺癌でありうる。
【００５７】
本発明のさらに別の観点においては，疾病または疾患の診断道具として，試料
においてポリペプチド，好ましくはホスファターゼを検出する方法が提供される
。該方法は， （ａ）試料において核酸標的領域を調節領域と比較し，前記核酸は前記ポリペ
プチドをコードし，ここで前記ポリペプチドはいずれかの図に記載される番号付
けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配
列を有し；そして （ｂ）疾病または疾患の指標として，前記標的領域と前記調節領域との間の配列
または量の相違を検出する の各工程を含む。疾病または疾患は，癌，心不全において見られる病態生理学的
低酸素症，および血管疾患であることができ，例えばアテローム性動脈硬化症，
狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，
コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，
バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および過誤腫でありうる
。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜
肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，直腸結腸癌
および甲状腺癌でありうる。
においてポリペプチド，好ましくはホスファターゼを検出する方法が提供される
。該方法は， （ａ）試料において核酸標的領域を調節領域と比較し，前記核酸は前記ポリペ
プチドをコードし，ここで前記ポリペプチドはいずれかの図に記載される番号付
けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配
列を有し；そして （ｂ）疾病または疾患の指標として，前記標的領域と前記調節領域との間の配列
または量の相違を検出する の各工程を含む。疾病または疾患は，癌，心不全において見られる病態生理学的
低酸素症，および血管疾患であることができ，例えばアテローム性動脈硬化症，
狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，
コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，
バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および過誤腫でありうる
。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜
肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，直腸結腸癌
および甲状腺癌でありうる。
【００５８】
上述した本発明の概要は，非限定的なものであり，本発明の他の特徴および利
点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００５９】図面の簡単な説明
図１は，本発明のホスファターゼポリヌクレオチドの比較を示す。左から右に
，各カラムは，ａ＆ｂ）本発明者らにより与えられた各配列の名前，ｃ）単離さ
れた配列の種，ｄ＆ｅ）それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列番号，
ｆ）ＯＲＦが全長（ＦＬ）であるか，全長触媒ドメイン（ＣＡＴ）をコードする
か，ｇ），ｈ）およびｉ）本文中に定義される，ホスファターゼのスーパーファ
ミリー，グループおよびファミリー，ｊ）およびｋ）それぞれヌクレオチドおよ
びアミノ酸で表した配列の長さ，１−ｎ）それぞれＯＲＦ開始および末端および
ＯＲＦの長さ，ｏ−ｒ）ＤＮＡ反復，ＳＮＰ位置，染色体位置および"発現"パタ
ーンが明細書に記載されているか否か，を表す。
，各カラムは，ａ＆ｂ）本発明者らにより与えられた各配列の名前，ｃ）単離さ
れた配列の種，ｄ＆ｅ）それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列番号，
ｆ）ＯＲＦが全長（ＦＬ）であるか，全長触媒ドメイン（ＣＡＴ）をコードする
か，ｇ），ｈ）およびｉ）本文中に定義される，ホスファターゼのスーパーファ
ミリー，グループおよびファミリー，ｊ）およびｋ）それぞれヌクレオチドおよ
びアミノ酸で表した配列の長さ，１−ｎ）それぞれＯＲＦ開始および末端および
ＯＲＦの長さ，ｏ−ｒ）ＤＮＡ反復，ＳＮＰ位置，染色体位置および"発現"パタ
ーンが明細書に記載されているか否か，を表す。
【００６０】
図２は，本発明のホスファターゼの比較を示す。左から右に，カラムａ）から
ｅ）上述の図１と同一，カラムｆ）およびｇ）それぞれ，遺伝子のグループおよ
びファミリー，カラムｈ）およびｉ）触媒ドメインの開始および末端を同定，カ
ラムｊ）およびｋ）ローダナーゼドメインの開始および末端，カラムｌ）からｑ
）本発明の核酸のそれぞれ，ｎｒａａ Ｐｓｃｏｒｅ，マッチを決定した連続す
るアミノ酸の長さ，ＩＤマッチ，同一性パーセント，類似性パーセントおよびｎ
ｒａａマッチＡＣＣ＃，を表す。最後に，最終カラムは，本発明の遺伝子および
／またはアミノ酸の簡単な説明を記載する。
ｅ）上述の図１と同一，カラムｆ）およびｇ）それぞれ，遺伝子のグループおよ
びファミリー，カラムｈ）およびｉ）触媒ドメインの開始および末端を同定，カ
ラムｊ）およびｋ）ローダナーゼドメインの開始および末端，カラムｌ）からｑ
）本発明の核酸のそれぞれ，ｎｒａａ Ｐｓｃｏｒｅ，マッチを決定した連続す
るアミノ酸の長さ，ＩＤマッチ，同一性パーセント，類似性パーセントおよびｎ
ｒａａマッチＡＣＣ＃，を表す。最後に，最終カラムは，本発明の遺伝子および
／またはアミノ酸の簡単な説明を記載する。
【００６１】
図３は，発現プロファイルからの結果を表す。左から右に，カラムａ）および
ｂ）は試料および起源を表す。カラムｃ）はタグを識別し，そしてｄ）は細胞タ
イプを表す。カラムｅ）は，概要のコメントを提供する。カラムｆ）からｋ）は
，それぞれ，腫瘍−ｓｙｍ，正常−ｓｙｍ，腫瘍−ｌｏ，腫瘍細胞，正常および
ｐ５３を識別する。カラム１）は活性値を表す。カラムｍ）−ｓ）はそれぞれ以
下の配列を用いて得られたデータを記載する： 配列番号１１ ＡＡ３７４７５３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，配列番号
２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ０６０７４６（Ｇ７７−８−１４
），配列番号３３ ＮＰ０６０２３２（ＡＡ２３２３８４），配列番号３７ Ｍ
ＴＭＲ７（ＡＡ６６３８７５），および配列番号３９ ＡＡ４９３９１５。図４
を参照。
ｂ）は試料および起源を表す。カラムｃ）はタグを識別し，そしてｄ）は細胞タ
イプを表す。カラムｅ）は，概要のコメントを提供する。カラムｆ）からｋ）は
，それぞれ，腫瘍−ｓｙｍ，正常−ｓｙｍ，腫瘍−ｌｏ，腫瘍細胞，正常および
ｐ５３を識別する。カラム１）は活性値を表す。カラムｍ）−ｓ）はそれぞれ以
下の配列を用いて得られたデータを記載する： 配列番号１１ ＡＡ３７４７５３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，配列番号
２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ０６０７４６（Ｇ７７−８−１４
），配列番号３３ ＮＰ０６０２３２（ＡＡ２３２３８４），配列番号３７ Ｍ
ＴＭＲ７（ＡＡ６６３８７５），および配列番号３９ ＡＡ４９３９１５。図４
を参照。
【００６２】
図４は，本発明にしたがうヌクレオチド配列を示す。
【００６３】
図５は，本発明にしたがうアミノ酸配列を示す。
【００６４】発明の詳細な説明
本発明は，新規ポリペプチドの単離および特徴決定，これらのポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列，種々の産物および種々のポリペプチド関連疾病お
よび状態，例えば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するために用いるこ
とができるアッセイ方法に関する。ポリペプチド，好ましくはホスファターゼ，
およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は，本明細書に記載される配列
が与えられれば，よく知られた標準的な合成手法により製造することができる。
コードするヌクレオチド配列，種々の産物および種々のポリペプチド関連疾病お
よび状態，例えば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するために用いるこ
とができるアッセイ方法に関する。ポリペプチド，好ましくはホスファターゼ，
およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は，本明細書に記載される配列
が与えられれば，よく知られた標準的な合成手法により製造することができる。
【００６５】
本発明に記載されるポリペプチドは，二重特異性蛋白質ホスファターゼの群に
属する。この分類は，この種類のホスファターゼの触媒ドメインを作り上げる保
存されたコアアミノ酸配列モチーフを利用する。二重特異性ホスファターゼの群
の触媒ドメインの独特の特徴的モチーフは，これらの酵素がホスホセリン／ホス
ホトレオニンならびにホスホチロシン残基を脱リン酸化する能力を担う。
属する。この分類は，この種類のホスファターゼの触媒ドメインを作り上げる保
存されたコアアミノ酸配列モチーフを利用する。二重特異性ホスファターゼの群
の触媒ドメインの独特の特徴的モチーフは，これらの酵素がホスホセリン／ホス
ホトレオニンならびにホスホチロシン残基を脱リン酸化する能力を担う。
【００６６】
二重特異性蛋白質ホスファターゼの群は，Ｃｄｃ１４ホスファターゼ，ＭＡＰ
キナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ），ミオチューブラリン（ＭＴＭ），抗ホスフ
ァターゼとして作用するＳｂｆｌに代表されるＭＴＭのサブクラス，低分子量（
ＬＭＷ）Ｃｄｃ２５様ホスファターゼおよびＰＴＥＮ（脂質ホスファターゼ）を
含むファミリーメンバーに分けられる。配列ホモロジーに基づいて，本発明の特
徴であるホスファターゼは，二重特異性ホスファターゼの以下の別個のファミリ
ーに属する：Ｃｄｃ１４，ＭＫＰ４，ＭＴＭ，ＭＴＭ様ＳＢＦ１，一群の抗ホス
ファターゼおよびＰＴＥＮ。既知のファミリー原型の構造的および機能的特徴の
記述，ならびに図３に示されるデータから得た各ホスファターゼに最も近いホモ
ログの概要が以下に示される。
キナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ），ミオチューブラリン（ＭＴＭ），抗ホスフ
ァターゼとして作用するＳｂｆｌに代表されるＭＴＭのサブクラス，低分子量（
ＬＭＷ）Ｃｄｃ２５様ホスファターゼおよびＰＴＥＮ（脂質ホスファターゼ）を
含むファミリーメンバーに分けられる。配列ホモロジーに基づいて，本発明の特
徴であるホスファターゼは，二重特異性ホスファターゼの以下の別個のファミリ
ーに属する：Ｃｄｃ１４，ＭＫＰ４，ＭＴＭ，ＭＴＭ様ＳＢＦ１，一群の抗ホス
ファターゼおよびＰＴＥＮ。既知のファミリー原型の構造的および機能的特徴の
記述，ならびに図３に示されるデータから得た各ホスファターゼに最も近いホモ
ログの概要が以下に示される。
【００６７】Ｃｄｃ１４ファミリー
二重特異性ホスファターゼのＣｄｃ１４ファミリーは，そのメンバーであるＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＣｄｃ１４ホスファタ
ーゼが細胞サイクルの有糸分裂の出口経路の制御において鍵となる役割を果たす
酵素であることが見いだされた後に命名された。２つの哺乳動物Ｃｄｃ１４ホス
ファターゼ，すなわちＣｄｃ１４Ａ１（ＡＦ０６４１０２）およびＣｄｃ１４Ｂ
１（ＡＦ０６４１０５）が知られている。これらのホスファターゼの触媒ドメイ
ン（それぞれ１３８および１３５アミノ酸の長さ）は，７２％の配列同一性を示
す。触媒領域を挟むものは，比較的長いＮ−末端（それぞれＣｄｃ１４Ａ１およ
びＣｄｃ１４Ｂｌ中で１９５および２３０アミノ酸）およびＣ−末端ドメイン（
それぞれＣｄｃ１４Ａ１およびＣｄｃ１４Ｂ１中で２９１および１３２アミノ酸
）である。Ｃｄｃ１４のＮ−末端ドメインは，ヒトの間ならびに進化的に遠いホ
モログとの間で高度に保存されているようであり，それぞれヒトＣｄｃ１４Ｂ１
，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｕ２８７３９）および酵母（Ｑ００６８４）Ｃｄｃ１４
に対して，１７８，１９３および１９３アミノ酸にわたり６５％，４１％および
３５％の配列同一性を示す。Ｃｄｃ１４のＣ−末端ドメインは，Ｎ−末端ドメイ
ンより低いレベルの配列保存性を示し，ヒトＣｄｃ１４Ａ１とＣｄｃ１４Ｂ１の
間で１５１アミノ酸にわたり３５％の同一性を示し，酵母およびＣ．ｅｌｅｇａ
ｎｓのＣｄｃ１４からの同等の領域に対しては検出可能なホモロジーは示さない
。Ｃｄｃ１４の高度に保存されたＮ−末端ドメインの機能的重要性は不明である
が，このドメインが活性を制御する蛋白質−蛋白質相互作用ならびにＣｄｃ１４
の細胞内分布に関与している可能性がある。この点については以下に記載する。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＣｄｃ１４ホスファタ
ーゼが細胞サイクルの有糸分裂の出口経路の制御において鍵となる役割を果たす
酵素であることが見いだされた後に命名された。２つの哺乳動物Ｃｄｃ１４ホス
ファターゼ，すなわちＣｄｃ１４Ａ１（ＡＦ０６４１０２）およびＣｄｃ１４Ｂ
１（ＡＦ０６４１０５）が知られている。これらのホスファターゼの触媒ドメイ
ン（それぞれ１３８および１３５アミノ酸の長さ）は，７２％の配列同一性を示
す。触媒領域を挟むものは，比較的長いＮ−末端（それぞれＣｄｃ１４Ａ１およ
びＣｄｃ１４Ｂｌ中で１９５および２３０アミノ酸）およびＣ−末端ドメイン（
それぞれＣｄｃ１４Ａ１およびＣｄｃ１４Ｂ１中で２９１および１３２アミノ酸
）である。Ｃｄｃ１４のＮ−末端ドメインは，ヒトの間ならびに進化的に遠いホ
モログとの間で高度に保存されているようであり，それぞれヒトＣｄｃ１４Ｂ１
，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｕ２８７３９）および酵母（Ｑ００６８４）Ｃｄｃ１４
に対して，１７８，１９３および１９３アミノ酸にわたり６５％，４１％および
３５％の配列同一性を示す。Ｃｄｃ１４のＣ−末端ドメインは，Ｎ−末端ドメイ
ンより低いレベルの配列保存性を示し，ヒトＣｄｃ１４Ａ１とＣｄｃ１４Ｂ１の
間で１５１アミノ酸にわたり３５％の同一性を示し，酵母およびＣ．ｅｌｅｇａ
ｎｓのＣｄｃ１４からの同等の領域に対しては検出可能なホモロジーは示さない
。Ｃｄｃ１４の高度に保存されたＮ−末端ドメインの機能的重要性は不明である
が，このドメインが活性を制御する蛋白質−蛋白質相互作用ならびにＣｄｃ１４
の細胞内分布に関与している可能性がある。この点については以下に記載する。
【００６８】
酵母における研究は，Ｃｄｃ１４がサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の不
活性化を介して有糸分裂の出口経路の制御に関与することを示唆する（Ｖｉｓｉ
ｎｔｉｎＲ，ｅｔ ａｌ．ＭｏｌＣｅｌｌ．（１９９８）２：７０９−７１８）
。Ｃｄｃ１４は，ＲＥＮＴ（核小体サイレンシングおよび終期の制御剤）と称さ
れる，蛋白質Ｎｅｔｌ（Ｃｆｉとも称される）およびＳｉｒ２を含む核小体蛋白
質複合体の一部である。Ｇ１から後期の間，Ｃｄｃ１４は核小体中に隔離されて
見いだされ，ここで，その酵素活性はＮｅｔｌにより阻害される。後期の終わり
に，Ｃｄｃ１４はＧＴＰａｓｅＴｅｍｌに依存する工程でＲＥＮＴ複合体から解
離する（Ｓｈｏｕ Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ １６：２３３−４
４）。放出されたＣｄｃ１４は，核に再局在し，ここで有糸分裂ＣＤＫを活性化
する。
活性化を介して有糸分裂の出口経路の制御に関与することを示唆する（Ｖｉｓｉ
ｎｔｉｎＲ，ｅｔ ａｌ．ＭｏｌＣｅｌｌ．（１９９８）２：７０９−７１８）
。Ｃｄｃ１４は，ＲＥＮＴ（核小体サイレンシングおよび終期の制御剤）と称さ
れる，蛋白質Ｎｅｔｌ（Ｃｆｉとも称される）およびＳｉｒ２を含む核小体蛋白
質複合体の一部である。Ｇ１から後期の間，Ｃｄｃ１４は核小体中に隔離されて
見いだされ，ここで，その酵素活性はＮｅｔｌにより阻害される。後期の終わり
に，Ｃｄｃ１４はＧＴＰａｓｅＴｅｍｌに依存する工程でＲＥＮＴ複合体から解
離する（Ｓｈｏｕ Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ １６：２３３−４
４）。放出されたＣｄｃ１４は，核に再局在し，ここで有糸分裂ＣＤＫを活性化
する。
【００６９】
Ｃｄｃ１４媒介性ＣＤＫ不活性化は，２つのメカニズムを介して生ずると考え
ら得ている。第１に，ユビキチン依存性蛋白質分解系ＡＰＣ（後期−促進複合体
）は，ＣＤＫ活性に通常必要な有糸分裂Ｃｌｂサイクリンを分解する。Ｃｄｃ１
４は，ＡＰＣ特異的因子Ｃｄｈｌ．２（Ｈｃｔｌとも称される）を脱リン酸化す
ることによりＣｌｂの分解を促進する。第２に，キナーゼ阻害剤であるＳｉｃｌ
はＣＤＫに結合し，その活性を阻害する。Ｃｄｃ１４はＳｉｃｌ転写因子Ｓｗｉ
５を脱リン酸化することによりＳｉｃｌ転写を活性化する。さらに，Ｃｄｃ１４
は，Ｓｉｃ１蛋白質を脱リン酸化することによりその安定性を増強する（Ｖｉｓ
ｉｎｔｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：８１８−２
３）。
ら得ている。第１に，ユビキチン依存性蛋白質分解系ＡＰＣ（後期−促進複合体
）は，ＣＤＫ活性に通常必要な有糸分裂Ｃｌｂサイクリンを分解する。Ｃｄｃ１
４は，ＡＰＣ特異的因子Ｃｄｈｌ．２（Ｈｃｔｌとも称される）を脱リン酸化す
ることによりＣｌｂの分解を促進する。第２に，キナーゼ阻害剤であるＳｉｃｌ
はＣＤＫに結合し，その活性を阻害する。Ｃｄｃ１４はＳｉｃｌ転写因子Ｓｗｉ
５を脱リン酸化することによりＳｉｃｌ転写を活性化する。さらに，Ｃｄｃ１４
は，Ｓｉｃ１蛋白質を脱リン酸化することによりその安定性を増強する（Ｖｉｓ
ｉｎｔｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：８１８−２
３）。
【００７０】
１５４アミノ酸の部分ネズミＡＡ０２３０７３（配列番号２）は，ホヤ類の生
物であるｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓからの推定オープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）であるＺ８３７６０と最も近いと考えられ，触媒ドメイン
に対応する５９アミノ酸にわたり６８％の同一性を有する。ＡＡ０２３０７３に
次に近いホモログは，ヒトＣｄｃ１４Ｂ２（ＡＦ０６４１０５）であると考えら
れ，６５アミノ酸にわたり４０％の同一性を有する。ＡＡ０２３０７３は，触媒
システインを含む，二重特異性ホスファターゼの保存された特徴を有する。
物であるｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓからの推定オープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）であるＺ８３７６０と最も近いと考えられ，触媒ドメイン
に対応する５９アミノ酸にわたり６８％の同一性を有する。ＡＡ０２３０７３に
次に近いホモログは，ヒトＣｄｃ１４Ｂ２（ＡＦ０６４１０５）であると考えら
れ，６５アミノ酸にわたり４０％の同一性を有する。ＡＡ０２３０７３は，触媒
システインを含む，二重特異性ホスファターゼの保存された特徴を有する。
【００７１】
ネズミＡＡ０２３０７３のヒトオルトログは，ＥＳＴ ＡＦ０８６５５３の形
で存在し，ＡＡ０２３０７３と１１５アミノ酸にわたり９４％のアミノ酸配列同
一性を有する。ＡＡ０２３０７３によりコードされる推定ホスファターゼは，触
媒的に活性なホスファターゼであると推定される。Ｃｄｃ１４に対するそのホモ
ロジーに基づけば，ＡＡ０２３０７３は，有糸分裂の制御において機能するかも
しれない。
で存在し，ＡＡ０２３０７３と１１５アミノ酸にわたり９４％のアミノ酸配列同
一性を有する。ＡＡ０２３０７３によりコードされる推定ホスファターゼは，触
媒的に活性なホスファターゼであると推定される。Ｃｄｃ１４に対するそのホモ
ロジーに基づけば，ＡＡ０２３０７３は，有糸分裂の制御において機能するかも
しれない。
【００７２】ＭＫＰファミリー
二重特異性ホスファターゼのＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）ファミ
リーは，ＭＡＰキナーゼ経路の負のフィードバック制御において中枢的な役割を
果たす重要な一群の酵素を規定する。ホスファターゼのこのファミリーは，１１
個のファミリーメンバーを有し，追加のホモログは本明細書に記載される。既知
のＭＫＰに含まれるものは，ＤＵＳ１（ＭＰＫ−１，ＣＬ１００，ＰＴＰＮ−１
０，ｅｒｐ，ＶＨ１または３ＣＨ１３４としても知られる），ＤＵＳ３（ＶＨＲ
としても知られる），ＤＵＳ４（ＨＶＨ２，ＴＹＰ１，ＭＫＰ２またはＶＨ２と
しても知られる），ＤＵＳ５（ＨＶＨ３，Ｂ２３，ＶＨ３としても知られる），
ＤＵＳ６（ＰＹＳＴ１，ＭＫＰ３，ｒＶＨ６としても知られる），ＤＵＳ７（Ｐ
ＹＳＴ２としても知られる），ＣＤＫＮ３（ＣＤＫＮ３，ＫＡＰ，ＣＩＰ２また
はＣＤＩ１としても知られる），ＶＨ５およびＳＴＹＸである。
リーは，ＭＡＰキナーゼ経路の負のフィードバック制御において中枢的な役割を
果たす重要な一群の酵素を規定する。ホスファターゼのこのファミリーは，１１
個のファミリーメンバーを有し，追加のホモログは本明細書に記載される。既知
のＭＫＰに含まれるものは，ＤＵＳ１（ＭＰＫ−１，ＣＬ１００，ＰＴＰＮ−１
０，ｅｒｐ，ＶＨ１または３ＣＨ１３４としても知られる），ＤＵＳ３（ＶＨＲ
としても知られる），ＤＵＳ４（ＨＶＨ２，ＴＹＰ１，ＭＫＰ２またはＶＨ２と
しても知られる），ＤＵＳ５（ＨＶＨ３，Ｂ２３，ＶＨ３としても知られる），
ＤＵＳ６（ＰＹＳＴ１，ＭＫＰ３，ｒＶＨ６としても知られる），ＤＵＳ７（Ｐ
ＹＳＴ２としても知られる），ＣＤＫＮ３（ＣＤＫＮ３，ＫＡＰ，ＣＩＰ２また
はＣＤＩ１としても知られる），ＶＨ５およびＳＴＹＸである。
【００７３】
構造的に，ＭＫＰは，２つのドメイン，すなわちＮ−およびＣ−末端触媒ドメ
インから構成される。Ｎ−末端ドメインは，約１４７−約２０６アミノ酸の範囲
のサイズであり，種々のファミリーメンバー間で限定されたホモロジー（２８−
４７％）を示す。ＭＫＰのＮ−末端領域は，ＣＨ２ドメインと称されるホモロジ
ーの２つのポケットならびに１２６アミノ酸のローダナーゼ様モチーフを特徴と
する。これらの特徴は，Ｃｄｃ２５ホスファターゼで保存されており，未知の機
能を果たす。ＭＫＰファミリーのメンバーの触媒ドメインは，そのサイズが約１
４７から約２０６アミノ酸まで様々であり，４０−７４％のアミノ酸配列同一性
を示す。
インから構成される。Ｎ−末端ドメインは，約１４７−約２０６アミノ酸の範囲
のサイズであり，種々のファミリーメンバー間で限定されたホモロジー（２８−
４７％）を示す。ＭＫＰのＮ−末端領域は，ＣＨ２ドメインと称されるホモロジ
ーの２つのポケットならびに１２６アミノ酸のローダナーゼ様モチーフを特徴と
する。これらの特徴は，Ｃｄｃ２５ホスファターゼで保存されており，未知の機
能を果たす。ＭＫＰファミリーのメンバーの触媒ドメインは，そのサイズが約１
４７から約２０６アミノ酸まで様々であり，４０−７４％のアミノ酸配列同一性
を示す。
【００７４】
ほとんどのＭＫＰホスファターゼは，ＭＡＰＫ経路に関与する脱リン酸化反応
キナーゼを介して不活性化することができる。ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナ
ーゼ），ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ／ストレス活性化蛋
白質キナーゼ）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は，細胞外リガンドに応答する
細胞分裂，分化またはアポトーシスを担うシグナル伝達事象を媒介する（Ｃｏｂ
ｂ Ｍ．Ｈ．，Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．（１９９９）７
１：４７９−５００）。完全なＭＡＰキナーゼの酵素的活性化には，ＭＡＰキナ
ーゼの活性化ループ中に存在するトレオニンおよびチロシン残基の選択的な上流
の二重特異性キナーゼによるリン酸化が同時に生ずることが必要である。ＭＫＰ
ファミリーの二重特異性ホスファターゼは，これらのトレオニンおよびチロシン
残基を脱リン酸化することにより，ＭＡＰキナーゼ不活性化を媒介する。このメ
カニズムは，ＭＡＰキナーゼ経路に負のフィードバック制御を提供する。
キナーゼを介して不活性化することができる。ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナ
ーゼ），ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ／ストレス活性化蛋
白質キナーゼ）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は，細胞外リガンドに応答する
細胞分裂，分化またはアポトーシスを担うシグナル伝達事象を媒介する（Ｃｏｂ
ｂ Ｍ．Ｈ．，Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．（１９９９）７
１：４７９−５００）。完全なＭＡＰキナーゼの酵素的活性化には，ＭＡＰキナ
ーゼの活性化ループ中に存在するトレオニンおよびチロシン残基の選択的な上流
の二重特異性キナーゼによるリン酸化が同時に生ずることが必要である。ＭＫＰ
ファミリーの二重特異性ホスファターゼは，これらのトレオニンおよびチロシン
残基を脱リン酸化することにより，ＭＡＰキナーゼ不活性化を媒介する。このメ
カニズムは，ＭＡＰキナーゼ経路に負のフィードバック制御を提供する。
【００７５】
ＭＫＰは，細胞トランスフォーメーションに関与するＭＡＰキナーゼカスケー
ドを減弱化させることにより，ヒト癌において重要な役割を果たすかもしれない
。
ドを減弱化させることにより，ヒト癌において重要な役割を果たすかもしれない
。
【００７６】
多数のＭＡＰキナーゼならびにＭＫＰが存在するのであれば，中心となる疑問
は，ＭＫＰによるキナーゼ基質認識には選択性があるか否かである。そのような
特異性が存在するという証拠はＤＵＳ−６（ＭＫＰ−３）およびＶＨ５により提
供され，これらはそれぞれＥＲＫまたはＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８ＭＡＰキ
ナーゼに対する高い選択性のホスファターゼであることが示されている（Ｍｕｄ
ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２７２
０５−８）。別のレベルの基質特異性は，核ではなくもっぱらサイトゾルに見い
だされるＤＵＳ−６（ＭＫＰ−３）により示されるように準細胞コンパートメン
ト化から来る（Ｇｒｏｏｍ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．
１５：３６２１−３６３２）。さらなる選択性は，発現の組織特異性のレベルで
生じうる（Ｍｕｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２：５１４１−５１５１）。
は，ＭＫＰによるキナーゼ基質認識には選択性があるか否かである。そのような
特異性が存在するという証拠はＤＵＳ−６（ＭＫＰ−３）およびＶＨ５により提
供され，これらはそれぞれＥＲＫまたはＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８ＭＡＰキ
ナーゼに対する高い選択性のホスファターゼであることが示されている（Ｍｕｄ
ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２７２
０５−８）。別のレベルの基質特異性は，核ではなくもっぱらサイトゾルに見い
だされるＤＵＳ−６（ＭＫＰ−３）により示されるように準細胞コンパートメン
ト化から来る（Ｇｒｏｏｍ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．
１５：３６２１−３６３２）。さらなる選択性は，発現の組織特異性のレベルで
生じうる（Ｍｕｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２：５１４１−５１５１）。
【００７７】
ＭＫＰは，その系統発生論的分布において偏在しているようである。これは，
多数のメンバーを有するそのＭＡＰキナーゼ対応物が，酵母（例えばＹＶＨ１）
，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（例えばＹ０４２），ショウジョウバエ（例えばｐｕｃｋ
ｅｒｅｄ），植物（例えばＤｓＰＴＰｌ）および哺乳動物において存在するため
である。異なる種から単離されたＭＫＰの主要な作用モードはＭＡＰＫ脱リン酸
化であるようであり，このことによりＭＡＰＫシグナル伝達経路に対して負のフ
ィードバックを与えている。
多数のメンバーを有するそのＭＡＰキナーゼ対応物が，酵母（例えばＹＶＨ１）
，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（例えばＹ０４２），ショウジョウバエ（例えばｐｕｃｋ
ｅｒｅｄ），植物（例えばＤｓＰＴＰｌ）および哺乳動物において存在するため
である。異なる種から単離されたＭＫＰの主要な作用モードはＭＡＰＫ脱リン酸
化であるようであり，このことによりＭＡＰＫシグナル伝達経路に対して負のフ
ィードバックを与えている。
【００７８】
低酸素条件下でＭＫＰ−１遺伝子発現が誘導されることにより示唆されるよう
に，ＭＫＰは病態生理学的低酸素症の間に重要な役割を果たすかもしれない（Ｌ
ａｄｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：
１２８９０−１２８９７）。腫瘍低酸素症は，悪性腫瘍の進行の間の脈管形成の
開始と直接連鎖している（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅ
ｌｌ ８６：３５３−３６４およびＭａｚｕｒｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９
９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４３６−３４４０）。多くの遺伝子が低
酸素状態の間に誘導されることが見いだされている。例えば，熱ショック転写因
子−１（ＨＳＦ−１）（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６２６３−６２６７），ｃ−ｆ
ｏｓおよびｃ−ｊｕｎ（Ａｕｓｓｅｒｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−５０４２，およびＭｕｌｌｅｒ
，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２３４３５−２３４
３９）および低酸素症誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：６０９−６１６）
。ＭＫＰ−１の転写産物および蛋白質は，初期癌腫ならびに乳癌および前立腺癌
腫の多くの段階においてアップレギュレートされることが示されている（例えば
，Ｌｅａｖ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：３６
１−３７０）。癌における増強されたＭＫＰ−１発現の役割は解明されていない
。低酸素状態はＪＮＫ経路の活性化を介してアポトーシスの引き金となり（Ｉｐ
，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１０：２０５−２１９に概説），ＭＡＰＫホスファターゼはこの経路に負のフ
ィードバックを与えるることが知られているため，ＭＫＰ−１はアポトーシスを
妨害することにより腫瘍成長を支持すると考えられる。ＭＡＰＫホスファターゼ
によるＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２の脱リン酸化および続く不活性化もまた，ア
ンギオスタチンによる脈管形成血管内皮細胞増殖の抑制を担うかもしれない（Ｒ
ｅｄｌｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ３６：２８
３４）。
に，ＭＫＰは病態生理学的低酸素症の間に重要な役割を果たすかもしれない（Ｌ
ａｄｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：
１２８９０−１２８９７）。腫瘍低酸素症は，悪性腫瘍の進行の間の脈管形成の
開始と直接連鎖している（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅ
ｌｌ ８６：３５３−３６４およびＭａｚｕｒｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９
９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４３６−３４４０）。多くの遺伝子が低
酸素状態の間に誘導されることが見いだされている。例えば，熱ショック転写因
子−１（ＨＳＦ−１）（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６２６３−６２６７），ｃ−ｆ
ｏｓおよびｃ−ｊｕｎ（Ａｕｓｓｅｒｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−５０４２，およびＭｕｌｌｅｒ
，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２３４３５−２３４
３９）および低酸素症誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：６０９−６１６）
。ＭＫＰ−１の転写産物および蛋白質は，初期癌腫ならびに乳癌および前立腺癌
腫の多くの段階においてアップレギュレートされることが示されている（例えば
，Ｌｅａｖ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：３６
１−３７０）。癌における増強されたＭＫＰ−１発現の役割は解明されていない
。低酸素状態はＪＮＫ経路の活性化を介してアポトーシスの引き金となり（Ｉｐ
，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１０：２０５−２１９に概説），ＭＡＰＫホスファターゼはこの経路に負のフ
ィードバックを与えるることが知られているため，ＭＫＰ−１はアポトーシスを
妨害することにより腫瘍成長を支持すると考えられる。ＭＡＰＫホスファターゼ
によるＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２の脱リン酸化および続く不活性化もまた，ア
ンギオスタチンによる脈管形成血管内皮細胞増殖の抑制を担うかもしれない（Ｒ
ｅｄｌｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ３６：２８
３４）。
【００７９】
本発明のＭＫＰホスファターゼは，その主要な機能としてＭＡＰＫシグナル伝
達の負のフィードバック制御を有するかもしれない。既知のＭＫＰの間では，作
用のメカニズムにおける基質認識のレベルでの選択性，細胞内分布および組織分
布の先例があるため，記載されるＭＫＰは，同様の選択性を示すかもしれない。
ＭＫＰはまた，脈管形成性腫瘍において生ずるような病理学的低酸素症の間にＪ
ＮＫ／ＳＡＰＫ経路を妨害することにより，アポトーシスの抑制に役割を果たす
かもしれない。抗アポトーシスＭＫＰを標的とする特異的ホスファターゼ阻害剤
の開発は，癌治療の方法として価値があることが判明するであろう。
達の負のフィードバック制御を有するかもしれない。既知のＭＫＰの間では，作
用のメカニズムにおける基質認識のレベルでの選択性，細胞内分布および組織分
布の先例があるため，記載されるＭＫＰは，同様の選択性を示すかもしれない。
ＭＫＰはまた，脈管形成性腫瘍において生ずるような病理学的低酸素症の間にＪ
ＮＫ／ＳＡＰＫ経路を妨害することにより，アポトーシスの抑制に役割を果たす
かもしれない。抗アポトーシスＭＫＰを標的とする特異的ホスファターゼ阻害剤
の開発は，癌治療の方法として価値があることが判明するであろう。
【００８０】
ＳＧＰ０３３（ＡＡ配列番号２６）によりコードされる１７６アミノ酸のヒト
蛋白質は，既知のヒト二重特異性ホスファターゼＭＫＰ１様（ＮＰ＿００８９５
７）と５０％の同一性を有する。これは反復ＤＮＡの２つの領域を有する（３２
３−３４１，５４１−５５９，図１）。ＳＧＰ０３３（ＡＡ配列番号２６）は，
ヒト染色体領域２ｑ３３−ｑ３７．２にマップされている。
蛋白質は，既知のヒト二重特異性ホスファターゼＭＫＰ１様（ＮＰ＿００８９５
７）と５０％の同一性を有する。これは反復ＤＮＡの２つの領域を有する（３２
３−３４１，５４１−５５９，図１）。ＳＧＰ０３３（ＡＡ配列番号２６）は，
ヒト染色体領域２ｑ３３−ｑ３７．２にマップされている。
【００８１】
１６３アミノ酸のネズミ蛋白質ＡＡ０３０３２２（ＡＡ配列番号０４）は，ヒ
トＭＫＰ１様ホスファターゼＮＰ＿００８９５７と３１％の同一性を有する。こ
れは，ヒトＳＧＰ０３３（ＡＡ配列番号２６）のネズミオルトログであり，１５
８アミノ酸の重複部位について８０％の同一性を有する。ＡＡ０３０３２２（Ｎ
Ａ配列番号０３）はヌクレオチド位置９５−１１４に反復領域を含む。
トＭＫＰ１様ホスファターゼＮＰ＿００８９５７と３１％の同一性を有する。こ
れは，ヒトＳＧＰ０３３（ＡＡ配列番号２６）のネズミオルトログであり，１５
８アミノ酸の重複部位について８０％の同一性を有する。ＡＡ０３０３２２（Ｎ
Ａ配列番号０３）はヌクレオチド位置９５−１１４に反復領域を含む。
【００８２】
１８４アミノ酸の全長ヒト遺伝子ＡＡ３７４７５３（ＡＡ配列番号１２）は，
二重特異性ホスファターゼＣＧ１００８９（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎ
ｏｇａｓｔｅｒの遺伝子産物）と５６％のアミノ酸同一性を有する。この遺伝子
は，胎児脳，精巣および胸腺において発現されている。１８４アミノ酸の遺伝子
ＡＡ１０３５９５（ＡＡ配列番号６）は，ヒトＡＡ３７４７５３（ＡＡ配列番号
１２）のネズミオルトログであり，１８４アミノ酸にわたり９４％の同一性を有
する
二重特異性ホスファターゼＣＧ１００８９（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎ
ｏｇａｓｔｅｒの遺伝子産物）と５６％のアミノ酸同一性を有する。この遺伝子
は，胎児脳，精巣および胸腺において発現されている。１８４アミノ酸の遺伝子
ＡＡ１０３５９５（ＡＡ配列番号６）は，ヒトＡＡ３７４７５３（ＡＡ配列番号
１２）のネズミオルトログであり，１８４アミノ酸にわたり９４％の同一性を有
する
【００８３】
１９８アミノ酸の全長ヒトＬＯＣ５１２０７（ＡＡ配列番号１８）は，公開さ
れた配列ＤＵＳ１３の蛋白質ホスファターゼＮＰ＿０５７４４８［Ｈｏｍｏ ｓ
ａｐｉｅｎｓ］と密接に関連しており，１９８アミノ酸にわたり９９％の同一性
を有する。ＬＯＣ５１２０７は，ヒト染色体１０ｑ２１．３にマップされる。１
９８アミノ酸の全長ネズミＡＡ１４４７０５（ＡＡ配列番号０８）は１９８アミ
ノ酸の全長ヒトＬＯＣ５１２０７（ＡＡ配列番号１８）のネズミオルトログであ
り，１９８アミノ酸にわたり８８％の同一性を有する。
れた配列ＤＵＳ１３の蛋白質ホスファターゼＮＰ＿０５７４４８［Ｈｏｍｏ ｓ
ａｐｉｅｎｓ］と密接に関連しており，１９８アミノ酸にわたり９９％の同一性
を有する。ＬＯＣ５１２０７は，ヒト染色体１０ｑ２１．３にマップされる。１
９８アミノ酸の全長ネズミＡＡ１４４７０５（ＡＡ配列番号０８）は１９８アミ
ノ酸の全長ヒトＬＯＣ５１２０７（ＡＡ配列番号１８）のネズミオルトログであ
り，１９８アミノ酸にわたり８８％の同一性を有する。
【００８４】
２１７アミノ酸の全長ヒトＡＩ０３１６５６（ＡＡ配列番号２８）は，推定Ｏ
ＲＦ ＡＡＦ６７１８７，ＭＡＰキナーゼホスファターゼ−１［Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ］に最も近く，７８アミノ酸にわたり４１％
の同一性を有する。発現は腫瘍試料において正常試料より高い。２２０アミノ酸
のネズミＡＡ２７４４５７（ＡＡ配列番号１０）は，２１７アミノ酸のヒトＡＩ
０３１６５６（ＡＡ配列番号２８）と密接に関連しており，２１２アミノ酸にわ
たり８４％の同一性を有する。
ＲＦ ＡＡＦ６７１８７，ＭＡＰキナーゼホスファターゼ−１［Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ］に最も近く，７８アミノ酸にわたり４１％
の同一性を有する。発現は腫瘍試料において正常試料より高い。２２０アミノ酸
のネズミＡＡ２７４４５７（ＡＡ配列番号１０）は，２１７アミノ酸のヒトＡＩ
０３１６５６（ＡＡ配列番号２８）と密接に関連しており，２１２アミノ酸にわ
たり８４％の同一性を有する。
【００８５】
ＮＡ配列番号２９は，染色体ｌｑ３２．１にマップされ，ヌクレオチド１０２
−１５２の間に反復領域を有する。２１８アミノ酸のネズミＡＡ３９６４２８（
ＡＡ配列番号１４）は，４８２アミノ酸のヒトＭＫＰ５（ＡＡ配列番号３０）に
最も近く，１５４アミノ酸にわたり９５％の同一性を有する。これはネズミＭＫ
Ｐ５である。
−１５２の間に反復領域を有する。２１８アミノ酸のネズミＡＡ３９６４２８（
ＡＡ配列番号１４）は，４８２アミノ酸のヒトＭＫＰ５（ＡＡ配列番号３０）に
最も近く，１５４アミノ酸にわたり９５％の同一性を有する。これはネズミＭＫ
Ｐ５である。
【００８６】
３４０アミノ酸のヒトＹＶＨ１（ＡＡ９２３１５８，ＡＡ配列番号２４）は，
３４０アミノ酸の公開された配列ＮＰ＿００９１７１と同一である。この遺伝子
は，染色体位置ｌｑ２１−ｑ２２にマップされる。３３９アミノ酸のネズミＡＡ
４２２６６１（ＡＡ配列番号１６）は，３４０アミノ酸のヒトＹＶＨ１（ＡＡ配
列番号２４）と最も近く，３３９アミノ酸にわたり８４％の同一性を有する。
３４０アミノ酸の公開された配列ＮＰ＿００９１７１と同一である。この遺伝子
は，染色体位置ｌｑ２１−ｑ２２にマップされる。３３９アミノ酸のネズミＡＡ
４２２６６１（ＡＡ配列番号１６）は，３４０アミノ酸のヒトＹＶＨ１（ＡＡ配
列番号２４）と最も近く，３３９アミノ酸にわたり８４％の同一性を有する。
【００８７】
１９０アミノ酸のヒト遺伝子ＡＡ８１３１２３（ＡＡ配列番号２０）は，１９
０アミノ酸にわたり，公開された配列ＡＡＤ３３９１０，ＭＫＰ様蛋白質ホスフ
ァターゼ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］と９５％同一である。ＡＡ８１３１２３
（ＮＡ配列番号１９）は，２つの反復領域（１１−２８；１８７−２０４）を有
し，遺伝子はヒト染色体位置Ｘｐ１１．４−ｑ１２にマップされる。
０アミノ酸にわたり，公開された配列ＡＡＤ３３９１０，ＭＫＰ様蛋白質ホスフ
ァターゼ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］と９５％同一である。ＡＡ８１３１２３
（ＮＡ配列番号１９）は，２つの反復領域（１１−２８；１８７−２０４）を有
し，遺伝子はヒト染色体位置Ｘｐ１１．４−ｑ１２にマップされる。
【００８８】
１８８アミノ酸のヒト遺伝子ＡＡ９１５９３２（ＡＡ配列番号２２）は，公開
された配列ＮＰ＿００８９５７，ＭＫＰ−１様［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］と
５０％同一である。ＤＮＡ配列（ＮＡ配列番号２１）は位置４１０−４２７に反
復領域を有し，遺伝子はヒト染色体２２ｑ１２．１−ｑｔｅｒにマップされる。
された配列ＮＰ＿００８９５７，ＭＫＰ−１様［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］と
５０％同一である。ＤＮＡ配列（ＮＡ配列番号２１）は位置４１０−４２７に反
復領域を有し，遺伝子はヒト染色体２２ｑ１２．１−ｑｔｅｒにマップされる。
【００８９】
ＮＰ＿０６０７４６は配列９１５−９３８に反復領域を有する。これはヒト染
色体１１ｑ１２−ｑ１３．２にマップされ，胎児脳および精巣で高レベルで発現
される。
色体１１ｑ１２−ｑ１３．２にマップされ，胎児脳および精巣で高レベルで発現
される。
【００９０】ＭＴＭファミリー
ＭＴＭは，ホスホセリンおよびホスホチロシン残基を脱リン酸化しうることが
示されている（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１７０３−１７１２）。構造的に，
ＭＴＭは，哺乳動物，酵母およびｅｌｅｇａｎｓＭＴＭの間で，それぞれ２５０
−４００および５０−３００の範囲のサイズのＮ−末端およびＣ−末端ドメイン
に挟まれた中心の２００アミノ酸の触媒領域から構成される。Ｓｂｆｌは，ＭＴ
Ｍと類似のドメイン構造を有するが，ただし，その２００アミノ酸の中心ＭＴＭ
触媒様領域は，はるかに長いＮ−末端ドメイン（１１６０アミノ酸）および同様
のサイズのＣ−末端ドメイン（３３５アミノ酸）により挟まれている。ＭＴＭフ
ァミリーメンバー（Ｓｂｆｌを含む）の中では，Ｎ−およびＣ−末端ドメインは
，それぞれ２個または１個のホモロジーのポケットを有する。保存領域の機能的
役割は不明である。ＭＴＭならびにＳｂｆｌのいずれにも推定貫膜ドメインが欠
失していることは，これらの蛋白質が細胞内環境に局在し，機能していることを
示唆する。すべての既知のヒトＭＴＭの組織分布は偏在しているが，ただしＭＴ
ＭＲ７は脳に制限されているようである（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（
１９９８）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１７０３−１７１２）。
示されている（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１７０３−１７１２）。構造的に，
ＭＴＭは，哺乳動物，酵母およびｅｌｅｇａｎｓＭＴＭの間で，それぞれ２５０
−４００および５０−３００の範囲のサイズのＮ−末端およびＣ−末端ドメイン
に挟まれた中心の２００アミノ酸の触媒領域から構成される。Ｓｂｆｌは，ＭＴ
Ｍと類似のドメイン構造を有するが，ただし，その２００アミノ酸の中心ＭＴＭ
触媒様領域は，はるかに長いＮ−末端ドメイン（１１６０アミノ酸）および同様
のサイズのＣ−末端ドメイン（３３５アミノ酸）により挟まれている。ＭＴＭフ
ァミリーメンバー（Ｓｂｆｌを含む）の中では，Ｎ−およびＣ−末端ドメインは
，それぞれ２個または１個のホモロジーのポケットを有する。保存領域の機能的
役割は不明である。ＭＴＭならびにＳｂｆｌのいずれにも推定貫膜ドメインが欠
失していることは，これらの蛋白質が細胞内環境に局在し，機能していることを
示唆する。すべての既知のヒトＭＴＭの組織分布は偏在しているが，ただしＭＴ
ＭＲ７は脳に制限されているようである（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（
１９９８）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１７０３−１７１２）。
【００９１】
これに対し，Ｓｂｆｌに代表される二重特異性ホスファターゼのＭＴＭファミ
リーの重要なサブクラスは，酵素的に不活性であり，生物学的にはその発癌可能
性を担うかもしれない活性である抗ホスファターゼとして機能するかもしれない
（Ｃｕｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １
８：３３１−３３７）。Ｓｂｆｌは，触媒に必要な特徴的な保存ＨＣＳＤＧＷモ
チーフを欠失しており，そのかわり，配列ＧＬＥＤＧＷを有する。さらに，Ｓｂ
ｆｌは，ＧＬＥＤＧＷモチーフのＣ−末端の６８−９２残基の間に位置するヘリ
ックス−ターン−ヘリックス領域を含む。このモチーフは，ＳｂｆｌとＳＥＴ結
合因子，例えばプロトオンコジンＨｒｘ（ショウジョウバエのｔｒｉｔｈｏｒａ
ｘ（Ｔｒｘ）の哺乳動物ホモログ）との間の相互作用を媒介するＳＩＤ（ＳＥＴ
蛋白質相互作用ドメイン）ドメインを規定する。ＳＥＴ（Ｓｕｖａｒ３−９，ｚ
ｅｓｔｅのエンハンサー，Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）−結合因子，例えばヒトＨｒｘ
およびショウジョウバエＴｒｘ，およびｚｅｓｔｅのエンハンサーは，遺伝子制
御に関与する蛋白質である（Ｃｕｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：３３１−３３７）。Ｓｂｆｌによる抗ホスファタ
ーゼ作用のメカニズムは，基質についてＭＴＭとの直接の競合に関与するかもし
れず，あるいは，この蛋白質はリン酸化された蛋白質に対する親和性を有するア
ダプター分子として機能するかもしれない。二重特異性ホスファターゼのＭＴＭ
ファミリーの伝統的な原型はＭＴＭ１（ミオチューブラリン）である。ＭＴＭ１
遺伝子（Ｘｑ２７−ｑ２８）中の変異は，高い新生児死亡をもたらす低張および
呼吸不全を特徴とする重篤な先天性筋疾患であるＸ連鎖筋細管ミオパシー（ＸＬ
ＭＴＭ）の原因である（ＯＭＩＭ３１０４００，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）。
ＭＴＭ１は，酵母［すなわちｓｃＭＴＭＨ，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｚ４９
６１０）］から哺乳動物まで保存されており，ヒトにおいては８個のＭＴＭファ
ミリーメンバーが同定されている（Ｌａｐｏｒｔｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ
Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１９９８ Ｏｃｔ；７（１１）：１７０３−１２）。他の
ヒトＭＴＭ遺伝子が広範な範囲の状態と関連する染色体座に位置するため，ＭＴ
Ｍ変異の病因的因果関係はＭＴＭ１に限定されない。例えば，ヒトＭＴＭＲ２（
ｌｌｑ２２）は，パピヨン−ルフェーヴル症候群（ＰＬＳ）（ＯＭＩＭ２４５０
００）（歯の早期歯周破壊を伴う症候群の座の中にマップされる。ヒトＭＴＭＲ
６（１３ｑ１２）は外胚葉性形成異常（ＯＭＩＭ１２９５００）およびメービウ
ス症候群（ＯＭＩＭ１５７９００）の候補である。さらに，ネズミを用いた研究
においては，種々のヒトＭＴＭ遺伝子の同一染色体上の対応物は，この種類のホ
スファターゼについて別の潜在的な疾病との関連を示す。ヒトＭＴＭＲ３は，マ
ウス変異体ｂｅｌｔｅｄおよびｄｉｌｕｔｉｏｎ−ｐｅｒｕに対応し，ヒトＭＴ
ＭＲ５はｇｒａｙｔｒｅｍｏｒ（ｇｔ）に，ヒトＭＴＭＲ７はｄｉｓｏｒｇａｎ
ｉｚａｔｉｏｎ（ｄｓ）およびｗｏｂｂｌｅｒ−ｌｅｔｈａｌ（ｗｌ）に対応す
る（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ７：１７０３１７１２）。
リーの重要なサブクラスは，酵素的に不活性であり，生物学的にはその発癌可能
性を担うかもしれない活性である抗ホスファターゼとして機能するかもしれない
（Ｃｕｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １
８：３３１−３３７）。Ｓｂｆｌは，触媒に必要な特徴的な保存ＨＣＳＤＧＷモ
チーフを欠失しており，そのかわり，配列ＧＬＥＤＧＷを有する。さらに，Ｓｂ
ｆｌは，ＧＬＥＤＧＷモチーフのＣ−末端の６８−９２残基の間に位置するヘリ
ックス−ターン−ヘリックス領域を含む。このモチーフは，ＳｂｆｌとＳＥＴ結
合因子，例えばプロトオンコジンＨｒｘ（ショウジョウバエのｔｒｉｔｈｏｒａ
ｘ（Ｔｒｘ）の哺乳動物ホモログ）との間の相互作用を媒介するＳＩＤ（ＳＥＴ
蛋白質相互作用ドメイン）ドメインを規定する。ＳＥＴ（Ｓｕｖａｒ３−９，ｚ
ｅｓｔｅのエンハンサー，Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）−結合因子，例えばヒトＨｒｘ
およびショウジョウバエＴｒｘ，およびｚｅｓｔｅのエンハンサーは，遺伝子制
御に関与する蛋白質である（Ｃｕｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：３３１−３３７）。Ｓｂｆｌによる抗ホスファタ
ーゼ作用のメカニズムは，基質についてＭＴＭとの直接の競合に関与するかもし
れず，あるいは，この蛋白質はリン酸化された蛋白質に対する親和性を有するア
ダプター分子として機能するかもしれない。二重特異性ホスファターゼのＭＴＭ
ファミリーの伝統的な原型はＭＴＭ１（ミオチューブラリン）である。ＭＴＭ１
遺伝子（Ｘｑ２７−ｑ２８）中の変異は，高い新生児死亡をもたらす低張および
呼吸不全を特徴とする重篤な先天性筋疾患であるＸ連鎖筋細管ミオパシー（ＸＬ
ＭＴＭ）の原因である（ＯＭＩＭ３１０４００，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）。
ＭＴＭ１は，酵母［すなわちｓｃＭＴＭＨ，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｚ４９
６１０）］から哺乳動物まで保存されており，ヒトにおいては８個のＭＴＭファ
ミリーメンバーが同定されている（Ｌａｐｏｒｔｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ
Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１９９８ Ｏｃｔ；７（１１）：１７０３−１２）。他の
ヒトＭＴＭ遺伝子が広範な範囲の状態と関連する染色体座に位置するため，ＭＴ
Ｍ変異の病因的因果関係はＭＴＭ１に限定されない。例えば，ヒトＭＴＭＲ２（
ｌｌｑ２２）は，パピヨン−ルフェーヴル症候群（ＰＬＳ）（ＯＭＩＭ２４５０
００）（歯の早期歯周破壊を伴う症候群の座の中にマップされる。ヒトＭＴＭＲ
６（１３ｑ１２）は外胚葉性形成異常（ＯＭＩＭ１２９５００）およびメービウ
ス症候群（ＯＭＩＭ１５７９００）の候補である。さらに，ネズミを用いた研究
においては，種々のヒトＭＴＭ遺伝子の同一染色体上の対応物は，この種類のホ
スファターゼについて別の潜在的な疾病との関連を示す。ヒトＭＴＭＲ３は，マ
ウス変異体ｂｅｌｔｅｄおよびｄｉｌｕｔｉｏｎ−ｐｅｒｕに対応し，ヒトＭＴ
ＭＲ５はｇｒａｙｔｒｅｍｏｒ（ｇｔ）に，ヒトＭＴＭＲ７はｄｉｓｏｒｇａｎ
ｉｚａｔｉｏｎ（ｄｓ）およびｗｏｂｂｌｅｒ−ｌｅｔｈａｌ（ｗｌ）に対応す
る（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ７：１７０３１７１２）。
【００９２】
ＭＴＭ１遺伝子中の変異が疾病と関連するという証拠が増えつつある。他のヒ
トＭＴＭ遺伝子が広範な範囲の状態と関連する染色体座に位置するため，ＭＴＭ
変異の病因的因果関係はＭＴＭ１に限定されない。例えば，ヒトＭＴＭＲ２（ｌ
ｌｑ２２）は，パピヨン−ルフェーヴル症候群（ＰＬＳ）（ＯＭＩＭ２４５００
０）（歯の早期歯周破壊を伴う症候群の座の中にマップされる。ヒトＭＴＭＲ６
（１３ｑ１２）は外胚葉性形成異常（ＯＭＩＭ１２９５００）およびメービウス
症候群（ＯＭＩＭ１５７９００）の候補である。さらに，ネズミを用いた研究に
おいては，種々のヒトＭＴＭ遺伝子の同一染色体上の対応物は，この種類のホス
ファターゼについて別の潜在的な疾病との関連を示す。ヒトＭＴＭＲ３は，マウ
ス変異体ｂｅｌｔｅｄおよびｄｉｌｕｔｉｏｎ−ｐｅｒｕ（ｄｐ）に対応し，ヒ
トＭＴＭＲ５はｇｒａｙｔｒｅｍｏｒ（ｇｔ）に，ヒトＭＴＭＲ７はｄｉｓｏｒ
ｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ｄｓ）およびｗｏｂｂｌｅｒ−ｌｅｔｈａｌ（ｗｌ）に
対応する（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１７０３１７１２）。
トＭＴＭ遺伝子が広範な範囲の状態と関連する染色体座に位置するため，ＭＴＭ
変異の病因的因果関係はＭＴＭ１に限定されない。例えば，ヒトＭＴＭＲ２（ｌ
ｌｑ２２）は，パピヨン−ルフェーヴル症候群（ＰＬＳ）（ＯＭＩＭ２４５００
０）（歯の早期歯周破壊を伴う症候群の座の中にマップされる。ヒトＭＴＭＲ６
（１３ｑ１２）は外胚葉性形成異常（ＯＭＩＭ１２９５００）およびメービウス
症候群（ＯＭＩＭ１５７９００）の候補である。さらに，ネズミを用いた研究に
おいては，種々のヒトＭＴＭ遺伝子の同一染色体上の対応物は，この種類のホス
ファターゼについて別の潜在的な疾病との関連を示す。ヒトＭＴＭＲ３は，マウ
ス変異体ｂｅｌｔｅｄおよびｄｉｌｕｔｉｏｎ−ｐｅｒｕ（ｄｐ）に対応し，ヒ
トＭＴＭＲ５はｇｒａｙｔｒｅｍｏｒ（ｇｔ）に，ヒトＭＴＭＲ７はｄｉｓｏｒ
ｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ｄｓ）およびｗｏｂｂｌｅｒ−ｌｅｔｈａｌ（ｗｌ）に
対応する（Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１７０３１７１２）。
【００９３】
本発明において記載されるＭＴＭ様遺伝子の２つ，ヒトＡＡ２３２２３８およ
びＡＡ２５１９２９は，抗ホスファターゼのＳｂｆｌＭＴＭ様ファミリーに属し
ている。これらの遺伝子によりコードされる潜在的ＯＲＦは，二重特異性ホスフ
ァターゼにおいて触媒活性に必要な標準的なＨＣＳモチーフを欠失しているが，
以下に概説するように，ＭＴＭにホモロジーを示す。さらに，ＡＡ２３２３８４
およびＡＡ２５１９２９は，Ｓｂｆｌにおいて見いだされるものと同等の位置に
，ＳＥＴドメイン蛋白質への結合に関与するであろうＳＩＤドメインを有してい
る。第３のＭＴＭ様遺伝子であるヒトＡＡ６６３８７５は，触媒ドメインを欠失
しているが，触媒的ＨＣＳの特徴的なモチーフを含むＭＴＭ様蛋白質（ＣＡＢ３
８７７８．１）のＮ−末端ドメインと強いホモロジーを有する。したがって，Ａ
Ａ６６３８７５は，酵素的に活性なＭＴＭ様ホスファターゼをコードすると推定
される。
びＡＡ２５１９２９は，抗ホスファターゼのＳｂｆｌＭＴＭ様ファミリーに属し
ている。これらの遺伝子によりコードされる潜在的ＯＲＦは，二重特異性ホスフ
ァターゼにおいて触媒活性に必要な標準的なＨＣＳモチーフを欠失しているが，
以下に概説するように，ＭＴＭにホモロジーを示す。さらに，ＡＡ２３２３８４
およびＡＡ２５１９２９は，Ｓｂｆｌにおいて見いだされるものと同等の位置に
，ＳＥＴドメイン蛋白質への結合に関与するであろうＳＩＤドメインを有してい
る。第３のＭＴＭ様遺伝子であるヒトＡＡ６６３８７５は，触媒ドメインを欠失
しているが，触媒的ＨＣＳの特徴的なモチーフを含むＭＴＭ様蛋白質（ＣＡＢ３
８７７８．１）のＮ−末端ドメインと強いホモロジーを有する。したがって，Ａ
Ａ６６３８７５は，酵素的に活性なＭＴＭ様ホスファターゼをコードすると推定
される。
【００９４】
４００アミノ酸の全長ヒトＡＡ２３２３８（配列番号３４）は，ＭＴＭ６（Ａ
Ｆ０７２９２８）およびＭＴＭ１（ＡＦ００２２２３）と最も近いと考えられて
おり，それぞれ１１４および１２６アミノ酸にわたり４３および４２％の配列同
一性を有する。５２アミノ酸の部分ヒトＡＡ２５１９２９（配列番号３６）は，
ヒトＭＴＭ３（Ｕ５８０３４）と最も近いと考えられており，４１アミノ酸にわ
たり４９％の同一性を有する。
Ｆ０７２９２８）およびＭＴＭ１（ＡＦ００２２２３）と最も近いと考えられて
おり，それぞれ１１４および１２６アミノ酸にわたり４３および４２％の配列同
一性を有する。５２アミノ酸の部分ヒトＡＡ２５１９２９（配列番号３６）は，
ヒトＭＴＭ３（Ｕ５８０３４）と最も近いと考えられており，４１アミノ酸にわ
たり４９％の同一性を有する。
【００９５】
１３８アミノ酸の部分ヒトＡＡ６６３８７５（配列番号３８）は，ヒト染色体
Ｘのｑ１１．２−１２（ＣＡＢ３８７７８．１）から推定されたＭＴＭ様ＯＲＦ
と最も近いと考えられており，８９アミノ酸にわたり４８％の同一性を有する。
Ｘのｑ１１．２−１２（ＣＡＢ３８７７８．１）から推定されたＭＴＭ様ＯＲＦ
と最も近いと考えられており，８９アミノ酸にわたり４８％の同一性を有する。
【００９６】
本発明において記載されるＭＴＭホスファターゼおよびＭＴＭ様抗ホスファタ
ーゼは，細胞分化，細胞分裂およびアポトーシスに関与するシグナリング経路の
制御において役割をはたすようである。
ーゼは，細胞分化，細胞分裂およびアポトーシスに関与するシグナリング経路の
制御において役割をはたすようである。
【００９７】ＰＴＥＮファミリー
腫瘍サプレッサーであるＰＴＥＮ（ＭＭＡＣ１またはＴＥＰ１としても知られ
る）は，脂質ホスファターゼとして作用する新規かつ珍しい酵素のＰＴＥＮファ
ミリーの原型のメンバーである。ＰＴＥＮは最初，ヒト神経膠芽細胞腫から単離
された腫瘍サプレッサー遺伝子として発見され（Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９
９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１９４３−１９４７），テンシンおよびオーギ
シリンとのホモロジーが認められた後に命名された。ＰＴＥＮ遺伝子（１０ｑ２
３）は，コウデン病（ＣＤ）（ＯＭＩＭ１５８３５０）および多数の過誤腫を特
徴とする状態であるバーニヤンゾナナ症候群（１５３４８０）の患者において変
異している。ＣＤ患者は，多数の組織，例えば乳，尿生殖器，消化器および甲状
腺を起源とする悪性腫瘍を発生する危険性が高い（例えば，Ｎｅｌｅｎ，Ｍ．Ｒ
．（１９９９）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−７３）。
る）は，脂質ホスファターゼとして作用する新規かつ珍しい酵素のＰＴＥＮファ
ミリーの原型のメンバーである。ＰＴＥＮは最初，ヒト神経膠芽細胞腫から単離
された腫瘍サプレッサー遺伝子として発見され（Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９
９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１９４３−１９４７），テンシンおよびオーギ
シリンとのホモロジーが認められた後に命名された。ＰＴＥＮ遺伝子（１０ｑ２
３）は，コウデン病（ＣＤ）（ＯＭＩＭ１５８３５０）および多数の過誤腫を特
徴とする状態であるバーニヤンゾナナ症候群（１５３４８０）の患者において変
異している。ＣＤ患者は，多数の組織，例えば乳，尿生殖器，消化器および甲状
腺を起源とする悪性腫瘍を発生する危険性が高い（例えば，Ｎｅｌｅｎ，Ｍ．Ｒ
．（１９９９）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−７３）。
【００９８】
ＰＴＥＮの発現は，ヒト神経膠芽細胞腫細胞の成長および腫瘍原性を阻害する
（Ｌｉ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．９５：１５４０６−１５４１１）。ＰＴＥＮの成長抑制活性は，これがＧ１
期で細胞サイクルの進行を妨害する能力により媒介される。ＰＴＥＮは，ＡＫＴ
の活性化剤であるリン脂質ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン
酸（ＰＩＰ３）の脱リン酸化によるＰＩ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路
の負の制御を介して，Ｇ１細胞サイクル進行を調節する。ＡＫＴ経路の下方調節
により，万能のシクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２７（ＫＩＰ１）の
レベルが増加し，したがって，ＣＤＫ活性が阻害されＧ１休止が生ずる（Ｌｉ，
Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５
：１５４０６−１５４１１）。
（Ｌｉ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．９５：１５４０６−１５４１１）。ＰＴＥＮの成長抑制活性は，これがＧ１
期で細胞サイクルの進行を妨害する能力により媒介される。ＰＴＥＮは，ＡＫＴ
の活性化剤であるリン脂質ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン
酸（ＰＩＰ３）の脱リン酸化によるＰＩ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路
の負の制御を介して，Ｇ１細胞サイクル進行を調節する。ＡＫＴ経路の下方調節
により，万能のシクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２７（ＫＩＰ１）の
レベルが増加し，したがって，ＣＤＫ活性が阻害されＧ１休止が生ずる（Ｌｉ，
Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５
：１５４０６−１５４１１）。
【００９９】
ＰＴＥＮがインビボおよびインビトロの両方でフォーカル接着キナーゼ（ＦＡ
Ｋ）と会合しこれを脱リン酸化する能力は，ＰＴＥＮがまた，細胞の広がりおよ
び運動性に関連するＦＡＫ誘導性シグナリング事象を下方に調節するかもしれな
いことを示唆する（Ｔａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２８０：１６１４−１６１７）。ＰＴＥＮ／ＦＡＫ相互作用は，最近，リン
脂質−活性化ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ細胞生存経路の抑制と関連づけられている（Ｔａ
ｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）２７４：２０６９３−２０７０３）。
これらの知見は，ＰＴＥＮが癌における細胞侵入および転移のプロセスに重要な
役割を果たすことを強く示唆する。
Ｋ）と会合しこれを脱リン酸化する能力は，ＰＴＥＮがまた，細胞の広がりおよ
び運動性に関連するＦＡＫ誘導性シグナリング事象を下方に調節するかもしれな
いことを示唆する（Ｔａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２８０：１６１４−１６１７）。ＰＴＥＮ／ＦＡＫ相互作用は，最近，リン
脂質−活性化ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ細胞生存経路の抑制と関連づけられている（Ｔａ
ｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）２７４：２０６９３−２０７０３）。
これらの知見は，ＰＴＥＮが癌における細胞侵入および転移のプロセスに重要な
役割を果たすことを強く示唆する。
【０１００】
ＰＴＥＮは，系統発生学的に保存されており，酵母（ＹＮＬ１２８Ｗ），Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓ（ｄａｆ−１８，ＣＡＡ１０３１５）（Ｍｉｈａｙｌｏｖａ Ｖ
．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９６
：７４２７３２）および哺乳動物に密接なホモログを有する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓにおいては，ＤＡＦ−１８はＤＡＦ−２およびＡＧＥ−１（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ
）シグナリング経路の負のレギュレーターとして作用し，これはＤＡＦ−１８が
インビボでホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸ホスファターゼに
作用することと一致する。
ｅｌｅｇａｎｓ（ｄａｆ−１８，ＣＡＡ１０３１５）（Ｍｉｈａｙｌｏｖａ Ｖ
．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９６
：７４２７３２）および哺乳動物に密接なホモログを有する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓにおいては，ＤＡＦ−１８はＤＡＦ−２およびＡＧＥ−１（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ
）シグナリング経路の負のレギュレーターとして作用し，これはＤＡＦ−１８が
インビボでホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸ホスファターゼに
作用することと一致する。
【０１０１】
２つのヒトＰＴＥＮ遺伝子，ＰＴＥＮ１（Ｕ９２４３６）およびＰＴＥＮ２（
ＡＦ０１０８３）が知られている。これらは４０３アミノ酸の長さであり，その
全体の長さにわたって９８％の同一性を有し，それぞれ２３および２２４アミノ
酸のＮ−およびＣ−末端ドメインに挟まれた中心の１５６アミノ酸触媒ドメイン
から構成される蛋白質をコードする。ＰＴＥＮのＣ末端は膜または細胞骨格界面
における重要な蛋白質−蛋白質相互作用に関与しているかもしれないＰＤＺドメ
インを有する。拡張されたＣ−末端ドメインの実際の機能は現在不明であるが，
ＰＴＥＮをホスホイノシチド合成が生ずる適正な膜／細胞骨格環境に局在させる
上でこのドメインが重要な役割を果たしていると考えられる。この部位における
ＰＩ３キナーゼ／ＰＴＥＮ活性のバランスが，拡散可能な第２のメッセンジャー
，例えばＰＩＰ３の有効な濃度を決定しているようである。ＰＩＰ３はＡＫＴの
みならず他の重要なシグナリング蛋白質，例えばＶａｖ，ＰＫＣ，ＰＬＣおよび
Ｂｔｋについても強力な活性化剤であるため（Ｍａｅｈａｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｄ
ｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１２
５−１２８により概説），ホスホイノシチドホスファターゼとしてのＰＴＥＮの
活性は，多様なシグナリング下流経路の減弱に中枢的な役割を果たしているよう
である。
ＡＦ０１０８３）が知られている。これらは４０３アミノ酸の長さであり，その
全体の長さにわたって９８％の同一性を有し，それぞれ２３および２２４アミノ
酸のＮ−およびＣ−末端ドメインに挟まれた中心の１５６アミノ酸触媒ドメイン
から構成される蛋白質をコードする。ＰＴＥＮのＣ末端は膜または細胞骨格界面
における重要な蛋白質−蛋白質相互作用に関与しているかもしれないＰＤＺドメ
インを有する。拡張されたＣ−末端ドメインの実際の機能は現在不明であるが，
ＰＴＥＮをホスホイノシチド合成が生ずる適正な膜／細胞骨格環境に局在させる
上でこのドメインが重要な役割を果たしていると考えられる。この部位における
ＰＩ３キナーゼ／ＰＴＥＮ活性のバランスが，拡散可能な第２のメッセンジャー
，例えばＰＩＰ３の有効な濃度を決定しているようである。ＰＩＰ３はＡＫＴの
みならず他の重要なシグナリング蛋白質，例えばＶａｖ，ＰＫＣ，ＰＬＣおよび
Ｂｔｋについても強力な活性化剤であるため（Ｍａｅｈａｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｄ
ｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１２
５−１２８により概説），ホスホイノシチドホスファターゼとしてのＰＴＥＮの
活性は，多様なシグナリング下流経路の減弱に中枢的な役割を果たしているよう
である。
【０１０２】
３５７アミノ酸のヒトＡＡ４９３９１５（ＡＡ配列番号４０）は，ＴＰＴＥ，
すなわち"テンシンホモロジーを有する貫膜ホスファターゼ"，ＮＰ＿０３７４４
７と，３５７アミノ酸にわたり６５％の同一性を有する。ヒトＡＡ４９３９１５
（ＡＡ配列番号４０）により表される新規ＰＴＥＮ様ホスファターゼは，ＰＴＥ
Ｎと同様に，腫瘍サプレッサー機能を有するかもしれない。ＡＡ４９３９１５（
ＡＡ配列番号４０）は，細胞成長およびアポトーシスを媒介するシグナリング事
象において，ならびに癌を治療するための新規な治療剤の設計において価値を有
するであろう。図３に示されるように，ＡＡ４９３９１５は，小脳，下垂体，前
立腺，胎児脳および胎児肺を含む多くの組織において発現されている。
すなわち"テンシンホモロジーを有する貫膜ホスファターゼ"，ＮＰ＿０３７４４
７と，３５７アミノ酸にわたり６５％の同一性を有する。ヒトＡＡ４９３９１５
（ＡＡ配列番号４０）により表される新規ＰＴＥＮ様ホスファターゼは，ＰＴＥ
Ｎと同様に，腫瘍サプレッサー機能を有するかもしれない。ＡＡ４９３９１５（
ＡＡ配列番号４０）は，細胞成長およびアポトーシスを媒介するシグナリング事
象において，ならびに癌を治療するための新規な治療剤の設計において価値を有
するであろう。図３に示されるように，ＡＡ４９３９１５は，小脳，下垂体，前
立腺，胎児脳および胎児肺を含む多くの組織において発現されている。
【０１０３】
したがって，本発明のポリペプチドおよびヌクレオチド配列を用いて，細胞成
長および生存の調節剤を同定することができ，これは，種々の細胞増殖疾患およ
び状態，特に不適切なホスファターゼ活性に関連する癌の治療剤を開発する上で
有用である。細胞内で作用してホスファターゼ活性を増強または阻害する化合物
を同定するアッセイは，ホスファターゼヌクレオチド配列を発現する遺伝子工学
処理した細胞株を創出することにより開発することができ，これは以下に詳細に
説明する。
長および生存の調節剤を同定することができ，これは，種々の細胞増殖疾患およ
び状態，特に不適切なホスファターゼ活性に関連する癌の治療剤を開発する上で
有用である。細胞内で作用してホスファターゼ活性を増強または阻害する化合物
を同定するアッセイは，ホスファターゼヌクレオチド配列を発現する遺伝子工学
処理した細胞株を創出することにより開発することができ，これは以下に詳細に
説明する。
【０１０４】Ｉ．ポリペプチドをコードする核酸
本発明の１つの観点は，ポリペプチドをコードする核酸配列を特徴とする。本
明細書に記載される単離された核酸分子の機能的同等物も本発明の範囲内に含ま
れる。機能的同等物または誘導体は，いくつかの方法により得ることができる。
遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他のコドンで置
き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，メチオニン
およびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすることができるた
め，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，ポリペプチド遺伝子の一部
および全部を合成して，配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配
列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番
号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号
２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番
号３９とは有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコー
ドされるアミノ酸配列は保存される。
明細書に記載される単離された核酸分子の機能的同等物も本発明の範囲内に含ま
れる。機能的同等物または誘導体は，いくつかの方法により得ることができる。
遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他のコドンで置
き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，メチオニン
およびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすることができるた
め，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，ポリペプチド遺伝子の一部
および全部を合成して，配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配
列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番
号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号
２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番
号３９とは有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコー
ドされるアミノ酸配列は保存される。
【０１０５】
さらに，核酸配列は，少なくとも１つのヌクレオチドを，配列番号１，配列番
号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配
列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列
番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番
号４１，配列番号３７または配列番号３９のいずれかに示される核酸の式の５’
末端におよび／または３’末端に付加，欠失または置換して得られるヌクレオチ
ド配列またはそれらの誘導体を含むことができる。その付加，欠失または置換が
，ヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２，配列番号４，配列番号６，
配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列
番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番
号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号
３８または配列番号４０のアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチド
またはポリヌクレオチドをこのようにして用いることができる。例えば，本発明
は，核酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加す
ることにより，または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端
に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる
任意の核酸配列を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応
じて，これらの５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を有することができる。
号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配
列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列
番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番
号４１，配列番号３７または配列番号３９のいずれかに示される核酸の式の５’
末端におよび／または３’末端に付加，欠失または置換して得られるヌクレオチ
ド配列またはそれらの誘導体を含むことができる。その付加，欠失または置換が
，ヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２，配列番号４，配列番号６，
配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列
番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番
号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号
３８または配列番号４０のアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチド
またはポリヌクレオチドをこのようにして用いることができる。例えば，本発明
は，核酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加す
ることにより，または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端
に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる
任意の核酸配列を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応
じて，これらの５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を有することができる。
【０１０６】
所定の核酸配列のそのような機能的変更により，例えば，これに融合した外来
核酸配列によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促
進される機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容されるホスファ
ターゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発
明に含まれる。
核酸配列によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促
進される機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容されるホスファ
ターゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発
明に含まれる。
【０１０７】
さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
【０１０８】
ポリペプチドの機能的同等物または誘導体はまた，ポリペプチドの１またはそ
れ以上の機能的ドメインをコードする核酸分子を用いて得ることができる。例え
ば，ホスファターゼの触媒ドメインは，チロシンおよび／またはセリン／トレオ
ニンアミノ酸上に結合したリン酸分子の酵素的除去剤として機能し，触媒ドメイ
ンのみをコードするかまたは他の異種核酸配列に連結した核酸配列は，ホスファ
ターゼの機能的誘導体であると考えることができる。
れ以上の機能的ドメインをコードする核酸分子を用いて得ることができる。例え
ば，ホスファターゼの触媒ドメインは，チロシンおよび／またはセリン／トレオ
ニンアミノ酸上に結合したリン酸分子の酵素的除去剤として機能し，触媒ドメイ
ンのみをコードするかまたは他の異種核酸配列に連結した核酸配列は，ホスファ
ターゼの機能的誘導体であると考えることができる。
【０１０９】ＩＩ．ポリペプチドを検出するための核酸プローブ
本発明の核酸プローブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適
当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得る
ことができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野におい
て認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（例
えば，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ"，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．
，１９８９）。
当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得る
ことができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野におい
て認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（例
えば，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ"，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．
，１９８９）。
【０１１０】
別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端および
Ｃ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学
合成を行うことができる。すなわち，合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手
法にしたがって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔ
ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがっ
て，適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを
得ることができる。
Ｃ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学
合成を行うことができる。すなわち，合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手
法にしたがって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔ
ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがっ
て，適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを
得ることができる。
【０１１１】
当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知ら
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを容易に設計することができる（例えば，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，第２版，ｅｄ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。本発明のハイブリダイゼーシ
ョンプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素標識，蛍光標識，
ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識することができ
る。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可視化すること
ができる。
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを容易に設計することができる（例えば，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，第２版，ｅｄ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。本発明のハイブリダイゼーシ
ョンプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素標識，蛍光標識，
ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識することができ
る。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可視化すること
ができる。
【０１１２】
本発明の核酸プローブは，ＲＮＡならびにＤＮＡプローブ，およびプローブが
本明細書に記載される条件下で特異的にハイブリダイズする能力を保持している
限り，糖リン酸または塩基部分で修飾された核酸を含むことができる。そのよう
なプローブは，当該技術分野において知られる手法を用いて作成することができ
る。核酸プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体
の例としては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合
炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えば
ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズおよびニトロセルロースが含まれる
。核酸プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野におい
てよく知られている。
本明細書に記載される条件下で特異的にハイブリダイズする能力を保持している
限り，糖リン酸または塩基部分で修飾された核酸を含むことができる。そのよう
なプローブは，当該技術分野において知られる手法を用いて作成することができ
る。核酸プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体
の例としては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合
炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えば
ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズおよびニトロセルロースが含まれる
。核酸プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野におい
てよく知られている。
【０１１３】
本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１１４】ＩＩＩ．プローブに基づく方法およびポリペプチドを検出するためのキット
試料中で本発明のポリペプチドの存在を検出する１つの方法は，（ａ）試料を
ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ
，そして（ｂ）核酸分子に結合したプローブの存在を検出する，ことを含む。当
業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核酸プ
ローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組織の
ＲＮＡ試料が含まれる。好ましい態様においては，高度にストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件が用いられる。
ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ
，そして（ｂ）核酸分子に結合したプローブの存在を検出する，ことを含む。当
業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核酸プ
ローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組織の
ＲＮＡ試料が含まれる。好ましい態様においては，高度にストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件が用いられる。
【０１１５】
試料中で本発明のポリペプチドの存在を検出するためのキットは，その中に上
述の核酸プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさ
らに，以下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬お
よび結合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例と
しては，限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビ
オチン，アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。
述の核酸プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさ
らに，以下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬お
よび結合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例と
しては，限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビ
オチン，アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。
【０１１６】
詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れら
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，そのような試薬をアッセイにおいて用いることに関連した１組の指針
とともに，またはこれらなしで，当該技術分野においてよく知られる確立された
キットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることを容易に認識する
であろう。
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，そのような試薬をアッセイにおいて用いることに関連した１組の指針
とともに，またはこれらなしで，当該技術分野においてよく知られる確立された
キットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることを容易に認識する
であろう。
【０１１７】ＩＶ．核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞
本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび本明細書に記載される核酸分子を含む組換えＤＮＡ
分子に関する。本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプ
チドに対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前
記細胞において機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，
単離されたおよび／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび本明細書に記載される核酸分子を含む組換えＤＮＡ
分子に関する。本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプ
チドに対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前
記細胞において機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，
単離されたおよび／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０１１８】
本発明はまた，本明細書に記載される核酸分子を含み，したがってポリペプチ
ドを発現しうる細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを
発現するよう変更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通
常は産生しないかまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生す
るように遺伝子操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを
発現するよう変更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，また
は合成配列のいずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現
させるための方法を容易に適用することができる。
ドを発現しうる細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを
発現するよう変更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通
常は産生しないかまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生す
るように遺伝子操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを
発現するよう変更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，また
は合成配列のいずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現
させるための方法を容易に適用することができる。
【０１１９】
核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
【０１２０】
所望の場合には，ポリペプチド遺伝子をコードする配列の３’側の非コーディ
ング領域を上述のクローニング方法により得ることができる。この領域は，その
転写終止制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することがで
きる。すなわち，ポリペプチド遺伝子をコードするＤＮＡ配列に天然に隣接して
いる３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる
。発現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主
細胞において機能的な３’領域で置き換えることができる。
ング領域を上述のクローニング方法により得ることができる。この領域は，その
転写終止制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することがで
きる。すなわち，ポリペプチド遺伝子をコードするＤＮＡ配列に天然に隣接して
いる３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる
。発現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主
細胞において機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０１２１】
２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列およびホスファターゼ配列
）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレームシフト変異を導入しな
い，（２）プロモーター領域配列がホスファターゼ遺伝子配列の転写を指示する
能力を妨害しない，または（３）ホスファターゼ遺伝子配列がプロモーター領域
配列により転写されることを妨害しない場合，動作可能なように連結されている
と言われる。すなわち，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の
転写を行うことができる場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているで
あろう。すなわち，ホスファターゼ遺伝子を発現させるためには，適当な宿主に
より認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレームシフト変異を導入しな
い，（２）プロモーター領域配列がホスファターゼ遺伝子配列の転写を指示する
能力を妨害しない，または（３）ホスファターゼ遺伝子配列がプロモーター領域
配列により転写されることを妨害しない場合，動作可能なように連結されている
と言われる。すなわち，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の
転写を行うことができる場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているで
あろう。すなわち，ホスファターゼ遺伝子を発現させるためには，適当な宿主に
より認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【０１２２】
本発明は，遺伝子（またはその機能的誘導体）を原核生物または真核生物細胞
のいずれかにおいて発現させることを包含する。原核生物宿主は，一般に，組換
え蛋白質の製造において非常に有効でありかつ便利であり，したがって，遺伝子
のための１つの好ましい発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌ
ｉの種々の株により代表される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用
いることができる。
のいずれかにおいて発現させることを包含する。原核生物宿主は，一般に，組換
え蛋白質の製造において非常に有効でありかつ便利であり，したがって，遺伝子
のための１つの好ましい発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌ
ｉの種々の株により代表される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用
いることができる。
【０１２３】
原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【０１２４】
認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０１２５】
ポリペプチド（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において発現させる
ためには，ポリペプチド配列が，機能的原核生物プロモーターと動作可能なよう
に連結されていることが必要である。そのようなプロモーターは，構成的であっ
てもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，誘導可能または抑制解除可能）
である。構成的プロモーターの例には，バクテリオファージλのｉｎｔプロモー
ター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター，およ
びｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列
のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例には
，バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．
ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター
，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−
特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージの
プロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，
ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８
６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８４）により概説され
ている。
ためには，ポリペプチド配列が，機能的原核生物プロモーターと動作可能なよう
に連結されていることが必要である。そのようなプロモーターは，構成的であっ
てもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，誘導可能または抑制解除可能）
である。構成的プロモーターの例には，バクテリオファージλのｉｎｔプロモー
ター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター，およ
びｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列
のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例には
，バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．
ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター
，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−
特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージの
プロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，
ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８
６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８４）により概説され
ている。
【０１２６】
原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子配列コーディング配列の上流に
リボソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例
えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：
３６５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トラ
ンスフォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿
主細胞のタイプに依存する。
リボソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例
えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：
３６５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トラ
ンスフォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿
主細胞のタイプに依存する。
【０１２７】
本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および"細胞培養"は互換的に
用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。すなわち，"トランス
フォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句は，継代の数にかか
わらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含む。また，意図的な
または偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物において精密に同一で
はないかもしれないことが理解される。しかし，定義されるように，変異体子孫
は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。すなわち，"トランス
フォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句は，継代の数にかか
わらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含む。また，意図的な
または偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物において精密に同一で
はないかもしれないことが理解される。しかし，定義されるように，変異体子孫
は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０１２８】
本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするペ
プチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されない。適当な宿
主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物宿主には，例
えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のいずれ
か）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，ＨｅＬａ細胞，
繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯ，３Ｔ３またはＣＨＯ−Ｋ１，またはリ
ンパ球由来の細胞（例えば３２Ｄ細胞），およびこれらの誘導体が含まれる。好
ましい哺乳動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細
胞腫細胞株，例えばＩＭＲ３３２およびＰＣ１２が含まれ，これらは正しい翻訳
後プロセシングのよりすぐれた能力を提供することができる。
プチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されない。適当な宿
主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物宿主には，例
えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のいずれ
か）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，ＨｅＬａ細胞，
繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯ，３Ｔ３またはＣＨＯ−Ｋ１，またはリ
ンパ球由来の細胞（例えば３２Ｄ細胞），およびこれらの誘導体が含まれる。好
ましい哺乳動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細
胞腫細胞株，例えばＩＭＲ３３２およびＰＣ１２が含まれ，これらは正しい翻訳
後プロセシングのよりすぐれた能力を提供することができる。
【０１２９】
さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルス
ベクターを，昆虫細胞においてホスファターゼを大量に発現するよう遺伝子工学
処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，１９
８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
（１９８６），Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｌｅ
ｎｕｍ，Ｖｏｌ．８ｐｐ．２７７−２９７）。
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルス
ベクターを，昆虫細胞においてホスファターゼを大量に発現するよう遺伝子工学
処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，１９
８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
（１９８６），Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｌｅ
ｎｕｍ，Ｖｏｌ．８ｐｐ．２７７−２９７）。
【０１３０】
酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている遺伝子配列からのプロモーターおよび終止
要素を組み込んだ一連の酵母遺伝子配列発現システムの任意のものを用いること
ができる。既知の解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを
提供することができる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実
質的な利点を与える。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用い
る多くの組換えＤＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造す
るために用いることができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子配列産物
のリーダー配列を認識して，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプ
チド）を分泌する。哺乳動物宿主についてはホスファターゼの発現にはいくつか
の可能なベクター系が利用可能である。
素をコードする活発に発現されている遺伝子配列からのプロモーターおよび終止
要素を組み込んだ一連の酵母遺伝子配列発現システムの任意のものを用いること
ができる。既知の解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを
提供することができる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実
質的な利点を与える。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用い
る多くの組換えＤＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造す
るために用いることができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子配列産物
のリーダー配列を認識して，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプ
チド）を分泌する。哺乳動物宿主についてはホスファターゼの発現にはいくつか
の可能なベクター系が利用可能である。
【０１３１】
特に好ましい酵母発現系は，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｏｃｙｃｅｓ ｐ
ｏｍｂｅを用いるものである。この系は，Ｓｒｃファミリーのメンバー（Ｓｕｐ
ｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２６２５，１９９３
）および他のＮＲ−ＴＫの活性を研究するために有用である。
ｏｍｂｅを用いるものである。この系は，Ｓｒｃファミリーのメンバー（Ｓｕｐ
ｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２６２５，１９９３
）および他のＮＲ−ＴＫの活性を研究するために有用である。
【０１３２】
宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０１３３】
ポリペプチドの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域を使用する
ことが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指示するの
に十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには，例えば
，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘル
ペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３５５
−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１）；およ
び酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，
１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
ことが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指示するの
に十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには，例えば
，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘル
ペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３５５
−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１）；およ
び酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，
１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０１３４】
真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，ポリペプチド（またはその機
能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンをコードし
うる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすることが好まし
い。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンがコーディング配列
と同じリーディングフレームにある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコ
ドンがコーディング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいず
れかをもたらす。
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，ポリペプチド（またはその機
能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンをコードし
うる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすることが好まし
い。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンがコーディング配列
と同じリーディングフレームにある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコ
ドンがコーディング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいず
れかをもたらす。
【０１３５】
ポリペプチド核酸分子および動作可能なように連結されたプロモーターは，レ
シピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複製ＤＮＡ（またはＲＮ
Ａ）分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線状分子またはより
好ましくは閉環状分子（プラスミド）のいずれでもよい。そのような分子は自己
複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現によ
り生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートさ
れることにより永久発現が得られる。
シピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複製ＤＮＡ（またはＲＮ
Ａ）分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線状分子またはより
好ましくは閉環状分子（プラスミド）のいずれでもよい。そのような分子は自己
複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現によ
り生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートさ
れることにより永久発現が得られる。
【０１３６】
所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。一本鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの最適な合成には追加の
要素も必要であろう。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転
写プロモーター，エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要
素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．３：２８０−，１９８３）により記載されるものが含まれる。
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。一本鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの最適な合成には追加の
要素も必要であろう。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転
写プロモーター，エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要
素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．３：２８０−，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０１３７】
導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０１３８】
好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例
えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ；
"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ"，１９８９，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９））などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓプラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる
。このようなプラスミドは，Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２に開示される。適当なＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３，１９８７），およびＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばＩＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏ
ｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ
Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ，ｐｐ．４５−５４，１９８６
）が含まれる。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（
Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６），およびＩｚ
ａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２，１９７８）
により概説されている。
えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ；
"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ"，１９８９，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９））などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓプラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる
。このようなプラスミドは，Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２に開示される。適当なＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３，１９８７），およびＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばＩＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏ
ｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ
Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ，ｐｐ．４５−５４，１９８６
）が含まれる。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（
Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６），およびＩｚ
ａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２，１９７８）
により概説されている。
【０１３９】
好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０１４０】
構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，ポリペプチドまたはそのフラグメントが産
生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，またはこ
れらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオキシウラ
シルを神経芽細胞腫細胞等に投与することにより）。本発明のペプチドを形成す
るために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい
条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，ポリペプチドまたはそのフラグメントが産
生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，またはこ
れらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオキシウラ
シルを神経芽細胞腫細胞等に投与することにより）。本発明のペプチドを形成す
るために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい
条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０１４１】Ｖ．ポリペプチド
本発明の別の特徴はポリペプチド，好ましくはホスファターゼである。当該技
術分野において知られる種々の方法論を用いて，本発明のポリペプチドを得るこ
とができる。ポリペプチドは，天然にポリペプチドを産生する組織または細胞か
ら精製することができる。あるいは，上述の単離された核酸を用いて蛋白質を組
換え的に発現させることができる。
術分野において知られる種々の方法論を用いて，本発明のポリペプチドを得るこ
とができる。ポリペプチドは，天然にポリペプチドを産生する組織または細胞か
ら精製することができる。あるいは，上述の単離された核酸を用いて蛋白質を組
換え的に発現させることができる。
【０１４２】
起源生物が天然にそのようなポリペプチドを含む限り，任意の真核生物を本発
明のポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用いる場
合，"起源生物"とは，その生物において蛋白質が発現されているか，蛋白質が最
終的にそれから単離されたかにかかわらず，蛋白質のアミノ酸配列が由来する元
の生物を意味する。
明のポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用いる場
合，"起源生物"とは，その生物において蛋白質が発現されているか，蛋白質が最
終的にそれから単離されたかにかかわらず，蛋白質のアミノ酸配列が由来する元
の生物を意味する。
【０１４３】
当業者は，天然の夾雑物を含まないペプチドを得るために，蛋白質を単離する
既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには，限定されないが，サイ
ズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，および
免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには，限定されないが，サイ
ズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，および
免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【０１４４】
ホスファターゼ蛋白質は，すべての蛋白質と同様に，別個の機能的単位または
ドメインから構成される。真核生物においては，いわゆる小胞体経路（バルクフ
ロー）により区分けされる蛋白質は，通常Ｎ末端にシグナル配列（リーダーペプ
チドとも称される）を有し，これは，ＥＲ（小胞体）膜を通って移動した後に切
り出される。Ｎ−末端シグナル配列は切り出されず，貫膜セグメントとして残る
が，このことはこれらの蛋白質がＥＲに残ることを意味しない。これらは，さら
に区分けされ，小胞中に含まれることができる。非レセプター蛋白質は一般に，
蛋白質：蛋白質相互作用の部位を提供することにより，またはある触媒活性（触
媒ドメイン中に含まれる）を有することにより，またはしばしばその両方により
，細胞内にシグナルを伝達するよう機能する。これらの種々のドメインの存在を
推定する方法は当該技術分野においてよく知られている。蛋白質：蛋白質相互作
用ドメインは，他の蛋白質との比較により同定することができる。例えば，ＳＨ
２ドメインは，約１００アミノ酸の蛋白質ドメインであり，蛋白質ＳｒｃとＦｐ
ｓとの間の保存配列領域として最初に同定された（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．６：４３９６，１９８６）。後に類似の配列
が多くの他の細胞内シグナル伝達蛋白質に見いだされた。ＳＨ２ドメインは，配
列特異的および厳密にリン酸化依存性様式で高い親和性をもってホスホチロシン
含有蛋白質と相互作用することにより，細胞内シグナリングカスケードの制御モ
ジュールとして機能する（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：８，１９９３）。キナーゼまたはホスファター
ゼ触媒ドメインは，キナーゼまたはホスファターゼ活性を有する他の既知の触媒
ドメインと比較することにより同定することができる。例えば，Ｈａｎｋｓ ａ
ｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：５７６−５９５，１９９５を参照。
ドメインから構成される。真核生物においては，いわゆる小胞体経路（バルクフ
ロー）により区分けされる蛋白質は，通常Ｎ末端にシグナル配列（リーダーペプ
チドとも称される）を有し，これは，ＥＲ（小胞体）膜を通って移動した後に切
り出される。Ｎ−末端シグナル配列は切り出されず，貫膜セグメントとして残る
が，このことはこれらの蛋白質がＥＲに残ることを意味しない。これらは，さら
に区分けされ，小胞中に含まれることができる。非レセプター蛋白質は一般に，
蛋白質：蛋白質相互作用の部位を提供することにより，またはある触媒活性（触
媒ドメイン中に含まれる）を有することにより，またはしばしばその両方により
，細胞内にシグナルを伝達するよう機能する。これらの種々のドメインの存在を
推定する方法は当該技術分野においてよく知られている。蛋白質：蛋白質相互作
用ドメインは，他の蛋白質との比較により同定することができる。例えば，ＳＨ
２ドメインは，約１００アミノ酸の蛋白質ドメインであり，蛋白質ＳｒｃとＦｐ
ｓとの間の保存配列領域として最初に同定された（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．６：４３９６，１９８６）。後に類似の配列
が多くの他の細胞内シグナル伝達蛋白質に見いだされた。ＳＨ２ドメインは，配
列特異的および厳密にリン酸化依存性様式で高い親和性をもってホスホチロシン
含有蛋白質と相互作用することにより，細胞内シグナリングカスケードの制御モ
ジュールとして機能する（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：８，１９９３）。キナーゼまたはホスファター
ゼ触媒ドメインは，キナーゼまたはホスファターゼ活性を有する他の既知の触媒
ドメインと比較することにより同定することができる。例えば，Ｈａｎｋｓ ａ
ｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：５７６−５９５，１９９５を参照。
【０１４５】
ホスファターゼドメインは，種々の用途を有する。そのような用途の例は，ホ
スファターゼ触媒ドメインおよび異種蛋白質（例えばグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ））から構成されるポリペプチドを作成することである。そ
のようなポリペプチドは，ホスファターゼ基質特異性を研究するために有用なホ
スファターゼ触媒活性についての生化学的アッセイにおいて，またはホスファタ
ーゼ触媒活性を調節しうる物質を同定するために用いることができる。あるいは
，当業者は，３つの主要なドメイン，すなわち細胞外ドメイン，貫膜ドメインま
たは細胞内ドメインの少なくとも１つを欠失したポリペプチドを作成することが
できる。そのようなポリペプチドは，細胞中で発現させたとき，ホスファターゼ
の天然の結合パートナーと複合体を形成することができるが，シグナルをさらに
下流の細胞内に伝達することができない。例えば，これは不完全にシグナリング
を行い，このため，ホスファターゼ活性の生物学的関連性を研究する上で有用で
あろう（例えば，Ｇｉｓｈｉｚｋｙ，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ：１０８８９，１９
９５を参照）。
スファターゼ触媒ドメインおよび異種蛋白質（例えばグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ））から構成されるポリペプチドを作成することである。そ
のようなポリペプチドは，ホスファターゼ基質特異性を研究するために有用なホ
スファターゼ触媒活性についての生化学的アッセイにおいて，またはホスファタ
ーゼ触媒活性を調節しうる物質を同定するために用いることができる。あるいは
，当業者は，３つの主要なドメイン，すなわち細胞外ドメイン，貫膜ドメインま
たは細胞内ドメインの少なくとも１つを欠失したポリペプチドを作成することが
できる。そのようなポリペプチドは，細胞中で発現させたとき，ホスファターゼ
の天然の結合パートナーと複合体を形成することができるが，シグナルをさらに
下流の細胞内に伝達することができない。例えば，これは不完全にシグナリング
を行い，このため，ホスファターゼ活性の生物学的関連性を研究する上で有用で
あろう（例えば，Ｇｉｓｈｉｚｋｙ，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ：１０８８９，１９
９５を参照）。
【０１４６】ＶＩ．ポリペプチドに対して結合親和性を有する抗体およびこの抗体を含むハイ ブリドーマ
本発明はまた，ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体に関する
。ポリペプチドは，配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番
号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号
２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３
０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号
４０に記載されるアミノ酸配列またはそのフラグメント，またはその少なくとも
６，１２，１８，２４，３０，３６，５０，７５，１００個の連続するアミノ酸
を有することができる。そのような抗体は，その結合アフィニティーを，第２の
ポリペプチドに対して結合親和性を有する最初のポリペプチドと比較することに
より同定することができる。第２のポリペプチド，例えばホスファターゼに選択
的に結合するものは，ホスファターゼ間またはホスファターゼと他のポリペプチ
ドとを区別することが必要とされる方法において用いるために選択されるであろ
う。そのような方法には，限定されないが，他のポリペプチドを含む組織におい
て変更されたホスファターゼ発現の分析，および全細胞を用いるアッセイシステ
ムが含まれる。
。ポリペプチドは，配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番
号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号
２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３
０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号
４０に記載されるアミノ酸配列またはそのフラグメント，またはその少なくとも
６，１２，１８，２４，３０，３６，５０，７５，１００個の連続するアミノ酸
を有することができる。そのような抗体は，その結合アフィニティーを，第２の
ポリペプチドに対して結合親和性を有する最初のポリペプチドと比較することに
より同定することができる。第２のポリペプチド，例えばホスファターゼに選択
的に結合するものは，ホスファターゼ間またはホスファターゼと他のポリペプチ
ドとを区別することが必要とされる方法において用いるために選択されるであろ
う。そのような方法には，限定されないが，他のポリペプチドを含む組織におい
て変更されたホスファターゼ発現の分析，および全細胞を用いるアッセイシステ
ムが含まれる。
【０１４７】
本発明のペプチドは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用いること
ができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書に記
載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するであろ
う。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，ならび
にこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒ
ト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において知ら
れる手法の１つを用いて生成することができる。本発明はまた，上述のモノクロ
ーナル抗体，またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。
ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を分泌しうる不死化細胞株である
。
ができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書に記
載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するであろ
う。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，ならび
にこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒ
ト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において知ら
れる手法の１つを用いて生成することができる。本発明はまた，上述のモノクロ
ーナル抗体，またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。
ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を分泌しうる不死化細胞株である
。
【０１４８】
一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【０１４９】
ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０１５０】
モノクローナル抗体については，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエロ
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知
られる多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬ
ＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用い
てスクリーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハ
イブリドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてク
ラスおよびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知
られる多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬ
ＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用い
てスクリーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハ
イブリドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてク
ラスおよびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０１５１】
ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５，１９７６を参照。本発明の標識さ
れた抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用いて，特
定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５，１９７６を参照。本発明の標識さ
れた抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用いて，特
定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【０１５２】
上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【０１５３】
さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０１５４】ＶＩＩ．ポリペプチドを検出するための抗体に基づく方法およびキット
本発明はまた，試料中においてポリペプチドを検出する方法を包含する。該方
法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触さ
せ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含
む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキ
ュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料
中でポリペプチドのレベルが正常なレベルと比較して変化（増加または減少）し
ていることは疾病を示すかもしれない。
法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触さ
せ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含
む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキ
ュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料
中でポリペプチドのレベルが正常なレベルと比較して変化（増加または減少）し
ていることは疾病を示すかもしれない。
【０１５５】
抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０１５６】
本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知
られており，本発明に容易に適合させることができる。
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知
られており，本発明に容易に適合させることができる。
【０１５７】
キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１ま
たはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検
出しうる試薬。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１ま
たはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検
出しうる試薬。
【０１５８】
検出試薬の例には，限定されないが，標識第２抗体が含まれ，あるいは，一次
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１５９】ＶＩＩＩ．ポリペプチドの天然の結合パートナーの単離
本発明はまた，ポリペプチドに結合しうる天然の結合パートナーを検出する方
法に関する。ポリペプチドの天然の結合パートナーは，例えば，シグナリングカ
スケードの一部として脱リン酸化される基質蛋白質でありうる。結合パートナー
は，複雑な混合物，例えば，血清，体液または細胞抽出物中に存在していてもよ
い。
法に関する。ポリペプチドの天然の結合パートナーは，例えば，シグナリングカ
スケードの一部として脱リン酸化される基質蛋白質でありうる。結合パートナー
は，複雑な混合物，例えば，血清，体液または細胞抽出物中に存在していてもよ
い。
【０１６０】
一般に，天然の結合パートナーを同定する方法は，物質をホスファターゼとと
もにインキュベートし，ホスファターゼに結合した物質の存在を検出することを
含む。好ましい方法には，Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ（上掲）のツーハイ
ブリッドシステムおよび共免疫沈殿が含まれる。
もにインキュベートし，ホスファターゼに結合した物質の存在を検出することを
含む。好ましい方法には，Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ（上掲）のツーハイ
ブリッドシステムおよび共免疫沈殿が含まれる。
【０１６１】ＩＸ．ポリペプチド活性を調節しうる物質の同定および使用
本発明はまた，ポリペプチド活性を調節しうる物質を検出する方法に関する。
そのような物質は，活性を増強する（アゴニスト）かまたは活性を阻害する（ア
ンタゴニスト）ことができる。アゴニストおよびアンタゴニストは，ペプチド，
抗体，天然起源からの産物，例えば真菌または植物抽出物，または小分子量の有
機化合物でありうる。一般に，小分子量の有機化合物が好ましい。ホスファター
ゼ調節活性について試験することのできる化合物の群の例としては，例えば，限
定されないが，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎ
ｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１４５７−１４
６８（本明細書の一部としてここに引用する）に開示される非ペプチジル化合物
，およびＢｕｒｋｅ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２９１−３０４およびＢｕｒｋｅ
，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４７：２２５−２
４１（図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に開示される化合物が
挙げられる。
そのような物質は，活性を増強する（アゴニスト）かまたは活性を阻害する（ア
ンタゴニスト）ことができる。アゴニストおよびアンタゴニストは，ペプチド，
抗体，天然起源からの産物，例えば真菌または植物抽出物，または小分子量の有
機化合物でありうる。一般に，小分子量の有機化合物が好ましい。ホスファター
ゼ調節活性について試験することのできる化合物の群の例としては，例えば，限
定されないが，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎ
ｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１４５７−１４
６８（本明細書の一部としてここに引用する）に開示される非ペプチジル化合物
，およびＢｕｒｋｅ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２９１−３０４およびＢｕｒｋｅ
，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４７：２２５−２
４１（図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に開示される化合物が
挙げられる。
【０１６２】
一般に，該方法は，少なくとも１つの本発明のポリペプチドを試験物質と接触
させ，ポリペプチドの活性を測定し，そして試験物質がポリペプチドの活性を調
節するか否かを判定することを含む。活性の変化は，ホスファターゼポリペプチ
ドのリン酸化の増加または減少，またはホスファターゼ基質のリン酸化の増加ま
たは減少として現れることができる。このようにして同定される物質は，物質の
アゴニストまたはアンタゴニストとしての性質を示すよう活性を変化させるであ
ろう。
させ，ポリペプチドの活性を測定し，そして試験物質がポリペプチドの活性を調
節するか否かを判定することを含む。活性の変化は，ホスファターゼポリペプチ
ドのリン酸化の増加または減少，またはホスファターゼ基質のリン酸化の増加ま
たは減少として現れることができる。このようにして同定される物質は，物質の
アゴニストまたはアンタゴニストとしての性質を示すよう活性を変化させるであ
ろう。
【０１６３】
該方法はまた，ホスファターゼを産生する細胞を試験物質の存在下でインキュ
ベートし，ホスファターゼ活性またはホスファターゼ結合パートナー活性のレベ
ルの変化を検出することを含む。活性の変化は，ホスファターゼポリペプチドの
リン酸化の増加または減少，ホスファターゼ基質のリン酸化の増加または減少，
または細胞における生物学的応答の増加または減少として現れることができる。
生物学的応答には，例えば，増殖，分化，生存または運動性が含まれる。このよ
うにして同定された物質は，物質のアゴニストまたはアンタゴニストとしての性
質を示すよう活性を変化させるであろう。いったん物質が同定されれば，精製さ
れた形で入手できない場合には，当該技術分野においてよく知られる手法を用い
てこれを単離することができる。
ベートし，ホスファターゼ活性またはホスファターゼ結合パートナー活性のレベ
ルの変化を検出することを含む。活性の変化は，ホスファターゼポリペプチドの
リン酸化の増加または減少，ホスファターゼ基質のリン酸化の増加または減少，
または細胞における生物学的応答の増加または減少として現れることができる。
生物学的応答には，例えば，増殖，分化，生存または運動性が含まれる。このよ
うにして同定された物質は，物質のアゴニストまたはアンタゴニストとしての性
質を示すよう活性を変化させるであろう。いったん物質が同定されれば，精製さ
れた形で入手できない場合には，当該技術分野においてよく知られる手法を用い
てこれを単離することができる。
【０１６４】Ｘ．疾病または疾患を治療する方法
本発明はまた，疾病または疾患を治療する方法に関する。該方法は，そのよう
な治療を必要とする患者に，本発明のホスファターゼを調節する物質を投与する
工程を含む。
な治療を必要とする患者に，本発明のホスファターゼを調節する物質を投与する
工程を含む。
【０１６５】
物質または化合物の毒性および治療上有効性は，培養細胞または実験動物にお
ける標準的な薬学的方法により決定することができる。毒性と治療的効果との間
の用量の比は治療指数であり，これはＬＤ50／ＥＤ50の比率として表すことがで
きる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび
動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるための投与量の範囲を定式
化するために用いることができる。そのような化合物の投与量は，好ましくは，
ＥＤ50を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は
，用いる投与形態および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。
ける標準的な薬学的方法により決定することができる。毒性と治療的効果との間
の用量の比は治療指数であり，これはＬＤ50／ＥＤ50の比率として表すことがで
きる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび
動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるための投与量の範囲を定式
化するために用いることができる。そのような化合物の投与量は，好ましくは，
ＥＤ50を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は
，用いる投与形態および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。
【０１６６】
本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療的に有効な用量
は，最初に細胞培養から見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，
最初に細胞培養アッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮して循環濃度範囲を達
成するような用量を処方することができる（例えば，蛋白質複合体の最大破壊の
半分，または複合体成分の細胞レベルおよび／または活性の阻害の半分を達成す
る試験化合物の濃度）。そのような情報を用いて，ヒトにおいて有用な用量をさ
らに正確に決定することができる。血漿中のレベルは，例えばＨＰＬＣにより測
定することができる。
は，最初に細胞培養から見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，
最初に細胞培養アッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮して循環濃度範囲を達
成するような用量を処方することができる（例えば，蛋白質複合体の最大破壊の
半分，または複合体成分の細胞レベルおよび／または活性の阻害の半分を達成す
る試験化合物の濃度）。そのような情報を用いて，ヒトにおいて有用な用量をさ
らに正確に決定することができる。血漿中のレベルは，例えばＨＰＬＣにより測
定することができる。
【０１６７】
正確な製剤，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮し
て選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈ
ｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
て選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈ
ｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０１６８】
担当医師は，毒性または組織不全のために，投与をいつどのように終了し，中
断し，または調節するかがわかるであろうことに注意すべきである。逆に，担当
医師は臨床応答が不適切な場合には治療をより高いレベルに調節することがわか
るであろう（毒性を排除しながら）。目的とする発癌性疾患の管理において投与
される用量の程度は，治療すべき状態の重篤度および投与経路に依存するであろ
う。状態の重篤度は，例えば，部分的には，標準的な予後評価法により評価する
ことができる。さらに，用量およびおそらくは投与頻度はまた，個々の患者の年
齢，体重および応答にしたがって様々であろう。獣医学においても上述したもの
に匹敵するプログラムを用いることができる。
断し，または調節するかがわかるであろうことに注意すべきである。逆に，担当
医師は臨床応答が不適切な場合には治療をより高いレベルに調節することがわか
るであろう（毒性を排除しながら）。目的とする発癌性疾患の管理において投与
される用量の程度は，治療すべき状態の重篤度および投与経路に依存するであろ
う。状態の重篤度は，例えば，部分的には，標準的な予後評価法により評価する
ことができる。さらに，用量およびおそらくは投与頻度はまた，個々の患者の年
齢，体重および応答にしたがって様々であろう。獣医学においても上述したもの
に匹敵するプログラムを用いることができる。
【０１６９】
治療すべき特定の状態によって，そのような薬剤を処方し，全身にまたは局所
に投与することができる。処方および投与の技術は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"１９９０，１８ｔｈ
ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見い
だすことができる。適切な経路には，例示にすぎないが，経口，直腸，経皮，膣
，経粘膜または腸投与，非経口輸送，例えば筋肉内，皮下，脊髄内，ならびに包
膜内，直接脳室内，静脈内，腹腔内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
に投与することができる。処方および投与の技術は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"１９９０，１８ｔｈ
ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見い
だすことができる。適切な経路には，例示にすぎないが，経口，直腸，経皮，膣
，経粘膜または腸投与，非経口輸送，例えば筋肉内，皮下，脊髄内，ならびに包
膜内，直接脳室内，静脈内，腹腔内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
【０１７０】
注射用には，本発明の薬剤は水溶性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル
溶液，または生理的塩類緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方すること
ができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が製剤に用いられ
る。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
溶液，または生理的塩類緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方すること
ができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が製剤に用いられ
る。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０１７１】
本発明を実施するために，薬学的に許容される担体を用いて本明細書に記載さ
れる化合物を全身投与に適した投与量で処方することは，本発明の範囲内である
。担体および適当な製造の実施を適切に選択することにより，本発明の組成物，
特に溶液として処方された組成物を非経口的に，例えば静脈内注射として投与す
ることができる。化合物は，当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容し
うる担体を用いて，経口投与に適した投与量で容易に製剤することができる。そ
のような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠
剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等とし
て製剤することを可能とする。
れる化合物を全身投与に適した投与量で処方することは，本発明の範囲内である
。担体および適当な製造の実施を適切に選択することにより，本発明の組成物，
特に溶液として処方された組成物を非経口的に，例えば静脈内注射として投与す
ることができる。化合物は，当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容し
うる担体を用いて，経口投与に適した投与量で容易に製剤することができる。そ
のような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠
剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等とし
て製剤することを可能とする。
【０１７２】
細胞内に投与することが意図される薬剤は，当業者によく知られる手法を用い
て投与することができる。例えば，そのような薬剤は，リポソーム中に封入し，
次に上述したように投与することができる。リポソームは，水性の内部を有する
球形の脂質二重層である。リポソームを形成する時に水性溶液中に存在するすべ
ての分子は，水性内部に取り込まれる。リポソームの内容物は，外部微小環境か
ら保護され，かつ，リポソームが細胞膜と融合するため細胞質内に効率的に輸送
される。さらに，その疎水性のため，小さい有機分子を細胞内に直接投与するこ
とができる。
て投与することができる。例えば，そのような薬剤は，リポソーム中に封入し，
次に上述したように投与することができる。リポソームは，水性の内部を有する
球形の脂質二重層である。リポソームを形成する時に水性溶液中に存在するすべ
ての分子は，水性内部に取り込まれる。リポソームの内容物は，外部微小環境か
ら保護され，かつ，リポソームが細胞膜と融合するため細胞質内に効率的に輸送
される。さらに，その疎水性のため，小さい有機分子を細胞内に直接投与するこ
とができる。
【０１７３】
本発明において用いるのに適した医薬組成物には，活性成分が意図する目的を
達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。有効量の決定は，特に
本明細書に提供される詳細な開示にしたがえば，十分に当業者の能力の範囲内で
ある。
達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。有効量の決定は，特に
本明細書に提供される詳細な開示にしたがえば，十分に当業者の能力の範囲内で
ある。
【０１７４】
これらの医薬組成物は，活性成分の他に，活性化合物を薬学的に使用すること
ができる製剤に加工することを容易にする，賦形剤および補助剤等の適当な薬学
的に許容される担体を含むことができる。経口投与用に処方される製剤は，例え
ば，錠剤，糖衣錠，カプセルまたは溶液の形態でありうる。
ができる製剤に加工することを容易にする，賦形剤および補助剤等の適当な薬学
的に許容される担体を含むことができる。経口投与用に処方される製剤は，例え
ば，錠剤，糖衣錠，カプセルまたは溶液の形態でありうる。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は，当該技術分野において知られる方法，例えば慣用の混
合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾
燥により製造することができる。
合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾
燥により製造することができる。
【０１７６】
非経口投与用の薬剤組成物は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。
さらに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製すること
ができる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン
酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を
含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビ
トール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいて
もよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当
該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
さらに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製すること
ができる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン
酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を
含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビ
トール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいて
もよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当
該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０１７７】
経口使用のための医薬製剤は，活性化合物を固体賦形剤と混合し，得られた混
合物を任意に破砕し，所望ならばさらに他の適当な補助剤を添加した後に，顆粒
混合物を加工して錠剤または糖衣剤のコアを得ることにより得ることができる。
適当な賦形剤は，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトー
ルを含む糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャ
ガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセル
ロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナ
トリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤である。
所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸ま
たはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
合物を任意に破砕し，所望ならばさらに他の適当な補助剤を添加した後に，顆粒
混合物を加工して錠剤または糖衣剤のコアを得ることにより得ることができる。
適当な賦形剤は，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトー
ルを含む糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャ
ガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセル
ロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナ
トリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤である。
所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸ま
たはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０１７８】
糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加す
ることができる。
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加す
ることができる。
【０１７９】
経口投与することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフィ
ットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロールやソルビトール等の可塑剤
から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分
を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよび
ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含む
ことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，
または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁すること
ができる。さらに安定剤を添加してもよい。
ットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロールやソルビトール等の可塑剤
から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分
を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよび
ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含む
ことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，
または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁すること
ができる。さらに安定剤を添加してもよい。
【０１８０】
患者に投与すべき化合物の量を決定する方法，および化合物を生物に投与する
モードは，米国特許０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および
国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）に記載されており，
これらの両方とも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，これに容易に適合しう
ることを理解するであろう。
モードは，米国特許０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および
国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）に記載されており，
これらの両方とも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，これに容易に適合しう
ることを理解するであろう。
【０１８１】
適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療している疾病のタイプ，用いられ
る特定の組成物，および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は，最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，最初に細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮して循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
る特定の組成物，および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は，最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，最初に細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮して循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
【０１８２】
薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器におけ
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
【０１８３】
毒性研究は，血液細胞組成を測定することにより実施することもできる。例え
ば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる
１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２
）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３
）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細
胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，
毒性が存在するか否かを示す。
ば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる
１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２
）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３
）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細
胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，
毒性が存在するか否かを示す。
【０１８４】
各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
【０１８５】
癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／日
，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲
である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であ
るかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲
である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であ
るかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０１８６】
血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であ
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０１８７】
ホスファターゼ調節活性を有するかもしれない化合物群の例には，例えば，限
定されないが，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎ
ｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１４５７−１４
６８（本明細書の一部としてここに引用する）に開示される非ペプチジル化合物
，Ｂｕｒｋｅ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２９１−３０４およびＢｕｒｋｅ，Ｊｒ
．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４７：２２５−２４１に
記載される化合物が含まれる。
定されないが，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎ
ｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１４５７−１４
６８（本明細書の一部としてここに引用する）に開示される非ペプチジル化合物
，Ｂｕｒｋｅ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２９１−３０４およびＢｕｒｋｅ，Ｊｒ
．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４７：２２５−２４１に
記載される化合物が含まれる。
【０１８８】ＸＩ．疾病または疾患の診断道具として試料においてホスファターゼを検出する 方法
本発明はまた，疾病または疾患の診断道具として，試料においてホスファター
ゼを検出する方法に関する。該方法は，試料をハイブリダイゼーションアッセイ
条件下で本発明のホスファターゼをコードする核酸分子にハイブリダイズする核
酸プローブと接触させ，疾病の指標としてプローブ：標的領域の存在または量を
検出することにより実施することができる。該方法はまた，試料中の本発明のホ
スファターゼをコードする核酸標的領域を調節領域と比較し，疾病または疾患の
指標として標的領域と調節領域との間の配列または量の相違を検出することによ
り実施することができる。疾病または疾患は，癌，心不全において見られるよう
な病態生理学的低酸素症，および血管疾患であることができ，例えば，アテロー
ム性動脈硬化症，狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフ
ェーヴル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルン
スタッド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および
過誤腫でありうる。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚
部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，
胃癌，直腸結腸癌および甲状腺癌でありうる。
ゼを検出する方法に関する。該方法は，試料をハイブリダイゼーションアッセイ
条件下で本発明のホスファターゼをコードする核酸分子にハイブリダイズする核
酸プローブと接触させ，疾病の指標としてプローブ：標的領域の存在または量を
検出することにより実施することができる。該方法はまた，試料中の本発明のホ
スファターゼをコードする核酸標的領域を調節領域と比較し，疾病または疾患の
指標として標的領域と調節領域との間の配列または量の相違を検出することによ
り実施することができる。疾病または疾患は，癌，心不全において見られるよう
な病態生理学的低酸素症，および血管疾患であることができ，例えば，アテロー
ム性動脈硬化症，狭窄および発作，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフ
ェーヴル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルン
スタッド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，神経膠芽細胞腫，精神分裂病および
過誤腫でありうる。癌は，乳癌，神経膠芽細胞腫，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚
部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，
胃癌，直腸結腸癌および甲状腺癌でありうる。
【０１８９】ＸＩＩ．トランスジェニック動物
複雑なインビボ系においてホスファターゼ活性を研究するために有用なトラン
スジェニック動物もまた本発明により企図される。本発明に関連するトランスジ
ェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能である。ホスファターゼをコー
ドするＤＮＡ配列を受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させ
るか，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細
胞分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）
。本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイル
ス，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
スジェニック動物もまた本発明により企図される。本発明に関連するトランスジ
ェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能である。ホスファターゼをコー
ドするＤＮＡ配列を受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させ
るか，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細
胞分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）
。本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイル
ス，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０１９０】
胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
【０１９１】
齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
【０１９２】
一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウス
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０を参照）。
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０を参照）。
【０１９３】
胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウ
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０１９４】
ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクロ
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０１９５】
ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
【０１９６】
すなわち，本発明は，ホスファターゼポリペプチドをコードするトランスジン
またはホスファターゼポリペプチドを発現させる遺伝子を含有するトランスジェ
ニックの非ヒト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺
乳動物は，ホスファターゼポリペプチドの導入の効果を研究するため，またはホ
スファターゼポリペプチドの発現を制御（すなわち，追加の遺伝子，アンチセン
ス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビボ試験系として特に
有用である。
またはホスファターゼポリペプチドを発現させる遺伝子を含有するトランスジェ
ニックの非ヒト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺
乳動物は，ホスファターゼポリペプチドの導入の効果を研究するため，またはホ
スファターゼポリペプチドの発現を制御（すなわち，追加の遺伝子，アンチセン
ス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビボ試験系として特に
有用である。
【０１９７】
"トランスジェニック動物"とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトホスファターゼポリペプチドをコードすることができる。動物における
自然の発現は，レセプターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡを与えることにより減少させることができる。
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトホスファターゼポリペプチドをコードすることができる。動物における
自然の発現は，レセプターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡを与えることにより減少させることができる。
【０１９８】ＸＩＩＩ．遺伝子治療
ホスファターゼまたはその遺伝子配列は，変異しているものおよびしていない
もののいずれも，遺伝子治療においても有用である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，
Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩に
より，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治療に対する実用的なアプロ
ーチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９９３）に記載されている。
もののいずれも，遺伝子治療においても有用である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，
Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩に
より，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治療に対する実用的なアプロ
ーチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９９３）に記載されている。
【０１９９】
１つの好ましい態様においては，ホスファターゼコーディング配列またはホス
ファターゼ変異体コーディング配列を含む発現ベクターを細胞に挿入し，細胞を
インビトロで成長させ，次にこれを大量に患者に注入する。別の好ましい態様に
おいては，選択されたプロモーター（例えば，強いプロモーター）を含むＤＮＡ
セグメントを，内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性
ホスファターゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーター
セグメントをこれが内因性ホスファターゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に
移送する）。
ファターゼ変異体コーディング配列を含む発現ベクターを細胞に挿入し，細胞を
インビトロで成長させ，次にこれを大量に患者に注入する。別の好ましい態様に
おいては，選択されたプロモーター（例えば，強いプロモーター）を含むＤＮＡ
セグメントを，内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性
ホスファターゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーター
セグメントをこれが内因性ホスファターゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に
移送する）。
【０２００】
遺伝子治療には，適当な細胞タイプを標的とするホスファターゼｃＤＮＡを含
むアデノウイルスを用いて，工学処理した細胞を移植することにより，ホスファ
ターゼウイルスを注入することにより，または裸のホスファターゼＤＮＡを適当
な細胞または組織，例えばニューロンに注入することにより，全身のホスファタ
ーゼを増加させることを含むことができる。
むアデノウイルスを用いて，工学処理した細胞を移植することにより，ホスファ
ターゼウイルスを注入することにより，または裸のホスファターゼＤＮＡを適当
な細胞または組織，例えばニューロンに注入することにより，全身のホスファタ
ーゼを増加させることを含むことができる。
【０２０１】
ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，ア
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えホスファ
ターゼ蛋白質をコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団
（例えば腫瘍細胞またはニューロン）に輸送することができる。当業者によく知
られる方法を用いて，コーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築す
ることができる（例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕ
ｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．
，１９８９に記載される手法を参照）。あるいは，蛋白質配列をコードする組換
え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的細胞への輸送のため
のリポソームまたは他の脂質系において用いることができる（例えば，Ｆｅｌｇ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８，１９８９）。ヒト
遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞内に直接輸送するい
くつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白質に複合体化させる
ことによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングすることを含む（Ｍｉ
ｌｌｅｒ，上掲）。
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えホスファ
ターゼ蛋白質をコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団
（例えば腫瘍細胞またはニューロン）に輸送することができる。当業者によく知
られる方法を用いて，コーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築す
ることができる（例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕ
ｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．
，１９８９に記載される手法を参照）。あるいは，蛋白質配列をコードする組換
え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的細胞への輸送のため
のリポソームまたは他の脂質系において用いることができる（例えば，Ｆｅｌｇ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８，１９８９）。ヒト
遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞内に直接輸送するい
くつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白質に複合体化させる
ことによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングすることを含む（Ｍｉ
ｌｌｅｒ，上掲）。
【０２０２】
最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【０２０３】
また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結
合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みお
よび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅ
ｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結
合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みお
よび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅ
ｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２０４】
本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【０２０５】
本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であ
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
【０２０６】
別の好ましい態様においては，ホスファターゼをコードする核酸配列を有する
ベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。
組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２
年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
ベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。
組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２
年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２０７】
上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２０８】
別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【０２０９】
以下の実施例は限定的なものではなく，単に本発明の種々の観点および特徴の
代表例にすぎない。以下の実施例は，本発明のセリン／トレオニンホスファター
ゼの単離および特性決定を示す。
代表例にすぎない。以下の実施例は，本発明のセリン／トレオニンホスファター
ゼの単離および特性決定を示す。
【０２１０】実施例１：新規哺乳動物蛋白質ホスファターゼをコードするｃＤＮＡクローンの 単離
新規クローンの同定および単離
新規な蛋白質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は，隠れマルコフモデル（Ｈ
ＭＭ；ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）で構築した哺乳動物お
よび酵母ホスファターゼ触媒ドメイン配列を用いて公共のＥＳＴデータベースか
ら同定した。二重特異性ホスファターゼは，哺乳動物および非哺乳動物起源から
の９３個のＤＳＰから構築したＨＭＭモデル（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓ
ｔｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｔｄｅｓｃ？ｎａｍｅ＝ＤＳＰｃ）を用い
て同定した。ＥＳＴは，６種類のオープンリーディングフレームで翻訳し，モデ
ルに対して検索した。公共のＥＳＴデータベースはまた，種々のファミリーの代
表的なメンバー，例えばヒトＤＵＳ６，ヒトＭＴＭ１，およびヒトＰＴＥＮ１を
用いてＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）により探索した。Ｈ
ＭＭに対して少なくとも１０のスコアまたはＢＬＡＳＴ検索で１．００より低い
Ｅ値を有したＥＳＴは，次に反復配列およびベクターについてマスクし，ＭＳＡ
を用いて分類した。得られたコンティグを既知のホスファターゼに対して検索し
て，新規ホスファターゼをコードするＥＳＴクローンを同定した。ＥＳＴおよび
ＰＣＲフラグメントの全配列決定は，サイクルシークエンシングＢｉｇ−ｄｙｅ
キットを用い，ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。シークエンシング反応生成物は，ＡＢ
Ｉ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＤＮＡシークエンサーにかけた。
ＭＭ；ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）で構築した哺乳動物お
よび酵母ホスファターゼ触媒ドメイン配列を用いて公共のＥＳＴデータベースか
ら同定した。二重特異性ホスファターゼは，哺乳動物および非哺乳動物起源から
の９３個のＤＳＰから構築したＨＭＭモデル（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓ
ｔｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｔｄｅｓｃ？ｎａｍｅ＝ＤＳＰｃ）を用い
て同定した。ＥＳＴは，６種類のオープンリーディングフレームで翻訳し，モデ
ルに対して検索した。公共のＥＳＴデータベースはまた，種々のファミリーの代
表的なメンバー，例えばヒトＤＵＳ６，ヒトＭＴＭ１，およびヒトＰＴＥＮ１を
用いてＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）により探索した。Ｈ
ＭＭに対して少なくとも１０のスコアまたはＢＬＡＳＴ検索で１．００より低い
Ｅ値を有したＥＳＴは，次に反復配列およびベクターについてマスクし，ＭＳＡ
を用いて分類した。得られたコンティグを既知のホスファターゼに対して検索し
て，新規ホスファターゼをコードするＥＳＴクローンを同定した。ＥＳＴおよび
ＰＣＲフラグメントの全配列決定は，サイクルシークエンシングＢｉｇ−ｄｙｅ
キットを用い，ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。シークエンシング反応生成物は，ＡＢ
Ｉ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＤＮＡシークエンサーにかけた。
【０２１１】結果
ホスファターゼについては以下の略号を用いた：
ＤｓＰＴＰ 二重特異性蛋白質ホスファターゼ
ＤＵＳ 二重特異性ホスファターゼ
ＧＡＫ サイクリンＧ付随キナーゼ
ＭＫＰ ＭＡＰキナーゼホスファターゼ
ＭＴＭ 筋細管ミオパシー（ミオチューブラリン）ホスファターゼ
ＰＴＥＮ ホスファターゼおよびテンシンのホモログ
種については以下の略号を用いた
ＡＴ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ＣＥ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ
ＣＩ Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ
ＤＭ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ
Ｈ ヒト
Ｍ ネズミ
ＮＴ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
Ｒ ウサギ
ＳＣ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＳＰ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
【０２１２】
図３は，新規蛋白質ホスファターゼについて，推定ＯＲＦを用いて非重複蛋白
質データベース（ＮＲＰデータベース）ならびに本明細書に記載される新規ホス
ファターゼを用いて構築したデータベース（レポジトリまたは"Ｒ"）に対して行
ったアミノ酸配列アラインメントを開示する。アラインメントは，スミス−ウォ
ーターマンアルゴリズムを用いて，ＰＡＭ １００マトリックステーブルおよび
それぞれ１４および１のギャップオープンおよび伸長ペナルティーで行った。図
３は，"％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ"，"ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｍａｔｃｈ"，"Ｄｂａｓ
ｅ"および"Ｈｉｔ ｓｐ"を示し，"Ｄｂａｓｅ ｈｉｔ"および"Ｈｉｔ Ａｃｃ
"は，各クエリーのベストヒットに対する同一性のパーセンテージの計算値を，
マッチしたもののデータベース起源，種，説明，および受託番号とともに表す。
質データベース（ＮＲＰデータベース）ならびに本明細書に記載される新規ホス
ファターゼを用いて構築したデータベース（レポジトリまたは"Ｒ"）に対して行
ったアミノ酸配列アラインメントを開示する。アラインメントは，スミス−ウォ
ーターマンアルゴリズムを用いて，ＰＡＭ １００マトリックステーブルおよび
それぞれ１４および１のギャップオープンおよび伸長ペナルティーで行った。図
３は，"％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ"，"ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｍａｔｃｈ"，"Ｄｂａｓ
ｅ"および"Ｈｉｔ ｓｐ"を示し，"Ｄｂａｓｅ ｈｉｔ"および"Ｈｉｔ Ａｃｃ
"は，各クエリーのベストヒットに対する同一性のパーセンテージの計算値を，
マッチしたもののデータベース起源，種，説明，および受託番号とともに表す。
【０２１３】実施例２．新規哺乳動物蛋白質ホスファターゼの染色体上の位置
２０個の新規蛋白質ホスファターゼの８個について，染色体上の位置（ＣＨＲ
位置）を図１に示す。
位置）を図１に示す。
【０２１４】
いくつかの起源を用いて，本明細書に記載される遺伝子のそれぞれの染色体位
置に関する情報を見いだした。最初に，核酸配列の受託番号を用いてＵｎｉｇｅ
ｎｅデータベースのクエリーを行った。Ｕｎｉｇｅｎｅ検索エンジンを含むサイ
トは：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅ
ｎｅ／Ｈｓ．Ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌである。Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中のマッ
プ位置の情報は，いくつかの起源から輸入されている。例えば，ｔｈｅ Ｏｎｌ
ｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩ
Ｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓ
ｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ），Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（
ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｇｄｂ／ｓｉｍｐｌｅＳ
ｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ），およびｔｈｅ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．
ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８０００／ｃｇｉｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｓｔｓｉｎｆ
ｏ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ｒｅｌｅａｓｅ）である。例えば，ＵｎｉｇｅｎｅをＡ
Ａ８１３１２３（ＭＫＰ様ホスファターゼ（配列番号１９）のＥＳＴ）で検索す
ると以下の情報が得られる：Ｘ：ＤＸＳ１０６１−ＤＸＳ１０３９。この遺伝子
の染色体Ｘの細胞遺伝学マップの"表意文字"上の位置も提供され，ＡＡ８１３１
２３がＸｐ１１．４−ｑ１２にマップされることが示される。Ｕｎｉｇｅｎｅが
ＥＳＴをマッピングしなければ，目的とする遺伝子の核酸を既にマップされてい
る配列を含むデータベース，例えばｄｂｓｔｓおよびｈｔｇｓ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｄａｔ
ａｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌに記載）に対してクエリーとして用いる。核酸配列は，
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ
−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔ）でＢＬＡＳＴ−２を用いて
検索し，ｄｂｓｔｓまたはｈｔｇｓのいずれかでクエリーとして用いる。上述し
たＷｈｉｔｅｈｅａｄおよびＧＤＢのサイトに加え，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙは，ＳＴＳデータからの染色体マッピングのための有用なサイト
を維持している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ
／ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒｆｏｒｍｎｅｗ．ｈｔｍｌ）。ｈｔｇｓに登録する際
にゲノム領域のヒットが注釈づけられているため，しばしばｈｔｇｓにおけるマ
ッチはただちに決定される。正確なマッチが見いだされれば（約１００塩基対ま
たはそれ以上の領域にわたる，反復配列を除く９９％の同一性としておおまかに
定義される），データベース中の収録物のマップされた位置を元のホスファター
ゼクエリーに割り当てる。これらの方法のいずれかにより細胞遺伝学的領域が同
定されれば，ＯＭＩＭを細胞遺伝学的位置で検索することにより，疾病との関連
を確立する。ＯＭＩＭは，疾病により系統づけられた細胞遺伝学的マップ位置の
検索可能なカタログを維持する。細胞遺伝学的領域についての入手可能な文献の
徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）を用いて行うこと
ができる。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体異常との関連
についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ
ｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことができる。
置に関する情報を見いだした。最初に，核酸配列の受託番号を用いてＵｎｉｇｅ
ｎｅデータベースのクエリーを行った。Ｕｎｉｇｅｎｅ検索エンジンを含むサイ
トは：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅ
ｎｅ／Ｈｓ．Ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌである。Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中のマッ
プ位置の情報は，いくつかの起源から輸入されている。例えば，ｔｈｅ Ｏｎｌ
ｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩ
Ｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓ
ｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ），Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（
ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｇｄｂ／ｓｉｍｐｌｅＳ
ｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ），およびｔｈｅ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．
ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８０００／ｃｇｉｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｓｔｓｉｎｆ
ｏ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ｒｅｌｅａｓｅ）である。例えば，ＵｎｉｇｅｎｅをＡ
Ａ８１３１２３（ＭＫＰ様ホスファターゼ（配列番号１９）のＥＳＴ）で検索す
ると以下の情報が得られる：Ｘ：ＤＸＳ１０６１−ＤＸＳ１０３９。この遺伝子
の染色体Ｘの細胞遺伝学マップの"表意文字"上の位置も提供され，ＡＡ８１３１
２３がＸｐ１１．４−ｑ１２にマップされることが示される。Ｕｎｉｇｅｎｅが
ＥＳＴをマッピングしなければ，目的とする遺伝子の核酸を既にマップされてい
る配列を含むデータベース，例えばｄｂｓｔｓおよびｈｔｇｓ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｄａｔ
ａｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌに記載）に対してクエリーとして用いる。核酸配列は，
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ
−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔ）でＢＬＡＳＴ−２を用いて
検索し，ｄｂｓｔｓまたはｈｔｇｓのいずれかでクエリーとして用いる。上述し
たＷｈｉｔｅｈｅａｄおよびＧＤＢのサイトに加え，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙは，ＳＴＳデータからの染色体マッピングのための有用なサイト
を維持している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ
／ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒｆｏｒｍｎｅｗ．ｈｔｍｌ）。ｈｔｇｓに登録する際
にゲノム領域のヒットが注釈づけられているため，しばしばｈｔｇｓにおけるマ
ッチはただちに決定される。正確なマッチが見いだされれば（約１００塩基対ま
たはそれ以上の領域にわたる，反復配列を除く９９％の同一性としておおまかに
定義される），データベース中の収録物のマップされた位置を元のホスファター
ゼクエリーに割り当てる。これらの方法のいずれかにより細胞遺伝学的領域が同
定されれば，ＯＭＩＭを細胞遺伝学的位置で検索することにより，疾病との関連
を確立する。ＯＭＩＭは，疾病により系統づけられた細胞遺伝学的マップ位置の
検索可能なカタログを維持する。細胞遺伝学的領域についての入手可能な文献の
徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）を用いて行うこと
ができる。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体異常との関連
についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ
ｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことができる。
【０２１５】染色体マッピングの結果
配列番号２５ ＳＧＰ０３３，２ｑ３３−ｑ３７．２にマッピング
この領域は，Ｉ型糖尿病のかかりやすさと関連づけられている（Ｍａｒｒｏｎ，
ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０００ Ｍａｒ；４９（３）：４９２−９）
。
ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０００ Ｍａｒ；４９（３）：４９２−９）
。
【０２１６】
配列番号１７ ＬＯＣ５１２０７（ＡＡ４３５５１３），ｌＯｑ２１．３にマッ
ピング 染色体１０ｑのアレル喪失は，ヒト肺癌腫瘍の進行および転移表現型（Ｐｅｔｅ
ｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９８；７７（２）：２
７０−６），および前立腺腫瘍成長（Ｌａｃｏｍｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ
Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９６ Ａｐｒ ２２；６９（２）：１１０−３）．と関
連づけられている。さらに染色体１０上の２つの腫瘍抑制遺伝子座がヒト神経膠
芽細胞腫に関与することが示されている（Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
Ｃａｎｃｅｒ １９９５ Ａｐｒ；１２（４）：２５５−６１）。
ピング 染色体１０ｑのアレル喪失は，ヒト肺癌腫瘍の進行および転移表現型（Ｐｅｔｅ
ｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９８；７７（２）：２
７０−６），および前立腺腫瘍成長（Ｌａｃｏｍｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ
Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９６ Ａｐｒ ２２；６９（２）：１１０−３）．と関
連づけられている。さらに染色体１０上の２つの腫瘍抑制遺伝子座がヒト神経膠
芽細胞腫に関与することが示されている（Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
Ｃａｎｃｅｒ １９９５ Ａｐｒ；１２（４）：２５５−６１）。
【０２１７】
配列番号２９ ＭＫＰ５はｌｑ３２．１にマッピングされている。
この領域は，腎臓集合管癌腫に関与しているかもしれない（Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｇ
，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９６ Ｎｏｖ １；５６（２１）：
５０４４−６）。この領域はまた，大頭症およびファンデルワンデ症候群におけ
る関与が示唆されている（Ｋｅｎｗｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｓ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ
Ｇｅｎｅｔ．１９９３ Ｓｅｐ；２（９）：１４６１−２）。
，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９６ Ｎｏｖ １；５６（２１）：
５０４４−６）。この領域はまた，大頭症およびファンデルワンデ症候群におけ
る関与が示唆されている（Ｋｅｎｗｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｓ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ
Ｇｅｎｅｔ．１９９３ Ｓｅｐ；２（９）：１４６１−２）。
【０２１８】
配列番号２３ ＹＶＨ１（ＡＡ９２３１５８），ｌｑ２１．２−ｑ２１．３にマ
ッピング ｌｑ２１の染色体異常は，ＣＮＳ疾患および癌に連鎖が認められている。Ｆａｎ
ａｎａｓらは，分裂病患者におけるｌｑ２１の染色体脆性部位を記載した（Ａｍ
Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９７）１５４：７−１６）。Ｚｉｍｏｎｊｉ
ｃ ＤＢらは，比較ゲノムハイブリダイゼーションにより同定されたヒト肝細胞
癌細胞株における新規な回帰的遺伝不均衡がこの領域にマップされることを記載
する（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９９）４：１２０８−１４）。原発性乳癌に
おいて染色体ｌｑの別個の領域の喪失および獲得の両方が示されている（Ｂｉｅ
ｃｈｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９５）１：１
２３−７）。
ッピング ｌｑ２１の染色体異常は，ＣＮＳ疾患および癌に連鎖が認められている。Ｆａｎ
ａｎａｓらは，分裂病患者におけるｌｑ２１の染色体脆性部位を記載した（Ａｍ
Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９７）１５４：７−１６）。Ｚｉｍｏｎｊｉ
ｃ ＤＢらは，比較ゲノムハイブリダイゼーションにより同定されたヒト肝細胞
癌細胞株における新規な回帰的遺伝不均衡がこの領域にマップされることを記載
する（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９９）４：１２０８−１４）。原発性乳癌に
おいて染色体ｌｑの別個の領域の喪失および獲得の両方が示されている（Ｂｉｅ
ｃｈｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９５）１：１
２３−７）。
【０２１９】
配列番号１９ ＡＡ８１３１２３，Ｘｐ１１．４−ｑ１２にマッピング
Ｘｐ１１に関与する転座が，種々のヒト癌と関連づけられている。例えば，ほと
んどの滑膜肉腫は，Ｘｐ１１と１８ｑ１１．２．との間の特定の染色体転座によ
り特徴づけられる（Ｗｉｌｌｅｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ
１９９８；３４（１３）：２０８７−９３）。Ｐｅｒｏｔらは，９歳および２
９歳の２人の女性患者における，Ｘｐ１１とｌｑ２１との間の転座を有する乳頭
腎細胞癌（ＲＣＣ）の２つの事例を報告している（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ
Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ（１９９９）１１０：５４−６）。
んどの滑膜肉腫は，Ｘｐ１１と１８ｑ１１．２．との間の特定の染色体転座によ
り特徴づけられる（Ｗｉｌｌｅｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ
１９９８；３４（１３）：２０８７−９３）。Ｐｅｒｏｔらは，９歳および２
９歳の２人の女性患者における，Ｘｐ１１とｌｑ２１との間の転座を有する乳頭
腎細胞癌（ＲＣＣ）の２つの事例を報告している（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ
Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ（１９９９）１１０：５４−６）。
【０２２０】
配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，２２ｑ１２．１−ｑｔｅｒにマッピング
２２ｑの頻繁な遺伝子座の欠失がヒト膵臓内分泌腫瘍と関連づけられている（Ｃ
ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：３７０６−
１１）。このことは，この領域が１またはそれ以上の腫瘍サプレッサー座を含む
ことを示唆する。
ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：３７０６−
１１）。このことは，この領域が１またはそれ以上の腫瘍サプレッサー座を含む
ことを示唆する。
【０２２１】
配列番号３１ ＮＰ＿０６０７４６，１１ｑ１２−ｑ１３．２にマッピング
この領域は，高頻度の染色体獲得および高レベルの増幅を特徴とする副腎皮質癌
腫への関与が示唆されている（Ｄｏｈｎａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｊｕｎ ２８（２）：１４５
−５２）。
腫への関与が示唆されている（Ｄｏｈｎａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｊｕｎ ２８（２）：１４５
−５２）。
【０２２２】
配列番号３７ ＭＴＭＲ７（ＡＡ６６３８７５），８ｐ２２にマッピング
この領域は，結腸癌に関与する腫瘍サプレッサー遺伝子を有することが示唆され
ている（Ｌｅｒｅｂｏｕｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．（１９９９）２：１４７−５３）。ＡＡ６６３８７５をコ
ードする遺伝子を含むゲノムクローン，ＡＢ０２０８６１が同定されている。Ａ
Ｂ０２０８６１は８ｐ２１．３−ｐ２２のヒトゲノムＤＮＡを表し，肝細胞，結
腸直腸，および非小細胞肺癌の抗オンコジンを含むと注釈されている（Ｎａｋａ
ｍｕｒａ，Ｙ．ａｎｄＩｓｏｍｕｒａ，Ｍ．，（ｉｎｐｒｅｓｓ）ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎｐｏｓｔ／Ｅｎｔｒ
ｅｚ／ｑｕｅｒｙ？ｕｉｄ＝４００３３８１＆ｆｏｒｍ＝６＆ｄｂ＝ｎ＆Ｄｏｐ
ｔ＝ｇ）。
ている（Ｌｅｒｅｂｏｕｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．（１９９９）２：１４７−５３）。ＡＡ６６３８７５をコ
ードする遺伝子を含むゲノムクローン，ＡＢ０２０８６１が同定されている。Ａ
Ｂ０２０８６１は８ｐ２１．３−ｐ２２のヒトゲノムＤＮＡを表し，肝細胞，結
腸直腸，および非小細胞肺癌の抗オンコジンを含むと注釈されている（Ｎａｋａ
ｍｕｒａ，Ｙ．ａｎｄＩｓｏｍｕｒａ，Ｍ．，（ｉｎｐｒｅｓｓ）ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎｐｏｓｔ／Ｅｎｔｒ
ｅｚ／ｑｕｅｒｙ？ｕｉｄ＝４００３３８１＆ｆｏｒｍ＝６＆ｄｂ＝ｎ＆Ｄｏｐ
ｔ＝ｇ）。
【０２２３】実施例３．新規哺乳動物蛋白質ホスファターゼの発現分析
遺伝子発現分析
組織アレイ
種々の起源に由来する"ｃＤＮＡライブラリ"をナイロン膜に固定化し，目的と
する遺伝子に由来する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメントで探索した。ＲＮＡの
起源は図３に示される。すなわち：１）Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈａｉｎ．ｃｏｍ／
ｍａｉｎ３．ｈｔｍｌ）；２）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）；３）ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍにより用いられた哺乳動物細
胞株（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；ＡＴＣＣから購入可
能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃａｔａｌｏｇｓ．ｈｔｍｌ）
；４）ＰａｔｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｉｃ．ｃｏ
ｍ／ｃｏｍｐａｎｙ／ｓｕｂｓｉｄｉａｒｉｅｓ／ｐａｉ．ｈｔｍｌ；Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ｃＤＮＡアレイを調製するプロトコルは
以下に詳述する。
する遺伝子に由来する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメントで探索した。ＲＮＡの
起源は図３に示される。すなわち：１）Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈａｉｎ．ｃｏｍ／
ｍａｉｎ３．ｈｔｍｌ）；２）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）；３）ｔｈｅ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍにより用いられた哺乳動物細
胞株（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；ＡＴＣＣから購入可
能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃａｔａｌｏｇｓ．ｈｔｍｌ）
；４）ＰａｔｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｉｃ．ｃｏ
ｍ／ｃｏｍｐａｎｙ／ｓｕｂｓｉｄｉａｒｉｅｓ／ｐａｉ．ｈｔｍｌ；Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ｃＤＮＡアレイを調製するプロトコルは
以下に詳述する。
【０２２４】
組織および培養細胞からの総ＲＮＡの調製
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２００３４
５） １．０ｇの組織を１０ｍｌの溶液Ｄ中でホモジナイズするか，または１０−１
００ｍｍディッシュ（ａ）からの組織培養細胞ペレットを１０ｍｌの溶液Ｄに再
懸濁する。ピペット上下により細胞を溶解させる。 １／１０容量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を加える。反転させて混合
する。 等量のフェノール（ｐＨ５．３−５．７）を加え，反転させて混合する。 １／５容量のクロロホルム−イソアミルアルコールを加え，１０秒間激しく撹
拌する。 管を氷上で１５分間インキュベートする。 管を４℃で１０，０００ｘｇ，２０分間遠心分離する。上部水性相を新たな管
に移す。下部のフェノール相は廃棄する。 等量のイソプロパノールを水性相に加え，反転させて混合する。 管を−２０℃で＞１時間インキュベートして，ＲＮＡを沈殿させる。 ４℃で１０，０００ｘｇ，２０分間遠心分離する。遠心分離後，管の底のペレ
ットはＲＮＡを含有する。 上清を除去し，廃棄する。 ペレットを３．０ｍｌの溶液Ｄに溶解する。 ３．０ｍｌのイソプロパノールを加え，反転させて混合する。 −２０℃で１時間インキュベートする。 ４℃で１０，０００ｘｇ，１０分間遠心分離する。 上清を除去し，廃棄する。 ペレットを７５％（ｖ／ｖ）エタノール：ＤＥＰＣ処理水（２５％）で洗浄す
る。 ペレットを真空下で２−５分間乾燥させる。乾燥させすぎない。 ＲＮＡを所望の容量のＤＥＰＣ処理水に再懸濁させる。 −８０℃で保存する。 入手可能な組織または細胞の量により，プロトコルをそれにしたがってスケー
ルアップまたはダウンすることができる。
５） １．０ｇの組織を１０ｍｌの溶液Ｄ中でホモジナイズするか，または１０−１
００ｍｍディッシュ（ａ）からの組織培養細胞ペレットを１０ｍｌの溶液Ｄに再
懸濁する。ピペット上下により細胞を溶解させる。 １／１０容量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を加える。反転させて混合
する。 等量のフェノール（ｐＨ５．３−５．７）を加え，反転させて混合する。 １／５容量のクロロホルム−イソアミルアルコールを加え，１０秒間激しく撹
拌する。 管を氷上で１５分間インキュベートする。 管を４℃で１０，０００ｘｇ，２０分間遠心分離する。上部水性相を新たな管
に移す。下部のフェノール相は廃棄する。 等量のイソプロパノールを水性相に加え，反転させて混合する。 管を−２０℃で＞１時間インキュベートして，ＲＮＡを沈殿させる。 ４℃で１０，０００ｘｇ，２０分間遠心分離する。遠心分離後，管の底のペレ
ットはＲＮＡを含有する。 上清を除去し，廃棄する。 ペレットを３．０ｍｌの溶液Ｄに溶解する。 ３．０ｍｌのイソプロパノールを加え，反転させて混合する。 −２０℃で１時間インキュベートする。 ４℃で１０，０００ｘｇ，１０分間遠心分離する。 上清を除去し，廃棄する。 ペレットを７５％（ｖ／ｖ）エタノール：ＤＥＰＣ処理水（２５％）で洗浄す
る。 ペレットを真空下で２−５分間乾燥させる。乾燥させすぎない。 ＲＮＡを所望の容量のＤＥＰＣ処理水に再懸濁させる。 −８０℃で保存する。 入手可能な組織または細胞の量により，プロトコルをそれにしたがってスケー
ルアップまたはダウンすることができる。
【０２２５】
総ヒトＲＮＡからのｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡの調製
試薬および装置
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）
グリコゲン，ＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏ中２ｍｇ／ｍＬ
１．−８０℃で保存された総ＲＮＡを溶解する。
２．１５０ｕＬＲＮＡ（約０．３−１ｍｇ），１５０ｕＬ２Ｘ結合緩衝液，お
よび５５ｕＬ Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ樹脂を混合する。 ３．６５℃で３分間加熱してＲＮＡを変性させる。 ４．室温に１０分間冷却して，ｍＲＮＡを樹脂にアニーリングさせる。 ５．微小遠心分離器で２分間遠心することにより，結合したｍＲＮＡを含む樹
脂を沈降させる。 ６．樹脂を６００ｕＬの洗浄緩衝液に，激しくボルテックスすることにより再
懸濁させる。 ７．微小遠心分離器で２分間遠心することにより，樹脂を沈降させる（ａ）。 ８．樹脂を６００ｕＬの洗浄緩衝液に再懸濁させる。 ９．Ｑｉａｇｅｎスピンカラムに移す。 １０．微小遠心分離器で３０秒間遠心分離することにより洗浄緩衝液を除去す
る。 １１．樹脂を３３ｕＬの８０℃溶出緩衝液に再懸濁させる（ｂ）。 １２．３０秒間遠心分離し，ｍＲＮＡを含む溶出液を新たな管に移す。 １３．追加の３３ｕＬｘ２容量の８０℃溶出緩衝液で残りのｍＲＮＡをスピン
カラム中のＯｌｉｇｏｔｅｘ樹脂から溶出させる。 １４．３つの３３ｕＬｍＲＮＡを合わせる。 １５．１ｕＬのグリコゲン，１０ｕＬの２．５Ｍ酢酸ナトリウムおよび２２０
ｕＬの１００％エタノールを加え，管を−８０℃で一夜置く。 １６．４℃，３０分間の遠心分離によりｍＲＮＡを沈降させる。 １７．Ｓｐｅｅｄｖａｃ中でｍＲＮＡペレットを乾燥する。 １８．ペレットを１１ｕＬの１ｘＴＥ（ｐＨ８．０）に再懸濁する（ｃ）。 １９．定量には１．０ｕＬを用いる（ｄ）。 ２０．０．１ｕｇ／ｕＬに希釈する。 ２１．収率は１．０ｍｇの総ＲＮＡから２０−２５ｕｇのｍＲＮＡであるはず
である。 （ａ）エッペンドルフ管中で第１回の洗浄を行い（例えば"バッチ洗浄"により
），スピンカラムを詰まらせる粒子および破片を除く（任意）。 （ｂ）スピンカラムを含むエッペンドルフ管を８０℃で３０秒間加熱して，ｍ
ＲＮＡの溶出を助ける。これを行わないと，ｍＲＮＡの収率が低下する。 （ｃ）溶液を０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理してリボ
ヌクレアーゼを不活性化させる。 （ｄ）０．１ｍＬのＳｙｂｅｒ ＧｒｅｅｎＩＩ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ ＃Ｓ−７５８５）溶液中で１．０ｕＬのＲＮＡを用いて濃度を決定
する。蛍光をＲＮＡ標準物質の蛍光と比較して濃度を決定する。
よび５５ｕＬ Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ樹脂を混合する。 ３．６５℃で３分間加熱してＲＮＡを変性させる。 ４．室温に１０分間冷却して，ｍＲＮＡを樹脂にアニーリングさせる。 ５．微小遠心分離器で２分間遠心することにより，結合したｍＲＮＡを含む樹
脂を沈降させる。 ６．樹脂を６００ｕＬの洗浄緩衝液に，激しくボルテックスすることにより再
懸濁させる。 ７．微小遠心分離器で２分間遠心することにより，樹脂を沈降させる（ａ）。 ８．樹脂を６００ｕＬの洗浄緩衝液に再懸濁させる。 ９．Ｑｉａｇｅｎスピンカラムに移す。 １０．微小遠心分離器で３０秒間遠心分離することにより洗浄緩衝液を除去す
る。 １１．樹脂を３３ｕＬの８０℃溶出緩衝液に再懸濁させる（ｂ）。 １２．３０秒間遠心分離し，ｍＲＮＡを含む溶出液を新たな管に移す。 １３．追加の３３ｕＬｘ２容量の８０℃溶出緩衝液で残りのｍＲＮＡをスピン
カラム中のＯｌｉｇｏｔｅｘ樹脂から溶出させる。 １４．３つの３３ｕＬｍＲＮＡを合わせる。 １５．１ｕＬのグリコゲン，１０ｕＬの２．５Ｍ酢酸ナトリウムおよび２２０
ｕＬの１００％エタノールを加え，管を−８０℃で一夜置く。 １６．４℃，３０分間の遠心分離によりｍＲＮＡを沈降させる。 １７．Ｓｐｅｅｄｖａｃ中でｍＲＮＡペレットを乾燥する。 １８．ペレットを１１ｕＬの１ｘＴＥ（ｐＨ８．０）に再懸濁する（ｃ）。 １９．定量には１．０ｕＬを用いる（ｄ）。 ２０．０．１ｕｇ／ｕＬに希釈する。 ２１．収率は１．０ｍｇの総ＲＮＡから２０−２５ｕｇのｍＲＮＡであるはず
である。 （ａ）エッペンドルフ管中で第１回の洗浄を行い（例えば"バッチ洗浄"により
），スピンカラムを詰まらせる粒子および破片を除く（任意）。 （ｂ）スピンカラムを含むエッペンドルフ管を８０℃で３０秒間加熱して，ｍ
ＲＮＡの溶出を助ける。これを行わないと，ｍＲＮＡの収率が低下する。 （ｃ）溶液を０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理してリボ
ヌクレアーゼを不活性化させる。 （ｄ）０．１ｍＬのＳｙｂｅｒ ＧｒｅｅｎＩＩ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ ＃Ｓ−７５８５）溶液中で１．０ｕＬのＲＮＡを用いて濃度を決定
する。蛍光をＲＮＡ標準物質の蛍光と比較して濃度を決定する。
【０２２６】
ｍＲＮＡまたは総ＲＮＡからのｓｓＤＮＡの調製
試薬および装置
総ＲＮＡまたはｍＲＮＡ
プライマーＣＤＳ５７−ｍｅｒ（オリゴｄＴ３０−ｍｅｒを含む）：
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ３０ＶＮ（Ｖ＝Ａ，Ｇ
，Ｃ Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ） プライマーＭＬ２Ｇ３０−ｍｅｒ： ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧ １００ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
＃２７−２０５０，−２０６０，−２０７０，−２０８０） ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮＡｓｅＨ-リバーストランスクリプターゼ
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１８０６４−０１４） １．２５０ｕＬＰＣＲ管において，４．０ｕＬの総ｍＲＮＡ（ａ）（１００ｎｇ
／ｕＬ）（ｂ），１．０ｕＬのオリゴ−ｄＴ含有プライマーＣＤＳ（１０ｕｍ／
ｕＬ）を混合する。 ２．ｍＲＮＡを７２℃で２分間変性させ，直ちに氷上に２分間置く。 ３．微小遠心管で室温で軽く遠心する。 ４．室温で；２ｕＬの５Ｘ第１鎖緩衝液（ＢＲＬより酵素とともに提供），１
ｕＬ ＤＴＴ（２０ｍＭ），１ｕＬ ５０ＸｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）お
よび１ｕＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩリバーストランスクリプターゼ（２
００Ｕ／ｕＬ）を加え，総反応容量を１０ｕＬとする。 ５．ピペットチップを穏やかに回すことにより混合する。 ６．反応を室温で５分間インキュベートする。 ７．ポリアデニル化ＲＮＡを空気インキュベータ中で４２℃で１時間逆転写す
る。 ８．１ｕＬのＭＬ２Ｇオリゴを加え，ピペットチップを用いて混合する。 ９．室温で５分間インキュベートする。 １０．４２℃でさらに１５分間インキュベートする。 １１．９０ｕＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えることにより反応を
停止し，−２０℃で１時間または二本鎖ｃＤＮＡの作成に必要になるまで凍結す
る。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡから総ｍＲＮＡ
を精製する。１０ｎｇ程度の少量のｐｏｌｙＡ+選択 ｍＲＮＡを用いて，良好
な質のｄｓＤＮＡを作成することができた。 ｂ．同じプロトコルにしたがい，総ＲＮＡからｓｓＤＮＡを作成する。総ＲＮ
ＡからｓｓＤＮＡを作成するためには，１ｕｇの総ＲＮＡを使用することが好ま
しいが，５０−２００ｎｇの総ＲＮＡ量を用いても良好な結果を得ることができ
る。ｃ．２００ｎｇより多いｍＲＮＡを用いた場合には，４４０ｕＬのＴｒｉｓ
緩衝液を加える。
，Ｃ Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ） プライマーＭＬ２Ｇ３０−ｍｅｒ： ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧ １００ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
＃２７−２０５０，−２０６０，−２０７０，−２０８０） ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮＡｓｅＨ-リバーストランスクリプターゼ
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１８０６４−０１４） １．２５０ｕＬＰＣＲ管において，４．０ｕＬの総ｍＲＮＡ（ａ）（１００ｎｇ
／ｕＬ）（ｂ），１．０ｕＬのオリゴ−ｄＴ含有プライマーＣＤＳ（１０ｕｍ／
ｕＬ）を混合する。 ２．ｍＲＮＡを７２℃で２分間変性させ，直ちに氷上に２分間置く。 ３．微小遠心管で室温で軽く遠心する。 ４．室温で；２ｕＬの５Ｘ第１鎖緩衝液（ＢＲＬより酵素とともに提供），１
ｕＬ ＤＴＴ（２０ｍＭ），１ｕＬ ５０ＸｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）お
よび１ｕＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩリバーストランスクリプターゼ（２
００Ｕ／ｕＬ）を加え，総反応容量を１０ｕＬとする。 ５．ピペットチップを穏やかに回すことにより混合する。 ６．反応を室温で５分間インキュベートする。 ７．ポリアデニル化ＲＮＡを空気インキュベータ中で４２℃で１時間逆転写す
る。 ８．１ｕＬのＭＬ２Ｇオリゴを加え，ピペットチップを用いて混合する。 ９．室温で５分間インキュベートする。 １０．４２℃でさらに１５分間インキュベートする。 １１．９０ｕＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えることにより反応を
停止し，−２０℃で１時間または二本鎖ｃＤＮＡの作成に必要になるまで凍結す
る。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡから総ｍＲＮＡ
を精製する。１０ｎｇ程度の少量のｐｏｌｙＡ+選択 ｍＲＮＡを用いて，良好
な質のｄｓＤＮＡを作成することができた。 ｂ．同じプロトコルにしたがい，総ＲＮＡからｓｓＤＮＡを作成する。総ＲＮ
ＡからｓｓＤＮＡを作成するためには，１ｕｇの総ＲＮＡを使用することが好ま
しいが，５０−２００ｎｇの総ＲＮＡ量を用いても良好な結果を得ることができ
る。ｃ．２００ｎｇより多いｍＲＮＡを用いた場合には，４４０ｕＬのＴｒｉｓ
緩衝液を加える。
【０２２７】
逆転写反応において総ＲＮＡまたはｍＲＮＡをテンプレートとして用いて，各
末端で特定の配列でタグ付けされた一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を生成した
。特異的配列を含むオリゴｄＴプライマー（ＣＤＳ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡ
ＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ30ＶＮ（Ｖ＝Ａ，Ｇ，Ｃ Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）
）は，ｍＲＮＡの３’末端でポリＡトラックにアニーリングし，リバーストラン
スクリプターゼ（ＭＭＬＶ ＲｎａｓｅＨ-）は，ＲＮＡ鎖の末端に到達するま
でアンチセンス鎖を転写し，ここで追加のＣ残基を加える。３つのＧで終わるプ
ライマー（ＳＭＩＩ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧ
ＣＧＧＧまたはＭＬ２Ｇ：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡ
ＣＧＣＧＧＧ）を加えると，これは付加されたＣにアニーリングし，ＭＭＬＶは
プライマー配列の残りをテンプレートとして認識して，転写を続ける。その結果
，合成されたｃＤＮＡは，５’末端および３’末端の両方に特定の配列タグを含
む。５’末端と３’末端が同じ配列でタグ付けされた場合（ＣＤＳおよびＳＭＩ
Ｉ），これは"対称"と称される。５’末端が３’末端とは異なる配列でタグ付け
された場合（ＣＤＳおよびＭＬ２Ｇ），これは"非対称"と称される。次に，二本
鎖"ｃＤＮＡライブラリ"は，付加された配列タグにアニーリングする３’ＰＣＲ
およびＭＬ２プライマー（３’ＰＣＲ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣ
ＡＧＡＧＴおよびＭＬ２：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴ）
を用いて，ＰＣＲ増幅により生成する。
末端で特定の配列でタグ付けされた一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を生成した
。特異的配列を含むオリゴｄＴプライマー（ＣＤＳ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡ
ＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ30ＶＮ（Ｖ＝Ａ，Ｇ，Ｃ Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）
）は，ｍＲＮＡの３’末端でポリＡトラックにアニーリングし，リバーストラン
スクリプターゼ（ＭＭＬＶ ＲｎａｓｅＨ-）は，ＲＮＡ鎖の末端に到達するま
でアンチセンス鎖を転写し，ここで追加のＣ残基を加える。３つのＧで終わるプ
ライマー（ＳＭＩＩ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧ
ＣＧＧＧまたはＭＬ２Ｇ：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡ
ＣＧＣＧＧＧ）を加えると，これは付加されたＣにアニーリングし，ＭＭＬＶは
プライマー配列の残りをテンプレートとして認識して，転写を続ける。その結果
，合成されたｃＤＮＡは，５’末端および３’末端の両方に特定の配列タグを含
む。５’末端と３’末端が同じ配列でタグ付けされた場合（ＣＤＳおよびＳＭＩ
Ｉ），これは"対称"と称される。５’末端が３’末端とは異なる配列でタグ付け
された場合（ＣＤＳおよびＭＬ２Ｇ），これは"非対称"と称される。次に，二本
鎖"ｃＤＮＡライブラリ"は，付加された配列タグにアニーリングする３’ＰＣＲ
およびＭＬ２プライマー（３’ＰＣＲ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣ
ＡＧＡＧＴおよびＭＬ２：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴ）
を用いて，ＰＣＲ増幅により生成する。
【０２２８】
細胞株および凍結組織からのｄｓ ｃＤＮＡの直線増幅
試薬および装置
一本鎖ｃＤＮＡ
プライマー ＰＣＲ ２３−ｍｅｒ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡ
ＧＡＧＴ プライマー ＭＬ２ ２３−ｍｅｒ：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣ
ＧＣＧＴ １００ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
＃２７−２０５０，−２０６０，−２０７０，−２０８０） Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃８４３０−
２） 実時間ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ，Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒまたはＢｉｏＲａｄ，ｉ
Ｃｙｃｌｅｒ） Ｓｙｂｅｒ ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＃Ｓ−７５８
５） １．一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡ（ａ）を，蛍光ヌクレオチドの存在下でＰＣ
Ｒにより直線的に増幅させて二本鎖ｃＤＮＡプローブを得る。増幅の間に必要な
最適なサイクルは各試料についてあらかじめ決定しておかなければならない。 ２．一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより直線的に増幅して二本鎖ｃＤＮＡを得る。
増幅の直線性は，実時間ＰＣＲ装置において蛍光によりモニターする。 ３．５０．０ｕＬ反応あたり，１．０ｕＬ ｓｓ ｃＤＮＡテンプレート，５
．０ｕＬ １０Ｘ Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ緩衝液，１．０ｕＬプライマ
ーＰＣＲ（１０ｐｍ／ｐＬ），１．０ｕＬプライマーＭＬ２（１０ｕｍ／ｍＬ）
，１．０ｕＬ ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ），１．０ｕＬ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
Ｉ（保存溶液の１：１，０００希釈）（ａ）１．０ｕＬ Ａｄｖａｎｔａｇｅ２
ポリメラーゼミックスおよび３９．０ｕＬ Ｈ2Ｏを加える。よく混合し，実時
間ＰＣＲ装置中に置く。 ４．以下の条件で増幅する：９５℃，１分間，次に３５サイクルの，９５℃，
５秒間，６５℃，５秒間，６８℃，６分間。 ５．各試料について，サイクルの最適数を決定する。 ６．５．０ｕＬのテンプレートを用い，ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ染料を省略し，
Ｈ2Ｏを３５ｕＬに調節して，工程２を繰り返す。工程４で決定した数の２サイ
クル少なく増幅する。 （ａ）ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎは光感受性である。 （ｂ）蛍光が直線的に上昇する傾きが増幅の直線範囲である。最適のサイクル
数は，曲線の直線部分中の最高数である。この数はいくぶん保守的に決定する方
がよい。 （ｃ）この工程は，蛍光プローブを作成するのに用いることができるほぼ無限
の量のｃＤＮＡを生成し，これは場合によっては望ましいであろう。出発物質が
限定された量のものでなければ，この工程は省略して，ｓｓ ｃＤＮＡから蛍光
プローブを直接作成することができる。
ＧＡＧＴ プライマー ＭＬ２ ２３−ｍｅｒ：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣ
ＧＣＧＴ １００ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
＃２７−２０５０，−２０６０，−２０７０，−２０８０） Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃８４３０−
２） 実時間ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ，Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒまたはＢｉｏＲａｄ，ｉ
Ｃｙｃｌｅｒ） Ｓｙｂｅｒ ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＃Ｓ−７５８
５） １．一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡ（ａ）を，蛍光ヌクレオチドの存在下でＰＣ
Ｒにより直線的に増幅させて二本鎖ｃＤＮＡプローブを得る。増幅の間に必要な
最適なサイクルは各試料についてあらかじめ決定しておかなければならない。 ２．一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより直線的に増幅して二本鎖ｃＤＮＡを得る。
増幅の直線性は，実時間ＰＣＲ装置において蛍光によりモニターする。 ３．５０．０ｕＬ反応あたり，１．０ｕＬ ｓｓ ｃＤＮＡテンプレート，５
．０ｕＬ １０Ｘ Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ緩衝液，１．０ｕＬプライマ
ーＰＣＲ（１０ｐｍ／ｐＬ），１．０ｕＬプライマーＭＬ２（１０ｕｍ／ｍＬ）
，１．０ｕＬ ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ），１．０ｕＬ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
Ｉ（保存溶液の１：１，０００希釈）（ａ）１．０ｕＬ Ａｄｖａｎｔａｇｅ２
ポリメラーゼミックスおよび３９．０ｕＬ Ｈ2Ｏを加える。よく混合し，実時
間ＰＣＲ装置中に置く。 ４．以下の条件で増幅する：９５℃，１分間，次に３５サイクルの，９５℃，
５秒間，６５℃，５秒間，６８℃，６分間。 ５．各試料について，サイクルの最適数を決定する。 ６．５．０ｕＬのテンプレートを用い，ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ染料を省略し，
Ｈ2Ｏを３５ｕＬに調節して，工程２を繰り返す。工程４で決定した数の２サイ
クル少なく増幅する。 （ａ）ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎは光感受性である。 （ｂ）蛍光が直線的に上昇する傾きが増幅の直線範囲である。最適のサイクル
数は，曲線の直線部分中の最高数である。この数はいくぶん保守的に決定する方
がよい。 （ｃ）この工程は，蛍光プローブを作成するのに用いることができるほぼ無限
の量のｃＤＮＡを生成し，これは場合によっては望ましいであろう。出発物質が
限定された量のものでなければ，この工程は省略して，ｓｓ ｃＤＮＡから蛍光
プローブを直接作成することができる。
【０２２９】アレイ作成および探索
増幅された"ｃＤＮＡライブラリ"は，３８４ピンのレプリケータを用いて手動
でナイロン膜に配列させた。プローブの生成のプロトコルおよびハイブリダイズ
条件は，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（３巻セット），Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，および製造元のプロトコル
に見いだすことができる。簡単には，アルカリ処理によりＤＮＡを変性させ，中
和し，ＵＶ光で架橋させた。アレイをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）でプレハイブリダイズさせ，目的とする遺伝子に対応するｃＤＮＡフラグメン
トのランダムヘキサマープライミング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＰｒｉｍｅＩｔ
Ｋｉｔ； Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ）により生成した32Ｐ標識プローブ
でハイブリダイズさせた。洗浄後，ブロットをホスファーイメージングカセット
に露光し，シグナルの強度を定量した（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉ
ｎｃ，Ｓｔ Ｃａｔｈｅｒｉｎｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）。アレイ上のＤＮ
Ａの量はまた，非変性または変性アレイを，それぞれＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
ＩまたはＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／）で２分間処理することにより定
量した（１：１００，０００，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０中）。５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で洗浄した後，蛍光放出をホスファーイメージャー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄｙｎ．ｃｏ
ｍ／）で検出し，ＡＩＳソフトウエアを用いて定量した。配列されたＤＮＡの量
を用いてハイブリダイゼーションシグナルを標準化し，補正された値を表３に示
す。
でナイロン膜に配列させた。プローブの生成のプロトコルおよびハイブリダイズ
条件は，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（３巻セット），Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，および製造元のプロトコル
に見いだすことができる。簡単には，アルカリ処理によりＤＮＡを変性させ，中
和し，ＵＶ光で架橋させた。アレイをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）でプレハイブリダイズさせ，目的とする遺伝子に対応するｃＤＮＡフラグメン
トのランダムヘキサマープライミング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＰｒｉｍｅＩｔ
Ｋｉｔ； Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ）により生成した32Ｐ標識プローブ
でハイブリダイズさせた。洗浄後，ブロットをホスファーイメージングカセット
に露光し，シグナルの強度を定量した（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉ
ｎｃ，Ｓｔ Ｃａｔｈｅｒｉｎｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）。アレイ上のＤＮ
Ａの量はまた，非変性または変性アレイを，それぞれＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
ＩまたはＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／）で２分間処理することにより定
量した（１：１００，０００，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０中）。５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で洗浄した後，蛍光放出をホスファーイメージャー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄｙｎ．ｃｏ
ｍ／）で検出し，ＡＩＳソフトウエアを用いて定量した。配列されたＤＮＡの量
を用いてハイブリダイゼーションシグナルを標準化し，補正された値を表３に示
す。
【０２３０】結果
本明細書に記載される蛋白質ホスファターゼのマイクロアレイ発現分析の結果
は図３に示される。データは，左から右に以下のものを表す："Ｓａｍｐｌｅ"，
試料の名前；"ｓｏｕｒｃｅ"，試料がどこから得られたか；"ｔａｇ"，対称また
は非対称プローブが用いられたかによりｓｙｍまたはａｓｙｍ（対称と非対称の
定義については以下を参照）；"ｔｙｐｅ"は組織タイプを表す（略号：ｈｅｍｅ
−造血；ｐｒｏ−前立腺；ＯＶ−卵巣；ｅｎｄ−内分泌；ｍｅｌ−メラノーマ；
ｎｅｕｒｏ−神経；ｌｅｕ−白血病；ｃｏｌ−結腸，ＭＧ−乳腺；"ｃｏｍｍｅ
ｎｔｓ"，組織起源についてのコメント；"Ｔｕｍｏｒ ｓｙｍ"は，組織が腫瘍
に由来することを示す，"ｓｙｍ"は，試料を作成するために用いた５’および３
’プライマーが同じであることを表す；"Ｎｏｒｍａｌ Ｓｙｍ"は，試料を作成
するために正常組織，および上述のように対称プライマーを用いたことを示す；
"Ｔｕｍｏｒ １°"は，原発性腫瘍組織を用いてｃＤＮＡを作成したことを示す
；"Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ"は，これらのｃＤＮＡ試料が培養腫瘍細胞から作成
されたことを示す；"Ｎｏｒｍａｌ"は，これらの試料が正常組織または細胞株に
由来することを示す；"ｐ５３"は，起源試料中のｐ５３遺伝子の状態，すなわち
変異体または野生型を表す。標準化された発現の値は，次のカラムにおいてその
配列番号で表される各遺伝子について示されている。図３に示される遺伝子は，
アクチン，配列番号１１ ＡＡ３７４７５３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２
，配列番号２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ０６０７４６（Ｇ７７
−８−１４），配列番号３３ ＮＰ０６０２３２（ＡＡ２３２３８４），配列番
号３７ ＭＴＭＲ７（ＡＡ６６３８７５），および配列番号３９ ＡＡ４９３９
１５である。
は図３に示される。データは，左から右に以下のものを表す："Ｓａｍｐｌｅ"，
試料の名前；"ｓｏｕｒｃｅ"，試料がどこから得られたか；"ｔａｇ"，対称また
は非対称プローブが用いられたかによりｓｙｍまたはａｓｙｍ（対称と非対称の
定義については以下を参照）；"ｔｙｐｅ"は組織タイプを表す（略号：ｈｅｍｅ
−造血；ｐｒｏ−前立腺；ＯＶ−卵巣；ｅｎｄ−内分泌；ｍｅｌ−メラノーマ；
ｎｅｕｒｏ−神経；ｌｅｕ−白血病；ｃｏｌ−結腸，ＭＧ−乳腺；"ｃｏｍｍｅ
ｎｔｓ"，組織起源についてのコメント；"Ｔｕｍｏｒ ｓｙｍ"は，組織が腫瘍
に由来することを示す，"ｓｙｍ"は，試料を作成するために用いた５’および３
’プライマーが同じであることを表す；"Ｎｏｒｍａｌ Ｓｙｍ"は，試料を作成
するために正常組織，および上述のように対称プライマーを用いたことを示す；
"Ｔｕｍｏｒ １°"は，原発性腫瘍組織を用いてｃＤＮＡを作成したことを示す
；"Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ"は，これらのｃＤＮＡ試料が培養腫瘍細胞から作成
されたことを示す；"Ｎｏｒｍａｌ"は，これらの試料が正常組織または細胞株に
由来することを示す；"ｐ５３"は，起源試料中のｐ５３遺伝子の状態，すなわち
変異体または野生型を表す。標準化された発現の値は，次のカラムにおいてその
配列番号で表される各遺伝子について示されている。図３に示される遺伝子は，
アクチン，配列番号１１ ＡＡ３７４７５３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２
，配列番号２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ０６０７４６（Ｇ７７
−８−１４），配列番号３３ ＮＰ０６０２３２（ＡＡ２３２３８４），配列番
号３７ ＭＴＭＲ７（ＡＡ６６３８７５），および配列番号３９ ＡＡ４９３９
１５である。
【０２３１】
一例として，種々の組織起源のＲＮＡ試料から作成したｃＤＮＡをナイロン膜
上にスポットし，目的とするホスファターゼ遺伝子から導いた放射性標識プロー
ブでハイブリダイズした。図３を参照すると，用いたホスファターゼ遺伝子配列
には以下のものが含まれる：配列番号１１ ＡＡ３７４７５３，配列番号２１
ＡＡ９１５９３２，配列番号２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ０６
０７４６Ｇ７７−８−１４，配列番号３３ ＮＰ０６０２３２ ＡＡ２３２３８
４，配列番号３７ ＭＴＭＲ７，およびＡＡ６６３８７５，配列番号３９ ＡＡ
４９３９１５。本明細書において議論するように，正常組織，腫瘍組織，種々の
細胞株，およびＰ５３野生型および変異型からの試料を用いて，発現アレイを作
成した。種々の組織起源における試験したホスファターゼ遺伝子の相対的遺伝子
発現レベルは，ハイブリダイズしたシグナルのＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ染色を測
定することにより定量した。図に記載される数値の読みは，バックグラウンド計
数を差し引いた後，ｃＤＮＡまたは非変性プローブからのハイブリダイゼーショ
ン結果に対して標準化した。
上にスポットし，目的とするホスファターゼ遺伝子から導いた放射性標識プロー
ブでハイブリダイズした。図３を参照すると，用いたホスファターゼ遺伝子配列
には以下のものが含まれる：配列番号１１ ＡＡ３７４７５３，配列番号２１
ＡＡ９１５９３２，配列番号２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ０６
０７４６Ｇ７７−８−１４，配列番号３３ ＮＰ０６０２３２ ＡＡ２３２３８
４，配列番号３７ ＭＴＭＲ７，およびＡＡ６６３８７５，配列番号３９ ＡＡ
４９３９１５。本明細書において議論するように，正常組織，腫瘍組織，種々の
細胞株，およびＰ５３野生型および変異型からの試料を用いて，発現アレイを作
成した。種々の組織起源における試験したホスファターゼ遺伝子の相対的遺伝子
発現レベルは，ハイブリダイズしたシグナルのＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ染色を測
定することにより定量した。図に記載される数値の読みは，バックグラウンド計
数を差し引いた後，ｃＤＮＡまたは非変性プローブからのハイブリダイゼーショ
ン結果に対して標準化した。
【０２３２】
本明細書に記載される対応する核酸およびアミノ酸配列の情報と合わせて，図
３中の意味のある発現レベルは，目的とするホスファターゼ遺伝子の種々の組織
起源における発現プロファイルを構成する。そのような発現プロファイルのデー
タは，本発明にしたがう治療計画の用途の指針となる。例えば，図３の登録物"
原発性腎臓細胞腺癌（ＮＣＩ７８６−０）"を参照すると，配列番号１１ ＡＡ
３７４７５３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，配列番号２７ ＡＩ０３１６
５６，配列番号３３ ＮＰ＿０６０２３２ ＡＡ２３２３８４および配列番号３
９ ＡＡ４９３９１５の発現のレベルは０である。配列番号３１ ＮＰ＿０６０
７４６ Ｇ７７−８−１４（２０３）の発現のレベルは限界点である。しかし，
配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５の発現のレベルは有意に高い（２
１０７）。このような垂直比較は，配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７
５によりコードされるホスファターゼ遺伝子の腎臓癌における関与が示唆される
ことを示す。すなわち，この遺伝子の機能活性を操作することにより，腎臓癌の
癌状態が影響を受けるかもしれない。図２に示されるように，配列番号３７ Ｍ
ＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５は，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓミオチューブラリン
関連蛋白質７である，ＭＴＭ様ホスファターゼをコードする。したがって，本発
明にしたがって腎臓癌に関連した癌状態を治療する方法は，例えば，ミオチュー
ブラリン関連蛋白質７のホスファターゼ活性の活性を調節しうる薬剤を患者に投
与することでありうる。すなわち，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は
，開示される治療方法に特異性および有効性を与える。
３中の意味のある発現レベルは，目的とするホスファターゼ遺伝子の種々の組織
起源における発現プロファイルを構成する。そのような発現プロファイルのデー
タは，本発明にしたがう治療計画の用途の指針となる。例えば，図３の登録物"
原発性腎臓細胞腺癌（ＮＣＩ７８６−０）"を参照すると，配列番号１１ ＡＡ
３７４７５３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，配列番号２７ ＡＩ０３１６
５６，配列番号３３ ＮＰ＿０６０２３２ ＡＡ２３２３８４および配列番号３
９ ＡＡ４９３９１５の発現のレベルは０である。配列番号３１ ＮＰ＿０６０
７４６ Ｇ７７−８−１４（２０３）の発現のレベルは限界点である。しかし，
配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５の発現のレベルは有意に高い（２
１０７）。このような垂直比較は，配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７
５によりコードされるホスファターゼ遺伝子の腎臓癌における関与が示唆される
ことを示す。すなわち，この遺伝子の機能活性を操作することにより，腎臓癌の
癌状態が影響を受けるかもしれない。図２に示されるように，配列番号３７ Ｍ
ＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５は，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓミオチューブラリン
関連蛋白質７である，ＭＴＭ様ホスファターゼをコードする。したがって，本発
明にしたがって腎臓癌に関連した癌状態を治療する方法は，例えば，ミオチュー
ブラリン関連蛋白質７のホスファターゼ活性の活性を調節しうる薬剤を患者に投
与することでありうる。すなわち，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は
，開示される治療方法に特異性および有効性を与える。
【０２３３】
また，これらのデータから診断の場面における用途が見いだされる。同じ実施
例を参照すると，図３における登録物である原発性腎臓細胞腺癌（ＮＣＩ７８６
−０）について，配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５の発現のレベル
は，試験した他の全てのホスファターゼ遺伝子（配列番号１１ ＡＡ３７４７５
３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，配列番号３３ ＮＰ＿０６０２３２ Ａ
Ａ２３２３８４，配列番号２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ＿０６
０７４６ Ｇ７７−８−１４，および配列番号３９ ＡＡ４９３９１５）と比較
して優位に高い（２１０７）。したがって，この比較は，配列番号３７ ＭＴＭ
Ｒ７ ＡＡ６６３８７５によりコードされるホスファターゼ遺伝子の発現の正し
いレベルが，腎臓癌状態と相関していることを示す。したがって，この遺伝子は
，腎臓癌状態のある程度の信頼性のあるレベルを有する診断マーカーとして用い
ることができる。この点に関して，多重マーカーに基づく診断試験を行って試験
結果を評価し，ここから導かれる診断の信頼性のレベルを高めることが推奨され
る。
例を参照すると，図３における登録物である原発性腎臓細胞腺癌（ＮＣＩ７８６
−０）について，配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５の発現のレベル
は，試験した他の全てのホスファターゼ遺伝子（配列番号１１ ＡＡ３７４７５
３，配列番号２１ ＡＡ９１５９３２，配列番号３３ ＮＰ＿０６０２３２ Ａ
Ａ２３２３８４，配列番号２７ ＡＩ０３１６５６，配列番号３１ ＮＰ＿０６
０７４６ Ｇ７７−８−１４，および配列番号３９ ＡＡ４９３９１５）と比較
して優位に高い（２１０７）。したがって，この比較は，配列番号３７ ＭＴＭ
Ｒ７ ＡＡ６６３８７５によりコードされるホスファターゼ遺伝子の発現の正し
いレベルが，腎臓癌状態と相関していることを示す。したがって，この遺伝子は
，腎臓癌状態のある程度の信頼性のあるレベルを有する診断マーカーとして用い
ることができる。この点に関して，多重マーカーに基づく診断試験を行って試験
結果を評価し，ここから導かれる診断の信頼性のレベルを高めることが推奨され
る。
【０２３４】
図２は，配列番号３７ ＭＴＭＲ７ ＡＡ６６３８７５がＨｏｍｏ ｓａｐｉ
ｅｎｓミオチューブラリン関連蛋白質７，すなわちＭＴＭ様ホスファターゼをコ
ードすることを示す。したがって，本発明にしたがう神経芽細胞腫と関係する癌
状態の診断方法は，試験試料（患者から回収することができる）を，Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓミオチューブラリン関連蛋白質７をコードする核酸配列にハイブ
リダイズすることができるヌクレオチドプローブと接触させ，次にハイブリダイ
ズしたプローブ：標的対の存在を検出し，そのようなハイブリダイゼーションの
レベルを神経芽細胞腫と関連する癌状態の指標として定量する。すなわち，本発
明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される診断方法に特異性および有
効性を与える。
ｅｎｓミオチューブラリン関連蛋白質７，すなわちＭＴＭ様ホスファターゼをコ
ードすることを示す。したがって，本発明にしたがう神経芽細胞腫と関係する癌
状態の診断方法は，試験試料（患者から回収することができる）を，Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓミオチューブラリン関連蛋白質７をコードする核酸配列にハイブ
リダイズすることができるヌクレオチドプローブと接触させ，次にハイブリダイ
ズしたプローブ：標的対の存在を検出し，そのようなハイブリダイゼーションの
レベルを神経芽細胞腫と関連する癌状態の指標として定量する。すなわち，本発
明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される診断方法に特異性および有
効性を与える。
【０２３５】
現在のところ好ましい態様の代表的なものは，例示的なものであって，本発明
の範囲を限定することを意図するものではない。当業者がなすであろう，本発明
の精神の範囲内に含まれる変更および他の用途は，特許請求の範囲により定義さ
れている。
の範囲を限定することを意図するものではない。当業者がなすであろう，本発明
の精神の範囲内に含まれる変更および他の用途は，特許請求の範囲により定義さ
れている。
【０２３６】
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
【０２３７】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において言及されるすべてのそのよう
な文献，ならびに他の種々の引用は，明示的に述べていない場合であっても，本
明細書の一部としてここに引用される。
術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において言及されるすべてのそのよう
な文献，ならびに他の種々の引用は，明示的に述べていない場合であっても，本
明細書の一部としてここに引用される。
【０２３８】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
【０２３９】
特に，本明細書に記載されるある処方は処方に添加された賦形剤により同定さ
れるが，本発明はこれらの賦形剤の組み合わせにより形成される最終処方をもカ
バーすることを意味する。特に，本発明は，添加された賦形剤の１つないしすべ
てが処方の間に反応し，最終処方中にもはや存在しないかまたは変化した形で存
在する処方を含む。
れるが，本発明はこれらの賦形剤の組み合わせにより形成される最終処方をもカ
バーすることを意味する。特に，本発明は，添加された賦形剤の１つないしすべ
てが処方の間に反応し，最終処方中にもはや存在しないかまたは変化した形で存
在する処方を含む。
【０２４０】
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０２４１】
他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】 図１は，本発明のホスファターゼポリヌクレオチドの比較を示す
。
。
【図２】 図２は，本発明のホスファターゼの比較を示す。
【図３】 図３は，発現プロファイルからの結果を表す。
【図４】 図４は，本発明にしたがうヌクレオチド配列を示す。
【図５】 図５は，本発明にしたがうアミノ酸配列を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/04 ４Ｃ０８４
9/04 11/00 ４Ｈ０４５
11/00 13/00
13/00 13/12
13/12 15/00
15/00 17/00
17/00 21/00
21/00 25/00
25/00 25/18
25/18 27/02
27/02 35/00
35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40
Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 9/16 Ｂ
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02
9/16 1/42
15/02 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
1/42 33/50 Ｚ
1/68 33/53 Ｍ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/53 Ｂ
33/566 5/00 Ａ
Ｂ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 プラウマン，グレゴリー・ディー
アメリカ合衆国94070カリフォルニア州
サン カルロス，ワインディング ウェイ
35
(72)発明者 マルティネス，リカルド
アメリカ合衆国94404カリフォルニア州
フォスター・シティ，カルティエ・レーン
984
(72)発明者 ホワイト，デイビッド
アメリカ合衆国94010カリフォルニア州
バーリンゲイム，バークレイ・ウェイ
2623
(72)発明者 ヒル，ロン
アメリカ合衆国94002カリフォルニア州
ユニオン シティ，オーク グローブ
532
(72)発明者 フラナガン，ピーター
アメリカ合衆国94114カリフォルニア州
サンフランシスコ，アパートメント
＃３，ハートフォード 225
(72)発明者 リュービン，マリオ
アメリカ合衆国94403カリフォルニア州
サン マテオ，アパートメント エー310，
ロス プラドス 3014
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 FB02
4B024 AA01 AA11 BA11 BA44 CA04
DA06 EA04 GA11 HA01
4B050 CC03 DD11 LL01
4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ33 QQ44
QR13 QR32 QR55 QS31 QS34
4B065 AA90X AA92X AA99Y AB01
AB05 AC14 BA02 BA08 CA24
CA25 CA44 CA46
4C084 AA02 AA07 AA17 NA14 ZA182
ZA332 ZA362 ZA592 ZA662
ZA752 ZA812 ZA892 ZA942
ZB262
4H045 AA11 CA40 DA75 EA50 FA74
Claims (23)
- 【請求項１】 ポリペプチドをコードする単離された，濃縮されたまたは精
製された核酸分子であって，前記核酸分子は以下のヌクレオチド配列： （ａ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列
番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番
号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号
３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に記載さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）高度にストリンジェントな条件下で（ｂ）の分子にハイブリダイズし，か
つ天然に生ずるポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載される全長アミノ酸配列であっ
て，ただし，いずれかの図のそれぞれのドメイン境界に記載される番号付けされ
たアミノ酸残基の，全部ではないが少なくとも１またはそれ以上を欠失したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｆ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｈ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載される全長アミノ酸配列であっ
て，Ｎ−末端ドメイン，ホスファターゼドメインおよびＣ−末端ドメインからな
る群より選択されるドメインの，全部ではないが１またはそれ以上を欠失してい
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； （ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｊ）配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番
号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号
２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３
１，配列番号３３，配列番号４１，配列番号３７または配列番号３９に記載され
るヌクレオチド配列を有する；または （ｋ）（ｊ）に記載されるヌクレオチド配列の相補体である， を含むことを特徴とする核酸分子。 - 【請求項２】 宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまた
はプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸。 - 【請求項３】 前記核酸分子が，哺乳動物から単離された，濃縮されたまた
は精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項４】 前記哺乳動物がヒトである，請求項３記載の核酸分子。
- 【請求項５】 核酸分子を含む組換え細胞であって，前記核酸分子はいずれ
かの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１
つに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることを特徴とす
る組換え細胞。 - 【請求項６】 単離された，濃縮されたまたは精製されたポリペプチドであ
って，前記ポリペプチドは， （ａ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列
番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番
号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号
３２，配列番号３４，配列番号４２，配列番号３８または配列番号４０に記載さ
れるアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番
号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列であって，
ただしいずれかの図のそれぞれのドメイン境界により記載されるアミノ酸番号の
，全部ではないが少なくとも１またはそれ以上を欠失したアミノ酸配列； （ｃ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の少なくとも１つに記載されるアミノ
酸配列；または （ｄ）配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号１０，配列番号１２，配
列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列
番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２または配列番号３４，配
列番号３８，配列番号４０または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列であっ
て，ただし，以下のドメイン：Ｎ−末端ドメイン，Ｃ−末端ドメインまたはホス
ファターゼドメインの全部ではないが少なくとも１つを欠失したアミノ酸配列 を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。 - 【請求項７】 前記ポリペプチドが，哺乳動物から単離された，精製された
または濃縮されたものである，請求項６記載のポリペプチド。 - 【請求項８】 前記哺乳動物がヒトである，請求項７記載のポリペプチド。
- 【請求項９】 ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する特異的結合親
和性を有する抗体または抗体フラグメントであって，前記ポリペプチドまたはそ
のフラグメントはいずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれ
ぞれの組の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする
抗体または抗体フラグメント。 - 【請求項１０】 請求項９記載の抗体または抗体フラグメントを産生するハ
イブリドーマ。 - 【請求項１１】 ポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であっ
て， （ａ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチ
ドを試験物質と接触させ； （ｂ）ホスファターゼの活性を測定し；そして （ｃ）試験物質がホスファターゼの活性を調節するか否かを判定する の各工程を含む方法。 - 【請求項１２】 細胞においてホスファターゼ活性を調節する物質を同定す
る方法であって， （ａ）いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の
少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのホスファタ
ーゼを細胞において発現させ； （ｂ）試験物質を細胞に加え；そして （ｃ）（ｉ）細胞表現型の変化；または （ｉｉ）ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用 をモニターする の各工程を含む方法。 - 【請求項１３】 疾病または疾患を治療する方法であって，そのような治療
を必要とする患者に，いずれかの図に記載される番号付けされたアミノ酸残基の
それぞれの組の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を有するホスファター
ゼの活性を調節する物質を投与する工程を含む方法。 - 【請求項１４】 前記疾病または疾患が，癌，病態生理学的低酸素症，心不
全および／または血管疾患，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴ
ル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッ
ド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫からなる群より選
択される，請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 前記癌が，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌
，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経
膠芽細胞腫，直腸結腸癌および甲状腺癌からなる群より選択される，請求項１４
記載の方法。 - 【請求項１６】 前記物質がインビトロでホスファターゼの活性を調節する
，請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 前記物質がホスファターゼ活性を刺激することによりホス
ファターゼの活性を調節する，請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 疾病または疾患の診断道具として，試料中においてホスフ
ァターゼを検出する方法であって， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下でいずれかの図に記
載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記載さ
れるアミノ酸配列を有するホスファターゼをコードする核酸とハイブリダイズす
る核酸プローブと接触させ； （ｂ）疾病を示す指標としてプローブ：標的領域の存在または量を検出する の各工程を含む方法。 - 【請求項１９】 前記疾病または疾患が，癌，病態生理学的低酸素症，心不
全および／または血管疾患，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴ
ル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッ
ド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫からなる群より選
択される，請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 前記癌が，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌
，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経
膠芽細胞腫，直腸結腸癌および甲状腺癌からなる群より選択される，請求項１９
記載の方法。 - 【請求項２１】 疾病または疾患の診断道具として，試料中のホスファター
ゼを検出する方法であって， （ａ）試料中において核酸の核酸標的領域を調節領域と比較し，ここで前記核酸
は前記ホスファターゼをコードしており，前記ホスファターゼは，いずれかの図
に記載される番号付けされたアミノ酸残基のそれぞれの組の少なくとも１つに記
載されるアミノ酸配列を有しており； （ｂ）疾病または疾患の指標として，前記標的領域と前記調節領域との間の配列
または量の相違を検出する， の各工程を含む方法。 - 【請求項２２】 前記疾病または疾患が，癌，病態生理学的低酸素症，心不
全および／または血管疾患，ミオパシー，先天性筋疾患，パピヨン−ルフェーヴ
ル症候群，コウデン病，外胚葉性形成異常，メービウス症候群，ブヨルンスタッ
ド症候群，バーニヤンゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫からなる群より選
択される，請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 前記癌が，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌
，滑膜肉腫，腎細胞癌，非小細胞肺癌，肝細胞癌，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経
膠芽細胞腫，直腸結腸癌および甲状腺癌からなる群より選択される，請求項２２
記載の方法。
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-
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