JP2002541802A - チロシンキナーゼ基質（Ｔｋｓ）蛋白質 - Google Patents
チロシンキナーゼ基質（Ｔｋｓ）蛋白質Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は，新規なＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２ポリペプチド，新規ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々の関連疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は，新規なポリペプチド，新規ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列，ならびに種々の疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物およ
び方法に関する。
配列，ならびに種々の疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物およ
び方法に関する。
【０００２】発明の背景 本発明の背景の以下の記載は，本発明の理解を助けるために提供され，本発明
に対する先行技術であるかまたはそれを記載すると認めるものではない。
に対する先行技術であるかまたはそれを記載すると認めるものではない。
【０００３】 細胞シグナル伝達は，各種の細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリ
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学機序の
一つに，その構造と機能を変化させることで成熟蛋白質の活性を制御できる蛋白
質の可逆的リン酸化がある。
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学機序の
一つに，その構造と機能を変化させることで成熟蛋白質の活性を制御できる蛋白
質の可逆的リン酸化がある。
【０００４】 真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼはセリン，スレオニン
およびチロシン残基のヒドロキシ置換基で蛋白質をリン酸化する。これらのキナ
ーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン
酸化に特異的なものの２グループに大別される。”二重特異性”キナーゼと称さ
れるキナーゼはチロシンおよびセリン／トレオニン残基をリン酸化することがで
きる。
およびチロシン残基のヒドロキシ置換基で蛋白質をリン酸化する。これらのキナ
ーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン
酸化に特異的なものの２グループに大別される。”二重特異性”キナーゼと称さ
れるキナーゼはチロシンおよびセリン／トレオニン残基をリン酸化することがで
きる。
【０００５】 多くのキナーゼは，その基質がリン酸化状態により活性が制御される他のキナ
ーゼを含む制御カスケードに関与する。最終的に，そのような経路の活性化によ
り生ずるリン酸化によって，下流のエフェクターの活性が調節される。
ーゼを含む制御カスケードに関与する。最終的に，そのような経路の活性化によ
り生ずるリン酸化によって，下流のエフェクターの活性が調節される。
【０００６】 非レセプターチロシンキナーゼは，原形質膜にリクルートされ，ここで固有の
蛋白質チロシンキナーゼ活性を有しない細胞表面レセプターによる細胞シグナリ
ングを媒介する。例えば，蛋白質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのメンバ
ーは，成長因子レセプターおよびＧ−蛋白質共役レセプターの刺激，ならびに多
くの他の細胞外刺激に応答して活性化される（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，１
９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：５１３−６０
９）。
蛋白質チロシンキナーゼ活性を有しない細胞表面レセプターによる細胞シグナリ
ングを媒介する。例えば，蛋白質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのメンバ
ーは，成長因子レセプターおよびＧ−蛋白質共役レセプターの刺激，ならびに多
くの他の細胞外刺激に応答して活性化される（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，１
９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：５１３−６０
９）。
【０００７】 Ｓｒｃファミリーのキナーゼは，血小板の被覆膜領域と会合していることが見
いだされている（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｂｌｏｏｄ ８
９：２３８４−９３）。ＰＣ１２細胞においてＳｒｃはシナプス小胞とともに精
製される（Ｌｉｎｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１１７：１０７７−８４）。Ｓｒｃは膜輸送に関与するいくつかの蛋白質，
例えばニューロンシナプス小胞付随蛋白質であるシナプシンＩ，シナプトフィシ
ンおよびシナプトギリンと会合しこれをリン酸化する（Ｂａｒｎｅｋｏｗ，ｅｔ
ａｌ．，１９９０．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１０１９−２４；Ｐｏｓｔｅｒ−
Ｂａｒｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９５：４６７３−７；Ｊａｎｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８５１−７）。
いだされている（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｂｌｏｏｄ ８
９：２３８４−９３）。ＰＣ１２細胞においてＳｒｃはシナプス小胞とともに精
製される（Ｌｉｎｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１１７：１０７７−８４）。Ｓｒｃは膜輸送に関与するいくつかの蛋白質，
例えばニューロンシナプス小胞付随蛋白質であるシナプシンＩ，シナプトフィシ
ンおよびシナプトギリンと会合しこれをリン酸化する（Ｂａｒｎｅｋｏｗ，ｅｔ
ａｌ．，１９９０．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１０１９−２４；Ｐｏｓｔｅｒ−
Ｂａｒｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９５：４６７３−７；Ｊａｎｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８５１−７）。
【０００８】 小ＧＴＰａｓｅは，細胞増殖および分化，細胞骨格編成，蛋白質輸送，細胞サ
イクルおよびフリーラジカル生成等の多様な生物学的機能を制御する分子スイッ
チとして作用する蛋白質の大きなファミリーである（Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅ
ｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４８（６２９７）：１２５−３２，１９９０．Ｂ
ｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４９（６３０５）：１１
７−２７，１９９１）。このＧＴＰａｓｅは，これらの中心的細胞経路を調節し
，ＧＴＰａｓｅおよびそのレギュレーターの両方が非常に重要であることを示唆
する。
イクルおよびフリーラジカル生成等の多様な生物学的機能を制御する分子スイッ
チとして作用する蛋白質の大きなファミリーである（Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅ
ｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４８（６２９７）：１２５−３２，１９９０．Ｂ
ｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４９（６３０５）：１１
７−２７，１９９１）。このＧＴＰａｓｅは，これらの中心的細胞経路を調節し
，ＧＴＰａｓｅおよびそのレギュレーターの両方が非常に重要であることを示唆
する。
【０００９】 ｄｂｌホモロジー領域（ＤＨドメイン）は，約２５０アミノ酸の領域であり，
ＤｂｌおよびＣｄｃ２４蛋白質において最初に見いだされた。多くの蛋白質がＤ
Ｈドメインを含むことが見いだされている。多くのＤＨ含有蛋白質は，Ｎ末端の
切断により細胞トランスフォーメーション活性を示す（Ｑｕｉｌｌｉａｍ，ＬＡ
．，ｅｔ．ａｌ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１７：３９５−４０４，１９９５．Ｗｈ
ｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２：Ｆ１−Ｆ２３，１９９７．Ｃｅｒｉｏｎ
ｅ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＺｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．８：２１６−２２２，１９９６に概説されている）。
ＤｂｌおよびＣｄｃ２４蛋白質において最初に見いだされた。多くの蛋白質がＤ
Ｈドメインを含むことが見いだされている。多くのＤＨ含有蛋白質は，Ｎ末端の
切断により細胞トランスフォーメーション活性を示す（Ｑｕｉｌｌｉａｍ，ＬＡ
．，ｅｔ．ａｌ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１７：３９５−４０４，１９９５．Ｗｈ
ｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２：Ｆ１−Ｆ２３，１９９７．Ｃｅｒｉｏｎ
ｅ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＺｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．８：２１６−２２２，１９９６に概説されている）。
【００１０】 多くのＤｂｌファミリー蛋白質のＤＨ／ＰＨモジュールは，グアニン交換因子
（ＧＥＰ）として作用することにより，種々のＲｈｏサブファミリー小ＧＴＰａ
ｓｅの活性を制御することが示されている（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．Ｐ．，ｅ
ｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３
３２：Ｆ１−Ｆ２３，１９９７．Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＺｈｅｎｇ，
Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８：２１６−２２２，１９９６）
。多くのＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅは，アクチン構造の組立を制御すること
が示されており，種々のキナーゼ経路を介して遺伝子転写を制御することができ
る（Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：５０９−５１４，１９９８）。
（ＧＥＰ）として作用することにより，種々のＲｈｏサブファミリー小ＧＴＰａ
ｓｅの活性を制御することが示されている（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．Ｐ．，ｅ
ｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３
３２：Ｆ１−Ｆ２３，１９９７．Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＺｈｅｎｇ，
Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８：２１６−２２２，１９９６）
。多くのＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅは，アクチン構造の組立を制御すること
が示されており，種々のキナーゼ経路を介して遺伝子転写を制御することができ
る（Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：５０９−５１４，１９９８）。
【００１１】発明の概要 本発明は，細胞質チロシンキナーゼＳｒｃの新規な基質である，Ｔｋｓ１０７
，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２に関する。
，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２に関する。
【００１２】 本発明の第１の観点は，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴ
ｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする，単離され，濃
縮され，または精製された核酸分子を特徴とする。
ｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする，単離され，濃
縮され，または精製された核酸分子を特徴とする。
【００１３】 核酸に関連して"単離された"とは，天然の起源から単離されたかまたは合成さ
れた，互いに結合したヌクレオチドのポリマーを意味し，ＤＮＡおよびＲＮＡを
含む。本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態
で見いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は
，天然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれている
ことを表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細
胞環境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオ
チド鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチ
ド物質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離
された染色体とは区別されることを意味する。
れた，互いに結合したヌクレオチドのポリマーを意味し，ＤＮＡおよびＲＮＡを
含む。本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態
で見いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は
，天然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれている
ことを表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細
胞環境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオ
チド鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチ
ド物質を本質的に含まず（少なくとも約９０−９５％純粋），したがって，単離
された染色体とは区別されることを意味する。
【００１４】 核酸に関連して，"濃縮された"との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡ
は，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵ
Ｃ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種
のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる事象，例えばウイルス感
染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語は，人が所望の
核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，ま
たはそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡ
は，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵ
Ｃ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種
のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる事象，例えばウイルス感
染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語は，人が所望の
核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
【００１５】 ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利であ
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくと
も１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的
に企図される。
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくと
も１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的
に企図される。
【００１６】 ポリペプチドとは，それぞれ配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列
番号８に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列の少なくと
も１０８，９３，６０または２０３個またはそれ以上の連続するアミノ酸，また
は本明細書に記載されるその機能的誘導体を意味する。全長配列が与えられてい
ない配列については，残りの配列は当業者によく知られる方法を用いて決定する
ことができ，これらも本発明に含まれる。ポリペプチドは，全長核酸配列，また
はポリペプチドの機能的活性が保持される限り全長核酸配列の任意の部分により
コードされることができる。
番号８に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列の少なくと
も１０８，９３，６０または２０３個またはそれ以上の連続するアミノ酸，また
は本明細書に記載されるその機能的誘導体を意味する。全長配列が与えられてい
ない配列については，残りの配列は当業者によく知られる方法を用いて決定する
ことができ，これらも本発明に含まれる。ポリペプチドは，全長核酸配列，また
はポリペプチドの機能的活性が保持される限り全長核酸配列の任意の部分により
コードされることができる。
【００１７】 アミノ酸配列は，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に示
される配列，または対応する全長アミノ酸配列，またはそのフラグメントと実質
的に類似するであろう。配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８
の配列と実質的に類似する配列は，好ましくはそれぞれの配列と，少なくとも９
０％（より好ましくは少なくとも９５％，最も好ましくは９９−１００％）の同
一性を有するであろう。
される配列，または対応する全長アミノ酸配列，またはそのフラグメントと実質
的に類似するであろう。配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８
の配列と実質的に類似する配列は，好ましくはそれぞれの配列と，少なくとも９
０％（より好ましくは少なくとも９５％，最も好ましくは９９−１００％）の同
一性を有するであろう。
【００１８】 "同一性"とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。一
般に，同一性は，同一の残基の数を残基とギャップの合計数で割り，１００を乗
ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ酸の付加または欠失により生
ずる，アラインメント中の空間である。すなわち，完全に同一の配列の２つのコ
ピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に保存され，欠失，付加また
は置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するであろう。当業者は，標準的
なパラメータをデフォルト設定として用いる，配列の同一性を決定するためのい
くつかのコンピュータプログラムが利用可能であることを認識するであろう。そ
のようなプログラムの例は，Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳ
Ｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０），およ
びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）である。好ましくは，これらのプ
ログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者はこれらの設定を変更する必要が
あるか否かを認識し，どのようにして変更するかを理解している。
般に，同一性は，同一の残基の数を残基とギャップの合計数で割り，１００を乗
ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ酸の付加または欠失により生
ずる，アラインメント中の空間である。すなわち，完全に同一の配列の２つのコ
ピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に保存され，欠失，付加また
は置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するであろう。当業者は，標準的
なパラメータをデフォルト設定として用いる，配列の同一性を決定するためのい
くつかのコンピュータプログラムが利用可能であることを認識するであろう。そ
のようなプログラムの例は，Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳ
Ｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０），およ
びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）である。好ましくは，これらのプ
ログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者はこれらの設定を変更する必要が
あるか否かを認識し，どのようにして変更するかを理解している。
【００１９】 好ましい態様においては，本発明は，（ａ）配列番号５，配列番号６，配列番
号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
する；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｃ）より高いストリ
ンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし
，かつ天然に生ずるポリペプチドをコードする；（ｄ）以下のアミノ酸残基のセ
グメントの全部ではないが１またはそれ以上を欠失することにより，配列番号５
，配列番号６，配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドとは異なる：配列番号５の１−１０８２，１０８３−１２５７，１２５８−１
２６４，１２６５−１３７２または１３７３−１５１９；配列番号６の１−３８
３または３８４−４７６；配列番号７の１−２２７，２２８−３７１または３７
２−４３１；または配列番号８の１−６２９または６３０−８３２；（ｅ）（ｄ
）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｆ）以下のアミノ酸残基に記載される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする：配列番号５の１−１０８２，
１０８３−１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１３７２または１３７３
−１５１９；配列番号６の１−３８３または３８４−４７６；配列番号７の１−
２２７，２２８−３７１または３７２−４３１；または配列番号８の１−６２９
または６３０−８３２；（ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｈ
）Ｎ末端ドメイン，ＤＨドメイン，Ｃ末端ドメイン，ＰＨドメイン，スペーサー
領域，ＳＨ３ドメイン，ＧＴＰａｓｅドメインおよびプロリンリッチ領域からな
る群より選択される１またはそれ以上のドメインを欠失することにより，配列番
号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドとは異なる；または（ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体
である，ヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする，単離され，濃縮さ
れ，または精製された核酸分子を特徴とする。
号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
する；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｃ）より高いストリ
ンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし
，かつ天然に生ずるポリペプチドをコードする；（ｄ）以下のアミノ酸残基のセ
グメントの全部ではないが１またはそれ以上を欠失することにより，配列番号５
，配列番号６，配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドとは異なる：配列番号５の１−１０８２，１０８３−１２５７，１２５８−１
２６４，１２６５−１３７２または１３７３−１５１９；配列番号６の１−３８
３または３８４−４７６；配列番号７の１−２２７，２２８−３７１または３７
２−４３１；または配列番号８の１−６２９または６３０−８３２；（ｅ）（ｄ
）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｆ）以下のアミノ酸残基に記載される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする：配列番号５の１−１０８２，
１０８３−１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１３７２または１３７３
−１５１９；配列番号６の１−３８３または３８４−４７６；配列番号７の１−
２２７，２２８−３７１または３７２−４３１；または配列番号８の１−６２９
または６３０−８３２；（ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｈ
）Ｎ末端ドメイン，ＤＨドメイン，Ｃ末端ドメイン，ＰＨドメイン，スペーサー
領域，ＳＨ３ドメイン，ＧＴＰａｓｅドメインおよびプロリンリッチ領域からな
る群より選択される１またはそれ以上のドメインを欠失することにより，配列番
号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドとは異なる；または（ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体
である，ヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする，単離され，濃縮さ
れ，または精製された核酸分子を特徴とする。
【００２０】 "相補体"との用語は，互いに多くの望ましい相互作用を形成しうる２つのヌク
レオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することが
できるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素
結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第
１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的
である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
レオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することが
できるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素
結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第
１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的
である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２１】 "ドメイン"との用語は，特定の機能を含むポリペプチドの領域を表す。例えば
，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されない
が，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細
胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の
機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残りと別々に発現させて
それ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するために
は無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域と
も称され，これもまたドメインと関連する。
，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されない
が，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細
胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の
機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残りと別々に発現させて
それ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するために
は無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域と
も称され，これもまたドメインと関連する。
【００２２】 "Ｎ末端ドメイン"との用語は，蛋白質キナーゼの開始メチオニンと触媒的ドメ
インとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重
複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行い，
触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末
端ドメインは，その長さに応じて，キナーゼ機能において制御的役割を果たすか
または果たさない。Ｎ末端ドメインが制御的役割を果たすことが知られている蛋
白質キナーゼの例はＰＡＫ６５であり，これはＣｄｃ４２およびｒａｃ結合に用
いられるＣＲＩＢモチーフを含む（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１
９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９０７１−２９０７４）。
インとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重
複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行い，
触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末
端ドメインは，その長さに応じて，キナーゼ機能において制御的役割を果たすか
または果たさない。Ｎ末端ドメインが制御的役割を果たすことが知られている蛋
白質キナーゼの例はＰＡＫ６５であり，これはＣｄｃ４２およびｒａｃ結合に用
いられるＣＲＩＢモチーフを含む（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１
９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９０７１−２９０７４）。
【００２３】 Ｎ末端ドメインは，配列番号５のアミノ酸残基１−２０８２，配列番号６の１
−３８３，配列番号７の１−２２７および配列番号８１−６２９にわたる。
−３８３，配列番号７の１−２２７および配列番号８１−６２９にわたる。
【００２４】 本明細書において用いる場合，"基質"との用語は，本発明の蛋白質によりリン
酸化される分子を表す。
酸化される分子を表す。
【００２５】 "Ｃ末端ドメイン"との用語は，一般に，最後の（Ｃ末端に最も近い位置にある
）機能ドメインと前のドメインのカルボキシ末端アミノ酸残基との間に位置する
領域を表す。"機能"ドメインとは，他の蛋白質とのアミノ酸配列ホモロジーから
推定して，または特定の構造的コンフォメーションを生じさせることができるア
ミノ酸配列が存在することにより，制御的または触媒的役割を果たしうるポリペ
プチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメインは，非重複蛋白質データベース
に対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンアラインメントを用いて，触媒ド
メインまたは任意の機能的末端触媒ドメインのＣ末端境界を規定することにより
同定することができる。
）機能ドメインと前のドメインのカルボキシ末端アミノ酸残基との間に位置する
領域を表す。"機能"ドメインとは，他の蛋白質とのアミノ酸配列ホモロジーから
推定して，または特定の構造的コンフォメーションを生じさせることができるア
ミノ酸配列が存在することにより，制御的または触媒的役割を果たしうるポリペ
プチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメインは，非重複蛋白質データベース
に対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンアラインメントを用いて，触媒ド
メインまたは任意の機能的末端触媒ドメインのＣ末端境界を規定することにより
同定することができる。
【００２６】 Ｃ末端ドメインは，配列番号５のアミノ酸残基１３７３−１５１９にわたる。
【００２７】 "ｄｂｌホモロジードメイン（ＤＨドメイン）"との用語は，本質的にα−らせ
んからなるドメインを表し，このいくつかは，隠れマルコフモデルにより同定し
て，先に定義されている保存領域（Ｓｏｉｓｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃ
ｅｌｌ，９５：２５９−２６８）に対応する（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕ
ｓｔｌ．ｅｄｕ）。
んからなるドメインを表し，このいくつかは，隠れマルコフモデルにより同定し
て，先に定義されている保存領域（Ｓｏｉｓｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃ
ｅｌｌ，９５：２５９−２６８）に対応する（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕ
ｓｔｌ．ｅｄｕ）。
【００２８】 ＤＨドメインは，配列番号５のアミノ酸残基１０８３−１２５７にわたる。
【００２９】 "ＰＨドメイン"とは，プレクストリンの約１００アミノ酸の領域に対してホモ
ロジーを有するポリペプチドを意味する。現在提唱されているＰＨドメインの総
数は７０を越える。最近の構造的研究は，ＰＨドメインが独特の構造的モジュー
ルであることを示した。折り畳みは，Ｃ−末端らせんにより１つの角で閉じてい
る２つの垂直なβシートの７連鎖サンドイッチとして最もよく記述される。ドメ
インの分極は明白であり，サンドイッチのらせんにより閉じた角と反対側の角で
３つの最も可変のループが正に荷電した表面を構成している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ
，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．．Ｃｅｌｌ．７９，１９９−２０９，１９９４（図面を
含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。種々のＰＨドメイン
の例は，Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１８：３４３−
３４８，１９９３およびＧｉｂｓｏｎ，ＴＪ．，ｅｔ ａｌ，ＴＩＢＳ，１９：
３４９−３５３，１９９４，（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する）に記載されている。他のＰＨドメインは，これらの刊行物に記載さ
れる配列アラインメント手法および三次元構造比較を用いて同定することができ
る。ＰＨドメインには，セリン／トレオニンキナーゼならびにチロシンキナーゼ
；小ＧＴＰ−結合蛋白質のレギュレータ；細胞骨格蛋白質；および推定シグナリ
ングアダプター分子中のものが含まれる。ＰＨドメインはまたダイナミン（細胞
膜輸送に関与する蛋白質）およびホスホリパーゼＣアイソフォームからも得られ
る。多くの形態のホスホリパーゼＣのクローニングおよび配列は，Ｓｕｈ，ｅｔ
ａｌ．．Ｃｅｌｌ，５４：１６１−１６９，１９８８（図面を含めその全体を
本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
ロジーを有するポリペプチドを意味する。現在提唱されているＰＨドメインの総
数は７０を越える。最近の構造的研究は，ＰＨドメインが独特の構造的モジュー
ルであることを示した。折り畳みは，Ｃ−末端らせんにより１つの角で閉じてい
る２つの垂直なβシートの７連鎖サンドイッチとして最もよく記述される。ドメ
インの分極は明白であり，サンドイッチのらせんにより閉じた角と反対側の角で
３つの最も可変のループが正に荷電した表面を構成している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ
，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．．Ｃｅｌｌ．７９，１９９−２０９，１９９４（図面を
含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。種々のＰＨドメイン
の例は，Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１８：３４３−
３４８，１９９３およびＧｉｂｓｏｎ，ＴＪ．，ｅｔ ａｌ，ＴＩＢＳ，１９：
３４９−３５３，１９９４，（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する）に記載されている。他のＰＨドメインは，これらの刊行物に記載さ
れる配列アラインメント手法および三次元構造比較を用いて同定することができ
る。ＰＨドメインには，セリン／トレオニンキナーゼならびにチロシンキナーゼ
；小ＧＴＰ−結合蛋白質のレギュレータ；細胞骨格蛋白質；および推定シグナリ
ングアダプター分子中のものが含まれる。ＰＨドメインはまたダイナミン（細胞
膜輸送に関与する蛋白質）およびホスホリパーゼＣアイソフォームからも得られ
る。多くの形態のホスホリパーゼＣのクローニングおよび配列は，Ｓｕｈ，ｅｔ
ａｌ．．Ｃｅｌｌ，５４：１６１−１６９，１９８８（図面を含めその全体を
本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【００３０】 ＰＨドメインは，配列番号５のアミノ酸１２６５−１３７２にわたる。
【００３１】 "ＳＨ３"ドメイン"およびＧＴＰａｓｅドメインとの用語は，よく知られる用
語であり，その意味は当業者に知られているように定義される。
語であり，その意味は当業者に知られているように定義される。
【００３２】 ＳＨ３ドメインは配列番号９のアミノ酸３７２−４３１にわたる。ＧＴＰａｓ
ｅドメインは，配列番号８のアミノ酸６３０−８３２にわたる。
ｅドメインは，配列番号８のアミノ酸６３０−８３２にわたる。
【００３３】 "シグナル伝達経路"との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播し，細
胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激するこ
とができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的には
レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，レセプターおよび非レ
セプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメイン，ホスホ
チロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合
（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ
３ドメイン含有蛋白質），ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激するこ
とができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的には
レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，レセプターおよび非レ
セプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメイン，ホスホ
チロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合
（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ
３ドメイン含有蛋白質），ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
【００３４】 本明細書において用いる場合，"プロリンリッチ領域"との用語は，蛋白質キナ
ーゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見いだされ
るこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。プロリ
ンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，標準的
なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥｄｉｔ
Ｓｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質と蛋白
質との相互作用に関与することが示されている（例えば，Ｇａｌｉｓｔｅｏ，Ｍ
．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０９９７
−２１０００，およびＳｕｄｏｌ，Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｙｓ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．６５：１１３−１３２を参照）。
ーゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見いだされ
るこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。プロリ
ンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，標準的
なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥｄｉｔ
Ｓｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質と蛋白
質との相互作用に関与することが示されている（例えば，Ｇａｌｉｓｔｅｏ，Ｍ
．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０９９７
−２１０００，およびＳｕｄｏｌ，Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｙｓ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．６５：１１３−１３２を参照）。
【００３５】 プロリンリッチ領域は配列番号５のアミノ酸残基３８４−４７６にわたる。
【００３６】 本明細書において用いる場合，"スペーサー領域"との用語は，予測される機能
的ドメインの間に位置する蛋白質の領域を表す。
的ドメインの間に位置する蛋白質の領域を表す。
【００３７】 スペーサー領域は，データベース中の任意のアミノ酸配列に対する検出可能な
ホモロジーを有しない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列
のスミスウォーターマンアラインメントを用いてフランキングしている機能的ド
メインのＣおよびＮ末端境界を規定することにより同定することができる。スペ
ーサー領域は，蛋白質キナーゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果
たさないかもしれない。スペーサー領域のキナーゼ機能における制御的役割の先
例は，ｓｒｃキナーゼスペーサーのドメイン間相互作用における役割により提供
される（Ｘｕ，Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：５９５−６
０２）。
ホモロジーを有しない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列
のスミスウォーターマンアラインメントを用いてフランキングしている機能的ド
メインのＣおよびＮ末端境界を規定することにより同定することができる。スペ
ーサー領域は，蛋白質キナーゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果
たさないかもしれない。スペーサー領域のキナーゼ機能における制御的役割の先
例は，ｓｒｃキナーゼスペーサーのドメイン間相互作用における役割により提供
される（Ｘｕ，Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：５９５−６
０２）。
【００３８】 スペーサー領域は，配列番号５のアミノ酸残基１２５８−１２６４にわたる。
【００３９】 所望の特異性および選択性に応じて，種々の低いまたは高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業
者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
は，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのよう
な条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有す
る核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は
，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸の
ハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００
個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブ
リダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個
のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業
者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
は，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのよう
な条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有す
る核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は
，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸の
ハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００
個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブ
リダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個
のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００４０】 ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以
下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する
：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０
．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハ
ルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗
浄。よりストリンジェントな条件は，２回目の洗浄について，０．１ＸＳＳＣ，
０．０５％ＳＤＳおよび５５℃を含む。いくつかの最もストリンジェントなハイ
ブリダイゼーションアッセイ条件においては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣ
で７０℃までの温度で行うことができる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８７
）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｐｇ４２１，（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する）。しかし，他の用途は，これらの条件の組の間に入る条件の使用を
必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーションを達成するのに必要な
条件を決定する方法は当業者にはよく知られており，いくつかの因子，例えば，
限定されないが，ハイブリダイズすべき配列および試験すべき試料に基づく。よ
り低いストリンジェンシーの洗浄条件は，洗浄工程においてより低い温度，例え
ば６５℃，６０℃，５５℃，５０℃または４２℃を用いる。
下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する
：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０
．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハ
ルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗
浄。よりストリンジェントな条件は，２回目の洗浄について，０．１ＸＳＳＣ，
０．０５％ＳＤＳおよび５５℃を含む。いくつかの最もストリンジェントなハイ
ブリダイゼーションアッセイ条件においては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣ
で７０℃までの温度で行うことができる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８７
）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｐｇ４２１，（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する）。しかし，他の用途は，これらの条件の組の間に入る条件の使用を
必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーションを達成するのに必要な
条件を決定する方法は当業者にはよく知られており，いくつかの因子，例えば，
限定されないが，ハイブリダイズすべき配列および試験すべき試料に基づく。よ
り低いストリンジェンシーの洗浄条件は，洗浄工程においてより低い温度，例え
ば６５℃，６０℃，５５℃，５０℃または４２℃を用いる。
【００４１】 別の好ましい態様においては，本発明は，ポリペプチドをコードし，かつ宿主
細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含
む，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴とする。本発明
はまた，組換え核酸，好ましくは細胞または生物中の組換え核酸を特徴とする。
組換え核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４に記載さ
れる配列，配列番号５，配列番号６，配列番号７，または配列番号８に記載され
るポリペプチドをコードする核酸，またはそれらの機能的誘導体，および宿主細
胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターを含むことが
できる。あるいは，組換え核酸は，細胞中で機能的な転写開始領域，ポリペプチ
ドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および細胞中で機能的な転写終止領
域を含むことができる。
細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含
む，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴とする。本発明
はまた，組換え核酸，好ましくは細胞または生物中の組換え核酸を特徴とする。
組換え核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４に記載さ
れる配列，配列番号５，配列番号６，配列番号７，または配列番号８に記載され
るポリペプチドをコードする核酸，またはそれらの機能的誘導体，および宿主細
胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターを含むことが
できる。あるいは，組換え核酸は，細胞中で機能的な転写開始領域，ポリペプチ
ドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および細胞中で機能的な転写終止領
域を含むことができる。
【００４２】 "ベクター"との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲノム
中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す
。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直
鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素によ
り切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。キ
ナーゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断片を一
緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる。
中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す
。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直
鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素によ
り切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。キ
ナーゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断片を一
緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる。
【００４３】 "トランスフェクトする"との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞
性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含
まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理す
ることにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること
，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含
まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理す
ることにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること
，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００４４】 本明細書において用いる場合，"プロモーター"との用語は，遺伝子配列の発現
に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々
の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロ
モーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのよう
な領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例
えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々
の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロ
モーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのよう
な領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例
えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００４５】 好ましい態様においては，単離された核酸は，配列番号１，配列番号２，配列
番号３または配列番号４に記載される核酸配列，または対応する全長配列を含む
か，本質的にそれからなるか，またはそれからなるか，配列番号５，配列番号６
，配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配
列，それらの機能的誘導体，またはそれぞれ配列番号５，配列番号６，または配
列番号７または配列番号８または対応する全長アミノ酸配列の少なくとも１０８
，９３，６０または２０３個の連続するアミノ酸をコードする。核酸は，ｃＤＮ
Ａクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより天然の起
源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好まし
くはヒト，血液，精液，または組織であり，核酸はトリエステル法によりまたは
自動化ＤＮＡ合成機を用いて合成してもよい。
番号３または配列番号４に記載される核酸配列，または対応する全長配列を含む
か，本質的にそれからなるか，またはそれからなるか，配列番号５，配列番号６
，配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配
列，それらの機能的誘導体，またはそれぞれ配列番号５，配列番号６，または配
列番号７または配列番号８または対応する全長アミノ酸配列の少なくとも１０８
，９３，６０または２０３個の連続するアミノ酸をコードする。核酸は，ｃＤＮ
Ａクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより天然の起
源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好まし
くはヒト，血液，精液，または組織であり，核酸はトリエステル法によりまたは
自動化ＤＮＡ合成機を用いて合成してもよい。
【００４６】 "哺乳動物"とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，
およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾
サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾
サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
【００４７】 さらに別の好ましい態様においては，核酸は，例えば，追加のポリペプチドの
同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを
設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプ
ローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の
領域である。
同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを
設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプ
ローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の
領域である。
【００４８】 "保存された核酸領域"とは，ポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上の
核酸上に存在する領域を意味し，特定の核酸配列がこの領域に低いストリンジェ
ンシー条件下でハイブリダイズすることができる。キナーゼポリペプチドをコー
ドする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー条件の例は，Ｂｅｒ
ｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｐｇ４２１（図面および表を含めその全
体を本明細書の一部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領
域は，２０ヌクレオチド中７個以下で異なる。
核酸上に存在する領域を意味し，特定の核酸配列がこの領域に低いストリンジェ
ンシー条件下でハイブリダイズすることができる。キナーゼポリペプチドをコー
ドする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー条件の例は，Ｂｅｒ
ｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｐｇ４２１（図面および表を含めその全
体を本明細書の一部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領
域は，２０ヌクレオチド中７個以下で異なる。
【００４９】 "独特の核酸領域"とは，ポリペプチドをコードする核酸中に存在し，天然に生
ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない配列を意味する
。そのような領域は，好ましくは，それぞれ配列番号５，配列番号６，配列番号
７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配
列またはそれらの機能的誘導体の，１０８，９３，６０または２０３個またはそ
れ以上の連続するアミノ酸をコードする。特に，独特の核酸領域は，好ましくは
哺乳動物起源のものである。
ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない配列を意味する
。そのような領域は，好ましくは，それぞれ配列番号５，配列番号６，配列番号
７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配
列またはそれらの機能的誘導体の，１０８，９３，６０または２０３個またはそ
れ以上の連続するアミノ酸をコードする。特に，独特の核酸領域は，好ましくは
哺乳動物起源のものである。
【００５０】 本発明の別の観点は，試料中でポリペプチドをコードする核酸を検出するため
の核酸プローブを特徴とする。ここで，前記ポリペプチドは，Ｔｋｓ１０７，Ｔ
ｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される。核酸
プローブは，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載され
るアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列，またはそれらの相補体によ
りコードされる蛋白質のフラグメントであるポリペプチドをコードしてもよい。
核酸プローブは，配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４に記載
される配列，または対応する全長配列，またはそれらの機能的誘導体にハイブリ
ダイズするであろうヌクレオチド塩基配列を含む。
の核酸プローブを特徴とする。ここで，前記ポリペプチドは，Ｔｋｓ１０７，Ｔ
ｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される。核酸
プローブは，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載され
るアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列，またはそれらの相補体によ
りコードされる蛋白質のフラグメントであるポリペプチドをコードしてもよい。
核酸プローブは，配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４に記載
される配列，または対応する全長配列，またはそれらの機能的誘導体にハイブリ
ダイズするであろうヌクレオチド塩基配列を含む。
【００５１】 プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下
で試料を核酸プローブと接触させ，ＲＮＡに結合したプローブの存在または量を
検出することにより，試料中のＲＮＡの存在または量を検出することが含まれる
。プローブとポリペプチドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュー
プレックスを，検出された核酸の配列の同定において用いることができる（Ｎｅ
ｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒ
ｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，１９９２（図面および表を含めその全体を本明
細書の一部としてここに引用する）。そのような方法を実施するためのキットは
，その中に核酸プローブが置かれている容器手段を含むように構築することがで
きる。
で試料を核酸プローブと接触させ，ＲＮＡに結合したプローブの存在または量を
検出することにより，試料中のＲＮＡの存在または量を検出することが含まれる
。プローブとポリペプチドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュー
プレックスを，検出された核酸の配列の同定において用いることができる（Ｎｅ
ｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒ
ｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，１９９２（図面および表を含めその全体を本明
細書の一部としてここに引用する）。そのような方法を実施するためのキットは
，その中に核酸プローブが置かれている容器手段を含むように構築することがで
きる。
【００５２】 別の観点においては，本発明は，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする組換え
核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子，または細胞または組織を記載する。そのよう
な細胞においては，核酸は遺伝的制御要素の制御下にあってもよく，または外来
性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。"外来性"とは，
通常はポリペプチドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングして
いないプロモーターを意味する。
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする組換え
核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子，または細胞または組織を記載する。そのよう
な細胞においては，核酸は遺伝的制御要素の制御下にあってもよく，または外来
性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。"外来性"とは，
通常はポリペプチドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングして
いないプロモーターを意味する。
【００５３】 ポリペプチドは，好ましくは配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列
番号８に記載されるアミノ酸配列またはその全長配列によりコードされる蛋白質
のフラグメントである。"フラグメント"とはポリペプチド中に存在するアミノ酸
配列を意味する。好ましくは，そのような配列は，それぞれ配列番号５，配列番
号６，配列番号７または配列番号８に記載される配列の少なくとも１０８，９３
，６０または２０３個の連続するアミノ酸を含む。
番号８に記載されるアミノ酸配列またはその全長配列によりコードされる蛋白質
のフラグメントである。"フラグメント"とはポリペプチド中に存在するアミノ酸
配列を意味する。好ましくは，そのような配列は，それぞれ配列番号５，配列番
号６，配列番号７または配列番号８に記載される配列の少なくとも１０８，９３
，６０または２０３個の連続するアミノ酸を含む。
【００５４】 別の観点においては，本発明は，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される，単離され，濃縮され，または精
製されたポリペプチドを特徴とする。
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される，単離され，濃縮され，または精
製されたポリペプチドを特徴とする。
【００５５】 ポリペプチドに関して"単離された"とは，互いに結合した２個以上のアミノ酸
のポリマーを意味し，天然の起源から単離されたまたは合成されたポリペプチド
を含む。本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された
形で見いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち
，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよ
い。この用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するも
のではなく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（
少なくとも約９０−９５％純粋）ことを意味する。
のポリマーを意味し，天然の起源から単離されたまたは合成されたポリペプチド
を含む。本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された
形で見いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち
，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよ
い。この用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するも
のではなく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（
少なくとも約９０−９５％純粋）ことを意味する。
【００５６】 ポリペプチドに関して使用する場合，"濃縮された"との用語は，特定のアミノ
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割
合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の
量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加
により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。
しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するもので
はなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する
ことに注意すべきである。本明細書において有意にとの用語は，増加のレベルが
そのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミ
ノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，
またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸
配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例
えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１
９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望
のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割
合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の
量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加
により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。
しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するもので
はなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する
ことに注意すべきである。本明細書において有意にとの用語は，増加のレベルが
そのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミ
ノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，
またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸
配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例
えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１
９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望
のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００５７】 ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましく
は２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物
質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９
５％，または９９％純粋である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましく
は２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物
質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９
５％，または９９％純粋である。
【００５８】 好ましい態様においては，ポリペプチドは，配列番号５，配列番号６，配列番
号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸
配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。好ましくは，ポリペプチ
ドは，それぞれ配列番号５，配列番号６，または配列番号７または配列番号８の
，少なくとも１０８，９３，６０または２０３個の連続するアミノ酸を含む。
号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸
配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。好ましくは，ポリペプチ
ドは，それぞれ配列番号５，配列番号６，または配列番号７または配列番号８の
，少なくとも１０８，９３，６０または２０３個の連続するアミノ酸を含む。
【００５９】 好ましい態様においては，ポリペプチドは， （ａ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列； （ｂ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列と，以下のアミノ酸残基のセグメントの全部ではないが１またはそれ以
上を欠失する点において異なるアミノ酸配列：配列番号５の１−１０８２，１０
８３−１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１３７２または配列番号６の
１３７３−１５１９；１−３８３または配列番号７の３８４−４７６；１−２２
７，２２８−３７１または３７２−４３１または配列番号８の１−６２９または
６３０−８３２； （ｃ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列の，配列番号５の１−１０８２，１０８３−１２５７，１２５８−１２
６４，１２６５−１３７２または１３７３−１５１９；配列番号６の１−３８３
または３８４−４７６；配列番号７の１−２２７，２２８−３７１または３７２
−４３１，または配列番号８の１−６２９または６３０−８３２のアミノ酸残基
：；または （ｄ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列と，Ｃ末端ドメイン，ＰＨドメイン，ＤＨドメイン，Ｎ末端ドメイン，
ＳＨ３ドメイン，スペーサー領域，プロリンリッチ領域およびＧＴＰａｓｅドメ
インからなる群より選択されるドメインの，全部ではないが１またはそれ以上を
欠失する点において異なるアミノ酸配列， を有するアミノ酸配列を含む。
ノ酸配列； （ｂ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列と，以下のアミノ酸残基のセグメントの全部ではないが１またはそれ以
上を欠失する点において異なるアミノ酸配列：配列番号５の１−１０８２，１０
８３−１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１３７２または配列番号６の
１３７３−１５１９；１−３８３または配列番号７の３８４−４７６；１−２２
７，２２８−３７１または３７２−４３１または配列番号８の１−６２９または
６３０−８３２； （ｃ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列の，配列番号５の１−１０８２，１０８３−１２５７，１２５８−１２
６４，１２６５−１３７２または１３７３−１５１９；配列番号６の１−３８３
または３８４−４７６；配列番号７の１−２２７，２２８−３７１または３７２
−４３１，または配列番号８の１−６２９または６３０−８３２のアミノ酸残基
：；または （ｄ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列と，Ｃ末端ドメイン，ＰＨドメイン，ＤＨドメイン，Ｎ末端ドメイン，
ＳＨ３ドメイン，スペーサー領域，プロリンリッチ領域およびＧＴＰａｓｅドメ
インからなる群より選択されるドメインの，全部ではないが１またはそれ以上を
欠失する点において異なるアミノ酸配列， を有するアミノ酸配列を含む。
【００６０】 ポリペプチドは，当該技術分野においてよく知られる方法により，天然の起源
から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましく
はヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。単離され，濃縮され，または精製されたポ
リペプチドは，好ましくは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８または
Ｔｋｓ２０２ポリペプチドである。
から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましく
はヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。単離され，濃縮され，または精製されたポ
リペプチドは，好ましくは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８または
Ｔｋｓ２０２ポリペプチドである。
【００６１】 ある態様においては，本発明は，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される組換えポリペプチドを含む。"組
換えポリペプチド"とは，その存在位置（例えば，天然に見いだされる物とは異
なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に生ずるポリペプチ
ドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポリペプチドを意味
する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常観察される量とは
異なる量で細胞中に存在するであろう。
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される組換えポリペプチドを含む。"組
換えポリペプチド"とは，その存在位置（例えば，天然に見いだされる物とは異
なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に生ずるポリペプチ
ドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポリペプチドを意味
する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常観察される量とは
異なる量で細胞中に存在するであろう。
【００６２】 別の観点においては，本発明は，ポリペプチドまたはポリペプチドドメインま
たはフラグメントに対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体）を特徴とし，ここで，ポリペプチドは，Ｔｋｓ
１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択さ
れる。"特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプ
チドに結合するより高い親和性をもって標的ポリペプチドに結合することを意味
する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領域を含
むポリペプチドである。"特異的結合親和性"との用語は，特定の条件下で，他の
ポリペプチドに結合するより高い親和性をもってポリペプチドに結合する抗体を
記述する。
たはフラグメントに対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体）を特徴とし，ここで，ポリペプチドは，Ｔｋｓ
１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択さ
れる。"特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプ
チドに結合するより高い親和性をもって標的ポリペプチドに結合することを意味
する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領域を含
むポリペプチドである。"特異的結合親和性"との用語は，特定の条件下で，他の
ポリペプチドに結合するより高い親和性をもってポリペプチドに結合する抗体を
記述する。
【００６３】 "ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
【００６４】 "モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であ
る。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意
の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法
により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方
は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
る。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意
の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法
により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方
は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
【００６５】 "抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
【００６６】 本発明のポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラ
グメントは，試料をポリペプチド−抗体免疫複合体の形成に適した条件下で抗体
で探索し，ポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出すること
により，試料中のポリペプチドの存在および／または量を検出する方法において
用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，ポリペプ
チドに特異的な抗体または抗体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーま
たは抗体それ自体のコンジュゲートを含むように構築することができる。
グメントは，試料をポリペプチド−抗体免疫複合体の形成に適した条件下で抗体
で探索し，ポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出すること
により，試料中のポリペプチドの存在および／または量を検出する方法において
用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，ポリペプ
チドに特異的な抗体または抗体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーま
たは抗体それ自体のコンジュゲートを含むように構築することができる。
【００６７】 本発明のポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラ
グメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精製することがで
きる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真核生物の両方に
おいて，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポリペプチド分
子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
グメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精製することがで
きる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真核生物の両方に
おいて，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポリペプチド分
子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
【００６８】 本発明のポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体は，免疫複合体
が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ポリペプチドに結合した抗体
の存在および／または量を検出することにより，試料中のポリペプチドの存在お
よび／または量を検出するための方法において用いることができる。そのような
方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パ
ートナーおよび標識（例えば放射性同位体）を含む第２の容器を含むように構築
することができる。診断キットはまた，ＦＤＡに認可された使用の通知およびそ
の指針を含んでいてもよい。
が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ポリペプチドに結合した抗体
の存在および／または量を検出することにより，試料中のポリペプチドの存在お
よび／または量を検出するための方法において用いることができる。そのような
方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パ
ートナーおよび標識（例えば放射性同位体）を含む第２の容器を含むように構築
することができる。診断キットはまた，ＦＤＡに認可された使用の通知およびそ
の指針を含んでいてもよい。
【００６９】 本発明のさらに別の観点は，ポリペプチドまたはポリペプチドドメインに対し
て特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とし，ここで
，ポリペプチドは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２
０２からなる群より選択される。"ハイブリドーマ"とは，抗体（例えば本発明の
ポリペプチドに対する抗体）を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態
様においては，ポリペプチドに対する抗体は，本発明のポリペプチドに特異的に
結合することができるアミノ酸の配列を含む。
て特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とし，ここで
，ポリペプチドは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２
０２からなる群より選択される。"ハイブリドーマ"とは，抗体（例えば本発明の
ポリペプチドに対する抗体）を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態
様においては，ポリペプチドに対する抗体は，本発明のポリペプチドに特異的に
結合することができるアミノ酸の配列を含む。
【００７０】 別の観点においては，本発明は，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドに結合することがで
きるポリペプチド結合剤を特徴とする。結合薬剤は，好ましくは，本発明のポリ
ペプチド上に存在するエピトープを認識する精製された抗体である。他の結合薬
剤には，そのようなポリペプチドに結合する分子およびポリペプチドに結合する
類似の分子が含まれる。そのような結合薬剤は，キナーゼ結合パートナー活性を
測定するアッセイを用いて同定することができる。
およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドに結合することがで
きるポリペプチド結合剤を特徴とする。結合薬剤は，好ましくは，本発明のポリ
ペプチド上に存在するエピトープを認識する精製された抗体である。他の結合薬
剤には，そのようなポリペプチドに結合する分子およびポリペプチドに結合する
類似の分子が含まれる。そのような結合薬剤は，キナーゼ結合パートナー活性を
測定するアッセイを用いて同定することができる。
【００７１】 本発明はまた，本発明のポリペプチドまたは同等の配列を含むヒト細胞をスク
リーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野において日常的かつ
標準的な技術，例えば本発明のポリペプチドの同定のために本明細書において記
載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブロット分析，イン
シトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト細胞において
新規ポリペプチドを同定することを含む。
リーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野において日常的かつ
標準的な技術，例えば本発明のポリペプチドの同定のために本明細書において記
載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブロット分析，イン
シトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト細胞において
新規ポリペプチドを同定することを含む。
【００７２】 さらに別の観点においては，本発明は，ポリペプチド活性を調節する物質を同
定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋ
ｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドを試験物質
と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）前記物質が
前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを決定する，ことを含む。
定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋ
ｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドを試験物質
と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）前記物質が
前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを決定する，ことを含む。
【００７３】 "調節する"との用語は，化合物が本発明のポリペプチドの機能を変化させる能
力を表す。調節剤は，好ましくは，ポリペプチドに暴露される化合物の濃度に依
存して，本発明のポリペプチドの活性を活性化しまたは阻害する。
力を表す。調節剤は，好ましくは，ポリペプチドに暴露される化合物の濃度に依
存して，本発明のポリペプチドの活性を活性化しまたは阻害する。
【００７４】 "活性化する"との用語は，ポリペプチドの細胞活性を増加させることを表す。
"阻害する"との用語は，ポリペプチドの細胞活性を減少させることを表す。活性
は，好ましくは，天然の結合パートナー，例えばｓｒｃとの相互作用に影響を与
える。
"阻害する"との用語は，ポリペプチドの細胞活性を減少させることを表す。活性
は，好ましくは，天然の結合パートナー，例えばｓｒｃとの相互作用に影響を与
える。
【００７５】 "調節する"との用語はまた，ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間に複
合体が形成される可能性を増加または減少させることにより，本発明のポリペプ
チドの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ポリペプチドと天然
の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される可能性を増加させ，よ
り好ましくは，暴露される化合物の濃度に依存して複合体が形成される確率を増
加または減少させ，最も好ましくは，ポリペプチドと天然の結合パートナーとの
間に複合体が形成される可能性を減少させる。
合体が形成される可能性を増加または減少させることにより，本発明のポリペプ
チドの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ポリペプチドと天然
の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される可能性を増加させ，よ
り好ましくは，暴露される化合物の濃度に依存して複合体が形成される確率を増
加または減少させ，最も好ましくは，ポリペプチドと天然の結合パートナーとの
間に複合体が形成される可能性を減少させる。
【００７６】 "複合体"との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シ
グナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を
含む。
グナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を
含む。
【００７７】 "天然の結合パートナー"との用語は，細胞中でポリペプチドに結合するポリペ
プチド，脂質，小分子，または核酸を表す。ポリペプチドと天然の結合パートナ
ーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少，ま
たはポリペプチド／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として
現れることができる。
プチド，脂質，小分子，または核酸を表す。ポリペプチドと天然の結合パートナ
ーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少，ま
たはポリペプチド／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として
現れることができる。
【００７８】 本明細書において用いる場合，"接触する"との用語は，試験化合物を含む溶液
を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物を
含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の成
分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合物
を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基づ
く装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物を
含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の成
分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合物
を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基づ
く装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
【００７９】 別の観点においては，本発明は，細胞においてポリペプチド活性を調節する物
質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞中でポリペプチドを発現
させ，ここで，前記ポリペプチドは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１
８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択され；（ｂ）前記細胞を試験物質と接
触させ；そして（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナ
ーとの間の相互作用の変化をモニターする，ことを含む。
質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞中でポリペプチドを発現
させ，ここで，前記ポリペプチドは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１
８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択され；（ｂ）前記細胞を試験物質と接
触させ；そして（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナ
ーとの間の相互作用の変化をモニターする，ことを含む。
【００８０】 本明細書において用いる場合，"発現"との用語は，細胞中で核酸ベクターから
本発明のポリペプチドが産生されることを表す。本明細書に記載されるように，
核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて細胞中にトラ
ンスフェクトする。
本発明のポリペプチドが産生されることを表す。本明細書に記載されるように，
核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて細胞中にトラ
ンスフェクトする。
【００８１】 別の観点においては，本発明は，治療を必要とする患者に，Ｔｋｓ１０７，Ｔ
ｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペ
プチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病を治療する方法を提供
する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，動脈硬化，自己免疫疾患，臓器
移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化ストレス関連神経変性性疾患およ
び癌からなる群より選択される。
ｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペ
プチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病を治療する方法を提供
する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，動脈硬化，自己免疫疾患，臓器
移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化ストレス関連神経変性性疾患およ
び癌からなる群より選択される。
【００８２】 疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾
患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイにお
いて陽性の結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限
定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質キナーゼの阻害剤
を含む。
患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイにお
いて陽性の結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限
定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質キナーゼの阻害剤
を含む。
【００８３】 "予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能
性を減少させることを表す。
性を減少させることを表す。
【００８４】 "治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【００８５】 "治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ
）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影
響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は
，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ
）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影
響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は
，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【００８６】 "異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。
【００８７】 異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症，ならび
に本発明の癌が含まれる。
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症，ならび
に本発明の癌が含まれる。
【００８８】 異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【００８９】 異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質キナーゼが
アポトーシス経路に関連している。蛋白質キナーゼのいずれかの機能の異常は，
細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質キナーゼが
アポトーシス経路に関連している。蛋白質キナーゼのいずれかの機能の異常は，
細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【００９０】 シグナル伝達プロセスにおけるキナーゼポリペプチドの機能に関連して，"異
常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触
媒活性が野生型蛋白質キナーゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか
，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の
蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，また
は天然の結合パートナーともはや相互作用しない，キナーゼを表す。
常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触
媒活性が野生型蛋白質キナーゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか
，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の
蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，また
は天然の結合パートナーともはや相互作用しない，キナーゼを表す。
【００９１】 "投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【００９２】 異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【００９３】 本発明の別の観点は，疾病または疾患の診断道具として，試料中においてポリ
ペプチド（またはポリペプチドをコードする核酸）を検出する方法を特徴とする
。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，Ｔｋｓ
１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択さ
れるポリペプチドの核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブと接触させ
，該プローブは，ポリペプチドをコードする核酸配列，そのフラグメント，およ
びその配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領
域ハイブリッドの存在または量を疾病または疾患の指標として検出する，の工程
を含む。
ペプチド（またはポリペプチドをコードする核酸）を検出する方法を特徴とする
。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，Ｔｋｓ
１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択さ
れるポリペプチドの核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブと接触させ
，該プローブは，ポリペプチドをコードする核酸配列，そのフラグメント，およ
びその配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領
域ハイブリッドの存在または量を疾病または疾患の指標として検出する，の工程
を含む。
【００９４】 本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，動
脈硬化，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化スト
レス関連神経変性性疾患および癌からなる群より選択される。
脈硬化，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化スト
レス関連神経変性性疾患および癌からなる群より選択される。
【００９５】 ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子が存在したとしても，遺伝子と
のみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハ
イブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防
止する。そのような条件は上で定義される。
のみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハ
イブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防
止する。そのような条件は上で定義される。
【００９６】 試料中の遺伝子の検出により診断することができる疾病には，核酸（ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"
増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加して
いることを意味する。
よび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"
増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加して
いることを意味する。
【００９７】 ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてＲＮＡが検出可能なように存在
することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためで
ある。他の正常細胞においては，そのような発現の基底レベルが存在し，したが
ってこれらの場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好まし
くはそれより多い，検出可能な存在の増加を示す核酸の増加である。
することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためで
ある。他の正常細胞においては，そのような発現の基底レベルが存在し，したが
ってこれらの場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好まし
くはそれより多い，検出可能な存在の増加を示す核酸の増加である。
【００９８】 試料中の核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは，癌が
含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細
胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は
，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出
物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術
分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に
適合させることができる。
含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細
胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は
，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出
物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術
分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に
適合させることができる。
【００９９】 最後に，本発明はＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２
０２を用いる，トランスジェニック動物および遺伝子治療に関する。
０２を用いる，トランスジェニック動物および遺伝子治療に関する。
【０１００】 本明細書においては，発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
【０１０１】 上述の本発明の概要は，限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点
は，以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
は，以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１０２】図面の簡単な説明 図１は，Ｔｋｓ１０７のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【０１０３】 図２は，Ｔｋｓ１１３のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【０１０４】 図３は，Ｔｋｓ１１８のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【０１０５】 図４は，Ｔｋｓ２０２のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【０１０６】 図５は，Ｔｋｓ１０７の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【０１０７】 図６は，Ｔｋｓ１１３の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【０１０８】 図７は，Ｔｋｓ１１８の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【０１０９】 図８は，Ｔｋｓ２０２の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【０１１０】 図９は，ｄｂｌ，ｃｄｃ２４，ｖａｖ，ｔｉａｍ，ｆｇｄｌおよびＧｒｕｂの
ｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）アラインメ
ントを示す。配列の上のバーは，ｈ−ｓｏｓ（Ｈ１−Ｈ８）または保存領域（Ｃ
Ｒ１−ＣＲ３）のＤＨ／ＰＨドメインの結晶構造から予測される重要なα−らせ
んを示す。いくつかのよく保存されているアミノ酸は影で示す（Ｓｏｉｓｓｏｎ
，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ９５：２５９−２６８）。
ｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）アラインメ
ントを示す。配列の上のバーは，ｈ−ｓｏｓ（Ｈ１−Ｈ８）または保存領域（Ｃ
Ｒ１−ＣＲ３）のＤＨ／ＰＨドメインの結晶構造から予測される重要なα−らせ
んを示す。いくつかのよく保存されているアミノ酸は影で示す（Ｓｏｉｓｓｏｎ
，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ９５：２５９−２６８）。
【０１１１】 図１０は，Ｇｒｕｂプレクストリンホモロジー（ＰＨ）ドメインと，ｄｂｌ，
ｔｉａｍ，およびｆｇｄｌのＰＨドメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）アラ
インメントを示す。影で示したアミノ酸は，ＰＨドメイン中に見いだされるいく
つかのよく保存されているアミノ酸である（Ｓｈａｗ，Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏ
Ｅｓｓａｙｓ１８：３５−４６）。
ｔｉａｍ，およびｆｇｄｌのＰＨドメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）アラ
インメントを示す。影で示したアミノ酸は，ＰＨドメイン中に見いだされるいく
つかのよく保存されているアミノ酸である（Ｓｈａｗ，Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏ
Ｅｓｓａｙｓ１８：３５−４６）。
【０１１２】 図１１は，種々の組織におけるＧｒｕｂの発現を示す。元のＴｋｓ１０７クロ
ーンを用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ｓを探索した。
ーンを用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ｓを探索した。
【０１１３】 図１２は，正常組織およびＮＣＩ腫瘍細胞におけるＧｒｕｂの発現を示す。元
のＴｋｓ１０７クローンを用いて，種々の起源からの総ＲＮＡを探索した。上の
２つのパネルは正常組織からのＲＮＡを含み，残りのパネルは種々の腫瘍細胞株
からのＲＮＡを含む。
のＴｋｓ１０７クローンを用いて，種々の起源からの総ＲＮＡを探索した。上の
２つのパネルは正常組織からのＲＮＡを含み，残りのパネルは種々の腫瘍細胞株
からのＲＮＡを含む。
【０１１４】 図１３は，２９３細胞におけるＧｒｕｂとＳｒｃの共発現を示す。ｍｙｃでタ
グづけした，Ｇｒｕｂの全長（ｗｔ），Ｎ末端（Ｎ），またはＣ末端（Ｃ）を発
現する構築物を，２９３細胞中で活性化Ｓｒｃ（ｋ＋）キナーゼ，不活性Ｓｒｃ
（ｋ−）とともに，またはＳｒｃなしで共発現させた。溶解物を抗ｍｙｃ抗体（
９Ｅ１０）で免疫沈澱させ，９Ｅ１０または抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）
でウエスタンブロットを行った。全長またはＮ末端Ｇｒｕｂのみが活性化Ｓｒｃ
によりリン酸化され，Ｃ末端Ｇｒｕｂを活性化Ｓｒｃと共発現させたとき，また
はいずれかのＧｒｕｂ構築物をキナーゼ不活性Ｓｒｃと共発現させたとき，リン
酸化は観察されなかった。
グづけした，Ｇｒｕｂの全長（ｗｔ），Ｎ末端（Ｎ），またはＣ末端（Ｃ）を発
現する構築物を，２９３細胞中で活性化Ｓｒｃ（ｋ＋）キナーゼ，不活性Ｓｒｃ
（ｋ−）とともに，またはＳｒｃなしで共発現させた。溶解物を抗ｍｙｃ抗体（
９Ｅ１０）で免疫沈澱させ，９Ｅ１０または抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）
でウエスタンブロットを行った。全長またはＮ末端Ｇｒｕｂのみが活性化Ｓｒｃ
によりリン酸化され，Ｃ末端Ｇｒｕｂを活性化Ｓｒｃと共発現させたとき，また
はいずれかのＧｒｕｂ構築物をキナーゼ不活性Ｓｒｃと共発現させたとき，リン
酸化は観察されなかった。
【０１１５】 図１４は，種々の組織におけるＴｋｓ１１３の発現を示す。Ｔｋｓ１１３から
の１．５ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。
の１．５ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。
【０１１６】 図１５は，Ｔｋｓ１１３特異的抗体を示す。レーン１および３は，ＮＩＨ３Ｔ
３細胞からの細胞溶解物を含み，レーン２および４は，ＮＣＩＨ４６０細胞から
の細胞溶解物を含む。パネルＡはウサギ前免疫血清で免疫ブロットした。パネル
Ｂは，Ｇｓｔ−Ｔｋｓ１１３で免疫したウサギからの血清で免疫ブロットした。
３細胞からの細胞溶解物を含み，レーン２および４は，ＮＣＩＨ４６０細胞から
の細胞溶解物を含む。パネルＡはウサギ前免疫血清で免疫ブロットした。パネル
Ｂは，Ｇｓｔ−Ｔｋｓ１１３で免疫したウサギからの血清で免疫ブロットした。
【０１１７】 図１６は，Ｔｋｓ１１８とｍＳＨ３Ｐ７，ドレブリンＥおよびＳｒｃのＳＨ３
ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｊ．Ｈｅｉｎの方法を用いるＭｅｇＡ
ｌｉｇｎ）を示す。
ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｊ．Ｈｅｉｎの方法を用いるＭｅｇＡ
ｌｉｇｎ）を示す。
【０１１８】 図１７は，種々の組織におけるＴｋｓ１１８の発現を示す。Ｔｋｓ１１８から
の１．６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントを用いてＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。
の１．６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントを用いてＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。
【０１１９】 図１８は，正常組織およびＮＣＩ腫瘍細胞におけるＴｋｓ１１８の発現を示す
。元のＴｋｓ１１８クローンを用いて，種々の組織からの総ＲＮＡを探索した。
上の２つのパネルは正常組織からのＲＮＡを含み，残りのパネルは種々の腫瘍細
胞株からのＲＮＡを含む。
。元のＴｋｓ１１８クローンを用いて，種々の組織からの総ＲＮＡを探索した。
上の２つのパネルは正常組織からのＲＮＡを含み，残りのパネルは種々の腫瘍細
胞株からのＲＮＡを含む。
【０１２０】 図１９は，２９３細胞におけるＴｋｓ１１８とＳｒｃの共発現を示す。２９３
細胞において，ｍｙｃでタグ付けしたＴｋｓ１１９を発現する構築物を，活性化
Ｓｒｃ（ｋ＋），キナーゼ不活性Ｓｒｃ（ｋ−）または空ベクター対照（−）と
ともに共発現させた。溶解物を抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）で免疫沈澱させ，９Ｅ
１０または抗ホスホチロシン抗体でウエスタンブロットを行った。Ｔｋｓ１１８
は，活性化Ｓｒｃと共発現した場合にのみリン酸化され，キナーゼ不活性Ｓｒｃ
ではリン酸化されなかったことに注意すべきである。
細胞において，ｍｙｃでタグ付けしたＴｋｓ１１９を発現する構築物を，活性化
Ｓｒｃ（ｋ＋），キナーゼ不活性Ｓｒｃ（ｋ−）または空ベクター対照（−）と
ともに共発現させた。溶解物を抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）で免疫沈澱させ，９Ｅ
１０または抗ホスホチロシン抗体でウエスタンブロットを行った。Ｔｋｓ１１８
は，活性化Ｓｒｃと共発現した場合にのみリン酸化され，キナーゼ不活性Ｓｒｃ
ではリン酸化されなかったことに注意すべきである。
【０１２１】 図２０は，ＮＩＨ３Ｔ３−Ｙ５２７Ｆ細胞の抗Ｔｋｓ１１８（α５０３３）お
よび抗ビンクリン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の共染色を
示す。染色は，Ｔｋｓ１１８の染色がビンクリンと共局在化していることを示し
，これらの細胞に見られる細胞突起部の末端の丸いポドソーム構造が染色された
。
よび抗ビンクリン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の共染色を
示す。染色は，Ｔｋｓ１１８の染色がビンクリンと共局在化していることを示し
，これらの細胞に見られる細胞突起部の末端の丸いポドソーム構造が染色された
。
【０１２２】 図２１は，Ｔｋｓ２０２のＣ末端と，ｃ−ｍｅｌおよびｒａｂ８のアラインメ
ント（Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるＭｅｇＡｌｉｇｎ）を示す。
ント（Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるＭｅｇＡｌｉｇｎ）を示す。
【０１２３】 図２２は，種々の組織におけるＴｋｓ２０２の発現を示す。元のＴｋｓ２０２
クローンの５’の５００ｂ．ｐ．を用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。
クローンの５’の５００ｂ．ｐ．を用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。
【０１２４】 図２３は，Ｇｒｕｂの５つの他のリーディングフレームの翻訳を示す。
【０１２５】 図２４は，Ｔｋｓ１１３の５つの他のリーディングフレームの翻訳を示す。
【０１２６】 図２５は，Ｔｋｓ１１８の５つの他のリーディングフレームの翻訳を示す。
【０１２７】 図２６は，Ｔｋｓ２０２の５つの他のリーディングフレームの翻訳を示す。
【０１２８】発明の詳細な説明 本発明は，部分的には，本発明の新規な基質であるＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１
３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２に関連するポリペプチド，そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸，そのような核酸を含む細胞，そのようなポリペプチ
ドに対する抗体，そのようなポリペプチドを用いるアッセイ，および上述のすべ
てに関連する方法に関する。ポリペプチドおよび核酸は，本明細書に記載される
配列が与えられれば，よく知られた標準的な合成法を用いて製造することができ
る。以下の例は，蛋白質Ｔｋｓ１０７／Ｇｒｕｂ，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
／ＤｒｅｓｈおよびＴｋｓ２０２（チロシンキナーゼ基質）の単離および特性決
定を示す。
３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２に関連するポリペプチド，そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸，そのような核酸を含む細胞，そのようなポリペプチ
ドに対する抗体，そのようなポリペプチドを用いるアッセイ，および上述のすべ
てに関連する方法に関する。ポリペプチドおよび核酸は，本明細書に記載される
配列が与えられれば，よく知られた標準的な合成法を用いて製造することができ
る。以下の例は，蛋白質Ｔｋｓ１０７／Ｇｒｕｂ，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
／ＤｒｅｓｈおよびＴｋｓ２０２（チロシンキナーゼ基質）の単離および特性決
定を示す。
【０１２９】 蛋白質チロシンキナーゼは，細胞外環境から細胞の内部にシグナルを伝達する
よう機能する，関連する蛋白質の大きなスーパーファミリーを構成する。これら
のシグナルは，細胞機能のあらゆる観点，例えば，成長，分化および死を指示す
る。任意の特定のキナーゼについて，関連の深い基質の同定はその機能を解明す
るための重要な工程である。
よう機能する，関連する蛋白質の大きなスーパーファミリーを構成する。これら
のシグナルは，細胞機能のあらゆる観点，例えば，成長，分化および死を指示す
る。任意の特定のキナーゼについて，関連の深い基質の同定はその機能を解明す
るための重要な工程である。
【０１３０】 我々は，細胞質チロシンキナーゼＳｒｃの新規な基質の同定を記述する。我々
は，ニトロセルロースフィルターに固定化したラムダ発現ライブラリのＳｒｃ含
有Ｓｆ９溶解物（Ｌｏｃｋ，Ｐ．ｅｔ．ａｌ．ＥＭＢＯＪ．１７（１５）：４３
４６−４３５７，１９９８）によるインビトロリン酸化に基づくスクリーニング
戦略を用いた。このようにして，４つのＳｒｃ基質をコードするラムダクローン
Ｔｋｓ１０７，１１３，１１８およびＴｋｓ２０２が同定された。
は，ニトロセルロースフィルターに固定化したラムダ発現ライブラリのＳｒｃ含
有Ｓｆ９溶解物（Ｌｏｃｋ，Ｐ．ｅｔ．ａｌ．ＥＭＢＯＪ．１７（１５）：４３
４６−４３５７，１９９８）によるインビトロリン酸化に基づくスクリーニング
戦略を用いた。このようにして，４つのＳｒｃ基質をコードするラムダクローン
Ｔｋｓ１０７，１１３，１１８およびＴｋｓ２０２が同定された。
【０１３１】本発明の核酸 本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすること
ができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子
の一部または全部を合成して，配列番号１，配列番号２，配列番号３および配列
番号４に示される核酸配列と有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし
，これによりコードされるアミノ酸配列は保存される。
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすること
ができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子
の一部または全部を合成して，配列番号１，配列番号２，配列番号３および配列
番号４に示される核酸配列と有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし
，これによりコードされるアミノ酸配列は保存される。
【０１３２】 さらに，核酸配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４
に示される核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端で
少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することにより得られる
ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が，ヌクレオ
チド配列によりコードされる配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番
号８のアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドをこのように用いることができる。例えば，本発明は，本発明の核酸配列ま
たはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより，
または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンと
してＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる任意の核酸配列
を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，これらの
５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を有することができる。
に示される核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端で
少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することにより得られる
ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が，ヌクレオ
チド配列によりコードされる配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番
号８のアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドをこのように用いることができる。例えば，本発明は，本発明の核酸配列ま
たはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより，
または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンと
してＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる任意の核酸配列
を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，これらの
５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を有することができる。
【０１３３】 所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明の遺伝子お
よびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明の遺伝子お
よびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
【０１３４】 さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
【０１３５】 本発明のＳｒｃ基質を単離するために，Ｌｏｃｋ，Ｐ．ｅｔ．ａｌ．ＥＭＢＯ
Ｊ．１７（１５）：４３４６−４３５７，１９９８（図面を含めその全体を本明
細書の一部としてここに引用する）に記載されるように，ニトロセルロースフィ
ルター上に固定化されたラムダ発現ライブラリのＳｒｃ含有Ｓｆ９溶解物による
インビトロリン酸化に基づくスクリーニング戦略を用いて，Ｓｒｃ基質を単離し
た。このようにして，４つのＳｒｃ基質をコードするラムダクローンＴｋｓ１０
７，１１３，１１８およびＴｋｓ２０２が同定された。
Ｊ．１７（１５）：４３４６−４３５７，１９９８（図面を含めその全体を本明
細書の一部としてここに引用する）に記載されるように，ニトロセルロースフィ
ルター上に固定化されたラムダ発現ライブラリのＳｒｃ含有Ｓｆ９溶解物による
インビトロリン酸化に基づくスクリーニング戦略を用いて，Ｓｒｃ基質を単離し
た。このようにして，４つのＳｒｃ基質をコードするラムダクローンＴｋｓ１０
７，１１３，１１８およびＴｋｓ２０２が同定された。
【０１３６】 Ｔｋｓ１０７（Ｇｒｕｂ） ラムダクローンｔｋｓ１０７は，ヒト肺腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０からのｃ
ＤＮＡを用いて構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリから単離された。Ｔｋｓ１
０７をコードするＤＮＡフラグメントを用いて，同じライブラリからＴｋｓ１０
７の種々の重複クローンを単離した。これらのクローンの１つ（Ｔｋｓ１０７−
４）は，推定開始メチオニンの上流にインフレームで終止コドンを有する，大き
いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このＯＲＦは，１５１１ア
ミノ酸の蛋白質をコードすると予測され，Ｇｒｕｂと名付けられた。この配列を
クエリーとして公共配列データベースをコンピュータ検索すると，このＯＲＦが
ｄｂｌホモロジードメイン（ＤＨ），続いてそのＣ末端にプレクストリンホモロ
ジードメイン（ＰＨ）を有することが明らかになった。
ＤＮＡを用いて構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリから単離された。Ｔｋｓ１
０７をコードするＤＮＡフラグメントを用いて，同じライブラリからＴｋｓ１０
７の種々の重複クローンを単離した。これらのクローンの１つ（Ｔｋｓ１０７−
４）は，推定開始メチオニンの上流にインフレームで終止コドンを有する，大き
いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このＯＲＦは，１５１１ア
ミノ酸の蛋白質をコードすると予測され，Ｇｒｕｂと名付けられた。この配列を
クエリーとして公共配列データベースをコンピュータ検索すると，このＯＲＦが
ｄｂｌホモロジードメイン（ＤＨ），続いてそのＣ末端にプレクストリンホモロ
ジードメイン（ＰＨ）を有することが明らかになった。
【０１３７】 ｄｂｌホモロジードメイン（ＤＨドメイン）は，最初にＤｂｌおよびＣｄｃ２
４蛋白質において見いだされた約２５０アミノ酸の領域である。その後，増加す
る蛋白質のリスト（＞２０）がＤＨドメインを含有することが示された。異なる
蛋白質のＤＨドメインは，互いに約３０％のアミノ酸同一性を有する。ＤＨドメ
インを含む蛋白質は，小ＧＴＰａｓｅのＲｈｏメンバーのグアニン交換因子（Ｇ
ＥＦ）として作用することが示されている。多くのＤＨ含有蛋白質は，Ｎ末端切
断により細胞トランスフォーメーション活性を示す（ここで，ＤＨドメインは変
異されない）（Ｑｕｉｌｌｉａｍ，ＬＡ．，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏ Ｅｓｓａｙｓ
，１７：３９５−４０４，１９９５．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．Ｐ．，ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２
：Ｆ１−Ｆ２３，１９９７．Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＺｈｅｎｇ，Ｙ．
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８：２１６−２２２，１９９６に概説
されている）。最近，ヒトＳｏｓのＤＨドメインの三次元構造が解明された（Ｓ
ｏｉｓｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９５：２５９−２６８）。
これはα−らせんから構成されていることが示され，このいくつかは先に定義さ
れたＤＨドメインの保存領域（ＣＲ）とよく対応する（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ
．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅ ｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ，１３３２：Ｆ１−Ｐ２３，１９９７，およびＧｒｕｂＧＥＰアラインメ
ントの図）。ＨＭＭＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を
用いてＤＨドメインについて隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。ＨＭＭ
ＥＲへの入力は，ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｍｐｓｏｎ，ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ
ＤＧ，Ｇｉｂｓｏｎ，ＴＪ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９９４）により評価された多配列アラインメント遺伝子である。（Ｓｏｉｓｓｏ
ｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．．Ｃｅｌｌ，９５：２５９−２６８）からの二次構
造情報をＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントに導入した。配列番号５（Ｔｋｓ１０
７／Ｇｒｕｂ）の１０８３−１２５７のアミノ酸領域は，この隠れマルコフモデ
ルとよく整合し，保存α−らせんモチーフならびに保存アミノ酸残基の両方を示
した（ＧｒｕｂＧＥＦアラインメント図）。
４蛋白質において見いだされた約２５０アミノ酸の領域である。その後，増加す
る蛋白質のリスト（＞２０）がＤＨドメインを含有することが示された。異なる
蛋白質のＤＨドメインは，互いに約３０％のアミノ酸同一性を有する。ＤＨドメ
インを含む蛋白質は，小ＧＴＰａｓｅのＲｈｏメンバーのグアニン交換因子（Ｇ
ＥＦ）として作用することが示されている。多くのＤＨ含有蛋白質は，Ｎ末端切
断により細胞トランスフォーメーション活性を示す（ここで，ＤＨドメインは変
異されない）（Ｑｕｉｌｌｉａｍ，ＬＡ．，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏ Ｅｓｓａｙｓ
，１７：３９５−４０４，１９９５．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．Ｐ．，ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２
：Ｆ１−Ｆ２３，１９９７．Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＺｈｅｎｇ，Ｙ．
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８：２１６−２２２，１９９６に概説
されている）。最近，ヒトＳｏｓのＤＨドメインの三次元構造が解明された（Ｓ
ｏｉｓｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９５：２５９−２６８）。
これはα−らせんから構成されていることが示され，このいくつかは先に定義さ
れたＤＨドメインの保存領域（ＣＲ）とよく対応する（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ
．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅ ｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ，１３３２：Ｆ１−Ｐ２３，１９９７，およびＧｒｕｂＧＥＰアラインメ
ントの図）。ＨＭＭＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を
用いてＤＨドメインについて隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。ＨＭＭ
ＥＲへの入力は，ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｍｐｓｏｎ，ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ
ＤＧ，Ｇｉｂｓｏｎ，ＴＪ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９９４）により評価された多配列アラインメント遺伝子である。（Ｓｏｉｓｓｏ
ｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．．Ｃｅｌｌ，９５：２５９−２６８）からの二次構
造情報をＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントに導入した。配列番号５（Ｔｋｓ１０
７／Ｇｒｕｂ）の１０８３−１２５７のアミノ酸領域は，この隠れマルコフモデ
ルとよく整合し，保存α−らせんモチーフならびに保存アミノ酸残基の両方を示
した（ＧｒｕｂＧＥＦアラインメント図）。
【０１３８】 さらに，２つのＥＳＴ（ＡＡ７７８２１０およびＡＡ８２９３４１）がＴｋｓ
１０７−４の３’配列と重複し，３’非翻訳配列がポリアデニル化まで延びてい
ることが見いだされた。Ｔｋｓ１０７，ｔｋｓ１０７−４および２つのＥＳＴか
ら編集された配列が配列番号１に示されており，これはＧｒｕｂと名付けられた
。この配列の提唱される関連性のある特徴は以下のものを含む：
１０７−４の３’配列と重複し，３’非翻訳配列がポリアデニル化まで延びてい
ることが見いだされた。Ｔｋｓ１０７，ｔｋｓ１０７−４および２つのＥＳＴか
ら編集された配列が配列番号１に示されており，これはＧｒｕｂと名付けられた
。この配列の提唱される関連性のある特徴は以下のものを含む：
【表１】 ヌクレオチド コメント １５５−１７７８ 元のＴｋｓ１０７の配列 １−５１０７ Ｔｋｓ１０７−４の配列 ２０８−４７６４ Ｇｒｕｂの推定コーディング領域 ３４５４−３９７８ Ｄｂｌホモロジードメイン ４０００−４３２３ プレクストリンホモロジードメイン ４１６４−５３３５ ＥＳＴＡＡ７７８２１０ ？−５３３２ ＥＳＴＡＡ８２９３４１（５’末端は未知） ５３０５−５３１５ ＡＡ８２９３４１には存在せず ４８９７ ＥＳＴにおいてはＧの代わりにＴ ５００５ ＥＳＴにおいてはＧの代わりにＴ ５０１０ ＥＳＴにおいてはＧの代わりにＴ ５０７２ ＥＳＴにおいてはＧの代わりにＴ ５１０３ ＥＳＴにおいてはＧの代わりにＴ
【０１３９】 ＧｒｕｂのＣ末端におけるＤＨ／ＰＨドメインのタンデムアレイは，Ｄｂｌフ
ァミリーの蛋白質の顕著な特徴である。このファミリーの多くのメンバーは，Ｎ
末端切断により細胞トランスフォーメーション活性を示す。細胞トランスフォー
メーションには，ＤＨ／ＰＨモジュールが無傷であることが必要である。多くの
Ｄｂｌファミリー蛋白質のＤＨ／ＰＨモジュールは，グアニン交換因子（ＧＥＦ
）として作用することにより種々のＲｈｏサブファミリー小ＧＴＰａｓｅの活性
を制御することが示されている。多くのＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅは，アク
チン構造の組立を制御し，種々のキナーゼ経路，例えばＪｎｋの活性化を通して
遺伝子転写を制御するかもしれないことが示されている（Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２７９：５０９−５１４，１９９８）。
ァミリーの蛋白質の顕著な特徴である。このファミリーの多くのメンバーは，Ｎ
末端切断により細胞トランスフォーメーション活性を示す。細胞トランスフォー
メーションには，ＤＨ／ＰＨモジュールが無傷であることが必要である。多くの
Ｄｂｌファミリー蛋白質のＤＨ／ＰＨモジュールは，グアニン交換因子（ＧＥＦ
）として作用することにより種々のＲｈｏサブファミリー小ＧＴＰａｓｅの活性
を制御することが示されている。多くのＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅは，アク
チン構造の組立を制御し，種々のキナーゼ経路，例えばＪｎｋの活性化を通して
遺伝子転写を制御するかもしれないことが示されている（Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２７９：５０９−５１４，１９９８）。
【０１４０】 Ｇｒｕｂ ｍＲＮＡは，調べたすべてのヒト組織において発現されており，特
に膵臓および脾臓で高い発現が見られる。６０種類の腫瘍細胞株についてＧｒｕ
ｂの発現レベルを測定し，１３（〜２１％）種類の細胞株で有意に上昇している
ことが見いだされ，１０またはそれ以上の細胞株でわずかに上昇しているかもし
れない。欠失分析は，２９３細胞中で両方を共発現させたときにＧｒｕｂがＮ末
端でＳｒｃによりリン酸化されることを示す。２９３細胞において発現させた組
換えＧｒｕｂは，見かけＭｒ約１９０，０００で移動する。これは予測されたＭ
ｒである１６４，７０１（一次アミノ酸配列に基づく）より大きいが，この範囲
のサイズの蛋白質のＭｒを正確に決定することはしばしば困難であり，Ｇｒｕｂ
がそのＭｒを変化させるかもしれない翻訳後修飾を有するか否かは明らかではな
い。
に膵臓および脾臓で高い発現が見られる。６０種類の腫瘍細胞株についてＧｒｕ
ｂの発現レベルを測定し，１３（〜２１％）種類の細胞株で有意に上昇している
ことが見いだされ，１０またはそれ以上の細胞株でわずかに上昇しているかもし
れない。欠失分析は，２９３細胞中で両方を共発現させたときにＧｒｕｂがＮ末
端でＳｒｃによりリン酸化されることを示す。２９３細胞において発現させた組
換えＧｒｕｂは，見かけＭｒ約１９０，０００で移動する。これは予測されたＭ
ｒである１６４，７０１（一次アミノ酸配列に基づく）より大きいが，この範囲
のサイズの蛋白質のＭｒを正確に決定することはしばしば困難であり，Ｇｒｕｂ
がそのＭｒを変化させるかもしれない翻訳後修飾を有するか否かは明らかではな
い。
【０１４１】 Ｇｒｕｂの全長，Ｎ末端またはＣ末端を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３クローン
を作成した。これらのクローンは，増強された成長速度，軟寒天中での成長，あ
るいは変化したモルホロジーを示さない（データ示さず）。しかし，２９３細胞
でＧｒｕｂのＮまたはＣ末端をＨＡ−ＪＮＫと共発現させると，Ｊｎｋ活性をベ
クター単独の４−６倍活性化した。野生型ＧｒｕｂをＨＡ−Ｊｎｋと共発現させ
ると，野生型ＧｒｕｂをＧｒｕｂのＮまたはＣ末端よりはるかに低いレベル（約
１／１０）で発現させたにもかかわらず，Ｊｎｋ活性が２．５倍促進された。こ
れに対し，他の異種蛋白質（ＳＨ３Ｐ７ΔＳＨ３）の過剰発現はＪｎｋ発現を弱
く活性化させたのみであった。これらのデータは，ＧｒｕｂのＣ末端が，おそら
くは未知のＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅのグアニン交換因子として作用するこ
とによりＪｎｋ活性を活性化しうることを示唆する。ＧｒｕｂのＤＨ／ＰＨまた
はＤＨドメインはそれ自体Ｊｎｋ活性を強く活性化しないことに注意することは
興味深い。このことは，ある種のｄｂｌファミリーメンバーのＤＨドメインは完
全な活性を示すためにフランキング領域を必要とする（おそらくは，フランキン
グ配列により付与される追加の構造的安定性のため）という挿話的証拠と一致す
る。Ｎ末端はまた，Ｊｎｋを活性化することができる。Ｎ末端がＪｎｋを活性化
するメカニズムは現在不明であるが，Ｎ末端がＪｎｋを活性化することができる
蛋白質に対する酵素的（すなわち，隠れたＧＥＦ活性）または結合活性を有する
ドメインを含む可能性がある。
を作成した。これらのクローンは，増強された成長速度，軟寒天中での成長，あ
るいは変化したモルホロジーを示さない（データ示さず）。しかし，２９３細胞
でＧｒｕｂのＮまたはＣ末端をＨＡ−ＪＮＫと共発現させると，Ｊｎｋ活性をベ
クター単独の４−６倍活性化した。野生型ＧｒｕｂをＨＡ−Ｊｎｋと共発現させ
ると，野生型ＧｒｕｂをＧｒｕｂのＮまたはＣ末端よりはるかに低いレベル（約
１／１０）で発現させたにもかかわらず，Ｊｎｋ活性が２．５倍促進された。こ
れに対し，他の異種蛋白質（ＳＨ３Ｐ７ΔＳＨ３）の過剰発現はＪｎｋ発現を弱
く活性化させたのみであった。これらのデータは，ＧｒｕｂのＣ末端が，おそら
くは未知のＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅのグアニン交換因子として作用するこ
とによりＪｎｋ活性を活性化しうることを示唆する。ＧｒｕｂのＤＨ／ＰＨまた
はＤＨドメインはそれ自体Ｊｎｋ活性を強く活性化しないことに注意することは
興味深い。このことは，ある種のｄｂｌファミリーメンバーのＤＨドメインは完
全な活性を示すためにフランキング領域を必要とする（おそらくは，フランキン
グ配列により付与される追加の構造的安定性のため）という挿話的証拠と一致す
る。Ｎ末端はまた，Ｊｎｋを活性化することができる。Ｎ末端がＪｎｋを活性化
するメカニズムは現在不明であるが，Ｎ末端がＪｎｋを活性化することができる
蛋白質に対する酵素的（すなわち，隠れたＧＥＦ活性）または結合活性を有する
ドメインを含む可能性がある。
【０１４２】 可能性のあるＧｒｕｂ機能をさらに理解するため，Ｇｒｕｂ相互作用蛋白質を
単離するために，酵母２−ハイブリッドスクリーニングにおいてＧｒｕｂのＮ末
端をおとりとして用いた。ＨｅｌａｃＤＮＡライブラリの約１．８ｘ１０6個の
トランスフォーマントを単離した。このアッセイにおいては，蛋白質スナピンを
コードする６個の独立したｃＤＮＡおよびラットＲＡＣＫ１のヒト相同体をコー
ドする２個の独立したｃＤＮＡが単離された。
単離するために，酵母２−ハイブリッドスクリーニングにおいてＧｒｕｂのＮ末
端をおとりとして用いた。ＨｅｌａｃＤＮＡライブラリの約１．８ｘ１０6個の
トランスフォーマントを単離した。このアッセイにおいては，蛋白質スナピンを
コードする６個の独立したｃＤＮＡおよびラットＲＡＣＫ１のヒト相同体をコー
ドする２個の独立したｃＤＮＡが単離された。
【０１４３】 スナピンは小さいニューロン特異的蛋白質であり，シナプス小胞に局在し，Ｓ
ＮＡＲＥ複合体とシナプトタグミンとの間の架橋として働く（Ｄａｒｄｉ，Ｊ．
，ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏ．１９９９，２：１１９−１２４）。
シナプトタグミンは，シナプス小胞と原形質膜との最終的な融合を誘発するカル
シウムセンサーである。ＧＴＰａｓｅのＲａｂサブファミリーの小ＧＴＰａｓｅ
はまた，効率的なシナプス輸送においても役割を果たす（Ｓｕｄｈｏｆ，Ｔ．Ｃ
．，Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３７５：６４５−６５３）。Ｇｒｕｂがこれらの
小ＧＴＰａｓｅのＧＥＦとして作用するという仮説は魅力的である。あるいは，
ＧｒｕｂはＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅのＧＥＦとしてより伝統的な様式で作
用するかもしれないが，スナピンに結合することにより，Ｒｈｏファミリーメン
バーを制御することによりアクチンサイクルへの小胞輸送とつながるかもしれな
い。
ＮＡＲＥ複合体とシナプトタグミンとの間の架橋として働く（Ｄａｒｄｉ，Ｊ．
，ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏ．１９９９，２：１１９−１２４）。
シナプトタグミンは，シナプス小胞と原形質膜との最終的な融合を誘発するカル
シウムセンサーである。ＧＴＰａｓｅのＲａｂサブファミリーの小ＧＴＰａｓｅ
はまた，効率的なシナプス輸送においても役割を果たす（Ｓｕｄｈｏｆ，Ｔ．Ｃ
．，Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３７５：６４５−６５３）。Ｇｒｕｂがこれらの
小ＧＴＰａｓｅのＧＥＦとして作用するという仮説は魅力的である。あるいは，
ＧｒｕｂはＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅのＧＥＦとしてより伝統的な様式で作
用するかもしれないが，スナピンに結合することにより，Ｒｈｏファミリーメン
バーを制御することによりアクチンサイクルへの小胞輸送とつながるかもしれな
い。
【０１４４】 ＲＡＣＫ１は最初，活性化蛋白質キナーゼＣの細胞内レセプターとしてクロー
ニングされた（Ｒｏｎ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．１９９４，９１
：８３９−８４３）。それ以来，ＲＡＣＫ１は，種々のシグナリング分子，例え
ばＳｒｃと結合すること，およびシグナリング複合体が組み立てられる分子足場
として作用するかもしれないことが示されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＭＭ，
ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９ ３８：１３７８７−９４．
Ｌｉｌｉｅｎｔａｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｄ．ＪＢＣ １９９８ ２
７３：２３７９−２３８３．Ｃｈａｎｇ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＭＣＢ １９９
８ １８：３２４５−３２５６．）。
ニングされた（Ｒｏｎ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．１９９４，９１
：８３９−８４３）。それ以来，ＲＡＣＫ１は，種々のシグナリング分子，例え
ばＳｒｃと結合すること，およびシグナリング複合体が組み立てられる分子足場
として作用するかもしれないことが示されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＭＭ，
ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９ ３８：１３７８７−９４．
Ｌｉｌｉｅｎｔａｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｄ．ＪＢＣ １９９８ ２
７３：２３７９−２３８３．Ｃｈａｎｇ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＭＣＢ １９９
８ １８：３２４５−３２５６．）。
【０１４５】Ｔｋｓ１１３ ラムダクローンＴｋｓ１１３は，ヒト肺腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０からｃＤ
ＮＡを用いて構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリから単離された。Ｔｋｓは，
１４３０ヌクレオチドのＥｃｏＲＩＸｈｏＩフラグメントを含む。このフラグメ
ントは，４７６アミノ酸のＯＲＦをコードし，公共に入手可能な配列のいずれと
も有意な相同性を有しない。しかし，Ｔｋｓ１１３は，Ｃ末端プロリンリッチド
メイン（２６％プロリン）中にいくつかのＰＸＸＰモチーフを含み，このことは
，これがＳＨ３ドメインを有するシグナリング分子の結合パートナーかもしれな
いことを示唆する。シグナリング複合体の足場，アンカーまたはアダプターとし
て働く蛋白質は，しばしば蛋白質／蛋白質相互作用の多数のモチーフ（例えばＰ
ＸＸＰ）を示す（Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２７８：２０７５−２０８０，１９９７）。
ＮＡを用いて構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリから単離された。Ｔｋｓは，
１４３０ヌクレオチドのＥｃｏＲＩＸｈｏＩフラグメントを含む。このフラグメ
ントは，４７６アミノ酸のＯＲＦをコードし，公共に入手可能な配列のいずれと
も有意な相同性を有しない。しかし，Ｔｋｓ１１３は，Ｃ末端プロリンリッチド
メイン（２６％プロリン）中にいくつかのＰＸＸＰモチーフを含み，このことは
，これがＳＨ３ドメインを有するシグナリング分子の結合パートナーかもしれな
いことを示唆する。シグナリング複合体の足場，アンカーまたはアダプターとし
て働く蛋白質は，しばしば蛋白質／蛋白質相互作用の多数のモチーフ（例えばＰ
ＸＸＰ）を示す（Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２７８：２０７５−２０８０，１９９７）。
【０１４６】 Ｔｋｓ１１３の配列は配列番号２に示される。この配列の関連性のある特徴は
以下のとおりである。Ｔｋｓ１１３ｍＲＮＡは調べたすべてのヒト組織において
発現されており，精巣，心臓および骨格筋において最も高く発現されている。こ
れらの実験でのＴｋｓ１１３のｍＲＮＡの見かけのサイズは約２．４ｋｂである
。さらに，Ｔｋｓ１１３のＮ末端に対して生成した抗体は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞に
おいて約７７ｋＤａの蛋白質を同定する。したがって，これらのデータに基づく
と，Ｔｋｓ１１３は全長クローンではなさそうである。Ｔｋｓ１１３の機能を解
明するためには，全長クローンを単離して，発現構築物等の試薬を生成すること
が必要である。
以下のとおりである。Ｔｋｓ１１３ｍＲＮＡは調べたすべてのヒト組織において
発現されており，精巣，心臓および骨格筋において最も高く発現されている。こ
れらの実験でのＴｋｓ１１３のｍＲＮＡの見かけのサイズは約２．４ｋｂである
。さらに，Ｔｋｓ１１３のＮ末端に対して生成した抗体は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞に
おいて約７７ｋＤａの蛋白質を同定する。したがって，これらのデータに基づく
と，Ｔｋｓ１１３は全長クローンではなさそうである。Ｔｋｓ１１３の機能を解
明するためには，全長クローンを単離して，発現構築物等の試薬を生成すること
が必要である。
【０１４７】Ｔｋｓ１１８ Ｔｋｓ１１８は，ヒト肺腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０からのｃＤＮＡを用いて
構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリから単離された。Ｔｋｓ１１８は，４３０
アミノ酸の大きいＯＲＦ（推定開始メチオニンから開始して）を有する１５３２
ヌクレオチドのクローンである。Ｔｋｓ１１８の最初の１１１５ヌクレオチドと
同一の独立したクローン（Ｔｋｓ１０９）もまた同じスクリーニングから単離さ
れた。これらの配列を用いて公共のデータベースを検索すると，ｔｋｓ１１８が
先にクローニングされたネズミ配列ＳＨ３Ｐ７と８６％同一であることが示され
，このことは，ｔｋｓ１１８がおそらくｍＳＨ３Ｐ７のヒトオルトログであるこ
とを示唆する（Ｓｐａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．
１４：７４１−７４４，１９９６）。さらに，Ｔｋｓ１１８のＮ末端２４０アミ
ノ酸は，トリ蛋白質であるドレブリン（Ｄｒｅｂｒｉｎ）と４４％同一である。
ドレブリンは，アクチン構造に結合しこれを変化させることが報告されている（
Ｓｈｉｒａｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７：２３１−２３６，１９９
５）。さらに，ｈＳＨ３Ｐ７もＣ末端６２アミノ酸にＳＨ３ドメインを含む。Ｔ
ｋｓ１１８の配列は配列番号３に示される。この配列の関連性のある特徴は以下
のとおりである。
構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリから単離された。Ｔｋｓ１１８は，４３０
アミノ酸の大きいＯＲＦ（推定開始メチオニンから開始して）を有する１５３２
ヌクレオチドのクローンである。Ｔｋｓ１１８の最初の１１１５ヌクレオチドと
同一の独立したクローン（Ｔｋｓ１０９）もまた同じスクリーニングから単離さ
れた。これらの配列を用いて公共のデータベースを検索すると，ｔｋｓ１１８が
先にクローニングされたネズミ配列ＳＨ３Ｐ７と８６％同一であることが示され
，このことは，ｔｋｓ１１８がおそらくｍＳＨ３Ｐ７のヒトオルトログであるこ
とを示唆する（Ｓｐａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．
１４：７４１−７４４，１９９６）。さらに，Ｔｋｓ１１８のＮ末端２４０アミ
ノ酸は，トリ蛋白質であるドレブリン（Ｄｒｅｂｒｉｎ）と４４％同一である。
ドレブリンは，アクチン構造に結合しこれを変化させることが報告されている（
Ｓｈｉｒａｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７：２３１−２３６，１９９
５）。さらに，ｈＳＨ３Ｐ７もＣ末端６２アミノ酸にＳＨ３ドメインを含む。Ｔ
ｋｓ１１８の配列は配列番号３に示される。この配列の関連性のある特徴は以下
のとおりである。
【表２】 ヌクレオチド コメント １−１５３５ Ｔｋｓ１１８配列 １−１１１５ Ｔｋｓ１０９配列 ２６−１３１９ Ｔｋｓ１１８コーディング配列 １−７２０ ドレブリンホモロジードメイン １１３０−１３１９ ＳＨ３ドメイン ９６６ Ｔｋｓ１０９においてはＣの代わりにＴ ９６９ Ｔｋｓ１０９においてはＣの代わりにＴ １０２３ Ｔｋｓ１０９においてはＣの代わりにＴ
【０１４８】 Ｔｋｓ１１８のｍＲＮＡは，調べたすべての組織において発現されており，脾
臓，胸腺，前立腺および末梢血リンパ球において最も高い発現が見られる。Ｔｋ
ｓ１１８ｍＲＮＡは，試験した腫瘍細胞株の４０％以上で過剰発現されている。
２９３細胞中で共発現させたときＴｋｓ１１８はＳｒｃによりリン酸化される。
ＮＩＨ３Ｔ３およびＳｒｃでトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞中でＴｋｓ
１１８を過剰発現させると，アクチン様構造に局在化する。注目すべきことに，
Ｓｒｃでトランスフォームした細胞においてＴｋｓ１１８はポドソームに局在す
る。この局在化は，ドレブリンホモロジードメインに依存しており，ドレブリン
がアクチン構造に結合してこれを変化させるという先の報告と一致する。最近ｍ
−ＳＨ３Ｐ７が抗原レセプター刺激リンパ球においてチロシンリン酸化され，Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞中でアクチン構造と共局在することが示されている（Ｌａｒｂｏ
ｌｅｔｔｅ，Ｏ．，ＭＣＢ．１９：１５３９−１５４６，１９９９）。現在，我
々は，Ｔｋｓ１１８がインビトロおよびインビボでアクチン構造に結合し，およ
び／または影響を及ぼすか否かを決定している。種々のＴｋｓ１１８構築物を細
胞株中で過剰発現させて，Ｔｋｓ１１８が，細胞成長，トランスフォーメーショ
ン，および運動性に及ぼす影響を決定することができる。
臓，胸腺，前立腺および末梢血リンパ球において最も高い発現が見られる。Ｔｋ
ｓ１１８ｍＲＮＡは，試験した腫瘍細胞株の４０％以上で過剰発現されている。
２９３細胞中で共発現させたときＴｋｓ１１８はＳｒｃによりリン酸化される。
ＮＩＨ３Ｔ３およびＳｒｃでトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞中でＴｋｓ
１１８を過剰発現させると，アクチン様構造に局在化する。注目すべきことに，
Ｓｒｃでトランスフォームした細胞においてＴｋｓ１１８はポドソームに局在す
る。この局在化は，ドレブリンホモロジードメインに依存しており，ドレブリン
がアクチン構造に結合してこれを変化させるという先の報告と一致する。最近ｍ
−ＳＨ３Ｐ７が抗原レセプター刺激リンパ球においてチロシンリン酸化され，Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞中でアクチン構造と共局在することが示されている（Ｌａｒｂｏ
ｌｅｔｔｅ，Ｏ．，ＭＣＢ．１９：１５３９−１５４６，１９９９）。現在，我
々は，Ｔｋｓ１１８がインビトロおよびインビボでアクチン構造に結合し，およ
び／または影響を及ぼすか否かを決定している。種々のＴｋｓ１１８構築物を細
胞株中で過剰発現させて，Ｔｋｓ１１８が，細胞成長，トランスフォーメーショ
ン，および運動性に及ぼす影響を決定することができる。
【０１４９】Ｔｋｓ２０２ ラムダクローンＴｋｓ２０２は，ヒト結腸腫瘍細胞株Ｃｏｌｏ２０５（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）からのｃＤＮＡを用いて構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリ
から単離された。ｔｋｓ２０２をコードするＤＮＡ配列を用いて公共のデータベ
ースを調べて，有益な相同性を明らかにした。この検索により，Ｔｋｓ２０２の
３’末端が小ＧＴＰａｓｅファミリーの蛋白質と相同のアミノ酸配列をコードす
ることが明らかになった。さらに，２つのＥＳＴ（ＡＡ４７０５１９およびｒ７
８６５５）がｔｋｓ２０２の３’配列と重複することも見いだされた。これらの
ＥＳＴからの配列を用いてＴｋｓ２０２配列をポリアデニル化部位まで延長した
。Ｔｋｓ２０２からの５’の約５００ヌクレオチドのＲＩ／Ｘｂａｌフラグメン
トを用いてＴｒｉｐ；Ｅｘ前立腺ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索し，追
加のＴｋｓ２０２クローンを得た。これらのクローンの１つであるＴｋｓ２０２
−１７は，５’配列を９３３ヌクレオチド延長した。５’配列の追加の３７０ヌ
クレオチドは，以下に記載する５’ＲＡＣＥの改変により得た。この５’ＲＡＣ
Ｅ産物は，ヌクレオチド１７０に終止コドンを示し，これはヌクレオチド６４７
の推定開始メチオニンの５’側である。Ｔｋｓ２０２，Ｔｋｓ２０２−１７，２
つのＥＳＴ，および５’ＲＡＣＥ産物から編集された配列が配列番号４に示され
る。この配列の関連性のある特徴は以下のとおりである：
ａｔａｇｅｎｅ）からのｃＤＮＡを用いて構築したλＺａｐｃＤＮＡライブラリ
から単離された。ｔｋｓ２０２をコードするＤＮＡ配列を用いて公共のデータベ
ースを調べて，有益な相同性を明らかにした。この検索により，Ｔｋｓ２０２の
３’末端が小ＧＴＰａｓｅファミリーの蛋白質と相同のアミノ酸配列をコードす
ることが明らかになった。さらに，２つのＥＳＴ（ＡＡ４７０５１９およびｒ７
８６５５）がｔｋｓ２０２の３’配列と重複することも見いだされた。これらの
ＥＳＴからの配列を用いてＴｋｓ２０２配列をポリアデニル化部位まで延長した
。Ｔｋｓ２０２からの５’の約５００ヌクレオチドのＲＩ／Ｘｂａｌフラグメン
トを用いてＴｒｉｐ；Ｅｘ前立腺ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索し，追
加のＴｋｓ２０２クローンを得た。これらのクローンの１つであるＴｋｓ２０２
−１７は，５’配列を９３３ヌクレオチド延長した。５’配列の追加の３７０ヌ
クレオチドは，以下に記載する５’ＲＡＣＥの改変により得た。この５’ＲＡＣ
Ｅ産物は，ヌクレオチド１７０に終止コドンを示し，これはヌクレオチド６４７
の推定開始メチオニンの５’側である。Ｔｋｓ２０２，Ｔｋｓ２０２−１７，２
つのＥＳＴ，および５’ＲＡＣＥ産物から編集された配列が配列番号４に示され
る。この配列の関連性のある特徴は以下のとおりである：
【表３】 ヌクレオチド コメント １３０５−３１５５ Ｔｋｓ２０２ ３７１−１７９８ Ｔｋｓ２０２−１７ ６４７−２８６６ 推定Ｔｋｓ２０２コーディング領域 ２２５８−２８６６ ＧＴＰａｓｅドメイン １−５３２ ５’ＲＡＣＥ産物 １７８８−３１５５ ＥＳＴ ＡＡ４７０５１９ ２５４４−３１５５ ＥＳＴ ｒ７８６５５
【０１５０】 ｔｋｓ２０２のＤＮＡフラグメントを用いて，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。このこと
により，内因性ｔｋｓ２０２ｍＲＮＡが約５ｋｂであり，前立腺および膵臓を除
き，試験したほとんどの組織で非常に低いかまたは検出されないレベルで発現さ
れていることが示された。
ｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。このこと
により，内因性ｔｋｓ２０２ｍＲＮＡが約５ｋｂであり，前立腺および膵臓を除
き，試験したほとんどの組織で非常に低いかまたは検出されないレベルで発現さ
れていることが示された。
【０１５１】 小ＧＴＰａｓｅは，多様な生物学的機能，例えば，細胞増殖および分化，細胞
骨格構成，蛋白質輸送，細胞サイクルおよびフリーラジカル生成を制御する分子
スイッチとして作用する蛋白質の大きなファミリーである（Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．
Ｒ．ｅｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４８（６２９７）：１２５−３２，１９９
０．Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４９（６３０５）
：１１７−２７，１９９１）。このＧＴＰａｓｅはこれらの中心的細胞経路を調
節し，ＧＴＰａｓｅおよびそのレギュレータの両方とも非常に重要であることを
示唆する。
骨格構成，蛋白質輸送，細胞サイクルおよびフリーラジカル生成を制御する分子
スイッチとして作用する蛋白質の大きなファミリーである（Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．
Ｒ．ｅｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４８（６２９７）：１２５−３２，１９９
０．Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ．ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ，３４９（６３０５）
：１１７−２７，１９９１）。このＧＴＰａｓｅはこれらの中心的細胞経路を調
節し，ＧＴＰａｓｅおよびそのレギュレータの両方とも非常に重要であることを
示唆する。
【０１５２】 小ＧＴＰａｓｅは，典型的には約２００アミノ酸であり，そのほぼすべてが単
一のＧＴＰａｓｅドメインに折り畳まれている。そのように，ｔｋｓ２０２は顕
著な延長Ｎ末端をそのＧＴＰａｓｅドメインに含む点において珍しい。この延長
の存在は，ｔｋｓ２０２（および類似の構造のまだ発見されていないＧＴＰａｓ
ｅ）の，ＧＴＰａｓｅについてこれまでに知られていない細胞での役割を示唆す
るかもしれず，またはＧＴＰａｓｅ活性を制御する新規なメカニズムであるかも
しれないと推測することができる。
一のＧＴＰａｓｅドメインに折り畳まれている。そのように，ｔｋｓ２０２は顕
著な延長Ｎ末端をそのＧＴＰａｓｅドメインに含む点において珍しい。この延長
の存在は，ｔｋｓ２０２（および類似の構造のまだ発見されていないＧＴＰａｓ
ｅ）の，ＧＴＰａｓｅについてこれまでに知られていない細胞での役割を示唆す
るかもしれず，またはＧＴＰａｓｅ活性を制御する新規なメカニズムであるかも
しれないと推測することができる。
【０１５３】ＩＩ．本発明の蛋白質を検出するための核酸プローブ，方法およびキット 本発明の核酸プローブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適
当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得る
ことができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野におい
て認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ"，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８
９を参照）。
当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得る
ことができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野におい
て認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ"，第２版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８
９を参照）。
【０１５４】 別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端および
Ｃ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学
合成を行うことができる。合成された核酸プローブは，ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にした
がって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当
な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ること
ができる。
Ｃ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学
合成を行うことができる。合成された核酸プローブは，ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にした
がって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当
な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ること
ができる。
【０１５５】 当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知ら
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを用意に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブは，標準的標識技術，例えば放射性標識，酵素標識
，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識す
ることができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可
視化することができる。
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いてそのようなプロ
ーブを用意に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブは，標準的標識技術，例えば放射性標識，酵素標識
，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識す
ることができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可
視化することができる。
【０１５６】 本発明の核酸プローブはＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含み，そのようなプ
ローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸
プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例とし
ては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物
，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアク
リルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体
支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
ローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸
プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例とし
ては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物
，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアク
リルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体
支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【０１５７】 本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１５８】 試料中で本発明の核酸の存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハイ
ブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そ
して（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む
。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核
酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組
織のＲＮＡ試料が含まれる。
ブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そ
して（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む
。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核
酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組
織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１５９】 試料中で本発明の核酸の存在を検出するためのキットは，その中に上述の核酸
プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以
下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合
した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，
限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，
アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。
プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以
下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合
した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，
限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，
アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。
【０１６０】 詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れら
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１６１】ＩＩＩ．Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２関連核 酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞 本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０１６２】 本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
【０１６３】 核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
【０１６４】 所望の場合には，本発明のポリペプチドをコードする配列の３’側の非コーデ
ィング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止制
御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。すな
わち，本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している３’
領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発現宿
主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞にお
いて機能的な３’領域で置き換えることができる。
ィング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止制
御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。すな
わち，本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している３’
領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発現宿
主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞にお
いて機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０１６５】 ２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列および本発明のポリペプチ
ドをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレームシ
フト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のポリペプチドを
コードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）本発明
のポリペプチドの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨
害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち，プロモ
ーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合，
ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本発明のポ
リペプチドをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主により認識さ
れる転写および翻訳シグナルが必要である。
ドをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の連結の性質が，（１）フレームシ
フト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のポリペプチドを
コードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）本発明
のポリペプチドの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨
害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち，プロモ
ーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合，
ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本発明のポ
リペプチドをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主により認識さ
れる転写および翻訳シグナルが必要である。
【０１６６】 本発明は，本発明のポリペプチド（またはその機能的誘導体）をコードする遺
伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含す
る。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効でありか
つ便利であり，したがって，本発明のポリペプチドのための１つの好ましい発現
システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表され
る。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含す
る。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効でありか
つ便利であり，したがって，本発明のポリペプチドのための１つの好ましい発現
システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表され
る。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【０１６７】 原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【０１６８】 認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０１６９】 本発明のポリペプチド（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において発
現させるためには，本発明のポリペプチドをコードする配列が，機能的原核生物
プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのような
プロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，
誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バクテリ
オファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配
列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な
原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プロモ
ーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃ
Ｉ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｏｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ
．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２
０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌ
ｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅ
ｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６），
およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４
２，１９８４）により概説されている。
現させるためには，本発明のポリペプチドをコードする配列が，機能的原核生物
プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのような
プロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，
誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バクテリ
オファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配
列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な
原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プロモ
ーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃ
Ｉ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｏｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ
．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２
０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌ
ｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅ
ｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６），
およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４
２，１９８４）により概説されている。
【０１７０】 原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボ
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０１７１】 本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするポ
リペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されない。適当
な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物宿主には
，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のい
ずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，ＨｅＬａ細
胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１，またはリンパ
球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞に
は，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株，例えばＩＭＲ
３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能力を提供
することができる。
リペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されない。適当
な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物宿主には
，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のい
ずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，ＨｅＬａ細
胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１，またはリンパ
球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞に
は，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株，例えばＩＭＲ
３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能力を提供
することができる。
【０１７２】 さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルス
ベクターを，昆虫細胞において本発明のキナーゼを大量に発現するよう遺伝子工
学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，１
９８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ
．２７７−２９７，１９８６）。
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルス
ベクターを，昆虫細胞において本発明のキナーゼを大量に発現するよう遺伝子工
学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，１
９８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ
．２７７−２９７，１９８６）。
【０１７３】 酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のポリペプチドの発現にはいくつかの可能なベクター系が
利用可能である。
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のポリペプチドの発現にはいくつかの可能なベクター系が
利用可能である。
【０１７４】 宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０１７５】 本発明のポリペプチドの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域を
使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指
示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには
，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２
）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１
：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１
）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６
９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指
示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには
，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２
）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１
：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１
）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６
９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０１７６】 真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のポリペプチド（また
はその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンを
コードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすること
が好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明の
ポリペプチドのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）また
はフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のポリペプチドのコーディング配
列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす。
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のポリペプチド（また
はその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンを
コードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすること
が好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明の
ポリペプチドのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）また
はフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のポリペプチドのコーディング配
列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす。
【０１７７】 本発明のポリペプチドをコードする核酸分子および動作可能なように連結され
たプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複
製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線
状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自
己複製することができず，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生
ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートされる
ことにより永久発現が得られる。
たプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複
製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線
状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自
己複製することができず，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生
ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートされる
ことにより永久発現が得られる。
【０１７８】 所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０１７９】 導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０１８０】 好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例
えば，，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ
；"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。．Ｂａｃｉｌｌｕｓ
プラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９
８２）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅ
ｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１
８３，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例え
ばＩＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ
，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミ
ドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７
０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３
：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
えば，，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ
；"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。．Ｂａｃｉｌｌｕｓ
プラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９
８２）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅ
ｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１
８３，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例え
ばＩＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ
，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミ
ドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７
０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３
：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０１８１】 好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０１８２】 構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のポリペプチドまたはそのフラグメ
ントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，
またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオ
キシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを形
成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ま
しい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のポリペプチドまたはそのフラグメ
ントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，
またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオ
キシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを形
成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ま
しい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０１８３】ＩＶ．本発明の蛋白質およびその発現パターン 当該技術分野において知られる種々の方法論を用いて，本発明のポリペプチド
を得ることができる。ポリペプチドは，天然にポリペプチドを産生する組織また
は細胞から精製することができる。あるいは，上述の単離された核酸フラグメン
トを用いて本発明のポリペプチドを生物中で発現させることができる。本発明の
試料には，細胞，蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物，または生物学的液体が含
まれる。試料は，アッセイフォーマット，検出方法，および試料として用いられ
る組織，細胞または抽出物の性質に基づいて様々であろう。
を得ることができる。ポリペプチドは，天然にポリペプチドを産生する組織また
は細胞から精製することができる。あるいは，上述の単離された核酸フラグメン
トを用いて本発明のポリペプチドを生物中で発現させることができる。本発明の
試料には，細胞，蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物，または生物学的液体が含
まれる。試料は，アッセイフォーマット，検出方法，および試料として用いられ
る組織，細胞または抽出物の性質に基づいて様々であろう。
【０１８４】 起源生物が天然にそのようなポリペプチドを含む限り，任意の真核生物を本発
明のポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用いる場
合，"起源生物"とは，その生物においてサブユニットが発現されているか，およ
び最終的にそれから単離されたかにかかわらず，サブユニットのアミノ酸配列が
由来する元の生物を意味する。
明のポリペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用いる場
合，"起源生物"とは，その生物においてサブユニットが発現されているか，およ
び最終的にそれから単離されたかにかかわらず，サブユニットのアミノ酸配列が
由来する元の生物を意味する。
【０１８５】 当業者は，天然の夾雑物を含まないポリペプチドを得るために，蛋白質を単離
する既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには，限定されないが，
サイズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，お
よび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
する既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには，限定されないが，
サイズ排除クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，お
よび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【０１８６】Ｔｋｓ１０７（Ｇｒｕｂ） ＧｒｕｂのＣ末端におけるＤＨ／ＰＨドメインのタンデムアレイは，蛋白質の
Ｄｂｌファミリーの顕著な特徴である。このファミリーの多くのメンバーは，Ｎ
末端切断により細胞トランスフォーメーション活性を示す。細胞トランスフォー
メーションには，ＤＨ／ＰＨモジュールが無傷であることが必要である。
Ｄｂｌファミリーの顕著な特徴である。このファミリーの多くのメンバーは，Ｎ
末端切断により細胞トランスフォーメーション活性を示す。細胞トランスフォー
メーションには，ＤＨ／ＰＨモジュールが無傷であることが必要である。
【０１８７】 ＧｒｕｂｍＲＮＡは，調べた全てのヒト組織で発現しており，特に膵臓および
脾臓で高い発現が見られる（図１１）。６０種類の腫瘍細胞株についてＧｒｕｂ
の発現レベルを測定し，１３（−２１％）種類の細胞株で有意に上昇しているこ
とが見いだされ，１０またはそれ以上の細胞株でわずかに上昇しているかもしれ
ない（図１２）。欠失分析は，２９３細胞において両方を共発現させたときＧｒ
ｕｂがＮ末端においてＳｒｃによりリン酸化されることを示す（図１３）。２９
３細胞中で発現させた組換えＧｒｕｂは，見かけのＭｒ約１９０，０００で移動
する（図１３）。これは予測されるＭｒである１６４，７０１（一次アミノ酸配
列に基づく）より大きいが，この範囲のサイズの蛋白質のＭｒを正確に決定する
ことはしばしば困難であり，ＧｒｕｂがそのＭｒを変更するかもしれない翻訳後
修飾を有するか否かは明らかではない。
脾臓で高い発現が見られる（図１１）。６０種類の腫瘍細胞株についてＧｒｕｂ
の発現レベルを測定し，１３（−２１％）種類の細胞株で有意に上昇しているこ
とが見いだされ，１０またはそれ以上の細胞株でわずかに上昇しているかもしれ
ない（図１２）。欠失分析は，２９３細胞において両方を共発現させたときＧｒ
ｕｂがＮ末端においてＳｒｃによりリン酸化されることを示す（図１３）。２９
３細胞中で発現させた組換えＧｒｕｂは，見かけのＭｒ約１９０，０００で移動
する（図１３）。これは予測されるＭｒである１６４，７０１（一次アミノ酸配
列に基づく）より大きいが，この範囲のサイズの蛋白質のＭｒを正確に決定する
ことはしばしば困難であり，ＧｒｕｂがそのＭｒを変更するかもしれない翻訳後
修飾を有するか否かは明らかではない。
【０１８８】 Ｇｒｕｂの正常および切断型変異体の過剰発現の結果の特性決定，特にこれら
が細胞トランスフォーメーションを誘導するか逆転するかに着目したものが進行
中である。組換え的に発現させた全長および切断型Ｇｒｕｂを，小ＧＴＰａｓｅ
の種々のメンバーに対するＧＥＦ活性の可能性について試験する。これらの組換
え蛋白質を発現する安定なクローンが単離されるであろう。これらは成長速度，
ＤＮＡ合成，細胞接触阻害（フォーカス形成），アンカー非依存性成長（軟寒天
アッセイ），およびヌードマウスにおける腫瘍原性について特性決定されるであ
ろう。
が細胞トランスフォーメーションを誘導するか逆転するかに着目したものが進行
中である。組換え的に発現させた全長および切断型Ｇｒｕｂを，小ＧＴＰａｓｅ
の種々のメンバーに対するＧＥＦ活性の可能性について試験する。これらの組換
え蛋白質を発現する安定なクローンが単離されるであろう。これらは成長速度，
ＤＮＡ合成，細胞接触阻害（フォーカス形成），アンカー非依存性成長（軟寒天
アッセイ），およびヌードマウスにおける腫瘍原性について特性決定されるであ
ろう。
【０１８９】Ｔｋｓ１１３ Ｔｋｓ１１３ｍＲＮＡは調べたすべてのヒト組織で発現されており，精巣，心
臓および骨格筋において最も高く発現される（図１４）。これらの実験における
Ｔｋｓ１１３のｍＲＮＡの見かけのサイズは約２．４ｋｂである。さらに，Ｔｋ
ｓ１１３のＮ末端に対して生成させた抗体は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞において約７７
ｋＤａの蛋白質を同定する。これらのデータに基づくと，Ｔｋｓ１１３は全長ク
ローンではなさそうである（図１５）。
臓および骨格筋において最も高く発現される（図１４）。これらの実験における
Ｔｋｓ１１３のｍＲＮＡの見かけのサイズは約２．４ｋｂである。さらに，Ｔｋ
ｓ１１３のＮ末端に対して生成させた抗体は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞において約７７
ｋＤａの蛋白質を同定する。これらのデータに基づくと，Ｔｋｓ１１３は全長ク
ローンではなさそうである（図１５）。
【０１９０】Ｔｋｓ１１８ ＴｋｓｍＲＮＡは，調べたすべての組織において発現しており，脾臓，胸腺，
前立腺および末梢血リンパ球において最も発現が高い（図１７）。Ｔｋｓ１１８
ｍＲＮＡは試験した腫瘍細胞株の４０％以上で過剰発現されている（図１８）。
２９３細胞において共発現させるとＴｋｓ１１８はＳｒｃによりリン酸化される
（図１９）。ＮＩＨ３Ｔ３およびＳｒｃでトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細
胞においてＴｋｓ１１８を過剰発現させると，アクチン様構造に局在化する（図
２０）。注目すべきことに，Ｔｋｓ１１８はＳｒｃでトランスフォームした細胞
においてはポドソームに局在化する（図２０）。この局在化は，ドレブリンホモ
ロジードメインに依存性であり，ドレブリンがアクチン構造に結合してこれを変
化させるという先の報告と一致する。最近，ｍ−ＳＨ３Ｐ７が抗原レセプター刺
激リンパ球においてチロシンリン酸化され，ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のアクチン構造
に共局在するることが示されている（Ｌａｒｂｏｌｅｔｔｅ，Ｏ．，ＭＣＢ．１
９：１５３９−１５４６，１９９９）。
前立腺および末梢血リンパ球において最も発現が高い（図１７）。Ｔｋｓ１１８
ｍＲＮＡは試験した腫瘍細胞株の４０％以上で過剰発現されている（図１８）。
２９３細胞において共発現させるとＴｋｓ１１８はＳｒｃによりリン酸化される
（図１９）。ＮＩＨ３Ｔ３およびＳｒｃでトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細
胞においてＴｋｓ１１８を過剰発現させると，アクチン様構造に局在化する（図
２０）。注目すべきことに，Ｔｋｓ１１８はＳｒｃでトランスフォームした細胞
においてはポドソームに局在化する（図２０）。この局在化は，ドレブリンホモ
ロジードメインに依存性であり，ドレブリンがアクチン構造に結合してこれを変
化させるという先の報告と一致する。最近，ｍ−ＳＨ３Ｐ７が抗原レセプター刺
激リンパ球においてチロシンリン酸化され，ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のアクチン構造
に共局在するることが示されている（Ｌａｒｂｏｌｅｔｔｅ，Ｏ．，ＭＣＢ．１
９：１５３９−１５４６，１９９９）。
【０１９１】 現在，我々は，Ｔｋｓ１１８がインビトロおよびインビボでアクチン構造に結
合し，および／またはそれに影響を与えるか否かを決定している。種々のＴｋｓ
１１８構築物を細胞株で過剰発現させて，細胞成長，トランスフォーメーション
および運動性に及ぼすＴｋｓ１１８の影響を決定する。
合し，および／またはそれに影響を与えるか否かを決定している。種々のＴｋｓ
１１８構築物を細胞株で過剰発現させて，細胞成長，トランスフォーメーション
および運動性に及ぼすＴｋｓ１１８の影響を決定する。
【０１９２】Ｔｋｓ２０２ ｔｋｓ２０２のＤＮＡフラグメントを用いてＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を探索した。このことに
より，内因性ｔｋｓ２０２ｍＲＮＡが約５ｋｂであり，前立腺および膵臓を除き
，試験したほとんどの組織において非常に低いかまたは検出されないレベルで発
現されていることが示された（図２２）。
より，内因性ｔｋｓ２０２ｍＲＮＡが約５ｋｂであり，前立腺および膵臓を除き
，試験したほとんどの組織において非常に低いかまたは検出されないレベルで発
現されていることが示された（図２２）。
【０１９３】 小ＧＴＰａｓｅは，典型的には約２００アミノ酸であり，そのほとんどすべて
は単一のＧＴＰａｓｅドメイン中に折り畳まれている。そのように，Ｔｋｓ２０
２は，そのＧＴＰａｓｅドメインへの顕著なＮ末端の延長を含む点において珍し
い。この延長の存在は，Ｔｋｓ２０２（および類似の構造のまだ発見されていな
いＧＴＰａｓｅ）の，ＧＴＰａｓｅについてこれまでに知られていない細胞での
役割を示唆するかもしれず，またはＧＴＰａｓｅ活性を制御する新規なメカニズ
ムであるかもしれないと推測することができる。
は単一のＧＴＰａｓｅドメイン中に折り畳まれている。そのように，Ｔｋｓ２０
２は，そのＧＴＰａｓｅドメインへの顕著なＮ末端の延長を含む点において珍し
い。この延長の存在は，Ｔｋｓ２０２（および類似の構造のまだ発見されていな
いＧＴＰａｓｅ）の，ＧＴＰａｓｅについてこれまでに知られていない細胞での
役割を示唆するかもしれず，またはＧＴＰａｓｅ活性を制御する新規なメカニズ
ムであるかもしれないと推測することができる。
【０１９４】Ｖ．Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２を検出する ための抗体，ハイブリドーマ，使用方法およびキット 本発明はまた，本発明の全長または部分ポリペプチドに対して特異的結合親和
性を有する抗体に関連する。そのような抗体は，本発明のポリペプチドに対する
その結合親和性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単
離することができる。本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体を，本発明
のポリペプチドと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において
用いるために選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他
のポリペプチドを含む組織における発現の変化の分析が含まれる。
性を有する抗体に関連する。そのような抗体は，本発明のポリペプチドに対する
その結合親和性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単
離することができる。本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体を，本発明
のポリペプチドと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において
用いるために選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他
のポリペプチドを含む組織における発現の変化の分析が含まれる。
【０１９５】 本発明のポリペプチドは，種々の手順および方法，例えば抗体の生成，医薬組
成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができる
。
成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができる
。
【０１９６】 本発明のポリペプチドは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用いる
ことができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書
に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するで
あろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，な
らびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体
のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において
知られる手法の１つを用いて生成することができる。
ことができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書
に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するで
あろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，な
らびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体
のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において
知られる手法の１つを用いて生成することができる。
【０１９７】 本発明はまた，上述のモノクローナル抗体，またはその結合フラグメントを産
生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体
を分泌することができる不死化細胞株である。
生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体
を分泌することができる不死化細胞株である。
【０１９８】 一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【０１９９】 ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０２００】 モノクローナル抗体のためには，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエロ
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲ
ｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリド
ーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよ
びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲ
ｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリド
ーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよ
びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０２０１】 ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８−３１９，１９７９；Ｅｎｇ
ｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９−１３５，１９７２；
Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５−２２６，１９７
６を参照。本発明の標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシト
ゥーアッセイに用いて，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定するこ
とができる。
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８−３１９，１９７９；Ｅｎｇ
ｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９−１３５，１９７２；
Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５−２２６，１９７
６を参照。本発明の標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシト
ゥーアッセイに用いて，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定するこ
とができる。
【０２０２】 上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【０２０３】 さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０２０４】 抗ペプチドペプチドは，本発明のポリペプチドのペプチド配列中に見いだされ
る塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で
置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，お
よび／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え，
およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
る塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で
置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，お
よび／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え，
およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
【０２０５】 本発明はまた，試料中においてＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８ま
たはＴｋｓ２０２ポリペプチドを検出する方法を包含する。該方法は，（ａ）試
料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ，そして（ｂ
）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含む。詳細には，
該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベートし，抗
体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で本発明のポ
リペプチドのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは疾病を示すか
もしれない。
たはＴｋｓ２０２ポリペプチドを検出する方法を包含する。該方法は，（ａ）試
料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ，そして（ｂ
）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含む。詳細には，
該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベートし，抗
体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で本発明のポ
リペプチドのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは疾病を示すか
もしれない。
【０２０６】 抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０２０７】 本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０２０８】 キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。好ましくは，キットは使用の指針も含む。別の好ましい態様においては，キ
ットは以下の１またはそれ以上を含む１またはそれ以上の他の容器をさらに含む
：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。好ましくは，キットは使用の指針も含む。別の好ましい態様においては，キ
ットは以下の１またはそれ以上を含む１またはそれ以上の他の容器をさらに含む
：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
【０２０９】 検出試薬の例には，限定されないが，標識第２抗体が含まれ，あるいは，一次
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０２１０】ＶＩ．本発明のポリペプチドと相互作用する化合物の単離 本発明はまた，本発明のＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴ
ｋｓ２０２に結合しうる化合物を検出する方法に関する。該方法は，化合物を本
発明のＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２とともに
インキュベートし，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２
０２に結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は，複雑な混合物，
例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。
ｋｓ２０２に結合しうる化合物を検出する方法に関する。該方法は，化合物を本
発明のＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２とともに
インキュベートし，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２
０２に結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は，複雑な混合物，
例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。
【０２１１】 本発明はまた，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０
２の活性または結合パートナー（例えばｓｒｃ）の活性のアゴニストまたはアン
タゴニストを検出する方法に関する。該方法は，本発明のポリペプチドを産生す
る細胞を化合物の存在下でインキュベートし，ポリペプチド活性またはポリペプ
チド結合パートナーの活性のレベルの変化を検出することを含む。このようにし
て同定される化合物は，化合物の存在を示す活性の変化を生ずるであろう。化合
物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していて
もよい。いったん化合物が同定されれば，当該技術分野においてよく知られる技
術を用いてこれを単離することができる。
２の活性または結合パートナー（例えばｓｒｃ）の活性のアゴニストまたはアン
タゴニストを検出する方法に関する。該方法は，本発明のポリペプチドを産生す
る細胞を化合物の存在下でインキュベートし，ポリペプチド活性またはポリペプ
チド結合パートナーの活性のレベルの変化を検出することを含む。このようにし
て同定される化合物は，化合物の存在を示す活性の変化を生ずるであろう。化合
物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していて
もよい。いったん化合物が同定されれば，当該技術分野においてよく知られる技
術を用いてこれを単離することができる。
【０２１２】 本発明はまた，哺乳動物においてｓｒｃ−結合パートナー関連活性をアゴナイ
ズ（促進）するかまたはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は，前記哺
乳動物に，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２ポリ
ペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまたはアン
タゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ
１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２関連機能をアゴナイズまたはアンタゴ
ナイズするのに十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与す
ることを含む，哺乳動物において，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
またはＴｋｓ２０２活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて，疾病を治
療する方法もまた本発明に含まれる。
ズ（促進）するかまたはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は，前記哺
乳動物に，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２ポリ
ペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを前記アゴニズムまたはアン
タゴニズムを生ずるのに十分な量で投与することを含む。Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ
１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２関連機能をアゴナイズまたはアンタゴ
ナイズするのに十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与す
ることを含む，哺乳動物において，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
またはＴｋｓ２０２活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて，疾病を治
療する方法もまた本発明に含まれる。
【０２１３】 疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は
，蛋白質ポリペプチドの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。
いくつかの小さい有機分子は蛋白質ポリペプチドの機能を調節する化合物の一群
を形成する。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例と
しては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（
ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａｇｕｉｒｅ
ｅｔ ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４
８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．），１−
シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），
スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物
（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０
５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４
／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．），三環
式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２年１２月１
０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１
５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙げられる（
これらのすべてを図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）。
，蛋白質ポリペプチドの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。
いくつかの小さい有機分子は蛋白質ポリペプチドの機能を調節する化合物の一群
を形成する。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例と
しては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（
ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａｇｕｉｒｅ
ｅｔ ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４
８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．），１−
シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），
スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物
（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０
５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４
／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．），三環
式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２年１２月１
０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１
５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙げられる（
これらのすべてを図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）。
【０２１４】 細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質阻害剤の多くは，機能を弱くしか阻害し
ない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し，したがって，疾病の治療
剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質阻害剤の多くは，機能を弱くしか阻害し
ない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し，したがって，疾病の治療
剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【０２１５】 しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙ
ｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７）および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ
−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許出
願０８／４８５，３２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏ
ｃｋｅｔ Ｎｏ．２２３／２９８）および国際特許出願ＷＯ９６／４０１１６（
１９９６年１２月１９日公開，Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）およびＷＯ９６／２２
９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ）（これら
はすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有す
るインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Ｉｎｄｏｌ
ｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅ
ｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．
の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ
Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７），"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉ
ｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の０８／４８５，３
２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２
２３／２９８），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａ
ｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細胞におけるイ
ンドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻
害パターンを教示する（いずれも，図面含め本明細書の一部としてここに引用す
る）。
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙ
ｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７）および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ
−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許出
願０８／４８５，３２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏ
ｃｋｅｔ Ｎｏ．２２３／２９８）および国際特許出願ＷＯ９６／４０１１６（
１９９６年１２月１９日公開，Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）およびＷＯ９６／２２
９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ）（これら
はすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有す
るインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Ｉｎｄｏｌ
ｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅ
ｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．
の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ
Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２２１／１８７），"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉ
ｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の０８／４８５，３
２３（１９９５年６月７日出願；Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２
２３／２９８），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａ
ｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細胞におけるイ
ンドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻
害パターンを教示する（いずれも，図面含め本明細書の一部としてここに引用す
る）。
【０２１６】 キナーゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されないが，チ
ロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上述のキ
ナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知られる化
合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類を記載
する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５２０７
２２Ａｌ；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；Ｋａｂ
ｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏ
ｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許．５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ ａ
ｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許．４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａｒ
ｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．
Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１），
２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８
３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒｙ
ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊａ
ｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１
，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９
（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅｔ
ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；Ｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１５
−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒ
ｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２５
−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅｔ
ｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅｃ
ｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１）
−．２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，ＡＳＳ；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
ロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上述のキ
ナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知られる化
合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類を記載
する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５２０７
２２Ａｌ；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；Ｋａｂ
ｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏ
ｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許．５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ ａ
ｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許．４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａｒ
ｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．
Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１），
２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８
３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒｙ
ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊａ
ｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１
，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９
（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅｔ
ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；Ｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１５
−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒ
ｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２５
−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅｔ
ｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅｃ
ｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１）
−．２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，ＡＳＳ；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０２１７】 キノキサリン類は，Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，
３１６，５５３，（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）に記載される。
３１６，５５３，（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）に記載される。
【０２１８】 キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，−およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載される。
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，−およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載される。
【０２１９】 チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３−．Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（
１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２
）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，
５３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
１（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（
１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２
２２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４
１３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ
ＦＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９
８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５
−３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ
ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５）
，８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａ
ｓ，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７
０−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含
めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３−．Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（
１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２
）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，
５３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
１（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（
１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２
２２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４
１３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ
ＦＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９
８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５
−３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ
ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５）
，８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａ
ｓ，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７
０−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含
めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２２０】 調節剤として用いることができる他の化合物には，オキシインドリノン，例え
ば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
ば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
【０２２１】ＶＩＩＩ．トランスジェニック動物 本発明に関連するトランスジェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能
である。ＤＮＡを雄前核と雌前核の融合前に受精可能卵の前核に注入するか，ま
たはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞分裂を
開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。本発明
の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス，特に
レトロウイルスを胚に感染させることができる。
である。ＤＮＡを雄前核と雌前核の融合前に受精可能卵の前核に注入するか，ま
たはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞分裂を
開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。本発明
の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス，特に
レトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２２２】 胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
【０２２３】 齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
【０２２４】 一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウス
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０）。
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０）。
【０２２５】 胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウ
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂ
ｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂ
ｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０２２６】 ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクロ
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０２２７】 ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
【０２２８】 本発明は，本発明のポリペプチドをコードするトランスジンまたはポリペプチ
ドの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒト哺乳動物を提
供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，ポリペプチドの導
入の効果を研究するため，またはポリペプチドの発現を制御（すなわち，追加の
遺伝子，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビ
ボ試験系として特に有用である。
ドの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒト哺乳動物を提
供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，ポリペプチドの導
入の効果を研究するため，またはポリペプチドの発現を制御（すなわち，追加の
遺伝子，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビ
ボ試験系として特に有用である。
【０２２９】 上述の参考文献はすべて，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する。
【０２３０】 "トランスジェニック動物"とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２をコー
ドすることができる。動物における自然の発現は，レセプターの発現を減少させ
るのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与えることにより減少させ
ることができる。
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトＴｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２をコー
ドすることができる。動物における自然の発現は，レセプターの発現を減少させ
るのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与えることにより減少させ
ることができる。
【０２３１】ＩＸ．遺伝子治療 Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２遺伝子または
その遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用である（総説としてＭｉｌｌｅｒ
，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩
により，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治療に対する実用的なアプ
ローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９９３）に記載されている。
その遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用である（総説としてＭｉｌｌｅｒ
，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩
により，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治療に対する実用的なアプ
ローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９９３）に記載されている。
【０２３２】 １つの好ましい態様においては，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８
またはＴｋｓ２０２のコーディング配列を含む発現ベクターを細胞に挿入し，細
胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患者に注入する。別の好ましい態
様においては，選択されたプロモーター（例えば，強いプロモーター）を含むＤ
ＮＡセグメントを，本発明の内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメ
ントが内因性ポリペプチド遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プ
ロモーターセグメントをこれが内因性遺伝子に直接連結するように細胞内に移送
する）。
またはＴｋｓ２０２のコーディング配列を含む発現ベクターを細胞に挿入し，細
胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患者に注入する。別の好ましい態
様においては，選択されたプロモーター（例えば，強いプロモーター）を含むＤ
ＮＡセグメントを，本発明の内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメ
ントが内因性ポリペプチド遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プ
ロモーターセグメントをこれが内因性遺伝子に直接連結するように細胞内に移送
する）。
【０２３３】 遺伝子治療は，腫瘍を標的とするポリペプチドｃＤＮＡを含むアデノウイルス
の使用を含むことができる。全身ポリペプチドは，遺伝子工学処理した細胞の移
植，そのようなポリペプチドをコードするウイルスの注入，または裸のＤＮＡの
適当な組織への注入により増加する。
の使用を含むことができる。全身ポリペプチドは，遺伝子工学処理した細胞の移
植，そのようなポリペプチドをコードするウイルスの注入，または裸のＤＮＡの
適当な組織への注入により増加する。
【０２３４】 そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害するこ
とにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害
し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能
力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失
またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害する
ことができる。
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害するこ
とにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害
し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能
力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失
またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害する
ことができる。
【０２３５】 ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，ア
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば
腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コー
ディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌ
ｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質配
列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的
細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる
（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８
，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞
内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白
質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングす
ることを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば
腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コー
ディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌ
ｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質配
列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的
細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる
（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８
，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞
内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白
質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングす
ることを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０２３６】 最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【０２３７】 また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または組換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改
良する蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにＤＮ
Ａを結合させる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または組換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改
良する蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにＤＮ
Ａを結合させる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２３８】 本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【０２３９】 本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であ
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
【０２４０】 別の好ましい態様においては，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８ま
たはＴｋｓ２０２ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターが提供さ
れ，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。組織特異的遺伝子
発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２年１１月３日出願
，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
たはＴｋｓ２０２ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターが提供さ
れ，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。組織特異的遺伝子
発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２年１１月３日出願
，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２４１】 上述の参考文献はすべて，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する。
【０２４２】 上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２４３】 別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【０２４４】Ｘ．物質の投与 患者に投与すべき化合物の量を決定する方法，および化合物を生物に投与する
モードは，米国特許０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および
国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）に記載されており，
これらの両方とも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，これに容易に適合しう
ることを理解するであろう。
モードは，米国特許０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および
国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）に記載されており，
これらの両方とも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，これに容易に適合しう
ることを理解するであろう。
【０２４５】 適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療している疾病のタイプ，用いられ
る特定の組成物，および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は，最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，最初は細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮して循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
る特定の組成物，および患者のサイズおよび生理学的状態等に依存する。本明細
書に記載される化合物の治療的に有効な用量は，最初に細胞培養および動物モデ
ルから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，最初は細胞培養ア
ッセイにおいて決定されたＩＣ50を考慮して循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおいて有用な用
量をさらに正確に決定することができる。
【０２４６】 薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器におけ
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
【０２４７】 毒性研究は，血液細胞組成物を測定することにより実施することもできる。例
えば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができ
る１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；
２）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして
３）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核
細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は
，毒性が存在するか否かを示す。
えば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができ
る１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；
２）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして
３）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核
細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は
，毒性が存在するか否かを示す。
【０２４８】 各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
【０２４９】 癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／ｄ
ａｙ，好ましくは，１−２５０ｍｇ／ｄａｙ，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／
ｄａｙの範囲である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持する
のに十分であるかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
ａｙ，好ましくは，１−２５０ｍｇ／ｄａｙ，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／
ｄａｙの範囲である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持する
のに十分であるかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０２５０】 血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であ
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０２５１】実施例 以下の実施例は限定的なものではなく，単に本発明の種々の観点および特徴の
代表例にすぎない。
代表例にすぎない。
【０２５２】リン酸化スクリーニング Ｓｒｃ基質を同定するために用いたリン酸化スクリーニング法は，先に報告さ
れている（Ｌｏｃｋ，Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．ＥＭＢＯＪ．１７（１５）：４３４６
−４３５７，１９９８）。ＮＣＩＨ４６０λＺＡＰライブラリからの約１．２Ｘ
１０6個のプラークおよびＣｏｌｏ２０５ λＺＡＰＩＩライブラリ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）からの４．９ｘ１０5個のプラークを１５０ｍｍペトリ皿に播種
した。プレートを１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）に浸漬したニトロセルロースフィルターで覆い，３７℃で１６時間イン
キュベートして，組換えｌａｃＺ融合蛋白質の発現を誘導した。レプリカフィル
ターをＴＥＳＴ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でよく洗浄し，次にキナーゼ緩衝液（１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２ｍＭ ＭｎＣｌ2を含むＴＢＳＴ）中で１時間平衡化
した。フィルターを３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むキナーゼ緩衝液中
で室温で１時間ブロッキングした。組換え蛋白質は，フィルターを１／１０また
は１／２０容量のバキュロウイルス由来ヒトＳｒｃ，２５０μＭＡＴＰおよび１
００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含むＳｆ９抽出物を補充したキナーゼ緩
衝液中で，３０℃で６０分間インキュベートすることによりリン酸化した。フィ
ルターをキナーゼ緩衝液のみで簡単に洗浄し，次にストリッピング緩衝液（６２
．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．０，２％ＳＤＳ，１００ｍＭ２−β−メルカ
プトエタノール）中で５０℃で３０分間インキュベートして，スクリーニングを
妨害するかもしれない付随している可能性のあるリン蛋白質，例えばＳｒｃそれ
自体またはＳｆ９細胞由来蛋白質を除去した。チロシンリン酸化蛋白質は，抗ホ
スホチロシンモノクローナル抗体，４Ｇ１０で，標準的な免疫ブロッティング法
を用いて検出した。陽性の第一次クローンを単離し，ＳＭ緩衝液（０．１ＭＮａ
Ｃｌ，８ｍＭＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ７．５，０．０１％ゼラ
チン）中に抽出し，追加の２ラウンドのリン酸化スクリーニングにより精製した
。精製したクローンのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドをλＺＡＰクローン
から切り出し，ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージを用いて，製造元の指針にし
たがって（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＳＯＬＲ細胞に導入した。
れている（Ｌｏｃｋ，Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．ＥＭＢＯＪ．１７（１５）：４３４６
−４３５７，１９９８）。ＮＣＩＨ４６０λＺＡＰライブラリからの約１．２Ｘ
１０6個のプラークおよびＣｏｌｏ２０５ λＺＡＰＩＩライブラリ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）からの４．９ｘ１０5個のプラークを１５０ｍｍペトリ皿に播種
した。プレートを１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）に浸漬したニトロセルロースフィルターで覆い，３７℃で１６時間イン
キュベートして，組換えｌａｃＺ融合蛋白質の発現を誘導した。レプリカフィル
ターをＴＥＳＴ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でよく洗浄し，次にキナーゼ緩衝液（１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２ｍＭ ＭｎＣｌ2を含むＴＢＳＴ）中で１時間平衡化
した。フィルターを３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むキナーゼ緩衝液中
で室温で１時間ブロッキングした。組換え蛋白質は，フィルターを１／１０また
は１／２０容量のバキュロウイルス由来ヒトＳｒｃ，２５０μＭＡＴＰおよび１
００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含むＳｆ９抽出物を補充したキナーゼ緩
衝液中で，３０℃で６０分間インキュベートすることによりリン酸化した。フィ
ルターをキナーゼ緩衝液のみで簡単に洗浄し，次にストリッピング緩衝液（６２
．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．０，２％ＳＤＳ，１００ｍＭ２−β−メルカ
プトエタノール）中で５０℃で３０分間インキュベートして，スクリーニングを
妨害するかもしれない付随している可能性のあるリン蛋白質，例えばＳｒｃそれ
自体またはＳｆ９細胞由来蛋白質を除去した。チロシンリン酸化蛋白質は，抗ホ
スホチロシンモノクローナル抗体，４Ｇ１０で，標準的な免疫ブロッティング法
を用いて検出した。陽性の第一次クローンを単離し，ＳＭ緩衝液（０．１ＭＮａ
Ｃｌ，８ｍＭＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ７．５，０．０１％ゼラ
チン）中に抽出し，追加の２ラウンドのリン酸化スクリーニングにより精製した
。精製したクローンのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドをλＺＡＰクローン
から切り出し，ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージを用いて，製造元の指針にし
たがって（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＳＯＬＲ細胞に導入した。
【０２５３】ラムダプラークスクリーニングおよびノザンハイブリダイゼーション 約３６０，０００個のＮＣＩＨ４６０λＺＡＰライブラリプラークをＮＣＺＹ
Ｍプレートに播種し，ニトロセルロースフィルター上に持ち上げた。フィルター
を変性し（０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ），中和し（０．５ＭＴｒｉｓ
７．４，１．５ＭＮａＣｌ），８０℃で焼き，ハイブリダイゼーション緩衝液（
５ＸＳＳＰＥ，１０Ｘデンハルト，２％ＳＤＳ，５０％ホルムアミド，０．１ｍ
ｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ）中で３−６時間プレハイブリダイズさせた。元の１．
６ｋｂＲＩ／ＸｈｏＩ ｔｋｓ１０７フラグメント（切り出したファージミドよ
り）を精製し，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍのＲａｎｄｏｍ Ｐｒ
ｉｍｅｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて標識し，Ｑｉａｇｅｎ
のＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。新鮮なハイブリダイゼ
ーション緩衝液中で４２℃で一夜ハイブリダイゼーションする間，フィルターを
この標識フラグメントで探索した。次に室温，２ＸＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳ，
１０分間で３回，および０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃で２０分間で
２回洗浄した。フィルターを風乾し，増感スクリーン１枚を用いて−８０℃で一
夜Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）を感光させた。陽性プラークを単
離し，続くハイブリダイゼーションスクリーニングのラウンドにより均一になる
まで精製した。精製クローンのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドをλＺＡＰ
クローンから切り出して，上述したようにＳＯＬＲ細胞に導入した。
Ｍプレートに播種し，ニトロセルロースフィルター上に持ち上げた。フィルター
を変性し（０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ），中和し（０．５ＭＴｒｉｓ
７．４，１．５ＭＮａＣｌ），８０℃で焼き，ハイブリダイゼーション緩衝液（
５ＸＳＳＰＥ，１０Ｘデンハルト，２％ＳＤＳ，５０％ホルムアミド，０．１ｍ
ｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ）中で３−６時間プレハイブリダイズさせた。元の１．
６ｋｂＲＩ／ＸｈｏＩ ｔｋｓ１０７フラグメント（切り出したファージミドよ
り）を精製し，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍのＲａｎｄｏｍ Ｐｒ
ｉｍｅｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて標識し，Ｑｉａｇｅｎ
のＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。新鮮なハイブリダイゼ
ーション緩衝液中で４２℃で一夜ハイブリダイゼーションする間，フィルターを
この標識フラグメントで探索した。次に室温，２ＸＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳ，
１０分間で３回，および０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃で２０分間で
２回洗浄した。フィルターを風乾し，増感スクリーン１枚を用いて−８０℃で一
夜Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）を感光させた。陽性プラークを単
離し，続くハイブリダイゼーションスクリーニングのラウンドにより均一になる
まで精製した。精製クローンのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドをλＺＡＰ
クローンから切り出して，上述したようにＳＯＬＲ細胞に導入した。
【０２５４】 約２７０，０００個のＴｒｉｐｌＥＸ−前立腺ライブラリプラーク（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を，元のＴｋｓ２０２クローンから得られた約５００ｂ．ｐ．のＥｃ
ｏＲＩ／Ｘｂａｌフラグメントで同様に探索した。このフラグメントをＲｅａｄ
ｙ ｔｏ Ｇｏ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｂｅａｄｓを用いてランダムプ
ライム標識し，Ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔ Ｇ−５０マイクロカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）で精製した。
ｔｅｃｈ）を，元のＴｋｓ２０２クローンから得られた約５００ｂ．ｐ．のＥｃ
ｏＲＩ／Ｘｂａｌフラグメントで同様に探索した。このフラグメントをＲｅａｄ
ｙ ｔｏ Ｇｏ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｂｅａｄｓを用いてランダムプ
ライム標識し，Ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔ Ｇ−５０マイクロカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）で精製した。
【０２５５】 Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ｓ ＩおよびＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を，ｔｋｓ１０７クローンからの１．６
ｋｂＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメント，Ｔｋｓ１１３クローンからの１．５ｋ
ｂＥｃｏＲＩフラグメント，Ｔｋｓ１１８クローンからの１．６ｋｂＥｃｏＲＩ
／ＸｈｏＩフラグメント，およびＴｋｓ２０２クローンからの約５００ｂ．ｐ．
ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌフラグメントを用いて，上述したものと同じ標識，ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄プロトコルでハイブリダイズさせた。各プローブの
間では，０．５％ＳＤＳ中で１０分間煮沸し，２ＸＳＳＣで洗浄することにより
ブロットをはがした。
ｓ ＩおよびＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を，ｔｋｓ１０７クローンからの１．６
ｋｂＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメント，Ｔｋｓ１１３クローンからの１．５ｋ
ｂＥｃｏＲＩフラグメント，Ｔｋｓ１１８クローンからの１．６ｋｂＥｃｏＲＩ
／ＸｈｏＩフラグメント，およびＴｋｓ２０２クローンからの約５００ｂ．ｐ．
ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌフラグメントを用いて，上述したものと同じ標識，ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄プロトコルでハイブリダイズさせた。各プローブの
間では，０．５％ＳＤＳ中で１０分間煮沸し，２ＸＳＳＣで洗浄することにより
ブロットをはがした。
【０２５６】構築物 すべての分子生物学的手法および緩衝液はＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ．ａｌ．１
９８９に記載されるように実施し調製した。
９８９に記載されるように実施し調製した。
【０２５７】 ４．６５ｋｂＮａｒＩ／ＰｖｕＩフラグメント（Ｔｋｓ１０７の全オープンリ
ーディングフレーム［ＯＲＦ］および約９０ｎ．ｔ．の３’非翻訳領域［ＵＴＲ
］を含む）をｐＣＭＶｎｅｏＭｙｃ２のＥｃｏＲＶ部位にクローニングすること
により，ｐＣｎＭ−１０７を構築した。このことにより，ＣＭＶプロモーターの
転写制御下にあるＮ末端Ｍｙｃタグ付き全長Ｔｋｓ１０７が作成された。ｐＣｎ
Ｍ−１０７のＣ末端にインフレームの４６６アミノ酸欠失を含むｐＣｎＭ−１０
７Ｎは，ｐＣｎＭ−１０７をＢｓｔＥＩＩ／ＸｈｏＩで消化し，ｄＮＴＰおよび
Ｔ４ポリメラーゼでフィルインし，Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再閉鎖することにより
作成した。ｐＣｎＭ２のＭｙｃタグに融合されたｔｋｓ１０７のＣ末端の４７７
ａ．ａ．からなるｐＣｎＭ−１０７Ｃは，ｐＣｎＭ−１０７のＢａｍＨＩ／Ｂｓ
ｔＥＩＩフラグメントのインフレーム欠失により作成した。ｐＣＡＮＭｙｃ−Ｇ
ｒｕｂＤＨ／ＰＨは，ＧｒｕｂのＤＨ／ＰＨドメインのみをコードするＢａｍＨ
Ｉ／ＸｈｏＩＰＣＲフラグメントをｐＣＡＮ−ＭｙｃＡのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ
部位にクローニングすることにより生成した。ＰＣＡＮ−ＭｙｃＡは，ポリリン
カー中に挿入されたＭｙｃタグを有するｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
誘導体である。ＰＣＲに用いたプライマーは，ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＧ
ＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＴおよびＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣ
ＴＧＴＣＴＣＣＡＣ（イタリックのヌクレオチドはＢａｍＨＩまたはＸｈｏｌ部
位を表す；下線のＣＴＡは遺伝子工学に作成された終止コドンである）であった
。ＰＣＡＮ−Ｍｙｃ−ＧｒｕｂＤＨは，ＧｒｕｂのＤＨドメインのみをコードす
るＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩＰＣＲフラグメントをｐＣＡＮＭｙｃＡにクローニング
することにより作成した。ＰＣＲに用いたプライマーは，以下のとおりであった
：ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＴおよびＣＡＣＣＴ
ＣＧＡＧＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣ（イタリックのヌ
クレオチドはＢａｍＨＩまたはＸｈｏｌ部位を表す；下線のＣＴＡは遺伝子工学
的に作成された終止コドンである）。
ーディングフレーム［ＯＲＦ］および約９０ｎ．ｔ．の３’非翻訳領域［ＵＴＲ
］を含む）をｐＣＭＶｎｅｏＭｙｃ２のＥｃｏＲＶ部位にクローニングすること
により，ｐＣｎＭ−１０７を構築した。このことにより，ＣＭＶプロモーターの
転写制御下にあるＮ末端Ｍｙｃタグ付き全長Ｔｋｓ１０７が作成された。ｐＣｎ
Ｍ−１０７のＣ末端にインフレームの４６６アミノ酸欠失を含むｐＣｎＭ−１０
７Ｎは，ｐＣｎＭ−１０７をＢｓｔＥＩＩ／ＸｈｏＩで消化し，ｄＮＴＰおよび
Ｔ４ポリメラーゼでフィルインし，Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再閉鎖することにより
作成した。ｐＣｎＭ２のＭｙｃタグに融合されたｔｋｓ１０７のＣ末端の４７７
ａ．ａ．からなるｐＣｎＭ−１０７Ｃは，ｐＣｎＭ−１０７のＢａｍＨＩ／Ｂｓ
ｔＥＩＩフラグメントのインフレーム欠失により作成した。ｐＣＡＮＭｙｃ−Ｇ
ｒｕｂＤＨ／ＰＨは，ＧｒｕｂのＤＨ／ＰＨドメインのみをコードするＢａｍＨ
Ｉ／ＸｈｏＩＰＣＲフラグメントをｐＣＡＮ−ＭｙｃＡのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ
部位にクローニングすることにより生成した。ＰＣＡＮ−ＭｙｃＡは，ポリリン
カー中に挿入されたＭｙｃタグを有するｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
誘導体である。ＰＣＲに用いたプライマーは，ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＧ
ＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＴおよびＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣ
ＴＧＴＣＴＣＣＡＣ（イタリックのヌクレオチドはＢａｍＨＩまたはＸｈｏｌ部
位を表す；下線のＣＴＡは遺伝子工学に作成された終止コドンである）であった
。ＰＣＡＮ−Ｍｙｃ−ＧｒｕｂＤＨは，ＧｒｕｂのＤＨドメインのみをコードす
るＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩＰＣＲフラグメントをｐＣＡＮＭｙｃＡにクローニング
することにより作成した。ＰＣＲに用いたプライマーは，以下のとおりであった
：ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＴおよびＣＡＣＣＴ
ＣＧＡＧＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣ（イタリックのヌ
クレオチドはＢａｍＨＩまたはＸｈｏｌ部位を表す；下線のＣＴＡは遺伝子工学
的に作成された終止コドンである）。
【０２５８】 ｔｋｓ１１８の約３３０ｎ．ｔ．のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩＰＣＲフラグメント
は，Ｔｋｓ１１８の５’コーディング領域にＢａｍＨｌ部位を融合させることに
より生成した。ＮｃｏＩ部位はＴｋｓ１１８に天然に見いだされる。用いたプラ
イマーは以下のとおりであった：５’プライマー，ＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴ
ＣＴＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＡＣＣＴＧ（配列番号９）（イタリックのヌクレオチ
ドはＢａｍＨＩ部位を表す；下線のＡＴＧはＴｋｓ１１８の開始メチオニンであ
る）；３’プライマー，ＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡ（配
列番号１０）。このＰＣＲ産物を用いて，ｔｋｓ１１８中のＢａｍＨＩ／Ｎｃｏ
Ｉフラグメントを置き換えた。このことにより，すべての５’ＵＴＲが効率よく
削除された。得られた構築物（全長ｔｋｓ１１８をコードする）からのＢａｍＨ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩフラグメントをｐＣｎＭ２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にク
ローニングしてｐＣｎＭ−１１８を得た。ＤｒｅｓｈのＳＨ３ドメインを欠失す
る発現構築物ｐＣｎＭ−１１８ΔＳＨ３は，ｐＣｎＭ−１１８のＢａｍＨＩ／Ｘ
ｃｍＩフラグメントをｐＣｎＭ２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にクローニング
することにより作成した。Ｔｋｓ１１８のＳＨ３ドメインのみを発現する構築物
ｐＣｎＭ−１１８ＳＨ３は，ｐＣｎＭ−１１８のＸｃｍＩ／Ａｓｐ７１８フラグ
メントをｐＣｎＭ２のＳｔｕＩ／Ａｓｐ７１８部位にクローニングすることによ
り作成した。
は，Ｔｋｓ１１８の５’コーディング領域にＢａｍＨｌ部位を融合させることに
より生成した。ＮｃｏＩ部位はＴｋｓ１１８に天然に見いだされる。用いたプラ
イマーは以下のとおりであった：５’プライマー，ＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴ
ＣＴＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＡＣＣＴＧ（配列番号９）（イタリックのヌクレオチ
ドはＢａｍＨＩ部位を表す；下線のＡＴＧはＴｋｓ１１８の開始メチオニンであ
る）；３’プライマー，ＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡ（配
列番号１０）。このＰＣＲ産物を用いて，ｔｋｓ１１８中のＢａｍＨＩ／Ｎｃｏ
Ｉフラグメントを置き換えた。このことにより，すべての５’ＵＴＲが効率よく
削除された。得られた構築物（全長ｔｋｓ１１８をコードする）からのＢａｍＨ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩフラグメントをｐＣｎＭ２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にク
ローニングしてｐＣｎＭ−１１８を得た。ＤｒｅｓｈのＳＨ３ドメインを欠失す
る発現構築物ｐＣｎＭ−１１８ΔＳＨ３は，ｐＣｎＭ−１１８のＢａｍＨＩ／Ｘ
ｃｍＩフラグメントをｐＣｎＭ２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にクローニング
することにより作成した。Ｔｋｓ１１８のＳＨ３ドメインのみを発現する構築物
ｐＣｎＭ−１１８ＳＨ３は，ｐＣｎＭ−１１８のＸｃｍＩ／Ａｓｐ７１８フラグ
メントをｐＣｎＭ２のＳｔｕＩ／Ａｓｐ７１８部位にクローニングすることによ
り作成した。
【０２５９】 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合したＴｋｓ１１８の
ＳＨ３ドメインを発現する構築物は，プライマー５’ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧ
ＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧ（配列番号１１）およびＧＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＴＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣ（配列番号１２）３’を用いてＳＨ３ド
メインをＰＣＲ増幅し，ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し，ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位にクローニングすることにより作成し，プラス
ミドｐＧＥＸ−１１８ＳＨ３を得た。
ＳＨ３ドメインを発現する構築物は，プライマー５’ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧ
ＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧ（配列番号１１）およびＧＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＴＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣ（配列番号１２）３’を用いてＳＨ３ド
メインをＰＣＲ増幅し，ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し，ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位にクローニングすることにより作成し，プラス
ミドｐＧＥＸ−１１８ＳＨ３を得た。
【０２６０】 ＧＳＴに融合したｔｋｓ１１３のＮ末端を発現する構築物は，ＥｃｏＲＩｔｋ
ｓ１１３フラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ−３中にクローニングすることにより作
成して，ｐＧＥＸ−１１３ａを得た。Ｔｋｓ１１３のＣ末端をコードするＡｓｐ
７１８／ＸｈｏＩフラグメントをｐＧＥＸ−１１３ａから欠失させて，ｐＧＥＸ
−１１３ｃを得た。
ｓ１１３フラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ−３中にクローニングすることにより作
成して，ｐＧＥＸ−１１３ａを得た。Ｔｋｓ１１３のＣ末端をコードするＡｓｐ
７１８／ＸｈｏＩフラグメントをｐＧＥＸ−１１３ａから欠失させて，ｐＧＥＸ
−１１３ｃを得た。
【０２６１】５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ Ｔｋｓ２０２の５’末端を伸長させるために５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを改変した
。第１鎖ｃＤＮＡは，オリゴＤＴプライミング逆転写によりヒト膵臓ｍＲＮＡか
ら作成した。第２鎖は，オリゴ（ＭＬ２Ｇ）ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴ
ＡＡＣＧＣＧＴＡＣＣＧＧＧでプライミングした。ＭＬ２Ｇの３’末端の３個の
Ｇはリバーストランスクリプターゼにより転写産物の末端に付加された非特異的
なＣの列と塩基対形成する。Ｔｋｓ２０２の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応は，配列
ＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＡＣＴＴＧＡＧＧＧのｔｋｓ２０２特異的プライマ
ーおよびＭＬ２Ｇを用いて，ＧＣ−ＲｉｃｈＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて行った。ＰＣＲ反応産物を
アガロースゲルで分離し，ニトロセルロースに移し，ランダムプライム（Ｒｅａ
ｄｙ ｔｏ Ｇｏ Ｂｅａｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）標識したＴｋｓ２０２−
１７の５’末端からの５５０ｎｔＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせた（
上述のように）。約５００ｂｐの標識されたバンドを切り出し，ＴｏｐｏＴＡク
ローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ中に
クローニングした。所望の挿入物を有するコロニーを，同じｔｋｓ２０２−１７
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。これらのコ
ロニーからのＤＮＡを調製し配列決定した。
。第１鎖ｃＤＮＡは，オリゴＤＴプライミング逆転写によりヒト膵臓ｍＲＮＡか
ら作成した。第２鎖は，オリゴ（ＭＬ２Ｇ）ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴ
ＡＡＣＧＣＧＴＡＣＣＧＧＧでプライミングした。ＭＬ２Ｇの３’末端の３個の
Ｇはリバーストランスクリプターゼにより転写産物の末端に付加された非特異的
なＣの列と塩基対形成する。Ｔｋｓ２０２の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応は，配列
ＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＡＣＴＴＧＡＧＧＧのｔｋｓ２０２特異的プライマ
ーおよびＭＬ２Ｇを用いて，ＧＣ−ＲｉｃｈＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて行った。ＰＣＲ反応産物を
アガロースゲルで分離し，ニトロセルロースに移し，ランダムプライム（Ｒｅａ
ｄｙ ｔｏ Ｇｏ Ｂｅａｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）標識したＴｋｓ２０２−
１７の５’末端からの５５０ｎｔＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせた（
上述のように）。約５００ｂｐの標識されたバンドを切り出し，ＴｏｐｏＴＡク
ローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ中に
クローニングした。所望の挿入物を有するコロニーを，同じｔｋｓ２０２−１７
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。これらのコ
ロニーからのＤＮＡを調製し配列決定した。
【０２６２】細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション 活性化トリＳｒｃアレルＹ５２７Ｆ（ＮＩＨ３Ｔ３−Ｙ５２７Ｆ）を安定に発
現する２９３，ＮＩＨ３Ｔ３，およびＮＩＨ３Ｔ３細胞株を，１０％ＦＣＳおよ
び抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。Ｄ
ＮＡトランスフェクションの前日に，コンフルエントの２９３細胞を１：１０に
，またはＮＩＨ３Ｔ３を１：５に分割した。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）ま
たはエフェクテン（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて，製造元の指針にしたがって，細胞
を０．１−５μｇのＤＮＡで４−２０時間トランスフェクトした。トランスフェ
クトした細胞をＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ，および抗生物質中で一夜回復させた。
現する２９３，ＮＩＨ３Ｔ３，およびＮＩＨ３Ｔ３細胞株を，１０％ＦＣＳおよ
び抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。Ｄ
ＮＡトランスフェクションの前日に，コンフルエントの２９３細胞を１：１０に
，またはＮＩＨ３Ｔ３を１：５に分割した。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）ま
たはエフェクテン（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて，製造元の指針にしたがって，細胞
を０．１−５μｇのＤＮＡで４−２０時間トランスフェクトした。トランスフェ
クトした細胞をＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ，および抗生物質中で一夜回復させた。
【０２６３】抗体 ＧＳＴ−ＤｒｅｓｈＳＨ３およびＧＳＴ−１１３ｃ融合蛋白質の産生を細菌中
で誘導し，グルタチオン−アガロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した
。４００ｍＬの誘導物からの細胞ペレットを，１００ｍｇ／ｍＬリゾチウム，１
０μｇ／ｍＬアプロチニン，２０μＭロイペプチンおよび１００μＭ（ＰＭＳＦ
）を含む３０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）に再懸濁し，超音波処理して細胞を溶解させた。溶解物を１
７Ｋｇで１５分間遠心分離した。１０ｍＬのＰＢＳを上清に加え，Ｔｗｅｅｎ２
０を加えて最終濃度０．１％とした。これをグルタチオン−アガロースカラムに
負荷し，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでよく洗浄した。融合蛋白質は，
７５ｍＭＨｅｐｅｓ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，２００ｍＭグルタチオン，５
ｍＭＤＴＴおよび０．１％オクチルグルコシドを用いて溶出した。溶出物をＰＢ
Ｓに対して透析した。
で誘導し，グルタチオン−アガロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した
。４００ｍＬの誘導物からの細胞ペレットを，１００ｍｇ／ｍＬリゾチウム，１
０μｇ／ｍＬアプロチニン，２０μＭロイペプチンおよび１００μＭ（ＰＭＳＦ
）を含む３０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）に再懸濁し，超音波処理して細胞を溶解させた。溶解物を１
７Ｋｇで１５分間遠心分離した。１０ｍＬのＰＢＳを上清に加え，Ｔｗｅｅｎ２
０を加えて最終濃度０．１％とした。これをグルタチオン−アガロースカラムに
負荷し，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでよく洗浄した。融合蛋白質は，
７５ｍＭＨｅｐｅｓ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，２００ｍＭグルタチオン，５
ｍＭＤＴＴおよび０．１％オクチルグルコシドを用いて溶出した。溶出物をＰＢ
Ｓに対して透析した。
【０２６４】 ポリクローナル抗体は，ウサギを２つの融合蛋白質（ＡｎｉｍａｌＰｈａｒｍ
）で免疫することにより生成した。抗体は，（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈澱させ，ＰＢ
Ｓ中に再懸濁し，ＧＳＴとカップリングさせたカラムを通してＧＳＴ特異的抗体
を除去した。得られた溶出物をＣＮ−Ｂｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）にカップリングさせたＧＳＴ融合蛋白質を含むカラムを通すことによ
り，アフィニティー精製した。
）で免疫することにより生成した。抗体は，（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈澱させ，ＰＢ
Ｓ中に再懸濁し，ＧＳＴとカップリングさせたカラムを通してＧＳＴ特異的抗体
を除去した。得られた溶出物をＣＮ−Ｂｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）にカップリングさせたＧＳＴ融合蛋白質を含むカラムを通すことによ
り，アフィニティー精製した。
【０２６５】細胞溶解，免疫沈澱，免疫ブロッティング 溶解用の細胞は，（ＰＢＳ＋Ｎａ３ＶＯ４）中で洗浄し，１００μＭＮａ3Ｖ
Ｏ4，１０ｍＭＮａＦ，０．５−２．０ｍＭＤＴＴ，１０μｇ／ｍｌアプロチニ
ン，２０μＭロイペプチンおよび１００μＭフッ化フェニルメチルスルホニル（
ＰＭＳＦ）を含む，ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ７．５，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，１％ＴＸ１００，１％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ）またはＨ
ＮＴＧ（１．５ｍＭＭｇＣｌ2，１５０ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭＨｅｐｅｓ７．
５．１０％グリセロール，１％ＴＸ１００，１ｍＭＥＧＴＡ）中で溶解した。抽
出物は１６，０００ｇで１０分間の遠心分離により透明にした。
Ｏ4，１０ｍＭＮａＦ，０．５−２．０ｍＭＤＴＴ，１０μｇ／ｍｌアプロチニ
ン，２０μＭロイペプチンおよび１００μＭフッ化フェニルメチルスルホニル（
ＰＭＳＦ）を含む，ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ７．５，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，１％ＴＸ１００，１％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ）またはＨ
ＮＴＧ（１．５ｍＭＭｇＣｌ2，１５０ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭＨｅｐｅｓ７．
５．１０％グリセロール，１％ＴＸ１００，１ｍＭＥＧＴＡ）中で溶解した。抽
出物は１６，０００ｇで１０分間の遠心分離により透明にした。
【０２６６】 ２−２０μｇの９Ｅ１０抗体または１２ＣＡ５および２０μＬのプロテインＡ
／Ｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で４
時間インキュベートすることにより，約０．２−５．０ｍｇの総蛋白質を免疫沈
澱した。免疫複合体を溶解緩衝液で４回洗浄し，４５μｌのＳＤＳ試料緩衝液（
８０ｍＭＴｒｉｓ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１．２５％ブロモ
フェノールブルーおよび２８０ｍＭβ−メルカプトエタノール）に再懸濁し，９
５℃で３−５分間加熱した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ半乾燥ブロッティング装置を用いて，ニトロセルロース膜（ＭＳＩ）上に免疫
ブロットした。
／Ｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で４
時間インキュベートすることにより，約０．２−５．０ｍｇの総蛋白質を免疫沈
澱した。免疫複合体を溶解緩衝液で４回洗浄し，４５μｌのＳＤＳ試料緩衝液（
８０ｍＭＴｒｉｓ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１．２５％ブロモ
フェノールブルーおよび２８０ｍＭβ−メルカプトエタノール）に再懸濁し，９
５℃で３−５分間加熱した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ半乾燥ブロッティング装置を用いて，ニトロセルロース膜（ＭＳＩ）上に免疫
ブロットした。
【０２６７】 フィルターを３％ＢＳＡまたは２％無脂乾燥乳を含むＴＢＳＴ（２５ｍＭＴｒ
ｉｓ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で，室温で
１時間ブロッキングした。フィルターをブロッキング緩衝液中で一次抗体ととも
に，以下の希釈率を用いて１時間インキュベートした：１２ＣＡ５，９Ｅ１０，
および４Ｇ１０１：５０００；抗ｃｓｔ１，１：２００；抗１１８ＳＨ３（α５
０３３）および抗ｔｋｓ１１８（α５０２９），１：１０００。フィルターをＴ
ＢＳＴで３ｘ１０分間洗浄し，ブロキング緩衝液中１：１００００のロバ抗ウサ
ギＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはヤギ抗マウスＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
中で１時間インキュベートした。フィルターを上述したように洗浄し，増強化学
発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）をＦｕｊｉＲＸフィルムと組み
合わせて蛋白質バンドを検出した。
ｉｓ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で，室温で
１時間ブロッキングした。フィルターをブロッキング緩衝液中で一次抗体ととも
に，以下の希釈率を用いて１時間インキュベートした：１２ＣＡ５，９Ｅ１０，
および４Ｇ１０１：５０００；抗ｃｓｔ１，１：２００；抗１１８ＳＨ３（α５
０３３）および抗ｔｋｓ１１８（α５０２９），１：１０００。フィルターをＴ
ＢＳＴで３ｘ１０分間洗浄し，ブロキング緩衝液中１：１００００のロバ抗ウサ
ギＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはヤギ抗マウスＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
中で１時間インキュベートした。フィルターを上述したように洗浄し，増強化学
発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）をＦｕｊｉＲＸフィルムと組み
合わせて蛋白質バンドを検出した。
【０２６８】細胞染色 ＮＩＨ３Ｔ３またはＮＩＨ３Ｔ３−Ｙ５２７Ｆ細胞を１：５でコンフルエント
の皿からカバースリップに分けた。細胞を上述および明細書本文に記載の種々の
プラスミドでトランスフェクトした。カバースリップ上の細胞をＰＢＳ中３％パ
ラホルムアルデヒドで固定し，ＰＢＳ中０．２％ＴＸ１００で透過性にした。細
胞をＰＢＳＴ中０．２％ＴＸ１００，０．２％ＢＳＡで希釈した種々の組み合わ
せの抗体で染色した。用いた一次抗体は１／５０に希釈した。第２抗体も１：５
０に希釈し，これは，Ｒａｂｂｉｔ−ＴｅｘＲｅｄ（ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒ
ｃｈ）およびＭｏｕｓｅ−Ｏｒｅｇｏｎ−Ｇｒｅｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒ
ｏｂｅ）であった。細胞はまた，ビス−ベンジミドで染色して，核を染色した。
の皿からカバースリップに分けた。細胞を上述および明細書本文に記載の種々の
プラスミドでトランスフェクトした。カバースリップ上の細胞をＰＢＳ中３％パ
ラホルムアルデヒドで固定し，ＰＢＳ中０．２％ＴＸ１００で透過性にした。細
胞をＰＢＳＴ中０．２％ＴＸ１００，０．２％ＢＳＡで希釈した種々の組み合わ
せの抗体で染色した。用いた一次抗体は１／５０に希釈した。第２抗体も１：５
０に希釈し，これは，Ｒａｂｂｉｔ−ＴｅｘＲｅｄ（ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒ
ｃｈ）およびＭｏｕｓｅ−Ｏｒｅｇｏｎ−Ｇｒｅｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒ
ｏｂｅ）であった。細胞はまた，ビス−ベンジミドで染色して，核を染色した。
【０２６９】ＪＮＫキナーゼアッセイ ２９３細胞をｐＣＡＮ−ＨＡ−ＪＮＫおよび種々の発現プラスミドでトランス
フェクトした。細胞をＨＮＴＧ中で溶解し，０．２ｍｇを１２ＣＡ５を用いて４
時間免疫沈澱させた。免疫沈殿物を溶解緩衝液で３回，キナーゼ緩衝液（２５ｍ
ＭＨｅｐｅｓ７．６，２０ｍＭＭｇＣｌ2，２ｍＭＤＴＴ，１００μＭＮａ3ＶＯ 4 ，１ｍＭＰＭＳＦ）で２回洗浄した。各免疫沈澱物の１／２をアクリルアミド
ゲルに流し，ＨＡ−ＪＮＫ発現レベルについてウエスタンブロットを行った。残
りを，２０μＭＡＴＰ，５μＣｉγＰ32ＡＴＰ，および５μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ
１−２２３を含む３０μｌのキナーゼ緩衝液に再懸濁し，３０℃で３０分間イン
キュベートした。７μｌの５ｘＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で反応を停止し，沸騰
させ，１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し，乾燥し，フィルムに露光した。Ｇ
ＳＴ−Ｊｕｎバンドを切り出し，シンチレーションカウンターで計数した。
フェクトした。細胞をＨＮＴＧ中で溶解し，０．２ｍｇを１２ＣＡ５を用いて４
時間免疫沈澱させた。免疫沈殿物を溶解緩衝液で３回，キナーゼ緩衝液（２５ｍ
ＭＨｅｐｅｓ７．６，２０ｍＭＭｇＣｌ2，２ｍＭＤＴＴ，１００μＭＮａ3ＶＯ 4 ，１ｍＭＰＭＳＦ）で２回洗浄した。各免疫沈澱物の１／２をアクリルアミド
ゲルに流し，ＨＡ−ＪＮＫ発現レベルについてウエスタンブロットを行った。残
りを，２０μＭＡＴＰ，５μＣｉγＰ32ＡＴＰ，および５μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ
１−２２３を含む３０μｌのキナーゼ緩衝液に再懸濁し，３０℃で３０分間イン
キュベートした。７μｌの５ｘＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で反応を停止し，沸騰
させ，１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し，乾燥し，フィルムに露光した。Ｇ
ＳＴ−Ｊｕｎバンドを切り出し，シンチレーションカウンターで計数した。
【０２７０】２−ハイブリッドスクリーニング ｐＣｎＭ−１０７ＮからのＧｒｕｂのＮ末端ドメインをコードするＢａｍＨＩ
フラグメントを，ｐＥＧ２０２のＢａｍＨＩ部位にクローニングして，ｐＥＧ−
１０７Ｎを作成した。このプラスミドは，ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡに融合さ
れたＧｒｕｂのＮ末端をコードする。このおとり構築物をＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａ
ｅＥＧＹ４８株に導入して，得られる株を製造した。ＥＧＹ４８は，ＬＥＵ２お
よびＬｅｘＡ結合部位を有する合成プロモーターの制御下にあるβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を含む。酵母発現ベクターｐＪＧ４５中のＨｅｌａｃＤＮＡ発現ラ
イブラリを，得られた株にトランスフォームした（Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．，Ｇｏｌ
ｅｍｉｓ，Ｅ．，Ｃｈｅｒｔｋｏｖ，Ｈ．，ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．（１９９
３）Ｃｅｌｌ ７５，７９１−８０３）。約１．８Ｘ１０6個のトランスフォー
マントを相互作用クローンについてスクリーニングした。６個の独立したｃＤＮ
Ａは，先に単離された遺伝子スナピン（Ｄａｒｄｉ，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｕｒｏ．（１９９９）２，１１９−１２４）と同一であることが見いださ
れた。２個の独立した重複クローンは，ラットＲＡＣＫ１のヒトのオルトログで
あることが見いだされた（Ｒｏｎ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９
９４）９１，８３９−８４３）。
フラグメントを，ｐＥＧ２０２のＢａｍＨＩ部位にクローニングして，ｐＥＧ−
１０７Ｎを作成した。このプラスミドは，ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡに融合さ
れたＧｒｕｂのＮ末端をコードする。このおとり構築物をＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａ
ｅＥＧＹ４８株に導入して，得られる株を製造した。ＥＧＹ４８は，ＬＥＵ２お
よびＬｅｘＡ結合部位を有する合成プロモーターの制御下にあるβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を含む。酵母発現ベクターｐＪＧ４５中のＨｅｌａｃＤＮＡ発現ラ
イブラリを，得られた株にトランスフォームした（Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．，Ｇｏｌ
ｅｍｉｓ，Ｅ．，Ｃｈｅｒｔｋｏｖ，Ｈ．，ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．（１９９
３）Ｃｅｌｌ ７５，７９１−８０３）。約１．８Ｘ１０6個のトランスフォー
マントを相互作用クローンについてスクリーニングした。６個の独立したｃＤＮ
Ａは，先に単離された遺伝子スナピン（Ｄａｒｄｉ，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｕｒｏ．（１９９９）２，１１９−１２４）と同一であることが見いださ
れた。２個の独立した重複クローンは，ラットＲＡＣＫ１のヒトのオルトログで
あることが見いだされた（Ｒｏｎ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９
９４）９１，８３９−８４３）。
【０２７１】結論 当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明
の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して
種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明
の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して
種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。
【０２７２】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。
【０２７３】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。
【０２７４】 すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してき
たが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そ
のような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると
考えられることが理解されるべきである。
たが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そ
のような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると
考えられることが理解されるべきである。
【０２７５】 さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０２７６】 遺伝コードの縮重の観点から，核酸の他の組み合わせもまた本明細書のペプチ
ドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つ
の核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸
について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは
平均で３１００，もしくは５ｘ１０47種類の核酸配列によりコードされるであろ
う。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第
１の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核
酸配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチ
ドおよび蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒト
において好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように
，本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更
しない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのような
ポリペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選
択することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，
アミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を
与えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする
対応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与
えずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合
蛋白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプ
チドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。
ポリペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の
実験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意
な活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸およ
び／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
ドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つ
の核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸
について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは
平均で３１００，もしくは５ｘ１０47種類の核酸配列によりコードされるであろ
う。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第
１の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核
酸配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチ
ドおよび蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒト
において好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように
，本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更
しない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのような
ポリペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選
択することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，
アミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を
与えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする
対応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与
えずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合
蛋白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプ
チドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。
ポリペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の
実験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意
な活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸およ
び／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
【０２７７】 本明細書においては，発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成す
る。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属
から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般
的記載が含まれる。
【０２７８】 他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】 図１は，Ｔｋｓ１０７のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す
。
。
【図２】 図２は，Ｔｋｓ１１３のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す
。
。
【図３】 図３は，Ｔｋｓ１１８のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す
。
。
【図４】 図４は，Ｔｋｓ２０２のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す
。
。
【図５】 図５は，Ｔｋｓ１０７の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号５）
を示す。
を示す。
【図６】 図６は，Ｔｋｓ１１３の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号６）
を示す。
を示す。
【図７】 図７は，Ｔｋｓ１１８の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号７）
を示す。
を示す。
【図８】 図８は，Ｔｋｓ２０２の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号８）
を示す。
を示す。
【図９】 図９は，ｄｂｌ，ｃｄｃ２４，ｖａｖ，ｔｉａｍ，ｆｇｄｌおよ
びＧｒｕｂのｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ
）アラインメントを示す。
びＧｒｕｂのｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ
）アラインメントを示す。
【図１０】 図１０は，Ｇｒｕｂプレクストリンホモロジー（ＰＨ）ドメイ
ンと，ｄｂｌ，ｔｉａｍ，およびｆｇｄｌのＰＨドメインの隠れマルコフモデル
（ＨＭＭ）アラインメントを示す。
ンと，ｄｂｌ，ｔｉａｍ，およびｆｇｄｌのＰＨドメインの隠れマルコフモデル
（ＨＭＭ）アラインメントを示す。
【図１１】 図１１は，種々の組織におけるＧｒｕｂの発現を示す。
【図１２】 図１２は，正常組織およびＮＣＩ腫瘍細胞におけるＧｒｕｂの
発現を示す。
発現を示す。
【図１３】 図１３は，２９３細胞におけるＧｒｕｂとＳｒｃの共発現を示
す。
す。
【図１４】 図１４は，種々の組織におけるＴｋｓ１１３の発現を示す。
【図１５】 図１５は，Ｔｋｓ１１３特異的抗体を示す。
【図１６】 図１６は，Ｔｋｓ１１８とｍＳＨ３Ｐ７，ドレブリンＥおよび
ＳｒｃのＳＨ３ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｊ．Ｈｅｉｎの方法を
用いるＭｅｇＡｌｉｇｎ）を示す。
ＳｒｃのＳＨ３ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｊ．Ｈｅｉｎの方法を
用いるＭｅｇＡｌｉｇｎ）を示す。
【図１７】 図１７は，種々の組織におけるＴｋｓ１１８の発現を示す。
【図１８】 図１８は，正常組織およびＮＣＩ腫瘍細胞におけるＴｋｓ１１
８の発現を示す。
８の発現を示す。
【図１９】 図１９は，２９３細胞におけるＴｋｓ１１８とＳｒｃの共発現
を示す。
を示す。
【図２０】 図２０は，ＮＩＨ３Ｔ３−Ｙ５２７Ｆ細胞の抗Ｔｋｓ１１８（
α５０３３）および抗ビンクリン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）の共染色を示す。
α５０３３）および抗ビンクリン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）の共染色を示す。
【図２１】 図２１は，Ｔｋｓ２０２のＣ末端と，ｃ−ｍｅｌおよびｒａｂ
８のアラインメント（Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるＭｅｇＡｌｉｇｎ）を示す。
８のアラインメント（Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるＭｅｇＡｌｉｇｎ）を示す。
【図２２】 図２２は，種々の組織におけるＴｋｓ２０２の発現を示す。
【図２３】 図２３は，Ｇｒｕｂの５つの他のリーディングフレームの翻訳
を示す。
を示す。
【図２４】 図２４は，Ｔｋｓ１１３の５つの他のリーディングフレームの
翻訳を示す。
翻訳を示す。
【図２５】 図２５は，Ｔｋｓ１１８の５つの他のリーディングフレームの
翻訳を示す。
翻訳を示す。
【図２６】 図２６は，Ｔｋｓ２０２の５つの他のリーディングフレームの
翻訳を示す。
翻訳を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 13/12 ４Ｃ０８４ 13/12 17/06 ４Ｈ０４５ 17/06 19/02 19/02 25/00 25/00 29/00 29/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ファン，フアン アメリカ合衆国 94002 カリフォルニア 州 ベルモント， チュラ ビスタ ドラ イブ 1512 (72)発明者 コートニッジ，サラ・エー アメリカ合衆国 94010 カリフォルニア 州 バーリンゲイム，アルバラード スト リート 1408 Ｆターム(参考） 2G045 BB24 CA25 CB01 CB14 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA43 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QQ52 QR55 QR59 QR62 QR77 QR80 QS24 QS25 QS28 QS34 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 ZA01 ZA34 ZA36 ZA45 ZA59 ZA68 ZA81 ZA89 ZA96 ZB02 ZB11 ZB15 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA21 EA22 EA23 EA27 EA28 EA50 FA74
Claims (25)
- 【請求項１】 Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ
２０２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする，単離され，濃縮さ
れ，または精製された核酸分子。 - 【請求項２】 前記核酸分子が， （ａ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）高いストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド分子に
ハイブリダイズし，かつ天然に生ずるポリペプチドをコードする； （ｄ）アミノ酸残基の以下のセグメントの全部ではないが１またはそれ以上を欠
失している点において，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８
のアミノ酸配列を含むポリペプチドと異なる：配列番号５の１−１０８２，１０
８３−１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１３７２または１３７３−１
５１９；配列番号６の１−３８３または３８４−４７６；配列番号７の１−２２
７，２２８−３７１または３７２−４３１；または配列番号８の１−６２９また
は６３０−８３２； （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｆ）以下のアミノ酸残基の少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードする：配列番号５の１−１０８２，１０８３−１２５７，１
２５８−１２６４，１２６５−１３７２または１３７３−１５１９；配列番号６
の１−３８３または３８４−４７６；配列番号７の１−２２７，２２８−３７１
または３７２−４３１または配列番号８の１−６２９または６３０−８３２； （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｈ）Ｃ末端ドメイン，Ｎ末端ドメイン，スペーサー領域，プロリンリッチ領域
，ＤＨドメイン，ＰＨドメイン，ＳＨ３ドメインおよびＧＴＰａｓｅドメインか
らなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失して
いる点において，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載
されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと異なる；または （ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体である， ヌクレオチド配列を含む，請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項３】 宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまた
はプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項４】 前記核酸分子が，哺乳動物から単離され，濃縮され，また
は精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項５】 前記哺乳動物がヒトである，請求項４記載の核酸分子。
- 【請求項６】 試料中においてポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を検出する核酸配列を含む核酸プローブであって，前記ポリペプチドが，Ｔｋ
ｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択
されることを特徴とする核酸プローブ。 - 【請求項７】 前記ポリペプチドが，配列番号５，配列番号６，配列番号
７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラ
グメントである，請求項６記載のプローブ。 - 【請求項８】 Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ
２０２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換
え細胞。 - 【請求項９】 前記ポリペプチドが，配列番号５，配列番号６，配列番号
７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラ
グメントである，請求項８記載の細胞。 - 【請求項１０】 全長または部分長Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ
１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択される，単離され，濃縮され，ま
たは精製されたポリペプチド。 - 【請求項１１】 前記ポリペプチドが，配列番号５，配列番号６，配列番
号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフ
ラグメントである，請求項１０記載のポリペプチド。 - 【請求項１２】 前記ポリペプチドが， （ａ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列； （ｂ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列，ただし，以下のアミノ酸残基のセグメントの全部ではないが１または
それ以上を欠失する点において異なる：配列番号５の１−１０８２，１０８３−
１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１３７２または１３７３−１５１９
；配列番号６の１−３８３または３８４−４７６；配列番号７の１−２２７，２
２８−３７１または３７２−４３１または配列番号８の１−６２９または６３０
−８３２； （ｃ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列の，以下のアミノ酸残基の少なくとも１つを含むアミノ酸配列：配列番
号５の１−１０８２，１０８３−１２５７，１２５８−１２６４，１２６５−１
３７２または１３７３−１５１９；配列番号６の１−３８３または３８４−４７
６；配列番号７の１−２２７，２２８−３７１または３７２−４３１；または配
列番号８の１−６２９または６３０−８３２；または （ｄ）配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８に記載されるアミ
ノ酸配列であって，ただし，Ｃ末端ドメイン，Ｎ−末端ドメイン，スペーサー領
域，プロリンリッチ領域，ＤＨドメイン，ＰＨドメイン，ＳＨ３ドメインおよび
ＧＴＰａｓｅドメインからなる群より選択されるドメインの，全部ではないが１
またはそれ以上を欠失する点において異なるアミノ酸配列， を含む，請求項１０記載のポリペプチド。 - 【請求項１３】 前記ポリペプチドが，哺乳動物から単離され，精製され
，または濃縮されたものである，請求項１０記載のポリペプチド。 - 【請求項１４】 前記哺乳動物がヒトである，請求項１３記載のポリペプ
チド。 - 【請求項１５】 前記ポリペプチドが，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔ
ｋｓ１１８またはＴｋｓ２０２ポリペプチドである，請求項１０記載のポリペプ
チド。 - 【請求項１６】 Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋ
ｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドに対して特異的結合親和性を有
する抗体または抗体フラグメント。 - 【請求項１７】 Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋ
ｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドに対して特異的結合親和性を有
する抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項１８】 ポリペプチド活性を調節する物質を同定する方法であっ
て， （ａ）Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる
群より選択されるポリペプチドを試験物質と接触させ； （ｂ）ポリペプチドの活性を測定し；および （ｃ）物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する， の各工程を含む方法。 - 【請求項１９】 ポリペプチドの活性がポリペプチドとＳｒｃとの間の相
互作用を含む，請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 細胞において活性を調節する物質を同定する方法であっ
て， （ａ）ポリペプチドまたはポリペプチドドメインを細胞中で発現させ，ここで，
前記ポリペプチドまたはポリペプチドドメインは，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３
，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択され； （ｂ）試験物質を前記細胞に加え；そして （ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドまたはポリペプチドドメインと天然の
結合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする， の各工程を含む方法。 - 【請求項２１】 天然の結合パートナーがＳｒｃである，請求項２０記載
の方法。 - 【請求項２２】 治療を必要とする患者に，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３
，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２からなる群より選択されるポリペプチドの活
性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療する方法。 - 【請求項２３】 前記疾病またはまたは疾患が，慢性関節リウマチ，動脈
硬化，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化ストレ
ス関連神経変性性疾患，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病および癌からな
る群より選択される，請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 前記免疫関連疾病および疾患が，慢性関節リウマチ，慢
性炎症性大腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，喘息，変形性関節症，
乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫および臓器移植からなる群より
選択される，請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 疾病または疾患の診断道具として試料中においてポリペ
プチドを検出する方法であって， （ａ）試料を，Ｔｋｓ１０７，Ｔｋｓ１１３，Ｔｋｓ１１８およびＴｋｓ２０２
からなる群より選択されるポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイゼーショ
ンアッセイ条件下でハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブ
は，前記ポリペプチド，そのフラグメント，および前記配列およびフラグメント
の相補体をコードする核酸配列を含み；そして （ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を前記疾病の指標として
検出する の各工程を含む方法。
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