JP2004514434A - 単離ヒトホスファターゼタンパク質、ヒトホスファターゼタンパク質をコード化する核酸分子及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【技術分野】
本発明は、ある有糸分裂促進物質−起動するタンパク質(MAP)キナーゼ・ホスファターゼ亜族、組み換えDNA分子とタンパク質生産に関連があるホスファターゼ・タンパク質に関する。本発明はそのようなペプチドとタンパク質分子をコード化している新しいホスファターゼ・ペプチドとタンパク質と核酸分子を提供する。そして、これらは人間の治療学と診断上の製剤と方法の開発に役立つ。具体的には、本発明は、新規なMAPキナーゼホスファターゼスプライス型に関する。
【0002】
【背景技術】
ホスファターゼタンパク質、特にMAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族は、薬学的機能と発展の主な目標である。したがって、ホスファターゼ・タンパク質の亜族の未知種を確認して、特徴づけることは、製薬発展の分野において重要である。本発明は、MAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族に対して相同性を持つ未知のヒトホスファターゼ・タンパク質を提供するものである。
【0003】
タンパク質ホスファターゼ
細胞信号伝達系は、多様な細胞プロセスを制御する外刺激が細胞の内部に中継される基本的メカニズムである。信号が細胞の内で送られる生化学経路は、直接または機能的に関係のある対話的タンパク質の回路から成る。信号形質導入の重要な生化学メカニズムのうちの1つは、タンパク質の上で特定の残基の可逆的リン酸化である。タンパク質のリン酸化状態は、その細胞位置と同様にその形態や酵素的な活動に影響を及ぼすかもしれない。タンパク質のリン酸化状態は、各種の特定のアミノ酸残基でタンパク質ホスファターゼ(PKs)とタンパク質ホスファターゼ(PPs)の互恵的な作用を通して調整される。
【0004】
タンパク質リン酸化は、真核生物細胞の活動を制御するのに用いられる普遍的な機能である。典型的哺乳類の細胞で活発なタンパク質の10%が燐酸化されると見積もられる。起動を授けて、アデノシン三リン酸分子からタンパク質−タンパク質ホスファターゼまで移される高エネルギーのリン酸塩は、その後タンパク質−タンパク質ホスファターゼから除去される。このように、ホスファターゼは細胞成長と分化を管理する大部分の細胞信号作用、cell−to−cell接触、細胞周期と腫瘍形成を制御する。
【0005】
タンパク質リン酸化/脱リン酸化サイクルは、細胞活動を制御するために真核生物細胞によって使用される主なメカニズムのうちの1つである。典型的哺乳類の細胞の中の活性タンパク質の10%以上が燐酸化されると見積もられる。タンパク質リン酸化/脱リン酸化の間、リン酸基はアデノシン三リン酸分子からタンパク質−タンパク質ホスファターゼまで移されて、タンパク質−タンパク質ホスファターゼから除去される。タンパク質ホスファターゼは、細胞成長と分化を管理する細胞信号作用、cell−to−cell接触、細胞周期と腫瘍形成で機能する。進化論的に異なった3つのタンパク質ホスファターゼ族は確認されている。これらは、serine/threonineホスファターゼ、タンパク質チロシン・ホスファターゼと酸性/アルカリ・ホスファターゼを含む(Carbonneau H.とTonks N. K.(1992)Annu.Rer.Cell.Biol. 8:463−93)。
【0006】
serine/threonineホスファターゼは、シトゾルであるかレセプターと関係している。2つの温度安定性のタンパク質、抑制剤1と2と、それらの二価の陽イオン必要性へのそれらの感度に基づいて、serine/threonineホスファターゼは、4つの異なったグループ、PPI、PP−IIA、PP−IIBとPP−IICに分けられることができる。PPIは、サイクリックAMP−dependentなタンパク質ホスファターゼによって燐酸化されるタンパク質の多数を脱リン酸化し、このためそれは多くのサイクリックAMPの重要なモジュレーター(細胞の中のホルモン反応)である。PP−IIAは細胞周期(成長と増殖)の制御のために、広い特性を持ち、そして、DNA複写、そして、主なホスファターゼはserine/threonineホスファターゼのリン酸化を翻す役割を果たす。PP−IIBまたはcalcineurin(Cn)は、Ca.sup.+2−起動するホスファターゼである;それは、イオン・チャンネル規則のような多様な細胞機能、neuronalな伝達、遺伝子転写、筋肉グリコーゲン代謝とリンパ球行動の調整に関係している。
【0007】
PP−IICは、サイクリックAMP起動するタンパク質−ホスファターゼ活動を管理することを含む多種多様な機能、Ca.sup.++に依存する信号の形質導入、信号の伝達が熱ショック反応と関係づけたtRNAに参加するMg.sup.++に依存するホスファターゼである。PP−IICは、kDaの40−45についての分子の量による単量体タンパク質である。PP−IICの1つの.alpha.といくつかの.beta. isoformsが確認された(Wenk, J. et al. (1992) FEBS Lett. 297: 135−138; Terasawa, T. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 307: 342−349; and Kato, S. et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 318: 387−393)。
【0008】
いつでも通常の細胞成長と分化のために必要なタンパク質リン酸化のレベルは、PKsとPPSの調整された動作を通して提供される。細胞前後関係に従い、酵素のこれらの2つのタイプは、敵対行動をとるかもしれないか信号形質導入の間、互いと協力するかもしれない。これらの酵素の間のアンバランスは、代謝の障害と細胞変換に至っている通常の細胞機能を弱めるかもしれない。
【0009】
たとえば、インシュリン・レセプター(それはPTKである)に結合しているインシュリンは、ブドウ糖輸送、グリコーゲンと脂肪の生合成、DNA合成、細胞分裂と分化のようないろいろな代謝の成長進めている影響を誘発する。真性糖尿病、そしてそれは特徴づける不十分な、あるいは、インシュリン信号形質導入の不足は、経路に合図しているインシュリンに沿ってどんなステップででもどんな異常にでも起因することがありえる。(Olefsky, 1988, in ”Cecil Textbook of Medicine,” 18th Ed., 2:1360−81)。
【0010】
たとえば、PTKs(例えばHER2)の過剰発現がガンの発達で決定的な役割を演ずることができることは、また、有名である‖(Slamon et al., 1987, Science 235:77−82)、まったく、この酵素の活動を妨げることができる抗体は、腫瘍成長を廃止することができる(Drebin et al., 1988, Oncogene 2:387−394)。Flk−1とPDGFレセプターのようなチロシン・ホスファターゼ信号の形質導入能力をブロックすることは、動物のモデルで腫瘍成長をブロックすることが示された(Millauer et al., 1994, Nature 367:577; Ueno et al., Science, 252:844−848)。
【0011】
相対的に、より少ないものは信号形質導入においてホスファターゼの直接の役割に関して知られている;PPsは、人間の病気で役割を果たすかもしれない。たとえば、RPTP.alpha.のectopicな現れは胚線維芽細胞(Zheng et al., Nature 359:336−339)において、異なる発現型を生じる、そして、embryonalな癌細胞の中のRPTP.alpha.の過剰発現は細胞がneuronalな発現型(den Hertog et al., EMBO J 12:3789−3798)で、細胞タイプに分化する原因になる。腎臓、小さい肺癌において、しばしば変えられる部分である染色体3p21に、人間のRPTP.gamma.のための遺伝子は、局所化された。突然変異は、外部の信号にもはや応答しないRPTPを生じるRPTP.gamma.の細胞外部分で起こるかもしれない(LaForgia et al., Wary et al., 1993, Cancer Res 52:478−482)。PTP1C(別名HCP、SHP)をコード化している遺伝子の中の突然変異は、高度の免疫不全にかかるマウスと大食細胞のhyperproliferationが付いてくる全身自己免疫病気での発現型の原因である(Schultz et al., 1993, Cell 73:1445−1454)。PTP1D(別名SypまたはPTP2C)は、PDGFR、EGFRとインシュリン・レセプター・基質1(IRS−1)においてリン酸化のサイトにSH2領域を通して結合することが示された。反PTP1D抗体の顕微鏡下注射によってPTP1Dの活動を減らし、インシュリンまたはEGFによって誘発された有糸分裂生起を妨げることが示された(Xiao et al., 1994, J Biol Chem 269:21244−21248)。
【0012】
MAP キナーゼホスファターゼ
本発明は3つの新規なmitogen−activatedタンパク質(MAP)キナーゼ・ホスファターゼを提供する。変形スプライス型1、2、3は、ここに参照される。具体的には、図3で示されるように、スプライス型2はエクソン13と14(それはスプライス型1と3で存在しない)を含み、そして、スプライス型3はエクソン7を欠く。そして、それはスプライス型1と2で存在する。全ての3つのisoformsからのcDNAクローンは、人間のchromsome 11の同じ領域にマップされた。スプライス型1は、アメリカ・アプリケーション2000年11月20日に出願09/715177号で出願人によって以前明らかにされた。
【0013】
MAPキナーゼ・ホスファターゼは、多数の危機的な生物学的過程に関係している二重特性タンパク質ホスファターゼである。ショウジョウバエにおいて、MAPキナーゼ・ホスファターゼが、生存能力にとって不可欠であるとわかった。さらに、l機能欠如突然変異は、ねじれられたおよび/または分岐された剛毛と翼髪を引き起こす。植物では、MAPキナーゼ・ホスファターゼは、ストレスと病原体(グプタ朝ほか(Gupta et al., Plant J 1998 Dec;16(5):581−9))への反応で、重要な役割を演ずる。MAPキナーゼ・ホスファターゼは、怪我と退行性の刺激(Winter et al., Brain Res 1998 Aug 10;801(1−2):198−205)の後でneuronalな生き残りとneuronalな細胞死で重要な役割を演ずる。MAPキナーゼ・ホスファターゼは、また、糖尿病と他のインシュリンに関連した状況で役割を果たすかもしれない;インシュリンはマップキナーゼホスファターゼ−1(MKP−1)を管理する、そして、MKP−1が合図している(Kusari et al., Mol Endocrinol 1997 Sep;11(10):1532−43)インシュリンのネガティブモジュレータの働きをすることを示唆された。さらに、MAPキナーゼ・ホスファターゼは細胞増殖(Emslie et al., Hum Genet 1994 May;93(5):513−6)のネガティブ調整のために重要かもしれず、そして、したがって、新しい人間のMAPキナーゼ・ホスファターゼ遺伝子はcandidate腫瘍−抑制器遺伝子として有効である。その上、MAPキナーゼ・ホスファターゼは、特に膵臓のガン(Furukawa et al., Cytogenet Cell Genet 1998;82(3−4):156−9)に関係しているかもしれない。
【0014】
MAPキナーゼ・ホスファターゼの更なる再調査のために、Scimeca et al., Oncogene 1997 Aug 7;15(6):717−25を参照。情報を他のスプライス変形で支えることについてはWang et al., Genomics 57 (2), 310−315 (1999)を参照。
これらをコード化している新しい人間のタンパク質ホスファターゼとポリヌクレオチドの発見は、診断、防止と異常であるか不必要なタンパク質リン酸化と関連する生物学的プロセスの処置に役立つ新しい構成を提供することによって当該分野において必要を満たす。
【0015】
【発明の要約】
本発明が基礎を形成される発明の概要は、人間のホスファターゼ・ペプチドのアミノ酸シーケンスとMAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族(対立変種とその他の哺乳類のオルトログsと同様に)と関連があるタンパク質の識別に関して分かれる。具体的には、本発明は、ホスファターゼスプライスが作る3つの新しいMAPキナーゼを提供する。これらのペプチドをコード化して、人間の治療的な目標(治療的なタンパク質の識別での援助)の発展のモデルとして使われることができて、細胞でホスファターゼ活動を調整する人間の治療的な試薬とホスファターゼを表す組織の発展の目標として用いられるこれらのユニークなペプチド・シーケンスと核酸シーケンス。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス型1が人間のすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳、(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺において発現されることを示した。さらに、スプライス型3は、胎児の脳において発現される。
【0016】
【発明を実施するための最良の形態】
概論
本発明は、ヒトゲノムのシーケンスに関するものである。ヒトゲノムの配列とアセンブリ、シーケンス情報の分析により、ホスファターゼ・タンパク質と当該分野で特徴づけられるタンパク質/ペプチド/ドメインまたはホスファターゼ・タンパク質の一部に構造上、あるいはシーケンス相同性を有するペプチドをコード化して、MAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族と関連があるヒトゲノムの以前未確認の断片が発現された。これらのシーケンスを利用して、更なるゲノム・シーケンスは集められ、複写し、および/又はcDNAシーケンスを単離し、特徴づけた。この分析に基づいて、本発明は、ホスファターゼスプライスが作る3つの新しい人間のMAPキナーゼ、cDNAシーケンスの形の核酸シーケンスとこれらのホスファターゼスプライス型、核酸バリエーション(対立な情報)、発現の組織拡散と最も緻密な当該分野に関する情報をコード化するゲノム・シーケンスのアミノ酸シーケンスに本発明のホスファターゼ・タンパク質に、構造上のシーケンス異体同形を持つ既知のタンパク質/ペプチド/ドメインを提供する。
【0017】
以前知られていないことに加えて、本発明において提供されるペプチドは、商業上重要な製品とサービスの発展のために使われる彼らの能力に基づいて選ばれる。具体的には、現在のペプチドは、ホスファターゼ亜族と発現パターンが観察したMAPキナーゼの既知のホスファターゼ・タンパク質に、相同性や構造上の相関性に基づいて選ばれる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。当該分野は、明らかにタンパク質のこのファミリーのメンバーと発現パターンを現在の遺伝子のそれと類似しているようにするタンパク質の商用の重要性を確立した。本発明と使用のペプチドのより特定の特徴の一部は、それについて、特に発明の背景で、そして、図に示される注釈において、ここで記述されておよび/または既知のMAPキナーゼ・ホスファターゼ族の各々用の技術またはホスファターゼ・タンパク質の亜族の範囲内で知られている。
【0018】
【実施例の詳細】
ペプチド分子
本発明はタンパク質のホスファターゼファミリーの一種であることと確認され、MAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族(タンパク質シーケンスは、図2、転写/cDNAシーケンスは図1、そして、ゲノム・シーケンスが図3に示される)と関連があるタンパク質分子をコード化する核酸シーケンスに関する。
【0019】
具体的には、本発明は、ホスファターゼスプライスが作る3つの新しいMAPキナーゼを提供する。図2に示されるペプチド・シーケンスとともに、明らかな変形として、特にallelicば変形を図3の情報を用いて記述したペプチド・シーケンスは、本発明のホスファターゼ・ペプチド、本発明のホスファターゼ・ペプチド、ホスファターゼスプライス型またはペプチド/タンパク質/スプライスを意味する。
【0020】
本発明は、製作し使用する当該分野の範囲内であるこれらのペプチドの全ての明らかな変形と同様に図2(図1(転写/cDNAまたは図3)で示される核酸分子によって、ゲノム・シーケンスをコード化した)で明らかにされるホスファターゼ・ペプチドのアミノ酸シーケンスから成るか、本質的に成るか、含むペプチドとタンパク質分子を提供する。これらの変形の一部は、下で詳述する。
【0021】
ここに、それがかなり細胞材料ないしと縁がないか化学前駆物質を観桜的に含まないとき、ペプチドは「単離する」、ないし「精製される」という。本発明のペプチドは、均質な純度または他の程度にまで精製されることができる。精製のレベルは、意図された使用により決定される。組成物が他の構成要素(分子が議論される単離した核酸の特徴)のかなりの量の限界的な状態でないペプチドの要求された機能を発揮できればよい。
若干の用途には「実質的に細胞材料を含まない」は、他のタンパク質(すなわち汚染タンパク質)をおよそ30%(乾物重量)未満にしているペプチド、およそ20%未満の他のタンパク質、およそ10%未満のタンパク質または他のおよそ5%未満の他のタンパク質の組成物を含む。
【0022】ペプチドが組換え的に生産されるとき、それはまた、培養(すなわち媒体がタンパク質組成物の量のおよそ20%以下)で、かなり自由でありえる。
「官能的に化学前駆物質または他の化学製品を含まない」言語は、そこに含まれている化学前駆体または他化学製品から分離されたペプチドの組成物を含む。1つの具体例で、「官能的に化学前駆物質または他の化学製品を含まない」言語は、化学前駆物質をおよそ30%(乾燥重量)未満にしているホスファターゼ・ペプチドの組成物または化学およそ10%の前駆物質または他の化学製品より少ないか化学およそ5%の前駆物質または他の化学製品より少ない他の化学製品(化学およそ20%未満の前駆物質または他の化学製品)を含む。
【0023】
単離したホスファターゼ・ペプチドは、自然にそれを発現する細胞から精製されることができるか、それ(組み換え)を発現するために変えられた細胞から(組換え)精製されることができるか、既知のタンパク質合成方法を使用して合成されることができる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1が人間のすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺で発現される。その上、スプライス型3は、胎児の脳においても表される。たとえば、ホスファターゼ・ペプチドをコード化している核酸分子は発現ベクターにクローンをつくられる。そして、宿主細胞とタンパク質に導入される発現ベクターが宿主細胞で表される。タンパク質は、それから標準のタンパク質精製テクニックを使用している適当な精製計画によって、細胞から分離されることができる。これらのテクニックの多くは、下で詳述する。
【0024】
したがって、本発明は、図2(SEQ ID NOS:2,5,7)(たとえば図1(SEQ ID NOS:1,4,6)とゲノム・シーケンスで示される核酸シーケンスが図3(SEQ ID NO:3)で提供したcDNAによってコード化されるタンパク質)で提供されるアミノ酸シーケンスから成るタンパク質を提供する。そのようなタンパク質のアミノ酸シーケンスは、図2で提供される。アミノ酸シーケンスがタンパク質の最終的なアミノ酸シーケンスであるとき、タンパク質はアミノ酸シーケンスから成る。
【0025】
本発明は、さらに本質的に図2(SEQ ID NOS:2,5,7)(たとえば図1(SEQ ID NOS:1,4,6)とゲノム・シーケンスで示される核酸シーケンスが図3(SEQ ID NO:3)で提供したcDNAによってコード化されるタンパク質)で提供されるアミノ酸シーケンスから成るタンパク質を提供する。例えば、約1〜100あるいはさらに付加的な残基、典型例には最終的タンパク質に1〜20のアミノ酸残基が含まれる特場合にように、そのようなアミノ酸シーケンスがほんの少しの更なるアミノ酸残基だけで存在するとき、タンパク質は本質的にアミノ酸シーケンスから成る。本発明は、さらに図2(SEQ ID NO:2,5,7)に示されるアミノ酸配列、タンパク質、たとえば図1(SEQ ID NO:1,4,6)に示される核酸シーケンス、図3(SEQ ID NO:3)のゲノム・シーケンスで示されるcDNAによってコード化されるタンパク質を含む。アミノ酸シーケンスが少なくともタンパク質の最終的なアミノ酸シーケンスの、部分であるとき、タンパク質はアミノ酸シーケンスから成る。そのようなやり方では、タンパク質はペプチドだけであることができるか、付加的なアミノ酸分子(例えばそれまたは非相同的なアミノ酸残基/ペプチド・シーケンスと自然に関係しているアミノ酸残基(隣接するコード化されたシーケンス))を持つことができる。そのようなタンパク質は、更なる2、3のアミノ酸残基を持つことができるか、数百またはより多くの付加的なアミノ酸から成ることができる。
【0026】
本発明のホスファターゼ・ペプチドから成るタンパク質の好ましい種は、自然に発生している成熟したタンパク質である。いろいろな種類のこれらのタンパク質が作られることができて/孤立することができる方法の概要は、下で提供される。
【0027】
本発明のホスファターゼ・ペプチドは、仮想的な融合タンパク質を形成するために非相同的なシーケンスに付けられることができる。そのような仮想的なおよび融合タンパク質は、アミノ酸シーケンスをホスファターゼ・ペプチドにかなり相応するようにしていない非相同的なタンパク質に、有効に結合されるホスファターゼ・ペプチドから成る。「有効に、結合される」ホスファターゼ・ペプチドと非相同的なタンパク質が溶かされたin−frameであることを示す。非相同的なタンパク質は、ホスファターゼ・ペプチドのN−末端C−末端に一体化されることができる。
【0028】
若干の用途には、融合タンパク質は、本質的にホスファターゼ・ペプチドの活動に影響を及ぼさない。たとえば融合タンパク質は、酵素の融合タンパク質(制限はされないが)に含まれることができ、たとえばベータ−ガラクトシダーゼ融合、イースト2−ハイブリッドGAL融合、poly−His融合、MYC−tagged、HI−tagged、Ig融合等が例示される。そのような融合タンパク質(特にpoly−His融合)は、組み換えホスファターゼ・ペプチドの精製を容易にすることができる。特定の宿主細胞(例えば哺乳類の宿主細胞)で、発現やタンパク質の分泌は、非相同的な信号のシーケンスを用いて増やされることができる。
【0029】
仮想的な融合タンパク質は、標準の組み換えDNAテクニックによって生産されることができる。たとえば、異なるタンパク質シーケンスのために符号化しているDNA断片は、従来のテクニックに従う結さつされた一緒にはやりのフレームである。もう一つの具体例で、融合遺伝子は、自動DNAシンセサイザーを含む従来のテクニックによって合成されることができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、与えるプライマーがその後復元されることができる2つの連続的遺伝子断片の間に相補的に実行され、仮想的な遺伝子シーケンス(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1992参照)を生成するために再増幅dしたアンカーを使用して、行われることができる。さらに、多くの発現ベクターは、とてもすでに市販である融合半体(例えばGSTタンパク質)をコード化する。ホスファターゼペプチド−コード化核酸は、融合半体がホスファターゼ・ペプチドへの結合されたin−frameであるように結合された発現ベクターへクローン化することができる。
【0030】
上で言及されるように、本発明も対立な本発明(例えばペプチドの自然に発生している成熟した形)/ペプチド、ペプチドの非自然に発生している組換え的な引き出された変形とオルトログsのシーケンス変形のタンパク質のアミノ酸シーケンスの明らかな変形及びペプチドのパラログsの提供を可能にする。そのような変形は、組み換え核酸技術とタンパク質生化学の分野で、当該分野−既知のテクニックを使用して、すぐに発生することができる。しかし、変形が発明の前に明らかにされるどんなアミノ酸シーケンスでも除外することは、理解される。そのような変形は、すぐに確認されることができて/分子のテクニックとシーケンス情報を使うことをここで明らかにされるようにした。さらに、そのような変形は、すぐに本発明のホスファターゼ・ペプチドに、シーケンスや構造上の相同性に基づく他のペプチドを区別されることができる。相同性/アイデンティティ・プレゼントの程度は、主にペプチドの機能が異なるか機能しない変形、パラログファミリーの中の分岐存在量とオルトログsの間の進化の距離であるかどうかに基づく。
【0031】
2つのアミノ酸シーケンスまたは2つの核酸シーケンスのパーセント・アイデンティティを決定するために、シーケンスは最適の比較目的(例えば、相違は一方、又は両方とも第一と第二のアミノ酸、または核酸シーケンスの最適の配置へ導入することができ、非相応するシーケンスは比較目的のために無視されることができる)のために列記する。
【0032】
好ましい具体例において、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80, 90%あるいはそれ以上、リファレンス・シーケンスの長さを、比較目的のために列記する。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドは、それから比較される。最初のシーケンスでの位置が第二のシーケンスでの対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによってふさがっているとき、分子はその位置(中古のここでアミノ酸または核酸「アイデンティティ」がアミノ酸または核酸「相同性」に等しくて)で同一である。2つのシーケンスの間のパーセント・アイデンティティは、相違の数と各々の長さが相違を作る口座に取って、シーケンスによって共有される同一の位置の数の機能である。そして、それは2つのシーケンスの最適の配置のために紹介される必要がある。
【0033】
パーセント・アイデンティティのシーケンスと決定の比較と2つのシーケンスの類似性は、数学的なアルゴリズムを使用して達成されることができる。(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). In a preferred embodiment, the percent identity between two amino acid sequences is determined using the Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444−453 (1970))。好ましい具体例で、2つのアミノ酸シーケンスの間のパーセント・アイデンティティがNeedlemanとWunschを使って決定されること(J. Mol. Biol. (48):444−453 (1970))、ブロッサム62のマトリックスかPAM250マトリックスと16、14、12、10、8、6の相違重量を使って、GCGソフトウェア・パッケージ(http://www.gcg.comで利用できる)において、GAPプログラムに組み込まれた、あるいは、4と長さが1、2、3、4、5または6の重くするアルゴリズム。まだもう一つの好ましい具体例で、2つのヌクレオチド配列の間のパーセント・アイデンティティはGCGソフトウェア・パッケージ(Devereux, J., et al.,(Nucleic Acids Res. 12(1):387(1984)))(http://www.gcg.comで利用できる)において、GAPプログラムを使用して決定される。そして、マトリックスと相違が40、50、60、70の重くする、あるいは、80と長さが1、2、3、4、5または6の重くするNWSgapdna.CMPを使う。もう一つの具体例で、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間のパーセント・アイデンティティはALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれたE. Myers and W. Miller (CABIOS, 4:11−17 (1989))のアルゴリズムを使用して決定される。そして、PAM120重さ残りテーブル(12の相違長さ刑と4の相違刑)を使う。
【0034】
たとえば、本発明のシーケンスがシーケンス・データベースに対して検索を実行するために「質問シーケンス」としてさらに使われることができる核酸とタンパク質は、他のファミリーの身元を確認するか、シーケンスを話した。そのような検索は、Altschul, et al. (J. Mol. Biol. 215:403−10 (1990))のNBLASTとXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実行されることができる。ヌクレオチドが捜すBLASTは、発明の核酸分子に、相応するヌクレオチド配列を得るためにNBLASTプログラム、得点= 100、wordlength = 12で実行されることができる。タンパク質が捜すBLASTは、発明のタンパク質に相応するアミノ酸シーケンスを得るためにXBLASTプログラム、得点= 50、wordlength = 3で実行されることができる。比較目的のために相違を作られた配置を得るために、Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25(17):3389−3402 (1997))で記述されるように、GappedされたBLASTは利用されることができる。BLASTを利用して、BLASTプログラムに相違を作るとき、それぞれのプログラム(例えばXBLASTとNBLAST)のデフォルト・パラメータが使われることができる。
【0035】
本発明のペプチドのうちの1つから成るタンパク質の省略なしの前処理された形態(成熟した処理された形式と同様に)は、すぐにホスファターゼ・ペプチドと同じ遺伝子の場所のそばでコード化されることと同様に本発明のホスファターゼ・ペプチドのうちの1つまで、完全なシーケンス・アイデンティティをここで提供しておくことと確認される。本発明の新しいホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子は公共のBAC AP001885に置かれる。そして、それは染色体11(図3で示されるように)にマップされることを知られている。
【0036】
ホスファターゼ・ペプチドの対立変種は、すぐにホスファターゼ・ペプチドと同じ遺伝子の場所のそばでコード化されることと同様に最も少なく一部のホスファターゼ・ペプチドでに、シーケンス相同性/アイデンティティの高い程度(重要な)をここで提供しておいている人間のタンパク質であることと確認されることができる。遺伝子の場所は、図3(例えばリファレンス人間にマップされるゲノム・シーケンス)で提供されるゲノム情報に基づいて、すぐに決定されることができる。本発明の新しいホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子は公共のBAC AP001885に置かれる。そして、それは染色体11(図3で示されるように)にマップされることを知られている。ここで使われるように、アミノ酸シーケンスがだいたい70−80%に概して少なくとも80−90%であるか90−95%について概して少なくともより多くであるかより相応するとき、2つのタンパク質(またはタンパク質の部位)は重要な相同性を持つ。より完全に、下で述べられるように、厳しい状況の下で核酸分子をコード化しているホスファターゼ・ペプチドに交雑する核酸シーケンスによって、本発明によれば、かなり相応するアミノ酸シーケンスは、コード化される。
【0037】
図3は、本発明のホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子において見つかったSNPsに関する情報を提供する。以下のSNPsは、確認された:G577A、G1451AとG2641A.G577AとG1451Aは、非同義のコーディングSNPsである。これらのSNPsに起因するシーケンスが示されるアミノ酸の中の変化図3、そして、リファレンスとして図2で提供される一般的な遺伝暗号とタンパク質シーケンスを使って、すぐに決定することができる。G2641Aは、ORFの3であり、そして、制御/規定する要素に影響を及ぼすかもしれない。
【0038】
ホスファターゼ・ペプチドのパラログsは、すぐに、人間から遺伝子によってコード化されながら、最も少なく一部のホスファターゼ・ペプチドでに、そして、類似した活動または機能を持ちながら重要なシーケンス相同性/アイデンティティのある程度を持つことと確認されることができる。2つのタンパク質は、概してアミノ酸シーケンスが概して少なくともおよそ60%以上であるパラログsと考えられて、所定の部位または領域を通して70%またはより大きい相同性について概して少なくともより多くである。より完全に、下で述べられるように、穏やかにの下で厳しい状況に核酸分子をコード化しているホスファターゼ・ペプチドに交雑する核酸シーケンスによって、そのようなパラログsは、コード化される。
【0039】
ホスファターゼ・ペプチドのオルトログsは、すぐにもう一つの有機体から遺伝子によってコード化されることと同様に最も少なく一部のホスファターゼ・ペプチドでに、重要なシーケンス相同性/アイデンティティのある程度を持つことと確認されることができる。
【0040】
好ましいオルトログsは、人間の治療的な目標と試薬の発展のための哺乳類(望ましくは霊長類)から分離される。より完全に、下で述べられるように、穏やかにの下で厳しい状況に核酸分子をコード化しているホスファターゼ・ペプチドに交雑する核酸シーケンスによって、そのようなオルトログsはコード化される。そして、タンパク質を産している2つの有機体の相関性の程度に依存する。
【0041】
本発明のホスファターゼ・ペプチドの非自然に発生している変形は、組み換えテクニックを使用して、すぐに発生することができる。このような変形は、ホスファターゼ・ペプチドのアミノ酸シーケンスで、削除、追加と代用に限られているものを含む。たとえば、代用の1つの例は、節約されたアミノ酸代用である。そのような代用は、同様の特徴のもう一つのアミノ酸によってホスファターゼ・ペプチドにおいて与えられたアミノ酸を代えるものである。概して、脂肪族のアミノ酸Ala、Val、LeuとIleの中の一方から他方への置き換えは、保守的な代用とみなされる;ヒドロキシ基を含む残基SerとThrの交換;酸性の残基AspとGluの交換;アミド残基AsnとGlnの間の代用;基本的残基LysとArgの交換;そして、方向族残基PheとTylの中の置き換え。アミノ酸変化が形質的に問題なしとされる基準が、Bowie et al., Science 247:1306−1310 (1990)であるとわかる。
【0042】
異なるホスファターゼ・ペプチドは、完全に機能的でありえるか、一つ以上の活動(例えば基質を結びつける能力、基質を脱リン酸化する能力、合図することを調整する能力、その他)において、機能が不足することができる。完全に機能変形は、概して保守的なバリエーションだけまたは非重要な残留物の中のまたは非棄却域での変化だけを含む。図2は、タンパク質分析の結果を提供して、重要な領域/部位を確認するのに用いられることができる。機能変形は、また、変化に終わらない類似したアミノ酸の置換または機能の微々たる変化を含むことができる。あるいは、そのような代用は、ある程度に明らかにまたは否定的に機能に影響を及ぼすかもしれない。
【0043】
機能しない変形は、概して一つ以上の非保守的なアミノ酸代用、削除、挿入、倒置または打ちきり、あるいは、代用、挿入、倒置または重要な残りまたは棄却域での削除を含む。
機能にとって不可欠であるアミノ酸は当該分野(例えばサイトに誘導された突然変異生成またはアラニン−スキャン突然変異生成(Cunningham et al., Science 244:1081−1085 (1989))において知られている方法によって確認されることができる。そして、特に図2で提供される結果を使う。後の手順は、分子においてあらゆる残りで一つのアラニン突然変異を紹介する。結果として生じる変異体分子は、それからホスファターゼ活動のような生物学的活動のためにまたは試験管内の増殖的な活動のような分析評価においてテストされる。結合しているパートナー/基質がまた、あることがありえることを結びつけるために重要であるサイトは、結晶化のような構造上の分析、核磁気共鳴またはphotoaffinityによってラベルをつけることを決定した(Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899−904 (1992)。
【0044】
そのような断片から成って、成るタンパク質とペプチドに加えて、本発明はさらにホスファターゼ・ペプチドの断片を提供する。そして、残りを含んでいる特にそれらが図2で確認される。しかし、発明が付随する断片は、本発明の前に公的に明らかにされるかもしれない断片を含むこととして解釈されることになっていない。
【0045】
ここで使われるように、断片はホスファターゼ・ペプチドから少なくとも8、10、12、14、16またはより隣接するアミノ酸残基から成る。そのような断片はホスファターゼ・ペプチドの生物学的活動の一つ以上を保持する能力に基づいて選ばれることができるか、機能を実行する能力のために選ばれることができた例えば、免疫原として基質または行為を結びつける。特に重要な断片は、生物学上活発な断片(たとえばあるペプチド)である、長さでのおよそ8つ以上のアミノ酸。そのような断片は、概してホスファターゼ・ペプチド(例えば活性部位、膜内外領域または基質結合領域)の領域またはモティーフから成る。さらに、断片が含む、制限される可能性はそうする。そして、断片、一体化するペプチド断片と断片を含んでいる領域またはモティーフが免疫原性構造を含む。
【0046】
予測された領域と機能サイトは、すぐに有名なコンピュータープログラムによって定義可能ですぐに当該分野(例えばPROSITE分析)の技術のそれらが利用できる。そのような分析の結果は、図2で提供される。
ポリペプチドは、しばしば20の自然に発生しているアミノ酸と、一般に呼ばれる20のアミノ酸以外のアミノ酸を含む。終端のアミノ酸を含んで、更なる、多くのアミノ酸は、自然の過程(例えば処理と他の翻訳後の修正)までにまたは当該分野において有名な化学の修正テクニックによって修正されるかもしれない。自然にホスファターゼ・ペプチドで起こる一般の修正は基本的テキスト、詳細なモノグラフと調査文学で記述される、そして、彼らは当該分野(これらの特徴の一部は、図2で確認される)の技術のそれらに有名である。
【0047】
既知の修正は(アセチル化)acylation、ADP−ribosylation、amidation、フラビンの共有結合付属品、ヘム半分の共有結合付属品、ヌクレオチドまたは派生的なヌクレオチドの共有結合付属品、脂質の共有結合付属品または、クロスリンクして、phosphotidylinositolの脂質派生的な、共有結合付属品環化、二硫化物結合形成、demethylation、共有結合クロスリンクの形成、シスチンの形成、形成のpyroglutamateする(formylation)ガンマ・カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、iodination、メチル化、myristoylation、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、prenylation、ラセミ化、selenoylation、硫酸化、移動−RNA調整されたarginylationのようなタンパク質へのアミノ酸の追加、そして、ubiquitinationを含むが制限はされない。
【0048】
そのような修正は、当該分野の技術のそれらに有名で、科学的な文学において大きい詳細において記述された。特に一般のいくつかの修正、グリコシル化、脂質配属、硫酸化、グルタミン酸残りのガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化と、たとえば、ADP−ribosylationは(例えばタンパク質s)、大部分の基本的テキストProteins − Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)に記述されてある。多くの詳細な批評は、例えばWold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1−12 (1983); Seifter et al. (Meth. Enzymol. 182: 626−646 (1990)) and Rattan et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48−62 (1992))Proteins − Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)によってこの主題で利用可能である; Seifter et al.(Meth. Enzymol. 182: 626−646 (1990))、そして、Rattan et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48−62 (1992))。
【0049】
したがって、本発明のホスファターゼ・ペプチドも派生物を含む、あるいは、成熟したホスファターゼ・ペプチドがもう一つの合成物(例えばホスファターゼ・ペプチドの半減期を増やす合成物)で溶かされて、どちらであるか、あるいは、付加的なアミノ酸がどれでリーダーまたは分泌腺のような成熟したホスファターゼ・ペプチドに一体化されるか、代えられたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコード化されるものでない、置換分として働くグループがあるアナログは成熟したホスファターゼ・ペプチドまたはプロ・タンパク質シーケンスの精製のために、シーケンスまたはシーケンスを含んだ。
【0050】
タンパク質/ペプチド 使用s
本発明のタンパク質/ペプチドの使用例が、図に示される機能情報に関連した相当で特定の分析評価において使われる;抗体を上げるか、もう一つの免疫反応を引き出すこと;分析法の中の試薬(ラベルをつけられた試薬を含むこと)が生物学的流体において量的にタンパク質(またはその結合するパートナーまたはリガンド)のレベルを決定するために設計したので;そして、対応するタンパク質が優先して表される(構成的にまたは組織分化または発展のまたは病気での特定のステージで州の)組織のための目印として。タンパク質が結合するか、もう一つのタンパク質またはリガンド(例えば(たとえば)ホスファターゼ−effectorタンパク質相互作用またはホスファターゼ−ligand相互作用の中の)に潜在的に結合する所で、タンパク質は結合する相互作用の抑制剤を確認するためにシステムを開発するために結合するパートナー/リガンドを確認するのに用いられることができる。何でもまたはこれらの使用の全ては、商品として商業化のために試薬等級またはキット・形態へ発達することができる。
【0051】
上でリストされる使用を実行する方法は、当該分野に熟練したそれらに有名である。そのような方法を明らかにしているリファレンスは、含む「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」2d ed、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds.,、そして、「Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques」、Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987。
【0052】
本発明のペプチドの潜在的な使用は、主に種/タンパク質の作用と同様にタンパク質の源に基づく。たとえば、人間と彼らの人間の/哺乳類のオルトログsから分離されるホスファターゼは、特に細胞の中の生物学的であるか病理学的反応またはホスファターゼを表す組織を調整することでの哺乳類の治療的なアプリケーション(例えば人間の薬)のために、試薬の身元を確認することの目標として用いられる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1が人間のすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型は、胎児の脳において発現する。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。
【0053】
それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺での発現を示す。ホスファターゼ・タンパク質(MAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族(発明の背景を見る)の特にメンバー)の活動を調整する医薬試薬の大きいパーセンテージは、開発されてある。特に図1で提供される発現情報と結合して、Backgroundで提供される構造上で機能情報と図は特定で相当な使用を本発明の分子のために用意する。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。そのような使用はここで提供される情報を使って、すぐに決定されることができる。そして、あるそれが当該分野とルーチン実験で知られている。
【0054】
本発明(本発明の前に明らかにされたかもしれない変形と断片を含むこと)のタンパク質は、MAPキナーゼ・ホスファターゼ亜族のメンバーと関連があるホスファターゼに関連した生物学的分析評価に役立つ。そのような分析評価は、既知のホスファターゼ機能または活動の何でもまたは診断と、特にホスファターゼを表す細胞と組織において、本発明の一つが属しているホスファターゼの亜族に特有であるホスファターゼに関連した状況の治療に役立つ資産を含む。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。
【0055】
本発明のタンパク質は、また、細胞ベースであるか細胞のないシステムでは、分析評価を隠している薬に役立つ。細胞ベースのシステムは、生検としての土地の人(すなわち通常ホスファターゼを表す細胞)でありえるか、細胞培養において広がった。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。交互の具体例で、細胞ベースの分析法は、ホスファターゼ・タンパク質を表している組み換え宿主細胞を含む。
【0056】
ポリペプチドは、その自然の州でのタンパク質または特異的疾患を引き起こす変えられた形式のホスファターゼ活動またはホスファターゼと関連する病理学を調整する合成物を確認するのに用いられることができる。本発明と適切な変形のホスファターゼと断片が、ホスファターゼに結合する能力のために、候補合成物を分析するために高いスループット・スクリーンにおいて使われることができる。これらの合成物は、ホスファターゼ活動に関して合成物の影響を決定するために機能ホスファターゼに対してさらにふるいにかけられることができる。
【0057】
さらに、これらの合成物は、活動/効果を決定するために動物であるか背骨のないシステムにおいてテストされることができる。合成物は確認されることができる。そして、それは起動させる(作動筋)か、ホスファターゼを機能させない(敵対者)要求された程度。さらに、本発明のタンパク質は、ホスファターゼ・タンパク質の間で刺激するか、相互作用を禁ずる能力と通常ホスファターゼ・タンパク質(例えば基質またはホスファターゼ・タンパク質が通常相互に作用する(たとえばもう一つのホスファターゼ)信号の経路の構成要素)と相互に作用する分子のために合成物をふるいにかけるのに用いられることができる。そのような分析評価は、概して、目標分子と相互に作用するために、ホスファターゼ・タンパク質を許す状況または断片の下でホスファターゼ・タンパク質を候補合成物と組み合わせるステップを含む、そして、タンパク質と目標の間の複合体の形成見つける‖またはホスファターゼ・タンパク質と、信号形質導入(例えばタンパク質リン酸化、サイクリックアデニル酸取引高とadenylateなシクラーゼ起動、その他)の関連する影響の何のようなでも、目標に対する相互作用の生化学結果見つける‖
【0058】
たとえば、候補合成物は、1)を含む)ランダムなペプチドライブラリーのIg尾のある融合ペプチドとメンバーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド(例えば、Lam et al., Nature 354:82−84 (1991); Houghten et al., Nature 354:84−86 (1991)参照)、そして、D−でできている組合せの化学から派生した分子のライブラリーやL−構成アミノ酸、2)phosphoペプチド(例えば、偶然と部分的に退化したもの(誘導されたphosphoペプチドライブラリー)のメンバー(Songyang et al., Cell 72:767−778 (1993)参照)、3)抗体(例えばFab、F(ab´)2、Fab発現ライブラリー断片と抗体のエピトープ−結合断片と同様に多クローン性で、単クローンで、人間らしくされて、反イディオタイプで、仮想的でシングルの鎖抗体);そして、4)小さい有機質で非有機的な分子(例えば組合せのおよび天産物ライブラリーから得られる分子)。
【0059】
1つの候補合成物は、結合している基質を争うレセプターの溶ける断片である。他の候補合成物は、変異体ホスファターゼを含んで、ホスファターゼ機能に影響を及ぼす突然変異を含んでいる断片をあてて、このように基質を争う。したがって、より高い類似性による例または基質を結びつけるが、リリースを許さない断片のために、基質を争う断片は、発明に取り囲まれている。
【0060】
発明は、ホスファターゼ活動を調整する(刺激するか、禁ずる)合成物を確認するために他の末端分析評価を更に含む。ホスファターゼ活動を示す信号の形質導入経路で、分析評価は概してイベントの分析評価を必要とする。このように、基質の脱リン酸化、タンパク質の起動、up−であるか、応えて刺激に対する反応が弱まった遺伝子の発現の変化、依存しているホスファターゼ・タンパク質は、滝が分析されることができると合図する。
【0061】
ホスファターゼによって調整される生物学的であるか生化学機能の何でも、エンドポイント分析評価として使われることができる。これらは、これらのエンドポイント分析評価目標のためにリファレンスによってここで引用されるリファレンスに取り入れられて、ここで記述される生化学biochemical/biologicalイベントの全てを含む、そして、当該分野またはそれの普通の技術のそれらに知られている他の機能は図(特に図2)に示される情報を使って、すぐに確認されることができる。具体的には、細胞の生物学的機能またはホスファターゼを表す組織は、分析されることができる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。
【0062】
合成物を結びつけておよび/または起動させることはまた、仮想的なホスファターゼ・タンパク質を用いて中で隠されることができる、そしてそれはアミンの末期の細胞外領域またはその部分(7つの膜内外部分であるか少しも細胞内であるか細胞外ループの何のようなでも全ての膜内外領域または小区域)、そして、カルボキシ、ターミナルの細胞内領域またはその部品は非相同的な領域または小区域と取り替えられることができる。たとえば、異なる基質と相互に作用する基質結合部位が使われることができる、そして、あるそれは天然のホスファターゼによって誓約書を出した。したがって、信号の形質導入構成要素の異なる集合は、起動の末端検査法として使われる。これは、分析評価がホスファターゼが誘導される特定の宿主細胞以外の中で実行されるのを許す。
【0063】
本発明のタンパク質は、また、設計される方法において分析評価にホスファターゼ(例えば結合するパートナーやリガンド)と相互に作用する合成物を発見する義務を負わせている競争に役立つ。このように、合成物を結合するか、さもなければポリペプチドと相互に作用させる状況の下で、合成物はホスファターゼ・ポリペプチドにさらされる。可溶性ホスファターゼ・ポリペプチドは、また、混合に加えられる。テスト合成物が可溶性ホスファターゼ・ポリペプチドと相互に作用するならば、それはホスファターゼ目標から形成される複合体の量または活動を減少させる。この種の分析評価は、特にホスファターゼの特定の部位と相互に作用する合成物が捜される事例に役立つ。このように、目標ホスファターゼ部位と争う可溶性ポリペプチドは、重要な部位と一致しているペプチド・シーケンスを含むようになっている。
【0064】
それが時々固定する好ましいものでもあって、無料の薬上映が分析する細胞を実行するためにホスファターゼ・タンパク質または断片、あるいは、オートメーションを適応させるために分析評価であるのと、同じくらいよく、タンパク質の一方または両方のuncomplexedされた種類から、複合体の分離を容易にするその目標分子。
【0065】
マトリックスでタンパク質を固定することのテクニックが、分析評価を隠している薬において使われることができる。1つの具体例で、タンパク質をマトリックスに束縛されさせる領域を加える融合タンパク質は、提供されることができる。たとえば、グルタチオン−S転移酵素融合タンパク質はグルタチオンsepharoseビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)の上へ吸着されることができる、あるいは、グルタチオンはmicrotitreプレート(それはそれから一体化物(例えば、35S−labeledされた)と候補が混ぜ合わせる細胞と組み合わせられる)をderivatizedした、そして、混合は複雑な形成(例えば、塩とpHの生理的条件で)に貢献する状況の下で卵を抱いた。インキュベーションの後で、ビーズはどんな束縛を解かれたラベルでも削除するために洗われる、そして、固定されるマトリックスと複合体の後、上澄みでか直接決定される識別用放射性同位元素は解離される。あるいは、複合体はマトリックスから解離されることができる。そして、標準のelectrophoreticなテクニックを使用しているゲルから量をはかられるビーズ分数において見つかるホスファターゼ−結合タンパク質のSDS−PAGEとレベルで切り離される。たとえば、ポリペプチドかその目標分子は、ビオチンの活用とテクニックを当該分野において有名に扱っているstreptavidinを利用して固定されることができる。あるいは、どちらがその目標分子にタンパク質の結合することを妨げないか、タンパク質で反動的な抗体がプレートの源にderivatizedされることができる、そして、タンパク質は抗体活用によって井戸でトラップをとりつけた。ホスファターゼ−結合タンパク質と候補合成物の準備は井戸をタンパク質−presentingしているホスファターゼにおいて暖められる、そして、井戸で閉じ込められる複合体の量は量をはかられることができる。GST−固定された複合体のためのそれらの記述された上記に加えて、そのような複合体を見つける方法は抗体をホスファターゼ・タンパク質目標分子で反動的に扱っている複合体のimmunodetectionを含む、あるいは、ホスファターゼ・タンパク質で反動的で、目標分子(目標分子と関連する酵素の活動を見つけることに頼る酵素にリンクされた分析評価と同様に)と争う。
【0066】
本発明のホスファターゼのうちの1つを調整する試薬は、単独であるいは、組合せで、上記の分析評価のうちの1つ以上を使って身元を確認されることができる。一般に最初に細胞−ベースの細胞無料のシステムを使用して、それから動物または他のモデル・システムにおいて活動を確かめることが、好ましい。そのようなモデル・システムは、当該分野において有名で、この文脈において、すぐに使用されることができる。
【0067】
分析評価を隠しているこれらの薬によって確認されるホスファターゼ・タンパク質活動のモジュレータは、ホスファターゼを表す細胞または組織を扱うことによって、キナーゼ経路のそばで調整される障害で、主題を扱うのに用いられることができる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。処置のこれらの方法はそのような処置を必要とする主題に、製薬構成でホスファターゼ活動のモジュレータを管理するステップを含む。そして、ここで述べられるように、モジュレータが確認される。
【0068】
発明のまだもう一つの面には、ホスファターゼ・タンパク質が2−ハイブリッド分析評価または3−ハイブリッド分析評価において「餌タンパク質」として使われることができること(例えば、U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223−232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046−12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920−924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693−1696; and Brent WO94/10300参照)、結合して、ホスファターゼを相互に作用して、ホスファターゼ活動に関係している他のタンパク質を確認するために)。そのようなホスファターゼ−結合タンパク質は、また、たとえば、キナーゼによって媒介される合図している経路の要素として、ホスファターゼ・タンパク質またはホスファターゼ目標によって信号の普及に下流に関係していそうである。あるいは、そのようなホスファターゼ−結合タンパク質は、ホスファターゼ抑制剤でありそうである。
【0069】
2−ハイブリッド・システムは大部分の転写要因のモジュール式の性質に基づく。そして、それは分離できるDNA結合するおよび起動領域から成る。手短に言うと、分析評価は2つの異なるDNA構成概念を利用する。1つの構成概念において、それがホスファターゼ・タンパク質のためにコード化する遺伝子は、既知の転写要因(例えばGAL−4)の領域を結びつけているDNAをコード化している遺伝子に一体化される。DNAシーケンスのライブラリーからの他の構造物(DNAシーケンス)の中の、それが未確認のタンパク質(「餌食」または「サンプル」)をコード化すること既知の転写の起動領域のためのコードが因数に分解する遺伝子に溶かす。「餌」と「餌食」タンパク質が相互に作用することができるならば、生体内に、ホスファターゼに依存する複合体を形成して、転写要因のDNA結合するおよび起動領域は近い近接に持ってこられる。この近接は、operablyに転写要因に反応する転写規定するサイトにリンクされるリポーター遺伝子(例えばLacZ)の転写を許す。リポーター遺伝子の発現は見つけられることができる、そして、機能転写要因を含んでいる細胞植民地は孤立することができて、ホスファターゼ・タンパク質と相互に作用するタンパク質をコード化するクローンをつくられた遺伝子を得るのに用いられることができる。
【0070】
この発明は、さらに上記の審査分析評価によって身元を確認される新しい試薬に付随する。したがって、適当な動物のモデルでここで述べられるように、さらに身元を確認される試薬を使用することは、この発明の範囲内である。たとえば、ここで記述され(例えばホスファターゼ−modulatingしている試薬、アンチセンスのホスファターゼ核酸分子、ホスファターゼに特有の抗体またはホスファターゼ−結合パートナー)て、同じになられる試薬が、そのような試薬と有効性を決定する動物であるか他のモデル、毒性または処置の副作用において使われることができる。あるいは、ここで記述されて、同じになられる試薬が、そのような試薬の働きのメカニズムを決定するために動物または他のモデルで使われることができる。さらに、ここで述べられるように、この発明は処置の上記の審査検査法によって身元を確認される新しい試薬の利用に付随する。
【0071】
本発明のホスファターゼ・タンパク質はまた、目標を病気を診断するために提供するために役に立つ、あるいは、病気に対する素因はペプチドによって調整した。したがって、発明は存在またはレベルを見つけることのための方法(細胞の中のタンパク質(またはmRNAをコード化すること))に組織または有機体を提供する。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。方法は、相互作用があることがありえるようなものは見つけたホスファターゼ・タンパク質と相互に作用することができる合成物で生物学的サンプルに連絡することを含む。そのような分析評価は、一つの発見形態または複数の発見形態(例えば抗体チップ配列)で提供されることができる。
【0072】
サンプルでタンパク質を見つけるための1つの薬品は、タンパク質に選択的に結合することができる抗体である。生物学的サンプルは、主題の範囲内で組織、細胞と流体プレゼントと同様に組織(主題から分離される細胞と生物学的流体)を含む。
【0073】
異なるペプチドを持っている患者、特に活動と現在のものがふさわしいタンパク質のファミリーの他のメンバーに知られている状況には、本発明のペプチドも、活発なタンパク質活動を診断することの目標、病気または病気に対する素因を提供する。このように、ペプチドは生物学的サンプルから分離されることができて、異常なペプチドに終わる遺伝子突然変異の存在のために分析されることができる。これは、アミノ酸代用、削除、挿入(再配置)(異常な継いでいるイベントの結果として)を含む、そして、不適当な翻訳後の修正。分析的方法は変えられたelectrophoreticな機動性(変えられたtrypticなペプチド・概要)を含む。そして、タンパク質に突然変異を認めて、細胞ベースであるか細胞のない分析法、基質または抗体−結合パターンでの変更、変えられた等電点、直接のアミノ酸性の配列と役に立つ既知の分析評価テクニックの他のものでホスファターゼ活動を変えられる。そのような分析評価は、一つの発見形態または複数の発見形態(例えば抗体チップ配列)で提供されることができる。
【0074】
ペプチドの探知の試験管内のテクニックは酵素結ばれた免疫吸着剤分析評価(ELISAs)を含む。そして、西洋のしみ、免疫沈降と免疫蛍光検査法が発見試薬(例えば試薬を結びつけている抗体またはタンパク質)を使う。あるいは、ペプチドは生体内にラベルをつけられた反ペプチド抗体を主題にもたらすことによる主題または他の種類の発見試薬に認められることができる。抗体が放射性の目印でラベルをつけられることができて、たとえば、被験者の中の存在と場所は、標準のイメージング・テクニックによって見つけられて、誰のものでありえる。主語で表されるペプチドの対立変種を見つける方法とサンプルでペプチドの断片を見つける方法は、特に役に立つ。
【0075】
ペプチドは、また、pharmacogenomicな分析に役立つ。Pharmacogenomicsは、影響を受ける人において変えられた薬性質と異常な行動のために薬に対するレスポンスにおける臨床的に重要な遺伝変化を扱う。例えばEichelbaum, M. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10−11):983−985 (1996)), Linder, M.W. (Clin. Chem. 43(2):254−266 (1997))参照。これらのバリエーションの臨床結果は、代謝における個々の変化の結果として特定の個人において特定の個人の中の治療的な薬の厳しい毒性または薬の治療的な失敗に終わる。このように、個人の遺伝子型は、治療的な合成物が体または体が合成物を新陳代謝させる方法に従って行動する方法を決定することができる。さらに、酵素を新陳代謝させている薬の活動は、強度と薬アクションの継続をもたらす。このように、個人のpharmacogenomicsは、個人の遺伝子型に基づく予防であるか治療的な処置のために、効果的合成物の選択とそのような合成物の効果的投薬を許す。酵素を新陳代謝させている若干の薬の中の遺伝子の多形性の発見は、一部の患者が期待される薬効果を得ないか、誇張された薬効果を示さないか、標準の薬投薬から重大な毒性を経験しない理由を説明した。多形性は、広範囲なmetabolizerの発現型と貧しいmetabolizerの発現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、1人の住民の中のホスファターゼ機能のうちの1つ以上がもう一人の住民においてそれらと異なるホスファターゼ・タンパク質の対立なタンパク質変形に至るかもしれない。ペプチドは、このように目標を処置様相に影響を及ぼすことができる遺伝子の傾向を確かめさせる。このように、リガンドに基づく処置において、多形性は基質結合とホスファターゼ起動において多少活発であるアミンのターミナルの細胞外領域や他の基質結合部位を引き起こすかもしれない。したがって、基質投薬は、多形性を含んでいる与えられた人口の範囲内で、治療的な影響を最大にするために必然的に修正される。genotypingすることに代わるものとして、特定の多形態のペプチドは、確認されることができた。
【0076】
ペプチドは、また、不在によって特徴づけられる障害を治療することに役立つか、不適当であるか不必要なタンパク質の発現である。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。したがって、処置のための方法は、ホスファターゼ・タンパク質または断片の使用を含む。
【0077】
Antibodies
本発明は、本発明のペプチド、そのようなペプチドを含んでいるタンパク質、それらの変形と断片に、選択的に結合する抗体を提供する。ここで使われるように、それが目標ペプチドを結びつけて、無関係なタンパク質にかなり縛らないとき、抗体は選択的に目標ペプチドを結びつける。そのようなタンパク質が断片による相同性または抗体のペプチド標的の領域を共有する限り、たとえ目標ペプチドでかなり相応しない他のタンパク質に、それも結合するとしても、抗体は選択的にペプチドを結びつけるとさらに考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体が交差反応性のある程度にもかかわらずさらに選択的であると思われる。
【0078】
ここで使われるように、抗体は当該分野の範囲内で認められるそれと一致している語で定義される:彼らは、抗原挑戦に応じて哺乳類の有機体によって生産されるマルチ・サブユニット・タンパク質である。本発明の抗体はFabまたはF(ab´)2を含むがこれに限らず多クローン性抗体と単クローン性抗体(そのような抗体の断片と同様に)を含む、そして、Fvはバラバラになる。
多くの方法は、与えられた目標ペプチドに対する抗体を生成しておよび/または確認することに知られている。そのような方法がHarlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, (1989)にいくつか記述されている。
【0079】
一般に、抗体を生成するために、単離したペプチドが、免疫原として使われて、哺乳類の有機体(例えばネズミ、ウサギまたはマウス)に与えられる。全身のタンパク質、抗原性ペプチド断片または融合タンパク質が、使われることができる。特に重要な断片は、それらがタンパク質配置方法を使用して、すぐに確認されることができるそれらのような機能領域(例えば図2で確認される領域とファミリーの間のシーケンス相同性または分岐の領域)をカバーすることである、そして、図に示す。
【0080】
抗体は、部位またはホスファターゼ・タンパク質の離散的な断片から望ましくは準備される。ここで述べられるように、抗体はペプチドのどんな部位からでも準備されることができる。しかし、好ましい部位は、機能/活動やホスファターゼ/結合パートナー相互作用に関係しているそれらを含む。シーケンス配置が節約されてユニークなシーケンス断片を確認するのに用いられることができる間、図2は特に重要な部位を確認するのに用いられることができる。
【0081】
抗原性断片は、概して少なくとも8つの隣接するアミノ酸残基から成る。抗原性ペプチドは、しかし少なくとも10の、12の、14の、16の以上アミノ酸残基から成ることができる。そのような断片は物理的な資産の上で選ばれることができる。そして、断片は、例えば、タンパク質の表面にある部位と一致する親水性の部位、あるいは、シーケンス・ユニークさ(図2参照)に基づいて選ぶことができる。
【0082】
本発明の抗体の発見は、抗体を見つけられる物質に結びつける(すなわち、身体的につながっている)ことによって容易にされることができる。見つけられる物質の例は、いろいろな酵素、補綴のグループ、蛍光性の材料、発光の材料、bioluminescentな材料と放射性物質を含む。適当な酵素の例は、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、b−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む;適当な補綴のグループ複合体の例は、streptavidin/ビオチンとavidin/biotinを含む;適当な蛍光性の材料の例は、umbelliferone、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、dichlorotriazinylamineフルオレセイン、dansyl塩化物またはフィコエリトリンを含む;発光の材料の例は、ルミノールを含む;bioluminescentな材料の例は発光酵素、ルシフェリンとエクオリンを含む、そして、適当な放射性物質の例は125I、131I、35Sまたは3Hを含む。
【0083】
Antibody 使用s
抗体が使われることができる抗体使用sは、標準のテクニック(例えば類似性クロマトグラフィまたは免疫沈降)によって、本発明のタンパク質のうちの1つを孤立させる。
【0084】
抗体は、細胞からの自然のタンパク質の精製を容易にすることができて、組換え的に宿主細胞で表されるタンパク質を生産した。それに加えて、そのような抗体は、有機体のいろいろな組織の中で、そして、通常の発展のコースの上にタンパク質の発現のパターンを決定するために細胞または組織において本発明のタンパク質のうちの1つの存在を見つけるために役に立つ。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。さらに、そのような抗体は、多量と発現のパターンを評価するために、vitroで、situでまたは細胞一体化物または上澄みでタンパク質を認めるのに用いられることができる。また、そのような抗体は、発展または生物学的状態の進行の間、異常な組織配布または異常な発現を評価するのに用いられることができる。全長タンパク質の断片を回すことの抗体探知は、取引高を確認するのに用いられることができる。
【0085】
さらに、抗体は病気の活発な段階に例えば病気州の発現を評価するのに用いられることができるか、個人において傾向で病気の方へタンパク質の機能に関連があった。障害が不適当な組織配布、発達上の発現、タンパク質の発現のレベルまたは表された/処理された形式に起因するとき、抗体は通常のタンパク質に対して準備されることができる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。障害がタンパク質において特定の突然変異によって特徴づけられるならば、この変異体タンパク質に固有な抗体が特定の変異体タンパク質の存在のために、分析評価に使われることができる。
【0086】
抗体は、また、有機体のいろいろな組織において、細胞の通常で異常な亜細胞性の局地化を評価するのに用いられることができる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。遺伝子のテストだけでなくおいて処置様相をモニターする際にも、診断上の使用は、適用されることができる。
【0087】
したがって、処置が最終的にあるところは発現レベルまたは異常なシーケンスと異常な組織配布の存在を修正することを目指した、あるいは、発達上の発現、タンパク質に向けられる抗体または関連した断片は治療的な有効性をモニターするのに用いられることができる。
その上、抗体はpharmacogenomicな分析に役立つ。このように、多形態のタンパク質に対して準備される抗体は、修正された処置様相を必要とする個人の身元を確認するのに用いられることができる。抗体は、また、electrophoreticな機動性、等電点、trypticなペプチド・概要と当該分野においてそれらに知られている他の物理的な分析評価によって分析される異常なタンパク質のために、免疫学の目印として診断上のツールとして有効である。
【0088】
抗体は、また、組織適合試験に役立つ。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。このように、特定のタンパク質が特定のティッシュの発現と相関していた所で、このタンパク質に特有である抗体は組織タイプを確認するのに用いられることができる。
【0089】
抗体はまた、たとえば、タンパク質機能を禁ずることに役立つ。そして、基質のような結合するパートナーに、ホスファターゼ・ペプチドの結合を妨げる。処置がタンパク質の機能を禁ずることを含む治療的な前後関係において、これらの使用は、また、適用されることができる。たとえば、抗体が結合しているブロックに使われることができる。そして、このようにペプチド活動を調整する(苦しませるか、敵対している)。抗体は、機能のために必要なサイトを含んでいる特定の断片に対してまたは細胞または細胞膜と関係している無傷のタンパク質に対して準備されることができる。本発明のタンパク質に関して、構造上の情報については図2を参照。
【0090】
発明も、生物学的サンプルでタンパク質の存在を見つけるために抗体を使うためにキットを含む。キットは、生物学的サンプルでタンパク質を見つけるためにラベルをつけられるかlabelableな抗体と合成物のような抗体または試薬から成ることができる;サンプルでタンパク質の量を決定するための手段;標準でサンプルでタンパク質の量を比較するための手段;そして、使用のための指示。そのようなキットは、一つのタンパク質またはエピトープを見つけるために供給されることができるか、抗体発見配列でエピトープの多数のうちの1つを見つけるために設定されることができる。配列はnuleicな酸性の配列のためにの下で詳述する、そして、類似した方法は抗体配列のために開発された。
【0091】
本発明がさらに提供する核のAcid Moleculesは、本発明(cDNA、転写とゲノム・シーケンス)のホスファターゼ・ペプチドまたはタンパク質をコード化する核酸分子を孤立させた。
【0092】
Nucleic Acid Molecules
そのような核酸分子は、本発明、その対立変種またはオルトログのホスファターゼ・ペプチドのうちの1つをコード化するヌクレオチド配列から成るか、本質的に成るか、成る、あるいは、そのパラログ。
【0093】
ここで使われるように、「単離した」核酸分子は核酸の自然な源で、他の核酸プレゼントから切り離されるものである。望ましくは、「単離した」核酸は、当然核酸の側面に位置するシーケンスと縁がない(シーケンスが居住を定めて、すなわちで5』、そして、3』核酸の終わり)核酸が誘導される有機体のゲノムDNAで。しかし、およそ5KB、4KB、3KB、2KBまたは特に1KB以下までの例のために、側面を接している若干のヌクレオチド配列が、あることがありえる同じ遺伝子の範囲内でシーケンスをコード化しているシーケンスとペプチドをコード化している隣接するペプチド・ゲノム・シーケンスでイントロンによって分かれた。重要な点は核酸がそれが特定の操作を受けることができるようなものは組み換え発現、調査の準備と下塗りのようなここで記述した遠くて重要でない側面を接しているシーケンスから分離されるということである、そして、他はシーケンスを核酸に特有に扱う。
【0094】
さらに、組み換えテクニックまたは化学前駆者または他化学製品によって生じられるとき、化学的に、総合されるとき、「単離した」核酸分子(例えば転写/cDNA分子)は他の細胞材料または文化媒体でかなり自由でありえる。しかし、核酸分子は、他のコーディングまたは規定するシーケンスに一体化されることができて、孤立してまだ考慮されることができる。
たとえば、ベクターに含まれる組み換えDNA分子は、孤立して考慮される。単離したDNA分子の更なる例は、非相同的な宿主細胞で維持される組み換えDNA分子を含むか、解決でDNA分子を精製した(部分的にまたはかなり)。単離したRNA分子は、本発明の単離したDNA分子の写しを活発であるか試験管内のRNAで含む。本発明に従う単離した核酸分子は、合成的に生産されるそのような分子を更に含む。
【0095】
したがって、本発明は、図1または3 [ SEQ ID NOS:1,4,6(cDNAシーケンス)とSEQは、NO:3(ゲノム・シーケンス)の身元を確認する]において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子または図2(SEQ ID NOS:2,5,7)で提供されるタンパク質をコード化するどんな核酸分子でも提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【0096】
本発明は、さらに本質的に図1または3 [ SEQ ID NOS:1,4,6(cDNAシーケンス)とSEQは、NO:3(ゲノム・シーケンス)の身元を確認する]において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子または図2(SEQ ID NOS:2,5,7)で提供されるタンパク質をコード化するどんな核酸分子でも提供する。そのようなヌクレオチド配列が最終的な核酸分子においてほんの少しの更なる核酸残りだけで存在するとき、核酸分子は本質的にヌクレオチド配列から成る。
【0097】
本発明は、さらに図1または3 [ SEQ ID NOS:1,4,6(cDNAシーケンス)とSEQは、NO:3(ゲノム・シーケンス)の身元を確認する]において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子または図2(SEQ ID NOS:2,5,7)で提供されるタンパク質をコード化するどんな核酸分子でも提供する。ヌクレオチド配列が少なくとも核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の部分であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。そのようなやり方では、核酸分子は、ヌクレオチド配列だけであることができるか、更なる核酸残り(例えばそれまたは非相同的なヌクレオチド配列と自然に関係している核酸残り)を持つことができる。そのような核酸分子は更なる2、3のヌクレオチドを持つことができる、あるいは、缶は数百またはより更なるヌクレオチドから成る。いろいろな種類のこれらの核酸分子がすぐに作られることができて/孤立することができる方法の概要は、下で提供される。
【0098】
図1と3において、コーディングと非コーディング・シーケンスは、提供される。本発明、人間ゲノム・シーケンス(図3)とcDNA/転写・シーケンス(図1)の源のため、図の中の核酸分子はゲノムintronicなシーケンス(5)を含む』、そして、3』非コーディング・シーケンス、遺伝子規定する部位、そして、非コーディングintergenicなシーケンス。一般に、そのようなシーケンス機能は、図1と3において有名であるか、当該分野において知られている計算のツールを使用して、すぐに確認されることができる。
【0099】
下で議論されるように、非コーディング部位(プロモーターのような特に遺伝子規定する要素)の一部はいろいろな目的(例えば非相同的な遺伝子発現の制御、合成物を調整している遺伝子活動を確認することの目標)に役立って、特にここで提供されるゲノム・シーケンスの断片として主張される。
【0100】
単離した核酸分子は、成熟したペプチド(たとえば、成熟した形式が複数のペプチド・チェーンを持つとき)に、付加的なアミノであるかカルボキシル−ターミナル・アミノ酸またはアミノ酸内部をプラスして成熟したタンパク質をコード化することができる。そのようなシーケンスは、前駆者から成熟した形式へのタンパク質の処理で役割を果たすかもしれないか、取引しているタンパク質を促進するかもしれないか、長くするかもしれないか、タンパク質半減期を短くするかもしれないか、とりわけ、分析評価または生産のためにタンパク質の操作を容易にするかもしれない。一般に、原位置にケースであって、付加的なアミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質から離れて処理されるかもしれない。
【0101】
上で言及する、単離した核酸分子は、含む、しかし、制限する(単独でホスファターゼ・ペプチドをコード化しているシーケンス)成熟したペプチドをコード化しているシーケンス、そして、付加的なコーディング、更なる非コーディング・シーケンス(たとえばイントロンと非コーディング5)をプラスした更なるコーディング・シーケンスの有無にかかわらないリーダーまたは分泌腺シーケンス(例えば予めプロであるかプロのタンパク質シーケンス)(成熟したペプチドをコード化しているシーケンス)のような、シーケンス』、そして、3』例えば写されるシーケンス、しかし、転写、mRNA処理(継いでいるおよびポリアデニル化信号を含むこと)、結合しているリボソームとmRNAの安定性で役割を果たす非翻訳されたシーケンス。それに加えて、核酸分子は、目印シーケンス符号化(たとえば精製を容易にするペプチド)に一体化されるかもしれない。
【0102】
単離した核酸分子がRNA(例えばmRNA)の形でまたは形式DNAの中にあることがありえる。そして、クローニングによって得られるか、化学の合成のテクニックによってまたはその組合せによって生じられるcDNAとゲノムDNAを含む。核酸(特にDNA)は、二倍の要素をもつかシングルの要素をもつことがありえる。シングルの要素をもつ核酸は、コーディング岸(感覚岸)または非コーディング岸(アンチセンスの岸)でありえる。
【0103】
発明は、さらに上で記述される本発明のホスファターゼ・タンパク質の明らかな変形をコード化する核酸分子と同様に本発明のペプチドの断片をコード化する核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、対立変種(同じ場所)、パラログs(異なる場所)とオルトログs(異なる有機体)のような、自然に発生しているかもしれないか、組み換えDNA方法によってまたは化学の統合によって造られるかもしれない。そのような非自然に発生している変形は、核酸分子、細胞または有機体に適用されるそれらを含む突然変異生成テクニックによって作られるかもしれない。したがって、上で示したように、変形はヌクレオチド代用、削除、倒置と挿入を含むことができる。バリエーションは、両方ともかどちらででも起こることができるコーディング、そして、非コーディング部位。バリエーションは、保守的で非保守的なアミノ酸代用を生じることができる。
【0104】
本発明は、さらに図1と3に示される核酸分子の非コーディング断片を提供する。断片が含む、制限される非コーディングがそうする、プロモーターが配列する、エンハンサーが配列する、シーケンスと遺伝子終了を調整している遺伝子が配列する優先株。そのような断片は、遺伝子−変調している試薬の身元を確認するために非相同的な遺伝子発現を制御する際に、そして、発展中のスクリーンにおいて役立つ。プロモーターは、すぐに5であることと確認されることができる』、図3で提供されるゲノム・シーケンスでのサイトは、ATGに始まる。
【0105】
断片は、12以上のヌクレオチドより大きい隣接するヌクレオチド配列から成る。さらに、断片はそうすることができた長さでの少なくとも30か、40か、50か、100か、250か500ヌクレオチド。断片の長さは、その意図された使用に基づく。たとえば、断片はペプチドの部位を運んでいるエピトープをコード化することができるか、DNAプローブと下塗りとして有効でありえる。そのような断片は、オリゴヌクレオチド調査を総合するために既知のヌクレオチド配列を使って孤立することができる。ラベルをつけられた調査は、それからコーディング部位と一致している核酸を孤立させるためにcDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリーまたはmRNAを隠すのに用いられることができる。さらに、下塗りが遺伝子のクローン特定の部位に対するPCR反応において使われることができる。
【0106】
調査/下塗りは、かなり概して精製されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・ペアから成る。オリゴヌクレオチドは、概しておよそ12の、20の、25の、40の、50の以上連続的ヌクレオチドに、少なくとも厳しい状況の下で交雑するヌクレオチド配列の部位から成る。
【0107】
オルトログs、相同物と対立変種は、方法を当該分野において有名に扱って確認されることができる。ペプチド Sectionで記述されるように、これらの変形は概して60−70%であるか、70−80%であるか、80−90%であるか90−95%について概して少なくともより多くであるか図シートにおいて示されるヌクレオチド配列またはこのシーケンスの断片により相応するペプチドをコード化しているヌクレオチド配列から成る。そのような核酸分子は、すぐに、図シートにおいて示されるヌクレオチド配列またはシーケンスの断片にとって、穏やかにの下で厳しい状況に雑種を産むことができることと確認されることができる。対立変種は、コード化している遺伝子の遺伝子の場所のそばで、すぐに決定されることができる。本発明の新しいホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子は公共のBAC AP001885に置かれる。そして、それは染色体11(図3で示されるように)にマップされることを知られている。
【0108】
図3は、本発明のホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子において見つかったSNPsに関する情報を提供する。以下のSNPsは、確認された:G577A、G1451AとG2641A.G577AとG1451Aは、非同義のコーディングSNPsである。これらのSNPsに起因するシーケンスが示されるアミノ酸の中の変化図3、そして、リファレンスとして図2で提供される一般的な遺伝暗号とタンパク質シーケンスを使って、すぐに決定することができる。G2641Aは、3である』ORFの、そして、制御/規定する要素に影響を及ぼすかもしれない。
【0109】
ここで使われるように、語が「厳しい状況の下で雑種を産ん」で、概して互いに最少の相応する60−70%でペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が互いに雑種を作られるままである交雑と洗濯の条件を記述するつもりである。
状況は、少なくとも利用できるか、少なくとも70%についてまたは少なくとも利用できるかより互いに相応するそのようなそのシーケンスが概して80% 60%互いに雑種を作られるままであるということでありえる。そのような厳しい状況は、当該分野に熟練したそれらに知られていて、Molecular Biology、ジョン・ワイリー、N.Y.(1989)、6.3.1−6.3.6でCurrent Protocolsで見つかる。厳しい交雑状況の1つの例は、塩化物/45Cころにクエン酸(SSC)ナトリウムが0.2のX SSC(50−65Cの0.1%の特別割引販売)で、一つ以上の洗浄によって続いた6Xナトリウムの中の交雑である。低い厳しさ交雑状況への穏健派の例は、当該分野において有名である。
【0110】
Nucleic Acid Nolecule 使用s
本発明の核酸分子が役立つ使用sが徹底調査する核のAcid Molecule、下塗り、そして、生物学的分析法では、化学中間体。核酸分子はメッセンジャーRNAのために交雑調査として有効である。そして、転写/cDNAと図2で記述されるペプチドをコード化している全身のcDNAとゲノム・クローンを孤立させて、同じであるか関連したペプチドを生産している変形(対立遺伝子、オルトログs、その他)と一致するcDNAとゲノム・クローンを孤立させるゲノムDNAが図2で示される。図3で図示されるように、以下のSNPバリエーションは確認された:G577A、G1451AとG2641A.
調査は、図に示される核酸分子の全ての長さに沿って、どんなシーケンスでもと一致することができる。したがって、それは5に由来することができた』部位、コーディング部位と3 noncodingする』部位をnoncodingする。しかし、議論されるように、断片は本発明の前に明らかにされる断片を含むこととして解釈されることになっていない。
【0111】
核酸分子は、また、核酸分子のどんな与えられた部位でも拡大するPCRのための下塗りとして有効で、要求された長さとシーケンスのアンチセンスの分子を合成するために役に立つ。
核酸分子は、また、組み換えベクターを造ることに役立つ。ベクターが部分を表す発現ベクターを含むそれまたは全ての、ペプチド・シーケンス。ベクターも、挿入ベクター(遺伝子や遺伝子製品の元の位置の発現を変えるために、統合されてにもう一つの核酸分子シーケンスに例えば細胞ゲノムに使われる)を含む。たとえば、内部から発生するコーディング・シーケンスは、一つ以上の特に紹介された突然変異を含んでいるコーディング部位の全部または一部で、相応する組換えを通して取り替えられることができる。
【0112】
核酸分子は、また、タンパク質の抗原性部分を表すことに役立つ。
核酸分子は、また、原位置ハイブリッド形成方法によって核酸分子の染色体の位置を測定するために調査として有効である。本発明の新しいホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子は公共のBAC AP001885に置かれる。そして、それは染色体11(図3で示されるように)にマップされることを知られている。
核酸分子は、また、ベクターを本発明の核酸分子の遺伝子規定する部位を含んでいるようにすることに役立つ。
【0113】
核酸分子は、また、ここで記述される核酸分子から作り出されるmRNAの、全てまたは部分と一致しているribozymesを設計することに役立つ。
核酸分子は、また、ペプチドの、部分または全てを表すベクターを作ることに役立つ。
核酸分子は、また、核酸分子とペプチドの、部分または全てを表している宿主細胞を造ることに役立つ。
核酸分子は、また、核酸分子とペプチドの、全てまたは部分を表している遺伝子導入動物を造ることに役立つ。
【0114】
核酸分子は、また、存在を決定するための交雑調査、レベル、形式と核酸発現の配布として有効である。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。したがって、調査は存在を見つけるのに用いられることができるの、あるいは、レベルを決定するの(細胞の中の特定の核酸分子)、そして、有機体において、組織。レベルが決定される核酸は、DNAまたはRNAでありえる。したがって、ここで記述されるペプチドと一致している調査は、所定の細胞、組織または有機体において発現や遺伝子転写番号を評価するのに用いられることができる。これらの使用は、増加を含んでいる障害の診断のために関連するか、通常の結果と比較してホスファターゼ・タンパク質発現で減少する。mRNAの発見の試験管内のテクニックは、ノーザン交雑と原位置ハイブリッド形成を含む。見つけることのvitroテクニックでは、DNAは米国南部の人交雑と原位置ハイブリッド形成を含む。
【0115】
調査が、細胞を確認するための診断上のテスト・キットまたはホスファターゼ・タンパク質を表す組織の一部として、例えば主題、mRNAまたはゲノムDNAからの細胞のサンプルでのホスファターゼ−符号化核酸のレベルを測定するか、ホスファターゼ遺伝子が変化したかどうか決定することによって使われることができる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。
【0116】
核酸発現分析評価は、ホスファターゼ核酸発現を調整する合成物を確認するために薬審査に役立つ。
発明は、このように方法をホスファターゼ遺伝子の核酸発現と関連する障害を治療するのに用いられることができる合成物、細胞でホスファターゼによって調整される特に生物学的で病理学的プロセスとそれを表す組織を確認するために提供する。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。方法は、概してホスファターゼ核酸の発現を調整する合成物の能力を分析して、このように望まれていないホスファターゼ核酸発現によって特徴づけられる障害を治療するのに用いられることができる合成物を確認することを含む。
【0117】
分析評価は、細胞ベースで細胞のないシステムにおいて実行されることができる。細胞ベースの分析法は、特定の核酸シーケンスを表すために遺伝子工学によるホスファターゼ核酸または組み換え細胞を自然に表している細胞を含む。
【0118】
ホスファターゼ核酸発現のための分析評価は、核酸濃度(例えばmRNAレベル)のまたは信号の経路に関係している副次的な合成物の直接の分析評価を必要とすることができる。さらに、up−であるか、ホスファターゼ・タンパク質に反応した信号経路の刺激に対する反応を抑制した遺伝子の発現は、また、分析されることができる。この具体例で、これらの遺伝子の規定する部位は、operablyに発光酵素のようなリポーター遺伝子に結ばれることができる。
【0119】
このように、合成物とmRNAの現れが決定した候補と、細胞が連絡される方法において、ホスファターゼ遺伝子発現のモジュレータは、確認されることができる。候補合成物の面前でホスファターゼmRNAの現れのレベルは、候補合成物がない場合、ホスファターゼmRNAの現れのレベルと比較してある。
候補合成物が、それからこの比較に基づく核酸発現のモジュレータと確認されることができて、たとえば異常な核酸発現によって特徴づけられる障害を治療するために、使われることができる。mRNAの現れが統計学的に候補合成物の面前でその不在にはかなり大きいとき、候補合成物は核酸発現の刺激器と確認される。核酸発現が統計学的に候補合成物の面前でその不在にはかなり少ないとき、候補合成物は核酸発現の抑制剤と確認される。
【0120】
細胞のホスファターゼ核酸発現を調整するために遺伝子モジュレータとして薬審査を通して確認される合成物を使用して目標とホスファターゼを表す組織としての核酸で、発明はさらに処置の方法を提供する。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。変調は、両方の上に向かう正規である(すなわち起動またはagonization)か下の規則(抑制または対抗)または核酸発現を含む。
【0121】
あるいは、ホスファターゼ核酸発現のためのモジュレータは小さい分子でありえる、あるいは、薬または小さい分子が細胞のホスファターゼ核酸発現とタンパク質を表す組織を禁ずる限り、薬はここで記述される審査分析評価を使うことを確認した。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。
【0122】
核酸分子は、また、臨床試験でまたは処置養生法において発現の変調している合成物またはホスファターゼ遺伝子の活動の効果をモニターすることに役立つ。このように、特に患者が抵抗を開発することができる合成物で、遺伝子発現パターンは、合成物で処置の継続効果のためにバロメーターとして用いられることができる。遺伝子発現パターンは、また、合成物に影響を受ける細胞の生理的反応を示す目印として用いられることができる。したがって、そのようなモニタリングは、合成物の増加された管理か患者が抵抗するようにならなかった代わりの合成物の管理を許す。同じように、核酸発現のレベルが望ましいレベルの下で減少するならば、合成物の管理は同一基準で減少することができる。
【0123】
そして、特に病理学に至る質的な変化には、核酸分子は、また、ホスファターゼ核酸発現の質的な変化の診断上の検査法に役立つ。核酸分子は、ホスファターゼ遺伝子と遺伝子発現製品(例えばmRNA)に突然変異を認めるのに用いられることができる。核酸分子は、そして、ホスファターゼ遺伝子に自然に発生している遺伝子突然変異を認めるためにそれによって交雑調査として突然変異による主題が突然変異に起因する障害の危険があるかどうか決定するのに用いられることができる。突然変異は削除(追加)を含む、あるいは、異常なメチル化のような倒置または転位(ゲノムDNAの修正)のような遺伝子(染色体の再配置)の中の一つ以上のヌクレオチドの置換は遺伝子転写番号(例えば拡大)を作るか、変わる。病気がoverexpression(underexpression)から生じるか、ホスファターゼ・タンパク質の発現を変えたとき、機能不全と関連するホスファターゼ遺伝子の変化する形の探知は進行中の病気のための診断上の道具または病気に対する感染性を提供する。
【0124】
ホスファターゼ遺伝子において突然変異をもたらしている個人は、いろいろなテクニックによって核の酸性のレベルで見つけられることができる。図3は、本発明のホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子において見つかったSNPsに関する情報を提供する。以下のSNPsは、確認された:G577A、G1451AとG2641A.G577AとG1451Aは、非同義のコーディングSNPsである。これらのSNPsに起因するシーケンスが示されるアミノ酸の中の変化図3、そして、リファレンスとして図2で提供される一般的な遺伝暗号とタンパク質シーケンスを使って、すぐに決定することができる。G2641Aは、3である』ORFの、そして、制御/規定する要素に影響を及ぼすかもしれない。本発明の新しいホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子は公共のBAC AP001885に置かれる。そして、それは染色体11(図3で示されるように)にマップされることを知られている。ゲノムDNAは、直接分析されることができるか、分析の前にPCRを用いて拡大されることができる。RNAまたはcDNAが、同様に使われることができる。若干の用途には、突然変異の探知がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(わかる(例えばアメリカPatent数字4,683,195と4,683,202))、例えばアンカーPCRまたはRACE PCRでまたは、代わりに、くくること連鎖反応(LCR)において調査/下塗りの使用を必要とすること(例えば、Landegran et al., Science 241:1077−1080 (1988), Nakazawa et al., PNAS 91:360−364 (1994)参照。)、どちらが特に遺伝子(Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23:675−682 (1995)参照)に、点突発変異を認めることに役立つことがありえるか、後者。この方法は、忍耐強い、孤立させている核酸から、細胞のサンプルを集めるステップを含むことができる(例えばゲノム(mRNAまたは両方とも)サンプルの細胞から)特に状況の下で遺伝子に交雑する一つ以上の下塗りによる核酸サンプルを連絡するそのようなその交雑、そして、遺伝子(存在するならば)の拡大起こる、そして、拡大製品の有無を見つけて、拡大製品の寸法を見つけて、長さを制御サンプルと比較すること。削除と挿入は、通常の遺伝子型と比較して拡大された製品の寸法の変化によって見つけられることができる。点突発変異は、通常のRNAまたはアンチセンスのDNAシーケンスに拡大されたDNAの雑種を作ることによって確認されることができる。
【0125】
あるいは、たとえば、ホスファターゼ遺伝子の中の突然変異は、ゲル電気泳動によって決定される規制酵素消化パターンで、変更によって直接確認されることができる。
更なる、シーケンスに特有のribozymes(米国特許第5,498,531号)は、発展による特定の突然変異またはribozyme裂け目サイトの損失の存在のために得点するのに用いられることができる。完全にマッチされたシーケンスは、ヌクレアーゼ裂け目消化分析評価による組合せを誤られたシーケンスからまたは溶ける温度の違いによって特徴づけられることができる。
【0126】
特定の場所のシーケンス変化は、また、RNaseとS1保護または化学の裂け目方法のようなヌクレアーゼ保護分析評価によって評価されることができる。さらに、変異体ホスファターゼ遺伝子と野生のタイプ遺伝子のシーケンス違いは、直接のDNA配列によって決定されることができる。質量分析によって配列を含む診断上の分析評価(Naeve, C.W., (1995) Biotechniques 19:448)を実行するとき、いろいろなオートメーション化した配列手順は利用されることができる(例えば、PCT International Publication No. WO 94/16101; Cohen et al., Adv. Chromatogr. 36:127−162 (1996), and Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147−159 (1993)参照)。
【0127】
遺伝子に突然変異を認める他の方法は、裂け目試薬からの保護がRNA/RNAまたはRNA/DNAデュプレックス(Myers et al., Science 230:1242 (1985), Cotton et al., PNAS 85:4397 (1988), Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217:286−295 (1992))で組合せを誤られたベースを見つけるのに用いられる方法を含む、変異体と荒野のelectrophoreticな機動性は入力する。そして、核酸は比較される(Orita et al., PNAS 86:2766 (1989); Cotton et al., Mutat. Res. 285:125−144 (1993); and Hayashi et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73−79 (1992))、そして、変性剤の勾配を含んでいるポリアクリルアミドゲルの中の変異体または野生のタイプ断片の動きは、勾配ゲル電気泳動(Myers et al., Nature 313:495 (1985))の特性を奪うことを使って分析される。点突発変異を見つけることの他のテクニックの例は、選択的なオリゴヌクレオチド交雑、選択的な拡大と選択的な下塗り拡張を含む。
【0128】
核酸分子は、また、必ずしも病気を引き起こすというわけではないことはそれにもかかわらず処置様相に影響を及ぼすその間個人を遺伝子型を見つけるため検査することに役立つ。このように、核酸分子は、個人の遺伝子型の関係と処置(pharmacogenomicな関係)のために使われる合成物への個人の反応を研究するのに用いられることができる。したがって、ここで記述される核酸分子は、適当な合成物を選ぶために処置のために個人または投薬養生法においてホスファターゼ遺伝子の突然変異内容を評価するのに用いられることができる。図3は、本発明のホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子において見つかったSNPsに関する情報を提供する。以下のSNPsは、確認された:G577A、G1451AとG2641A.G577AとG1451Aは、非同義のコーディングSNPsである。これらのSNPsに起因するシーケンスが示されるアミノ酸の中の変化図3、そして、リファレンスとして図2で提供される一般的な遺伝暗号とタンパク質シーケンスを使って、すぐに決定することができる。G2641Aは、3である』ORFの、そして、制御/規定する要素に影響を及ぼすかもしれない。
【0129】
このように、処置に影響を及ぼす遺伝子のバリエーションを表示している核酸分子は、個人において処置を合わせるのに用いられることができる診断上の目標を提供する。したがって、組み換え細胞の生産とこれらの多形性を含んでいる動物は、処置合成物と投薬養生法の効果的臨床デザインを許す。
核酸分子は、このように細胞、組織と有機体のホスファターゼ遺伝子発現を制御するためにアンチセンスの構成概念として有効である。DNAアンチセンスの核酸分子は転写に関係している遺伝子の部位に相補的になっている。そして、転写とそれゆえに、ホスファターゼ・タンパク質の生産を防ぐ。アンチセンスのRNAまたはDNA核酸分子は、mRNAに雑種を産んで、このようにホスファターゼ・タンパク質にmRNAの翻訳を妨げる。
【0130】
あるいは、アンチセンスの分子の種は、ホスファターゼ核酸の発現を減少させるためにmRNAを機能させないことに慣れていることができる。
したがって、これらの分子は、異常であるか望まれていないホスファターゼ核酸発現によって特徴づけられる障害を治療することができる。このテクニックは、翻訳されるmRNAの能力を減らすmRNAで、一つ以上の部位に相補的なヌクレオチド配列を含んでいるribozymesによって、裂け目を含む。可能な部位は、ホスファターゼ・タンパク質(例えば結合している基質)の触媒作用で他の機能活動と一致しているコーディング部位と特にコーディング部位を含む。
【0131】
核酸分子も、ホスファターゼ遺伝子発現で異常である細胞を含んでいる患者において、ベクターを遺伝子治療のために用意する。
このように、組み換え細胞(それは活発に設計されたXであって、患者に戻った患者の細胞を含む)は、セルが個人を扱うために要求されたホスファターゼ・タンパク質を産する個人に導入される。
【0132】
発明も、生物学的サンプルでホスファターゼ核酸の存在を見つけるためにキットを含む。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のホスファターゼ・タンパク質のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。具体的には、仮想北のしみは、すい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫と卵巣腫瘍組織の発現を示す。それに加えて、パネルを隠しているPCRに基づく組織は、脳の発現を示す(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。たとえば、キットはラベルをつけられるかlabelableな核酸のような試薬または生物学的サンプルでホスファターゼ核酸を見つけることができる試薬から成ることができる;サンプルでホスファターゼ核酸の量を決定するための手段;そして、標準でサンプルでホスファターゼ核酸の量を比較するための手段。合成物または試薬は、適当な容器に詰められることができる。キットは、ホスファターゼ・タンパク質mRNAまたはDNAを見つけるためにキットを使用するために指示を更に含むことができる。
【0133】
Nucleic Acid Arrays
本発明がさらに核酸発見キット(例えば図1と3(SEQ ID NOS:1,3,4,6)に示されるシーケンス情報に基づく核酸分子の配列またはmicroarrays)に提供する核のAcid Arrays。
【0134】
ここで使われるように、「配列」または「Microarrays」は異なったポリヌクレオチドの配列または、紙、ナイロンまたは膜、フィルタ、チップ、ガラスのスライドまたは他のどの適当な強烈な支持もの他の種のような、基質の上で総合されるオリゴヌクレオチドに言及する。1つの具体例で、microarrayが準備されて、US Patent 5,837,832, Chee et al., PCT application W095/11995 (Chee et al.), Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675−1680) and Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614−10619)において記述される方法に一致して扱ったこと、そして、どちらがリファレンスによって彼らの全部でここで取り入れられるかすべてのもの。他の具体例で、そのような配列は、ブラウンほかによって記述される方法によって生じられる、米国特許5,807,522。
【0135】
microarrayまたは発見キットは望ましくは多数のユニークな、シングルの要素をもつ核酸シーケンス(通常合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドかcDNAsの断片)から成る。そして、強烈な支持に固定される。オリゴヌクレオチドは、望ましくは長さ(より望ましくは長さでの15−30のヌクレオチド)において、そして、最も望ましくは長さでの20−25のヌクレオチドのまわりに6−60のヌクレオチドのまわりにある。microarrayまたは発見キットの特定のタイプのために、長さでの7−20のヌクレオチドだけであるオリゴヌクレオチドを使うことが、好ましいかもしれない。microarrayまたは発見キットは、既知のものをカバーするオリゴヌクレオチドを含むかもしれない5』、あるいは、3』(シーケンス)全長シーケンスをカバーする連続したオリゴヌクレオチド;またはシーケンスに沿って特定部位から選ばれるユニークなオリゴヌクレオチド。microarrayまたは発見キットにおいて使われるポリヌクレオチドは、遺伝子または重要な遺伝子に特有であるオリゴヌクレオチドであるかもしれない。
【0136】
重要な(または本発明のcontigsから確認されるORF)gene(s)が概して始まるコンピュータ・アルゴリズムを使用することを調べられて、microarrayまたは発見キットのために、既知のシーケンスにオリゴヌクレオチドを生産するために5』、あるいは、で3』ヌクレオチド配列の終わり。典型的アルゴリズムは、それから遺伝子に特有である定義済みの長さのオリゴマーを確認して、交雑にふさわしい範囲の中のGC内容を持って、交雑を妨げるかもしれない予測された第二の構造が不足する。特定の状況には、microarrayまたは発見キットでオリゴヌクレオチドのペアを使うことは、適切かもしれない。シーケンスの中央に望ましくは位置する1つのヌクレオチドを除いて、「ペア」は同一である。ペア(1時までに組合せを誤られて)での第二のオリゴヌクレオチドは、制御として用いられる。オリゴヌクレオチド・ペアの数は、2から100万まで変動するかもしれない。オリゴマーは、光に誘導された化学のプロセスを使用している基質の上で、指定の部位で合成される。基質は、紙、ナイロンまたは膜、フィルタ、チップ、ガラスのスライドまたは他のどの適当な強烈な支持もの他の種であるかもしれない。
【0137】
もう一つの面には、オリゴヌクレオチドは化学の継手手順とインクジェット式のアプリケーション装置を用いて基質の表面で合成されるかもしれない。そして、そのことはPCT application W095/251116 (Baldeschweiler et al.)においてどちらがリファレンスによってその全部でここで取り入れられるかについて記述した。もう一つの面には、1ドットの(またはスロット)しみに類似している「グリッドを据えられた」配列は、掃除機システム、サーマル、UV、機械であるか化学の結束している手順を使用している基質の表面に配置して、cDNA断片またはオリゴヌクレオチドを結ぶのに用いられるかもしれない。配列(例えばそれらの記述された上記)は、手によってまたは利用できる装置(スロットしみまたは点しみ装置)、材料(どんな適当な強烈な支持でも)と機械(ロボット器具を含むこと)を用いて生じられるかもしれなくて、市販の計装の効率的利用の役に立つ2と一つの100万の間で8、24、96、384、1536、6144以上のオリゴヌクレオチドまたは他のどの数も含むかもしれない。
【0138】
サンプルを行うために、生物学的サンプルからmicroarrayまたは発見キット、RNAまたはDNAを使っている分析は、交雑調査になる。mRNAは孤立する、そして、cDNAが生じられて、アンチセンスのRNA(aRNA)を作るためにテンプレートとして使われる。aRNAは蛍光性のヌクレオチドの面前で拡大される、そして、調査シーケンスがmicroarrayまたは発見キットの相補的なオリゴヌクレオチドに交雑するように、ラベルをつけられた調査はmicroarrayまたは発見キットで暖められる。交雑が正確な相補的なマッチでまたはより少ない相補性のいろいろな程度で起こるように、インキュベーション状況は調節される。
【0139】
nonhybridizedされた調査の除去の後、スキャナはレベルと蛍光のパターンを決定するのに用いられる。調べられたイメージは、microarrayまたは発見キットで、相補性の程度と各々のオリゴヌクレオチド・シーケンスの相対的な多量を決定するために調べられる。生物学的サンプルは、どんな身体の流体(例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他)でも、洗練された細胞、生検または他の組織準備から得られるかもしれない。発見システムは、同時に異なったシーケンスの全てのために不在、存在と交雑の量を計るのに用いられるかもしれない。
【0140】
このデータが、サンプルの中でシーケンス、発現パターン、突然変異、変形または多形性の大規模な相互関係研究のために使われるかもしれない。
【0141】
そのような配列を使って、本発明は、本発明のホスファターゼタンパク質s/ペプチドsの現れを確認するために方法を提供する。詳細に、そのような方法は、一つ以上の核酸分子によるテスト・サンプルを暖めて、テスト・サンプルの範囲内で構成要素で核酸分子の結合のための含有率を示すことから成る。そのような分析評価は、概して多くの遺伝子を含んでいる配列を含む、どちらが本発明の遺伝子であるか、少なくとも1、そして、または本発明のホスファターゼ遺伝子の対立遺伝子。図3は、本発明のホスファターゼ・タンパク質をコード化している遺伝子において見つかったSNPsに関する情報を提供する。以下のSNPsは、確認された:G577A、G1451AとG2641A.G577AとG1451Aは、非同義のコーディングSNPsである。これらのSNPsに起因するシーケンスが示されるアミノ酸の中の変化図3、そして、リファレンスとして図2で提供される一般的な遺伝暗号とタンパク質シーケンスを使って、すぐに決定することができる。G2641Aは、3である』ORFの、そして、制御/規定する要素に影響を及ぼすかもしれない。
【0142】
テスト・サンプルで核酸分子を暖めることの条件は、変化する。インキュベーション状況は、分析評価、使用される発見方法とタイプにおいて使用される形態に依存する、そして、分析評価において使われる核酸分子の自然。
当該分野に熟練したものは、一般に利用できる交雑、拡大または配列分析評価形態のどんな一つでもすぐにここで明らかにされるHumanゲノムの新しい断片を使用するのに適していることがありえると認める。そのような分析評価の例が、Chard, T, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G. R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1 982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)からわかる。
【0143】
本発明のテスト・サンプルは、細胞(細胞のタンパク質または膜抜粋)を含む。上記の方法において使われるサンプルが変えるテストは分析評価形態、発見方法の性質と組織に基づいた。そして、細胞または抜粋が分析されるサンプルとして使われた。核酸抜粋を準備することのためであるか細胞の方法は、当該分野においてかなり知られてあって、すぐにあることができる利用されるシステムと互換性を持つサンプルを得るために適応させる。
【0144】
本発明のもう一つの実施例で、本発明の分析評価を行うために、必要な試薬を含むキットは、提供される。
具体的には、発明は、近い制限(成り立つ一つ以上の容器)で、受けるために区分されたキットを提供する:Humanゲノムの断片に結合することができる核酸分子のうちの1つを含んでいる最初の容器がここで明らかにした(a);そして、以下のうちの1つ以上を含んでいる1つ以上の他の(b)容器:試薬(結合された核酸の存在を見つけることができる試薬)を洗う。
【0145】
詳細に、区分されたキットは、試薬が別々の容器に含まれるどんなキットでも含む。そのような容器は、小さいガラスの容器、プラスチック容器、プラスチックの小板、ガラスまたは紙を含む、あるいは、二酸化ケイ素のような材料を配列すること。そのような容器能率的に試薬を1つのコンパートメントからサンプルと試薬がクロス汚染しないか試薬であるか各々の容器の解答ようなものは1つのコンパートメントから量的ファッションにおいて加えられることができるもう一つのコンパートメントまで移す1を許すもう。そのような容器はテスト・サンプルを受け入れる容器、核酸調査を含む容器、洗浄試薬(例えば、リン酸塩は塩水湖、Tris−バッファ、その他を緩衝した。)を含む容器を含む、そして、試薬を含む容器は結合された調査を見つけたものである。当該分野に熟練したものは、すぐに、本発明の以前未確認のホスファターゼ遺伝子がここで明らかにされるシーケンス情報を使って、通常確認されることができることはすぐに当該分野(特に発現配列)において有名である確立したキット・形態のうちの1つに組み込まれることができると認める。
【0146】
Vectors/host cells
発明もここで記述される核酸分子を含んでいるベクターに提供するベクター/ホスト細胞。用語「ベクター」は担体(望ましくは核酸分子)に言及する。そして、それは核酸分子を輸送することができる。ベクターが核酸分子であるとき、核酸分子は共有結合してベクター核酸に結合される。発明のこの面で、ベクターがプラスミド、シングルまたは二重の座礁されたバクテリオファージ(一つであるか二重の座礁されたRNAまたはDNAウィルスのベクター)を含むことまたは人工染色体(例えばBAC、PAC、YAC、OR MAC)。
【0147】
それが核酸分子の付加的な転写を繰り返して、生産する染色体外の要素として、ベクターは宿主細胞で維持されることができる。あるいは、ベクターはゲノムを宿主細胞に組み込むかもしれなくて、ホストが独房生活をする時が繰り返す核酸分子の付加的な転写を生産するかもしれない。
発明は、核酸分子の発現(発現ベクター)のために、ベクターをメンテナンス(クローニング・ベクター)またはベクターのために用意する。ベクターは、prokaryoticであるか真核生物細胞でまたは両方(シャトル・ベクター)ともで機能することができる。
【0148】
発現ベクターは、核酸分子のそのようなその転写が宿主細胞で与えられる核酸分子に、ベクターにおいてoperablyに結ばれるシス代理の規定する部位を含む。核酸分子は、転写に影響を及ぼすことができる別々の核酸分子で、宿主細胞に導入されることができる。このように、第二の核酸分子は、ベクターから核酸分子の転写を許すためにシス規定する制御部位と相互に作用しているトランス代理の要因を提供するかもしれない。あるいは、トランス代理の要因は、宿主細胞によって供給されるかもしれない。最後に、トランス代理の要因は、ベクターから作り出されることができる。しかし、いくらかの具体例で、核酸分子の転写や翻訳が細胞のないシステムで起こることができることは、理解される。
【0149】
ここで記述される核酸分子がoperablyに結合されることができる規定するシーケンスは、mRNA転写を指示するためにプロモーターを含む。これらは、含む、しかし、制限する(バクテリオファージlからの左のプロモーター)ラック、TRPと大腸菌、SV40からの早くて最近のプロモーター、プロモーター前半即時のCMV、プロモーター前半、そして、遅くアデノウイルスと長いターミナルが繰り返すレトロウイルスからのTACプロモーター。
【0150】
転写を進める制御部位に加えて、発現ベクターは、また、転写(例えばサイトとエンハンサーを結びつけているリプレッサー)を調整する部位を含むかもしれない。例は、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス即時の早いエンハンサー、ポリオーマ・エンハンサー、アデノウイルス・エンハンサーとレトロウイルスLTRエンハンサーを含む。転写開始と制御の場所を含むことに加えて、発現ベクターがまた、転写終了のために必要なシーケンスを含むことができること、そして、写された部位で翻訳の場所を結びつけているリボソーム。発現のための他の規定する制御要素は、ポリアデニル化信号と同様に開始と終了コドンを含む。当該分野の普通の技術の人は、発現ベクターに役立つ多数の規定するシーケンスを知っている。たとえば、そのような規定するシーケンスはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)で記述される。
【0151】
いろいろな発現ベクターは、核酸分子を表すのに用いられることができる。ウイルス(例えばbaculovir使用s、パポーバウイルス(例えばSV40)、Vacciniaウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、狂犬病恐怖症ウイルスとレトロウイルス)から、イースト人工染色体を含むイースト染色体の要素からのイースト・エピソームから、そのようなベクターは、バクテリオファージからの染色体で、episomalでウイルスから派生したベクター(たとえば細菌のプラスミドに由来するベクター)を含む。ベクターは、また、プラスミドてバクテリオファージ遺伝子の要素(例えばcosmidsとphagemids)に由来するそれらのようなこれらの源の組合せに由来するかもしれない。prokaryoticで真核生物ホストのための適切なクローニングと発現ベクターはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)で記述される。
【0152】
規定するシーケンスは、一つ以上の宿主細胞(すなわち明確な組織)の構成する発現を提供するかもしれないか、温度、栄養を含む添加物または外生の要因(例えばホルモンまたは他のリガンド)によって例えば一つ以上の細胞タイプのinducibleな発現の準備をするかもしれない。prokaryoticで真核生物ホストの構成してinducibleな発現の準備をしているいろいろなベクターは、当該分野の普通の技術のそれらに有名である。
【0153】
核酸分子は、有名な方法論のそばにベクター核酸に挿入されることができる。通常、最終的に表されるDNAシーケンスは、一つ以上の規制酵素でDNAシーケンスと発現ベクターを裂くことによる発現ベクターに結ばれて、一緒にそれから断片を結さつしている。規制酵素消化とくくることの手続きは、当該分野の普通の技術のそれらに有名である。
適当な核酸分子を含んでいるベクターは、普及のための適切な宿主細胞または有名なテクニックを使用している発現に導入されることができる。
【0154】
細菌の細胞は、含む、制限されるために(大腸菌)Streptomyces、そして、Salmonella typhimurium.‖真核生物細胞は、含む、しかし、制限する(イースト)昆虫細胞(例えばショウジョウバエ、COSとCHO細胞のような動物性細胞と設備細胞)。
ここで述べられるように、融合タンパク質としてペプチドを表すことは、望ましいかもしれない。したがって、発明はペプチドの生産を考慮に入れる融合ベクターを提供する。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現を増やすことができる、類似性精製のためにたとえばリガンドの働きをすることによって、タンパク質の精製において組み換えタンパク質と援助の可溶性を増やしなさい。
【0155】
要求されたペプチドが最終的に融合半分から切り離されることができるように、タンパク質分解裂け目サイトは融合半分が接合する所に紹介されるかもしれない。タンパク質分解酵素は、含む、制限されるXa、トロンビンとenteroホスファターゼ.因数に分解する典型的融合発現ベクターはpGEX(Smith et al., Gene 67:31−40 (1988))、グルタチオンS−転移酵素(GST)を一体化するpMAL(New England Biolabs, Beverly, MA))とpRIT5(Pharmacia、Piscataway、NJ)を含む。そして、それぞれ、マルトースEがタンパク質またはタンパク質Aを目標組み換えタンパク質に結びつける。適当なinducibleな非融合大腸菌発現ベクターの例は、11d、pTrc(Amann et al., Gene 69:301−315 (1988))とpET(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60−89 (1990))を含む。
【0156】
組み換えタンパク質発現は、宿主細胞がproteolyticallyに組み換えタンパク質を裂く損なわれた能力を持つ遺伝子の背景を提供することによってホスト・バクテリアにおいて最大にされることができる(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119−128)。あるいは、重要な核酸分子のシーケンスは、優先のコドン使用を特定の宿主細胞(たとえば大腸菌)のために用意するために変えられることができる(Wada et al., Nucleic Acids Res. 20:2111−2118 (1992))。
【0157】
イーストにおいて働いている発現ベクターのそばで、核酸分子は、また、表されることができる。例えば、S. cerevisiaeなどのイースト発現のためのベクターの例は、pYepSec1(Baldari, et al., EMBO J. 6:229−234 (1987))、pMFa(Kurjan et al., Cell 30:933−943(1982))、pJRY88(Schultz et al., Gene 54:113−123 (1987))とpYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を含む。
【0158】
核酸分子は、また、たとえば、baculovirus発現ベクターを使用している昆虫細胞で表されることができる。洗練された昆虫細胞(例えばSf 9セル)の中のタンパク質の発現に利用できるBaculovirusベクターは、pAcシリーズを含む(Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156−2165 (1983))、そして、pVLシリーズ(Lucklow et al., Virology 170:31−39 (1989))。
【0159】
発明の特定の実施例で、ここで記述される核酸分子は、哺乳類の発現ベクターを使用している哺乳類の細胞で表される。哺乳類の発現ベクターの例は、pCDM8(Seed, B. Nature 329:840(1987))とpMT2PC(Kaufman et al., EMBO J. 6:187−195 (1987))を含む。ここでリストされる発現ベクターは、核酸分子を表すために役に立つ当該分野の普通の技術のそれらが利用できる有名なベクターだけの例として提供される。当該分野の普通の技術の人は、メンテナンス普及にふさわしい他のベクターまたはここで記述される核酸分子の発現を知っている。これらはたとえばSambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989で見られる。
【0160】
発明も、ここで記述される核酸シーケンスが逆のオリエンテーションの中のベクターにクローンをつくられるが、operablyにアンチセンスのRNAの転写を許す規定するシーケンスに結ばれるベクターを包囲する。このように、ここで記述される核酸分子シーケンスの、アンチセンスの転写は全てにまたは部分に生産されることができる。そして、コーディングと非コーディング部位を含む。このアンチセンスのRNAの現れは、感覚RNA(規定するシーケンス、構成するかinducibleな発現、組織に特有の発現)の現れに関してより上に記述されるパラメータの各々に従属する。
【0161】
発明も、ここで記述されるベクターを含んでいる組み換え宿主細胞に関連がある。宿主細胞は、したがって、prokaryoticな細胞、イーストのような下部の真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞と哺乳類の細胞のようなより高い真核生物細胞を含む。
【0162】
組み換え宿主細胞は、すぐに当該分野の普通の技術の人が利用できるテクニックによって、細胞にここで記述されるベクター構成概念を紹介することによって準備される。これらは、含む、しかし、制限する(リン酸カルシウム・トランスフェクション)トランスフェクション、陽イオン脂質によって媒介されるトランスフェクション、electroporation、形質導入、伝染病、lipofectionとSambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)で見つけられるそれらのような他のテクニック、ほかをDEAE−dextran−mediatedした。
【0163】
宿主細胞は、複数のベクターを含むことができる。このように、異なるヌクレオチド配列は、同じ細胞の異なるベクターで紹介されることができる。同じように、それらが発現ベクターのために要因を処理することを提供することのような核酸分子と、関連がない他の核酸分子で、核酸分子は、か単独で紹介されることができる。複数のベクターが細胞に導入されるとき、ベクターは独立して紹介されることができるか、共同紹介するか、核酸分子ベクターに結ばれることができる。
【0164】
バクテリオファージとウィルスのベクターの場合、これらは伝染病と形質導入の標準の手続きによって、パックされるかカプセルに入れられたウイルスとして細胞に導入されることができる。ウィルスのベクターは、複写−有能な複写−欠陥品でありえる。ウィルスの複写が不完全であるケースには、複写は欠陥を補足する機能を提供している宿主細胞で起こる。
【0165】
ベクターは、一般にベクターが造る組み換えを含む細胞の部分母集団の選択を可能にする選択可能な目印を含む。目印は、ここで記述される核酸分子を含むか、別々のベクターの上にあるかもしれない同じベクターに含まれることができる。目印は、真核生物宿主細胞のためにprokaryoticな宿主細胞とdihydrofolateな還元酵素またはネオマイシン抵抗のためにテトラサイクリンまたはアンピシリン−抵抗遺伝子を含む。
【0166】
しかし、選択をphenotypicな特徴のために用意するどんな目印でも、効果的である。成熟したタンパク質が適切な規定するシーケンスの制御中で、バクテリア、イースト、哺乳類の細胞と他の細胞で生産されることができる間、cell−は転写を解く、そして、翻訳システムはまた、ここで記述されるDNA構成概念に由来するRNAを使っているこれらのタンパク質を生産するのに用いられることができる。
【0167】
ペプチドの分泌は、要求される、適当な分泌信号が組み込まれるタンパク質(例えばホスファターゼ)を含んでいるマルチ膜内外領域で、成し遂げるのが難しいベクター。信号のシーケンスは、ペプチドに内部から発生することがありえるかこれらのペプチドに非相同的でありえる。ペプチドは、媒体に分泌されない、概してホスファターゼによるケースである、タンパク質は標準の混乱手順によって宿主細胞から分離されることができる雪解け、超音波処理、機械の混乱、試薬を一体化させる効果などを凍らせる。ペプチドは、それから回収されることができて、硫酸アンモニウム降水を含む有名な精製方法、酸性抽出物、陰イオンまたは疎水性の陽イオン交換クロマトグラフィ(phosphocelluloseクロマトグラフィ)によって精製した−相互作用クロマトグラフィ、類似性クロマトグラフィ、hydroxylapatiteクロマトグラフィ、レクチン・クロマトグラフィまたは高性能な液体のクロマトグラフィ。
【0168】
また、ここで記述されるペプチドの組み換え生産での宿主細胞によって、細胞によって、ペプチドがいろいろなグリコシル化パターンを持つことができると思う‖または多分非だろうglycosylated‖いつとしてバクテリアの中の生じる。それに加えて、ペプチドはホストによって媒介されるプロセスの結果として最初の修正されたメチオニンをいくらかの訴訟に含むかもしれない。
【0169】
使用s of vectors and host cells
ペプチドを表している組み換え宿主細胞がここで記述したベクターとホスト電池の使用は、いろいろな使用を持つ。最初に、細胞はホスファターゼ・タンパク質を生産することに役立つ、あるいは、もっと先でありえるペプチドはホスファターゼ・タンパク質または断片の要求された量を生じるために精製した。このように、発現ベクターを含んでいる宿主細胞は、ペプチド生産に役立つ。
【0170】
宿主細胞は、また、当該分野において知られているそれらの描かれた他であるだけでなく上記の形態のような、ホスファターゼ・タンパク質またはホスファターゼ・タンパク質断片を含んでいる細胞ベースの分析法を実行することに役立つ。このように、天然のホスファターゼ・タンパク質を表している組み換え宿主細胞は、ホスファターゼ・タンパク質機能を刺激するか、禁ずる合成物を分析することに役立つ。
【0171】
宿主細胞は、また、これらの機能が影響を受けるホスファターゼ・タンパク質変異体を確認することに役立つ。変異体が自然に起こって、病理学を引き起こすならば、突然変異を含んでいる宿主細胞は天然のホスファターゼ・タンパク質に対する彼らの影響によって、示されないかもしれない変異体ホスファターゼ・タンパク質(たとえば、機能を刺激しているか、禁じて)に、要求された影響を及ぼす分析評価合成物にとって有用である。
【0172】
遺伝子工学による宿主細胞は、さらに人間外の遺伝子導入動物を生産するのに用いられることができる。遺伝子導入動物は望ましくはネズミまたはマウスのような哺乳類(たとえば齧歯動物)である。そこにおいて、動物の細胞のうちの1つ以上は遺伝子導入を含む。遺伝子導入は、遺伝子導入動物が育つ細胞のゲノムに組み込まれる、そして、一つ以上の細胞タイプの中の成熟した動物のゲノムまたは遺伝子導入動物の組織の中に残る外生のDNAである。これらの動物は、ホスファターゼ・タンパク質活動のモジュレータをホスファターゼ・タンパク質の機能を研究することに役立って、確認していて、評価している。遺伝子導入動物の他の例は、人間外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏と両生類を含む。
【0173】
遺伝子導入動物は、例えば、顕微鏡下注射(レトロウイルスの伝染病)によって核酸を肥やされた卵母細胞の男の前核にもたらすことによって生産されることができる、そして、卵母細胞がpseudopregnantな女性において発達するのを許すことは動物を育てる。
【0174】
ホスファターゼ・タンパク質ヌクレオチド配列の何でも、人間以外の動物(例えばマウス)のゲノムに、遺伝子導入として紹介されることができる。発現ベクターに役立つ規定するか他のシーケンスの何でも、遺伝子導入・シーケンスの部分をつくることができる。すでに含まれないならば、これはintronicなシーケンスとポリアデニル化信号を含む。組織に特有の規定するsequence(s)は、特定の細胞にホスファターゼ・タンパク質の直接の発現に、operablyに遺伝子導入に結ばれることができる。
【0175】
胎児操作を通して遺伝子導入動物を生成する方法と顕微鏡下注射(マウスのような特に動物)は当該分野においてありきたりになって、たとえば、U.S. Patent Nos. 4,736,866 and 4,870,009, both by Leder et al., U.S. Patent No. 4,873,191 by Wagner et al. and in Hogan, B., Manipulating the Mo使用 Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)をManipulatingする。類似した方法が、他の遺伝子導入動物の生産のために使われる。遺伝子導入創設者動物は、そのゲノムの中の遺伝子導入や組織の中の遺伝子導入mRNAまたは動物の細胞の発現の存在に基づいて確認されることができる。
【0176】
遺伝子導入創設者動物は、それから遺伝子導入を運んでいる付加的な動物を育てるのに用いられることができる。さらに、遺伝子導入を運んでいる遺伝子導入動物は、他の遺伝子導入sを運んでいる他の遺伝子導入動物に、さらに育てられることができる。遺伝子導入動物も、全ての動物または動物の組織がここで記述されるhomologouslyな組み換え宿主細胞を使って生産された動物を含む。
【0177】
もう一つの具体例で、遺伝子導入の管理された現れを考慮に入れる選ばれたシステムを含む遺伝子導入人間以外の動物は、生産されることができる。そのようなシステムの1つの例は、バクテリオファージP1のcre/loxP recombinaseシステムである。cre/loxP recombinaseシステムの記述のために、参照(例えばLakso et al. PNAS 89:6232−6236 (1992)参照)。recombinaseシステムのもう一つの例は、S. cerevisiae (O’Gorman et al. Science 251:1351−1355 (1991)のFLP recombinaseシステムである。cre/loxP recombinaseシステムが遺伝子導入の現れを管理するのに用いられるならば、Cre recombinaseと選ばれたタンパク質をコード化している動物含んでいる遺伝子導入sは必要である。例えば、そのような動物は2匹の遺伝子導入動物を仲間にすることによって「倍の」遺伝子導入動物の建設を通して提供されることができる。そして、選ばれたタンパク質をコード化している遺伝子導入を含んでいるものと遺伝子導入を含んでいる他がrecombinaseをコード化する。
【0178】
ここで記述される人間外の遺伝子導入動物のクローンは、また、Wilmut, I. et al. Nature 385:810−813 (1997) and PCT International Publication Nos. WO 97/07668 and WO 97/07669に記述される方法によって生産されることができる。手短に言えば、遺伝子導入動物からの細胞(例えば体細胞)は、孤立することができて、成長サイクルを出ることを説いてさせられることができて、Goフェーズを入れられることができる。
【0179】
例えば、静止した細胞が孤立する同じ種の動物からの細胞核を取り除かれた卵母細胞にとって、静止した細胞は、それから電気的な脈の使用を通して一体化されることができる。再建された卵母細胞は、それからそれが桑実胚または胚盤胞に発達して、それから移ったようなものを耕作されるpseudopregnantな雌の里の動物。この雌の里の動物の生まれる子は、細胞(例えば体細胞)が孤立する動物のクローンである。
【0180】
ここで記述されるペプチドを表す組み換え細胞を含んでいる遺伝子導入動物は、活発な1インチ前後関係においてここで記述される分析評価を実行するために役に立つ。したがって、生体内に存在する、そして、結合している基質、キナーゼ・タンパク質起動と信号形質導入を生じることができたいろいろな生理的要因は、試験管内の細胞のないか細胞ベースの分析法から、明白でないかもしれない。したがって、基質相互作用を含む活発なホスファターゼ・タンパク質機能、ホスファターゼ・タンパク質機能と基質相互作用の特定の変異体ホスファターゼ・タンパク質の影響と仮想的なホスファターゼ・タンパク質の影響において分析評価に人間外の遺伝子導入動物を提供することは、役に立つ。また、無効な突然変異(すなわちかなりまたは完全に一つ以上のホスファターゼ・タンパク質機能を除去する突然変異)の影響を評価することが可能である。
【0181】
出版と特許が上記の仕様において言及した全ては、リファレンスによってここで取り入れられる。発明の記述された方法とシステムのいろいろな修正とバリエーションは、範囲から出発することのない当該分野と発明の精神に熟練したそれらにとって明らかである。発明が特定の好ましい具体例と関連して記述されたけれども、それが理解されなければならなくて、その発明要求する‖そのような特定の具体例に過度に制限してはならない。本当に、分子生物学または関連したフィールドのフィールドに熟練したそれらにとって明らかである発明を実行するための上記のモードのいろいろな修正は、以下の要求の範囲内であるつもりである。
【0182】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明のホスファターゼスプライス形の各々をコード化する3つのcDNA分子のヌクレオチド配列を提供する。(スプライス型1つの= SEQ ID NO:1は形式2つの= SEQ ID NO:4を継ぐ、形式3つの= SEQ ID NO:6を継ぎなさい)In追加、構造、そして、ATGスタート、中止と組織配布のような、情報が提供される汎関数どこで、利用でき、それは1をすぐにこの分子のシーケンスに基づく発明の特定の使用を決定させる。実験的なデータ、そのことは図1が本発明のスプライス形1がすい臓、結腸とすい臓腺癌、すい臓上皮癌、肺大きい細胞癌、腎臓細胞癌、胎盤絨毛膜癌腫、卵巣腫瘍組織、脳において人間において表されることを示すと中で定めた‖(含む胎児)、心臓(含む胎児)、腎臓(含む胎児)(子宮)、そして、甲状腺。その上、スプライス型3は、胎児の脳において表される。
【図2】
図2は、本発明の3枚のホスファターゼスプライス形態の予測されたアミノ酸シーケンスを提供する。(スプライス型1つの= SEQ ID NO:2は形式2つの= SEQ ID NO:5を継ぐ、形式3つの= SEQ ID NO:7を継ぎなさい)、In追加は組み立てる、そして、タンパク質族、機能と修正サイトのような機能情報は提供される。そして、すぐに発明の特定の使用を決定する利用できる、許しているものはこの分子のシーケンスに基づいた。
【図3】
図3は、本発明の3枚のホスファターゼスプライス形態をコード化している遺伝子にわたるゲノム・シーケンスを提供する。(SEQ ID NO:3)In追加は組み立てる、そして、機能情報(例えばイントロン/エクソン構造、プロモーター場所、その他)は提供される。そして、すぐに発明の特定の使用を決定する利用できる、許しているものはこの分子のシーケンスに基づいた。図3も、3枚のスプライス形態をコード化しているゲノム・シーケンスの地図位置が人間の染色体11であることを示す。図3で図示されるように、以下のSNPバリエーションは確認された:G577A、G1451AとG2641A.図3は、構造/シーケンス・バリエーションを図示するためにさらに遺伝子構造に3枚のスプライス形態のcDNAとペプチド・シーケンスの典型的で複数の配置を提供する。具体的には、図3で示されるように、スプライス型2はエクソン13と14(それはスプライス型1と3で不在である)を含む、そして、スプライス型3はエクソン7を逃がしている。そして、それはスプライス型1と2で存在する。
Claims (23)
- 下記グループから選ばれるアミノ酸シーケンスからなる単離ペプチド。
(a)SEQ ID NO. 2, 5, 7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンス;
(b)SEQ ID NO. 2, 5, 7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンスの対立変種のアミノ酸シーケンスであって、前記対立変種は、SEQ ID NO.1, 3, 4, 6からなるグループから選ばれる核酸分子の対向鎖に、厳密な条件でハイブリダイズされる核酸分子によってエンコードされるもの;
(c) SEQ ID NO. 2, 5, 7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンスのオルトログのアミノ酸シーケンスであって、前記オルトログは、SEQ ID NO. 1, 3, 4, 6からなるグループから選ばれる核酸分子の対向鎖に、厳密な条件でハイプリダイズされる核酸分子によってエンコードされるもの;及び
(d)SEQ ID NO. 2, 5, 7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンスの断片であって、該断片は、少なくとも10の隣接するアミノ酸からなるもの。 - 下記グループから選ばれるアミノ酸シーケンスを含んでいる単離したペプチド。
(a)SEQ ID NO. 2, 5, 7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンス;
(b)アミノ酸シーケンスの対立変種のアミノ酸シーケンスがSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、SEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子の対立している岸に、厳しい状況の下で交雑する核酸分子によって、そこで言われた対立変種は、コード化される;
(c)アミノ酸シーケンスのオルトログのアミノ酸シーケンスがSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、SEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子の対立している岸に、厳しい状況の下で交雑する核酸分子によって、そこで言われたオルトログは、コード化される;
そして、
(d)アミノ酸シーケンスの断片がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われた断片は、少なくとも10の隣接するアミノ酸から成る。 - 請求項2のペプチドに選択的に反応する単離した抗体。
- 下記グループから選ばれるヌクレオチド配列からなる単離した核酸分子。
(a)SEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンスをコード化するヌクレオチド配列;
(b)それがアミノ酸シーケンスの対立変種の、コード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われたヌクレオチド配列は、SEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子の対立している岸に、厳しい状況の下で交雑する;
(c)アミノ酸シーケンスのオルトログをコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われたヌクレオチド配列は、SEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子の対立している岸に、厳しい状況の下で交雑する;
(d)アミノ酸シーケンスの断片をコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われた断片は、少なくとも10の隣接するアミノ酸から成る;
そして、
(e)(a)のヌクレオチド配列を補うものであるヌクレオチド配列−(d)。 - 下記グループから選ばれるヌクレオチド配列を含んでいる単離した核酸分子。
(a)SEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンスをコード化するヌクレオチド配列;
(b)それがアミノ酸シーケンスの対立変種の、コード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われたヌクレオチド配列は、SEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子の対立している岸に、厳しい状況の下で交雑する;
(c)アミノ酸シーケンスのオルトログをコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われたヌクレオチド配列は、SEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子の対立している岸に、厳しい状況の下で交雑する;
(d)アミノ酸シーケンスの断片をコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NOS:2、5と7からなるグループから選ばれて、そこで言われた断片は、少なくとも10の隣接するアミノ酸から成る;
そして、
(e)(a)のヌクレオチド配列を補うものであるヌクレオチド配列−(d)。 - 請求項5の核酸分子を含んでいる遺伝子チップ。
- 請求項5の核酸分子を含んでいる人間以外の遺伝子導入動物。
- 請求項5の核酸分子を含んでいる核酸ベクター。
- 請求項8のベクターを含んでいる宿主細胞。
- 請求項1記載のいずれかのペプチドを製造する方法であって、(a)〜(d)のいずれかのアミノ酸シーケンスを宿主細胞に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される状況の下で宿主細胞を培養する方法。
- 請求項2記載のいずれかのペプチドを製造する方法であって、(a)〜(d)のいずれかのアミノ酸シーケンスを宿主細胞に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される状況の下で宿主細胞を培養する方法。
- 試料中における請求項2記載のいすれかのペプチドを検出する方法であって、該方法は、試料中の該ペプチドの存在を特異的に検出する試薬と接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。
- 試料中における請求項5記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、該方法は、厳密な条件下で前記核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと試料を接触させ、試料中の核酸分子にオリゴヌクレオチドが結合するかどうかにより検出する方法。
- 請求項2記載のペプチドのモジュレータを確認する方法であって、該方法は、前記ペプチドと試薬を接触させ、前記ペプチドの機能あるいは活性を調整したか否かを検出する方法。
- 前記試薬が前記ペプチドを発現する発現ベクターを含んでいる宿主細胞に与えられる請求項14の方法。
- 請求項2のペプチドのいずれかに結合する試薬の確認方法であって、該方法は、ペプチドを該試薬と接触させ、混合物中にペプチドと試薬が結合した複合体が検出するか否かを試験する方法。
- 請求項16の方法により同定された試薬と、薬学的に許容できる担体とを含む薬剤組成物。。
- ヒトフォスファターゼタンパク質により誘導される疾患あるいは状態を処置する方法であって、請求項16記載の方法で特定された試薬を薬学的有効量、患者に投与する方法。
- 請求項2のペプチドを発現するモジュレータを確認する方法であって、該方法は、前記ペプチドを発現する細胞を試薬と接触させ、該試薬が前記ペプチドの発現を調整するか否かにより確認する方方法。
- SEQ ID NO. 2, 5, 7からなるグループから選択されるアミノ酸シーケンスと、少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸シーケンス有する単利ヒトホスファターゼ・ペプチド。
- SEQ ID NO, 2, 5, 7からなるグループから選ばれるアミノ酸シーケンスと少なくとも90パーセントの相同性を共有する請求項20のペプチド。
- ヒトホスファターゼ・ペプチドをコードしている単離核酸分子であって、SEQ ID NO. 1, 3, 4, 6からなるグループから選ばれる核酸分子と少なくとも80パーセントの相同性を有している核酸分子。
- 少なくとも90パーセントの異体同形をSEQ ID NOS:1、3、4と6からなるグループから選ばれる核酸分子と共有する請求項22に従う核酸分子。
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