JP2003534793A - 哺乳動物蛋白質ホスファターゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は，ホスファターゼポリペプチド，ホスファターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の診断および診断に有用な種々の産物および方法に関する。バイオインフォマティクス戦略を用いて，ＭＡＰキナーゼホスファターゼＰＴＰおよびＳＴＰの哺乳動物のメンバーが単離され，その蛋白質構造が推定された。
Description
【０００１】
本発明は，米国特許仮出願６０／２０８，２９１（２０００年５月３０日出願
）に基づく優先権を主張し、この全体を本明細書の一部としてここに引用する。
）に基づく優先権を主張し、この全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】発明の分野
本発明は，ホスファターゼポリペプチド，ホスファターゼポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の
診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
ドするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の
診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
【０００３】発明の背景
以下の発明の背景の記載は本発明の理解を助けるために提供され，本発明に
対する先行技術であるかまたはそれを記述すると認めるものではない。
対する先行技術であるかまたはそれを記述すると認めるものではない。
【０００４】
細胞シグナル伝達は，各種の細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリ
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニ
ズムの一つは蛋白質キナーゼによる蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成
熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる
。真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼは，セリン，トレオニ
ンおよびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナ
ーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン
酸化に特異的なものの２グループに大別される。
レーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニ
ズムの一つは蛋白質キナーゼによる蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成
熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる
。真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼは，セリン，トレオニ
ンおよびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナ
ーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン
酸化に特異的なものの２グループに大別される。
【０００５】
所定の基質のリン酸化状態はまた，蛋白質ホスファターゼ，すなわち，蛋白質
キナーゼにより所定の基質に加えられたリン酸基の除去を担う一群の蛋白質によ
っても制御される。蛋白質ホスファターゼもまた，セリン／トレオニン，または
チロシンのいずれかに特異的であるとして分類することができる。このファミリ
ーのいくつかのメンバーは，チロシンのみを脱リン酸化することができ，"蛋白
質チロシンホスファターゼ"（"ＰＴＰ"）として知られており，他のものはチロ
シンならびにセリンおよびトレオニンを脱リン酸化することができ，"二重特異
性ホスファターゼ"（"ＤＳＰ"）と称され；第３のファミリーはセリンまたはト
レオニンのみをリン酸化する（"ＳＴＰ"）。これらは，Ｆａｕｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９６ Ｎｏｖ ２１（１１
）：４１３−７）およびＭａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．
１９９８ Ｆｅｂ ２８；８（１）：２−１１）に記載される。これらの蛋白質
は，共通の触媒コア構造を含む２５０−３００アミノ酸ドメインを共有する。関
連するホスファターゼは，チロシンホスファターゼ，二重特異性ホスファターゼ
，およびミオチューブラリン様（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｌｉｋｅ）ホスフ
ァターゼ（（Ｆａｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，；およびＭａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．，上掲）の別個のサブファミリーに分類される。
キナーゼにより所定の基質に加えられたリン酸基の除去を担う一群の蛋白質によ
っても制御される。蛋白質ホスファターゼもまた，セリン／トレオニン，または
チロシンのいずれかに特異的であるとして分類することができる。このファミリ
ーのいくつかのメンバーは，チロシンのみを脱リン酸化することができ，"蛋白
質チロシンホスファターゼ"（"ＰＴＰ"）として知られており，他のものはチロ
シンならびにセリンおよびトレオニンを脱リン酸化することができ，"二重特異
性ホスファターゼ"（"ＤＳＰ"）と称され；第３のファミリーはセリンまたはト
レオニンのみをリン酸化する（"ＳＴＰ"）。これらは，Ｆａｕｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９６ Ｎｏｖ ２１（１１
）：４１３−７）およびＭａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．
１９９８ Ｆｅｂ ２８；８（１）：２−１１）に記載される。これらの蛋白質
は，共通の触媒コア構造を含む２５０−３００アミノ酸ドメインを共有する。関
連するホスファターゼは，チロシンホスファターゼ，二重特異性ホスファターゼ
，およびミオチューブラリン様（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｌｉｋｅ）ホスフ
ァターゼ（（Ｆａｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，；およびＭａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．，上掲）の別個のサブファミリーに分類される。
【０００６】
ホスファターゼは，上流のレギュレータと相互作用すると考えられている種々
の非触媒ドメインを有する。例としては，ＳＨ３含有蛋白質との相互作用のため
のプロリンリッチドメイン，またはＲａｃ，Ｒｈｏ，およびＲａｂ等の小さいＧ
蛋白質との相互作用のための特異的ドメインが含まれる。これらの相互作用は，
種々の細胞表面レセプターの活性化等の外部刺激，例えば，チロシンキナーゼ，
サイトカインレセプター，ＴＮＦレセプター，Ｆａｓ，Ｔ細胞レセプター，ＣＤ
２８，またはＣＤ４０に応答した独特の生化学的経路の間をクロストークするた
めのメカニズムを提供するかもしれない。
の非触媒ドメインを有する。例としては，ＳＨ３含有蛋白質との相互作用のため
のプロリンリッチドメイン，またはＲａｃ，Ｒｈｏ，およびＲａｂ等の小さいＧ
蛋白質との相互作用のための特異的ドメインが含まれる。これらの相互作用は，
種々の細胞表面レセプターの活性化等の外部刺激，例えば，チロシンキナーゼ，
サイトカインレセプター，ＴＮＦレセプター，Ｆａｓ，Ｔ細胞レセプター，ＣＤ
２８，またはＣＤ４０に応答した独特の生化学的経路の間をクロストークするた
めのメカニズムを提供するかもしれない。
【０００７】
ホスファターゼは，種々の細胞応答，例えば，成長因子，サイトカインおよび
ホルモンに対する応答，酸化−，ＵＶ−，または照射−関連ストレス経路，炎症
性シグナル（例えばＴＮＦα），アポトーシス刺激（例えばＦａｓ），Ｔおよび
Ｂ細胞共刺激，細胞骨格構造の制御，および細胞トランスフォーメーション等の
制御において関与することが示唆されている（ＴＨＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＨＯ
ＳＰＨＡＴＡＳＥ ＦＡＣＴＢＯＯＫ，Ｔｏｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照）。
ホルモンに対する応答，酸化−，ＵＶ−，または照射−関連ストレス経路，炎症
性シグナル（例えばＴＮＦα），アポトーシス刺激（例えばＦａｓ），Ｔおよび
Ｂ細胞共刺激，細胞骨格構造の制御，および細胞トランスフォーメーション等の
制御において関与することが示唆されている（ＴＨＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＨＯ
ＳＰＨＡＴＡＳＥ ＦＡＣＴＢＯＯＫ，Ｔｏｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照）。
【０００８】
したがって，その不適切な活性が癌または他の疾患につながりうる追加のホス
ファターゼを同定し，これらの疾患の適切な治療をも同定することが必要とされ
ている。
ファターゼを同定し，これらの疾患の適切な治療をも同定することが必要とされ
ている。
【０００９】発明の概要
本発明にしたがうホスファターゼの特徴を記載するために，以下の略号を用い
る： ＤｓＰＴＰ 二重特異性蛋白質ホスファターゼ ＤＵＳ 二重特異性ホスファターゼ ＭＫＰ ＭＡＰキナーゼホスファターゼ ＭＴＭ 筋細管ミオパシー（ミオチューブラリン）ホスファターゼ ＰＴＰ 蛋白質チロシンホスファターゼ ＳＴＰ セリントレオニンホスファターゼ ＰＴＥＮ ホスファターゼおよびテンシンホモログ
る： ＤｓＰＴＰ 二重特異性蛋白質ホスファターゼ ＤＵＳ 二重特異性ホスファターゼ ＭＫＰ ＭＡＰキナーゼホスファターゼ ＭＴＭ 筋細管ミオパシー（ミオチューブラリン）ホスファターゼ ＰＴＰ 蛋白質チロシンホスファターゼ ＳＴＰ セリントレオニンホスファターゼ ＰＴＥＮ ホスファターゼおよびテンシンホモログ
【００１０】
"モチーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより
，我々は，ホスファターゼファミリーのある種の追加の哺乳動物メンバーを同定
し，これは本明細書に記載される。本発明は，５個のホスファターゼの部分配列
または完全配列，ならびにこれらの分類，予測されたまたは推定された蛋白質構
造，およびこれらの蛋白質の生物学的および治療上の関連性を解明する戦略を提
供する。これらの新規蛋白質には，ＳＴＰグループの３種類，ＤＳＰグループの
１種類，およびｃＰＴＰグループの１種類のホスファターゼポリペプチドが含ま
れる。新規蛋白質を確立されたファミリーに属するとして分類することは，各蛋
白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの予測におけるのみならず，これら
の蛋白質の制御，基質，およびシグナリング経路においても，非常に正確である
ことが証明された。
，我々は，ホスファターゼファミリーのある種の追加の哺乳動物メンバーを同定
し，これは本明細書に記載される。本発明は，５個のホスファターゼの部分配列
または完全配列，ならびにこれらの分類，予測されたまたは推定された蛋白質構
造，およびこれらの蛋白質の生物学的および治療上の関連性を解明する戦略を提
供する。これらの新規蛋白質には，ＳＴＰグループの３種類，ＤＳＰグループの
１種類，およびｃＰＴＰグループの１種類のホスファターゼポリペプチドが含ま
れる。新規蛋白質を確立されたファミリーに属するとして分類することは，各蛋
白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの予測におけるのみならず，これら
の蛋白質の制御，基質，およびシグナリング経路においても，非常に正確である
ことが証明された。
【００１１】
本発明の１つの観点は，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，
および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ
酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮さ
れた，または精製された核酸分子を特徴とする。
および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ
酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮さ
れた，または精製された核酸分子を特徴とする。
【００１２】
核酸に関して"単離された"とは，互いに結合した１０個（好ましくは２１個，
より好ましくは３９個，最も好ましくは７５個）またはそれ以上のヌクレオチド
のポリマーを意味し，天然起源から単離された，またはセンス鎖または相補的な
アンチセンス鎖として合成されるＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本発明のある
態様においては，より長い核酸が好ましく，例えば，３００，６００，９００，
１２００，１５００，またはそれ以上のヌクレオチドのもの，および／または配
列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，および配列番号５に記載され
る配列からなる群より選択される配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，
８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，
９７％，９８％または９９％の同一性を有するものが好ましい。
より好ましくは３９個，最も好ましくは７５個）またはそれ以上のヌクレオチド
のポリマーを意味し，天然起源から単離された，またはセンス鎖または相補的な
アンチセンス鎖として合成されるＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本発明のある
態様においては，より長い核酸が好ましく，例えば，３００，６００，９００，
１２００，１５００，またはそれ以上のヌクレオチドのもの，および／または配
列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，および配列番号５に記載され
る配列からなる群より選択される配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，
８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，
９７％，９８％または９９％の同一性を有するものが好ましい。
【００１３】
核酸とは，限定されないが，ＤＮＡ，ＲＮＡまたはｃＤＮＡを意味し，核酸が
ＲＮＡである場合にはチミンがウラシルであることが理解される。
ＲＮＡである場合にはチミンがウラシルであることが理解される。
【００１４】
本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見
いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていること
を表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環
境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド
鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド物
質を本質的に含まず（好ましくは約９０％純粋，より好ましくは少なくとも約９
５％純粋），したがって，単離された染色体とは区別されることを意味する。
いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天
然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていること
を表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環
境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド
鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド物
質を本質的に含まず（好ましくは約９０％純粋，より好ましくは少なくとも約９
５％純粋），したがって，単離された染色体とは区別されることを意味する。
【００１５】
核酸に関連して，"濃縮された"との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５倍，より好ま
しくは少なくとも１０倍またはさらにそれ以上増加していることを意味する。ま
たこの用語は，他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味する
ものではない。他の起源のＤＮＡは，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはク
ローニングベクター，例えばｐＵＣ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，
１つのｍＲＮＡのレベルが他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然
に生ずる事象，例えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長から区別される。す
なわち，この用語は，人が所望の核酸の比率を上昇させることを意図する状況の
みをカバーする。
配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正
常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合
（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮ
Ａの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，
またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし
，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するも
のではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを
意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのよ
うな増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，
他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５倍，より好ま
しくは少なくとも１０倍またはさらにそれ以上増加していることを意味する。ま
たこの用語は，他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味する
ものではない。他の起源のＤＮＡは，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはク
ローニングベクター，例えばｐＵＣ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，
１つのｍＲＮＡのレベルが他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然
に生ずる事象，例えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長から区別される。す
なわち，この用語は，人が所望の核酸の比率を上昇させることを意図する状況の
みをカバーする。
【００１６】
ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利であ
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくと
も１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的
に企図される。
る。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物
）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較
的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ
／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々の
クローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローン
から得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得る
ことができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した
天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々
のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により
合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡラ
イブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，
天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくと
も１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的
に企図される。
【００１７】
"ホスファターゼポリペプチド"とは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の，３２個（好ましくは４０，より
好ましくは４５，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸を
意味する。ある観点においては，１００，２００，３００，４００，４５０，５
００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ以上のアミノ酸の
ポリペプチドが好ましい。ホスファターゼポリペプチドは，ポリペプチドの機能
的活性が保持される限り，全長核酸配列または全長核酸配列の任意の部分（例え
ば，本明細書において定義される"フラグメント"），例えば，触媒ドメイン（本
明細書において定義される）またはその一部によりコードされることができる。
遺伝コードの縮重のため，多数の異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードし
うることは当該技術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸の保存的
変更を行って，元の機能を保持している蛋白質またはポリペプチドを得ることが
できることも，当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には，
アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること，例えば，１つ
の脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のもので，または塩
基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ，酸性残基ＧｌｕおよびＡｓｐ，アミド残基Ｇｌｎ
およびＡｓｎ，ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｙｒ，または芳香族残基Ｐｈｅ
およびＴｙｒの間で置き換えることが含まれる。蛋白質全体にあったとしてもわ
ずかの影響しか与えないアミノ酸の交換を作成することに関するさらなる情報は
，Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４７，１３０６−
１３１０に見いだすことができる（図面および表を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）。すべての場合において，すべての順列がこの開示に
よりカバーされることが意図される。
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の，３２個（好ましくは４０，より
好ましくは４５，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸を
意味する。ある観点においては，１００，２００，３００，４００，４５０，５
００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ以上のアミノ酸の
ポリペプチドが好ましい。ホスファターゼポリペプチドは，ポリペプチドの機能
的活性が保持される限り，全長核酸配列または全長核酸配列の任意の部分（例え
ば，本明細書において定義される"フラグメント"），例えば，触媒ドメイン（本
明細書において定義される）またはその一部によりコードされることができる。
遺伝コードの縮重のため，多数の異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードし
うることは当該技術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸の保存的
変更を行って，元の機能を保持している蛋白質またはポリペプチドを得ることが
できることも，当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には，
アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること，例えば，１つ
の脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のもので，または塩
基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ，酸性残基ＧｌｕおよびＡｓｐ，アミド残基Ｇｌｎ
およびＡｓｎ，ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｙｒ，または芳香族残基Ｐｈｅ
およびＴｙｒの間で置き換えることが含まれる。蛋白質全体にあったとしてもわ
ずかの影響しか与えないアミノ酸の交換を作成することに関するさらなる情報は
，Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４７，１３０６−
１３１０に見いだすことができる（図面および表を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）。すべての場合において，すべての順列がこの開示に
よりカバーされることが意図される。
【００１８】
本発明のホスファターゼペプチドのアミノ酸配列は，配列番号６，配列番号７
，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列から
なる群より選択されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列，または
そのフラグメントを有する配列に実質的に類似するであろう。
，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列から
なる群より選択されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列，または
そのフラグメントを有する配列に実質的に類似するであろう。
【００１９】
配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記
載される配列からなる群より選択される配列に実質的に類似する配列は，好まし
くは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
からなる群より選択される配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，８０％
，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％
，９８％または９９％の同一性を有するであろう。好ましくは，ホスファターゼ
ポリペプチドは，上述の配列の１つと，少なくとも約９０％，９１％，９２％，
９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有す
るであろう。
載される配列からなる群より選択される配列に実質的に類似する配列は，好まし
くは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
からなる群より選択される配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，８０％
，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％
，９８％または９９％の同一性を有するであろう。好ましくは，ホスファターゼ
ポリペプチドは，上述の配列の１つと，少なくとも約９０％，９１％，９２％，
９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有す
るであろう。
【００２０】
"同一性"とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。同
一性は，同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列のドメイン中の残
基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ
酸の付加または欠失により生じたアラインメント中の空間である。すなわち，完
全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に
保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するで
あろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するための
いくつかのコンピュータプログラム，例えば，Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴまたは
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３
−４１０），およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）
（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９
５−１９７）が利用可能であることを認識するであろう。好ましくは，これらの
プログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者は，これらの設定を変更するこ
とが必要であるか否かを認識しており，どのようにして変更するかがわかる。
一性は，同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列のドメイン中の残
基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ
酸の付加または欠失により生じたアラインメント中の空間である。すなわち，完
全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に
保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するで
あろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するための
いくつかのコンピュータプログラム，例えば，Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴまたは
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３
−４１０），およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）
（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９
５−１９７）が利用可能であることを認識するであろう。好ましくは，これらの
プログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者は，これらの設定を変更するこ
とが必要であるか否かを認識しており，どのようにして変更するかがわかる。
【００２１】
"類似性"は，同一の残基の数と保存的に置換された残基の数（Ｂｏｗｉｅ，ｅ
ｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２４７，１３０６−１３１０を参照（図
面および表を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）との合計
を残基とギャップの総数で割り，１００を乗ずることにより測定することができ
る。
ｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２４７，１３０６−１３１０を参照（図
面および表を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）との合計
を残基とギャップの総数で割り，１００を乗ずることにより測定することができ
る。
【００２２】
好ましい態様においては，本発明は，以下のヌクレオチド配列を含むホスファ
ターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮されたまたは精製された核
酸分子を特徴とする： （ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）（ａ）のヌクレオチド分子に高度にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし，かつ天然に生ずるホスファターゼポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，た
だしＮ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コ
イルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テ
ールからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠
失しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；および （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である。
ターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮されたまたは精製された核
酸分子を特徴とする： （ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）（ａ）のヌクレオチド分子に高度にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし，かつ天然に生ずるホスファターゼポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，た
だしＮ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コ
イルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テ
ールからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠
失しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；および （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２３】
好ましい態様においては，本発明は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，および配列番号５からなる群より選択される配列と実質的に同一の
ヌクレオチド配列を含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を
特徴とする。好ましくは，配列は，上述の配列と少なくとも５０％，６０％，７
５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９
６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有する。
配列番号４，および配列番号５からなる群より選択される配列と実質的に同一の
ヌクレオチド配列を含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を
特徴とする。好ましくは，配列は，上述の配列と少なくとも５０％，６０％，７
５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９
６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有する。
【００２４】
"相補体"との用語は，互いに多くの望ましい相互作用を形成しうる２つのヌク
レオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することが
できるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素
結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第
１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的
である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
レオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することが
できるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素
結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第
１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的
である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２５】
所望の特異性および選択性に応じて，種々の低いまたは高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業
者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
は，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのよう
な条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有す
る核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は
，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸の
ハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００
個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブ
リダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個
のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
ーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業
者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
は，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのよう
な条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有す
る核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は
，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸の
ハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００
個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブ
リダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個
のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００２６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以
下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する
：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０
．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハ
ルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗
浄。いくつかの最もストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件に
おいては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣで７０℃までの温度で行うことがで
きる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｇ４２１（図面および表を
含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。しかし，他の用途は，
これらの条件の組の間に入る条件の使用を必要とするかもしれない。所望のハイ
ブリダイゼーションを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく
知られており，いくつかの因子，例えば，限定されないが，ハイブリダイズすべ
き配列および試験すべき試料に基づく。低いストリンジェンシーの洗浄条件は，
しばしば洗浄工程の間により低い温度，例えば，６５℃，６０℃，５５℃，５０
℃，または４２℃を用いる。
下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する
：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０
．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハ
ルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗
浄。いくつかの最もストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件に
おいては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣで７０℃までの温度で行うことがで
きる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｇ４２１（図面および表を
含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。しかし，他の用途は，
これらの条件の組の間に入る条件の使用を必要とするかもしれない。所望のハイ
ブリダイゼーションを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく
知られており，いくつかの因子，例えば，限定されないが，ハイブリダイズすべ
き配列および試験すべき試料に基づく。低いストリンジェンシーの洗浄条件は，
しばしば洗浄工程の間により低い温度，例えば，６５℃，６０℃，５５℃，５０
℃，または４２℃を用いる。
【００２７】
"ドメイン"との用語は，特定の機能を含むポリペプチドの領域を表す。例えば
，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されない
が，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細
胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の
機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残部と別々に発現させて
それ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するために
は無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域と
も称され，これもまたドメインと関連する。
，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されない
が，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細
胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の
機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残部と別々に発現させて
それ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するために
は無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域と
も称され，これもまたドメインと関連する。
【００２８】
"Ｎ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの開始メチオニンと触媒
的ドメインとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列
を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを
行い，触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる
。Ｎ末端ドメインは，その長さに応じて，ホスファターゼ機能において制御的役
割を果たすかまたは果たさない。"触媒ドメイン"とは，典型的には２５−３００
アミノ酸の長さであり，高エネルギーリン酸ドナー分子，例えばＡＴＰまたはＧ
ＴＰから，それ自身（自己リン酸化）または他の蛋白質（外因性リン酸化）への
リン酸転移反応を担う蛋白質ホスファターゼの領域を表す。蛋白質ホスファター
ゼの触媒ドメインは高度に保存されたアミノ酸残基を含む１２個のサブドメイン
から構成され，正しいポリペプチドのフォールディングおよび触媒を担う。触媒
ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してをスミス・ウォー
ターマンアライメントさせた後に同定することができる。
的ドメインとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列
を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを
行い，触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる
。Ｎ末端ドメインは，その長さに応じて，ホスファターゼ機能において制御的役
割を果たすかまたは果たさない。"触媒ドメイン"とは，典型的には２５−３００
アミノ酸の長さであり，高エネルギーリン酸ドナー分子，例えばＡＴＰまたはＧ
ＴＰから，それ自身（自己リン酸化）または他の蛋白質（外因性リン酸化）への
リン酸転移反応を担う蛋白質ホスファターゼの領域を表す。蛋白質ホスファター
ゼの触媒ドメインは高度に保存されたアミノ酸残基を含む１２個のサブドメイン
から構成され，正しいポリペプチドのフォールディングおよび触媒を担う。触媒
ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してをスミス・ウォー
ターマンアライメントさせた後に同定することができる。
【００２９】
本明細書において用いられる場合，"触媒活性"との用語は，ホスファターゼ触
媒ドメインが基質をリン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，リン酸
化された生成物に変換される基質の量を時間の関数として決定することにより測
定することができる。触媒活性は，時間を一定にして定められた時間の後にリン
酸化された基質の濃度を決定することにより，本発明の方法により測定すること
ができる。基質のリン酸化は，蛋白質ホスファターゼの活性部位において生ずる
。活性部位は，通常は，基質が蛋白質ホスファターゼに結合し，リン酸化される
空洞である。
媒ドメインが基質をリン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，リン酸
化された生成物に変換される基質の量を時間の関数として決定することにより測
定することができる。触媒活性は，時間を一定にして定められた時間の後にリン
酸化された基質の濃度を決定することにより，本発明の方法により測定すること
ができる。基質のリン酸化は，蛋白質ホスファターゼの活性部位において生ずる
。活性部位は，通常は，基質が蛋白質ホスファターゼに結合し，リン酸化される
空洞である。
【００３０】
本明細書において用いられる場合，"基質"との用語は，本発明のホスファター
ゼによりリン酸化される分子を表す。ホスファターゼは，リン酸化されたセリン
／トレオニンまたはチロシンアミノ酸からリン酸基を除去する。分子は別の蛋白
質またはポリペプチドであってもよい。
ゼによりリン酸化される分子を表す。ホスファターゼは，リン酸化されたセリン
／トレオニンまたはチロシンアミノ酸からリン酸基を除去する。分子は別の蛋白
質またはポリペプチドであってもよい。
【００３１】
"Ｃ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの触媒ドメインまたは最
後の（Ｃ末端に最も近い位置の）機能的ドメインとカルボキシ末端アミノ酸残基
との間に位置する領域を表す。"機能的"ドメインとは，他の蛋白質に対するアミ
ノ酸配列ホモロジーから，または特定の構造的コンフォメーションを与えるであ
ろうアミノ酸配列の存在（例えばＮ末端ドメイン）により，制御的または触媒的
役割を果たすであろう，ポリペプチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメイン
は，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンア
ラインメントを用いて，触媒ドメインまたは任意の機能的なＣ末端の触媒外ドメ
インのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。その長さおよび
アミノ酸組成に依存して，Ｃ末端ドメインは，ホスファターゼ機能において制御
的機能を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。本発明のいくつかのホ
スファターゼについては，Ｃ末端ドメインはまた触媒ドメインを含むかもしれな
い（上述）。
後の（Ｃ末端に最も近い位置の）機能的ドメインとカルボキシ末端アミノ酸残基
との間に位置する領域を表す。"機能的"ドメインとは，他の蛋白質に対するアミ
ノ酸配列ホモロジーから，または特定の構造的コンフォメーションを与えるであ
ろうアミノ酸配列の存在（例えばＮ末端ドメイン）により，制御的または触媒的
役割を果たすであろう，ポリペプチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメイン
は，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンア
ラインメントを用いて，触媒ドメインまたは任意の機能的なＣ末端の触媒外ドメ
インのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。その長さおよび
アミノ酸組成に依存して，Ｃ末端ドメインは，ホスファターゼ機能において制御
的機能を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。本発明のいくつかのホ
スファターゼについては，Ｃ末端ドメインはまた触媒ドメインを含むかもしれな
い（上述）。
【００３２】
本明細書において用いる場合，"Ｃ末端テール"との用語は，ホモロジーにより
，その最も近いホモログのＣ末端アミノ酸を越えて伸長または突出している蛋白
質ホスファターゼのＣ末端ドメインを表す。Ｃ末端テールは，蛋白質配列を非重
複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用
いることにより，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相
同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。Ｃ末端テー
ルは，その長さに依存して，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすか
もしれないし果たさないかもしれない。
，その最も近いホモログのＣ末端アミノ酸を越えて伸長または突出している蛋白
質ホスファターゼのＣ末端ドメインを表す。Ｃ末端テールは，蛋白質配列を非重
複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用
いることにより，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相
同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。Ｃ末端テー
ルは，その長さに依存して，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすか
もしれないし果たさないかもしれない。
【００３３】
本明細書において用いる場合，"コイルドコイル構造領域"との用語は，コンピ
ュータアルゴリズム，例えばＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９６）Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：５１３−５２５）により推定してコイルド
コイル構造をとる可能性が高いポリペプチド配列を表す。コイルドコイルは，平
行な２または３個の両親媒性α−ヘリックスから形成される。コイルドコイルは
，他のポリペプチドのコイルドコイルドメインと結合してホモ二量体またはヘテ
ロ二量体を生ずることができる（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２：１１６２−１１６４）。
ュータアルゴリズム，例えばＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９６）Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：５１３−５２５）により推定してコイルド
コイル構造をとる可能性が高いポリペプチド配列を表す。コイルドコイルは，平
行な２または３個の両親媒性α−ヘリックスから形成される。コイルドコイルは
，他のポリペプチドのコイルドコイルドメインと結合してホモ二量体またはヘテ
ロ二量体を生ずることができる（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２：１１６２−１１６４）。
【００３４】
本明細書において用いる場合，"プロリンリッチ領域"との用語は，蛋白質ホス
ファターゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見い
だされるこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。
プロリンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，
標準的なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥ
ｄｉｔＳｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質
と蛋白質との相互作用に関与することが示されている。
ファターゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見い
だされるこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。
プロリンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，
標準的なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥ
ｄｉｔＳｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質
と蛋白質との相互作用に関与することが示されている。
【００３５】
本明細書において用いる場合，"スペーサー領域"との用語は，予測される機能
的ドメインの間に位置する蛋白質ホスファターゼの領域を表す。スペーサー領域
は，データベース中の任意のアミノ酸配列に対する検出可能なホモロジーを有し
ない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミスウォータ
ーマンアラインメントを用いて，これを挟む機能的ドメインのＣおよびＮ末端境
界を規定することにより同定することができる。スペーサー領域は，蛋白質ホス
ファターゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果たさないかもしれな
い。
的ドメインの間に位置する蛋白質ホスファターゼの領域を表す。スペーサー領域
は，データベース中の任意のアミノ酸配列に対する検出可能なホモロジーを有し
ない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミスウォータ
ーマンアラインメントを用いて，これを挟む機能的ドメインのＣおよびＮ末端境
界を規定することにより同定することができる。スペーサー領域は，蛋白質ホス
ファターゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果たさないかもしれな
い。
【００３６】
本明細書において用いる場合，"挿入物"との用語は，密接なホモログ中にはな
い蛋白質ホスファターゼの一部を表す。挿入物は，エクソンの選択的スプライシ
ングの産物であるかもしれないしそうではないかもしれない。挿入物は，蛋白質
配列の非重複蛋白質データベースに対するスミス−ウォーターマン配列アライン
メントを用いて，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相
同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。挿入物は，
蛋白質−蛋白質相互作用のための新規な伝達手段を提示することにより，または
そのような相互作用を妨害することにより，機能的役割を果たすかもしれない。
い蛋白質ホスファターゼの一部を表す。挿入物は，エクソンの選択的スプライシ
ングの産物であるかもしれないしそうではないかもしれない。挿入物は，蛋白質
配列の非重複蛋白質データベースに対するスミス−ウォーターマン配列アライン
メントを用いて，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相
同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。挿入物は，
蛋白質−蛋白質相互作用のための新規な伝達手段を提示することにより，または
そのような相互作用を妨害することにより，機能的役割を果たすかもしれない。
【００３７】
"シグナル伝達経路"との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播し，細
胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激するこ
とができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的には
レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよ
び非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを
含むポリペプチド，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）
およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリ
ンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅ，ホスホジエ
ステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋
結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ
，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激するこ
とができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的には
レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよ
び非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを
含むポリペプチド，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）
およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリ
ンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅ，ホスホジエ
ステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋
結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ
，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
【００３８】
別の好ましい態様においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドをコー
ドし，宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーター
をさらに含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする
。本発明はまた，組換え核酸を特徴とし，これは好ましくは細胞または生物内に
ある。組換え核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，およ
び配列番号５に記載される配列からなる群より選択される配列，またはその機能
的誘導体，および宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたは
プロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は，細胞において機能
的な転写開始領域，ホスファターゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補
的な配列および細胞において機能的な転写終止領域を含んでいてもよい。特定の
ベクターおよび宿主細胞の組み合わせは本明細書において議論される。
ドし，宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーター
をさらに含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする
。本発明はまた，組換え核酸を特徴とし，これは好ましくは細胞または生物内に
ある。組換え核酸は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，およ
び配列番号５に記載される配列からなる群より選択される配列，またはその機能
的誘導体，および宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたは
プロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は，細胞において機能
的な転写開始領域，ホスファターゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補
的な配列および細胞において機能的な転写終止領域を含んでいてもよい。特定の
ベクターおよび宿主細胞の組み合わせは本明細書において議論される。
【００３９】
"ベクター"との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲノム
中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す
。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直
鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素によ
り切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。ホ
スファターゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断
片を一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる
。
中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す
。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直
鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素によ
り切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。ホ
スファターゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断
片を一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる
。
【００４０】
"トランスフェクトする"との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞
性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含
まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理す
ることにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること
，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含
まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理す
ることにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること
，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００４１】
本明細書において用いる場合，"プロモーター"との用語は，遺伝子配列の発現
に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々
の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロ
モーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのよう
な領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例
えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々
の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロ
モーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのよう
な領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例
えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００４２】
好ましい態様においては，単離された核酸は，配列番号１，配列番号２，配列
番号３，配列番号４，および配列番号５に記載される配列からなる群より選択さ
れる核酸配列を含むか，本質的にそれからなるか，それからなり，かつ，配列番
号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載される
アミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列，その機能的誘導体，また
は配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記
載されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも３５，４０，４５，
５０，６０，７５，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸をコー
ドする。核酸は，ｃＤＮＡクローニングにより，またはサブトラクティブハイブ
リダイゼーションにより，天然の起源から単離することができる。天然の起源は
哺乳動物であることができ，好ましくはヒト，好ましくは血液，精液または組織
であり，核酸はトリエステル法によりまたは自動化ＤＮＡ合成機を用いることに
より合成してもよい。
番号３，配列番号４，および配列番号５に記載される配列からなる群より選択さ
れる核酸配列を含むか，本質的にそれからなるか，それからなり，かつ，配列番
号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載される
アミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列，その機能的誘導体，また
は配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記
載されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも３５，４０，４５，
５０，６０，７５，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸をコー
ドする。核酸は，ｃＤＮＡクローニングにより，またはサブトラクティブハイブ
リダイゼーションにより，天然の起源から単離することができる。天然の起源は
哺乳動物であることができ，好ましくはヒト，好ましくは血液，精液または組織
であり，核酸はトリエステル法によりまたは自動化ＤＮＡ合成機を用いることに
より合成してもよい。
【００４３】
"哺乳動物"とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，
およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾
サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾
サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
【００４４】
さらに別の好ましい態様においては，核酸は，例えば，追加のポリペプチドの
同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを
設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプ
ローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の
領域である。
同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを
設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプ
ローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の
領域である。
【００４５】
"保存された核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする２つま
たはそれ以上の核酸に存在する領域を意味し，特定の核酸配列は低いストリンジ
ェンシー条件下でこの領域にハイブリダイズすることができる。ホスファターゼ
ポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー
条件の例は，Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：３９９−
４０７（１９８７）およびＷａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５
２：４１５−４２３（１９８７）（図面および表を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領域は，２０ヌクレ
オチド中５個以下で異なり，より好ましくは２０ヌクレオチド中２個，最も好ま
しくは２０ヌクレオチド中１個が異なる。
たはそれ以上の核酸に存在する領域を意味し，特定の核酸配列は低いストリンジ
ェンシー条件下でこの領域にハイブリダイズすることができる。ホスファターゼ
ポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー
条件の例は，Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：３９９−
４０７（１９８７）およびＷａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５
２：４１５−４２３（１９８７）（図面および表を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領域は，２０ヌクレ
オチド中５個以下で異なり，より好ましくは２０ヌクレオチド中２個，最も好ま
しくは２０ヌクレオチド中１個が異なる。
【００４６】
"独特の核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸中に存
在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない
配列を意味する。そのような領域は，好ましくは配列番号６，配列番号７，配列
番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群
より選択される全長アミノ酸配列に記載される３２個（好ましくは４０個，より
好ましくは４５個，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸
をコードする。特に，独特の核酸領域は，好ましくは哺乳動物起源のものである
。
在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない
配列を意味する。そのような領域は，好ましくは配列番号６，配列番号７，配列
番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群
より選択される全長アミノ酸配列に記載される３２個（好ましくは４０個，より
好ましくは４５個，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸
をコードする。特に，独特の核酸領域は，好ましくは哺乳動物起源のものである
。
【００４７】
本発明の別の観点は，試料において，配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする核酸を検
出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは，配列番号１，配列番
号２，配列番号３，配列番号４，および配列番号５，またはその機能的誘導体に
記載される配列からなる群より選択される配列にハイブリダイズするであろうヌ
クレオチド塩基配列を含む。
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする核酸を検
出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは，配列番号１，配列番
号２，配列番号３，配列番号４，および配列番号５，またはその機能的誘導体に
記載される配列からなる群より選択される配列にハイブリダイズするであろうヌ
クレオチド塩基配列を含む。
【００４８】
好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号６，配列番号７，配列番
号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列またはその機
能的誘導体からなる群より選択される全長配列の，少なくとも１２，３２，７５
，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連
続するアミノ酸をコードする核酸にハイブリダイズする。
号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列またはその機
能的誘導体からなる群より選択される全長配列の，少なくとも１２，３２，７５
，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連
続するアミノ酸をコードする核酸にハイブリダイズする。
【００４９】
プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下
で試料を核酸プローブと接触させ，ホスファターゼＲＮＡに結合したプローブの
存在または量を検出することにより，試料中のホスファターゼＲＮＡの存在また
は量を検出することが含まれる。プローブとホスファターゼポリペプチドをコー
ドする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを，検出された核酸の
配列の同定において用いることができる（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ
ｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，
１９９２（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブが置かれ
ている容器手段を含むように構築することができる。
で試料を核酸プローブと接触させ，ホスファターゼＲＮＡに結合したプローブの
存在または量を検出することにより，試料中のホスファターゼＲＮＡの存在また
は量を検出することが含まれる。プローブとホスファターゼポリペプチドをコー
ドする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを，検出された核酸の
配列の同定において用いることができる（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ
ｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，
１９９２（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
）。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブが置かれ
ている容器手段を含むように構築することができる。
【００５０】
別の観点においては，本発明は，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子を含
む組換え細胞または組織を記述する。そのような細胞においては，核酸は遺伝的
制御要素の制御下にあってもよく，または外来性プロモーターを含む外来性制御
要素の制御下にあってもよい。"外来性"とは，通常はホスファターゼポリペプチ
ドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングしていないプロモータ
ーを意味する。
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子を含
む組換え細胞または組織を記述する。そのような細胞においては，核酸は遺伝的
制御要素の制御下にあってもよく，または外来性プロモーターを含む外来性制御
要素の制御下にあってもよい。"外来性"とは，通常はホスファターゼポリペプチ
ドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングしていないプロモータ
ーを意味する。
【００５１】
ポリペプチドは，好ましくは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番
号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される
全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。"フラグメ
ント"とは，ホスファターゼポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を意味する
。好ましくは，そのような配列は，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
る全長配列の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３
００個の連続するアミノ酸を含む。
号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される
全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。"フラグメ
ント"とは，ホスファターゼポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を意味する
。好ましくは，そのような配列は，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
る全長配列の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３
００個の連続するアミノ酸を含む。
【００５２】
別の観点においては，本発明は，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有する，単離された，濃縮されたまたは精製されたホスファタ
ーゼポリペプチドを特徴とする。
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有する，単離された，濃縮されたまたは精製されたホスファタ
ーゼポリペプチドを特徴とする。
【００５３】
ポリペプチドに関して"単離された"とは，互いに結合した６個（好ましくは１
２個，より好ましくは１８個，最も好ましくは２５，３２，４０，または５０個
）またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味し，天然起源から単離されたポリ
ペプチドまたは合成されたポリペプチドが含まれる。ある種の観点においては，
より長いポリペプチド，例えば，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番
号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される
全長配列の，１００，２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６０
０，７００，８００，９００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むものが
好ましい。
２個，より好ましくは１８個，最も好ましくは２５，３２，４０，または５０個
）またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味し，天然起源から単離されたポリ
ペプチドまたは合成されたポリペプチドが含まれる。ある種の観点においては，
より長いポリペプチド，例えば，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番
号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択される
全長配列の，１００，２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６０
０，７００，８００，９００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むものが
好ましい。
【００５４】
本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見
いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生
ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列
は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。こ
の用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものでは
なく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なく
とも約９０％純粋，より好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上純粋）こ
とを意味する。
いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生
ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列
は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。こ
の用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものでは
なく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なく
とも約９０％純粋，より好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上純粋）こ
とを意味する。
【００５５】
ポリペプチドに関して使用する場合，"濃縮された"との用語は，特定のアミノ
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割
合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の
量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加
により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。
しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するもので
はなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する
ことに注意すべきである。本明細書において"有意"にとの用語は，増加のレベル
がそのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のア
ミノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍
，またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ
酸配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，
例えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ
１９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所
望のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけ
るより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割
合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の
量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加
により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。
しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するもので
はなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する
ことに注意すべきである。本明細書において"有意"にとの用語は，増加のレベル
がそのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のア
ミノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍
，またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ
酸配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，
例えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ
１９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所
望のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００５６】
ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましく
は２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物
質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９
５％，または９９％純粋である。
ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）
を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋
であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍
高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましく
は２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物
質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９
５％，または９９％純粋である。
【００５７】
好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号６，配列
番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配
列からなる群より選択される全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラ
グメントである。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号６，配
列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸
配列，またはその機能的誘導体からなる群より選択される全長配列の，少なくと
も３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ
酸を含む。
番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配
列からなる群より選択される全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラ
グメントである。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号６，配
列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸
配列，またはその機能的誘導体からなる群より選択される全長配列の，少なくと
も３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ
酸を含む。
【００５８】
好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドは，
（ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；および （ｂ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，た
だし，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｎ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，
コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端
テールからなる群より選択されるドメインの１またはそれ以上が欠失している配
列； を有するアミノ酸配列を含む。
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；および （ｂ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，た
だし，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｎ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，
コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端
テールからなる群より選択されるドメインの１またはそれ以上が欠失している配
列； を有するアミノ酸配列を含む。
【００５９】
ポリペプチドは，当該技術分野においてよく知られる方法により，天然の起源
から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましく
はヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。
から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましく
はヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。
【００６０】
ある態様においては，本発明は，（ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８
，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選
択されるアミノ酸配列を有する組換えホスファターゼポリペプチドを含む。"組
換えホスファターゼポリペプチド"とは，その存在位置（例えば，天然に見いだ
される物とは異なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に生
ずるポリペプチドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポリ
ペプチドを意味する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常観
察される量とは異なる量で細胞中に存在するであろう。
，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選
択されるアミノ酸配列を有する組換えホスファターゼポリペプチドを含む。"組
換えホスファターゼポリペプチド"とは，その存在位置（例えば，天然に見いだ
される物とは異なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に生
ずるポリペプチドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポリ
ペプチドを意味する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常観
察される量とは異なる量で細胞中に存在するであろう。
【００６１】
宿主細胞中で発現させるべきポリペプチドは，異種蛋白質からの領域を含む融
合蛋白質であってもよい。そのような領域を含むことにより，例えば，分泌させ
，安定性を改良し，またはポリペプチドの精製を容易にすることができる。例え
ば，適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター中に組み込むこと
ができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を，ポリペプチドが
シグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるように，ポリヌクレオチド
配列にインフレームで融合させることができる。意図する宿主細胞において機能
的であるシグナルペプチドは，ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましく
は，シグナル配列はポリペプチドが細胞から分泌される際にポリペプチドから切
断される。すなわち，ホスファターゼポリペプチドのＮ末端が運搬ペプチドに融
合されている好ましい融合蛋白質を作成することができる。
合蛋白質であってもよい。そのような領域を含むことにより，例えば，分泌させ
，安定性を改良し，またはポリペプチドの精製を容易にすることができる。例え
ば，適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター中に組み込むこと
ができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を，ポリペプチドが
シグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるように，ポリヌクレオチド
配列にインフレームで融合させることができる。意図する宿主細胞において機能
的であるシグナルペプチドは，ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましく
は，シグナル配列はポリペプチドが細胞から分泌される際にポリペプチドから切
断される。すなわち，ホスファターゼポリペプチドのＮ末端が運搬ペプチドに融
合されている好ましい融合蛋白質を作成することができる。
【００６２】
１つの態様においては，ポリペプチドは，ポリペプチドの精製を容易にするた
めに用いられる異種領域を含む融合蛋白質を含む。そのような機能のために用い
られる入手可能なペプチドの多くは，融合蛋白質が結合パートナーに選択的に結
合することを可能とする。好ましい結合パートナーには，プロテインＡのＩｇＧ
結合ドメインの１またはそれ以上が含まれ，これは，ＩｇＧ結合セファロース等
のアフィニティークロマトグラフィーにより容易に均一にまで精製される。ある
いは，多くのベクターは，標的蛋白質のＮ末端またはＣ末端で発現されることが
できるヒスチジン残基のストレッチを有するという利点を有しており，したがっ
て，金属キレート化クロマトグラフィーにより目的とする蛋白質を回収すること
ができる。蛋白質加水分解酵素，例えばエンテロホスファターゼ，ファクターＸ
プロコラゲナーゼまたはトロンビンの認識部位をコードするヌクレオチド配列を
ホスファターゼポリペプチドの配列のすぐ上流に配置すると，融合蛋白質を切断
して成熟ホスファターゼポリペプチドを得ることができる。融合蛋白質結合パー
トナーのさらなる例には，限定されないが，酵母Ｉ−因子，ｓｆ９昆虫細胞にお
けるミツバチメラチンリーダー，６−Ｈｉｓタグ，チオレドキシンタグ，ヘマグ
ルチニンタグ，ＧＳＴタグ，およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。当業
者には理解されるように，ペプチドを認識しこれに結合する結合パートナーは，
任意のイオン，分子または化合物であることができ，例えば金属イオン（例えば
金属アフィニティーカラム），抗体，またはそのフラグメント，およびペプチド
に結合する任意の蛋白質またはペプチド，例えばＦＬＡＧタグが含まれる。
めに用いられる異種領域を含む融合蛋白質を含む。そのような機能のために用い
られる入手可能なペプチドの多くは，融合蛋白質が結合パートナーに選択的に結
合することを可能とする。好ましい結合パートナーには，プロテインＡのＩｇＧ
結合ドメインの１またはそれ以上が含まれ，これは，ＩｇＧ結合セファロース等
のアフィニティークロマトグラフィーにより容易に均一にまで精製される。ある
いは，多くのベクターは，標的蛋白質のＮ末端またはＣ末端で発現されることが
できるヒスチジン残基のストレッチを有するという利点を有しており，したがっ
て，金属キレート化クロマトグラフィーにより目的とする蛋白質を回収すること
ができる。蛋白質加水分解酵素，例えばエンテロホスファターゼ，ファクターＸ
プロコラゲナーゼまたはトロンビンの認識部位をコードするヌクレオチド配列を
ホスファターゼポリペプチドの配列のすぐ上流に配置すると，融合蛋白質を切断
して成熟ホスファターゼポリペプチドを得ることができる。融合蛋白質結合パー
トナーのさらなる例には，限定されないが，酵母Ｉ−因子，ｓｆ９昆虫細胞にお
けるミツバチメラチンリーダー，６−Ｈｉｓタグ，チオレドキシンタグ，ヘマグ
ルチニンタグ，ＧＳＴタグ，およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。当業
者には理解されるように，ペプチドを認識しこれに結合する結合パートナーは，
任意のイオン，分子または化合物であることができ，例えば金属イオン（例えば
金属アフィニティーカラム），抗体，またはそのフラグメント，およびペプチド
に結合する任意の蛋白質またはペプチド，例えばＦＬＡＧタグが含まれる。
【００６３】抗体
別の観点においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドまたはホスファ
ターゼポリペプチドドメインまたはフラグメントに対して特異的結合親和性を有
する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を特徴とし
，ここで，ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９
，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも約９０％同一の配列を有する群から選択される。"特異的
結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチドに結合す
るより高い親和性をもって標的ホスファターゼポリペプチドに結合することを意
味する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領域を
含むポリペプチドである。抗体を用いて，ホスファターゼポリペプチドの内因性
起源を同定し，細胞サイクル制御をモニターすることができ，または，ホスファ
ターゼポリペプチドの細胞中の免疫局在化に用いることができる。
ターゼポリペプチドドメインまたはフラグメントに対して特異的結合親和性を有
する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を特徴とし
，ここで，ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９
，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも約９０％同一の配列を有する群から選択される。"特異的
結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチドに結合す
るより高い親和性をもって標的ホスファターゼポリペプチドに結合することを意
味する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領域を
含むポリペプチドである。抗体を用いて，ホスファターゼポリペプチドの内因性
起源を同定し，細胞サイクル制御をモニターすることができ，または，ホスファ
ターゼポリペプチドの細胞中の免疫局在化に用いることができる。
【００６４】
"ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
【００６５】
"モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であ
る。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意
の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法
により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方
は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
る。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意
の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法
により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方
は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
【００６６】
本発明の抗体には，"ヒト化"モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が
含まれる。ヒト化抗体は，抗体の非ヒト（典型的にはネズミ）相補性決定領域が
非ヒト（例えばネズミ）免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメイ
ン中に移され，次にネズミ対応物のフレームワーク領域中のいくつかのヒト残基
が置き換えられている組換え蛋白質である。本発明にしたがうヒト化抗体は，治
療方法において用いるのに適している。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをク
ローニングする一般的手法は，例えば刊行物（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３（１９８９））
に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を製造する手法は，例えば，Ｊｏ
ｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｃａｒｔｅｒら（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）），Ｓａ
ｎｄｈｕ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）），
およびＳｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３））に記
載されている。
含まれる。ヒト化抗体は，抗体の非ヒト（典型的にはネズミ）相補性決定領域が
非ヒト（例えばネズミ）免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメイ
ン中に移され，次にネズミ対応物のフレームワーク領域中のいくつかのヒト残基
が置き換えられている組換え蛋白質である。本発明にしたがうヒト化抗体は，治
療方法において用いるのに適している。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをク
ローニングする一般的手法は，例えば刊行物（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３（１９８９））
に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を製造する手法は，例えば，Ｊｏ
ｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｃａｒｔｅｒら（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）），Ｓａ
ｎｄｈｕ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）），
およびＳｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３））に記
載されている。
【００６７】
"抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
【００６８】
本発明の抗体フラグメントには，"一本鎖抗体"が含まれる。この記載において
用いられる語句は，特異性をもって抗原と結合し，抗体の重鎖および軽鎖からの
可変または超可変領域を含む線状ポリペプチドを示す。そのような一本鎖抗体は
，一般的な方法論により製造することができる。ＦｖフラグメントのＶｈおよび
Ｖｌ領域を共有結合させ，ジスルフィド結合を導入することにより安定化させる
。Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３６２（１９９０
））を参照。あるいは，ペプチドリンカーを挿入することによりＶｈおよびＶｌ
領域を結合させることができる。Ｖｈ，Ｖｌおよびペプチドリンカー配列をコー
ドする遺伝子は，組換え発現ベクターを用いて構築し発現させることができる。
Ｃｏｌｃｈｅｒら（Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１
（１９９０））を参照。ＶｈおよびＶｌ抗体鎖からの超可変領域を含むアミノ酸
配列もまた，ジスルフィド結合またはペプチドリンカーを用いて構築することが
できる。
用いられる語句は，特異性をもって抗原と結合し，抗体の重鎖および軽鎖からの
可変または超可変領域を含む線状ポリペプチドを示す。そのような一本鎖抗体は
，一般的な方法論により製造することができる。ＦｖフラグメントのＶｈおよび
Ｖｌ領域を共有結合させ，ジスルフィド結合を導入することにより安定化させる
。Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３６２（１９９０
））を参照。あるいは，ペプチドリンカーを挿入することによりＶｈおよびＶｌ
領域を結合させることができる。Ｖｈ，Ｖｌおよびペプチドリンカー配列をコー
ドする遺伝子は，組換え発現ベクターを用いて構築し発現させることができる。
Ｃｏｌｃｈｅｒら（Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１
（１９９０））を参照。ＶｈおよびＶｌ抗体鎖からの超可変領域を含むアミノ酸
配列もまた，ジスルフィド結合またはペプチドリンカーを用いて構築することが
できる。
【００６９】
本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体
または抗体フラグメントは，試料をホスファターゼ−抗体免疫複合体の形成に適
した条件下で抗体で探索し，ホスファターゼポリペプチドに結合した抗体の存在
および／または量を検出することにより，試料中のホスファターゼポリペプチド
の存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのよう
な方法を実施するための診断キットは，ホスファターゼに特異的な抗体または抗
体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュ
ゲートを含むように構築することができる。
または抗体フラグメントは，試料をホスファターゼ−抗体免疫複合体の形成に適
した条件下で抗体で探索し，ホスファターゼポリペプチドに結合した抗体の存在
および／または量を検出することにより，試料中のホスファターゼポリペプチド
の存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのよう
な方法を実施するための診断キットは，ホスファターゼに特異的な抗体または抗
体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュ
ゲートを含むように構築することができる。
【００７０】
本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体
または抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精
製することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真
核生物の両方において，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。
ポリペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
または抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精
製することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真
核生物の両方において，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。
ポリペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
【００７１】
本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体
は，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ホスファター
ゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，
試料中のホスファターゼポリペプチドの存在および／または量を検出するための
方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キット
は，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射
性同位体）を含む第２の容器を含むように構築することができる。診断キットは
また，ＦＤＡに認可された使用の通知およびその指針を含んでいてもよい。
は，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ホスファター
ゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，
試料中のホスファターゼポリペプチドの存在および／または量を検出するための
方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キット
は，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射
性同位体）を含む第２の容器を含むように構築することができる。診断キットは
また，ＦＤＡに認可された使用の通知およびその指針を含んでいてもよい。
【００７２】
別の観点においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドまたはホスファ
ターゼポリペプチドドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生する
ハイブリドーマを特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７
，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列から
なる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択される。"ハイブリドー
マ"とは，抗体，例えば本発明のホスファターゼに対する抗体を分泌しうる不死
化細胞株を意味する。好ましい態様においては，ホスファターゼに対する抗体は
，本発明のホスファターゼポリペプチドに特異的に結合することができるアミノ
酸の配列を含む。
ターゼポリペプチドドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生する
ハイブリドーマを特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７
，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列から
なる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択される。"ハイブリドー
マ"とは，抗体，例えば本発明のホスファターゼに対する抗体を分泌しうる不死
化細胞株を意味する。好ましい態様においては，ホスファターゼに対する抗体は
，本発明のホスファターゼポリペプチドに特異的に結合することができるアミノ
酸の配列を含む。
【００７３】
別の観点においては，本発明はまた，上述したいずれかの核酸分子によりコー
ドされるポリペプチドに結合する抗体，および負対照抗体を含むキットに関する
。
ドされるポリペプチドに結合する抗体，および負対照抗体を含むキットに関する
。
【００７４】
"負対照抗体"との用語は，特異的結合親和性を有する抗体と類似の起源に由来
するが，本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示さない抗体を表す。
するが，本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示さない抗体を表す。
【００７５】
別の観点においては，本発明は，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有する群から選択されるホスファターゼポリペプチドに結合す
ることができるホスファターゼポリペプチド結合剤を特徴とする。結合剤は，好
ましくは，本発明のホスファターゼポリペプチド上に存在するエピトープを認識
する精製された抗体である。他の結合剤には，ホスファターゼポリペプチドに結
合する分子およびホスファターゼポリペプチドに結合する類似の分子が含まれる
。そのような結合剤は，ホスファターゼ結合パートナー活性を測定するアッセイ
を用いて同定することができる。
番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有する群から選択されるホスファターゼポリペプチドに結合す
ることができるホスファターゼポリペプチド結合剤を特徴とする。結合剤は，好
ましくは，本発明のホスファターゼポリペプチド上に存在するエピトープを認識
する精製された抗体である。他の結合剤には，ホスファターゼポリペプチドに結
合する分子およびホスファターゼポリペプチドに結合する類似の分子が含まれる
。そのような結合剤は，ホスファターゼ結合パートナー活性を測定するアッセイ
を用いて同定することができる。
【００７６】ホスファターゼポリペプチドを検出するためのスクリーニング方法
本発明はまた，本発明のホスファターゼポリペプチドまたは同等の配列を含む
ヒト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野にお
いて日常的かつ標準的な技術，例えば本発明のホスファターゼの同定のために本
明細書において記載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブ
ロット分析，インシトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，
ヒト細胞において新規ポリペプチドを同定することを含む。
ヒト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野にお
いて日常的かつ標準的な技術，例えば本発明のホスファターゼの同定のために本
明細書において記載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブ
ロット分析，インシトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，
ヒト細胞において新規ポリペプチドを同定することを含む。
【００７７】ホスファターゼ活性を腸背鬱する物質を同定するためのスクリーニング方法
別の観点においては，本発明は，ホスファターゼ活性を調節する物質を同定す
る方法を特徴とする。該方法は，（ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むホスファターゼポリペプチドを
試験物質と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）前
記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する，の各工程を含む
。より好ましくは，配列は，挙げられる配列と少なくとも約９０％，９１％，９
２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性
を有する。
る方法を特徴とする。該方法は，（ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むホスファターゼポリペプチドを
試験物質と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）前
記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する，の各工程を含む
。より好ましくは，配列は，挙げられる配列と少なくとも約９０％，９１％，９
２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性
を有する。
【００７８】
"調節する"との用語は，化合物が本発明のホスファターゼの機能を変化させる
能力を表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度
に依存して本発明のホスファターゼの活性を活性化するかまたは阻害する。
能力を表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度
に依存して本発明のホスファターゼの活性を活性化するかまたは阻害する。
【００７９】
"調節する"との用語はまた，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に
複合体が形成される確率を増加または減少させることにより，本発明のホスファ
ターゼの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼと
天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，
より好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度に依存してホスファ
ターゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減
少させ，最も好ましくは，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に複合
体が形成される確率を減少させる。
複合体が形成される確率を増加または減少させることにより，本発明のホスファ
ターゼの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼと
天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，
より好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度に依存してホスファ
ターゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減
少させ，最も好ましくは，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に複合
体が形成される確率を減少させる。
【００８０】
"活性化する"との用語は，ホスファターゼの細胞活性を増加させることを表す
。阻害するとの用語は，ホスファターゼの細胞活性を減少させることを表す。ホ
スファターゼ活性は，好ましくは，天然の結合パートナーと相互作用し，その後
，リン酸化された基質からリン酸を除去することである。
。阻害するとの用語は，ホスファターゼの細胞活性を減少させることを表す。ホ
スファターゼ活性は，好ましくは，天然の結合パートナーと相互作用し，その後
，リン酸化された基質からリン酸を除去することである。
【００８１】
"複合体"との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シ
グナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を
含む。
グナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を
含む。
【００８２】
"天然の結合パートナー"との用語は，細胞中でホスファターゼに結合するポリ
ペプチド，脂質，小分子，または核酸を表す。ホスファターゼと天然の結合パー
トナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少
，またはホスファターゼ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少
として現れることができる。
ペプチド，脂質，小分子，または核酸を表す。ホスファターゼと天然の結合パー
トナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少
，またはホスファターゼ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少
として現れることができる。
【００８３】
本明細書において用いる場合，"接触させる"との用語は，試験化合物を含む溶
液を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物
を含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の
成分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合
物を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基
づく装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
液を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物
を含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の
成分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合
物を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基
づく装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
【００８４】
別の観点においては，本発明は，細胞においてホスファターゼ活性を調節する
物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞においてホスファター
ゼポリペプチドを発現させ，ここで前記ポリペプチドは，配列番号６，配列番号
７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択され；（ｂ）試験物質
を前記細胞に加え；そして（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結
合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする，の各工程を含む。
物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞においてホスファター
ゼポリペプチドを発現させ，ここで前記ポリペプチドは，配列番号６，配列番号
７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有する群から選択され；（ｂ）試験物質
を前記細胞に加え；そして（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結
合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする，の各工程を含む。
【００８５】
本明細書において用いる場合，"発現"との用語は，細胞中でホスファターゼ遺
伝子を含む核酸ベクターから本発明のホスファターゼが産生されることを表す。
本明細書に記載されるように，核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知ら
れる手法を用いて細胞中にトランスフェクトする。
伝子を含む核酸ベクターから本発明のホスファターゼが産生されることを表す。
本明細書に記載されるように，核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知ら
れる手法を用いて細胞中にトランスフェクトする。
【００８６】
本発明の別の観点は，本発明のホスファターゼポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法に関する。該方法は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接
触させ，化合物がホスファターゼポリペプチドに結合するか否かを判定すること
を含む。結合は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが
，ゲルシフトアッセイ，ウエスタンブロット，放射性標識競合アッセイ，ファー
ジに基づく発現クローニング，クロマトグラフィーによる共分画，共沈澱，架橋
，相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析，サウスウエスタン分析，ＥＬＩＳ
Ａ等により判定することができる。このようなアッセイは，例えば，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９
９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体を本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されている。スクリーニングすべき化合物には，限定
されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源の化合物が含まれる。
を同定する方法に関する。該方法は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接
触させ，化合物がホスファターゼポリペプチドに結合するか否かを判定すること
を含む。結合は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが
，ゲルシフトアッセイ，ウエスタンブロット，放射性標識競合アッセイ，ファー
ジに基づく発現クローニング，クロマトグラフィーによる共分画，共沈澱，架橋
，相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析，サウスウエスタン分析，ＥＬＩＳ
Ａ等により判定することができる。このようなアッセイは，例えば，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９
９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体を本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されている。スクリーニングすべき化合物には，限定
されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源の化合物が含まれる。
【００８７】
本発明の方法はまた，標識，例えば放射性標識（例えば125Ｉ，35Ｓ，32Ｐ，3 3
Ｐ，3Ｈ），蛍光標識，化学発光標識，酵素標識および免疫学的標識に結合した
化合物を包含する。そのような試験において用いるホスファターゼポリペプチド
は，溶液中で遊離であってもよく，固体支持体に結合していてもよく，細胞表面
上に存在してもよく，細胞内に存在してもよく，または細胞の一部に付随してい
てもよい。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物との間
の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物によ
り引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成
の減少を調べることができる。
化合物を包含する。そのような試験において用いるホスファターゼポリペプチド
は，溶液中で遊離であってもよく，固体支持体に結合していてもよく，細胞表面
上に存在してもよく，細胞内に存在してもよく，または細胞の一部に付随してい
てもよい。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物との間
の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物によ
り引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成
の減少を調べることができる。
【００８８】
他のアッセイを用いて，酵素活性を調べることができる。これには，限定され
ないが，測光法，放射線法，ＨＰＬＣ，電気化学的方法等が含まれ，これは，例
えば，Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，ｅｄｓ．Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ，１９９
２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（その全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載されている。
ないが，測光法，放射線法，ＨＰＬＣ，電気化学的方法等が含まれ，これは，例
えば，Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，ｅｄｓ．Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ，１９９
２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（その全体を本明細書の
一部としてここに引用する）に記載されている。
【００８９】
本発明の別の観点は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接触させ，化合
物がホスファターゼポリペプチドの活性を調節するか否かを判定することを含む
，ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する（すなわち，増加または減少さ
せる）化合物を同定する方法に関する。これらの化合物はまた，"蛋白質ホスフ
ァターゼの調節剤"と称される。試験化合物の存在下における活性を，試験化合
物の非存在下における活性に対して測定する。試験化合物を含む試料の活性が試
験化合物を含まない試料の活性より高い場合，その化合物は活性を増加させたの
であろう。同様に，試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の
活性より低い場合，その化合物は活性を阻害したのであろう。
物がホスファターゼポリペプチドの活性を調節するか否かを判定することを含む
，ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する（すなわち，増加または減少さ
せる）化合物を同定する方法に関する。これらの化合物はまた，"蛋白質ホスフ
ァターゼの調節剤"と称される。試験化合物の存在下における活性を，試験化合
物の非存在下における活性に対して測定する。試験化合物を含む試料の活性が試
験化合物を含まない試料の活性より高い場合，その化合物は活性を増加させたの
であろう。同様に，試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の
活性より低い場合，その化合物は活性を阻害したのであろう。
【００９０】
本発明は，種々の薬剤スクリーニング手法のいずれかにおいてホスファターゼ
ポリペプチドを用いて化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリ
ーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または
化学的起源のものが含まれる。そのような試験において用いるホスファターゼポ
リペプチドは，任意の形状であることができ，好ましくは，溶液中で遊離してい
るか，固体支持体に結合しているか，細胞表面上に存在するか，または細胞内に
存在する。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物の間の
複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により
引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の
減少を調べることができる。
ポリペプチドを用いて化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリ
ーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または
化学的起源のものが含まれる。そのような試験において用いるホスファターゼポ
リペプチドは，任意の形状であることができ，好ましくは，溶液中で遊離してい
るか，固体支持体に結合しているか，細胞表面上に存在するか，または細胞内に
存在する。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物の間の
複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により
引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の
減少を調べることができる。
【００９１】
本発明のホスファターゼポリペプチドの活性は，例えば，化学的に合成された
ペプチドリガンドに結合するかまたはそれにより活性化される能力を調べること
により決定することができる。あるいは，ホスファターゼポリペプチドの活性は
，カルシウム等の金属イオン，ホルモン，ケモカイン，神経ペプチド，神経伝達
物質，ヌクレオチド，脂質，臭気物質，および光子に結合する能力を調べること
によりアッセイすることができる。すなわち，ホスファターゼポリペプチドの活
性の調節剤は，ホスファターゼの機能，例えばホスファターゼの結合特性または
シグナル伝達等の活性または膜局在を変化させるであろう。
ペプチドリガンドに結合するかまたはそれにより活性化される能力を調べること
により決定することができる。あるいは，ホスファターゼポリペプチドの活性は
，カルシウム等の金属イオン，ホルモン，ケモカイン，神経ペプチド，神経伝達
物質，ヌクレオチド，脂質，臭気物質，および光子に結合する能力を調べること
によりアッセイすることができる。すなわち，ホスファターゼポリペプチドの活
性の調節剤は，ホスファターゼの機能，例えばホスファターゼの結合特性または
シグナル伝達等の活性または膜局在を変化させるであろう。
【００９２】
本発明の方法の種々の態様においては，アッセイは，酵母成長アッセイ，エク
オリンアッセイ，ルシフェラーゼアッセイ，有糸分裂促進アッセイ，ＭＡＰホス
ファターゼ活性アッセイ，ならびに当該技術分野において一般に知られている結
合または機能に基づくホスファターゼ活性の他のアッセイの形をとることができ
る。これらの態様のいくつかにおいては，本発明は，レセプターおよび非レセプ
ター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホス
ファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含有するポリペプチド，ホ
スホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン
結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（
ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅｓ，ホスホジエステラーゼ，ホスホ
リパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭ
Ｐ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，
ヌクレオチド交換因子，および転写因子の任意のものを含む。本発明にしたがう
ホスファターゼの生物学的活性には，限定されないが，天然のまたは合成のリガ
ンドの結合，ならびに当該技術分野において知られるホスファターゼの機能的活
性のいずれかが含まれる。ホスファターゼ活性の非限定的例には，ホスファター
ゼ結合相互作用および／またはシグナル伝達に及ぼす影響を含む種々の形の貫膜
シグナリングが含まれる。
オリンアッセイ，ルシフェラーゼアッセイ，有糸分裂促進アッセイ，ＭＡＰホス
ファターゼ活性アッセイ，ならびに当該技術分野において一般に知られている結
合または機能に基づくホスファターゼ活性の他のアッセイの形をとることができ
る。これらの態様のいくつかにおいては，本発明は，レセプターおよび非レセプ
ター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホス
ファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含有するポリペプチド，ホ
スホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン
結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（
ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅｓ，ホスホジエステラーゼ，ホスホ
リパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭ
Ｐ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，
ヌクレオチド交換因子，および転写因子の任意のものを含む。本発明にしたがう
ホスファターゼの生物学的活性には，限定されないが，天然のまたは合成のリガ
ンドの結合，ならびに当該技術分野において知られるホスファターゼの機能的活
性のいずれかが含まれる。ホスファターゼ活性の非限定的例には，ホスファター
ゼ結合相互作用および／またはシグナル伝達に及ぼす影響を含む種々の形の貫膜
シグナリングが含まれる。
【００９３】
本発明の調節剤は，種々の化学構造を示し，これは一般に，天然のホスファタ
ーゼリガンドの模倣体，およびホスファターゼのペプチドおよび非ペプチドアロ
ステリックエフェクターに分類することができる。本発明は適切な調節剤の起源
を限定するものではなく，これは，天然起源，例えば植物，動物または無機抽出
物，または非天然起源，例えば小分子ライブラリ（コンビナトリアル化学方法に
より構築したライブラリを含む）およびペプチドライブラリから得ることができ
る。
ーゼリガンドの模倣体，およびホスファターゼのペプチドおよび非ペプチドアロ
ステリックエフェクターに分類することができる。本発明は適切な調節剤の起源
を限定するものではなく，これは，天然起源，例えば植物，動物または無機抽出
物，または非天然起源，例えば小分子ライブラリ（コンビナトリアル化学方法に
より構築したライブラリを含む）およびペプチドライブラリから得ることができ
る。
【００９４】
ホスファターゼをコードするｃＤＮＡを薬剤発見において用いることはよく知
られている。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において１日に数千種
類の未知の化合物を試験することができるアッセイが詳細に提供されている。文
献は，薬剤発見のためにＨＴＳ結合アッセイにおいて放射性標識リガンドを使用
する例を多数記載している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４を参照；総説につ
いては，Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。結合アッセイＨＴＳのためには，組
換えレセプターが好ましい。これは特異性がより高く（より高い相対純度），大
量のレセプター材料を生成する能力を提供し，広範な種類のフォーマットで用い
ることができるためである（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，１９９２，１０，９７３−９８０を参照；その全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する）。
られている。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において１日に数千種
類の未知の化合物を試験することができるアッセイが詳細に提供されている。文
献は，薬剤発見のためにＨＴＳ結合アッセイにおいて放射性標識リガンドを使用
する例を多数記載している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４を参照；総説につ
いては，Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。結合アッセイＨＴＳのためには，組
換えレセプターが好ましい。これは特異性がより高く（より高い相対純度），大
量のレセプター材料を生成する能力を提供し，広範な種類のフォーマットで用い
ることができるためである（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，１９９２，１０，９７３−９８０を参照；その全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する）。
【００９５】
組換えレセプターの機能的発現には種々の異種システムが利用可能であり，当
業者にはよく知られている。そのようなシステムには，細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒ
ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８），酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅ
ｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４
），何種類かの昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙ
ｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８），両生類細胞（Ｊａｙａｗ
ｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）およびいくつかの哺
乳動物細胞株（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ等；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３を
参照）が含まれる。これらの例は他の可能な細胞発現システム，例えば線虫から
得られる細胞株を使用することを排除するものではない（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／
３７１７７）。
業者にはよく知られている。そのようなシステムには，細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒ
ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８），酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅ
ｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４
），何種類かの昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙ
ｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８），両生類細胞（Ｊａｙａｗ
ｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）およびいくつかの哺
乳動物細胞株（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ等；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３を
参照）が含まれる。これらの例は他の可能な細胞発現システム，例えば線虫から
得られる細胞株を使用することを排除するものではない（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／
３７１７７）。
【００９６】
発現されたホスファターゼを，その規定されたリガンド（この場合にはこれを
活性化する対応するペプチド）とともにＨＴＳ結合アッセイにおいて用いること
ができる。同定されたペプチドは，適当な放射性同位体，例えば，限定されない
が，125Ｉ，3Ｈ，35Ｓまたは32Ｐで，当業者によく知られる方法により標識する
。あるいは，ペプチドは，適当な蛍光誘導体を用いてよく知られる方法により標
識してもよい（Ｂａｉｎｄｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，
１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙ Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換え蛋白質を発現する細
胞株から作成した膜調節物において，レセプターに特異的に結合する放射活性リ
ガンドは，いくつかの標準的な方法の１つ，例えば，レセプター−リガンド複合
体を濾過して結合したリガンドを未結合リガンドから分離する方法において，Ｈ
ＴＳアッセイにより検出することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ
．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４．；Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５
５）。別の方法としては，シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはその
ような分離を必要としないフラッシュプレート（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ）フォー
マットが挙げられる（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１；Ｂｏｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−
２９２．）。蛍光リガンドの結合は，例えば，蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）
，結合したリガンドの直接分光蛍光分析，または蛍光分極等の種々の方法により
検出することができる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄ
ａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
活性化する対応するペプチド）とともにＨＴＳ結合アッセイにおいて用いること
ができる。同定されたペプチドは，適当な放射性同位体，例えば，限定されない
が，125Ｉ，3Ｈ，35Ｓまたは32Ｐで，当業者によく知られる方法により標識する
。あるいは，ペプチドは，適当な蛍光誘導体を用いてよく知られる方法により標
識してもよい（Ｂａｉｎｄｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，
１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙ Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換え蛋白質を発現する細
胞株から作成した膜調節物において，レセプターに特異的に結合する放射活性リ
ガンドは，いくつかの標準的な方法の１つ，例えば，レセプター−リガンド複合
体を濾過して結合したリガンドを未結合リガンドから分離する方法において，Ｈ
ＴＳアッセイにより検出することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ
．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４．；Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５
５）。別の方法としては，シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはその
ような分離を必要としないフラッシュプレート（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ）フォー
マットが挙げられる（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１；Ｂｏｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−
２９２．）。蛍光リガンドの結合は，例えば，蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）
，結合したリガンドの直接分光蛍光分析，または蛍光分極等の種々の方法により
検出することができる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄ
ａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
【００９７】
ホスファターゼおよび異種ホスファターゼポリペプチドの機能的発現に必要な
天然の結合パートナーは，宿主細胞の天然の構成物であってもよく，またはよく
知られる組換え技術により導入してもよい。ホスファターゼポリペプチドは無傷
であってもよく，キメラであってもよい。ホスファターゼ活性化により他の天然
蛋白質が刺激または阻害され，これらの事象を測定可能な応答に連結させること
ができる。
天然の結合パートナーは，宿主細胞の天然の構成物であってもよく，またはよく
知られる組換え技術により導入してもよい。ホスファターゼポリペプチドは無傷
であってもよく，キメラであってもよい。ホスファターゼ活性化により他の天然
蛋白質が刺激または阻害され，これらの事象を測定可能な応答に連結させること
ができる。
【００９８】
そのような生物学的応答の例には，限定されないが，以下のものが含まれる：
特別に遺伝子工学処理した酵母細胞において制限栄養の非存在下で生存する能力
（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７
，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定される細胞内Ｃａ2+濃度の変化
（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ
．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光の変化を用いてリガンド誘
導性の膜電位または細胞内ｐＨの変化をモニターすることもできる。このような
目的のためにＨＴＳのための自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄ
ｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１
９９６，１，７５−８０）。共通のセカンドを測定するためのアッセイもまた利
用可能であるが，これらは一般的にはＨＴＳには好ましくない。
特別に遺伝子工学処理した酵母細胞において制限栄養の非存在下で生存する能力
（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７
，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定される細胞内Ｃａ2+濃度の変化
（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ
．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光の変化を用いてリガンド誘
導性の膜電位または細胞内ｐＨの変化をモニターすることもできる。このような
目的のためにＨＴＳのための自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄ
ｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１
９９６，１，７５−８０）。共通のセカンドを測定するためのアッセイもまた利
用可能であるが，これらは一般的にはＨＴＳには好ましくない。
【００９９】
本発明は，ホスファターゼポリペプチドに結合するリガンドの阻害剤をスクリ
ーニングし同定する多数のアッセイを企図する。１つの例においては，ホスファ
ターゼポリペプチドを固定化し，候補調節剤，例えば阻害剤化合物の存在下およ
び非存在下において，結合パートナーとの相互作用を評価することができる。別
の例においては，ホスファターゼポリペプチドとその結合パートナーとの間の相
互作用は，溶液アッセイにおいて，候補阻害剤化合物の存在下および非存在下の
両方で評価することができる。いずれのアッセイにおいても，阻害剤はホスファ
ターゼポリペプチドとその天然の結合パートナーとの間の結合を減少させる化合
物として同定される。別の企図されるアッセイには，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／
２０６５２（１９９５年８月３日公開；図面および表を含め本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されるような，トランスフォームしたまたはトランス
フェクトした宿主細胞におけるポジティブシグナルの検出により蛋白質／蛋白質
相互作用の阻害剤を同定する，ジハイブリッドアッセイの変種が含まれる。
ーニングし同定する多数のアッセイを企図する。１つの例においては，ホスファ
ターゼポリペプチドを固定化し，候補調節剤，例えば阻害剤化合物の存在下およ
び非存在下において，結合パートナーとの相互作用を評価することができる。別
の例においては，ホスファターゼポリペプチドとその結合パートナーとの間の相
互作用は，溶液アッセイにおいて，候補阻害剤化合物の存在下および非存在下の
両方で評価することができる。いずれのアッセイにおいても，阻害剤はホスファ
ターゼポリペプチドとその天然の結合パートナーとの間の結合を減少させる化合
物として同定される。別の企図されるアッセイには，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／
２０６５２（１９９５年８月３日公開；図面および表を含め本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されるような，トランスフォームしたまたはトランス
フェクトした宿主細胞におけるポジティブシグナルの検出により蛋白質／蛋白質
相互作用の阻害剤を同定する，ジハイブリッドアッセイの変種が含まれる。
【０１００】
本発明により企図される調節剤の候補には，潜在的活性化剤または潜在的阻害
剤のいずれかのライブラリから選択される化合物が含まれる。小分子調節剤の同
定に用いられる多くの多様なライブラリが存在し，これには，例えば，（１）化
学ライブラリ，（２）天然産物ライブラリ，および（３）ランダムペプチド，オ
リゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリが
含まれる。化学ライブラリはランダムな化学構造から構成され，その一部は既知
の化合物の類似体または他の薬剤発見スクリーニングにおいて"ヒット"または"
リード"として同定された化合物の類似体であるが，別のものは天然産物から誘
導され，さらに別のものは，無指向性有機合成化学から生ずる。天然産物ライブ
ラリは，（１）土壌，植物または海洋生物からの培養液の発酵および抽出，また
は（２）植物または海洋生物の抽出，によりスクリーニング用の混合物を作成す
るために用いられる，微生物，動物，植物，または海洋生物の収集物である。天
然産物ライブラリには，ポリケタイド，非リボソームペプチド，およびそれらの
変種（天然に生じない）が含まれる。総説については，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２
：６３−６８（１９９８）を参照。コンビナトリアルライブラリは，混合物とし
ての多数のペプチド，オリゴヌクレオチド，または有機化合物から構成される。
これらのライブラリは，伝統的自動化合成法，ＰＣＲ，クローニング，または私
有の合成法により比較的容易に製造することができる。特に興味深いものは非ペ
プチドコンビナトリアルライブラリである。さらに興味深い他のライブラリには
，ペプチド，蛋白質，ペプチド模倣物，多重平行合成収集物，リコンビナトリア
ル，およびポリペプチドライブラリが含まれる。コンビナトリアルケミストリお
よびこれから作成されるライブラリの総説については，Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照。本
明細書に記載される，種々のライブラリを用いる調節剤の同定により，候補物質
である"ヒット"（または"リード"）を改変して，"ヒット"が活性を調節する能力
を最適化することができる。
剤のいずれかのライブラリから選択される化合物が含まれる。小分子調節剤の同
定に用いられる多くの多様なライブラリが存在し，これには，例えば，（１）化
学ライブラリ，（２）天然産物ライブラリ，および（３）ランダムペプチド，オ
リゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリが
含まれる。化学ライブラリはランダムな化学構造から構成され，その一部は既知
の化合物の類似体または他の薬剤発見スクリーニングにおいて"ヒット"または"
リード"として同定された化合物の類似体であるが，別のものは天然産物から誘
導され，さらに別のものは，無指向性有機合成化学から生ずる。天然産物ライブ
ラリは，（１）土壌，植物または海洋生物からの培養液の発酵および抽出，また
は（２）植物または海洋生物の抽出，によりスクリーニング用の混合物を作成す
るために用いられる，微生物，動物，植物，または海洋生物の収集物である。天
然産物ライブラリには，ポリケタイド，非リボソームペプチド，およびそれらの
変種（天然に生じない）が含まれる。総説については，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２
：６３−６８（１９９８）を参照。コンビナトリアルライブラリは，混合物とし
ての多数のペプチド，オリゴヌクレオチド，または有機化合物から構成される。
これらのライブラリは，伝統的自動化合成法，ＰＣＲ，クローニング，または私
有の合成法により比較的容易に製造することができる。特に興味深いものは非ペ
プチドコンビナトリアルライブラリである。さらに興味深い他のライブラリには
，ペプチド，蛋白質，ペプチド模倣物，多重平行合成収集物，リコンビナトリア
ル，およびポリペプチドライブラリが含まれる。コンビナトリアルケミストリお
よびこれから作成されるライブラリの総説については，Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照。本
明細書に記載される，種々のライブラリを用いる調節剤の同定により，候補物質
である"ヒット"（または"リード"）を改変して，"ヒット"が活性を調節する能力
を最適化することができる。
【０１０１】
本発明により企図される他の候補阻害剤を設計することができ，これには溶解
性型の結合パートナー，ならびにキメラ，または融合蛋白質等の結合パートナー
が含まれる。本明細書において用いる場合，"結合パートナー"は，上述したよう
な天然の結合パートナーならびにキメラポリペプチド，天然のリガンド以外のペ
プチド調節剤，抗体，抗体フラグメント，および同定されたホスファターゼ遺伝
子の発現産物に免疫特異的な抗体ドメインを含む改変型化合物を広く包含する。
性型の結合パートナー，ならびにキメラ，または融合蛋白質等の結合パートナー
が含まれる。本明細書において用いる場合，"結合パートナー"は，上述したよう
な天然の結合パートナーならびにキメラポリペプチド，天然のリガンド以外のペ
プチド調節剤，抗体，抗体フラグメント，および同定されたホスファターゼ遺伝
子の発現産物に免疫特異的な抗体ドメインを含む改変型化合物を広く包含する。
【０１０２】
ホスファターゼポリペプチドの特異的ペプチドリガンドを同定するために他の
アッセイを用いることができ，これには，試験リガンドの標的蛋白質への直接結
合の測定により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイ，ならびにイオンスプ
レー質量分析計／ＨＰＬＣ方法を用いてアフィニティー限外濾過により標的蛋白
質のリガンドを同定するアッセイ，または他の物理学的および分析的方法が含ま
れる。あるいは，そのような結合相互作用は，Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９），およびＦｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１
９９４）（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載される酵母ツ
ーハイブリッド系を用いて間接的に評価することができる。ツーハイブリッド系
は２つの蛋白質またはポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝子アッ
セイである。これを用いて，目的とする既知の蛋白質または線引きされたドメイ
ンまたは相互作用に重要な残基に結合する蛋白質を同定することができる。この
方法論の変形が，ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のクローニング，蛋白質
に結合するペプチドの同定，および薬剤のスクリーニング用に開発されている。
ツーハイブリッド系は，１対の相互作用する蛋白質が転写活性化ドメインをレポ
ーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインの近く
に配置させる能力を利用しており，一般に酵母において行われる。アッセイにお
いては，（１）第１の蛋白質に融合されたＤＮＡ結合ドメイン，および（２）第
２の蛋白質に融合された活性化ドメイン，をコードする２つのハイブリッド遺伝
子を構築することが必要である。ＤＮＡ結合ドメインは，第１のハイブリッド蛋
白質をレポーター遺伝子のＵＡＳにターゲティングする。しかし，ほとんどの蛋
白質は活性化ドメインを有していないため，このＤＮＡ結合ハイブリッド蛋白質
はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブ
リッド蛋白質は，ＵＡＳに結合しないため，それ自身ではレポーター遺伝子の発
現を活性化しない。しかし，両方のハイブリッド蛋白質が存在する場合には，第
１の蛋白質と第２の蛋白質との非共有結合的相互作用が活性化ドメインをＵＡＳ
につなぎ，レポーター遺伝子の転写を活性化させる。例えば，第１の蛋白質が，
他の蛋白質または核酸と相互作用することが知られているホスファターゼ遺伝子
産物，またはそのフラグメントである場合，このアッセイを用いて結合相互作用
に干渉する薬剤を検出することができる。異なる試験薬剤を系に添加してレポー
ター遺伝子の発現をモニターする。阻害剤が存在すると，レポーターシグナルが
発生しない。
アッセイを用いることができ，これには，試験リガンドの標的蛋白質への直接結
合の測定により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイ，ならびにイオンスプ
レー質量分析計／ＨＰＬＣ方法を用いてアフィニティー限外濾過により標的蛋白
質のリガンドを同定するアッセイ，または他の物理学的および分析的方法が含ま
れる。あるいは，そのような結合相互作用は，Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９），およびＦｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１
９９４）（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載される酵母ツ
ーハイブリッド系を用いて間接的に評価することができる。ツーハイブリッド系
は２つの蛋白質またはポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝子アッ
セイである。これを用いて，目的とする既知の蛋白質または線引きされたドメイ
ンまたは相互作用に重要な残基に結合する蛋白質を同定することができる。この
方法論の変形が，ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のクローニング，蛋白質
に結合するペプチドの同定，および薬剤のスクリーニング用に開発されている。
ツーハイブリッド系は，１対の相互作用する蛋白質が転写活性化ドメインをレポ
ーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインの近く
に配置させる能力を利用しており，一般に酵母において行われる。アッセイにお
いては，（１）第１の蛋白質に融合されたＤＮＡ結合ドメイン，および（２）第
２の蛋白質に融合された活性化ドメイン，をコードする２つのハイブリッド遺伝
子を構築することが必要である。ＤＮＡ結合ドメインは，第１のハイブリッド蛋
白質をレポーター遺伝子のＵＡＳにターゲティングする。しかし，ほとんどの蛋
白質は活性化ドメインを有していないため，このＤＮＡ結合ハイブリッド蛋白質
はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブ
リッド蛋白質は，ＵＡＳに結合しないため，それ自身ではレポーター遺伝子の発
現を活性化しない。しかし，両方のハイブリッド蛋白質が存在する場合には，第
１の蛋白質と第２の蛋白質との非共有結合的相互作用が活性化ドメインをＵＡＳ
につなぎ，レポーター遺伝子の転写を活性化させる。例えば，第１の蛋白質が，
他の蛋白質または核酸と相互作用することが知られているホスファターゼ遺伝子
産物，またはそのフラグメントである場合，このアッセイを用いて結合相互作用
に干渉する薬剤を検出することができる。異なる試験薬剤を系に添加してレポー
ター遺伝子の発現をモニターする。阻害剤が存在すると，レポーターシグナルが
発生しない。
【０１０３】
ホスファターゼポリペプチド遺伝子産物の機能が未知であり，遺伝子産物に結
合するリガンドが知られていない場合においても，酵母ツーハイブリッドアッセ
イを用いて遺伝子産物に結合する蛋白質を同定することができる。ホスファター
ゼポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する蛋白質を同定するアッセイに
おいては，ホスファターゼポリペプチド（またはフラグメント）およびＵＡＳ結
合ドメイン（すなわち，第１の蛋白質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチ
ドを用いることができる。さらに，それぞれが活性化ドメインに融合された異な
る第２の蛋白質をコードする多数のハイブリッド遺伝子を製造し，アッセイにお
いてスクリーニングすることができる。典型的には，第２の蛋白質は総ｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡ融合ライブラリの１またはそれ以上のメンバーによりコード
され，ここで，それぞれの第２の蛋白質のコーディング領域は活性化ドメインに
融合されている。この系は広範な種類の蛋白質に適用することができ，第２の結
合蛋白質の同一性または機能を知ることすら必要ではない。この系は非常に感度
が高く，他の方法では明らかにされない相互作用を検出することができる。過渡
的相互作用であっても，転写を誘発して安定なｍＲＮＡを生成し，これは繰り返
し翻訳されてレポーター蛋白質を生成することができる。
合するリガンドが知られていない場合においても，酵母ツーハイブリッドアッセ
イを用いて遺伝子産物に結合する蛋白質を同定することができる。ホスファター
ゼポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する蛋白質を同定するアッセイに
おいては，ホスファターゼポリペプチド（またはフラグメント）およびＵＡＳ結
合ドメイン（すなわち，第１の蛋白質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチ
ドを用いることができる。さらに，それぞれが活性化ドメインに融合された異な
る第２の蛋白質をコードする多数のハイブリッド遺伝子を製造し，アッセイにお
いてスクリーニングすることができる。典型的には，第２の蛋白質は総ｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡ融合ライブラリの１またはそれ以上のメンバーによりコード
され，ここで，それぞれの第２の蛋白質のコーディング領域は活性化ドメインに
融合されている。この系は広範な種類の蛋白質に適用することができ，第２の結
合蛋白質の同一性または機能を知ることすら必要ではない。この系は非常に感度
が高く，他の方法では明らかにされない相互作用を検出することができる。過渡
的相互作用であっても，転写を誘発して安定なｍＲＮＡを生成し，これは繰り返
し翻訳されてレポーター蛋白質を生成することができる。
【０１０４】
他のアッセイを用いて，標的蛋白質に結合する薬剤を検索してもよい。試験リ
ガンドの標的蛋白質への直接結合を同定する１つのそのようなスクリーニング方
法が，米国特許５，５８５，２７７（本明細書の一部としてここに引用する）に
議論されている。この方法は，蛋白質は一般に折り畳まれた状態と折り畳まれて
いない状態の混合物として存在し，２つの状態の間で継続的に交替しているとい
う原理に基づく。試験リガンドが折り畳まれた形の標的蛋白質に結合する場合（
すなわち，試験リガンドが標的蛋白質のリガンドである場合），リガンドに結合
した標的蛋白質分子は折り畳まれた状態のままである。すなわち，折り畳まれた
標的蛋白質は，標的蛋白質に結合する試験リガンドの存在下で，リガンドの非存
在下におけるよりも多く存在する。リガンドの標的蛋白質への結合は，折り畳ま
れた状態と折り畳まれていない状態の標的蛋白質とを区別する任意の方法により
検出することができる。このアッセイを行うためには，標的蛋白質の機能がわか
っている必要はない。この方法により事実上すべての薬剤，例えば，限定されな
いが，金属，ポリペプチド，蛋白質，脂質，多糖類，ポリヌクレオチドおよび小
有機分子を試験リガンドとして評価することができる。
ガンドの標的蛋白質への直接結合を同定する１つのそのようなスクリーニング方
法が，米国特許５，５８５，２７７（本明細書の一部としてここに引用する）に
議論されている。この方法は，蛋白質は一般に折り畳まれた状態と折り畳まれて
いない状態の混合物として存在し，２つの状態の間で継続的に交替しているとい
う原理に基づく。試験リガンドが折り畳まれた形の標的蛋白質に結合する場合（
すなわち，試験リガンドが標的蛋白質のリガンドである場合），リガンドに結合
した標的蛋白質分子は折り畳まれた状態のままである。すなわち，折り畳まれた
標的蛋白質は，標的蛋白質に結合する試験リガンドの存在下で，リガンドの非存
在下におけるよりも多く存在する。リガンドの標的蛋白質への結合は，折り畳ま
れた状態と折り畳まれていない状態の標的蛋白質とを区別する任意の方法により
検出することができる。このアッセイを行うためには，標的蛋白質の機能がわか
っている必要はない。この方法により事実上すべての薬剤，例えば，限定されな
いが，金属，ポリペプチド，蛋白質，脂質，多糖類，ポリヌクレオチドおよび小
有機分子を試験リガンドとして評価することができる。
【０１０５】
標的蛋白質のリガンドを同定する別の方法は，Ｗｉｅｂｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ
．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）（本明細書
の一部としてここに引用する）に記載されている。この手法は，１回に溶液相中
の２０−３０種類の薬剤のコンビナトリアルライブラリを標的蛋白質に対する結
合についてスクリーニングする。簡単な膜洗浄により標的蛋白質に結合する薬剤
を他のライブラリ成分から分離する。次にフィルター上に保持された特定の選択
された分子を標的蛋白質から遊離させ，ＨＰＬＣおよび気体補助エレクトロスプ
レー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析する。この方法は，標的蛋
白質に対して最も高い親和性を有するライブラリ成分を選択し，特に小分子ライ
ブラリについて有用である。
．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）（本明細書
の一部としてここに引用する）に記載されている。この手法は，１回に溶液相中
の２０−３０種類の薬剤のコンビナトリアルライブラリを標的蛋白質に対する結
合についてスクリーニングする。簡単な膜洗浄により標的蛋白質に結合する薬剤
を他のライブラリ成分から分離する。次にフィルター上に保持された特定の選択
された分子を標的蛋白質から遊離させ，ＨＰＬＣおよび気体補助エレクトロスプ
レー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析する。この方法は，標的蛋
白質に対して最も高い親和性を有するライブラリ成分を選択し，特に小分子ライ
ブラリについて有用である。
【０１０６】
本発明の好ましい態様においては，ホスファターゼ活性を調節する化合物をス
クリーニングする方法は，試験化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ
，化合物とホスファターゼポリペプチドとの間の複合体の存在についてアッセイ
することを含む。そのようなアッセイにおいては，典型的にはリガンドを標識す
る。適当にインキュベートした後，遊離のリガンドを結合した形のリガンドから
分離する。遊離のまたは複合体を形成していない標識の量は，特定の化合物がホ
スファターゼポリペプチドに結合する能力の尺度である。
クリーニングする方法は，試験化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ
，化合物とホスファターゼポリペプチドとの間の複合体の存在についてアッセイ
することを含む。そのようなアッセイにおいては，典型的にはリガンドを標識す
る。適当にインキュベートした後，遊離のリガンドを結合した形のリガンドから
分離する。遊離のまたは複合体を形成していない標識の量は，特定の化合物がホ
スファターゼポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０１０７】
本発明の別の態様においては，ホスファターゼポリペプチドに対して適切な結
合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを用いる。簡単には
，多数の様々な小ペプチド試験化合物を固体支持体上で合成する。ペプチド試験
化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ，洗浄する。次に，結合したホ
スファターゼポリペプチドを当該技術分野においてよく知られる方法により検出
する。精製した本発明のポリペプチドを，上述した薬剤スクリーニング手法にお
いて用いるために，直接プレート上にコーティングすることもできる。さらに，
非中和抗体を用いて蛋白質を捕獲し，これを固体支持体上に固定化することがで
きる。
合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを用いる。簡単には
，多数の様々な小ペプチド試験化合物を固体支持体上で合成する。ペプチド試験
化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ，洗浄する。次に，結合したホ
スファターゼポリペプチドを当該技術分野においてよく知られる方法により検出
する。精製した本発明のポリペプチドを，上述した薬剤スクリーニング手法にお
いて用いるために，直接プレート上にコーティングすることもできる。さらに，
非中和抗体を用いて蛋白質を捕獲し，これを固体支持体上に固定化することがで
きる。
【０１０８】
本発明の別の態様は，本発明のポリペプチドに結合しうる中和抗体がポリペプ
チドに対する結合について試験化合物と特異的に競合する，競合スクリーニング
アッセイを用いることを含む。このようにして，抗体を用いて，ホスファターゼ
ポリペプチドと１またはそれ以上の抗原性決定基を共有するペプチドの存在を検
出することができる。放射性標識した競合結合実験は，Ａ．Ｈ．Ｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ，１９９７，ｖｏｌ．４１，ｎｏ．１０．ｐｐ．２１２７−２１３１に
記載されており，この開示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
チドに対する結合について試験化合物と特異的に競合する，競合スクリーニング
アッセイを用いることを含む。このようにして，抗体を用いて，ホスファターゼ
ポリペプチドと１またはそれ以上の抗原性決定基を共有するペプチドの存在を検
出することができる。放射性標識した競合結合実験は，Ａ．Ｈ．Ｌｉｎ ｅｔ
ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ，１９９７，ｖｏｌ．４１，ｎｏ．１０．ｐｐ．２１２７−２１３１に
記載されており，この開示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０１０９】治療方法
本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼポリペプチドおよび本発明
の他のいずれかのホスファターゼポリペプチドを投与することにより，疾病また
は疾患を治療する方法を含む。"遺伝子治療"の節で議論されるように，本発明の
ホスファターゼポリペプチドはまた，ホスファターゼポリペプチドをインビボで
発現させるための適当なポリヌクレオチド手段を投与することにより，間接的に
投与してもよい。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，上述の配列の１
つと９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８
％または９９％の同一性を有するであろう。
配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択
されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼポリペプチドおよび本発明
の他のいずれかのホスファターゼポリペプチドを投与することにより，疾病また
は疾患を治療する方法を含む。"遺伝子治療"の節で議論されるように，本発明の
ホスファターゼポリペプチドはまた，ホスファターゼポリペプチドをインビボで
発現させるための適当なポリヌクレオチド手段を投与することにより，間接的に
投与してもよい。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，上述の配列の１
つと９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８
％または９９％の同一性を有するであろう。
【０１１０】
別の観点においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号６，配列
番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載される配列からな
る群より選択される配列と実質的に同一のホスファターゼの活性を調節する物質
を投与することにより疾病または疾患を治療する方法を提供する。好ましくは疾
病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾
病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病
には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態
，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血
圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂
病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハン
チントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病
，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，Ｈ
ＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により
引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病およ
び肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流
再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性
動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，
例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬
化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫
，および臓器移植拒絶が含まれる。
番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載される配列からな
る群より選択される配列と実質的に同一のホスファターゼの活性を調節する物質
を投与することにより疾病または疾患を治療する方法を提供する。好ましくは疾
病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾
病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病
には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態
，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血
圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂
病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハン
チントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病
，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，Ｈ
ＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により
引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病およ
び肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流
再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性
動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，
例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬
化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫
，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１１１】
好ましい態様においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号６，
配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ
酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプ
チドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または
予防する方法を提供する。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，
心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より
選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；
中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不
全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性およ
び神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病；躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の
精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病，またはツレット症候群；
神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，お
よび筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプ
リオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイ
ルス感染；代謝性疾患，例えば，糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症
候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患
，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑
内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性
炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾
癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる
。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳または
ニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細に
は，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経
系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害
，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば
不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症
，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツ
ハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩ
Ｖ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌
生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば
糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば
再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテロ
ーム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性
疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発
性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己
免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ
酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプ
チドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または
予防する方法を提供する。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，
心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より
選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；
中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不
全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性およ
び神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病；躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の
精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病，またはツレット症候群；
神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，お
よび筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプ
リオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイ
ルス感染；代謝性疾患，例えば，糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症
候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患
，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑
内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性
炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾
癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる
。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳または
ニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細に
は，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経
系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害
，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば
不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症
，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツ
ハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩ
Ｖ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌
生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば
糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば
再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテロ
ーム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性
疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発
性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己
免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１１２】
本発明はまた，治療を必要とする患者に，配列番号６，配列番号７，配列番号
８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より
選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの活性を調節する
物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を特徴と
する。好ましくは，疾病は，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，および癌
からなる群より選択される。最も好ましくは，免疫関連疾病および疾患は，慢性
関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息
，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，および臓器移植からな
る群より選択される。
８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より
選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの活性を調節する
物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を特徴と
する。好ましくは，疾病は，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，および癌
からなる群より選択される。最も好ましくは，免疫関連疾病および疾患は，慢性
関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息
，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，および臓器移植からな
る群より選択される。
【０１１３】
ホスファターゼ関連疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題
とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のイン
ビトロアッセイにおいて陽性の結果を示す（そのようなアッセイの例は，本明細
書，例えば実施例９において提供され参照される）。望ましい活性についてスク
リーニングすることができる物質の例は，明細書の全体，例えば本節（ホスファ
ターゼ活性を調節する物質を同定するためのスクリーニング方法）に提供され参
照される。ホスファターゼの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されない
が，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，および本節および以下の実
施例９に引用される方法およびスクリーニング、および他のいずれかの適当な方
法により判定される，蛋白質ホスファターゼの他の阻害剤を含む。アンチセンス
オリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用は，以下の"遺伝子治療"の節でさら
に詳細に説明される。
とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のイン
ビトロアッセイにおいて陽性の結果を示す（そのようなアッセイの例は，本明細
書，例えば実施例９において提供され参照される）。望ましい活性についてスク
リーニングすることができる物質の例は，明細書の全体，例えば本節（ホスファ
ターゼ活性を調節する物質を同定するためのスクリーニング方法）に提供され参
照される。ホスファターゼの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されない
が，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，および本節および以下の実
施例９に引用される方法およびスクリーニング、および他のいずれかの適当な方
法により判定される，蛋白質ホスファターゼの他の阻害剤を含む。アンチセンス
オリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用は，以下の"遺伝子治療"の節でさら
に詳細に説明される。
【０１１４】
"予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能
性を減少させることを表す。
性を減少させることを表す。
【０１１５】
"治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１１６】
"治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
または減少；（ｂ）細胞死の活性化または阻害（すなわち，遅延または停止）；
（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度
の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対し
て有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができ
る。
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
または減少；（ｂ）細胞死の活性化または阻害（すなわち，遅延または停止）；
（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度
の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対し
て有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができ
る。
【０１１７】
"異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。
【０１１８】
異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
【０１１９】
異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１２０】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファタ
ーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機
能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファタ
ーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機
能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１２１】
シグナル伝達プロセスにおけるホスファターゼの機能に関連して，"異常な"と
の用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が
野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，
天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋
白質ホスファターゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，
または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを表す。
の用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が
野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，
天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋
白質ホスファターゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，
または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを表す。
【０１２２】
"投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【０１２３】
異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０１２４】
別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中に
おいてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（
ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号６，配列番号
７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの核
酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，ここで，前記プロー
ブは，ポリペプチド，そのフラグメントをコードする核酸配列，および配列およ
びフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッド
の存在または量を疾病の指標として検出する， の各工程を含む。
おいてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（
ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号６，配列番号
７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの核
酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，ここで，前記プロー
ブは，ポリペプチド，そのフラグメントをコードする核酸配列，および配列およ
びフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッド
の存在または量を疾病の指標として検出する， の各工程を含む。
【０１２５】
本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，動
脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的
ストレス関連神経変性性疾患，および癌からなる群より選択される。
脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的
ストレス関連神経変性性疾患，および癌からなる群より選択される。
【０１２６】
ホスファターゼ"標的領域"とは，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列
番号４，および配列番号５に記載される配列からなる群より選択されるヌクレオ
チド塩基配列，または核酸プローブが特異的にハイブリダイズするであろう対応
する全長配列，その機能的誘導体，またはそのフラグメントまたはそのドメイン
である。特異的なハイブリダイゼーションとは，他の核酸の存在下において，プ
ローブが本発明のホスファターゼの核酸標的領域にのみ検出可能なようにハイブ
リダイズすることを示す。予測標的領域は，当該技術分野においてよく知られる
，データベース中の最も近い関連配列のアラインメントおよび比較からなる方法
により同定することができる。
番号４，および配列番号５に記載される配列からなる群より選択されるヌクレオ
チド塩基配列，または核酸プローブが特異的にハイブリダイズするであろう対応
する全長配列，その機能的誘導体，またはそのフラグメントまたはそのドメイン
である。特異的なハイブリダイゼーションとは，他の核酸の存在下において，プ
ローブが本発明のホスファターゼの核酸標的領域にのみ検出可能なようにハイブ
リダイズすることを示す。予測標的領域は，当該技術分野においてよく知られる
，データベース中の最も近い関連配列のアラインメントおよび比較からなる方法
により同定することができる。
【０１２７】
好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号６，配列番号７，配列番
号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列，または対応
する全長アミノ酸配列またはそれらの機能的誘導体からなる群より選択される配
列の，少なくとも６，１２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２
５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードするホスファターゼ標
的領域にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の
存在下でホスファターゼ遺伝子とのみハイブリダイゼーションが生ずるような条
件であるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，
高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条
件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核
酸のハイブリダイゼーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列，または対応
する全長アミノ酸配列またはそれらの機能的誘導体からなる群より選択される配
列の，少なくとも６，１２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２
５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードするホスファターゼ標
的領域にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の
存在下でホスファターゼ遺伝子とのみハイブリダイゼーションが生ずるような条
件であるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，
高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条
件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核
酸のハイブリダイゼーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
【０１２８】
試料中のホスファターゼ遺伝子の検出により診断することができる疾病には，
ホスファターゼ核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅
されている疾病が含まれる。"増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でホスフ
ァターゼＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。正常細胞にお
いては，ホスファターゼは典型的には１コピーの遺伝子として見いだされる。選
択された疾病においては，ホスファターゼ遺伝子の染色体位置が増幅されて，遺
伝子の多数のコピーまたは増幅が生ずる。遺伝子増幅は，そのようなホスファタ
ーゼＲＮＡを増幅させることができ，またはホスファターゼＲＮＡはホスファタ
ーゼＤＮＡの増幅なしに増幅することができる。
ホスファターゼ核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅
されている疾病が含まれる。"増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でホスフ
ァターゼＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。正常細胞にお
いては，ホスファターゼは典型的には１コピーの遺伝子として見いだされる。選
択された疾病においては，ホスファターゼ遺伝子の染色体位置が増幅されて，遺
伝子の多数のコピーまたは増幅が生ずる。遺伝子増幅は，そのようなホスファタ
ーゼＲＮＡを増幅させることができ，またはホスファターゼＲＮＡはホスファタ
ーゼＤＮＡの増幅なしに増幅することができる。
【０１２９】
ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてホスファターゼＲＮＡが検出可
能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ホスファターゼ
ＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，ホスファターゼ
の発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと
比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い，ホスファターゼＲＮＡ
の検出である。
能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ホスファターゼ
ＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，ホスファターゼ
の発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと
比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い，ホスファターゼＲＮＡ
の検出である。
【０１３０】
試料中のホスファターゼ核酸の検出により診断することができる疾病には，好
ましくは癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，
細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用い
られる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細
胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法
は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るた
めに容易に適合させることができる。
ましくは癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，
細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用い
られる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細
胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法
は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るた
めに容易に適合させることができる。
【０１３１】
別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中の
ホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試
料中のホスファターゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を，ホスファター
ゼポリペプチド，またはその１またはそれ以上フラグメントをコードする対照核
酸標的領域と比較し，ここで，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号６，配
列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載される配列，ま
たはその１またはそれ以上フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列
を有しており；そして（ｂ）標的領域と対照標的領域との間の配列または量の相
違を疾病または疾患の指標として検出することを含む。好ましくは，疾病は，癌
，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，およ
び代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組
織，または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例え
ば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，
および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁
うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチント
ン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病，パー
キンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−
２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起
こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満
，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄
，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬
化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例え
ば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症
，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，お
よび臓器移植拒絶が含まれる。
ホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試
料中のホスファターゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を，ホスファター
ゼポリペプチド，またはその１またはそれ以上フラグメントをコードする対照核
酸標的領域と比較し，ここで，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号６，配
列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載される配列，ま
たはその１またはそれ以上フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列
を有しており；そして（ｂ）標的領域と対照標的領域との間の配列または量の相
違を疾病または疾患の指標として検出することを含む。好ましくは，疾病は，癌
，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，およ
び代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組
織，または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例え
ば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，
および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁
うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチント
ン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病，パー
キンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−
２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起
こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満
，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄
，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬
化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例え
ば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症
，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，お
よび臓器移植拒絶が含まれる。
【０１３２】
本明細書において用いる場合，"比較する"との用語は，試料から単離された核
酸標的領域と対照核酸標的領域との間の不一致を同定することを表す。不一致は
，ヌクレオチド配列における，例えば挿入，欠失，または点突然変異であっても
よく，または所定のヌクレオチド配列の量におけるものであってもよい。配列に
おけるこれらの不一致を判定する方法は当業者にはよく知られている。"対照"核
酸標的領域とは，正常細胞，例えば，先に記載したような疾病を有しない細胞に
おいて見いだされる配列または配列の量を表す。
酸標的領域と対照核酸標的領域との間の不一致を同定することを表す。不一致は
，ヌクレオチド配列における，例えば挿入，欠失，または点突然変異であっても
よく，または所定のヌクレオチド配列の量におけるものであってもよい。配列に
おけるこれらの不一致を判定する方法は当業者にはよく知られている。"対照"核
酸標的領域とは，正常細胞，例えば，先に記載したような疾病を有しない細胞に
おいて見いだされる配列または配列の量を表す。
【０１３３】使用方法
本発明の配列は，コードされる蛋白質ホスファターゼの触媒活性を阻害し，以
下の疾病の治療に潜在的有用性を有する小分子化合物のスクリーニングに有用で
あろう：組織または血液の癌，例えば，乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，
卵巣，膀胱または腎臓の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば
，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，お
よび高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ
病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病ま
たはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン
病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または
他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされる
ウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこ
れらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血
栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾
病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウ
マチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性
関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶
。
下の疾病の治療に潜在的有用性を有する小分子化合物のスクリーニングに有用で
あろう：組織または血液の癌，例えば，乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，
卵巣，膀胱または腎臓の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば
，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，お
よび高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ
病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病ま
たはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン
病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または
他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされる
ウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこ
れらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血
栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾
病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウ
マチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性
関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶
。
【０１３４】
上述した本発明の概要は限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点
は，以下の本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
は，以下の本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１３５】図面の簡単な説明
図１Ａ−Ｂは，ヒト蛋白質ホスファターゼのヌクレオチド配列を示す（配列番
号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，および配列番号５）。
号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，および配列番号５）。
【０１３６】
図２は，配列番号１−配列番号５によりコードされるヒト蛋白質ホスファター
ゼのアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０）。
ゼのアミノ酸配列を提供する（それぞれ配列番号６，配列番号７，配列番号８，
配列番号９，および配列番号１０）。
【０１３７】発明の詳細な説明
本発明は，新規なポリペプチド，これらのポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列の単離および特徴付け，種々のポリペプチド関連疾病および状態，例え
ば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するのに用いることができる種々の
産物およびアッセイ方法に関する。ポリペプチド，好ましくはホスファターゼ，
およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は，本明細書に記載される配列
が与えられれば，よく知られる標準的な合成手法を用いて製造することができる
。以下の表１−４を参照すると，本発明の遺伝子をより理解することができる。
本発明はさらに，多数の異なる態様，例えば以下に記載される態様を提供する。
チド配列の単離および特徴付け，種々のポリペプチド関連疾病および状態，例え
ば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するのに用いることができる種々の
産物およびアッセイ方法に関する。ポリペプチド，好ましくはホスファターゼ，
およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は，本明細書に記載される配列
が与えられれば，よく知られる標準的な合成手法を用いて製造することができる
。以下の表１−４を参照すると，本発明の遺伝子をより理解することができる。
本発明はさらに，多数の異なる態様，例えば以下に記載される態様を提供する。
【０１３８】核酸
マップされた遺伝子の染色体の位置と癌における関与が示唆されているアンプ
リコンとの関連づけは，文献検索（ＰｕｂＭｅｄｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ），ＯＭＩ
Ｍ検索（ＯｎｌｉｎｅＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｉｎＭａｎ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａ
ｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）およびＫｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．により維持
されている癌アンプリコンの包括的データベース（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａ
ｌ．，ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉ
ｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ １５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／−ｌｅｌｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）に基づく。
マップされた遺伝子の多くについて，Ｋｎｕｕｔｉｌａからの細胞遺伝学的領域
が示されており，続いて，増幅が報告されている事例の数および調べた事例の総
数が示されている。
リコンとの関連づけは，文献検索（ＰｕｂＭｅｄｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ），ＯＭＩ
Ｍ検索（ＯｎｌｉｎｅＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｉｎＭａｎ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａ
ｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）およびＫｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．により維持
されている癌アンプリコンの包括的データベース（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａ
ｌ．，ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉ
ｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ １５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／−ｌｅｌｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）に基づく。
マップされた遺伝子の多くについて，Ｋｎｕｕｔｉｌａからの細胞遺伝学的領域
が示されており，続いて，増幅が報告されている事例の数および調べた事例の総
数が示されている。
【０１３９】
一塩基多型については，ＮＣＢＩで維持されているｄｂＳＮＰ（一塩基多型の
データベース）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）においてＳＮＰが記録されている場合に，受託
番号が与えられる。本出願において用いた配列のいずれもｄｂＳＮＰで表された
ＳＮＰｓを有していない。
データベース）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）においてＳＮＰが記録されている場合に，受託
番号が与えられる。本出願において用いた配列のいずれもｄｂＳＮＰで表された
ＳＮＰｓを有していない。
【０１４０】核酸プローブ，ホスファターゼを検出するための方法およびキット
本発明はさらに，核酸プローブおよびその用途を提供する。本発明の核酸プロ
ーブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染色体またはｃ
ＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得ることができる。染色
体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野において認識されている方
法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，第２版．Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９を参照）。
ーブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染色体またはｃ
ＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得ることができる。染色
体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野において認識されている方
法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，第２版．Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９を参照）。
【０１４１】
別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端，およ
びＣ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化
学合成を行うことができる。合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にした
がって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当
な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ること
ができる。
びＣ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化
学合成を行うことができる。合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にした
がって，本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当
な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ること
ができる。
【０１４２】
当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知ら
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いて，そのようなプ
ローブを容易に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハ
イブリダイゼーションプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素
標識，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標
識することができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用い
て可視化することができる。
れるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いて，そのようなプ
ローブを容易に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハ
イブリダイゼーションプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素
標識，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標
識することができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用い
て可視化することができる。
【０１４３】
本発明の核酸プローブはＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含み，そのようなプ
ローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸
プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例とし
ては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物
，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアク
リルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体
支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
ローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸
プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例とし
ては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物
，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアク
リルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体
支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【０１４４】
本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセ
イフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の
性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野にお
いてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１４５】
試料中で本発明の核酸の存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハイ
ブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そ
して（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む
。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核
酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組
織のＲＮＡ試料が含まれる。
ブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そ
して（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む
。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核
酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組
織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１４６】
試料中で本発明の核酸の存在を検出するためのキットは，その中に上述の核酸
プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以
下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合
した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，
限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，
アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。好ましくは，キットはさ
らに使用の指針を含む。
プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以
下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合
した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，
限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，
アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。好ましくは，キットはさ
らに使用の指針を含む。
【０１４７】
詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れら
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
れている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラス
チック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容
器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液
を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えること
ができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有
効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器
，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬
（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイ
ブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられ
る試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プ
ローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの
１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１４８】本発明にしたがうポリペプチドの分類
本発明の多数の蛋白質ホスファターゼについて，これが属する蛋白質クラスお
よびファミリーの分類，非触媒的蛋白質モチーフの概要，ならびに染色体位置が
提供される。この情報は，各蛋白質についての機能，制御および／または治療的
有用性を決定するのに有用である。染色体領域の増幅を種々の癌と関連づけるこ
とができる。本明細書において議論されるアンプリコンについては，情報源はＫ
ｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ（Ｋｎｕｕｔｉｌａ Ｓ，Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔ
Ａ−Ｍ，Ａｕｔｉｏ Ｋ，Ｔａｒｋｋａｎｅｎ Ｍ，Ｗｏｌｆ Ｍ，Ｍｏｎｎｉ
Ｏ，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ Ｊ，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ ＭＬ，Ｔａｐｐｅｒ
Ｊ，Ｐｅｒｅ Ｈ，Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ Ｗ，Ｈｅｍｍｅｒ Ｓ，Ｗａｓｅｎｉｕ
ｓ Ｖ−Ｍ，Ｖｉｄｇｒｅｎ Ｖ＆Ｚｈｕ Ｙ：ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅ
ｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５２：１１０７−
１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／〜ｌｇ
ｌ＿ｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）であった。
よびファミリーの分類，非触媒的蛋白質モチーフの概要，ならびに染色体位置が
提供される。この情報は，各蛋白質についての機能，制御および／または治療的
有用性を決定するのに有用である。染色体領域の増幅を種々の癌と関連づけるこ
とができる。本明細書において議論されるアンプリコンについては，情報源はＫ
ｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ（Ｋｎｕｕｔｉｌａ Ｓ，Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔ
Ａ−Ｍ，Ａｕｔｉｏ Ｋ，Ｔａｒｋｋａｎｅｎ Ｍ，Ｗｏｌｆ Ｍ，Ｍｏｎｎｉ
Ｏ，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ Ｊ，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ ＭＬ，Ｔａｐｐｅｒ
Ｊ，Ｐｅｒｅ Ｈ，Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ Ｗ，Ｈｅｍｍｅｒ Ｓ，Ｗａｓｅｎｉｕ
ｓ Ｖ−Ｍ，Ｖｉｄｇｒｅｎ Ｖ＆Ｚｈｕ Ｙ：ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅ
ｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５２：１１０７−
１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／〜ｌｇ
ｌ＿ｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）であった。
【０１４９】
ホスファターゼ分類および蛋白質ドメインは，しばしば，経路，細胞での役割
，または上流または下流の制御のメカニズムを反映する。また，疾病関連性遺伝
子は，しばしば関連する遺伝子のファミリーにおいて生ずる。例えば，ホスファ
ターゼファミリーの１つのメンバーがオンコジンまたは腫瘍サプレッサーとして
機能する場合，または，免疫，神経，心臓血管，または代謝性疾患において破壊
されていることが見いだされている場合，他のファミリーメンバーはしばしば関
連する役割を果たすであろう。
，または上流または下流の制御のメカニズムを反映する。また，疾病関連性遺伝
子は，しばしば関連する遺伝子のファミリーにおいて生ずる。例えば，ホスファ
ターゼファミリーの１つのメンバーがオンコジンまたは腫瘍サプレッサーとして
機能する場合，または，免疫，神経，心臓血管，または代謝性疾患において破壊
されていることが見いだされている場合，他のファミリーメンバーはしばしば関
連する役割を果たすであろう。
【０１５０】
染色体位置は，腫瘍アンプリコンまたは腫瘍サプレッサー遺伝子座についての
候補標的を同定することができる。有力な腫瘍アンプリコンの概要は文献から入
手可能であり，隣接する領域に位置するホスファターゼ遺伝子の増幅されたコピ
ーを含むことを実験的に確認すべき腫瘍タイプを同定することができる。
候補標的を同定することができる。有力な腫瘍アンプリコンの概要は文献から入
手可能であり，隣接する領域に位置するホスファターゼ遺伝子の増幅されたコピ
ーを含むことを実験的に確認すべき腫瘍タイプを同定することができる。
【０１５１】
本発明のポリペプチドのより詳細な特性決定，例えば潜在的な生物学的および
臨床的意味は，例えば実施例２および３に提供される。
臨床的意味は，例えば実施例２および３に提供される。
【０１５２】ホスファターゼ活性を示すポリペプチドの分類
本明細書に記載されるポリペプチドは，以下のグループのいずれかに属するこ
とができる：（１）蛋白質ホスファターゼの二重特異性グループ（ＤＳＰ）；（
２）セリン−トレオニンホスファターゼ（ＳＴＰ）；または（３）蛋白質チロシ
ンホスファターゼ（ＰＴＰ）。この分類は，少なくとも部分的には，このクラス
のホスファターゼの触媒ドメインを構築している保存されたコアアミノ酸配列モ
チーフによる。
とができる：（１）蛋白質ホスファターゼの二重特異性グループ（ＤＳＰ）；（
２）セリン−トレオニンホスファターゼ（ＳＴＰ）；または（３）蛋白質チロシ
ンホスファターゼ（ＰＴＰ）。この分類は，少なくとも部分的には，このクラス
のホスファターゼの触媒ドメインを構築している保存されたコアアミノ酸配列モ
チーフによる。
【０１５３】ＤＳＰグループ
ＤＳＰグループの新規なホスファターゼはＳＧＰ０６１（配列番号２）であり
，これはＭＫＰ様ホスファターゼである。
，これはＭＫＰ様ホスファターゼである。
【０１５４】
二重特異性クラスのホスファターゼの触媒ドメインの独特の特徴的モチーフは
これらの酵素がホスホセリン／ホスホトレオニン，ならびにホスホチロシン残基
を脱リン酸化する能力を担う。蛋白質ホスファターゼの二重特異性グループには
，ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）のファミリーメンバーが含まれる。
ＭＫＰファミリーの構造的および機能的特徴は以下に記載される。これらのポリ
ペプチドは，以下の活性の１またはそれ以上を有することができる。
これらの酵素がホスホセリン／ホスホトレオニン，ならびにホスホチロシン残基
を脱リン酸化する能力を担う。蛋白質ホスファターゼの二重特異性グループには
，ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）のファミリーメンバーが含まれる。
ＭＫＰファミリーの構造的および機能的特徴は以下に記載される。これらのポリ
ペプチドは，以下の活性の１またはそれ以上を有することができる。
【０１５５】ＭＫＰファミリー
ＳＧＰ０６１，配列番号２は新規なＭＫＰ様ホスファターゼである。二重特異
性ホスファターゼファミリーには，約２０個の既知のヒトメンバーが含まれる（
一覧については，ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
ｄｅ／ｓｍａｒｔ／ｇｅｔ＿ｍｅｍｂｅｒｓ．ｐｌ？ＷＨＡＴ＝ｓｐｅｃｉｅｓ
＆ＮＡＭＥ＝ＤＳＰｃ＆ＷＨＩＣＨ＝Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓを参照）。二重
特異性ホスファターゼのＭＰＫファミリーのよく知られるメンバーには以下のも
のが含まれる：ＤＵＳ１（ＭＰＫ−１，ＣＬ１００，ＰＴＰＮ−１０，ｅｒｐ，
ＶＨ１または３ＣＨ１３４としても知られる），ＤＵＳ３（ＶＨＲとしても知ら
れる），ＤＵＳ４（ＨＶＨ２，ＴＹＰ１，ＭＫＰ２またはＶＨ２としても知られ
る），ＤＵＳ５（ＨＶＨ３，Ｂ２３，ＶＨ３としても知られる），ＤＵＳ６（Ｐ
ＹＳＴ１，ＭＫＰ３，ｒＶＨ６としても知られる），ＤＵＳ７（ＰＹＳＴ２とし
ても知られる），ＣＤＫＮ３（ＣＤＫＮ３，ＫＡＰ，ＣＩＰ２またはＣＤＩ１と
しても知られる），ＶＨ５およびＳＴＹＸ。
性ホスファターゼファミリーには，約２０個の既知のヒトメンバーが含まれる（
一覧については，ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
ｄｅ／ｓｍａｒｔ／ｇｅｔ＿ｍｅｍｂｅｒｓ．ｐｌ？ＷＨＡＴ＝ｓｐｅｃｉｅｓ
＆ＮＡＭＥ＝ＤＳＰｃ＆ＷＨＩＣＨ＝Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓを参照）。二重
特異性ホスファターゼのＭＰＫファミリーのよく知られるメンバーには以下のも
のが含まれる：ＤＵＳ１（ＭＰＫ−１，ＣＬ１００，ＰＴＰＮ−１０，ｅｒｐ，
ＶＨ１または３ＣＨ１３４としても知られる），ＤＵＳ３（ＶＨＲとしても知ら
れる），ＤＵＳ４（ＨＶＨ２，ＴＹＰ１，ＭＫＰ２またはＶＨ２としても知られ
る），ＤＵＳ５（ＨＶＨ３，Ｂ２３，ＶＨ３としても知られる），ＤＵＳ６（Ｐ
ＹＳＴ１，ＭＫＰ３，ｒＶＨ６としても知られる），ＤＵＳ７（ＰＹＳＴ２とし
ても知られる），ＣＤＫＮ３（ＣＤＫＮ３，ＫＡＰ，ＣＩＰ２またはＣＤＩ１と
しても知られる），ＶＨ５およびＳＴＹＸ。
【０１５６】
ほとんどのＭＫＰホスファターゼは，脱リン酸化反応により，ＭＡＰＫ経路に
関与するキナーゼを不活性化することができる。ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キ
ナーゼ），ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ／ストレス活性化蛋白
質キナーゼ）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は，細胞外リガンドに応答して，
細胞分裂，分化またはアポトーシスを担うシグナル伝達事象を媒介する（Ｃｏｂ
ｂＭＨ，Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；７１（３−
４）：４７９−５００）。完全なＭＡＰキナーゼ酵素活性には，選択的上流二重
特異性キナーゼによる，ＭＡＰキナーゼの活性ループに存在するトレオニンおよ
びチロシン残基の同時リン酸化が必要である。ＭＫＰファミリー二重特異性ホス
ファターゼは，これらのトレオニンおよびチロシン残基を脱リン酸化することに
よりＭＡＰキナーゼの活性を媒介する。このメカニズムは，ＭＡＰキナーゼ経路
の負のフィードバック制御を提供する。
関与するキナーゼを不活性化することができる。ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キ
ナーゼ），ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ／ストレス活性化蛋白
質キナーゼ）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は，細胞外リガンドに応答して，
細胞分裂，分化またはアポトーシスを担うシグナル伝達事象を媒介する（Ｃｏｂ
ｂＭＨ，Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；７１（３−
４）：４７９−５００）。完全なＭＡＰキナーゼ酵素活性には，選択的上流二重
特異性キナーゼによる，ＭＡＰキナーゼの活性ループに存在するトレオニンおよ
びチロシン残基の同時リン酸化が必要である。ＭＫＰファミリー二重特異性ホス
ファターゼは，これらのトレオニンおよびチロシン残基を脱リン酸化することに
よりＭＡＰキナーゼの活性を媒介する。このメカニズムは，ＭＡＰキナーゼ経路
の負のフィードバック制御を提供する。
【０１５７】
多数のＭＡＰキナーゼ，ならびにＭＫＰが存在するが，中心となる疑問は，Ｍ
ＫＰによるキナーゼ基質認識において選択性が存在するか否かである。そのよう
な特異性が存在するという証拠は，ＤＵＳ−６（ＭＫＰ３）およびＶＨ５により
提供される。これらは，それぞれＥＲＫまたはＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８Ｍ
ＡＰキナーゼに対して高度に選択的なホスファターゼであることが示されている
（Ｍｕｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｎｏｖ１
；２７１（４４）：２７２０５−８．）。別のレベルの基質特異性は，ＤＵＳ−
６（ＭＫＰ３）により示されるように，細胞内コンパートメント化により生ずる
。これは，核ではなく細胞質においてのみ見いだされる（Ｇｒｏｏｍ，Ｌ．Ａ．
ｅｔ ａｌ（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３６２１−３６３２）。さらに，
特異性は，発現の組織特異性のレベルからも生じうる（例えば，Ｍｕｄａ，Ｍ．
ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５１４１−５１５１
）。
ＫＰによるキナーゼ基質認識において選択性が存在するか否かである。そのよう
な特異性が存在するという証拠は，ＤＵＳ−６（ＭＫＰ３）およびＶＨ５により
提供される。これらは，それぞれＥＲＫまたはＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８Ｍ
ＡＰキナーゼに対して高度に選択的なホスファターゼであることが示されている
（Ｍｕｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｎｏｖ１
；２７１（４４）：２７２０５−８．）。別のレベルの基質特異性は，ＤＵＳ−
６（ＭＫＰ３）により示されるように，細胞内コンパートメント化により生ずる
。これは，核ではなく細胞質においてのみ見いだされる（Ｇｒｏｏｍ，Ｌ．Ａ．
ｅｔ ａｌ（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３６２１−３６３２）。さらに，
特異性は，発現の組織特異性のレベルからも生じうる（例えば，Ｍｕｄａ，Ｍ．
ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５１４１−５１５１
）。
【０１５８】
ＭＡＰキナーゼ対応物の多数のメンバーが酵母（例えばＹＶＨ１），Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓ（例えばＹ０４２），ショウジョウバエ（例えばｐｕｃｋｃｅｒｅｄ
），植物（例えばＤｓＰＴＰｌ）および哺乳動物に存在するように，ＭＫＰは，
系統発生的分布において普遍的であるようである。多様な種から単離されたＭＫ
Ｐの主要な作用モードは，ＭＡＰＫを脱リン酸化し，このことによりＭＡＰＫシ
グナル伝達経路に負のフィードバックを提供することである。
ｅｇａｎｓ（例えばＹ０４２），ショウジョウバエ（例えばｐｕｃｋｃｅｒｅｄ
），植物（例えばＤｓＰＴＰｌ）および哺乳動物に存在するように，ＭＫＰは，
系統発生的分布において普遍的であるようである。多様な種から単離されたＭＫ
Ｐの主要な作用モードは，ＭＡＰＫを脱リン酸化し，このことによりＭＡＰＫシ
グナル伝達経路に負のフィードバックを提供することである。
【０１５９】
ＭＫＰは，低酸素条件下でＭＫＰ−１遺伝子発現が誘導されることから示唆さ
れるように，病態生理学的低酸素の間に重要な役割を果たしているかもしれない
（Ｌａｄｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
４：１２８９０−１２８９７）。腫瘍の低酸素は，悪性発達の間の脈管形成の開
始に直接連鎖している（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃｅｌｌ
８６：３５３−３６４およびＭａｚｕｒｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９６）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４３６−３４４０）。低酸素状態の間に多くの
遺伝子が誘導されることが見いだされている：例えば熱ショック転写因子−１（
ＨＳＦ−１）（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６２６３−６２６７），ｃ−ｆｏｓおよ
びｃ−ｊｕｎ（Ａｕｓｓｅｒｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−５０４２，およびＭｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．
（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２３４３５−２３４３９），お
よび低酸素誘導可能因子−１（ＨＩＦ−１）（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：６０９−６１６）。ＭＫＰ−
１の転写産物および蛋白質は，初期癌腫，ならびに乳および前立腺癌腫の多くの
段階でアップレギュレートされることが示されている（Ｌｅａｖ，Ｉ．ｅｔ ａ
ｌ（１９９６）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：３６１−３７０）。前立腺腫瘍細
胞株におけるＭＫＰ−１の過剰発現は，Ｆａｓリガンド誘導性アポトーシスに対
する耐性を付与し（Ｓｒｉｋａｎｔｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：１６９−１７８），ＭＫＰ−１がアポトー
シスの阻害に寄与し，アンドロゲン非依存性増殖をもたらすことが示唆されてい
る。ＭＫＰ−１はまた，抗新生物剤，例えばシスプラチンおよびカンプトテシン
により引き起こされるアポトーシスの誘導を阻害することができる（Ｓａｎｃｈ
ｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：５
１４２−５１５２；Ｃｏｓｔａ Ｐｅｒｅｉｒａ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０
００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８２７−１８３４）。低酸素状態はＪ
ＮＫ経路の活性化を介してアポトーシスを誘発し（Ｉｐ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ（
１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０５−２１９に
概説），ＭＡＰＫホスファターゼはこの経路に負のフィードバックを与えること
が知られているため，ＭＫＰ−１はアポトーシスを妨害することにより腫瘍成長
を支持することが予測される。ＭＫＰ−１の過剰発現はコトランスフェクション
した腫瘍細胞においてＳＡＰＫ／ＪＮＫの低酸素誘導性活性を妨害する（Ｌａｄ
ｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２
８９０−１２８９７）。
れるように，病態生理学的低酸素の間に重要な役割を果たしているかもしれない
（Ｌａｄｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
４：１２８９０−１２８９７）。腫瘍の低酸素は，悪性発達の間の脈管形成の開
始に直接連鎖している（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃｅｌｌ
８６：３５３−３６４およびＭａｚｕｒｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９６）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４３６−３４４０）。低酸素状態の間に多くの
遺伝子が誘導されることが見いだされている：例えば熱ショック転写因子−１（
ＨＳＦ−１）（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６２６３−６２６７），ｃ−ｆｏｓおよ
びｃ−ｊｕｎ（Ａｕｓｓｅｒｅｒ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−５０４２，およびＭｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．
（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２３４３５−２３４３９），お
よび低酸素誘導可能因子−１（ＨＩＦ−１）（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：６０９−６１６）。ＭＫＰ−
１の転写産物および蛋白質は，初期癌腫，ならびに乳および前立腺癌腫の多くの
段階でアップレギュレートされることが示されている（Ｌｅａｖ，Ｉ．ｅｔ ａ
ｌ（１９９６）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：３６１−３７０）。前立腺腫瘍細
胞株におけるＭＫＰ−１の過剰発現は，Ｆａｓリガンド誘導性アポトーシスに対
する耐性を付与し（Ｓｒｉｋａｎｔｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：１６９−１７８），ＭＫＰ−１がアポトー
シスの阻害に寄与し，アンドロゲン非依存性増殖をもたらすことが示唆されてい
る。ＭＫＰ−１はまた，抗新生物剤，例えばシスプラチンおよびカンプトテシン
により引き起こされるアポトーシスの誘導を阻害することができる（Ｓａｎｃｈ
ｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：５
１４２−５１５２；Ｃｏｓｔａ Ｐｅｒｅｉｒａ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０
００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８２７−１８３４）。低酸素状態はＪ
ＮＫ経路の活性化を介してアポトーシスを誘発し（Ｉｐ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ（
１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２０５−２１９に
概説），ＭＡＰＫホスファターゼはこの経路に負のフィードバックを与えること
が知られているため，ＭＫＰ−１はアポトーシスを妨害することにより腫瘍成長
を支持することが予測される。ＭＫＰ−１の過剰発現はコトランスフェクション
した腫瘍細胞においてＳＡＰＫ／ＪＮＫの低酸素誘導性活性を妨害する（Ｌａｄ
ｅｒｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２
８９０−１２８９７）。
【０１６０】
ＭＡＰＫホスファターゼによるＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２の脱リン酸化およ
び続く不活性化は，アンジオスタチンによる脈管形成性血管内皮細胞増殖の抑制
を担うかもしれない（Ｒｅｄｌｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖａ
ｓｃ．Ｒｅｓ ３６：２８−３４）。
び続く不活性化は，アンジオスタチンによる脈管形成性血管内皮細胞増殖の抑制
を担うかもしれない（Ｒｅｄｌｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖａ
ｓｃ．Ｒｅｓ ３６：２８−３４）。
【０１６１】
本発明に示される新規ＭＰＫファミリーホスファターゼは，その主要な機能と
してＭＡＰＫシグナル伝達の負のフィードバック制御を有するようであるホスフ
ァターゼの，大きくなりつつあるリストに寄与する。既知のＭＰＫの間では基質
認識のレベルでの作用メカニズムにおける選択性，細胞内局在および組織分布が
知られているため，本明細書に記載される新規ＭＰＫは，同様の選択性を示すか
もしれない。新規ＭＰＫはまた，ＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路を遮断することにより，
病因的低酸素症，例えば脈管形成腫瘍において生ずるようなものにおいて，アポ
トーシスの抑制において役割を果たすかもしれない。抗アポトーシス性ＭＫＰを
標的とする特異的ホスファターゼ阻害剤の開発は，癌治療の方法として価値を有
するであろう。
してＭＡＰＫシグナル伝達の負のフィードバック制御を有するようであるホスフ
ァターゼの，大きくなりつつあるリストに寄与する。既知のＭＰＫの間では基質
認識のレベルでの作用メカニズムにおける選択性，細胞内局在および組織分布が
知られているため，本明細書に記載される新規ＭＰＫは，同様の選択性を示すか
もしれない。新規ＭＰＫはまた，ＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路を遮断することにより，
病因的低酸素症，例えば脈管形成腫瘍において生ずるようなものにおいて，アポ
トーシスの抑制において役割を果たすかもしれない。抗アポトーシス性ＭＫＰを
標的とする特異的ホスファターゼ阻害剤の開発は，癌治療の方法として価値を有
するであろう。
【０１６２】ＰＴＰグループ
本発明は，新規なＰＴＰ様ホスファターゼポリペプチドであるＳＧＰ０５７（
配列番号１）を記載する。このポリペプチドは，ＰＴＰのＳＨ２−含有ＳＨＰサ
ブファミリーに最も類似する。これらのＰＴＰは，サイトカインシグナリング（
Ｋｉｌｅ Ｂ．Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００１ Ａｐ
ｒ；７３（３）：２９２−８）；レプチンシグナリングの制御（Ｌｏｔｈｇｒｅ
ｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００１
Ｆｅｂ９；１５４５（１−２）：２０−９）；免疫応答および自己免疫に関与
するＴ−細胞活性化（Ｆｏｒｔｉｎ Ｊ．Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０
０１ Ａｐｒ１５；９７（８）：２３９０−４００）；および血管平滑筋細胞の
アポトーシス（Ｃｕｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２
００１ Ｍａｒ；４９（４）：８６３−７１）において重要な役割を果たす。Ｓ
ＧＰ０５７もまた，これらの重要な細胞プロセス，または蛋白質チロシンリン酸
化／脱リン酸化により制御される他のプロセスにおいて役割を果たしているかも
しれない。
配列番号１）を記載する。このポリペプチドは，ＰＴＰのＳＨ２−含有ＳＨＰサ
ブファミリーに最も類似する。これらのＰＴＰは，サイトカインシグナリング（
Ｋｉｌｅ Ｂ．Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００１ Ａｐ
ｒ；７３（３）：２９２−８）；レプチンシグナリングの制御（Ｌｏｔｈｇｒｅ
ｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００１
Ｆｅｂ９；１５４５（１−２）：２０−９）；免疫応答および自己免疫に関与
するＴ−細胞活性化（Ｆｏｒｔｉｎ Ｊ．Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０
０１ Ａｐｒ１５；９７（８）：２３９０−４００）；および血管平滑筋細胞の
アポトーシス（Ｃｕｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２
００１ Ｍａｒ；４９（４）：８６３−７１）において重要な役割を果たす。Ｓ
ＧＰ０５７もまた，これらの重要な細胞プロセス，または蛋白質チロシンリン酸
化／脱リン酸化により制御される他のプロセスにおいて役割を果たしているかも
しれない。
【０１６３】ＳＴＰグループ
本明細書においては，３つの新規なＳＴＰホスファターゼポリペプチドが記載
される：ＳＧＰ０５０（配列番号３），ＳＧＰ０４５（配列番号４），およびＳ
ＧＰ０３６（配列番号５）。これらは，例えば，表１−４にさらに詳細に開示さ
れる。
される：ＳＧＰ０５０（配列番号３），ＳＧＰ０４５（配列番号４），およびＳ
ＧＰ０３６（配列番号５）。これらは，例えば，表１−４にさらに詳細に開示さ
れる。
【０１６４】
セリン−トレオニンホスファターゼは，ＰＰ１，ＰＰ２Ａ，ＰＰ２Ｂ，および
ＰＰ２Ｃで表される４つの主要なクラスに分けることができる。ＰＰ２ａは多制
御サブユニットに付随して見いだされ，その不活性化はウイルス成分，例えばス
モールＴ抗原によるトランスフォーメーションにつながりうる。制御サブユニッ
トの１つにおける変異は結腸直腸癌に関連づけられており，腫瘍サプレッサーと
しての役割と一致する（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ ２０００ ４７：
２６８−７１）。最近，ＰＰ２ａはＴリンパ球の活性化における関与が示唆され
ている（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００ １３：３１
３−２２）。ＰＰ１は，種々の細胞機能，例えば低酸素症に対する応答，アポト
ーシスおよび細胞質分裂における関与が示唆されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０００ ９７：１２０９１−９６，Ａｙｌｉｏｎ ｅｔ
ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２０００ １９２２３７−４６，Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００ ６８：１３５０−５８）。最後に，糖尿
病ラットにおける研究は，対照と比較して低下したＰＰ１活性および上昇したＰ
Ｐ２Ａ活性を示す（Ｂｅｇｕｍ ａｎｄ Ｒａｇｏｌｉａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ １９９８ ４７：５４−６２）。本明細書に記載される３つの新規なＳＴＰ
は，ＰＰ２Ｃサブファミリーに最も関連している。ＰＰ２Ｃホスファターゼは，
多くの細胞プロセス，例えば，インテグリンシグナル伝達の調節（Ｌｅｕｎｇ−
Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１ Ｍａｙ１
；２０（９）：２１６０−２１７０）；ＴＡＫ１シグナリング経路の制御（Ｈａ
ｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｆｅｂ２３
；２７６（８）：５７５３−９），細胞チャネルの制御（Ｔｒａｖｉｓ Ｓ．Ｍ
，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７ Ｓ
ｅｐ３０；９４（２０）：１１０５５−６０）およびサイクリン依存性キナーゼ
およびＲａｓ経路の制御（Ｃｈｅｎｇ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ．２０００ Ｎｏｖ３；２７５（４４）：３４７４４−３４７４９；Ｓａａｖ
ｅｄｒａ Ｈ．Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００ Ａｕｇ１０；
１９（３４）：３９４８−５４）に関与している。研究は，種々の疾病，例えば
，発癌，炎症性疾病，および代謝性疾病においてセリントレオニンホスファター
ゼが関与する可能性を示唆する。
ＰＰ２Ｃで表される４つの主要なクラスに分けることができる。ＰＰ２ａは多制
御サブユニットに付随して見いだされ，その不活性化はウイルス成分，例えばス
モールＴ抗原によるトランスフォーメーションにつながりうる。制御サブユニッ
トの１つにおける変異は結腸直腸癌に関連づけられており，腫瘍サプレッサーと
しての役割と一致する（Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ ２０００ ４７：
２６８−７１）。最近，ＰＰ２ａはＴリンパ球の活性化における関与が示唆され
ている（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００ １３：３１
３−２２）。ＰＰ１は，種々の細胞機能，例えば低酸素症に対する応答，アポト
ーシスおよび細胞質分裂における関与が示唆されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０００ ９７：１２０９１−９６，Ａｙｌｉｏｎ ｅｔ
ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２０００ １９２２３７−４６，Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００ ６８：１３５０−５８）。最後に，糖尿
病ラットにおける研究は，対照と比較して低下したＰＰ１活性および上昇したＰ
Ｐ２Ａ活性を示す（Ｂｅｇｕｍ ａｎｄ Ｒａｇｏｌｉａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ １９９８ ４７：５４−６２）。本明細書に記載される３つの新規なＳＴＰ
は，ＰＰ２Ｃサブファミリーに最も関連している。ＰＰ２Ｃホスファターゼは，
多くの細胞プロセス，例えば，インテグリンシグナル伝達の調節（Ｌｅｕｎｇ−
Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１ Ｍａｙ１
；２０（９）：２１６０−２１７０）；ＴＡＫ１シグナリング経路の制御（Ｈａ
ｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｆｅｂ２３
；２７６（８）：５７５３−９），細胞チャネルの制御（Ｔｒａｖｉｓ Ｓ．Ｍ
，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７ Ｓ
ｅｐ３０；９４（２０）：１１０５５−６０）およびサイクリン依存性キナーゼ
およびＲａｓ経路の制御（Ｃｈｅｎｇ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ．２０００ Ｎｏｖ３；２７５（４４）：３４７４４−３４７４９；Ｓａａｖ
ｅｄｒａ Ｈ．Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００ Ａｕｇ１０；
１９（３４）：３９４８−５４）に関与している。研究は，種々の疾病，例えば
，発癌，炎症性疾病，および代謝性疾病においてセリントレオニンホスファター
ゼが関与する可能性を示唆する。
【０１６５】本発明にしたがう治療方法： 診断：
本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中のポリペプチドを検出す
る方法を提供する。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ
条件下で，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号
１０からなる群より選択されるポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズす
る核酸プローブと接触させ，前記プローブは，ポリペプチドをコードする核酸配
列，そのフラグメント，および配列の相補体およびフラグメントを含み；そして
（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出
する，の各工程を含む。
る方法を提供する。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ
条件下で，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号
１０からなる群より選択されるポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズす
る核酸プローブと接触させ，前記プローブは，ポリペプチドをコードする核酸配
列，そのフラグメント，および配列の相補体およびフラグメントを含み；そして
（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出
する，の各工程を含む。
【０１６６】
本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，ア
テローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎
不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性疾患，例えば糖尿病，生殖疾
患，例えば不妊症，および癌からなる群より選択される。
テローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎
不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性疾患，例えば糖尿病，生殖疾
患，例えば不妊症，および癌からなる群より選択される。
【０１６７】
ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の存在下においてその遺伝子と
のみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハ
イブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防
止する。そのような条件は上で定義される。
のみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハ
イブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオ
チド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防
止する。そのような条件は上で定義される。
【０１６８】
試料中の遺伝子の検出により診断することができる疾病には，核酸（ＤＮＡお
よび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"
増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加して
いることを意味する。
よび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"
増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加して
いることを意味する。
【０１６９】
ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてＲＮＡが検出可能なように存在
することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためで
ある。他の正常細胞においては，発現の基底レベルが存在し，したがってこれら
の場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれよ
り多い検出である。
することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためで
ある。他の正常細胞においては，発現の基底レベルが存在し，したがってこれら
の場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれよ
り多い検出である。
【０１７０】
試料中の核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは，癌が
含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細
胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は
，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出
物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術
分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に
適合させることができる。
含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細
胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は
，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出
物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術
分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に
適合させることができる。
【０１７１】抗体，ハイブリドーマ，ホスファターゼの検出のための使用方法およびキット
本発明は，本発明のホスファターゼに対して結合親和性を有する抗体に関する
。ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列，またはその機能的誘導体，またはその
少なくとも９個の連続するアミノ酸（好ましくは，その少なくとも２０，３０，
３５，または４０個の連続するアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配
列を有することができる。
。ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列，またはその機能的誘導体，またはその
少なくとも９個の連続するアミノ酸（好ましくは，その少なくとも２０，３０，
３５，または４０個の連続するアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配
列を有することができる。
【０１７２】
本発明はまた，本発明のホスファターゼに対して特異的結合親和性を有する抗
体に関する。そのような抗体は，本発明のホスファターゼに対するその結合親和
性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単離することが
できる。本発明のホスファターゼに選択的に結合する抗体を，本発明のホスファ
ターゼと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるた
めに選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他のポリペ
プチドを含む組織におけるホスファターゼ発現の変化の分析が含まれる。
体に関する。そのような抗体は，本発明のホスファターゼに対するその結合親和
性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単離することが
できる。本発明のホスファターゼに選択的に結合する抗体を，本発明のホスファ
ターゼと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるた
めに選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他のポリペ
プチドを含む組織におけるホスファターゼ発現の変化の分析が含まれる。
【０１７３】
本発明のホスファターゼは，種々の手順および方法，例えば抗体の生成，医薬
組成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができ
る。
組成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができ
る。
【０１７４】
本発明のホスファターゼは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用い
ることができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細
書に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識する
であろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，
ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗
体のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野におい
て知られる手法の１つを用いて生成することができる。
ることができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細
書に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識する
であろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，
ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗
体のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野におい
て知られる手法の１つを用いて生成することができる。
【０１７５】
本発明はまた，上述のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを産生
するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を
分泌することができる不死化細胞株である。
するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を
分泌することができる不死化細胞株である。
【０１７６】
一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒ
ｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１
，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ
等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技
術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下ま
たは腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫
する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識
するであろう。
【０１７７】
ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはア
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法
は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋
白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか
，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０１７８】
モノクローナル抗体については，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエロ
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリ
ドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスお
よびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
ーマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる
多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ
アッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスク
リーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリ
ドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスお
よびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０１７９】
ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５，１９７６を参照。本発明の抗体は
，二次標識された抗ウサギ抗体を用いて間接的に標識してもよい。本発明の標識
された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用いて，
特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスク
リーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体
は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素
標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光
標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能
なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野にお
いてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５，１９７６を参照。本発明の抗体は
，二次標識された抗ウサギ抗体を用いて間接的に標識してもよい。本発明の標識
された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用いて，
特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【０１８０】
上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロー
スおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテッ
クスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術
は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈ
Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９８６；Ｊａｃ
ｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，イ
ンビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用
いることができる。
【０１８１】
さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法お
よびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容
易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，
１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８
：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０１８２】
抗ペプチドペプチドは，本発明のホスファターゼのペプチド配列中に見いださ
れる塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基
で置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，
および／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え
，およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える
。
れる塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基
で置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，
および／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え
，およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える
。
【０１８３】
本発明はまた，試料中においてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を
包含する。該方法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述
の抗体と接触させ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出
する，ことを含む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明
の抗体とインキュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイするこ
とを含む。試料中で本発明のホスファターゼのレベルが正常なレベルと比較して
変化していることは疾病を示すかもしれない。
包含する。該方法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述
の抗体と接触させ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出
する，ことを含む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明
の抗体とインキュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイするこ
とを含む。試料中で本発明のホスファターゼのレベルが正常なレベルと比較して
変化していることは疾病を示すかもしれない。
【０１８４】
抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およ
びアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者
は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノア
ッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，また
はロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容
易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例
は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（"
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖ
ｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ
：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０１８５】
本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法におい
て用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセ
イすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋
白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知
られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させ
ることができる。
【０１８６】
キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１ま
たはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検
出しうる試薬。
キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合
パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができ
る。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１ま
たはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検
出しうる試薬。
【０１８７】
検出試薬の例には，限定されないが，標識二次抗体が含まれ，あるいは，一次
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，ま
たは抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキット
について上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，
当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易
に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０１８８】ホスファターゼと相互作用する化合物の単離
本発明はまた，本発明の蛋白質ホスファターゼに結合しうる化合物を検出する
方法に関する。該方法は，化合物を本発明のホスファターゼとともにインキュベ
ートし，ホスファターゼに結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物
は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していても
よい。
方法に関する。該方法は，化合物を本発明のホスファターゼとともにインキュベ
ートし，ホスファターゼに結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物
は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していても
よい。
【０１８９】
本発明はまた，ホスファターゼの活性またはホスファターゼの結合パートナー
の活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は，
本発明のホスファターゼを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし，
ホスファターゼ活性またはホスファターゼ結合パートナーの活性のレベルの変化
を検出することを含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示
す活性の変化を生ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液
，または細胞抽出物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，
当該技術分野においてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
の活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は，
本発明のホスファターゼを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし，
ホスファターゼ活性またはホスファターゼ結合パートナーの活性のレベルの変化
を検出することを含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示
す活性の変化を生ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液
，または細胞抽出物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，
当該技術分野においてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【０１９０】ポリペプチド活性の調節：
本発明はさらに，治療を必要とする患者に，配列番号６，配列番号７，配列番
号８，配列番号９，および配列番号１０からなる群より選択されるポリペプチド
，その機能的誘導体，およびそのフラグメントの活性を調節する物質を投与する
ことにより，疾病または異常な状態を治療する方法を提供する。好ましくは，疾
病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，
心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性
および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。
号８，配列番号９，および配列番号１０からなる群より選択されるポリペプチド
，その機能的誘導体，およびそのフラグメントの活性を調節する物質を投与する
ことにより，疾病または異常な状態を治療する方法を提供する。好ましくは，疾
病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，
心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性
および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。
【０１９１】
疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾
患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のアッセイにおいて陽性の
結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されない
が，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質ホスファターゼの阻害剤を含
む。
患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のアッセイにおいて陽性の
結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されない
が，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質ホスファターゼの阻害剤を含
む。
【０１９２】
"予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能
性を減少させることを表す。
性を減少させることを表す。
【０１９３】
"治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくと
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
も部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１９４】
"治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
または減少；（ｂ）細胞死の活性化または阻害（すなわち，遅延または停止）；
（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度
の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対し
て有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができ
る。
または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をあ
る程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ
以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加
または減少；（ｂ）細胞死の活性化または阻害（すなわち，遅延または停止）；
（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度
の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対し
て有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができ
る。
【０１９５】
"異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。異常な状態にはまた，変則的な細胞サイクル進行，す
なわち有糸分裂および減数分裂を通る正常な細胞サイクル進行が変則的であるこ
とが含まれる。
正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，また
は細胞生存に関連しうる。異常な状態にはまた，変則的な細胞サイクル進行，す
なわち有糸分裂および減数分裂を通る正常な細胞サイクル進行が変則的であるこ
とが含まれる。
【０１９６】
異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれ
る。
【０１９７】
異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１９８】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファタ
ーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機
能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファタ
ーゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機
能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１９９】
シグナル伝達プロセスにおけるホスファターゼポリペプチドの機能に関連して
，"異常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，そ
の触媒活性が野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異
しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異してい
るか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されな
いか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを
表す。
，"異常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，そ
の触媒活性が野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異
しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異してい
るか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されな
いか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを
表す。
【０２００】
"投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在
する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞
培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞について
は，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定され
ないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の
細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例え
ば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメー
ション手法，および担体手法が含まれる。
【０２０１】
異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合
物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好まし
くはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは
有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０２０２】ホスファターゼ関連活性の促進またはアンタゴナイズ
本発明はまた，哺乳動物においてホスファターゼ関連活性を調節する方法を包
含する。該方法は，前記哺乳動物に，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配
列番号９，および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対する
アゴニストまたはアンタゴニスト，その機能的誘導体，およびそのフラグメント
を，前記調節を行うのに十分な量で投与することを含む。本発明はまた，ホスフ
ァターゼに関連する機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量の
アゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物に
おいて，上述のポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾
病を治療する方法を含む。
含する。該方法は，前記哺乳動物に，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配
列番号９，および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対する
アゴニストまたはアンタゴニスト，その機能的誘導体，およびそのフラグメント
を，前記調節を行うのに十分な量で投与することを含む。本発明はまた，ホスフ
ァターゼに関連する機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量の
アゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物に
おいて，上述のポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾
病を治療する方法を含む。
【０２０３】
治療を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定の疾病状態との関連性を評価
することができる。本発明の１つの態様にしたがえば，マイクロアレイ発現分析
を実施して，本発明にしたがう種々のホスファターゼ遺伝子の発現プロファイル
を確立し，このことにより，その発現がある種の疾病状態と相関する遺伝子を同
定することができる。
することができる。本発明の１つの態様にしたがえば，マイクロアレイ発現分析
を実施して，本発明にしたがう種々のホスファターゼ遺伝子の発現プロファイル
を確立し，このことにより，その発現がある種の疾病状態と相関する遺伝子を同
定することができる。
【０２０４】
種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されているため，そのよ
うな治療は，広範な範囲の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管
疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビ
ウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病お
よび過誤腫について実施することができる。特に重要なものは，種々のタイプの
癌の治療である。したがって，本発明は，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部
癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫
瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌等の病理を治療する方
法を提供する。
うな治療は，広範な範囲の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管
疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビ
ウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病お
よび過誤腫について実施することができる。特に重要なものは，種々のタイプの
癌の治療である。したがって，本発明は，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部
癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫
瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌等の病理を治療する方
法を提供する。
【０２０５】
例えば，種々の組織起源のＲＮＡ試料から作成したｃＤＮＡをナイロン膜にス
ポットし，目的とするホスファターゼ遺伝子に由来する放射性標識プローブでハ
イブリダイズさせることができる。
ポットし，目的とするホスファターゼ遺伝子に由来する放射性標識プローブでハ
イブリダイズさせることができる。
【０２０６】
実施例３に記載される方法と類似の方法において生成された発現データに基づ
いて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができることが理解され
るであろう。これらの方法は上述の議論に基づいて当業者には明らかであり，し
たがって，本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および相関分析か
ら導かれる推論を用いて，本発明にしたがう治療方法または投与計画を具体化す
ることができる。例えば，正常組織および疾病組織の試料の対を用いて発現アレ
イを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどのホスファター
ゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このことにより，本
発明にしたがう治療方法の標的を形成するであろう。すなわち，インビボまたは
インビトロのいずれかでこれらの活性を制御することができる調節剤または薬剤
を同定することができ，所定の疾病状態の治療において用いることができる。
いて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができることが理解され
るであろう。これらの方法は上述の議論に基づいて当業者には明らかであり，し
たがって，本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および相関分析か
ら導かれる推論を用いて，本発明にしたがう治療方法または投与計画を具体化す
ることができる。例えば，正常組織および疾病組織の試料の対を用いて発現アレ
イを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどのホスファター
ゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このことにより，本
発明にしたがう治療方法の標的を形成するであろう。すなわち，インビボまたは
インビトロのいずれかでこれらの活性を制御することができる調節剤または薬剤
を同定することができ，所定の疾病状態の治療において用いることができる。
【０２０７】
本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，本明細書に開示され
るホスファターゼ遺伝子配列から誘導されるヌクレオチドプローブ，例えば本明
細書に記載されるものを用いて，試料中においてホスファターゼを検出する方法
が提供される。種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されている
ため，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，
パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症
候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過
誤腫について，そのような診断の尺度を用いることができる。特に重要なものは
，種々のタイプの癌の診断である。本発明の診断方法を用いて，乳癌，尿生殖器
癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細
胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌
について試験することができる。
るホスファターゼ遺伝子配列から誘導されるヌクレオチドプローブ，例えば本明
細書に記載されるものを用いて，試料中においてホスファターゼを検出する方法
が提供される。種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されている
ため，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，
パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症
候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過
誤腫について，そのような診断の尺度を用いることができる。特に重要なものは
，種々のタイプの癌の診断である。本発明の診断方法を用いて，乳癌，尿生殖器
癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細
胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌
について試験することができる。
【０２０８】
同様の特徴において，正確な診断を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定
の疾病状態との関連性の程度を判定することは有用である。そのような判定は，
本発明の１つの態様にしたがってマイクロアレイ発現分析を実施することにより
行うことができる。その発現がある種の疾病状態と関連するホスファターゼ遺伝
子は，上述した方法により同定することができる。
の疾病状態との関連性の程度を判定することは有用である。そのような判定は，
本発明の１つの態様にしたがってマイクロアレイ発現分析を実施することにより
行うことができる。その発現がある種の疾病状態と関連するホスファターゼ遺伝
子は，上述した方法により同定することができる。
【０２０９】
マイクロアレイデータから得られたデータはまた，特定の病因に罹患している
かもしれない患者を診断するのに用いることができる。したがって，本発明にし
たがって黒色腫に関連する癌状態を診断する方法は，試験試料（患者から集める
ことができる）を配列番号１により表される蛋白質をコードする核酸配列とハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチドプローブと接触させ；次に，ハイブリ
ダイズしたプローブ：標的の対の存在を検出し，神経芽細胞腫に関連する癌状態
の指標としてそのようなハイブリダイゼーションのレベルを定量することである
。すなわち，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される診断方法
に特異性および有効性を付与する。
かもしれない患者を診断するのに用いることができる。したがって，本発明にし
たがって黒色腫に関連する癌状態を診断する方法は，試験試料（患者から集める
ことができる）を配列番号１により表される蛋白質をコードする核酸配列とハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチドプローブと接触させ；次に，ハイブリ
ダイズしたプローブ：標的の対の存在を検出し，神経芽細胞腫に関連する癌状態
の指標としてそのようなハイブリダイゼーションのレベルを定量することである
。すなわち，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される診断方法
に特異性および有効性を付与する。
【０２１０】
上述したように，本明細書に記載される方法と類似の方法において生成された
発現データに基づいて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができ
る。これらも必然的に本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および
相関分析から導かれる推論を用いて，本発明にしたがう診断方法を具体化するこ
とができる。注目すべき１つのシナリオは，正常組織と疾病組織の試料の対を用
いて発現アレイを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどの
ホスファターゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このこ
とにより，上述の診断方法において用いられる診断マーカーとして働くことがで
きる。
発現データに基づいて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができ
る。これらも必然的に本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および
相関分析から導かれる推論を用いて，本発明にしたがう診断方法を具体化するこ
とができる。注目すべき１つのシナリオは，正常組織と疾病組織の試料の対を用
いて発現アレイを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどの
ホスファターゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このこ
とにより，上述の診断方法において用いられる診断マーカーとして働くことがで
きる。
【０２１１】
本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，試料中でホスファタ
ーゼを検出する別の方法が提供される。該方法は，本発明に開示されるホスファ
ターゼ遺伝子，例えば図２に挙げられるアミノ酸配列をコードする遺伝子の核酸
標的領域を制御領域と比較し；そして次に，標的領域と制御領域との間の配列ま
たは量の相違を，疾病または疾患の指標として検出することを含む。この方法は
また，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，
パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症
候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過
誤腫の診断に用いることができる。特に重要なものは種々のタイプの癌の診断で
ある。上述の診断方法において述べたように，この特定の方法を同様に用いて，
乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小
細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，
および甲状腺癌について試験することができる。
ーゼを検出する別の方法が提供される。該方法は，本発明に開示されるホスファ
ターゼ遺伝子，例えば図２に挙げられるアミノ酸配列をコードする遺伝子の核酸
標的領域を制御領域と比較し；そして次に，標的領域と制御領域との間の配列ま
たは量の相違を，疾病または疾患の指標として検出することを含む。この方法は
また，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，
パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症
候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過
誤腫の診断に用いることができる。特に重要なものは種々のタイプの癌の診断で
ある。上述の診断方法において述べたように，この特定の方法を同様に用いて，
乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小
細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，
および甲状腺癌について試験することができる。
【０２１２】
標的領域は，ホスファターゼ遺伝子中の目的とする任意の特定の領域であるこ
とができ，例えば，上流の制御領域が含まれる。ホスファターゼのファミリーに
おいては，上流の制御領域の配列の変動はしばしば機能的な関連性を有しており
，そのいくつかは，ある種の疾病状態を引き起こすのに重要であるかもしれない
。ある種のホスファターゼ遺伝子における標的領域の量の変化，例えば，レセプ
ター結合部位等の制御領域のコピー数の変化もまた，機能的分化のメカニズムを
表し，したがって，ある種の疾病状態と関連しているであろう。したがって，標
的領域の配列および量を対照領域と比較してそのような相違を検出することは，
疾病状態の検出に有効につながるであろう。
とができ，例えば，上流の制御領域が含まれる。ホスファターゼのファミリーに
おいては，上流の制御領域の配列の変動はしばしば機能的な関連性を有しており
，そのいくつかは，ある種の疾病状態を引き起こすのに重要であるかもしれない
。ある種のホスファターゼ遺伝子における標的領域の量の変化，例えば，レセプ
ター結合部位等の制御領域のコピー数の変化もまた，機能的分化のメカニズムを
表し，したがって，ある種の疾病状態と関連しているであろう。したがって，標
的領域の配列および量を対照領域と比較してそのような相違を検出することは，
疾病状態の検出に有効につながるであろう。
【０２１３】
本発明の１つの態様においては，マイクロアレイ実験を用いて，疾病状態と１
組のホスファターゼ遺伝子の間の標的領域の変動との間の潜在的な関連性を同定
することができる。例えば，目的とするホスファターゼ遺伝子の，それぞれ所定
の標的領域および対照領域に対応する核酸プローブを作成することができる。正
常組織および疾病組織からの試料を用いて，上でおよび実施例３で議論されるよ
うに，マイクロアレイを作成することができる。このように作成されたアレイに
これらのプローブをハイブリダイズさせることにより，目的とする領域の正常お
よび疾病状態における比較プロファイルが得られ，標的領域と対照領域との，問
題とする疾病に特徴的な相違の定義を導くことができる。次に，そのような定義
は，本発明にしたがう副次的に言及される診断方法において用いられるような，
疾病状態の指標として働くことができる。多くの同等または類似の方法を用いて
，この方法にしたがう診断を実施することができることが理解されるであろう。
これらは，本明細書に提供される実施例に基づいて当業者には明らかであり，し
たがって，本発明の範囲内に含まれる。
組のホスファターゼ遺伝子の間の標的領域の変動との間の潜在的な関連性を同定
することができる。例えば，目的とするホスファターゼ遺伝子の，それぞれ所定
の標的領域および対照領域に対応する核酸プローブを作成することができる。正
常組織および疾病組織からの試料を用いて，上でおよび実施例３で議論されるよ
うに，マイクロアレイを作成することができる。このように作成されたアレイに
これらのプローブをハイブリダイズさせることにより，目的とする領域の正常お
よび疾病状態における比較プロファイルが得られ，標的領域と対照領域との，問
題とする疾病に特徴的な相違の定義を導くことができる。次に，そのような定義
は，本発明にしたがう副次的に言及される診断方法において用いられるような，
疾病状態の指標として働くことができる。多くの同等または類似の方法を用いて
，この方法にしたがう診断を実施することができることが理解されるであろう。
これらは，本明細書に提供される実施例に基づいて当業者には明らかであり，し
たがって，本発明の範囲内に含まれる。
【０２１４】
疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は
，蛋白質ホスファターゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた
。いくつかの小さい有機分子は蛋白質ホスファターゼの機能を調節する化合物の
一群を形成する。蛋白質ホスファターゼの機能を阻害することが報告されている
分子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリー
ル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａ
ｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ
９４／１４８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ
．），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，
９９２），スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリ
ジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州
特許出願０５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ
ＷＯ９４／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ
．），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２
年１２月１０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ Ｗ
Ｏ９１／１５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙
げられる。
，蛋白質ホスファターゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた
。いくつかの小さい有機分子は蛋白質ホスファターゼの機能を調節する化合物の
一群を形成する。蛋白質ホスファターゼの機能を阻害することが報告されている
分子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリー
ル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａ
ｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ
９４／１４８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ
．），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，
９９２），スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリ
ジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州
特許出願０５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ
ＷＯ９４／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ
．），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０，１９９２
年１２月１０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ Ｗ
Ｏ９１／１５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ）が挙
げられる。
【０２１５】
細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質ホスファターゼ阻害剤の多くは，蛋白質
ホスファターゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質ホス
ファターゼを阻害し，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こ
すであろう。
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質ホスファターゼ阻害剤の多くは，蛋白質
ホスファターゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質ホス
ファターゼを阻害し，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こ
すであろう。
【０２１６】
しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄ
ｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許５，８８０，１
４１（米国特許出願０８／４８５，３２３），国際公開ＷＯ９６／４０１１６，
（１９９６年１２月 １９日公開，Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．）および国際公開Ｗ
Ｏ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａ
ｌ）（これらはすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環
式成分を有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。
"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ
ｅｔ ａｌ．の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願），"Ｂ
ｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．の米国特許５，８８０，１４１（米国特許出願０８／４８５，３２３
，１９９５年６月７日出願），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１
日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細
胞におけるインドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノ
ン誘導体の阻害パターンを教示する。
子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌ
ｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，
ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化
合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，
リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎ
ｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．の米
国特許出願０８／７０２，２３２および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄ
ｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅｔ ａｌの米国特許５，８８０，１
４１（米国特許出願０８／４８５，３２３），国際公開ＷＯ９６／４０１１６，
（１９９６年１２月 １９日公開，Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．）および国際公開Ｗ
Ｏ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａ
ｌ）（これらはすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環
式成分を有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。
"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ
ｅｔ ａｌ．の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願），"Ｂ
ｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．の米国特許５，８８０，１４１（米国特許出願０８／４８５，３２３
，１９９５年６月７日出願），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１
日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細
胞におけるインドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノ
ン誘導体の阻害パターンを教示する。
【０２１７】
ホスファターゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されない
が，チロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上
述のキナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知ら
れる化合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類
を記載する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５
２０７２２Ａ１；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；
Ｋａｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ
Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ
ａｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａ
ｒｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９
）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ
．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１）
，２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９
８３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒ
ｙｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊ
ａｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５
１，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２
９（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；
Ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１
５−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎ
ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２
５−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅ
ｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅ
ｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１
），２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，Ａ６５；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
が，チロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上
述のキナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知ら
れる化合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類
を記載する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開０５
２０７２２Ａ１；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；
Ｋａｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ ａｎｄ
Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ
ａｎｄ Ｃｏｍｅｒ，米国特許４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ ａｎｄ Ｗａ
ｒｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９
）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ
．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（２ ｐａｒｔ１）
，２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９
８３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒ
ｙｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊ
ａｃｋｍａｎｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５
１，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２
９（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；
Ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７５，４１
５−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１８９−１９６；Ｍｉｎ
ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，３２
５−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅ
ｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅ
ｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１
），２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，Ａ６５；Ｓｉ
ｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３，
２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０２１８】
キノキサリン類は，Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，
３１６，５５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に記載される。
３１６，５５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に記載される。
【０２１９】
キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）に記載される。
ｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，およびＢｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｂｉｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ
２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）に記載される。
【０２２０】
チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３：Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（１
９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）
Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，５
３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１
（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（１
９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２２
２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４１
３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ Ｆ
ＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５−
３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５），
８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ
，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７０
−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．．（１
９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．
６３６３−６１４３：Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ ａｌ．，（１
９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）
Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３，５
３−６０；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１
（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，（１
９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ５，２１３−２２
２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４１
３−４１８；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ Ｆ
ＡＳＥＢ Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．．（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２，３３５−
３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（５），
８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ
，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７０
−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含め
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２２１】
調節剤として用いることができる他の化合物には，オキシインドリノン，例え
ば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
ば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含
め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
【０２２２】組換えＤＮＡ技術 ホスファターゼ核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞：
本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに
，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応する
アミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において
機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよ
び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０２２３】
本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変
更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しない
かまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子
操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変
更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のい
ずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方
法を容易に適用することができる。
【０２２４】
核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
ド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言
われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮ
Ａ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連
結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異な
るであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プ
ロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮ
Ａに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。
そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディン
グ配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むで
あろう。
【０２２５】
所望の場合には，本発明のホスファターゼをコードする配列の３’側の非コー
ディング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止
制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。す
なわち，本発明のホスファターゼをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している
３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発
現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞
において機能的な３’領域で置き換えることができる。
ディング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止
制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。す
なわち，本発明のホスファターゼをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している
３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発
現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞
において機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０２２６】
２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列および本発明のホスファタ
ーゼをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が，ホスファタ
ーゼ配列が転写されることを可能とする場合，すなわち，連結が，（１）フレー
ムシフト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のホスファタ
ーゼをコードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）
本発明のホスファターゼの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写される
ことを妨害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち
，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができ
る場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本
発明のホスファターゼをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主に
より認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
ーゼをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が，ホスファタ
ーゼ配列が転写されることを可能とする場合，すなわち，連結が，（１）フレー
ムシフト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のホスファタ
ーゼをコードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）
本発明のホスファターゼの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写される
ことを妨害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち
，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができ
る場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本
発明のホスファターゼをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主に
より認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【０２２７】
本発明は，本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）をコードする
遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含
する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効であり
かつ便利であり，したがって，本発明のホスファターゼのための１つの好ましい
発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表
される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含
する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効であり
かつ便利であり，したがって，本発明のホスファターゼのための１つの好ましい
発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表
される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【０２２８】
原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ
ーの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なフ
ァージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等
が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が
含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞に
おいて複製する能力を有する。
【０２２９】
認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
ｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，
ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプ
リコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０２３０】
本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において
発現させるためには，本発明のホスファターゼをコードする配列が，機能的原核
生物プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのよ
うなプロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわ
ち，誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バク
テリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝
子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可
能な原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プ
ロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌ
ａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）および
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．２０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，
Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），
Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６
），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−
４４２，１９８４）により概説されている。
発現させるためには，本発明のホスファターゼをコードする配列が，機能的原核
生物プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのよ
うなプロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわ
ち，誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バク
テリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝
子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可
能な原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プ
ロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌ
ａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）および
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ．．Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｅｕｃｎｅ ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．２０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，
Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），
Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６
），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−
４４２，１９８４）により概説されている。
【０２３１】
原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボ
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
ソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば
，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６
５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランス
フォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細
胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および
"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。
すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句
は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含
む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物に
おいて精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義される
ように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０２３２】
本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするホ
スファターゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定
されない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真
核生物宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまた
は組織培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞に
は，ＨｅＬａ細胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１
，またはリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳
動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株
，例えばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐ
れた能力を提供することができる。
スファターゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定
されない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真
核生物宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまた
は組織培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞に
は，ＨｅＬａ細胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１
，またはリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳
動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株
，例えばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐ
れた能力を提供することができる。
【０２３３】
さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，ショウジョウバエアルコールデヒ
ドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルスベク
ターを，昆虫細胞において本発明のホスファターゼを大量に発現するよう遺伝子
工学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，
１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ
ｐ．２７７−２９７，１９８６）。
御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパ
リンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能であ
る。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖａ
ｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，ショウジョウバエアルコールデヒ
ドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルスベク
ターを，昆虫細胞において本発明のホスファターゼを大量に発現するよう遺伝子
工学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３，
１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ
ｐ．２７７−２９７，１９８６）。
【０２３４】
酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のホスファターゼの発現にはいくつかの可能なベクター系
が利用可能である。
素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を
組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の
解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することがで
きる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与え
る。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤ
ＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いるこ
とができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して
，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主における本発明のホスファターゼの発現にはいくつかの可能なベクター系
が利用可能である。
【０２３５】
宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることがで
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
きる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する
特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することが
できる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシン
などからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝
子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするも
のを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現
を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例え
ば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０２３６】
本発明のホスファターゼの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域
を使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を
指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターに
は，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８
２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３
１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８
１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−
６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
を使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を
指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターに
は，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８
２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３
１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８
１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−
６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０２３７】
真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始さ
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のホスファターゼ（ま
たはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニン
をコードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にするこ
とが好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明
のホスファターゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）
またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のホスファターゼのコーディ
ング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす
。
れる。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のホスファターゼ（ま
たはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニン
をコードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にするこ
とが好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明
のホスファターゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）
またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のホスファターゼのコーディ
ング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす
。
【０２３８】
本発明のホスファターゼをコードする核酸分子および動作可能なように連結さ
れたプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非
複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直
線状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は
自己複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現
により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレー
トされることにより永久発現が得られる。
れたプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非
複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直
線状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は
自己複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現
により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレー
トされることにより永久発現が得られる。
【０２３９】
所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
ることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートして
いる細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ
以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養
要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例え
ば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべき
ＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクシ
ョンにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろ
う。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，
エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃ
ＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０２４０】
導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまた
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
はウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種
類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイ
ルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞
を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定
の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿
主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０２４１】
好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例
えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ；
"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラ
スミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃｚａ
ｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌ
ｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２
）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄ
ａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３
，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばΦ
Ｃ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ ｅｔ ａｌｅｓ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ
，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミ
ドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７
０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３
：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，ΣＶＸ；
"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラ
スミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃｚａ
ｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌ
ｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２
）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄ
ａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３
，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばΦ
Ｃ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ ｅｔ ａｌｅｓ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ
，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミ
ドはＪｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７
０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３
：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０２４２】
好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒ
ｏａｃｈ，"Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０
，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：
３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ
ｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０２４３】
構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のホスファターゼまたはそのフラグ
メントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか
，またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデ
オキシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを
形成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好
ましい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェ
クション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション
，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により
，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエ
ント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クロ
ーニングされた遺伝子の発現により，本発明のホスファターゼまたはそのフラグ
メントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか
，またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデ
オキシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを
形成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好
ましい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０２４４】トランスジェニック動物：
本発明に関連するトランスジェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能
である。ＤＮＡを受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させる
か，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞
分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。
本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス
，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
である。ＤＮＡを受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させる
か，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞
分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。
本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス
，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２４５】
胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェ
ニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩
させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物
は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌ
ａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等か
ら入手することができる。
【０２４６】
齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
者によく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵およ
び鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ
Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９
１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許
，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０年７月３０
日）に記載されている。
【０２４７】
一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウス
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０）。
を過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または
頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去す
る。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精
管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚
を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類
似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−
１１１２，１９９０）。
【０２４８】
胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウ
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
ム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られて
いる（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０２４９】
ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクロ
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
ーンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。
あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連
結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，
当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる
（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０２５０】
ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（す
なわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅ
ｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクロ
ーンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの
教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法
の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に
移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティング
により分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物およ
び他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ ａ
ｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ Ｓｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８）。
【０２５１】
すなわち，本発明は，本発明のホスファターゼをコードするトランスジンまた
はホスファターゼの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒ
ト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，ホ
スファターゼの導入の効果を研究するため，またはホスファターゼの発現を制御
（すなわち，追加の遺伝子，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により
）するためのインビボ試験系として特に有用である。
はホスファターゼの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒ
ト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，ホ
スファターゼの導入の効果を研究するため，またはホスファターゼの発現を制御
（すなわち，追加の遺伝子，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により
）するためのインビボ試験系として特に有用である。
【０２５２】
"トランスジェニック動物"とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトキナーゼをコードすることができる。動物における自然の発現は，レセ
プターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与
えることにより減少させることができる。
胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部
となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，
ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ
は，ヒトキナーゼをコードすることができる。動物における自然の発現は，レセ
プターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与
えることにより減少させることができる。
【０２５３】遺伝子治療
本発明のホスファターゼまたはその遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用
である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１
９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト
遺伝子治療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の
基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，
１９９３）に記載されている。
である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１
９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト
遺伝子治療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の
基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，
１９９３）に記載されている。
【０２５４】
１つの好ましい態様においては，ホスファターゼのコーディング配列を含む発
現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患
者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例えば
，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のホスファターゼをコ
ードする内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性ホスフ
ァターゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーターセグメ
ントをこれが内因性ホスファターゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送す
る）。
現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患
者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例えば
，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のホスファターゼをコ
ードする内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性ホスフ
ァターゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーターセグメ
ントをこれが内因性ホスファターゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送す
る）。
【０２５５】
遺伝子治療は，腫瘍を標的とするホスファターゼｃＤＮＡを含むアデノウイル
スの使用を含むことができる。全身ホスファターゼは，遺伝子工学処理した細胞
の移植，ホスファターゼをコードするウイルスの注入，または裸のホスファター
ゼＤＮＡの適当な組織への注入により増加する。
スの使用を含むことができる。全身ホスファターゼは，遺伝子工学処理した細胞
の移植，ホスファターゼをコードするウイルスの注入，または裸のホスファター
ゼＤＮＡの適当な組織への注入により増加する。
【０２５６】
そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害するこ
とにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害
し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能
力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失
またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害する
ことができる。
１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することがで
きる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害するこ
とにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害
し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能
力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失
またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害する
ことができる。
【０２５７】
ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，ア
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えホスファ
ターゼをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例え
ば腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コ
ーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質
配列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標
的細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができ
る（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−
８，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細
胞内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋
白質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティング
することを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
デノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシ
パピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えホスファ
ターゼをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例え
ば腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コ
ーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質
配列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標
的細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができ
る（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−
８，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細
胞内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋
白質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティング
することを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０２５８】
最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は
，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニ
ズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞に
ＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡ
をＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランス
フェクション（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２
７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレク
トロポレーション（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，
これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４
１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる
粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する
他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである
。
【０２５９】
また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞へ
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結
合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みお
よび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅ
ｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
の取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を
含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結
合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みお
よび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅ
ｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２６０】
本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定
の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺
伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。
一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的
細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取
り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が
含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核
因子に結合することが必要である。
【０２６１】
本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であ
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
り，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボ
でまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す
。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，ま
たは，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うこと
ができる。
【０２６２】
別の好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸
配列を有するベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ
発現される。組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３
６（１９９２年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
配列を有するベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ
発現される。組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３
６（１９９２年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２６３】
上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したよう
な付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２６４】
本発明のホスファターゼポリペプチドの発現（過剰発現を含む）は，ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害するアンチセンス分子を投与
することにより阻害することができる。あるいは，ｍＲＮＡを切断するリボザイ
ムを用いて同様の様式で発現を阻害することができる。アンチセンスおよびリボ
ザイム技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外
因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られてい
る。これらの各方法は，例えば，本発明のホスファターゼポリペプチドのアンチ
センスまたはリボザイム転写産物のいずれかをコードするベクター等のシステム
を利用する。
チドをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害するアンチセンス分子を投与
することにより阻害することができる。あるいは，ｍＲＮＡを切断するリボザイ
ムを用いて同様の様式で発現を阻害することができる。アンチセンスおよびリボ
ザイム技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外
因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られてい
る。これらの各方法は，例えば，本発明のホスファターゼポリペプチドのアンチ
センスまたはリボザイム転写産物のいずれかをコードするベクター等のシステム
を利用する。
【０２６５】
"リボザイム"との用語は，触媒的特性を有する１またはそれ以上のＲＮＡのＲ
ＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたは
ポリメラーゼ活性を示す。リボザイムは多数のＲＮＡ自己切断反応を媒介する構
造化されたＲＮＡ分子である。異なる二次構造を有する種々のタイプのトランス
作用性リボザイム，例えば"ハンマーヘッド"および"ヘアピン"タイプのものが同
定されている。種々のリボザイムが特性決定されている。例えば，米国特許５，
２４６，９２１，５，２２５，３４７，５，２２５，３３７および５，１４９，
７９６を参照。デオキシリボオリゴヌクレオチドとリボオリゴヌクレオチドとを
含む，触媒活性を有する混合リボザイムが記載されている（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ
，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：５６５−５６７（１９９０））。
ＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたは
ポリメラーゼ活性を示す。リボザイムは多数のＲＮＡ自己切断反応を媒介する構
造化されたＲＮＡ分子である。異なる二次構造を有する種々のタイプのトランス
作用性リボザイム，例えば"ハンマーヘッド"および"ヘアピン"タイプのものが同
定されている。種々のリボザイムが特性決定されている。例えば，米国特許５，
２４６，９２１，５，２２５，３４７，５，２２５，３３７および５，１４９，
７９６を参照。デオキシリボオリゴヌクレオチドとリボオリゴヌクレオチドとを
含む，触媒活性を有する混合リボザイムが記載されている（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ
，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：５６５−５６７（１９９０））。
【０２６６】
本明細書において用いる場合，"アンチセンス"とは，ゲノムＤＮＡおよび／ま
たは本発明のホスファターゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡと，特異的にハ
イブリダイズし，例えば細胞条件下で結合して，例えば，転写および／または翻
訳を阻害することによりその蛋白質の発現を阻害する，核酸分子またはその誘導
体を表す。結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく，または，例えば，
ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には，二重ヘリックスの主溝における特
異的相互作用によるものでもよい。
たは本発明のホスファターゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡと，特異的にハ
イブリダイズし，例えば細胞条件下で結合して，例えば，転写および／または翻
訳を阻害することによりその蛋白質の発現を阻害する，核酸分子またはその誘導
体を表す。結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく，または，例えば，
ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には，二重ヘリックスの主溝における特
異的相互作用によるものでもよい。
【０２６７】
１つの観点においては，アンチセンス構築物は，エクスビボで生成され，細胞
中に導入されたときに，限定されないが，本発明のホスファターゼポリヌクレオ
チドのｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることにより遺伝
子発現を阻害しうる核酸である。
中に導入されたときに，限定されないが，本発明のホスファターゼポリヌクレオ
チドのｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることにより遺伝
子発現を阻害しうる核酸である。
【０２６８】
アンチセンス方法は，ホスファターゼポリペプチドｍＲＮＡに相補的であり，
本発明のホスファターゼポリヌクレオチド，例えば，配列番号１，配列番号２，
配列番号３，配列番号４，および配列番号５に基づくオリゴヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を含むことができる。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは，ホスファターゼポリペプチドのｍＲＮＡ転写産物に結合し，翻訳
を妨害する。
本発明のホスファターゼポリヌクレオチド，例えば，配列番号１，配列番号２，
配列番号３，配列番号４，および配列番号５に基づくオリゴヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を含むことができる。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは，ホスファターゼポリペプチドのｍＲＮＡ転写産物に結合し，翻訳
を妨害する。
【０２６９】
完全な相補性が好ましいが，必要ではない。本明細書において用いる場合，Ｒ
ＮＡの一部に"相補的な"配列とは，ＲＮＡとハイブリダイズして安定なデュープ
レックスを形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセ
ンス核酸の場合には，デュープレックスＤＮＡの一本鎖を試験するか，またはト
リプレックス形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は，相
補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に，ハイブリダイ
ズする核酸が長いほど，ＲＮＡとより多い塩基ミスマッチを含むことができ，な
お安定なデュープレックス（または場合によりトリプレックス）を形成すること
ができる。当業者は，ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な方法
を用いることにより，ミスマッチの許容可能な程度を確かめることができる。
ＮＡの一部に"相補的な"配列とは，ＲＮＡとハイブリダイズして安定なデュープ
レックスを形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセ
ンス核酸の場合には，デュープレックスＤＮＡの一本鎖を試験するか，またはト
リプレックス形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は，相
補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に，ハイブリダイ
ズする核酸が長いほど，ＲＮＡとより多い塩基ミスマッチを含むことができ，な
お安定なデュープレックス（または場合によりトリプレックス）を形成すること
ができる。当業者は，ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な方法
を用いることにより，ミスマッチの許容可能な程度を確かめることができる。
【０２７０】
一般に，メッセージの５’末端，例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含
む５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは，翻訳の阻害において最も有
効に作用するはずである。しかし，ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も
同様にｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ，
Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。ｍＲＮＡのコーディング領
域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは比較的有効性の低い翻訳の阻害
剤であるが，本発明にしたがって用いることが可能である。ホスファターゼポリ
ペプチドのｍＲＮＡの５’，３’またはコーディング領域のいずれにハイブリダ
イズするよう設計されているかにかかわらず，アンチセンス核酸は少なくとも６
ヌクレオチドの長さであるべきであり，好ましくは約１００ヌクレオチドより短
く，より好ましくは約５０または３０ヌクレオチドより短い。典型的には，これ
らは１０−２５ヌクレオチドの長さであるべきである。このような原則は，現場
の者に適当なオリゴヌクレオチドを選択する上での情報を与えるであろう。好ま
しい態様においては，アンチセンス配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号
３，配列番号４，および配列番号５からなる群より選択される核酸配列またはこ
れらのドメインの，約１０−３０個の，より好ましくは１５−２５個の連続する
ヌクレオチド塩基を含むか，これからなるか，または本質的にこれからなるオリ
ゴヌクレオチド配列から選択される。
む５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは，翻訳の阻害において最も有
効に作用するはずである。しかし，ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も
同様にｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ，
Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。ｍＲＮＡのコーディング領
域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは比較的有効性の低い翻訳の阻害
剤であるが，本発明にしたがって用いることが可能である。ホスファターゼポリ
ペプチドのｍＲＮＡの５’，３’またはコーディング領域のいずれにハイブリダ
イズするよう設計されているかにかかわらず，アンチセンス核酸は少なくとも６
ヌクレオチドの長さであるべきであり，好ましくは約１００ヌクレオチドより短
く，より好ましくは約５０または３０ヌクレオチドより短い。典型的には，これ
らは１０−２５ヌクレオチドの長さであるべきである。このような原則は，現場
の者に適当なオリゴヌクレオチドを選択する上での情報を与えるであろう。好ま
しい態様においては，アンチセンス配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号
３，配列番号４，および配列番号５からなる群より選択される核酸配列またはこ
れらのドメインの，約１０−３０個の，より好ましくは１５−２５個の連続する
ヌクレオチド塩基を含むか，これからなるか，または本質的にこれからなるオリ
ゴヌクレオチド配列から選択される。
【０２７１】
別の好ましい態様においては，本発明は，配列番号６，配列番号７，配列番号
８，配列番号９，および配列番号１０からなる群より選択されるポリペプチドを
コードする核酸配列の，約１０−３０個の，より好ましくは１５−２５個の連続
するヌクレオチド塩基を含むか，これからなるか，本質的にこれからなる，単離
された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を含む。
８，配列番号９，および配列番号１０からなる群より選択されるポリペプチドを
コードする核酸配列の，約１０−３０個の，より好ましくは１５−２５個の連続
するヌクレオチド塩基を含むか，これからなるか，本質的にこれからなる，単離
された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を含む。
【０２７２】
本発明の配列を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができ
る。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを，標的ホスファターゼを発現
する細胞に投与して，標的ＲＮＡまたは蛋白質のレベルを内部対照ＲＮＡまたは
蛋白質のレベルと比較することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用
いて得られる結果はまた，適当な対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果
と比較することができる。好ましい対照オリゴヌクレオチドは，試験オリゴヌク
レオチドとほぼ同じ長さのオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡまたは蛋白質
のレベルを減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する。
る。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを，標的ホスファターゼを発現
する細胞に投与して，標的ＲＮＡまたは蛋白質のレベルを内部対照ＲＮＡまたは
蛋白質のレベルと比較することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用
いて得られる結果はまた，適当な対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果
と比較することができる。好ましい対照オリゴヌクレオチドは，試験オリゴヌク
レオチドとほぼ同じ長さのオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡまたは蛋白質
のレベルを減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する。
【０２７３】
オリゴヌクレオチドは，ＤＮＡまたはＲＮＡ，またはこれらのキメラ混合物ま
たは誘導体または改変体であることができ，一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴ
ヌクレオチドは，塩基成分，糖成分，またはホスフェート骨格において修飾して
，例えば，分子の安定性またはハイブリダイゼーションを改良することができる
。オリゴヌクレオチドは，結合した他の基，例えばペプチド（例えば，インビボ
で宿主細胞レセプターにターゲティングするため），または細胞膜（例えば，Ｌ
ｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４
８−６５２；ＰＣＴ国際公開ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公
開）を参照），または血液脳関門（例えば，ＰＣＴ国際公開ＷＯ８９／１０１３
４（１９８８年４月２５日公開）を参照）を越える輸送を容易にする試薬，ハイ
ブリダイゼーション励起性切断試薬（例えば，Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９８
８）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照）またはインタ
ーカレート剤（例えば，Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−
５４９を参照）を含むことができる。この目的のために，オリゴヌクレオチドを
他の分子，例えば，ペプチド，ハイブリダイゼーション励起性架橋剤，輸送剤，
ハイブリダイゼーション励起性切断剤等とコンジュゲートさせることができる。
たは誘導体または改変体であることができ，一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴ
ヌクレオチドは，塩基成分，糖成分，またはホスフェート骨格において修飾して
，例えば，分子の安定性またはハイブリダイゼーションを改良することができる
。オリゴヌクレオチドは，結合した他の基，例えばペプチド（例えば，インビボ
で宿主細胞レセプターにターゲティングするため），または細胞膜（例えば，Ｌ
ｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４
８−６５２；ＰＣＴ国際公開ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公
開）を参照），または血液脳関門（例えば，ＰＣＴ国際公開ＷＯ８９／１０１３
４（１９８８年４月２５日公開）を参照）を越える輸送を容易にする試薬，ハイ
ブリダイゼーション励起性切断試薬（例えば，Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９８
８）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照）またはインタ
ーカレート剤（例えば，Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−
５４９を参照）を含むことができる。この目的のために，オリゴヌクレオチドを
他の分子，例えば，ペプチド，ハイブリダイゼーション励起性架橋剤，輸送剤，
ハイブリダイゼーション励起性切断剤等とコンジュゲートさせることができる。
【０２７４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは，５−フルオロウラシル，５−ブロモウラ
シル，５−クロロウラシル，５−ヨードウラシル，ヒポキサンチン，キサンチン
，４−アセチルシトシン，および５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル
などの成分から選択される少なくとも１つの修飾塩基成分を含むことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた，限定されないが，アラビノース，２−
フルオロアラビノース，キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される
少なくとも１つの修飾糖成分を含んでいてもよい。
シル，５−クロロウラシル，５−ヨードウラシル，ヒポキサンチン，キサンチン
，４−アセチルシトシン，および５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル
などの成分から選択される少なくとも１つの修飾塩基成分を含むことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた，限定されないが，アラビノース，２−
フルオロアラビノース，キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される
少なくとも１つの修飾糖成分を含んでいてもよい。
【０２７５】
さらに別の態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ホスホロチ
オエート，ホスホロジチオエート，ホスホルアミドチオエート，ホスホルアミデ
ート，ホスホルジアミデート，メチルホスホネート，アルキルホスホトリエステ
ル，およびホルムアセタールまたはこれらの類似体からなる群より選択される少
なくとも１つの修飾ホスフェート骨格を含む（米国特許５，１７６，９９６；５
，２６４，５６４；および５，２５６，７７５も参照）。
オエート，ホスホロジチオエート，ホスホルアミドチオエート，ホスホルアミデ
ート，ホスホルジアミデート，メチルホスホネート，アルキルホスホトリエステ
ル，およびホルムアセタールまたはこれらの類似体からなる群より選択される少
なくとも１つの修飾ホスフェート骨格を含む（米国特許５，１７６，９９６；５
，２６４，５６４；および５，２５６，７７５も参照）。
【０２７６】
さらに別の態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマー
オリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは，通常のβ−ユ
ニットとは異なり，相補的ＲＮＡと，鎖が互いにパラレルに走る特別の二本鎖ハ
イブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは２’
−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８），またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。
オリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは，通常のβ−ユ
ニットとは異なり，相補的ＲＮＡと，鎖が互いにパラレルに走る特別の二本鎖ハ
イブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは２’
−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８），またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。
【０２７７】
また適しているものは，ポリセリン，ポリトレオニン等のポリペプチドである
ペプチジル核酸であり，これには側鎖の位置で核酸（Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）で置
換された種々のアミノ酸を含むコポリマーが含まれる。このようなポリマーの鎖
は，天然のＤＮＡ／ＲＮＡと同じ様式で相補塩基を介してハイブリダイズするこ
とができる。あるいは，本発明のアンチセンス構築物は，例えば，細胞内で転写
されたときに本発明のホスファターゼポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの
少なくとも独特の部分に相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミドまたはベクタ
ーとして輸送することができる。
ペプチジル核酸であり，これには側鎖の位置で核酸（Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）で置
換された種々のアミノ酸を含むコポリマーが含まれる。このようなポリマーの鎖
は，天然のＤＮＡ／ＲＮＡと同じ様式で相補塩基を介してハイブリダイズするこ
とができる。あるいは，本発明のアンチセンス構築物は，例えば，細胞内で転写
されたときに本発明のホスファターゼポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの
少なくとも独特の部分に相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミドまたはベクタ
ーとして輸送することができる。
【０２７８】
領域配列をコードするホスファターゼポリペプチドに相補的なアンチセンスヌ
クレオチドを用いることができるが，転写された非翻訳領域に相補的なものが最
も好ましい。
クレオチドを用いることができるが，転写された非翻訳領域に相補的なものが最
も好ましい。
【０２７９】
別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書にお
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
いて用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供
給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の
機能を提供することを意味する。
【０２８０】医薬処方および投与経路
本明細書に記載される化合物，例えば，本発明のホスファターゼポリペプチド
，アンチセンス分子，リボザイム，および本発明のホスファターゼポリペプチド
の活性を調節する他のいずれかの化合物は，それ自体で，または医薬組成物中で
ヒト患者に投与することができる。医薬組成物では，組み合わせ療法におけるよ
うに，化合物が他の活性成分と混合されているか，または適当な担体または賦形
剤と混合されている。本発明の化合物の処方および投与の手法は"Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見いだすことが
できる。
，アンチセンス分子，リボザイム，および本発明のホスファターゼポリペプチド
の活性を調節する他のいずれかの化合物は，それ自体で，または医薬組成物中で
ヒト患者に投与することができる。医薬組成物では，組み合わせ療法におけるよ
うに，化合物が他の活性成分と混合されているか，または適当な担体または賦形
剤と混合されている。本発明の化合物の処方および投与の手法は"Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見いだすことが
できる。
【０２８１】投与経路：
投与の適当な経路には，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸投与；非経口
輸送，例えば筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内注入，ならびに鞘内，直接心室内，
腹膜内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
輸送，例えば筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内注入，ならびに鞘内，直接心室内，
腹膜内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
【０２８２】
あるいは，化合物を全身ではなく局所的に投与してもよく，これには，例えば
，化合物を，しばしばデポ製剤または徐放製剤として直接固体腫瘍に注射するこ
とが含まれる。
，化合物を，しばしばデポ製剤または徐放製剤として直接固体腫瘍に注射するこ
とが含まれる。
【０２８３】
さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，
例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソ
ームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソ
ームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０２８４】組成物／処方：
本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，限
定されないが，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封
入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
定されないが，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封
入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
【０２８５】
すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬
剤として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補
助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方
法で製剤することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
剤として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補
助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方
法で製剤することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０２８６】
注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶
液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することが
できる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる
。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することが
できる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる
。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０２８７】
経口投与のためには，化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許
容しうる担体と混合することにより化合物を容易に処方することができる。その
ような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤
，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として
処方することを可能とする。適当な担体には，特に，ラクトース，ショ糖，マン
ニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン
，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラ
ガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カル
ボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビ
ニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナト
リウム等の崩壊剤を加えてもよい。
容しうる担体と混合することにより化合物を容易に処方することができる。その
ような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤
，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として
処方することを可能とする。適当な担体には，特に，ラクトース，ショ糖，マン
ニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン
，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラ
ガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カル
ボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビ
ニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナト
リウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０２８８】
糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加し
てもよい。
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加し
てもよい。
【０２８９】
経口で使用することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフ
ィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑
剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成
分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよ
びステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含
むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン
，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁するこ
とができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そ
のような投与に適当な用量で調製すべきである。
ィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑
剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成
分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよ
びステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含
むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン
，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁するこ
とができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そ
のような投与に適当な用量で調製すべきである。
【０２９０】
口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形に
することができる。
することができる。
【０２９１】
吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，噴射剤，例えば
，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフル
オロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまた
はネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧された
エアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブに
より調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するための
ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトー
スまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフル
オロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまた
はネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧された
エアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブに
より調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するための
ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトー
スまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
【０２９２】
化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方する
ことができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは
添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性ま
たは水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることがで
き，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
ことができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは
添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性ま
たは水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることがで
き，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０２９３】
非経口投与用の薬剤処方は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。さ
らに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することが
できる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸
エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含
む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビト
ール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいても
よい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該
化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
らに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することが
できる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸
エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含
む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビト
ール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいても
よい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該
化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０２９４】
あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば
発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０２９５】
化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤
を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０２９６】
上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。
そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によ
るか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，例えば，化合
物は，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁
液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として
，処方することができる。
そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によ
るか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，例えば，化合
物は，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁
液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として
，処方することができる。
【０２９７】
本発明の化合物のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界面活性
剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系であってもよい。共溶媒
系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコ
ール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である
。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液
中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，
それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶
解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，
共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面
活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコ
ールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニ
ルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖ま
たは多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系であってもよい。共溶媒
系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコ
ール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である
。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液
中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，
それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶
解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，
共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面
活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコ
ールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニ
ルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖ま
たは多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０２９８】
あるいは，疎水的医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソーム
および乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知
られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用
いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続放
出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用い
て輸送することができる。種々の持続放出材料が当業者にはよく知られている。
持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間
，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さ
らに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
および乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知
られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用
いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続放
出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用い
て輸送することができる。種々の持続放出材料が当業者にはよく知られている。
持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間
，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さ
らに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０２９９】
医薬組成物はまた，適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいて
もよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウ
ム，リン酸カルシウム，種々の糖，澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，および
ポリエチレングリコール等の高分子が含まれる。
もよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウ
ム，リン酸カルシウム，種々の糖，澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，および
ポリエチレングリコール等の高分子が含まれる。
【０３００】
本発明のチロシンまたはセリン／トレオニンホスファターゼ調節化合物の多く
は，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供される。薬学的に適合
性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石
酸，リンゴ酸，クエン酸等を用いて形成することができる。塩は，水性または他
のプロトン性溶媒において，対応する遊離塩基の形よりもより溶解性である傾向
にある。
は，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供される。薬学的に適合
性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石
酸，リンゴ酸，クエン酸等を用いて形成することができる。塩は，水性または他
のプロトン性溶媒において，対応する遊離塩基の形よりもより溶解性である傾向
にある。
【０３０１】適切な投与計画：
本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図され
る目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には
，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療
している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。本発明の化
合物の治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，
十分に当業者の能力の範囲内である。
る目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には
，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療
している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。本発明の化
合物の治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，
十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３０２】
患者に投与すべき化合物の投与量および生物に化合物を投与するモードを決定
する方法は，米国特許出願０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）
および国際出願ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）（この両方に
ついて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に開示されている。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易
に適合させることができることを理解するであろう。
する方法は，米国特許出願０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）
および国際出願ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）（この両方に
ついて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
に開示されている。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易
に適合させることができることを理解するであろう。
【０３０３】
適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療する疾病のタイプ，用いられる特
定の組成物および患者のサイズおよび生理学的状態に依存する。本明細書に記載
される化合物についての治療上有効量は，最初は培養細胞および動物モデルから
見積もることができる。例えば，容量は，動物モデルにおいて，培養細胞アッセ
イにおいて決定されたＩＣ50を最初に考慮した循環濃度範囲を達成する用量を処
方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおける有用な用量を
より正確に決定することができる。
定の組成物および患者のサイズおよび生理学的状態に依存する。本明細書に記載
される化合物についての治療上有効量は，最初は培養細胞および動物モデルから
見積もることができる。例えば，容量は，動物モデルにおいて，培養細胞アッセ
イにおいて決定されたＩＣ50を最初に考慮した循環濃度範囲を達成する用量を処
方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおける有用な用量を
より正確に決定することができる。
【０３０４】
本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な用量は
，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにお
いて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちチロシンまたはセリン／ト
レオニンホスファターゼ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を
含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。そのような情
報は，ヒトまたは他の被験体における有用な用量のさらに正確な決定のために用
いることができる。
，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにお
いて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちチロシンまたはセリン／ト
レオニンホスファターゼ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を
含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。そのような情
報は，ヒトまたは他の被験体における有用な用量のさらに正確な決定のために用
いることができる。
【０３０５】
本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験
動物における標準的な薬理学的方法，例えばＬＤ50（集団の５０％に致死的な用
量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することにより，
決定することができる。毒性と治療上有効性の用量の比は治療指数であり，ＬＤ50 とＥＤ50の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好まし
い。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにお
いて用いるための投与量の範囲を定式化するために用いることができる。このよ
うな化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ50を含み毒性がほとんどまたは全くな
い循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路に
より，この範囲内で様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，
個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇ
ｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａ
ｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
動物における標準的な薬理学的方法，例えばＬＤ50（集団の５０％に致死的な用
量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することにより，
決定することができる。毒性と治療上有効性の用量の比は治療指数であり，ＬＤ50 とＥＤ50の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好まし
い。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにお
いて用いるための投与量の範囲を定式化するために用いることができる。このよ
うな化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ50を含み毒性がほとんどまたは全くな
い循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路に
より，この範囲内で様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，
個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇ
ｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａ
ｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０３０６】
毒性研究は，血液細胞組成を測定することにより実施することもできる。例え
ば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる
１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２
）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３
）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細
胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，
毒性が存在するか否かを示す。
ば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる
１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２
）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３
）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細
胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，
毒性が存在するか否かを示す。
【０３０７】
各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
ｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅ
ｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉ
ｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３
にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表
的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について
調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重
または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有
する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど
，化合物はより好ましくない。
【０３０８】
癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／日
，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲
である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であ
るかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲
である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であ
るかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０３０９】
血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であ
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
ればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０３１０】
薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器におけ
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
る生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易に
することができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処
置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，および
ＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができ
る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動
力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化するこ
とができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデル
として用いることができる。
【０３１１】
投与量および間隔は，個々に，活性成分がホスファターゼ調節効果を維持する
のに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節する
ことができる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例
えば，限定されないが，本明細書に記載されるアッセイを用いて，ホスファター
ゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。
ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するで
あろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決
定することができる。
のに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節する
ことができる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例
えば，限定されないが，本明細書に記載されるアッセイを用いて，ホスファター
ゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。
ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するで
あろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決
定することができる。
【０３１２】
投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−
９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の
時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである
。
９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の
時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである
。
【０３１３】
局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度
とは関係ないであろう。
とは関係ないであろう。
【０３１４】
投与される特定の組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛
の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０３１５】包装：
組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を
含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。
パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むこ
とができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されてい
てもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または
販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添
付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用のポリヌクレオチ
ドの形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例
えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか
，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処
方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置さ
れ，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すことができる。ラベ
ル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，
糖尿病等の治療が挙げられる。
含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。
パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むこ
とができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されてい
てもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または
販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添
付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用のポリヌクレオチ
ドの形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例
えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか
，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処
方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置さ
れ，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すことができる。ラベ
ル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，
糖尿病等の治療が挙げられる。
【０３１６】機能的誘導体
本発明はまた，本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体を提供する。
"機能的誘導体"は，本発明のポリペプチドまたは核酸の"化学的誘導体"，"フラ
グメント"または"変種"を意味し，これらの用語は以下に定義される。機能的誘
導体は，蛋白質の機能の少なくとも一部，例えば蛋白質に特異的な抗体との反応
性，非触媒ドメインにより媒介される酵素活性または結合活性を保持しており，
これにより本発明にしたがう有用性を有する。遺伝コードの縮重のため，多くの
異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができることは当該技術分
野においてよく知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変更して，元の機能
性的を保持する蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも当該技術分
野においてよく知られている。いずれの場合においても，すべての順列が本明細
書の開示によりカバーされることが意図される。
"機能的誘導体"は，本発明のポリペプチドまたは核酸の"化学的誘導体"，"フラ
グメント"または"変種"を意味し，これらの用語は以下に定義される。機能的誘
導体は，蛋白質の機能の少なくとも一部，例えば蛋白質に特異的な抗体との反応
性，非触媒ドメインにより媒介される酵素活性または結合活性を保持しており，
これにより本発明にしたがう有用性を有する。遺伝コードの縮重のため，多くの
異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができることは当該技術分
野においてよく知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変更して，元の機能
性的を保持する蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも当該技術分
野においてよく知られている。いずれの場合においても，すべての順列が本明細
書の開示によりカバーされることが意図される。
【０３１７】
本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすること
ができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子
の一部または全部を合成して，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号
４，および配列番号５に記載される配列からなる群より選択される核酸配列と有
意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコードされるアミ
ノ酸配列は保存される。
含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他の
コドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，
メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすること
ができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子
の一部または全部を合成して，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号
４，および配列番号５に記載される配列からなる群より選択される核酸配列と有
意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコードされるアミ
ノ酸配列は保存される。
【０３１８】
さらに，核酸配列は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，お
よび配列番号５に記載される配列，またはその誘導体．からなる群より選択され
る核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端で少なくと
も１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することにより得られるヌクレオ
チド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が，ヌクレオチド配列
によりコードされる，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，およ
び配列番号１０に記載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を変更
しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこのように用いるこ
とができる。例えば，本発明は，本発明の核酸配列またはその誘導体の５’−末
端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより，または本発明のヌクレオチ
ド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたは
ＴＧＡを付加することにより得られる任意の核酸配列を含むことを意図する。さ
らに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，これらの５’−末端および／または
３’−末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる
。
よび配列番号５に記載される配列，またはその誘導体．からなる群より選択され
る核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端で少なくと
も１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することにより得られるヌクレオ
チド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が，ヌクレオチド配列
によりコードされる，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，およ
び配列番号１０に記載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を変更
しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこのように用いるこ
とができる。例えば，本発明は，本発明の核酸配列またはその誘導体の５’−末
端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより，または本発明のヌクレオチ
ド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたは
ＴＧＡを付加することにより得られる任意の核酸配列を含むことを意図する。さ
らに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，これらの５’−末端および／または
３’−末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる
。
【０３１９】
所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明のホスファ
ターゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発
明に含まれる。
によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される
機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明のホスファ
ターゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発
明に含まれる。
【０３２０】
さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生
されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製
造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つの
ポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コード
の縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子
も機能的に同等である。
【０３２１】
複合体の"化学的誘導体"は，通常は蛋白質の一部ではない追加の化学的成分を
含む。蛋白質またはペプチドの共有結合修飾は，本発明の範囲内に含まれる。そ
のような修飾は，以下に記載するように，ペプチドの標的アミノ酸残基を選択さ
れた側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導化剤と反応させることにより，分
子中に導入することができる。
含む。蛋白質またはペプチドの共有結合修飾は，本発明の範囲内に含まれる。そ
のような修飾は，以下に記載するように，ペプチドの標的アミノ酸残基を選択さ
れた側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導化剤と反応させることにより，分
子中に導入することができる。
【０３２２】
システイン残基は，最も一般的にはアルファ−ハロアセテート（および対応す
るアミン），例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて，カルボ
キシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基は，ブ
ロモトリフルオロアセトン，クロロアセチルホスフェート，Ｎ−アルキルマレイ
ミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド，メチル２−ピリジルジスルフィ
ド，ｐ−クロロ水銀ベンゾエート，２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール，ま
たはクロロ７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させるこ
とにより誘導化する。
るアミン），例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて，カルボ
キシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基は，ブ
ロモトリフルオロアセトン，クロロアセチルホスフェート，Ｎ−アルキルマレイ
ミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド，メチル２−ピリジルジスルフィ
ド，ｐ−クロロ水銀ベンゾエート，２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール，ま
たはクロロ７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させるこ
とにより誘導化する。
【０３２３】
ヒスチジン残基は，ｐＨ５．５−７．０でジエチルプロカーボネートと反応さ
せることにより誘導化することができる。これは，この薬剤がヒスチジンの側鎖
に比較的特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である
。反応は，好ましくは，０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行う。
せることにより誘導化することができる。これは，この薬剤がヒスチジンの側鎖
に比較的特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である
。反応は，好ましくは，０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行う。
【０３２４】
リジンおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応さ
せる。これらの薬剤による誘導化は，リジン残基の電荷を逆転させる効果を有す
る。１級アミン含有残基を誘導化するための他の適当な試薬には，イミドエステ
ル，例えば，メチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリド
キサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ
ウレア；２，４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼに触媒されるグリ
オキシレートとの反応が含まれる。
せる。これらの薬剤による誘導化は，リジン残基の電荷を逆転させる効果を有す
る。１級アミン含有残基を誘導化するための他の適当な試薬には，イミドエステ
ル，例えば，メチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリド
キサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ
ウレア；２，４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼに触媒されるグリ
オキシレートとの反応が含まれる。
【０３２５】
アルギニン残基は慣用的な試薬の１つまたはいくつかと反応させることにより
修飾する。これには，例えば，フェニルグリオキサール，２，３−ブタンジオン
，１，２−シクロヘキサンジオン，およびニンヒドリンがある。アルギニン残基
の誘導化には，グアニジン官能基の高いｐＫａのため，反応をアルカリ条件中で
行うことが必要である。さらに，これらの試薬はリジンの基ならびにアルギニン
アルファアミノ基とも反応することができる。
修飾する。これには，例えば，フェニルグリオキサール，２，３−ブタンジオン
，１，２−シクロヘキサンジオン，およびニンヒドリンがある。アルギニン残基
の誘導化には，グアニジン官能基の高いｐＫａのため，反応をアルカリ条件中で
行うことが必要である。さらに，これらの試薬はリジンの基ならびにアルギニン
アルファアミノ基とも反応することができる。
【０３２６】
チロシン残基は，芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反
応させることにより光学的標識を導入するための修飾のよく知られる標的である
。最も一般的には，Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用い
て，それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
応させることにより光学的標識を導入するための修飾のよく知られる標的である
。最も一般的には，Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用い
て，それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
【０３２７】
カルボキシル側鎖（アスパラギン酸およびグルタミン酸）は，カルボジイミド
（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’），例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４
，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドと反応させることにより，選択的に修
飾する。さらに，アスパラギン酸およびグルタミン酸残基は，アンモニウムイオ
ンと反応させることにより，アスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’），例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４
，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドと反応させることにより，選択的に修
飾する。さらに，アスパラギン酸およびグルタミン酸残基は，アンモニウムイオ
ンと反応させることにより，アスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
【０３２８】
グルタミンおよびアスパラギン残基は，しばしば脱アミド化して，対応するグ
ルタミン酸およびアスパラギン酸残基に変換する。あるいは，これらの残基をよ
り穏和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形も本発明の範
囲内である。
ルタミン酸およびアスパラギン酸残基に変換する。あるいは，これらの残基をよ
り穏和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形も本発明の範
囲内である。
【０３２９】
二官能性薬剤による誘導化は，例えば，蛋白質の成分ペプチドを互いに，また
は複合体中の他の蛋白質と，または水不溶性支持体マトリクスと，または他の高
分子担体と架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋薬剤としては，例え
ば，１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデヒ
ド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば，４−アジドサリチル酸の
エステル，ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含む），および二官能
性マレイミド，例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。
メチル−３−［ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導化
薬剤により，光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体が得られる。
あるいは，反応性の水不溶性マトリクス，例えば臭化シアン活性化炭水化物およ
び米国特許３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４
，２４７，６４２；４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載され
る反応性基質を蛋白質固定化のために用いることができる。
は複合体中の他の蛋白質と，または水不溶性支持体マトリクスと，または他の高
分子担体と架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋薬剤としては，例え
ば，１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデヒ
ド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば，４−アジドサリチル酸の
エステル，ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含む），および二官能
性マレイミド，例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。
メチル−３−［ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導化
薬剤により，光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体が得られる。
あるいは，反応性の水不溶性マトリクス，例えば臭化シアン活性化炭水化物およ
び米国特許３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４
，２４７，６４２；４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載され
る反応性基質を蛋白質固定化のために用いることができる。
【０３３０】
他の修飾としては，プロリンおよびリジンのヒドロキシル化，セリンまたはト
レオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化，リジン，アルギニン，およびヒスチ
ジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
ｐｐ．７９−８６（１９８３）），Ｎ末端アミンのアセチル化，および場合によ
りＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
レオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化，リジン，アルギニン，およびヒスチ
ジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
ｐｐ．７９−８６（１９８３）），Ｎ末端アミンのアセチル化，および場合によ
りＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０３３１】
そのような誘導化された成分は，安定性，溶解性，吸収，生物学的半減期等を
改良することができる。あるいは，これらの成分は，蛋白質複合体の望ましくな
い副作用を排除するかまたは緩和することができる。そのような効果を媒介しう
る成分は，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。
改良することができる。あるいは，これらの成分は，蛋白質複合体の望ましくな
い副作用を排除するかまたは緩和することができる。そのような効果を媒介しう
る成分は，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。
【０３３２】
"フラグメント"との用語は，これが由来する全長ポリペプチドより短い長さを
有する蛋白質または複合体のアミノ酸配列に由来するポリペプチドを示すものと
して用いられる。そのようなフラグメントは，例えば，全長蛋白質の蛋白質分解
性切断により製造することができる。好ましくは，フラグメントは，蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配
列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸を除去する
ことにより，組換えにより得る。蛋白質のフラグメントは，本明細書に記載され
るように，シグナル伝達を調節するように作用する物質のスクリーニングに有用
である。そのようなフラグメントは，天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的
部分を保持しているであろうことが理解される。そのような保持される特徴の例
としては，触媒的活性；基質特異性；無傷の細胞中における他の分子との相互作
用；制御機能；または天然の複合体またはそのエピトープに対する抗体との結合
が挙げられる。
有する蛋白質または複合体のアミノ酸配列に由来するポリペプチドを示すものと
して用いられる。そのようなフラグメントは，例えば，全長蛋白質の蛋白質分解
性切断により製造することができる。好ましくは，フラグメントは，蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配
列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸を除去する
ことにより，組換えにより得る。蛋白質のフラグメントは，本明細書に記載され
るように，シグナル伝達を調節するように作用する物質のスクリーニングに有用
である。そのようなフラグメントは，天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的
部分を保持しているであろうことが理解される。そのような保持される特徴の例
としては，触媒的活性；基質特異性；無傷の細胞中における他の分子との相互作
用；制御機能；または天然の複合体またはそのエピトープに対する抗体との結合
が挙げられる。
【０３３３】
本発明の範囲内に入ることが意図される別の機能的誘導体は，天然のポリペプ
チドに対して，１またはそれ以上のアミノ酸を欠失しているか，追加のまたは置
換されたアミノ酸を含む"変種"ポリペプチドである。変種は，蛋白質のＤＮＡコ
ーディング配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中
の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸のためのコドン
を付加，除去，および／または改変することにより，天然に生ずる複合体成分か
ら誘導することができる。追加，置換および／または追加アミノ酸を有するその
ような変種は，上述するように，天然の蛋白質の１またはそれ以上の特徴的部分
を保持していることが理解される。
チドに対して，１またはそれ以上のアミノ酸を欠失しているか，追加のまたは置
換されたアミノ酸を含む"変種"ポリペプチドである。変種は，蛋白質のＤＮＡコ
ーディング配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中
の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸のためのコドン
を付加，除去，および／または改変することにより，天然に生ずる複合体成分か
ら誘導することができる。追加，置換および／または追加アミノ酸を有するその
ような変種は，上述するように，天然の蛋白質の１またはそれ以上の特徴的部分
を保持していることが理解される。
【０３３４】
アミノ酸残基が除去，挿入および／または置換されている蛋白質の機能的誘導
体は，当業者によく知られる標準的な手法を用いて製造することができる。例え
ば，機能的誘導体の改変された成分は，改変されたコード配列を生成するように
，ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを修飾する部位特異的突然変異手法（Ａｄ
ｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＤＮＡ ２：１８３に例示されている）
を用いて，その後上述したような手法を用いてこの組換えＤＮＡを原核生物また
は真核生物宿主細胞中で発現させることにより，製造することができる。あるい
は，アミノ酸が削除，挿入および／または置換されている蛋白質は，当該技術分
野においてよく知られる方法を用いて，直接化学合成により便利に製造すること
ができる。蛋白質の機能的誘導体は，典型的には天然の蛋白質と同じ質の生物学
的活性を示す。
体は，当業者によく知られる標準的な手法を用いて製造することができる。例え
ば，機能的誘導体の改変された成分は，改変されたコード配列を生成するように
，ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを修飾する部位特異的突然変異手法（Ａｄ
ｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＤＮＡ ２：１８３に例示されている）
を用いて，その後上述したような手法を用いてこの組換えＤＮＡを原核生物また
は真核生物宿主細胞中で発現させることにより，製造することができる。あるい
は，アミノ酸が削除，挿入および／または置換されている蛋白質は，当該技術分
野においてよく知られる方法を用いて，直接化学合成により便利に製造すること
ができる。蛋白質の機能的誘導体は，典型的には天然の蛋白質と同じ質の生物学
的活性を示す。
【０３３５】
本発明はまた，核酸配列が天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的部分を含
む本発明にしたがうホスファターゼをコードするか否かを検出する方法を提供す
る。記載されるように，そのような保存された特徴の例には以下のものが含まれ
る：触媒活性；基質特異性；無傷の細胞における他の分子との相互作用；制御機
能；または天然の複合体に特異的な抗体またはそのエピトープとの結合。したが
って，本発明は，所定の核酸分子によりコードされるポリペプチドホスファター
ゼの１またはそれ以上の特徴，特に，触媒ドメインの存在を分析するアッセイを
提供する。
む本発明にしたがうホスファターゼをコードするか否かを検出する方法を提供す
る。記載されるように，そのような保存された特徴の例には以下のものが含まれ
る：触媒活性；基質特異性；無傷の細胞における他の分子との相互作用；制御機
能；または天然の複合体に特異的な抗体またはそのエピトープとの結合。したが
って，本発明は，所定の核酸分子によりコードされるポリペプチドホスファター
ゼの１またはそれ以上の特徴，特に，触媒ドメインの存在を分析するアッセイを
提供する。
【０３３６】
この目的のため，適当なアッセイは，ホスファターゼ蛋白質を精製し定量する
ことから開始することができる。次に，例えば，一連の希釈を行い，加水分解し
うる基質，および任意にポリペプチドの触媒活性を増加させることができる還元
剤を含む緩衝液（例えばＡＢＴ緩衝液）中でインキュベートすることにより，蛋
白質をアッセイすることができる。好ましくは，基質はｐ−ニトロフェニルホス
フェート（ｐＮＰＰ）であり，還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり，
ｍＭ濃度はそれぞれ４Ｘおよび１Ｘであうｒ。インキュベーションは，活性によ
り，室温で約２分間から一夜でありうる。反応を停止するためには，ＮａＯＨを
加え，これは約１００μｌの１０ＮＮａＯＨでありうる。懸濁液を遠心分離し，
上清をＯＤ４１０ｎＭで分析して，蛋白質ホスファターゼが触媒特性を示すか否
かを判定することができる。
ことから開始することができる。次に，例えば，一連の希釈を行い，加水分解し
うる基質，および任意にポリペプチドの触媒活性を増加させることができる還元
剤を含む緩衝液（例えばＡＢＴ緩衝液）中でインキュベートすることにより，蛋
白質をアッセイすることができる。好ましくは，基質はｐ−ニトロフェニルホス
フェート（ｐＮＰＰ）であり，還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり，
ｍＭ濃度はそれぞれ４Ｘおよび１Ｘであうｒ。インキュベーションは，活性によ
り，室温で約２分間から一夜でありうる。反応を停止するためには，ＮａＯＨを
加え，これは約１００μｌの１０ＮＮａＯＨでありうる。懸濁液を遠心分離し，
上清をＯＤ４１０ｎＭで分析して，蛋白質ホスファターゼが触媒特性を示すか否
かを判定することができる。
【０３３７】表およびその記載
表１は，各遺伝子の名前，各遺伝子の分類，配列中のオープンリーディングフ
レームの位置，および対応するペプチドの長さを表す。データは，左から右に，
以下のものを表す："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"
，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"ＮＡ長さ"，"ＯＲＦ開
始"，"ＯＲＦ終了"，"ＯＲＦ長さ"，および"ＡＡ長さ"。"遺伝子名"は，ホスフ
ァターゼまたはホスファターゼ様酵素をコードする配列に与えられた名前を表す
。各遺伝子は，"ＳＧＰ"名称およびその後の番号により表される。ＳＧＰ名は，
通常は，１つの連続配列（"コンティグ"）に構築された多数の重複配列を表す。
"ＩＤ＃ｎａ"および"ＩＤ＃ａａ"は，本明細書において各核酸およびアミノ酸配
列に与えられた同定番号を表す。"ＦＬ／Ｃａｔ"は，遺伝子の長さを表し，ＦＬ
は全長を，"Ｃａｔ"は触媒ドメインのみが示されていることを表す。このカラム
中の"Ｐａｒｔｉａｌ"とは，配列が部分的蛋白質ホスファターゼ触媒ドメインを
コードすることを示す。"スーパーファミリー"とは，遺伝子が二重特異性ホスフ
ァターゼ，蛋白質チロシンホスファターゼまたはセリントレオニンホスファター
ゼであるかを識別する。"グループ"および"ファミリー"は，配列ホモロジーによ
り定義され，先に確立されている系統発生分析に基づく蛋白質ホスファターゼの
分類を表す（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏ
ｏｋ，Ｎｉｃｋ Ｔｏｎｋｓ，Ｓｈｉｒｉｓｈ Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｈａｒ
ｒｙ Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ，２０００）。"ＮＡ
長さ"は，対応する核酸配列の長さをヌクレオチドで表す。"ＯＲＦ開始"は，オ
ープンリーディングフレームの開始ヌクレオチドを表す。"ＯＲＦ終了"は，オー
プンリーディングフレームの終止コドンを除く最後のヌクレオチドを表す。"Ｏ
ＲＦ長さ"は，オープンリーディングフレームの長さをヌクレオチドで表す。"Ａ
Ａ長さ"は，対応する核酸配列においてコードされるペプチドの長さをアミノ酸
で表す。
レームの位置，および対応するペプチドの長さを表す。データは，左から右に，
以下のものを表す："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"
，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"ＮＡ長さ"，"ＯＲＦ開
始"，"ＯＲＦ終了"，"ＯＲＦ長さ"，および"ＡＡ長さ"。"遺伝子名"は，ホスフ
ァターゼまたはホスファターゼ様酵素をコードする配列に与えられた名前を表す
。各遺伝子は，"ＳＧＰ"名称およびその後の番号により表される。ＳＧＰ名は，
通常は，１つの連続配列（"コンティグ"）に構築された多数の重複配列を表す。
"ＩＤ＃ｎａ"および"ＩＤ＃ａａ"は，本明細書において各核酸およびアミノ酸配
列に与えられた同定番号を表す。"ＦＬ／Ｃａｔ"は，遺伝子の長さを表し，ＦＬ
は全長を，"Ｃａｔ"は触媒ドメインのみが示されていることを表す。このカラム
中の"Ｐａｒｔｉａｌ"とは，配列が部分的蛋白質ホスファターゼ触媒ドメインを
コードすることを示す。"スーパーファミリー"とは，遺伝子が二重特異性ホスフ
ァターゼ，蛋白質チロシンホスファターゼまたはセリントレオニンホスファター
ゼであるかを識別する。"グループ"および"ファミリー"は，配列ホモロジーによ
り定義され，先に確立されている系統発生分析に基づく蛋白質ホスファターゼの
分類を表す（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏ
ｏｋ，Ｎｉｃｋ Ｔｏｎｋｓ，Ｓｈｉｒｉｓｈ Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｈａｒ
ｒｙ Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ，２０００）。"ＮＡ
長さ"は，対応する核酸配列の長さをヌクレオチドで表す。"ＯＲＦ開始"は，オ
ープンリーディングフレームの開始ヌクレオチドを表す。"ＯＲＦ終了"は，オー
プンリーディングフレームの終止コドンを除く最後のヌクレオチドを表す。"Ｏ
ＲＦ長さ"は，オープンリーディングフレームの長さをヌクレオチドで表す。"Ａ
Ａ長さ"は，対応する核酸配列においてコードされるペプチドの長さをアミノ酸
で表す。
【０３３８】
表１−オープンリーディングフレーム
【表１】
【０３３９】
表２は，本明細書に記載される遺伝子の以下の特徴を示す：染色体位置，一塩
基多型（ＳＮＰｓ），ｄｂＥＳＴにおける表示，および反復領域。示されるデー
タは，左から右に，以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃
ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"
染色体"，"ＳＮＰｓ"，"ｄｂＥＳＴ＿ヒット"，および"反復"。最初の７つのカ
ラム（すなわち，"遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，
"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"）の内容は，表１について上
述したとおりである。"染色体"は，遺伝子の細胞遺伝学的位置を表す。"ＳＮＰ
ｓ"カラムの情報は，候補一塩基多型（ＳＮＰｓ）の核酸位置および縮重性を示
す。"ｄｂＥＳＴヒット"は，対応する遺伝子に対して少なくとも１００ｂｐの１
００％同一性を含む，ＥＳＴの公共のデータベース（ｄｂＥＳＴ，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔ
ｍｌ）中の登録物の受託番号を示す。これらのＥＳＴはｄｂＥＳＴのｂｌａｓｔ
ｎにより同定した。"反復"は，複雑性が低く，いくつかの別々の遺伝子中に存在
する約２１ｂｐの長さの短い配列の位置に関する情報を含む。これらの反復は，
ＮＣＢＩ（ｎｒｎａ）の非重複核酸データベースに対するＤＮＡ配列のｂｌａｓ
ｔｎにより同定した。この反復カラムに含まれるためには，配列は典型的にはそ
の長さにわたり１００％同一性を有し，典型的には少なくとも５つの異なる遺伝
子中に存在する。
基多型（ＳＮＰｓ），ｄｂＥＳＴにおける表示，および反復領域。示されるデー
タは，左から右に，以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃
ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"
染色体"，"ＳＮＰｓ"，"ｄｂＥＳＴ＿ヒット"，および"反復"。最初の７つのカ
ラム（すなわち，"遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，
"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"）の内容は，表１について上
述したとおりである。"染色体"は，遺伝子の細胞遺伝学的位置を表す。"ＳＮＰ
ｓ"カラムの情報は，候補一塩基多型（ＳＮＰｓ）の核酸位置および縮重性を示
す。"ｄｂＥＳＴヒット"は，対応する遺伝子に対して少なくとも１００ｂｐの１
００％同一性を含む，ＥＳＴの公共のデータベース（ｄｂＥＳＴ，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔ
ｍｌ）中の登録物の受託番号を示す。これらのＥＳＴはｄｂＥＳＴのｂｌａｓｔ
ｎにより同定した。"反復"は，複雑性が低く，いくつかの別々の遺伝子中に存在
する約２１ｂｐの長さの短い配列の位置に関する情報を含む。これらの反復は，
ＮＣＢＩ（ｎｒｎａ）の非重複核酸データベースに対するＤＮＡ配列のｂｌａｓ
ｔｎにより同定した。この反復カラムに含まれるためには，配列は典型的にはそ
の長さにわたり１００％同一性を有し，典型的には少なくとも５つの異なる遺伝
子中に存在する。
【０３４０】
表２−ＣＨＲ，ＳＮＰｓ，ｄｂＥＳＴ，反復
【表２】
【０３４１】
表３は，ホスファターゼ触媒ドメインの程度および境界を示す。カラムの表題
は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃ
ａｔ"，"ドメイン""Ｐｈｏｓ開始""Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始""プロフ
ァイル終了"，"他のドメイン"および"ＳＨ２境界"。カラム"遺伝子名"，"ＩＤ＃
ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＰＬ／Ｃａｔ"の内容は表１について上述したとおりで
ある。"Ｐｈｏｓ開始"，"Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始"および"プロファ
イル終了"は，隠れマルコフモデルを用いて得た，触媒範囲の境界を規定するデ
ータを表す（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔ
ｍｌ）。蛋白質全体中の触媒ドメインの境界は，"Ｐｈｏｓ開始"および"Ｐｈｏ
ｓ終了"のカラムで示される。３つのプロファイルを用いた。１つは１７３アミ
ノ酸の長さの二重特異性ホスファターゼ（ＤＳＰ）について；１つは３０１アミ
ノ酸の長さのＳＴＰについて；１つは２６４アミノ酸の長さＰＴＰについてであ
る。（用いたプロファイルはｈｔｔｐ：／／ｐｆａｄ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／に
示される）。プロファイルが全長触媒ドメインを認識する蛋白質は，"プロファ
イル開始"が１であり，プロファイル終了は３つのファミリーについて以下のと
おりである：ＤＳＰは１７３，ＳＴＰは３０１，ＰＴＰは２６４。部分的触媒ド
メインを有する遺伝子は，プロファイル開始が１より大きく（ホスファターゼド
メインの開始が欠失していることを示す），および／または"プロファイル終了
が"２６１より小さい（ホスファターゼドメインのＣ末端が欠失していることを
示す）。"他のドメイン"のカラムは，ＰＦＡＭ検索（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．
ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）により新規ホスファターゼ蛋白質において同定された非
ホスファターゼドメインを表す。ＳＧＰ０５７，配列番号１は，２つの部分ＳＨ
２ドメインを有する。ＳＨ２ドメインをコードする領域は"ＳＨ２ドメイン"のカ
ラムにおいて示されている。配列番号２，配列番号３，および配列番号４は全長
遺伝子であるが，配列番号１および配列番号５は部分遺伝子である。
は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃ
ａｔ"，"ドメイン""Ｐｈｏｓ開始""Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始""プロフ
ァイル終了"，"他のドメイン"および"ＳＨ２境界"。カラム"遺伝子名"，"ＩＤ＃
ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＰＬ／Ｃａｔ"の内容は表１について上述したとおりで
ある。"Ｐｈｏｓ開始"，"Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始"および"プロファ
イル終了"は，隠れマルコフモデルを用いて得た，触媒範囲の境界を規定するデ
ータを表す（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔ
ｍｌ）。蛋白質全体中の触媒ドメインの境界は，"Ｐｈｏｓ開始"および"Ｐｈｏ
ｓ終了"のカラムで示される。３つのプロファイルを用いた。１つは１７３アミ
ノ酸の長さの二重特異性ホスファターゼ（ＤＳＰ）について；１つは３０１アミ
ノ酸の長さのＳＴＰについて；１つは２６４アミノ酸の長さＰＴＰについてであ
る。（用いたプロファイルはｈｔｔｐ：／／ｐｆａｄ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／に
示される）。プロファイルが全長触媒ドメインを認識する蛋白質は，"プロファ
イル開始"が１であり，プロファイル終了は３つのファミリーについて以下のと
おりである：ＤＳＰは１７３，ＳＴＰは３０１，ＰＴＰは２６４。部分的触媒ド
メインを有する遺伝子は，プロファイル開始が１より大きく（ホスファターゼド
メインの開始が欠失していることを示す），および／または"プロファイル終了
が"２６１より小さい（ホスファターゼドメインのＣ末端が欠失していることを
示す）。"他のドメイン"のカラムは，ＰＦＡＭ検索（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．
ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）により新規ホスファターゼ蛋白質において同定された非
ホスファターゼドメインを表す。ＳＧＰ０５７，配列番号１は，２つの部分ＳＨ
２ドメインを有する。ＳＨ２ドメインをコードする領域は"ＳＨ２ドメイン"のカ
ラムにおいて示されている。配列番号２，配列番号３，および配列番号４は全長
遺伝子であるが，配列番号１および配列番号５は部分遺伝子である。
【０３４２】
表３−ホスファターゼドメイン
【表３】
【０３４３】
表４は，非重複蛋白質配列のＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ
）に対するアミノ酸配列のスミス・ウォーターマン類似性検索（マトリックス：
Ｐａｍｌ００；ギャップオープン／イクステンションペナルティー１２／２）の
結果を示す。カラム標題は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"
ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリ
ー"，"Ｐスコア"，"ａａ長さ"，"ａａＩＤマッチ"，"％同一性"，"％類似性"，"
ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"，"説明"。次のカラム："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"
ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"ファミリー"の内容は表１について上述したと
おりである。"Ｐスコア"はスミス・ウォーターマン確率スコアを表す。この数値
はアラインメントが偶然により生ずるおよその確率を表す。すなわち，非常に低
い数値，例えば２．１０Ｅ−６４は，クエリーとデータベース標的との間に非常
に顕著なマッチがあることを示す。"ａａ長さ"は，蛋白質の長さをアミノ酸で表
す。"ａａＩＤマッチ"は，アラインメント中で同一であるアミノ酸の数を示す。
"％同一性"は，アラインメントした領域にわたって同一であるヌクレオチドのパ
ーセントを示す。"％類似性"は，アラインメント全体にわたって類似するアミノ
酸のパーセントを示す。"ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"は，非重複蛋白質のＮＣＢＩ
データベース中で最も類似する蛋白質の受託番号を示す。"説明"は，非重複蛋白
質ＮＣＢＩデータベース中で最も類似する蛋白質の名前を含む。
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ
）に対するアミノ酸配列のスミス・ウォーターマン類似性検索（マトリックス：
Ｐａｍｌ００；ギャップオープン／イクステンションペナルティー１２／２）の
結果を示す。カラム標題は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"
ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリ
ー"，"Ｐスコア"，"ａａ長さ"，"ａａＩＤマッチ"，"％同一性"，"％類似性"，"
ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"，"説明"。次のカラム："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"
ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"ファミリー"の内容は表１について上述したと
おりである。"Ｐスコア"はスミス・ウォーターマン確率スコアを表す。この数値
はアラインメントが偶然により生ずるおよその確率を表す。すなわち，非常に低
い数値，例えば２．１０Ｅ−６４は，クエリーとデータベース標的との間に非常
に顕著なマッチがあることを示す。"ａａ長さ"は，蛋白質の長さをアミノ酸で表
す。"ａａＩＤマッチ"は，アラインメント中で同一であるアミノ酸の数を示す。
"％同一性"は，アラインメントした領域にわたって同一であるヌクレオチドのパ
ーセントを示す。"％類似性"は，アラインメント全体にわたって類似するアミノ
酸のパーセントを示す。"ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"は，非重複蛋白質のＮＣＢＩ
データベース中で最も類似する蛋白質の受託番号を示す。"説明"は，非重複蛋白
質ＮＣＢＩデータベース中で最も類似する蛋白質の名前を含む。
【０３４４】
表４−スミス・ウォーターマン
【表４】
【０３４５】実施例
以下の実施例は限定ではなく，本発明の種々の観点および特徴の代表的なもの
にすぎない。以下の実施例は，本発明のセリン／トレオニンホスファターゼの単
離および特徴付けを示す。
にすぎない。以下の実施例は，本発明のセリン／トレオニンホスファターゼの単
離および特徴付けを示す。
【０３４６】実施例１：ゲノムＤＮＡからの蛋白質ホスファターゼ遺伝子の同定および特徴付 け 材料および方法
新規ホスファターゼは，Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム配列データベースから，およ
び公共のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｊｅｃｔ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から，隠れマル
コフモデル（ＨＭＭＲ）を用いて同定した。ゲノムデータベース登録物は，６つ
のオープンリーディングフレームに翻訳し，ＨＭＭＲ２．１のフィールドプログ
ラム可能アレイ（ＦＰＧＡ）加速版を有するＴｉｍｅｌｏｇｉｃ Ｄｅｃｙｐｈ
ｅｒボックスを用いて，モデルに対してこれらを検索した。ＨＭＭＲプロファイ
ルに対してアラインメントした，予測された蛋白質配列をコードするＤＮＡ配列
を，元のゲノムデータベースから抽出した。次に，核酸配列をＰａｎｇｅａ Ｃ
ｌｕｓｔｅｒｉｎｇツールを用いてクラスター化し，反復登録物を排除した。次
に推定蛋白質ホスファターゼ配列を一連のクエリーおよびフィルターを通して順
番に走らせて，新規蛋白質ホスファターゼ配列を同定した。特に，ＨＭＭＲで同
定された配列は，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸを用いて，既知のヒト蛋白質
ホスファターゼおよびすべてのその後の新規蛋白質ホスファターゼ配列をそれが
同定されるにつれて含有するヌクレオチドおよびアミノ酸レポジトリに対して検
索した。出力はスプレッドシートで表示して，手動検査で既知の遺伝子を排除す
ることを容易にした。２つのモデル，すなわち，"完全"モデルおよび"部分"また
はスミス・ウォーターマンモデルを開発した。部分モデルを用いて準触媒的ホス
ファターゼドメインを同定し，完全モデルを用いて完全触媒ドメインを同定した
。次に選択したヒットをＢＬＡＳＴＮを用いて公共ｎｒｎａおよびＥＳＴデータ
ベースに対してクエリーを行い，これらが実際にユニークであることを確認した
。場合によっては，新規遺伝子は，先に同定されている齧歯類または脊椎動物蛋
白質ホスファターゼのオルトログであると判定された。
び公共のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｊｅｃｔ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から，隠れマル
コフモデル（ＨＭＭＲ）を用いて同定した。ゲノムデータベース登録物は，６つ
のオープンリーディングフレームに翻訳し，ＨＭＭＲ２．１のフィールドプログ
ラム可能アレイ（ＦＰＧＡ）加速版を有するＴｉｍｅｌｏｇｉｃ Ｄｅｃｙｐｈ
ｅｒボックスを用いて，モデルに対してこれらを検索した。ＨＭＭＲプロファイ
ルに対してアラインメントした，予測された蛋白質配列をコードするＤＮＡ配列
を，元のゲノムデータベースから抽出した。次に，核酸配列をＰａｎｇｅａ Ｃ
ｌｕｓｔｅｒｉｎｇツールを用いてクラスター化し，反復登録物を排除した。次
に推定蛋白質ホスファターゼ配列を一連のクエリーおよびフィルターを通して順
番に走らせて，新規蛋白質ホスファターゼ配列を同定した。特に，ＨＭＭＲで同
定された配列は，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸを用いて，既知のヒト蛋白質
ホスファターゼおよびすべてのその後の新規蛋白質ホスファターゼ配列をそれが
同定されるにつれて含有するヌクレオチドおよびアミノ酸レポジトリに対して検
索した。出力はスプレッドシートで表示して，手動検査で既知の遺伝子を排除す
ることを容易にした。２つのモデル，すなわち，"完全"モデルおよび"部分"また
はスミス・ウォーターマンモデルを開発した。部分モデルを用いて準触媒的ホス
ファターゼドメインを同定し，完全モデルを用いて完全触媒ドメインを同定した
。次に選択したヒットをＢＬＡＳＴＮを用いて公共ｎｒｎａおよびＥＳＴデータ
ベースに対してクエリーを行い，これらが実際にユニークであることを確認した
。場合によっては，新規遺伝子は，先に同定されている齧歯類または脊椎動物蛋
白質ホスファターゼのオルトログであると判定された。
【０３４７】
部分ＤＮＡ配列の延長による全長オープンリーディングフレームの包含は，い
くつかの方法により行った。表５に示されるｃＤＮＡデータベースを繰り返しｂ
ｌａｓｔｎ検索して，ゲノム配列を延長したｃＤＮＡを見いだした。"Ｌｉｆｅ
ＳｅｑＧｏｌｄ"データベースはＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／）から入手した。ＮＣＢＩデータ
ベースはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／）から入手した。すべてのｂｌａｓｔｎ検索は，ヌクレオチドミス
マッチについてのペナルティー３，およびヌクレオチドマッチのリウォード１を
用いて行った。ギャップ付きｂｌａｓｔアルゴリズムは以下に記載されている（
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，
Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚ
ｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ
． Ｌｉｐｍａｎ （１９９７），"Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳ
Ｉ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
くつかの方法により行った。表５に示されるｃＤＮＡデータベースを繰り返しｂ
ｌａｓｔｎ検索して，ゲノム配列を延長したｃＤＮＡを見いだした。"Ｌｉｆｅ
ＳｅｑＧｏｌｄ"データベースはＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／）から入手した。ＮＣＢＩデータ
ベースはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／）から入手した。すべてのｂｌａｓｔｎ検索は，ヌクレオチドミス
マッチについてのペナルティー３，およびヌクレオチドマッチのリウォード１を
用いて行った。ギャップ付きｂｌａｓｔアルゴリズムは以下に記載されている（
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，
Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚ
ｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ
． Ｌｉｐｍａｎ （１９９７），"Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳ
Ｉ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【０３４８】
部分ＤＮＡ配列の伸長による全長オープンリーディングフレームの包含はまた
，ゲノムデータベースの検索の繰り返しにより行った。第１の方法は，スミス−
ウォーターマンアルゴリズムを用いて，最も近い蛋白質ホモログまたはオルトロ
グを部分配列に対して蛋白質−蛋白質検索を行った。標的データベースは，Ｇｅ
ｎｅｓｃａｎおよびヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）ならびにＣｅｌｅｒａか
ら得られた全ヒトゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測か
らなる。検索したゲノムデータベースの完全なセットは以下の表６に示される。
潜在的な延長をコードするゲノム配列は，ＮＣＢＩ非重複データベースに対する
ｂｌａｓｔｘ分析を行ってヒットの新規性を確認することによりさらに評価した
。延長するゲノム配列は，ＤＮＡＳｔａｒのＳｅｑｍａｎプログラムを用いて潜
在的イントロンを削除した後にｃＤＮＡ配列中に組み込んだ。スミス−ウォータ
ーマン検索について用いたデフォルトのパラメータは以下のとおりである。マト
リクス：ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップオープニングペナルティー：１２；ギャッ
プ延長ペナルティー：２．Ｇｅｎｅｓｃａｎ予測は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラ
ムを，Ｃｈｒｉｓ Ｂｕｒｇｅ ａｎｄ Ｓａｍ Ｋａｒｌｉｎ（"Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ"，ＪＭＢ（１９９７）２６８（１）：
７８−９４）に詳細が記載されるように用いて行った。ゲノムＤＮＡからのＯＲ
Ｆの予測は，標準的な６フレーム翻訳を用いて行った。
，ゲノムデータベースの検索の繰り返しにより行った。第１の方法は，スミス−
ウォーターマンアルゴリズムを用いて，最も近い蛋白質ホモログまたはオルトロ
グを部分配列に対して蛋白質−蛋白質検索を行った。標的データベースは，Ｇｅ
ｎｅｓｃａｎおよびヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）ならびにＣｅｌｅｒａか
ら得られた全ヒトゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測か
らなる。検索したゲノムデータベースの完全なセットは以下の表６に示される。
潜在的な延長をコードするゲノム配列は，ＮＣＢＩ非重複データベースに対する
ｂｌａｓｔｘ分析を行ってヒットの新規性を確認することによりさらに評価した
。延長するゲノム配列は，ＤＮＡＳｔａｒのＳｅｑｍａｎプログラムを用いて潜
在的イントロンを削除した後にｃＤＮＡ配列中に組み込んだ。スミス−ウォータ
ーマン検索について用いたデフォルトのパラメータは以下のとおりである。マト
リクス：ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップオープニングペナルティー：１２；ギャッ
プ延長ペナルティー：２．Ｇｅｎｅｓｃａｎ予測は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラ
ムを，Ｃｈｒｉｓ Ｂｕｒｇｅ ａｎｄ Ｓａｍ Ｋａｒｌｉｎ（"Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ"，ＪＭＢ（１９９７）２６８（１）：
７８−９４）に詳細が記載されるように用いて行った。ゲノムＤＮＡからのＯＲ
Ｆの予測は，標準的な６フレーム翻訳を用いて行った。
【０３４９】
ゲノム配列からＤＮＡ伸長を規定する別の方法は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラ
ムを用いてゲノムデータベースを繰り返し検索してエクソンスプライシングを予
測した。次にこれらの予測された遺伝子を，関連するホスファターゼに対するホ
モロジーに基づいてこれらが部分遺伝子の"本物の"延長であるかを見ることによ
り評価した。
ムを用いてゲノムデータベースを繰り返し検索してエクソンスプライシングを予
測した。次にこれらの予測された遺伝子を，関連するホスファターゼに対するホ
モロジーに基づいてこれらが部分遺伝子の"本物の"延長であるかを見ることによ
り評価した。
【０３５０】
別の方法は，Ｇｅｎｅｗｉｓｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇ
ｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２／）を使用して，最も近いオ
ルトログ／ホモログに対するホモロジーに基づいて潜在的ＯＲＦを予測すること
を含む。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，２つの入力，すなわち相同の蛋白質と目的とする
遺伝子を含むゲノムＤＮＡを必要とする。ゲノムＤＮＡはＣｅｌｅｒａおよびヒ
トゲノムプロジェクトのデータベースのｂｌａｓｔｎ検索により同定した。オル
トログは，ＮＣＢＩ非重複蛋白質データベース（ＮＲＡＡ）をｂｌａｓｔｐ検索
することにより同定した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，蛋白質配列をゲノムＤＮＡ配列
と比較し，イントロンおよびフレームシフトエラーを得ることができる。
ｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２／）を使用して，最も近いオ
ルトログ／ホモログに対するホモロジーに基づいて潜在的ＯＲＦを予測すること
を含む。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，２つの入力，すなわち相同の蛋白質と目的とする
遺伝子を含むゲノムＤＮＡを必要とする。ゲノムＤＮＡはＣｅｌｅｒａおよびヒ
トゲノムプロジェクトのデータベースのｂｌａｓｔｎ検索により同定した。オル
トログは，ＮＣＢＩ非重複蛋白質データベース（ＮＲＡＡ）をｂｌａｓｔｐ検索
することにより同定した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，蛋白質配列をゲノムＤＮＡ配列
と比較し，イントロンおよびフレームシフトエラーを得ることができる。
【０３５１】
表５−ｃＤＮＡに基づく配列延長に用いたデータベース
【表５】
【０３５２】
表６−ゲノムに基づく配列延長に用いたデータベース
【表６】
【０３５３】結果
Ｇｅｎｅｗｉｓｅを用いて延長した遺伝子については，蛋白質オルトログおよ
びゲノムＤＮＡの受託番号が記載されている（Ｇｅｎｅｗｉｓｅはゲノム配列か
ら標的遺伝子のコーディング配列を組み立てるためにオルトログを用いる）。オ
ルトログのアミノ酸配列は，蛋白質のＮＣＢＩ非重複データベースから得た（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒ
ｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）。ゲノムＤＮＡは２つの起源，すなわち，Ｃｅｌｅｒａ
およびＮＣＢＩ−ＮＲＮＡからのものであり，これは以下に示される。ｃＤＮＡ
起源もまた以下に示される。略号：ＨＧＰ：ヒトゲノムプロジェクト；ＮＣＢＩ
，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
びゲノムＤＮＡの受託番号が記載されている（Ｇｅｎｅｗｉｓｅはゲノム配列か
ら標的遺伝子のコーディング配列を組み立てるためにオルトログを用いる）。オ
ルトログのアミノ酸配列は，蛋白質のＮＣＢＩ非重複データベースから得た（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒ
ｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）。ゲノムＤＮＡは２つの起源，すなわち，Ｃｅｌｅｒａ
およびＮＣＢＩ−ＮＲＮＡからのものであり，これは以下に示される。ｃＤＮＡ
起源もまた以下に示される。略号：ＨＧＰ：ヒトゲノムプロジェクト；ＮＣＢＩ
，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
【０３５４】ＳＧＰ０５７，配列番号１，配列番号６
Ｇｅｎｅｗｉｓｅホモログ：ヒト蛋白質チロシンホスファターゼ（ｇｉ｜１３６
５２７４１）（３４アミノ酸にわたり７０％同一性）。このヒト蛋白質チロシン
ホスファターゼは，２つのＳＨ２ドメインを含む（７９アミノ酸ドメインにわた
り，３８％同一性／７０％類似性）。 ゲノムコンティグ：ＮＣＢＩｇｉ｜１３９９２３１７．ｃＤＮＡ起源（ｄｂＥＳ
Ｔ，Ｉｎｃｙｔｅ）はゲノム予測を延長しなかった。
５２７４１）（３４アミノ酸にわたり７０％同一性）。このヒト蛋白質チロシン
ホスファターゼは，２つのＳＨ２ドメインを含む（７９アミノ酸ドメインにわた
り，３８％同一性／７０％類似性）。 ゲノムコンティグ：ＮＣＢＩｇｉ｜１３９９２３１７．ｃＤＮＡ起源（ｄｂＥＳ
Ｔ，Ｉｎｃｙｔｅ）はゲノム予測を延長しなかった。
【０３５５】
ＳＧＰ０５７，配列番号１，配列番号６は，１０２６ヌクレオチドの長さであ
る。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１０２６で終了し，
１０２６ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３４２アミノ酸の
長さである。この配列は，部分蛋白質ホスファターゼ触媒ドメインおよび２つの
部分ＳＨ２ドメインを含む。これは次のように分類される（スーパーファミリー
／グループ／ファミリー）：チロシンホスファターゼ，ｃＰＴＰ，ＳＨＰ。この
遺伝子は染色体１にマップされる。この詳細な細胞遺伝学的位置は決定されてい
ない。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメイン（ｄ
ｂＥＳＴ）中にこの遺伝子についてのＥＳＴが１つ存在する：ＢＦ０３５６２２
。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１ｂｐに
わたり１００％マッチ）。
る。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１０２６で終了し，
１０２６ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３４２アミノ酸の
長さである。この配列は，部分蛋白質ホスファターゼ触媒ドメインおよび２つの
部分ＳＨ２ドメインを含む。これは次のように分類される（スーパーファミリー
／グループ／ファミリー）：チロシンホスファターゼ，ｃＰＴＰ，ＳＨＰ。この
遺伝子は染色体１にマップされる。この詳細な細胞遺伝学的位置は決定されてい
ない。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメイン（ｄ
ｂＥＳＴ）中にこの遺伝子についてのＥＳＴが１つ存在する：ＢＦ０３５６２２
。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１ｂｐに
わたり１００％マッチ）。
【０３５６】ＳＧＰ０６１，配列番号２，配列番号７
Ｇｅｎｅｗｉｓｅホモログ：推定Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｇｉ｜１２８５２
６９６｜ｄｂｊ）蛋白質（２３２アミノ酸にわたり７５％同一性）。推定蛋白質
は二重特異性ホスファターゼ触媒ドメインを含む（１７３アミノ酸にわたり１７
％同一性／５２％類似性）。 ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ９００００６２５０７
４５８３．
６９６｜ｄｂｊ）蛋白質（２３２アミノ酸にわたり７５％同一性）。推定蛋白質
は二重特異性ホスファターゼ触媒ドメインを含む（１７３アミノ酸にわたり１７
％同一性／５２％類似性）。 ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ９００００６２５０７
４５８３．
【０３５７】
ＳＧＰ０６１，配列番号２，配列番号７は８００ヌクレオチドの長さである。
オープンリーディングフレームは位置１９５で開始し，位置８００で終了し，６
０６ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２０１アミノ酸の長さ
である。この配列は全長二重特異性ホスファターゼ遺伝子をコードする。これは
次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重特
異性ホスファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置１１ｐ１１．１
にマップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ド
メイン（ｄｂＥＳＴ）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれ
る（他のものも存在する）：ＢＧ７２４１９８，ＢＧ７２２１８７，ＢＧ７２２
１１４。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１
ｂｐにわたり１００％マッチ）。
オープンリーディングフレームは位置１９５で開始し，位置８００で終了し，６
０６ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は２０１アミノ酸の長さ
である。この配列は全長二重特異性ホスファターゼ遺伝子をコードする。これは
次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：二重特
異性ホスファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この遺伝子は染色体位置１１ｐ１１．１
にマップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ド
メイン（ｄｂＥＳＴ）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれ
る（他のものも存在する）：ＢＧ７２４１９８，ＢＧ７２２１８７，ＢＧ７２２
１１４。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１
ｂｐにわたり１００％マッチ）。
【０３５８】ＳＧＰ０５０，配列番号３，配列番号８
Ｇｅｎｗｉｓｅホモログ：推定Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｇｉ｜１２８５０３
３２｜ｄｂｊ）蛋白質（４４９アミノ酸にわたり８９％同一性）。 ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ９００００６２６３５
４９１６
３２｜ｄｂｊ）蛋白質（４４９アミノ酸にわたり８９％同一性）。 ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ９００００６２６３５
４９１６
【０３５９】
ＳＧＰ０５０，配列番号３，配列番号８は１３８０ヌクレオチドの長さである
。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１３８０で終了し，１
３８０ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は４５９アミノ酸の長
さである。この配列は全長セリントレオニンホスファターゼをコードする。これ
は次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セリ
ンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置３ｐ２１．１に
マップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメ
イン（ｄｂＥＳＴ）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれる
（他のものも存在する）：ＡＷ９６０７５９，ＡＡ２９２２６６，ＢＦ０５９５
２１。この遺伝子はヌクレオチド位置３９８−４１７において反復配列を有する
（反復配列：ｃｃａｔｃｔｔｇｇｃｔｇｃｃａａｃａｃｃ）。
。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１３８０で終了し，１
３８０ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は４５９アミノ酸の長
さである。この配列は全長セリントレオニンホスファターゼをコードする。これ
は次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セリ
ンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置３ｐ２１．１に
マップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメ
イン（ｄｂＥＳＴ）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれる
（他のものも存在する）：ＡＷ９６０７５９，ＡＡ２９２２６６，ＢＦ０５９５
２１。この遺伝子はヌクレオチド位置３９８−４１７において反復配列を有する
（反復配列：ｃｃａｔｃｔｔｇｇｃｔｇｃｃａａｃａｃｃ）。
【０３６０】ＳＧＰ０４５，配列番号４，配列番号９
Ｇｅｎｗｉｓｅホモログ：蛋白質ホスファターゼ１Ｂ２，Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒ
ｖｅｇｉｃｕｓ（ｇｉ｜１２６６６５２１｜ｅｍｂ）（３５８アミノ酸にわたり
４７％同一性）。 ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ９２０００００４２５
２５４４．
ｖｅｇｉｃｕｓ（ｇｉ｜１２６６６５２１｜ｅｍｂ）（３５８アミノ酸にわたり
４７％同一性）。 ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ９２０００００４２５
２５４４．
【０３６１】
ＳＧＰ０４５，配列番号４，配列番号９は，１１６４ヌクレオチドの長さであ
る。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１１６４で終了し，
１１６４ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３８７アミノ酸の
長さである。この配列は，全長セリントレオニンホスファターゼをコードする。
これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：
セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置１９ｑ１３
．３にマップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。こ
の遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ
）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれる（他のものも存在
する）：ＢＦ５０７４２３，ＢＧ４９４４１８，ＢＧ１９６６８８。この遺伝子
は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１ｂｐにわたり１００
％マッチ）。
る。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１１６４で終了し，
１１６４ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３８７アミノ酸の
長さである。この配列は，全長セリントレオニンホスファターゼをコードする。
これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：
セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置１９ｑ１３
．３にマップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。こ
の遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ
）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれる（他のものも存在
する）：ＢＦ５０７４２３，ＢＧ４９４４１８，ＢＧ１９６６８８。この遺伝子
は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１ｂｐにわたり１００
％マッチ）。
【０３６２】ＳＧＰ０３６，配列番号５，配列番号１０
Ｇｅｎｗｉｓｅホモログ：蛋白質ホスファターゼ２Ｃベータ［Ｂｏｓ ｔａｕｒ
ｕｓ］． ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ３００１９１０９５．
ｕｓ］． ゲノムコンティグ：Ｃｅｌｅｒａ＿ａｓｍ５ｈコンティグ３００１９１０９５．
【０３６３】
ＳＧＰ０３６，配列番号５，配列番号１０は４２９ヌクレオチドの長さである
。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置４２９で終了し，４２
９ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１４３アミノ酸の長さで
ある。この配列は部分セリントレオニンホスファターゼ遺伝子をコードする。こ
れは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セ
リンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置４ｑ２４にマ
ップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメイ
ン（ｄｂＥＳＴ）中にこの遺伝子についてのＥＳＴが１つ存在する：ＡＷ２７４
８５０。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１
ｂｐにわたり１００％マッチ）。
。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置４２９で終了し，４２
９ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は１４３アミノ酸の長さで
ある。この配列は部分セリントレオニンホスファターゼ遺伝子をコードする。こ
れは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セ
リンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置４ｑ２４にマ
ップされる。この遺伝子はマップされた一塩基多型候補を含まない。公共ドメイ
ン（ｄｂＥＳＴ）中にこの遺伝子についてのＥＳＴが１つ存在する：ＡＷ２７４
８５０。この遺伝子は上で定義した反復配列を含まない（多数の遺伝子中で２１
ｂｐにわたり１００％マッチ）。
【０３６４】実施例２：予測蛋白質
ＳＧＰ０５７，配列番号１は，３４２アミノ酸の長さの蛋白質，配列番号６を
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：チロシンホスファターゼ，ｃＰＴＰ，ＳＨＰ。この蛋白質中のホス
ファターゼドメインは，プロファイル位置１からプロファイル位置９０まで蛋白
質チロシンホスファターゼについての隠れマルコフプロファイルとマッチする。
コードされる蛋白質のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸２６５からアミ
ノ酸３４０である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共データベース（
ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりである：Ｐスコ
ア＝１．５０Ｅ−５６；同一のアミノ酸の数＝１５９；％同一性＝４３％；％類
似性＝５６％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番号はＮＰ＿０３７２
２０．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は
次のとおりである：ＳＨ−ＰＴＰ２，非レセプタータイプ１１［Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］。この蛋白質は２つの部分ＳＨ２ドメインを含む：アミ
ノ酸位置２−４２，およびアミノ酸位置１０８−１６７。ＳＨ２ドメインは，他
の蛋白質のホスホチロシン残基との結合を媒介し，蛋白質−蛋白質相互作用，蛋
白質局在化および酵素制御において鍵となる役割を果たす。
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：チロシンホスファターゼ，ｃＰＴＰ，ＳＨＰ。この蛋白質中のホス
ファターゼドメインは，プロファイル位置１からプロファイル位置９０まで蛋白
質チロシンホスファターゼについての隠れマルコフプロファイルとマッチする。
コードされる蛋白質のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸２６５からアミ
ノ酸３４０である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共データベース（
ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりである：Ｐスコ
ア＝１．５０Ｅ−５６；同一のアミノ酸の数＝１５９；％同一性＝４３％；％類
似性＝５６％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番号はＮＰ＿０３７２
２０．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は
次のとおりである：ＳＨ−ＰＴＰ２，非レセプタータイプ１１［Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］。この蛋白質は２つの部分ＳＨ２ドメインを含む：アミ
ノ酸位置２−４２，およびアミノ酸位置１０８−１６７。ＳＨ２ドメインは，他
の蛋白質のホスホチロシン残基との結合を媒介し，蛋白質−蛋白質相互作用，蛋
白質局在化および酵素制御において鍵となる役割を果たす。
【０３６５】
ＳＧＰ０６１，配列番号２は，２０１アミノ酸の長さの蛋白質，配列番号７を
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：二重特異性ホスファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この蛋白質のホスフ
ァターゼドメインは，プロファイル位置１からプロファイル位置１７２まで二重
特異性ホスファターゼについての隠れマルコフプロファイルとマッチする。コー
ドされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸３７からアミノ酸
１８５である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲ
ＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりである：Ｐスコア＝
５．５０Ｅ−１０９；同一のアミノ酸の数＝１６３；％同一性＝８４％；％類似
性＝９３％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番号はＢＡＢ２９５０４
．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次の
とおりである：ＡＫ０１４６９１，推定二重特異性ホスファターゼ［Ｍｕｓ ｍ
ｕｓｃｕｌｕｓ］。
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：二重特異性ホスファターゼ，ＤＳＰ，ＭＫＰ。この蛋白質のホスフ
ァターゼドメインは，プロファイル位置１からプロファイル位置１７２まで二重
特異性ホスファターゼについての隠れマルコフプロファイルとマッチする。コー
ドされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸３７からアミノ酸
１８５である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲ
ＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりである：Ｐスコア＝
５．５０Ｅ−１０９；同一のアミノ酸の数＝１６３；％同一性＝８４％；％類似
性＝９３％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番号はＢＡＢ２９５０４
．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種は次の
とおりである：ＡＫ０１４６９１，推定二重特異性ホスファターゼ［Ｍｕｓ ｍ
ｕｓｃｕｌｕｓ］。
【０３６６】
ＳＧＰ０５０，配列番号３は，４５９アミノ酸の長さの蛋白質，配列番号８を
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この蛋白質のホスファ
ターゼドメインは，プロファイル位置８０からプロファイル位置２８６までセリ
ントレオニンホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）についての隠れマルコフプロファイル
とマッチする。コードされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ
酸１８７からアミノ酸４１５である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公
共データベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとお
りである：Ｐスコア＝１．４０Ｅ−２３４；同一のアミノ酸の数＝４０１；％同
一性＝８８％；％類似性＝９４％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番
号はＢＡＢ２８６７９．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前また
は説明および種は次のとおりである：ＡＫ０１３１４９，推定ＳＴＰ［Ｍｕｓ
ｍｕｓｃｕｌｕｓ］。
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この蛋白質のホスファ
ターゼドメインは，プロファイル位置８０からプロファイル位置２８６までセリ
ントレオニンホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）についての隠れマルコフプロファイル
とマッチする。コードされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ
酸１８７からアミノ酸４１５である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公
共データベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとお
りである：Ｐスコア＝１．４０Ｅ−２３４；同一のアミノ酸の数＝４０１；％同
一性＝８８％；％類似性＝９４％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番
号はＢＡＢ２８６７９．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前また
は説明および種は次のとおりである：ＡＫ０１３１４９，推定ＳＴＰ［Ｍｕｓ
ｍｕｓｃｕｌｕｓ］。
【０３６７】
ＳＧＰ０４５，配列番号４は、３８７アミノ酸の長さの蛋白質，配列番号９を
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この蛋白質のホスファ
ターゼドメインは，プロファイル位置１からプロファイル位置３０１までセリン
トレオニンホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）についての隠れマルコフプロファイルと
マッチする。コードされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸
２２からアミノ酸２７６である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共デ
ータベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりで
ある：Ｐスコア＝１．７０Ｅ−７４；同一のアミノ酸の数＝１６５；％同一性＝
４５％；％類似性＝６２％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番号はＰ
３５８１５である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種
は次のとおりである：ＰＰ２Ｃ−ベータ（ＩＡ）（ＰＰ１Ｂ）［Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］。
コードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／フ
ァミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この蛋白質のホスファ
ターゼドメインは，プロファイル位置１からプロファイル位置３０１までセリン
トレオニンホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）についての隠れマルコフプロファイルと
マッチする。コードされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸
２２からアミノ酸２７６である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共デ
ータベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりで
ある：Ｐスコア＝１．７０Ｅ−７４；同一のアミノ酸の数＝１６５；％同一性＝
４５％；％類似性＝６２％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託番号はＰ
３５８１５である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前または説明および種
は次のとおりである：ＰＰ２Ｃ−ベータ（ＩＡ）（ＰＰ１Ｂ）［Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］。
【０３６８】
ＳＧＰ０３６，配列番号５は，１４３アミノ酸の長さの蛋白質，配列番号１０
をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／
ファミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この蛋白質の部分ホ
スファターゼドメインは，プロファイル位置１３６からプロファイル位置３０１
までセリントレオニンホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）についての隠れマルコフプロ
ファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置
は，アミノ酸１からアミノ酸１４３である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配
列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下
のとおりである：Ｐスコア＝２．７０Ｅ−１０；同一のアミノ酸の数＝３９；％
同一性＝３８％；％類似性＝５９％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託
番号はＮＰ＿０６７６８９．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前
または説明および種は次のとおりである：概日振動蛋白質（ＳＣＯＰ）［Ｒａｔ
ｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］。
をコードする。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／
ファミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この蛋白質の部分ホ
スファターゼドメインは，プロファイル位置１３６からプロファイル位置３０１
までセリントレオニンホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）についての隠れマルコフプロ
ファイルとマッチする。コードされる蛋白質中のホスファターゼ触媒領域の位置
は，アミノ酸１からアミノ酸１４３である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配
列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下
のとおりである：Ｐスコア＝２．７０Ｅ−１０；同一のアミノ酸の数＝３９；％
同一性＝３８％；％類似性＝５９％；ＮＲＡＡの最も類似するエントリーの受託
番号はＮＰ＿０６７６８９．１である；ＮＲＡＡ中の最も類似する蛋白質の名前
または説明および種は次のとおりである：概日振動蛋白質（ＳＣＯＰ）［Ｒａｔ
ｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］。
【０３６９】実施例３．新規哺乳動物蛋白質ホスファターゼの発現分析 １）組織アレイ
種々の起源に由来する"ｃＤＮＡライブラリ"をナイロン膜上に固定化し，目的
とする遺伝子に由来する３２Ｐ標識ｃＤＮＡフラグメントで探索した。ＲＮＡの
起源は表３に示される：１）Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗ
ａｒｄ，ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈａｉｎ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ３
．ｈｔｍｌ）：２）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）：３）ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／：ＡＴＣＣ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃａｔａ
ｌｏｇｓ．ｈｔｍｌから注文可能）により用いられた哺乳動物細胞株；４）Ｐａ
ｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｉｃ．ｃｏｍ／ｃｏ
ｍｐａｎｙ／ｓｕｂｓｉｄｉａｒｉｅｓ／ｐａｉ．ｈｔｍｌ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ｃＤＮＡアレイを調製するプロトコルは以下に詳
細に記載される。いくつかの細胞株を化合物で処理して，それが遺伝子発現にお
よぼす影響を評価した。８種類の処理を用いた：１）対照，２）低血清，３）２
００μＭミモシン，４）３ｍＭＨＵ，５）２μＭＡＵＲ２阻害剤，６）１０μＭ
シスプラチン，７）４００ｎｇ／ｍｌノコダゾール−２４時間，および８）４０
０ｎｇ／ｍｌノコダゾール−４８時間。
とする遺伝子に由来する３２Ｐ標識ｃＤＮＡフラグメントで探索した。ＲＮＡの
起源は表３に示される：１）Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗ
ａｒｄ，ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈａｉｎ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ３
．ｈｔｍｌ）：２）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）：３）ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／：ＡＴＣＣ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃａｔａ
ｌｏｇｓ．ｈｔｍｌから注文可能）により用いられた哺乳動物細胞株；４）Ｐａ
ｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｉｃ．ｃｏｍ／ｃｏ
ｍｐａｎｙ／ｓｕｂｓｉｄｉａｒｉｅｓ／ｐａｉ．ｈｔｍｌ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ｃＤＮＡアレイを調製するプロトコルは以下に詳
細に記載される。いくつかの細胞株を化合物で処理して，それが遺伝子発現にお
よぼす影響を評価した。８種類の処理を用いた：１）対照，２）低血清，３）２
００μＭミモシン，４）３ｍＭＨＵ，５）２μＭＡＵＲ２阻害剤，６）１０μＭ
シスプラチン，７）４００ｎｇ／ｍｌノコダゾール−２４時間，および８）４０
０ｎｇ／ｍｌノコダゾール−４８時間。
【０３７０】
４５０以上の組織または細胞株起源に由来する"ｃＤＮＡライブラリ"をナイロ
ン膜に固定化し，目的とする遺伝子に由来する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメン
トで探索した。ｃＤＮＡを作成するためには，総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを逆転写
反応においてテンプレートとして用いて，両端に特定の配列でタグ付けされた一
本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を生成した。特定の配列（ＣＤＳ：ＡＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ30ＶＮ（Ｖ＝Ａ，Ｇ，ＣＮ＝Ａ，Ｇ
，Ｃ，Ｔ））を含むオリゴｄＴプライマーは，ｍＲＮＡの３’末端のポリＡトラ
ックにアニーリングし，リバーストランスクリプターゼ（ＭＭＬＶ Ｒｎａｓｅ
Ｈ-）はＲＮＡ鎖の末端に到達するまでアンチセンス鎖を転写し，ここで追加の
Ｃ残基を付加する。３つのＧで終わるプライマー（ＳＭＩＩ：ＡＡＧＣＡＧＴＧ
ＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧまたはＭＬ２Ｇ：ＡＡＧＴＧＧ
ＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧ）を加えると，これは付加
されたＣにアニーリングし，ＭＭＬＶはプライマー配列の残りをテンプレートと
して認識して転写を続ける。その結果，合成されたｃＤＮＡは５’末端および３
’末端の両方に特定の配列タグを含む。５’末端および３’末端を同じ配列（Ｃ
ＤＳおよびＳＭＩＩ）でタグ付けした場合，これは"対称"と称される。５’末端
を３’末端とは異なる配列（ＣＤＳおよびＭＬ２Ｇ）でタグ付けした場合，これ
は"非対称"と称される。次に，付加された配列タグにアニーリングする３’ＰＣ
ＲおよびＭＬ２プライマー（３’ＰＣＲ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧ
ＣＡＧＡＧＴおよびＭＬ２：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴ
）を用いて，ＰＣＲ増幅により二本鎖"ｃＤＮＡライブラリ"を生成する。
ン膜に固定化し，目的とする遺伝子に由来する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメン
トで探索した。ｃＤＮＡを作成するためには，総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを逆転写
反応においてテンプレートとして用いて，両端に特定の配列でタグ付けされた一
本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を生成した。特定の配列（ＣＤＳ：ＡＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ30ＶＮ（Ｖ＝Ａ，Ｇ，ＣＮ＝Ａ，Ｇ
，Ｃ，Ｔ））を含むオリゴｄＴプライマーは，ｍＲＮＡの３’末端のポリＡトラ
ックにアニーリングし，リバーストランスクリプターゼ（ＭＭＬＶ Ｒｎａｓｅ
Ｈ-）はＲＮＡ鎖の末端に到達するまでアンチセンス鎖を転写し，ここで追加の
Ｃ残基を付加する。３つのＧで終わるプライマー（ＳＭＩＩ：ＡＡＧＣＡＧＴＧ
ＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧまたはＭＬ２Ｇ：ＡＡＧＴＧＧ
ＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧ）を加えると，これは付加
されたＣにアニーリングし，ＭＭＬＶはプライマー配列の残りをテンプレートと
して認識して転写を続ける。その結果，合成されたｃＤＮＡは５’末端および３
’末端の両方に特定の配列タグを含む。５’末端および３’末端を同じ配列（Ｃ
ＤＳおよびＳＭＩＩ）でタグ付けした場合，これは"対称"と称される。５’末端
を３’末端とは異なる配列（ＣＤＳおよびＭＬ２Ｇ）でタグ付けした場合，これ
は"非対称"と称される。次に，付加された配列タグにアニーリングする３’ＰＣ
ＲおよびＭＬ２プライマー（３’ＰＣＲ：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧ
ＣＡＧＡＧＴおよびＭＬ２：ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴ
）を用いて，ＰＣＲ増幅により二本鎖"ｃＤＮＡライブラリ"を生成する。
【０３７１】
増幅させた"ｃＤＮＡライブラリ"を３８４ピンレプリケータを用いて手動でナ
イロン膜上に配列させた。ＤＮＡをアルカリ処理により変性させ，中和し，ＵＶ
光で架橋させた。アレイをＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でプレ
ハイブリダイズさせ，目的とする遺伝子に対応するｃＤＮＡフラグメントのラン
ダムヘキサマープライミングにより生成した32Ｐ標識プローブを用いてハイブリ
ダイズさせた。洗浄した後，ブロットをホスファーイメージングカセットに露光
し，シグナルの強度を定量した。アレイ上のＤＮＡの量もまた，非変性または変
性アレイをそれぞれＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＩまたはＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
ＩＩで２分間処理することにより定量した（１：１００，０００，５０ｍＭＴ
ｒｉｓ，ｐＨ８．０中）。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で洗浄した後，ホス
ファーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で蛍光放出を検
出し定量した。整列させたＤＮＡの量を用いてハイブリダイゼーションシグナル
を標準化した。
イロン膜上に配列させた。ＤＮＡをアルカリ処理により変性させ，中和し，ＵＶ
光で架橋させた。アレイをＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でプレ
ハイブリダイズさせ，目的とする遺伝子に対応するｃＤＮＡフラグメントのラン
ダムヘキサマープライミングにより生成した32Ｐ標識プローブを用いてハイブリ
ダイズさせた。洗浄した後，ブロットをホスファーイメージングカセットに露光
し，シグナルの強度を定量した。アレイ上のＤＮＡの量もまた，非変性または変
性アレイをそれぞれＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＩまたはＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ
ＩＩで２分間処理することにより定量した（１：１００，０００，５０ｍＭＴ
ｒｉｓ，ｐＨ８．０中）。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で洗浄した後，ホス
ファーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で蛍光放出を検
出し定量した。整列させたＤＮＡの量を用いてハイブリダイゼーションシグナル
を標準化した。
【０３７２】
ＳＧＰ０６１用の32Ｐ標識プローブを生成するためのｃＤＮＡフラグメントを
調製するために，２つのオリゴヌクレオチド，５’−ＴＴＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧ
ＡＣＧＣＧＣ−３’および５’−ＴＣＣＣＡＴＣＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧ−３
’を用いて，ＰＣＲにより４３０塩基対フラグメントを増幅した。フラグメント
をアガロースゲルでの分離により精製し，同じオリゴヌクレオチドをシークエン
ス反応のプライマーとして用いて配列を確認した。ＰＣＲ産物は，ある範囲の組
織起源，例えば，前立腺，胎盤，唾液腺，骨格筋，脊髄，ならびに多くの腫瘍細
胞株において検出可能であった。次に，このｃＤＮＡフラグメントを用いて，上
述のようにして，組織アレイにおけるＳＧＰ０６１の発現を判定した。正常組織
発現レベルと腫瘍細胞株との発現レベルの最初の比較は，ＳＧＰ０６１が多くの
腫瘍細胞株，例えば，乳，結腸，白血病，肺，黒色腫，神経膠芽細胞腫，卵巣お
よび腎臓組織起源に由来する細胞株で上昇していることを明らかにした。
調製するために，２つのオリゴヌクレオチド，５’−ＴＴＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧ
ＡＣＧＣＧＣ−３’および５’−ＴＣＣＣＡＴＣＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧ−３
’を用いて，ＰＣＲにより４３０塩基対フラグメントを増幅した。フラグメント
をアガロースゲルでの分離により精製し，同じオリゴヌクレオチドをシークエン
ス反応のプライマーとして用いて配列を確認した。ＰＣＲ産物は，ある範囲の組
織起源，例えば，前立腺，胎盤，唾液腺，骨格筋，脊髄，ならびに多くの腫瘍細
胞株において検出可能であった。次に，このｃＤＮＡフラグメントを用いて，上
述のようにして，組織アレイにおけるＳＧＰ０６１の発現を判定した。正常組織
発現レベルと腫瘍細胞株との発現レベルの最初の比較は，ＳＧＰ０６１が多くの
腫瘍細胞株，例えば，乳，結腸，白血病，肺，黒色腫，神経膠芽細胞腫，卵巣お
よび腎臓組織起源に由来する細胞株で上昇していることを明らかにした。
【０３７３】
ＳＧＰ０６１についてのこの組織アレイのデータを，異なる組織タイプにわた
って，レンジ規格化を用いて統計学的分析用に規格化した。規格化は，測定値を
一般的スケールに変換する。我々は各変数の最も小さい値を各値から引いてその
レンジで割るレンジ標準化を用いた。新たなスケールは０で始まり，１．０で終
わる。標準化したデータについて以下の統計学的方法を実行した：記述的統計の
生成，グラフによる可視化，階層的およびｋ平均クラスター分析（１０，７，お
よび５クラスター），および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いる群間の比較。特定
の組織タイプについて正常および腫瘍組織の両方のデータが存在する場合，２つ
の群を差異について直接比較した。すべての統計学的分析は，対称および非対称
組織アレイ実験室方法について別々に行った。これは，遺伝子発現は用いた方法
に依存するためである。ＳＧＰ０６１の場合，対称方法（ｎ＝１０７）は一貫し
て非対称方法（ｎ＝３９２）より高い平均発現値を与えたが，差の平均倍率は３
６．０倍であった。
って，レンジ規格化を用いて統計学的分析用に規格化した。規格化は，測定値を
一般的スケールに変換する。我々は各変数の最も小さい値を各値から引いてその
レンジで割るレンジ標準化を用いた。新たなスケールは０で始まり，１．０で終
わる。標準化したデータについて以下の統計学的方法を実行した：記述的統計の
生成，グラフによる可視化，階層的およびｋ平均クラスター分析（１０，７，お
よび５クラスター），および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いる群間の比較。特定
の組織タイプについて正常および腫瘍組織の両方のデータが存在する場合，２つ
の群を差異について直接比較した。すべての統計学的分析は，対称および非対称
組織アレイ実験室方法について別々に行った。これは，遺伝子発現は用いた方法
に依存するためである。ＳＧＰ０６１の場合，対称方法（ｎ＝１０７）は一貫し
て非対称方法（ｎ＝３９２）より高い平均発現値を与えたが，差の平均倍率は３
６．０倍であった。
【０３７４】
ＳＧＰ０６１は，対称（１．３５ｘ）および非対称（３．５９ｘ）方法のいず
れにおいても，細胞株試料において組織試料におけるより高度に発現されている
。しかし，腫瘍と正常試料との間の比率にはある不一致が存在し，これは、試料
が組織または細胞株のいずれから得られたものであるかにより影響されるようで
あった。一般に，この遺伝子は正常試料よりも腫瘍においてより高度に発現され
ているようである。細胞株および組織試料をプールすると，腫瘍試料においてよ
り高い発現が観察された（２．７ｘ（非対称）および１．２ｘ（対称））。しか
し，これらの比率の相違は，統計学的に有意ではなかった。対称および非対称方
法のいずれにおいても，この遺伝子は非常に高度に発現されており，神経膠芽細
胞腫，乳癌，および肺癌を表す腫瘍試料を含む強いクラスターを形成した。乳癌
および前立腺癌において非常に高度に発現されていることが観察されているキナ
ーゼ付随ホスファターゼ（ＫＡＰ）と同様に，このホスファターゼは、マーカー
および／または治療標的として重要性を有するかもしれない。
れにおいても，細胞株試料において組織試料におけるより高度に発現されている
。しかし，腫瘍と正常試料との間の比率にはある不一致が存在し，これは、試料
が組織または細胞株のいずれから得られたものであるかにより影響されるようで
あった。一般に，この遺伝子は正常試料よりも腫瘍においてより高度に発現され
ているようである。細胞株および組織試料をプールすると，腫瘍試料においてよ
り高い発現が観察された（２．７ｘ（非対称）および１．２ｘ（対称））。しか
し，これらの比率の相違は，統計学的に有意ではなかった。対称および非対称方
法のいずれにおいても，この遺伝子は非常に高度に発現されており，神経膠芽細
胞腫，乳癌，および肺癌を表す腫瘍試料を含む強いクラスターを形成した。乳癌
および前立腺癌において非常に高度に発現されていることが観察されているキナ
ーゼ付随ホスファターゼ（ＫＡＰ）と同様に，このホスファターゼは、マーカー
および／または治療標的として重要性を有するかもしれない。
【０３７５】２）多数組織発現ブロット（ＭＴＥ）
ＭＴＥ（多数組織発現）ブロットは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手する。これらのブロットは，正常ヒト組織およびヒト
細胞株に由来する８４個の整列したｃＤＮＡ試料および対照を含む。発現ブロッ
トを０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含むＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブ
リダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で６５
℃で２時間プレハイブリダイズさせる。放射性ＤＮＡプローブは，ランダムプラ
イミングＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて調製する。精製したＤＮＡフ
ラグメント（１００ｎｇ）をキットのプロトコルを用いて２５０μＣｉの３２Ｐ
標識ｄＣＴＰで４５分間標識する。スピンカラム（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔＧ５０
マイクロカラム，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）を用いて
取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。３分間煮沸することにより変性さ
せた後，プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に加え，ブロットを６５℃
で２０時間ハイブリダイズさせた。次にブロットを１５ｍＭＮａＣｌ，１．５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム，０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液
で６５℃で４回各１５分間洗浄し，ホスファーイメージャースクリーンに露光し
て定量した。
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手する。これらのブロットは，正常ヒト組織およびヒト
細胞株に由来する８４個の整列したｃＤＮＡ試料および対照を含む。発現ブロッ
トを０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含むＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブ
リダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で６５
℃で２時間プレハイブリダイズさせる。放射性ＤＮＡプローブは，ランダムプラ
イミングＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて調製する。精製したＤＮＡフ
ラグメント（１００ｎｇ）をキットのプロトコルを用いて２５０μＣｉの３２Ｐ
標識ｄＣＴＰで４５分間標識する。スピンカラム（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔＧ５０
マイクロカラム，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）を用いて
取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。３分間煮沸することにより変性さ
せた後，プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に加え，ブロットを６５℃
で２０時間ハイブリダイズさせた。次にブロットを１５ｍＭＮａＣｌ，１．５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム，０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液
で６５℃で４回各１５分間洗浄し，ホスファーイメージャースクリーンに露光し
て定量した。
【０３７６】実施例４：哺乳動物蛋白質ホスファターゼの染色体位置
いくつかの情報源を用いて，本発明の遺伝子のそれぞれの染色体上の位置に関
する情報を得た。Ｃｅｌｅｒａブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ
．ｃｏｍ）を用いて，ｃｅｌｅｒａコンフィギュレーションを特定の細胞遺伝学
的バンドに位置決定した。また，核酸配列の受託番号を用いてＵｎｉｇｅｎｅデ
ータベースを検索した。Ｕｎｉｇｅｎｅサーチエンジンを含むサイトは，ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／Ｈｓ．
Ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌである。Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中のマップ位置の情報
は，いくつかの情報源，例えば，ｔｈｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ
Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ
），Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ．ｉｎｆ
ｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｇｄｂ／ｓｉｍｐｌｅＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ），およ
びｔｈｅ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｙｓｉ
ｃａｌ ｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８００
０／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｓｔｓ＿ｉｎｆｏ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ｒ
ｅｌｅａｓｅ）から得た。ＵｎｉｇｅｎｅがＥＳＴをマップしなかった場合には
，既にマップされている配列を含むデータベース，例えばｄｂｓｔｓおよびｈｔ
ｇｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ
／ｂｌａｓｔｄａｔａｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）に対して目的とする遺伝子につい
ての核酸をクエリーとして用いた。核酸配列はＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−
ｎｅｗｂｌａｓｔ）でＢＬＡＳＴ−２を用いて検索し，これを用いてｄｂｓｔｓ
またはｈｔｇｓのいずれかにクエリーを行った。これらの方法のいずれかにより
細胞遺伝学的領域を同定した後，ＯＭＩＭを細胞遺伝学的位置で検索することに
より，疾病との関連を確立する。ＯＭＩＭは，疾病により系統づけられた細胞遺
伝学的マップ位置の検索可能なカタログを維持する。また，細胞遺伝学的領域に
ついての入手可能な文献の徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈ
ｔｍｌ）を用いて行う。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体
異常との関連についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ
Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことがで
きる。
する情報を得た。Ｃｅｌｅｒａブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ
．ｃｏｍ）を用いて，ｃｅｌｅｒａコンフィギュレーションを特定の細胞遺伝学
的バンドに位置決定した。また，核酸配列の受託番号を用いてＵｎｉｇｅｎｅデ
ータベースを検索した。Ｕｎｉｇｅｎｅサーチエンジンを含むサイトは，ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／Ｈｓ．
Ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌである。Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中のマップ位置の情報
は，いくつかの情報源，例えば，ｔｈｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ
Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ
），Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ．ｉｎｆ
ｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｇｄｂ／ｓｉｍｐｌｅＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ），およ
びｔｈｅ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｙｓｉ
ｃａｌ ｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８００
０／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｓｔｓ＿ｉｎｆｏ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ｒ
ｅｌｅａｓｅ）から得た。ＵｎｉｇｅｎｅがＥＳＴをマップしなかった場合には
，既にマップされている配列を含むデータベース，例えばｄｂｓｔｓおよびｈｔ
ｇｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ
／ｂｌａｓｔｄａｔａｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）に対して目的とする遺伝子につい
ての核酸をクエリーとして用いた。核酸配列はＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−
ｎｅｗｂｌａｓｔ）でＢＬＡＳＴ−２を用いて検索し，これを用いてｄｂｓｔｓ
またはｈｔｇｓのいずれかにクエリーを行った。これらの方法のいずれかにより
細胞遺伝学的領域を同定した後，ＯＭＩＭを細胞遺伝学的位置で検索することに
より，疾病との関連を確立する。ＯＭＩＭは，疾病により系統づけられた細胞遺
伝学的マップ位置の検索可能なカタログを維持する。また，細胞遺伝学的領域に
ついての入手可能な文献の徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈ
ｔｍｌ）を用いて行う。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体
異常との関連についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ
Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことがで
きる。
【０３７７】
以下の節は，本発明に含まれるホスファターゼについて確立された染色体位置
にマップされる種々の疾病および／または疾患を記載する。本発明のホスファタ
ーゼポリヌクレオチドを用いて，関連性のある疾病および／または疾患を有する
かまたはそれを発達させるリスクを有する個人を同定することができる。本明細
書において議論されるように，本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは
，ホスファターゼ活性を調節し，したがって種々の疾病および／または疾患を改
善する化合物を同定するのに有用である。
にマップされる種々の疾病および／または疾患を記載する。本発明のホスファタ
ーゼポリヌクレオチドを用いて，関連性のある疾病および／または疾患を有する
かまたはそれを発達させるリスクを有する個人を同定することができる。本明細
書において議論されるように，本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは
，ホスファターゼ活性を調節し，したがって種々の疾病および／または疾患を改
善する化合物を同定するのに有用である。
【０３７８】結果：
ＳＧＰ０５７，配列番号１，配列番号６は染色体１にマップされる。
【０３７９】
ＳＧＰ０６１，配列番号２，配列番号７は１１ｐ１１にマップされる。この領
域は，前立腺癌（Ｏｚｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２００
０ Ｊｕｌ；１７（１）：１１３−７）；およびセリアック病（Ｋｉｎｇ Ａ．
Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ｎｏｖ；６４（Ｐｔ
６）：４７９−９０）と関連づけられている。
域は，前立腺癌（Ｏｚｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２００
０ Ｊｕｌ；１７（１）：１１３−７）；およびセリアック病（Ｋｉｎｇ Ａ．
Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ｎｏｖ；６４（Ｐｔ
６）：４７９−９０）と関連づけられている。
【０３８０】
ＳＧＰ０５０，配列番号３，配列番号８は３ｐ２１．１にマップされる。この
領域における異常は，腎臓細胞癌腫と関連づけられている（Ｇｒｏｎｗａｌｄ
Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．１９９９；２３（
６）：４７９−８４）。
領域における異常は，腎臓細胞癌腫と関連づけられている（Ｇｒｏｎｗａｌｄ
Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．１９９９；２３（
６）：４７９−８４）。
【０３８１】
ＳＧＰ０４５，配列番号４，配列番号９は１９ｑ１３．３にマップされる。
【０３８２】
ＳＧＰ０３６，配列番号５，配列番号１０は位置４ｑ２４にマップされる。こ
の領域中の染色体不安定化は，甲状腺癌腫と関連づけられている（Ｋｙｔｏｌａ
Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０００ Ａｕｇ；１５７（２
）：５７９−８６）。
の領域中の染色体不安定化は，甲状腺癌腫と関連づけられている（Ｋｙｔｏｌａ
Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０００ Ａｕｇ；１５７（２
）：５７９−８６）。
【０３８３】実施例５：一塩基多型（ＳＮＰｓ）候補 材料および方法
ヒトＤＮＡにおける最も一般的な変種は一塩基多型（ＳＮＰｓ）であり，これ
は，約１００−３００塩基に１回生ずる。ＳＮＰｓは大規模の関連遺伝学研究を
容易にすると予測されているため，最近，ＳＮＰの発見および検出に多大な興味
がもたれている。本明細書に記載される遺伝子の候補ＳＮＰｓは，核酸配列を公
共のデータベースに記録されているＳＮＰｓを含む配列に対してｂｌａｓｔｎ検
索することにより同定した（ｄｂＳＮＰ，ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐｂｌａｓｔｐｒｅｔｔｙ．ｈ
ｔｍｌ）。ＳＮＰ含有配列についてｄｂＳＮＰ受託番号が与えられている。ＳＮ
Ｐｓはまた，発現遺伝子（ｄｂＥＳＴ，ＮＲＮＡ）およびゲノム配列（すなわち
ＮＲＮＡ）のいくつかのデータベースを一塩基対ミスマッチについて比較するこ
とにより同定した。結果は，表２の"ＳＮＰｓ"のカラムに示される。これらは候
補ＳＮＰｓである。ヒト集団におけるこれらの実際の頻度は決定していない。以
下のコードはそれぞれのＤＮＡ配列を表す標準である： Ｇ＝グアノシン Ａ＝アデノシン Ｔ＝チミジン Ｃ＝シチジン Ｒ＝ＧまたはＡ，（プリン） Ｙ＝ＣまたはＴ，（ピリミジン） Ｋ＝ＧまたはＴ，（ケト） Ｗ＝ＡまたはＴ，（弱）（２つの水素結合） Ｓ＝ＣまたはＧ，（強）（３つの水素結合） Ｍ＝ＡまたはＣ，（アミノ） Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ（すなわち，Ａ以外） Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ（すなわち，Ｃ以外） Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ（すなわち，Ｇ以外） Ｖ＝Ａ，ＣまたはＧ（すなわち，Ｔ以外） Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ，（任意） Ｘ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ 相補的ＤＮＡ鎖 ＧＡＴＣＲＹＷＳＫＭＢＶＤＨＮＸ ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ ＣＴＡＧＹＲＳＷＭＫＶＢＨＤＮＸ
は，約１００−３００塩基に１回生ずる。ＳＮＰｓは大規模の関連遺伝学研究を
容易にすると予測されているため，最近，ＳＮＰの発見および検出に多大な興味
がもたれている。本明細書に記載される遺伝子の候補ＳＮＰｓは，核酸配列を公
共のデータベースに記録されているＳＮＰｓを含む配列に対してｂｌａｓｔｎ検
索することにより同定した（ｄｂＳＮＰ，ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐｂｌａｓｔｐｒｅｔｔｙ．ｈ
ｔｍｌ）。ＳＮＰ含有配列についてｄｂＳＮＰ受託番号が与えられている。ＳＮ
Ｐｓはまた，発現遺伝子（ｄｂＥＳＴ，ＮＲＮＡ）およびゲノム配列（すなわち
ＮＲＮＡ）のいくつかのデータベースを一塩基対ミスマッチについて比較するこ
とにより同定した。結果は，表２の"ＳＮＰｓ"のカラムに示される。これらは候
補ＳＮＰｓである。ヒト集団におけるこれらの実際の頻度は決定していない。以
下のコードはそれぞれのＤＮＡ配列を表す標準である： Ｇ＝グアノシン Ａ＝アデノシン Ｔ＝チミジン Ｃ＝シチジン Ｒ＝ＧまたはＡ，（プリン） Ｙ＝ＣまたはＴ，（ピリミジン） Ｋ＝ＧまたはＴ，（ケト） Ｗ＝ＡまたはＴ，（弱）（２つの水素結合） Ｓ＝ＣまたはＧ，（強）（３つの水素結合） Ｍ＝ＡまたはＣ，（アミノ） Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ（すなわち，Ａ以外） Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ（すなわち，Ｃ以外） Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ（すなわち，Ｇ以外） Ｖ＝Ａ，ＣまたはＧ（すなわち，Ｔ以外） Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ，（任意） Ｘ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ 相補的ＤＮＡ鎖 ＧＡＴＣＲＹＷＳＫＭＢＶＤＨＮＸ ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ ＣＴＡＧＹＲＳＷＭＫＶＢＨＤＮＸ
【０３８４】
例えば，２つのバージョンの遺伝子が存在し，一方は所定の位置に"Ｃ"を有し
，他方は同じ位置に"Ｔ”を有する場合，その位置はＹと表され，これはＣまた
はＴを意味する。表１においては，ＳＧＰ００２についてＳＮＰのカラムには"
１１６５＝Ｒ"と記載されており，これは，位置１１６５において多型が存在す
ることを意味する。この位置は，場合によりＧを，場合によりＡを含む（ＲはＡ
またはＧを表す）。ＳＮＰｓは，遺伝子に付随する遺伝性の特徴を同定するため
に重要であろう。
，他方は同じ位置に"Ｔ”を有する場合，その位置はＹと表され，これはＣまた
はＴを意味する。表１においては，ＳＧＰ００２についてＳＮＰのカラムには"
１１６５＝Ｒ"と記載されており，これは，位置１１６５において多型が存在す
ることを意味する。この位置は，場合によりＧを，場合によりＡを含む（ＲはＡ
またはＧを表す）。ＳＮＰｓは，遺伝子に付随する遺伝性の特徴を同定するため
に重要であろう。
【０３８５】結果
本明細書に記載される新規ホスファターゼ配列においてはＳＮＰｓは見いださ
れなかった。
れなかった。
【０３８６】実施例６：哺乳動物蛋白質ホスファターゼをコードするｃＤＮＡの単離 材料および方法 新規クローンの同定
総ＲＮＡは，原発性腫瘍，正常および腫瘍細胞株，正常ヒト組織，およびソー
トしたヒト造血細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｐ．Ｃｈ
ｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１６２，１５６（１９８７））のグアニジン塩／フェノール抽出プロトコルを用
いて単離する。これらのＲＮＡを用いて，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ ｅｔ ａｌ．（１９８９），ＦＯＣ
ＵＳ １１，６６）を用いて，製造元により推奨される条件で一本鎖ｃＤＮＡを
生成する。典型的な反応においては，６０μｌの反応容量中で１０μｇの総ＲＮ
Ａおよび１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）12-18を用いる。生成物をＲＮａｓｅＨで
処理し，Ｈ2Ｏで１００μｌに希釈する。続くＰＣＲ増幅のためには，１−４μ
ｌのこのｓｓｃＤＮＡを各反応において用いる。
トしたヒト造血細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｐ．Ｃｈ
ｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１６２，１５６（１９８７））のグアニジン塩／フェノール抽出プロトコルを用
いて単離する。これらのＲＮＡを用いて，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ ｅｔ ａｌ．（１９８９），ＦＯＣ
ＵＳ １１，６６）を用いて，製造元により推奨される条件で一本鎖ｃＤＮＡを
生成する。典型的な反応においては，６０μｌの反応容量中で１０μｇの総ＲＮ
Ａおよび１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）12-18を用いる。生成物をＲＮａｓｅＨで
処理し，Ｈ2Ｏで１００μｌに希釈する。続くＰＣＲ増幅のためには，１−４μ
ｌのこのｓｓｃＤＮＡを各反応において用いる。
【０３８７】
縮重オリゴヌクレオチドは，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４
８ＤＮＡ合成機で確立されたホスホルアミダイト化学を用いて合成し，エタノー
ルで沈澱させ，精製せずにＰＣＲ用に用いる。これらのプライマーは，いくつか
の蛋白質ホスファターゼの触媒ドメイン中の保存モチーフのセンスおよびアンチ
センス鎖に由来する。縮重ヌクレオチド残基の表示は以下のとおりである：Ｎ＝
Ａ，Ｃ，Ｇ，またはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ
，Ｇではない；Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ，Ｃではない；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＷ＝
ＡまたはＴ。
８ＤＮＡ合成機で確立されたホスホルアミダイト化学を用いて合成し，エタノー
ルで沈澱させ，精製せずにＰＣＲ用に用いる。これらのプライマーは，いくつか
の蛋白質ホスファターゼの触媒ドメイン中の保存モチーフのセンスおよびアンチ
センス鎖に由来する。縮重ヌクレオチド残基の表示は以下のとおりである：Ｎ＝
Ａ，Ｃ，Ｇ，またはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ
，Ｇではない；Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ，Ｃではない；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＷ＝
ＡまたはＴ。
【０３８８】
ＰＣＲ反応は，多数の一本鎖ｃＤＮＡに適用される縮重プライマーを用いて行
う。プライマーをそれぞれ最終濃度５μＭで，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ
８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，各２００μＭデオキシヌ
クレオシド三リン酸，０．００１％ゼラチン，１．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ），および１−４μ
ｇのｃＤＮＡを含む混合物に加える。９５℃で３分間変性させた後，サイクルの
条件は，９４℃で３０秒間，５０℃で１分間，および７２℃で１分４５秒間を３
５サイクルである。３００−３５０ｂｐの間に移動したＰＣＲフラグメントをＧ
ｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて２％アガロースゲルから単離
し，製造元のプロトコルにしたがってｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｃｏｒｐ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）中にＴ−Ａクローニングする。
う。プライマーをそれぞれ最終濃度５μＭで，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ
８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，各２００μＭデオキシヌ
クレオシド三リン酸，０．００１％ゼラチン，１．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ），および１−４μ
ｇのｃＤＮＡを含む混合物に加える。９５℃で３分間変性させた後，サイクルの
条件は，９４℃で３０秒間，５０℃で１分間，および７２℃で１分４５秒間を３
５サイクルである。３００−３５０ｂｐの間に移動したＰＣＲフラグメントをＧ
ｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて２％アガロースゲルから単離
し，製造元のプロトコルにしたがってｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ Ｃｏｒｐ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）中にＴ−Ａクローニングする。
【０３８９】
Ｑｉａｇｅｎカラムを用いるミニプラスミドＤＮＡ調製用にコロニーを選択し
，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットおよびＡｍｐｌｉＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプ
ラスミドＤＮＡを配列決定する。配列決定反応生成物はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３
７７ ＤＮＡシークエンサーにかけ，ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズム（
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３−１０）を用いて分析する。
，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットおよびＡｍｐｌｉＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプ
ラスミドＤＮＡを配列決定する。配列決定反応生成物はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３
７７ ＤＮＡシークエンサーにかけ，ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズム（
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３−１０）を用いて分析する。
【０３９０】
追加のＰＣＲ戦略を用いて，正確なまたはほぼ正確なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて種々のＰＣＲフラグメントまたはＥＳＴを接続する。ＰＣＲ条件
は上述したとおりであるが，ただし，アニーリング温度は，式：Ｔｍ＝４（Ｇ＋
Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）を用いて各オリゴ対について計算する。
イマーを用いて種々のＰＣＲフラグメントまたはＥＳＴを接続する。ＰＣＲ条件
は上述したとおりであるが，ただし，アニーリング温度は，式：Ｔｍ＝４（Ｇ＋
Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）を用いて各オリゴ対について計算する。
【０３９１】ｃＤＮＡクローンの単離：
ヒトｃＤＮＡライブラリをホスファターゼ関連遺伝子に対応するＰＣＲまたは
ＥＳＴフラグメントで探索する。プローブをランダムプライミングにより32Ｐで
標識し，ライブラリスクリーニングの標準的手法にしたがって，２ｘ１０6ｃｐ
ｍ／ｍＬで用いる。プレハイブリダイゼーション（３時間）およびハイブリダイ
ゼーション（一夜）は，５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液，２．５％硫酸デキス
トラン，５０ｍＭＮａ2ＰＯ4／ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．０，５０％ホルムアミド
，１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で行う。ストリンジェントな
洗浄は，６５℃で，０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で行う。ＤＮＡ配列
決定は，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットを用い，Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用
いて両方の鎖について行う。配列決定反応生成物をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７
ＤＮＡシークエンサーにかける。
ＥＳＴフラグメントで探索する。プローブをランダムプライミングにより32Ｐで
標識し，ライブラリスクリーニングの標準的手法にしたがって，２ｘ１０6ｃｐ
ｍ／ｍＬで用いる。プレハイブリダイゼーション（３時間）およびハイブリダイ
ゼーション（一夜）は，５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液，２．５％硫酸デキス
トラン，５０ｍＭＮａ2ＰＯ4／ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．０，５０％ホルムアミド
，１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で行う。ストリンジェントな
洗浄は，６５℃で，０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で行う。ＤＮＡ配列
決定は，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットを用い，Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用
いて両方の鎖について行う。配列決定反応生成物をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７
ＤＮＡシークエンサーにかける。
【０３９２】実施例７：蛋白質ホスファターゼ遺伝子発現 発現ベクターの構築
ヒトｃＤＮＡのいくつかから発現構築物を作成する：ａ）ｐＣＤＮＡ発現ベク
ター中の完全長クローン；ｂ）ＧＳＴ発現カセットのＣ末端に融合させた新規ホ
スファターゼの触媒ドメインを含むＧＳＴ融合構築物；およびｃ）ｐＣＤＮＡベ
クター中に挿入されたホスファターゼドメイン中の予測触媒部位にＣｙｓからＳ
ｅｒ（ＣからＳ）変異を含む完全長クローン。
ター中の完全長クローン；ｂ）ＧＳＴ発現カセットのＣ末端に融合させた新規ホ
スファターゼの触媒ドメインを含むＧＳＴ融合構築物；およびｃ）ｐＣＤＮＡベ
クター中に挿入されたホスファターゼドメイン中の予測触媒部位にＣｙｓからＳ
ｅｒ（ＣからＳ）変異を含む完全長クローン。
【０３９３】
ホスファターゼの"ＣからＳ"変異体は優性負の構築物として機能するかもしれ
ず，これらの新規ホスファターゼの機能を解明するために用いられる。
ず，これらの新規ホスファターゼの機能を解明するために用いられる。
【０３９４】実施例８：蛋白質ホスファターゼに対する特異的免疫試薬の作成 材料および方法
単離されたホスファターゼポリペプチドに対応するＫＬＨ−またはＭＡＰ−コ
ンジュゲート化合成ペプチドに対する特異的免疫試薬をウサギで生成させる。Ｃ
末端ペプチドをグルタルアルデヒドでＫＬＨとコンジュゲートさせ，遊離Ｃ末端
を残す。内部ペプチドは，ブロックされたＮ末端を用いてＭＡＰ−コンジュゲー
トさせる。追加の免疫試薬はまた，細菌で発現させた各新規ＰＴＰまたはＳＴＰ
の細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質でウサギを免疫することにより生成す
ることができる。内因性起源について試験する前に，最初に，種々の免疫血清を
，組換え蛋白質に対する反応性および選択性について試験する。
ンジュゲート化合成ペプチドに対する特異的免疫試薬をウサギで生成させる。Ｃ
末端ペプチドをグルタルアルデヒドでＫＬＨとコンジュゲートさせ，遊離Ｃ末端
を残す。内部ペプチドは，ブロックされたＮ末端を用いてＭＡＰ−コンジュゲー
トさせる。追加の免疫試薬はまた，細菌で発現させた各新規ＰＴＰまたはＳＴＰ
の細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質でウサギを免疫することにより生成す
ることができる。内因性起源について試験する前に，最初に，種々の免疫血清を
，組換え蛋白質に対する反応性および選択性について試験する。
【０３９５】ウエスタンブロット
ＳＤＳ ＰＡＧＥ上の蛋白質をイモビロン膜に移す。洗浄緩衝液はＰＢＳＴ（
標準的リン酸緩衝化食塩水，ｐＨ７．４＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で
ある。ブロッキングおよび抗体インキュベーション緩衝液はＰＢＳＴ＋５％ミル
クである。抗体希釈は１：１０００から１：２０００の範囲である。
標準的リン酸緩衝化食塩水，ｐＨ７．４＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で
ある。ブロッキングおよび抗体インキュベーション緩衝液はＰＢＳＴ＋５％ミル
クである。抗体希釈は１：１０００から１：２０００の範囲である。
【０３９６】実施例９：蛋白質ホスファターゼの組換え発現および生物学的アッセイ 材料および方法 哺乳動物細胞におけるホスファターゼの過渡的発現
ホスファターゼ構築物を含むｐｃＤＮＡ発現プラスミド（１０μｇＤＮＡ／１
００ｍｍプレート）をリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とともに２９３細
胞中に導入する。７２時間後，細胞を０．５ｍＬの可溶化緩衝液（２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ，ｐＨ７．３５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール，１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭフッ
化フェニルメチルスルホニル，１μｇ／ｍＬアプロチニン）中に回収する。試料
アリコートを６％アクリルアミド／０．５％ビスアクリルアミドゲルのＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し，電気泳動的にニトロセル
ロースに移す。非特異的結合は，ブロットをＢｌｏｔｔｏ（５％ｗ／ｖ無脂乾燥
ミルクおよび０．２％ｖ／ｖ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有
するリン酸緩衝化食塩水）中でプレインキュベートすることによりブロックし，
種々の抗ペプチドまたは抗ＧＳＴ融合蛋白質特異的抗血清を用いて組換え蛋白質
を検出した。
００ｍｍプレート）をリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とともに２９３細
胞中に導入する。７２時間後，細胞を０．５ｍＬの可溶化緩衝液（２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ，ｐＨ７．３５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール，１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭフッ
化フェニルメチルスルホニル，１μｇ／ｍＬアプロチニン）中に回収する。試料
アリコートを６％アクリルアミド／０．５％ビスアクリルアミドゲルのＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し，電気泳動的にニトロセル
ロースに移す。非特異的結合は，ブロットをＢｌｏｔｔｏ（５％ｗ／ｖ無脂乾燥
ミルクおよび０．２％ｖ／ｖ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有
するリン酸緩衝化食塩水）中でプレインキュベートすることによりブロックし，
種々の抗ペプチドまたは抗ＧＳＴ融合蛋白質特異的抗血清を用いて組換え蛋白質
を検出した。
【０３９７】インビトロホスファターゼアッセイ
ホスファターゼ発現構築物でトランスフェクトした３日後，１０ｃｍプレート
の２９３細胞をＰＢＳで洗浄し，氷上でホスファターゼ阻害剤を含む２ｍＬのＰ
ＢＳＴＤＳで可溶化する（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．２５，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５％デオキシコール酸，０．１
％ＳＤＳ，０．２％アジ化ナトリウム，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，４
ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム，１％アプロチニン，５μｇ／ｍＬロイペプチ
ン）。細胞断片を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分間，４℃）により除去し，
溶解物をプロテインＡセファロースの１：１スラリー５０μｌとともにそれぞれ
１時間２回インキュベートすることにより前精製する。０．５ｍＬの精製上清を
，１０μｌのプロテインＡ精製ホスファターゼ特異的抗血清（ＧＳＴ融合蛋白質
または抗ペプチド抗血清から生成）プラス５０μｌのプロテインＡ−セファロー
スの１：１スラリーで，４℃で２時間インキュベートする。次にビーズをＰＢＳ
ＴＤＳ中で２回，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール）中で２回洗浄
する。
の２９３細胞をＰＢＳで洗浄し，氷上でホスファターゼ阻害剤を含む２ｍＬのＰ
ＢＳＴＤＳで可溶化する（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．２５，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５％デオキシコール酸，０．１
％ＳＤＳ，０．２％アジ化ナトリウム，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，４
ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム，１％アプロチニン，５μｇ／ｍＬロイペプチ
ン）。細胞断片を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分間，４℃）により除去し，
溶解物をプロテインＡセファロースの１：１スラリー５０μｌとともにそれぞれ
１時間２回インキュベートすることにより前精製する。０．５ｍＬの精製上清を
，１０μｌのプロテインＡ精製ホスファターゼ特異的抗血清（ＧＳＴ融合蛋白質
または抗ペプチド抗血清から生成）プラス５０μｌのプロテインＡ−セファロー
スの１：１スラリーで，４℃で２時間インキュベートする。次にビーズをＰＢＳ
ＴＤＳ中で２回，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール）中で２回洗浄
する。
【０３９８】
セファロースビーズ上の免疫精製ホスファターゼを２０μｌのＨＮＴＧ＋３０
ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ ＭｎＣｌ2，および２０μＣｉ［α32Ｐ］ＡＴＰ（
３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）中に再懸濁する。ホスファターゼ反応は室温で３０分
間実施し，５０ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＨＮＴＧを加えることにより停止させ
る。試料をＨＮＴＧ中で６回洗浄し，ＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸し，６％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーにより分析する。リン酸化
アミノ酸の分析は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した32Ｐ−標識バンドの標
準的２Ｄ法により行う。細菌で発現させたホスファターゼのＧＳＴ融合構築物に
ついても同様のアッセイを行う。
ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ ＭｎＣｌ2，および２０μＣｉ［α32Ｐ］ＡＴＰ（
３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）中に再懸濁する。ホスファターゼ反応は室温で３０分
間実施し，５０ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＨＮＴＧを加えることにより停止させ
る。試料をＨＮＴＧ中で６回洗浄し，ＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸し，６％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーにより分析する。リン酸化
アミノ酸の分析は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した32Ｐ−標識バンドの標
準的２Ｄ法により行う。細菌で発現させたホスファターゼのＧＳＴ融合構築物に
ついても同様のアッセイを行う。
【０３９９】実施例１０：サザンブロッティングによる遺伝子増幅の証明 材料および方法
ナイロン膜はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入する。変性溶
液は，０．４ＭＮａＯＨおよび０．６Ｍ ＮａＣｌを含む。中和溶液は，０．５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５および１．５ＭＮａＣｌを含む。ハイブリダイ
ゼーション溶液は，５０％ホルムアミド，６ＸＳＳＰＥ，２．５Ｘデンハルト溶
液，０．２ｍｇ／ｍＬ変性サケＤＮＡ，０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ，および
０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む。制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍから購入する。放射性標識プローブは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの
Ｐｒｉｍｅ−ｉｔＩＩキットを用いて調製する。プローブテンプレートに用いる
ベータアクチンＤＮＡフラグメントはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入する。
液は，０．４ＭＮａＯＨおよび０．６Ｍ ＮａＣｌを含む。中和溶液は，０．５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５および１．５ＭＮａＣｌを含む。ハイブリダイ
ゼーション溶液は，５０％ホルムアミド，６ＸＳＳＰＥ，２．５Ｘデンハルト溶
液，０．２ｍｇ／ｍＬ変性サケＤＮＡ，０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ，および
０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む。制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍから購入する。放射性標識プローブは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの
Ｐｒｉｍｅ−ｉｔＩＩキットを用いて調製する。プローブテンプレートに用いる
ベータアクチンＤＮＡフラグメントはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入する。
【０４００】
種々の腫瘍細胞株（例えば，ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，Ｃａｌｕ−６
，Ａ５４９，ＨＣＴ−１５，ＨＴ−２９，Ｃｏｌｏ２０５，ＬＳ−１８０，ＤＬ
Ｄ−１，ＨＣＴ−１１６，ＰＣ３，ＣＡＰＡＮ−２，ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，Ｐ
ＡＮＣ−１，ＡｓＰｃ−１，ＢｘＰＣ−３，ＯＶＣＡＲ−３，ＳＫＯＶ３，ＳＷ
６２６およびＰＡ−１），および２つの正常細胞株から，ゲノムＤＮＡを単離す
る。
，Ａ５４９，ＨＣＴ−１５，ＨＴ−２９，Ｃｏｌｏ２０５，ＬＳ−１８０，ＤＬ
Ｄ−１，ＨＣＴ−１１６，ＰＣ３，ＣＡＰＡＮ−２，ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，Ｐ
ＡＮＣ−１，ＡｓＰｃ−１，ＢｘＰＣ−３，ＯＶＣＡＲ−３，ＳＫＯＶ３，ＳＷ
６２６およびＰＡ−１），および２つの正常細胞株から，ゲノムＤＮＡを単離す
る。
【０４０１】
各ゲノムＤＮＡ試料の１０μｇのアリコートをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し，
別の１０μｇの試料をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化する。制限酵素消化したＤ
ＮＡ試料を０．７％アガロースゲルに負荷し，電気泳動分離した後，標準的方法
によりＤＮＡをナイロン膜にキャピラリー移動させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）。
別の１０μｇの試料をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化する。制限酵素消化したＤ
ＮＡ試料を０．７％アガロースゲルに負荷し，電気泳動分離した後，標準的方法
によりＤＮＡをナイロン膜にキャピラリー移動させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）。
【０４０２】実施例１１：ファージディスプレイによる蛋白質−蛋白質相互作用の検出 材料および方法
ファージディスプレイは，所望のおとりに対する親和性に基づいて分子相互作
用を単離する方法を提供する。ファージ被覆蛋白質への融合としてクローニング
されたｃＤＮＡフラグメントは，ファージの表面にディスプレイされる。おとり
と相互作用するファージをアフィニティー精製により濃縮し，個々のクローンか
らの挿入ＤＮＡを分析する。
用を単離する方法を提供する。ファージ被覆蛋白質への融合としてクローニング
されたｃＤＮＡフラグメントは，ファージの表面にディスプレイされる。おとり
と相互作用するファージをアフィニティー精製により濃縮し，個々のクローンか
らの挿入ＤＮＡを分析する。
【０４０３】Ｔ７ファージディスプレイライブラリ
すべてのライブラリは，Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−ｌｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ
）中で，製造元の指針にしたがって構築する。
）中で，製造元の指針にしたがって構築する。
【０４０４】おとりの提示
おとりとして用いるべき蛋白質ドメインは，ＧＳＴへのＣ末端融合体として作
成し，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。ペプチドは化学的に合成し，長鎖スペーサー
ビオチン試薬を用いてＮ末端でビオチン化する。
成し，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。ペプチドは化学的に合成し，長鎖スペーサー
ビオチン試薬を用いてＮ末端でビオチン化する。
【０４０５】選択
ＰａｎＭｉｘおよびＥ．ｃｏｌｉ阻害剤カクテル（ＳｉｇｍａＰ−８４６５）
を補充した，新たに調製したライブラリ（１０10−１０12ｐｆｕ）のアリコート
を，固定化したおとりとともに室温で１−２時間インキュベートする。未結合フ
ァージを洗浄緩衝液でよく洗浄する（少なくとも４回）。３−４ラウンドの選択
の後，結合したファージを１００μｌの１％ＳＤＳ中に溶出し，アガロースプレ
ートに播種して，単一プラークを得る。
を補充した，新たに調製したライブラリ（１０10−１０12ｐｆｕ）のアリコート
を，固定化したおとりとともに室温で１−２時間インキュベートする。未結合フ
ァージを洗浄緩衝液でよく洗浄する（少なくとも４回）。３−４ラウンドの選択
の後，結合したファージを１００μｌの１％ＳＤＳ中に溶出し，アガロースプレ
ートに播種して，単一プラークを得る。
【０４０６】挿入ＤＮＡの同定
個別のプラークを２５μｌの１０ｍＭＥＤＴＡ中に取り出し，７０℃で１０分
間加熱することによりファージを破壊する。２μｌの破壊ファージを５０μｌの
ＰＣＲ反応混合物に加える。３５ラウンドの熱サイクル（９４℃，５０秒間；５
０℃，１分間；７２℃，１分間）により挿入ＤＮＡを増幅する。
間加熱することによりファージを破壊する。２μｌの破壊ファージを５０μｌの
ＰＣＲ反応混合物に加える。３５ラウンドの熱サイクル（９４℃，５０秒間；５
０℃，１分間；７２℃，１分間）により挿入ＤＮＡを増幅する。
【０４０７】緩衝液の組成
１０ｘＰａｎＭｉｘ
５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１０％無脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）
１０ｍＭＥＧＴＡ
２５０ｍＭＮａＦ
２５０μｇ／ｍＬヘパリン（ｓｉｇｍａ）
２５０μｇ／ｍＬ，剪断し，沸騰させたサケ精子ＤＮＡ（ｓｉｇｍａ）
０．０５％アジ化ナトリウム
ＰＢＳ中で調製する。
【０４０８】洗浄緩衝液
ＰＢＳ，以下のもので補充：
０．５％ＮＰ−４０
２５μｇ／ｍＬヘパリン
ＰＣＲ反応混合物
１．０ｍＬ １０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，１５ｍＭＭｇを
含む） 各０．２ｍＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ保存液） ０．１ｍＬ Ｔ７ＵＰプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴ
ＡＴＴＣＣＡＧＴＣ ０．１ｍＬ Ｔ７ＤＮプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧ
ＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧ ０．２ｍＬ ２５ｍＭＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４，ＥＤＴＡ補償用 蒸留水で１０ｍＬとする 反応液５０μｌあたり１ユニットのＴａｑポリメラーゼを加える ライブラリ：Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−Ｈ４４１
含む） 各０．２ｍＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ保存液） ０．１ｍＬ Ｔ７ＵＰプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴ
ＡＴＴＣＣＡＧＴＣ ０．１ｍＬ Ｔ７ＤＮプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧ
ＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧ ０．２ｍＬ ２５ｍＭＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４，ＥＤＴＡ補償用 蒸留水で１０ｍＬとする 反応液５０μｌあたり１ユニットのＴａｑポリメラーゼを加える ライブラリ：Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−Ｈ４４１
【０４０９】化合物の評価
所定の任意の一連の化合物について，生物学的活性のスペクトルを観察するこ
とができることが理解されるであろう。１つの好ましい態様においては，本発明
は，細胞シグナル伝達に関連する蛋白質酵素，好ましくは蛋白質ホスファターゼ
，最も好ましくは蛋白質チロシンホスファターゼを調節する能力を示す化合物に
関する。以下に記載されるアッセイを用いて，最適な程度の所望の活性を示す化
合物を選択する。
とができることが理解されるであろう。１つの好ましい態様においては，本発明
は，細胞シグナル伝達に関連する蛋白質酵素，好ましくは蛋白質ホスファターゼ
，最も好ましくは蛋白質チロシンホスファターゼを調節する能力を示す化合物に
関する。以下に記載されるアッセイを用いて，最適な程度の所望の活性を示す化
合物を選択する。
【０４１０】
本明細書において用いる場合，"最適な程度の所望の活性"との語句は，疾患に
罹患している動物またはヒト患者に治療上有効量の本発明の化合物を可能な最低
の投与量で与えるような，細胞シグナル伝達を媒介し特定の疾患と関連する蛋白
質酵素に対する最高の治療指数（上で定義）を表す。
罹患している動物またはヒト患者に治療上有効量の本発明の化合物を可能な最低
の投与量で与えるような，細胞シグナル伝達を媒介し特定の疾患と関連する蛋白
質酵素に対する最高の治療指数（上で定義）を表す。
【０４１１】阻害的活性を決定するためのアッセイ
当該技術分野において知られる種々の方法を用いて，本発明の化合物による蛋
白質酵素，特に蛋白質ホスファターゼの活性の阻害を同定，評価またはアッセイ
することができる。例えば，限定されないが，ホスファターゼに関しては，その
ようなアッセイは，培養標的細胞を化合物に暴露し，（ａ）細胞溶解物を生化学
的に分析して，リン酸化された蛋白質のレベルおよび／または種類を評価する；
または（ｂ）試験物質に暴露されていない対照細胞と比較して，処理細胞におけ
る発現型のまたは機能的変化を評点することを含む。
白質酵素，特に蛋白質ホスファターゼの活性の阻害を同定，評価またはアッセイ
することができる。例えば，限定されないが，ホスファターゼに関しては，その
ようなアッセイは，培養標的細胞を化合物に暴露し，（ａ）細胞溶解物を生化学
的に分析して，リン酸化された蛋白質のレベルおよび／または種類を評価する；
または（ｂ）試験物質に暴露されていない対照細胞と比較して，処理細胞におけ
る発現型のまたは機能的変化を評点することを含む。
【０４１２】
シグナル伝達レセプターの天然のリガンドの模倣体を同定または評価する際に
は，細胞を本発明の化合物に暴露し，天然のリガンドにのみ暴露された正対照，
および化合物にも天然のリガンドにも暴露されていない負対照と比較する。天然
のリガンドの非存在下で基底レベルでリン酸化されることが知られているレセプ
ター，例えばインスリンレセプターについては，アッセイはリガンドの非存在下
で行うことができる。リガンド誘導性シグナル伝達の阻害剤または促進剤を同定
または評価する際には，細胞を天然のリガンドの存在下で本発明の化合物に暴露
し，本発明の化合物に暴露されていない対照と比較する。
は，細胞を本発明の化合物に暴露し，天然のリガンドにのみ暴露された正対照，
および化合物にも天然のリガンドにも暴露されていない負対照と比較する。天然
のリガンドの非存在下で基底レベルでリン酸化されることが知られているレセプ
ター，例えばインスリンレセプターについては，アッセイはリガンドの非存在下
で行うことができる。リガンド誘導性シグナル伝達の阻害剤または促進剤を同定
または評価する際には，細胞を天然のリガンドの存在下で本発明の化合物に暴露
し，本発明の化合物に暴露されていない対照と比較する。
【０４１３】
以下に記載されるアッセイは，本発明の化合物がホスファターゼ活性を阻害す
る能力を評価する一次スクリーニングとして用いることができる。また，アッセ
イを用いて，ある範囲の濃度，例えば１００μＭ−１ｐＭの範囲を試験し，リン
酸化またはシグナル伝達の量が対照と比較して５０％減少するか増加する濃度（
ＩＣ50）を計算することにより，化合物の相対的効力を評価することができる。
る能力を評価する一次スクリーニングとして用いることができる。また，アッセ
イを用いて，ある範囲の濃度，例えば１００μＭ−１ｐＭの範囲を試験し，リン
酸化またはシグナル伝達の量が対照と比較して５０％減少するか増加する濃度（
ＩＣ50）を計算することにより，化合物の相対的効力を評価することができる。
【０４１４】生化学的アッセイ
１つの態様においては，シグナル伝達の間にチロシン残基においてリン酸化ま
たは脱リン酸化される基質分子を有する標的細胞を本発明の化合物および放射性
標識したリン酸に暴露し，その後，これを溶解して目的とする基質を含む細胞内
容物を放出させる。基質は，ドデシルリン酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）技術を一次元または二次元で用いて細胞溶解物の
蛋白質成分を分離し，Ｘ線フィルムに暴露してリン酸化された蛋白質の存在を検
出することにより分析することができる。放射性標識を用いない同様の手法にお
いては，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した蛋白質成分をニトロセルロース膜に移
し，抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）抗体を用いてｐＴｙｒの存在を検出する。
あるいは，細胞溶解物を固体支持体に結合した基質特異的結合抗体とともにイン
キュベートすることにより目的とする基質を最初に単離し，次に非結合細胞成分
を洗い流し，抗ｐＴｙｒ抗体により固体支持体上のｐＴｙｒの存在または非存在
を評価することが好ましい。この好ましい方法は，自動化ロボットシステムによ
りマイクロタイタープレートフォーマットで容易に行うことができ，このことに
より，大量の試料を適当な短い時間枠で試験することができる。
たは脱リン酸化される基質分子を有する標的細胞を本発明の化合物および放射性
標識したリン酸に暴露し，その後，これを溶解して目的とする基質を含む細胞内
容物を放出させる。基質は，ドデシルリン酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）技術を一次元または二次元で用いて細胞溶解物の
蛋白質成分を分離し，Ｘ線フィルムに暴露してリン酸化された蛋白質の存在を検
出することにより分析することができる。放射性標識を用いない同様の手法にお
いては，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した蛋白質成分をニトロセルロース膜に移
し，抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）抗体を用いてｐＴｙｒの存在を検出する。
あるいは，細胞溶解物を固体支持体に結合した基質特異的結合抗体とともにイン
キュベートすることにより目的とする基質を最初に単離し，次に非結合細胞成分
を洗い流し，抗ｐＴｙｒ抗体により固体支持体上のｐＴｙｒの存在または非存在
を評価することが好ましい。この好ましい方法は，自動化ロボットシステムによ
りマイクロタイタープレートフォーマットで容易に行うことができ，このことに
より，大量の試料を適当な短い時間枠で試験することができる。
【０４１５】
抗ｐＴｙｒ抗体は，放射性物質で標識することにより検出することができ，こ
れはオートラジオグラフィーによるその検出を容易にする。あるいは，抗ｐＴｙ
ｒ抗体を酵素，例えば西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化させ，次
にその酵素の適当な基質を加えることにより検出する。基質の選択は当業者には
明らかである。さらに別の方法は，ｐＴｙｒ抗体を認識する二次抗体と反応させ
ることにより抗ｐＴｙｒ抗体を検出することを含む。この二次抗体は，放射性物
質または先に記載した酵素で標識する。当該技術分野において知られる，抗体を
検出する他の任意の方法を用いることができる。
れはオートラジオグラフィーによるその検出を容易にする。あるいは，抗ｐＴｙ
ｒ抗体を酵素，例えば西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化させ，次
にその酵素の適当な基質を加えることにより検出する。基質の選択は当業者には
明らかである。さらに別の方法は，ｐＴｙｒ抗体を認識する二次抗体と反応させ
ることにより抗ｐＴｙｒ抗体を検出することを含む。この二次抗体は，放射性物
質または先に記載した酵素で標識する。当該技術分野において知られる，抗体を
検出する他の任意の方法を用いることができる。
【０４１６】
上述の方法はまた，シグナル伝達基質分子を含む細胞溶解物およびホスファタ
ーゼが本発明の化合物およびキナーゼと混合されている無細胞系において用いる
こともできる。基質は，アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加えてキナーゼ反応を
開始することによりリン酸化される。化合物の活性を評価するためには，反応混
合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法により分析することができ，またはこれを固体支持
体に結合した基質−特異的結合抗体に加えて，分離されたまたは捕捉された基質
について上述した検出方法を実施して，ｐＴｙｒの存在または非存在を評価する
ことができる。結果を化合物を加えない反応混合物から得られた結果と比較する
。無細胞系には，天然のリガンドまたはその種類についての知識は必要ではない
。例えば，Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ．ａｌ，（米国特許５，１５５，０３１）は，基
質としてインスリンレセプターを，標的細胞としてラット脂肪細胞を用いて，過
バナジン酸がＰＴＰ活性を阻害する能力を示すことを記載する。Ｂｕｒｋｅ ｅ
ｔ．ａｌ．（１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
，２０４：１２９−１３４）は，自己リン酸化インスリンレセプターおよび組換
えＰＴＰ１Ｂを用いてホスホチロシル模倣体の阻害的活性を評価することを記載
する。
ーゼが本発明の化合物およびキナーゼと混合されている無細胞系において用いる
こともできる。基質は，アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加えてキナーゼ反応を
開始することによりリン酸化される。化合物の活性を評価するためには，反応混
合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法により分析することができ，またはこれを固体支持
体に結合した基質−特異的結合抗体に加えて，分離されたまたは捕捉された基質
について上述した検出方法を実施して，ｐＴｙｒの存在または非存在を評価する
ことができる。結果を化合物を加えない反応混合物から得られた結果と比較する
。無細胞系には，天然のリガンドまたはその種類についての知識は必要ではない
。例えば，Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ．ａｌ，（米国特許５，１５５，０３１）は，基
質としてインスリンレセプターを，標的細胞としてラット脂肪細胞を用いて，過
バナジン酸がＰＴＰ活性を阻害する能力を示すことを記載する。Ｂｕｒｋｅ ｅ
ｔ．ａｌ．（１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
，２０４：１２９−１３４）は，自己リン酸化インスリンレセプターおよび組換
えＰＴＰ１Ｂを用いてホスホチロシル模倣体の阻害的活性を評価することを記載
する。
【０４１７】
基質蛋白質のリン酸化または脱リン酸化を測定することに加えて，第２のメッ
センジャーの産生の活性化または調節，細胞のイオンレベルの変化，シグナリン
グ分子の会合，解離または移動，遺伝子または特異的遺伝子の転写または翻訳の
誘導をモニターすることができる。これらの生化学的アッセイは，これらの目的
のために開発された慣用の手法を用いて行うことができる。
センジャーの産生の活性化または調節，細胞のイオンレベルの変化，シグナリン
グ分子の会合，解離または移動，遺伝子または特異的遺伝子の転写または翻訳の
誘導をモニターすることができる。これらの生化学的アッセイは，これらの目的
のために開発された慣用の手法を用いて行うことができる。
【０４１８】生物学的アッセイ
本発明の化合物がシグナル伝達を制御するＰＴＰの活性を調節する能力はまた
，リガンド結合に関連する形態学的または機能的変化を評点することにより測定
することができる。当該技術分野において知られる任意の定性的または定量的手
法を適用して，シグナリング経路においてホスファターゼの制御下にある細胞プ
ロセスを観察および測定することができる。そのような細胞プロセスには，限定
されないが，同化および異化プロセス，細胞増殖，細胞分化，細胞接着，細胞移
動および細胞死が含まれる。
，リガンド結合に関連する形態学的または機能的変化を評点することにより測定
することができる。当該技術分野において知られる任意の定性的または定量的手
法を適用して，シグナリング経路においてホスファターゼの制御下にある細胞プ
ロセスを観察および測定することができる。そのような細胞プロセスには，限定
されないが，同化および異化プロセス，細胞増殖，細胞分化，細胞接着，細胞移
動および細胞死が含まれる。
【０４１９】
バナジン酸のホスファターゼ阻害剤としての種々の生物学的効果を研究するた
めに用いられてきた手法を，本発明の化合物について用いるために適合させるこ
とができる。例えば，バナジン酸は，ラット脂肪細胞においてグルコースおよび
グルコース類似体のインスリン感受性促進性輸送システムを活性化することが示
されている（Ｄｕｂｙａｋ ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２５６：５３０６−５３１２）。本発明の化合物の活性は，化合物に暴露し
たラット脂肪細胞におけるグルコース類似体，例えば２−デオキシ−3Ｈ−グル
コースの輸送の速度の増加を測定することにより評価することができる。バナジ
ン酸はまた，インスリンがラット脂肪細胞におけるグルコース酸化に及ぼす影響
を模倣する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８
４：５５６−５５８）。本発明の化合物は，14Ｃ−グルコースの14ＣＯ2への変
換を測定することにより，グルコース酸化の刺激について試験することができる
。さらに，ナトリウムオルトバナジン酸がエリスロポエチン媒介性細胞増殖に及
ぼす影響は，ＤＮＡ合成の間のトリチル化チミジンの取り込みにより評価して，
ＤＮＡ含量に基づく細胞サイクル分析により評価されている（Ｓｐｉｖａｋ ｅ
ｔ．ａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：５００−５０４）。
同様に，細胞増殖において役割を果たすホスファターゼに対する本発明の化合物
の活性は，細胞サイクル分析により評価することができる。
めに用いられてきた手法を，本発明の化合物について用いるために適合させるこ
とができる。例えば，バナジン酸は，ラット脂肪細胞においてグルコースおよび
グルコース類似体のインスリン感受性促進性輸送システムを活性化することが示
されている（Ｄｕｂｙａｋ ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２５６：５３０６−５３１２）。本発明の化合物の活性は，化合物に暴露し
たラット脂肪細胞におけるグルコース類似体，例えば２−デオキシ−3Ｈ−グル
コースの輸送の速度の増加を測定することにより評価することができる。バナジ
ン酸はまた，インスリンがラット脂肪細胞におけるグルコース酸化に及ぼす影響
を模倣する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８
４：５５６−５５８）。本発明の化合物は，14Ｃ−グルコースの14ＣＯ2への変
換を測定することにより，グルコース酸化の刺激について試験することができる
。さらに，ナトリウムオルトバナジン酸がエリスロポエチン媒介性細胞増殖に及
ぼす影響は，ＤＮＡ合成の間のトリチル化チミジンの取り込みにより評価して，
ＤＮＡ含量に基づく細胞サイクル分析により評価されている（Ｓｐｉｖａｋ ｅ
ｔ．ａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：５００−５０４）。
同様に，細胞増殖において役割を果たすホスファターゼに対する本発明の化合物
の活性は，細胞サイクル分析により評価することができる。
【０４２０】
本発明の化合物の活性はまた，シグナル伝達の機能不全により引き起こされる
かこれに関連する疾患の実験モデルを用いて動物において評価することができる
。例えば，本発明の化合物の活性は，非肥満性糖尿病マウス（Ｌｕｎｄ ｅｔ．
ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：７２７−７２９），ＢＢＷｉｓｔａ
ｒラットおよびストレプトゾトシン誘導性糖尿病ラット（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ
．ａｌ．，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９７：３７２−３７６）
において，インスリンレセプターシグナル伝達に及ぼす化合物の影響について試
験することができる。ホスファターゼはシグナル伝達の機能不全において重要な
役割を果たし，細胞トランスフォーメーションにつながりうるため，化合物の活
性は，動物発癌性実験において評価することもできる。例えば，オカダイン酸（
ホスファターゼ阻害剤）は，マウス皮膚において腫瘍形成を促進することが示さ
れている（Ｓｕｇａｎｕｍａ ｅｔ．ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：１７６８−１７７１）。
かこれに関連する疾患の実験モデルを用いて動物において評価することができる
。例えば，本発明の化合物の活性は，非肥満性糖尿病マウス（Ｌｕｎｄ ｅｔ．
ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：７２７−７２９），ＢＢＷｉｓｔａ
ｒラットおよびストレプトゾトシン誘導性糖尿病ラット（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ
．ａｌ．，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９７：３７２−３７６）
において，インスリンレセプターシグナル伝達に及ぼす化合物の影響について試
験することができる。ホスファターゼはシグナル伝達の機能不全において重要な
役割を果たし，細胞トランスフォーメーションにつながりうるため，化合物の活
性は，動物発癌性実験において評価することもできる。例えば，オカダイン酸（
ホスファターゼ阻害剤）は，マウス皮膚において腫瘍形成を促進することが示さ
れている（Ｓｕｇａｎｕｍａ ｅｔ．ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：１７６８−１７７１）。
【０４２１】
これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて，ヒト
において用いるためのある範囲の投与量を処方することができる。本発明の化合
物の投与量は，毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内でなければなら
ない。投与量は，用いられる投与量の形態および投与経路に依存して，この範囲
内で様々でありうる。
において用いるためのある範囲の投与量を処方することができる。本発明の化合
物の投与量は，毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内でなければなら
ない。投与量は，用いられる投与量の形態および投与経路に依存して，この範囲
内で様々でありうる。
【０４２２】ホスホチロシン酵素結合イムノソルベントアッセイ
このアッセイを用いて，本発明の化合物がインスリンレセプター（ＩＲ）上の
ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）残基の脱リン酸化を阻害する能力を試験することが
できる。当業者は，異なる標的細胞および結合抗体を用いることにより，他の基
質分子，例えば血小板由来成長因子レセプターをこのアッセイにおいて用いるこ
とができることを認識するであろう。アッセイにおいて異なる基質分子を用いる
ことにより，異なる蛋白質チロシン酵素に対する本発明の化合物の活性を評価す
ることができる。ＩＲの場合，内因性キナーゼ活性はインスリン結合がない場合
であっても低いレベルで活性がある。したがって，ＩＲのリン酸化を刺激するた
めにはインスリンは必要ではない。すなわち，化合物に暴露した後，細胞溶解物
を調製し，抗インスリンレセプター抗体で被覆したマイクロタイタープレートに
加えることができる。抗ｐＴｙｒ抗体および酵素結合二次抗体を用いて捕捉され
たインスリンレセプターのリン酸化のレベルを検出する。
ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）残基の脱リン酸化を阻害する能力を試験することが
できる。当業者は，異なる標的細胞および結合抗体を用いることにより，他の基
質分子，例えば血小板由来成長因子レセプターをこのアッセイにおいて用いるこ
とができることを認識するであろう。アッセイにおいて異なる基質分子を用いる
ことにより，異なる蛋白質チロシン酵素に対する本発明の化合物の活性を評価す
ることができる。ＩＲの場合，内因性キナーゼ活性はインスリン結合がない場合
であっても低いレベルで活性がある。したがって，ＩＲのリン酸化を刺激するた
めにはインスリンは必要ではない。すなわち，化合物に暴露した後，細胞溶解物
を調製し，抗インスリンレセプター抗体で被覆したマイクロタイタープレートに
加えることができる。抗ｐＴｙｒ抗体および酵素結合二次抗体を用いて捕捉され
たインスリンレセプターのリン酸化のレベルを検出する。
【０４２３】化合物−ＰＴＰのＩＣ５０を決定するためのアッセイ方法
本発明の種々の化合物の活性のレベルおよび１またはそれ以上のＰＴＰに及ぼ
す影響を決定するためには，以下のインビトロアッセイ方法が好ましい。当該技
術分野においてよく知られる手法を用いて，任意のＰＴＰについて同様のアッセ
イを設計することができる。
す影響を決定するためには，以下のインビトロアッセイ方法が好ましい。当該技
術分野においてよく知られる手法を用いて，任意のＰＴＰについて同様のアッセ
イを設計することができる。
【０４２４】
本明細書に記載される触媒的アッセイは，９６−ウエルフォーマットで行う。
一般的方法は，最初に，広範囲の緩衝液ｐＨにわたってイオン強度の変動を最少
にした３成分緩衝液系を用いて，ＰＴＰの最適ｐＨを決定する。次に，各特異的
基質−ＰＴＰ系についてミカエリス−メンテン定数，すなわちＫｍを決定する。
次にこのＫｍ値を化合物スクリーニングの基質反応濃度として用いる。最後に，
試験ＰＴＰを種々の濃度の化合物に１５分間暴露し，基質と１０分間反応させる
。結果はパーセント阻害対化合物濃度としてプロットし，プロットの内挿からＩ
Ｃ50を求める。
一般的方法は，最初に，広範囲の緩衝液ｐＨにわたってイオン強度の変動を最少
にした３成分緩衝液系を用いて，ＰＴＰの最適ｐＨを決定する。次に，各特異的
基質−ＰＴＰ系についてミカエリス−メンテン定数，すなわちＫｍを決定する。
次にこのＫｍ値を化合物スクリーニングの基質反応濃度として用いる。最後に，
試験ＰＴＰを種々の濃度の化合物に１５分間暴露し，基質と１０分間反応させる
。結果はパーセント阻害対化合物濃度としてプロットし，プロットの内挿からＩ
Ｃ50を求める。
【０４２５】
以下の材料および試薬を用いた。
１．特に示さない限り，アッセイ緩衝液をすべてのアッセイ溶液の溶媒として用
いた。 成分 濃度 アセテート（Ｆｉｓｈｅｒ １００ｍＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ３８，５００） ビス−ｔｒｉｓ（ＳｉｇｍａＢ−７５３５） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｆｉｓｈｅｒ ５０ｍＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１５２−５） グリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ １０％（ｖ／ｖ） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ２２９−１） ＊ＤＴＴ使用直前に１ｍＭを加える ２．９６ウエルイージーウォッシュプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３６９） ３．ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ ７３８−３７９） ４．フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ Ｆ−２９９９） ５．０．２２μねじ蓋濾過システム５００ｍｌ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳＣＧＰＵ
０５ＲＥ） ６．１０Ｎ ＮａＯＨ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＳ２５５−１
） ７．１０Ｎ ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１４４−５００
） ８．化合物は，ＤＭＳＯ（ＳｉｇｍａＤ−５８７９）に５または１０ｍＭ濃度で
溶解し，小さいアリコートで−２０℃で保存した。
いた。 成分 濃度 アセテート（Ｆｉｓｈｅｒ １００ｍＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ３８，５００） ビス−ｔｒｉｓ（ＳｉｇｍａＢ−７５３５） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｆｉｓｈｅｒ ５０ｍＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１５２−５） グリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ １０％（ｖ／ｖ） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ２２９−１） ＊ＤＴＴ使用直前に１ｍＭを加える ２．９６ウエルイージーウォッシュプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３６９） ３．ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ ７３８−３７９） ４．フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ Ｆ−２９９９） ５．０．２２μねじ蓋濾過システム５００ｍｌ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳＣＧＰＵ
０５ＲＥ） ６．１０Ｎ ＮａＯＨ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＳ２５５−１
） ７．１０Ｎ ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１４４−５００
） ８．化合物は，ＤＭＳＯ（ＳｉｇｍａＤ−５８７９）に５または１０ｍＭ濃度で
溶解し，小さいアリコートで−２０℃で保存した。
【０４２６】方法
すべてのアッセイは，ｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として用いて行う。用いた
各ＰＴＰについて最適ｐＨを決定する。
各ＰＴＰについて最適ｐＨを決定する。
【０４２７】ＰＴＰアッセイ
ＰＴＰａｓｅ活性は，適当な濃度のｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として含む１
００μｌの反応混合物中で２５℃でアッセイする。反応は，ＰＴＰを加えること
により開始し，１０分後に５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えることにより停止す
る。基質の非酵素的加水分解は，酵素を加えない対照を測定することにより補正
する。生成したｐ−ニトロフェノールの量は，４１０ｎｍの吸収から決定する。
速度論的パラメータＫｍを決定するためには，種々の基質濃度で初速度を測定し
，データをミカエリス等式 速度＝（Ｖｍａｘ×［Ｓ］）／（Ｋｍ＋［Ｓ］） ［Ｓ］＝基質反応濃度 に適合させる。
００μｌの反応混合物中で２５℃でアッセイする。反応は，ＰＴＰを加えること
により開始し，１０分後に５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えることにより停止す
る。基質の非酵素的加水分解は，酵素を加えない対照を測定することにより補正
する。生成したｐ−ニトロフェノールの量は，４１０ｎｍの吸収から決定する。
速度論的パラメータＫｍを決定するためには，種々の基質濃度で初速度を測定し
，データをミカエリス等式 速度＝（Ｖｍａｘ×［Ｓ］）／（Ｋｍ＋［Ｓ］） ［Ｓ］＝基質反応濃度 に適合させる。
【０４２８】阻害実験
化合物がＰＴＰに及ぼす影響は，２５℃でｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として
用いて評価する。ＰＴＰを種々の濃度の化合物とともに１５分間プレインキュベ
ートする。次に基質を固定濃度（通常は先に計算されたＫｍと等しい）で加える
。１０分後，ＮａＯＨを加えて反応を停止する。ｐＮＰＰの加水分解は，Ｂｉｏ
ｔｅｋ Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ２００マイクロプレートスキャニング分光光度計
で４１０ｎｍで追跡する。パーセント阻害は，以下のように計算する： パーセント阻害＝［（対照シグナル−化合物シグナル）／対照シグナル］
ｘ１００％ 次に，パーセント阻害対化合物濃度のプロットを内挿することによりＩＣ５０を
決定する。
用いて評価する。ＰＴＰを種々の濃度の化合物とともに１５分間プレインキュベ
ートする。次に基質を固定濃度（通常は先に計算されたＫｍと等しい）で加える
。１０分後，ＮａＯＨを加えて反応を停止する。ｐＮＰＰの加水分解は，Ｂｉｏ
ｔｅｋ Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ２００マイクロプレートスキャニング分光光度計
で４１０ｎｍで追跡する。パーセント阻害は，以下のように計算する： パーセント阻害＝［（対照シグナル−化合物シグナル）／対照シグナル］
ｘ１００％ 次に，パーセント阻害対化合物濃度のプロットを内挿することによりＩＣ５０を
決定する。
【０４２９】
細菌ＧＳＴ−ＰＴＰ融合蛋白質発現のために設計したプラスミドは，ＰＣＲ生
成ヒトＰＴＰフラグメントをｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）中に挿入することにより作成する。次に，これらの構築物のいくつかを
用いて，Ｓｆ−９昆虫細胞における発現用にホスファターゼをｐＦａｓｔＢａｃ
−１中にサブクローニングする。ＰＴＰ遺伝子の最初の増幅に用いたオリゴヌク
レオチドは以下に示される。ｃＤＮＡｓは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したＲＮ
Ａで，Ｇｉｌｂｏ ＢＲＬ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプレ増幅システムを用いて
調製する。
成ヒトＰＴＰフラグメントをｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）中に挿入することにより作成する。次に，これらの構築物のいくつかを
用いて，Ｓｆ−９昆虫細胞における発現用にホスファターゼをｐＦａｓｔＢａｃ
−１中にサブクローニングする。ＰＴＰ遺伝子の最初の増幅に用いたオリゴヌク
レオチドは以下に示される。ｃＤＮＡｓは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したＲＮ
Ａで，Ｇｉｌｂｏ ＢＲＬ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプレ増幅システムを用いて
調製する。
【０４３０】結論
当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明
の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して
種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明
の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して
種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
【０４３１】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。
【０４３２】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発
明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更およ
び変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される
本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発
明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更およ
び変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される
本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０４３３】
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０４３４】
遺伝コードの縮重の観点から，核酸の他の組み合わせもまた本明細書のペプチ
ドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つ
の核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸
について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは
平均で３100，すなわち５ｘ１０47種類の核酸配列によりコードされるであろう
。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第１
の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核酸
配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチド
および蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒトに
おいて好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように，
本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更し
ない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのようなポ
リペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選択
することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，ア
ミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を与
えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする対
応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与え
ずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合蛋
白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプチ
ドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。ポ
リペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の実
験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意な
活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸および
／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
ドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つ
の核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸
について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは
平均で３100，すなわち５ｘ１０47種類の核酸配列によりコードされるであろう
。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第１
の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核酸
配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチド
および蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒトに
おいて好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように，
本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更し
ない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのようなポ
リペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選択
することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，ア
ミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を与
えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする対
応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与え
ずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合蛋
白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプチ
ドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。ポ
リペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の実
験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意な
活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸および
／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
【０４３５】
本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に
含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成
する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，
属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一
般的記載が含まれる。
含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成
する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，
属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一
般的記載が含まれる。
【０４３６】
他の態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】 図１は，ヒト蛋白質ホスファターゼのヌクレオチド配列を示す。
【図２】 図２は，配列番号１−配列番号５によりコードされるヒト蛋白質
ホスファターゼのアミノ酸配列を示す。
ホスファターゼのアミノ酸配列を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/12 ４Ｃ０８４
9/12 11/02 ４Ｈ０４５
11/02 11/06
11/06 17/06
17/06 19/02
19/02 25/00
25/00 25/02
25/02 25/04
25/04 25/06
25/06 25/18
25/18 25/28
25/28 29/00
29/00 １０１
１０１ 35/00
35/00 37/00
37/00 Ｃ０７Ｋ 16/40
Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 9/16 Ｂ
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02
9/16 1/42
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ
1/42 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
1/68 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ
33/50 33/566
33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/566 5/00 Ａ
Ｂ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＣ，ＥＥ
，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，
ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ
Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ
，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ
，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 プラウマン，グレゴリー・ディー
アメリカ合衆国 94070 カリフォルニア
州 サン カルロス，ワインディング ウ
ェイ 35
(72)発明者 ホワイト，デイビッド
アメリカ合衆国 94002 カリフォルニア
州 ベルモント，バークレイ ウェイ
2623
(72)発明者 シュダーサナム，スーチャ
アメリカ合衆国 94904 カリフォルニア
州 グリーンブレー，コルテ パレンシオ
20
(72)発明者 マニング，ジェラルド
アメリカ合衆国 94025 カリフォルニア
州 メンロ パーク，フレモント ストリ
ート 844，♯４
(72)発明者 ケーネピール，ショーン
アメリカ合衆国 94610 カリフォルニア
州 オークランド， オレンジ ストリー
ト 447，＃22
(72)発明者 マルティネス，リカルド
アメリカ合衆国 94404 カリフォルニア
州 フォスター シティ，カルティエ レ
ーン 984
(72)発明者 ヒル， ロナルド・ジェイ
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 バー
リンゲイム オーク グローブ アヴェニ
ュー 532
(72)発明者 フラナガン，ピーター
アメリカ合衆国 94110 カリフォルニア
州 サンフランシスコ， リバティー ス
トリート 192
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB03 BB20 CB01
DA12 DA13 DA14 DA20 DA36
DA77 FB01 FB02
4B024 AA01 AA11 BA11 BA43 CA04
CA11 DA02 DA05 DA11 EA02
EA03 EA04 FA02 GA01 GA11
HA01 HA03 HA12
4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03
4B063 QA01 QA08 QA17 QQ05 QQ13
QQ33 QQ42 QQ52 QR08 QR13
QR33 QR42 QR55 QR57 QR59
QR62 QR74 QR80 QS05 QS25
QS34 QS36 QX02
4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y
AB01 AB02 BA01 BA08 CA25
CA31 CA44 CA46
4C084 AA17 NA14 ZA02 ZA08 ZA15
ZA18 ZA20 ZA22 ZA34 ZA36
ZA42 ZA43 ZA45 ZA59 ZA68
ZA81 ZA89 ZA96 ZB05 ZB08
ZB11 ZB15 ZB26
4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40
DA76 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (32)
- 【請求項１】 ホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃
縮された，または精製された核酸分子であって，前記核酸分子は， （ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズ
し，かつホスファターゼポリペプチドをコードする； （ｄ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするが，ただし，前記ポリペプチドは，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末
端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プ
ロリンリッチ領域，スペーサー領域およびＣ末端テールの全部ではないが１また
はそれ以上を欠失しており；または （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である， のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。 - 【請求項２】 宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまた
はプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項３】 前記核酸分子が，哺乳動物から単離された，濃縮された，ま
たは精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項４】 前記哺乳動物がヒトである，請求項３記載の核酸分子。
- 【請求項５】 ストリンジェントな条件下で配列番号６，配列番号７，配列
番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群
より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸を含む，
請求項１記載の核酸分子。 - 【請求項６】 単離され，濃縮され，または精製されたホスファターゼポリ
ペプチドであって， （ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載される配列からなる群より選択される配列と少なくとも約９０％同一であ
るアミノ酸配列；または （ｂ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって，ただし，ポ
リペプチドは、Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ド
メイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域および
Ｃ末端テイルからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ
以上を欠失しているアミノ酸配列， を含むポリペプチド。 - 【請求項７】 前記ポリペプチドが，哺乳動物から単離され，精製され，ま
たは濃縮されたものである，請求項６記載のホスファターゼポリペプチド。 - 【請求項８】 前記哺乳動物がヒトである，請求項７記載のホスファターゼ
ポリペプチド。 - 【請求項９】 ホスファターゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドのドメ
インに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントであって，
前記ポリペプチドは，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，およ
び配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配
列を含むことを特徴とする抗体または抗体フラグメント。 - 【請求項１０】 請求項９記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 【請求項１１】 請求項６記載のポリペプチドに結合する抗体および負対照
抗体を含むキット。 - 【請求項１２】 ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定
する方法であって， （ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と実質的に同
一のホスファターゼポリペプチドを試験物質と接触させ； （ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして （ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する， の各工程を含む方法。 - 【請求項１３】 細胞においてホスファターゼポリペプチドの活性を調節す
る物質を同定する方法であって， （ａ）配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０
に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と実質的に同
一の配列を有するホスファターゼポリペプチドを発現させ； （ｂ）前記細胞に試験物質を加え；そして （ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互
作用の変化をモニターする， の各工程を含む方法。 - 【請求項１４】 治療を必要とする患者に，配列番号６，配列番号７，配列
番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列からなる群
より選択されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼの活性を調節する
物質を投与することにより疾病または疾患を治療する方法。 - 【請求項１５】 前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心
臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，代謝性疾患および炎症性疾患からな
る群より選択される，請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 前記疾病または疾患が，組織の癌；血液または造血細胞起
源の癌；乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌から
なる群より選択される，請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 前記疾病または疾患が，中枢神経系または末梢神経系疾病
，片頭痛；痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高
血圧症；精神病性疾患；神経性疾患および運動異常症からなる群より選択される
，請求項１５記載の方法。 - 【請求項１８】 前記疾病または疾患が，炎症性疾患，例えば慢性関節リウ
マチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性
関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶
からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。 - 【請求項１９】 前記物質がインビトロでホスファターゼ活性を調節する，
請求項１５記載の方法。 - 【請求項２０】 前記物質がホスファターゼ阻害剤である，請求項１９記載
の方法。 - 【請求項２１】 疾病または疾患の診断道具として試料中においてホスファ
ターゼポリペプチドを検出する方法であって， （ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で配列番号６，配列
番号７，配列番号８，配列番号９，および配列番号１０に記載されるアミノ酸配
列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチド
の核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは
，核酸配列，そのフラグメント，または前記配列およびフラグメントの相補体を
含み；そして （ｂ）標的領域：プローブハイブリッドの存在または量を前記疾病または疾患の
指標として検出する， の各工程を含む方法。 - 【請求項２２】 前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心
臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，代謝性疾患および炎症性疾患からな
る群より選択される，請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 前記疾病または疾患が，組織の癌；血液または造血細胞起
源の癌；乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌から
なる群より選択される，請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 前記疾病または疾患が，中枢神経系または末梢神経系疾病
，片頭痛，痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高
血圧症；精神病性疾患；神経性疾患；および運動異常症からなる群より選択され
る，請求項２２記載の方法。 - 【請求項２５】 前記疾病または疾患が，炎症性疾患，例えば慢性関節リウ
マチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性
関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶
からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。 - 【請求項２６】 配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，およ
び配列番号１０からなる群より選択される配列を有するホスファターゼポリペプ
チドのドメインをコードする核酸分子を含む，単離された，濃縮されたまたは精
製された核酸分子。 - 【請求項２７】 配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，およ
び配列番号１０に記載されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチ
ドと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む、ホスファターゼポリペプチドをコードする単
離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。 - 【請求項２８】 分子が，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号
４，および配列番号５からなる群より選択される配列と実質的に同一のヌクレオ
チド配列を含む，請求項１記載の単離された，濃縮されたまたは精製された核酸
分子。 - 【請求項２９】 配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，およ
び配列番号１０からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列の
約１０−３０個の連続するヌクレオチド塩基から本質的になる，単離された，濃
縮されたまたは精製された核酸分子。 - 【請求項３０】 配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，およ
び配列番号５からなる群より選択される核酸配列の約１０−３０個の連続するヌ
クレオチド塩基から本質的になる，請求項２９記載の単離された，濃縮されたま
たは精製された核酸分子。 - 【請求項３１】 請求項１記載の核酸分子を含む組換え細胞。
- 【請求項３２】 請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
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