DE69737889T2

DE69737889T2 - Kalzium-aktivierte kaliumkanäle mit niedriger und mittlerer leitfähigkeit und ihre verwendungen.

Info

Publication number: DE69737889T2
Application number: DE69737889T
Authority: DE
Inventors: John P. Portland ADELMAN; James Portland MAYLIE; Chris T. Portland BOND; Christopher P. Durham SILVIA
Original assignee: ICA GEN Inc; ICA-GEN Inc; Oregon Health Science University
Current assignee: ICA GEN Inc; ICA-GEN Inc; Oregon Health Science University
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: DE69739956D1; AU4266097A; US6692937B2; EP0948542B1; US20020192757A1; US6797486B2; CA2265485A1; DE69737889D1; WO1998011139A1; US7026451B2; US20030082683A1; JP2004065264A; JP2008092950A; US6987169B2; EP0948542A1; AU726158B2; JP4052582B2; US20030105284A1; JP4052525B2; US20020155531A1

Description

RÜCKVERWEISUNG AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität des Einreichungsdatums von USSN 60/026,451, eingereicht am 11. September 1997; USSN 60/040,052, eingereicht am 7. März 1997; und USSN 60/045,233, eingereicht am 17. April 1997.
FÖDERATIV GEFÖRDERTE FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten unter der Bewilligungsnr. 1R01NS31872-01A1, erteilt durch die Nationalen Gesundheitsinstitute (National Institutes of Health), durchgeführt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen mit Bezug auf die und Verfahren zur Identifizierung von Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen mit niedriger Leitfähigkeit (SK). Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, auf Verbindungen zu prüfen, die den Kaliumionenstrom durch Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle erhöhen oder verringern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kalzium-aktivierte Kaliumströme sind in einer breiten Vielzahl von Tierzellen, wie Nerven-, Muskel-, Drüsen- oder Epithelgewebe, und vom Immunsystem zu finden. Die Kanäle, die diese Ströme regulieren, öffnen und erlauben das Entweichen von Kalium, wenn sich die innere Kalziumkonzentration erhöht. Dieser Ausstrom von Kaliumionen macht das Innere der Zelle negativer, wobei er den Depolarisierspannungen entgegenwirkt, die an die Zelle angebracht werden.
Zwei verschiedene Klassen von Kalzium-aktivierten K⁺-Kanälen (K_ca-Kanäle) sind beschrieben worden. Kalzium-aktivierte K⁺-Kanäle mit hoher Leitfähigkeit (BK-Kanäle) werden durch die gemeinsame Einwirkung von inneren Kalziumionen und das Membranpotential torgesteuert und weisen eine einheitliche Leitfähigkeit zwischen 100 und 220 pS auf. Kalzium-aktivierte K⁺-Kanäle mit niedriger (SK) und mittlerer (IK) Leitfähigkeit werden nur durch innere Kalziumionen mit einer einheitliche Leitfähigkeit von 2-20 bzw. 20-85 pS torgesteuert, und sind gegenüber Kalzium empfindlicher als es BK-Kanäle sind (für eine Übersicht siehe Latorre et al., 1989, Ann. Rev. Phys., 51, 385-399). Außerdem zeigt jede Art von K_ca-Kanälen ein ausgeprägtes pharmakologisches Profil. Alle drei Klassen werden weit exprimiert, und ihre Aktivität hyperpolarisiert das Membranpotential. Mitglieder der BK- (Atkinson et al., 1991, Science, 253, 551-555.; Adelman et al., 1992 Neuron, 9, 209-216.; Butler, 1993, Science, 261, 221-224) und SK- (Kohler et al., 1996, Science, 273, 1709-1714.) Unterfamilien sind kloniert und in heterologen Zelltypen exprimiert worden, wo sie die grundlegenden Eigenschaften ihrer nativen Gegenstücke wiedergeben.
Aktionspotentiale von Neuronen von Vertebraten sind gefolgt von einer Nachhyperpolarisation (AHP), die für mehrere Sekunden fortbestehen kann und profunde Konsequenzen für das Feuerungsmuster des Neurons aufweisen. Änderungen in der AHP sind mit der Anfallsaktivität (Alger et al., J. Physiol. 399:191-205 (1988)) und dem Lernen und Gedächtnis (de Jonge et al., Exp. Br. Res. 80:456-462 (1990)) in Zusammenhang gebracht worden. Das AHP besteht aus zwei markanten Komponenten, einer schnellen Komponente (fAHP), welche eine Spitzenfrequenz zu Beginn eines Ausbruchs vermittelt, und einer nachfolgenden langsamen Komponente (sAHP), welche für die Spitzenfrequenzanpassung verantwortlich ist (Nicoll, Science 241:545-551 (1988)).
Jede Komponente des AHP ist kinetisch ausgeprägt und der Aktivierung von verschiedenen Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen zuzuschreiben. Die Aktivierung von Spannungs- und Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen mit hoher Leitfähigkeit (100-200 picoSiemens (pS)) (BK-Kanäle) liegt dem fAHP zugrunde (Lancaster et al., J. Physiol. 389:187-203 (1987); Viana et al., J. Neurophysiol. 69:2150-2163 (1993)), welche sich schnell entwickelt (1-2 ms) und fällt innerhalb von einigen 10 Millisekunden ab. Die Kanäle, die dem sAHP zugrundeliegen, sind Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle mit niedriger Leitfähigkeit (SK-Kanäle), welche sich von den BK-Kanälen unterscheiden, wobei sie Kalzium-sensitiver sind, nicht Spannungs-torgesteuert sind und eine kleinere einheitliche Leitfähigkeit besitzen (Lancaster et al., J. Neurosci. 11:23-30 (1991); Sah, J. Neurophysiol. 74:1772-1776 (1995)).
Die fAHP und die sAHP unterscheiden sich auch in ihrer Pharmakologie. Die fAHP wird durch niedrige Konzentrationen von externem Tetraethylammonium (TEA) und Charybdotoxin (CTX) gemäß der Pharmakologie der BK-Kanäle blockiert. Lancaster et al., J. Physiol. 389:187-203 (1987); Viana et al., J. Neurophysiol. 69:2150-2163 (1993); Butler et al., Science 261:221-224 (1993). Im Gegensatz dazu ist die sAHP gegenüber CTX nicht sensitiv, fällt aber, betreffend die Sensitivität gegenüber dem Bienengift-Peptidtoxin, Apamin, in zwei Klassen. Zum Beispiel ist die sAHP in den Hippokampuspyramidenneuronen gegenüber Apamin nicht sensitiv (Lancaster et al., J. Neurophysiol. 55:1268-1282 (1986)), während sie in den Hippokampusinterneuronen und in den Vagusneuronen durch nanomolare Konzentrationen des Toxins blockiert wird (Sah, J. Neurophysiol. 74:1772-1776 (1995); Zhang et al., J. Physiol. 488:661-672 (1995)).
Zusätzlich zu seiner Rolle in neuronalen Zellen sind Nicht-Spannungs-torgesteuerte, Apaminsensitive Kaliumkanäle, die durch submikromolare Konzentrationen von Kalzium aktiviert werden, von peripheren Zelltypen beschrieben worden, einschließlich Skelettmuskelzellen (Blatz et al., Nature 323:718-720 (1986)), Drüsenzellen (Tse et al., Science 255:462-464 (1992); Park, J. Physiol. 481:555-570 (1994)) und T-Lymphozyten (Grissmer et al., J. Gen. Physiol. 99:63-84 (1992)).
Zum Beispiel ist vorgeschlagen worden, dass SK-Kanäle den Apaminrezeptor darstellen, der in der Muskelmembran von Patienten mit myotonischer Muskeldystrophie gefunden wurde. Renaud et al., Nature 319:678-680 (1986)). Auch Grissmer et al. (J. Gen. Physiol. 99:63-84 (1992)) berichten, dass CTX-nicht sensitive, Apamin-sensitive Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle in einer Leukämie-T-Zelllinie des Menschen identifiziert wurden, und weisen darauf hin, dass Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle eine tragende Rolle während der T-Zellaktivierung durch Aufrechterhalten von dynamischen Mustern des Kalziumsignals spielen. Und in vielen Zellen werden SK-Kanäle als Ergebnis von Neurotransmitter- oder Hormonaktivität aktiviert. Haylett et al., in: Potassium Channels: Structure, Classification, Function and Therapeutic Potential (Cook, N.S., Hrsg.), S. 71-95, John Wiley and Sons, 1990). Kanäle mit mittlerer Leitfähigkeit spielen in der Physiologie von roten Blutzellen eine Rolle.
Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle mit mittlerer Leitfähigkeit sind vorher in der Literatur durch ihre Elektrophysiologie beschrieben worden. Der Gardos-Kanal wird durch submikromolare Konzentrationen von innerem Kalzium geöffnet und weist eine gleichrichtende einheitliche Leitfähigkeit auf, die im Bereich von 50 pS bei –120 mV bis 13 pS bei 120 mV liegt (symmetrisches 120 mM K⁺; Christophersen, 1991, J. Membrane Biol., 119, 75-83). Er wird durch Charybdotoxin (CTX), aber nicht durch das strukturell verwandte Peptid Iberiotoxin (IBX) blockiert, von denen beide BK Kanäle blockieren (Brugnara et al., 1995a, J. Membr. Biol., 147, 71-82). Apamin, ein potenter Blocker bestimmter nativer (Vincent et al., 1975, J. Biochem., 14, 2521.; Blatz und Magleby, 1986, Nature, 323, 718-720.) und klonierter SK-Kanäle, blockiert IK-Kanäle nicht (de-Allie et al., 1996, Br. J. Pharm., 117.479-487). Der Gardos-Kanal wird auch durch einige Imidazolverbindungen, wie Clotrimazol, aber nicht Ketoconazol, blockiert (Brugnara et al., 1993, J. Clin. Invest., 92,520-526).
IK-Kanäle sind in einer Vielzahl von anderen Zelltypen beschrieben worden. Die Hauptzellen des kortikalen Sammelganges der Ratte segregieren verschiedene Klassen von K⁺-Kanälen zu den Luminal- und Basolateralmembranen. IK-Kanäle liegen in der Basolateralmembran vor, wo sie die Rezirkulation von K⁺ durch diese Membran fördern, wobei die Aktivität der Na⁺- + _K+_- ATPase und dadurch die Na⁺-Reabsorption in das Blut erhöht wird (Hirsch und Schlatter, 1995, Pflügers Arch. – Eur. J. Physiol., 449, 338-344) IK-Kanäle sind auch mit der Mikrovaskulatur der Niere in Zusammenhang gebracht worden, wo sie für die Vasodilatationswirkungen von Bradykinin verantwortlich sein können (Rapacon et al., 1996). In den Kapillarendothelzellen des Gehirns werden IK-Kanäle durch Endothelin aktiviert, das von Neuronen und der Glia produziert wird, wobei ein Überschuss an K⁺ in das Blut abgeführt wird (Renterghem et al., 1995, J. Neurochem., 65, 1274-1281). Neutrophile Granulozyten, bewegliche Phagozyten, welche gegen mikrobielle Eindringlinge verteidigen, sind einer großen Depolarisation unterworfen, die der Agonistenstimulation nachfolgt, und IK-Kanäle sind mit der Repolarisation des stimulierten Granulozyten in Zusammenhang gebracht worden (Varnai et al., 1993, J. Physiol., 472, 373-390). IK-Kanäle sind auch sowohl in ruhenden als auch in aktivierten T-Lymphozyten des Menschen identifiziert worden. Grissmer et al. 1993, J. Gen. Physiol. 102, 601-630 berichtete, dass IK-Kanäle durch niedrige nanomolare Konzentrationen von Charybdotoxin blockiert wurden, geringe oder keine Spannungsabhängigkeit zeigten und gegenüber Apamin nicht sensitiv waren. Dieser Kanal ist auch in Erythrozyten des Menschen identifiziert worden, wo er eine wichtige Rolle in der intrazellulären Volumenhomöostase (Joiner, C.H., 1993, Am. J. Physiol. 264: C251-270) und im glatten Muskel (Van Renterghem, C. et al. 1996, J. Neurochemistry 65, 1274-1281) spielt.
Folglich scheint es, dass SK- und IK-Kanäle eine Unterfamilie von Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen umfassen, welche in vielen Zelltypen physiologische Schlüsselrollen spielen. Die Schlüsselrolle von SK- und IK-Kanälen in einer breiten Vielzahl von physiologischen Funktionen vorausgesetzt, ist demgemäß auf dem Fachgebiet die Identifizierung von neuen SK- und IK-Kanalproteinen und der sie kodierenden Nukleinsäuren benötigt. Außerdem sind Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche SK- und IK-Kanalströme erhöhen oder verringern, für ihre Verwendung bei der Behandlung oder Regulierung von: Lern- und Gedächtnisstörungen, Anfällen, myotonischen Dystrophien, Immunantworten und Neurotransmitter- oder Hormonsekretionen erforderlich. Die vorliegende Erfindung liefert diese und andere Vorteile.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptidmonomer eines Kalzium-aktivierten Kaliumkanals mit niedriger Leitfähigkeit kodiert, gemäß Anspruch 1 oder 10.
Jede nachfolgend gegebene Information, welche nicht in den Schutzbereich der Ansprüche fällt, dient nur zu Informationszwecken und soll nicht Teil der vorliegenden Erfindung sein.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue isolierte, Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle mit niedriger Leitfähigkeit (SK) und isolierte SK-Kanäle kodierende Nukleinsäuren (d.h. SK-Kanal-Nukleinsäuren). Die Verteilung, Funktion und Pharmakologie definieren diese neuen Klassen von Kanälen als SK-Kanäle.
Die Expression von isoliertes SK-Kanalprotein kodierenden Nukleinsäuren in einer Wirtszelle stellt eine Zusammensetzung bereit, welche verwendet werden kann, um Verbindungen zu identifizieren, die den Kaliumionenstrom durch Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle mit niedriger Leitfähigkeit (SK) erhöhen oder verringern. Weil SK-Kanäle der langsamen Komponente der Nachhyperpolarisation (sAHP) von Neuronen unterworfen sind, stellt eine Änderung von neuronaler sAHP Mittel bereit, um epileptische Anfälle zu unterdrücken oder Lern- oder Gedächtnisstörungen zu modulieren.
Kalzium-aktivierte SK-Kanäle stehen auch im Zusammenhang mit der T-Zellaktivierung. Folglich stellt die Erhöhung oder Verringerung von SK-Kanalströmen Mittel bereit, um die Immunantwort zu unterdrücken oder zu potenzieren. Außerdem hängen SK-Kanäle mit Hormon- und Neurotransmittersekretionen zusammen. Demgemäß stellt die Änderung der SK-Kanalströme Mittel bereit, um zelluläre oder glanduläre Sekretionen zu regulieren und dadurch deren gestörte Gleichgewichte zu behandeln.
Es wird auch angenommen, dass Kalzium-aktivierte Kanäle mit mittlerer Leitfähigkeit (IK) eine wichtige physiologische Rolle besonders in peripheren Geweben spielen. Zum Beispiel ist von Kanälen mit mittlerer Leitfähigkeit in roten Blutzellen berichtet worden, die teilweise zur Zelldehydratisierung beitragen, ein Prozess, der bei der Sichelzellenanämie verschärft ist.
Die Erfindung betrifft auch Subsequenzen von isolierten Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen mit niedriger Leitfähigkeit und isolierte SK-Kanalproteine kodierende Nukleinsäuren. Isolierte SK-Kanalproteine kodierende Nukleinsäuren sind als Sonden zur Identifizierung von aberranten Transkriptionsprodukten oder von erhöhten oder verringerten Transkriptionsspiegeln von SK-Kanäle kodierenden Genen nützlich. Die Untersuchung auf erhöhte oder verringerte Transkription kann in Arzneistoffscreeningprotokollen verwendet werden. Ebenso können SK-Kanalproteine als Immunogene verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung in immundiagnostischen Untersuchungen einer erhöhten oder verringerten Expression von Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen in Arzneistoffscreeningprotokollen zu erzeugen.
Definitionen
Einheiten, Präfixe und Symbole können in ihrer SI-anerkannten Form angegeben werden. Wenn nicht etwas anderes angezeigt ist, werden jeweils Nukleinsäuren von links nach rechts in 5'-nach-3'-Orientierung geschrieben; werden Aminosäuresequenzen von links nach rechts in Amino-nach-Carboxy-Orientierung geschrieben. Numerische Bereiche schließen die Zahlen, die den Bereich definieren, ein. Die Begriffe, die nachstehend definiert sind, werden vollständiger durch Bezugnahme auf die Beschreibung in ihrer Gesamtheit definiert.
Die Begriffe „Nukleinsäure" „Sonde" oder „Primer" schließen einen Bezug auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidpolymer entweder in einzel- oder doppelsträngiger Form ein, und umfassen, wenn nicht anders beschränkt, bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden, die an Nukleinsäuren auf eine Art und Weise hybridisieren, die natürlich vorkommenden Nukleotiden ähnlich ist. Wenn nicht etwas anderes angezeigt ist, schließt eine bestimmte Nukleinsäuresequenz deren vollständig komplementäre Sequenz ein. Eukaryotische Nukleinsäuren sind Nukleinsäuren aus eukaryotischen Zellen, vorzugsweise Zellen von vielzelligen Eukaryoten.
Der Begriff „rekombinant" schließt, wenn er mit Bezug auf eine Zelle oder ein Protein, eine Nukleinsäure oder einen Vektor verwendet wird, den Bezug auf eine Zelle, ein Protein oder eine Nukleinsäure oder einen Vektor ein, der durch die Einbringung einer heterologen Nukleinsäure oder durch die Änderung einer nativen Nukleinsäure zu einer Form modifiziert worden ist, die dieser Zelle nicht nativ ist, oder dass sich die Zelle von einer so modifizierten Zelle ableitet. Folglich exprimieren zum Beispiel rekombinante Zellen Gene und Proteine, die innerhalb der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht gefunden werden, oder sie exprimieren native Gene, die anders unnormal exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden.
Der Begriff „Subsequenz" im Zusammenhang mit einer Bezugsnukleinsäuresequenz schließt den Bezug auf eine benachbarte Sequenz von der Nukleinsäure mit weniger Nukleotiden in der Länge als die Bezugsnukleinsäure ein. Im Zusammenhang mit einer Bezugsprotein-, -polypeptid-, oder -peptidsequenz (zusammen „Protein"), bezieht sich „Subsequenz" auf eine benachbarte Sequenz von dem Bezugsprotein mit weniger Aminosäuren als das Bezugsprotein.
Die Begriffe „identisch" oder „Sequenzidentität" im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen schließt den Bezug auf die Reste in den beiden Sequenzen ein, welche dieselben sind, wenn sie für maximale Übereinstimmung in einem spezifizierten Vergleichsfenster ausgerichtet sind. Wenn die Sequenzidentität in Prozent in Bezug auf Proteine verwendet wird, ist anzuerkennen, dass Restpositionen, welche nicht identisch sind, sich häufig durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wo Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z.B. hinsichtlich der Ladung oder Hydrophobie) ersetzt sind und die deshalb die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wo sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann die Sequenzidentität in Prozent nach oben eingestellt werden, um die konservative Natur der Substitution zu korrigieren. Mittel zum Durchführen dieser Einstellung sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise schließt dies das Bewerten einer konservativen Substitution als teilweise anstatt einer vollständig fehlerhaften Paarung ein, wodurch die Sequenzidentität in Prozent erhöht wird. Folglich wird, wenn zum Beispiel einer identischen Aminosäure ein Wert von 1 und einer nicht-konservativen Substitution ein Wert von Null gegeben wird, einer konservativen Substitution ein Wert zwischen Null und 1 gegeben. Die Bewertung von konservativen Substitutionen wird z.B. gemäß dem Algorithmus von Meyers und Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988), wie z.B. im Programm PC/GENE (intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, USA) implementiert, berechnet.
Ein „Vergleichsfenster", wie hier verwendet, schließt den Bezug auf ein Segment von einer Anzahl von benachbarten Positionen ein, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 20 bis 600, gewöhnlich etwa 50 bis etwa 200, gewöhnlicher etwa 100 bis etwa 150, in welcher eine Sequenz mit einer Bezugssequenz derselben Anzahl von benachbarten Positionen verglichen werden kann, nachdem die beiden Sequenzen optimal ausgerichtet worden sind. Verfahren zur Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich kann durch den Algorithmus der lokalen Homologie von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; durch den Algorithmus der Homologieausrichtung von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444; durch computerunterstützte Implementierungen dieser Algorithmen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf CLUSTAL im PC/GENE-Programm von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetik-Softwarepaket (Wisconsin Genetics Software Package), Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA) durchgeführt werden; das CLUSTAL-Programm ist von Higgins und Sharp (1988) Gene, 73: 237-244 und Higgins und Sharp (1989) CAB/OS 5: 151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10881-90; Huang et al. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8, 155-65 und Pearson et al. (1994) Methods in Molecular Biology 24, 307-31 gut beschrieben. Die Ausrichtung wird auch häufig durch Kontrolle und manuelle Ausrichtung durchgeführt.
Die Begriffe „wesentliche Identität" oder „Ähnlichkeit" von Polynukleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Sequenzidentität aufweist, verglichen mit einer Bezugssequenz, wobei die vorstehend beschriebenen Programme (vorzugsweise BLAST) unter Verwendung von Standardparametern verwendet werden. Ein Hinweis, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das Polypeptid, welches von der ersten Nukleinsäure kodiert wird, mit dem Polypeptid, das von der zweiten Nukleinsäure kodiert wird, immunologisch kreuzreaktiv ist.
Ein anderer Hinweis, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen dieselbe Identität aufweisen, ist, dass die beiden Moleküle unter „gemäßigt stringenten Hybridisierungsbedingungen" (oder „gemäßigten Bedingungen") aneinander hybridisieren. Beispielhafte „gemäßigte stringente Hybridisierungsbedingungen" schließen eine Hybridisierung in einem Puffer aus 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SOS bei 37°C und einmal Waschen in 1 X SSC bei 45°C ein. Eine positive Hybridisierung ist mindestens das Zweifache des Hintergrunds. Der Fachmann erkennt leicht, dass eine alternative Hybridisierung und Waschbedingungen angewendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Stringenz bereitzustellen. Nukleinsäuren, welche unter gemäßigt stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht aneinander hybridisieren, sind noch immer im Wesentlichen identisch, wenn die sie kodierenden Polypeptide im Wesentlichen identisch sind. Dies tritt z.B. auf, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Degeneriertheit des Codons, die durch den genetischen Code erlaubt ist, erzeugt wird.
Die Begriffe „wesentliche Identität" oder „Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit einem Peptid zeigt an, dass ein Peptid eine Sequenz mit mindestens 60% Sequenzidentität zu einer Bezugssequenz, gewöhnlich mindestens 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 85%, am meisten bevorzugt mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität zu der Bezugssequenz innerhalb eines spezifizierten Vergleichsfensters umfasst. Vorzugsweise wird eine optimale Ausrichtung unter Verwendung eines Algorithmus' der Homologieausrichtung von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 durchgeführt. Ein Hinweis, dass zwei Peptidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass ein Peptid mit Antikörpern, die gegen das zweite Peptid gezüchtet wurden, immunologisch reaktiv ist. Folglich ist ein Peptid mit einem zweiten Peptid im Wesentlichen identisch, wenn sich zum Beispiel die beiden Peptide nur durch eine konservative Substitution unterscheiden. Im Allgemeinen wird die Ähnlichkeit unter Verwendung eines Vergleichsfensters mit einer Länge einer Anzahl von 20 bis zur Anzahl der Reste in der Sequenz der Kernregion in voller Länge benachbarten Positionen (d.h. der Region der optimalen Ausrichtung mit rSK2 von Aminosäurerest 135 bis 462), wobei sich das Vergleichsfenster innerhalb der Kernsequenz befindet, bestimmt.
Die Begriffe „Oligonukleotid-" oder „Polynukleotid"-Sonden schließen den Bezug sowohl auf doppelsträngige als auch einzelsträngige DNA oder RNA ein. Die Begriffe beziehen sich auch auf synthetisch oder rekombinant abgeleitete Sequenzen, die im Wesentlichen frei von Kontamination von Nicht-Nukleinsäuren sind.
Wie hier verwendet, bedeutet „Kontakt" oder „in Kontakt bringen", in direkte physikalische Verbindung bringen.
Eine „biologische Probe", wie hier verwendet, ist eine Probe eines biologischen Gewebes oder einer biologischen Flüssigkeit, das/die ein SK-Kanalprotein oder die Nukleinsäure, die das entsprechende SK-Kanalprotein kodiert, enthält. Derartige Proben schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Sputum, Fruchtwasser, Blut, Blutzellen (z.B. weiße Zellen) oder Gewebe. Biologische Proben können auch Gewebeschnitte, wie gefrorene Schnitte, einschließen, die für histologische Zwecke genommen worden sind. Beispiele von biologischen Proben schließen eine Zellprobe vom Nerven-, Muskel-, Drüsen- oder Epithelgewebe oder vom Immunsystem ein (z.B. T-Zellen). Eine biologische Probe wird typischerweise von einem eukaryotischen Organismus erhalten, vorzugsweise einem vielzelligen Eukaryoten, wie von einem Insekt, von Protozoen, Vögeln, Fischen, Reptilien und vorzugsweise einem Säugetier, wie Ratte, Mäuse, Kuh, Hund, Meerschweinchen oder Kaninchen und am meisten bevorzugt einem Primaten, wie Makaken, Schimpansen oder Menschen.
Der Begriff „Antikörper" schließt auch Antigen-bindende Formen von Antikörpern ein (z.B. Fab, F(ab)₂). Der Begriff „Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das im Wesentlichen durch ein Immunglobulingen oder durch Immunglobulingene kodiert wird, oder auf deren Fragmente, welche einen Analyten (Antigen) spezifisch binden und diesen erkennen. Die erkannten Immunglobulingene schließen die Gene der konstanten Region κ, λ, α, γ, δ, ε und μ, sowie die Gene der variablen Region unzähliger Immunglobuline ein. Leichte Ketten werden entweder als κ oder λ klassifiziert. Schwere Ketten werden als γ, μ, α, δ oder ε klassifiziert, welche wiederum die Immunglobulinklassen, IgG, IgM, IgA, IgD beziehungsweise IgE definieren.
Eine beispielhafte strukturelle Immunglobulin-(Antikörper-)Einheit umfasst ein Tetramer. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine „leichte" (etwa 25 kD) und eine „schwere" Kette (etwa 50-70 kD) aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die hauptsächlich für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) beziehen sich auf diese leichten beziehungsweise schweren Ketten.
Antikörper existieren z.B. als intakte Immunglobuline oder als mehrere gut charakterisierte Fragmente, die durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen hergestellt worden sind. Folglich spaltet zum Beispiel Pepsin einen Antikörper unterhalb der Disulfidbindungen in der Scharnierregion, wobei F(ab)'₂, ein Dimer von Fab, welches selbst eine leichte Kette ist, die mit V_H-C_H1 durch eine Disulfidbindung verbunden ist, hergestellt wird. Das F(ab)'₂ kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbindung in der Scharnierregion zu brechen, wodurch das F(ab)'₂-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'- Monomer ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der Scharnierregion (siehe Fundamental Immunology, 3. Aufl., W.E. Paul, Hrsg., Raven Press, N.Y. 1993). Während verschiedene Antikörperfragmente hinsichtlich des Verdaus eines intakten Antikörpers definiert werden, erkennt der Fachmann, dass derartige Fragmente entweder chemisch oder unter Verwendung der rekombinanten DNA-Methodologie de novo synthetisiert werden können. Folglich schließt der Begriff Antikörper, wie hier verwendet, auch Antikörperfragmente, wie Single-Chain-Fv, chimärische Antikörper (d.h. die konstante und variable Regionen von verschiedenen Spezies umfassen), humanisierte Antikörper (d.h. die eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) von einer nicht-menschlichen Quelle umfassen) und heterokonjugierte Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) ein.
Aminosäuren können hier entweder mit ihren allgemein bekannten Dreibuchstabensymbolen, oder mit den Einbuchstabensymbolen bezeichnet werden, die durch die IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemische Bezeichnungskommission) empfohlen worden sind. Nukleotide können ebenso mit ihren allgemein geltenden Einbuchstabencodes bezeichnet werden.
Der Begriff „konservativ modifizierte Varianten" findet Anwendung sowohl bei Aminosäure- als auch Nukleinsäuresequenzen. In Bezug auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf solche Nukleinsäuren, welche identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder, wenn die Nukleinsäure keine Aminosäuresequenz kodiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes kodieren viele funktionell identische Nukleinsäuren jedes bestimmte Protein. Zum Beispiel kodieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Folglich kann bei jeder Position, an der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert ist, das Codon zu einem der beschriebenen entsprechenden Codons geändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu ändern. Derartige Nukleinsäureveränderungen sind „stille Veränderungen", welche eine Spezies von konservativ modifizierten Veränderungen sind. Jede hier erwähnte Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid kodiert, beschreibt auch jede mögliche stille Veränderung der Nukleinsäure. Der Fachmann erkennt, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (ausgenommen AUG, welches gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist), modifiziert werden kann, wobei ein funktionell identisches Molekül erhalten wird. Demgemäß ist jede stille Veränderung einer Nukleinsäure, welche ein Polypeptid kodiert, in jeder beschriebenen Sequenz implizit.
Im Hinblick auf Aminosäuresequenzen erkennt der Fachmann, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen zu einer Nukleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, welche eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz der Aminosäuren in der kodierten Sequenz ändern, addieren oder deletieren, eine „konservativ modifizierte Variante" sind, wobei die Änderung zur Substitution einer Aminosäure gegen eine chemisch ähnliche Aminosäure führt. Tabellen von konservativer Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die folgenden sechs Reste enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (B), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

Siehe auch Creighton (1984) Proteins W.H. Freeman and Company.
Die Begriffe „biologisch rein" oder „isoliert" beziehen sich auf Material, welches im Wesentlich oder praktisch frei von Komponenten ist, welche dieses gewöhnlich begleiten oder mit ihm Wechselwirken, wie in ihrer natürlich vorkommenden Umgebung gefunden. Das isolierte Material umfasst gegebenenfalls Material, das nicht mit dem Material in seiner natürlichen Umgebung gefunden wird.
Der Begriff „kodiert ein Protein, welches durch eine Nukleinsäure kodiert sein könnte, die unter gemäßigt stringenten Hybridisierungsbedingungen selektiv an eine Sequenz hybridisiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:" bezieht sich im Zusammenhang mit Nukleinsäuren auf solche Nukleinsäuren, die natürlich vorkommende Proteine oder Derivate von natürlichen Proteinen kodieren, aber welche absichtlich modifiziert oder konstruiert sind, so dass sie unter den angegebenen Bedingungen nicht mehr an das Protein natürlichen Ursprungs hybridisieren.
Ein „Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch erzeugt ist, mit einer Reihe von spezifizierten Nukleinsäureelementen, welche die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Wirtszelle erlauben. Der Expressionsvektor kann ein Teil eines Plasmids, Virus' oder Nukleinsäurefragments sein. Typischerweise schließt der Expressionsvektor eine zu transkribierende Nukleinsäure und einen Promotor ein.
Der Begriff „funktionelle Wirkungen" im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Prüfen von Verbindungen, die den Kanal beeinflussen, schließt die Bestimmung irgendeines Parameters ein, der sich indirekt oder direkt unter dem Einfluss des Kanals befindet. Er schließt Änderungen des Ionenstromes und Membranpotentials ein, schließt aber auch andere physiologische Wirkungen, wie Zunahmen oder Abnahmen der Transkription oder Hormonfreisetzung, ein.
„Selektiv hybridisierend" oder „selektive Hybridisierung" oder „hybridisiert selektiv" bedeuten Hybridisierung einer Nukleinsäuresequenz an eine spezifizierte Nukleinsäurezielsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen in einem detektierbar größeren Ausmaß als ihre Hybridisierung an Nicht-Ziel-Nukleinsäuresequenzen und/oder zum erheblichen Ausschluss von Nicht-Ziel-Nukleinsäuren. Selektiv hybridisierende Sequenzen weisen mindestens 80% Sequenzidentität, vorzugsweise 90% Sequenzidentität, und am meisten bevorzugt 100% Sequenzidentität (d.h. sind komplementär) miteinander auf. „Sequenzidentität in Prozent" wird durch Vergleich von zwei optimal ausgerichteten Sequenzen gegenüber einem Vergleichsfenster bestimmt, wobei der Teil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) umfassen kann, verglichen mit der Bezugssequenz (welche keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Ausrichtung der beiden Sequenzen. Der Prozentsatz wird durch Bestimmen der Anzahl von Positionen berechnet, an welcher die identische Nukleinsäurebase oder der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, so dass die Anzahl der übereinstimmenden Positionen erhalten wird und die Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl von Positionen im Vergleichsfenster geteilt und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, so dass die Sequenzidentität in Prozent erhalten wird.
Die Begriffe „stringente Bedingungen" oder „stringente Hybridisierungsbedingungen" beziehen sich auf Bedingungen, unter welchen eine Sonde in einem detektierbar größeren Ausmaß als andere Sequenzen an ihre Zielsequenz hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen verschieden. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Allgemein sind stringente Bedingungen etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem derfinierten pH-Wert ausgewählt. Der T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei welcher 50% einer komplementären Zielsequenz an eine tadellos passende Sonde hybridisiert. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei welchen die Salzkonzentration kleiner ist als etwa 1,0 M Na-Ionen-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 und die Temperatur mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. mehr als 50 Nukleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können auch mit der Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie Formamid, erreicht werden. Beispielhaft niedrige stringente Bedingungen schließen die Hybridisierung mit einer Pufferlösung aus 30% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einmal Waschen in 2 X SSC bei 50°C ein. Beispielhaft hohe stringente Bedingungen schließen die Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einmal Waschen in 0,1 X SSC bei 60°C ein.
„Stringente Hybridisierungsbedingungen" oder „stringente Bedingungen" im Zusammenhang mit Nukleinsäurehybridisierungsuntersuchungsformaten sind sequenzabhängig und unter verschiedenen Umgebungsparametern verschieden. Ein umfangreicher Führer zur Hybridisierung von Nukleinsäuren wird in Tijssen (1993) Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I Chapter 2 „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York gefunden. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unter verschiedenen Umständen verschieden. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen.
Der Begriff „Hybridisierungskomplex" bedeutet, dass eine Doppelstrang-Nukleinsäuresequenz durch selektive Hybridisierung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen aneinander erzeugt worden ist.
Der Begriff „Wirtszelle" bedeutet eine Zelle, welche einen Expressionsvektor enthält und die Replikation oder Expression des Expressionsvektors trägt. Wirtszellen können prokaryotische Zellen wie E. coli oder eukaryotische Zellen, wie Hefe, Insekten-, Amphibien- oder Säugetierzellen sein.
Der Begriff „Leitfähigkeit" bedeutet elektrische Leitfähigkeit. Elektrische Leitfähigkeit wird bequem in Siemens (1/ohm = mho) gemessen. Einheitliche Leitfähigkeit wird durch Messung von Einzelkanalströmen unter Verwendung eines Patch-Clamp-Protokolls unter Bedingungen, die in Beispiel 6 (d.h. in einem Oozyten) aufgezeigt sind, unter Verwendung einer symmetrischen Kaliumionenkonzentration von 120 mM bestimmt. Siehe allgemein Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Aufl., Sinauer Assoc., Sunderland, MA. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Leitfähigkeit" auf die elektrische einheitliche Leitfähigkeit eines einzelnen homomeren Proteins des Bezugs-SK-Kanalproteins.
Der Begriff „wenn in einem Oozyten exprimiert, führt es zur Bildung eines SK-Kanals" schließt den Bezug auf die Expression eines Bezugs-SK-Proteins ein, bei welchem eine Mehrzahl von Bezugs-SK-Proteinen zusammengesetzt werden, um alleine oder in Verbindung mit anderen endogenen Xenopus Oozyt-Molekülen einen SK-Kanal zu erzeugen. Expression innerhalb eines Xenopus Oozyten ist in den hier dargestellten Beispielen, z.B. Beispiel 3, offenbart.
Der Begriff „wenn in einem Oozyten exprimiert, führt es zur Bildung eines Kalzium-aktivierten Kaliumkanals" schließt den Bezug auf die Expression eines Bezugs-SK-Proteins ein, bei welchem eine Mehrzahl von Bezugs-SK-Proteinen zusammengesetzt werden, um alleine oder in Verbindung mit anderen endogenen Xenopus Oozyt-Molekülen einen Kalzium-aktivierten Kaliumkanal zu erzeugen. Expression innerhalb eines Xenopus Oozyten ist in den hier bereitgestellten Beispielen, z.B. Beispiel 3, offenbart.
Der Begriff „immunologisch reaktive Bedingungen" bedeutet Bedingungen, welche erlauben, dass ein Antikörper, der gegen ein bestimmtes Epitop erzeugt worden ist, an dieses Epitop in einem detektierbar größeren Ausmaß als an im Wesentlichen alle anderen Epitope bindet. Immunologisch reaktive Bedingungen sind vom Format der Antikörperbindungsreaktion abhängig und sind typischerweise solche, die bei Immunoassayprotokollen verwendet werden. Siehe Harlow und Lane (1988), Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, bezüglich einer Beschreibung von Immunoassayformaten und -bedingungen.
Der Bgriff „Antikörper, der mit einem Protein reaktiv ist" bedeutet, dass das Protein „spezifisch immunreaktiv mit einem Antikörper" ist.
Der Begriff „spezifisch immunreaktiv mit einem Antikörper" oder „bindet spezifisch an einen Antikörper" bezieht sich, wenn er sich auf ein Protein oder Peptid bezieht, auf eine Bindungsreaktion zwischen einem Antikörper und einem Protein mit einem Epitop, das durch die Antigenbindungsstelle des Antikörpers erkannt wird. Diese Bindungsreaktion wird durch die Gegenwart eines Proteins mit dem erkannten Epitop in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Stoffen bestimmt. Folglich binden die spezifizierten Antikörper unter bestimmten Immunoassaybedingungen an ein Protein mit dem erkannten Epitop und binden, wenn überhaupt, in einem detektierbar geringeren Ausmaß an andere Proteine, denen das Epitop fehlt, welche in der Probe vorliegen.
Spezifische Bindung an einen Antikörper unter derartigen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der wegen seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt ist. Zum Beispiel können Antikörper ausgewählt werden, die gegen das Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 30, 32, 43 und 47 dargestellt ist, gezüchtet wurden, so dass Antikörper erhalten werden, die mit Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteinen mit niedriger und/oder mittlerer Leitfähigkeit und nicht mit anderen Proteinen spezifisch immunreaktiv sind. Die Proteine, die als Immunogene verwendet werden, können sich in nativer Konformation befinden oder denaturiert sein, um ein lineares Epitop bereitzustellen.
Eine Vielzahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die mit einem bestimmten Protein spezifisch immunreaktiv sind. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper auszuwählen, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane (1988), Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, bezüglich einer Beschreibung von Immunoassayformaten und -bedingungen, die verwendet werden können, um spezifische Immunreaktivität zu bestimmen.
Der Begriff „transfiziert" bedeutet die Einbringung einer Nukleinsäure in eine eukaryotische Zelle, wobei die Nukleinsäure in das Genom der Zelle (d.h. Chromosomen-, Plasmid- oder mitochondriale DNA) eingebracht, in ein autonomes Replicon umgewandelt oder transient exprimiert (z.B. transfizierte mRNA) werden kann. Die Transfektion kann in vivo oder ex vivo stattfinden. „Ex vivo" bedeutet außerhalb des Körpers des Organismus', aus welchem eine Zelle oder Zellen erhalten werden oder aus welchem eine Zelllinie isoliert wird. Ex vivo-Transfektion ist vorzugsweise gefolgt von der Re-Infusion der Zellen zurück in den Organismus.
Im Gegensatz dazu bedeutet „in vivo" innerhalb des Körpers des Organismus', aus welchem die Zelle erhalten wurde oder aus welcher eine Zelllinie isoliert wird.
Der Begriff „antigen" bedeutet einen Stoff, gegen welchen ein Antikörper erzeugt werden kann und mit welchem der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist. Ein Antikörper, der mit einem bestimmten Antigen immunologisch reaktiv ist, kann in vivo oder durch rekombinante Verfahren, wie Selektion von Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen- oder ähnlichen Vektoren, erzeugt werden. Siehe z.B. Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; und Ward et al. (1989) Nature 341:544-546; und Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology, 14:309-314.
„Kodierend oder „kodiert" bedeutet im Hinblick auf eine spezifizierte Nukleinsäure, dass sie die Information zur Translation in das spezifizierte Protein umfasst. Die Information ist durch die Verwendung von Codons spezifiziert. Typischerweise wird die Aminosäuresequenz durch die Nukleinsäure unter Verwendung des „universellen" genetischen Codes kodiert. Jedoch können Varianten des universellen Codes, wie er in einigen Pflanzen, Tieren und in pilzartigen Mitochondrien, dem Bakterium Mykoplasma capricolum vorliegt (Proc. Natl. Acad. Sci., 82:2306-2309 (1985)) oder dem Ziliaten Macronucleus vorkommt, verwendet werden, wenn die Nukleinsäure unter Verwendung dieser Organismen exprimiert wird.
Der Begriff „benachbarte Aminosäuren von" im Zusammenhang mit einer spezifizierten Anzahl von Aminosäureresten von einer spezifizierten Sequenz bedeutet eine Sequenz von Aminosäuren der spezifizierten Anzahl innerhalb der spezifizierten Bezugssequenz, welche die identische Reihenfolge von Aminosäuren aufweist, von denen jede direkt neben denselben Aminosäuren wie in der Bezugssequenz liegt.
„Kalzium-aktivierter Kaliumkanal mit niedriger Leitfähigkeit" oder „SK-Kanal" bedeutet einen Membrankanal, welcher nicht Spannungs-torgesteuert ist, durch Kalzium von etwa 30 nM bis 10 μM aktiviert wird und eine einheitliche Leitfähigkeit von etwa 2 bis 60 pS, häufig 2 bis 25 pS aufweist, wenn diese unter einer symmetrischen Kaliumkonzentration von 120 mM unter Anrwendung der Bedingungen, die in Beispiel 6 spezifiziert sind, gemessen wird. Ein SK-Kanal umfasst mehrfache SK-Kanalproteine als Untereinheiten, typischerweise vier SK-Kanalproteine (z.B. SK-Kanalproteine mit voller Länge oder mit im Wesentlichen voller Länge).
„Kalzium-aktiviertes Kanalprotein mit niedriger Leitfähigkeit” oder „SK-Kanalprotein" bedeutet ein Peptid aus mindestens 10 benachbarten Aminosäuren in der Länge einer Aminosäuresequenz, welche einen SK-Kanal bildet. Diese Proteine dienen in ihrer vollen Länge als Monomere des SK-Kanals. Folglich kann ein SK-Kanalprotein die funktionellen Eigenschaften zum Erzeugen eines heteromeren oder homomeren Proteins mit den funktionellen Eigenschaften eines SK-Kanals aufweisen oder dessen Peptidfragment sein. Zum Beispiel veranschaulichen sowohl das N-terminal verlängerte rsk3 (SEQ ID Nr. 43) als auch das trunkierte rsk3 (SEQ ID Nr. 3) praktisch identische funktionelle Eigenschaften.
„Kalzium-aktivierter Kaliumkanal" bedeutet einen Kalzium-aktivierten Kaliumkanal mit niedriger Leitfähigkeit (SK).
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hier austauschbar verwendet, so dass sie sich auf ein Polymer von Aminosäureresten beziehen. Die Begriffe beziehen sich auf Aminosäurepolymere, in welchen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure sind, sowie auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere.
„Reagiert spezifisch" oder „spezifisch reaktiv" beziehen sich auf eine Reaktion der Spezifität, die durch die zwischen einem Antikörper und einem Protein, welches mit diesem Antikörper „spezifisch bindet", gezeigt wird.
„Menschliche genomische Bibliothek" bedeutet eine Sammlung von isolierten DNA-Molekülen, welche im Wesentlichen das gesamte Genom eines Menschen darstellt. Der Aufbau einer genomischen Bibliothek wird in Standarddruckschriften der molekularen Biologie dargestellt, wie Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Band 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laborstory Manual (2. Aufl.) Bd. 1-3; und Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., (1994 Ergänzungsband) (Ausubel).
Der Begriff „amplifiziert" bedeutet den Aufbau von mehrfachen Kopien einer Nukleinsäuresequenz oder von mehrfachen Kopien, die zu der Nukleinsäuresequenz komplementär sind, wobei mindestens eine der Nukleinsäuresequenzen als Matrize verwendet wird. Amplifikationssysteme schließen das System der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), das System der Ligase-Kettenreaktion (LCR), die Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), Qß-Replikasesysteme, das Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS) und die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ein. Siehe z.B. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, Hsrg. D. H. Persing et al., American Society for Microbiology, Washington, D.C.
Der Begriff „Rest" oder „Aminosäurerest" oder „Aminosäure", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Aminosäure, die in einem Protein, Polypeptid oder Peptid (zusammen „Peptid") eingebracht ist. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein und kann, wenn nicht anders beschränkt, bekannte Analoga von natürlichen Aminosäuren umfassen, die auf eine ähnliche Art und Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren arbeiten können.
„Segment einer Nukleinsäure" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von 15 bis etwa 1500 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga oder Konkatamere einer derartigen Sequenz.
„Bestimmen der funktionellen Wirkung" bedeutet das Überprüfen der Wirkung einer Verbindung, die den Kaliumionenstrom an einer Zelle oder Zellmembran hinsichtlich der Zell- und Zellmembranfunktion erhöht oder verringert. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff auf die funktionelle Wirkung der Verbindung auf die SK-Kanalaktivität, z.B. auf Änderungen der Leitfähigkeit, der Spannungstorsteuerung und auf dergleichen.
Kalzium-aktivierte Kaliumkanalproteine mit niedriger Leitfähigkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft Kalzium-aktivierte Kanalproteine mit niedriger Leitfähigkeit (SK) (zusammen „Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle"). Die isolierten Kalzium-aktivierten Kanalproteine mit niedriger Leitfähigkeit (SK) gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens N Aminosäuren mit einer der Sequenzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47 und deren konservativ modifizierten Varianten, wobei N eine der ganzen Zahlen ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 10 bis 600, und wobei die Sequenz zum Ursprungsprotein einzigartig ist.
Typischerweise haben die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine und die spezifischen Peptide eine Länge von mindestens 15, 25, 35 oder 50 Aminosäuren, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400 oder 500 Aminosäuren und am meisten bevorzugt die volle Länge von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 oder 47 oder von deren konservativ modifizierten Varianten. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung Sequenzen in voller Länge und Subsequenzen von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 und 47 und Sequenzen in voller Länge und Subsequenzen von konservativ modifizierten Varianten von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 und 47. Eine Sequenz „in voller Länge" von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 oder 47 bedeutet jeweils die Sequenz von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20. 32, 43 beziehungsweise 47. Eine Sequenz „in voller Länge" einer konservativ modifizierten Variante von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 oder 47 bedeutet jeweils eine konservativ modifizierte Variante von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 beziehungsweise 47. Die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine und Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können als Immunogene zur Herstellung von immundiagnostischen Sonden zum Bewerten von erhöhter oder verringerter Expression von Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen in Arzneistoffscreeninganalysen verwendet werden.
Die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung schließen auch Proteine ein, welche wesentliche Identität (d.h. Ähnlichkeit) mit einem Kalzium-aktivierten Kaliumkanal von mindestens N Aminosäuren von einer der Sequenzen aufweisen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 32, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47 und deren konservativ modifizierten Varianten, wobei N eine der ganzen Zahlen ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 10 bis 600. Allgemein haben die Kalziumaktivierten Kaliumkanalproteine eine Länge von mindestens 50, typischerweise mindestens 100, vorzugsweise mindestens 200, stärker bevorzugt mindestens 300 und am meisten bevorzugt mindestens 400 Aminosäurereste. Typischerweise ist die im Wesentlichen ähnliche oder konservativ modifizierte Variante des Kalzium-aktivierten Kalium-SK-Kanalproteins ein eukaryotisches Protein, vorzugsweise aus vielzelligen Eukaryoten, wie Insekten, Protozoen, Vögeln, Fischen, Amphibien, Reptilien oder Säugetieren.
Die SK-Kanalproteine, welche im Wesentlichen identisch sind zu oder eine konservativ modifizierte Variante sind von einem SK-Kanalprotein mit einer Sequenz, die ausgewählt ist aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47, reagierten unter immunologisch reaktiven Bedingungen spezifisch mit einem Immunglobulin, das mit einem SK-Kanalprotein reaktiv ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47.
Eine Vielzahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um eine derartige immunologisch spezifische Reaktion zu bewerten, die zum Beispiel ELISA, kompetitive Immunoassays, Radioimmunoassays, Westernblots, indirekte Immunfluoreszenzanalysen und dergleichen einschließen.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die SK-Kanalproteine, welche im Wesentlichen identisch sind zu oder eine konservativ modifizierte Variante sind von einem SK-Kanalprotein mit einer Sequenz, die ausgewählt ist aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47, eine Aminosäuresequenz, welche eine 60% bis 100% Ähnlichkeit mit einem Vergleichsfenster innerhalb der Kernsequenz (oder „Kernregion") eines SK-Kanalproteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 43 und 47 aufweist.
Folglich wird die Ähnlichkeit durch Bezug auf die Kernregion oder deren Subsequenz bestimmt. Die Kernregion von hSK1 (SEQ ID Nr. 1) befindet sich im Bereich von Aminosäurerest 124 bis 451 (SEQ ID Nr. 27). Die Kernregion von rSK2 (SEQ ID Nr. 2) befindet sich im Bereich von Aminosäurerest 135 bis 462. Die Kernregion von trunkiertem rSK3 (SEQ ID Nr. 3) befindet sich im Bereich von Aminosäurerest 109 bis 436. Die Kernregion von N-terminal verlängertem rSK3 (SEQ ID Nr. 43) befindet sich im Bereich von 288-615. Die Kernregion von rSK1 (SEQ ID Nr. 4) ist durch die Region definiert, welche mit den vorhergehenden Regionen ausgerichtet wird. Die Kernregion von hSK2 (SEQ ID Nr. 19) befindet sich im Bereich von Aminosäurerest 134 bis 461. Die Kernregion von trunkiertem hSK3 (SEQ ID Nr. 20) befindet sich im Bereich von Aminosäurerest 109 bis 436. Die Kernregion von N-terminal verlängertem hSK3 (SEQ ID Nr. 47) befindet sich im Bereich von 238-465. Folglich schließen die Kernregionen von SEQ ID Nr. 1-4, 19, 20, 43 und 47 die Aminosäurerest-Subsequenzen LSDYALIFGM (SEQ ID Nr. 17) am proximalen Aminoende und QRKFLQAIHQ (SEQ ID Nr. 18) am proximalen Carboxylende ein und sind durch sie definiert. Die Kernregion von hIK1 (SEQ ID Nr. 32) befindet sich im Bereich der Aminosäuren 25 bis 351. Eine Subsequenz der Kernregion weist eine Länge von 10 bis zur Länge einer Kernsequenz von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 oder 47 auf. Vorzugsweise umfassen SK-Kanalproteine eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Ähnlichkeit gegenüber einem Vergleichsfenster von 20 benachbarten Aminosäuren innerhalb der Kernsequenz.
Ähnlichkeit wird auch durch Bezug auf die funktionellen Eigenschaften des Kalzium-aktivierten Kanalproteins bestimmt. Zum Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung mehrere SK3-Aminosäuresequenzen, welche, wenn sie exprimiert werden, praktisch identische Ströme aufweisen. cDNAs, die rSK3 kodieren, sind in zwei verschiedenen Formen isoliert worden. Die erste, SEQ ID Nr. 44, die SEQ ID Nr. 43 kodiert, ist das endogene rSK3 oder das N-terminal verlängerte rSK3. Die zweite, SEQ ID Nr. 16, die SEQ ID Nr. 3 kodiert, ist im Verhältnis zu SEQ ID Nr. 43 am N-Terminus trunkiert. Das trunkierte rSK3-Protein (SEQ ID Nr. 3) weist auch einen verschiedenen C-Terminus auf, bei welchem die letzten 9 Aminosäuren von SEQ ID Nr. 43 durch 5 verschiedene Aminosäuren ersetzt sind. Obwohl diese Sequenzen sich sowohl am N- als auch am C-Terminus unterscheiden, exprimieren sie praktisch identische Ströme. Weil das N-terminal verlängerte und das trunkierte SK3 denselben Strom exprimieren, ist die N-terminale Verlängerung für die Kanalfunktion an sich nicht wesentlich, ist aber wahrscheinlich am Targeting des Proteins auf eine spezifische Position in der Zelle beteiligt.
In ähnlicher Weise sind zwei cDNAs für hSK3 identifiziert worden: N-terminal verlängertes hSK3 (SEQ ID Nr. 48, die SEQ ID Nr. 47 kodiert) und trunkiertes hSK3 (SEQ ID Nr. 22, die SEQ ID Nr. 20 kodiert). Außerdem kann eine ähnliche N-terminale Verlängerung für SK2 existieren. Genomische Sequenzen der Maus sowohl für SK2 als auch SK3 beweisen, dass beide ein verlängertes offenes Leseraster aufweisen, welches zu den Aminosäuresequenzen benachbart ist, für welche funktionelle Stromexpression bewiesen worden ist. Folglich werden im Wesentlichen auch identische SK-Kanalproteine oder deren konservativ modifizierte Varianten auf der Basis von funktionellen Eigenschaften identifiziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft funktionelle SK-Kanalproteine und deren Subsequenzen. Funktionelle SK-Kanäle gemäß der vorliegenden Erfindung weisen eine einheitliche Leitfähigkeit zwischen 2 und 60 pS, gewöhnlicher zwischen 5 und 25 pS, und Molekulargewichte zwischen 40 und 100 kD, gewöhnlicher 50 bis 80 kD, für jedes der SK-Kanalproteine auf, welche den SK-Kanal bilden. Die einheitliche Leitfähigkeit kann bequem bestimmt werden, indem die Von-innen-nach-außen- (Inside-out-) oder Von-außen-nach-innen- (Outside-in-) Patchclamp-Konfigurationen verwendet werden. Diese Konfigurationen sind insbesondere für das Studium der Biophysik von Ionenkanälen (Kinetik, Leitfähigkeit, Selektivität, Mechanismus der Permeation und Blockade) angezeigt. Patchclamp-Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. den Bericht von Franciolini, Patch clamp technique and biophysical study of membrane channels, Experientia, 42(6):589-594 (1986); und Sakmann et al., Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes, Annual Review of Physiology, 46:455-472 (1984).
Die isolierten SK-Proteine innerhalb des Schutzbereichs gemäß der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, welche, wenn sie in voller Länge und in einer Zelle von einer stillen Linie exprimiert werden, eine Funktionalität und Pharmakologie definieren, die einen SK-Kanal anzeigen. Eine stille Linie ist eine Zelllinie, der in ihrem nativen Zustand (z.B. die keine rekombinanten SK-Kanäle exprimiert) eine niedrige oder uninteressante elektrische Aktivität aufweist, z.B. eine CHO-Zelllinie. Zum Beispiel werden eine Kontrollzelle (ohne Expression eines mutmaßlichen SK-Kanals gemäß der vorliegenden Erfindung) und eine experimentelle Zelle (die einen mutmaßlichen SK-Kanal exprimiert) unter den Bedingungen beibehalten, die zur Messung von elektrophysiologischen Parametern Standard sind, wie sie in den hier offenbarten Arbeitsbeispielen gezeigt werden. Jede Zelle wird mit einem Kalziumionophor behandelt. Beispielhafte Ionophore schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf solche Standardverbindungen, wie Ionomycin (Sigma Chemical Co.) oder A23187 (Sigma Chemical Co.). Eine Zelle wird häufig mit einem Ionophor bei einer Konzentration von etwa 1 μM behandelt.
Danach werden elektrophysiologische Messungen der Zellen vorgenommen, um Induktion eines Kaliumstromes (z.B. durch Radiotracer) oder eine Änderung der Leitfähigkeit der Zelle (z.B. durch Patch-Clamp) oder eine Änderung der Spannung (z.B. durch Fluoreszenzfarbstoff) zu detektieren. Wenn die Gegenwart eines Ionenkanals durch eine Kalzium-induzierte Änderung angezeigt wird, werden nachfolgende Tests angewendet, um den Kanal als SK-Kanal gemäß der vorliegenden Erfindung zu kennzeichnen. Vorzugsweise werden mindestens zwei Eigenschaften bestimmt, stärker bevorzugt mindestens 3, oder 4 werden bestimmt. Eigenschaften von SK-Kanälen gemäß der vorliegenden Erfindung werden hier vollständiger offenbart.
Zum Beispiel kann ein Zelle, die einen SK-Kanal gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, eine Leitfähigkeit zwischen 2 und 30 pS aufweisen, häufig zwischen 2 und 25 pS, kann, aber nicht notwendigerweise, eine Blockade durch Apamin in einem Bereich von 10 pM bis etwa 100 nM zeigen, kann ein SK-Kanalprotein von etwa 40 zu 80 kD umfassen, kann Sequenzähnlichkeit von mindestens 60% und stärker bevorzugt von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% in einer Ausrichtung mit den Kernregionen der hier offenbarten beispielhaften SK-Kanalproteine zeigen und kann unter immunologisch reaktiven Bedingungen mit einem Antikörper, der mit einem hier offenbarten beispielhaften SK- oder IK-Kanal (z.B. SEQ ID Nr. 1-4, 19, 20, 32, 43 und 47) gezüchtet wurde, spezifisch reaktiv sein. Derartige Standardverfahren helfen bei der Identifizierung von SK-Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Festphasensynthese von SK-Kanalproteinen mit einer Länge von weniger als etwa 50 Aminosäuren kann durch Anbringen der C-terminalen Aminosäure der Sequenz an einem unlöslichen Träger, gefolgt von aufeinanderfolgender Addition der restlichen Aminosäuren in der Sequenz, erreicht werden. Verfahren zur Festphasensynthese werden von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; S. 3-284 in: The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Bd. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984), beschrieben. SK-Kanalproteine mit größerer Länge können durch Kondensation der Amino- und Carboxytermini von kürzeren Fragmenten synthetisiert werden. Verfahren zum Erzeugen von Peptidbindungen durch Aktivierung eines Carboxyterminalen Endes (z.B. durch die Verwendung des Koppelungsreagenzes N,N'-Dicycylohexylcarbodiimid) sind dem Fachmann bekannt.
Erlangung von Nukleinsäuren, die Kalzium-aktivierte Kaliumkanalproteine kodieren
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuren von RNA, DNA oder deren Chimäre, welche Kalzium-aktivierte SK-Kanalproteine kodieren („SK-Kanalprotein-Nukleinsäuren"), wie vorstehend ausführlicher diskutiert worden ist. Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können als Sonden zum Beispiel bei der Detektion von Mängeln beim Spiegel von mRNA, Mutationen im Gen (z.B. Substitutionen, Deletionen oder Additionen), zum Überwachen einer Hochregulierung von SK-Kanälen in Arzneistoffscreeninganalysen oder zur rekombinanten Expression von SK-Kanalproteinen zur Verwendung als Immunogene bei der Herstellung von Antikörpern verwendet werden.
Nukleinsäuren, die die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, können unter Verwendung von rekombinanten oder synthetischen Standardverfahren hergestellt werden. Mit den Aminosäuresequenzen der hier bereitgestellten SK-Kanalproteine kann der Fachmann leicht eine Vielzahl von Klonen konstruieren, die funktionell äquivalente Nukleinsäuren enthalten, wie Nukleinsäuren, welche dasselbe Protein kodieren. Klonierungsverfahren zum Erreichen dieser Enden und Sequenzierverfahren zum Verifizieren der Sequenz der Nukleinsäuren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele von geeigneten Klonierungs- und Sequenzierverfahren und Anleitungen, die ausreichen, um den Fachmann durch viele Klonierungsversuche zu leiten, sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (2. Aufl., Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laborstory (1989)), Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (Berger und Kimmel (Hrsg.), San Diego: Academic Press, Inc. (1987)), oder Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, et al. (Hrsg.), Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York (1987) beschrieben. Produktinformation von Herstellern von biologischen Reagenzien und experimentellem Gerät enthalten ebenfalls Information, die bei bekannten biologischen Verfahren nützlich ist. Derartige Hersteller schließen die SIGMA chemical company (Saint Louis, MO), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laborstories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company.(Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz), Invitrogen, San Diego, CA und Applied Biosystems (Foster City, CA) sowie viele andere kommerzielle Quellen, die dem Fachmann bekannt sind, ein.
1. Isolierung von SK-Kanalproteinen durch Nukleinsäurehybridisierung
Die isolierten Nukleinsäurezusammensetzungen gemäß dieser Erfindung, unabhängig davon, ob es sich dabei um RNA, cDNA, genomische DNA oder um ein Hybrid der verschiedenen Kombinationen handelt, werden aus biologischen Quellen isoliert oder in vitro synthetisiert. Desoxinukleotide können mit jedem geeigneten Verfahren, das zum Beispiel Klonieren und Restriktion von geeigneten Sequenzen einschließt, oder durch direkte chemische Synthese mit Verfahren, wie dem Phosphotriesterverfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979); dem Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979); dem Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981); dem Festphasen-Phosphoramidittriesterverfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22(20):1859-1862, z.B. unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers, z.B. wie in Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 beschrieben; und dem Festträgerverfahren von US-Patent Nr. 4,458,066 , hergestellt werden. Mit der chemischen Synthese wird ein einzelsträngiges Oligonukleotid hergestellt. Dieses kann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase unter Verwendung eines Einzelstrangs als Matrize in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass, während die chemische Synthese von DNA auf Sequenzen von etwa 100 Basen beschränkt ist, längere Sequenzen durch die Ligierung von kürzeren Sequenzen erhalten werden können.
Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 1 kodieren, können durch Amplifikation einer menschlichen Hippocampus-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimern mit der folgenden Sequenz erhalten werden:
ATGCCGGGTCCCCGGGCGGCCTGC (SEQ ID Nr. 5) und
TCACCCGCAGTCCGAGGGGGCCAC (SEQ ID Nr. 6). Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 2 kodieren, können durch Amplifikation einer Rattengehirn-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimern mit der folgenden Sequenz erhalten werden: ATGAGCAGCTGCAGGTACAACGGG (SEQ ID Nr. 7) und
CTAGCTACTCTCAGATGAAGTTGG (SEQ ID Nr. 8). Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 43 kodieren, können durch Amplifikation einer Rattengehirn-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimern mit der folgenden Sequenz erhalten werden: ATGAGCTCCTGCAAATACAGCGGT (SEQ ID Nr. 9) und TTAGCAACTGCTTGAACTTG (SEQ ID Nr. 10). Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 4 kodieren, können durch Amplifikation einer Rattengehirn-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimern mit der folgenden Sequenz erhalten werden:
TCAGGGAAGCCCCCGACCGTCAGT (SEQ ID Nr. 11) und TCACCCACAGTCTGATGCCGTGGT (SEQ ID Nr. 12). Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 19 kodieren, können durch Amplifikation einer menschlichen Hippocampus-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimern mit der folgenden Sequenz erhalten werden: ATGAGCAGCTGCAGGTACAACG (SEQ ID Nr. 23) und CTAGCTACTCTCTGATGAAGTTG (SEQ ID Nr. 24). Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 20 (hSK3) kodieren, können durch Amplifikation einer menschlichen Hippocampus-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimern mit der folgenden Sequenz erhalten werden: ATGAGCTCCTGCAAGTATAGC (SEQ ID Nr. 25) und TTAGCAACTGCTTGAACTTGTG (SEQ ID Nr. 26). Nukleinsäuren, die das IK-Kanalprotein von SEQ ID Nr. 32 kodieren, können durch Amplifikation einer menschlichen Pankreas-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von isolierten Nukleinsäureprimerpaaren mit der folgenden Sequenz erhalten werden: (SEQ ID Nr. 38 und 39) und (SEQ ID Nr. 40 und 41).
Die isolierten Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können durch in vitro-Verfahren, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), das Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS), das sich selbsterhaltende Sequenzreplikationssystem (SSR), kloniert oder amplifiziert werden. Eine breite Vielzahl von Klonierungs- und in vitro-Amplifikationsverfahren ist dem Fachmann gut bekannt. Beispiele dieser Techniken und Anleitungen, die ausreichen, um den Fachmann durch viele Klonierungsversuche zu leiten, sind in: Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual. (2. Aufl.) Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel); Cashion et al., US-Patent Nr. 5,017,478 ; und Carr, Europäisches Patent Nr. 0 246 864 , zu finden.
Beispiele von Verfahren, die ausreichen, um den Fachmann durch in vitro-Amplifikationsverfahren zu leiten, sind in: Berger, Sambrook und Ausubel, sowie Mullis et al., (1987) US-Patent Nr. 4,683,202 ; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. Hrsg) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1. Oktober 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science, 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology, 8: 291-294; Wu und Wallace, (1989) Gene, 4: 560; und Barringer et al. (1990) Gene, 89:117, zu finden.
Isolierte Nukleinsäuren, die SK-Kanalproteine kodieren, umfassen eine Nukleinsäuresequenz, die ein SK-Kanalprotein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20 und dessen Subsequenzen. In den bevorzugten Ausführungsformen ist die isolierte Nukleinsäure, die ein SK-Kanalprotein kodiert, aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22 und dessen Subsequenzen.
Zusätzlich zu den hier identifizierten isolierten Nukleinsäuren schließt die Erfindung auch andere isolierte Nukleinsäuren ein, die Kalzium-aktivierte Kaliumkanalproteine kodieren, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure selektiv hybridisieren, die ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 32, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47 und dessen Subsequenzen. Allgemein hybridisiert die isolierte Nukleinsäure, die ein Kalzium-aktiviertes Kaliumkanalprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, unter mindestens gemäßigt stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz der folgenden SEQ ID Nr.: 13, 14, 15, 16, 21, 22, 31, 44 oder 48, welche die Kernregion oder deren Subsequenz kodiert. In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich, kodiert die isolierte Nukleinsäure, die das Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein kodiert, eine Aminosäuresequenz von mindestens 60%, 70%, 80% oder 90% Ähnlichkeit über die Länge der Kernregion. In geeigneter Weise wird die Nukleinsäure, die eine Subsequenz der Kernregion kodiert, von den folgenden SEQ ID Nr. erhalten: 13, 14, 15, 16, 21, 22, 32, 44 oder 48, und hat mindestens eine Länge von 15 bis 400 Nukleotiden und im Allgemeinen eine Länge von mindestens 250 oder 300 Nukleotiden; vorzugsweise kodiert die Nukleinsäure die gesamte Kernsequenz. Die Nukleinsäuresequenz oder deren Subsequenz, die das Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein kodiert, umfasst eine Länge von mindestens N' Nukleotiden, wobei N' eine der ganzen Zahlen ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 18 bis 2000. Folglich umfassen die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung genomische DNA und Kerntranskripte, die SK-Kanalproteine kodieren.
Wenn die Nukleinsäure, die ein SK-Kanalprotein kodiert, als Nukleinsäuresonden verwendet werden soll, es ist häufig wünschenswert, die Nukleinsäure mit detektierbaren Markierungen zu markieren. Die Markierungen können durch eines von mehreren Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, eingebracht werden. Jedoch wird die Markierung in einer bevorzugten Ausführungsform während des Amplifikationsschrittes bei der Herstellung der Nukleinsäuren gleichzeitig eingebracht. Folglich stellt zum Beispiel die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit markierten Primern oder markierten Nukleotiden ein markiertes Amplifikationsprodukt bereit. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bringt die Transkriptionsamplifikation unter Verwendung eines markierten Nukleotids (z.B. Fluoreszein-markiertes UTP und/oder CTP) eine Markierung in die transkribierten Nukleinsäuren ein.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Markierung direkt zu einer ursprünglichen Nukleinsäureprobe (z.B. mRNA, polyA mRNA, cDNA usw.) oder zum Amplifikationsprodukt, nachdem die Amplifikation beendet ist, zugefügt werden. Mittel zum Anbringen von Markierungen an Nukleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt und schließen zum Beispiel Nicktranslation oder Endmarkierung (z.B. mit einer markierten RNA) durch Phosphorylierung der Nukleinsäure und nachfolgendes Anbringen (Ligierung) eines Nukleinsäurelinkers, der die Probennukleinsäure mit einer Markierung verbindet (z.B. einem Fluorophor), ein.
Detektierbare Markierungen, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen jede Zusammensetzung ein, die durch spektralanalytische, radioisotopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar sind. Nützliche Markierungen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Biotin zum Färben mit markiertem Streptavidinkonjugat, magnetische Kügelchen, Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluorescein, Texasrot, Rhodamin, grünes Fluoreszenzprotein und dergleichen), radioaktive Markierungen (z.B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴O oder ³²P), Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und andere, die allgemein in einem ELISA verwendet werden) sowie kolorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastik- (z.B. Polystyrol-, Polypropylen-, Latex- usw.) Kügelchen, ein. Patente, die die Verwendung derartiger Markierungen lehren, schließen die US-Patente Nr. 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 und 4,366,241 ein.
Mittel zum Detektieren derartiger Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Folglich können zum Beispiel radioaktive Markierungen unter Verwendung eines photographischen Films oder von Szintillationszählern detektiert werden, Fluoreszenzmarker können unter Verwendung eines Photodetektors detektiert werden, um emittiertes Licht zu detektieren. Enzymatische Markierungen werden typischerweise durch Bereitstellen des Enzyms mit einem Substrat und Detektieren des Reaktionsprodukts detektiert, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat hergestellt wird, und kolorimetrische Markierungen werden durch einfaches Sichtbarmachen der farbigen Markierungen detektiert.
Die Sonden werden verwendet, um genomische oder cDNA-Bibliotheken aus jeder Quelle von Interesse zu screenen, einschließlich spezifischer Gewebe (z.B. vom Herz. Gehirn, Pankreas) und einer Tierquelle, wie Ratte, Mensch, Vogel usw. Screeningverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind in den allgemeinen Texten beschrieben, die vorstehend zitiert sind, wie in Sambrook und Ausubel.
2. Isolierung von SK-Kanalproteinen durch Immunoscreening
Zusätzlich zur Verwendung von Nukleinsäuresonden zur Identifizierung von neuen Formen des hier beanspruchten Proteins ist es möglich, Antikörper zu verwenden, um Expressionsbibliotheken zu prüfen. Dies ist eine gut bekannte Technologie. (Siehe Young und Davis, 1982 Efficient isolation of genes using antibody grobes, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 80:1194-1198.) Im Allgemeinen kann eine cDNA-Expressionsbibliothek aus im Handel erhältlichen Kits oder unter Verwendung von leicht erhältlichen Komponenten hergestellt werden. Phagenvektoren sind bevorzugt, aber eine Vielzahl anderer Vektoren ist für die Expression eines Proteins erhältlich. Derartige Vektoren schließen ein, sind aber ist nicht beschränkt, auf Hefe, Tierzellen und Xenopus Oozyten. Man wählt mRNA aus einer Quelle aus, die mit dem Zielprotein angereichert ist und erzeugt cDNA, welche dann in einen Vektor ligiert und zum Immunoscreening in die Bibliothekswirtszellen transformiert wird. Das Screening bezieht das Binden und das Sichtbarmachen von Antikörpern ein, die an spezifischen Proteinen an Zellen gebunden sind oder an einem festen Träger, wie Nitrozellulose- oder Nylonmembranen, immobilisiert sind. Positive Klone werden für die Reinigung zur Homogenität ausgewählt, und die isolierte cDNA wird dann zur Expression in den gewünschten Wirtszellen hergestellt. Ein guter allgemeiner Überblick über diese Technologie ist in: Methods of Cell Biology Bd 37, mit dem Titel Antibodies in Cell Biology, Hrsg. DJ Asai S 369-382, 1993 zu finden.
Wenn sie ausgewählt werden, um Kalzium-aktivierte Kanalproteine zu erhalten, können Antikörper, die für das gesamte Protein oder Teile selektiv sind, verwendet werden. Geeignete Peptidsequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt, auf GHRRALFEKRKRLSDY (SEQ ID Nr. 28), FTDASSRSIGAL (SEQ ID Nr. 29) und ARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTKR (SEQ ID Nr. 30) oder ARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTK (SEQ ID Nr. 42).
Nukleinsäureanalysen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Detektieren und/oder Quantifizieren der SK-Kanalproteinexpression durch Durchführen einer Analyse für das Gentranskript (z.B. Kern-RNA, mRNA). Die Analyse kann auf die Gegenwart oder das Fehlen des normalen Gens oder Genprodukts, auf die Gegenwart oder das Fehlen eines anormalen Gens oder Genprodukts, oder die Quantifizierung der Transkriptionsspiegel eines normalen oder anormalen SK-Kanalprotein-Genprodukts zielen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäureanalysen mit einer Probe einer Nukleinsäure, die aus dem zu testenden Organismus isoliert worden ist, durchgeführt. In der einfachsten Ausführungsform ist solch eine Nukleinsäureprobe die Gesamt-mRNA, die aus einer biologischen Probe isoliert worden ist. Die Nukleinsäure (z.B. entweder genomische DNA oder mRNA) kann aus der Probe gemäß einem von mehreren Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, isoliert werden.
Verfahren zum Isolieren von Gesamt-DNA oder mRNA zur Verwendung unter anderem in einer Nukleinsäureanalyse sind dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel sind Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren in Kapitel 3 von Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Teil 1. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, Hrsg. Elsevier, N.Y. (1993) ausführlich beschrieben. Der Fachmann erkennt, dass, wenn Änderungen der Kopienzahl des Gens, das ein SK-Kanalprotein kodiert, detektiert werden sollen, vorzugsweise genomische DNA isoliert wird. Umgekehrt wird, wenn Expressionsspiegel eines Gens oder von Genen detektiert werden sollen, vorzugsweise RNA (mRNA) isoliert.
Häufig ist es wünschenswert, die Nukleinsäureprobe vor der Hybridisierung zu amplifizieren. Der Fachmann erkennt, dass, welches Amplifikationsverfahren auch immer verwendet wird, darauf geachtet werden muss, ein Verfahren zu verwenden, das die relativen Häufigkeiten der amplifizierten Nukleinsäuren beibehält oder reguliert, wenn ein quantitatives Ergebnis gewünscht ist. Verfahren zur „quantitativen" Amplifikation sind dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel schließt quantitative PCR das gleichzeitige gemeinsame Amplifizieren einer bekannten Menge einer Kontrollsequenz unter Verwendung derselben Primer ein. Dies stellt einen internen Standard bereit, der verwendet werden kann, um die PCR-Reaktion zu kalibrieren. Die Anordnung hoher Dichte kann dann Sonden, die zum internen Standard spezifisch sind, zur Quantifizierung der amplifizierten Nukleinsäure einschließen. Ausführliche Protokolle zur quantitativen PCR sind in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990), angegeben.
Das Verfahren zum Detektieren der Gegenwart einer Nukleinsäuresequenz, die ein SK-Kanalprotein kodiert, umfasst im Allgemeinen: (a) das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wobei eine Nukleinsäuresonde ein Nukleinsäuresegment umfasst, welches an eine Nukleinsäuresequenz (Ziel) selektiv hybridisiert, die ein SK-Kanalprotein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 43 und SEQ ID Nr. 47; (b) spezifisches Hybridisieren der Sonde an die Nukleinsäure, die ein SK-Kanalprotein kodiert, um einen Hybridisierungskomplex zu erzeugen, wobei die Detektion des Hybridisierungskomplexes eine Indikation der Gegenwart der SK-Nukleinsäuresequenz in der Probe ist.
Das Nukleinsäuresegment der Sonde ist eine Subsequenz mit einer Länge von mindestens N" benachbarten Nukleotiden einer Nukleinsäure, die einen SK-Kanal kodiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 44 und SEQ ID Nr. 48 sowie deren komplementären Sequenzen. N" ist eine der ganzen Zahlen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus jeder der ganzen Zahlen von 15 bis 1500. „Benachbarte Nukleotide" von einer Bezugsnukleinsäure bedeutet eine Sequenz von Nukleotiden mit derselben Reihenfolge und direkt neben denselben Nukleotiden (d.h. ohne Additionen oder Deletionen) wie bei der Bezugsnukleinsäure. Typischerweise hat das Nukleinsäuresegment eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden. Die bevorzugte Länge der Nukleinsäuresonde beträgt von 24 bis 200 Nukleotiden.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen leitet sich das Nukleinsäuresegment von einer Nukleinsäure ab, welche eine Kernregion eines Proteins kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 und 47. In geeigneter Weise ist die Nukleinsäure, welche die Kernregion kodiert, eine Subsequenz einer Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den: SEQ ID Nr.: 13, 14, 15, 16, 21, 22, 31, 44, 48 und deren komplementären Sequenzen. Gewöhnlich und insbesondere bei der Kreuzhybridisierung zwischen Spezies (Cross-Species Hybridization) würde das Nukleinsäuresegment eine Aminosäuresequenz innerhalb der Kernregion kodieren und eine Länge von mindestens 250 Nukleotiden haben, am meisten bevorzugt die Gesamtheit der Kernregion kodieren und/oder an die Zielsequenz unter gemäßigt stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
Der Fachmann erkennt, dass Nukleinsäuresequenzen der Sonde so ausgewählt sind, dass sie die selektive Hybridisierung des Nukleinsäuresegments an das Ziel nicht beeinträchtigen. Folglich werden zum Beispiel alle zusätzlichen Nukleotide, die an dem Nukleinsäuresegment angebracht sind, allgemein so ausgewählt, dass sie weder unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäureziel (potentiell falsch negativ) noch an Nukleinsäuren selektiv hybridisieren, die keine SK-Kanalproteine oder -peptide kodieren (potentiell falsch positiv). Die Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen, um die Selektivität und Spezifität sicherzustellen, sind dem Fachmann bekannt. Im Allgemeinen sollte die Länge der Sonde auf eine Minimallänge gehalten werden, die erforderlich ist, um die gewünschten Ergebnisse zu erreichen. Die Länge der Nukleinsäure, die ein SK-Kanalprotein oder -peptid kodiert (d.h. die „SK-Kanalprotein-Nukleinsäure"), wird vorstehend ausführlicher diskutiert, beträgt aber vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide.
Eine Vielzahl von Nukleinsäurehybridisierungsformaten ist dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel schließen gebräuchliche Formate Sandwichanalysen und Kompetitiv- oder Verdrängungsanalysen ein. Hybridisierungsverfahren sind allgemein in Berger und Kimmel, (1987), ibid.; „Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach" (Harnes, B.D. und Higgins, S.J. (Hrsg.), IRL Press, 1985; Gall und Pardue, (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 63:378-383 (1969)); und John, Burnsteil und Jones (Nature, 223:582-587 (1969)) beschrieben.
Sandwichanalysen sind kommerziell nützliche Hybridisierungsanalysen zum Detektieren oder Isolieren von Nukleinsäuresequenzen. Derartige Analysen verwenden eine an einem festen Träger kovalent immobilisierte „Capture"-Nukleinsäure und eine markierte „Signal"-Nukleinsäure in Lösung. Die biologische Probe stellt die Zielnukleinsäure bereit. Die „Capture"-Nukleinsäuresonde und die „Signal"-Nukleinsäure hybridisieren an der Zielnukleinsäure, so dass ein „Sandwich"-Hybridisierungskomplex erzeugt wird. Um wirksam zu sein, kann die Signalnukleinsäure nicht an der Capturenukleinsäure hybridisieren.
Bei der in situ-Hybridisierung wird die Zielnukleinsäure von ihrer zellulären Umgebung so befreit, dass sie für die Hybridisierung innerhalb der Zelle verfügbar ist, während die zelluläre Morphologie für nachfolgende Interpretation und Analyse konserviert wird. Die folgenden Artikel geben einen Überblick über das Fachgebiet der in situ-Hybridisierung: Singer et al., Biotechniques 4(3):230-250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, Bd. VII, S. 189-226 (1984); Wilkinson, "The theory and practice of in situ hybridization" in: In situ Hybridization, Hrsg. D.G. Wilkinson. IRL Press, Oxford University Press, Oxford, und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hrsg. Harnes, B.D. and Higgins, S.J., IRL Press (1987).
Typischerweise werden markierte Signalnukleinsäuren verwendet, um Hybridisierung zu detektieren. Komplementäre Nukleinsäuren oder Signalnukleinsäuren können mit einem von mehreren Verfahren markiert werden, die typischerweise angewendet werden, um die Gegenwart von hybridisierten Oligonukleotiden zu detektieren. Das häufigste Verfahren der Detektion ist die Anwendung der Autoradiographie mit ³H-, ¹²⁵I-, ³⁵S-, ¹⁴C- oder ³²P-markierten Sonden oder dergleichen. Andere Markierungen schließen an markierte Antikörper bindende Liganden, Fluorophore, Chemolumineszenzagenzien, Enzyme und Antikörper, welche als spezifische Bindungspaarmitglieder für einen markierten Liganden dienen können, ein.
Die Markierung kann auch die indirekte Detektion des Hybridisierungskomplexes zulassen. Zum Beispiel kann, wenn die Markierung ein Hapten oder Antigen ist, die Probe unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden. Bei diesen Systemen wird ein Signal durch Anbringen von Fluoreszenz- oder Enzymmolekülen an die Antikörper oder in einigen Fällen durch Anbringen einer radioaktiven Markierung erzeugt. (Tijssen, „Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Burdon, van Knippenberg (Hrsg.), Elsevier, S. 9-20 (1985)).
Die detektierbare Markierung, die in den Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch eines von mehreren Mitteln eingebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. wie vorstehend diskutiert. Mittel zum Detektieren derartiger Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Sensitivität der Hybridisierungsanalysen kann durch die Verwendung eines Nukleinsäureamplifikationssystems erhöht werden, welches die Zielnukleinsäure, die detektiert wird, multipliziert. Beispiele derartiger Systeme schließen das Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) System und das Ligase-Kettenreaktions- (LCR-) System ein. Andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sind das Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikations- (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) und das Qβ-Replikasesystem.
Der Fachmann erkennt, dass anormale Expressionsspiegel oder anormale Expressionsprodukte (z.B. mutierte Transkripte, trunkierte oder Non-Sense-Proteine) durch Vergleich mit normalen Expressionsspiegeln und normalen Expressionsprodukten identifiziert werden. Normale Expressionsspiegel oder normale Expressionsprodukte können für jede einzelne Population, Subpopulation oder Gruppe von Organismen gemäß den Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Typischerweise schließt dies die Identifikation gesunder Organismen (d.h. von Organismen mit einem funktionellen SK-Kanalprotein, wie durch solche Eigenschaften, wie Leitfähigkeit und Kalziumsensitivität, angezeigt) und die Messung von Expressionsspiegeln des SK-Kanalproteingens (wie hier beschrieben) oder die Sequenzierung des Gens, der mRNA oder der revers transkribierten cDNA ein, um typische (normale) Sequenzveränderungen zu erhalten. Die Anwendung von statistischen Standardverfahren, die in der Molekularen Genetik angewendet werden, erlaubt die Bestimmung von Grundlinienspiegeln der Expression und von normalen Genprodukten sowie von wesentlichen Abweichungen von derartigen Grundlinienspiegeln.
Nukleinsäureanalysekits
Die Nukleinsäuren gemäß dieser Erfindung können in einem Kit enthalten sein, welcher verwendet werden kann, um in einer biologischen Probe die Gegenwart oder das Fehlen des normalen Gens oder Genprodukts, das einen SK-Kanal gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, auf die Gegenwart oder das Fehlen eines anormalen Gens oder Genprodukts, das einen SK-Kanal kodiert, oder die Quantifizierung der Transkriptionsspiegel eines normalen oder anormalen SK-Kanalprotein-Genprodukts zu bestimmen. Der Kit enthält typischerweise eine stabile Zubereitung der Nukleinsäuresonden zur Durchführung der Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung. Ferner kann der Kit auch eine Hybridisierungslösung entweder in trockener oder flüssiger Form zur Hybridisierung von Sonden, um Kalzium-aktivierte Kaliumkanalproteine oder Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein-Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung anzupeilen, eine Lösung zum Waschen und Entfernen unerwünschter und nicht-hybridisierter Nukleinsäuren, ein Substrat zum Detektieren des Hybridisierungskomplexes und/oder Anleitungen zum Durchführen und Interpretieren der Analyse enthalten.
Expression von Nukleinsäuren
Sobald die Nukleinsäuren, die ein SK-Kanalprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, isoliert und kloniert sind, kann man das gewünschte Protein in einer rekombinant konstruierten Zelle, wie in Bakterien-, Hefe-, Insekten- (besonders unter Verwendung von Baculovirusvektoren) und Säugetierzellen exprimieren. Ein „rekombinantes Protein" ist ein Protein, das unter Verwendung von Zellen produziert ist, die in ihrer nativen Form keine endogene Kopie der DNA aufweisen, die in der Lage ist, das Protein zu exprimieren. Die Zellen produzieren das rekombinante Protein, weil sie durch die Einbringung der geeigneten isolierten Nukleinsäuresequenz (z. B. einem Vektor, der eine SK-Kanalprotein-Nukleinsäure enthält) genetisch verändert worden sind.
Es wird erwartet, dass sich der Fachmann in den zahlreichen Expressionssystemen gut auskennt, die für die Expression von DNA, die SK-Kanalproteine kodiert, verfügbar sind. Es wird kein Versuch unternommen, die verschiedenen Verfahren, die für die Expression von Proteinen in Prokaryoten oder Eukaryoten bekannt sind, ausführlich zu beschreiben.
Kurz zusammengefasst, wird die Expression von natürlichen oder synthetischen Nukleinsäuren, die Kalzium-aktivierte Kaliumkanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, typischerweise durch funktionsfähiges Verbinden der DNA oder cDNA mit einem Promotor (welcher entweder konstitutiv oder induzierbar ist), gefolgt von der Einbringung in einen Expressionsvektor, erreicht. Die Vektoren können zur Replikation und Integration entweder in Prokaryoten oder Eukaryoten geeignet sein. Typische Expressionsvektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Initiationssequenzen und Promotoren, die zur Regulation der Expression der DNA, die das SK-Kanalprotein kodiert, nützlich sind. Um einen hohen Expressionsspiegel eines klonierten Gens zu erhalten, ist es wünschenswert, Expressionsvektoren zu konstruieren, welche mindestens einen starken Promotor, um die Transkription zu leiten, eine Ribosomenbindungsstelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptions-/Translationsterminator enthalten. Der Fachmann würde erkennen, dass Änderungen an einem SK-Kanalprotein durchgeführt werden können, ohne seine biologische Aktivität zu vermindern. Einge Änderungen können durchgeführt werden, um das Klonieren, die Expression oder die Einbringung des zielgerichteten Moleküls in ein Fusionsprotein zu erleichtern. Derartige Änderungen sind dem Fachmann bekannt und schließen zum Beispiel ein Methionin, das am Aminoterminus addiert wird, um eine Initiationsstelle zu schaffen, oder zusätzliche Aminosäuren (z.B. polyHis) ein, die an jedem der Termini angeordnet sind, um in geeigneter Weise gelegene Restriktionsstellen oder Terminationscodons oder Reinigungssequenzen zu erzeugen.
1. Expression in Prokaryoten
Beispiele von regulatorischen Regionen, die für diesen Zweck in E. coli geeignet sind, sind die Promotor- und Operatorregion des E. coli-Tryptophanbiosynthesestoffwechselwegs, wie von Yanofsky, Bacteriol. 158:1018-1024 (1984) beschrieben, und der nach links gerichtete Promotor des Phagen lambda (P_L), wie von Herskowitz und Hagen, Ann. Rev. Genet., 14:399-445 (1980) beschrieben. Die Einbringung von Selektionsmarkern in DNA-Vektoren, die in E. coli transfiziert werden, ist auch nützlich. Beispiele derartiger Marker schließen Gene ein, die Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol spezifizieren. Siehe Sambrook, et al. hinsichtlich Einzelheiten, die Selektionsmarker zur Verwendung in E. coli betreffen.
Der Vektor wird ausgewählt, um eine Einbringung in die geeignete Wirtszelle zu erlauben. Bakterielle Vektoren stammen typischerweise von Plasmiden oder Phagen. Geeignete bakterielle Zellen werden mit Phagenvektorteilchen infiziert oder mit nackter Phagenvektor-DNA transfiziert. Wenn ein Plasmidvektor verwendet wird, werden die bakteriellen Zellen mit der Plasmidvektor-DNA transfiziert. Expressionssysteme zum Exprimieren von SK-Kanalproteinen sind unter Verwendung von E. coli, Bacillus sp. und Salmonella verfügbar (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)).
Wenn SK- oder IK-Kanalproteine in S. typhimurium exprimiert werden, sollte man die inhärente Instabilität von Plasmidvektoren kennen. Um dies zu verhindern, kann das fremde Gen in eine nicht-essentielle Region des Wirtschromosoms eingebracht werden. Dies wird erreicht, indem das Gen zunächst in ein Plasmid eingeführt wird, so dass es von Regionen von DNA flankiert wird, die zur Insertionsstelle im Salmonella-Chromosom homolog ist. Nach der Einbringung des Plasmids in das S. typhimurium, wird das fremde Gen durch homologe Rekombination zwischen die flankierenden Sequenzen und chromosomale DNA in das Chromosom eingebracht.
Ein Beispiel davon, wie dies erreicht werden kann, beruht auf dem his-Operon von Salmonella. Zwei Schritte sind in dieses Verfahren einbezogen. Zuerst muss ein Segment des his-Operons in dem Salmonella-Stamm, der als Träger ausgewählt ist, deletiert werden. Zweitens wird ein Plasmid, das die deletierte his-Region stromabwärts des Gens trägt, das das SK- oder IK-Kanalprotein kodiert, in den his-Salmonella-Stamm transfiziert. Die Integration sowohl von den his-Sequenzen als auch von einem Gen, das ein SK-Kanalprotein kodiert, findet statt, so dass sich rekombinante Stämme bilden, welche als his⁺ selektiert werden können.
Die Detektion des exprimierten Proteins wird durch Verfahren erreicht, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und die zum Beispiel Radioimmunoassays, Westernblot-Verfahren oder Immunpräzipitation einschließen. Die Reinigung von E. coli kann nach den Verfahren erreicht werden, die in US-Patent Nr. 4,511,503 beschrieben sind.
2. Expression in Eukaryoten
Eine Vielzahl von eukaryotischen Expressionssystemen, wie Hefe, Insektenzelllinien, Vogel-, Fisch-, Frosch- und Säugetierzellen, sind dem Fachmann bekannt. Wie nachstehend kurz erklärt, können SK-Kanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung in diesen eukaryotischen Systemen exprimiert werden. Die Expression von SK- oder IK-Kanälen in Eukaryoten ist besonders bevorzugt.
Die Synthese von heterologen Proteinen in Hefe ist bekannt. Methods in Yeast Genetics, Sherman, F. et al., Cold Spring Harbor Laborstory, (1982) ist eine anerkannte Arbeit, in der die verschiedenen Verfahren beschrieben sind, die verfügbar sind, um das Protein in Hefe zu produzieren. Geeignete Vektoren weisen üblicherweise Expressionskontrollsequenzen auf, wie Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glykolytische Enzyme und einen Ursprung der Replikation, Terminationssequenzen und dergleichen, wie gewünscht. Zum Beispiel sind geeignete Vektoren in der Literatur beschrieben (Botstein et al. 1979, Gene, 8:17-24; Broach et al., 1979, Gene, 8:121-133).
Zwei Verfahren werden in transfizierenden Hefezellen verwendet. In einem Fall werden Hefezellen zuerst unter Verwendung von Zymolyase, Lyticase oder Glusulase in Protoplasten umgewandelt, gefolgt von der Zugabe von DNA und Polyethylenglykol (PEG). Die PEG-behandelten Protoplasten werden dann in einem 3% Agarmedium unter selektiven Bedingungen regeneriert. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in den Aufsätzen von J.D. Beggs, 1978, Nature (London), 275:104-109; und Hinnen, A. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933 spezifiziert. Das zweite Verfahren schließt keinen Abbau der Zellwand ein. Stattdessen werden die Zellen mit Lithiumchlorid oder -acetat und PEG behandelt und auf selektive Platten gesetzt (Ito, H. et al., 1983, J. Bact., 153:163-168).
Die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung können, sobald sie exprimiert sind, durch Lysieren der Zellen und Anwenden von Standardprotein-Isolierungsverfahren auf die Lysate aus der Hefe isoliert werden. Die Überwachung des Reinigungsverfahrens kann unter Verwendung von Westernblot-Verfahren oder Radioimmunoassay von anderen Standardimmunoassayverfahren erreicht werden.
Die Sequenzen, die die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine kodieren, können auch zu verschiedenen Expressionsvektoren zur Verwendung in transfizierenden Zellkulturen, zum Beispiel von Säugetier-, Insekten-, Vogel-, Amphibien- oder Fischursprung, ligiert werden. Veranschaulichend für Zellkulturen, die für die Produktion der Peptide nützlich sind, sind Säugetierzellen. Säugetierzellsysteme liegen häufig in Form von einzelligen Schichten von Zellen vor, obwohl auch Säugetierzellsuspensionen verwendet werden können. Mehrere geeignete Wirtszelllinien, die in der Lage sind, intakte Proteine zu exprimieren, sind auf dem Fachgebiet entwickelt worden und schließen die HEK293-, BHK21- und CHO-Zelllinien sowie verschiedene menschliche Zelllinien, wie COS-Zelllinien, HeLa-Zellen, Myelom-Zelllinien, Jurkat-Zellen, ein. In einigen Ausführungsformen werden Xenopus Oozyten verwendet. Der Fachmann erkennt, dass bevorzugte Zelllinien zum Exprimieren von SK-Kanälen im Wesentlichen Leitfähigkeiten fehlen, welche mit solchen konkurrieren, die durch die Kalziumaktivierten Kaliumkanäle gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden (d.h. „stille Linien"). Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen, wie einen Ursprung der Replikation, einen Promotor (z.B. den CMV-Promotor, einen HSV-tk-Promotor oder pgk- (Phosphoglyceratkinase-) Promotor), einen Enhancer (Queen et al. (1986) Immunol. Rev. 89:49) und erforderliche Verarbeitungsinformationsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylationsstellen (z. B. eine große SV40-large T Ag poly A-Additionsstelle) und Transkriptionsterminatorsequenzen, einschließen. Andere Tierzellen, die zur Produktion von SK-Kanalproteinen nützlich sind, sind zum Beispiel vom American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7. Auflage, 1992) erhältlich.
Geeignete Vektoren zum Exprimieren von SK-Kanalproteinen in Insektenzellen leiten sich gewöhnlich von dem Baculovirus SF9 ab. Geeignete Insektenzelllinien schließen Moskitolarven-, Seidenraupen-, Heerwurm-, Motten- und Drosophila-Zelllinien, wie eine Schneider-Zelllinie (siehe Schneider J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-365 (1987), ein.
Wie vorstehend gezeigt, enthält der Vektor, z.B. ein Plasmid, welches verwendet wird, um die Wirtszelle zu transfizieren, vorzugsweise DNA-Sequenzen, um die Transkription zu initiieren, und Sequenzen, um die Translation des Proteins zu regulieren. Diese Sequenzen werden als Expressionskontrollsequenzen bezeichnet.
Wie bei Hefe, müssen, wenn Wirtszellen höherer Tiere verwendet werden, Polyadenlyations- oder Transkriptionsterminatorsequenzen von bekannten Säugetiergenen in den Vektor eingebracht werden. Ein Beispiel einer Terminatorsequenz ist die Polyadenlyationssequenz vom Rinderwachstumshormongen. Sequenzen zum genauen Spleißen des Transkripts können auch eingeschlossen sein. Ein Beispiel einer Spleißsequenz ist das VP1-Intron von SV40 (Sprague, J. et al., 1983, J. Virol. 45: 773-781).
Außerdem können Gensequenzen zum Regulieren der Replikation in der Wirtszelle in den Vektor eingebracht werden, wie solche, die in Vektoren des Rinderpapillomavirus-Typs gefunden werden. Saveria-Campo, M., 1985, „Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector" in: DNA Cloning Bd. II A Practical Approach Hrsg. D.M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia S. 213-238.
Die Wirtszellen sind für die Transfektion befähigt oder werden durch verschiedene Mittel dafür befähigt. Es gibt mehrere bekannte Verfahren zum Einführen von DNA in Tierzellen. Diese schließen ein: Kalziumphosphatpräzipitation, Fusion der rezipienten Zellen mit bakteriellen Protoplasten, die die DNA enthalten, Behandlung der rezipienten Zellen mit Liposomen, die die DNA enthalten, DEAE-Dextran, Elektroporation und Mikro-Injektion der DNA direkt in die Zellen. Die transfizierten Zellen werden durch Mittel, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, gezüchtet. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., (1977). Die exprimierten Proteine werden durch gut bekannte mechanische, chemische oder enzymatische Mittel zurück gewonnen.
Reinigung von exprimierten Peptiden
Die SK-Kanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung, welche durch rekombinante DNA-Technologie produziert werden, können mit Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden. Rekombinant produzierte SK-Kanalproteine können direkt exprimiert oder als Fusionsprotein exprimiert werden. Das rekombinante Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch eine Kombination von Zelllyse (z. B. Ultraschall) und Affinitätschromatographie gereinigt. Für Fusionsprodukte setzt der nachfolgende Verdau des Fusionsproteins mit einem geeigneten proteolytischen Enzym das gewünschte rekombinante Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein frei.
Die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine gemäß dieser Erfindung, ob rekombinant oder synthetisch, können mit Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, die selektive Präzipitation mit solchen Stoffen, wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immunrenigungsverfahren und andere einschließen, zu erheblicher Reinheit gereinigt werden. Siehe zum Beispiel R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press, 1990. Zum Beispiel können die Proteine gemäß dieser Erfindung durch Immunaffinitätssäulen unter Verwendung von Antikörpern, die gegen die hier beschriebenen SK-Kanalproteine gezüchtet werden, gereinigt werden.
Antikörper gegen Kalzium-aktivierte Kaliumkanalproteine
Antikörper werden gegen das SK-Kanalprotein gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich Individuum-, Allel-, Stamm- oder Speziesvarianten und deren Fragmenten, sowohl in ihren natürlich vorkommenden Formen (voller Länge) als auch in rekombinanten Formen gezüchtet. Außerdem werden Antikörper gegen diese Proteine entweder in ihren nativen Konfigurationen oder in nicht-nativen Konfigurationen gezüchtet. Anti-Idiotyp-Antikörper können auch erzeugt werden. Viele Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Die folgende Diskussion wird als allgemeiner Überblick über die verfügbaren Verfahren dargestellt; jedoch erkennt der Fachmann, dass viele Varianten zu den folgenden Verfahren bekannt sind.
A. Antikörperproduktion
Mehrere Immunogene sind verwendet worden, um Antikörper zu produzieren, die mit einem SK-Kanalprotein spezifisch reaktiv sind. Ein isoliertes rekombinantes, synthetisches oder natives SK-Kanalprotein mit einer Länge von 5 Aminosäuren oder größer und ausgewählt aus einer Subsequenz von SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 oder 47 sind die bevorzugten Immunogene (Antigen) für die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. Der Fachmann versteht leicht, dass die Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung typischerweise vor der Erzeugung von Antikörpern zum Screenen von Expressionsbibliotheken oder anderen Assays, in welchen ein mutmaßliches Kalziumaktiviertes Kaliumkanalprotein gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, denaturiert oder in einer nicht-nativen Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur denaturiert werden. Beispielhafte Proteine zur Verwendung als Immunogene schließen ein, sind aber nicht beschränkt, auf GHRRALFEKRKRLSDY (SEQ ID Nr. 28), FTDASSRSIGAL (SEQ ID Nr. 29), ARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTKR (SEQ ID Nr. 30) und ARKLELTKAEKHVHNFMMDTQLTK (SEQ ID Nr. 42). In einer Klasse von bevorzugten Ausführungsformen ist auch ein Immunogen-Proteinkonjugat als Immunogen eingeschlossen. Natürlich vorkommende SK-Kanalproteine werden auch entweder in reiner oder unreiner Form verwendet.
Das SK- oder IK-Kanalprotein wird dann einem Tier injiziert, das in der Lage ist, Antikörper zu produzieren. Entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper können zur nachfolgenden Verwendung bei Immunoassays erzeugt werden, um die Gegenwart und Quantität des Kalzium-aktivierten Kaliumkanalproteins zu messen. Verfahren zum Produzieren von polyklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Kurz, es wird ein Immunogen (Antigen), vorzugsweise ein gereinigtes SK-Kanalprotein, ein SK-Kanalprotein, das mit einem geeigneten Träger (z.B. GST, Hämocyanin der Napfschnecke usw.) verbunden ist, oder ein SK-Kanalprotein, das in einen Immunisierungsvektor, wie einen rekombinanten Vacciniavirus (siehe US-Patent Nr. 4,722,848 ), eingebracht ist, mit einem Hilfsstoff gemischt, und Tiere werden mit dem Gemisch immunisiert. Die Immunreaktion des Tieres auf die Immunogenproduktion wird durch Nehmen von Testblut und Bestimmen des Titers der Reaktivität auf das interessierende Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein überwacht. Wenn geeignet hohe Titer von Antikörper gegen das Immunogen erhalten werden, wird Blut von dem Tier gesammelt, und Antiseren werden hergestellt. Falls gewünscht wird eine weitere Fraktionierung der Antiseren, um die Antikörper anzureichern, die mit dem SK-Kanalprotein reaktiv sind, durchgeführt (siehe z.B. Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; und Harlow und Lane (1989) Antibodies: A Laborstory Manual Cold Spring Harbor Press, NY).
Antikörper, einschließlich Bindungsfragmente und deren rekombinante Single-Chain-Versionen, gegen vorbestimmte Fragmente des SK-Kanalproteins werden, wie vorstehend beschrieben, durch Immunisieren von Tieren, z.B. mit Konjugaten der Fragmente mit Trägerproteinen gezüchtet. Typischerweise ist das interessierende Immunogen ein SK-Kanalprotein mit mindestens etwa 5 Aminosäuren, insbesondere typischerweise hat das SK-Kanalprotein eine Länge von 10 Aminosäuren, vorzugsweise 15 Aminosäuren, und stärker bevorzugt hat das Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein eine Länge von 20 Aminosäuren oder größer. Die Peptide werden typischerweise mit einem Trägerprotein (z.B. als Fusionsprotein) verbunden oder werden in einem Immunisierungsvektor rekombinant exprimiert. Antigendeterminanten an Peptiden, an welche Antikörper binden, haben typischerweise eine Länge von 3 bis 10 Aminosäuren.
Monoklonale Antikörper werden aus den Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper absondern. Monoklonale Antikörper werden zum Binden an das SK-Kanalprotein abgesucht, von welchem sich das Immunogen ableitet. Spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper binden gewöhnlich mit einer K_D von mindestens etwa 0,1 mM, gewöhnlicher von mindestens etwa 50 μM und am meisten bevorzugt von mindestens etwa 1 μM oder besser.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Säugetierwirten, wie Mäusen, Nagetieren, Primaten, Menschen usw. zu produzieren. Eine Beschreibung der Verfahren zur Produktion derartiger monoklonaler Antikörper wird z.B. gefunden in: Stites et al. (Hrsg.) Basic and Clinical Immunology (4. Aufl.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, und darin zitierte Bezüge; Harlow und Lane, ibid.; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Aufl.) Academic Press, New York, NY; und Kohler und Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Kurz zusammengefasst, läuft dieses Verfahren durch Injizieren eines Tieres mit einem Immunogen, das ein SK-Kanalprotein enthält, ab. Das Tier wird dann getötet, und die Zellen werden aus seiner Milz entnommen, welche mit Myelomzellen fusioniert werden. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle oder „Hybridoma", die in der Lage ist, in vitro zu reproduzieren. Die Population von Hybridomen wird dann gescreent, um einzelne Klone zu isolieren, von denen jeder eine einzige Antikörperspezies gegen das Immunogen absondert. Auf diese Art und Weise sind die einzelnen Antikörperspezies, die erhalten werden, die Produkte von immortalisierten und klonierten einzelnen B-Zellen aus dem immunen Tier, das in Reaktion auf eine spezifische Stelle erzeugt wird, die auf dem immunogenen Stoff erkannt wird.
Alternative Verfahren der Immortalisation schließen Transfektion mit Epstein-Barr-Virus, Oncogenen oder Retroviren oder andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ein. Kolonien, die aus einzelnen, immortalisierten Zellen entstehen, werden zur Produktion von Antikörpern der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen gescreent, und die Ausbeute der monoklonalen Antikörper, die mit derartigen Zellen produziert werden, wird durch verschiedene Verfahren, einschließlich Injektion in den peritonealen Raum eines Vertebraten- (vorzugsweise Säugetier-) Wirtes, erhöht. Die SK-Kanalproteine und Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung werden mit oder ohne Änderung verwendet und schließen chimäre Antikörper, wie humanisierte Mausantikörper, ein.
Andere geeignete Verfahren schließen Selektion von Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen- oder ähnlichen Vektoren ein (siehe z.B. Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; und Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546; und Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 309-314). In einer anderen Ausführungsform können monoklonale Antikörper des Menschen mit hoher Avidität aus transgenen Mäusen erhalten werden, die Fragmente von nicht-umgelagerten Ig-Loki des Menschen der schweren und leichten Kette (d.h. Minilokus von transgenen Mäusen) umfassen. Fishwild et al., Nature Biotech., 14:845-851 (1996).
Häufig werden SK-Kanalproteine und Antikörper entweder durch kovalentes oder nicht-kovalentes Verbinden mit einem Stoff, welcher ein detektierbares Signal liefert, markiert. Eine breite Vielzahl von Markierungen und Konjugationsverfahren sind bekannt, und von ihnen wird sowohl in der wissenschaftlichen als auch der Patentliteratur eingehend berichtet. Geeignete Markierungen schließen Radionukleotide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzreste, Chemolumineszenzreste, magnetische Teilchen und dergleichen ein. Patente, die die Verwendung derartiger Markierungen lehren, schließen die US-Patente Nr. 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 ; und 4,366,241 ein. Auch rekombinante Immunglobuline können produziert werden. Siehe Cabilly, US-Patent Nr. 4,816,567 ; und Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033.
Die Antikörper gemäß dieser Erfindung werden auch für die Affinitätschromatographie für die Isolierung von SK-Kanalproteinen verwendet. Säulen werden hergestellt, wobei z.B. Antikörper an einen festen Träger, z.B. Teilchen, wie Agarose, Sephadex oder dergleichen, gebunden sind, wobei ein Zelllysat durch die Säule geleitet, gewaschen und mit zunehmenden Konzentrationen eines milden Denaturierungsmittels behandelt wird, wodurch gereinigtes SK-Kanalprotein freigesetzt wird.
Die Antikörper können verwendet werden, um Expressionsbibliotheken auf bestimmte Expressionsprodukte, wie ein normales oder anormales SK-Kanalprotein des Menschen, zu screenen. Gewöhnlich werden die Antikörper in einem derartigen Verfahren mit einem Rest markiert, der eine einfache Detektion der Gegenwart eines Antigens durch Antikörperbindung erlaubt.
Antikörper, die gegen ein SK-Kanalprotein gezüchtet werden, können auch verwendet werden, um Anti-Idiotyp-Antikörper zu züchten. Diese sind zum Detektieren oder Diagnostizieren verschiedener pathologischer Zustände nützlich, die mit der Gegenwart der jeweiligen Antigene im Zusammenhang stehen.
B. Produktion von humanen oder humanisierten (chimären) Antikörpern
Die anti SK-Kanalprotein-Antikörper gemäß dieser Erfindung können auch einem Säugetier (z.B. einem menschlichen Patienten) für therapeutische Zwecke (z.B. zum Zielrichten von Molekülen, wenn sie mit Wirkmolekülen, wie Markierungen, Zytotoxinen, Enzymen, Wachstumsfaktoren, Arzneistoffen usw., konjugiert oder fusioniert sind) verabreicht werden. Antikörper, die einem anderen Organismus als der Spezies, in welcher sie gezüchtet worden sind, verabreicht werden, sind häufig immunogen. Folglich induzieren zum Beispiel Mausantikörper, die einem Menschen verabreicht worden sind, häufig eine Immunreaktion gegen den Antikörper (z.B. die Reaktion des Mensch-anti-Mausantikörpers (HAMA)) bei mehrfachen Verabreichungen. Die immunogenen Eigenschaften des Antikörpers werden durch das Ändern von Teilen des Antikörpers oder des gesamten Antikörpers in charakteristische menschliche Sequenzen verringert, wodurch jeweils chimäre oder menschliche Antikörper produziert werden.
i) Humanisierte (chimäre) Antikörper
Humanisierte (chimäre) Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, die einen humanen und einen nicht-humanen Teil umfassen. Genauer leitet sich die Antigen verbindende Region (oder variable Region) eines humanisierten chimären Antikörpers von einer nicht-humanen Quelle (z.B. der Maus) ab, und die konstante Region des chimären Antikörpers (welche dem Immunglobulin biologische Effektorfunktion verleiht) leitet sich von einer humanen Quelle ab. Der humanisierte chimäre Antikörper sollte die Antigenbindungsspezifität des nicht-humanen Antikörpermoleküls aufweisen, und ihr sollte die Effektorfunktion vom humanen Antikörpermolekül verliehen werden. Viele Verfahren zum Erzeugen chimärer Antikörper sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,502,167 , 5,500,362 , 5,491,088 , 5,482,856 , 5,472,693 , 5,354,847 , 5,292,867 , 5,231,026 , 5,204,244 , 5,202,238 , 5,169,939 , 5,081,235 , 5,075,431 und 4,975,369 ). Ausführliche Verfahren zur Produktion von chimären (humanisierten) Antikörpern können in US-Patent Nr. 5,482,856 gefunden werden.
ii) Humane Antikörper
In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung vollständig humane anti-SK-Kanalprotein-Antikörper bereit. Humane Antikörper bestehen vollständig aus charakteristischen humanen Polypeptidsequenzen. Die humanen anti SK-Kanalprotein-Antikörper gemäß dieser Erfindung können unter Verwendung einer breiten Vielzahl von Verfahren (siehe z.B. Larrick et al., US-Patent Nr. 5,001,065 zum Überblick) produziert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die humanen anti-SK-Kanalprotein-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung gewöhnlich zuerst in Triomazellen produziert. Die Gene, die die Antikörper kodieren, werden dann in anderen Zellen, insbesondere nicht-humanen, Säugetierzellen kloniert und exprimiert. Die allgemeine Herangehensweise zur Produktion von humanen Antikörpern durch die Triomatechnologie ist von Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, US-Patent Nr. 4,634,664 und Engelman et al., US-Patent Nr. 4,634,666 beschrieben worden. Die Antikörper-produzierenden Zelllinien, die mit diesem Verfahren erhalten werden, werden Triomas genannt, weil sie von drei Zellen abstammen; zwei humanen und einer Maus. Es wurde festgestellt, dass Triomas Antikörper stabiler produzieren als gewöhnliche Hybridomen, die aus humanen Zellen gebildet werden.
Die Gene, die die schweren und leichten Ketten der Immunglobuline kodieren, die von den Trioma-Zelllinien abgesondert werden, werden mit den Verfahren kloniert, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987; Co et al. (1992) J. Immunol., 148: 1149). Zum Beispiel werden Gene, die die schweren und die leichten Ketten kodieren, aus einer genomischen DNA oder cDNA einer Trioma kloniert, die durch reverse Transkription der RNA der Trioma produziert wird. Das Klonieren wird durch herkömmliche Verfahren erreicht, einschließlich der Verwendung von PCR-Primern, die an den Sequenzen hybridisieren, die die Gene oder Segmente von Genen, die kloniert werden sollen, flankieren oder diese überlappen.
Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein-Immunoassays
Immunoassays für SK-Kanalproteine können zu mindestens zwei verschiedenen Zwecken verwendet werden. Sie können verwendet werden, um die Verwandtschaft des Proteins aufgrund seiner Fähigkeit, immunologisch kreuzzureagieren, zu bestimmen oder zur Detektion der Gegenwart oder des Fehlens der Kanalproteine.
Bei der Bestimmung, ob ein unbekanntes Protein mit den Kanalproteinen gemäß dieser Erfindung verwandt ist, kann eine Vielzahl von Assays angewendet werden. Zum Beispiel und bevorzugt ist ein kompetitiver Immunoassay zum Prüfen auf Kreuzreaktivität. Zum Beispiel kann das Protein von SEQ ID Nr. 2 oder 32 an einem festen Träger immobilisiert werden. Proteine oder Peptide werden zu dem Assay zugefügt, welcher mit der Bindung der Antiseren um das immobilisierte Antigen konkurriert. Die Fähigkeit der vorstehenden Proteine, mit der Bindung der Antiseren um das immobilisierte Protein zu konkurrieren, wird mit dem Protein verglichen, von dem angenommen wird, dass es mit dem Testprotein verwandt ist.
Um sicher zu stellen, dass die Antiseren, die geprüft werden, an ein bestimmtes Protein spezifisch oder selektiv binden, werden sie auf Kreuzreaktivität mit anderen nah verwandten Proteinen geprüft. Dies lässt die Produktion von Seren zu, die zwischen Kanälen mit niedriger, mittlerer und hoher Leitfähigkeit unterscheiden. Die Kreuzreaktivität in Prozent für die vorstehenden Proteine kann unter Verwendung von Standardberechnungen berechnet werden. Antiseren mit weniger als 10% Kreuzreaktivität mit jedem der vorstehend aufgeführten Proteine werden ausgewählt und vereinigt. Gegebenenfalls werden die kreuzreagierenden Antikörper aus den vereinigten Antiseren durch Immunoabsorption mit den vorstehend aufgeführten Proteinen entfernt.
Die immunoabsorbierten und vereinigten Antiseren werden dann in einem kompetitiven Bindungsimmunoassay, wie vorstehend beschrieben, verwendet, um ein zweites Protein mit dem beanspruchten oder Prototypimmunogenprotein zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die beiden Proteine jeweils in einem breiten Bereich von Konzentrationen analysiert, und die Menge jedes Proteins, die erforderlich ist, um 50% der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Protein zu hemmen, wird bestimmt. Wenn die erforderliche Menge des Proteins kleiner als das Zweifache der Menge des Prototypproteins ist, dann wird von dem zweiten Protein gesagt, dass es an einen Antikörper spezifisch bindet, der gegen das Prototypimmunogen erzeugt wird. Wenn die Antikörper gegen ein kurzes Peptid erzeugt werden, werden die Testproteine gegebenenfalls denaturiert, um vollständig auf selektive Bindung zu prüfen. In Situationen, in denen das Zielpeptid für die Antikörper nicht leicht zugänglich ist, weil das Zielpeptid Teil eines größeren Proteins ist, ist es angemessen, die Verwandtschaft der Testproteine gegen Prototypproteine ähnlicher Größe zu messen, z.B. würde man ein Monomer mit vollständiger Länge gegen ein Prototypmonomer mit vollständiger Länge prüfen, selbst wenn die Antiseren gegen ein Peptid des Prototypmonomers erzeugt wurden. Dies vereinfacht das Lesen der Testergebnisse und vermeidet, Konformationsprobleme und Molekulargewicht/molare Konzentrationen bei der Bestimmung der Daten, die von den kompetitiven Immunoassays erzeugt worden sind, berücksichtigen zu müssen.
Mittel zum Detektieren der SK-Kanalproteine gemäß der vorliegenden Erfindung stellen keine kritischen Gesichtspunkte gemäß der vorliegenden Erfindung dar. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die SK-Kanalproteine unter Verwendung von mehreren gut bekannten Immunobindungsassays detektiert und/oder quantitativ bestimmt (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,366,241 ; 4,376,110 ; 4,517,288 und 4,837,168 ). Für einen Überblick der allgemeinen Immunoassays, siehe auch: Methods in Cell Biology Band 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Hrsg. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7. Auflage, Stites & Terr, Hrsg. (1991). Immunobindungsassays (oder Immunoassays) verwenden typischerweise ein „Capturemittel", um spezifisch an den Analyten (in diesem Fall ein Kalziumaktiviertes Kaliumkanalprotein) zu binden und diesen häufig zu immobilisieren. Das Capturemittel ist ein Rest, der spezifisch an den Analyten bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Capturemittel ein Antikörper, der (ein) Kalzium-aktiviertes) Kaliumkanalprotein(e) gemäß der vorliegenden Erfindung spezifisch bindet. Der Antikörper (anti SK-Kanalprotein-Antikörper) kann durch eines von mehreren Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, wie hier beschrieben, produziert werden.
Immunoassays verwenden häufig auch ein Markierungsmittel, um an den Bindungskomplex, der von dem Capturemittel und dem Analyten gebildet wird, spezifisch zu binden und ihn zu markieren. Das Markierungsmittel kann selbst einer der Reste sein, der den Antikörper/Analyt-Komplex enthält. Folglich kann das Markierungsmittel ein markiertes SK-Kanalprotein oder ein markierter anti-SK-Kanalprotein-Antikörper sein. In einer anderen Ausführungsform kann das Markierungsmittel ein dritter Rest, wie ein anderer Antikörper, sein, der spezifisch an den Antikörper/SK-Kanalproteinkomplex bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Markierungsmittel ein zweiter SK-Kanalprotein-Antikörper, der eine Markierung trägt. In einer anderen Ausführungsform kann dem zweiten SK-Kanalprotein-Antikörper eine Markierung fehlen, aber sie kann wiederum von einem markierten dritten Antikörper, der zu den Antikörpern der Spezies spezifisch ist, von welcher sich der zweite Antikörper ableitet, gebunden sein. Der Zweite kann mit einem detektierbaren Rest, wie Biotin, an welches ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, wie Enzymmarkiertes Streptavidin, modifiziert sein.
Andere Proteine, die in der Lage sind, konstante Immunglobulinregionen, wie Protein A oder Protein G, spezifisch zu binden, können ebenfalls als Markierungsmittel verwendet werden. Diese Proteine sind normale Bestandteile der Zellwände von Streptokokken-Bakterien. Sie zeigen eine starke nicht-immunogene Reaktivität mit konstanten Immunglobulinregionen von einer Vielzahl von Spezies (siehe allgemein Kronval et al. (1973) J. Immunol., 111: 1401-1406 und Akerstrom, et al. (1985) J. Immunol., 135: 2589-2542).
Bei allen Assays können Inkubations- und/oder Waschschritte nach jeder Kombination von Reagenzien erforderlich sein. Inkubationschritte können von etwa 5 Sekunden bis zu mehreren Stunden, vorzugsweise von etwa 5 Minuten bis zu etwa 24 Stunden, variieren. Jedoch hängt die Inkubationszeit vom Assayformat, Analyten, Volumen der Lösung, von Konzentrationen und dergleichen ab. Gewöhnlich werden die Assays bei Umgebungstemperatur durchgeführt, obwohl sie über einen Bereich von Temperaturen, wie 10°C bis 40°C, durchgeführt werden können.
Während die Einzelheiten der Immunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem bestimmten verwendeten Format variieren können, umfasst das Verfahren zum Detektieren eines SK-Kanalproteins in einer biologischen Probe allgemein die Schritte des In-Kontakt-Bringens der biologischen Probe mit einem Antikörper, welcher mit dem SK-Kanalprotein unter immunologisch reaktiven Bedingungen spezifisch reagiert. Der Antikörper wird unter immunologisch reaktiven Bedingungen an das SK-Kanalprotein gebunden, und die Gegenwart des gebundenen Antikörpers wird direkt oder indirekt detektiert.
A. Nicht-kompetitive Assayformate
Immunoassays zum Detektieren von SK-Kanalproteinen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen kompetitive und nicht-kompetitive Formate ein. Nicht-kompetitive Immunoassays sind Assays, bei welchen die Menge des eingefangenen Analyten (in diesem Fall eines SK-Kanalproteins) direkt gemessen wird. In einem bevorzugten „Sandwich"-Assay zum Beispiel kann das Capturemittel (anti SK-Kanalprotein-Antikörper) direkt an ein festes Substrat gebunden werden, wo sie immobilisiert werden. Diese immobilisierten Antikörper fangen dann das SK-Kanalprotein ein, das in der Testprobe vorliegt. Das so immobilisierte SK-Kanalprotein wird dann mit einem Markierungsmittel, wie einem zweiten humanen SK-Kanalprotein-Antikörper, der eine Markierung trägt, gebunden. In einer anderen Ausführungsform kann dem zweiten SK-Kanalprotein-Antikörper eine Markierung fehlen, aber er kann wiederum mit einem markierten dritten Antikörper, der zu Antikörpern der Spezies spezifisch ist, von welcher sich der zweite Antikörper ableitet, gebunden werden. Der Zweite kann mit einem detektierbaren Rest, wie Biotin, an welchen ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, wie Enzymmarkiertes Streptavidin, modifiziert sein.
B. Kompetitive Assayformate
Bei kompetitiven Assays wird die Menge des Analyten (SK-Kanalprotein), der in der Probe vorliegt, durch Messung der Menge eines zugefügten (exogenen) Analyten (SK-Kanalprotein), der von einem Capturemittel (anti SK-Kanalprotein-Antikörper) durch den Analyten, der in der Probe vorliegt, verdrängt (oder weg konkurriert) wird, indirekt gemessen. In diesem Fall wird bei einem kompetitiven Assay eine bekannte Menge eines SK-Kanalproteins zu der Probe zugefügt, und die Probe wird dann mit einem Capturemittel, in diesem Fall einem Antikörper, der an das SK-Kanalprotein spezifisch bindet, in Kontakt gebracht. Die Menge an SK-Kanalprotein, die an den Antikörper gebunden wird, ist umgekehrt proportional zu der Konzentration des SK-Kanalproteins, das in der Probe vorliegt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper an einem festen Substrat immobilisiert. Die Menge an SK-Kanalprotein, die an den Antikörper gebunden wird, kann entweder durch Messung der Menge an SK-Kanalprotein, die im entsprechenden SK-Kanalprotein/Antikörper-Komplex vorliegt, oder in einer anderen Ausführungsform durch Messung der Menge an restlichem, nicht-komplexiertem SK-Kanalprotein bestimmt werden. Die Menge an SK-Kanalprotein kann durch Bereitstellen eines markierten SK-Kanalproteinmoleküls detektiert werden.
Ein Hapteninhibierungsassay ist ein anderer bevorzugter kompetitiver Assay. Bei diesem Assay wird ein bekannter Analyt, in diesem Fall ein SK-Kanalprotein, an einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge eines anti SK-Kanalprotein-Antikörpers wird jeweils zur Probe zugefügt, und die Probe wird dann mit dem immobilisierten SK-Kanalprotein in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an anti-SK-Kanalprotein-Antikörper, die an das immobilisierte SK-Kanalprotein gebunden wird, umgekehrt proportional zu der Menge des SK-Kanalproteins, das in der Probe vorliegt. Wieder kann die Menge des immobilisierten Antikörpers durch Detektieren entweder der immobilisierten Fraktion eines Antikörpers oder der Fraktion des Antikörpers, der in Lösung bleibt, detektiert werden. Die Detektion kann direkt, wenn der Antikörper markiert ist, oder durch die nachfolgende Zugabe eines markierten Rests, der spezifisch an den Antikörper bindet, wie vorstehend beschrieben, indirekt sein.
C. Andere Assayformate
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Westernblot- (Immunoblot-) Analyse angewendet, um die Gegenwart eines SK-Kanalproteins in der Probe zu detektieren und quantitativ zu bestimmen. Das Verfahren umfasst allgemein das Trennen von Probenproteinen durch Gelelektrophorese auf der Grundlage des Molekulargewichts, Überführen der getrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (wie einen Nitrozellulosefilter, einen Nylonfilter oder einen derivatisierten Nylonfilter) und Inkubieren der Probe mit den Antikörpern, die das SK-Kanalprotein spezifisch binden. Die anti-SK-Kanalprotein-Antikörper binden jeweils spezifisch an die SK-Kanalproteine an dem festen Träger. Diese Antikörper können direkt markiert werden oder können in einer anderen Ausführungsform anschließend unter Verwendung markierter Antikörper (z.B. markierter Schaf-anti-Mausantikörper), die spezifisch an das anti SK-Kanalprotein binden, detektiert werden.
Andere Assayformate schließen Liposomimmunoassays (LIA) ein, bei welchen Liposome verwendet werden, die entworfen sind, um spezifische Moleküle (z.B. Antikörper) zu binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker freizusetzen. Die freigesetzten Chemikalien werden dann gemäß Standardverfahren detektiert (siehe Monroe et al. (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41).
D. Markierungen
Die bestimmte Markierung oder der bestimmte detektierbare Rest, der beim Assay verwendet wird, ist kein kritischer Gesichtspunkt der Erfindung, solange er die spezifische Bindung des Antikörpers, der in dem Assay verwendet wird, nicht erheblich beeinträchtigt. Die detektierbare Gruppe kann jedes Material mit einer detektierbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Derartige detektierbare Markierungen sind auf dem Gebiet der Immunoassays gut entwickelt worden, und im Allgemeinen kann fast jede Markierung, die in derartigen Verfahren nützlich ist, auf die vorliegende Erfindung angewendet werden. Folglich ist eine Markierung eine Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, radioisotopische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar ist. Nützliche Markierungen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die beim Markieren von Nukleinsäuren, wie vorstehend diskutiert, verwendet werden.
Die Markierung kann direkt oder indirekt mit der gewünschten Komponente des Assays gemäß den Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verbunden werden. Wie vorstehend angezeigt, kann eine breite Vielzahl von Markierungen verwendet werden, wobei die Auswahl der Markierung von der erforderlichen Sensitivität, Mühelosigkeit der Konjugation mit der Verbindung, den Stabilitätsbedingungen, der verfügbaren Instrumentenausrüstung und Beseitigungsbestimmungen abhängig ist.
Nicht-radioaktive Markierungen werden häufig durch indirekte Mittel angebracht. Im Allgemeinen wird ein Ligandmolekül (z.B. Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann an ein Anti-Ligandmolekül (z.B. Streptavidin), welches entweder inhärent detektierbar ist oder welches an ein Signalsystem, wie ein detektierbares Enzym, eine Fluoreszenzverbindung oder eine Chemolumineszenzverbindung, kovalent gebunden ist. Mehrere Liganden und Anti-Liganden können verwendet werden. Wenn ein Ligand einen natürlichen Anti-Liganden, zum Beispiel Biotin, Thyroxin und Cortisol aufweist, kann er in Verbindung mit den markierten, natürlich vorkommenden Anti-Liganden verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann jede Hapten- oder Antigenverbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden.
Die Moleküle können auch mit Signal-erzeugenden Verbindungen, z.B. durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor, direkt konjugiert sein. Interssierende Enzyme als Markierungen sind hauptsächlich Hydrolasen, besonders Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreduktasen, besonders Peroxidasen. Fluoreszenzverbindungen schließen Fluoreszein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw. ein. Chemolumineszenz-Verbindungen schließen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, z.B. Luminol, ein. Für einen Überblick über die verschiedenen Markierungs- oder Signalerzeugenden Systeme, welche verwendet werden können, siehe US-Patent Nr. 4,391,904 ).
Mittel zum Detektieren von Markierungen sind dem Fachmann bekannt. Folglich schließen die Mittel zur Detektion zum Beispiel einen Szintillationszähler oder fotographischen Film wie bei der Autoradiographie ein, wenn die Markierung eine radioaktive Markierung ist. Wenn die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, kann sie durch Anregen des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge des Lichtes und Detektieren der so erhaltenen Fluoreszenz detektiert werden. Die Fluoreszenz kann visuell mittels eines fotographischen Films, durch die Verwendung von elektronischen Detektoren, wie ladungsgekoppelten Bauelementen (CCDs) oder Photovervielfachern und dergleichen, detektiert werden. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen durch Bereitstellen der geeigneten Substrate für das Enzym und Detektieren des so erhaltenen Reaktionsprodukts detektiert werden. Schließlich können einfache kolorimetrische Markierungen einfach durch Beobachten der Farbe, die mit der Markierung verbunden ist, detektiert werden. Folglich erscheint konjugiertes Gold bei verschiedenen Dipstick-Assays häufig rosafarben, während verschiedene konjugierte Kügelchen in der Farbe der Kügelchen erscheinen.
Einige Analyseformate erfordern keine Verwendung von markierten Komponenten. Zum Beispiel können Agglutinationsassays angewendet werden, um die Gegenwart der Zielantikörper zu detektieren. In diesem Fall werden Antigen-überzogene Teilchen durch Proben, die die Zielantikörper enthalten, agglutiniert. In diesem Format müssen keine der Komponenten markiert werden, und die Gegenwart des Zielantikörpers wird durch einfache Sichtkontrolle detektiert.
Immunoassay-Detektionskits
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits zur Diagnose von Organismen (z.B. Patienten) mit einem Mangel in den Spiegeln des exprimierten SK- oder IK-Kanalproteins bereit. Die Kits enthalten vorzugsweise ein oder mehr Reagenzien zum Detektieren der Menge an SK-Kanalprotein in einem Säugetier. Bevorzugte Reagenzien schließen Antikörper ein, die spezifisch an normale SK-Kanalproteine oder deren Subsequenzen binden. Der Antikörper kann frei oder auf einem festen Träger, wie einem Reagenzglas, einer Mikrotiterplatte, einem Dipstick und dergleichen, immobilisiert sein. Der Kit kann auch Instruktionsmaterialien enthalten, die die Verwendung des Antikörpers in einer Analyse zur Detektion eines SK-Kanalproteins lehren. Der Kit kann geeignete Reagenzien zur Detektion von Markierungen, Positiv- und Negativkontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer und der dergleichen enthalten.
Assays auf Verbindungen, die den K⁺-Strom erhöhen oder verringern
Isolierte SK-Kanal-Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung, welche in Zellen exprimiert werden, können in einer Vielzahl von Assays verwendet werden, um Verbindungen zu detektieren, die jeweils den Strom (d.h. Einstrom oder Ausstrom) von Kalium durch die SK-Kanäle erhöhen oder verringern. Im Allgemeinen verursachen Verbindungen, die den Kaliumionenstrom verringern, eine Abnahme um mindestens 10% oder 20%, stärker bevorzugt um mindestens 30%, 40% oder 50% und am meisten bevorzugt um mindestens 70%, 80%, 90% oder 100%. Verbindungen, die den Strom der Kaliumionen erhöhen, verursachen eine detektierbare Zunahme der Kaliumionen-Stromdichte durch Zunahme der Wahrscheinlichkeit, dass der SK-Kanal offen ist und der Durchgang der Kaliumionen ermöglicht ist. Typischerweise nimmt der Strom um mindestens 20%, 50%, 100% oder 200%, häufig um mindestens 400%, 600%, 1.000%, 5.000% oder 10.000%, zu. Ein erhöhter oder verringerter Strom von Kalium kann durch Bestimmen von Änderungen der Polarisation (d.h. des elektrischen Potentials) der Zelle, die den SK-Kanal exprimiert, bewertet werden. Ein besonders bevorzugtes Mittel zum Bestimmen von Änderungen der Zellpolarisation ist die Spannung-Clamp-Technik. Gesamtzell-Ströme werden bequem unter Anwendung der Bedingungen, die in Beispiel 3 aufgezeigt sind, bestimmt. Andere bekannte Assays schließen ein: radioaktive Rubidiumstrom-Assays und Fluoreszenz-Assays unter Verwendung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen. Siehe z.B. Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol., 88:67-75 (1988); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994). Assays auf Verbindungen, die in der Lage sind, den Kaliumstrom durch das SK-Kanalprotein zu hemmen oder zu erhöhen, können durch Einbringen der Verbindungen in eine Badlösung durchgeführt werden, die in Verbindung steht mit und Zellen mit einem SK-Kanal gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Siehe z.B. Blatz et al., Nature, 323:718-720 (1986); Park, J. Physiol. 481:555-570 (1994). Im Allgemeinen liegen die zu prüfenden Verbindungen im Bereich von 1 pM bis 100 mM vor. Änderungen der Funktion der Kanäle können in den elektrischen Strömen oder dem Ionenstrom oder in der Folge von Änderungen der Ströme und des Stroms gemessen werden.
Die Wirkungen der Testverbindungen auf die Funktion der Kanäle können durch Änderungen der elektrischen Ströme oder des Ionenstroms oder in der Folge von Änderungen der Ströme und des Stroms gemessen werden. Änderungen des elektrischen Stroms oder des Ionenstroms werden entweder durch Zunahmen oder Abnahmen des Stroms der Kationen, wie von Kalium- oder Rubidiumionen, gemessen. Die Kationen können in einer Vielzahl von Standardmethoden gemessen werden. Sie können direkt durch Konzentrationsänderungen der Ionen oder indirekt durch Membranpotential oder durch radioaktive Markierung der Ionen gemessen werden. Der Einfluss der Testverbindung auf den Ionenstrom kann ziemlich mannigfaltig sein. Demgemäß kann jede geeignete physiologische Änderung verwendet werden, um den Einfluss einer Testverbindung auf die Kanäle gemäß dieser Erfindung zu bewerten. Änderungen der Kanalfunktion können durch Ligandenverdrängung, wie CTX-Freisetzung, gemessen werden. Wenn die funktionellen Konsequenzen unter Verwendung intakter Zellen oder Tiere bestimmt werden, kann man auch eine Vielzahl von Wirkungen, wie Transmitter-Freisetzung (z. B. Dopamin), Hormon-Freisetzung (z.B. Insulin), Transkriptionsänderungen sowohl auf bekannte als auch auf nicht-gekennzeichnete genetische Marker (z. B. Northernblots), Zellvolumenänderungen (z. B. der roten Blutzellen), Immunreaktionen (z. B. T-Zellaktivierung), Änderungen des Zellmetabolismus, wie Zellwachstum oder pH-Änderungen, messen.
Vorzugsweise wird der SK-Kanal des Assays aus einem Kanalprotein der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 43 oder 47 oder deren konservativ modifizierten Varianten ausgewählt. In einer anderen Ausführungsform leitet sich der SK-Kanal des Assays von einem Eukaryoten ab und schließt eine Aminosäure-Subsequenz mit einer Sequenzähnlichkeit zur Kernregion der SK-Kanalproteine der SEQ ID Nr. 1 bis 4, 19, 20, 43 und/oder 47 ein. Allgemein hat das funktionelle SK-Kanalprotein eine Länge von mindestens 400, 450, 500 oder 550 Aminosäuren. Der Prozentsatz der Sequenzähnlichkeit mit der Kernregion eines Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43 und 47, ist eine der ganzen Zahlen zwischen 60 und 100. Allgemein beträgt die Sequenzähnlichkeit mindestens 60%, typischerweise mindestens 70%, allgemein mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, am meisten bevorzugt mindestens 90% und häufig mindestens 95%. Folglich hybridisieren SK-Kanalhomologe unter gemäßigten Hybridisierungsbedingungen an eine Nukleinsäure mit einer Länge von mindestens 300 Nukleotiden von der Kernregion einer Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 13, 14, 15, 16, 21, 22 und deren komplementären Sequenzen.
Die „Kernregion" oder „die Kernsequenz" der SEQ ID Nr. 13-16, 21, 22, 44 und 48 entspricht der kodierten Region der Ausrichtung zwischen den SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 43 und 47 mit und von rSK2 (SEQ ID Nr. 2) Aminosäurerest 135 bis 462. In bevorzugten Ausführungsformen weist der SK-Kanal mindestens 90% Sequenzähnlichkeit auf, verglichen mit der Kernsequenz einer Sequenz mit der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 43 oder 47 gegenüber einem Vergleichsfenster von einem von 20 benachbarten Aminosäureresten bis 300 benachbarten Aminosäureresten innerhalb von der Kernregion.
Die SK-Kanal-Homologe weisen allgemein im Wesentlichen ähnliche Leitfähigkeitseigenschaften (z.B. 2-60 pS) und Kalziumsensitivitäten (30 nM – 10 μM) auf. Chimäre, die durch Expression von mindestens zwei der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20 oder 32 erzeugt werden, können auch verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle, die in Kontakt mit einer Verbindung gebracht wird, welche auf eine Erhöhung oder Erniedrigung des Kaliumstroms analysiert wird, eine eukaryotische Zelle, stärker bevorzugt ein Oozyt von Xenopus (z.B. Xenopus laevis).
Noch ein anderer Assay auf Verbindungen, die den Kaliumstrom in Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen erhöhen oder verringern, bezieht die „virtuelle Genetik" ein, bei welcher ein Computersystem verwendet wird, um eine dreidimensionale Struktur von SK- und IK-Proteinen zu erzeugen, die auf der strukturellen Information beruht, die durch die Aminosäuresequenz kodiert wird. Die Aminosäuresequenz tritt direkt und aktiv mit einem vorher etablierten Algorithmus in einem Computerprogramm in Wechselwirkung, wobei Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturmodelle des Proteins erhalten werden. Die Modelle der Proteinstruktur werden dann untersucht, um Regionen der Struktur zu identifizieren, die die Eignung aufweisen, an Liganden zu binden. Diese Regionen werden dann verwendet, um Liganden zu identifizieren, die an das Protein binden.
Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird durch die Eingabe von Kanalprotein-Aminosäuresequenzen oder -Nukleinsäuresequenzen, die ein Kanalprotein kodieren, in das Computersystem erzeugt. Die Aminosäuresequenz des Kanalproteins ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 19, 20, 32, 43, 47 und deren konservativ modifizierten Versionen. Die Aminosäuresequenz stellt die Primärsequenz des Proteins dar, welche die Strukturinformation des Proteins kodiert. Die Aminosäuresequenz wird in das Computersystem von den computerlesbaren Substraten eingegeben, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf, elektronische Speichermedien (z.B. magnetische Disketten, Bänder, Patronen und Chips), optische Medien (z.B. CD-ROM, Telefonleitungen), Adressen zu Internetstellen und RAM. Das dreidimensionale Strukturmodell des Kanalproteins wird dann durch die Wechselwirkung der Aminosäure-Sequenz und des Computersystems erzeugt. Die Software sind im Handel erhältliche Programme, wie Biopolymer, Quants und Insight.
Die Aminosäuresequenz stellt eine Primärstruktur dar, die die Information kodiert, die erforderlich ist, um die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur des Proteins zu erzeugen. Die Software betrachtet bestimmte Parameter, die durch die Primärsequenz kodiert werden, um das Strukturmodell zu erzeugen. Diese Parameter werden als „Energieterme", bezeichnet und schließen hauptsächlich das elektrostatische Potential, das hydrohobe Potential, die dem Lösungsmittel zugängliche Oberfläche und die Wasserstoffbindung ein. Sekundärenergieterme schließen das van der Waals-Potential ein. Biologische Moleküle erzeugen die Strukturen, die die Energieterme auf eine kumulative Art und Weise minimieren. Das Computerprogramm verwendet deshalb diese Terme, die durch die Primärstruktur oder Aminosäuresequenz kodiert sind, um das Sekundärstrukturmodell zu erzeugen.
Die Tertiärstruktur des Proteins, die durch die Sekundärstruktur kodiert ist, wird dann auf der Grundlage der Energieterme der Sekundärstruktur erzeugt. Der Benutzer kann an diesem Punkt zusätzliche Variablen, wie, ob das Protein Membran-gebunden oder löslich ist, seine Position im Körper und ob es ein zytoplasmatisches, Oberflächen- oder Kernprotein ist, eingeben. Diese Variablen zusammen mit den Energietermen der Sekundärstruktur werden verwendet, um das Modell der Tertiärstruktur zu erzeugen. Beim Modellieren der Tertiärstruktur gleicht das Computerprogramm hydrophobe Proteinflächen der Sekundärstruktur mit ähnlichen Flächen und hydrophile Sekundärstruktur mit ähnlichen ab.
Schließlich kann die Quartärstruktur von Multiuntereinheits-Proteinen auf eine ähnliche Art und Weise unter Anwendung von Anisotropietermen modelliert werden. Diese Terme verbinden verschiedene Proteinuntereinheiten mineinander, um die Wechselwirkung der Untereinheiten energetisch zu minimieren. Im Fall von Kanalproteinen bilden typischerweise vier identische Untereinheiten die Quartärstruktur des Kanals.
Sobald die Struktur erzeugt worden ist, werden potentielle Ligandenbindungsregionen durch das Computersystem identifiziert. Dreidimensionale Strukturen für potentielle Liganden werden durch Eingabe von Aminosäure- und Nukleotidsequenzen oder chemischen Formeln von Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, erzeugt. Die dreidimensionale Struktur des potentiellen Liganden wird dann mit der des Kanalproteins verglichen, um Liganden zu identifizieren, die an das Kanalprotein binden. Die Bindungsaffinität zwischen dem Protein und den Liganden wird unter Anwendung der Energieterme bestimmt, um zu bestimmen, welche Liganden eine erhöhte Wahrscheinlichkeit zur Bindung an das Protein aufweisen.
Computersysteme werden auch verwendet, um auf Mutationen von SK-Genen zu screenen. Derartige Mutationen können mit Krankheitszuständen verbunden sein. Sobald die Mutationen identifiziert sind, können Diagnoseassays angewendet werden, um Patienten mit derartig mutierten Genen, die mit Krankheitszuständen verbunden sind, zu identifizieren. Die Identifizierung der mutierten SK- und IK-Gene schließt den Empfang einer Eingabe einer ersten Nukleinsäuresequenz ein, die ein Kalziumkanalprotein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 20, 32, 43, 47 und deren konservativ modifizierten Versionen. Die Sequenz wird in das Computersystem eingegeben, wie vorstehend beschrieben. Die erste Nukleinsäuresequenz wird dann mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz verglichen, die wesentliche Identität zu der ersten Nukleinsäuresequenz aufweist. Die zweite Nukleinsäuresequenz wird auf die vorstehend beschriebene Art und Weise in das Computersystem eingegeben. Sobald die erste und die folgenden Sequenzen verglichen sind, werden Nukleotidunterschiede zwischen den Sequenzen identifiziert. Derartige Sequenzen können Allelunterschiede bei den SK-Genen und Mutationen, die mit Krankheitszuständen verbunden sind, darstellen.
Zelltransfektion und Gentherapie
Die vorliegende Erfindung betrifft verpackbare SK-Kanalprotein-Nukleinsäuren (cDNAs), vorstehend, für die Transfektion von Zellen in vitro und in vivo. Diese verpackbaren Nukleinsäuren können in einen von mehreren bekannten Vektoren für die Transfektion von Zielzellen und -organismen insertiert werden, wie nachstehend beschrieben. Die Nukleinsäuren werden durch die Wechselwirkung des Vektors und der Zielzelle ex vivo oder in vivo in Zellen transfiziert. Die SK-Kanalprotein-Nukleinsäure exprimiert dann unter der Kontrolle eines Promotors das Kalzium-aktivierte Kaliumkanalprotein gemäß der vorliegenden Erfindung, wodurch die Wirkungen des Fehlens, der teilweisen Inaktivierung oder der anormalen Expression des SK-Kanalproteingens abgeschwächt werden.
Derartige Gentherapieverfahren sind angewendet worden, um die erworbenen und vererbten genetischen Defekte, Krebs und Vireninfektion in mehreren Zusammenhängen zu beheben. Die Eignung, artifizielle Gene in Menschen zu exprimieren, erleichtert die Vorbeugung und/oder Heilung von vielen wichtigen Krankheiten des Menschen, einschließlich vieler Krankheiten, welche einer Behandlung durch andere Therapien nicht zugänglich sind. Als Beispiel verbessert die in vivo-Expression von Cholesterin-regulierenden Genen, Genen, welche die Replikation von HIV selektiv blockieren, und Tumor-supprimierenden Genen bei menschlichen Patienten die Behandlung von Herzkrankheit, AIDS beziehungsweise Krebs drastisch. Für einen Überblick über die Gentherapieverfahren siehe Anderson, Science (1992) 256:808-813; Nabel und Feigner (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani und Caskey (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer und Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44; Haddada et al. (1995) in: Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler und Böhm (Hrsg) Springer-Verlag, Heidelberg Deutschland; und Yu et al., Gene Therapy (1994) 1:13-26.
Die Zuführung des Gens oder von genetischem Material in die Zelle ist der erste kritische Schritt bei der Gentherapiebehandlung einer Krankheit. Viele Zuführverfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Derartige Verfahren schließen zum Beispiel Liposom-basierte Genzuführung (Debs und Zhu (1993) WO 93/24640 ; Mannino und Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose US-Patent Nr. 5,279,833 ; Brigham (1991) WO 91/06309 ; und Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414) und Replikations-defekte retrovirale Vektoren ein, die eine therapeutische Polynukleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms beherbergen (siehe z.B. Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4:43 und Cornetta et al.. Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)). Häufig verwendete retrovirale Vektoren schließen solche ein, die auf dem Mäuseleukämievirus (MuLV), Gibbonaffenleukämievirus (GaLV), Affenimmunschwächevirus (SIV), menschlichen Immunschwächevirus (HIV) und deren Kombinationen beruhen. Siehe z.B. Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5):1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al., PCT/US94/05700 und Rosenburg und Fauci (1993) in: Fundamental Immunology, dritte Auflage Paul (Hrsg.) Raven Press, Ltd.. New York und die Bezüge darin, sowie Yu et al., Gene Therapy (1994) ibid.).
AAV-basierte Vektoren werden auch verwendet, um Zellen mit Zielnukleinsäuren zu transduzieren, z.B bei der in vitro-Produktion von Nukleinsäuren und Peptiden und bei in vivo- und ex vivo-Gentherapieverfahren. Siehe West et al. (1987) Virology 160:38-47; Carter et al. (1989) US-Patent Nr. 4,797,368 ; Carter et al. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351 und Samulski (ibid.) für einen Überblick über AAV-Vektoren. Der Aufbau von rekombinanten AAV-Vektoren ist in mehreren Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich Lebkowski, US-Patent Nr. 5,173,414 ; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat und Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; McLaughlin et al. (1988) und Samulski et al. (1989) J. Virol., 63:03822-3828. Zelllinien, die durch rAAV transfiziert werden können, schließen solche ein, die in Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol., 8:3988-3996 beschrieben sind.
A. Ex vivo-Transfektion von Zellen
Die ex vivo-Zelltransfektion zur Diagnose, Forschung oder zur Gentherapie (z.B. über Reinfusion der transfizierten Zellen in den Wirtsorganismus) ist dem Fachmann gut bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen aus dem Organismus der Versuchsperson isoliert, mit einer SK-Kanalprotein-Nukleinsäure (Gen oder cDNA) transfiziert und zurück in den Organismus der Versuchsperson (z.B. einen Patient) reinfundiert. Verschiedene Zelltypen, die zur ex vivo-Transfektion geeignet sind, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Freshney et al., Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, dritte Auflage Wiley-Liss, New York (1994)) und die darin zitierten Bezüge bezüglich einer Diskussion darüber, wie Zellen aus Patienten isoliert und gezüchtet werden).
Wie vorstehend angezeigt, steht die verpackbare Nukleinsäure, welche ein SK-Kanalprotein kodiert, in einer bevorzugten Ausführungsform unter der Kontrolle eines aktivierten oder konstitutiven Promotors. Die transfizierte(n) Zelle(n) exprimier(t)(en) ein funktionelles SK-Kanalprotein, welches die Wirkungen mangelhafter oder anormaler SK-Kanalprotein-Genexpression abschwächt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Stammzellen bei ex vivo-Verfahren zur Zelltransfektion und Gentherapie verwendet. Der Vorteil bei der Verwendung von Stammzellen besteht darin, dass sie in vitro in andere Zelltypen differenziert werden können, oder in ein Säugetier (wie den Spender der Zellen) eingeführt werden können, wo sie im Knochenmark verankert werden. Verfahren zum Differenzieren von CD34⁺-Zellen in vitro in klinisch wichtige Immunzelltypen unter Verwendung von Zytokinen, wie GM-CSF, IFN-γ und TNF-α, sind bekannt (siehe Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1693-1702 und Szabolcs et al. (1995) 154: 5851-5861).
Stammzellen werden unter Verwendung bekannter Verfahren zur Transduktion und Differenzierung isoliert. Zum Beispiel werden in Mäusen Knochenmarkzellen durch Töten der Maus und Zerschneiden der Beinknochen mit einer Schere isoliert. Stammzellen werden aus Knochenmarkzellen durch Waschen der Knochenmarkzellen mit Antikörpern, welche unerwünschte Zellen, wie CD4⁺ und CD8⁺ (T-Zellen), CD45⁺ (panB-Zellen), GR-1 (Granulozyten) und Ia^d (differenzierte Antigen-präsentierende Zellen), binden, isoliert. Als Beispiel für dieses Protokoll siehe Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1693-1702.
Beim Menschen werden Knochenmarkaspirationen von Darmbeinkämmen z.B. unter Vollnarkose im Operationsraum durchgeführt. Die Knochenmarkaspirationen liegen in einer Menge von ungefähr 1000 ml vor und werden von den hinteren Darmbeinen und -kämmen gesammelt. Wenn die Gesamtzahl der gesammelten Zellen kleiner als etwa 2 × 10⁸/kg ist, wird eine zweite Aspiration unter Verwendung des Brustbeins und der vorderen Darmbeinkämme zusätzlich zu den hinteren Kämmen durchgeführt. Während der Operation werden zwei Einheiten von bestrahlten verpackten roten Zellen verabreicht, um das Volumen des entnommenen Marks durch die Aspiration zu ersetzen. Der menschliche Hämatopoeseprogenitor und Stammzellen sind durch die Gegenwart eines CD34-Oberflächenmembranantigens gekennzeichnet. Dieses Antigen wird zur Reinigung, z.B. an Affinitätssäulen, welche CD34 binden, verwendet. Nachdem das Knochenmark gesammelt worden ist, werden die mononukleären Zellen von den anderen Komponenten mittels Ficol-Gradientenzentrifugation getrennt. Dies wird durch ein halbautomatisiertes Verfahren unter Verwendung eines Zellseparators (z.B. eines Baxter Fenwal CS3000+ oder einer Terumo-Maschine) durchgeführt. Die Zellen geringer Dichte, die meistens aus mononuklearen Zellen bestehen, werden gesammelt, und die Zellen werden bei 37°C 1,5 Stunden lang in Plastikflaschen inkubiert. Die anhaftenden Zellen (Monozyten, Makrophagen und B-Zellen) werden verworfen. Die nicht-anhaftenden Zellen werden dann gesammelt und mit einem monoklonalen anti-CD34-Antikörper (z.B. dem Mausantikörper 9C5) bei 4°C 30 Minuten lang mit leichter Umdrehung inkubiert. Die Endkonzentration für den anti-CD34-Antikörper beträgt 10 μg/ml. Nach zweimaligem Waschen werden paramagnetische Mikrokügelchen (Dyna Beads, geliefert von Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, Kalifornien), die mit Schaf-anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörpern beschichtet sind, zu der Zellsuspension in einem Verhältnis von 2 Zellen/Kügelchen zugegeben. Nach einem weiteren Inkubationszeitraum von 30 Minuten bei 4°C werden die rosettenförmigen Zellen mit magnetischen Kügelchen mit einem Magneten gesammelt. Chymopapain (geliefert von Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, Kalifornien) mit einer Endkonzentration von 200 U/ml wird zugefügt, um die Kügelchen von den CD34⁺-Zellen freizusetzen. In einer anderen Ausführungsform und vorzugsweise kann ein Affinitätssäulen-Isolierungsverfahren angewendet werden, welches an CD34 oder an Antikörper, die an CD34 gebunden sind, bindet (siehe die nachstehenden Beispiele). Siehe Ho et al. (1995) Stem Cells 13 (Ergänzungsbd. 3): 100-105. Siehe auch Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17.
In einer anderen Ausführungsform werden Hämatopoesestammzellen aus fötalem Nabelschnurblut isoliert. Yu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 699-703 beschreiben ein bevorzugtes Verfahren zum Transduzieren von CD34⁺-Zellen aus menschlichem fötalem Nabelschnurblut unter Verwendung von retroviralen Vektoren.
B. In vivo-Transfektion
Vektoren (z.B. Retroviren, Adenoviren, Liposome usw.), die therapeutische Nukleinsäuren enthalten, können dem Organismus zur Transduktion von Zellen in vivo direkt verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt auf einem der Wege, die zum Einbringen eines Moleküls in Endkontakt mit Blut- oder Gewebezellen gewöhnlich angewendet werden. Die verpackten Nukleinsäuren werden auf jede geeignete Art und Weise, vorzugsweise mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, verabreicht. Geeignete Verfahren zum Verabreichen derartiger verpackter Nukleinsäuren sind verfügbar und dem Fachmann bekannt, und, obwohl mehr als ein Weg angewendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann häufig ein bestimmter Weg eine unmittelbarere und wirksamere Reaktion als ein anderer Weg liefern.
Pharmazeutisch verträgliche Träger werden teilweise durch die bestimmte Zusammensetzung, die verabreicht wird, sowie durch das bestimmte Verfahren, das angewendet wird, um die Zusammensetzung zu verabreichen, bestimmt. Demgemäß gibt es eine breite Vielzahl von geeigneten Formulierungen von Arzneimitteln gemäß der vorliegenden Erfindung.
Formulierungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können bestehen aus (a) flüssigen Lösungen, wie einer wirksamen Menge der verpackten Nukleinsäure, suspendiert in Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Kochsalzlösung oder PEG 400; (b) Kapseln, Kissen oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs als Flüssigkeiten, Feststoffe, Granulate oder Gelatine enthalten; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit; und (d) geeigneten Emulsionen. Tablettenformen können einen oder mehrere von Laktose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Kalziumphosphaten, Maisstärke, Kartoffelstärke, Tragant, mikrokristalline Cellulose, Akaziengummi, Gelatine, kolloidales Siliziumdioxid, Natriumcroscarmellose, Talkum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Excipienten, farbgebende Stoffe, Füllstoffe, Bindemittel, Verdünnungsmittel, Puffermittel, Feuchthaltemittel, Konservierungsmittel, Geschmacksmittel, Farbstoffe, Sprengmitteln und pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten. Pastillenformen können den Wirkstoff in einem Geschmacksstoff, gewöhnlich Saccharose, und Akaziengummi oder Tragant enthalten, sowie Pastillen, die den Wirkstoff in einem inerten Träger, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akaziengummiemulsionen, Gelen und dergleichen enthalten, die zusätzlich zum Wirkstoff Träger enthalten, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Die verpackten Nukleinsäuren, alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten, können zu Aerosolformulierungen (d.h., sie können „vernebelt" werden), die über Inhalation zu verabreichen sind, verarbeitet werden. Aerosolformulierungen können in unter Druck gesetzte verträgliche Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen, gebracht werden.
Geeignete Formulierungen zur rektalen Verabreichung schließen zum Beispiel Suppositorien, welche aus der verpackten Nukleinsäure mit einem Suppositoriumträger bestehen, ein. Geeignete Suppositoriumträger schließen natürliche oder synthetische Triglyceride oder Paraffinkohlenwasserstoffe ein. Außerdem ist es auch möglich, rektale Gelatinekapseln zu verwenden, welche aus einer Kombination der verpackten Nukleinsäure mit einem Träger, einschließlich zum Beispiel flüssigen Triglyceriden, Polyethylenglykolen und Paraffinkohlenwasserstoffen, bestehen.
Formulierungen, die zur parenterale Verabreichung, wie zum Beispiel durch intraartikuläre (in die Gelenke), intravenöse, intramuskuläre, intradermale, intraperitoneale und subkutane Wege, geeignet sind, schließen wässrige und nicht-wässerige, isotonische sterile Injektionslösungen, welche Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostate und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen ein, die Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisierungsmittel und Konservierungsmittel enthalten können. Bei der Ausübung dieser Erfindung können Zusammensetzungen zum Beispiel durch intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Parenterale Verabreichung und intravenöse Verabreichung sind die bevorzugten Verfahren der Verabreichung. Die Formulierungen der verpackten Nukleinsäure können in versiegelten Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältern, wie Ampullen und Fläschchen, angeboten werden.
Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der vorher beschriebenen Art hergestellt werden. Zellen, die durch die verpackte Nukleinsäure transduziert werden, wie vorstehend im Zusammenhang mit der ex vivo-Therapie beschrieben, können auch intravenös oder parenteral verabreicht werden, wie vorstehend beschrieben.
Die Dosis, die einem Patienten verabreicht wird, sollte im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ausreichen, um im Laufe der Zeit eine vorteilhafte therapeutische Reaktion bei dem Patienten zu bewirken. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit des bestimmten verwendeten Vektors und nach dem Zustand des Patienten sowie nach dem Körpergewicht oder der Oberfläche des zu behandelnden Patienten bestimmt. Die Größe der Dosis wird auch durch das Bestehen, die Natur und den Umfang aller nachteiligen Nebenwirkungen, die die Verabreichung eines bestimmten Vektors begleiten, oder den transduzierten Zelltyp bei einem bestimmten Patienten bestimmt.
Beim Bestimmen der wirksamen Menge des Vektors, der bei der Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen infolge von verminderter oder anomaler Expression eines SK-Kanalproteins zu verabreichen ist, bewertet der Arzt zirkulierende Plasmaspiegel des Vektors, die Vektortoxizitäten, das Fortschreiten der Krankheit und die Produktion der anti-Vektor-Antikörper. Allgemein beträgt das Dosisäquivalent einer nackten Nukleinsäure von einem Vektor etwa 1 μg bis 100 μg für einen typischen 70 Kilogramm-Patienten, und Dosen von Vektoren, welche ein retrovirales Teilchen einschließen, werden berechnet, so dass eine äquivalente Menge einer therapeutischen Nukleinsäure erhalten wird.
Zur Verabreichung können Inhibitoren und transduzierte Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Rate verabreicht werden, die durch den LD-50-Wert des Inhibitors, Vektors oder transduzierten Zelltyps und die Nebenwirkungen des Inhibitors, Vektors oder Zelltyps bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt wird, wenn auf die Masse und Gesamtgesundheit des Patienten angewendet. Die Verabreichung kann über einzelne oder geteilte Dosen erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden vor der Infusion Blutproben erhalten und zur Analyse gelagert. Zwischen 1 × 10⁸ und 1 × 10¹² transduzierte Zellen werden über 60-200 Minuten lang intravenös infundiert. Lebenszeichen und Sauerstoffsättigung durch Pulsoximetrie werden eng überwacht. Blutproben werden 5 Minuten und 1 Stunde nach der Infusion genommen und zur nachfolgenden Analyse gelagert. Leukopheress, Transduktion und Reinfusion können wiederholt werden und werden alle 2 bis 3 Monate wiederholt. Nach der ersten Behandlung können Infusionen auf einer ambulanten Grundlage nach Ermessen des Klinikers durchgeführt werden. Wenn die Reinfusion als ambulanter Patient gegeben wird, wird der Teilnehmer mindestens 4, und vorzugsweise 8 Stunden nach der Therapie überwacht.
Transduzierte Zellen werden zur Reinfusion gemäß etablierter Verfahren hergestellt. Siehe Abrahamsen et al. (1991) J. Clin. Apheresis, 6: 48-53; Carter et al. (1988) J. Clin. Arpheresis, 4:113-117; Aebersold et al. (1988) J. Immunol. Meth., 112: 1-7; Muul et al. (1987) J. Immunol. Methods, 101:171-181 und Carter et al. (1987) Transfusion 27: 362-365. Nach einem Zeitraum von etwa 2-4 Wochen in Kultur sollten die Zellen zwischen 1 × 10⁸ und 1 × 10¹² zählen. In dieser Hinsicht variieren die Wachstumseigenschaften der Zellen von Patient zu Patient und von Zelltyp zu Zelltyp. Etwa 72 Stunden vor der Reinfusion der transduzierten Zellen wird ein Aliquot zur Analyse des Phänotyps und des Prozentsatzes der Zellen, die das therapeutische Mittel exprimieren, genommen.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiel zum Zweck der Klarheit des Verständnisses ausführlich beschrieben worden ist, ist es nahe liegend, dass bestimmte Änderungen und Abwandlungen innerhalb des Schutzbereichs der hinzugefügten Patentansprüche durchgeführt werden können.
Beispiel 1
Beispiel 1 beschreibt die Isolierung und das Sequenzieren von Klonen, die Kalzium-abhängige Kaliumkanäle mit niedriger und mittlerer Leitfähigkeit kodieren.
A. Kaliumkanäle mit niedriger Leitfähigkeit mit Ausnahme des minK-Proteins (Takumi et al., Science, 242:1042-1045 (1988) teilen ein gemeinsames Strukturmotiv innerhalb der Porenregion, einschließlich der Sequenz, welche die charakteristische Selektivitätssequenz für einwertige Kationen vorgibt (Heginbotham et al., Biophys. J., 66:1061-1067 (1994)).
Mit einer BLAST-Suche der EST-Datenbank unter Verwendung der Suchsequenz FXSIPXXXWWAXVTMTTVGYGDMXP (SEQ ID Nr. 45), wobei fehlerhafte Paarungen erlaubt waren, wurden bekannte Kaliumkanalsequenzen und Genbank #M62043 herausgefunden. Oligonukleotide, die den Nukleotiden 6-36 (sense) und 258-287 (antisense) von #M62043 entsprechen, wurden synthetisiert (Genosys, The Woodlands, TX), unter Verwendung von Polynukleotidkinase (BRL) und ³²P-ATP (NEN) radioaktiv markiert und verwendet, um ~10⁶ rekombinante Phagen aus der humanen Hippocampus-cDNA-Bibliothek zu screenen (40% Formamid; 1 M NaCl, 1% SDS, 37°C; gewaschen mit 1 X SSC bei 50°C). Doppelt positiv hybridisierende Phagen wurden durch erneutes Screenen bei verringerten Dichten gereinigt.
cDNA-Insertionen wurden in M13 subkloniert und die Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Didesoxykettenabbruchverfahrens und der T7-DNA-Polymerase (Sequenase, UBI) bestimmt. Ein Fragment dieses Klons, das die Porendomäne (Aminosäuren 325-522) enthielt, wurde unter Verwendung zufälliger Primer (Boehringer) radioaktiv markiert und verwendet, um eine Rattengehirn-cDNA-Bibliothek zu screenen (30% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS, 37°C; gewaschen mit 2 X SSC bei 50°C). Positiv hybridisierende Phagen wurden gereinigt und die Nukleotidsequenzen der Insertionen bestimmt. Computeranalysen wurden unter Verwendung der GCG-Software-Suite (Genetics Computer Group; Version 8.1) durchgeführt.
Zusätzlich zu bekannten Kaliumkanälen deutete eine der detektierten Sequenzen vom humanen Hippocampus darauf hin, dass sie das Konsensusmotiv enthalten kann, schloss aber mehrere Mehrdeutigkeiten ein (Genbank #M62043). Auf Grundlage dieser Sequenz wurden Oligonukleotide mit der Sequenz synthetisiert, die die Nukleotide 6 bis 36 des Sensestrangs haben; sowie die Nukleotide 258 bis 287 des Antisensestrangs. Die Oligonukleotide wurden verwendet, um eine humane Hippocampus-cDNA-Bibliothek zu prüfen.
Eine Sequenz, die eine vollständige Länge kodiert, hSK1 (SEQ ID Nr. 13), wurde isoliert und auf offene Leseraster, Kozak-Konsensussequenzen, potentielle Transmembrandomänen und vorausgesagte Proteinstruktur analysiert. Ein Fragment, das die mutmaßliche Porenregion enthielt, wurde durch zufälliges Primen radioaktiv markiert und anschließend verwendet, um eine Rattengehirn-cDNA-Bibliothek unter Verwendung einer Hybridisierungslösung aus 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS und 100 μg/ml Hefe-RNA bei 37°C zu untersuchen, und unter Verwendung von 0,5 X SSC bei 55°C gewaschen. Zwei Klone, die verschiedene vollständige Längen kodierende Sequenzen enthielten, wurden isoliert und analysiert: rSK2 (SEQ ID Nr. 15) und rSK3 (SEQ ID Nr. 16). Außerdem wurde ein teilweiser Klon identifiziert, der das Rattenhomolog von hSK1 (rSK1 (SEQ ID Nr. 14)) darstellt.
Die Sequenzen sagen Proteine mit 561 Aminosäuren für hSK1 (SEQ ID Nr. 1), 580 Aminosäuren für rSK2 (SEQ ID Nr. 2) und 553 Aminosäuren für rSK3 (SEQ ID Nr. 3) voraus, welche keine Dehnungen der Homologie (d.h. kein Signal oberhalb des Hintergrunds unter geringen stringenten Bedingungen) mit anderen klonierten Kaliumkanälen enthalten, abgesehen von einer 12-Aminosäuresequenz in der mutmaßlichen Porenregion. Eine Hydrophobieanalyse sagt sechs Transmembransegmente voraus, wobei die N- und C-Termini innerhalb der Zelle liegen. Die Sequenzen sind über ihre Transmembrankerne hochkonserviert (80-90% Identität), divergieren aber in Sequenz und Länge innerhalb ihrer N- und C-terminalen Domänen (Tabelle 1). Tabelle 1
Die vierte vorausgesagte Membran-durchspannende Domäne enthält 3 positiv geladene Reste, die nicht jede dritte Position besetzen, wie bei den Spannungs-abhängigen Kaliumkanälen (Durell et al., Biophys. J., 62:238-250 (1992)), sind aber durch 6 und 7 Reste getrennt. Es gibt Mehrfachkonsensusziele zur Phosphorylierung durch eine Vielzahl von Proteinkinasen. Einige dieser Stellen werden in allen Klonen gefunden. Jedoch enthält jeder Klon potentielle Phosphorylierungsstellen, die nicht unter allen Mitgliedern konserviert sind. Es gibt keine konservierten N-verbundenen Glycosylierungsstellen (NXXS/T) (SEQ ID Nr. 46) in vorausgesagten extrazellulären Domänen und kein Konsensusnukleotid oder Kalziumbindungsdomänen (E-F-Hände).
Northernblots von Rattengehirn und -skelettmuskeln zeigen, dass rSK3-Transkripte von diesen Geweben Proteine kodieren, die im Verhältnis zu dem rSK3-Klon SEQ ID Nr. 16 N-terminal verlängert sind. Die Nukleinsäure, die die N-terminale rSK3-Verlängerung kodiert, wurde kloniert und sequenziert, und die cDNA, die das N-terminal verlängerte rSK3 kodiert, wird durch SEQ ID Nr. 44 dargestellt. Außerdem wurde gezeigt, dass endogenes rSK3 eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Protein mit einem C-Terminus kodiert, wobei die letzten 5 Aminosäuren von SEQ ID Nr. 3 durch die letzten 9 Aminosäuren von SEQ ID Nr. 43 ersetzt sind. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass hSK3 eine N-terminale Verlängerung aufweist, und die cDNA, die diese N-terminale Verlängerung kodiert, wird von SEQ ID Nr. 48 dargestellt.
Beispiel 2
Beispiel 2 beschreibt die in situ-Hybridisierung von Rattengehirnschnitten unter Verwendung von Sequenzen, die für jeden der Ratten-SK-Kanalklone eindeutig sind, und die Bestimmung von Transkriptgrößen von verschiedenen peripheren Geweben.
Die Pflege und Behandlung von erwachsenen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten entsprachen den höchsten Standards der Institutionsrichtlinien. Die Ratten wurden mit Pentobarbital tief betäubt und mit eiskalter Kochsalzlösung, gefolgt von eiskaltem 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumborat (pH 9,5) transkardial perfundiert. Die Gehirne wurden schnell entfernt und über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd in Boratpuffer (pH 9,5), der 10% Saccharose enthielt, nachfixiert. Kryostat-Mikrotom-Schnitte (25 mm) wurden auf Gelatine- und Poly-L-lysinbeschichteten Objektträgern angebracht und 15 min lang in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS inkubiert, zweimal in 0,1 M PBS gewaschen und 30 min lang bei 37°C in 10 mg/ml Proteinase K in 100 mM Tris, 50 mM EDTA (pH 8), gefolgt von 0,0025% Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin bei Raumtemperatur behandelt. Die Schnitte wurden dann in 2 X SSC gewaschen, in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol dehydratisiert und bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet.
Matrizen zur Sondensynthese stellten C-terminale und 3'-nicht-translatierte Sequenzen dar, die zu jedem der Klone einzigartig waren, und wurden in pKS subkloniert. Unter Verwendung linearisierter Matrizen-DNA wurde eine ³⁵S-markierte Antisense-cRNA-Sonde 5 min lang auf 65°C erwärmt und auf 10 cpm/ml in Hybridisierungspuffer; 66% Formamid, 260 mM NaCl, 1,3 X Denhardt-Lösung, (13 mM Tris, pH 8,0, 1,3 mM EDTA, 13% Dextransulfat) verdünnt. Die Schnitte im Hybridisierungsgemisch wurden mit silikonisierten Glasdeckgläsern bedeckt und unter Verwendung von DPX-Mountant versiegelt. Nach dem 20 Stunden langen Inkubieren bei 58°C wurden die Objektträger in 4 X SSC getränkt, um die Deckgläser zu entfernen, dann vor der Ribonuclease A-Behandlung (20 mg/ml, 30 min lang bei 37°C) mit 4 X SSC (4 mal, jeweils 5 min lang) gespült. Die Objektträger wurden dann in abnehmenden Konzentrationen von SSC, das 1 mM DTT enthielt, bis zu einer Endstringenz von 0,1 X SSC, 1 mM DTT 30 min lang bei 65°C gespült. Nach dem Dehydratisieren der Schnitte in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol wurden sie vakuumgetrocknet und 7 Tage lang DuPont Cronex-4 Röntgenstrahlfilm ausgesetzt. Der Film wurde durch ein Microtek ScanMaker 1850S bei einer Auflösung von 728 Pixeln/cm gescannt und die Bilder unter Verwendung von Image v1.55-Software (NIH) und Photoshop (Adobe) analysiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass mRNAs zu den Rattensequenzen in charakteristischen, aber überlappenden Mustern über das ganze ZNS breit verteilt sind. rSK1 wird im Hippokampus und im Gyrus dentatus, der Körnerschicht und im vorderen olfaktorischen Kern exprimiert. rSK1-mRNA wurde auch im Subiculum, im olfaktorischen Tuberkel und im Neocortex detektiert. rSK2-mRNA ist die am häufigsten exprimierte mit höchster Expression im Hippokampus und niedrigeren Spiegeln im Gyrus dentatus, im Bulbus olfactorius und im vorderen olfaktorischen Kern. rSK2-mRNA wurde auch in der Körnerschicht, im retikulären Kern des Thalamus' und des Nucleus' pontis detektiert. Das Muster der in situ-Hybridisierung für rSK2-mRNA stimmt mit dem Muster von radioaktiv markiertem Apamin, das im Rattengehirn bindet, überein (Gelhart, Neuroscience, 52:191-205 (1993)). rSK3-mRNA wurde im olfaktorischen Tuberkel und im Bulbus olfactorius, überall im Thalamus, im lateralen Septum, in der ventralen Haubenregion und in der Substantia nigra pars compacta detektiert. Gemäßigte Spiegel wurden überall im Hypothalamus, im caudate putamen und im nucleus accumbens detektiert.
Dieselben eindeutigen Sequenzen für rSK1 und rSK2 wurden verwendet, um Nothernblots zu prüfen, die mit mRNA hergestellt wurden, die aus Gesamtgehirn- und diversen peripheren Geweben isoliert wurde. Gesamt-RNA wurde (Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5300 (1979)) aus Rattengehirn, der Nebenniere, dem Thymus, der Milz, dem Skelettmuskel, dem Herzen, der Niere, der Leber und der Lunge von 3 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten extrahiert. Poly(A)⁺-mRNA wurde durch Oligo-d(T)-Cellulosechromatographie (Collaborative Research) gereinigt, und 3 μg von jedem Gewebe wurde durch Elektrophorese durch ein 1% Agarose-Formaldehyd-Gel und Überführung auf Genescreen- (NEN) Nylonmembranen als Northernblot hergestellt. Antisense-Ribosonden mit derselben Sequenz, wie sie für die in situ-Hybridisierung verwendet wurden, wurden aus linearisierten DNA-Matrizen unter Verwendung von ³²P-UTP (NEN) synthetisiert. Blots wurden in 50% Formamid, 5% SDS, 400 mM NaPO₄, 1 mM EDTA bei 60°C 12 Stunden lang hybridisiert, gefolgt von Waschen in 0,05 X SSC bei 65°C, und unter Verwendung eines Phosphorimager 445 SI (Molecular Dynamics) nach 15 Stunden sichtbar gemacht.
rSK1-mRNA wurde in Rattengehirn und -herz detektiert, während rSK2-mRNA in Gehirn und Nebenniere detektiert wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass rSK1-mRNAs von unterschiedlichen Größen im Gehirn (3,2 kb) und Herz (4,4 kb) vorliegen. rSK2-mRNA wurde in Gehirn und Nebenniere als zwei Banden von 2,2 und 2,4 kb detektiert. Weder rSK1- noch rSK2-mRNA wurde aus Lunge, Leber, Niere, Thymus, Milz oder Skelettmuskel detektiert.
Beispiel 3
Beispiel 3 beschreibt die in-vitro-Expression von SK- und IK-Kanalproteinen.
3A. Beispiel 3A beschreibt die in-vitro-Expression von rSK2- und hSK1-mRNAs in Xenopus Oozyten und Messungen der elektrischen Leitfähigkeit.
In-vitro-mRNA-Synthese und Oozyten-Injektionen wurden durchgeführt, wie in Adelman et al., Neuron, 9:209-216 (1992) beschrieben. Pflege und Behandlung von Xenopus entsprachen den höchsten Standards der Institutionsrichtlinien. Die Frösche wurden nicht mehr als zwei Operationen unterworfen, die durch mindestens drei Wochen getrennt waren, und die Operationen wurden unter Verwendung gut etablierter Verfahren durchgeführt. Die Frösche wurden mit einer entlüfteten Lösung von 3-Aminobenzoesäureethylester betäubt.
Die Oozyten wurden 2-5 Tage nach der Injektion von 2 ng mRNA untersucht. Gesamtzell-Ströme wurden nach der mRNA-Injektion unter Verwendung eines Zwei-Elektroden-Spannungs-Clamps mit einem CA-1-Verstärker, der über eine Schnittstelle mit einem Macintosh Quadra 650-Computer angeschlossen war, gemessen. Daten wurden gleichzeitig durch Pulse (Heka, Deutschland) bei 500 Hz und Chart (AD Instruments, Australien) bei 10 Hz erfasst. Während der Aufnahme wurden die Oozyten kontinuierlich mit ND-96-Lösung, die 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES (pH 7,5 mit NaOH) enthielt, bei Raumtemperatur überschichtet. Um die Cl^–-Ströme zu minimieren, wurden einige Oozyten in Cl^–-freier ND96-Lösung (96 mM Na-Glukonat, 2 mM K-Glukonat, 2,7 mM Ca-Glukonat₂, 1 mM Mg-Glukonat₂, 5 mM HEPES, pH 7,5 mit NaOH) getränkt und untersucht. Spannungsprotokolle von einem Haltepotential von –80 mV riefen keine Ströme hervor, die von den Kontrolloozyten verschieden waren.
Weil das Expressionsmuster von rSK2 dem von mGluR1a, einen metabotropen Glutamatrezeptor (Houamed et al., Science, 252:1318-1321 (1991); Masu et al., Nature, 349:760-765 (1991)) ähnlich ist, wurde mGluR1a-mRNA mit oder ohne SK-mRNAs injiziert. Die Zugabe von Glutamat (1 mM) zum Bad, das den Oozyten enthielt, dem mGluR1a-mRNA injiziert wurde, rief alleine wegen der Aktivierung von endogenen Kalzium-aktivierten Chloridkanälen, gefolgt von der Freisetzung von intrazellulärem Kalzium, einen transienten, nach innen gerichteten Strom hervor (Houamed et al., Science, 252:1318-1321 (1991); Masu et al., Nature, 349:760-765 (1991)). Ähnliche Ergebnisse wurden in sechs anderen Oozyten erhalten, denen mGluR1a injiziert wurde. Spannungsanstiege von –120 bis 60 mV, die nahe dem Peak der nach innen gerichteten Reaktion appliziert wurden, riefen einen nach außen gerichteten gleichgerichteten Strom hervor, der sich bei –25 mV nahe des Cl^–-Umkehrpotentials umkehrte. Die Zugabe von Glutamat (1 mM) zu den Oozyten, das mit mGluR1a- und rSK2-mRNA zusammen injiziert wurde, rief den transienten Kalzium-aktivierten Chloridstrom hervor, der mit mGluR1a-injizierten Oozyten beobachtet wurde, gefolgt von einem großen transienten, nach außen gerichteten Strom. Ähnliche Ergebnisse wurden in 14 anderen Oozyten erhalten, denen mGluR1a und rSK2 zusammen injiziert wurden. Spannungsanstiege von –120 bis 60 mV, die nahe des Peaks der nach außen gerichteten Reaktion appliziert wurden, riefen einen großen nach innen gerichteten gleichgerichteten Strom hervor, der sich nahe –95 mV nahe des K⁺-Umkehrpotentials umkehrte. Dieses Ergebnis wurde mit jeder der klonierten Untereinheiten erhalten und legt nahe, dass die klonierten Sequenzen Kaliumkanäle kodieren.
Im Anschluss an die Einrichtung des 2-Elektroden-Spannungs-Clamps wurde der Oozyt mit einer dritten Elektrode durchbohrt, die 200 mM EGTA, pH eingestellt auf 7,2 mit KOH, enthielt. Der Eingangswiderstand wurde während des Durchbohrens überwacht, um die Oozytenlebensfähigkeit sicherzustellen. Zur angezeigten Zeit wurden 50 nl der EGTA-Lösung in den Oozyten injiziert. Unter der Annahme, dass ein Oozyt ein Volumen von 1 μl aufweist, betrug die vorausgesagte Endkonzentration von EGTA 10 mM. Eine intrazelluläre Injektion von EGTA hob beide Stromreaktionen auf, die durch die nachfolgende Anwendung von Glutamat hervorgerufen wurden, wobei angezeigt wurde, dass beide Komponenten Kalzium-aktiviert sind. Ähnliche Ergebnisse wurden in 3 anderen Oozyten erhalten, denen mGluR1a und rSK2 zusammen injiziert wurden. Strom/Spannungs-Verhältnis von Oozyten, denen rSK2-mRNA in Cl^–-freier externer Lösung, die 2, 6 oder 20 mM K⁺ enthielt, injiziert wurden. Der Strom wurde durch Injektion von CaCl₂ zu einer Endkonzentration von ~1 mM aktiviert (Adelman et al., Neuron, 9:209-216 (1992)). Der Hintergrundstrom wurde durch Anwendung von 100 nM Apamin bestimmt. Der Apamin-nicht-sensitive Hintergrundstrom variierte nicht mit externem K.
Zwei Tage nach der Injektion wurden die Oozyten >24 Stunden lang in Cl^–-freier ND96-Lösung getränkt, um die Cl^–-Ströme zu minimieren. Im 2-Elektroden-Aufnahmemodus wurde der Kanal durch Injektion von 5 nl 200 mM CaCl₂ durch eine dritte Elektrode aktiviert, was eine intrazelluläre Endkonzentration von ~1 mM Ca²⁺ zur Folge hatte. Dieses Verfahren führte zu einer länger andauernden Aktivierung des K⁺-Stroms als desjenigen, der durch Glutamat in Oozyten aktiviert wurde, denen mGluR1a und rSK2 zusammen ijiziert wurden. Bei diesen Oozyten wurde das Umkehrpotential im Verhältnis zum Hintergrundstrom in 100 nM Apamin bestimmt. Das mittlere Umkehrpotential ± Standardabweichung, das gegen [K⁺]₀ aufgezeichnet wurde, ergab eine Steigung von 55,4 mV/Dekadenänderung in [K⁺]₀ und einen y-Achsenabschnitt von –110 mV bei 1 mM [K⁺]₀.
Makroskopische Ströme wurden auch von Membran-Patches (excised patches) aufgezeichnet. Ströme wurden durch 2,5 Sekunden-Spannungsanstiege von –100 bis 100 mV in einem Inside-Out-Membran-Patch von einem Oozyten hervorgerufen, der rSK2 exprimiert. Ohne im Bad angewendetes Kalzium waren die Ströme von Kontrolloozyten nicht verschieden. Oozyten wurden injiziert, wie für die Zweielektroden-Spannungs-Clamp-Aufnahmen beschrieben.
Zwei bis neun Tage nach der Injektion wurden Inside-Out-Makropatches in eine Badlösung herausgeschnitten, die 116 mM K-Glukonat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES (pH-Wert 7,25, eingestellt mit KOH) enthielt, ergänzt mit CaCl₂ und/oder EGTA. Um eine nominal Ca-freie Lösung zu erhalten, wurde 1 mM EGTA zugefügt. In einer anderen Ausführungsform wurde CaCl₂ zur Badlösung zugefügt, wobei freie Kalziumkonzentrationen von 1-10 μM erhalten wurden. In diesem Fall wurde der Anteil von Kalzium, das an Glukonat bindet, mit einem Computerprogramm (CaBuf) bestimmt, wobei eine Stabilitätkonstante für Ca² ⁺-Glukonat von 15,9 M^–1 angenommen wurde (Dawson et al., Data for Biochemical Research (Oxford University Press, New York, (1969)). Um Ca² ⁺-Konzentrationen von unter 1 μM zu erhalten, wurden 5 mM EGTA zu der Badlösung zugefügt, und CaCl₂ wurde, wie unter Verwendung des CaBuf-Programms und von veröffentlichten Stabilitätskonstanten berechnet, zugefügt (Fabiato et al., J. Physiol., 75:463-505 (1979)). Bei Experimenten, bei welchen Mg²⁺ zu der Badlösung zugefügt wurde, wurde MgCl₂ zu den Gesamtkonzentrationen zugefügt, die im Text angegeben sind. Unter diesen Bedingungen ist die Bindung von Mg²⁺ an Glukonat vernachlässigbar (Stabilitätskonstante 1,7 M^–1).
Elektroden wurden aus dünnwandigem Filament-Borosilikatglas (World Precision Instruments) gezogen und mit 116 mM K-Glukonat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES (pH-Wert 7,25) gefüllt. Der Elektrodenwiderstand betrug typischerweise 2-5 MΩ. Membran-Patches wurden mit Spannung unter Verwendung eines Axopatch 200A-Verstärkers (Axon Instruments) festgeklemmt. Bei den Daten wurden die niedrigen Frequenzanteile nach Sessel bei 2 kH gefiltert und unter Verwendung der Pulse-Software (HEKA Electronik) ermittelt. Die Analyse wurde unter Verwendung von Pulse-, Kaleidograph- (Abelbeck) oder IGOR- (Wavemetrics) Software durchgeführt. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur von einem Haltepotential von –80 mV durchgeführt. 2,5 Sekunden-Spannungsanstiege von –100 zu 100 mV wurden bei einer Abtastfrequenz von 500 Hz ermittelt. In einer anderen Ausführungsform wurden Strom/Spannungs-Verhältnisse vom mittleren Strom während 500 ms-Steuerungen zu Spannungen zwischen –100 und 100 mV in 20 mV-Stufen erhalten, die bei 5 kHz aufgenommen wurden.
Eine Zugabe von 5 μM Ca²⁺ zu der intrazellulären (Bad-) Lösung rief einen erheblichen Strom hervor. Spannungsanstiege bei symmetrischem 120 mM K⁺ und bei Fehlen von innerem Mg²⁺ ließen ein Strom/Spannungs-Verhältnis mit geringfügig nach innen gerichteter Gleichrichtung erkennen. Spannungsschritte zwischen –100 und 100 mV von einem Haltepotential von –80 mV riefen zeitunabhängige Ströme hervor. Das abgeleitete I-V-Verhältnis reflektiert die nach innen gerichtete Gleichrichtung, die aus den Spannungsanstiegen ersichtlich ist. Der Strom wurde durch Spannungsschritte von einem Inside-Out-Makropatch hervorgerufen, das aus einem Oozyten herausgeschnitten wurde, der rSK2 exprimiert. Mit 5 μM Ca²⁺ im Bad wurde die Membran von einem Haltepotential von –80 mV zu Testpotentialen zwischen –100 und 100 mV stufenweise geändert und dann auf –50 mV repolarisiert. Ströme aktivierten sofort und zeigten keine Inaktivierung während der 500 ms-Testimpulse. Ähnliche Ergebnisse wurden für hSK1 erhalten, außer dass die nach innen gerichtete Gleichrichtung nicht so ausgeprägt war. Diese Ergebnisse identifizieren diese neue Familie als Kalzium-aktivierte Kaliumkanäle.
Beispiel 4
Beispiel 4 beschreibt die Kalziumsensitivität von rSK2-Kanälen.
Unter Verwendung von Inside-Out-Mikropatches, wie vorstehend beschrieben, wurde gezeigt, dass rSK2-Ströme, die durch Spannungsanstiege hervorgerufen wurden, von der Konzentration von Kalzium in der inneren (Bad-) Lösung abhängen. Die Steigung der Leitfähigkeit am Umkehrpotential wurde als Funktion der Kalziumkonzentration aufgezeichnet, und die Datenpunkte wurden in die Hill-Gleichung eingesetzt. Von 8 Patches betrug die mittlere K_d für Kalzium 0,63 ± 0,23 μM. Die steile Abhängigkeit von Kalzium, die aus dem Plot erkennbar ist, wird durch einen Hill-Koeffizienten von 4,81 ± 1,46 reflektiert, was nahelegt, dass mindestens zwei Kalziumionen an der Kanal-Torsteuerung beteiligt sind.
Beispiel 5
Beispiel 5 beschreibt die Magnesium-induzierte nach innen gerichtete Gleichrichtung für den rSK2-Kanal.
Die nach innen gerichtete Gleichrichtung bei rSK2, wie vorstehend beschrieben, wurde bei Fehlen von anderen inneren Kationen als Kalium und Kalzium (5 μM) beobachtet. Native SK-Kanäle zeigen eine nach innen gerichtete Gleichrichtung, die durch innere Mg²⁺-Ionen (Lancaster et al., J. Neurosci., 11:23-30 (1991)) induziert wurde. Im Hippokampus zeigen SK-Kanäle eine signifikante nach innen gerichtete Gleichrichtung in Gegenwart von innerem Mg²⁺ (idem). Ströme wurden von einem Inside-Out-Makropatch, der aus einem Oozyten herausgeschnitten wurde, der rSK2 exprimiert, in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von innerem Mg²⁺ und 10 μM Ca²⁺ hervorgerufen. Wenn verschiedene Konzentrationen von Mg²⁺ (0,1-3 mM) zur Lösung zugefügt wurden, die mit Inside-Out-Makropatches in Badkontakt standen, wurden nach außen gerichtete Ströme signifikant verringert.
Die Konzentrations- und Spannungs-Abhängigkeit von Mg² ⁺-induzierter nach innen gerichteter Gleichrichtung wurden untersucht. Es wurde eine geringfügige Abnahme des nach innen gerichteten Stroms bei Zunahme von Mg²⁺ beobachtet. Deshalb wurde das Verhältnis des nach außen gerichteten Stromes bei Potentialen zwischen 20 und 100 mV zu dem nach innen gerichteten Strom bei –100 mV als Funktion der verschiedenen Konzentrationen des inneren Mg²⁺ aufgezeichnet. Von Mehrfachexperimenten wurden die Datenpunkte, die bei verschiedenen Mg² ⁺-Konzentrationen und Spannungen erhalten wurden, an die Hill-Gleichung angepasst, wobei ein mittlerer Hill-Koeffizienten von 0,94 ± 0,27 (n = 24) erhalten wurde. Danach wurde der Hill-Koeffizient auf 1 festgelegt, und die mittlere K_d wurde als Funktion des Testpotentials aufgezeichnet. Die K_d verringerte sich bei Zunahme der Spannungen, was nahelegt, dass die Mg² ⁺-Blockade spannungsabhängig war. K_d für Mg²⁺ wurde von 5 Patches erhalten, wie in Tafel B bei 20, 40, 60, 80 und 100 mV gezeigt ist. Werte bei jedem Potential wurden gemittelt, als Funktion der Spannung aufgezeichnet und an die Woodhull-Gleichung, K_d(0 mV) exp(δzFE/RT) angepasst, wobei K_d(0 mV) = 6 mM, δ der Anteil des elektrischen Feldes ist, das das Mg²⁺-Ion erfährt, 0,30, z die Wertigkeit ist, 2, und F, E, R und T ihre üblichen Bedeutungen haben (Woodhull, J. Gen. Physiol., 61:687-708 (1973)). Die Anwendung der Woodhull-Gleichung legte nahe, dass das Mg²⁺-Ion ungefähr 0,30 des elektrischen Feldes der Membran erfährt.
Beispiel 6
Beispiel 6 beschreibt Einzelkanalaufnahmen von Oozyten.
6A. Beispiel 6A beschreibt Einzelkanäle, die unter Verwendung von Inside-Out-Patches untersucht wurden, die aus Oozyten herausgeschnitten wurden, die rSK2 exprimieren. Die Zugabe von Kalzium in submikromolaren Konzentrationen induzierte Kanalaktivität, die in Kontrollproben nicht gesehen wurden. Ein repräsentativer Patch zeigte, dass 0,2 μM Kalzium, das auf die Bad-Lösung angewendet wurde, Öffnungen zu einer einzelnen Amplitude induzierten. Die Kanalaktivität nahm zu, wenn die Kalziumkonzentration erhöht wurde, so dass in 0,6 μM Kalzium einheitliche Öffnungen nicht mehr aufgelöst werden konnten. Beim Auswaschen des Kalziums verschwand die Kanalaktivität. Die Kanalaktivität in Gegenwart von 0,4 μM Kalzium wurde bei mehreren Spannungen aufgezeichnet. Ähnlich den makroskopischen Anstiegsaufnahmen war die Kanalöffnungswahrscheinlichkeit von der Spannung offensichtlich nicht abhängig.
Einheitliche Öffnungen, die bei mehreren Spannungen gemessen wurden, wurden verwendet, um ein Einzelkanal-I/V-Verhältnis zu konstruieren. Die verwendeten Lösungen waren dieselben wie für Makropatchaufnahmen (Beispiel 5). Elektroden wurden aus Corning 7052-Glas (Garner) gezogen und wiesen Widerstände von 9-13 MΩ auf. Daten wurden bei 1 kHz (Sessel) gefiltert, bei 10 kHz unter Verwendung von Pulse (HEKA Electronik) ermittelt und direkt auf einem Macintosh Quadra 650 gespeichert. Einzelkanäle wurden unter Verwendung von MacTac (SKALAR Instruments) analysiert. Das Verfahren der „50%-Schwelle" wurde angewendet, um Ereignisamplituden zu schätzen. Die Schwelle wurde für jede Öffnung eingestellt, und jeder Übergang wurde visuell untersucht, bevor sie angenommen wurde. Amplitudenhistogramme wurden unter Anwendung von MacTacfit (SKALAR Instruments) konstruiert und passten am besten zu einer einzelnen Gauß-Verteilung. Die Kanalöffnungswahrscheinlichkeit wurde als NP(o) geschätzt, das Produkt der Öffnungswahrscheinlichkeit mit der Anzahl der Kanäle multipliziert. NP(o) wurde als die Summe von (Verweilzeit × Levelzahl) berechnet, geteilt durch die Gesamtzeit. N wurde als die Anzahl von gleichzeitig offenen Kanälen bei 0,4 μM Kalzium geschätzt. Eine lineare Regressionsanalyse an drei Patches eines Oozyten, der entweder rSK2 oder hSK1 exprimiert, ergab eine mittlere Einzelkanalleitfähigkeit von 9,9 ± 0,9 pS beziehungsweise 9,2 ± 0,3 pS.
Beispiel 7
Beispiel 7 beschreibt die Pharmakologie von neuen Kaliumkanälen der Ratte und des Menschen.
7A. Makroskopische rSK2-Ströme wurden in 5 μM Ca²⁺ von Inside-Out-Makropatches entweder mit 0 oder 60 pM Apamin oder mit 0 oder 2 μM d-Tubocurare in der Patchpipette aufgezeichnet, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die funktionellen Eigenschaften der klonierten Kanäle erinnern an die SK-Klasse der Kalzium-aktivierten Kaliumkanäle, die in Neuronen (Lancaster und Adams, J. Neurophysiol., 55:1268-1282 (1986); Lancaster et al., J. Neurosci., 11:23-30 (1991); Sah et al., J. Neurophysiol., 68:1834-1841 (1992)), Skelettmuskel (Blatz und Magleby, Nature, 323:718-720 (1986)), chromaffinen Nebennierenzellen (Park, J. Physiol., 481:555-570 ((1994); Artalejo et al., Pflugers Archiv., 423:97-103 (1993)) und T-Lymphozyten (Grissmer et al., J. Gen. Physiol., 99:63-84 (1992)) beschrieben sind. Native SK-Kanäle zeigen eine ausgeprägte Pharmakologie. Sie werden durch das Skorpionpeptid, Charyodotoxin (CTX), einen starken Blocker von BK-Kaliumkanälen, nicht blockiert (Miller et al., Nature, 313:316-318 (1985)). Jedoch werden viele, aber nicht alle SK-Kanäle durch das Bienengifttoxin, Apamin, und das Pflanzenalkaloid, d-Tubocurare, blockiert (dTC; Zhang und McBain, J. Physiol., 488:661-672 (1995), Park, J. Physiol., 481:555-570 (1994); Dun et al., J. Physiol., 375:499-514 (1986)). Die Anwendung von 500 nM CTX blockierte rSK2 oder hSK1 nicht, hob aber die Aktivität von hSlo BK-Strömen auf. rSK2-Ströme wurden durch pikomolare Konzentrationen von Apamin mit einer K_d von 63 pM stark blockiert. Im Gegensatz dazu beeinflusste die Anwendung von 100 nM Apamin nicht die hSK-1-Ströme (n = 8). dTC blockierte auch rSK2-Ströme mit einer K_d von 2,4 μM, während hSK1 mit einer K_d von 76,2 μM ungefähr 30-fach weniger sensitiv war. Sequenzverzeichnis

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptidmonomer eines Kalzium-aktivierten Kaliumkanals mit niedriger Leitfähigkeit kodiert, wobei das Monomer: a) ein Molekulargewicht zwischen 40 und 100 kDa aufweist; b) eine einheitliche Leitfähigkeit zwischen 2 und 60 pS aufweist, wenn das Monomer in der funktionalen polymeren Form eines Kaliumkanals vorliegt und in einer Xenopus Oozyte exprimiert wird; und c) eine Kernregion aufweist, die die Aminosäure-Subsequenzen LSDYALIFGM (SEQ ID Nr. 17) am proximalen Aminoende und QRKFLQAIHQ (SEQ ID Nr. 18) am proximalen Carboxylende einschließt und durch diese definiert ist, wobei die Kernregion mindestens 80% Identität zur Kernregion von hSK2 aufweist, welche sich von Aminosäurerest 134 bis 461 von SEQ ID Nr. 19 befindet.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend SEQ ID Nr. 1, 19, 20 und 47.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Nukleinsäuresequenz selektiv hybridisiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID Nr. 13, 21, 22 und 48.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht zwischen 50 und 80 kDa kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit einer einheitlichen Leitfähigkeit zwischen 5 und 25 pS kodiert, wenn das Polypeptid in der funktionalen polymeren Form eines Kaliumkanals vorliegt und in einer Xenopus Oozyte exprimiert wird.
Antikörper, der unter immunologisch reaktiven Bedingungen mit einem Kalziumaktivierten Kaliumkanalprotein mit niedriger Leitfähigkeit spezifisch reaktiv ist, wobei das Protein eine Sequenz SEQ ID Nr. 19 aufweist.
Antikörper nach Anspruch 6, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 8 transfiziert ist.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptidmonomer eines Kalzium-aktivierten Kaliumkanals mit niedriger Leitfähigkeit kodiert, wobei das Monomer, das einen Kaliumkanal bildet, aufweist: a) ein Molekulargewicht zwischen 40 und 100 kDa und b) eine einheitliche Leitfähigkeit zwischen 2 und 60 pS, wenn die Nukleinsäure, die das Monomer kodiert, in einer Xenopus Oozyte exprimiert wird, wobei die Nukleinsäure unter hochstringenten Bedingungen an eine Polynukleotidsequenz selektiv hybridisiert, die die SEQ ID Nr. 19 kodiert, wobei die hochstringenten Bedingungen eine Hybridisierung bei 37°C in einer Lösung, enthaltend 50% Formamid, 1 M NaCl und 1% SOS, und Waschen bei 60°C in einer Lösung, enthaltend 0,1 × SSC, umfasst.