ES2276466T3 - Polipeptido humano leucocitico del canal de potasio activado por calcio. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID Nº 3.

Description

Polipéptido humano leucocítico del canal de potasio activado por calcio.

Resumen de la descripción

Se describe un nuevo polipéptido humano leucocítico del canal de potasio activado por calcio, que se expresa en grandes cantidades en células T activadas. Se describe un ADNc de longitud completa que codifica el nuevo polipéptido del canal de potasio activado por calcio, así como la región estructural interior y la secuencia de restos de aminoácidos de la molécula biológica natural. Se proporcionan métodos para identificar compuestos que modulan la actividad biológica de un canal de potasio activado por calcio humano leucocítico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de un nuevo polipéptido humano del canal de potasio activado por calcio, derivado de los nódulos linfáticos, y al uso de estas secuencias para identificar compuestos que modulan la actividad de leucocitos humanos. La invención también se refiere al diagnóstico, estudio, prevención y tratamiento de una enfermedad relacionada con leucocitos disfuncionales.

Antecedentes de la invención

Las células madre hematopoyéticas dan lugar a todos los elementos formados de la sangre, incluyendo los leucocitos que generalmente están implicados en diversas enfermedades que incluyen la inflamación aguda y crónica, el asma, alergias, rechazo de injertos, trastornos proliferativos, anemias, choque séptico y trastornos relacionados, psoriasis, enfermedades neurodegenerativas con componentes inmunológicos, así como enfermedades autoinmunitarias que incluyen artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta de tejido conjuntivo, y encefalomielitis alérgica experimental (EAE). Los leucocitos comprenden neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos (que incluyen células T y células B), y monocitos. Los leucocitos pueden atravesar cada epitelio en el cuerpo, independientemente de su forma, grosor o permeabilidad. Gallin, E. K., et al., Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Segunda Edición, 441-458 (1992).

Los órganos linfoides centrales comprenden la médula ósea y el timo, en los que las células madre dan lugar a una progenie diversa de componentes de células de la sangre, incluyendo linfocitos. Los fagocitos, neutrófilos y monocitos se desarrollan en la médula ósea. Después de abandonar la médula, entran en el torrente sanguíneo, en el que forman un conjunto circulante y marginante. Los monocitos migran a los tejidos y cavidades corporales, en los que se diferencian en macrófagos. Los tejidos linfáticos en mamíferos se clasifican como centrales o periféricos, en los que generan linfocitos precursores funcionales, o proporcionan microentornos para la interacción de células linfoides con antígeno y células accesorias. Los linfocitos son cualquiera de los leucocitos mononucleares, no fagocíticos, que son las células inmunológicamente competentes del organismo y sus precursores.

El movimiento de los linfocitos T y B, y de las células mononucleares, a través y dentro del tejido linfático, es vitalmente importante para las interacciones celulares inductivas y reguladoras intrincadas que tienen lugar durante la iniciación y el transcurso de respuestas inmunitarias in vivo, incluyendo la inflamación. En la parte superior de la cascada de la respuesta inflamatoria se encuentran los linfocitos T. Las células T responden a sustancias nocivas mediante la activación, y enviando más de una docena de señales químicas diferentes que atraen a células inflamatorias. Vogel, G., Science, 276:1643 (1997); Immunophysiology, editado por Oppenheim, J.J., et al., Oxford (1990).

La célula T dirige la participación de leucocitos, incluyendo células B y macrófabos, en las respuestas inmunitarias humoral y celular fisiológicas globales. Las células T son responsables de dirigir células para que proliferen, migren y se diferencien en células efectoras apropiadas, vía la transducción de señales inter- e intracelulares. La importancia de la integridad bioactiva de un linfocito T normal se percibe fácilmente en medicina clínica actualmente como resultado de la notable demostración de las consecuencias de la disfunción de las células T. Textbook of Internal Medicine, Cap. 146, Lippincott, Phil. (1989).

La emigración de células inflamatorias desde la sangre hacia los tejidos representa uno de los componentes más importantes de la respuesta inflamatoria. Sin embargo, no es la verdadera acumulación de células lo que es crítico, sino, más bien, lo que hacen en el tejido a su llegada. Ciertos leucocitos (por ejemplo, neutrófilos y eosinófilos), cuando se estimulan apropiadamente, se mueven desde la sangre hasta los tejidos, y, en segundos, liberan sus contenidos en una vacuola endocítica, o, mediante fusión con la membrana plasmática, al exterior de la célula. De este modo, se logra una función primordial en los procesos inflamatorios. La categoría de células inflamatorias fagocíticas comprende neutrófilos, eosinófilos, y la serie fagocítica mononuclear. Gallin, E. K., et al., Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Segunda Edición, 441-458 (1992).

Se cree que la enfermedad inflamatoria crónica, la artritis reumatoide, por ejemplo, está mediada por células T activadas que se infiltran en la membrana sinovial e inician una serie de procesos inflamatorios. Panayi. G.S., et al., The Importance of the T-Cell in Initiating and Maintaining the Chronic Synovitis of Rheumatoid Arthritis, Arthritis Rheum, 35:729 (1992). Signos acumulativos también indican que la enfermedad autoinmunitaria esclerosis múltiple (MS) está mediada por linfocitos T autorreactivos. Stinissen. P., et al., Crit. Rev. Immunol., 17(1):33 (1997). Se ha demostrado que las células T autorreactivas sufren una activación in vivo y la expansión clonal en pacientes con MS. Zhang, J., et al., J. Mol. Med., 74(11):653 (1996). En diabetes mellitus, las células T anormales destruyen sistémicamente las células de los islotes pancreáticos, de forma que son incapaces de producir insulina. Además, otro desarrollo reciente impulsor en la implicación de células T sobrerreactivas es el reconocimiento de que parece que un subconjunto particular de linfocitos T es un culpable importante en el asma y otras enfermedades alérgicas, respondiendo con vigor indebido a invasores aparentemente no dañinos (las tasas de asma por cápita en el mundo desarrollado han aumentado drásticamente en las últimas décadas; doblándose en los EE.UU. desde 1980). New Clues to Asthma Therapies: Vogel, G., Science, 276:1643 (1997).

Los leucocitos reciben y responden a una variedad de estímulos como parte de su papel en defensas del hospedante y de la función inmune. La activación fisiológica de células T, por ejemplo, se logra cuando las células T encuentran células que presentan antígenos (APC) que tienen su ligando cognato (es decir, un péptido particular unido a una molécula de MHC de clase I o de clase II específica). Development and Function of Lymphocytes (Paul, W. E., Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Segunda Edición. Editado por J. I. Gallin, I. M. Godlstein, y R. Snyderman Raven Press, Ltd., Nueva York (1992)).

Desde hace tiempo se sospecha que los canales y flujos de iones desarrollan un papel en la transducción de señales linfocitarias. Mediante el control de los flujos iónicos a través de la membrana plasmática, los canales de potasio median cambios en las concentraciones intracelulares de iones y en el potencial de membrana, en respuesta a una variedad de estímulos. Los canales de potasio activados por calcio (K(Ca)) hacen que los linfocitos se hiperpolaricen en respuesta a la elevación de Ca^{2+} intracelular provocada por el acoplamiento del receptor al antígeno. La expresión de los canales tanto de K(V) como de K(Ca), accionados por el voltaje, está regulada al alza a medida que las células se dirigen hacia la división tras la estimulación mitogénica. Se han revisado los aspectos reguladores de los canales de potasio linfocíticos, incluyendo por qué se requieren para la activación de células T, así como las relaciones causales entre los canales iónicos, el potencial de membrana, la estimulación de mitógenos y la expresión génica de linfoquina. Lewis, R.S. y Cahalan, M.D., Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes, Annual Review of Immunol., 13:623 (1995).

Los avances recientes en la clonación de los canales de potasio activados por calcio han expandido enormemente la comprensión de la estructura de estas macromoléculas. Se han identificado ADNc de longitud completa, así como componentes típicos, de un canal de potasio previamente no identificado, a partir del cerebro. Kohler, M., et al., Science, 273:1709 (1996).

Así pues, el consenso es que al menos se expresan dos tipos de canales de potasio activados por calcio K(Ca), que se distinguen fácilmente por sus diferentes conductancias y perfiles farmacológicos, en un patrón específico de linaje en linfocitos. Los genes para estos canales todavía no se han clonado. Lewis. R.S. y Cahalan, M.D., Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes, Annual Review of Immunol., 13:623 (1995).

Los mitógenos de células T y B estimulan un incremento tanto de la densidad de canales de potasio accionados por el voltaje como activados por el calcio, y existe una correlación positiva entre la densidad de canales de K^{+} y la actividad proliferativa en timocitos. Además, los estudios farmacológicos sugieren claramente un requisito para canales de K^{+} funcionales en la activación de células T y B. Id.

Un número de fármacos comercializados funcionan como antagonistas de canales de potasio. El más importante de estos incluye los compuestos gliburida, glipizida y tolbutamida. Estos antagonistas de canales de potasio son útiles como agentes antidiabéticos. También, los antagonistas de canales de potasio se utilizan como agentes antiarrítmicos de clase III, y para tratar infartos agudos en seres humanos. Se sabe que un número de toxinas de origen natural bloquean los canales de potasio, incluyendo la apamina, iberiotoxina, caribdotoxina (CTX), margatoxina, noxiustoxina, kaliotoxina, dendrotoxina(s), péptido desgranulante de mastocitos (MCD), y beta-búngarotoxina (beta-BTX).

Una variedad de agentes farmacológicos han demostrado que bloquean el canal de potasio accionado por voltaje, y, en paralelo, inhiben la activación y purificación de linfocitos T y B. Lewis, R.S. y Cahalan, M.D., Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes, Annual Review of Immunol., 13:623 (1995).

Desafortunadamente, todavía no se ha encontrado ningún compuesto que bloquee exclusivamente los canales de potasio activados por calcio, especialmente en leucocitos humanos. En consecuencia, existe la necesidad de identificar un canal de potasio activado por calcio de origen leucocítico como una diana farmacológica para identificar sistemáticamente compuestos candidatos para la modulación de la actividad celular. Tales moduladores son potencialmente útiles para tratar trastornos manifestados por leucocitos disfuncionales. Todavía existe la necesidad de la capacidad de identificar sistemáticamente tales compuestos. Además, se necesitan bloqueadores selectivos de canales para tratar la contribución de canales de potasio activados por calcio al potencial de membrana, y para la señalización durante la activación de células T. Grissmer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol, 102:601 (1993). El papel central de los canales de potasio en la regulación de numerosas funciones celulares los convierten en dianas particularmente importantes para el desarrollo terapéutico. Es probable que las terapias inmunitarias específicas, diseñadas para controlar la activación y proliferación de células T, mejoren la evolución clínica de diversas enfermedades autoinmunitarias.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige a una molécula polinucleotídica aislada y purificada, que codifica un polipéptido de un canal de potasio, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3. Los polinucleótidos aislados y purificados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7 (ADNc del canal de potasio activado por calcio) y SEQ ID NO:2 (región codificante estructural del canal de potasio activado por calcio).

Además, la actual invención se dirige a un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

La invención se dirige además a un vector de expresión para la expresión de un polipéptido de un canal de potasio activado por calcio, en un hospedante recombinante, en el que dicho vector contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de un canal de potasio activado por calcio que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3.

Además, la invención se refiere a una célula hospedante que contiene un vector de expresión, para la expresión de un polipéptido de un canal de potasio activado por calcio, en el que dicho vector contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de un canal de potasio activado por calcio que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3.

La actual invención se refiere además a un método para identificar compuestos que modulan una actividad del canal de potasio, que comprende:

(a)

combinar un compuesto modulador candidato de la actividad de un canal de potasio, con el canal de potasio que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, y

(b)

medir un efecto del modulador sobre el canal.

La invención también se refiere a un método para identificar compuestos que modulan la actividad de un canal de potasio, que comprende:

(a)

combinar un compuesto modulador candidato de una actividad del canal de potasio, con una célula hospedante que expresa el polipéptido de un canal de potasio que tiene la secuencia sustancialmente según se representa en SEQ ID NO:3, y

(b)

medir un efecto del modulador sobre el canal.

La invención se refiere además a una molécula polinucleotídica antisentido que comprende el complemento de SEQ ID NO:2.

La actual invención también se refiere a un anticuerpo específico para un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

La actual invención también se refiere a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo específico para un polinucleótido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, para la identificación de una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta la SEQ ID NO:1 que es la secuencia de ácidos nucleicos de ADNc de longitud completa, de 2262 bases, que codifica el polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio (hKCa4) descrito aquí.

La Figura 2 presenta la SEQ ID NO:2, que es la región estructural traducida, ATG hasta TAG, de la secuencia de ácidos nucleicos de ADNc que codifica el nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí.

La Figura 3 presenta la SEQ ID NO:3, que es la secuencia de 427 restos de aminoácidos del nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí.

La Figura 4 presenta la SEQ ID NO:4, que es la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido derivado de cerebro HSK1 del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia (Kohler, M., et al., Science, 273:1709 (1996)).

La Figura 5 muestra la SEQ ID NO:5, que es la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido derivado de cerebro RSK2 del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia (Kohler, M., et al., Science, 273:1709 (1996)).

La Figura 6 muestra la SEQ ID NO:6, que es la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido derivado de cerebro RSK3 del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia (Kohler, M., et al., Science, 273:1709 (1996)).

La Figura 7 muestra una comparación entre la secuencia de restos de aminoácidos del nuevo polipéptido humano derivado de nódulos linfáticos del canal de potasio activado por calcio, descrito aquí (SEQ ID NO:3) (denominado HKCA4), y las secuencias de restos de aminoácidos de los polipéptidos HSK1 (SEQ ID NO:4), RSK2 (SEQ ID NO:5) y RSK3 (SEQ ID NO:6) derivados del cerebro del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia. Se presentan en cajas los restos conservados de aminoácidos. Los guiones representan saltos introducidos para optimizar el alineamiento. Las secuencias mostradas en esta figura se produjeron usando el programa de alineamiento de multisecuencias de programa de ordenador DNASTAR (DNASTAR Inc, Madison WI).

La Figura 8 representa una gráfica de hidrofobia de la secuencia de 427 restos de aminoácidos del nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio (SEQ ID NO:3). Se indican seis (6) regiones transmembránicas, S1 hasta S6. Kyte, J., Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., 157:105 (1982). (DNASTAR Inc. Madison WI).

La Figura 9 muestra una fuerte señal de ARNm del nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí, con la activación de células T, en un análisis de transferencia Northern.

La Figura 10 muestra SEQ ID NO:8, que es un clon de ADNc parcial del nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí.

La Figura 11 muestra SEQ ID NO:9, que es un clon de ADNc parcial del nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí.

La Figura 12 muestra SEQ ID NO:7, una secuencia de ácidos nucleicos de ADNc de longitud completa, de 2238 bases, que comprende SEQ ID NO:2, y que codifica el nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí (una variación 5'UTR de SEQ ID NO:1, se subrayan el codón iniciador y el codón de parada).

La Figura 13 demuestra las corrientes de KCa (actividad biológica) en células HEK 293 transfectadas con SEQ ID NO:2. (a) Dependencia de la corriente celular completa en la perfusión de ionomicina 1 \muM, y bloqueo mediante CTX (100 nM). Las corrientes superimpuestas fueron provocadas por rampas de voltaje de 200 ms desde -100 hasta +40 mV (E_{mantenimiento} = -50 mV). La disolución de la pipeta contenía 100 nM [Ca^{2+}]_{libre}, y la disolución del baño contenía 160 mM de K^{+}. (b) Bloqueo, dependiente de la concentración, de la corriente de KCa mediante CTX (\bullet), TEA (\blacksquare), y clotrimazol (\blacktriangle). El protocolo es el mismo que en el apartado (a), excepto que la [Ca^{2+}]_{libre} se tamponó hasta 1 \muM en la pipeta, y se omitió la ionomicina del baño. Las corrientes se midieron a -95 mV en la rampa, y se normalizaron entre la amplitud de control y aquella obtenida durante la perfusión con 100 nM de CTX en el mismo experimento. Cada punto es la media \pm SEM de 3-5 experimentos. Las líneas gruesas son ajustes a una ecuación de Hill de la siguiente forma: 100/[1+(K_{d}/x)^{n}], en la que x es la concentración, K_{d} es la concentración que produce una inhibición del 50 por ciento, y n es el factor de pendiente de la recta. Véase el texto para parámetros ajustados. (c) Selectividad de K^{+} de la corriente de KCa. Cada punto representa la media \pm SEM voltaje (n = 3-6), en el que la corriente de control convergió con la corriente en CTX durante rampas de voltaje a la concentración de K^{+}_{(salida)} designada. La línea gruesa es una regresión lineal de los datos (pendiente 57 mV).

La Figura 14 presenta registros de canales individuales y la sensibilidad al calcio del nuevo canal (SEQ ID NO:2): (a) corriente de canal individual a partir de un parche unido a célula con 160 K^{+} en la pipeta. El baño contenía disolución de Ringer con 1 \muM de ionomicina. El parche formó una rampa a lo largo de 100 ms desde -120 hasta +60 mV. Se restó digitalmente una traza en blanco (es decir, sin aberturas del canal). La línea discontinua representa una conductancia de pendiente de 31 pS. (b) Las trazas representativas obtenidas a partir de un parche de dentro-fuera cortado a partir de una célula transfectada con hKCa4 (E_{mantenimiento} = -80 mV). La pipeta contenía 160 mM de K^{+}, y el parche se perfusionó con la [Ca^{2+}]_{libre} indicada. (c) Relación entre la probabilidad abierta y la [Ca^{2+}]_{libre}
citoplásmica determinada usando el protocolo experimental en (b). Las probabilidades abiertas de los canales individuales se determinaron mediante las áreas relativas de ajustes gausianos a histogramas de amplitud-frecuencia. Los puntos son la media \pm SEM a partir de un número designado de experimentos. La línea continua es un ajuste a la ecuación de Hill descrita en la Fig. 13b. (d) Tabla resumen de datos obtenidos a partir de los experimentos mostrados en las Fig. 13 y 14 para SEQ ID NO:2 expresado en células HEK, en comparación con los datos publicados para el canal de KCa de células T humanas.

La Figura 15 presenta la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:7, así como la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO:3). Se encuadran y se sombrean las regiones transmembránicas predichas. Los sitios de consenso para la glicosilación se indican mediante un triángulo; los sitios de fosforilación de serina-treonina se rodean con un círculo, la señal de poliadenilación se subraya, y el codón de parada se indica mediante un asterisco. (b) Gráfica de hidropatía de SEQ ID NO:3, que muestra seis segmentos transmembránicos predichos y un poro entre S5 y S6. (c) Dendograma de aminoácidos de SEQ ID NO:3 con los canales de KCa de pequeña conductancia recientemente clonados, hSK1, rSK2 y rSK3 (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, respectivamente).

La Figura 16 muestra un análisis de transferencia Northern de un mensaje de SEQ ID NO:7: (a) en tejidos múltiples, (b) en linfocitos T humanos en reposo y activados, que muestran la regulación al alza del mensaje, (c) en análisis de pinzamiento zonal de células T representativas que se sometieron a análisis Northern en (b), que muestra la regulación al alza de las corrientes del canal de KCa con la activación. Cada traza de corriente superimpuesta fue provocada por una rampa de voltaje de 200 ms desde -100 hasta +40 mV (E_{mantenimiento} = -50 mV). Traza 1: célula T en reposo, 2: célula T en reposo más 100 mM de CTX, 3: célula T activada, 4: célula T activada más 100 nM de CTX. Se muestran los componentes de las corrientes de Kv y KCa.

La Figura 17 muestra el registro de la corriente del pinzamiento zonal de transfectantes estables de HEK 293/SEQ ID NO:2.

La Figura 18 muestra una curva de dosis frente a respuesta, para los canales de hKCa4 que se unen a CTX (SEQ ID NO:3).

La Figura 19 muestra los análisis de transferencia Western de anticuerpos anti-SEQ ID NO:3.

La Figura 20 demuestra la regulación a la baja de las corrientes de los canales de potasio activados por calcio (SEQ ID NO:3) en estirpes celulares T inducidas hasta anergia.

La Figura 21 ilustra el análisis de supresión de la cola de COOH de SEQ ID NO:3, para identificar el sitio de interacción con calmodulina.

La Figura 22 muestra el ADNc de longitud completa (SEQ ID NO:13 del ortólogo Kca4 murino, que incluye la región codificante estructural (subrayada ATG \rightarrow TAG).

La Figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos naturales (SEQ ID NO:14) del homólogo de Kca4 murino.

La Figura 24 muestra el alineamiento de aminoácidos de secuencias homólogas de KCa4 de ratón y de ser humano.

Descripción detallada de la invención

Excepto que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los mismos significados que los entendidos habitualmente por la persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención.

La actividad biológica, como se usa aquí, se refiere a la capacidad de un canal de potasio activado por calcio de permitir el flujo y/o transporte de iones potasio transmembránicos, o para regular el flujo y/o transporte iónico de potasio transmembránico. La actividad biológica, como se usa aquí, también pretende englobar la actividad farmacológica, per se, como en la capacidad de una subunidad para unirse o asociarse con al menos alguna otra subunidad peptídica del canal, ligando, o cofactor (por ejemplo, calmodulina y/o calcio), y/o modular de otro modo la actividad biológica de un canal de potasio.

Fragmento biológicamente activo, como se usa aquí, incluye péptidos que se han truncado con respecto a los términos M o C, o ambos; o el extremo 5' o 3' correspondiente de las regiones codificantes de ácidos nucleicos correspondientes, o ambos, fragmentos los cuales realizan sustancialmente la misma función o codifican péptidos que realizan sustancialmente la misma función de manera sustancialmente igual a la del precursor. Fragmento biológicamente activo, como se usa aquí, también pretende englobar mutantes negativos dominantes, farmacológicamente activos, contemplados aquí.

Secuencia de ácidos nucleicos, como se usa aquí, se refiere a una secuencia oligonucleotídica, nucleotídica o polinucleotídica, y a sus fragmentos o porciones, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser bicatenario o monocatenario, ya sea que represente la cadena sentido o antisentido. De forma similar, secuencia de aminoácidos, como se usa aquí, se refiere a secuencias peptídicas o proteínicas, o sus porciones. El término "purificado" se refiere a moléculas, ya sea secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, que se eliminan de su entorno natural y se aíslan o se separan de al menos algún otro componente con el que están asociados naturalmente.

"Sustancialmente como se representa", como se usa aquí, se refiere a proteínas derivadas funcionales, péptidos variantes y secuencias de ADN que pueden tener cambios pero que realizan sustancialmente la misma función bioquímica de manera sustancialmente igual; sin embargo, "sustancialmente según se representa" como se usa aquí, también se refiere a versiones de mutantes negativos dominantes.

Administración directa, como se usa aquí, se refiere a la administración directa de constructos de ácidos nucleicos que codifican realizaciones (por ejemplo, SEQ ID NO:3, mutante negativo dominante, molécula de compuesto modulador, molécula antisentido, molécula de anticuerpo) de la presente invención, o sus fragmentos; y la administración directa de realizaciones de la presente invención, o sus fragmentos, y la introducción in vivo de moléculas de la presente invención, preferiblemente vía un vector de expresión eucariota eficaz, en un portador farmacéutico adecuado. Los polinucleótidos y moléculas terapéuticas de la presente invención también se pueden suministrar en forma de transcritos de ácidos nucleicos.

El término "modulación" se usa aquí para referirse a la capacidad de potenciar o inhibir una propiedad funcional de una subunidad o de un canal de potasio. El término "modulación" también se usa aquí para referirse a la capacidad de afectar a la actividad biofísica de una célula. Modular la fisiología, como se usa aquí, se refiere a la regulación biofisiológica de células y/o tejido, y al tratamiento de trastornos patofisiológicos relacionados.

La modulación o regulación de la actividad biológica y/o de la actividad farmacológica, como se usa aquí, se refiere a la unión, bloqueo, antagonización, represión, neutralización, o secuestro, de una estructura biomolecular del canal de potasio, incluyendo, pero sin limitarse a, el nuevo polipéptido del canal de potasio activado por calcio descrito aquí; así como para la regulación al alza o agonización o activación de un canal de potasio mediante un compuesto identificado por los medios descritos aquí.

La secuencia de ácidos nucleicos también proporciona el diseño de moléculas antisentido útiles en la regulación a la baja, disminución o eliminación de la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos genómica en células, incluyendo, pero sin limitarse a, leucocitos, células endoteliales, microglías, y células tumorales o cancerígenas.

Vector de expresión, como se usa aquí, se refiere a construcciones vectoriales de ácidos nucleicos que tienen componentes para dirigir la expresión de regiones codificantes de proteínas heterólogas, incluyendo regiones codificantes de la presente invención, a través de la transcripción y traducción exacta en células hospedantes. Los vectores de expresión contienen habitualmente un promotor para dirigir las polimerasas para transcribir la región codificante heteróloga, un sitio de clonación en el cual introducir la región codificante heteróloga, y habitualmente señales de poliadenilación. Los vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores retrovíricos, vectores víricos y vectores sintéticos.

Células hospedantes transformadas, como se usa aquí, se refiere a células que tienen regiones codificantes de la presente invención integradas establemente en su genoma, o presentes episómicamente como entidades replicantes o no replicantes en forma de un ácido nucleico lineal o transcrito o plásmido circular o vector.

Canales de potasio activados por calcio

Los canales de potasio activados por calcio (K(Ca)) provocan que los linfocitos se hiperpolaricen en respuesta a la elevación de Ca^{2+} intracelular provocado por el enganche del receptor al antígeno. La expresión tanto de los canales de potasio activados por calcio K(Ca) como del potasio accionado por voltaje K(V) está regulada al alza a medida que las células progresan hacia la división después de la estimulación mitogénica. La señal del calcio se requiere para permitir un número de sucesos de activación esenciales estrechamente ligados a la abertura y cierre de los canales de calcio y de potasio, según se demuestra mediante la formación de imágenes de Ca^{2+} en células individuales. La señalización sostenida y las oscilaciones dependen absolutamente de los canales de Ca^{2+} de la membrana plasmática, que se activan indirectamente mediante el agotamiento de almacenes de calcio intracelular. Lewis, R.S. y Cahalan, M.D., Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes, Annual Review of Immunol., 13:623 (1995).

La densidad de superficie de los canales de potasio en la membrana plasmática de linfocitos T está regulada durante el desarrollo y durante la activación de células maduras por mitógenos. Para un repaso, véase Cahalan, M.D., et al.; Curr. Top. Membr., 39:357-394; Lewis, R.S.. et al., Trends Neurosci., 11:214-218. La expresión de los canales de potasio activados por calcio K(Ca) en células T humanas está regulada profundamente al alza por mitógenos, aumentando desde \sim20 para una célula en reposo hasta >500 canales por citoblastos T tratados con fitohemaglutinina (PHA). De este modo, la contribución relativa de los canales de K(Ca) al potencial de membrana parece que está enormemente potenciada en células activadas, y quizás en células de memoria. Lewis, R.S. y Cahalan, M.D., Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes, Annual Review of Immunol., 13:623 (1995).

Grissmer, S., et al., han demostrado además que la estimulación mitogénica de células T humanas da como resultado un aumento de la concentración de Ca^{2+} libre citosólico, que es vital para sucesos subsiguientes que conducen a la proliferación celular y a la secreción de linfoquinas. Los canales de potasio activados por calcio (K(Ca)) se caracterizaron en linfocitos T de sangre periférica humana en reposo y activados, usando un registro de pinzamiento zonal simultáneo, y usando la monitorización mediante fura-2 de la concentración de Ca^{2+} citosólico. Los experimentos con células completas, usando disoluciones de pipeta tamponadas con EGTA para elevar la [Ca^{2+}]_{i} hasta 1 \muM, revelaron un aumento de 25 veces del número de canales de potasio activados por calcio conductores por célula, a partir de una media de 20 en células T en reposo hasta >500 canales por célula en citoblastos T después de la activación mitogénica. Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol, 102:601 (1993). El caudal elevado de canales de potasio activados por calcio, y la apertura y cierre discretos, permite la medida de corrientes a través de canales individuales usando técnicas de pinzamiento zonal estándares. Los resultados dados a conocer indican que la expresión del canal de potasio activado por calcio, sensible a caribdotoxina (CTX), aumenta drásticamente después de la activación. Los citoblastos T activados expresan muchos más canales de potasio activados por calcio que los linfocitos T HPB en reposo. El número creciente de canales de K(Ca) refleja un incremento principalmente en la densidad de superficie de los canales. J. Gen. Physiol, 102:601 (1993).

Se ha demostrado que la caribdotoxina, (CTX), un péptido de 37 aminoácidos, purificado a partir del veneno de escorpión Leiurus quinquestriatus (Gimenenz-Gallego et al., PNAS, 85: 3329-3333, 1988), bloquea la proliferación, inducida por mitógenos, de linfocitos T periféricos humanos (Lin C et al., FASEB J. 6: 1693, 1992). Se ha demostrado que este efecto de CTX actúa vía el bloqueo de los canales de potasio que mantienen el potencial de membrana en reposo de la célula (Leonard R et al., PNAS 89: 10094-98. 1992). CTX es un bloqueador tanto del canal de potasio activado por calcio (KCa) como del canal de potasio accionado por voltaje (Kv1.3), en células T (Grissmer et al., J. Gen Physiol. 102: 601-630, 1993). La CTX afecta sólo a las vías de activación dependientes del calcio, en linfocitos (Garcia ML. J Bioenerg. Biomembr 23: 615-646, 1991). Se ha usado CTX marcada radioactivamente como un ligando para la identificación sistemática de alto rendimiento (HTS) de fármacos para Kv1.3 (Hill RJ, Mol. Pharm. 48: 98-104, 1995; Deutsch C et al., J. Biol. Chem. 266: 3668-3674, 1991). Aunque se han identificado otras toxinas peptídicas que bloquean selectivamente Kv1.3, no existe ningún agente farmacológico que bloquee selectivamente el canal de KCa en linfocitos, con una potencia elevada. Con la clonación del nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí, ahora es posible generar una estirpe celular que sobreexprese el canal que se puede usar entonces en la identificación sistemática de alto rendimiento (HTS) para identificar bloqueadores selectivos de un canal de potasio activado por calcio en linfocitos T. Estos agentes bloqueadores de canales también se podrían usar como herramientas de investigación para comprender el papel fisiológico de estos canales en una variedad de células de origen hematopoyético y de otro origen.

Los bloqueadores de canales selectivos son necesarios para dirigir la contribución de canales de potasio activados por calcio hacia el potencial de membrana, y para la señalización durante la activación de células T. Grissmer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol, 102:601 (1993).

Además, se dio a conocer que los canales de potasio activados por calcio, descritos por Grissmer, S., et al., se asemejan a los encontrados en glóbulos rojos, el tipo celular en el que se descubrieron en primer lugar los canales de K(Ca) a través de medidas de flujo de trazadores. Gardos, G., The Function of Calcium in the Potassium Permeability of Human Erythrocytes, Biochim. Biophys. Acta., 30:653 (1958); repasado por Schwarz y Passow, Calcium Activated Potassium Channels in Erythrocytes, Annual Review of Physiology, 45:359 (1983); véase también, Brugnara, C., et al., Therapy with Oral Clotrimazole Induces Inhibition of the Gardos Channel and Reduction or Erythrocyte Dehydration in Patients with Sickel Cell Disease, J. Clin. Investigation, 97(5):1227 (1996).

Refiérase a la patente U.S. nº 5.397.702, Assay For and Treatment of Autoimmune Diseases, expedida el 14 de marzo de 1995; la patente U.S. nº. 5.637.470, Screening array using cells expressing recombinant alpha and beta subunits of the mammalian large-conductance (maxi-K) potassium channel, expedida el 10 de junio de 1997; la patente U.S. nº 5.607.843, Nucleic Acid Sequence Encoding Apamin Binding Protein, expedida el 4 de marzo de 1997; y la patente U.S. nº 5.602.169, 3-substituted oxindole derivatives as potassium channel modulators, expedida el 11 de febrero de 1997.

Canales de potasio activados por calcio de IK (conductancia intermedia)

El canal de IK se expresa en células hematopoyéticas y en células endoteliales, ciertas células de origen epitelial y en glóbulos rojos. En los glóbulos rojos, en los que el canal se ha denominado el canal de Gardos, una elevación de la concentración de Ca^{2+} intracelular abre el canal y provoca pérdida de potasio y deshidratación celular, un estado que se ve exacerbado en anemia drepanocítica. Los enfoques terapéuticos prometedores para la anemia drepanocítica implican bloquear específicamente el canal de IK. Los canales de IK también se han implicado en la microvasculatura del riñón, en el que pueden ser responsables de los efectos vasodilatadores de la bradiquinina. La disminución de la tensión sanguínea durante el choque séptico está provocada por un incremento de la producción de NO por las células endoteliales, y los canales de IK en estas células son responsables de mantener el influjo de Ca^{2+} que activa la NO sintasa sensible a Ca^{2+}. En células endoteliales capilares del cerebro, los canales de IK, activados por endotelina que se produce por neuronas y neuroglía, desvían el exceso de K^{+} a la sangre. Los granulocitos neutrofílicos, células fagocíticas móviles que defienden contra invasores microbianos, sufren una gran despolarización tras la estimulación agonista, y los canales de IK se han visto implicados en la repolarización del granulocito estimulado. El canal de IK es sensible a un número de toxinas peptídicas, así como también a bloqueadores orgánicos. La caribdotoxina es el bloqueador peptídico más potente (IC_{50} = 5-10 nM sobre hKCa4 clonado (SEQ ID NO:3, más arriba)), y clotrimazol es el más potente de los antimicóticos (IC_{50} = 100-300 nM) (Figs. 5-6). El clotrimazol es el compuesto que se evalúa para el tratamiento de la anemia drepanocítica.

Canales de potasio activados por calcio derivados del cerebro

Köhler, M. et al., describe las estructuras moleculares de miembros de una familia previamente no identificada de canales de potasio activados por calcio, con seis dominios transmembránicos clonados, a partir de cerebro de rata y de ser humano. Se aislaron y se tradujeron tres secuencias codificantes de longitud completa en sus respectivas secuencias de restos de aminoácidos, una de ser humano, HSK1 (SEQ ID NO:4) (561 restos), y dos procedentes de cerebro de rata, rSK2 (SEQ ID NO:5), (580 restos), y rSK3 (SEQ ID NO:6) (553 restos). La expresión de los ARNm respectivos en oocitos de Xenopus dio como resultado canales de potasio independientes del voltaje, activados por calcio. Science. 273:1709 (1996). El análisis de hidrofobia predice seis segmentos transmembránicos de cada uno, residiendo los términos NH2 y COOH dentro de la célula. Las secuencias se conservan enormemente a través de sus núcleos transmembránicos (80 hasta 90% de homología), pero divergen en secuencia y en longitud dentro de sus dominios NH2- y COOH-terminales. Los canales clonados no muestran una homología significativa de aminoácidos con otras subunidades de canales de potasio clonados, excepto por un tramo de 12 restos dentro del dominio de poro putativo. Las gráficas de hidrofobia predijeron que estas subunidades contienen seis dominios transmembránicos, una topología compartida con miembros de la clase de canales de K^{+} accionados por voltaje. Jan, L.Y., et al., Nature. 345:672 (1990). Aunque relacionados en topología con los canales de K^{+} dependientes del voltaje, incluyendo una región P y un segmento S4, los clones de Köhler, M. et al., residen en una rama evolutiva distinta dentro de la superfamilia de canales de K^{+}. Science, 273:1709 (1996).

Nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio (IK)

Los canales de potasio desempeñan un papel crítico a la hora de modular la señalización por calcio de los linfocitos. Verheugen, J. A., et al., Cell Calcium, 17: 287 (1995). Los linfocitos T humanos expresan al menos dos tipos de canales de potasio: aquellos que se abren en respuesta a cambios en el potencial de membrana (canales de Kv), y aquellos que son activados tras las elevaciones de los niveles de calcio intracelular (canales de KCa). Lewis, R. S., et al., Annu. Rev. Immunol., 13:623 (1995). El canal de Kv predominante, en células T humanas, está codificado por Kv1.3, un gen del canal de potasio accionado por voltaje relacionado con Shaker. Kv1.3 se ha caracterizado ampliamente a nivel molecular y fisiológico, y desempeña un papel vital a la hora de controlar la proliferación de células T, principalmente manteniendo el potencial de membrana en descanso de la célula. Chandy, K. G., et al., Sem. Neurosci., 5:125 (1993). Con la activación de las células T, hay como máximo un incremento de 2 veces de las corrientes de Kv1.3. El canal de KCa predominante, en linfocitos T, es de conductancia intermedia, es insensible al voltaje, y se bloquea potencialmente por el péptido de veneno de escorpión, caribdotoxina (CTX; 4). A diferencia de Kv1.3, las corrientes del canal de KCa se regulan drásticamente al alza (10-25 veces) tras la estimulación mitogénica o antigénica, y se piensa que desempeñan un papel importante en la post-activación y en los fenómenos inmunes secundarios. Grissmer, S., et al., 102:601 (1993); Verheugen, J. A., et al., Cell Calcium. 21:1 (1997). Los canales de KCa, con propiedades biofísicas y farmacológicas muy similares a las del canal de linfocitos T, también se han identificado en glóbulos rojos, por ejemplo el canal de Gardos, en macrófagos, neutrófilos, linfocitos B, así como también en otros tejidos periféricos no inmunitarios. Grygorczyz. R., et al., Biophys. J., 45:693 (1984); Gallin, E. K., Am. J. Physiol., (Cell Physiol. 26) 257:C77-C-85 (1989); Karl-Heinz, et al., J. Clin. Invest., 85:491 (1990); Mahaut-Smith. M. P., et al., J. Physiol., 415:69 (1989). Sin embargo, hasta ahora se ha desconocido la identidad molecular de este tipo de canal. Se describe aquí la clonación y caracterización de un canal de KCa sensible a CTX, de conductancia intermedia, denominado hKCa4 (SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3), procedente de una librería de ADNc de ganglios linfáticos humanos. Se presenta la prueba convergente molecular, biofísica y farmacológica de que las nuevas secuencias presentadas aquí (por ejemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, y SEQ ID NO:7) corresponden al canal de KCa predominante en células T humanas.

En la Fig. 1 (SEQ ID NO:1) y en la Fig. 12 (SEQ ID NO:7) se exponen ADNc de longitud completa ejemplares, procedentes de ganglios linfáticos humanos, que comprenden la región codificante del nuevo polipéptido del canal de potasio activado por calcio descrito aquí. La región codificante estructural natural para el polipéptido objeto se expone en la Fig. 2 (SEQ ID NO:2). En la Fig. 3 (SEQ ID NO:3) se expone la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido natural del canal de potasio activado por calcio descrito aquí. La proteína traducida de SEQ ID NO:3 comprende 427 restos de aminoácidos Fig. 3, y parece tener 6 regiones transmembránicas, es decir, los restos 25-42, 64-79, 105-120, 150-174, 205-223, y 265-285, S1 hasta S6, respectivamente, reveladas por análisis de hidropatía Fig. 8. Además, el polipéptido de SEQ ID NO:3 presenta una región de poro del canal de potasio activado por calcio, es decir, restos 245-260 que contienen la secuencia de firma de consenso de los canales de potasio. Heigenbothams, L., et al., Biophys. J., 66(4):1061 (1994).

La secuencia de aminoácidos del nuevo canal de potasio activado por calcio (SEQ ID NO:3) es aproximadamente un 41% homólogo con los canales de potasio activados por calcio hSK1, rSK2 y rSK3) clonados a partir del cerebro. Kohler, M., et al., Science, 273:1709 (1996). La Fig. 4 muestra SEQ ID NO:4 que es la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido HSK1 derivado de cerebro, de pequeña conductancia, del canal de potasio activado por calcio. La Fig. 5 muestra SEQ ID NO:5 que es la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido RSK2 derivado del cerebro del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia. La Fig.6 muestra SEQ ID NO:6 que es la secuencia de restos de aminoácidos del polipéptido RSK3 derivado del cerebro del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia. La Fig. 7 muestra una comparación entre la secuencia de restos de aminoácidos del nuevo polipéptido humano derivado de ganglios linfáticos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí (SEQ ID NO:3) (denominado HKCA4), y las secuencias de restos de aminoácidos de los péptidos HSK1 (SEQ ID NO:4), RSK2 (SEQ ID NO:5), y RSK3 (SEQ ID NO:6) derivados del cerebro del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia. Se recuadran los restos de aminoácidos conservados. Las rayas discontinuas representan saltos introducidos para optimizar el alineamiento. Las secuencias mostradas en esta figura se produjeron usando el programa de alineamiento de múltiples secuencias de DNASTAR software (DNASTAR Inc, Madison WI).

La región de poro, entre los restos 245-260 de SEQ ID NO:3, muestra diferencias de aminoácidos significativas a partir de sus homólogos HSK1 (SEQ ID NO:4), RSK2 (SEQ ID NO:5) o RSK3 (SEQ ID NO:6), véase la Fig. 7, que predice diferente farmacología y biofísica de los canales de potasio activados por calcio derivados del cerebro. Kohler, M.. et al., Science, 273: 1709 (1996). También se ha identificado una variante de corte y empalme del gen objeto, como se discute más abajo en la región correspondiente a las regiones S2-S3 de SEQ ID NO:3.

De forma similar a la descripción previa por Grissmer, S., et al., en el que la expresión del canal de potasio activado por calcio sensible a caribdotoxina (CTX) aumenta drásticamente después de la activación de células T. J. Gen. Physiol, 102:601 (1993). El nuevo polipéptido derivado de ganglios linfáticos humano del canal de potasio activado por calcio descrito aquí (SEQ ID NO:3) muestra que tiene un nivel elevado de expresión, demostrado vía análisis de Northern Fig. 9, en células T activadas con relación a células T en descanso. La Fig. 9 muestra una fuerte señal de ARNm del nuevo canal de potasio activado por calcio derivado de ganglios linfáticos humano descrito aquí, con la activación de células T, en análisis de transferencia Northern.

La observación de la regulación al alza drástica del nuevo canal de potasio activado por calcio, con la activación de células T, proporciona signos de que este canal desempeña un papel crucial en sucesos de señalización de linfocitos. Además, la expresión elevada del canal de potasio activado por calcio en próstata, colon y placenta, sugiere igualmente un papel importante en la fisiología de estos tejidos. Los transcritos del nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí no se detectan en el cerebro. La expresión del canal objeto en células de las líneas mieloide, linfoide y eritroide indica que podrían presentar un papel importante en la modulación de respuestas inmunitarias, así como también en la fisiología de glóbulos rojos y de las plaquetas. En consecuencia, debido a los indicios de una señal de ARNm muy fuerte en células T activadas, y al hecho de que SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:7) se aisló como se describe más abajo a partir de una librería de ganglios linfáticos, que está enriquecida con células T activadas, parece que el polipéptido de la actual invención es una diana farmacológica ideal para modular la actividad de leucocitos humanos y otras células de origen hematopoyético, y de células T en particular.

Por lo tanto, es probable que los compuestos (por ejemplo, pequeñas moléculas, péptidos, análogos, miméticos), que modulan el canal de potasio activado por calcio derivado de ganglios linfáticos descrito aquí, se podrían usar en el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluyendo inflamación aguda y crónica, asma, alergias, rechazo de injertos, trastornos proliferativos, anemias, enfermedades neurodegenerativas con componentes inmunológicos, así como enfermedades autoinmunitarias incluyendo artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad de tejido conjuntivo mixta, y encefalomielitis alérgica experimental (EAE).

Se ha aislado, a partir de una librería de ganglios linfáticos humanos, una secuencia génica descrita aquí (por ejemplo, SEQ ID NO:7), que codifica un canal de potasio activado por calcio, de conductancia intermedia. La proteína traducida tiene una longitud de 427 aminoácidos, tiene 6 segmentos transmembránicos, S1-S6, y un motivo de poro entre S5 y S6. La nueva proteína (SEQ ID NO:3) comparte una similitud de 40-42% a nivel de aminoácidos con tres canales de potasio activados por calcio de pequeña conductancia, clonados a partir del cerebro. La SEQ ID NO:7 representa cartográficamente el cromosoma humano 19q 13.1-13.2. El análisis de transferencia Northern de linfocitos T humanos primarios revela un transcrito de 2.2 Kb que está muy regulado al alza en células activadas en comparación con células en descanso, concomitante con un incremento en las corrientes de KCa. Los transcritos del nuevo gen presentado aquí se detectan mediante PCR y mediante transferencias Northerns en placenta, próstata, timo, bazo, colon y en muchas estirpes celulares de origen hematopoyético. Los registros de pinzamiento zonal de células HEK 293 transfectadas con SEQ ID NO:2 revelan una gran corriente de potasio de rectificación hacia el interior, independiente del voltaje, con una única conductancia de canal de 33 \pm 2 pS en disoluciones de potasio simétricas. El canal se activa mediante calcio intracelular (Kd = 270 \pm 8 nM), con interacción altamente cooperante de \sim3 iones de calcio por canal. Las corrientes de hKCa4 se bloquean mediante tetraetilamonio aplicado externamente (Kd = 30 \pm 6 mM), caribdotoxina (Kd = 10 \pm 1 nM) y clotrimazol (Kd = 380 \pm 34 nM), pero son resistentes a apamina, iberiotoxina, kaliotoxina y escilatoxina (Kd >1 \muM). Estas propiedades del canal clonado son muy similares a las dadas a conocer para el canal de KCa en linfocitos T humanos activados (Grissmer et al, J. Gen. Physiol. 102: 601. 1993), secuencias descritas aquí (por ejemplo, SEQ ID NO:7; SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:2; y SEQ ID NO:3) son realizaciones ejemplares que codifican este tipo de canal natural.

Se ha identificado un clon de ADNc de 2,2 Kb descrito aquí (por ejemplo, SEQ ID NO: 7) a partir de una librería lambda de ganglios linfáticos humanos usando una sonda derivada de una secuencia de EST que se identificó a partir de una búsqueda en base de datos de nuevos canales de potasio. El clon tiene 400 pb de 5' UTR, 1,3 Kb de región codificante y 540 pb de 3' UTR (fig. 17A). Todo el transcrito se cartografió para la banda de 2,2 Kb predominante observada en transferencia Northern a partir de diversos tejidos (véase fig. 18). Se identificaron cuatro clones lambda independientes, que comenzaron con la misma secuencia de 5' UTR (\pm 15 pb), y la 3' UTR terminó con una señal de poliadenilación seguida de una cola de poli-A. También se detectó un codón de parada dentro del marco, en dirección 5' del ATG iniciador en los 4 clones, excluyendo la existencia de iniciadores ATG alternativos en dirección 5'. El nuevo gen (por ejemplo, SEQ ID NO:2) se cartografió al cromosoma 19q13.1-13.2. La proteína producida comprende 427 aminoácidos. Las gráficas de hidropatía revelan un término N intracelular corto, seguido de 6 segmentos transmembránicos (S1-S6), y un término C intracelular largo (Fig. 17 B). El bucle entre S5 y S6 contiene la secuencia GYG altamente conservada, característica de todos los poros de los canales de potasio clonados (10). La proteína del canal (SEQ ID NO:3) tiene un sitio de glicosilación enlazado a N de consenso, entre S5 y el poro, y varios sitios para la fosforilación de serina-treonina. No hay en SEQ ID NO:3, un motivo de mano E-F de consenso. Una comparación de la secuencia de aminoácidos de hKCa4 con otros miembros representativos de la superfamilia de canales de K^{+} revela que es más similar a los canales de KCa de pequeña conductancia (hSK1, rSK2, rSK3; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) clonados recientemente a partir del cerebro, aunque comparte sólo un 40-42% de identidad de aminoácidos con ellos, garantizando la colocación dentro de una subfamilia distinta (fig. 15 C).

El nuevo gen descrito aquí (por ejemplo, SEQ ID NO:2) se cartografía al cromosoma humano 19q13.1-13.2. Esta región del cromosoma 19 tiene varios lugares de susceptibilidad a enfermedades, incluyendo linfoma de células B y el síndrome de Diamond-BlackFan. Las anormalidades del gen descrito aquí pueden estar asociadas con cualquier trastorno que se corresponda a este área general, incluyendo trastornos que están siendo actualmente cartografiados como parte del proyecto de genoma humano.

El análisis de transferencia Northern revela una fuerte señal a \sim2,2 Kb en linfocitos T humanos activados, en la placenta, próstata, y colon (fig. 16A y B). Se observó una señal moderada en el bazo, en el timo y en leucocitos de sangre periférica (fig. 16A); no hubo ninguna señal detectable en el cerebro. También se observaron en algunos tejidos transcritos minoritarios de tamaños más grandes (fig. 16A).

El nuevo gen descrito aquí (SEQ ID NO:2), cuando se cotransfectó con un gen informador para GFP en células HEK 293, produjo una corriente de K^{+} dependiente de calcio, con una fuerte rectificación hacia el interior en disoluciones de K^{+} simétricas, con la perfusión de 1 \muM de ionomicina (Fig. 13A). La corriente inducida por ionomicina se bloqueó completamente mediante 100 nM de CTX, pero se vio inafectada (es decir, <10% de cambio en amplitud) mediante 1 \muM de apamina (n = 2). La diálisis interna con una disolución que contiene 1 \muM de [Ca^{2+}]_{libre} también activó una gran corriente estable (15,4 \pm 2,4 nS pendiente de conductancia entre -100 y -30 mV; n = 11), con características similares. La evaluación farmacológica (Fig. 13B) reveló que esta corriente estaba potencialmente inhibida por CTX (K_{d} = 10 \pm 1 nM), y también estaba bloqueada por TEA (K_{d} = 30 \pm 7 mM) y por clotrimazol (K_{d} = 387 \pm 34 nM), pero era insensible a apamina, iberiotoxina, y kaliotoxina, y escilatoxina (Kd > 1 \muM, n=3 para cada experimento). La corriente del control durante las rampas en 160 mM de K^{+} simétrica convergió con la corriente provocada durante la perfusión de CTX próxima a 0 mV (por ejemplo, Fig. 13A), apoyando la selectividad de K^{+} del canal. La selectividad de K^{+} se evaluó adicionalmente examinando los potenciales inversos de las corrientes de control frente a CTX, a lo largo de un intervalo de concentraciones de K^{+}_{(salida)} diferentes (Fig. 13C). El potencial inverso se desplazó -57 mV por un incremento de e veces en K^{+}_{(salida)}, en estrecha relación con el valor de Nernstian predicho para un canal selectivo de K^{+}. Las células de HEK 293 sin transfectar, o las células transfectadas con GFP sola, mostró corrientes pequeñas en respuesta a rampas de voltaje durante la diálisis con 1 \muM Ca^{2+}_{(libre)} (conductancia < 0.1 nS: n = 8), y estas corrientes no se vieron afectadas de forma medible por 100 nM de CTX. Los registros unidos a células revelaron aperturas de canales individuales durante la perfusión con disolución de Ringer que contiene 1 \muM de ionomicina. Los canales mostraron una conductancia unitaria (medida durante rampas de voltaje entre -120 y -30 mV de 33 + 2 pS
(n = 3; Fig. 14A) con pipetas que contienen 160 mM de K^{+}, y 9 \pm 1 pS con pipetas que contienen 4,5 mM de K^{+}. Los potenciales de pipeta entre -100 y +20 mV no tuvieron ningún efecto aparente sobre la probabilidad de las aberturas de los canales (P_{o}) durante las rampas (por ejemplo, Fig. 16A) o etapas. La configuración de interior-exterior, en K^{+} simétrica, también reveló canales individuales de conductancia similar con una puerta que dependió claramente de la [Ca^{2+}]_{libre} en la cara citoplásmica del parche (Fig. 14B). La P_{o} con diferente [Ca^{2+}]_{libre} varió considerablemente entre las células, pero nunca superó \sim0,5. El ajuste de la curva de probabilidad abierta frente a [Ca^{2+}]_{libre} reveló una activación K_{d} = 270 \pm 8 nM de Ca^{2+} con un coeficiente de Hill de 2,7 \pm 0,2, indicativo de una interacción muy cooperativa entre iones de calcio y el canal (Fig. 14C).

Los signos demostrados aquí de que el nuevo gen (por ejemplo, SEQ ID NO:2) codifica el canal de potasio activado por calcio, en linfocitos T, se resumen según lo siguiente: (a) el clon se identificó a partir de una librería de ganglios linfáticos que está enriquecida en células T activadas, (b) el análisis de transferencia Northern de células T en reposo y activadas revela una regulación al alza de \sim10 veces de los niveles del transcrito, correspondiente a un incremento en los niveles de corriente (Fig. 16B), (c) las propiedades biofísicas y farmacológicas de las corrientes son muy similares a las dadas para células T (Grissmer, S., et al., 102:601 (1993); Verheugen, J. A. H., et al., Cell Calcium 21:1 (1997)), incluyendo la rectificación hacia el interior en una disolución K muy concentrada, el bloqueo por CTX y TEA, la conductancia del canal individual, y Kd para la dependencia del calcio (Fig. 14D). Además, la SEQ ID NO:2 posiblemente pueda codificar los canales de KCa encontrados en otras células de origen hematopoyético, incluyendo eritrocitos, monocitos, células B, neutrófilos y eosinófilos. Las propiedades electrofisiológicas dadas a conocer del canal, a partir de estas células, son compatibles con los datos presentados aquí, por ejemplo SEQ ID NO:2 expresado heterogéneamente en células HEK 293. Además, se amplificó una banda de 1 Kb usando cebadores específicos de SEQ ID NO:7, por ejemplo, y se confirmó su secuencia a partir de muchas estirpes celulares de origen hematopoyético (por ejemplo, U937, HL-60, hepatocitos fetales, Jurkats). Los cambios sutiles en las propiedades dadas a conocer son atribuibles a diferencias en modificaciones post-traduccionales y/o en asociación con subunidades accesorias en diferentes tipos celulares.

La regulación significativa al alza de los nuevos niveles del transcrito durante la activación de las células T subraya la importancia de estos canales en la activación temprana y en la post-activación de respuestas inmunes. El acoplamiento del receptor de células T por mitógeno o antígeno provoca un incremento en las concentraciones de calcio intracelular, conduciendo a las hiperpolarizaciones de la membrana (en lugar de la despolarización), provocadas por la apertura de los canales de KCa. Este suceso, a su vez, maximiza la fuerza accionadora eléctrica para el influjo de calcio a través de canales activados de liberación de calcio, facilitando las oscilaciones de calcio sostenidas requeridas para la proliferación celular, para la producción de citoquinas y la expresión de la función inmune. Se ha dado a conocer que el bloqueo de los canales tanto de KCa como de Kv provoca una inhibición profunda de la proliferación de células T (Rader, R. K., et al., J. Immunol. 156:1425 (1996)) mientras que el bloqueo de los canales de KCa es suficiente para evitar respuestas inmunitarias secundarias (Verheugen, J. A. H., et al., Cell Calcium, 21: 1 (1997)).

El transcrito de la subunidad del canal de potasio activado por calcio (SEQ ID NO:3) (hKCa4) está presente en microgliocitos

Los microgliocitos son macrófagos residentes en el cerebro que desempeñan papeles vitales en respuestas neuroinflamatorias y en enfermedades neurodegenerativas (Wood, P.L., Role of CNS macrophages in neurodegenerarion in Neuroinflammation: mechanism and management, editado por PL Wood, Human Press Inc., Totowa, NJ). En vista de SEQ ID NO:2 expresada en varias células de origen hematopoyético, incluyendo monocitos y macrófagos, se cuestionó si podría estar presente en microgliocitos. Se obtuvo una banda predicha de 800 pb a partir de ADNc de microgliocitos, y se confirmó la secuencia, indicando la presencia de un transcrito en microgliocitos cerebrales. Véase Ejemplo XIX.

La calmodulina es un compañero de interacción para la nueva subunidad del canal de potasio activado por calcio (hKCa4), y es posiblemente el sensor de calcio

Los canales de potasio activados por calcio, de pequeña conductancia y de conductancia intermedia, KCa2, KCa3, KCa4, pertenecen a una subfamilia distinta de canales de K^{+} que desempeñan papeles cruciales en la hiperpolarización de células excitables y no excitables. A pesar de su exquisita sensibilidad al calcio, la región codificante proteínica de estos canales no contiene ningún bowl de calcio de consenso o motivos de mano de EF. Para investigar si una proteína accesoria está implicada en la sensibilización al calcio, se usó la cola de C de 146 aminoácidos de hKCa4 como un cebo para identificar sistemáticamente una librería de células T activadas en un sistema de dos híbridos de levadura (explicado más abajo). Varios de los clones positivos codificaron calmodulina. Véase, Vogel. H.: The Merck Frosst Award Lecture 1994, Calmodulin: a versatile calcium mediator protein., Biochem Cell Biol., 72(9-10):357 (1994).

Los experimentos de derribo de fusión con GST han confirmado la interacción, y el análisis de supresión ha identificado los primeros 97 aminoácidos en la cola de C de hKCa4 que se requieren para la unión a calmodulina (Fig. 21). Esta región está muy conservada entre todos los canales de SKCa, y parece que contiene aminoácidos hidrófobos y positivamente cargados representativos de dominios de unión a calmodulina. La interacción de calmodulina con la cola de C no parece requerir calcio, y sugiere que la calmodulina podría estar preunida al canal sobre la membrana. Las corrientes del canal de potasio activado por calcio de SEQ ID NO:3 (hKCa4), en células HEK 293, están inhibidas (50-60% a 10 \muM) por el antagonista de calmodulina W7. Tomados juntos, los datos señalan el hecho de que la calmodulina puede servir posiblemente como el sensor de calcio para esta clase de canales.

Realizaciones

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NO:2) y de aminoácidos (SEQ ID NO:3) de un nuevo canal de potasio humano, derivado de ganglios linfáticos, activado por calcio, y sus variaciones, y al uso de estas secuencias para identificar compuestos que modulan la actividad de leucocitos humanos, como se describe más abajo.

La invención se refiere además al uso del nuevo canal de potasio activado por calcio en sistemas de expresión como ensayos para agonistas o antagonistas de los canales de potasio activados por calcio. La invención también se refiere al diagnóstico, estudio, prevención y tratamiento de la enfermedad relacionada con leucocitos disfuncionales.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican el canal de potasio leucocítico humano, activado por potasio, SEQ ID NO:3, o un derivado funcionalmente equivalente del mismo, se pueden usar según la presente invención, que comprende supresiones, inserciones y/o sustituciones de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:2. Las variantes biológicamente activas y/o farmacológicamente activas de la subunidad del canal de potasio activado por calcio de la presente invención también pueden comprender supresiones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos de SEQ ID NO:3. Una realización particularmente preferida de la presente invención es un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia sustancialmente como se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Las sustituciones de aminoácidos de SEQ ID NO:3 se pueden realizar, por ejemplo, en base a la similitud de la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o la naturaleza anfipática de los restos, en tanto que se retenga la actividad biológica del canal de potasio activado por calcio. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos cabeza polares no cargados, que tienen valores de hidrofilia similares, incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos del canal de potasio activado por calcio descrito aquí son una suma exponencial debido a la sustitución potencial de codones degenerados (codones diferentes que codifican el mismo aminoácido). La secuencia oligonucleotídica seleccionada para la expresión heteróloga está personalizada por lo tanto de forma preferible para satisfacer el reconocimiento del codón de ARNt característico más habitual del sistema de expresión de hospedante particular usado, como es bien conocido por los expertos en la técnica.

Las sustituciones conservativas adecuadas de los aminoácidos son conocidas por los expertos en esta técnica, y se pueden realizar sin alterar la actividad biológica del polipéptido resultante, independientemente del método de síntesis escogido. La frase "sustitución conservativa" incluye el uso de un resto químicamente derivatizado, en lugar de un resto no derivatizado, con la condición de que tal polipéptido presente la actividad de unión deseada. Los isómeros D también pueden sustituir a los aminoácidos de origen natural. Las sustituciones se realizan preferiblemente, aunque no exclusivamente, según aquellas expuestas en la Tabla 1, según lo siguiente:

TABLA 1

1

Las secuencias nucleotídicas de la presente invención también se pueden manipular mediante ingeniería a fin de alterar una secuencia codificante por una variedad de razones, incluyendo pero sin limitarse a alteraciones que modifiquen la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones usando técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar patrones de glucosilación, para cambiar la preferencia del
codón, etc.

Se contemplan aquí realizaciones de mutantes negativos dominantes de la subunidad del canal (véase, Fig. 15 para realizaciones de cambio de sitio (los sitios para la glicosilación se indican mediante un triángulo; los sitios de fosforilación de serina-treonina están encerrados en círculos) (por ejemplo, cambio a D o R), cualquiera de los cambios en la región del poro son realizaciones preferidas como mutantes negativos cominantes), como agentes farmacológicamente valiosos a fin de atenuar la actividad biológica del canal correspondiente in vivo.

Se pueden usar versiones generalmente mutadas, o realizaciones de especies de mutagénesis dirigida al sitio de la región del poro de SEQ ID NO:2, por ejemplo, para producir canales de potasio no funcionales, activados por calcio, para que se sobreexpresen subsiguientemente en células heterólogas, preferiblemente aquellas de origen hematopoyético, para anular canales endógenos mediante supresión negativa dominante del canal. Ribera, A.B., J. Neurosci., 16:1123, (1996); Babila, T., et al., Neuron, 12:615 (1994).

Se incluyen dentro del alcance de la presente invención los alelos del gen del canal de potasio activado por calcio de la presente invención. Como se usa aquí, una secuencia de alelos o alélica es una forma alternativa de la subunidad aquí. Los alelos resultan de mutaciones de ácidos nucleicos y de variantes de corte y empalme de ARNm o de transcritos más largos que comprenden SEQ ID NO:2 que producen polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada.

Las realizaciones particularmente preferidas de la presente invención son células hospedantes transformadas con un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia sustancialmente según se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento biológicamente activo del mismo. Se pueden usar células de este tipo, o preparaciones obtenidas a partir de ellas, para identificar sistemáticamente moduladores farmacológicamente activos de la actividad del nuevo canal de potasio activado por calcio, usando métodos que son bien conocidos en la técnica. Patente U.S. nº 5.397.702, Assay For and Treatment of Autoimmune Diseases, expedida el 14 de marzo de 1995; patente U.S. nº 5.637.470, Screening array using cells expressing recombinant alpha and beta subunits of the mammalian large-conductance (maxi-K) potassium channel, expedida el 10 de junio de 1997; patente U.S. nº 5.607.843, Nucleic Acid Sequence Encoding Apamin Binding Protein, expedida el 4 de marzo de 1997; y patente U.S. nº 5.602.169, 3-substituted oxindole derivatives as potassium channel modulators, expedida el 11 de febrero de 1997.

Tales moduladores son potencialmente útiles para tratar la enfermedad que se manifiesta mediante leucocitos disfuncionales, incluyendo pero sin limitarse a inflamación aguda y crónica, asma, alergias, rechazo de injertos, trastornos proliferativos, anemias, enfermedades neurodegenerativas con componentes inmunológicos, así como enfermedades autoinmunitarias que incluyen artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta de tejidos conjuntivos, y encefalomielitis alérgica experimental (EAE).

Como se usa aquí, un "derivado funcional" del canal de potasio activado por calcio descrito aquí es un compuesto que posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a SEQ ID NO:3. La expresión "derivados funcionales" pretende incluir los "fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos", y "derivados químicos". El término "variante" quiere decir una molécula sustancialmente similar en estructura y en función a cualquier molécula completa del canal de potasio activado por calcio, o a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente similar" al polipéptido del canal de potasio activado por calcio si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares, o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. El término "análogo" se refiere a una molécula sustancialmente similar en función a cualquier polipéptido entero del canal de potasio activado por calcio, o a un fragmento del mismo.

El ADN del canal de potasio activado por calcio clonado, obtenido mediante los métodos descritos aquí, se puede expresar de forma recombinante mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados, y se puede transferir en células hospedantes procariotas o eucariotas para producir el polipéptido del canal de potasio activado por calcio. Las técnicas para tales manipulaciones se describen completamente en Sambrook. J., et al.. Molecular Cloning Segunda Edición, 1990, Cold Spring Harbor Press, y son bien conocidas en la técnica.

Los vectores de expresión se definen aquí como secuencias de ADN que son requeridas para la transcripción de copias clonadas de genes, y para la traducción de sus ARNm en una célula hospedante apropiada. Tales vectores se pueden usar para expresar secuencias de ácidos nucleicos en una variedad de hospedantes, tales como bacterias, algas verdiazules, células vegetales, células de insectos, células fúngicas, células de seres humanos y de animales. Los vectores especialmente diseñados permiten el traslado de ADN entre hospedantes, tales como bacterias-levaduras, o bacterias-células animales, o bacterias-células fúngicas, o bacterias-células de invertebrados.

Síntesis in vitro de ARNm protegido en los extremos

El ADNc de longitud completa (SEQ ID NO:1) se puede usar en procedimientos estándares para sintetizar ARNm biológicamente activo para la expresión funcional en células heterólogas, en oocitos de Xenopus, por ejemplo, o en diversos tipos de células de mamíferos. Véase, por ejemplo, Goldin A, Methods Enzymol. 207:279 (1992).

La región codificante para el nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí (por ejemplo, una región que comprende SEQ ID NO:2), que codifica el polipéptido que tiene una secuencia bioactiva sustancialmente como se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento biológicamente activo del mismo, se puede clonar en 3', por ejemplo, a un promotor bacteriófago, por ejemplo, un promotor SP6, T7 o T3. Los vectores PGEM de Promega, Madison, WI, son ejemplos de vectores preferidos que se pueden usar con la presente invención. Se prefieren especialmente los vectores estándares conocidos en la técnica, tales como pSP64T o pBSTA, que potencian la estabilidad del mensaje e incrementan la expresión específica en oocitos de Xenopus. Kreig y Melton, Nucleic Acids Res., 12:7057 (1984). Estos vectores preferidos particulares contienen regiones de ARNm sin traducir en 5' y 3' de beta-globina de Xenopus, que flanquean el extremo 5' y una cola de poli-A en el extremo 3' del gen.

Seguidamente, se puede cortar, con una enzima de restricción, un constructo de ADN en vector plasmídico que contiene un inserto que codifica el nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí, o una fragmento biológicamente activo del mismo (por ejemplo, una región SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:7 que comprende SEQ ID NO:2, o una versión truncada de la misma), para linealizar el constructo 3' a la región codificante estructural. El vector linealizado se debe de extraer con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico, se debe de precipitar con etanol y se debe de resuspender en agua libre de ARNasa, para uso como un molde para la transcripción. La reacción de transcripción, por ejemplo, se puede llevar a cabo como se describe más abajo, para sintetizar ARNm biológicamente activo para la traducción in vivo o in vitro mediante métodos que son bien conocids en la técnica. Se prefiere especialmente el kit mMessage mMachine™, AMBION, Austin, TX, para sintetizar ARNm biológicamente activo. Como alternativa, los transcritos de ARNm se pueden usar como sondas para el análisis de la distribución de tejidos mediante análisis Northern y/o para ensayos de protección de ARNasa.

Síntesis de ARNm

PGEM, Promega, Madison, WI
10x SP6/T7 tampón	5 ul
10X ATP, CTP, UTP (5 mM cada uno)	5 ul
10x GTP (5 mM)	1 ul
10x GpppG (Cap; 5 mM)	5 ul
DTT (1 M)	0,5 ul
Inhibidor de ARNasa (40U/ul)	1,25 ul
Agua	27 ul
AND linealizado (1 ug/ul)	1-5 ul
SP6 o T7 ARN polimerasa (20U/ul)	1-3 ul
Volumen total de la reacción	50 ul

\vskip1.000000\baselineskip

Incúbese a 37 grados durante 1-2 horas. Añádase 1 ul de ADNasa libre de ARNasa, para degradar el ADN molde. Digiérase durante 10 minutos. Añádase 75 ul de agua. Extráigase con fenol/CHCl3. Precipítese el ADN con etanol. Almacénese en alícuotas a -70 grados.

Expresión funcional

El ARNm biológicamente activo se puede introducir en células heterólogas para la expresión y análisis funcionales, mediante métodos bien conocidos en la técnica. El ARNm sintético procedente de los constructos ejemplares más arriba, por ejemplo, se puede inyectar en oocitos de Xenopus para la expresión y análisis funcionales. Goldin, A., Methods Enzyml.,207:266, (1992). Los canales de potasio activados por calcio heterólogos se pueden examinar usando técnicas estándares de pinzamiento con voltaje de dos electrodos. Véase, por ejemplo, Stuhmer, W., Methods in Enzymol., 207:319, (1992); Kohler, et al., Science, 273:1709 (1996). Las concentraciones de calcio en el interior de la célula se puede alterar, por ejemplo, añadiendo ionomicina, un ionóforo de calcio, una coexpresión con una proteína G acoplada a receptor, que provoca una elevación del calcio intracelular. Las concentraciones de calcio se pueden alterar alternativamente empujando dentro-fuera parches, y cambiando las concentraciones de calcio en el medio del baño. Grissmer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol, 102:601 (1993). También se estudiaron parámetros biofísicos estándares, tales como la activación, la dependencia del calcio, la conductancia de un solo canal, la inactivación, las corrientes de cola, la selectividad por el potasio, y la farmacología concienzuda de diversos bloqueadores de los canales de K, incluyendo TEA, caribdotoxina, apamina, y otros. Grissmer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol, 102:601 (1993).

Como alternativa, se puede introducir ARNc (ARNm sintético procedente de un constructo de ADNc) en células heterólogas de mamíferos, por ejemplo, las células RBL (ATCC # CRL 1378), y células 293 (ATCC # CRL 1573) se pueden transformar usando métodos estándares en la técnica. Por ejemplo, se puede usar el sistema de microinyección de Eppendorf (Micromanipulator 5171 y Transjector 5242). Las células transformadas se pueden analizar para determinar las corrientes de K activadas por calcio, alrededor de 4 horas más tarde, usando las técnicas de pinzamiento zonal que están bien documentadas. Por ejemplo, Ikeda, et al., Pfueg. Arch. Eur. J. Physiol., 422:201 (1992); Grissmer, et al., J. Gen. Physiol., 102:601 (1993).

Sobreexpresión del nuevo canal en estirpes celulares

Se contemplan células transfectantes eucariotas transitorias y/o estables, que comprenden la región o regiones codificantes descritas aquí, para la expresión en gran cantidad del nuevo canal de potasio activado por calcio.

Los transfectantes eucariotas son realizaciones preferidas de la presente invención para el empleo en estudios de unión a dianas farmacológicas para la identificación de moléculas que bloquean el nuevo canal descrito aquí in vivo. Se prefieren particularmente células HEK.

La expresión transitoria de regiones codificantes para el nuevo canal se puede lograr mediante la transfección directa en células de mamíferos, mediante técnicas estándares. Omari, K. et al., J. Physiol., 499:369, (1997); Panyi, G. et al., J. Gen. Physiol., 107(3):409 (1996). La expresión transitoria en gran cantidad se puede lograr usando sistemas víricos estándares, por ejemplo, baculovirus, adenovirus, o virus de la vacuna. El número de canales que resulta de estos sistemas es típicamente de 5-500K por célula. Kamb, A., Methods Enzymol. 207:423 (1992); Sun, T. et al., Biochemistry, 33(33):9992 (1994); Spencer, R.H., et al., J. Biol. Chem., 272:2389 (1997). Véase, Ejemplo XV, sistema de expresión de Baculovirus para hKCa4 (SEQ ID NO:2).

La transfección estable de células heterólogas usando secuencias que codifican el nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí (SEQ ID NO:3), o variaciones biológicamente activas o fragmentos de los mismos, se pueden generar usando, por ejemplo, células NIH-3t3, L929, COS, HEK, o CHO. Véase, por ejemplo, EMBO, 11 (6):2033 (1992), Grissmer, et al., Mol. Pharm., 45:1227 (1994).

Un vector preferido para uso con la presente invención es pcDNA/Neo, que está comercialmente disponible de INVITROGEN, Carlsbad, CA.

Las células, por ejemplo NIH-3t3, se hacen crecer hasta una confluencia del 50% en placas de 60 mm (los medios y las condiciones están de acuerdo con los requisitos de la estirpe celular particular), y se transfectan con 5 ug de ADN puro que comprende una región codificante del nuevo canal de potasio activado por calcio, por ejemplo SEQ ID NO:2, en pCDNA/Neo, usando el reactivo de lipofección, como se describe por el proveedor (LIFE TECHNOLOGIES Gibco BRL, Bethesda, MD). Después de la transfección, las células se incuban a 37ºC, condiciones para 3 días en medio con 10% de FCS. Las células se siembran tripsinizadas en cápsulas de 100 mm, y después se seleccionan con 300 ug/ml de G418 (neomicina). Sólo las células que tienen una integración estable de la región codificante heteróloga crecerán en presencia de G418, que se confiere mediante el gen de resistencia a neomicina en el plásmido. Los clones aislados se procesan durante 2-3 etapas de purificación, y se someten a análisis de pinzamiento zonal para determinar las corrientes de KCa.

Para expresar en células de mamíferos el polipéptido recombinante del canal de potasio activado por calcio descrito aquí, se puede usar una variedad de vectores de expresión de mamíferos. Los vectores de expresión de mamíferos comercialmente disponibles, que son adecuados para la expresión recombinante, incluyen pero no se limitan a pcDNA3 (Invitrogen), pMC I neo (Stratagene), pXT 1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVept (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y IZD35 (ATCC 37565).

Para expresar en células de insectos el polipéptido recombinante del canal de potasio activado por calcio, junto con la subunidad alfa, se puede usar una variedad de vectores de expresión de células de insectos. Los vectores de expresión de células de insectos comercialmente disponibles, que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de la subunidad beta, incluyen, pero no se limitan a, pBlue Bac III (INVITROGEN).

Se prefieren especialmente las células hospedantes recombinantes eucariotas. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a levadura, células de mamíferos que incluyen, pero no se limitan a, estirpes celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono, y de roedor, y células de insectos que incluyen, pero no se limitan a, estirpes celulares derivadas de Drosophila y del gusano de la seda. Las estirpes celulares derivadas de especies de mamíferos, que pueden ser adecuadas y que están comercialmente disponibles, incluyen, pero no se limitan a, células L como L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L como L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).

El canal de potasio activado por calcio también se puede expresar como una proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales, añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano, que permiten la purificación sobre metales inmovilizados (Porath, J., Protein Expr Purif., 3:263 (1992)), dominios de la proteína A, que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio usado en el sistema de purificación mediante extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). Para facilitar la purificación, es útil incluir secuencias ligadoras escindibles, tales como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA), entre el dominio de purificación y TMP.

Proteínas de fusión a glutationa-S-transferasa (GST), traducción in vitro de calmodulina, y unión de calmodulina a proteína de fusión a GST

Los plásmidos de fusión a GST se basaron en PGEX-6P-1 (Pharmacia, Piscataway, NJ), y se construyeron por medios convencionales, usando PCR estándar con un cebador para el C-terminal de la secuencia de KCa4 con el sitio de restricción apropiado, sitio EcoRI y el sitio XhoI en este caso. Las posiciones 1252-1272 de SEQ ID NO: 1 es el oligonucleótido sentido, y las posiciones 1660-1680 de SEQ ID NO: I es el oligonucleótido antisentido para el contructo de GST C-terminal de hKCa4 de longitud completa. Después de la transfección en BL21 de Escherichia coli, se indujo la síntesis de las proteínas de fusión con 0,2 mM de isopropil-b-D-tiogalactósido (IPTG) en un cultivo líquido, hechas crecer hasta una OD de 1,0. Después de 2-3 h a 37ºC, las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en tampón de lisis NETN (0,5% de Nonidet P-40/1 mM de EDTA/20 mM de Tris-HCl, pH 8,0/100 mM de NaCl; 1,0 ml por 20 ml de cultivo), y se lisaron por ultrasonidos. El lisado se aclaró por centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4ºC. Las proteínas de fusión a GST en el sobrenadante se adsorbieron, durante 30 min a temperatura ambiente, a perlas de glutationa-agarosa en NETN [1 volumen de lisado: 1 volumen de 50% (vol./vol.) de suspension de perlas de agarosa-GSH (Pharmacia) en NETN]. El último lavado fue con el tampón de unión [1% (vol./vol.) de polioxietilen 9 lauril éter/2 mM de EDTA/100 mM de NaCl/20 mM de Tris-HCl, pH 8,01, en lugar de NETN]. Las suspensiones [50% (vol./vol.)] de perlas de agarosa-GSH lavadas, con las proteínas de fusión a GST adsorbidas sobre ellas (agarosa-GSH:fusiones de GST), se incubaron entonces durante 30 minutos a temperatura ambiente en un volumen igual de tampón de unión con calmodulina marcada con ^{35}S, se sintetizaron mediante transcripción-traducción acoplada (Cat#L4610, Promega, Madison, WI), como se describe (Pragnell, et al., Nature, 368:67 (1994). Después de una dilución de 50 veces en tampón de unión, las perlas se centrifugaron y se lavaron tres veces con tampón de unión, y se resuspendieron en un volumen igual de 4x tampón de muestra de Laemmli. Las proteínas liberadas de las perlas se analizaron mediante 12% de SDS/PAGE, seguido de autorradiografía, para detectar la retención de camodulina mediante los fragmentos fusionados a GST. Se usó luciferasa traducida in vivo para ensayar la especificidad en la interacción de calmodulina con los fragmentos C-terminales de KCa4.

Expresión estable en células de mamíferos de hkca4 para el desarrollo de un ensayo

La expresión heteróloga de canales clonados es un prerrequisito para el desarrollo del ensayo, ensayos de unión particularmente preferidos que requieren una densidad elevada de canales puros. La primera etapa hacia el desarrollo del ensayo para la nueva subunidad del canal (hKCa4) (SEQ ID NO:3) fue por lo tanto la generación de un sistema de expresión de alto nivel. Se desarrolló en células HEK 293 un transfectante estable del nuevo gen descrito aquí.

Se subclonó SEQ ID NO:2 en vectores de expresión de células de mamíferos para generar líneas tanto establemente integradas como episómicamente replicantes. Para líneas estables, se usó el constructo (pGEN IRES-neo) y el constructo pcDNA3 (descritos en JBC. 272 (52): 32723). El vector pGEN IRES-neo se obtuvo escindiendo un fragmento de SmaI/ScaI de 1,3 kb que contiene la región codificante (SEQ ID NO:2) del canal de potasio activado por calcio. Este fragmento se subclonó en el vector en el sitio SmaI. Esta estrategia de clonación da como resultado un constructo que usa el auténtico iniciador metionina.

Para las líneas episómicas, se subclonó primero SEQ ID NO:2 en pFastBac 1 procedente del constructo pcDNA3, usando una estrategia que elimina los tres aminoácidos de fusión en dirección 5'. Se escindió un fragmento NcoI de 1101 pb a partir del constructo pcDNA3, y se clonó en el sitio NcoI de pBlueBac III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se identificó una colonia cuya orientación contenía el sitio BamHI procedente de la región de clonación múltiple de pBlueBac III en el extremo 5' del fragmento de ADNc (hKCa4). El extremo 5' del ADNc se escindió entonces a partir de pBlueBac III usando BamHI (5') y EcoRV (interno a hKCa4). El extremo 3' del gen se proporcionó escindiendo el constructo pcDNA3 con EcoRV y XhoI (3'). La región codificante reconstruida se clonó en los sitios BamHI (5') y XhoI (3') del vector pFastBac 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Esta estrategia de clonación eliminó el MGA N-terminal creado clonando en pcDNA3. La región codificante de la subunidad del canal de potasio activado por calcio se escindió entonces a partir de este constructo pFastBac 1, usando KpnI (5') y NotI (3'), y se clonó en los sitios KpnI y NotI de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Se cultivaron células HEK293 en medio DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, 100 unidades por ml de penicilina y 100 \mug, por ml, de estreptomicina. Las células CHO-K1 se cultivaron en medio F12 de Ham que contiene 10% de suero fetal bovino. Las transfecciones en células HEK293 se lograron usando el kit de transfección de mamíferos LipoTAXI (cat # 204110) de Stratagene (La Jolla, CA), y, separadamente, un protocolo de transfección con fosfato de calcio modificado (véase el Ejemplo XIII). Las transfecciones con LipoTAXI se realizaron según el protocolo, con las siguientes notas: se mezcló 1 ml de DMEM libre de suero con 70 \mul de reactivo de transfección, y se añadieron 15 \mug de (pGEN IRES-neo) o de constructo de pcDNA3 - hKCa4. Se dejaron formar los complejos de ADN/lípido durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con los complejos de ADN/lípido durante cuatro horas a 37ºC, 5% de CO_{2}. Se añadieron diez ml de DMEM que contiene 20% de suero fetal bovino (FBS), y las células se hicieron crecer toda la noche. Las transfecciones con fosfato de calcio siguieron el protocolo adjunto (Ejemplo XIII). Se generaron líneas episómicas en células HEK293 usando el constructo de pCEP4/SEQ ID NO:2 y el método con fosfato de calcio modificado, según el protocolo (Ejemplo XIII).

Las transfecciones en células CHO-K1 se lograron usando el reactivo Cellfectin de Life Technologies, Gaithersburg, MD, (cat # 10362-010), según el Ejemplo XIV.

Para todas las líneas, se eliminaron los medios y se sustituyeron por uno reciente la mañana después de la transfección. Cuarenta y ocho horas más tarde (es decir, tres días después de la transfección), las células se dividieron según lo siguiente: líneas estables HEK293, 1:10; líneas episómicas HEK293, 1:4; líneas estables CHO-K1, 1:4. Veinticuatro horas después de la división (es decir, cuatro días después de la transfección), las líneas estables se sometieron a medio que contiene 1 mg/ml de sulfato de G418 (MediaTech, Inc., Herndon, VA, cat # 30-234-CR; o Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat # 10131-035), y las líneas episómicas HEK293 se sometieron a medio que contiene 250 \mug/ml de higromicina B (Calbiochem, San Diego, CA, cat # 400051). Las líneas episómicas HEK293 no se clonaron, sino más bien se mantuvieron como cuatro poblaciones separadas. Para todas las líneas estables, las colonias se recogieron después de 10 días en medio selectivo usando discos de clonación estériles (Research Products International, Mount Prospect, IL, cat. # 248710, según su protocolo (véase el protocolo adjunto #3). Los clones se expandieron según el protocolo, y se caracterizaron mediante análisis de transferencia Northern y unión a ^{125}I-CTX.

Ensayo de ARN mediante transferencia de punto para la identificación sistemática de clones positivos

Las caracterizaciones iniciales se realizaron sembrando líneas estables o episómicas HEK293 en dos placas de 96 pocillos, por duplicado, y se hicieron crecer hasta confluencia. Una placa se procesó para ARN total bruto enjuagando las células con 250 \mul de disolución salina tamponada con fosfato, y lisando las células directamente en el pocillo con 100 \mul por pocillo de tampón RLT más \beta-mercaptoetanol de Qiagen, Inc., Chatsworth, CA (cat # 79216). Los lisados se sometieron a vacío en una membrana de nailon cargada positivamente Hybond N+ (Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL, cat # RPN203B) que se había empapado en 2 X de disolución SSC concentrada (20 X SSC es 0,3 M citrato Na_{3} y 3 M NaCl a pH 7,0). Los pocillos se enjuagaron 2 a 3 veces en 2 X SSC, y la mancha se reticuló en un Spectrolinker XL1500 (Spectronics Corp., Westbury, NY) con el ajuste óptimo. El aparato de vacío usado fue el aparato de 96 pocillos Bio-dot, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, cat. # 170-6545. La sonda usada para hibridar la mancha fue un producto de PCR que corresponde al nucleótido # 658-1098 de hKCa4. Se marcaron cincuenta ng de fragment usando \alpha^{32}P-dCTP (NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA, cat. # NEG-013H) y perlas de marcado Ready-To-Go (-dCTP) (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, cat # 27-9240-01) según las recomendaciones del fabricante. El producto marcado se purificó a partir de nucleótido radioactivo no incorporado, usando microcolumnas Probe Quant G-50 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, cat # 27-5335-01) según las recomendaciones del fabricante. La mancha se prehibridó en disolución ExpressHyb (Clontech, Palo Alto, CA, cat # 8015-1) durante 1,5 horas a 68ºC. Se desnaturalizaron, al calentar a ebullición, veinticinco ng (28 X 10^{6} cpm) de la sonda, y se añadieron a 10 ml de ExpressHyb precalentado reciente. Esto sustituyó a la disolución de prehibridación durante una hora a 68ºC. La mancha se lavó dos veces durante veinte minutos a temperatura ambiente en 2 X SSC y 0,1% de SDS, seguido de dos lavados de quince minutos a 50ºC en 0,1 X SSC y 0,1% de SDS. La mancha se expuso entonces a una película toda la noche con dos pantallas intensificadoras.

Ensayo de unión a CTX para la identificación sistemática de clones positivos

La segunda placa se procesó para determinar la unión a ^{125}I-CTX, aclarando cada pocillo en 250 \mul de disolución salina tamponada con fosfato, y desuniendo las células usando 50 \mul por pocillo de verseno (Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat # 15040-066). Las células se pipetearon para romper los grumos, y para asegurar que estaban desunidas, y las células se centrifugaron entonces cinco minutos a 1000 rpm para llevar a las células al fondo de los pocillos. Se eliminó el sobrenadante con cuidado, y el pelete celular se almacenó a -20ºC hasta que se llevó a cabo el ensayo de unión. Para comenzar el experimento, se dejó que las placas se descongelasen hasta la temperatura ambiente, y se añadió a cada pocillo 200 ul de tampón de ensayo (5 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 6 mM glucosa, pH 8,4) que contiene 0,02% de seroalbúmina bovina. Se añadieron 50 ul de ^{125}I-caribdotoxina (Dupont New England Nuclear, Boston, MA, Cat # NEX-276) a cada pocillo, hasta una concentración final de 50 pM. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave en una mezcladora de placas Titertek. Después de una hora, el ligando unido se separó del libre mediante filtración en GF/C Unifilters (Packard, Meriden, CT) que se habían empapado previamente en 0,6% de polietilenimina. Las muestras se lavaron dos veces rápidamente, usando un tampón de lavado en hielo frío (200 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 8,0). Las placas Unifilter se secaron en aire toda la noche. Cuando estuvieron secas, se añadieron 25 ul de Microscint-20 a las placas Unifilters, y se contaron en un contador de centelleo Top Count (Packard, Meriden, CT).

Las líneas celulares que aparecieron positivas tanto para el transcrito de ARN SEQ ID NO:2 como para la unión de ^{125}I-CTX se caracterizaron adicionalmente mediante análisis de pinzamiento zonal de célula completa.

Registro de pinzamiento zonal de transfectantes estables

Se registraron las corrientes con un amplificador Axopatch 200A (Axon Instr., Foster City, CA), usando las configuraciones de célula completa y de dentro-fuera (Hammill, et al., Pfugers Arch., 391:85 (1981)). Se fabricaron pipetas de vidrio de borosilicato, de paredes delgadas, y se pulieron al fuego hasta una resistencia de DC de 2-8 M\Omega. La resistencia de los sellos de parche fue >10 G\Omega. Los potenciales de unión de líquidos se corrigieron para todos los experimentos, y se usó una compensación de resistencia en serie de >70% cuando la corriente máxima fue de >0.5 nA. Se implementaron los protocolos de pinzamiento de voltaje, y se realizó la adquisición de datos con el programa de ordenador pClamp 6.0 (Axon Instr., CA). Las corrientes se filtraron mediante paso bajo a (-3 db a 1 kHz), y después se digitalizaron a 3-8 kHz como archivos de ordenador, con una interfaz TL-1 (Scientific Solutions, Solon, OH). Las corrientes se midieron con un programa de ordenador p-Clamp, y se obtuvieron ajustes iterativos de curvas con el programa de ordenador p-Clamp u Origin (Version 3.73; Microcal Inc., Northampton, MA).

Para el registro de células completas, la disolución de pipeta contenía (en mM) 160 aspartato de K, 2 MgCl_{2}, 5 HEPES, and 1,6 EGTA con 0,8 CaCl_{2} (calculado [Ca^{2+}]_{libre} = 100 nM; Eqcal software, Biosoft Corp, Cambridge. UK) o 1,6 CaCl_{2} (calculado [Ca^{2+}]_{libre} = 1 \muM) a pH 7,2 (mediante KOH) y una osmolalidad de \sim315 mOsm (mediante sacarosa). Las células se prefusionaron localmente con una disolución que contiene 160 KCl, 2 CaCl_{2}, 1 MgCl_{2}, 5 HEPES, y 5 glucosa a pH 7,4 (mediante KOH) y una osmolalidad de -325 mOsm. En experimentos de selectividad de K^{+}, la Na^{+} equimolar se sustituyó por K^{+}. El protocolo de pinzamiento de voltaje de célula completa provocó una corriente mediante una rampa de voltaje de 273 ms desde -100 hasta +40 mV. La pendiente de conductancia se midió durante la rampa de voltaje entre -99 a -50,1 mV. La pendiente de conductancia del bloque de caribdotoxina a 100 ó 300 nM se restó de la corriente del control como pérdida.

Los números de canales se calcularon usando la fórmula: (conductancia de la célula completa/conductancia unitaria)/(probabilidad abierta de 0,5). El protocolo de pinzamiento de voltaje de unión a célula provocó una corriente de canal individual mediante una rampa de 500 ms desde -120 a +180 mV. La conductancia unitaria se midió durante la rampa de voltaje entre -99 hasta +20 mV. Varios clones de transfectantes estables expresaron grandes corrientes de KCa. En la Fig. 17 se muestra una traza de corriente a partir de un clon de ejemplo (HC23). Esta corriente se bloqueó mediante CTX (ensayo de unión a ^{125}I-caribdotoxina para KCa4 (SEQ ID NO:3) (Véanse los ejemplos I, II y III)). En la Fig. 18 se
muestra un ejemplo de una curva de dosis frente a respuesta para la unión a CTX en canales de KCa4 (SEQ ID NO:3).

Expresión de la subunidad del canal de potasio humano activado por calcio (hKCa4) en células T anérgicas

En el caso de que un linfocito T interaccione con un antígeno específico y dé como resultado la señalización a través del receptor del antígeno de la célula T, pero que no conduzca a respuesta proliferativa de células T, la célula entra en un estado de falta de sensibilidad, o anergia. Johnson, J.G., et al., Life Sciences, 55: 1767 (1994). Para la activación de células T normales, la síntesis y proliferación de IL-2, se requieren dos señales: una a través del complejo de receptor de células T (TCR), y otro a través de una molécula coestimulante en la célula T, conocida como CD28. La inducción de la anergia puede resultar de un número de situaciones diferentes, incluyendo la presentación de antígenos en ausencia de coestimulación, el bloqueo farmacológico de la proliferación de células T, o la estimulación crónica del TCR mediante el antígeno. La anergia es un estado de larga duración caracterizado por una incapacidad profunda de la célula T para producir IL-2. Una comprensión del mecanismo de la inducción de la anergia y de su mantenimiento conducirá ciertamente a aplicaciones clínicas beneficiosas, incluyendo la aceptación de la mejora de injertos y la evitación de tales respuestas inmunitarias perjudiciales, tales como la autoinmunidad y la alergia. Véase el Ejemplo XVII.

Se ha demostrado una drástica regulación al alza del ARN de la nueva subunidad del canal de potasio activado por calcio, y de las corrientes, cuando se activan las células T. Parece que existe una correlación entre la inducción de las corrientes de hKCa4 (SEQ ID NO:3) y el estado anérgico.

Se sometieron a pinzamiento zonal las células T en reposo (sin estímulo), activadas (anti-CD3+CD28) y las inducidas a anergia (anti-CD3 solo), para examinar las actividades relativas de los canales de KCa4. Se demuestra aquí una drástica regulación a la baja de la corriente de KCa4 en células T que reciben una ocupación de TCR solo, en comparación con células T que reciben una ocupación de TCR más una coestimulación, (p<0.001). Los resultados se resumen en la Fig.20. Los datos señalan la importancia de la señal coestimulante en la regulación al alza de este canal durante la activación de las células T.

Antibodies

Se diseñaron tres péptidos para SEQ ID NO:3 (hKCa4) para la generación de anticuerpos. Estos péptidos se escogieron basándose en la especificidad por KCa4 con respecto a KCal-3, así como un índice de antigenicidad elevado.

A:

Posiciones 415-427 + C de SEQ ID NO:3 (término COOH con una cisteína añadida)

B:

Posiciones 415-427 de SEQ ID NO:3 (tienen un término COOH)

C:

Posiciones 135-148 de SEQ ID NO:3 (bucle S3-S4)

Los péptidos se ordenaron a partir de Research Genetics, Huntsville. AL. Los péptidos se conjugaron a KLH y a BSA usando el kit de conjugación de Imject Immunogen EDC (Cat#77101, Pierce Inc., IL). Los péptidos conjugados con KHL se enviaron a Medicina Veterinaria para la generación de anticuerpos en conejos. Se usaron 300 ug del péptido con KHL por inyección. El protocolo de inmunización fue el siguiente:

2

Un ELISA (kit ELISAmate, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. MD), que usa el péptido con BSA como el antígeno, y anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP como el reactivo secundario, dio títulos muy buenos en sueros inmunes para los tres anticuerpos peptídicos ensayados. El análisis de transferencia Western (que usa el kit de detección de ECL, Amersham., England) de una proteína de fusión a GST de cola del término C (obtenida en bacterias; véase en cualquier parte en este documento bajo dos híbridos de levadura) recogieron una banda fuerte en el tamaño predicho cuando se usó el antisuero B peptídico, pero no con el antisuero peptídico C (que se dirigió al bucle S3-S4). Véase la Fig. 19.

Además, el polipéptido del canal de potasio activado por calcio recombinante se puede separar de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad formada por anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para el polipéptido del canal de potasio activado por calcio naciente, de longitud completa, o fragmentos polipeptídicos del canal de potasio activado por calcio.

Los polipéptidos del canal de potasio activado por calcio descritos aquí se pueden usar para purificar por afinidad efectores biológicos a partir de materiales biológicos naturales, por ejemplo tejido enfermo. Las técnicas de cromatografía de afinidad son bien conocidas por los expertos en la técnica. Un péptido del canal de potasio activado por calcio descrito aquí, o un fragmento efectivo del mismo, se fija a una matriz sólida, por ejemplo Sefarosa activada por CNBr, según el protocolo del proveedor (Pharmacia, Piscataway, NJ), y se hace pasar una disolución celular homogeneizada/tamponada que contiene una molécula potencial de interés a través de la columna. Después de lavar, la columna retiene sólo el efector biológico que se eluye subsiguientemente, por ejemplo, usando 0,5M de ácido acético, o un gradiente de NaCl.

Los anticuerpos monoespecíficos para el polipéptido del canal de potasio activado por calcio se purifican a partir de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos reactivos contra el polipéptido, o se preparan como anticuerpos monoclonales, reactivos con el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497 (1975). El anticuerpo monoespecífico, como se usa aquí, se define como una especie de anticuerpo individual, o una especie de anticuerpo múltiple con características de unión homogénea por el nuevo canal de potasio activado por calcio. La unión homogénea, como se usa aquí, se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo a unirse a un antígeno específico o epítopo, tales como los asociados con el nuevo canal de potasio activado por calcio, como se ha descrito. Los anticuerpos específicos del nuevo canal de potasio activado por calcio se producen mediante animales inmunizados tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos, y similares, prefiriéndose los conejos, con una concentración apropiada del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, ya sea con o sin adyuvante inmunitario.

El suero preinmune se recogió antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre alrededor de 0,1 mg y alrededor de 1000 mg de polipéptido del canal de potasio activado por calcio, asociado con un adyuvante inmunitario aceptable. Tales adyuvantes inmunitarios incluyen, pero no se limitan a, completo de Freund, incompleto de Freund, precipitado de alúmina, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial consiste en polipéptido del canal de potasio activado por calcio en, preferiblemente, adyuvante completo de Freund, en múltiples sitios, ya sea subcutáneamente (SC), intraperitonealmente (IP), o ambas. Cada animal se sangró a intervalos regulares, preferiblemente de forma semanal, para determinar el título de anticuerpos. Los animales pueden o no recibir inyecciones de recuerdo, tras la inmunización inicial. A los animales que reciben inyecciones de recuerdo se les da generalmente una cantidad igual del antígeno en adyuvante incompleto de Freund, mediante la misma ruta. Se administran inyecciones de recuerdo a intervalos de alrededor de tres semanas, hasta que se obtienen los títulos máximos. Alrededor de 7 días después de la inmunización de recuerdo, o alrededor de una semana después de una única inmunización, los animales se sangran, se recoge el suero, y se almacenan alícuotas a alrededor de -20ºC.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con el polipéptido del canal de potasio activado por calcio se preparan inmunizando ratones consanguíneos, preferiblemente Balb/c, con el polipéptido del canal de potasio activado por calcio. Los ratones se inmunizaron mediante la vía IP o SC con alrededor de 0,1 mg hasta alrededor de 10 mg, preferiblemente alrededor de 1 mg, de polipéptido del canal de potasio activado por calcio, en alrededor de 0,5 ml de tampón o de disolución salina, incorporado en un volumen igual de un adyuvante aceptable, como se explica anteriormente. Se prefiere el adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial en el día 0, y se dejan descansar durante alrededor de 3 hasta alrededor de 30 semanas. A los ratones inmunizados se les da uno o más inmunizaciones de recuerdo, de alrededor de 0,1 hasta alrededor de 10 mg del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, en una disolución tampón, tal como disolución salina tamponada con fosfato, mediante vía intravenosa (IV). Los linfocitos, procedentes de ratones positivos al anticuerpo, preferiblemente linfocitos del bazo, se obtienen eliminando los bazos de los ratones inmunizados, mediante procedimientos estándares conocidos en la técnica. Se producen células de hibridomas mezclando los linfocitos del bazo con un compañero de fusión apropiado, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Los compañeros de fusión pueden incluir, pero no se limitan a: mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, prefiriéndose Sp 2/0. Las células productores de anticuerpos y las células de mielomas se fusionan en polietilenglicol, peso molecular de alrededor de 1000, a concentraciones desde alrededor de 30% hasta alrededor de 50%. Las células de hibridomas fusionadas se seleccionan mediante crecimiento en hipoxantina, timidina, y aminopterina, suplementado con medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los fluidos sobrenadantes se recogieron a partir de pocillos positivos en aproximadamente los días 14, 18, y 21, y se identificaron para determinar la producción de anticuerpos mediante un inmunoensayo, tal como un inmunorradioensayo en fase sólida (SPIRA), usando el polipéptido del canal de potasio activado por calcio como el antígeno. Los fluidos del cultivo también se ensayaron en el ensayo de precipitación de Ouchterlony, para determinar el isotipo del mAb. Las células de hibridomas procedentes de pocillos positivos a anticuerpos se clonaron mediante una técnica tal como la técnica de agar blando, de MacPherson, Soft Agar Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973.

Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo inyectando, aproximadamente 0,5 ml por ratón, a ratones Balb/c cebados con pristano, alrededor de 2 x 10^{6} hasta alrededor de 6 x 10^{6} células de hibridomas, alrededor de 4 días después del cebado. El fluido ascítico se recoge aproximadamente 8-12 días después de la transferencia de células, y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica.

La producción in vitro de mAb anti-[polipéptido del canal de potasio activado por calcio] se lleva a cabo haciendo crecer el hibridoma en DMEM que contiene alrededor de 2% de suero fetal de ternera, para obtener cantidades suficientes del mAb específico. Los mAb se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica.

Los títulos de anticuerpos de fluidos de cultivos de hibridomas o ascíticos se determinan mediante diversos ensayos serológicos e inmunológicos, que incluye, pero no se limitan a, precipitación, aglutinamiento pasivo, técnica de anticuerpo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayo (RIA). Se usan ensayos de diagnóstico similares para detectar la presencia del nuevo polipéptido del canal de potasio activado por calcio en fluidos o tejidos corporales y extractos celulares.

Los ensayos de diagnóstico que usan anticuerpos específicos del polipéptido del canal de potasio activado por calcio son útiles para el diagnóstico de patologías, trastornos o enfermedades caracterizadas por la expresión anormal del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o la expresión de genes asociados con el crecimiento anormal de las células. Los ensayos de diagnóstico para el polipéptido del canal de potasio activado por calcio incluye métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar el polipéptido del canal de potasio activado por calcio en fluidos orgánicos humanos, células, tejidos, o secciones o extractos de tales tejidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniéndolos, ya sea covalente o no covalentemente, con una molécula informadora, de las cuales muchas son conocidas por los expertos en la técnica.

En la técnica se conoce una variedad de protocolos para medir el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína respectiva. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Se prefiere un inmunoensayo a base de monoclonales de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales que reaccionan con dos epítopos que no interfieren sobre el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, pero se puede emplear un ensayo de unión competitivo. Estos ensayos se describen, entre otros lugares, en Maddox. DE et al (1983. J Exp Med 158:1211).

A fin de proporcionar una base para el diagnóstico de la enfermedad, se deben de establecer los valores normales o estándares para la expresión del polipéptido del canal de potasio activado por calcio. Esto se logra combinando fluidos orgánicos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, ya sea animal o ser humano, con un anticuerpo para el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, en condiciones adecuadas para la formación del complejo, bien conocidas en la técnica. La cantidad de formación de complejo se puede cuantificar comparándola con una serie de diluciones de controles positivos, en los que se combina una cantidad conocida de anticuerpo con concentraciones conocidas del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, purificado. Después, los valores estándar obtenidos a partir de muestras normales se pueden comparar con valores obtenidos a partir de muestras procedentes de sujetos afectados potencialmente por un trastorno o enfermedad relacionada con la expresión del polipéptido del canal de potasio activado por calcio. La desviación entre los valores estándar y del sujeto establece la presencia del estado mórbido.

Es fácilmente manifiesto para los expertos en la técnica que los métodos descritos anteriormente para producir anticuerpos monoespecíficos se pueden utilizar para producir anticuerpos específicos para fragmentos del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o el polipéptido del canal de potasio activado por calcio naciente, de longitud completa. Específicamente, es fácilmente manifiesto para los expertos en la técnica que se pueden generar anticuerpos monoespecíficos que son específicos para el receptor completamente funcional o fragmentos del mismo.

Las columnas de afinidad para el anticuerpo del polipéptido del canal de potasio activado por calcio se obtienen añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte en gel que se activa con ésteres de N-hidroxisuccinimida, de forma que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan entonces al gel, vía enlaces de amida, con el brazo espaciador. El resto de los ésteres activados se paralizan entonces con 1M de etanolamina HCl (pH 8).

La columna se lava con agua, seguido de 0,23M de glicina HCl (pH 2,6), para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra entonces en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) con un detergente apropiado, y los sobrenadantes de los cultivos celulares o los extractos celulares que contienen el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, obtenidos usando los detergentes solubilizantes de membrana apropiados, se hacen pasar lentamente a través de la columna. La columna se lava entonces con detergente/disolución salina tamponada con fosfato, hasta que la densidad óptica cae hasta el valor de fondo, y después la proteína se eluye con 0,23M glicina-HCl (pH 2,6)/detergente. El polipéptido del canal de potasio activado por calcio, purificado, se dializa entonces frente a detergente/disolución salina tamponada con fosfato.

Métodos de identificación sistemática

La presente invención también se refiere a métodos para identificar compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que codifica el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, así como la función del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, in vivo.

Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no proteínicas. Los compuestos pueden modular incrementando o atenuando la expresión de ADN o ARN que codifica el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o la función del polipéptido del canal de potasio activado por calcio. Los compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o la función del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, se pueden detectar mediante una variedad de ensayos. El ensayo puede ser un ensayo simple de tipo "sí/no" para determinar si hay un cambio en la expresión o en la función. El ensayo puede ser cuantitativo, comparando la expresión o la función de una muestra de ensayo con los niveles de expresión o la función en una muestra estándar.

El polipéptido del canal de potasio activado por calcio descrito aquí, sus fragmentos inmunógenos u oligopéptidos, se pueden usar para identificar compuestos terapéuticos en cualquier variedad de técnicas de identificación de fármacos. El fragmento empleado en tal ensayo puede estar en libre en una disolución, fijado a un soporte sólido, portado sobre una superficie celular, o localizado intracelularmente. Se puede medir la abolición de la actividad o la formación de complejos de unión entre el polipéptido del canal de potasio activado por calcio y el agente ensayado. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para identificar una pluralidad de compuestos para la afinidad de unión específica con el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o un fragmento del mismo, que comprende proporcionar una pluralidad de compuestos; combinar el polipéptido del canal de potasio activado por calcio de la presente invención, o un fragmento del mismo, con cada uno de la pluralidad de compuestos, durante un tiempo suficiente para permitir la unión en condiciones adecuadas; y detectar la unión del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o un fragmento del mismo, a cada uno de la pluralidad de compuestos, identificando de ese modo los compuestos que se unen específicamente al polipéptido del canal de potasio activado por calcio.

Puesto que el nuevo gen, por ejemplo SEQ ID NO:1, se expresa de forma muy importante en células T activadas, y puesto que los canales de potasio activados por calcio de las células T son bloqueados potentemente por la toxina de escorpión caribdotoxina (CTX), se pueden usar en ensayos de unión radiomarcados diversas estirpes celulares que sobreexpresan heterólogamente las regiones codificantes estructurales del nuevo canal descritas aquí, para identificar sistemáticamente moléculas farmacológicamente activas que bloqueen el nuevo canal usando ^{125}I-CTX como el ligando.

Ensayo de unión a CTX para la identificación de alto rendimiento de moduladores del nuevo canal

Realizaciones particularmente preferidas de la presente invención son estirpes celulares que sobreexpresan heterólogamente el canal de potasio activado por calcio descrito aquí (por ejemplo, SEQ ID NO:3, o una versión truncada biológicamente activa del mismo, o una fusión quimérica) y su uso en ensayos de unión para identificar moléculas farmacológicamente activas que bloquean o modulan de otro modo la actividad biológica del nuevo canal.

Por ejemplo, se puede usar un ensayo de unión radiomarcado, que use ^{125}I-CTX como el ligando, como se describe previamente por Hill, R.J., Mol. Pharm., 48:98 (1995), y Deutsch, C., et al., J. Biol. Chem., 266:3668 (1991). Las preparaciones de membranas de estirpes celulares que sobreexpresan el nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí se obtienen homogeneizando la células usando un Polytron durante 25 segundos a 13.000 rpm, y que se hacen girar a baja velocidad (100 g) durante 2 minutos. El sobrenadante se hace girar a alta velocidad (50.000 g) durante10 minutos. El pelete se suspende en 1 ml de tampón de ensayo (5 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 6 mM de glucosa, pH 8,4), y se diluyó hasta 50 ug/ml.

Se añadieron 130 ul de tampón de ensayo a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos, así como 20 ul de compuesto de molécula de ensayo (el fármaco de ensayo puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, un péptido, un análogo o un compuesto mimético)/tampón de ensayo de control/no específica (10 nM de CTX fría) (no marcada). Se incubaron 50 ul de membranas procedentes de células que sobreexpresan el nuevo canal de potasio activado por calcio a 50 ug/ml y 50 ul de ^{125}I-CTX (25 pM: NEN. 2200 Ci/mmol), durante 20 minutos a 21ºC con mezclamiento. La CTX radiomarcada unida se separó de la CTX radiomarcada libre en disolución filtrando sobre GF/C Unifilters (Packard Instruments) previamente empapados, y lavando en tampón de lavado enfriado con hielo. Después de secar, las placas de filtro se contaron mediante centelleo. Los datos de los experimentos de saturación se someten a análisis de Scatchard y a regresión lineal. Deutsch, et al., J. Biol. Chem., 266:3668 (1991). Se identifican los compuestos que compiten con la CTX radiomarcada por la unión al nuevo canal de potasio activado por calcio descrito aquí, que producen una reducción en los recuentos específicos.

Ensayo de proximidad por centelleo

En otra realización, un ensayo de proximidad por centelleo (SPA), que elimina la necesidad de filtros, se puede adaptar fácilmente para ensayos de identificación sistemática de alto rendimiento (HTS). Hoffman, R., et al., Anal. Biochem., 20370 (1992): Kienuis, C.B.M., et al., J. Recept. Res., 12:389 (1992).Véase el Ejemplo XVI.

Lector de placas formador de imágenes fluorométrico (FLIPR)

El sistema FLIPR es el más útil como una identificación sistemática de alto rendimiento primaria para canales iónicos, que influye en el potencial de membrana celular (por ejemplo: KCa4 (SEQ ID NO:3) descrito aquí). FLIPR es un dispositivo comercial (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) que se diseña para medir las señales fluorescentes simultáneamente de 96 pocillos en una placa de microtitulación usando un láser de ión de argón y un sistema óptico semiconfocal. Está equipado con un pipeteador de 96 puntas, que permite la administración simultánea del fármaco a todos los pocillos. Las resolución de tiempo está por debajo de 1 segundo. Los colorantes fluorescentes que son los más útiles son DiBAC4(3) para el potencial de membrana (Epps, D.E., et al., Chem Phys Lipids., 69(2):137 (1994)) y Fluo-3 para calcio (Rijkers, G.T., et al., Cytometry, 11(8):923 (1990). Las células que expresan establemente SEQ ID NO:2 se cultivan en placas de 96 pocillos, a una densidad de 0,5 x 10^{4} células/pocillo, y se deja que formen una monocapa uniforme. Al siguiente día, se eliminaron los medios celulares, y se incubaron con tampón de EBSS que contiene 20 mM de tampón HEPES y 5 uM de DiBAC (cat# B-438, Molecular Probes), con o sin compuestos de ensayo, y se incubaron a 37 grados durante 1,5 horas. Las células se lavaron entonces en un tampón salino no fluorescente, tal como EBSS. La fluorescencia se midió usando medios ópticos de láser de FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Se prefieren métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de un polipéptido humano leucocítico del canal de potasio activado por calcio, que comprenden:

(a) combinar un compuesto modulador candidato de una actividad del canal de potasio activado por calcio humano leucocítico con un polipéptido de un canal de potasio activado por calcio humano que tiene la secuencia SEQ ID NO:3, y

(b) medir un efecto del compuesto modulador candidato sobre el canal.

Se prefieren especialmente los métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de un canal de potasio activado por calcio humano leucocítico, que comprenden:

(a) combinar un compuesto modulador candidato de una actividad del canal de potasio activado por calcio humano leucocítico con una célula hospedante que expresa el polipéptido de un canal de potasio activado por calcio humano que tiene la secuencia SEQ ID NO:3, y

(b) medir un efecto del compuesto modulador candidato sobre el canal.

Los compuestos que se identifican generalmente según los métodos descritos y citados aquí, que modulan la actividad de un canal de potasio activado por calcio, que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3, son realizaciones especialmente preferidas de la presente invención.

Ensayos de dos híbridos

En otra realización de la invención, se puede ligar una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un canal de potasio activado por calcio humano sustancialmente como se representa en SEQ ID NO:3, o un fragmento biológicamente activo del mismo, a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para identificar compuestos para la modulación de la actividad biológica, puede ser útil codificar un canal de potasio activado por calcio quimérico como se describe aquí, para la expresión en células hospedantes heterólogas. Los constructos quiméricos también se pueden usar para expresar un "cebo", según métodos bien conocidos que usan un sistema de dos híbridos de levadura, para identificar péptido naturales accesorios que se pueden asociar con el polipéptido del canal de potasio activado por calcio descrito aquí. Fields, S., et al., Trends Genet., 10:286 (1994); Allen, J.B., et al., TIBS, 20:511 (1995). Se ha descrito un sistema de dos híbridos de levadura en el que se pueden detectar las interacciones proteína:proteína usando un ensayo genético a base de levadura vía la reconstitución de los activadores transcripcionales. Fields, S., Song, O., Nature 340:245 (1989). El sistema de dos híbridos usa la capacidad de un par de proteína que interactúan entre sí para aproximar lo más posible un dominio de activación de la transcripción a un sitio de unión a ADN que regula la expresión de un gen informador adyacente. Véase también Mendelsohn, A.R., Brent. R., Curr. Op. Biotech., 5:482 (1994); Phizicky. E.M., Fields, S., Microbiological Rev., 59(1):94 (1995): Yang, M., et al., Nucleic Acids Res., 23(7):1152 (1995): Fields, S., Sternglanz, R., TIG, 10(8):286 (1994); y las patentes US 5.283.173, System to Detect Protein-Protein Interactions, y 5.468.614.

Experimentos de dos hibridaciones de levadura (implicación de calmodulina)

El sistema de dos híbridos MATCHMAKER de Clontech, Palo Alto CA, (Cat # K1604-1) es un sistema a base de GAL4 completo que proporciona un ensayo transcripcional para detectar interacciones proteína-proteína en levadura. El sistema de dos híbridos utiliza una selección de crecimiento poderosa - la expresión condicional de un gen informador nutricional - para identificar un gran número de transformantes de levadura con una librería de fusión especialmente construida para proteínas que interactúan entre sí. Se subclonó el C-terminal de hKCa4 (SEQ ID NO: 2) en el vector GAL4 DNA-BD (pAS2-1, Clontech, Palo Alto, CA) por medios convencionales, usando una PCR estándar (Clontech, PT3061-1). Los sitios de restricción usados en la subclonación son EcoRI y XhoI. Este constructo se confirmó entonces secuenciando, y se usó como el cebo en la identificación de la librería. La librería usada es ADNc MATCHMAKER humano leucocítica (HL4021AB, Clontech). Todos los procedimientos de identificación se realizaron basándose en las recomendaciones del fabricante (Manual de Clontech #PT3061-1). Se identificaron diez mil clones positivos putativos después de la primera ronda de identificación. Dos mil de estos clones se sometieron entonces a un ensayo de lacZ de elevación de colonias, que identificó siete positivas. Las colonias positivas se secuenciaron entonces para un análisis posterior, tal como la comparación con la base de datos de secuencias. Seis de los siete clones codificaron calmodulina.

Antisentido

En otra realización de la invención, se pueden usar las secuencias de ADNc SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:7, proporcionadas aquí, para estudiar la importancia fisiológica del nuevo canal de potasio activado por calcio en células, especialmente células de origen hematopoyético, eliminando el gen endógeno mediante uso de constructos antisentido que seleccionan como diana, por ejemplo, la región de la metionina iniciadora o la región de poro descrita más arriba. Véase, por ejemplo, Shirihai, O. et al., Pfugers Arch. 431:632 (1996); Chung, S., et al., PNAS, 92:5955 (1995).; la patente U.S. nº 5.639.595, Identification of Novel Drugs and Reagents, expedida el 17 de junio de 1997, en la que se describen a conciencia métodos para identificar secuencias oligonucleotídicas que presentan actividad in vivo. Los vectores de expresión que contienen secuencias oligonucleotídicas al azar derivadas de polinucleótidos previamente conocidos se transforman en células.

Las células se ensayaron entonces en busca de un fenotipo que resulte de la actividad deseada del oligonucleótido.

Una vez que se han identificado las células con el fenotipo deseado, se puede identificar la secuencia del oligonucleótido que tiene la actividad deseada. La identificación se puede lograr recuperando el vector o mediante amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y secuenciación de la región que contiene el material de ácido nucleico insertado.

Las secuencias nucleotídicas que son complementarias al polipéptido del canal de potasio activado por calcio que codifican la secuencia polinucleotídica se pueden sintetizar para la terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN, tales como fosforotioatos o metilfosfatos, ARN, derivados estables de ARN, tales como 2'-O-alquil-ARN, u otros miméticos oligonucleotídicos. Las moléculas antisentido del polipéptido del canal de potasio activado por calcio se pueden introducir en células mediante microinyección, encapsulamiento liposómico, o mediante expresión a partir de vectores que contienen la secuencia antisentido. La terapia antisentido del polipéptido del canal de potasio activado por calcio puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que es beneficioso reducir la actividad del polipéptido del canal de potasio activado por calcio.

La terapia génica antisentido del polipéptido del canal de potasio activado por calcio se puede usar para introducir el polipéptido en las células de órganos diana. Contrariamente, la terapia génica del polipéptido del canal de potasio activado por calcio se puede usar para reducir la expresión del polipéptido en las células de órganos diana. La región codificante del polipéptido del canal de potasio activado por calcio se puede ligar en vectores víricos que median las transferencia del ADN del polipéptido del canal de potasio activado por calcio mediante infección de células hospedantes receptoras. Los vectores víricos adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus de la vacuna, virus de la polio, y similares. Como alternativa, el ADN del polipéptido del canal de potasio activado por calcio se puede transferir en células para terapia génica mediante técnicas no víricas, incluyendo la transferencia de ADN dirigido a una diana y mediada por receptores, usando conjugados de ligando-ADN o conjugados de adenovirus-ligando-ADN, fusión de membranas por lipofección, o microinyección directa. Estos procedimientos y sus variaciones se adecuados para la terapia génica ex vivo así como in vivo del polipéptido del canal de potasio activado por calcio.

Composiciones

Las composiciones farmacéuticamente útiles el ADN del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, ARN del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o el polipéptido del canal de potasio activado por calcio, o moduladores de la actividad del polipéptido del canal de potasio activado por calcio, se pueden formular según métodos conocidos tales como mediante la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos y métodos de formulación se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína, ADN, ARN, o modulador.

Las composiciones terapéuticas o de diagnóstico de la invención se administran a un individuo en cantidades suficiente para tratar o diagnosticar trastornos relacionados con el polipéptido del canal de potasio activado por calcio. La cantidad eficaz puede variar según una variedad de factores tales como el estado del individuo, el peso, el sexo y la edad. Otros factores incluyen el modo de administración.

Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar al individuo mediante una variedad de vías, tales como la subcutánea, tópica, oral e intramuscular.

La expresión "derivado químico" describe una molécula que contiene restos químicos adicionales que normalmente no son una parte de la molécula base. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, la semivida, la absorción, etc., de la molécula base. Como alternativa, los restos pueden atenuar efectos secundarios indeseables de la molécula base, o disminuir la toxicidad de la molécula base. Los ejemplos de tales restos se describen en una variedad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos identificados según los métodos descritos aquí se pueden usar solos, a dosis apropiadas definidas mediante ensayos normales a fin de obtener la modulación óptima de un canal de potasio activado por calcio, o su actividad, mientras que a la vez se minimiza cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser deseable la coadministración o la administración secuencial de otros agentes. La presente invención también tiene el objetivo de proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas, para uso en los nuevos métodos de tratamiento de la presente invención. Las composiciones que contienen compuestos identificados según esta invención como el ingrediente activo para uso en la modulación de los canales de potasio activados por calcio se pueden administrar en una amplia variedad de formas de dosificación terapéutica, en vehículos convencionales para la administración. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar en formas de dosificación orales, tales como comprimidos, cápsulas (conteniendo cada una formulaciones de liberación retrasada y de liberación sostenida), pastillas, polvos, gránulos, elixires, tinciones, disoluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Igualmente, se pueden administrar en forma intravenosa (tanto en bolo como en infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o intramuscular, siendo todas las formas de uso bien conocidas por los expertos en las técnicas farmacéuticas. Como agente modulador del canal de potasio activado por calcio, se puede emplear una cantidad eficaz pero no tóxica del compuesto deseado.

La dosis diaria de los productos puede variar a lo largo de un amplio intervalo, desde 0,01 hasta 1.000 mg por humano adulto/por día. Para la administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos revestidos o no revestidos que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, y 50,0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar. Normalmente se suministra una cantidad eficaz del fármaco en una dosis desde alrededor de 0,0001 mg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg de peso corporal por día. El intervalo es más particularmente desde alrededor de 0,001 mg/kg hasta 10 mg/kg de peso corporal por día. Incluso más particularmente, el intervalo varía desde alrededor de 0,05 hasta alrededor de 1 mg/kg. Por supuesto, la dosis variará dependiendo de la potencia del compuesto particular. Algunos compuestos serán más potentes que otros. Además, la dosis variará dependiendo de la biodisponibilidad del compuesto. Cuanto más biodisponible y potente sea el compuesto, menos cantidad de compuesto se necesitará administrar mediante cualquier vía de suministro, incluyendo pero sin limitarse al suministro oral. Las dosis de los moduladores del canal de potasio activado por calcio se ajustan, cuando se combinan, para lograr los efectos deseados. Por otro lado, las dosis de estos diversos agentes se pueden optimizar independientemente y combinar para lograr un resultado sinérgico en el que la patología se reduce más que si cualquier agente se usase solo.

Ejemplos Ejemplo I Preparación de membrana de células HEK transfectadas para identificar compuestos

Las membranas se preparan cuando las células HEK en cada matraz T-150 (o T-175 o T-225) confluyen. La preparación de las membranas a partir de cada matraz de células se realiza según lo siguiente:

1. Sepárense por vertido los medios de cultivo celular, y guárdense (puesto que siempre contienen algunas células que se han descargado al manipular el matraz).

2. Aclárese la capa confluente de células con alrededor de 8 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS), a 37ºC. Esto elimina el suero fetal de ternera residual que puede inhibir la tripsina usada en la etapa 3. Guárdese también el PBS procedente del aclarado, para capturar cualquier célula que se descargue.

3. Añádase alrededor de 5 ml de tripsina-EDTA, a 37ºC. Mueva suavemente el matraz hacia delante y hacia atrás, para permitir que la tripsina lave toda la capa de células. En alrededor de 30 segundos, algunas de las células estarán sueltas; golpéese el matraz firmemente sobre la mesa de laboratorio, para descargar el resto de las células. Añádase rápidamente medio reciente al matraz, para detener la reacción de tripsina. Añádase alrededor de 10 ml de medio por cada 5 ml de tripsina. Pipetéese la tripsina/células/medio en un tubo de centrifugadora. Aclárese el matraz con alrededor de 5 ml más de medio, y combínese con los otros tubos.

4. Lávense las células haciéndolas girar a 250xg, 8 min. Resuspéndanse los peletes celulares individuales en un pequeño volumen de tampón de ensayo, y combínense en un tubo.

5. Homogeneícense las células usando un Polytron, 25 segundos, 13000 RPM.

6. Giro a baja velocidad: 800 RPM (\sim100xg) 2 min.; guárdese el sobrenadante; deséchese el pelete.

7. Giro a alta velocidad: transfiérase el sobrenadante a tubos de alta velocidad, y háganse girar a 20.000 RPM (50,000xg), 10 min. Deséchese el sobrenadante; añádase 1 ml de tampón de ensayo sobre la parte superior del pelete.

8. Congélese en hielo seco; tápense los tubos y almacénense a -80ºC.

Dilúyanse las membranas hasta 50 ug/ml, y úsense 2,5 ug en cada pocillo (50 ul de 50 ug/ml).

Ejemplo II Ensayo de unión a ^{125}-I caribdotoxina para (SEQ ID NO: 3) HKca4 (A) Método de filtración Materiales

Tampón de ensayo	Tampón de lavado
5 mM NaCl	200 mM NaCl
5 mM KCl	20 mM HEPES
10 mM HEPES	pH 8,0 con Tris base
6 mM glucosa
230 mM sacarosa
llevar hasta pH 8,4 con TRIS base y BSA hasta una [final] de 0,02%

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Células MEL completas establemente transfectadas con SEQ ID NO:2 500.000 células por pocillo - o - células HEK establemente transfectadas con SEQ ID NO:2

Misc. Placas de microtitulación de 96 pocillos, Falcon, fondo redondo, sin cultivo de tejido tratado con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), sin Ca++ ni Mg++

Unifilters, GF/C, de 96 pocillos (Packard, Meriden, CT).

Flúor de centelleo Microscint-20, Packard

Contador de centelleo Top Count, Packard

Polietilenimina, 0,6% para empapar a los Unifilters

^{125}I-Caribdotoxina, (NEN, Boston, MA, NEX-276) 2200 Ci/mmol de unión no específica definida con 100nM de ChTX fría (Bachem, King of Prussia, PA).

Ensayo: 130 ul de tampón de ensayo

20 ul de compuesto de ensayo o tampón o CTX fría (no específica) 50 ul células a 1E^{6}/ml (500.000 por pocillo)

50 ul ^{125}I-ChTX [final] 50 pM

250 ul volumen total

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Método de ensayo

Colóquense 130 ul de tampón de ensayo por pocillo en una placa de 96 pocillos. Añádanse 20 ul de compuesto de ensayo, o disolución de control (más tampón o diluyente de compuesto de ensayo), o no específico (definido con 100 nM de CTX fría). Lávense las células dos veces en PBS, resuspéndanse en tampón de ensayo, y añádanse 50 ul de células a la placa de ensayo. Añádanse 50 ul de ^{125}I-ChTX, [final] 50 pM, e incúbense durante 45 minutos a 21ºC, mezclando en la mezcladora de placas. Sepárese la ^{125}I-ChTX libre de la unida filtrando sobre los GF/C Unifilters previamente empapados. Lávese dos veces rápidamente, usando tampón de lavado enfriado en hielo. Déjense secar las placas Unifilter toda la noche. Cuando estén secas, añádanse 25 ul de Microscint-20 a los Unifilters, y recuéntese en un contador de centelleo Top Count.

En la Fig. 18 se muestra un ejemplo de una curva de dosis frente a respuesta para la unión a CTX/subunidad del nuevo canal de potasio activado por calcio (hKCa4).

Ejemplo III Ensayos de unión a 125I-ChTX

Los linfocitos se incuban en tubos de poliestireno de 12 x 75 mm con ^{125}I-ChTX (1-2 x 10^{3} Ci/mmol). Excepto que se señale de otro modo, las células se suspenden en medio de sacarosa isotónico (Medio I) que contiene 10 mM de NaHepes, 5 mM de KCl, 5 mM de NaCl, y 6 mM de glucosa, pH 8,4, y se incubaron con ^{125}I-ChTX durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador giratorio. La unión no específica se determina en presencia de 10 nM de ChTX natural. Las suspensiones celulares madre se diluyen para dar una concentración celular final de 2,5 x 10^{5} células/ml en un volumen total de 400 \mul. Al final del periodo de incubación, las muestras se diluyen con 4 ml de disolución de parada enfriada en hielo, que contiene 200 mM de NaCl, 20 mM de Hepes (ácido libre), valorado a pH 8,0 con Tris base. Las muestras paralizadas se filtraron a través de filtros de microfibra de vidrio GF/C, que se habían empapado previamente en 0,6% de polietilenimina, y se lavaron dos veces con disolución de parada enfriada en hielo. Se usan muestras por triplicado para cada punto del experimento. La desviación estándar de la media es típicamente menor que 5%. Las diferentes preparaciones celulares pueden producir relaciones en cierto modo diferentes de unión a ^{125}I-ChTX no específica/total. Las disoluciones madre de ChTX se preparan en 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% de seroalbúmina bovina.

Análisis de los datos - Los datos procedentes de experimentos de saturación se someten a análisis de Scatchard, y se realiza una regresión lineal para producir la constante de disociación en el equilibrio (K_{4}) y la concentración máxima del receptor (B_{máx}). Los coeficientes de correlación para estas determinaciones son típicamente mayores que 0,95. Los datos procedentes de los experimentos de competición se analizan mediante el método estándar de Cheng y Prusoff para determinar los valores de K_{i}. La constante de velocidad de disociación (\kappa_{1}) se determina directamente a partir de la gráfica de primer orden de la disociación del ligando frente al tiempo. La constante de velocidad de disociación (\kappa_{1}) se determina a partir de la ecuación k_{1} = k_{obe}([LR]_{c}/([L][LR]_{max})), en la que [L] es la concentración del ligando, [LR]_{c} es la concentración del complejo en el equilibrio, [LR]_{max} es el número máximo de receptores presentes, y k_{obe} es la pendiente de la gráfica de pseudo-primer orden ln ([LR]_{e}/{[L]_{c} - [LR]_{t}}] frente al tiempo. También se determina la velocidad de asociación y disociación de ^{125}I-ChTX midiendo la cinética de la unión a la toxina marcada radiactivamente a diferentes concentraciones del ligando, determinando k_{obe} a cada concentración de toxina a partir de representaciones semilogarítmicas de estos datos, y determinando k_{1} y k_{-1} a partir de la pendiente y la intersección con Y, respectivamente, de la gráfica de k_{obe} frente a la concentración de ChTX.

Se pueden usar ensayos de unión a 125I-ChTX con la presente invención, sustancialmente como se describe por Deutsch. C., et al., J. of Biological Chemistry, 266: nº 6, 3668-3674 (1991).

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Ejemplo IV Búsqueda de base de datos

Se derivó un motivo de poro de canales de potasio accionados por voltaje, SEQ ID NO: 10: PASFWWATITMTTV
GYGDIYP, a partir de hKv2.1, un canal de K relacionado con Shab (Chandy y Gutman, Handbook of Receptors and Channels, Ligand and Voltage-gated Ion Channels, Editado por R. Alan North, CRC Press, Inc., capítulo 1 (1995)). Se usó SEQ ID NO: 10 para averiguar vía una búsqueda tblastn de una base de datos privada sin aclaraciones. Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403 (1990). De esta manera se identificó SEQ ID NO:8 (Fig. 8). Entonces se usó SEQ ID NO:8 como una secuencia de averiguación en una búsqueda blastn frente a la base de datos privada, para identificar SEQ ID NO:9 (Fig. 9) mediante clones que solapan.

Tanto los clones de SEQ ID NO:8 como SEQ ID NO:9 se aislaron de una librería de ADNc de donante masculino o femenino de células mononucleares adherentes. La librería se construyó usando 2 microgramos de poliA ARN aislado de células mononucleares adherentes, que procedieron de un conjunto de donantes masculinos y femeninos. Las células se cultivaron durante 24 horas tras la centrifugación con Ficoll Hypaque. La síntesis de ADNc se inició usando un cebador de NotI-oligo(dT). El ADNc bicatenario se hizo romo, se ligó a adaptadores EcoRI, se digirió con NotI, se seleccionó por tamaños, y se clonó en los sitios NotI y EcoRI del vector pSPORT. Los clones de SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9 se secuenciaron (secuenciación de ciclo terminador con colorante ABI PRISM™, en un secuenciador automatizado ABI PRISM™ 377). SEQ ID NO:8 es 384 pb más corto que SEQ ID NO:9, y son idénticas en todo menos en el extremo 5', en el que difieren en cincuenta y cinco (55) nucleótidos. Este signo sugiere la existencia de una variante de corte y empalme alternativa del gen natural. Se usó SEQ ID NO:9 para identificar clone SEQ ID NO: de longitud completa descrito aquí, identificando una librería de ADNc de ganglios linfáticos humanos, como se describe más abajo.

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Ejemplo V Identificación de librería de ADNc

Se usó una librería de ADNc lambda gt 10 de ganglios linfáticos humanos, cebada con oligo-dT más al azar, procedente de ARNm obtenido de ganglios linfáticos completos de 6 donantes caucásicos masculinos/femeninos, de edades entre 26-29.

Clontech Labortatories, Palo Alto, CA (Cat # HL5000a: Lot # 46005). Se siguió la metodología estándar como se describe en el manual de protocolo de la Librería Lambda de Clonetech (PT1010-1).

Identificación primaria

Se colocaron en placas alrededor de 30.000 unidades formadoras de placas (pfu) del fago lambda sobre placas de 150 mm que contienen agar LB + 10 mM de MgSO4+ 200 ul de un cultivo nocturno de la cepa C600 Hfi del hospedante bacteriano de E. coli. Se obtuvieron veinte de tales placas, un total de 600.000 placas para la identificación primaria.

Las placas se invirtieron y se incubaron a 37ºC toda la noche. Los diámetros de las placas empezaron a entrar en contacto entre sí. Las placas se congelaron durante 1 hora.

Se marcó con un lápiz un filtro de membrana de nailon de 150 mm (Amersham), y se colocó sobre una placa de agarosa LB que contiene las placas. El filtro se marcó adicionalmente en 3 localizaciones periféricas asimétricas punteando el filtro en el agar con una aguja de calibre 16. El fondo de la placa que corresponde al orificio se marcó con un marcador. Después de 1 minuto, el filtro se desprendió con cuidado, y se hizo flotar sobre la parte superior de una disolución desnaturalizante de ADN (1,5 M de NaCl, 0,5 M de NaOH), con las placas hacia arriba, durante 30 segundos. Se retiró el filtro, y se sumergió en disolución neutralizante (1,5 M de NaCl, 0,5 M de Tris-HCl, pH 8) durante 5 minutos, se aclaró en 2x SSC (0,3 M de NaCl, 0,03M de citrato de Na), y se colocó en un papel Whatman 3M para secarlo. El ADN se fijó sobre el filtro mediante reticulación con UV durante 45 segundos. Este procedimiento se repitió para las 20 placas. En segundo lugar, se colocaron filtros por duplicado sobre las placas originales, y se procesaron de forma similar.

Hibridación

Los 40 filtros preparados se prehibridaron en 6X SSPE, 5X de Denhart y 0,25% de SDS y 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón, durante 4 horas a 42ºC en un agitador con un baño de agua.

Sonda para la identificación de la librería

Los cebadores se diseñaron basándose en SEQ ID NO:9 para generar una sonda vía PCR. Las secuencias del cebador usadas fueron: 5' (directo) que corresponde a los nucleótidos 658-676 de SEQ ID NO: 1, y 5' (inversa) que corresponde a los nucleótidos 1643-1661 de SEQ ID NO: 1. La secuencia diana se amplificó a partir de 1 ng de plásmido de SEQ ID NO:9 (en el vector pSport 1, Life Technologies, Gaithersburg, MD) en 50 \mul de reacción, usando polimerasa Advantage™ KlenTaq (Clontech # 8417-1, lote 7020348) según las recomendaciones del fabricante. Se emplearon parámetros de ciclación según las condiciones del kit de Clontech Marathon-Ready (PCR de tipo "touchdown", con extensiones de tres minutos). El producto de ácido nucleico diana se purificó usando el kit de purificación de PCR Qiaquick de Qiagen, cat # 28104), según el protocolo del fabricante, y se usó subsiguientemente para identificar la librería de ADNc de ganglios linfáticos humanos. La sonda se marcó radiactivamente usando ^{32}P-dCTP (Pharmacia Inc., Piscataway. NJ, cat# 27-9240 B).

La sonda marcada radiactivamente se añadió a la mezcla de prehibridación que contiene los filtros, y se dejó hibridar a 42ºC toda la noche. Los filtros se lavaron dos veces en tampón 2 (1 X SSC, 0,5% de SDS) a 65ºC durante 1 hora, se colocaron sobre papel de filtro Whatman, y se expusieron a una película de rayos X toda la noche. Se identificaron treinta y ocho placas positivas. Las placas se recogieron y se eluyeron en 1 ml de tampón de dilución usando una punta de pipeta P1000 de corte.

Identificaciones secundarias y terciarias

De los 38 clones positivos, 12 se escogieron [al azar] para la identificación secundaria. Los clones se colocaron en placas a diluciones de 1:10.000, se hicieron crecer toda la noche, se filtraron sobre filtros de nailon, se desnaturalizaron, se neutralizaron y se sondaron con la sonda SEQ ID NO:9 de 1 Kb, usando el método ECL no radioactivo (Amersham, Inc., Cat# RPN 3001). Se recogieron diez clones positivos (uno de cada placa), y se procesaron para la identificación terciaria como se describe más arriba. Al menos el 80% al 100% de las placas terciarias fueron positivas. Se recogió una placa positiva procedente de cada una de las 10 placas.

Amplificación de insertos de clones lambda

Los 10 insertos de lambda se amplificaron a partir de 1 \mul de sobrenadante de fago en 50 \mul de reacción, usando polimerasa Advantage™ KlenTaq (Clontech # 8417-1, lote 7020348) según las recomendaciones del fabricante, con la adición de 5% de concentración final de DMSO. Los cebadores fueron cebadores vectoriales que corresponden a los nucleótidos 201-231 (directo) y 267-298 (hacia atrás) de \lambdagt10, que rodean el sitio de clonación de EcoRI (Apéndice C. Clontech Lambda Library Protocol Handbook, manual # PT1010-1). Los parámetros de la ciclación se realizaron según el manual del usuario de Clontech Marathon-Ready cDNA (PT1156-1) p. 19, programa 1 (de forma breve, PCR de tipo touchdown con extensiones de tres minutos). El producto se purificó usando el kit de purificación de PCR Qiaquick de Qiagen (cat # 28104) según el protocolo del fabricante. Se secuenciaron cuatro productos de PCR directamente en presencia de DMSO (secuenciación de ciclo terminador con colorante ABI PRISM™, en un secuenciador automatizado ABI PRISM™ 377). Se identificó un clon que contenía el ADNc de longitud completa: SEQ ID NO: 1.

Ejemplo VI Transferencias Northern

A fin de analizar la distribución de tejidos y el tamaño de los transcritos que corresponden a SEQ ID NO:1, se realizaron análisis de transferencia Northern usando dos sondas separadas. Se usaron transferencias de ARNm prefabricadas de Clontech que contenían aproximadamente 2 ug de poliA + ARN por línea.

La sonda I se generó digiriendo SEQ ID NO:8 (en pSport1, Life Technologies) con las enzimas de restricción PstI y ScaI, según las recomendaciones del fabricante (Promega), y aislando en gel el fragmento de 444 pb usando técnicas de biología molecular estándares. Este fragmento corresponde a 3' UTR, nucleótidos 1716-2163 de SEQ ID NO: 1, un área que concuerda perfectamente entre SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9. El fragmento de restricción se purificó a partir de agarosa usando el kit de extracción en gel Qiaquick de Qiagen, según las recomendaciones del fabricante, y se cuantificó mediante medida de la DO a 260 nm. Se marcaron veinte ng de fragmento usando \alpha^{32}P-dCTP (Dupont NEN) y las perlas de marcado Ready-To-Go™ de Pharmacia (-dCTP) (cat # 27-9240-01), según las recomendaciones del fabricante. El producto marcado se purificó a partir de nucleótido radioactivo no incorporado, usando microcolumnas de Pharmacia ProbeQuant™ G-50 (cat # 27-5335-01), según las recomendaciones del fabricante.

Se usaron veinte ng (17 x 10^{6} cpm) de fragmento de restricción marcado, para sondar las transferencias Northern de múltiples tejidos de Clontech (catálogo # 7760-1 y 7759-1), y una transferencia preparada (descrita más arriba) según las recomendaciones de Clontech (Manual del Usuario #PT1200-1). Las transferencias se prehibridaron durante 45 minutos a 68ºC en disolución ExpressHyb™ de Clontech (cat # 8015-1). La sonda desnaturalizada se añadió a 10 ml de ExpressHyb™ reciente, calentada previamente. Esto sustituyó a la disolución de la prehibridación durante 1,5 horas a 68ºC. Las transferencias se lavaron tres veces, diez minutos cada una, en 2X SSC + 0,1% de SDS a temperatura ambiente, seguido de dos lavados, veinte minutos cada uno, en 0,1X SSC + 0,1% de SDS a 50ºC. Las transferencias se expusieron a una película toda la noche, usando pantallas intensificadoras.

La sonda 2 se generó mediante PCR usando los cebadores: 5' (directo) que corresponde a SEQ ID NO: nucleótidos 658-676, y 5' (inverso) que corresponde SEQ ID NO: nucleótidos 1079-1098. El producto de 440 pb es único para el clon de la SEQ ID NO:9, excepto para la secuencia del cebador inverso, que se encontró también en el clon de SEQ ID NO:8. Los reactivos de PCR, el molde, y las condiciones de ciclamiento fueron las mismas que los usados para generar la sonda de la librería de ADNc, excepto que los tiempos de extensión fueron 1,5 minutos. El producto se purificó de la misma manera que la sonda de la librería. Se marcaron cuarenta ng de la sonda 2 de Northern exactamente como la sonda 1 de Northern, y se usaron para identificar las Northern de múltiples tejidos de Clontech como se describe más arriba para la sonda 1 de Northern.

Ejemplo VII Transferencia Northern II

Puesto que se sabe que los canales de potasio activados por calcio están regulados tremendamente al alza con la activación de células T (por ejemplo, Grissmer, et al., J. Gen. Physiol. 102:601 (1993)), se determinó el patrón de expresión de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO:7) en linfocitos T de sangre periférica humana, en descanso frente a activados.

Se aislaron células mononucleares a partir de sangre completa (obtenida de donantes sanos) en gradientes de densidad Ficoll-Hypaque como en Current Protocols in Immunology, vol. 1, ed. por John E. Coligan, et al., John Wiley and Sons. (1996). Los glóbulos rojos se eliminaron mediante lisis hipotónica durante 45 segundos en 0,2% de disolución salina, seguido de un volumen igual de 1,6% de disolución salina para devolver a la disolución salina a la concentración fisiológica. Después de un lavado adicional en disolución salina equilibrada de Hank (Life Technologies cat # 14175-095), las poblaciones de CD14+ (monocito y macrófago) y CD19+ (células B) se eliminaron usando Dynal's Dynabeads® M450 Pan-B (CD19, cat # 111.03) y M450 CD 14 (cat # 111.11), según el protocolo estándar de Dynal. Las células que quedan fueron 80-90% de células T según se evaluó mediante análisis FACS.

Las células T se cultivaron toda la noche a 37ºC, 5% CO_{2}, en medio RPMI 1640 completo (RPMI 1640, Life Technologies, cat # 11875-093, que contiene: 10% de suero fetal bovino, Life Technologies, cat # 26140-087, inactivado por calor 30 minutos a 56ºC; 1X penicilina/estreptomicina, Life Technologies, cat # 15140-122). Las células se activaron entonces con una concentración final de 10 \mug/ml de fitohemaglutinina (PHA-P, Sigma cat # L9132) en RPMI completo durante 48-72 horas a 37ºC, 5% CO_{2}. Se aisló ARN mensajero usando el kit FastTrack® 2.0 de Invitrogen (cat # K1593-02). Se hicieron pasar 2,8 \mug de cada ARNm sobre un 1% gel de agarosa/formaldehído/formamida según Sambrook et al., Molecular Cloning Lab Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Press (1989), section 7:43, con 3 \mug de ARN de patrón de escala como marcadores de tamaño (Life Technologies, cat # 15620-016). El ARN se transfirió toda la noche a una membrana de nailon cargada positivamente (Hybond™-N+, Amersham # RPN203B), según el protocolo estándar de Amersham, y entonces se retículo mediante UV a la membrana usando el Stratalinker de Stratagene en el modo automático.

Ejemplo VIII PCR de SEQ ID NO:1 procedente de diversos ADNc humanos de origen hematopoyético

Se determina que el mensaje de SEQ ID NO: I (SEQ ID NO:7) está presente en otras células de origen hematopoyético mediante PCR con ADNc aislados de diferentes estirpes celulares de origen hematopoyético.

El producto diana se amplificó a partir de 2-2,5 ng de ARNm transcritos de forma inversa, en 20 \mul de reacción usando polimerasa Advantage™ KlenTaq (Clontech # 8417-1, lot 7020348) según las recomendaciones del fabricante. Las secuencias del conjunto 1 de cebadores son: 5' (directo) que corresponden a SEQ ID NO: nucleótidos 1462-1479, y 5' (inversa) que corresponden a SEQ ID NO: I nucleótidos 1904-1922. El conjunto 2 de cebadores fue el mimo conjunto usado para generar sonda para la identificación de la librería de ADNc. Las reacciones del conjunto 2 de cebadores incluyeron DMSO a una concentración final de 5%. Los parámetros de la ciclación siguieron el Manual del Usuario de Clontech Marathon-Ready cDNA User Manual (PT1156-1) p. 19, programa 1 (de forma breve, una PCR de tipo "touchdown" con extensiones de 1,5-2 minutos). Se analizaron 10 \mul de cada reacción en un gel de agarosa al 1% que contiene 0,5 \mug/ml de concentración final de bromuro de etidio en tampón de TAE como en Sambrook et al., Molecular Cloning Lab Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press (1989), usando 600 ng de ADN de patrón de escala de 1 kb como marcadores (Life Technologies, cat # 15615-016).

Ejemplo IX SEQ ID NO:7

Identificación de la librería: Se usó un fragmento marcado con ^{32}P-dCTP, procedente de un clon (que corresponde a las posiciones 658-1661 de SEQ ID NO:7), como sonda para identificar \sim 600.000 placas recombinantes procedentes de una librería de ADNc de lambda gt10 de ganglios linfáticos humanos (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Las hibridaciones se realizaron a 42ºC toda la noche. Los filtros se lavaron dos veces en 1X SSC, 0,5% de SDS a 65ºC durante 1 hora, y se expusieron a una película de rayos X toda la noche. De los 38 clones doblemente positivos, 10 se sometieron a dos rondas de purificación de placas, y nueva identificación. Los insertos se amplificaron usando cebadores específicos de lambda, y los amplicones se secuenciaron directamente mediante secuenciación automatizada como antes. Seis clones tuvieron la información de secuencia SEQ ID NO:7, y tres fueron de longitud completa. Un clon de longitud completa se subclonó y secuenció totalmente en ambas direcciones, y se usó para la expresión subsiguiente de los constructos.

El análisis mediante ordenador de la secuencia estructural se realizó usando un programa de ordenador Lasergene (DNAstar. Inc, Madison. WI). Los alineamientos con otras secuencias de canales de potasio se realizaron usando el algoritmo CLUSTAL (programa Megalign, Lasergene), y estos se utilizaron para crear un dendrograma. La penalización del salto y la penalización de la longitud del salto fueron 10 en cada caso. Las gráficas de hidropatía estuvieron de acuerdo con los criterios de Kyte-Doolittle, promediando a lo largo de un ventana de 9 restos (Protean program. Lasergene). Los sitios de modificación postraduccionales se identificaron usando búsquedas de patrones dentro del programa Protean (Lasergene). Los patrones se derivaron de la base de datos Prosite, y el umbral para el emparejamiento fue de 100 por cien.

Ejemplo X Transfecciones transitorias

Se clonó un fragmento SmaI/ScaI de \sim1,3 Kb que contiene la región codificante (nucleótidos 390-1718 de SEQ ID NO:7 y que contiene toda la secuencia para SEQ ID NO:2) en el vector pcDNA3 (Invitrogen) en el sitio EcoRV. Esta estrategia de clonación introdujo una metionina adicional y dos aminoácidos (G, A) en dirección 5' y en el marco con la metionina iniciadora auténtica. Se transfectaron aproximadamente 3X10^{5} células HEK 293 (ATCC, Rockville, MD) con 5 \mug del nuevo gen en el vector pcDNA3, junto con 1 \mug de proteína verde fluorescente (GFP) en el vector pEGFP-C 1 (Clontech), usando el kit de transfección LipoTAXI™ (Stratagene, La Jolla. CA) según las instrucciones del fabricante. Las corrientes se registraron 24-72 horas más tarde. La GFP se usó para seguir la pista de las células fluorescentes para el pinzamiento zonal.

Ejemplo XI Localización cromosómica del nuevo gen

Se usaron dos (2) ng de ADN genómico humano (Sigma #D-4642 lote 41019) para amplificar un fragmento de PCR de ADN genómico de 2 Kb en 20 \mul de reacción usando 1X polimerasa Advantage KlenTaq de Clontech en 1X tampón (Clontech # 8417-1) y 200 \muM dNTPs (concentración final) más 0,2 \muM de cada cebador (concentración final). El cebador directo corresponde a los nucleótidos 1462-1479 de SEQ ID NO: 7; el cebador inverso corresponde a los nucleótidos 1904-1922 de SEQ ID NO: 7. Los parámetros de la ciclación fueron los siguientes: un ciclo de 94ºC, 1 min. 30 s; cinco ciclos de 94ºC, 30 s, 72ºC, 3 min.; cinco ciclos de 94ºC, 30 s, 70ºC, 3 min.; veinticinco ciclos de 94ºC, 30 s, 68ºC, 3 min.

El producto de 2 kb obtenido a partir de la reacción de PCR anterior se subclonó en pT7Blue (Novagen # 69820-1). Dos clones se secuenciaron con cebadores específicos de vectores. Los cebadores de la PCR (cebador directo: 5' GTG
GACATCTCCAAGGTACTAGGA 3' (SEQ ID NO:11) y cebador inverso: 5' TTTACTGACAGGCTGTGTGTGCCA 3' (SEQ ID NO:12)) se diseñaron a partir de la secuencia genómica de 2 Kb descrita más arriba, para amplificar de forma reproducible un único producto de 139 pb a partir de 25 ng de ADN genómico vía la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bajo las siguientes condiciones: 2 mM de MgCl_{2}, 100 \muM dNTPs, y 1 \muM de cada cebador, para 35 ciclos de 94ºC durante 30 s, 65ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s. Estos cebadores y condiciones se usaron subsiguientemente para identificar la librería BAC de "Research Genetics" de una manera tridimensional mediante PCR (Bentley, et al., 1992), usando 10 ng de ADN de conjunto en un volumen de reacción de 50 \mul. Se identificó BAC 107 D 14 y se organizó en tiras para dar colonias individuales después de un crecimiento durante toda la noche a 37ºC en placas de LB-agar + cloranfenicol (12,5 \mug/ml). Las colonias se identificaron mediante PCR (Huxley, et al., 1990) para confirmar que se había aislado el BAC correcto. Una de las colonias se usó como un inóculo para 500 ml de LB + cloranfenicol, que se hizo crecer a 37ºC toda la noche con agitación a 200 rpm. Este cultivo se usó para preparar ADN mediante el método de lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979), y se purificó mediante bandas sobre cloruro de cesio. El ADN se usó como una
sonda para la localización cromosómica mediante hibridación in situ fluorescente (Trask B, 1995), descrita más abajo.

Se prepararon diseminaciones de cromosomas a partir de linfocitos humanos estimulados con PHA, que se habían cultivado en medio suplementado con BrdU (200 mg/ml), durante 16 horas, y en medio libre de BrdU durante otras 5 horas, antes del tratamiento con colcemida. Los portaobjetos se tiñeron durante 30 minutos a temperatura ambiente en Hoecsht 33258 (5 mg/ml en 2xSSC), después se colocaron boca abajo en 2xSSC en un transiluminador de UV durante 30 minutos, y se deshidrataron en gradiente de etanol. Los cromosomas se desnaturalizaron mediante incubación en 70% de formamida, 2xSSC a 75ºC durante 5 minutos.

El ADN de BAC 107d14 se biotiniló mediante traducción de corte usando el kit Bionick según las instrucciones del fabricante (BRL). Se disolvieron 200 ng de BAC marcado y 10 mg de Cot-1 DNA (BRL) en 20 ml de tampón de hibridación (50% de formamida, 2xSSC, 10% de sulfato de dextrano), se desnaturalizaron, y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos antes de hibridarlos a los cromosomas desnaturalizados a 37ºC durante 72 horas. Los portaobjetos se lavaron durante 3x5 minutos en 50% de formamida/2xSSC, 2xSSC a 42ºC y 0,1 xSSC a 60ºC. Los portaobjetos se bloquearon durante una hora mediante incubación a temperatura ambiente en 4xSSC/ 5% de leche seca /0,05% de Triton X-100. La detección de la sonda se realizó con FITC-avidina (5 mg/ml), con una ronda de amplificación de señal usando anti-avidina biotinilada (5 mg/ml) (Vector Laboratories) en 4xSSC/ 5% de leche seca/ 0,05% de Triton X-100. Los lavados entre tratamientos fueron 3x 3 minutos en 4xSSC/0,05% de Triton X-100. Los portaobjetos se contratiñeron con 0,1 mg/ml de DAPI, y se analizaron en un microscopio Axioskop (Zeiss) ajustado con una cámara Nu200 CCD (Photometrics) y un programa de ordenador SmartCapture (Digital Scientific).

Para la colonización de BAC 107d14 y YAC 798E5, se marcó ADN (levadura total más YAC) con digoxigenina dUTP mediante traducción de corte (kit de Boehringer Mannheim). Se añadieron 300 mg de ADN marcado y 3 mg de ADN Cot-1 a la mezcla anterior, y se procesaron como antes: la detección del BAC fue como se describe antes, pero con rodamina-avidina. La detección de YAC usó 1 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti digoxigenina (Boehringer Mannheim), seguido de 1/100 de conjugado de FITC anti-IgG de ratón, seguido de 1/500 de conjugado de FITC anti-IgG de conejo (Sigma). La señal fue visible al ojo. Las señales pareadas se obtuvieron en el cromosoma 19 con BAC 107d14. La colocalización de BAC 107d14 y YAC 798E5 dio señales sobrepuestas entre sí, indicando una localización en 19q 13.1-13.2.

Referencias para la localización cromosómica

Birnboim, H.C. y Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7 1513.

Huxley, C., Green, E.D., y Dunham, I. (1990). Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends Genet. 6 236.

Bentley, D.R., Todd, C., Collins, J., Holland, J., Dunham, I., Hassock, S., Bankier, A. y Gianelli, F. (1992). The development and application of automated gridding for efficient screening of yeast and bacterial ordered libraries. Genomics 12, 534 - 541.

Trask, B (1995) en Genome Analysis: A laboratorory manual. Eds. B. Birren, E. Green y R. Myers, CSHL Press Inc.

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Ejemplo XII Registro del pinzamiento zonal

Las corrientes se registraron con un amplificador Axopatch 200A (Axon Instr., Foster City, CA) usando la configuración convencional de célula completa, de unión de células, y de interior-exterior. Christian, E.P., et al., J. Membr. Biol., 150:63 (1996). Las células HEK transfectadas se seleccionaron para el registro mediante la presencia de un marcado con GFP durante la iluminación epifluorescente con una fuente de luz de arco de mercurio Nikon y un bloque de filtro de FITC (excitación: 485/22 nm, emisión: 505 nm). Se fabricaron pipetas de vidrio de borosilicato de paredes delgadas, se trataron con Sylgard y se pulieron al fuego hasta una resistencia DC de 2 - 8 M\Omega. La resistencia de los sellos del parche fue de > 10 G\Omega. Los potenciales de unión de líquidos (14) se corrigieron para todos los experimentos examinando potenciales inversos. Se usó una compensación de resistencia en serie de >70% en todos los experimentos en los que la corriente mínima fue >0,5 nA. Se implementaron protocolos de pinzamiento zonal, y la adquisición se datos se realizó con el programa de ordenador pClamp 6.0 (Axon Instr.). Las corrientes se filtraron con pasada baja a (-3 db a 1 ó 2 kHz), y después se digitalizaron a 3-8 kHz como archivos de ordenador con un interfaz TL-1 (Scientific Solutions, Solon, OH).

Para la formación de sellos, las células se sumergieron en un baño en disolución de Ringer normal que contiene (en nM) 160 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl_{2}, 5 HEPES y 2 CaCl_{2} (excepto para la formación del parche interior-exterior cortado, en el que la disolución del baño contenía 0 CaCl_{2}) a pH 7,4 (mediante NaOH) y una osmolalidad de \sim325 mOsm (mediante sacarosa). Para el registro de células completas, la disolución de la pipeta contenía (en nM): 160 aspartato de K, 2 MgCl_{2}, 5 HEPES y 1,6 EGTA con 0,8 CaCl_{2} ([Ca^{2+}]_{libre} calculada = 100 nM; programa de ordenador Eqcal, Biosoft Corp, Cambridge, UK), ó 1,6 CaCl_{2} ([Ca^{2+}]_{libre} calculada = 1 \muM) a pH 7,2 (mediante KOH) y una osmolalidad de \sim315 mOsm (mediante sacarosa). Las células se perfusionaron localmente con una disolución que contiene 160 KCl, 2 CaCl_{2} 1 MgCl_{2}, 5 HEPES, y 5 glucosa a pH 7,4 (mediante KOH) y una osmolalidad de \sim325 mOsm. En el experimento de selectividad de K^{+}, el Na^{+} equimolar se sustituyó por K^{+}. Para parches unidos a células, la disolución de pipeta contenía 160 KCl, 2 CaCl_{2}, 1 MgCl_{2}, y 10 HEPES a pH 7,4 (mediante NaOH) y una osmolalidad de -325 mOsm (para la determinación de la conductancia unitaria a [K^{+}]_{0} fisiológica, la pipeta contenía Ringer). Las células se perfusionaron con disolución de Ringer +/- 1 \muM de ionomicina. Para parches de interior-exterior cortados, la disolución de pipeta contenía 160 KCl, 2 CaCl_{2}, 1 MgCl_{2} y 10 HEPES a pH 7,4 (mediante KOH) y una osmolalidad de \sim325 mOsm. La disolución de perfusión local (carra citoplásmica) contenía 160 aspartato de K, 2 MgCl_{2}, 5 HEPES y 10 EGTA a pH 7,2 (mediante KOH) y una osmolalidad de -329 mOsm con CaCl_{2} añadido a concentraciones que produjeron la [Ca^{2+}]_{libre} calculada especificada. Las disoluciones de perfusión se suministraron localmente usando un sistema de válvulas de solenoides (13). Las toxinas se adquirieron de Sigma Chemicals (St. Louis. MO), y se diluyeron en una disolución que contiene 0,01% de seroalbúmina bovina.

Ejemplo XIII Protocolo de transfección de CaPO4 para células HEK293 Reactivos

Prepárese 1) 2 x HBS
Reactivo	Final	gramos, seco
HEPES pH 7,05	50 mM	5,0
KCl	10 mM	0,37
dextrosa	12 mM	1,0
NaCl	280 mM	8,0
NaHPO4 (MW 141,96)	1,5 mM	0,1065 g
500 ml total, pH hasta 7,05 (Nota: el pH es importante).
2) CaCl_{2}	2M	29,4 g
\underline{100 \ ml \ total}

Las disoluciones madre se pueden congelar a -20ºC. Una vez abiertas, las disoluciones se pueden almacenar a 4ºC durante 6 semanas.

Método (para cada placa T75):

1. Colóquense las células en placas 2-3 días antes de la transfección, para asegurar una confluencia de \sim75% inmediatamente antes de la transfección. Esto es realmente importante, es vital que existan aún algunos espacios en la placa antes de comenzar.

2. En el día de la transfección, prepárese ADN en agua hasta un volumen final de 876 ml en un tubo Falcon de 15 ml (poliestireno). Se usaron 20 mg de plásmido hKCa4 (pcDNA3 o pGEN IRES-neo) y 10 \mug de pEGFP-C1.

3. Añádanse 124 ml de 2M CaC12 a ADN, y mézclese.

4. Elimínense los medios de las células con mucho cuidado.

5. Añádanse 8 ml de medio reciente, muy lentamente, por el lado de la placa, para asegurar que las células no se descoloquen.

6. Añádase cloroquina hasta una concentración final de 25 mM (0,1 ml de 100x madre (2,5 mM)), y girar suavemente.

7. Añádase 1 ml de 2X HBS sobre ADN gota a gota mientras se burbujea (o mézclese la disolución) durante 30 s.

8. Inmediatamente, añádase la mezcla sobre células gota a gota cubriendo toda la placa, y déjese a 37ºC durante 6-10 horas (habitualmente 6).

9. Nota: Déjese la cloroquina sobre las células durante un tiempo MÁX. de 10 horas.

10. Al final del día, sustitúyase con medio reciente, y nuevamente a la mañana siguiente. Las células deberían de estar listas para comprobar la GFP en ese momento, y hasta 2 días después de la transfección.

Para estables: en el día 4, (48 horas después del último cambio de medio), repártanse las células en placas de 150 mm (o en T150 para episómicas, si no se van a clonar colonias individuales) a \sim 1:10 en medio completo.

En el día 5, (24 horas después de repartirlas), colóquense las células en medio selectivo; HEK293 tómese 1 mg/ml de G418 y 250 \mug/ml de higromicina B.

Ejemplo XIV Transfección de células cho-k1 con Cellfectin

1. Divídanse las células 2-3 días antes del tiempo, de forma que tengan una confluencia de 50-70%, en un matraz T75 (por ejemplo, háganse crecer células CHO-K1 en F12 de Ham más 10% de FBS, sin antibióticos).

2. Colóquense 30 \mug de ADN hKCa4 (ya sea pGEN IRES-neo o pcDNA3) más 15 \mug de pEGFP-Cl en un tubo Falcon de 15 ml (poliestireno).

3. Añádanse 2 ml de medio sin suero ni antibióticos (en este caso F12 de Ham (denominado SFM (por brevedad)).

4. En un tubo de poliestireno separado, mézclense 2 ml de SFM con reactivo Cellfectin (50 \muL por T75 (LTI# 10362-010).*

5. Combínense los contenidos de los dos tubos, mézclense, y déjense reposar a temperatura ambiente 15 minutos.

6. Lávense las células en SFM, y después añádanse 5 ml de SFM por T75.

7. Añádanse 11 ml de SFM a la mezcla de ADN/Cellfectin (llevando el volumen hasta 15 ml).

8. Inmediatamente echar encima las mezcla de ADN/Cellfectin sobre las células.

9. Incúbese a 37ºC en 5% CO_{2} durante 5 horas.

10. Elimínese la mezcla de ADN/Cellfectin, y sustitúyase con F12 de Ham más 10% de FBS.

11. Al siguiente días cámbiese el medio, y compruébese EGFP.

Para estables: en el día 4, (48 horas después del último cambio de medio), repártanse las células en placas de 150 mm (o en T150 para episómicas, si no se requiere la clonación de colonias individuales) a \sim 1:10 en medio completo.

En el día 5, (24 horas después de repartirlas), colóquense las células en medio selectivo; CHO-K1 tómese 1 mg/ml de G418 y 300 \mug/ml de higromicina B.

Ejemplo XV Sistema de expresión de baculovirus para hKCa4 (SEQ ID NO:2)

Se construyó un virus recombinante que contiene la región codificante de hKCa4, usando el sistema de expresión de baculovirus Bac-To-Bac (Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat. # 10359-016). La región codificante de hKCa4 se subclonó en el vector donante pFastBac 1 escindiendo el constructo pcDNA3 (descrito en el documento JBC 272 (52): 32723-32726) con los sitios EcoRI (5') y XhoI (3'), liberando el inserto de 1356 pb, y se clonó en estos sitios dentro de pFastBac1. Esta estrategia retiene la metionina adicional y dos aminoácidos (G, A) en dirección 5' y dentro del marco con la metionina iniciadora auténtica. La transposición se realizó como se detalla en el protocolo de Life Technologies, Gaithersburg, MD, con las siguientes notas: las placas de transformación se incubaron 48 horas a 37ºC para que se produjera la transposición. Las placas de colonias vueltas a poner en tiras también se incubaron 48 horas a 37ºC para asegurar un fenotipo blanco. Para transfectar células Sf9, se usaron 8 \mul de ADN bacmid miniprep y 5 \mul de Cellfectin. Las mezclas de ADN más Cellfectin se dejaron incubar 20 minutos antes de aplicarlas a las
células.

Se obtuvieron dos lotes de pasada del virus infectando 3 X 10^{6} células Sf9 en un matraz T25 con 100 \muL del virus de una pasada (el sobrenadante de la transfección producido antes), en un volumen total de 5 ml. La infección se dejó transcurrir durante tres días a 27ºC en una cámara humidificada, y se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares. Este virus de dos pasadas se cuantificó usando el kit de titulación rápida de baculovirus BacPAK (Clontech, Palo Alto, CA, cat # K1599-1), o mediante un ensayo de placas convencional (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Baculovirus Expression Training course manual, 3.54-3.58).

Se generaron lotes víricos de tres pasadas de título elevado, a partir de dos virus de pasada, infectando células Sf9 en medio Sf900II en suspensión a una MOI de 0,1 y a una densidad celular de 4,0 X 10^{6}/ml. Después de dejar que el virus se adhiriese a las células durante una hora a temperatura ambiente con agitación constante, las células se recolectaron y se resuspendieron en medio reciente, hasta una densidad celular de 1,0 X 10^{6}/ml. La infección se dejó continuar durante dos días en suspensión a 27ºC y 110 rpm. El sobrenadante (virus de tres pasadas) se recolectó y se cuantificó del mismo modo que para el virus de dos pasadas. Las infecciones para la producción de proteína se realizaron a diversos MOI y tiempos de recogida, como afirma el manual Bac-To-Bac. Las células se examinaron mediante el análisis de pinzamiento zonal y/o unión a ^{125}I-caribdotoxina (CTX).

Ejemplo XVI Ensayo de proximidad por centelleo (SPA)

Este método se ha aplicado con éxito a ensayos de unión a receptores, inmovilizando receptores directamente sobre perlas de SPA vía un número de métodos de acoplamiento (Bosworth N y Towers P, Nature, 342: 167-168, 1989; Undenfriend S et. al., Anal. Biochem. 161: 494-500. 1987). Las perlas usadas más habitualmente son aquellas acopladas a aglutinina de germen de trigo (WGA), que se une a restos de N-acetil-b-D-glucosamina en glicolípidos y glicoproteías de la membrana. (Nagata Y y Burger MM, JBC, 249: 3116-3122, 1974). Una vez inmovilizado, el receptor está suficientemente cerca de la perla de forma que, siempre que un ligando radiomarcado adecuadamente se una al receptor, estará en estrecha proximidad suficiente para estimular a la perla a que emita luz. Cualquier radioligando no unido está demasiado distante de la perla para transferir energía, y pasa desapercibido. Por lo tanto, la perla sólo detecta la población de moléculas de ligando que están unidas al receptor. La discriminación de la unió por proximidad significa que no se requiere ninguna separación del ligando unido y libre, como en los métodos tradicionales. El SPA es una técnica extremadamente poderosa cuando se requiere analizar simultáneamente un gran número de muestras, como es el caso durante un ensayo de alto rendimiento en busca de compuestos (News, 27: Noviembre 1996, Amersham Life Sciences).

Todos los reactivos para el ensayo de SPA (excepto para las disoluciones tampón) se obtuvieron de Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL.

Tampón de ensayo:	Tampón de lavado:
5 mM de NaCl	200 mM de NaCl
5 mM de KCl	20 mM de HEPES
10 mM de HEPES	pH 8,0 con Tris base
6 mM de glucosa
llevar hasta pH 8,4 con TRIS base

realización del ensayo en placas de microtitulación de SPA de 96 pocillos

0,5-3 mg por pocillo de perlas de SPA revestidas con aglutinina de germen de trigo (Amersham, Cat# RPNQ0001).

5-30 ug de membranas de células HEK de KCa4 por pocillo

50 pM de 125I caribdotoxina (CTX, NEN, Boston, MA)

no específica definida con 50 nM de caribdotoxina fría (Bachem, King of Prussia, PA).

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo:

50 ul de perlas + membranas

50 ul de tampón de ensayo

50 ul de compuesto experimental o no específico o tampón (define la unión total)

50 ul de ligando

Se dejó preincubar a las membranas con perlas de SPA durante 1-2 horas; las membranas no unidas se lavaron de las perlas mediante centrifugación.

El tampón de ensayo se añadió a cada pocillo, seguido de los compuestos, las membranas de las perlas y el ligando.

El ensayo se incuba con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se deja que las perlas sedimenten toda la noche, y después la placa se cuenta en un contador de centelleo Top Count (Packard, Meriden. CT).

Ejemplo XVII Estirpe de células T anérgica

3926 alloT es una de un número de estirpes de células T aloreactivas específicas de HLA-DR4Dw4, que se pueden producir según la metodología estándar. Se mezclaron veinticinco millones de células mononucleares de sangre periférica, procedente de un donante que no tiene el alotipo HLA-DR4, con el mismo número de células mononucleares de sangre irradiada, procedente de un donante que tiene el alotipo HLA-DR4, en 5 ml de medio de crecimiento de células RPMI 1640 suplementado con glutamina y 5% de suero humano. Después de 14 días de cultivo, las células viables se aislaron mediante centrifugación sobre un gradiente de densidad Lymphopaque, y se añadieron 5 millones de células a otros veinticinco millones de células mononucleares de sangre irradiada, procedente del mismo donante HLA-DR4Dw4-positivo. En el día 4 se añadió hIL-2 recombinante (2 Unidades/ml), y después cada 3 días.

La estirpe se mantuvo mediante reestimulación periódica y adición de IL-2, como se describe. La aloespecificidad por HLA-DR4Dw4 de las estirpes se confirmó demostrando que eran capaces de proliferar en respuesta a células EBV B homozigóticas HLA-DR4Dw4 (estirpe celular JAH) y transfectantes de células L que expresan HLA-DR4Dw4.

Mantenimiento

Se descongeló un vial congelado de la estirpe de células T 3926 procedente del Reino Unido, y se mantuvo en medio RPMI con 10% de FCS y glutamina. Las células se mantuvieron en un protocolo de "estimulación en descanso", estimulándolas con anti-CD3 soluble (2,5 mg/ml catálogo # 30100D más 2,5 mg/ml catálogo #30110D de PharMingen, San Diego, CA) más PBMC humana no tipada, tratada con mitomicina C, para proporcionar la señal coestimulante. La PBMC también actuaría reticulando el CD3 soluble en el TCR. Después de dos días, se añadieron a las células 5 unidades/ml de IL-2 recombinante humana (Boehringer Mannheim. Indianapolis, IN). Durante esta etapa de estimulación, se observó que las células T se agrupaban en racimos y proliferaban. Las células T usadas en los experimentos se dejaron reposar al menos una semana después de la adición de IL-2, y se separaron del desecho celular y de la PBMC muerta, mediante centrifugación con gradiente de densidad Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO).

Condiciones de pretratamiento para células en descanso, activadas y anérgicas

Se incubaron alocélulas T 3926 purificadas (4 x 105 células/pocillo) en placas de 24 pocillos que no están revestidas (células "en descanso"), o que están revestidas con anti-CD3 más anti-CD28 (2,5 mg/ml de cada uno de los dos anticuerpos anti-CD3 más 20 mg/ml catálogo # 33740D- "dos señales") o, a fin de inducir anergia, con 2,5 mg/ml de cada uno de los dos anticuerpos humanos anti-CD3 en una placa de 6 pocillos ("una señal"). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS. Las células se lavaron de los anticuerpos después de un día, y se dejaron reposar en pocillos recientes durante dos días más (total de tres días después de la exposición a los anticuerpos), en cuyo momento las células T se pinzaron zonalmente para determinar los canales de KCa como se describe aquí en otra parte de este documento.

Ejemplo XVIII Clonación de KCa4 murino

Se inició un esfuerzo para clonar un gen de KCa4 de roedor, debido a que hay varios modelos de roedores de autoinmunidad disponibles, y fue importante verificar que los genes de roedores son esencialmente los mismos que el gen humano, para estos modelos de animales que se van a usar. Una primera publicación ya había demostrado, mediante electrofisiología, que el canal de KCa en linfocitos de roedores se comporta muy similar a su homónimo humano; es bajo en células en reposo, y está regulado tremendamente al alza con la activación linfocítica (Mahaut-Smith y Mason J. Physiol. 1991).

Se usó la secuencia de aminoácidos de KCa4 (SEQ ID NO:3) humana como una secuencia de averiguación en una búsqueda TBLASTN frente a la base de datos embl est. Una EST de ratón, número de acceso W30402, mostró una identidad de 79% con hKCa4 en el término amino (N-term.) (a lo largo de una región de 89 aminoácidos), y una identidad de 63% con hKCa4 en el término carboxi (C-term.) (a lo largo de sólo una región de 20 aminoácidos). La traducción conceptual de la EST dio como resultado un proteína truncada en comparación con la esperada para una subunidad de canal iónico hexitransmembránico, en la que la porción de la molécula que corresponde a la tercera región transmembránica tiene suprimida los últimos 20 aminoácidos. Sin embargo, debido a la elevada homología con la secuencia humana, se diseñaron cebadores en dirección 5' de la metionina de partida putativa, y en dirección 3' del codón de parada putativo al KCa4 de ratón de "longitud completa" de PCR. La secuencia del cebador directo corresponde
a nucleótidos 20-42 de W30402. La secuencia del cebador inverso corresponde a nucleótidos 413-436 de W30402.

Se obtuvo ADNc a partir de la estirpe celular MEL-C88 eritroleucémica de ratón (Deisseroth, A., et al., Cell 15: 55 (1978)). Las células se cultivaron en medio \alphaMEM que contiene 10% desuero fetal bovino, 100 unidades de penicilina y 100 \mug por ml de estreptomicina. Se aisló ARN total usando el kit RNeasy Midi prep de Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, cat. # 75142, y se trató con DNAse I, Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat. # 18068-015, según las instrucciones del fabricante. La síntesis de ADNc se realizó con transcriptasa inversa SuperScript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat. # 18064-014), usando el cebador de síntesis de ADNc Marathon (kit de amplificación de ADNc Marathon, Clontech, Palo Alto, CA, cat. # K 1802-1), según el protocolo de SuperScript II. El ADNc monocatenario se digirió con RNAse H (Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat. # YD1220), y se usó
a \sim1 ng por PCR.

Los productos de mKCa4 se amplificaron a partir del ADNc en reacciones de 25 \mul usando la polimerasa Advantage™ KlenTaq (Clontech, Palo Alto, CA # 8417-1) según las recomendaciones del fabricante, con adición de una concentración final de 5% de DMSO. Los parámetros de ciclación fueron los siguientes: un ciclo a 94ºC durante 1,5 minutos; treinta ciclos de: 94ºC treinta segundos, 65ºC cuarenta y cinco segundos, 68ºC un minuto. Se analizaron diez \mul de cada reacción en un gel de agarosa al 1% que contiene una concentración final de 0.5 \mug/ml de bromuro de etidio en tampón TAE como en Sambrook et al, Molecular Cloning Lab Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press 1989, usando 600 ng de ADN de patrón de escala de 1 kb como marcador (Life Technologies, Gaithersburg, MD. cat # 15615). El resto de los 15 \mul de las reacciones se purificaron usando el kit de purificación de PCR Qiaquick, según las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, cat # 28104), se cuantificaron mediante medidas de densidad óptica a 260 nm, y se sometieron a secuenciación automatizada (secuenciación de ciclo terminador con colorante ABI PRISM™, en un secuenciador automatizado ABI PRISM™ 377).

La secuencia nucleotídica de la región codificante de longitud completa, la secuencia de aminoácidos traducida, y el alineamiento de aminoácidos de las secuencias de KCa4 humana y ortóloga de ratón se muestran en la Fig. 22 (SEQ ID NO: 13), en la Fig. 23 (SEQ ID NO: 14) (homólogo murino (ortólogo de Kca4 humano, SEQ ID NO:3)), y en la Fig. 24, respectivamente.

Ejemplo XIX Aislamiento de microgliocitos y transcritos

Se obtuvo tejido de cerebro fetal humano (fetos de 16 a 22 semanas) comercialmente a partir de la Anatomic Gift Foundation (Woodbine, GA). Los hemisferios cerebrales se colocaron en disolución salina equilibrada de Hank congelada, estéril, libre de calcio y libre de magnesio (HBSS, # 14170-112, Gibco-BRL. Gaithersburg, MD). Las meninges se retiraron con un fórceps estéril, y el tejido se disoció inicialmente mediante trituración repetida a través de pipetas estériles. El tejido se incubó con 0,05% de tripsina/0,53 mM de EDTA (# 25300-054, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y 0,15 mg/ml de ADNasa (# D-5025, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a 37ºC durante 45 minutos con agitación suave. Se añadió 10% de suero fetal bovino (FBS, # 160001-036, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) a la suspensión, para detener la tripsinización. Las células se hicieron pasar entonces a través de una malla de polipropileno de 210 \mum y 149 \mum (# 08-670-188 y # 08-670-189, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), secuencialmente. El filtrado se lavó dos veces y se resuspendió en medio completo [DMEM (con concentración elevada de glucosa, L-glutamina y HEPES), Gibco # 12430-054; 100 U-\mug/ml de penicilina/estreptomicina, Gibco # 15070-030; 10% de FBS, Gibco # 160001-036]. Las células se colocaron en placas a una densidad de 80 millones/75 cm^{2} matraz (# 12-565-52, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Los cultivos se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2} durante 2 semanas (con un cambio medio después de una semana en cultivo, para eliminar el desecho celular). Los cultivos maduros constaron de astrocitos, neuronas, microgliocitos y oligodendrocitos. La población de microgliocitos está enriquecida en el sobrenadante, que se cosechó (los astrocitos y oligodendrocitos se quedan pegados a la placa). Las células se lisaron en tampón RLT (QIAGEN) con 0,01% de b-ME (Sigma Cat.# M7154), y se congelaron a -80ºC hasta el uso. Las células lisadas se descongelaron en hielo, y se procesaron a través de QIAshredder (QIAGEN Cat.# 79654) para homogeneizarlas.

Después se preparó ARN total con el minikit RNeasy (QIAGEN Cat.#74103) según las directrices del fabricante. Las concentración se determinó mediante absorbancia a 260 nm. Se preparó ADNc a partir de 3,2 ug ARN microgliocítico mediante transcripción inversa estándar, usando el kit de transcriptasa inversa SuperScript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD, cat. # 18064-014). La PCR se realizó a una hibridación a 65 grados. Los cebadores específicos de KCa4 humano fueron: cebador directo: posiciones 862-883 de SEQ ID NO:1; y cebador inverso que corresponde a las posiciones 1659-1680 de SEQ ID NO: 1.

Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas preferidas, se debe de entender que la invención, según se reivindica, no debería de estar limitada excesivamente a tales realizaciones específicas. De hecho, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvios para los expertos en biología molecular o campos relacionados, estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

(I) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDO HUMANO DEL CANAL DE POTASIO ACTIVADO POR CALCIO DERIVADO DE GANGLIOS LINFÁTICOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: ZENECA Pharmaceuticals, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1800 Concord Pike

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Wilmington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

STATE: DE

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 19850-5437

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA DE EXPOLTACIÓN: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: FastSEQ para Windows Versión 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: (UK)9714760.7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JUL-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: (UK)9721366.4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-OCT-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Higgins, Patrick H.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 39.709

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: PHM.70235

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 302.886.4889

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 302.886.8221

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2261 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIP DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1284 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 427 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3.

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 561 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

9

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 579 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 551 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2238 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1250 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1624 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ala Ser Phe Trp Trp Ala Thr Ile Thr Met Thr Thr Val Gly Tyr}

\sac{Gly Asp Ile Tyr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGACATCT CCAAGGTACT AGGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTACTGACA GGCTGTGTGT GCCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1381 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 425 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

21

Claims (13)

1. Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID Nº 3.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica comprende la SEQ ID Nº 2.

3. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1.

4. Una molécula antisentido que comprende la secuencia complementaria del polinucleótido según la reivindicación 2.

5. Una célula hospedante aislada, transformada mediante el vector de expresión según la reivindicación 3.

6. Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 3.

7. Un anticuerpo específico del polipéptido según la reivindicación 6.

8. Un método de producción de células que expresan un polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID Nº 3, comprendiendo dicho método cultivar una célula según la reivindicación 5 en condiciones propicias para la expresión de dicho polipéptido.

9. Un método de producción de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: cultivar una célula hospedante según la reivindicación 5 en condiciones propicias para la expresión de dicho polipéptido, y recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo de células hospedantes.

10. Un método de identificación de compuestos que modulan la actividad del polipéptido según la reivindicación 6, que comprende las etapas que consisten en:

(a)

combinar un compuesto de ensayo con el polipéptido según la reivindicación 6, y

(b)

medir un efecto del compuesto de ensayo sobre el polipéptido.

11. Un método de identificación de compuestos que modulan la actividad de un canal de potasio que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3, que comprende las etapas que consisten en:

(a) combinar un compuesto de ensayo modulador de la actividad de un canal de potasio con una célula hospedante que expresa un polipéptido de un canal de potasio que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3, y

(b) medir un efecto del compuesto de ensayo sobre el canal.

12. Una composición para la identificación de una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 7.

13. Un método de detección sistemática de una pluralidad de compuestos para determinar la afinidad de unión con el polipéptido según la reivindicación 6, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en:

(a) suministrar una pluralidad de compuestos;

(b) combinar los compuestos con los polipéptidos según la reivindicación 6 durante un tiempo suficiente para que un compuesto se una al polipéptido; e

(c) identificar los compuestos que se unen al polipéptido.