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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Identifizierung und
Isolierung von neuen, hierin als DNA47361 bezeichneten DNAs, und
die rekombinante Produktion neuer menschlicher (als PRO385 bezeichneter)
Toll-Homologe, für
welche diese DNAs kodieren.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Membrangebundene
Proteine und Rezeptoren können
eine wichtige Rolle bei der Ausbildung, Differenzierung und Erhaltung
vielzelliger Organismen spielen. Das Schicksal vieler individueller
Zellen, z. B. die Vermehrung, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung
mit anderen Zellen ist typischerweise von Informationen bestimmt,
die von anderen Zellen und/oder aus der unmittelbaren Umgebung erhalten
werden. Diese Informationen werden häufig von sekretierten Polypeptiden
(beispielsweise mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen
Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen) übertragen,
die dann wieder von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen
Proteinen erhalten und interpretiert werden. Derartige membrangebundene
Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf
Cytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, an Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligte
Rezeptoren und Zelladhäsionsmoleküle, wie
z. B. Selectine und Integrine. Zum Beispiel wird die Übertragung
von Signalen, die Zellwachstum und Differenzierung regulieren, zum
Teil durch Phosphorylierung verschiedener Zellproteine reguliert.
Proteintyrosinkinasen – Enzyme,
die diesen Prozess katalysieren – können ebenfalls als Wachstumsfaktorrezeptoren
agieren. Beispiele umfassen Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor
und Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor.
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Membrangebundene
Proteine und Rezeptormoleküle
haben verschiedene industrielle Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich als
pharmazeutische und diagnostische Mittel. Rezeptor-Immunoadhäsine können beispielsweise
als therapeutische Mittel eingesetzt werden, um die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung
zu blockieren. Die membrangebundenen Proteine können außerdem für das Screening von potentiellen
Peptid-Inhibitoren oder kleinen Inhibitor-Molekülen der maßgeblichen Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung
eingesetzt werden.
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Es
werden von der Industrie sowie in der Wissenschaft Anstrengungen
unternommen, neue native Rezeptorproteine zu identifizieren. Viele
Anstrengungen konzentrieren sich auf das Screening von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken,
um die kodierenden Sequenzen für
neue Rezeptorproteine zu identifizieren.
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Die
Klonierung des Toll-Gens von Drosophila, eines Prädeterminations-Gens,
das eine zentrale Rolle bei der Etablierung des embryonalen, dorsal-ventralen
Musters spielt, ist von Hashimoto et al., Cell 52, 269–279 (1988)
beschrieben worden. Das Drosophila-Toll-Gen kodiert für ein integrales
Membranprotein mit einer extrazytoplasmatischen Domäne von 803
Aminosäuren
und einer zytoplasmatischen Domäne
von 269 Aminosäuren.
Die extrazytoplasmatische Domäne
weist ein potentielles membrandurchdringendes Segment auf und enthält mehrere
Kopien eines an Leucin reichen Segments, eines Strukturmotivs, das
sich in vielen Transmembranproteinen findet. Das Toll-Protein steuert
die Bildung des dorsal-ventralen Musters in Drosophila-Embryos und
aktiviert den Transkriptionsfaktor Dorsal bei Bindung an seinen
Liganden Spätzle.
(Morisato und Anderson, Cell 76, 677–688 (1994).) In der adulten
Drosophila nimmt der Toll/Dorsal-Signalweg an der gegen Pilze gerichteten
Immunantwort teil. (Lenaitre et al., Cell 86, 973–983 (1996)).
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Ein
menschliches Homolog des Drosophila-Toll-Proteins ist von Medzhitov
et al., Nature 388, 394–397 (1997)
beschrieben worden. Dieses menschliche Toll ist wie das Drosophila-Toll
ein Transmembranprotein des Typs I mit einer extrazellulären Domäne bestehend
aus 21 tandemwiederholten, an Leucin reichen Motiven (an Leucin
reiche Region – LRR),
die durch eine Nicht-LRR-Region voneinander getrennt sind, und einer
zytoplasmatischen Domäne,
die zur zytoplasmatischen Domäne
des menschlichen Interleukin-1-(IL-1-)Rezeptors homolog ist. Eine
konstitutiv aktive Mutante des menschlichen, in menschliche Zelllinien
transfizierten Tolls erwies sich als fähig, die Aktivierung von NF-κB und die
Expression von NF-κB-gesteuerten
Genen für
die Entzündungs-Cytokine
IL-1, IL-6 und IL-8, sowie die Expression des konstimulatorischen
Moleküls
B7.1, das für die
Aktivierung nativer T-Zellen erforderlich ist, zu induzieren. Es
ist vorgeschlagen worden, das Toll in Wirbeltieren als nicht-klonaler
Rezeptor des Immunsystems fungiert, der Signale zur Aktivierung
einer angeborenen sowie einer adaptiven Immunantwort in Wirbeltieren
auslösen
kann. Das von Medzhitov et al. (siehe oben) beschriebene menschliche
Toll-Gen wurde am stärksten
in Milz und Peripherblut-Leukozyten (PBL) exprimiert, und die Autoren
schlugen vor, dass seine Expression in anderen Geweben auf die Gegenwart
von Makrophagen und dendritischen Zeilen zurückzuführen sein könnten, in denen es als Frühwarnsystem
für Infektionen agieren
könnte.
Die öffentliche
GenBank-Datenbank enthält
die folgenden Toll-Sequenzen: Tollt (DNAX# HSU88540-1, die mit der
zufallssequenzierten Volllängen-cDNA
#HUMRSC786-1 identisch ist); Toll2 (DNAX# HSU88871-1); Toll3 (DNAX#
HSU88879-1); und Toll4 (DNAX# HSU88880-1, die mit der von Medzhitov
et al. (siehe oben) beschriebenen Sequenz identisch ist). Eine Toll-Teilsequenz (Toll5)
ist von GenBank unter DNAX# HSU88881-1 verfügbar.
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Weitere
menschliche Homologe des Drosophila-Toll-Proteins, die als Toll-artige
Rezeptoren (huTLRs1-5) bezeichnet werden, wurden kürzlich kloniert
und erwiesen sich als das Spiegelbild der topographischen Struktur
des Drosophila-Gegenstücks
(Rock et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588–593 (1998)). Die Überexpression
einer konstitutiv aktiven Mutante von einem der menschlichen TLR
(Toll-Protein-Homolog – Medzhitov
et al. (siehe oben); TLR4 – Rock
et al. (siehe oben)) führt
zur Aktivierung von NF-κB
und der Induktion der Entzündungs-Cytokine
und konstimulatorischen Moleküle.
Medzhitov et al. (siehe oben).
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Anmelder haben einen neuen cDNA-Klon identifiziert, der für neue menschliche
Toll-Polypeptide kodiert, die in der vorliegenden Erfindung als
PRO285 (kodiert von DNA40021), PRO286 (kodiert von DNA42668) und
PRO358 (kodiert von DNA47361) bezeichnet werden.
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In
einer ihrer Ausführungsformen
stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine DNA umfasst,
die für
ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Sequenzidentität, vorzugsweise
zumindest 95% Sequenzidentität
mit (a) einem DNA-Molekül aufweist,
das für
ein PRO358-Polypeptid kodiert, das die Aminosäurereste 20 bis 811 aus 12A–B
(Seq.-ID Nr. 13) aufweist, oder zum Komplement des DNA-Moleküls. Das
komplementäre
DNA-Molekül
bleibt vorzugsweise unter zumindest mäßig stringenten und, gegebenenfalls,
unter hochstringenten Bedingungen stabil an eine derartige kodierende
Nucleinsäuresequenz
gebunden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül ein Polynucleotid,
das zumindest 95% Sequenzidentität
mit einem Polynucleotid aufweist, das für ein Polypeptid kodiert, das
die Sequenz der Aminosäuren
1 bis 811 aus 12A–B (Seq.-ID Nr. 13) oder das
Komplement des DNA-Moleküls umfasst.
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In
einer speziellen Ausführungsform
stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das DNA umfasst,
die für
native PRO358-Polypeptide oder Varianten davon mit oder ohne die
N-terminale Signalsequenz und mit oder ohne die Transmembranregionen
der entsprechenden Sequenzen voller Länge kodiert. In einem ihrer
Aspekte umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA, die für ein reifes,
natives PRO358-Polpeptid voller Länge kodiert, das die Aminosäurereste
1 bis 811 aus 12A–B (Seq.-ID Nr. 13) aufweist
oder komplementär
zu einer derartigen kodierenden Nucleinsäuresequenz ist. In einem weiteren
Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein natives
PRO358-Polypeptid ohne eine N-terminale Signalsequenz kodierende
DNA umfasst oder komplementär
zu einer derartigen kodierenden Nucleinsäuresequenz ist. In noch einer
weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung Nucleinsäure,
die für
inaktivierte Formen oder für
Formen der nativen PRO385-Proteine voller Länge kodiert, bei denen die
Transmembrandomäne deletiert
ist.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein PRO358-Polypeptid
kodiert, das DNA umfasst, die an das Komplement der Nucleinsäure zwischen
den Resten von 111 bis einschließlich 2544 aus 13A– B (Seq.-ID
Nr. 14) hybridisiert. Vorzugsweise tritt die Hybridisierung unter
stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen auf.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül den am 7. November 1997 unter
der ATCC-Nummer 209431 hinterlegten Klon (DNA 47361-1249).
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der DNA umfasst, die für PRO358-Polypeptide
oder ihre in den Ansprüchen
dargelegten Varianten kodiert. Folglich kann der Vektor jegliche
der hierin oben definierten isolierten Nucleinsäuremoleküle umfassen.
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In
einer besonderen Ausführungsform
stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der ein Polynucleotid umfasst,
das zumindest etwa 80% Sequenzidentität aufweist, vorzugsweise zumindest
etwa 85% Sequenzidentität,
noch bevorzugter zumindest etwa 90% Sequenzidentität, am bevorzugtesten
zumindest etwa 95% Sequenzidentität mit einem Polynucleotid,
das für
ein Polynucletid kodiert, das die Sequenz der Aminosäuren 20
bis 811 aus 12A–B (Seq.-ID Nr. 13) oder das
Komplement eines solchen Polynucleotids umfasst. In einer besonderen
Ausführungsform
umfasst der Vektor DNA, die für
das neue Toll-Homolog (PRO358) mit oder ohne die N-terminalen Signalsequenz
(etwa Aminosäuren
1 bis 19) oder eine Transmembrandomäne (etwa Aminosäuren 576–595), deletierte
oder inaktivierte Variante davon oder die extrazelluläre Domäne (etwa
Aminosäuren
20 bis 595) des reifen Proteins oder ein Protein kodiert, das eine
beliebige dieser Sequenzen umfasst. Eine Wirtszelle, die einen solchen
Vektor umfasst, wird ebenfalls bereitgestellt.
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Eine
einen derartigen Vektor enthaltende Wirtszelle wird ebenfalls bereitgestellt.
Beispielhaft können die
Wirtszellen CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein.
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Außerdem wird
ein Verfahren zur Herstellung von PRO358-Polypeptiden bereitgestellt
und umfasst das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die
zur Expression von PRO358 und Gewinnung von PRO358 aus der Zellkultur
geeignet sind.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung isolierte PRO358-Polypeptide bereit. Die Erfindung
stellt ein isoliertes PRO358-Polypeptid nativer Sequenz oder Varianten
davon bereit. Insbesondere stellt die Erfindung ein isoliertes PRO358-Polypeptid
nativer Sequenz bereit, die in bestimmten Ausführungsformen die Aminosäuresequenz
umfasst, die Reste 20 bis 575 oder 20 bis 811 oder 1 bis 811 aus 12A–B
(Seq.-ID Nr. 13) umfasst.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung Hybridmoleküle
bereit, die PRO358-Polypeptide umfassen, die an eine heterologe
Polypeptid- oder Aminosäuresequenz
fusioniert sind. Ein Beispiel eines derartigen Hybridmoleküls umfasst
ein PRO358-Polypeptid, das an eine Epitopmarkersequenz oder an eine Fc-Region
eines Immunglobulins fusioniert ist. Ein Beispiel eines derartigen
Hybridmoleküls
umfasst ein PRO358-Polypeptid (einschließlich seiner Varianten, bei
denen das Signalpeptid und/oder die Transmembrandomäne und gegebenenfalls
die intrazelluläre
Domäne
deletiert sind), das an eine Epitopmarkersequenz oder an eine Fc-Region
eines Immunglobulins fusioniert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
die Fusion die extrazelluläre
Domäne
von PRO285, fusioniert an eine konstante Immunglobulinregion, die
zumindest die CH2- und CH3-Domänen
umfasst.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung einen Antikörper
bereit, der spezifisch an PRO358-Polypeptide bindet. Gegebenenfalls
ist der Antikörper
ein monoklonaler Antikörper.
Die Erfindung umfasst speziell Antikörper mit Doppelspezifitäten, z.
B. bispezifische Antikörper,
die mehr als ein Toll-Polypeptid binden.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
eine Zusammensetzung, die einen spezifisch an ein PRO358-Polypeptid
bindenden Antikörper
in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst,
sowie die medizinischen Verwendungen derartiger Antikörper, insbesondere
zur Behandlung von septischem Schock.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt das Expressionsmuster des menschlichen
Toll-Rezeptors 2 (huTLR2) (Rock et al., siehe oben). a. Northern-Analyse
von mehreren menschlichen, mit einer TLR2-Sonde sondierten Immungeweben. PBL,
Peripherblut-Leukozyten. b. Angereicherte Expression von TLR2- in
Makrophagen und transkriptionelle Up-Regulation von TLR2 als Reaktion
auf LPS. Quantitative RT-PCR wurde verwendet, um die relativen Expressionsstärken von
TLR2 in PBL, T-Zellen, Makrophagen (MΦ) und LPS-stimulierten Makrophagen (MΦ + LPS)
zu ermitteln.
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2. TLR2 vermittelt LPS-induzierte Signalisierung.
a. 293-Zellen, die TLR2 stabil exprimieren, erwerben LPS-Reaktionsfähigkeit.
Entweder eine Population stabiler, gD.TLR2 exprimierender Klone
(293-TLR2 pop1) oder ein einzelner Klon von gD.TLR2 exprimierenden
Zellen (293-TLR2-Klon 1) oder Kontrollzellen (293-MSCV), die mit
dem Expressionsvektor alleine stabil transfiziert waren, wurden
mit pGL3.ELAM.tk vorübergehend
transfiziert und dann mit 1 μg/ml
055:B5-Enhancer für
6 Stunden mit oder ohne LBP in serumfreiem Medium stimuliert. Die
Aktivierung des ELAM-Enhancers wurde wie in den Beispielen beschrieben
gemessen. Es wurden Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten erlangt.
Keine Stimulierung wurde bei Verwendung des Kontroll-Reporterplasmids
beobachtet, dem der ELAM-Enhancer fehlte (Daten nicht dargestellt).
Die Expression des Reporterplasmids war in unbehandelten Zellen
oder in mit LBP alleine behandelten Zellen gleich (Daten nicht dargestellt).
b. Western-Blot, der die Expression von epitopmarkiertem TLR2 in
293-Zellen zeigt.
c. Zeitverlauf der TLR2-abhängigen,
LPS-induzierten Aktivierung und Translokation von NF-κB. Kernextrakte
wurden hergestellt aus Zellen, die mit 055:B5-LPS (10 μg/ml) und
LBP für
die angegebenen Zeiten behandelt waren (oben), oder aus Zellen,
die mit 1 μM
Cycloheximid (CHX) für
1 Stunde vorbehandelt und mit 1 μg/ml
LPS für
1 Stunde in Gegenwart von LBP in serumfreiem Medium stimuliert waren
(unten). d. Wirkung von mCD14 auf die NF-κB-Aktivierung durch TLR2. Vektor-Kontrolle
(193-MSCV) oder 293-TLR2-pop1-Zellen wurden mit dem Reporterplasmid
und einem CD14-Expressionsvektor (+mCD14) bzw. Vektor-Kon trolle (–mCD14)
transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die transfizierten Zellen mit
055:B5-LPS für
6 Stunden in Gegenwart von LBP in serumfreiem Medium stimuliert.
Die dargestellten Daten repräsentieren
drei unabhängige Experimente.
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3.
Domänenfunktion
von TLR2 bei der Signalisierung. a. Illustrationen von verschiedenen TLR2-Konstrukten.
TLR2-WT, die epitopmarkierte Form von TLR2 voller Länge, TLR2-Δ1 und -Δ2 stellen
eine von 13 bzw. 141 Aminosäuren
am Carboxylterminus dar. CD4-TLR2, ein menschliches CD4-TLR2-Hybrid,
bei dem die extrazelluläre
Domäne
von TLR2 durch die Aminosäuren
1–205
von menschlichem CD4 ersetzt ist. EDC, extrazelluläre Domäne; TM,
Transmembranregion; ICD, intrazelluläre Domäne. b. C-terminale Reste, die für die IL-1R-
und TLR2-Signalübertragung
entscheidend sind. Restenummern sind an der rechten Seite jedes Proteins
dargestellt. Der Pfeil bezeichnet die Position der TLR2-Δ1-Trunkation.
*, Reste, die für
die IL-R1-Signalübertragung
entscheidend sind (Heguy et al., J. Biol. Chem. 267, 2605–2609 (1992);
Croston et al., J. Biol. Chem. 270, 16514–16517 (1995)). I, identische
Aminosäure;:,
konservative Änderungen.
c. TLR-R2-Varianten sind unfähig,
NF-κB als
Reaktion auf LPS und LBP zu induzieren. 293-Zellen wurden vorübergehend
mit pGL3.ELAM.tk und Expressionsvektoren transfiziert, die für TLR2 oder
TLR2-Varianten voller Länge
wie angegeben kodieren. Die Zellen wurden außerdem mit einem CD14-Expressionsplasmid
(+mCD14) oder mit einem Kontrollplasmid (–mCD14) transfiziert. Die gleich
starke Expression jedes Proteins wird mittels Western-Blot unter
Verwendung von entweder Anti-gD- oder CD4-Antikörper bestätigt (unten). Der Luciferase-Test wurde
wie in den Beispielen beschrieben durchgeführt. Die Daten wurden aus Doppelexperimenten
erhalten.
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4. Hohe Potenz von E. coli K12 LPS (LCD25)
und seine Bindung an TLR2. a. Dosis-Reaktions-Kurve verschiedener
LPS-Präparate.
b. Spezifische Wechselwirkung von [3H]-LPS
(LCD25) mit der extrazellulären
Domäne
von TLR2. Spezifische Bindung wurde an TLR2-Fc, nicht jedoch an
entweder Fc alleine oder an Fusionsproteine beobachtet, welche die
extrazellulären
Domänen
von Rse, Axl, Her2 oder Her4 enthielten. Die Bindung an TLR2-Fc
trat spezifisch mit LCD25-LPS in Konkurrenz, nicht jedoch mit detoxifiziertem LPS.
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5.
TLR2 ist für
die LPS-induzierte IL-8-Expression erforderlich. 293-MSCV-Vektorkontroll-
und 293-TLR2-Zellen, die mCD14 vorübergehend exprimierten, wurden
mit LBP alleine oder gemeinsam mit dem angegebenen Typ von LPS bei
Konzentrationen von 1 μg/ml
in serumfreiem Medium für
6 Stunden stimuliert. Es wurden gleiche Mengen an poly-(A)-RNAs
für die
Northern-Analyse verwendet.
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6.
Nucleotidsequenz, die für
huTLR2 kodiert (Seq.-ID Nr. 11) kodiert.
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7.
Aminosäuresequenz
von huTLR2 (Seq.-ID Nr. 12).
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8 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz
eines menschlichen Toll-Proteins nativer Sequenz, die PRO358 genannt
wird (Seq.-ID Nr. 13). In der Figur bilden die Aminosäuren 1 bis
19 eine mutmaßliche Signalsequenz,
die Aminosäuren
20 bis 575 sind die mutmaßliche
extrazelluläre
Domäne,
wobei die Aminosäuren
20 bis 54 die Eigenschaften von leucinreichen Wiederholungen aufweisen,
die Aminosäuren
576 bis 595 sind eine mutmaßliche
Transmembrandomäne,
während
die Aminosäuren
596 bis 811 eine intrazelluläre Domäne bilden.
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9A–B
(Seq.-ID Nr. 14) zeigen die Nucleotidsequenz einer menschlichen
Toll-Protein-cDNA nativer Sequenz, die DNA47361 genannt wird, die
für das
reife, Volllängen-Toll-Protein
PRO358 kodiert. Da die dargestellte Sequenz gewisse äußere Sequenzen
enthält,
ist das ATG-Startcodon unterstrichen und das TAA-Stopcodon eingerahmt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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I. Definitionen
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Die
Ausdrücke „PRO358-Polypeptid", „PRO358", „PRO358-Tollhomolog" und grammatikalische
Varianten davon umfassen bei Verwendung hierin die nativen Sequenzen
von PRO358-Toll-Proteinen und Varianten (die hierin genauer definiert
werden). Das PRO358-Polypeptid kann aus zahlreichen Quellen, wie
z. B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle,
isoliert oder durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren oder durch beliebige
Kombination dieser und ähnlicher
Techniken hergestellt werden.
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Ein „PRO358
nativer Sequenz" umfasst
ein Polypeptid aus der Natur, das dieselbe Sequenz wie PRO358 aufweist.
Derartige Toll-Polypeptide nativer Sequenz können aus der Natur isoliert
und durch rekombinante oder synthetische Mittel hergestellt werden.
Der Ausdruck „PRO358
nativer Sequenz" umfasst
ausdrücklich
natürlich
vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen der hierin offenbarten
PRO358-Polypeptide
(z. B. eine Sequenz der extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Variantenformen
(z. B. alternativ gespleißte
Formen) und natürlich
vorkommende allelische Varianten. In einer der Ausführungsformen
der Erfindung ist das PRO358 nativer Sequenz ein reifes oder Volllängen-PRO358-Polypeptid
nativer Sequenz, das die Aminosäuren
20 bis 811 aus 12A–B (Seq.-ID Nr. 13) mit oder
ohne N-terminale Signalsequenz (Aminosäuren 1 bis 19) und mit oder
ohne N-terminales Methionin umfasst. In einer weiteren Ausführungsform
ist das PRO358 nativer Sequenz die lösliche Form des Volllängen-PRO358,
das die extrazelluläre
Domäne
des Volllängenproteins
(Aminosäuren
29 bis 575) mit oder ohne die N-terminale Signalsequenz umfasst,
und mit oder ohne N-terminales Methionin.
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Unter
dem Ausdruck „PRO358-Variante" wird ein unten definiertes,
aktives PRO358-Polypeptid
verstanden, das zumindest 80%, vorzugsweise zumindest etwa 85%,
noch bevorzugter zumindest etwa 90%, am bevorzugtesten zumindest
etwa 95% Aminosäuresequenzidentität zu PRO358
aufweist, das die in 12A–B (Seq.-ID
Nr. 13) gezeigte, abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist. Derartige
Varianten umfassen beispielsweise PRO358-Polypeptide, worin ein
oder mehrere Aminosäurereste
am N- oder C-Terminus der Sequenzen aus 11A–B (Seq.-ID
Nr. 13) addiert bzw. deletiert sind. Varianten umfassen insbesondere
transmembrandomänendeletierte
und inaktivierte Varianten der nativen Sequenz PRO358, die auch
Teil oder alles ihrer intrazellulären deletierten Domäne aufweisen
können.
Bevorzugte Varianten sind jene, die einen hohen Grad an Sequenzidentität zur extrazellulären Domäne eines
PRO358-Polypeptids nativer Sequenz aufweisen. In einer speziellen
Ausführungsform
behalten die PRO358-Varianten der vorliegenden Erfindung zumindest
einen C-terminalen Abschnitt der intrazellulären Domäne des entsprechenden nativen
Proteins bei, und besonders bevorzugt behalten sie den Großteil der
intrazellulären
und extrazellulären
Domänen
bei. Allerdings können derartige
Varianten in Abhängigkeit
von ihrer vorgesehenen Verwendung verschiedene Aminosäureänderungen,
z. B. Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen, innerhalb
dieser Regionen aufweisen.
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„Prozentuelle(%-)Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der
hierin identifizierten PRO358-Sequenzen ist als der prozentuelle
Anteil an Aminosäureresten
in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten
in der PRO358-Sequenz identisch sind, und zwar nach gegebenenfalls
erforderlicher Angleichung der Sequenzen und Einführung von
Lücken,
um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erlangen, wobei jegliche
konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt
bleiben. Eine Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen
Aminosäuresequenzidentität kann auf
verschiedene fachbekannte Arten erzielt werden, beispielsweise unter
Verwendung öffentlich
zugänglicher
Computersoftware, wie z. B. BLAST-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR-)Software.
Der Fachmann kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung
ermitteln, einschließlich
jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung maximaler Angleichung über die
volle Länge
der verglichenen Sequenzen benötigt
werden. Die ALIGN-Software wird zur Ermittlung der Aminosäuresequenzidentität bevorzugt.
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In
einem speziellen Aspekt ist die „prozentuelle(%-)Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der PRO358-Sequenzen
hierin als der prozentuelle Anteil an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz
definiert, die mit den Aminosäureresten
in der PRO358-Sequenz identisch sind, und zwar nach gegebenenfalls erforderlicher
Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, um die maximale prozentuelle
Sequenzidentität
zu erlangen, wobei jegliche konservativen Substitutionen als Teil
der Sequenzidentität
nicht berücksichtigt
werden. Die hierin verwendeten %-Identität-Werte werden mittels WU-BLAST-2 erzeugt,
das von (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996);
http://blastwustl/edu/blast/README.html) erhalten wurde. WU-BLAST-2
verwendet mehrere Suchparameter, wovon die meisten auf Standardwerte
eingestellt werden. Die verstellbaren Parameter werden auf die folgenden
Werte eingestellt: Overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word
threshold (T) = 11. Die HSP S- und HSP S2-Parameter sind dynamische
Werte und werden vom Programm selbst in Abhängigkeit von der Zusammensetzung
der jeweiligen Sequenz und Zusammensetzung der jeweiligen Datenbank
festgesetzt, gegen die die Sequenz von Interesse durchsucht wird:
jedoch können
die Werte verstellt werden, um die Empfindlichkeit zu steigern.
Ein Wert für
die %-Aminosäuresequenzidentität wird ermittelt,
indem die Anzahl identischer Reste durch die Gesamtanzahl an Resten
der „längeren" Sequenz in der angeglichenen
Region dividiert wird (mittels WU-Blast-2 zur Maximierung der Angleichung
eingeführte
Lücken
werden ignoriert).
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Der
Ausdruck „Positive" umfasst im Zusammenhang
mit dem wie oben beschrieben durchgeführten Sequenzvergleich Reste
in den verglichenen Sequenzen, die nicht identisch sind, sondern ähnliche
Eigenschaften aufweisen (z. B. als Folge konservativer Substitutionen).
Der %-Wert an Positiven wird ermittelt, indem der Bruchteil an Resten,
die in der BLOSUM-62-Matrix eine positive Bewertung erhalten, durch
die Gesamtanzahl der Reste in der oben definierten, längeren Sequenz
dividiert wird.
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„Prozentuelle(%-)Nucleinsäuresequenzidentität" ist bezüglich der
hierin identifizierten DNA47361-Sequenzen als der prozentuelle Anteil
an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den
Nucleotiden in den DNA47361-Sequenzen identisch sind, und zwar nach
gegebenenfalls erforderlicher Angleichung der Sequenzen und Einführung von
Lücken,
um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erlangen. Eine Angleichung
zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Nucleinsäuresequenzidentität kann auf
verschiedene fachbekannte Weisen erzielt werden, beispielsweise
unter Verwendung öffentlich
zugänglicher
Computersoftware, wie z. B. BLAST-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR-)Software.
Der Fachmann kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung
ermitteln, einschließlich
jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung maximaler Angleichung über die
volle Länge
der verglichenen Sequenzen benötigt
werden. Die ALIGN-Software wird zur Ermittlung der Nucleinsäuresequenzidentität bevorzugt.
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Im
Speziellen ist die „prozentuelle(%-)Nucleinsäuresequenzidentität" bezüglich der
kodierenden Sequenz der PRO358-Polypeptide hierin als prozentueller
Anteil von Nucleotidresten in einer Kandidatensequenz definiert,
die mit den Nucleotidresten in der für PRO358 kodierenden Sequenz
identisch sind. Die hierin verwendeten Identitätswerte wurden mittels BLASTN-Modul
des auf Standardparameter eingestellten WU-BLAST-2 erzeugt, wobei „overlap
span" und „overlap
fraction" auf 1
bzw. 0,125 eingestellt waren.
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Unter „isoliert" wird bei der Beschreibung
der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide ein Polypeptid
verstanden, das identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen
Umgebung abgesondert und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende
Komponenten seiner natürlichen
Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen
oder therapeutischen Verwendungen für das Polypeptid stören würden und
können
Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nicht-proteinische
Gelöststoffe
umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um
zumindest 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz
durch Verwendung eines Drehbecher-Sequenzierers zu erlangen, oder
(2) bis zur Homogenität
mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen
unter Verwendung von Coomassie-Blau-
oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes
Polypeptid umfasst Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da
zumindest eine Komponente der natürlichen Umge bung von PRO358
nicht vorhanden sein wird. Für
gewöhnlich
wird jedoch das isolierte Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt
hergestellt.
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Ein „isoliertes" DNA47361-Nucleinsäuremolekül ist ein
Nucleinsäuremolekül, das identifiziert
und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül abgetrennt
ist, mit dem es für
gewöhnlich
in der natürlichen
Quelle der DNA47361-Nucleinsäure
assoziiert ist. Ein isoliertes DNA47361-Nucleinsäuremolekül liegt nicht in der Form oder
in dem Milieu vor, in der/dem es sich in der Natur findet. Isolierte
DNA47361-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden
sich daher von dem DNA47361-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen
existiert. Jedoch umfasst ein isoliertes DNA47361-Nucleinsäuremolekül in Zellen
enthaltene DNA47361-Nucleinsäuremoleküle, die
für gewöhnlich DNA47361
exprimieren, wo sich das Nucleinsäuremolekül beispielsweise an einem anderen
chromosomalen Ort als dem natürlicher
Zellen befindet.
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„Toll-Rezeptor
2", „TLR2" und „huTLR2" werden austauschbar
verwendet und beziehen sich auf einen von Rock et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95, 588–593
(1998) als „HuTLR2" bezeichneten menschlichen Toll-Rezeptor.
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen
von huTLR2 sind in 10 (Seq.-ID Nr.
11) bzw. 11 (Seq.-ID Nr. 12) gezeigt.
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Der
Ausdruck „Expressionsvektor" wird verwendet,
um einen Vektor zu definieren, in dem eine für ein hierin beschriebenes
Toll-Homolog-Protein kodierende Nucleinsäure operabel an Kontrollsequenzen
gebunden ist, die fähig
sind, seine Expression in geeigneten Wirtszellen zu beeinflussen.
Vektoren tragen für
gewöhnlich
eine Replikationsstelle (obgleich dies nicht erforderlich ist wenn
Chromosomenintegration erfolgt). Expressionsvektoren umfassen außerdem Markersequenzen,
die fähig
sind, für
eine Phänotypselektion
in transformierten Zellen zu sorgen. Beispielweise wird E. coli
typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem
von einer E. coli-Spezies
hergeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322
enthält
Gene für
Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher ein einfaches
Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen sowohl zum Zwecke
der Klonierung, als auch zum Zwecke der Expression bereit. Expressionsvektoren
werden außerdem
im Idealfall Sequenzen enthalten, die zur Kontrolle der Transkription
und Translation zweckdienlich sind, z. B. Promotoren und Shine-Dalgarno-Sequenzen
(für Prokaryoten) oder
Promotoren und Enhancer (für
Säugetierzellen).
Die Promotoren können,
müssen
aber nicht induzierbar sein; sogar für leistungsfähige konstitutive
Promotoren, wie z. B. den CMV-Promotor für Säugetierwirte erwies sich, dass
sie LHR ohne Wirtszelltoxizität
produzieren. Obgleich es denkbar ist, dass Expressionsvektoren keinerlei
die Expression kontrollierende, replikative Sequenzen oder Selektionsgene
enthalten müssen,
kann ihre Abwesenheit die Identifizierung von Hybridtransformanten
und die Erzielung eines hohen Ausmaßes an Hybridimmunglobulinexpression
behindern.
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Der
Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf
DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden
Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die
Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind,
umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und
eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen setzen bekanntermaßen Promotoren,
Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
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Eine
Nucleinsäure
ist „operabel
gebunden", wenn
sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäuresequenz
gesetzt ist. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel
an DNA für
ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das
an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder
Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn
er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle
ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert
ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operabel
gebunden", dass
die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines
Sekretionsleaders zusammenhängend
sind und sich in Lesephase befinden. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein.
Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen
erzielt. Falls derartige Stellen nicht vorhanden sind, dann werden
synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher
Praxis verwendet.
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Der
Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten
Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Anti-PRO358-Antikörper (einschließlich Agonisten-,
Antagonisten- und neutralisierende Antikörper) und Anti-PRO358-Antikörperzusammensetzungen
mit polyepitopischer Spezifität.
Der Ausdruck „monoklonaler
Antikörper" bezieht sich bei
Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population
von im Wesentlichen homogenen Antikörper erlangt wurde, d. h.,
dass die die Population umfassenden individuellen Antikörper mit
Ausnahme von möglichen
natürlich
vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch
sind.
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Der
Ausdruck „Antagonist" wird hierin im weitesten
Sinne verwendet und umfasst jegliches Molekül, das eine biologische Aktivität eines
hierin offenbarten Toll-Rezeptors teilweise oder vollständig blockiert,
verhindert, hemmt oder neutralisiert. In ähnlicher Weise wird der Ausdruck „Agonist" im weitesten Sinne
verwendet und umfasst jegliches Molekül, das eine biologische Aktivität eines
hierin offenbarten nativen Toll-Rezeptors
nachahmt oder verstärkt.
Geeignete Agonisten- oder Antagonisten-Moleküle umfassen ausdrücklich Agonisten-
und Antagonisten-Antikörper
oder Antikörper-Fragmente, Fragmente
oder Aminosäuresequenzvarianten
nativer Toll-Rezeptor-Polypeptide,
Peptide, kleine organische Moleküle
usw.
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„Aktiv" oder „Aktivität" beziehen sich zum
Zwecke hierin auf (eine) Form(en) von PRO358, welche die biologischen
und/oder immunogenen Aktivitäten
von nativem oder natürlich
vorkommendem PRO358 beibehalten. Eine bevorzugte „Aktivität" ist die Fähigkeit,
die Aktivierung von NF-κB
und/oder die Expression von NF-κB-kontrollierten
Genen für
die Entzündungscytokine
IL-1, IL-6 und IL-8 zu induzieren. Eine weitere bevorzugte „Aktivität" ist die Fähigkeit,
die erworbene und/oder adaptive Immunantwort in Wirbeltieren zu
aktivieren. Eine außerdem
bevorzugte „Aktivität" ist die Fähigkeit,
die Gegenwart von an Mikroorganismen vorhandenen konservativen Molekülstrukturen
wahrzunehmen und im Speziellen die Fähigkeit, die Lipopolysaccharid- (LPS-)Signalisierung
zu vermitteln. Dieselbe Definition von „Aktivität" trifft auf Agonisten (z. B. Agonisten-Antikörper) von
PRO358-Polypeptiden zu. Wie oben erwähnt ist die „Aktivität" eines Antagonisten
(einschließlich
Agonisten-Antikörper)
eines PRO358-Polypeptids als die Fähigkeit definiert, jeglichen
der oben identifizierten Aktivitäten
eines PRO358-Polypeptids entgegenzuwirken, z. B. teilweise oder
vollständig
zu blockieren, zu verhindern, zu hemmen oder zu neutralisieren.
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Die „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen
kann von einem gewöhnlich
Fachkundigen leicht ermittelt werden und ist im Allgemeinen eine
empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration
abhängt.
Im Allgemeinen erfordern längere
Sonden höhere
Temperaturen für
die richtige Annelierung, während
kürzere
Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen
von der Fähigkeit
denaturierter DNA ab, wieder zu annelieren, wenn komplementäre Stränge in einem
Milieu unter ihrer Schmelztemperatur zugegen sind. Je höher der
Grad an erwünschter
Homologie zwischen Sonde und hybridisierbarer Sequenz, desto höher die
relative Temperatur, die eingesetzt werden kann. Es folgt daraus,
dass höhere
relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionsbedingungen stringenter
zu machen, während
niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und
Erklärungen
zur Stringenz und zu Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology (1995).
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Die
hierin definierten „stringenten
Bedingungen" oder „Bedingungen
hoher Stringenz" können durch jene
gekennzeichnet sein die: (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur fürs Waschen
einsetzen, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1%
Natriumdodecylsulfat bei 50°C;
(2) ein Denaturierungsmittel während
der Hybridisierung einsetzen, wie z. B. Formamid, beispielsweise
50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1%
Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750
mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75
M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8),
0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte
Lachsspermien-DNA (50 μg/ml),
0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschvorgängen bei
42°C in
0,2 × SSC
(Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt
von einem aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bei 55°C bestehendem
Waschvorgang hoher Stringenz einsetzen.
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„Mäßig stringente
Bedingungen" können so
festgelegt werden, wie sie von Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laborstory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben
sind, und umfassen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen
(z. B. Temperatur, Ionenstärke
und %-SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind.
Ein Beispiel mäßig stringenter
Bedingungen ist die Inkubation über
Nacht bei 37°C
in einer Lösung,
die Folgendes umfasst: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat),
50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10%
Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte, gescherte Lachsspermien-DNA,
gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Der Fachmann
wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. erforderlichenfalls
einzustellen sind, um Einflussgrößen, wie
z. B. Sondenlänge
und dergleichen Rechnung zu tragen.
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Der
Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei
Verwendung hierin auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein „Markerpolypeptid" fusioniertes FIZZ-Polypeptid
umfasst. Das Markerpolypeptid hat eine ausreichende Anzahl von Resten,
um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt
werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, so dass es nicht die Aktivität des Polypeptids
stört,
an das es fusioniert ist. Das Markerpolypeptid ist außerdem vorzugsweise
ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper im Wesentlichen nicht
mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markerpolypeptide
weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise
zwischen etwa 8 und 50 Aminosäureresten
(vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäureresten) auf.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck „Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die
Bindungsspezifität
eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen konstanter
Immunglobulindomänen
vereint. Strukturell umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz
mit der gewünschten
Bindungsspezifität,
die nicht die Antigenerkennungs- und Bindungsstel le eines Antikörpers ist
(d. h. heterolog ist), mit der Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne. Der
Adhäsin-Abschnitt
eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise
eine zusammenhängende
Aminosäuresequenz,
die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden
umfasst. Die Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne im Immunoadhäsin kann
von jeglichem Immunglobulin, wie z. B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder
IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich
IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erlangt werden.
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„Behandlung" bezieht sich auf
therapeutische Behandlung sowie auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen,
worin das Ziel die Verlangsamung (Linderung) des pathologischen
Leidens oder Störung
ist, auf die abgezielt wird. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen
jene, bei denen die Störung
bereits vorliegt, sowie jene, die für die Störung anfällig sind oder jene, die vor
der Störung
zu bewahren sind.
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„Chronische" Verabreichung bezieht
sich auf Verabreichung des/der Mittel(s) auf kontinuierliche Weise im
Gegensatz zur akuten Weise, so dass die anfängliche therapeutische Wirkung
(Aktivität)
für einen
längeren Zeitraum
aufrechterhalten wird.
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„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung
bezieht sich auf jegliches als Säugetier
klassifiziertes Tier, einschließlich
Menschen, Nutztiere, Zoo-, Sport- und Haustiere, wie z. B. Hunde,
Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine usw. Vorzugsweise ist das
Säugetier
der Mensch.
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Verabreichung „in Kombination
mit" einem oder
mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst simultane (gleichzeitige)
und aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
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Der
Ausdruck „Lipopolysaccharid" oder „LPS" wird hierin als
Synonym von „Endotoxin" verwendet. Lipopolysaccharide
(LPS) sind charakteristische Komponenten der äußeren Membran Gram-negativer
Bakterien, z. B. Escherichia coli. Sie bestehen aus einem Polysaccharid-Abschnitt
und einem Fett, das Lipid A genannt wird. Das Poly saccharid, das
sich von Spezies zu Spezies unterscheidet, besteht aus der O-spezifischen Kette
(aufgebaut aus sich wiederholenden Einheiten von drei bis acht Zuckern)
und dem zweiteiligen Kern. Lipid A umfasst praktisch immer zwei
Glucosamin-Zucker,
die durch Phosphat und eine variable Anzahl an Fettsäuren modifiziert
sind. Für
weitere Informationen siehe beispielsweise Rietschel und Brade,
Scientific American, August 1992, S. 54–61.
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Der
Ausdruck „septischer
Schock" wird hierin
im weitesten Sinne verwendet, einschließlich aller Definitionen, die
in Bone, Ann. Intern. Med. 114, 332–333 (1991), offenbart sind.
Im Speziellen beginnt septischer Schock mit einer systemischen Reaktion
auf Infektion, einem Syndrom, das Sepsis genannt wird. Wenn dieses Syndrom
zu Blutunterdruck und Organ-Dysfunktion führt, wird es septischer Schock
genannt. Septischer Schock kann durch Gram-positive Organismen und
Pilze sowie durch Endotoxin enthaltende Gram-negative Organismen
ausgelöst
werden. Demgemäß ist die
vorliegende Definition nicht auf „Endotoxin-Schock" eingeschränkt.
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II. Zusammensetzungen und Verfahren der
Erfindung
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A. PRO358 voller Länge
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Die
vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen
bereit, die für
ein Polypeptid kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung PRO358
genannt werden. Insbesondere haben die Anmelder cDNAs identifiziert
und isoliert, die für
PRO358-Polypeptide kodieren, wie in den untenstehenden Beispielen
ausführlicher
offenbart wird. Unter Verwendung von BLAST- und FastA-Sequenzangleichungscomputerprogrammen
haben die Anmelder gefunden, dass die kodierende Sequenz von PRO358
höchst
homolog zu den DNA-Sequenzen HSU88540_1, HSU88878_1, HSU88879_1,
HSU88880_1, HSU88881_1 und HSU79260_1 in der Gen-Bank-Datenbank ist. Mit Ausnahme vn
HSU79260_1 sind die angeführten
Proteine als menschliche tollähnliche
Rezeptoren identifiziert worden.
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Demgemäß wird derzeit
angenommen, dass die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten PRO358-Proteine
neu identifizierte menschliche Homologe des Drosophila-Proteins
Toll sind und wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der adaptiven
Immunität
spielen. Im Spezielleren könnte
PRO358 an Entzündungen,
septischem Schock und Reaktion auf Pathogene beteiligt sein und
möglicherweise
eine Rolle bei verschiedenen medizinischen Leiden spielen, die durch
Immunreaktion verschärft
werden, wie z. B. bei Diabetes, ALS, Krebs, Rheumatoidarthritis
und Geschwüren.
Die Rolle von PRO358 als Pathogenmustererkennungsrezeptoren, die
die Gegenwart konservierter Molekularstrukturen wahrnehmen, die
an Mikroben vorkommen, wird durch die in der vorliegenden Anmeldung
offenbarten Daten weiter erhärtet,
wobei die Daten zeigen, dass ein bekannter menschlicher Toll-Rezeptor,
TLR2, ein direkter Vermittler der LPS-Signalisierung ist.
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B. PRO358-Varianten
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Zusätzlich zu
den hierin beschriebenen PRO358 nativer Sequenz und voller Länge ist
vorgesehen, dass Varianten dieser Sequenzen hergestellt werden können. PRO358-Varianten
können
hergestellt werden, indem geeignete Nucleotidveränderungen in die PRO358-DNA
eingeführt
oder die gewünschten
Varianten-Polypeptide synthetisiert werden. Der Fachkundige wird
anerkennen, dass Aminosäureveränderungen
die posttranslationellen Prozesse der PRO358-Polypeptide verändern können, wie
z. B. Verändern
der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Verändern der
Merkmale der Membranverankerung.
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Variationen
im PRO358 nativer Sequenz und voller Länge oder in verschiedenen Domänen von
hierin beschriebenem PRO358 können
beispielsweise unter Anwendung jeglicher Technik oder Richtlinien
für konservative
und nicht-konservative Mutationen vorgenommen werden, wie sie beispielsweise
im
US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt
sind. Variationen können
eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer für das PRO358-Polypeptid
kodierender Codons sein, das in einer Veränderung der Aminosäuresequenz
im Vergleich zu entsprechenden Polypeptiden nativer Sequenz resultiert.
Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumin dest
einer Aminosäure
mit jeglicher anderen Aminosäure
in einer oder mehreren Domänen
von PRO358. Bei der Entscheidung, welcher Aminosäurerest ohne nachteilige Beeinflussung
der gewünschten
Aktivität
insertiert, substituiert oder deletiert werden könnte, kann man sich durch Vergleichen der
Sequenz von PRO358 mit jener von homologen, bekannten Proteinmolekülen und
Minimieren der Anzahl an vorgenommenen Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher
Homologie leiten lassen. Aminosäuresubstitutionen
können
das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure sein, die ähnliche
strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist, wie z. B.
das Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d. h. konservative Aminosäureersetzungen.
Insertionen oder Deletionen können
gegebenenfalls im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zulässige Variation
kann ermittelt werden, indem Insertionen, Deletionen oder Substitutionen
von Aminosäuren
in der Sequenz vorgenommen und die resultierenden Varianten auf
Aktivität
in dem in den unten stehenden Beispielen beschriebenen In-vitro-Test
getestet werden.
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Die
Variationen können
unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind, wie z. B. Oligonucleotid-vermittelte
(ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese.
Ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331
(1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)), Kassettenmutagenese
(Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese
(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986))
oder andere bekannte Techniken können
an der klonierten DNA durchgeführt
werden, um die PRO358-Varianten-DNA herzustellen.
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Scanning-Aminosäureanalyse
kann außerdem
eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden
Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind
relativ kleine, neutrale Aminosäuren.
Derartige Aminosäuren
umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise
eine bevorzugte Scanning-Aminosäure
unter dieser Gruppe, da sie die über den
Beta-Kohlenstoff hinausgehende Seitenkette eliminiert und mit geringerer
Wahrscheinlichkeit die Hauptkettenkonformation der Variante verändert.
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Alanin
ist außerdem
typischerweise bevorzugt, weil es die häufigste Aminosäure ist.
Weiters findet es sich häufig
sowohl in verborgenen, als auch in exponierten Positionen (Creighton,
The Proteins, W. H. Freeman & Co.,
N. Y.; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)). Falls Alaninsubstitution
keine ausreichenden Mengen der Variante liefert, kann eine isoterische
Aminosäure
verwendet werden.
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Varianten
der hierin offenbarten PRO358-Toll-Proteine umfassen Proteine, bei
denen die Transmembrandomänen
deletiert oder inaktiviert worden sind. Transmembranregionen sind
höchst
hydrophobe oder lipophile Domänen,
welche die geeignete Größe aufweisen,
um die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran zu durchdringen. Es wird
von diesen angenommen, dass sie die nativen, reifen PRO285-, PRO286-
und PRO358-Polypeptide in der Zellmembran verankern. Im PRO358 erstreckt
sich die Transmembrandomäne von
etwa der Aminosäureposition
576 bis etwa zur Aminosäureposition
595.
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Die
Deletion oder Substitution der Transmembrandomäne erleichtert die Gewinnung
und stellt eine lösliche
Form eines PRO358-Polypeptids bereit, indem dessen Zell- oder Membranlipid-Affinität vermindert und
dessen Wasserlöslichkeit
verbessert wird. Wenn die Transmembran- und Zytoplasma-Domänen deletiert werden,
vermeidet man die Einführung
potentiell immunogener Epitope entweder durch Exposition von ansonsten
intrazellulären
Polypeptiden, die vom Körper
als fremd erkannt werden könnten,
oder durch Insertion heterologer Polypeptide, die potentiell immunogen
sind. Ein prinzipieller Vorteil eines transmembrandomänendeletierten
PRO358 ist es, dass es in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert
wird. Diese Variante ist in Körperflüssigkeiten
wie Blut löslich
und hat keine nennenswerte Affinität für Zellmembranlipide, was seine Gewinnung
aus rekombinanter Zellkultur beträchtlich vereinfacht.
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Es
ist aus der bevorstehenden Diskussion offensichtlich, dass Substitutionen,
Deletionen, Insertionen oder beliebige Kombinationen davon eingeführt werden
können,
um zum endgültigen
Konstrukt zu gelangen. Es kann allgemein gesagt werden, dass lösliche Varianten
keine funktionstüchtige
Transmembrandomäne
aufweisen und vor zugsweise keine funktionsfähige zytoplasmatische Sequenz
aufweisen werden. Dies kann im Allgemeinen durch Deletion der maßgeblichen
Domäne
erzielt werden, obgleich adäquate
Insertions- oder Substitutionsvarianten zu diesem Zweck ebenfalls
wirkungsvoll sind. Beispielsweise wird die Transmembrandomäne durch
jegliche Aminosäuresequenz,
z. B. eine zufällige
oder vorherbestimmte Sequenz von etwa 5 bis 50 Serinen, Threoninen,
Lysinen, Argininen, Glutaminen, Asparaginsäuren und ähnliche hydrophile Reste substituiert,
die allesamt ein hydrophiles Hydropathie-Profil aufweisen. Wie die
Deletions-(trunkierten) PRO285-, PRO286- und PRO358-Varianten werden
diese Varianten in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert.
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Weitere
Deletionsvarianten der reifen PRO358-Polypeptide voller Länge (oder
transmembrandomänendeletierte
und inaktivierte Formen davon) umfassen Varianten, aus denen das
N-terminale Signalpeptid (vermutlich identifiziert für PRO358
als Aminosäuren
1 bis 26) und/oder das initiierende Methionin deletiert worden sind.
Die native Signalsequenz könnte
auch durch ein anderes (heterologes) Signalpeptid, das jenes eines
anderen Toll-artigen Proteins sein könnte, oder durch eine andere
menschliche oder nicht-menschliche (z. B. Bakterien-, Hefe- oder
nicht-menschliche Säugetier-)
Signalsequenz ersetzt werden.
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Es
wird angenommen, dass die intrazelluläre Domäne und insbesondere ihr C-terminaler
Abschnitt für die
biologische Funktion dieser Polypeptide wichtig ist. Wenn es demgemäß das Ziel
ist, Varianten herzustellen, die die biologische Aktivität eines
entsprechenden Toll-artigen Proteins beibehalten, wird zumindest
ein wesentlicher Teil dieser Regionen beibehalten und wenn Veränderungen,
wenn überhaupt,
vorgenommen werden, umfassen sie konservative Aminosäuresubstitutionen
und/oder Insertionen oder Aminosäuren,
die hinsichtlich ihrer Eigenschaften jenen ähnlich sind, die in der Region
vorhanden sind, in welche die Aminosäure insertiert wird. Wenn jedoch
eine wesentliche Modifizierung der biologischen Funktion eines nativen
Toll-Rezeptors erforderlich ist (wenn es z. B. das Ziel ist, Antagonisten
der jeweiligen Toll-Polypeptide
herzustellen), umfassen die Veränderungen
die Substitution und/oder Insertion von Aminosäuren, die sich hinsichtlich
ihrer Eigenschaften von der Aminosäu re an der abgezielten Position
im entsprechenden nativen Toll-Polypeptid unterscheiden.
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Natürlich vorkommende
Aminosäuren
werden auf Basis der gemeinsamen Seitenketteneigenschaften in Gruppen
unterteilt:
- (1) hydrophob: Norleucin, Met,
Ala, Val, Leu, Ile;
- (2) neutral hydrophob: Cys, Ser, Thr;
- (3) sauer: Asp, Glu;
- (4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
- (5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro;
und
- (6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.
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Konservative
Substitutionen umfassen den Austausch eines Elements innerhalb einer
der Gruppen durch ein anderes Element derselben Gruppe, wogegen
nicht-konservative
Substitutionen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen
gegen ein anderes bedingen. Von Varianten, die durch nicht-konservative Substitutionen
erlangt wurden, wird erwartet, dass sie in erheblicheren Veränderungen
der biologischen Eigenschaften/Funktion der erlangten Variante resultieren.
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Aminosäureinsertionen
umfassen amino- und/oder carboxyl-terminale Fusionen, die hinsichtlich
der Länge
von einem Rest bis zu Polypeptiden reichen, die hundert oder mehr
Reste enthalten, sowie Intrasequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer
Aminosäurereste.
Intrasequenz-Insertionen (d. h. Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz
des PRO358-Proteins) können
im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, bevorzugter
1 bis 5 Resten, bevorzugter 1 bis 3 Resten liegen. Beispiele terminaler
Insertionen umfassen die PRO358-Polypeptide mit einem N-terminalen
Methioninrest, einem Artefakt seiner direkten Expression in bakterieller
rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen
Signalsequenz mit dem N-Terminus des PRO358-Moleküls, um die
Sekretion des reifen 1-TRAF-Proteins aus rekombinanten Wirtszellen
zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen werden im Allgemeinen
von der daher dazu homologen vorgesehenen Wirtszellspezies erhalten.
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Geeignete
Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. coli, Alpha-Faktor für Hefe und
Virussignale, wie z. B. Herpes gD für Säugetierzellen.
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Andere
Insertionsvarianten der hierin offenbarten nativen Toll-artigen
Moleküle
umfassen die Fusion des N- oder C-Terminus des Moleküls nativer
Sequenz an immunogene Polypeptide, z. B. bakterielle Polypeptide,
wie z. B. β-Lactamase
oder ein Enzym, dass vom trp-Locus von E. coli kodiert wird, oder
Hefeprotein, und C-terminale Fusionen mit Proteinen, die eine längere Halbwertszeit
aufweisen, wie z. B. Immunglobulinregionen (vorzugsweise konstante
Immunglobulinregionen, um Immunadhäsine zu liefern), Albumin oder
Ferritin, wie beschrieben in der am 6. April 1989 veröffentlichten
WO 89/02922 . Zur Produktion
von Immunglobulinfusionen siehe auch
US-Patent
Nr. 5.428.130 , erteilt am 27. Juni 1995.
-
Da
es häufig
schwierig ist, die Eigenschaften einer Toll-artigen Proteinvariante
im Voraus vorherzusagen, ist einzusehen, dass ein Screening notwendig
sein wird, um die optimale Variante auszuwählen. Zu diesem Zweck sind
biochemische oder andere Screeningtests griffbereit, wie z. B. jene,
die hierin unten beschrieben sind.
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C. Modifikationen der PRO358-Toll-Proteine
-
Kovalente
Modifikationen der menschlichen PRO358-Toll-Homologe sind im Schutzumfang
dieser Erfindung enthalten. Eine Art der kovalenten Modifizierung
umfasst das Umsetzen der abgezielten Aminosäurereste des PRO358-Proteins
mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das fähig ist,
mit ausgewählten
Seitenketten oder den Resten des N- oder C-Terminus zu reagieren.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Reagenzien ist beispielsweise
zur Vernetzung von PRO358 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zweckdienlich,
und zwar zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO358-Antikörpern und
umgekehrt. Häufig
verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd,
N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-azidosalicylsäure, homobifunktionelle
Imidoester, einschließlich
Disuccinimidylester wie z. B. 3,3'-Dithiobis- (succinimidylpropionat), bifunktionale
Maleimide wie z. B. Bis-N-maleimido-1,8-octan und Mittel wie z.
B. Methyl-3[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
-
Andere
Modifizierungen umfassen die Deamidierung von Glutaminyl- und Asparagylresten
zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung
von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl-
und Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin-
und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)),
Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen
Carboxylgruppen.
-
Die
Derivatisierung mit bifunktionellen Reagenzien ist zur Herstellung
intramolekularer Aggregate der Toll-artigen Rezeptoren hierin mit
Polypeptiden sowie zur Vernetzung dieser Polypeptide an eine wasserunlösliche Trägermatrix
oder Oberfläche
zur Verwendung in Tests oder für
Affinitätsreinigung
zweckdienlich. Außerdem
stellt eine Untersuchung von Interkettenvernetzungen direkte Informationen über die
Konformationsstruktur bereit. Häufig
verwendete Vernetzungsmittel umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester
und bifunktionelle Maleimide. Derivatisierungsmittel, wie z. B.
Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat
liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die fähig sind,
Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ dazu werden
reaktive wasserunlösliche
Matrices, wie z. B. mit Bromcyan aktivierte Kohlenhydrate und die
in den
US-Patenten Nr. 3.959.642 ;
3.969.287 ;
3.691.016 ;
4.195.128 ;
4.247.642 ;
4.229.537 ;
4.055.635 ; und
4.330.440 beschriebenen reaktiven
Substrate für die
Proteinimmobilisierung und Vernetzung eingesetzt.
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Ein
weiterer Typ der kovalenten Modifizierung der PRO358-Polypeptide,
der im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst das
Verändern
des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter „Verändern des
nativen Glykosylierungsmusters" wird
für die
Zwecke hierin das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen,
die sich in der nativen Sequenz finden (entweder durch Entfernen
der zugrunde liegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletieren
der Glyko sylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel),
und/oder das Anfügen
einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen verstanden, die in der
nativen Sequenz nicht vorkommen. Außerdem umfasst der Ausdruck
qualitative Änderungen
der Glykosylierung der nativen Proteine, umfassend eine Veränderung
der Beschaffenheit und Anteile der vorliegenden Kohlenhydrate.
-
Das
Anfügen
von Glykosylierungsstellen an die PRO358-Polypeptide kann durch
Verändern
der Aminosäuresequenz
erzielt werden. Die Veränderung
kann beispielsweise durch Anfügen
oder Ersatz eines Serin- oder Threoninrestes an/in die/der native(n)
Sequenz vorgenommen werden (für
O-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls
durch Änderungen
auf DNA-Ebene verändert werden,
insbesondere durch Mutieren der für die PRO358-Polypeptide kodierenden
DNA an vorgewählten
Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten
Aminosäuren
translatiert werden.
-
Ein
weiteres Mittel zur Erhöhung
der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen an den PRO358-Polypeptiden
ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das
Polypeptid. Derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung
beschrieben, z. B. in
WO 87/05330 ,
veröffentlicht
am 11. September 1987 und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem.,
S. 259–306
(1981).
-
Die
Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die an den PRO285-, PRO286-
und PRO358-Polypeptiden vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch
oder durch Mutationssubstitution von Codons erzielt werden, die
für Aminosäurereste
kodieren, die als Glykosylierungsziele dienen. Chemische Deglykosylierungstechniken
sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise
von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) und
von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981) beschrieben. Die enzymatische
Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch
Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen wie von
Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987) beschrieben erzielt
werden.
-
-
Die
PRO358-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können außerdem auf eine Weise modifiziert werden,
bei der ein Hybridmolekül
gebildet wird, das PRO358 oder ein Fragment davon umfasst, das an
ein(e) weitere(s), heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz
fusioniert ist. In einer der Ausführungsformen umfasst ein derartiges
Hybridmolekül
eine Fusion des PRO358-Polypeptids mit einem Marker-Polypeptid,
das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Marker-Antikörper selektiv
binden kann. Der Epitop-Marker wird im Allgemeinen am Amino- oder
Carboxylterminus eines nativen PRO358-Moleküls oder einer Variante davon
platziert. Die Gegenwart derartiger Epitop-markierter Formen kann
unter Verwendung eines Antikörpers
gegen das Marker-Polypeptid nachgewiesen werden. Außerdem ermöglicht die
Bereitstellung des Epitop-Markers die einfache Reinigung der PRO358-Polypeptide
mittels Affinitätsreinigung
unter Verwendung eines Anti-Marker-Antikörpers oder einer anderen Art
von Affinitätsmatrix,
die an den Epitop-Marker bindet.
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Verschiedene
Marker-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(Poly-His-)
oder Poly-Histidin-Glycin-(Poly-His-Gly-)
Epitop-Marker; das flu-HA-Marker-Polypeptid und sein Antikörper 12CA5
(Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den c-myc-Marker und die 8F9-,
3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen (Evan et al.,
Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); und der Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein D
(gD-) Marker und sein Antikörper
(Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Andere Marker-Polypeptide
umfassen das Flag-Peptid
(Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid
(Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid
(Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen-10-Protein-Peptidmarker
(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
kann das Hybridmolekül
eine Fusion der PRO358-Polypeptide oder von Fragmenten davon mit
einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins
umfassen. Für
eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls könnte eine derartige Fusion
die an die Fc-Region eines Ig-, wie z. B. IgG-Molkeüls sein.
Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen (transmembrandomänendeletierten
oder inaktivierten) Form eines PRO358-Polypeptids anstelle von zumindest einer
variabeln Region in einem Ig-Molekül. Zur Produktion von Immunglobulinfusionen
siehe auch
US-Patent Nr. 5.428.130 ,
erteilt am 27. Juni 1995.
-
D. Herstellung von PRO358-Polypeptiden
-
Die
untenstehende Beschreibung betrifft in erster Linie die Herstellung
von PRO358-Toll-Homologen durch
Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder
transfiziert sind, der für
diese Proteine kodierende Nucleinsäure (z. B. DNA47361) enthält). Es
ist selbstverständlich
vorgesehen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung
wohlbekannt sind, zur Herstellung von PRO358 oder Varianten davon
eingesetzt werden können.
Zum Beispiel können
die PRO358-Sequenz oder Abschnitte davon durch direkte Peptidsynthese
unter Verwendung von Festphasentechniken hergestellt werden (siehe
z. B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman
Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85,
2149–2154
(1963)). Eine In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller
Techniken oder automatisiert durchgeführt werden. Die automatisierte
Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems
Peptide Synthesizers (Foster City, CA) unter Anwendung der Anleitungen
des Herstellers erzielt werden. Verschiedene Abschnitte von PRO358
können
chemisch gesondert oder kombiniert unter Anwendung chemischer oder
enzymatischer Verfahren synthetisiert werden, um PRO358 voller Länge herzustellen.
-
1. Isolierung von für PRO358 kodierender DNA
-
Für PRO358
kodierende DNA kann aus einer cDNA-Bibliothek erlangt werden, die
aus Geweben hergestellt wurde, von denen angenommen wird, das sie
die PRO358-mRNA
besitzen und sie in einem nachweisbaren Ausmaß exprimieren. Demgemäß kann menschliche
PRO358-DNA leicht aus einer aus menschlichem Gewebe hergestellten
cDNA-Bibliothek auf eine Weise erlangt werden, wie sie in den Beispielen
beschrieben wird. Das zugrunde liegende Gen kann ebenfalls aus einer
Genom-Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erlangt werden.
Zusätzlich
zu den in den Beispielen beschriebenen Bibliotheken kann für die menschlichen
Toll-Proteine der vorliegenden Erfindung kodierende DNA beispielsweise
aus Milzzellen oder Peripherblut-Leukozyten (PBL) isoliert werden.
-
Bibliotheken
können
mit Sonden (wie z. B. Antikörpern
gegen das PRO358-Protein oder Oligonucleotide von zumindest etwa
20–80
Basen) gescreent werden, die so konstruiert sind, dass sie das Gen
von Interesse oder das von ihm kodierte Protein identifizieren.
Das Screenen der cDNA- oder Genom-Bibliothek mit der gewählten Sonde
kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden,
wie zum Beispiel jenen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning,
A Laborstory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laborstory Press
(1989) beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zur Isolierung
des für
PRO358 kodierenden Gens ist die Verwendung des PCR-Verfahrens (Sambrook
et al., siehe oben; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory
Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1995)).
-
Die
unten stehenden Beispiele beschreiben Techniken zum Screenen einer
cDNA-Bibliothek.
Die als Sonden gewählten
Oligonucleotidsequenzen sollten von ausreichender Länge und
ausreichend eindeutig sein, damit falsch-positive Resultate minimiert
werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise markiert, so dass es
bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen
werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung
wohlbekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markern wie
z. B. 32P-markiertes ATP, Biotinylierung oder
Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger und
hoher Stringenz werden in Sambrook et al., siehe oben, bereitgestellt.
-
Bei
derartigen Bibliotheks-Screeningverfahren identifizierte Sequenzen
können
mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken, wie
z. B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt
und verfügbar
sind, verglichen und an diese angeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf
Aminosäure- oder auf Nucleotid-Ebene)
innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die volle Länge der
Sequenz hinweg kann durch Sequenzangleichung unter Verwendung von
Computersoftwareprogrammen, wie z. B. ALIGN, DNAstar und INHERIT
ermittelt werden, die verschiedene Algorithmen einsetzen, um Homologie/Sequenzidentität zu messen.
-
Nucleinsäure, die
eine für
Protein kodierende Sequenz aufweist, kann durch Screenen ausgewählter cDNA-
oder Genom-Bibliotheken unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten,
hergeleiteten Aminosäuresequenz
erlangt werden, und, falls erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher
Primerextensionsverfahren, wie sie in Sambrook et al., siehe oben,
beschrieben sind, um Vorläufer
und Prozessierungszwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die nicht
in cDNA revers transkribiert worden sind.
-
2. Auswahl und Transformation
von Wirtszellen
-
Wirtszellen
werden mit hierin zur Produktion der menschlichen Toll-Proteine
beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert
oder transformiert und auf herkömmlichen
Nährmedien
kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren,
zum Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten
Sequenzen kodierenden Gene modifiziert worden sind. Die Kultivierungsbedingungen,
wie z. B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen können vom
geübten
Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren
gewählt
werden. Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische
Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalial
Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL
Press (1991) und Sambrook et al. siehe oben.
-
Verfahren
der Transfektion sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, beispielsweise
CaPO
4 und Elektroporation. In Abhängigkeit
von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von
Standardtechniken durchgeführt,
die für
derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung, die wie in
Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben Calciumchlorid einsetzt,
oder die Elektroporation werden allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen
verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit
Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen
verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983) und in der am
29. Juni 1989 veröffentlichten
WO 89/05859 beschrieben
wird. Für
Säugetierzellen
ohne derartige Zellwände
kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren
von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978) eingesetzt werden.
Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransformationen
sind im
US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben
worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem
Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977) und
Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979) ausgeführt. Jedoch
können
auch andere Verfahren zur Einführung von
DNA in Zellen verwendet werden, wie z. B. mittels Kernmikroinjektion,
Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen,
oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin. Zu verschiedenen
Techniken zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et
al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990) und Mansour et
al., Nature 336, 348–352
(1988).
-
Geeignete
Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der DNA in die Vektoren
hierin umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete
Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf
Eubakterien, wie z. B. Gramnegative oder Gram-positive Organismen,
beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z. B. E. coli. Verschiedene
E. coli-Stämme
sind öffentlich
zugänglich,
wie z. B. E. coli K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC
31.537); E. coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
-
Zusätzlich zu
Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder
Hefe geeignete Klonierungs- und Expressionswirte für menschliche
Toll-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter
niederer eukaryotischer Wirtsmikroorganismus.
-
Geeignete
Wirtszellen zur Expression der glykosylierten menschlichen Toll-Proteine
stammen von mehrzelligen Organismen. Beispiele von Zellen wirbelloser
Tiere umfassen Insektenzellen, wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera
Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien
umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-)
und COS-Zellen. Speziellere Beispiele umfassen die mit SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie
(COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293
oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur,
Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR
(CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980));
Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980));
menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen
(Hep G2, HB 8065); und Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51).
Es wird davon ausgegangen, dass der Fachmann auf dem Gebiet der
Erfindung fähig
ist, die geeignete Wirtszelle auszuwählen.
-
3. Auswahl und Verwendung
eines Replikationsvektors
-
Die
für PRO358
kodierende Nucleinsäure
(z. B. cDNA oder genomische DNA) kann zur Klonierung (DNA-Amplifikation)
oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden.
Es sind verschiedene Vektoren öffentlich
zugänglich.
Der Vektor kann in Form eines Plasmids, Cosmids, Virusteilchens
oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine
Vielzahl von Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen
wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) unter
Anwendung von Techniken insertiert, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch
nicht eingeschränkt
auf eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsstartpunkt,
ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und
eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter
Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, setzt
standardmäßige Ligationstechniken
ein, die dem geübten
Fachmann bekannt sind.
-
Die
PRO358-Proteine können
nicht nur direkt rekombinant produziert werden, sondern auch als
Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptide, das eine Signalsequenz
und ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am
N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann
die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder kann ein
Abschnitt der PRO358-DNA
sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann
eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der
Gruppe der Alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen
Enterotoxin II-Leader gewählt
ist. Für
die Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces-
und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader,
Letzterer beschrieben im
US-Patent
Nr. 5.010.182 ) oder Saure-Phosphatase-Leader, der Glucoamylase-Leader
aus C. albicans (
EP 362.179 ,
veröffentlicht
am 4. April 1990) oder das in der am 15. November 1990 veröffentlichten
WO 90/13646 beschriebene
Signal sein. Bei der Säugetierzellexpression
können
Säugetier-Signalsequenzen
verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie
z. B. Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder
einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader.
-
Expressions-
sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die es dem Vektor ermöglicht,
sich in einer oder mehreren gewählten
Wirtszellen zu replizieren. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl
von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt
aus dem Plasmid pBR322 ist für die
meisten Gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet
und verschiedene Virusstartpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV
oder BPV) sind zur Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen geeignet.
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen,
das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene
kodieren für
Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine
verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin
verleihen, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) kritische
Nährstoffe
bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind,
z. B. das für
D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
-
Ein
Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, welche
die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der
PRO-358-Nucleinsäure
kompetent sind, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete
Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich
DHFR-Aktivität
defiziente CHO-Zelllinie, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980) beschrieben hergestellt und vermehrt
wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das
im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature
282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et
al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker
für einen
mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, sich in Tryptophan
zu vermehren, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones,
Genetics 85, 12 (1977)).
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor,
der operabel an die für
das PRO358-Protein kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um
die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Vielzahl
an möglichen
Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Zur Verwendung bei
prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase-
und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978);
Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische-Phosphatase,
ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res.
8, 4057 (1980); EP 36.776) und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor
(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)).
Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine
Shine-Dalgarno-(S. D.-) Sequenz enthalten, die operabel an die für PRO358
kodierende DNA gebunden ist.
-
Beispiele
geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefewirten umfassen
die Promotoren für
3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073
(1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme
Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie
z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase,
Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase,
Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
-
Andere
Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen
Vorteil der Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind,
sind die Promotorregionen für
Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure-Phosphatase, mit dem
Stickstoffmetabolismus assoziierte, abbauende Enzyme, Metallothionein,
Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose-
und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren
und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in
EP 73.657 näher beschrieben.
-
Die
Transkription von PRO358 aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise
von Vektoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, z. B. Polyoma-Virus,
Geflügelpocken-Virus
(
UK 2.211.504 , veröffentlicht
am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus,
Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus
und Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem
Actinpromotor oder einem Immunglobulin-Promotor und aus Hitzeschock-Promotoren
unter der Vorraussetzung erlangt werden, das derartige Promotoren
mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
-
Die
Transkription einer für
das PRO358-Polypeptid kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten kann gesteigert
werden, indem eine Enhancersequenz in den Vektor insertiert wird.
Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, die üblicherweise 10 bis 300 bp
lang sind, die an einem Promotor agieren, um seine Transkription
zu steigern. Es sind zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen
bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise
wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus eukaryotischer Zellen
verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer, den Polyoma-Enhancer
an der späten Seite
des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Die Enhancer
können
an einer Position 5' oder 3' der für PRO358
kodierenden Sequenz gespleißt
werden, befinden sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
-
Bei
eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere,
Mensch oder kernhaltigen Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen)
verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten,
die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der
mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise von den 5'- und, gelegentlich,
3'-untranslatierten
Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich.
Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente
im untranslatierten Abschnitt der für PRO358 kodierenden mRNA transkribiert
werden.
-
Weitere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese
von PRO285 in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind,
werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al.,
Nature 281, 40–46
(1979);
EP 117.060 ; und
EP 117.058 beschrieben.
-
4. Detektion von Genamplifikation/Genexpression
-
Genamplifikation
und/oder Genexpression kann in einer Probe direkt gemessen werden,
beispielsweise durch herkömmliches
Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der mRNA-Transkription (Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting
(DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer
geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten
Sequenzen. Alternativ dazu können
Antikörper
eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe
und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe erkennen können. Die
Antikörper können ihrerseits
markiert sein und der Test kann ausgeführt werden, wo der Duplex an
eine Oberfläche
gebunden ist, so dass bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die
Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
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Die
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren,
wie z. B. immunohistochemische Färbung
von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten
gemessen werden, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren.
Für die
immunohistochemische Färbung
und/oder den Test von Probenflüssigkeiten
zweckdienliche Antikörper
können
entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper sein und in jeglichem
Säugetier
hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen
PRO358-Polypeptide nativer Sequenz oder gegen ein synthetische Peptid
auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine
an PRO358-DNA fusionierte und für
ein spezifisches Antikörperepitop
kodierende exogene Sequenz hergestellt werden.
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5. Polypeptidreinigung
-
PRO358-Formen
können
aus Zellkulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden.
Falls es membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten
Tensidlösung
(z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran
freigesetzt werden. Bei der Expression von PRO358 eingesetzte Zellen
können
durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie z. B.
Einfrier-Auftau-Zyklen, Beschallung,
mechanisches Aufbrechen oder zelllysierende Mittel aufgebrochen
werden.
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Es
kann wünschenswert
sein, PRO358 von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden abzutrennen.
Die folgenden Verfahren sind beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren:
mittels Fraktionierung an Silika oder an einem Ionentauscherharz,
wie z. B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration,
beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75; Protein A-Sepharose-Säulen zur
Entfernung von Verunreinigungen, wie z. B. IgG; und metallkomplexierende
Säulen
zur Bindung Epitop-markierter Formen des Toll-Proteins. Verschiedene
Verfahren der Proteinreinigung können
eingesetzt werden, und derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt und beispielsweise bei Deutscher, Methods in Enzymology
182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag; New York (1982) beschrieben. Der/die Reinigungs schritt(e)
hängt/hängen beispielsweise
von der Beschaffenheit des verwendeten Produktionsprozesses und
dem jeweils produzierten Toll-Protein ab.
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E. Verwendungen für die Toll-Proteine und kodierenden
Nucleinsäuren
-
Nucleotidsequenzen
(oder ihr Komplement), die für
Toll-Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren, haben verschiedene
Anwendungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen
als Hybridisierungssonden, bei der Chromosomen- und Genkartierung
und bei der Erzeugung von Anti-Sense-RNA und DNA. Toll-Nucleinsäure wird
auch für
die Herstellung von PRO358-Polypeptiden durch hierin beschriebene
rekombinante Techniken zweckdienlich sein.
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Die
DNA40021-Gene nativer Sequenz und voller Länge, die für PRO358 oder Abschnitte davon
kodieren, können
als Hybridisierungssonden für
eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das Gen voller Länge zu isolieren
oder noch weitere Gene zu isolieren (beispielsweise jene, die für natürlich vorkommende Varianten
von PRO358 oder ihre weiteren menschlichen Homologe oder Homologe
aus anderen Spezies kodieren), die eine gewünschte Sequenzidentität mit der
in 1, 3 und 12A–B
offenbarten PRO358-Sequenz aufweisen. Optional beträgt die Länge der
Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von
der Nucleotidsequenz aus 13A–B (Seq.-ID
Nr. 14) abgeleitet werden oder aus genomischen Sequenzen, die Promotoren,
Enhancerelemente und Introns einer nativen Sequenz umfassen. Beispielhaft
wird ein Screeningverfahren das Isolieren der kodierenden Region
von PRO358 unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz umfassen,
um eine gewählte
Sonde von etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden
können
mit einer Reihe von Markern markiert sein, einschließlich Radionucleotiden,
wie z. B. 32P oder 35S,
oder enzymatischen Markern, wie z. B. alkalische Phosphatase, an
die Sonde gekoppelt über
Avidin/Biotin-Kopplungssysteme. Markierte Sonden mit einer Sequenz,
die zu derjenigen von PRO358 (DNA 47361) der vorliegenden Erfindung
komplementär
ist, können
zum Screenen von Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA
oder mRNA verwendet werden, um zu ermitteln, an welche Ele mente
derartiger Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungstechniken
werden in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
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Die
Sonden können
außerdem
in PCR-Techniken eingesetzt werden, um einen Pool von Sequenzen zur
Identifizierung nahe verwandter Toll-Sequenzen zu erzeugen.
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Nucleotidsequenzen,
die für
ein Toll-Protein hierin kodieren, können außerdem verwendet werden, um Hybridisierungssonden
zur Kartierung des Gens zu konstruieren, das für dieses Toll-Protein kodiert,
sowie für die
genetische Analyse von Individuen mit genetischen Störungen.
Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können an ein Chromosom und spezifische
Regionen eines Chromosoms kartiert werden, und zwar unter Anwendung
bekannter Techniken, wie z. B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse
gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screening
mit Bibliotheken.
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Die
menschlichen Toll-Proteine der vorliegenden Erfindung können außerdem in
Tests verwendet werden, um andere Proteine oder Moleküle zu identifizieren,
die an der Toll-vermittelten Signalübertragung beteiligt sind.
Beispielsweise ist PRO358 zweckdienlich bei der Identifizierung
der bislang unbekannten natürlichen Liganden
menschlicher Toll-Proteine oder anderer Faktoren, die (direkt oder
indirekt) an der Aktivierung und/oder Signalisierung durch einen
menschlichen Toll-Rezeptor, wie z. B. potentielle, mit einem Toll-Rezeptor assoziierte
Kinasen beteiligt sind. Außerdem
können
Inhibitoren der Rezeptor/Ligand-Bindungswechselwirkung identifiziert
werden. An derartigen Bindungswechselwirkungen beteiligte Proteine
können
außerdem
verwendet werden, um auf Peptide oder kleine Moleküle zu screenen,
die Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung sind.
Es können
Screeningtests konstruiert werden, um Leitsubstanzen zu finden,
welche die biologische Aktivität
eines nativen Toll-Polypeptids oder eines Liganden für ein natives
Toll-Polypeptid nachahmen. Derartige Screeningtests umfassen Tests,
die dem Hochdurchsatz-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind,
wodurch sie sich besonders zur Identifizierung kleiner Moleküle als Medikamentkandidaten
eignen. Vorgesehene kleine Moleküle
umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen.
Die Tests können
in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests,
biochemische Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierende
Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut charakterisiert sind.
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In-vitro-Tests
setzen ein Gemisch aus Verbindungen, einschließlich eines Toll-Rezeptor-Polypeptids ein,
das Teil eines Fusionsprodukts mit einem anderen Peptid oder Polypeptid,
z. B. einem Marker zur Detektion oder Verankerung usw. sein kann.
Das Testgemisch kann außerdem
(für Bindungstests)
ein natürliches intra-
oder extrazelluläres
Toll-bindendes Ziel umfassen (d. h., einen Toll-Liganden oder ein
weiteres Molekül, das
bekanntermaßen
den Toll-Rezeptor aktiviert und/oder durch diesen signalisiert).
Obgleich native Bindungsziele verwendet werden können, wird häufig bevorzugt,
einen Abschnitt derartiger nativer Bindungsziele zu verwenden (z.
B. Peptide), solange der Abschnitt für eine Bindungsaffinität und Avidität gegenüber dem
gegenständlichen
Toll-Protein sorgt, die im Test leicht gemessen werden kann. Das
Testgemisch enthält
außerdem
einen pharmakologischen Kandidaten-Wirkstoff. Kandidaten-Wirkstoffe
umfassen zahlreiche chemische Klassen und sind typischerweise organische
Verbindungen, vorzugsweise kleine organische Verbindungen und werden
aus einer Reihe von Quellen erlangt, einschließlich aus Bibliotheken synthetischer
oder natürlicher Verbindungen.
Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann ebenfalls im Gemisch enthalten
sein, wie z. B. Salze, Puffer, neutrale Proteine, z. B. Albumin,
Detergenzien, Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle
Mittel usw.
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Bei
In-vitro-Bindungstests wird das erhaltende Gemisch unter Bedingungen
inkubiert, wonach das Toll-Protein ohne die Gegenwart des Kandidaten-Moleküls das zelluläre Bindungsziel,
einen Abschnitt oder ein Analogon davon spezifisch mit einer Referenzaffinität bindet.
Die Komponenten des Gemischs können
in jeglicher Reihenfolge zugegeben werden, die für die erforderlichen Bindungen
sorgt, und Inkubationen können bei
jeglicher Temperatur durchgeführt
werden, welche die optimale Bindung fördert. Inkubationszeiten werden gleichermaßen für optimale
Bindung gewählt,
jedoch auch minimiert, um ein schnelles Hochdurchsatz-Screening
zu erleichtern.
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Nach
der Inkubation wird die durch das Mittel beeinflusste Bindung zwischen
dem Toll-Protein und einem oder mehreren Bindungszielen mithilfe
jeglicher zweckmäßigen Technik
nachgewiesen. Für
zellfreie Bindungstests wird häufig
ein Trennschritt verwendet, um gebundene von ungebundenen Komponenten
zu trennen. Die Trennung kann durch Präzipitation (z. B. TCA-Präzipitation,
Immunopräzipitation
usw.), Immobilisierung (z. B. an ein festes Substrat) usw., gefolgt
vom Waschen, zum Beispiel Membranfiltration (z. B. Ionentauscherpapier
P-18 von Whatman, hydrophobe GFC-Membran von Polyfiltronic usw.),
Gelchromatographie (z. B. Gelfiltration, Affinität usw.) herbeigeführt werden.
Für Toll-abhängige Transkriptionstests
wird die Bindung durch eine Änderung
der Expression eines Toll-abhängigen
Reporters nachgewiesen.
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Die
Detektion kann auf jegliche zweckdienliche Weise ausgeführt werden.
Für zellfreie
Bindungstests umfasst einer der Komponenten für gewöhnlich einen Marker oder sie
ist daran gekoppelt. Der Marker kann einen direkten Nachweis als
Radioaktivität,
Lumineszenz, optische Dichte oder Elektronendichte bereitstellen, oder
einen indirekten Nachweis bereitstellen, wie z. B. einen Epitopmarker,
ein Enzym usw. Eine Vielzahl an Verfahren kann verwendet werden,
um den Marker in Abhängigkeit
von der Beschaffenheit des Markers und anderen Testkomponenten nachzuweisen,
z. B. durch optische Dichte oder Elektronendichte, Strahlungsemissionen,
strahlungslose Energieübertragungen
usw. oder indirekt mit Antikörperkonjugaten.
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Nucleinsäuren, die
für PRO358
oder ihre modifizierten Formen kodieren, können außerdem verwendet werden, um
entweder transgene nicht-menschliche Tiere oder nicht-menschliche „Knockout"-Tiere zu erzeugen,
die wiederum bei der Entwicklung und beim Screening therapeutisch
zweckdienlicher Reagenzien verwendbar sind. Ein transgenes Tier
(z. B. eine Maus oder Ratte) ist ein nicht-menschliches Tier mit
Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in einem
pränatalen,
z. B. embryonalen Stadium in das Tier oder einen Vorfahren des Tiers
eingeführt
worden ist. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert
ist, aus dem sich ein transgenes Tier entwickelt. cDNA kann verwendet
werden, um für
PRO358 kodierende, genomische DNA zu klonieren, und zwar in Übereinstimmung
mit etablierten Techniken und den genomischen Sequenzen, die zur
Erzeugung transgener Tiere verwendet werden, die Zellen enthalten,
die für PRO358
kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Erzeugung von nicht-menschlichen
transgenen Tieren, insbesondere Tieren wie z. B. Mäusen und
Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung üblich geworden und sind beispielsweise
in den
US-Patenten Nr. 4.736.866 und
4.870.009 beschrieben. Typischerweise
wird auf bestimmte Zellen für
die Transgeninkorporation mit gewebespezifischen Enhancern abgezielt.
Transgene nicht-menschliche Tiere, die eine Kopie eines in einem
embryonalen Stadium in die Keimbahn des Tiers eingeführte Kopie
eines für
PRO358 kodierenden Transgens enthalten, können verwendet werden, um die
Wirkung der erhöhten
Expression von für
PRO358 kodierender DNA zu untersuchen. Derartige Tiere können als Versuchstiere
für Reagenzien
verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor
z. B. pathologischen Zuständen
verleihen, die mit seiner Expression verbunden sind. Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt und
ein vermindertes Auftreten des pathologischen Zustands im Vergleich
zu unbehandelten, das Transgen tragenden Tieren würde eine
mögliche
therapeutische Intervention für
den pathologischen Zustand anzeigen.
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Alternativ
dazu können
nicht-menschliche Wirbeltier- (z. B. Säugetier-)Homologe von PRO358
verwendet werden, um ein nicht-menschliches „Knockout"-Tier zu konstruieren, das ein defizientes
oder verändertes
für PRO358
kodierendes Gen aufweist, und zwar als Folge der homologen Rekombination
zwischen dem endogenen, für
PRO358-Protein kodierenden Gen und veränderter genomischer, für PRO358
kodierender, in eine embryonale Zelle des nicht-menschlichen Tiers
eingeführter
DNA. Beispielsweise kann für PRO358
kodierende cDNA verwendet werden, um für PRO358 kodierende genomische
DNA nach etablierten Techniken zu klonieren. Ein Abschnitt der für PRO358
kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes
Gen ersetzt werden, wie z. B. durch ein Gen, das für einen
selektierbaren Marker kodiert, der zur Beobachtung der Integration
verwendet werden kann. Typischerweise sind mehrere Kilobasen unveränderter,
flankierender DNA (sowohl am 5'-,
als auch am 3'-Ende)
im Vektor enthalten (siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503
(1987) für
eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird
in eine embryonale nicht-menschliche Stammzelllinie eingeführt (z.
B. durch Elektroporation) und es werden Zellen ausgewählt, in
denen die eingeführte
DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat (Siehe z. B.
Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die gewählten Zellen werden dann in
eine Blastozyte eines nicht-menschlichen
Tiers (z. B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationshybride
auszubilden (siehe z. B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic
Stern Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.), IRL,
Oxford, S. 113–152
(1987)). Ein nicht-menschlicher Hybridembryo kann dann in ein geeignetes
scheinträchtiges,
weibliches, nicht-menschliches Pflegetier implantiert und der Embryo
ausgetragen werden, um ein nicht-menschliches „Knockout"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, welche
die homolog rekombinierte rekombinante DNA in ihren Keimzellen beherbergen,
können
mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um
Tiere zu züchten,
bei denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Nicht-menschliche
Knockout-Tiere können
beispielsweise hinsichtlich ihrer Fähigkeit charakterisiert werden, sich
gegen gewisse pathologische Zustände
zu wehren, und hinsichtlich ihrer Entwicklung pathologischer Zustände aufgrund
der Abwesenheit der PRO358-Polypeptide.
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Für die hierin
offenbarten Toll-Polypeptide kodierende Nucleinsäure kann außerdem in der Gentherapie verwendet
werden. Bei Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um
die In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen Genprodukts,
z. B. zum Ersatz eines defizienten Gens zu erzielen. „Gentherapie" umfasst sowohl die
herkömmliche
Gentherapie, wobei eine dauerhafte Wirkung durch eine einzige Behandlung
erzielt wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen
Mitteln, was die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer
therapeutische wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und DNAs
können
als therapeutische Mittel zum Blockieren der Expression gewisser
Gene in vivo verwendet werden. Es ist bereits gezeigt worden, dass
kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo
sie als Inhibitoren agieren, und zwar trotz ihrer niedrigen intrazellulären Konzentrationen,
die von ihrer beschränkten
Aufnahme durch die Zellmembran verursacht werden (Zamecnit et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986)). Die Oligonucleotide
können
modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu erhöhen, z. B. durch Substituieren
ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
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Es
gibt eine Reihe von verfügbaren
Techniken zur Einführung
von Nucleinsäuren
in lebensfähige
Zellen. Die Techniken variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nucleinsäure in vitro,
oder in vivo in die Zellen des vorgesehenen Wirts transferiert wird.
Techniken, die für
den Transfer von Nucleinsäure
in Säugetierzellen
in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation,
Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren
usw. Die gegenwärtig
bevorzugten In-vivo-Gentransfertechniken umfassen die Transfektion
mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und die Virushüllprotein-Liposom-vermittelte
Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)).
Unter manchen Umständen
ist es wünschenswert,
die Nucleinsäurequelle
mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Zielzellen abzielt,
wie z. B. einem für
ein Zelloberflächenmembranprotein
oder die Zielzelle spezifischen Antikörper, einem Liganden für einen
Rezeptor auf der Zielzelle usw. Wo Liposomen eingesetzt werden,
können
Proteine, die an ein mit Endozytose in Verbindung stehendes Oberflächenmembranprotein
binden, zum Abzielen und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet
werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen
bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antiköper für Proteine, die im Zyklus internalisiert
werden, Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisierung abzielen und
die intrazelluläre
Halbwertszeit erhöhen.
Die Technik der Rezeptor-vermittelten Endozytose wird beispielsweise
von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987), und Wagner et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990) beschrieben. Für einen Überblick über die
gegenwärtig
bekannten Genmarkierungs- und Gentherapie-Protokolle siehe Anderson et
al., Science 256, 808–813
(1992).
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Die
verschiedenen im Zusammenhang mit den Toll-Proteinen hierin aufgezählten Verwendungen
sind auch für
Agonisten der nativen Toll-Rezeptoren gültig, die zumindest eine biologische
Funktion eines naiven Toll-Rezeptors nachahmen.
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F. Anti-Toll-Protein-Antikörper
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
Anti-Toll-Protein-Antikörper
bereit. Beispielhafte Antikörper umfassen
polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische Antikörper und
Heterokonjugat-Antikörper.
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1. Polyklonale Antikörper
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Die
Anti-Toll-Protein-Antikörper
können
polyklonale Antikörper
umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind
dem geübten
Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier
beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines Immunisierungsmittels
und, falls erwünscht, eines
Adjuvans hergestellt werden. Typischerweise wird das Immunisierungsmittel
und/oder Adjuvans durch mehrere subkutane oder intraperitoneale
Injektionen in das Säugetier
injiziert. Es kann zweckdienlich sein, das Immunisierungsmittel
an ein Protein zu konjugieren, das im zu immunisierenden Säugetier
bekanntermaßen immunogen
ist. Beispiele derartiger immunogener Proteine umfassen, sind jedoch
nicht eingeschränkt
auf Keyhole-Limpet-Hämocyanin,
Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnen-Trypsininhibitor. Beispiele von Adjuvantien,
die eingesetzt werden können,
umfassen Freund'sches
komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans(Monophosphoryl-Lipid A,
synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll
kann vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren
gewählt
werden.
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2. Monoklonale Antikörper
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Die
Anti-Toll-Protein-Antikörper
können
alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter
Verwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden, wie z. B. jenen,
die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) beschrieben
werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder
ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem Immunisierungsmittel
immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren
oder zur Produktion von Antikörpern
fähig sind, die
spezifisch an das Immunisierungsmittel binden. Alternativ dazu können Lymphozyten
in vitro immunisiert werden.
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Das
Immunisierungsmittel wird typischerweise die PRO358-Polypeptide
oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Im Allgemeinen werden entweder
Peripherblutlymphozyten (PBLs) verwendet, falls Zellen menschlichen
Ursprungs erwünscht
sind, oder es werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet,
falls nicht-menschliche Säugetierquellen
gewünscht
sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie
unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z. B.
Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle auszubilden
(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic
Press, S. 59–103
(1986)). Immortalisierte Zelllinien sind für gewöhnlich transformierte Säugetierzellen,
insbesondere Myelomzellen, die von Nagern, Rind und Mensch stammen. Üblicherweise
werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen
können
in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise
eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben
der unfusionierten, immortalisierten Zellen hemmt. Wenn beispielsweise
den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
(HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Medium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin,
Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") umfassen, wobei
diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindert.
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Bevorzugte
immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren,
eine starke Expression des Antikörpers
durch die selektierten, Antikörper
produzierenden Zellen fördern
und gegen ein Medium, wie z. B. HAT-Medium empfindlich sind. Bevorzugtere
immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise
vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California
und der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland bezogen
werden können.
Menschliche Myelomzelllinien und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien
sind außerdem
für die
Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben worden (Kozbor,
J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New
York, S. 51–63
(1987)).
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Das
Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann
dann auf die Gegenwart von gegen PRO358 gerichteten Antikörpern getestet
werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen
produzierten monoklonalen Antikörper
mittels Immunopräzipitation
oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. den Radioimmuntest
(RIA) oder Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) bestimmt. Derartige
Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die
Bindungsaffinität
des monoklonalen Antikörpers
kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse von Munson und Pollard,
Anal. Biochem. 107, 220 (1980) bestimmt werden.
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Nach
Identifizierung der gewünschten
Hybridomzellen können
die Klone mittels Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, siehe
oben). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise
Dulbecco's Modified
Eagle's Medium und
RMPI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in
vivo in Aszites in einem Säugetier
gezüchtet werden.
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Die
von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können aus
dem Kulturmedium oder aus der Aszitesflüssigkeit durch herkömmliche
Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z. B. Protein A-Sepharose,
Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie
isoliert oder gereinigt werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
können
außerdem
durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z. B.
jenen, die im
US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben
sind. Für
die monoklonalen Antikörper der
Erfindung kodierende DNA kann leicht unter Anwendung herkömmlicher
Verfahren isoliert und sequenziert werden (z. B. durch Verwendung
von Oligonucleotidsonden, die fähig
sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten
von Maus-Antikörpern
kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte
Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA
in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen,
wie z. B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder
Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein
pro duzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in rekombinanten Wirtszellen
zu erlangen. Die DNA kann außerdem
modifiziert werden, beispielsweise durch Ersetzen der kodierenden
Sequenz für
menschliche konstante Domänen
der Schwer- und Leichtketten anstelle der homologen Maus-Sequenzen
(
US-Patent Nr. 4.816.567 ;
Morrison et al., siehe oben) oder durch kovalentes Verbinden der
gesamten oder eines Abschnitts der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid
an die für
Immunglobulin kodierenden Sequenz. Die konstanten Domänen eines
Antikörpers
der Erfindung oder die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden
Stellen eines Antikörpers
der Erfindung können
durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ersetzt werden, um
einen bivalenten Hybridantikörper
zu erzeugen.
-
Die
Antikörper
können
monovalente Antikörper
sein. Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper sind
auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst
eines der Verfahren die rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter
Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen
Punkt in der Fc-Region trunkiert, so dass die Schwerkettenvernetzung
verhindert wird. Alternativ dazu werden die maßgeblichen Cysteinreste durch
einen anderen Aminosäurerest
ersetzt oder werden deletiert, um eine Vernetzung zu verhindern.
-
In-vitro-Verfahren
sind ebenfalls zur Herstellung monovalenter Antikörper geeignet.
Der Verdau von Antikörpern
zur Produktion von Fragmenten davon, insbesondere Fab-Fragmenten,
kann unter Verwendung routinemäßiger Techniken
erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
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3. Humanisierte und menschliche
Antikörper
-
Die
Anti-Toll-Antikörper
der Erfindung können
außerdem
humanisierte Antikörper
und menschliche Antikörper
umfassen. Humanisierte Formen nicht-menschlicher Antikörper (z.
B. Maus-Antikörper)
sind Chimäre
Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.
B. Fv, Fab, Fab',
F(ab')2 oder
andere antigenbin dende Untersequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz
enthalten, die von einem nicht-menschlichen Immunglobulin stammt.
Humanisierte Antikörper
umfassen menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), bei denen Reste einer
Complementary-determining-region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer
CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie
z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität ersetzt
sind. In manchen Fällen
werden Fv-Gerüstreste
des menschlichen Immunglobulins durch die entsprechenden nicht-menschlichen Reste
ersetzt. Humanisierte Antikörper
können
außerdem
Reste umfassen, die sich weder im Empfänger-Antikörper, noch in den importierten CDR-
oder Gerüst-Sequenzen
finden. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im
Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen
Domänen
umfassen, bei denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen
jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle
oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen
Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird
im Optimalfall außerdem
zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc),
typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins umfassen (Jones
et al., Nature 321, 522–525
(1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr.
Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)).
-
Verfahren
zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen
oder mehrere Aminosäurereste
auf, die in diesen aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt worden
sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne
entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem
Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321,
522–525
(1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science
239, 1534–1536
(1988)) durch Ersetzen von Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch
die entsprechenden Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen durchgeführt werden.
Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper Hybridantikörper (
US-Patent Nr. 4.816.567 ),
worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable
Domäne
durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies
ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise
menschliche Antikörper,
bei denen manche CDR-Reste und möglicherweise
manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern ersetzt
sind.
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Menschliche
Antikörper
können
außerdem
unter Verwendung verschiedener Techniken hergestellt werden, die
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken
(Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et
al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al.
und Boerner et al. sind zur Herstellung menschlicher monoklonaler
Antikörper
ebenfalls verfügbar (Cole
et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
S. 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)).
Gleichermaßen
können
menschliche Antikörper
durch Einführen
menschlicher Immunglobulin-Loci in transgene Tiere, z. B. Mäuse hergestellt
werden, bei denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder
vollständig
inaktiviert worden sind. Bei Exposition wird die Produktion menschlicher Antikörper beobachtet,
die jener in Menschen beobachteten in allen Aspekten, einschließlich Gen-Umordnung, Assemblierung
und Antikörperrepertoire
sehr ähnlich
ist. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den
US-Patenten Nr. 5.545.807 ;
5.545.806 ;
5.569.825 ;
5.625.126 ;
5.633.425 ;
5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen
Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992);
Lonberg et al., Nature 368, 856–859
(1994); Morrison, Nature 368, 812–13 (1994); Fishwild et al.,
Nature Biotechnology 14, 845–51 (1996);
Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar,
Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93
(1995).
-
4. Bispezifische Antikörper
-
Bispezifische
Antikörper
sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte Antikörper, die
Bindungsspezifitäten
für zumindest
zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall kann
einer der Bindungsspezifitäten
für das
PRO358-Protein, die andere für
ein anderes Antigen und vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein
oder einen Rezeptor oder eine Rezeptor-Untereinheit sein. Es ist
außer dem möglich, bispezifische
Antikörper
herzustellen, die Spezifitäten
gegen zwei unterschiedliche Toll-artige Proteine, wie z. B. beliebige
zwei der in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Toll-Homologe,
oder ein hierin offenbartes Toll-Protein und ein auf dem Gebiet
der Erfindung bekanntes Toll-Protein, z. B. TLR2 aufweisen. Derartige
bispezifische Antikörper
könnten
die Erkennung verschiedener Pathogenmuster durch Toll-Rezeptoren blockieren
und es wird daher von ihnen erwartet, dass sie signifikante Vorteile
bei der Behandlung von Sepsis und septischem Schock aufweisen.
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Verfahren
zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise
basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf
der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren,
wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen
(Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Wegen der zufälligen Auswahl
von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten produzieren diese Hybridome(Quadrome)
ein mögliches
Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die
richtige bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des richtigen
Moleküls
wird üblicherweise
durch affinitätschromatograpische
Schritte erzielt. Ähnliche
Verfahren sind in der am 13. Mai 1993 veröffentlichten
WO 93/08829 und in Traunecker et
al., EMBO J. 10, 3655–3659
(1991) offenbart.
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Variable
Domänen
von Antikörpern
mit den gewünschten
Bindungsspezifitäten
(Antikörper-Antigen-kombinierenden
Stellen) können
an lmmunglobulinsequenzen konstanter Domänen fusioniert werden. Die
Fusion erfolgt vorzugsweise mit der konstanten Domäne einer
Immunglobulin-Schwerkette, die zumindest einen Teil der Gelenks-,
CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste
konstante Region der Schwerkette (CH1), welche die für Leichtkettenbindung
benötigte
Stelle enthält,
in zumindest einer der Fusionen zugegen ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen
und, falls erwünscht,
für die
Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren
insertiert und werden in einen geeigneten Wirtsorganismus transfiziert.
Für weitere
Einzelheiten zur Erzeugung bi spezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh
et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
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5. Heterokonjugat-Antikörper
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Heterokonjugat-Antikörper liegen
ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind
aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Derartige
Antikörper
sind zum Abzielen von Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen
(
US-Patent Nr. 4.676.980 )
und zur Behandlung der HIV-Infektion
(
WO 91/00360 ;
WO 92/200373 ;
EP 03089 ) vorgeschlagen worden.
Es ist vorgesehen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung
bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener
Verfahren, die Vernetzungsmittel umfassen, hergestellt werden können. Beispielsweise
können
Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder
durch Bilden einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele
geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und
Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im
US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart
sind.
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G. Verwendungen für Anti-Toll-Protein-Antikörper
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Die
Anti-Toll-Antikörper
der Erfindung haben verschiedene Verwendungsmöglichkeiten. Zum Beispiel können Anti-PRO-358-Antikörper in
diagnostischen Tests auf PRO358 verwendet werden, z. B. zur Detektion seiner
Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum. Verschiedenartige
diagnostische, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Testtechniken
können
verwendet werden, wie z. B. kompetitive Bindungstests, direkte oder
indirekte Sandwich-Tests und Immunpräzipitationstests, die entweder
in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden (Zola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987)).
Die in diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung
markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung sollte fähig sein,
entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren.
Zum Beispiel kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop,
wie z. B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszierende oder chemilumineszente
Verbindung, wie z. B. Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin,
oder ein Enzym, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase
oder Meerrettichperoxidase sein. Es kann jegliches auf dem Gebiet
der Erfindung bekannte Verfahren zur Konjugation des Antikörpers an
eine nachweisbare Gruppierung eingesetzt werden, einschließlich jener Verfahren,
die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry
13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981);
und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982) beschrieben werden.
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Anti-PRO358-Antikörper sind
außerdem
zur Affinitätsreinigung
dieser Proteine aus rekombinanter Zellkultur oder aus natürlichen
Quellen zweckdienlich. Bei diesem Verfahren werden die Antikörper gegen
diese Toll-Proteine auf einem geeigneten Träger, wie z. B. Sephadex-Harz
oder Filterpapier unter Anwendung von Verfahren immobilisiert, die
auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Der immobilisierte
Antikörper
wird dann mit einer das Toll-Protein enthaltenden Probe kontaktiert,
und danach wird der Träger
mit einem geeigneten Lösungsmittel
gewaschen, das im Wesentlichen alles Material mit Ausnahme des an
den immobilisierten Antikörper
gebundenen PRO358-Proteins entfernt. Schließlich wird der Träger mit
einem anderen geeigneten Lösungsmittel
gewaschen, welches das Protein vom Antikörper freisetzt.
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Anti-Toll-Rezeptor
(d. h. Anti-PRO358-Antikörper)
kann auch zur Blockierung der biologischen Aktivitäten der
entsprechenden Toll-Rezeptoren zweckdienlich sein. Es wird angenommen,
dass die hauptsächliche Funktion
der Familie von Toll-Rezeptoren jene ist, als Pathogenerkennungsrezeptoren
zu fungieren, welche die Gegenwart von auf Mikroben vorhandenen
konservierten Molekülmustern
wahrnehmen. Lipopolysaccharide (LPS, auch als Endotoxine bekannt),
potentiell letale, von verschiedenen Bakterien produzierte Moleküle, binden
an das Lipopolysaccharid-bindende Protein (LBP) im Blut. Der gebildete
Komplex aktiviert dann einen als CD14 bekannten Rezeptor. Es gibt
auf dem Gebiet der Erfindung keinen Konsens darüber, was als nächstes geschieht.
Nach einer Hypothese instruiert CD14 nicht direkt Makrophagen, Cytokine,
Zelladhäsionsproteine
und Enzyme zu produzieren, die an der Produktion entzündungsfördernder
Vermittler niedrigen Molekulargewichts beteiligt sind, son dern ermöglicht es
dem LPS, einen zweiten Rezeptor zu aktivieren. Alternativ dazu ist
vorgeschlagen worden, dass LPS gewisse Rezeptoren direkt, ohne die
Hilfe von LBP oder CD14 aktivieren könnten. Die in der vorliegenden
Anmeldung offenbarten Daten weisen darauf hin, dass die menschlichen Toll-artigen
Rezeptoren Signalisierungsrezeptoren sind, die durch LPS in einer
LBP- und CD14-reaktiven Weise aktivieren. Da dieser Mechanismus
unter physiologischen Bedingungen zu einem häufig fatalen, septischer Schock
genannten Syndrom führen
kann, könnten
Anti-Toll-Rezeptor-Antikörper
(genau wie andere Toll-Rezeptor-Antagonisten) bei der Behandlung
von septischem Schock zweckdienlich sein. Es ist vorauszusehen, dass
die verschiedenen Toll-Rezeptoren unterschiedliche Pathogene erkennen
könnten,
z. B. verschiedene Stämme
von Gram-negativen oder Gram-positiven Bakterien. Demgemäß kann unter
gewissen Umständen eine
Kombinationstherapie mit einem Gemisch von Antikörpern, die spezifisch verschiedene
Toll-Rezeptoren binden, oder die Verwendung von bispezifischen Anti-Toll-Antikörpern wünschenswert
sein.
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Es
wird hierin speziell gezeigt, dass Anti-huTLR2-Antikörper besonders
zweckdienlich zur Blockierung der Induktion dieses Rezeptors durch
LPS sind. Da gezeigt worden ist, dass LPS-Exposition zu septischem Schock
führen
kann (Parrillo, N. Engl. J. Med. 328, 1471–1477 (1993)), sind Anti-huTLR2-Antikörper bei
der Behandlung von septischem Schock möglicherweise zweckdienlich.
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Die
vorangehend im Zusammenhang mit den Anti-Toll-Rezeptor-Antikörpern aufgezählten therapeutischen
und diagnostischen Verwendungen sind auch auf andere Toll-Antagonisten,
d. h., andere Moleküle
(Proteine, Peptide, kleine organische Moleküle usw.) anwendbar, welche
die Toll-Rezeptor-Aktivierung und/oder die durch Toll-Rezeptoren vermittelte
Signalübertragung
blockieren.
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Angesichts
ihres therapeutischen Potenzials werden die Toll-Proteine (einschließlich Varianten
der nativen Toll-Homologe) und ihre Agonisten und Antagonisten (einschließlich, jedoch
nicht eingeschränkt
auf Anti-Toll-Antikörper)
in Zusammensetzungen inkorporiert, die für therapeutische Verwendung
zweckdienlich sind. Therapeutische Zusammensetzungen werden zur
Lagerung hergestellt, indem der aktive Be standteil mit dem gewünschten
Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten
oder Stabilisatoren (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., A. Osol (Hrsg.), Ausgabe 1980)
in Form lyophilisierter Formulierungen oder wässriger Lösungen vermischt wird. Annehmbare
Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen
und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B.
Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare
(weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin,
Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon,
Aminosäuren,
wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide,
Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder
Dextrine; Komplexierungsmittel, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole,
wie z. B. Mannit oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z.
B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. Tween, Pluronics
oder PEG.
-
Die
aktiven Bestandteile können
außerdem
in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken
oder durch Grenzflächenpolymerisation
hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder
Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln,
in kolloidalen Medikamentabgabesystemen (beispielsweise Liposomen,
Albumin-Mikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen
eingeschlossen sein. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical
Sciences (siehe oben) offenbart.
-
Die
zur Verabreichung in vivo zu verwendenden Formulierungen müssen steril
sein. Die kann leicht mittels Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen
von oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt werden.
-
Therapeutische
Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter gefüllt, der
eine sterile Füllöffnung aufweist,
beispielsweise in einen Beutel für
intravenöse
Lösungen
oder in ein Fläschchen mit
einem von einer Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
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Der
Verabreichungsweg steht mit bekannten Verfahren im Einklang, z.
B. Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale,
intrazerebrale, intramuskuläre,
intraokulare, intraarterielle oder intraläsionale Wege, topische Verabreichung
oder durch Depotsysteme.
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Geeignete
Beispiele von Präparaten
mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Polymermatrices
in Form von Formteilchen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln. Matrices
für nachhaltige
Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide (
US-Patente Nr. 3.773.919 ,
EP 58.481 ), Copolymere von
L-Glutaminsäure
und γ-Ethyl-L-glutamat
(U. Sidman et al., Biopolymers 22(1), 547–556 (1983)), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat)
(R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981)
und R. Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982)), Ethylenvinylacetat
(R. Langer et al., Id.) oder Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure (
EP 133.988 ). Zusammensetzungen
mit nachhaltiger Freisetzung umfassen außerdem Liposomen. Liposomen,
die ein Molekül
enthalten, das im Schutzumfang der Erfindung liegt, werden durch
an sich bekannte Verfahren hergestellt:
DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692
(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980);
EP 52322 ;
EP 36676 A ,
EP 88046 ;
EP
143949 ;
EP 142641 ;
Japanische Patentanmeldung 83-118008 ;
US-Patente Nr. 4.485.045 und
4.544.545 ; und
EP 102.324 . Für gewöhnlich sind die Liposomen vom
kleinen (etwa 200–800
Angström)
unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt höher als etwa 30 Mol-% Cholesterin
ist, wobei der gewählte
Anteil auf die optimale NT-4-Therapie eingestellt wird.
-
Eine
wirksame Menge des aktiven Bestandteils wird beispielsweise von
den therapeutischen Zeilen, dem Verabreichungsweg und dem Leiden
des Patienten abhängen.
Demgemäß wird notwendig
sein, dass der Therapeut die Dosierung titriert und den Verabreichungsweg
wie erforderlich modifiziert, um die optimale therapeutische Wirkung
zu erzielen. Eine typische tägliche
Dosis kann im Bereich von 1 μg/kg
bis zu 100 mg/kg oder mehr in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren
liegen. Typischerweise wird der Kliniker ein Molekül der vorliegenden
Erfindung verabreichen, bis eine Dosis erreicht ist, die für die erforderliche
biologische Wirkung sorgt. Der Fortschritt der Therapie kann leicht
durch herkömmliche
Tests verfolgt werden.
-
Die
folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken
bereitgestellt und beabsichtigen in keiner Weise eine Einschränkung des
Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
-
Alle
in der vorliegenden Patentbeschreibung zitierten Patente und Literaturstellen
sind hiermit zur Gänze
durch Verweis aufgenommen.
-
BEISPIELE
-
Im
Handel erhältlich
Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden,
sofern nicht anders angegeben, nach den Anleitungen der Hersteller
verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen
und in der gesamten Patentbeschreibung durch ATCC-Zugangsnummern
gekennzeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, USA.
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BEISPIEL 1
-
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches
PRO358 kodieren
-
Die
Sequenzen einer extrazellulären
Domäne
(ECD) (einschließlich
der Sekretionssignalsequenz, wenn eine vorliegt) aus bekannten Elementen
der menschlichen Toll-Rezeptorfamilie
wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken
umfassten öffentliche
EST-Datenbanken (z. B. GenBank) und eine proprietäre EST-Datenbank
(LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo
Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des BLAST- oder BLAST2-Computerprogramms
durchgeführt
[Altschul et al.; Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)] als Vergleich
der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen.
Diese Vergleiche, die zu einer BLAST-Zahl von 70 (oder in einigen
Fällen 90)
oder mehr führten,
die nicht für
bekannte Proteine kodierten, wurden geclustered und in Consensus-DNA-Sequenzen
mit dem Programm „phrap" angeordnet (Phil
Green, University of Washington, Seattle, Washington).
-
Ein
EST wurde in der Incyte Datenbank identifiziert (INC3115949).
-
Auf
Basis der EST-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert, um durch
PCR eine DNA-Bibliothek zu identifizieren, welche die Sequenz von
Interesse enthielt und zur Verwendung als Sonden, zum Isolieren eines
Klons der für
PRO358 kodierenden Sequenz voller Länge.
-
Ein
Paar von PCR-Primern (Vorwärts
und Rückwärts) wurde
synthetisiert:
-
Es
wurde auch eine Sonde synthetisiert:
-
Um
mehrere Bibliotheken auf eine Quelle eines Klons voller Länge zu screenen,
wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit dem
oben festgelegten PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek
wurde dann verwendet, um für
das PRO358-Gen kodierende Klone unter Verwendung des Sondenoligonucleotids
und eines der PCR-Primer zu isolieren.
-
RNA
zur Herstellung der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem Knochenmark
isoliert (LIB256). Die cDNA-Bibliotheken, die verwendet wurden,
um die cDNA-Klone zu isolieren, wurden durch Standardverfahren unter
Verwendung von im Handel erhältlichen
Reagenzien wie z. B. von Invitrogen, San Diego, CA hergestellt.
Die cDNA wurde mit Oligo-dT geprimed, das eine NotI-Stelle enthielt,
stumpfendig an SalI-Adaptoren gebunden,
die mit Hämokinase
behandelt worden waren, mit NotI gespalten, in geeigneter Weise
durch Gelelektrophorese auf eine bestimmte Größe gebracht und in einer definierten
Ausrichtung in den einzigartigen XhoI- und NotI-Stellen in einen geeigneten Klonierungsvektor
kloniert (wie z. B. pRKB oder pRKD, pRK5B ist ein Vorläufer von
pRK5D, der nicht die Sfil-Stelle enthält, siehe Holmes et al.; Science
253, 1278–1280
(1991)).
-
DNA-Sequenzierung
der Klone, die wie oben beschrieben isoliert wurden, ergab die DNA-Sequenz voller
Länge für PRO358
(13A, und 13B,
Seq.-ID Nr. 14) und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO358 (12A und 12B,
Seq.-ID Nr. 13).
-
Die
gesamte Nucleotidsequenz des identifizierten Klons (DNA47361) ist
in den 13A–B (Seq.-ID Nr. 14) dargestellt.
Klon DNA47361 enthält
einen einzigen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle
(ATG-Startsignal) an Nucleotidpositionen, die in den 13A und 13B unterstrichen sind.
Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer
ist 811 Aminosäuren
lang, einschließlich
einer mutmaßlichen
Signalsequenz (Aminosäuren
1 bis 19), einer extrazellulären
Domäne
(Aminosäuren
20 bis 575, einschließlich leucinreicher
Wiederholungen in der Region von Position 55 bis Position 575),
einer mutmaßlichen
Transmembrandomäne
(Aminosäuren
576 bis 595). Klon DNA47361 (DNA47361-1249 genannt) ist bei der
ATCC hinterlegt worden und es wurde diesem die ATCC-Hinterlegungsnummer
209431 zugeteilt.
-
Auf
Basis einer BLAST- und FastA-Sequenzangleichungsanalyse (unter Verwendung
des Computerprogramms ALIGN) der Sequenz voller Länge von
PRO358 ist die DNA ein menschliches Homolog des Drosophila-Toll-Proteins
und ist zu den folgenden menschlichen Toll-Proteinen homolog: Tollt
(DNAX# HSU88540-1, das mit der zufallssequenzierten cDNA# HUMRSC786-1
voller Länge
identisch ist); Toll2 (DNAX# HSU88878-1); Toll3 (DNAX# HSU88879-1);
und Toll4 (DNAX# HSU88880-1).
-
Beispiel 2
-
Verwendung von PRO358-DNA als Hybridisierungssonde
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für PRO358
kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde. In der folgenden
Beschreibung werden diese Proteine kollektiv als „Toll-Homologe" bezeichnet.
-
Die
kodierende Sequenz eines Toll-Homologs umfassende DNA wird als Sonde
eingesetzt, um auf homologe DNAs (wie z. B. jene, die für natürlich vorkommende
Varianten dieser speziellen Toll-Proteine kodieren) in cDNA-Bibliotheken
menschlicher Gewebe oder Genombibliotheken menschlicher Gewebe zu
screenen.
-
Hybridisierung
und Waschen von Filtern, die eine der beiden Bibliothek-DNAs enthalten,
werden unter den folgenden hochstringenten Bedingungen durchgeführt. Die
Hybridisierung von radioaktiv markierter, Toll-Homolog-hergeleiteter
Sonde an die Filter wird in einer Lösung aus 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1%
SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardt-Lösung und
10% Dextransulfat bei 42°C
für 20
Stunden durchgeführt.
Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung von 0,1 × SSC und
0,1% SDS bei 42°C
durchgeführt.
-
DNAs,
die eine gewünschte
Sequenzidentität
mit der DNA aufweisen, die für
das Toll-Homolog voller Länge
und nativer Sequenz kodiert, können
dann unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten
Standardtechniken identifiziert werden.
-
Beispiel 3
-
Expression von PRO358 in E. coli
-
Dieses
Beispiel illustriert die Herstellung einer unglykosylierten Form
von PRO358 („Toll-Homolog") durch rekombinante
Expression in E. coli.
-
Die
für ein
Toll-Homolog kodierende DNA-Sequenz wird zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer
amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten,
die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen.
Es kann eine Vielzahl an Expressionsvektoren eingesetzt werden.
Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (das aus E. coli
stammt; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), das Gene für Ampicillin-
und Tetracyclinresistenz enthält.
Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert.
Die mittels PCR amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor
ligiert. Der Vektor wird vorzugs weise Sequenzen umfassen, die für ein Antibiotikaresistenzgen,
einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (einschließlich der
ersten sechs STII-Codons, Polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltstelle), die
kodierende Region, Lambda-Transkriptionsfaktor und ein argU-Gen
kodieren.
-
Das
Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen gewählten E.
coli-Stamm unter Anwendung der in Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen
Verfahren zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer
Fähigkeit
identifiziert, sich auf LB-Platten zu vermehren, worauf gegen Antibiotikum
resistente Kolonien selektiert werden. Plasmid-DNA kann isoliert
und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
-
Selektierte
Klone können über Nacht
in Flüssigkulturmedium,
wie z. B. mit Antibiotika ergänzter LB-Brühe gezüchtet werden.
Die Übernachtkultur
kann anschließend
verwendet werden, um eine Kultur im größeren Maßstab zu inokulieren. Die Zellen
werden dann auf die gewünschte
optische Dichte gezüchtet,
wobei während
der Züchtung
der Promotor eingeschaltet wird.
-
Nach
dem Kultivieren der Zellen für
mehrere weitere Stunden können
die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das mittels Zentrifugation
erlangte Zellpellet kann unter Verwendung von verschiedenen, auf dem
Gebiet der Erfindung bekannten Mitteln solubilisiert und das solubilisierte
Toll-Homolog dann unter Verwendung einer Metallchelatsäule unter
Bedingungen gereinigt werden, die eine starke Bindung des Proteins ermöglichen.
-
Beispiel 4
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Expression von PRO358 in Säugetierzellen
-
Dieses
Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form von
PRO358 („Toll-Homolog") durch rekombinante
Expression in Säugetierzellen.
-
Der
Vektor pRK5 (Siehe
EP 307.247 ,
veröffentlicht
am 15. März
1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird
die für
Toll-Homolog kodierende DNA mit gewählten Restriktionsenzymen in pRK5
ligiert, um die Insertion der für
Toll-Homolog kodierenden
DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren zu ermöglichen,
wie sie z. B. in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben werden.
Der resultierende Vektor wird pRK5-PRO358 genannt.
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In
einer der Ausführungsformen
können
die Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL
1573) werden in Gewebekulturplatten auf Konfluenz gezüchtet, und
zwar in Medium, wie z. B. in mit Fötalkälberserum und gegebenenfalls
Nährstoffkomponenten
und/oder Antibiotika ergänztem
DMEM. Etwa 10 μg
pRK5-PRO-358-DNA
wird mit etwa 1 μg
für das
VA-RNA-Gen kodierender DNA (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982))
vermischt und in 500 μl
1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 gelöst. Diesem Gemisch
werden tropfenweise 500 μl
50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 zugegeben
und es wird die Bildung eines Präzipitats
für 10
Minuten bei 25°C
ermöglicht.
Das Präzipitat
wird suspendiert und den 293-Zellen zugegeben und für etwa vier
Stunden bei 37°C
absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt und es werden
2 ml 20%iges Glycerin in PBS für
30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem
Medium gewaschen, worauf frisches Medium zugesetzt und die Zellen
für etwa
5 Tage kultiviert werden.
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Ungefähr 24 Stunden
nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch
Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium ersetzt, das 200 μCi/ml 35S-Cystein und 200 μCi/ml 35S-Methionin
enthält.
Nach 12 Stunden Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt,
mit einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf ein 15%-iges SDS-Gel geladen.
Das verarbeitete Gel kann getrocknet und zur Belichtung eines Film
für eine
definierte Zeit verwendet werden, um die Gegenwart von Polypeptid
nachzuweisen. Die die transfizierten Zellen enthaltenden Kulturen
können
einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen und
das Medium in ausgewählten
Biotests getestet werden.
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In
einer alternativen Technik kann Toll-Homolog-DNA vorübergehend
in 293-Zellen eingeführt
werden, und zwar unter Anwendung des von Somparyrac et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981) beschriebenen Verfahrens. 293-Zellen
werden in einer Spinnerflasche auf maximale Dichte gezüchtet und
es werden 700 μg pRK5-PRO(358)-DNA zugegeben.
Die Zellen werden zunächst
mittels Zentrifugation aus der Spinnerflasche konzentriert und mit
PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet
für vier
Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin für 90 Sekunden
behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Gewebekulturmedium,
5 μg/ml
Rinderinsulin und 0,1 μg/ml
Rindertransferrin enthaltende Spinnerflasche rückgeführt. Nach etwa vier Tagen wird
das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen
und Trümmer
zu entfernen. Die das entsprechende exprimierte Toll-Homolog enthaltende
Probe kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren, wie z. B.
Dialyse und/oder Säulenchromatographie
konzentriert und gereinigt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
die Toll-Homologe in CHO-Zellen exprimiert werden. Die pRK5-Vektoren
können
unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z. B. CaPO4 oder
DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben
können
die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine)
oder Kulturmedium ersetzt werden, das einen radioaktiven Marker,
wie z. B. 35S-Methinin enthält. Nach
dem Feststellen der Gegenwart von PRO358-Polypeptid kann das Kulturmedium durch
serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen
für etwa
6 Tage inkubiert und das konditionierte Medium dann geerntet. Das
das exprimierte Toll-Homolog enthaltende Medium kann dann mit einem
beliebigen gewählten
Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
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Epitopmarkierte
Toll-Homologe können
ebenfalls in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Die Toll-Homolog-DNA
kann aus dem pRK5-Vektor heraus subkloniert werden. Das Subklon-Insert
kann einer PCR unterzogen werden, um In-Frame mit dem gewählten Epitopmarker,
wie z. B. dem Poly-His-Marker in einen Baculovirus-Expressionsvektor
zu fusionieren. Das Poly-His-markierte Insert kann dann in einen
SV40-angetriebenen
Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z. B.
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DHFR
zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie oben
beschrieben) mit dem SV40-angetriebenen Vektor transfiziert werden.
Es kann wie oben beschrieben eine Markierung durchgeführt werden,
um die Expression zu verifizieren. Das das exprimierte Poly-His-markierte
Toll-Homolog enthaltende Kulturmedium kann dann mit einem beliebigen
gewählten
Verfahren, wie z. B. Ni2 +-Chelat-Affinitätschromatographie
konzentriert und gereinigt werden.
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Beispiel 5
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Expression von PRO358 in Hefe
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO358
(„Toll-Homolog”) in Hefe.
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Zunächst werden
Expressionsvektoren für
intrazelluläre
Produktion oder Sekretion eines Toll-Homologs aus dem ADH2/GAPDH-Promotor
konstruiert. Für
das gewünschte
Toll-Homolog kodierende DNA, ein gewähltes Signalpeptid und der
Promotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen im gewählten Plasmid insertiert,
um die intrazelluläre
Expression zu steuern. Zur Sekretion kann für das gewählte Toll-Homolog kodierende
DNA in das gewählte
Plasmid kloniert werden, und zwar zusammen mit für den ADH2/GAPDH-Promotor kodierender
DNA, der Hefe-α-Faktor-Sekretionssignal/Leader-Sequenz
und Linkersequenzen (falls benötigt)
zur Sekretion.
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Hefezellen,
wie z. B. Stamm AB110, können
dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert
und in gewählten
Fermentationsmedien kultiviert werden. Die Überstände der transformierten Hefe
können
mittels Präzipitation
mit 10% Trichloressigsäure
und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff
analysiert werden.
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Rekombinante
Toll-Homologe können
anschließend
isoliert und gereinigt werden, indem die Hefezellen aus dem Fermentationsmedium
mittels Zentrifugation entfernt werden und das Medium dann unter
Verwendung gewählter
Kartuschenfilter konzen triert wird. Das das Toll-Homolog enthaltende
Konzentrat kann unter Verwendung gewählter Säulenchromatographieharze weiter
gereinigt werden.
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Beispiel 6
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Expression von PRO358 in Baculovirus-infizierten
Insektenzellen
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Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO358
(„ Toll-Homolog") in Baculovirus-infizierten
Insektenzellen.
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Die
für das
Toll-Homolog kodierende Sequenz wird stromauf eines in einem Baculovirus-Expressionsvektor
enthaltenen Epitopmarkers fusioniert. Derartige Epitopmarker umfassen
Poly-His-Marker und Immunglobulinmarker (wie z. B. Fc-Regionen von
IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide,
die aus handelsüblichen
Plasmiden, wie z. B. pVL1393 (Novagen) stammen. Zusammenfassend
wird die kodierende Sequenz oder der gewünschte Abschnitt der kodierenden
Sequenz (wie z. B. die für
die extrazelluläre
Domäne
kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu
den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind.
Der 5'-Primen kann
flankierende (gewählte)
Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit diesen
gewählten
Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
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Der
rekombinante Baculovirus wird durch Cotransfizieren des obigen Plasmids
und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen)
in Spodoptera frugiperda-(„Sf9"-) Zellen (ATCC CRL
1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich)
erzeugt. Nach 4–5
Tagen Inkubation bei 28°C
werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet.
Virusinfektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus
expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford
(1994) beschrieben durchgeführt.
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Exprimiertes
Poly-His-markiertes Toll-Homolog kann dann zum Beispiel mittels
Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie
wie folgt gereinigt werden. Extrakte aus rekombinanten virusinfizierten
Sf9-Zellen werden wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993)
beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen in Beschallungspuffer
(25 mM Hepes, pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 0,1
mM EDTA; 10% Glycerin; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) gewaschen, resuspendiert
und zweimal für
20 Sekunden auf Eis beschallt. Die beschallten Proben werden mittels
Zentrifugation geklärt
und der Überstand
wird 50-fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10%
Glycerin, pH 7,8) verdünnt
und durch ein 0,45 μm-Filter
filtriert. Eine Ni2 +-NTA-Agarosesäule (im
Handel von Qiagen erhältlich)
wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser
gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte
Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird
mit Beladungspuffer bis zum Erreichen der A280-Basislinie
gewaschen, worauf das Fraktionensammeln begonnen wird. Als nächstes wird
die Säule
mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10%
Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der unspezifisch gebundenes Protein
eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A280-Basislinie
wird die Säule
mit einem Gradienten von 0 bis 500 mM Imidazol im zweiten Waschpuffer
entwickelt. Es werden 1 ml-Fraktionen gesammelt und mittels SDS-PAGE
und Silberfärbung
oder Western-Blot mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Ni2 +-NTA(Qiagen) analysiert.
Das eluierte, His10-markierte Polypeptid
enthaltende Fraktionen werden vereinigt und gegen Beladungspuffer
dialysiert.
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Alternativ
dazu kann die Reinigung von IgG-markierten (oder Fc-markierten)
Toll-Homologen unter Verwendung
bekannter Chromatographietechniken, einschließlich beispielsweise Protein
A- oder Protein G-Säulenchromatographie
durchgeführt
werden.
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Beispiel 7 (Bezugsbeispiel)
-
NF-κB-Test
-
Da
die Toll-Proteine über
den NF-κB-Weg
signalisieren, kann ihre biologische Aktivität in einem NF-κB-Test getestet
werden. Bei diesem Test werden Jurkat-Zellen vorübergehend unter Verwendung
von Lipofectamin-Reagens (Gibco-BRL) nach den Anleitungen des Herstellers
transfiziert. 1 μg
pB2XLuc-Plasmid, welches das NF-κB-angetriebene Luciferase-Gen
enthält,
wird mit 1 μg
pSRαN-Expressionsvektor
mit oder ohne das für
PRO285 kodierende Insert cotransfiziert. Als positive Kontrolle
werden Zellen mit PMA (Phorbol-Myristylacetat; 20 ng/ml) und PHA
(Phytohämagglutinin,
2 μg/ml)
für drei
bis vier Stunden behandelt. Die Zellen werden 2 oder 3 Tage später zur
Messung von Luciferaseaktivität
unter Verwendung von Reagenzien von Promega lysiert.
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Beispiel 8
-
Herstellung von Antikörpern, die PRO358 binden
-
Dieses
Beispiel illustriert die Herstellung monoklonaler Antikörper, die
PRO358 („Toll-Homolog”) spezifisch
binden können.
-
Techniken
zur Produktion der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding (siehe oben)
beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigte Toll-Homologe,
das gewünschte
Toll-Homolog enthaltende Fusionsproteine und Zellen, die rekombinante
Toll-Homologe an der Zelloberfläche
exprimieren. Die Wahl des Immunogens kann vom geübten Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren
getroffen werden.
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Mäuse, wie
z. B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freund'schem Adjuvans emulgierten
Toll-Homolog-Immunogen immunisiert und in einer Menge von 1–100 Mikrogramm
subkutan oder intraperitoneal injiziert. Alternativ dazu wird das
Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Mailton, MT)
emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten
Mäuse werden
dann 10 bis 12 Tage später
mit zusätzlichem,
im gewählten
Adjuvans emulgierten Immunogen geboostet. Danach können die
Mäuse außerdem mit
zusätzlichen
Immunisierungsinjektionen für
mehrere Wochen geboostet werden. Serumproben können aus den Mäusen in
regelmäßigen Abständen mittels
retroorbitaler Blutung zum Testen in ELISA-Tests erlangt werden,
um Antikörper
nachzuweisen.
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Nachdem
ein geeigneter Antikörpertiter
detektiert worden ist, können
die bezüglich
Antikörper "positiven" Tiere mit einer
letzten intravenösen
Injektion eines Toll-Homologs injiziert werden. Drei bis vier Tage
später
werden die Mäuse
getötet
und die Milzzellen gesammelt. Die Milzzellen werden dann (unter
Verwendung von 35%igem Polyethylenglykol) mit einer gewählten Maus-Myelomzelllinie,
wie z. B. P3X63AgU.1 (erhältlich von
ATCC, Nr. CRL 1597) fusioniert. Die Fusionen liefern Hybridomzellen,
die dann in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert werden können, die
HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, um die
Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden
zu hemmen.
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Die
Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen
das entsprechende Toll-Homolog getestet. Die Feststellung „positiver" Hybridomzellen,
welche die gewünschten
monoklonalen Antikörper
gegen ein Toll-Homolog sekretieren, ist dem Fachmann auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt.
-
Die
positiven Hybridomzellen können
intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites
zu produzieren, welche die monoklonalen Anti-Toll-Homolog-Antikörper enthalten.
Alternativ dazu können
die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollflaschen gezüchtet werden.
Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann
unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie
erzielt werden. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie auf Basis
der Bindung von Antikörper
an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
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Beispiel 9
-
HuTLR2 vermittelt Lipopolysaccharid-(LPS-)
induzierte Zellsignalisierung
-
Verfahren
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Reagenzien.
[3H]-markiertes, unmarkiertes LCD25 und
LPS aus S. minnesota R595 wurden von List Biochemicals (Campbell,
CA) und alle anderen LPS von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)
bezogen. LP wurde als konditioniertes Medium aus mit einem menschlichen
LBP-Expressionsvektor transfizierten 293-Zellen bereitgestellt.
Das TLR2-Fc-Fusionsprotein wurde mittels Baculovirus-System produziert
und wie beschrieben gereinigt. Market al., J. Biol. Chem. 269, 10720–10728 (1994).
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Konstruktion
von Expressionsplasmiden. Eine für
menschliches TLR2 kodierende cDNA wurde aus einer menschlichen Fötallungenbibliothek
kloniert. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz stimmte mit der
vorher veröffentlichten
Sequenz (Rock et al., siehe oben) mit Ausnahme einer Glu→Asp-Substitution
an der Aminosäure
726 überein.
Die aminosäureterminale
Epitopmarker-Version von TLR2 (dG.TLR2) wurde konstruiert, indem
eine XhoI-Restriktionsstelle unmittelbar stromauf von Leucin an
Position 17 (der ersten Aminosäure
der vorhergesagten reifen Form von TLR2) angefügt und dieses an die Aminosäuren 1–53 von
Glykoprotein D aus Herpes-Simplex-Virus Typ 1 wie beschrieben gebunden
wurde. Mark et al., siehe oben. PCR-Produkte wurden sequenziert
und in einen Säugetier-Expressionsvektor
subkloniert, der das Puromycin-Resistenzgen enthält. C-terminale Trunkationsvarianten
von gD.TLR2 wurden konstruiert, indem die cDNA an einer in der kodierenden
Sequenz der intrazellulären
Domäne
vorhandenen BlpI-Stelle (Variante Δ1) oder NsiI-Stelle (Variante Δ2) und an
einer im 3'-Polylinker
des Expressionsvektors vorhandenen NotI-Stelle verdaut wurde, gefolgt
von Ligation von Oligonucleotidlinkern.
-
-
Das
CD4/TLR2-Hybrid wurde mittels PCR konstruiert und enthielt die Aminosäuren 1–205 (das
Signalpeptid und zwei Immunglobulin-artige Domänen) von menschlichem CD4 fusioniert
an die Aminosäuren 588–784 (die
Transmembrandomäne
und intrazelluläre
Domäne)
von menschlichem TLPR2 mit einem vom Linker kodierten Valin an der
Verbindungsstelle der CD4- und TLR2-Sequenzen. Das pGL3.ELAM.tk-Reporterplasmid enthielt
insertiert
zwischen den SacI- und HindIII-Stellen des Luciferase-Reporterplasmids
pGL3 (Promega). Die C-terminale Epitopmarker-Version LBP (LBP-FLAG)
wurde mittels PCR konstruiert, indem eine Asc1-Stelle anstelle des
nativen Stopcodons angefügt
und dieses Fragment in pRK5-FLAG subkloniert wurde, was in der C-terminalen
Anfügung
der Aminosäuren
GRA DYK DDD DK resultierte (Seq.-ID Nr. 23).
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Stabile
Zelllinien/Pools. Menschliche 293-Urnierenzellen wurden in LGDMEM/HAM-F12-(50:50-)Medium
gezüchtet,
das mit 10% FBS, 2 mM Glutamin und Penicillin/Streptomycin ergänzt war.
Zur stabilen Expression von gD.TLR2 wurden die Zellen mit dem gD.TLR2-Expressionsvektor
transfiziert und bei einer Endkonzentration von 1 μg/ml auf
Puromycinresistenz selektiert. Ein stabiler Pool von Zellen (293-TLR2
pop1) wurde mittels FACS unter Verwendung eines Antikörpers gegen
den gD-Marker isoliert. Sowohl der Pool, als auch der Einzelzellenklon
(293-TLR2-Klon 1) wurden mittels FACS- und Western-Blot-Analyse
wie in Mark et al. (siehe oben) beschrieben charakterisiert.
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Luciferase-Reportertest
und Gel-Retentionsanalyse (EMSA). Elterliche oder stabile 29332-Zellen
(2 × 105 Zellen pro Napf) wurden in Sechs-Napf-Platten
geimpft und am folgenden Tag mit den Expressionsplasmiden zusammen
mit 0,5 μg
des Luciferase-Reporterplasmids
pGL3-ELAM.tk und 0,05 μg
des Renilla-Luciferase-Reportervektors als innere Kontrolle transfiziert.
Nach 24 Stunden wurden die Zellen entweder mit LPS, LBP oder mit
beiden, LPS und LBP behandelt und es wurde die Genaktivität gemessen.
Die Daten werden als relative Luciferaseaktivität ausgedrückt, indem die Glühwürmchen-Luciferaseaktivität durch
jene der Renilla-Luciferase dividiert wird. Für EMSA wurden Kernextrakte
hergestellt und in einer DNA-Bindungsreaktion mit 5'-[32P]-radiomarkierten,
eine Consensus-NF-κB-Stelle
enthaltenden Oligonucleotiden (Santa Cruz Biotechnology, sc-2511)
verwendet. Die Identität
von NF-κB
im Komplex wurde mittels Supershift mit Antikörpern gegen NF-κB bestätigt (Daten
nicht dargestellt).
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RNA-Expression.
Der Gewebe-Northern-Blot wurde von Clontech bezogen und mit einer
Sonde hybridisiert, welche die extrazelluläre Domäne von TLR2 umfasst. Polyadenylierte
mRNA wurde aus 293-Zellen oder 293-TLR2-Zellen isoliert, und es
wurden Northern-Blots mit menschlichem IL-8-cDNA-Fragment sondiert. TLR2-Expression
wurde unter Anwendung quantitativer PCR unter Verwendung der Realtime„TaqManTM"-Technologie
ermittelt und an einem Sequenzdetektor, Modell 770 (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA) im Wesentlichen wie beschrieben analysiert
(Luoh et al., J. Mol. Endocrinol. 18, 77–85 (1997)).
-
Die
Vorwärts-
und Rückwärtsprimer
wurden
zusammen mit einer Hybridisierungssonde
eingesetzt, die am 5'-Nucleotid mit einem
Reporterfarbstoff FAM und am 3'-Nucleotid
mit einem Quench-Farbstoff TAMRA markiert war. Makrophagen/Monozyten
wurden 16 Stunden mit 1 μg/ml
LPS behandelt.
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Rezeptorbindungstest.
Um die direkte Bindung zu ermitteln, wurden 20 ng [3H]-LPS
mit 600 ng TLR2-Fc in 100 μl
Bindungspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Hepes, 0,03% BSA) vermischt,
der 15 μl
Protein A-Sepharose enthielt. Nach 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur
wurden Protein A-Sepharose-Proben zweimal mit kaltem PBS/0,1% NP-40
gewaschen und in 1% SOS und 25 mM EDTA enthaltendem Bindungspuffer
resuspendiert und gezählt.
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Ergebnisse
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In
Drosophila ist der Toll-Rezeptor für die Bildung des embryonalen
dorsal-ventralen Musters erforderlich und nimmt außerdem an
der fungiziden Immunantwort in der adulten Fliege teil. Belvin und
Anderson, Ann. Rev. Cell. Biol. 12, 393–416 (1996); Lemaitre et al.,
Cell 86, 973–983
(1996). Toll ist ein Transmembranprotein des Typs I, das eine extrazelluläre Domäne mit mehreren
an Leucin reichen Wiederholungen (LRRs) und eine zytoplasmatische
Domäne
mit Sequenzhomologie zum Interleukin-1-Rezeptor (IL-1R) und mehrere Pflanzen-Krankheitsresistenzproteine
enthält.
Wie vorher erwähnt
gibt es mehrere menschliche Homologe, die kloniert worden sind,
wovon manche in der vorliegenden Anmeldung als neue Proteine offenbart
sind. Diese menschlichen Proteine spiegeln die topographische Struktur
ihres Drosophila-Gegenstücks
wider. Es hat sich erwiesen, dass die Überexpression einer konstitutiv
aktiven Mutante von einem menschlichen TLR (TLR4) zur Aktivierung
von NF-κB
und Induktion der Entzündungscytokine
und konstimulatorischen Molekülen
führt (Medzhitov
et al. und Rocke et al., siehe oben).
-
Um
zu untersuchen, ob menschliche TLRs an der LPS-induzierten Zellaktivierung
beteiligt sein könnten,
untersuchten die Erfinder zunächst
die Expression von TLRs in einer Reihe von Immungeweben. Von einem
der TLRs, TLR2, erwies sich, dass es in allen untersuchten Lymphgeweben
exprimiert wurde, wobei die stärkste
Expression in Peripherblutleukozyten auftrat (5a).
Die Expression von TLRs ist in Monozyten/Makrophagen, den hauptsächlichen
CD14-exprimirenden und LPS-reaktiven Zellen angereichert. Interessanterweise
wird TLR2 bei Stimulierung isolierter Monozyten/Makrophagen mit
LPS up-reguliert (5b), und zwar auf ähnliche
Weise, wie es für
CD14 beschrieben worden ist (Matsuura et al., Eur. J. Immunol. 22,
1663–1665 (1992);
Croston et al., J. Biol. Chem. 270, 16517–16517 (1995)).
-
Dieses
Ergebnis regte die Erfinder an zu ermitteln, ob TLR2 an der LPS-vermittelten
Zellsignalisierung beteiligt ist. Die Erfinder konstruierten embryonale
293-Zellen derart, dass sie eine Version von TLR2 (gD-TLR2) exprimierten,
die einen aminoterminalen Epitopmarker enthielt. Es wurde ein stabiler
Pool von Klonen sowie ein einzelner Klon isoliert, von denen gezeigt
wurde, dass sie ein neues Protein von etwa 105 kDa exprimierten
(6b), das mit der vorhergesagten Größe von TLR2
(~89 kDa) und der Gegenwart von 4 möglichen Glykosylierungsstellen übereinstimmte.
Die Erfinder untersuchten die Reaktion von 293- oder 293-TLR2-Zellen
und LBP durch Messen der Expression eines vom NF-κB-reaktiven
Enhancer des E-Selectin-Gens angetriebenen Reportergens (Croston
et al., siehe oben). Während
weder LPS- noch LBP-Behandlung alleine in signifikanter Genaktivierung
resultierten, resultierte die Zugabe von beiden, LPS und LBP, in
einer beträchtlichen
Induktion der Reportergenaktivität
in TLR2 exprimierenden Zellen, nicht jedoch in Kontroll-293-Zellen
(6a). Darüber hinaus fanden die Erfinder
unter Verwendung eines Gel-Retentionstests (EMSA), dass LPS in Kombination
mit LBP NK-κB-Aktivität in TLR2-exprimierenden
Zellen induzierte (6c). Die Kinetik
der LPS-induzierten NF-κB-Aktivität in 293-TLR2-Zellen glich
jener von Knochenmark- und Nicht-Knochenmarkzellen (Delude et al.,
J. Biol. Chem. 269, 22253–22260
(1994); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9930–9934 (1993))
insofern, als das die Ansammlung von NF-κB im Kern innerhalb von 30 Minuten
nach der Exposition mit LPS maximal ist. Die Aktivierung von NF-κB durch LPS/LBP
in 293-TLR2-Zellen erfordert keine De-novo-Proteinsynthese, da die
Vorbehandlung mit Cycloheximid (6c)
oder Actinomycin D (nicht dargestellt) die NF-κB-Aktivierung nicht hemmt.
-
Sowohl
die membrangebundene Form von CD14 (mCD14), die auf Knochenmarkzellen
vorhanden ist, als auch lösliches
CD14 (sCD14), das im Plasma vorhanden ist (Bazil et al., Eur. J.
Immunol. 16, 1583–1589 (1986)),
verstärken
die Reaktivität
von Zellen gegen LPS. Die Erfinder beobachteten, dass 293-Zellen
wenig oder kein CD14 an ihrer Oberfläche exprimieren (Daten nicht
dargestellt). Jedoch erhöhte
die vorübergehende Transfektion
von 293-Zellen mit mCD14 die Empfindlichkeit und das Ausmaß der TLR2-vermittelten
LPS-Reaktionsfähigkeit
(6d).
-
Die
oben präsentierten
Daten legten nahe, dass TLR2 als Signalübertrager für LPS fungieren könnte. Um
die Rolle der intrazellulären
Domäne
von TLR2 bei der Vermittlung der LPS-Reaktion zu untersuchen, ermittelten
die Erfinder, ob TLR2-Varianten mit C-terminalen Trunkationen von
entweder 13 (TLR-Δ1)
oder 141 Aminosäuren
(TLR2-Δ2)
den ELAM-Reporter in vorübergehend
transfizierten 293-Zellen regulieren können. Die Erfinder beobachteten,
dass beide C-terminalen Trunkierungsvarianten bezüglich der
Aktivierung des Reportergens defizient waren, obgleich die Erfinder eine
Expression dieser Rezeptoren an der Zelloberfläche mittels FACS-Analyse (nicht
dargestellt) und mittels Western-Blot (7c)
nachweisen konnten. Die Region der intrazellulären, TLR2-Δ1-deletierten Domäne zeigt
eine auffällige Ähnlichkeit
mit einer Region der intrazellulären
IL-1R-Domäne,
die für
die Assoziation mit der IL-1R-assoziierten
Kinase IRAK erforderlich ist (Croston et al., siehe oben) (7b). Die Erfinder wiesen außerdem nach,
dass die extrazelluläre
Domäne
(ECD) von TLR2 für
die LPS-Reaktionsfähigkeit
insofern erforderlich ist, als dass eine TLR2-Variante, bei der
die ECD von TLR2 durch einen Abschnitt der ECD von CD4 ersetzt war,
ebenfalls nicht auf LPS reagierte (7a und 7b).
-
LPS
ist eine komplexes Glykolipid, das aus der proximalen hydrophoben
Lipid A-Gruppierung,
der distalen hydrophilen O-Antigen-Polysaccharidregion und dem Kernsaccharid
besteht, das Lipid A- und O-Antigen-Strukturen verbindet. Im Gegensatz
zum Lipid A-Abschnitt besteht eine beträchtliche Diversität unter
den O-Antigen-Strukturen
aus verschiedenen Gram-negativen Bakterien. Lipid A ist für LPS-Reaktionen
verantwortlich und Behandlungen, welche die Fettsäureseitenketten
von Lipid A entfernen, inaktivieren LPS. Die Erfinder verglichen
die Potenz von aus verschiedenen Gram-negativen Bakterien hergestelltem
LPS sowie LPS, das mittels alkalischer Hydrolyse „entgiftet" worden ist. Die
Erfinder beobachteten, dass aus Escherichia coli vom Serotyp LCD25
für die
Aktivierung von TLR2 um nahezu zwei Größenordnungen wirksamer war
als das serologisch unterschiedliche 055:85-LPS aus Escherichia
coli (8a). Aus S. minnesota R595-LPS
hergestelltes LPS ist ebenfalls ein wirksamer Induktor der TLR2-Aktivität, während TLR2
nicht auf „entgiftetes
LPS" reagierte.
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Die
Erfinder untersuchten, ob TLR2 LPS bindet, indem ermittelt wurde,
ob eine lösliche
Form der extrazellulären
TLR2-Domäne
(TLR2-Fc) 3H-markiertes LPS in einem In-vitro-Test
band. Die Erfinder beobachteten, dass 3H-LCD25-LPS
das TLR2-Fc-Fusionsprotein band, nicht jedoch entweder Fc alleine
oder Fusionsproteine, die die ECD mehrerer anderer Rezeptoren enthielten
(8b). Diese Bindung stand in spezifischer Konkurrenz
zu unmarkiertem LCD25-LPS, nicht jedoch zu entgiftetem LPS. Die
vorläufige
Analyse der Bindung von LPS an TLR2-Fc legt nahe, dass die Kd rela tiv
niedrig ist (500–700
nM) und dass die Kinetik der Bindung sehr langsam ist (Daten nicht
dargestellt). Die Erfinder vermuten, dass andere Proteine, wie z.
B. LBP die Bindung von LPS an TLR2 in vivo verstärken könnten, ganz wie das Überführen von
LPS von seiner freien, aggregierten Form (mizellaren Form) in CD14
durch LBP. Dies steht im Einklang mit den In-vivo-Ergebnissen der
Erfinder, die zeigen, dass LBP erforderlich ist, um eine empfindliche
Reaktion von TLR2 auf LPS zu erlangen (6a).
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Die
ILS-Behandlung von Makrophagen bewirkt die Expression einer Reihe
von Entzündungscytokinen.
Gleichermaßen
resultierte die Expression von TLR2 in 293-Zellen in einer > 100fachen Induktion
von IL-8-mRNA als Reaktion auf LPS/LBP, während entgiftetes LPS in diesem
Test inaktiv ist (9).
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Diese
Daten legen nahe, dass TLR2 eine essentielle Rolle bei der angeborenen
Immunreaktion, der ersten Verteidigungslinie gegen mikrobielle Pathogene
spielt. TLR2 und CD14 werden beide an Knochenmarkzellen exprimiert
und ihre Induktion wird bei LPS-Behandlung koordiniert induziert.
Die Expression von TLR2 in Nicht-Knochenmarkszellen verleiht normalen,
nicht reaktionsfähigen
Zellen LPS-Reaktionsfähigkeit
durch einen Mechanismus, der von LBP abhängt und durch die Expression
von mCD14 verstärkt
wird. Die LPS-Behandlung von TLR2-exprimierenden Zellen resultiert
in der Aktivierung von NF-κB
und anschließender
Induktion von Genen, welche die adaptive Reaktion auslösen, wie
z. B. IL-8 (9). Die Daten der Erfinder
legen nahe, dass TLR2 sowohl an der Wahrnehmung der Gegenwart von
LPS, als auch an der Übertragung
dieser Information über
die Plasmamembran hinweg teilnimmt, da intakte extrazelluläre und intrazelluläre Domänen für LPS-Reaktionen
erforderlich sind. Darüber
hinaus ist eine Region im C-terminalen Schwanz von TLR2, der Homologie
zu einem Abschnitt des IL-1R aufweist, der für die Assoziation mit IRAK
erforderlich ist, für
die NF-κB-Aktivierung
notwendig.
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Drosophila-Toll
und der Toll-verwandte Rezeptor 18-Wheeler spielen eine wichtige
Rolle bei der Induktion antimikrobieller Peptide als Reaktion auf
Bakterien bzw. Pilze.
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Medzhitov
et al., siehe oben. Genetische Daten haben Spätzle als Ligand für Toll bei
der Bildung von dorsoventralen Mustern impliziert und zur Vermutung
geführt,
dass ein Homolog von Spätzle
für die
Regulation menschlicher TLRs bei der Immunreaktion von Bedeutung
sein könnte.
Die Beobachtungen der Erfinder, dass die Aktivierung von TLR2 durch
LPS nicht durch Cycloheximid blockiert wird und dass die extrazelluläre Domäne von TLR2
ein niedrigaffiner Rezeptor für
LPS in vitro ist, steht im Einklang mit einem Modell, bei dem TLR2
an der LPS-Erkennung teilnimmt. Die Daten der Erfinder schließen die
Möglichkeit
nicht aus, dass andere Proteine (wie z. B. ein Spätzle-Homolog)
die Reaktion von TLR2 auf LPS modifizieren könnte. Es ist anzumerken, dass,
obgleich extrazelluläre
Domänen
von TLR2 und Drosophila-Toll
beide LRRS enthalten, diese weniger als 20% Aminosäureidentität aufweisen.
Zweitens sind LRR-Proteine „Mustererkennungsrezeptoren" (PRRs) für eine Vielzahl
von Molekülarten,
wie z. B. Proteine, Peptide und Kohlenhydrate. Dangl et al., Cell 91,
17–24
(1997). Drittens ist die Erforderlichkeit von Spätzle bei der Drosophila-Immunreaktion
nicht so eindeutig wie jene von Toll. Im Gegensatz zu Defekten in
Toll induzieren Spätzle-Mutanten
normale Ausmaße
der antimikrobiellen Peptide Defensin und Attacin und sind hinsichtlich
der Cecropin A-Expression nach Pilzexposition nur partiell defizient
und hinsichtlich der Aktivierung von Dorsal als Reaktion auf Verletzung
nicht defizient. Lemaitre et al., Cell 86, 973–983 (1996); Lemaitre et al.,
EMBO J. 14, 536–545
(1995).
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Wie
vorhin erwähnt,
ist TLR2 ein Mitglied der großen
Familie der menschlichen, mit Toll in Beziehung stehenden Rezeptoren,
einschließlich
der drei neuen Rezeptoren (kodiert von DNA47361), die in der vorliegenden
Anmeldung speziell offenbart sind. Die in diesem Beispiel dargelegten
Daten sowie der Beweis der Beteiligung von TLR4 an der Aktivierung
von NF-κB-reaktiven
Genen legen nahe, dass es eine Hauptfunktion dieser Rezeptorenfamilie
ist, als Erkennungsrezeptoren für
Pathogenmuster zu agieren, welche die Gegenwart von konservierten,
an Mikroben vorhandenen molekularer Strukturen wahrnehmen, wie es
ursprünglich von
Janeway und Kollegen vorgeschlagen worden ist (Medzhitov et al.,
siehe oben). Die menschliche TLR-Familie könnte ein Ziel für therapeutische
Strategien zur Behandlung von septischem Schock darstellen.
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Beispiel 10
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In-situ-Hybridisierung
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Die
In-situ-Hybridisierung ist eine mächtige und vielseitige Technik
zur Detektion und zur Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen in Zell- oder
Gewebepräparaten.
Sie kann beispielsweise zweckdienlich sein, um Orte der Genexpression
zu identifizieren, die Gewebeverteilung der Transkription zu analysieren,
Virusinfektion zu identifizieren und zu lokalisieren, Veränderungen
der spezifischen mRNA-Synthese zu verfolgen und die Chromosomenkartierung
zu unterstützen.
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Die
In-situ-Hybridisierung wurde nach einer optimierten Version des
Protokolls von Lu und Gillett, Cell Vision 1, 169–176 (1994)
unter Verwendung PCR-erzeugter, 33Pmarkierter
Ribosonden durchgeführt.
Zusammenfassend wurden formalinfixierte, in Paraffin eingebettete
menschliche Gewebe geschnitten, entparaffiniert, in Proteinase K
(20 g/ml) für
15 Minuten bei 37°C
deproteinisiert und für
die In-situ-Hybridisierung wie von Lu und Gillett (siehe oben) beschrieben
weiterverarbeitet. Eine [33P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde
wurde aus einem PCR-Produkt erzeugt und bei 55°C über Nacht hybridisiert. Die
Objektträger
wurden in die Kernemulsion Kodak NTB2 eingetaucht und für 4 Wochen
exponiert.
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Synthese der 33P-Ribosonde
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6,0 μl (125 mCi) 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2.000 Ci/mmol)
wurden mittels Speed-Vac getrocknet. Jedem getrocknetes 33P-UTP enthaltenden Röhrchen wurden die folgenden
Bestandteile zugegeben:
2,0 μl
5 × Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100
mM)
2,0 μl
NTP-Gemisch (2,5 mM:10 μ;
jeweils 10 mM GTP, CTP und ATP + 10 μl H2O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Templat
(1 μg)
1,0 μl H2O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte
T3 = AS, T7 = S, für
gewöhnlich)
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Die
Röhrchen
wurden bei 37°C
für eine
Stunde inkubiert. Es wurde 1 μl
RQ1-DNase zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C für 15 Minuten.
90 μl TE
(10 mM Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) wurden zugegeben und das Gemisch
wurde auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde
in eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit aingebracht und unter
Verwendung von Programm 10 (6 Minuten) zentrifugiert. Die Filtrationseinheit
wurde über
ein zweites Röhrchen
invertiert und unter Verwendung von Programm 2 (3 Minuten) zentrifugiert.
Nach der letzten Zentrifugation zur Gewinnung wurden 100 μl TE zugegeben.
1 μl des Endprodukts
wurde auf DE81-Papier
pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
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Die
Sonde wurde auf einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde
oder 5 μl
der RNA Mrk III wurden zu 3 μl
Beladungspuffer zugegeben. Nach Erhitzen auf einem Heizblock bei
95°C für drei Minuten
wurde das Gel sofort auf Eis gelegt. Die Näpfe des Gels wurden gespült, die
Probe aufgegeben und bei 180–250
Volt für
45 Minuten laufen gelassen. Das Gel wurde in Saranfolie eingewickelt
und einem XAR-Film mit einer Verstärkerfolie für eine Stunde bis über Nacht
in der Gefriertruhe bei –70°C exponiert.
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33P-Hybridisierung
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Vorbehandlung
gefrorener Schnitte. Die Objektträger wurden aus der Gefriertruhe
entnommen, auf Aluminiumschalen gegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten
aufgetaut. Die Schalen wurden für
fünf Minuten
in einen 55°C-Inkubator
gegeben, um die Kondensation zu vermindern. Die Objektträger wurden
für 10 Minuten
in 4% Paraformaldehyd auf Eis im Abzug fixiert und in 0,5 × SSC für 5 Minuten
bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ-H2O). Nach Deproteinierung in 0,5 μg/ml Proteinase
K für 10
Minuten bei 37°C
(12,5 μl
einer Stammlösung
mit 10 mg/ml in 250 ml des vorgewärmten, RNase-freien RNAse-Puffers) wurden
die Schnitte in 0,5 μ SSC
für 10
Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden in 70%, 95%,
100% Ethanol für
jeweils 2 Minuten entwässert.
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Vorbehandlung
von in Paraffin eingebetteten Schnitten. Die Objektträger wurden
entparaffiniert, in SQ-H2O gegeben und zweimal
in 2 × SSC
bei Raumtemperatur für
jeweils 5 Minuten gespült.
Die Schnitte wurden deproteinisiert, und zwar in 20 μg/ml Proteinase
K (500 μl
von 10 mg/ml in 250 ml Rnase-freiem Puffer, 37°C, 15 Minuten) – menschlicher
Embryo, oder 8 × Proteinase
K (100 μl
in 250 ml Rnase-Puffer, 37°C,
30 Minuten) – Formalingewebe.
Anschließendes
Spülen
in 0,5 × SSC
und Entwässerung
wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
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Vorhybridisierung.
Die Objektträger
wurden In einer Kunststoffbox ausgelegt, die mit Box-Puffer- (4 × SSC, 50%
Formamid) gesättigtem
Filterpapier ausgekleidet war. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer
(3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ-H2O) bedeckt, mittels Vortex vermischt und
in der Mikrowelle für
2 Minuten mit gelockertem Verschluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf
Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ-H2O zugegeben, das Gewebe mittels Vortex gut
durchmischt und bei 42°C
für 1–4 Stunden inkubiert.
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Hybridisierung.
1,0 × 106 cpm Sonde und 1,0 μl tRNA (Stammlösung mit
50 mg/ml) je Objektträger
wurden bei 95°C
für 3 Minuten
erhitzt. Die Objektträger
wurden auf Eis abgekühlt
und es wurden 48 μl
Hybridisierungspuffer je Objektträger zugegeben. Nach dem Vortexen
wurden 50 μl 33P-Gemisch zu 50 μl der Vorhybridisierung am Objektträger zugegeben.
Die Objektträger
wurden über
Nacht bei 55°C
inkubiert.
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Waschen.
Es wurde für
2 × 10
Minuten mit 2 × SSC,
EDTA bei Raumtemperatur (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA,
Vf = 4L) gewaschen, gefolgt von RNaseA-Behandlung
bei 37°C
für 30
Minuten (500 μl
mit 10 mg/ml in 250 ml Rnase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden
2 × 10
Minuten mit 2 × SSC,
EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringenz-Waschbedingungen
waren die folgenden: 2 Stunden bei 55°C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC +
16 ml EDTA, Vf = 4L).
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Ergebnisse
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PRO358 (DNA47361)
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Das
Expressionsmuster von PRO358 (DNA47361) in menschlichen Erwachsenen- und fötalen Geweben
wurde untersucht. Die folgenden Sonden wurden verwendet, basierend
auf der Volllängen-DNA47361-Sequenz
synthetisiert:
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In
diesem Versuch wurde Expression in darmassoziiertem Lymphoidgewebe
und sich entwickelnden Folliculi lymphatici lienales der Milz im
Fötus festgestellt.
Geringgradige Expression war in der pALS-Region von normalem erwachsenem
Milzgewebe festzustellen. Obwohl alle anderen Gewebe negativ waren,
ist es möglich,
dass geringe Expressionslevel in anderen Gewebetypen unter empfindlichen
Bedingungen beobachtet werden könnten.
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Hinterlegung von Material
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Die
folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklaven Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt.
Material | ATCC-Hinterlegungsnummer | Hinterlegungsdatum |
DNA47361-1249 | 209431 | 7.
November 1997 |
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Diese
Hinterlegung wurde gemäß den Bestimmungen
des „Budapester
Vertrags über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren" (Budapester
Vetrag) und den darin enthaltenen Regelungen vorgenommen. Dies garantiert
die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur
der Hinterlegung für
30 Jahre vom Datum der Hinterlegung an. Die Hinterlegung wird von
der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt
und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC,
was die stän dige
und uneingeschränkte
Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit
bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Veröffentlichung
jeglicher US- oder ausländischer
Patentanmeldung gewährleistet,
was auch immer zuerst eintritt, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft
für jemanden
vom US-Commissioner für
Patente und Warenzeichen Bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC § 122 und
den entsprechenden Regelungen des Commissioner (einschließlich 37
CFR § 1,14
mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638).
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Der
Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien,
falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung
unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört wird,
nach Benachrichtigung unverzüglich
durch andere derselben Art ersetzt werden. Die Verfügbarkeit
der hinterlegten Materialien ist nicht als Zugeständnis auszulegen,
die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt jeglicher Regierung
gemäß ihrer
Patentrechte gewährten
Rechte in die Praxis umzusetzen.
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Die
vorangehende niedergeschriebene Patentschrift wird als ausreichend
erachtet, einem Fachkundigen zu ermöglichen, die Erfindung in die
Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte
Konstrukt in seinen Ansprüchen
nicht eingeschränkt,
da die hinterlegte Ausführungsform
als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht
ist, und jegliche funktionell gleichwertigen Konstrukte daher im
Schutzumfang dieser Erfindung liegen. Die Hinterlegung von Material
hierin stellt kein Eingeständnis
dar, dass die hierin enthaltende niedergeschriebene Beschreibung
unzulänglich
ist, um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung,
einschließlich
ihrer besten Ausführungsart
zu ermöglichen,
noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der
Ansprüche
auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die sie verkörpert. Tatsächlich werden
verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin
dargestellt und beschrieben sind, dem Fachkundigen auf dem Gebiet
der Erfindung aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich
und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche. Sequenzprotokoll
SEQUENZPROTOKOLL