JP4562123B2 - Toll様レセプター強制発現細胞の利用 - Google Patents
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Description
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、TLR強制発現細胞の利用法を提供することを目的とする。
(1)ブタ腸管パイエル板よりTotal RNAを抽出し、ヒトおよびマウスTLR9遺伝子における保存性の高い領域より作製したプライマーを用いてRT-PCR法、RACE法によりブタTLR9遺伝子をクローニングし、その全遺伝子配列を決定した。
(2)遺伝子情報から得られたブタTLR9全アミノ酸配列から抗原決定基部位を探索し、選抜した領域をペプチド合成しブタTLR9ポリクローナル抗体作製用抗原とした。抗原は化学合成後、定法によりウサギに免疫し、ブタTLR9に対するポリクローナル抗体を作成した。
(3)ブタTLR9遺伝子をHEK293T細胞(ヒト胎児腎細胞)に導入し、ブタTLR9遺伝子導入細胞(トランスフェクタント)を作製した。
(4)ブタTLR9のHEK293Tにおける発現については、ブタTLR9 mRNAの発現をRT-PCR法により、また、ブタTLR9膜タンパクの発現をブタTLR9ポリクローナル抗体による免疫染色法によりレーザー顕微鏡およびフローサイトメーターを用いて確認した。
(5)ヒトおよびマウス細胞を強く刺激する特異的CpG DNAモチーフを含むオリゴDNA(それぞれCpG2006,CpG1826)に対する反応性を解析した。
〔1〕 被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法であって、
(a)腸管組織において発現しているToll様レセプターを強制発現させた細胞に、被験試料を接触させる工程
(b)該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Toll様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Toll様レセプターの活性が、上記被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される方法。
〔2〕 以下の(a)および(b)の工程を含む、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法。
(a)〔1〕に記載の評価方法により、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価する工程
(b)複数の被験試料から、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する工程
〔3〕 〔2〕に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する医薬組成物の製造方法。
〔4〕 被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法であって、
(a)被験微生物から抽出物を調製する工程
(b)腸管組織において発現しているToll様レセプターを強制発現させた細胞に、該抽出物を接触させる工程
(c)該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Toll様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Toll様レセプターの活性が、上記抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される方法。
〔5〕 以下の(a)および(b)の工程を含む、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法。
(a)〔4〕に記載の評価方法により、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する工程
(b)複数の被験微生物から、腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物を選択する工程
〔6〕 〔5〕に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物と食品上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する食品組成物の製造方法。
〔7〕 微生物が乳酸菌であり、食品組成物が乳製品である、〔6〕に記載の方法。
〔8〕 微生物が細菌である、〔4〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕 細菌が乳酸菌である、〔8〕に記載の方法。
〔10〕 腸管組織において発現しているToll様レセプターをコードするDNAを有する発現ベクターを細胞に導入する工程を含む、腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法。
〔11〕 腸管組織において発現しているToll様レセプターを強制発現させた細胞を、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法。
〔12〕 腸管組織が腸管リンパ系組織である、〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔13〕 腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、〔12〕に記載の方法。
〔14〕 Toll様レセプターがブタ由来である、〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕 Toll様レセプターがToll様レセプター9および/または2である、〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔16〕 〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の方法に用いるための、腸管組織において発現しているToll様レセプターを強制発現させた細胞。
〔17〕 腸管組織において発現しているToll様レセプターをコードするDNAを有する発現ベクターを細胞に導入することで製造される、腸管免疫担当細胞のモデル細胞。
〔18〕 腸管組織が腸管リンパ系組織である、〔16〕または〔17〕に記載の細胞。
〔19〕 腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、〔18〕に記載の細胞。
〔20〕 Toll様レセプターがブタ由来である、〔16〕〜〔19〕のいずれかに記載の細胞。
〔21〕 Toll様レセプターがToll様レセプター9および/または2である、〔16〕〜〔19〕のいずれかに記載の細胞。
上記評価方法またはスクリーニング方法によって得られた試料は、免疫賦活化機能を有する試料として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
以下に、乳業用乳酸菌からCpG モチーフ、ATモチーフまたはCpG 様モチーフを有する断片の調整方法を例示するが、本発明の方法はこれに限定されない。
上記評価方法またはスクリーニング方法によって得られた微生物は、免疫賦活化機能を有する微生物として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
このようにして製造された食品組成物は、免疫賦活化機能を有する食品組成物(例えば機能性食品、健康食品、特定保健用食品等)として、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
〔実施例1〕
フナコシ株式会社より購入した。
DDBJ/EMBL/GenBankにおいて公開されているヒトおよびマウスTLR9(それぞれAccession Number AB045180およびAF348140)遺伝子配列をもとに保存性の高い領域を探索しプライマーを作製した。そのプライマーを用いてブタ腸管パイエル板由来total RNAからRT-PCR法によりブタTLR9遺伝子断片を得た。得られた遺伝子断片はpGEM-T-Easy vectorにライゲーションしE.coli JM109コンピテントセルにトランスフォーメーションしサブクローニングした。DNA配列はDNA sequencer Model 4000L(Li-Cor, Lincoln, NE, USA)により決定した。塩基配列、アミノ酸配列解析にはGENETYX-SV/RC Ver.11.0.3.1を用いた。残りのブタTLR9遺伝子配列はブタTLR9遺伝子断片から設計したプライマーを用いてRACE法により得た。全TLR9遺伝子をPCR法により増幅しクローニングした。
GENETYX-SV/RC Ver.11.0.3.1を用いた抗原決定基(エピトープ)解析とタンパク2次構造解析よりブタTLR9アミノ酸配列中より268から284番目の領域が高い抗原性を持つことを見出した。その領域のペプチド合成および合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体作製をサワディテクノロジー株式会社に依頼した。
ブタTLR9遺伝子を導入する宿主細胞としては、ヒトの細胞系で遺伝子導入のホスト細胞として広く利用されているHEK293T細胞(ヒト胎児腎細胞)を選択した。ヒトTLR9特異的プライマーを用いてHEK293T細胞がTLR9遺伝子を発現していないことを解析し、シグナルペプチドを除くブタTLR9遺伝子をライゲーションしたpCXN2.1-FLAG 遺伝子発現ベクター (H. Niwa et al, Gene, 108 (1991) 193-199 )(大阪大学大学院医学研究科宮崎純一氏より分譲) をリポフェクション法によりHEK293T細胞にトランスフェクションした。抗生物質にはG418ネオマイシン(SIGMA)を用い、BECKMAN COULTER社のEPICSセルソーターシステムによりブタTLR9発現細胞をセレクションした。
トランスフェクタントよりTRIzol(インビトロジェン)を用いてtotal RNAを抽出し、ブタTLR9特異的プライマー(本発明で設計)、ヒトTLR9特異的プライマーおよびポジティブコントロールとしてヒトGAPDHプライマー(K. A. Zarember, P. J. Godowski, J. Immunology, 168 (2002) 554-561) を用いてRT-PCR法によるTLR9 mRNA遺伝子発現解析を行った。
細胞を1次抗体としてanti-FLAG mouse IgGモノクローナル抗体(SIGMA)で4℃、1時間処理後、2次抗体としてanti-mouse IgG-PerCP 標識抗体で4℃、30分間染色した。核染色はPropidium iodideを4℃、10分間処理で行った。解析にはFACSCaliburTM(日本BECTON DICKINSON株式会社)を用いた。ブタTLR9ポリクローナル抗体による免疫染色は、上記のように1次抗体染色後、2次抗体として、anti-rabbit IgG-Alexa 488標識抗体で4℃、30分間染色し、核染後解析した。また、細胞をI型コラーゲンコートDisk(IWAKI)に播き1次抗体としてanti-FLAG mouse IgGビオチン標識抗体(SIGMA)で4℃、1時間処理後、2次抗体としてストレプトアビジン-PE-Cy5抗体で4℃、30分間染色した。核染色にはPropidium iodide 4℃、10分間処理した。解析には共焦点レーザー顕微鏡(BIO-RAD社)を用いた。
CpG DNAは、既に報告のあるヒト免疫細胞を強く刺激する大腸菌ゲノムDNA由来CpG2006型(5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(配列番号:9))とマウス免疫細胞を強く刺激するCpG1826型(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(配列番号:10)) (S. Pichyangkul et al, J. Immunological Methods, 247 (2001) 83-94) を用い、1Mの濃度のCpG DNAで、37℃にて1時間反応後、FACSCaliburTMおよび共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析を行なった。
ブタ各種組織(心臓、胸腺、肺臓、脾臓、肝臓、腎臓、骨格筋、十二指腸、空腸、回腸、回腸由来パイエル板、回腸由来腸管膜リンパ節)よりtotal RNAを抽出し、total RNA 1μgからoligo-d(T)18プライマーを用いてcDNAを合成後精製した。ブタTLR9特異的プライマーおよび精製cDNAからLightCycler (Roche)を用いて real-time quantitative PCRに供した。リアクションキットとしてLight Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche)を用いた。検量線から求めたブタTLR9遺伝子量とハウスキーピング遺伝子であるβアクチン遺伝子量との比から、ブタTLR9 mRNA量を算出した。結果は、脾臓中のTLR9発現量を1.000とした場合の各種組織に含まれるブタTLR9 mRNA量を数値化し比較した。
本発明により決定したブタTLR9 cDNA塩基配列は3090塩基の構造遺伝子(ORF)を含む3145塩基(5’側に54塩基の非転写領域を含む)であった。ORFは1029残基のアミノ酸をコードしており、分子量は115.8kDaであった(図1および2)。多種TLR9に対するアライメントを図4および5に示した。ブタTLR9アミノ酸配列とヒト、マウス、ネコTLR9に対してそれぞれ82.0%、74.9%および86.6%の相同性が認められた(表2)。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
TLR9 塩基配列a アミノ酸配列a
相同性(%) 相同性(%)
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ヒト 84.9 82.0
マウス 78.2 74.9
ネコ 86.6 86.6
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aヒト、マウスおよびネコTLR9の配列情報は、DDBJより以下のaccession No.(それぞれAB045180、AF348140およびAY137581)で入手した。
コントロール細胞とトランスフェクタント由来total RNAを鋳型としたブタTLR9 mRNAとヒトTLR9 mRNAのRT-PCR発現解析によりトランスフェクタントにおけるブタTLR9 mRNAの強い発現が認められた。また、両者ともにヒトTLR9 mRNAの発現は認められなかった(図6)。
フローサイトメトリーによる発現解析から、1次抗体として抗-FLAG抗体を用いた場合、コントロール細胞と比較してポジティブ側への大きなシフトがみられた(図7-a)。またブタTLR9抗体を用いた場合もポジティブ側へのシフトがみられた(図7-b)。レーザー顕微鏡による解析からも同様に発現が確認された(図8‐a、c、b、d)。
共焦点レーザー顕微鏡による解析ではCpG DNAの違いによる取り込みの顕著な差は判断できなかったが、フローサイトメトリーによるCpG DNAの取り込み解析によりブタTLR9はマウス型CpG 1826よりもヒト型CpG2006を比較的多く取り込んでいることが明らかとなった(図7‐c、8‐e、f)。
real-time PCR法による各種組織におけるブタTLR9 mRNAの発現解析の結果、ブタTLR9は、腸管リンパ系組織において、特にパイエル板と腸管膜リンパ節において強く発現していることが明らかとなった(図9)。
本実施例によりブタTLR9はマウスに比べヒトやネコTLR9と高い相同性を示すことが明らかとなった。また、real-time PCRによる発現解析から、これまでTLR9は脾臓において強い発現が認められるという報告がされていたが、経口的に病原細菌に曝される可能性が最も高い腸管粘膜系の内、腸管免疫の中心的な役割を果たすパイエル板や腸管膜リンパ節において、脾臓の約3倍以上のmRNA発現が認められた点は大変興味深い新知見である。また、本実施例はブタTLR9トランスフェクタントを構築することに成功し、本トランスフェクタントを用いたCpG DNAの取り込み解析から、ブタTLR9がマウス型に比べてヒト型CpG DNAに対する反応性が高かったことから、今後、このトランスフェクタントを用いた機能性乳酸菌DNAの認識性の解析が飛躍的に進み、ブタを実験動物としたヒトへのモデル系の計画的解析を通して、機能性食品開発の基礎研究が分子間の反応としてより詳細に検討できる。
本発明で得られた知見は、今後腸管におけるTLR9を介したシグナル伝達経路についてその認識メカニズムを分子レベルで明らかするための糸口となり、自然免疫という基本的な免疫システムがより発展的に解明されるための原動力ともなる。
1.1 細胞株
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)K-1細胞は、TKG細胞バンク(東北大学、加齢医学研究所)から得て、10%仔ウシ胎児血清、50 mg/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES(2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸)緩衝液、0.11 mg/mlピルビン酸ナトリウム、および0.5 mM 2-メルカプトエタノール(シグマ(Sigma)、東京、日本)を添加した完全なダルベッコ改変イーグル培地において維持した。
2種の乳酸桿菌、デルブリュック菌亜種ブルガリクス(L. delbrueckii ssp.bulgaricus)とL.ガセリ(L. gasseri)を用いた。L.ブルガリクスNIAI B6は、国立動物産業研究所(つくば市、日本)から得た。L.ブルガリクス JCM 1002TおよびL.ガセリJCM 1131Tは、日本微生物コレクション(JCM、埼玉県、日本)から購入した。L. ガセリOLL2716は、明治乳業(小田原市、神奈川県、日本)の食品機能性研究所から供与された。株は全てMRSブロス(ディフコ(Difco)、デトロイト、アメリカ)において37℃で16時間培養して、凍結乾燥し、NF-κBレポーターアッセイのために用いた。
sTLR2のコード領域を、ブタパイエル板から単離した総RNAからRT-PCRによって増幅した。N-末端FLAGタグ-sTLR2発現ベクターは、ブタTLR2のコード領域を、単離されたsTLR2 cDNAからPCRによって増幅して、N-末端FLAGエピトープをコードするpCXN2.1-FLAG発現ベクターのNotI-EcoRI部位にクローニングした(Niwa, H., et al. (1991) Gene 108, 193-199.)。構築物の構造は、制限酵素マッピングおよびDNA配列分析によって確認した。
トランスフェクションの前日に、CHO K-1細胞4×105個/ウェルを6ウェルプレートに播種した。培養1日後、リポフェクタミンTM試薬(インビトロジェン(Invitrogen Corp.)、カールスバッド、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて、sTLR2をコードするpCXN2.1-FLAG発現ベクター(1μg/ウェル)を細胞にトランスフェクトした。sTLR2発現トランスフェクタントをG418(インビトロジェン)(1.0 mg/ml)によって10日間陽性選択して、これをCHO K-1sTLR2 transと命名した。プラスミドベクターのみをトランスフェクトしたCHO K-1細胞は、CHO K-1Cont.と命名した。sTLR2の発現は、sTLR2に結合させたFLAGタンパク質の細胞外染色によって確認した(1.7 タンパク質発現分析参照)。
cDNAを総RNAから合成して、トランスフェクタントおよび非トランスフェクタントにおいてTRIZOL試薬(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ロックビル、メリーランド州)によって調製して、rTaqポリメラーゼ(タカラバイオインク(TaKaRa BIO Inc)、大津、日本)を用いて増幅した。外因性のsTLR2を検出するために、以下のプライマーを用いてDNAを増幅した。
センス:5'-TTC AGG CCA AGG ATT TCC AG-3'(配列番号:37)
アンチセンス:5'-TCA CTG TGC TGG GTT CAT TG-3'(配列番号:38)
センス:5'-TCT ACA ACG SGC TGC GTG TG-3'(配列番号39)
アンチセンス:5'-GCT TCT CTT TGA TGT CAC GC-3'(配列番号:40)
PCRサイクル条件は、95℃で5分の後95℃で30秒、55℃で30秒、および72℃で30秒を30サイクルであった。PCR産物は、1.5%アガロースゲル上で、エチジウムブロマイドによって可視化して分析した。
sTLR2タンパク質は、二次構造、疎水性、および抗原性を予測するためにジェネティクス-SV/RC(11.0.3.1)を用いて分析した後、細胞外ドメインにおけるアミノ酸76〜90個を含む領域(CVNLRALRLGANSIH)(配列番号:41)をペプチド合成のために選択した。免疫抗原としての合成ポリペプチドを、フロイントの完全アジュバントと共に1:1の割合で乳化した。抗sTLR2ポリクローナルAbは、0.3 mg/ウサギの用量で皮下注射した合成ポリペプチドによってウサギ(日本白色種)を免疫することによって産生した。1ヶ月間隔で追加免疫を2回行った後、ウサギから採血して抗血清を回収した後、エピトープのアフィニティクロマトグラフィーによる精製を行った。最終的に、直接的な酵素結合イムノソルベントアッセイ(データは示していない)によって、sTLR2の高い抗体価が得られた。
細胞を洗浄して、固定し、透過性にして、N-末端FLAG-sTLR2タンパク質に関して抗FLAG M5マウスモノクローナルAb(シグマ)および第一抗体としてウサギ抗sTLR2ポリクローナルAbを用いて染色した。次に、細胞をそれぞれ、フィコエリスリン(PE)またはアレクサ660結合抗マウスIgGおよびアレクサ488結合抗ウサギIgGによって処置した。PEおよびアレクサ488シグナルは、フローサイトメトリー(FACSキャリバーTM、ベクトンディッキンソン(BECTON DICKINSON)、東京)によって決定した。アレクサ660およびアレクサ488シグナルは、共焦点レーザー顕微鏡(バイオラド・ラボラトリーズインク(Bio-Rad Laboratories Inc.)、ハーキュリーズ、カリフォルニア州)によって決定した。
10 μg/mlザイモサン(モレキュラープローブス(Molecular Probes)、ユージーン、オレゴン州)によって刺激して一晩培養した細胞を、2%グルタルアルデヒドを含む0.2 M燐酸緩衝生理食塩液(pH 7.4)において30分間固定した。段階的な濃度のエタノール(50%、60%、70%、80%、90%および99%)を用いて細胞を脱水した後、無水エタノールによって2回洗浄した。試料を臨界点乾燥させて、金-パラジウムによってコーティングしてからS-4200走査型電子顕微鏡(ヒタチ(HITACHI)、東京、日本)によって観察した。
細胞を、最終濃度20 μg/mlのFITC-結合ザイモサンによって37℃で1時間処置した。細胞を固定した後、ザイモサンの取り込みをフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー顕微鏡によって検出した。
細胞(24ウェルプレートにおいて8×104個/ウェル)を、リポフェクタミンTM試薬と共にヒトNF-κB遺伝子A1およびA2部位を含むpGLM-ENH-luciベクター(Ueda, A., et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 31092-31099.; Inadera, H., et al. (2000) Endocrinology 141, 50-59.)0.5 μgを用いて18時間トランスフェクトさせた。様々なリガンドによる24時間の刺激の後、製造元(プロメガ(Promega)、東京、日本)が推奨する条件を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。刺激指数(S.I.)は、以下の等式によって推定した:[(CHO K-1sTLR2trans.細胞における共鳴単位(RU)−(バックグラウンドのRU)]/[(CHO K-1Cont.細胞における共鳴単位(RU)−(バックグラウンドのRU)]。アッセイは全て、異なる3つの培養ウェルを用いて少なくとも3回の異なる実験によって行った。
腸関連リンパ様組織に属する回腸パイエル板から単離したブタmRNAを用いて、Horton R. H.らにより報告されているオーバーラップPCR伸長法によってsTLR2の完全長のcDNAを作製した(Horton, R.H., et al. (1989) Gene 77, 61-68.)。sTLR2の完全長のcDNAは、アミノ酸785個をコードする2358 bpであり、計算分子量は89.6 kDaであった。得られたcDNAは、Munetaら(Muneta, Y., et al. (2003) J. Interferon Cytokine Res. 23, 583-589.)によって最近報告された、リポ多糖類によって刺激したブタ肺胞マクロファージから得られたcDNAと同一であった。ブタTLR2のヌクレオチド配列は、アクセッション番号AB072190としてDDBJ、EMBL、およびGenBankヌクレオチドデータベースに提出されている。
CHO K-1細胞は、チャイニーズハムスターの機能的TLR2を発現しないことから、sTLR2をコードするpCXN-FLAGベクターによるリポフェクションによってCHO K-1sTLR2trans細胞を確立した(Heine, H., et al. (1999) J. Immunol. 162, 6971-6975.)。RT-PCR分析で、sTLR2のmRNAがCHO K-1sTLR2trans細胞において発現されたことから、外因性のsTLR2 mRNAがCHO K-1sTLR2trans細胞において発現されたことが示された(図10)。プラスミドベクターのみをトランスフェクトしたCHO K-1Cont.細胞とCHO K-1sTLR2trans細胞とをマウス抗FLAG mAbおよび抗-sTLR2ポリクローナル抗体によって染色すると、FLAGおよびsTLR2陽性細胞は、フローサイトメトリー(図11-a、b)および共焦点レーザー顕微鏡(図12-a、b、d、e)によってCHO K-1sTLR2trans細胞でのみ検出された。さらに、走査型電子顕微鏡写真から、TLR2-特異的リガンドとして同定されているザイモサンによって細胞を処置した場合、CHO K-1sTLR2trans細胞の表面は劇的に粗くなったが、CHO K-1Cont.細胞では粗くならなかったことが示された(図13)。これらの結果により、sTLR2がCHO K-1sTLR2trans細胞において確実に発現していることが確認された。CHO K-1Cont.細胞およびCHO K-1sTLR2trans細胞をザイモサンによって1時間処置すると、ザイモサンを取り込んだ細胞は、CHO K-1sTLR2trans細胞では強く検出されたが、CHO K-1Cont.細胞では検出されなかった(図11-c)。さらに、FITC標識ザイモサン(緑色)およびFLAG-sTLR2(青色)が同時に局在することは、CHO K-1sTLR2trans細胞でのみ示された(図12-c、f)。これらは、微生物の細胞壁成分によって誘導されたシグナル伝達が、sTLR2を通して核に達し、トランスフェクタントの生物機能の活性化が起こった可能性を示している。
Underhillらにより、TLR2が、5分以内にザイモサンを含むマクロファージファゴソームに特異的に補充されることが示されている(Underhill, D., et al. (1999) Nature 401, 811-815.)。粒子のインターナリゼーションの全段階において、TLR2は液胞の内容物を認識し、特定の生物に対する防御に対して適当な炎症反応を誘発した。したがって、CHO K-1sTLR2trans細胞におけるTLR2による活性化を評価するために、細胞にNF-κB依存的ルシフェラーゼレポーター(pGLM-ENH-luci)ベクターを一過性に同時トランスフェクトした。ザイモサンおよびPGNによって刺激したCHO K-1sTLR2trans細胞は、NF-κB依存的ルシフェラーゼ活性を有意に増加させたが、sTLR9のリガンドDNAであるD25には反応しなかった(図14)。これらの知見は、CHO K-1sTLR2trans細胞が微生物の細胞壁成分を選択的に認識して、それによってNF-κB活性化が誘導されうることを示唆する。
Claims (10)
- 被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法であって、
(a)腸管組織において発現している、配列番号:35に記載の塩基配列がコードするブタ由来Toll様レセプター2を強制発現させた哺乳類細胞に、被験試料を接触させる工程
(b)該哺乳類細胞におけるシグナル伝達を指標に、該ブタ由来Toll様レセプター2の活性を測定する工程
を含み、上記ブタ由来Toll様レセプター2の活性が、上記被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される方法。 - 以下の(a)および(b)の工程を含む、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法。
(a)請求項1に記載の評価方法により、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価する工程
(b)複数の被験試料から、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する工程 - 被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法であって、
(a)被験微生物から抽出物を調製する工程
(b)腸管組織において発現している、配列番号:35に記載の塩基配列がコードするブタ由来Toll様レセプター2を強制発現させた哺乳類細胞に、該抽出物を接触させる工程
(c)該哺乳類細胞におけるシグナル伝達を指標に、該ブタ由来Toll様レセプター2の活性を測定する工程
を含み、上記ブタ由来Toll様レセプター2の活性が、上記抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される方法。 - 以下の(a)および(b)の工程を含む、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法。
(a)請求項3に記載の評価方法により、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する工程
(b)複数の被験微生物から、腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物を選択する工程 - 腸管組織において発現しているブタ由来Toll様レセプター2をコードする配列番号:35に記載の塩基配列を含むDNAを有する発現ベクターを哺乳類細胞に導入する工程を含む、腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法。
- 腸管組織において発現している、配列番号:35に記載の塩基配列がコードするブタ由来Toll様レセプター2を強制発現させた哺乳類細胞を、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法。
- 哺乳類細胞がチャイニーズハムスター由来である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の方法に用いるための、腸管組織において発現している、配列番号:35に記載の塩基配列がコードするブタ由来Toll様レセプター2を強制発現させた哺乳類細胞。
- 腸管組織において発現しているブタ由来Toll様レセプター2をコードする配列番号:35に記載の塩基配列を含むDNAを有する発現ベクターを哺乳類細胞に導入することで製造される、腸管免疫担当細胞のモデル細胞。
- チャイニーズハムスター由来である、請求項8または9に記載の細胞。
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